A rapid and robust nanoscopy method and use thereof

Abstract

Disclosed herein is a method for imaging of biomolecules in a sample, involving the steps of: (i) anchor, (ii) gelation, (iii) denaturation and hydrolysis, (iv) expansion, (v) staining, and (vi) imaging the expanded sample; wherein microwave irradiation accelerates steps (i), (ii), (iii), (iv), and / or (v) in comparison to these steps being conducted without microwave irradiation. Methods disclosed herein achieve results faster than current standard expansion microscopy methods with improved linear expansion factors.

Description

A RAPID AND ROBUST NANOSCOPY METHOD AND USE THEREOF

[0001] CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims the benefit of and priority to U.S. Provisional Application No. 63 / 668,334 filed July 8, 2024 and U.S. Provisional Application No. 63 / 737,807 filed December 23, 2024, which is herein incorporated by reference in its entirety.FIELD OF THE INVENTION

[0003] This invention is generally in the field of biological imaging, specifically expansion microscopy and related labelling and analysis of various types of biological specimens.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0004] The need for better imaging methods is nearly universal for biological research. As the cornerstone of understanding biological processes, microscopy techniques have played a pivotal role in numerous scientific breakthroughs and discoveries. A recent addition is Expansion microscopy (ExM) introduced by Boyden’s lab in 2015, enabling high-resolution imaging of biological samples by physically expanding the specimens, thereby overcoming the diffraction-limited resolution barrier of conventional light microscopy. The utilization of ExM techniques also revealed previously unknown assembly and organization of biological nanostructures.

[0005] Expansion Microscopy (ExM) shows substantial promise in the realm of biological and biomedical investigations, owing to its enhanced resolution and extensive versatility in contrast to alternative super-resolution microscopy techniques. Nevertheless, the integration of this approach on a wider scale has been constrained by the time-consuming nature of the sample preparation process, particularly for challenging-to-expand biological specimens (e.g., formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) sections and large three-dimensional specimens) . In order to facilitate the widespread implementation of ExM, the development of a method that is rapid, robust, and compatible with a wide range of specimens is needed.

[0006] There remains a need to provide improved method for expansion microscopy.

[0007] Therefore, it is the object of the present application to provide a rapid and robust method for expansion microscopy.SUMMARY OF THE INVENTION

[0008] Disclosed herein is a method for imaging of biomolecules in a sample, including the following steps: (i) fixation, (ii) anchor and gelation, (iii) denaturation and hydrolysis, (iv) expansion, (v) staining, and (vi) imaging; wherein microwave irradiation accelerates steps (i) , (ii) , (iii) , (iv) , and / or (v) in comparison to these steps being conducted without microwave irradiation. The disclosed method can advantageously, be completed in no more than 3.0 hours, for different sample types under microwave irradiation; and achieves a 25-fold single step linear expansion factor.

[0009] The disclosed method is an expansion upon a method for optical imaging of samples (e.g. biological specimens) with resolution better than the classical microscopy diffraction limit, based on physically expanding the specimen itself. Exemplary sample types include, but are not limited to a cell, tissue, lymph node, organoid and a Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) sample.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0010] FIG. 1A is a schematic showing BOOST microwave-assisted protocols for three sample types. Reagents and processing times are listed for each step. FIG. 1B is a bar graph showing the comparison of processing times for selected ExM techniques for three types of samples. FIG. 1C is a schematic showing the microwave-assisted BOOST hydrogel chemistry uses free-radical initiated polymerization of AA and bis, followed by alkaline hydrolysis to convert amide groups into charged carboxyl groups, transforming the gel into a swellable polyelectrolyte hydrogel. FIG. 1D is a schematic showing the microwave-assisted anchoring with the reactions between the amine groups of the biomolecules and aldehyde of PFA to produce methylol groups, followed by reactions with AA to be anchored to the hydrogel. FIG. 1E is a schematic diagram of biomolecules undergoing microwave-assisted gelation, hydrolysis, denaturation, and expansion; green dots and purple sticks depict the anchorable gel-reactive groups on biomolecules. FIG. 1F is a line graph showing the comparison of concentrations of acrylamide (AA) and N, N’ -methylenebisacrylamide (bis) for maximizing the expansion factor (EF) under 20-minute microwave-assisted hydrolysis (mean ± SD, n = 3) . FIG. 1G are the gel mechanical performance measurements showing the deformation indexes of BOOST gel formulations and the TREx gel. Squares in the background indicate 5 mm × 5 mm areas.

[0011] FIG. 2A is a schematic of ultrastructural staining after BOOST denaturation with reagents and processing times listed. FIG. 2B is a bar graph showing the comparison of the BOOST microwave-assisted NHS ester staining time with ExM techniques that used post-processing NHS ester staining. FIG. 2C is a 3D visualization of a mitotic U2-OS cell stained with NHS ester and SYTOX Green, EF = 10.2×. FIG. 2D shows a (Left) 2D image of a U2-OS cell stained with NHS ester and SYTOX Green, EF = 10.2× and (Right) , magnified views of the boxed region. Blue arrow, granular component of nucleolus. Line profile along the dashed line indicating a partially complementary staining pattern of NHS ester and SYTOX Green in the nucleolus. FIG. 2E are images showing that BOOST enables the preservation of ultrastructural details in vibratome-cut mouse tissue sections. (i) NHS ester labeled synaptic structures in expanded 100 μm mouse brain section, EF = 9.5×. (ii) NHS ester labeled mouse sperm annulus (green arrowhead) , midpiece (below the annulus) , and principal piece (above the annulus) in expanded 100 μm mouse testicle section, EF = 9.4×. (iii) NHS ester labeled mouse hepatocytes showing endoplasmic reticulum (purple arrowhead) , mitochondria (blue arrowhead) , and nuclear pores (green arrowhead) in expanded 100 μm mouse liver section, EF = 9.1×. (iv) NHS ester labeled mouse cardiomyocyte showing densely labeled A-band with intercalated M-line (green arrowheads) in expanded 100 μm mouse heart section, EF = 8.9×. (v) NHS ester labeled mouse podocyte foot process (green arrowhead) and continuous globular basement membrane (blue arrowhead) in expanded 100 μm mouse kidney section, and a zoomed-in view (right) of the boxed region on the left panel, EF = 9.0×. FIG. 2F are images of an NHS ester stained FFPE section of mouse lung bearing tumors before and after BOOST treatment. Post-BOOST images were taken by shrinking the expanded section (8.9×) back to ～2.6× in PBS. Magnified views of the boxed region showing a tumor before and after expansion. Right, a 3D visualization of the expanded mouse tumor, EF = 8.9×. FIG. 2G are images showing NHS ester stained human prostate cancer FFPE section before and after BOOST processing. Magnified views of the boxed region (orange) showing tumor cells became clearly resolved after expansion under the same microscope setup, EF = 8.7×. FIG. 2H is an image showing visualization of mitochondria (green arrowhead) in the NHS ester stained FFPE human prostate cancer section, EF = 8.7×. Scale bars (biological scale) : 2 μm (C) ; 2 μm (D, left) ; 1 μm (D, right) ; 2 μm (E, left and top right) ; 0.2 μm (E (i) , all four panels) ; 0.2 μm (E (ii) ) ; 1 μm (E (iii) , top and bottom) ; 0.5 μm (E (iv) ) ; 2 μm (E (v) , left) ; 0.5 μm (E (v) , right) ; 1 mm (F, top left and top middle) ; 400 μm (F, bottom left and bottom middle) ; 500 μm (G, left and right normal views) , 20 μm (G, left and right boxed zoomed-in views) ; 1 μm (H) .

[0012] FIG. 3A is a schematic of microwave-assisted immunostaining after BOOST denaturation with the reagents and processing times listed. FIG. 3B is a bar graph showing the comparison of the immunostaining duration with selected ExM techniques that used post-denaturation immunostaining. FIG. 3C are images of U2-OS cells pre-BOOST stained for α-tubulin processed with Sparse deconvolution (single z plane) and expanded view after BOOST processing (maximum intensity projection, Z = 11 frames) , EF = 10.2×. FIG. 3D are images showing the measurement error as a function of measurement distance for pre-expansion (processed with Sparse deconvolution) versus post-expansion U2-OS α-tubulin images. Mean is represented by the solid line with dashed lines representing standard deviation from the mean, performed using n = 4 replicates with average EF = 10.0×. FIG. 3E are images with a magnified view show the post-BOOST immunolabeling of Nuclear Pore Complexes (NPCs) of U2-OS cells coupled with SYTOX Green stain, EF = 9.6×. FIG. 3F is an image showing dashed circles were manually fitted on the NPC staining and quantified to plot the mean diameter of NPCs with standard deviations, using n = 120 NPCs from four replicates with average EF = 9.7×. FIG. 3G shows images (top) with magnified views (bottom) show the labeling against keratin coupled with SYTOX Green stain in the human prostate cancer FPPE section. Pre-BOOST images were processed with Sparse deconvolution (single Z plane) , and expanded view after BOOST processing (maximum intensity projection, Z = 10 frames) were manually selected to match the same Z, EF = 8.7×. FIG. 3H are line graphs showing the measurement error as a function of measurement distance for pre-expansion versus post-expansion FFPE prostate cancer keratin labeling. Mean is represented by the solid line with dashed lines representing standard deviation from the mean, performed using n = 4 replicates with average EF = 8.6×. FIG. 3I shows a line graph showing the measurement error as a function of measurement distance for pre-expansion versus post-expansion FFPE prostate cancer section SYTOX Green stain. Mean is represented by the solid line with dashed lines representing standard deviation from the mean, performed using n = 4 replicates with average EF = 8.6×. FIG. 3J are images showing that BOOST enables post-expansion immunolabeling for 100 μm vibratome-cut sections, with the lower row showing magnified views from the boxed regions of the upper row images. (i) Mouse heart capillaries stained against caveolin-1 (CAV1) followed by NHS ester morphological stain, EF = 9.0×; (ii) Mouse podocytes stained against vimentin followed by NHS ester morphological stain, EF =9.1×; (iii) Mouse synaptic structures stained against synaptophysin followed by NHS-ester morphological, EF = 9.5×. FIG. 3K are images showing that BOOST enables post-expansion immunolabeling for FFPE human prostate cancer specimens. (i) Maximum intensity projection (Z = 30 frames) of post-BOOST staining of keratin with SYTOX Green; (ii) Maximum intensity projection (Z = 34 frames) of post-BOOST staining of CAV1 with SYTOX Green, EF = 8.7×; (iii) Maximum intensity projection (Z = 32 frames) of post-BOOST staining of vimentin with SYTOX Green, EF = 8.6×; (iv) Maximum intensity projection (Z = 30 frames) of post-BOOST staining of α-tubulin with SYTOX Green, EF = 8.6×; (v) Maximum intensity projection (Z = 5 frames) of post-BOOST staining ATPIF1 with SYTOX Green, EF = 8.7×.

[0013] Scale bar (biological scale) : 5 μm (C, left and right) ; 2 μm (E, left) ; 0.5 μm (E, right) ; 0.1 μm (F, top) ; 20 μm (G, top left and top right) ; 2 μm (G, bottom left and bottom right) ; 10 μm (J (i) and J (ii) , top) ; 2 μm (J (i) and J (ii) , bottom) ; 5 μm (J (iii) , top) ; 0.2 μm (J (iii) , bottom) ; 5 μm (K (i) , (ii) , (iii) , (iv) and (v) ) .

[0014] Fig. 4A shows a schematic of BOOST workflow for large biological specimens with reagents and processing times listed. FIG. 4B shows 3D visualization of an expanded whole airway organoid stained with NHS ester and SYTOX Green, EF = 10.1×. FIG. 4C are images showing 3D visualization (left) of an airway organoid stained with NHS ester, SYTOX Green, and antibody against β-tubulin IV, with magnified views (middle and right) to reveal the ultrastructural details of cilia, EF = 10.0×. FIG. 4D are images showing the processing workflow of an intact lymph node to achieve a 9-fold expansion. Each square in the background represents a 5 mm × 5 mm area. FIG. 4E is a 2D image of the middle section of intact lymph node stained with ATTO 565 NHS ester, and FIG. 4F is a magnified 3D view of the boxed region, EF = 9×.

[0015] FIG. 4G is an image showing the 3D and 2D view of selected regions in the intact lymph node. Scale bar (biological scale) : 100 μm (B) ; 10 μm (C, left) ; 2 μm (C, middle) ; 0.5 μm (C, right) ; 100 μm (E) ; 10 μm (F) ; 2 μm (G) .

[0016] FIG. 5A is a line graph comparing the pH of the hydrolysis buffer to maximize the EF under microwave irradiation for 30 minutes with 30%w / v AA and 0.01%w / v bis blank gels (mean ± SD, n = 3) . FIG. 5B is a line graph comparing the microwave-assisted hydrolysis processing times to achieve the highest EF with pH 12 hydrolysis buffer (mean ± SD, n = 3) .

[0017] FIG. 5C are images showing the assessment of the morphology preservation and NHS ester labeling efficiency with 100-μm mouse liver sections under various alkaline strengths. All samples were stained with ATTO 565 NHS ester. Scale bars (biological scale) : 10 μm (left) ; 5 μm (middle) ; 4 μm (right) .

[0018] FIG. 6A are images showing the assessment of the compatibility of AcX anchoring using mouse liver sections under microwave irradiation of 10 minutes or 20 minutes, and no anchoring and TREx’s AcX anchoring protocol was used as a control. All samples were processed with TREx protocols. Samples showed less preserved morphology under AcX anchoring with microwave irradiation. FIG. 6B are images showing the evaluation of anchoring strategies comparing glutaraldehyde (10-minute microwave irradiation) , AcX (1-hour room temperature incubation) , and 30%AA + 4%PFA (10-minute microwave irradiation) based on gel formula of 30%w / v AA and 0.01%w / v bis. Microwave-assisted 30%AA + 4%PFA anchoring showed a similar preservation of the morphology to the standard TREx AcX anchoring method. All samples were mouse liver section samples and stained with ATTO 565 NHS ester to visualize morphology preservation. Scale bars (biological scale) : 2 μm (A) ; 5 μm (B) .

[0019] FIG. 7A is an image showing the comparison between standard 1-hour NHS ester incubation (EF = 9×) and microwave-assisted 15-minute NHS ester incubation (EF = 9.1×) , and both enabled the visualization of mitochondria in a subcellular context. FIG. 7B are images showing the comparison of staining with different NHS esters for microwave-assisted morphological staining. All three NHS esters enabled visualization of the mitochondria with slight differential staining of subcellular structures with the three NHS esters. Scale bars (biological scale) : 2 μm.

[0020] FIG. 8A are 2D images NHS ester stained expanded liver section with EF = 9.1×, expanded brain section with EF = 9.6×, expanded kidney section with EF = 9.2×, expanded heart section with EF = 9.0×, expanded testicle section with EF = 9.4×, and expanded spleen section with EF = 9.2×. FIG. 8B are images showing the Microwaved-assisted NHS ester staining (EF =8.9×) improved the staining uniformity compared with a standard 1-hour NHS staining in expanded 100 μm mouse liver sections (EF = 8.9×) . Scale bar (biological scale) : 20 μm (A, top left, top middle, and bottom middle) ; 10 μm (A, top right, bottom left, and bottom right) ; 12 μm (B) .

[0021] FIG. 9 are images showing the BOOST morphological staining for 100 μm vibratome-cut mouse tissue sections (testicle, kidney, and heart) reveals structural integrity on a 3D microscale. Left, 3D display of sperms in mouse testicle section with EF = 9.4×; middle, 3D display of glomerulus in mouse kidney section with EF = 9.2×; right, 3D display of cardiomyocytes in mouse heart section with EF = 9.0×. Scale bars (biological scale) : 3 μm (left) ; 5 μm (middle and right) .

[0022] FIG. 10A shows a tile scan, zoomed-in region, and a 3D visualization of a brain section stained with dual ATTO 565 NHS ester and ATTO 647N NHS ester showing differential contrast patterns, EF = 9.1×. FIG. 10B is a 3D visualization and magnified 3D view of expanded kidney sections stained with ATTO 565 NHS ester and ATTO 647N NHS ester highlighting morphology of different structures, EF = 8.7×. Scale bars (biological scale) : 10 μm (A, left) ; 2 μm (A, right) ; 40 μm (B, left) ; 20 μm (B, right) .

[0023] FIG. 11 shows images of the same gel-embedded FFPE section before hydrolysis and after hydrolysis in PBS (EF = 2.3×) . Scale bars (biological scale) : 1 mm (left and right) .

[0024] FIG. 12A shows Top, images of mouse FFPE lung sample before and after BOOST processing stained with NHS ester, EF = 8.3×. Bottom, measurement error as a function of measurement distance for pre-expansion versus post-expansion images. Mean is represented by the solid line with dashed lines representing standard deviation from the mean, performed using n = 4 replicates with average EF = 8.1×. FIG. 12B shows Top, images of human prostate cancer FFPE section before BOOST and after BOOST processing stained with NHS ester, EF = 8.7×. Bottom, measurement error as a function of measurement distance for pre-expansion versus post-expansion FFPE human prostate images. Mean is represented by the solid line with dashed lines representing standard deviation from the mean, performed using n = 4 replicates with average EF = 8.6×. Scale bars (biological scale) : 300 μm (A, top left and top right) ; 500 μm (B, top left and top right) .

[0025] FIG. 13A shows immunostaining of NPCs with anti-NUP153 and anti-NUP96 antibodies on fixed U2-OS cells (left) followed by BOOST processing and DAPI staining (right) , EF =9.4×. FIG. 13B shows immunostaining of NPCs of fixed U2-OS cells (two shown here) after BOOST denaturation with anti-NUP153 and anti-NUP96 antibodies, EF = 9.6×. The nucleus is stained with SYTOX Green. FIG. 13C are images showing microwave-assisted immunostaining and standard immunostaining of human prostate cancer FFPE samples after BOOST denaturation generated consistent results. Images were taken in PBS, EF = 2.5×. Scale bars (biological scale) : 20 μm (A, left) ; 2 μm (A, right) ; 2 μm (B) ; 200 μm (C) .

[0026] FIG. 14A are images showing secondary antibody only negative controls for the immunostaining result for Post-BOOST U2-OS cell (EF = 10.1×) , showing weak and non-specific signals. FIG. 14B are images showing secondary antibody only negative controls for the mouse brain section (EF = 9.5×) , showing weak and non-specific signals. FIG. 14C are images showing secondary antibody only negative controls for mouse kidney section (EF = 9.1×) , showing weak and non-specific signals. FIG. 14D are images showing secondary antibody only negative controls for mouse heart section (EF = 8.8×) , showing weak and non-specific signals.

[0027] FIG. 14E are images showing secondary antibody only negative controls for human prostate cancer FFPE section (EF = 8.6×) , showing weak and non-specific signals, and FIG. 14F are images showing human prostate cancer FFPE section (EF = 2.3×) stained with Alexa Fluor 647-conjugated anti-rabbit IgG secondary antibody. Scale bars (biological scale) : 1 μm (A) ; 10 μm (B) ; 5 μm (C) ; 5 μm (D) ; 5 μm (E) ; 200 μm (F) .

[0028] FIG. 15 is a schematic showing the BOOST workflow on five sample types (i.e., cells, tissue sections, FFPE sample, large 3D organoids, intact lymph node) with the reagents and processing times listed. Three staining options are tested, including microwave-assisted immunostaining for visualizing proteins of interest (Option 1) , microwave-assisted morphological staining with NHS esters coupled with DNA dyes (Option 2) , and an additional option to combine the above two options with immunostaining performed first, followed by morphological stain (Option 3) .

[0029] FIG. 16A is a schematic showing three strategies are used in this manuscript to determine the EF. FIG. 16B are images showing the expansion factor determination by measuring the expansion of linear length (usually the longest) before and after BOOST. FIG. 16C are images showing the EF determination is done by measuring the gel (for cell samples) or specimens (for tissue section, FFPE sample, and large specimens) area before and after BOOST. FIG. 16D are images showing that EF determination by measuring the sizes of the stained nucleus (n > 50) for each sample before and after BOOST treatment. Scale bar (biological scale) : 100 μm (D, left) ; 20 μm (D, right) .DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0030] The disclosed methods provide a robust and fast workflow that can expand biological samples [cells, tissues, clinical samples] to ～10 times of its original size, allowing efficient visualization of morphology and molecules in biological samples with high resolution. involves embedding biological samples (cells, tissues, clinical samples) into formulated hydrogel framework with the aid of designed microwave reactions. The gel which later expands to 8-10 times of its original size, while retaining proteins and original morphology from the biological sample for overall better resolved visualization of the morphology and molecules in biological samples, which can be used for research purposes and clinical applications.

[0031] The disclosed method offers several advantages over conventional expansion microscopy. Conventional expansion microscopy workflow requires a long processing time. The process is particularly long for FFPE samples used for clinical applications. Often-impure sodium acrylate addition of conventional expansion gel formulations, which makes the workflow not robust. Additionally, conventional expansion microscopy protocols are often limited to certain types of samples.

[0032] I. Definitions

[0033] As used herein, the term “specimen” , “sample” or “sample of interest” generally refers to, but not limited to, a biological, chemical or biochemical sample, such as a cell, array of cells, tumor, tissue, cell isolate, biochemical assembly, or a distribution of molecules suitable for microscopic analysis. The sample may be a thin section of a frozen or paraffin embedded tissue or other biological specimen section, and may be attached to a microscope slide. The specimen may have been previously preserved in formalin, alcohol, or another fixative. These are merely examples of the plethora of specimens amenable to the methods described herein.

[0034] As used herein, the term “swellable material” generally refers to a material that expands when contacted with a liquid, such as water or other solvent. Preferably, the swellable material uniformly expands equally in 3 dimensions (i.e., isotropically) . Additionally or alternatively, the material is transparent such that, upon expansion, light can pass through the sample. In one embodiment the swellable material is a swellable polymer or hydrogel. For example, one or more polymerizable materials, monomers or oligomers can be used for swelling hydrogel polymer formation, such as monomers containing unsaturated carbonyls, such as methacrylates, acrylates, acrylamides, acrylic acid and / or its salt derivatives, monoalkylacrylamides including but not limited to methyl, ethyl, propyl or isopropyl acrylamide or N, N-dimethylacrylamide 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid and its salt derivatives, dialkylacrylamides such as dimethylacrylamide and diethylacrylamide, vinyl alcohols. During the polymerization process, a small quantity of di-or poly-functional monomers, commonly referred to as crosslinkers or multi-functional monomers, are included, such as dialkylacrylamides, N, N’ -methylenebisacrylamide, N, N’ -ethylenebisacrylamide, N, N’ - (Propane-1, 3-diyl) diacrylamide, N, N’ (Butane-1, 4-diyl) diacrylamide, N, N’ hexamethylenebisacrylamide, N, N'- (1, 2-Dihydroxyethylene) bisacrylamide, piperazine diacrylamide, hexahydro-1, 3, 5-tris (1-oxoallyl) -1, 3, 5-triazine, N, N'- (Disulfanediylbis (ethane-2, 1-diyl) ) diacrylamide, poly (ethylene glycol) diacrylamide, N, N- (2-amino-1, 4-phenylene) diacrylamide, or N, N'- (2-Aminopropane-1, 3-diyl) diacrylamide. Precursors can also contain polymerization initiators and crosslinkers. In a preferred embodiment, the swellable polymer is polyacrylamide and / or copolymers thereof. Alternatively or additionally, the swellable material can be formed in situ by chemically crosslinking water soluble oligomers or polymers. Thus, in some embodiments, the method involves adding precursors (such as water soluble precursors) of the swellable material to the sample and rendering the precursors swellable in situ.

[0035] II. Microwave-Assisted Expansion Microscopy

[0036] A set of reagents and protocols, which are microwave-compatible, have been developed, which accelerate every step of the workflow (i.e., infiltration, gelation, digestion, staining, and expansion) and reduce the time required for each sample from days to less than two hours. The methods employ acrylamide gel with designed microwave chemistry to avoid the use of sodium acrylate and show improved robustness. The single component gel formulation also allows the expansion of biological samples to 8-10 folds of their original size at one single step. The method is compatible with not only cultured cells and thin tissue sections, but also for FFPE samples and thicker samples with similar sizes as needle biopsy and whole tissues.

[0037] Disclosed herein is a method for imaging of biomolecules in a sample, involving the steps of: (i) fixation: fixing a sample by crosslinking biomolecules for structural &molecular preservation, such as chemical fixation induced by formaldehyde and its derivatives, glutaraldehyde, alcohol, glyoxal and epoxide families; (ii) anchor and gelation: subjecting the sample, to a first one or more monomers, and a one or more crosslinker agent to elicit gelation, forming a swellable neutral material, wherein the gel-reactive chemical groups of the biomolecules within the sample, using bifunctional or multifunctional anchoring molecules such as aldehydes and / or acrylamide mixture, epoxides, glutaraldehyde, Acrylic acid N-hydroxysuccinimide ester and Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester, are anchored to the swellable material by covalently bonded; (iii) denaturation and hydrolysis: subjecting the sample to denaturation using heat based denaturants, and driving the neutral material to hydrolysis to form a swellable polyelectrolyte material; (iv) expansion: swelling the swellable polyelectrolyte material to form an expanded sample; (v) staining: staining the sample either before or after steps (i) (ii) , (iii) , or (iv) ; and (vi) imaging: imaging the expanded sample; wherein microwave irradiation accelerates steps (i) , (ii) , (iii) , (iv) , and / or (v) in comparison to these steps being conducted without microwave irradiation;

[0038] wherein the method, in embodiments referring to FIG 1A, is completed in no more than 3.0 hours, such as between 0.5 hours and 1.5 hours, between 0.5 hours and 2.0 hours, between 0.5 hours and 2.5 hours, or between 0.5 hours and 3.0 hours for different sample types under microwave irradiation; and the method achieves a maximally 25-fold single step linear expansion factor, such as 1-25 fold, 5-25 fold, 5-20 fold, 5-15 fold, 10-15 fold, or 10-20 fold single step linear expansion factor. In some embodiments, the biomolecule is a protein, nucleic acid and lipid.

[0039] The disclosed method is an expansion upon a method for optical imaging of samples (e.g. biological specimens) with resolution better than the classical microscopy diffraction limit, based on physically expanding the specimen itself. In some embodiments, the sample type is a cell, tissue, lymph node, organoid, or a Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) sample. In this method, cultured cells, fixed tissue, or in principle any other type of sample of interest, including biological materials, are infused with a composition, or chemical cocktail, that results in it becoming embedded in the sample material, and then the composition can be expanded isotropically, preferably with nanoscale precision, in three dimensions. Fresh, frozen, aldehyde-fixed, or formalin-fixed and paraffin embedded specimens can be utilized in the process, among others. Such specimens can be prepared, thawed, deparaffinized, and any other treatment to render the sample ready for the ExM process.

[0040] In some embodiments, the disclosed method provides a microscopy method for producing a high-resolution image of a sample, the method involving enlarging a sample of interest and viewing the enlarged sample under a microscope. In some embodiments, enlarging the sample of interest involves embedding a sample of interest in a swellable material and then swelling the material. In some embodiments, the sample of interest is labeled.

[0041] In some embodiments, the method for the optical imaging of a sample of interest provides resolution better than the classical microscopy diffraction limit, based on physically expanding the sample itself. In some embodiments, the method involves embedding a sample of interest in a swellable material and then swelling the material. In certain embodiments, the sample of interest is labeled.

[0042] The swollen material with its embedded sample (e.g. biological specimen) can be imaged on any optical microscope, allowing effective imaging of features below the classical diffraction limit. Since the resultant specimen can be transparent, custom microscopes capable of large volume, wide field of view, fast 3-D scanning may also be used in conjunction with the expanded sample.

[0043] This enables new kinds of scientific exploration, such as mapping the brain, discovering the tumor heterogeneity in tumor microenvironment, as well as new diagnostic, personalized medicine, histopathological, and other medical capabilities.

[0044] A. Anchoring and Gelation

[0045] The disclosed method involves an anchoring step wherein the biomolecules within the fixed sample are conjugated, under microwave irradiation, with bifunctional or multifunctional anchoring molecules , wherein the anchoring molecules or the reacted moieties contain gel-reactive chemical groups. The disclosed method also involves a gelation step wherein the sample, a first one or more monomer, and a one or more crosslinker agent are subjected to gelation, forming a swellable neutral material, wherein the gel-reactive chemical groups of the biomolecules within the sample are anchored to the swellable neutral material.

[0046] In some embodiments, embedding the sample in a swellable material involves permeating (such as, perfusing, infusing, soaking, adding or other intermixing) the sample with the swellable material, preferably by adding precursors thereof. Alternatively or additionally, embedding the sample in a swellable material involving permeating one or more monomers or other precursors throughout the sample and polymerizing and / or crosslinking the monomers or precursors to form the swellable material or polymer. In this manner the sample of interest is embedded in the swellable material.

[0047] In some embodiments, the sample of interest, or a labeled sample, can, optionally, be treated with a detergent prior to being contacted with the one or more swellable material precursors. The use of a detergent can improve the wettability of the sample or disrupt the sample to allow the one or more swellable monomer precursors to permeate throughout sample.

[0048] In some embodiments, the sample is permeated with a first one or more monomer and a one or more crosslinker agent or a solution containing a first one or more monomer and a one or more crosslinker agent which are then reacted to form a swellable neutral material. For example, if the sample of interest is to be embedded in polyacrylamide hydrogel, a solution containing the first one or more monomer acrylamide and the cross-linker N, N-methylenebisacrylamide or dimethylacrylamide are perfused throughout the sample. In some embodiments, the first one or more monomers are acrylamide, glycidyl methacrylate, or glycerol triglycidyl ether. In some embodiments, the one or more crosslinker agent is N, N’ -methylenebisacrylamide, N, N’ -ethylenebisacrylamide, N, N’ - (Propane-1, 3-diyl) diacrylamide, N, N’ (Butane-1, 4-diyl) diacrylamide, N, N’ hexamethylenebisacrylamide, N, N'- (1, 2-Dihydroxyethylene) bisacrylamide, piperazine diacrylamide, hexahydro-1, 3, 5-tris (1-oxoallyl) -1, 3, 5-triazine, N, N'- (Disulfanediylbis (ethane-2, 1-diyl) ) diacrylamide, poly (ethylene glycol) diacrylamide, N, N- (2-amino-1, 4-phenylene) diacrylamide, or N, N'- (2-Aminopropane-1, 3-diyl) diacrylamide. In some embodiments, the proportion of these components in the embedding solution are provided to result in a polymer that is optimally swellable to desired expansion factor. Once the sample, or labeled sample, is permeated and polymerized, the hydrogel is partially to fully, activated in the hydrolysis step to form sodium polyacrylate. The monomer solution may also include chemical and / or physical initiators and accelerators of the polymerization process. In a preferred embodiment, the solution comprising the monomers is aqueous. In some embodiments, during step (i) amine groups on the biomolecules of the sample react with anchoring reagents to form a reactive group, and / or further reacts with a second one or more monomer to form the crosslinker. In some embodiments, the second one or more monomer is acrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N, N-dimethylacrylamide 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid sodium salt, acrylic acid. In some embodiments, the anchoring reagent is difunctional or polyfunctional. In some embodiments, the anchoring reagent is epoxide family including glycidyl methacrylate and glycerol triglycidyl ether, glutaraldehyde, Acrylic acid N-hydroxysuccinimide ester, methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester, aldehydes fixatives and / or acrylamide combination, or a combination thereof, but not succinimidyl ester of 6- ( (acryloyl) amino) hexanoic acid (AcX) .

[0049] In some embodiments, the sample (e.g., a labeled sample) is anchored to the swellable material before expansion. This can preferably be accomplished by chemically anchoring a tag or label with the swellable material, such as before or in situ formation of the swellable material. In certain embodiments, the dyes or stains used to label biomolecules of interest (e.g., nucleic acids and proteins) have the ability to anchor the biomolecule of interest to the swellable material by means of an anchorable moiety on the dye or stain. In some embodiments, anchorable dyes are used and / or an anchoring agent is used. In some embodiments, during step (ii) microwave irradiation promotes free radical polymerization between the first one or more monomer and the one or more crosslinker agent to form the swellable neutral material and the microwave irradiation promotes biomolecular tethering of the biomolecules to the swellable neutral material by improving infiltration of the first one or more monomer and the second one or more monomer into the swellable neutral material.

[0050] B. Denaturation and Hydrolysis

[0051] Following anchoring and gelation, the sample is subjected to denaturation to disrupt the underlying network of biological molecules, leaving the tags of interest (e.g., labeled antibody, stain) intact and anchored to the gel, and subject the swellable neutral material to hydrolysis to form a swellable polyelectrolyte material. In some embodiments, after the labeled sample has been anchored to the swellable material, the sample is subjected to denaturation of the endogenous biological molecules (or the physical structure of the sample of interest, where the sample is other than a biological material) , leaving the tags or fluorescent dye molecules intact and anchored to the swellable material. In this way, the mechanical properties of the gel-biomolecule hybrid material are rendered more spatially uniform, allowing isotropic expansion with minimal artifacts. In some embodiments, the denaturation utilizes heat and / or enzymatic approach, but not proteinase K. In some embodiments, the denaturation utilizes heat promoted under microwave irradiation and a chaotropic reagent. In some embodiments, the chaotropic agent is sodium dodecyl sulfate, urea, guanidine hydrochloride, Tris-HCl, Ethylenediaminetetraacetic acid or salt derivatives, Triton X-100, Tween 20, sodium chloride, boric acid or salt derivatives.

[0052] In some embodiments, during step (iii) the microwave irradiation promotes hydrolysis of the swellable neutral material into the swellable polyelectrolyte under alkaline conditions.

[0053] D. Expansion

[0054] The disclosed method involves an expansion step (iv) , wherein the swellable polyelectrolyte material undergoes swelling to form an expanded sample containing the expanded polyelectrolyte material.

[0055] In some embodiments, swelling the swellable polyelectrolyte material results in a swelled material with an expansion factor of no more than 25x, or between 7.0x and 30.0x, between 7.5x and 30.0x, between 8.0x and 30.0x, between 8.5x and 30.0x, between 8.5x and 30.0x, between 9.0x and 30.0x, between 9.5x and 30.0x, between 10.0x and 30.0x, between 10.0x and 25.0x, between 8.0x and 25.0x, between 7.5x and 25.0x, or between 7.0x and 25.0x.

[0056] D. Staining

[0057] The disclosed method further involves staining step (v) wherein the sample embedded in the polyelectrolyte hydrogel, or the expanded sample is stained with a fluorescent dye or antibody. In some embodiments, the step (v) is repeated one or more times. In some forms, the staining is proteomic staining or immunostaining, or a combination thereof.

[0058] Immunostaining is a standard technique that employs antibodies to detect and quantify antigen levels. This process uses an antibody targeted against a specific molecule, referred to as the primary antibody, to detect its presence. A secondary antibody conjugated with either a fluorescent or enzymatic tag is used to bind to the primary antibody, and the presence of the marker can thereby be visualized and / or quantified through the use of a fluorescence microscope or by the addition of a colored substrate. In some forms, the primary antibody is conjugated to the fluorescent tag i.e., the method omits a secondary antibody.

[0059] Examples of fluorescent labels / dyes include, but are not limited to, Atto dyes, 4-acetamido-4′-isothiocyanatostilbene-2, 2′disulfonic acid; acridine and derivatives: acridine, acridine isothiocyanate; 5- (2′-aminoethyl) aminonaphthalene-1-sulfonic acid (EDANS) ; 4-amino-N- [3-vinylsulfonyl) phenyl] naphthalimide-3, 5 disulfonate; N- (4-anilino-1-naphthyl) maleimide; anthranilamide; BODIPY; Brilliant Yellow; coumarin and derivatives; coumarin, 7-amino-4-methylcoumarin (AMC, Coumarin 120) , 7-amino-4-trifluoromethylcouluarin (Coumaran 151) ; cyanine dyes; cyanosine; 4′, 6-diaminidino-2-phenylindole (DAPI) ; 5′5″-dibromopyrogallol-sulfonaphthalein (Bromopyrogallol Red) ; 7-diethylamino-3- (4′-isothiocyanatophenyl) -4-methylcoumarin; diethylenetriamine pentaacetate; 4, 4′-diisothiocyanatodihydro-stilbene-2, 2′-disulfonic acid; 4, 4′-diisothiocyanatostilbene-2, 2′-disulfonic acid; 5- [dimethylamino] naphthalene-1-sulfonyl chloride (DNS, dansylchloride) ; 4-dimethylaminophenylazophenyl-4′-isothiocyanate (DABITC) ; eosin and derivatives; eosin, eosin isothiocyanate, erythrosin and derivatives; erythrosin B, erythrosin, isothiocyanate; ethidium; fluorescein and derivatives; 5-carboxyfluorescein (FAM) , 5- (4, 6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF) , 2′, 7′-dimethoxy-4′5′-dichloro-6-carboxyfluorescein, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, QFITC, (XRITC) ; fluorescamine; IR144; IR1446; Malachite Green isothiocyanate; 4-methylumbelliferoneortho cresolphthalein; nitrotyrosine; pararosaniline; Phenol Red; B-phycoerythrin; o-phthaldialdehyde; pyrene and derivatives: pyrene, pyrene butyrate, succinimidyl 1-pyrene; butyrate quantum dots; Reactive Red 4 (CibacronTM Brilliant Red 3B-A) rhodamine and derivatives: 6-carboxy-X-rhodamine (ROX) , 6-carboxyrhodamine (R6G) , lissamine rhodamine B sulfonyl chloride rhodamine (Rhod) , rhodamine B, rhodamine 123, rhodamine X isothiocyanate, sulforhodamine B, sulforhodamine 101, sulfonyl chloride derivative of sulforhodamine 101 (Texas Red) ; N, N, N′, N′tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA) ; tetramethyl rhodamine; tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC) ; riboflavin; rosolic acid; terbium chelate derivatives; Cy3; Cy5; Cy5.5; Cy7; IRD 700; IRD 800; La Jolta Blue; phthalo cyanine; and naphthalo cyanine. Preferred fluorescent labels are FAM and VICTM (from Applied Biosystems) . Labels other than fluorescent labels are contemplated by the invention, including other optically-detectable labels.

[0060] In some embodiments, during step (v) the sample is stained with one or more fluorescent dyes and / or one or more antibodies. In some forms, the one or more fluorescent dyes are nuclear stains such as DAPI, Hoechst and Sytox Green, morphological dyes such as NHS ester conjugated with a fluorescent dye, maleimide conjugated with a fluorescent dye, hydrazide conjugated with a fluorescent dye, cadaverine conjugated with a fluorescent dye, lipid or synthesized lipid with long alkyl chain conjugated with a fluorescent dye. In some embodiments, during step (v) the microwave irradiation promotes uniformity of the one or more fluorescent dyes within the sample. In some embodiments, step (v) further involves a washing step to remove unbound or nonspecifically bound antibodies or dyes. In some embodiments, step (v) further involves a blocking step to prevent nonspecific binding of the antibody.

[0061] In some embodiments, the method involves step (vii) antigen retrieval: wherein the sample is subjected to microwave irradiation in a buffer solution to reverse heavy chemical crosslinks and step (vii) is conducted before step (ii) .

[0062] In some embodiments, the method involves step (vii) antigen retrieval: wherein the sample is subjected to microwave irradiation in a buffer solution to reverse heavy chemical crosslinks and step (vii) is conducted before step (ii) .

[0063] The disclosed and methods can be further understood through the following numbered paragraphs.

[0064] 1. A method for imagining biomolecules in a sample under microwave irradiation, comprising the steps of:

[0065] (i) anchor: subjecting the sample to conjugation with the biomolecules within the sample through fixatives to preserve structural and molecular information, then anchoring the biomolecules within the sample with one or more anchoring reagent to form gel-reactive chemical groups;

[0066] (ii) gelation: subjecting the sample, a first one or more monomer, and a one or more crosslinker agent to gelation, forming a swellable neutral material, wherein the gel-reactive chemical groups of the biomolecules within the sample are further anchored to the swellable neutral material;

[0067] (iii) denaturation and hydrolysis: subjecting the sample to denaturation and the swellable neutral material to hydrolysis to form a swellable polyelectrolyte material;

[0068] (iv) expansion: swelling the swellable polyelectrolyte material to form an expanded sample;

[0069] (v) stain: staining the sample either before or after steps (i) (ii) , (iii) , or (iv) ; and (vi) image: imaging the expanded sample.

[0070] wherein the microwave irradiation accelerates steps (i) , (ii) , (iii) , (iv) , and / or (v) in comparison to these steps being conducted without microwave irradiation;

[0071] wherein the method is completed no more than 3.0 hours; and

[0072] the method achieves at most 25-fold single step linear expansion factor.

[0073] 2. The method of paragraph 1, wherein the sample is a cell, tissue slice or block, lymph node, organoid, or a Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) sample.

[0074] 3. The method of paragraphs 1 or 2, wherein the biomolecule is a protein.

[0075] 4. The method of any one of paragraphs 1-3 wherein the first one or more monomers are methacrylates, acrylates, acrylamides, acrylic acids and / or its salt derivatives, monoalkylacrylamides including but not limited to methyl, ethyl, propyl or isopropyl acrylamide or N, N-dimethylacrylamide 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acids and its salt derivatives, dialkylacrylamides such as dimethylacrylamide and diethylacrylamides, or vinyl alcohols.

[0076] 5. The method of any one of paragraphs 1-4, wherein the one or more crosslinker agent is N, N’ -methylenebisacrylamide, N, N’ -ethylenebisacrylamide, N, N’ - (Propane-1, 3-diyl) diacrylamide, N, N’ (Butane-1, 4-diyl) diacrylamide, N, N’ hexamethylenebisacrylamide, N, N'- (1, 2-Dihydroxyethylene) bisacrylamide, piperazine diacrylamide, hexahydro-1, 3, 5-tris (1-oxoallyl) -1, 3, 5-triazine, N, N'- (Disulfanediylbis (ethane-2, 1-diyl) ) diacrylamide, poly (ethylene glycol) diacrylamide, N, N- (2-amino-1, 4-phenylene) diacrylamide, or N, N'- (2-Aminopropane-1, 3-diyl) diacrylamide.

[0077] 6. The method of any one of paragraphs 1-5, wherein during step (i) amine groups on the biomolecules reacts with an anchoring reagent to form a reactive group, which further reacts with a second one or more monomer to form the stable anchor.

[0078] 7. The method of paragraph 6, wherein the second one or more monomer are methacrylates, acrylates, acrylamides, acrylic acids and / or its salt derivatives, monoalkylacrylamides including but not limited to methyl, ethyl, propyl or isopropyl acrylamides or N, N-dimethylacrylamide 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acids and its salt derivatives, dialkylacrylamides such as dimethylacrylamide and diethylacrylamides, or vinyl alcohols.

[0079] 8. The method of paragraphs 6 or 7, wherein during step (ii) promotes free radical polymerization between the first one or more monomer and the one or more crosslinker agent to form the swellable neutral material and the microwave irradiation promotes biomolecular tethering of the biomolecules to the swellable neutral material by improving infiltration of the first one or more monomer and the second one or more monomer into the swellable neutral material.

[0080] 9. The method of paragraph 6, wherein the anchoring reagent is bifunctional or multifunctional molecules such as aldehydes and / or acrylamide mixture, epoxides, glutaraldehyde, Acrylic acid N-hydroxysuccinimide ester and Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester, or a combination thereof, but not succinimidyl ester of 6- ( (acryloyl) amino) hexanoic acid (AcX) .

[0081] 10. The method of any one of paragraphs 1-9, wherein during step (iii) the microwave irradiation promotes hydrolysis of the swellable neutral material into the swellable polyelectrolyte under alkaline conditions.

[0082] 11. The method of any one of paragraphs 1-10, wherein during step (iii) the denaturation utilizes heat, one or more chaotropic reagents, and / or one or more enzyme, but not Proteinase K.

[0083] 12. The method of paragraph 11, wherein the chaotropic agent is sodium dodecyl sulfate, urea, guanidine hydrochloride, Tris-HCl, Ethylenediaminetetraacetic acid or salt derivatives, Triton X-100, Tween 20, sodium chloride, boric acid or salt derivatives.

[0084] 13. The method of any one of paragraphs 1-12, wherein step (v) is repeated one or more times.

[0085] 14. The method of any one of paragraphs 1-13, wherein the staining is proteomic staining or immunostaining, or a combination thereof.

[0086] 15. The method of any one of paragraphs 1-14, wherein during step (v) the sample is stained with one or more fluorescent dyes and / or one or more antibodies.

[0087] 16. The method of paragraph 15, wherein the one or more fluorescent dyes are nuclear stains or morphological dyes.

[0088] 17. The method of paragraph 16, wherein the morphological dyes are such as NHS ester conjugated with a fluorescent dye, maleimide conjugated with a fluorescent dye, hydrazide conjugated with a fluorescent dye, cadaverine conjugated with a fluorescent dye, lipid or synthesized lipid with long alkyl chain conjugated with a fluorescent dye.

[0089] 18. The method of paragraph 16, wherein the nuclear dyes are SYTOX Green, DAPI, or Hoechst.

[0090] 19. The method of any one of paragraphs 1-18, wherein during step (v) the microwave irradiation promotes uniformity of the one or more fluorescent dyes within the sample.

[0091] 20. The method of any one of paragraphs 1-19, wherein step (v) further comprises a washing step to remove unbound or nonspecifically bound antibodies or dyes.

[0092] 21. The method of any one of paragraphs 1-20, wherein step (v) further comprises a blocking step to prevent nonspecific binding of the antibody.

[0093] 22. The method of any one of paragraphs 1-21, further comprising step (vii) antigen retrieval: wherein the sample is subjected to microwave irradiation in a buffer solution to reverse heavy chemical crosslinks and step (vii) is conducted before step (ii) .

[0094] The methods, compounds, and compositions herein described are further illustrated in the following examples, which are provided by way of illustration and are not intended to be limiting. It will be appreciated that variations in proportions and alternatives in elements of the components shown will be apparent to those skilled in the art and are within the scope of disclosed forms. All parts or amounts, unless otherwise specified, are by weight.

[0095] EXAMPLES

[0096] Example 1:

[0097] Materials and Methods

[0098] Chemicals

[0099] Acrylamide (A9099, Sigma-Aldrich) , N, N'-Methylenebis (acrylamide) (146072, Sigma-Aldrich) , ammonium persulfate (A7460, Sigma-Aldrich) , TEMED (1610801, Bio-Rad) , sodium chloride (S3014, Sigma-Aldrich) , paraformaldehyde (15700, EMS) , glutaraldehyde (16501, EMS) , sodium dodecyl sulfate (L3771, Sigma-Aldrich) , sodium hydroxide (S5881, Sigma-Aldrich) , boric acid (A01298, 3A) , ATTO 488, 565, 647N NHS esters (ATTO-TEC) , SYTOX Green (S7020, Thermo Fisher) , tris base (T6066, Sigma-Aldrich) , ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (E5134, Sigma-Aldrich) , poly-L-lysine solution (P8920, Sigma-Aldrich) , Sigmacote (SL2, Sigma-Aldrich) , DAPI (62248, Thermo Fisher) , xylene (UN1307, DUKSAN) , ethanol absolute (UN1170, Scharlau) , Phosphate-buffered saline (PBS) (Gibco 10010023) , Bovine serum albumin (BSA) (9998S, ENERGY) , Triton X-100 (X100, Sigma-Aldrich) , Tween20 (P9416, Sigma-Aldrich) , sodium acrylate (408220, Sigma-Aldrich) , 4-hydroxy TEMPO (E020145, Energy) .

[0100] Antibodies

[0101] Rabbit polyclonal anti-α-tubulin (11224-1-AP, Proteintech) , rabbit polyclonal anti-NUP98-NUP96 (12329-1-AP, Proteintech) , rabbit polyclonal anti-NUP153 (14189-1-AP, Proteintech) , rabbit polyclonal anti-PSMA / GCPII (13163-1-AP, Proteintech) , rabbit monoclonal anti-beta IV tubulin antibody (EPR16776, Abcam) , rabbit polyclonal synaptophysin antibody (17785-1-AP, Proteintech) , rabbit polyclonal ATPIF1 antibody (12067-1-AP, Proteintech) , rabbit polyclonal vimentin antibody (10366-1-AP, Proteintech) , rabbit polyclonal pan-keratin antibody (26411-1-AP, Proteintech) , rabbit monoclonal caveolin-1 (D46G3) XP antibody (3267S, Cell Signaling Technology) , Alexa Fluor 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG (ab150063, Abcam) , and Alexa Fluor 568-conjugated donkey anti-rabbit IgG (ab175470, Abcam) .

[0102] Cultured cell samples

[0103] U2-OS cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10%FBS and 1%penicillin / streptomycin at 37℃ in the presence of 5%CO2. To prepare cells for fixation, imaging, and expansion, cells were seeded on 12 mm × 12 mm coverslips and cultured until they reached 50-60%confluency for fixation. Cells on coverslips were normally fixed using 4%PFA and 0.1%GA in PBS buffer for 10 minutes. For NUP 98-96 &NUP153 immunostaining, a different fixation strategy, as reported previously, was used to better preserve nuclear pores. 2, 43 Briefly, cells were firstly prefixed using 2.4%PFA in PBS for 30 seconds, followed by incubation with 0.4%Triton X-100 in PBS for 3 minutes and two additional 5-minute washes in PBS on a rocking platform. Subsequently, the cells were fixed with 2.4%PFA in PBS for 20 minutes at room temperature and then washed twice for 5 minutes with PBS on a rocking platform. A second permeabilization step was carried out using a 0.2%Triton X-100 in PBS for 10 minutes, followed by two additional 5-minute washes in PBS on a rocking platform.

[0104] Mouse tissue section and lymph node samples

[0105] Mice were anesthetized using 2%Xylazine: 10%Ketamine : PBS mixed in 1: 2: 9, and perfused transcardially with 20 mL of PBS and 20 mL of cold fixative solution (4%PFA in PBS) . Tissues (i.e., brain, liver, kidney, intact lymph nodes) were then harvested and fixed for 48-72 hours with the same fixative solution at 4℃. Fixed tissues were then sectioned to 100 μm-thick slices using a vibratome (easiSlicer, TED PELLA) . The protocol of the mouse experiment was approved by The Committee on the Use of Live Animals on Teaching and Research at the University of Hong Kong.

[0106] Mouse FFPE samples

[0107] The lung tumor was established by intravenously injecting 5×105 -1×106 mouse LLC cells into C57B6 / J mice. The lung tissue was collected after 4 weeks of injection. The protocol of the mouse experiment was approved by The Committee on the Use of Live Animals on Teaching and Research at the University of Hong Kong. Tissues were then fixed in 4%PFA in PBS for at least 24 hours. Fixed tissues were then dehydrated and processed as follows: 80%ethanol for 15 minutes, 95%ethanol for 30 minutes for 3 times, 100%ethanol for 45 minutes for 3 times, toluene for 15 minutes for twice, and pre-warmed paraffin for 45 minutes for 3 times. Then samples were embedded in fresh paraffin.

[0108] Human FFPE samples

[0109] All prostate cancer paraffin tissues were obtained from the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University and approved by the ethics committee of the institution. The pathological diagnosis of the patients was confirmed by two experienced pathologists. Briefly, after surgical resection of the tumor, the samples were fixed with formalin for dehydration immediately and then embedded with paraffin. 5 μm thickness sections were prepared and mounted on glass slides for subsequent analysis.

[0110] Lung airway organoid samples

[0111] The lung organoids were cultured in an expansion medium and passaged every 2 to 3 weeks with a ratio between 1: 3 to 1: 10, as described previously. 44 The lung organoids were cultured in the expansion medium for 7-10 days after passaging. To generate apical-out airway organoids, lung organoids were recovered from matrigel and then suspension-cultured in proximal differentiation medium (PneumaCultTM-ALI medium + 10 μM Y-27632 + 10 μM DAPT + 100 μg / mL primocin) in Nunclon Sphera culture plate (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) for 14 days. Differentiated airway organoids were then fixed with 4%PFA in PBS for 1 hour at room temperature before processing.

[0112] Microwave set-up

[0113] A PELCO Pro+ Microwave Processing System (36700, TED PELLA) was used for all the microwave processing in BOOST, with ColdSpot Plus and EM Pro Vacuum Chamber used for specified steps. All the detailed microwave parameters for each step are included in Table 1-3.

[0114] Table 1: Microwave settings for BOOST processes

[0115] Table 2: Additional Microwave settings for BOOST processes

[0116] Table 3: Volume of solutions used for each BOOST processing step

[0117] Immunostaining for cultured cells

[0118] Cells were washed twice with PBS at room temperature, 5 minutes each, on a rocking platform. Then, samples were permeabilized with PBS containing 0.2%Triton X-100 for 10 minutes at room temperature and washed three times with PBS, 5 minutes each, either on a rocking platform or under microwave irradiation (Tables 1 and 2) . Then, samples were blocked using 3%BSA in PBS for 5 minutes under programmed microwave irradiation (Tables 1 and 2) , followed by incubation with primary antibodies diluted (1: 200 dilution) with 1%BSA in PBS for 5 minutes under programmed microwave irradiation (Tables 1 and 2) , then washed three times with PBS, 5 minutes each. Finally, samples were incubated with fluorophore-conjugated secondary antibodies (1: 250 dilution) diluted with 1%BSA in PBS for 5 minutes under programmed microwave irradiation (Tables 1 and 2) and washed in PBS for three times, 5 minutes each. Samples will be used for BOOST.

[0119] FFPE sample preparation

[0120] FFPE sections mounted on glass slides were deparaffined. Briefly, slides were baked in the oven for 1 h at 60℃, incubated in fresh xylene for 10 minutes twice, and then processed at room temperature in the following flow, 3 minutes for each step: xylene × 3, 100%ethanol × 3, 95%ethanol × 1, 70%ethanol × 1, ddH2O × 1, PBS × 3. Antigen retrieval was performed with the slide placed in a microwavable container with the antigen retrieval buffer (Tris / EDTA pH 9) and irradiated with microwave for 30 minutes using the pre-set program (Tables 1 and 2) . The samples were cooled to room temperature and then washed with PBS three times.

[0121] Gelation chamber design

[0122] For sample with thickness < 300 μm (i.e., cells, tissue sections, FFPE, organoids) : Two strips of 300 μm-thick silicone sheet (pre-treated with ethanol to remove impurities) were placed on the parafilm-wrapped or Sigmacote-treated glass slides with appropriate distance left in between for the sample inclusion. The gelation chamber will produce the final gel with a thickness of 300 μm.

[0123] For thick samples (i.e., organoids, whole lymph nodes) : Silicone sheet of appropriate thickness was selected, or several 300 μm-thick silicone sheets could be stacked for a deeper chamber. Then the sheet or stacked sheets were punched with a hole of appropriate size sufficient to cover the entire sample volume.

[0124] BOOST monomer infiltration, anchoring, and gelation

[0125] Cultured cells: Cultured cells on the coverslip were placed in a 12-well plate, incubated with anchoring solution (15%w / v AA, 0.005%w / v bis, 0.65M sodium chloride (NaCl) , and 4%PFA in PBS) for 5 minutes under programmed microwave irradiation (Tables 1 and 2) . Then, the coverslip was placed on the gelation chamber on ice, with the gelation solution (15%w / v AA, 0.005%w / v bis, 0.65M NaCl, 4%PFA, 0.1%w / v TEMED and 0.1%w / v APS in PBS) being mixed well and injected into the space between. The chamber was transferred to the microwave processor for 10 minutes under programmed microwave irradiation (Tables 1 and 2) for gelation. The coverslip with the gel could then be lifted off the chamber, and the gel was cut into a desired size.

[0126] Tissue sections: The 100-μm vibratome-cut section was first washed in PBS supplemented with 0.2%Triton X-100 three times, 5 minutes each. Then it was placed in anchoring solution (17.5%w / v AA, 0.0075%w / v bis, 0.65M NaCl, 4%PFA in PBS) and incubated for 10 minutes under programmed microwave irradiation in a vacuum environment (Tables 1 and 2) . Then, the tissue was transferred to the gelation chamber on ice. A coverslip was placed on the silicone strips to cover the tissue. The gelation solution (17.5%w / v AA, 0.0075%w / v bis, 0.65M NaCl, 4%PFA, 0.1%w / v TEMED and 0.1%w / v APS in PBS) was mixed well and injected into the space between, and transferred to the microwave processor for 10 minutes under programmed microwave irradiation in vacuum environment (Tables 1 and 2) for gelation. The coverslip with the gel could then be lifted off the chamber, and the gel was cut into a desired size.

[0127] FFPE sections: After FFPE pre-processing step, the slide with FFPE section was cut to a desired size, placed in infiltration / anchoring solution (17.5%w / v AA, 0.0075%w / v bis, 0.65M NaCl, and 4%PFA in PBS) and incubated for 15 minutes under programmed microwave irradiation in a vacuum environment (Tables 1 and 2) . Then, the slide was placed on ice, and two 300-μm silicone strips were placed near the tissue section to construct a chamber on the same slide. A Sigmacote-treated coverslip was placed over the tissue section, and the gelation solution (17.5%w / v AA, 0.0075%w / v bis, 0.65M NaCl, 4%PFA, 0.1%w / v TEMED, and 0.1%w / v APS in PBS) was mixed well and injected into the space between. The chamber was then transferred to the microwave processor for 15 minutes under programmed microwave irradiation (Tables 1 and 2) for gelation. The coverslip with the gel could then be lifted off the chamber, and the gel was cut into a desired size.

[0128] Organoids: The fixed organoids were permeabilized for 5 minutes using PBS + 0.5%Triton X-100. Monomer anchoring was then performed in anchoring solution (15%w / v AA, 0.005%w / v bis, 0.65M NaCl, and 4%PFA in PBS) for 20 minutes under programmed microwave irradiation in a vacuum environment (Tables 1 and 2) . Then, the tissue was transferred on the gelation chamber on ice. The gelation solution (17.5%w / v AA, 0.0075%w / v bis, 0.65M NaCl, 4%PFA, 0.1%w / v TEMED, and 0.1%w / v APS in PBS) was mixed well and injected into the chamber space to cover the sample and a coverslip was placed on the silicone sheet to cover the chamber. The chamber was transferred to the microwave processor for 15 minutes under programmed microwave irradiation in vacuum environment (Tables 1 and 2) for gelation. The coverslip with the gel could then be lifted off the chamber, and the gel was cut into a desired size.

[0129] Whole lymph node: The fixed lymph node was permeabilized for 10 minutes using PBS +0.5%Triton X-100. Monomer anchoring was then performed in anchoring solution (17.5%w / v AA, 0.0075%w / v bis, 0.65M NaCl, and 4%PFA in PBS) for 30 minutes under programmed microwave irradiation in a vacuum environment (Tables 1 and 2) . Then, the tissue was transferred on the gelation chamber on ice. The gelation solution (17.5%w / v AA, 0.0075%w / v bis, 0.65M NaCl, 4%PFA, 0.1%w / v TEMED and 0.1%w / v APS in PBS) was mixed well and injected into the space to cover the sample and a coverslip was placed on the silicone sheet to cover the chamber. The chamber was transferred to the microwave processor for 30 minutes under programmed microwave irradiation in a vacuum environment (Tables 1 and 2) for gelation. The coverslip with the gel could then be lifted off the chamber, and the gel was cut into a desired size.

[0130] BOOST denaturation and hydrolysis conversion

[0131] Culture cells and tissue sections: The gel was washed with PBS, then transferred with a paintbrush, into a microwavable vessel containing denaturation buffer (10%w / v SDS, 0.05M boric acid in ddH2O, pH 12) and processed immediately under microwave irradiation for 20 minutes (Tables 1 and 2) . Then, the gel was washed in large volumes of PBS supplemented with 0.1%Tween 20 (PBST) for at least twice, either on a rocking platform or under microwave irradiation (Tables 1 and 2) , 5 minutes each.

[0132] FFPE sections: The slide with the gel was washed with PBS, then placed into a microwavable vessel containing denaturation buffer (10%w / v SDS, 0.05M boric acid in ddH2O, pH 12) and processed with programmed microwave irradiation for 30 minutes (Tables 1 and 2) . The gel would normally detach from the slide in the first 5 minutes, the slide could be removed, and the gel was hydrolyzed for the rest of 25 minutes. Then, the gel was washed in large volumes of PBST for at least twice, 5 minutes each.

[0133] Organoids / Whole lymph nodes: The gel with the organoid / lymph node embedded was washed with PBS, then placed into a microwavable vessel containing denaturation buffer (10%w / v SDS, 0.05M boric acid in ddH2O, pH 12) and processed with programmed microwave irradiation for 30 / 60 minutes (Tables 1 and 2) . Then, the gel was washed in large volumes of PBST for at least twice, 10 minutes each.

[0134] BOOST post-denaturation NHS ester staining

[0135] Cultured cells, tissue sections, and FFPE sections: The denatured gel, after thorough washing, was incubated with ATTO NHS esters diluted in 1: 200 in PBS and / or SYTOX Green dyes diluted in 1: 500 for 15 minutes under microwave irradiation (Tables 1 and 2) . Then, the gel was washed in large volumes of PBST for at least twice either on a rocking platform or under microwave irradiation (Tables 1 and 2) , 5 minutes each.

[0136] Organoids / Whole lymph nodes: The denatured gel after through washing, was incubated with ATTO NHS esters diluted in 1: 200 in PBS and / or SYTOX Green dyes diluted in 1: 500 for 25-50 minutes under microwave irradiation (Tables 1 and 2) . Then, the gel was washed in large volumes of PBST for at least twice, 10 minutes each.

[0137] BOOST immunostaining after hydrolysis and denaturation

[0138] Cultured cells, tissue sections, FFPE sections and organoids: The denatured gel after thorough washing, was incubated in the blocking buffer (3%BSA with 0.2%Triton X-100 in PBS) under microwave irradiation for 10-15 minutes (Tables 1 and 2) . Then, the gel was incubated with primary antibodies diluted (1: 100 dilution) with 1%BSA + 0.1%Triton X-100 in PBS for 10 minutes under programmed microwave irradiation (Tables 1 and 2) . The gel was then washed three times with excessive PBST, 5 minutes each, either on a rocking platform or under microwave irradiation (Tables 1 and 2) . The gel was finally incubated with fluorophore-conjugated secondary antibodies (1: 150 dilution) in 1%BSA + 0.1%Triton X-100 in PBS for 10 minutes under programmed microwave irradiation (Tables 1 and 2) . The gel was then washed at least three times with excessive PBST, 5 minutes each.

[0139] BOOST expansion

[0140] For cultured cells, tissue sections, FFPE sections, organoids and whole lymph nodes, large volume of ddH2O was exchanged every 5-10 minutes, either on a rocking platform or under microwave irradiation (Tables 1 and 2) until fully expanded, usually four exchanges would be sufficient.

[0141] Gel mounting and imaging

[0142] The bottom of plate / dish used for imaging was coated with poly-L-lysine to prevent gel drifting during imaging. Four microscope systems were employed. Epifluorescence images were captured on Keyence X810, using 4× / 0.13 NA air (Fig. 2F and 11) , 10× / 0.45 NA air (Fig. 2G and 12) , 20× / 0.45 NA air (Fig. 13C) . Confocal microscopy and structured illumination microscopy images were captured either using a ZEISS LSM900 upright microscope equipped with Zeiss Plan-Neofluar 2.5× / 0.085 NA air (Fig. 4B and 4E) , Zeiss N-Achroplan 10× / 0.3 NA water immersion (Fig. 4C, 4F, 8, and 14F) , Zeiss Plan-Apochromat 40× / 1.0 NA water immersion (Fig. 2E, 2H, 3G, 3J, 3K, 4C, 4G, 5C, 6A, 6B, 7A, 8, 9, 10A, 14B, 14C, 14D, and 14E) objectives or a Vt-iSIM inverted microscope equipped with Olympus UPLSAPO60XW 60× / 1.20 NA water immersion objective (Fig. 2C, 2D, 3C, 3E, 3F, 7B, 13A, 13B, and 14A) . In addition, tested tile images were captured using a LiTone LBS Light-sheet Microscope equipped with a Nikon 16× / 0.80 NA water dipping objective (Fig. 10B) .

[0143] Assessing hydrolysis conditions in protein and morphology preservation

[0144] The workflows were adapted as previously reported27 except for the hydrolysis step modified into three conditions (i.e., pH 10, pH 11, and pH 12) for the evaluation of morphological difference and protein retention under 20-minute microwave. Fixed liver slices were first incubated in a monomer solution (30%w / v AA, 0.01%w / v bis, 0.65 M NaCl, 4%w / v PFA, and 0.1%w / v TEMED in PBS) at room temperature for 3 hours. Then, the tissue was transferred to the gelation chamber (monomer solution with 0.1%w / v APS) . A coverslip was placed on the silicone strips to cover the tissue and the fresh gelation solution was injected into the space between. The chamber was then placed at room temperature for 40 minutes to complete gelation, and the gel was cut into appropriate sizes and recovered in PBS. For the modified hydrolysis, hydrolysis buffer (0.2M SDS, 0.05M boric acid in DI water) for three pH conditions: pH 10, pH 11, and pH 12, was prepared separately. The recovered gel was then transferred with a paintbrush, into a microwavable vessel containing denaturation buffer of specified pH value and processed immediately under microwave irradiation for 20 minutes (Tables 1 and 2) . The denatured gel was then washed in PBS four times, 1 hour each. The washed gel was stained with ATTO 565 NHS ester diluted 1: 200 in PBS for 1 hour at room temperature, then washed in ddH2O three times, 15 minutes each, followed by an exchange of ddH2O every hour to a fully expanded state for imaging.

[0145] Optimization of microwave-assisted anchoring

[0146] The workflows were adapted from previously published 3 except for the anchoring step modified into four conditions (i.e., no anchoring, 10-minute microwave, 20-minute microwave, and the standard TREx protocol of 1-hour incubation) for the evaluation of AcX effectiveness under microwave. For standard TREx anchoring, liver sections were incubated in 100 μg / mL AcX diluted in PBS for 1 hour at room temperature. For modified microwave-assisted anchoring, liver sections were incubated in 100 μg / mL AcX diluted in PBS and processed in a microwave processor for 10 minutes and 20 minutes (Tables 1 and 2) , respectively. After the anchoring step, the sections were rinsed in PBS. Later incubated in TREx gelation solution (10.34%w / v SA, 14.22%w / v AA, 0.005%w / v bis, 0.15%w / v APS, 0.15%w / v TEMED, 0.0015%w / v TEMPO in PBS) for 20 minutes on ice. Then, the tissue section was transferred on the gelation chamber on ice. A coverslip was placed on the silicone strips to cover the tissue. The fresh gelation solution was then injected into the space between. The chamber was placed in a 37℃incubator for 1 hour to complete gelation, and the gel was cut into appropriate sizes and recovered in PBS. Gel was then placed into TREx disruption buffer (5%w / v SDS, 0.2M NaCl, 0.05M Tris in ddH2O, pH 7.5) in a tube and the tube was transferred to an incubator set at 80℃for 3 hours. The denatured gel was then recovered in 0.4M NaCl followed by two washes in PBS, 30 minutes each. The washed gel was stained with ATTO 565 NHS ester diluted 1: 200 in PBS, then washed in ddH2O three times, 15 minutes each, followed by an exchange of ddH2O every hour to a fully expanded state for imaging.

[0147] Standard post-denaturation immunostaining for FFPE sample

[0148] The denatured FFPE gel after thorough washing, was incubated in the blocking buffer (3%BSA with 0.2%Triton X-100 in PBS) at room temperature for 3 hours. Then, the gel was incubated with primary antibodies diluted (1: 100 dilution) with 1%BSA + 0.1%Triton X-100 in PBS overnight at 4℃. The gel was then washed three times with excessive PBST, 30 minutes each, on a rocking platform. The gel was finally incubated with fluorophore-conjugated secondary antibodies (1: 150 dilution) in 1%BSA + 0.1%Triton X-100 in PBS for 3 hours at room temperature. The gel was then washed at least three times with excessive PBST, 30 minutes each.

[0149] Expansion factor determination

[0150] Three strategies were used to determine expansion factors (Fig. 15) . First being the linear measurement of the longest distance of the unexpanded gel and expanded gel, second being the square root of the area ratio of the gel size in two states and lastly being the cell nucleus size quantification based on pre-BOOST SYTOX Green, NHS ester staining or NUP immunostaining of unexpanded and expanded images.

[0151] Sparse deconvolution

[0152] The pre-BOOST images used for distortion analysis (Fig. 3C and 3G) were processed using Sparse deconvolution to improve the resolution for more accurate distortion analysis. 41 For Fig. 3C, Sparse iteration was set to 100, image fidelity was set to 1000, and sparsity was set to 100 with 10 deconvolution times. For Fig. 3G, Sparse iteration was set to 100, image fidelity was set to 500, and sparsity was set to 50 with 10 deconvolution times.

[0153] Distortion and RMSE analysis

[0154] The unexpanded and expanded image distortion was evaluated using B-spline transformation in Elastix, and RMSE was analyzed according to protocols and script offered by Vaughan’s group. 45

[0155] Deformation index (DI) analysis

[0156] Blank gel was formed in a gelation chamber with a thickness of 800 μm, a 4 mm diameter region was punched to produce a circular gel, then hydrolysis was performed (only for BOOST formulations) , and gel was expanded to a fully expanded state. To calculate the DI, the gel was cut in half and stood against the ruler wall (with the curved side facing downwards to allow the flat surface to deform) , images were taken and later processed in ImageJ for measurement of the best-fit deformed circle. Two BOOST formulations were used (17.5%w / v AA  / 0.0075%w / v bis; 15%w / v AA  / 0.005%w / v bis) , and the original TREx formulation was also evaluated (10.34%w / v SA, 14.22%w / v AA, 0.005%w / v bis, 0.15%w / v APS, 0.15%w / v TEMED in PBS) .

[0157] Results

[0158] BOOST chemistry and workflow

[0159] A series of microwave-assisted chemistry and protocols were developed for the whole workflow of ExM, from anchoring, gelation, denaturation, wash and expansion. The running time for various sample types varies while shortening the expansion process for all sample types to under two hours (Fig. 1A) . When compared to other protocols to date 3-5, 25, 27, there has been a significant reduction in the amount of time used, making it about 6-40 times faster (Fig. 1B) , while achieving ～10-fold single step linear expansion factor. Hence, the developed ExM protocol was termed BOOST.

[0160] At the early stage of the development, the hydrogel chemistry was selected without SA addition due to reported problems, such as quality inconsistency of different sources and SA-induced tissue shrinkage. 5, 27, 28 An acrylamide-only gel recipe introduced by ZOOM27 based on 30% (w / v) acrylamide (AA) and a cross-linking agent 0.01% (w / v) N, N’ -methylenebisacrylamide (bis) was initially employed here to develop the early microwave-compatible gelation and denaturation processes. For the gelation process, like conventional polyacrylamide gels, bis crosslinks polymer chains to the network under free radical polymerization, 29 which can be accelerated by low-energy microwave irradiation23 and it was subsequently confirmed by carrying out the gelation process under microwave using the acrylamide-only gel recipe (Fig. 1C) . For the denaturation process, as SA is absent in the crosslinked hydrogel, simultaneous hydrogel hydrolysis is required to transform the neutral polyacrylamide gel into a swellable polyelectrolyte hydrogel, facilitating the expansion process (Fig. 1C) , which can also be theoretically assisted with microwave irradiation under alkaline conditions. 30 To validate, hydrolysis of the crosslinked blank hydrogel (30%w / v AA + 0.01%w / v bis) was tested with an alkaline buffer with pH ranging from 9 to 12 under microwave irradiation, a maximal pH of 12 was chosen here for 12 is the highest pH reported for non-destructive treatment proteins. 31 An increase in expansion factor (EF) was observed with the increasing pH, reaching a maximum of ～5× EF (Fig. 5A) . The findings also indicate that a 20-minute duration is sufficient to achieve the maximum EF for this specific gel formulation (Fig. 5B) . Simultaneous to hydrogel hydrolysis, anchored proteins need to be digested to ensure uniform expansion. A denaturation method was designed based on heat and chaotropic reagent, sodium dodecyl sulfate (SDS) , which is a recognized method from SDS-PAGE32 and microwave compatible, 22 and is being suggested to facilitate better epitope preservation for better immunostaining. 28, 33 Therefore 10%w / v SDS was also employed in the hydrolysis buffer. Toward intact morphology and protein preservation, the impact of hydrolysis buffer pH on the preservation of morphology and proteins with samples embedded was evaluated. N-Hydroxysuccinimide (NHS) ester staining was performed on ZOOM-processed mouse liver sections and observed no significant differences in protein intensity or morphology across the tested pH range under microwave hydrolysis (pH 10 to pH 12) (Fig. 5C) .

[0161] In addition to the microwave-adapted gelation and hydrolysis step, a microwave-compatible anchoring strategy was designed to maximize biomolecular tethering to the hydrogel within a limited time. The widely used anchoring strategy by Acroylol-X (AcX) 28 was tested to see if it is compatible with microwave irradiation. The Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx) protocol3 was used in this case with only the anchoring step being modified into several testing conditions (Fig. 6A) . Notably, microwaved samples exhibited inferior preservation compared to the standard AcX-incubated samples. Instead, the microwaved samples resembled the one without any anchoring, suggesting that the acceleration of AcX and amine reactions was ineffective under microwave conditions (Fig. 6A) . Different anchoring strategies were tested (Fig. 6B) and finalized with a microwave-assisted anchoring strategy of 30%AA + 4%PFA. 26 In this anchoring strategy, amine groups on biomolecules are initially modified by PFA to form a reactive methylol group (Fig. 1D) , which further reacts with surrounding excess acrylamide monomers to form a protein with a gel-reactive group that is later anchored to the gel matrix during polymerization (Fig. 1E) . 26, 34 The acceleration of anchoring methods using PFA and AA is useful for the protein fixation with improved effectiveness and uniformity under microwave irradiation35, ensuring that reactive methylols are rapidly available for further acrylamide reactions.

[0162] To achieve higher resolution, the gel formulation was developed to increase EFs while preserving adequate gel mechanical properties. Gel formulations with various AA and bis concentrations were tested (Fig. 1F) . The mechanical property measured by deformation index (DI) and corresponding expansion factor of blank gels of the selected formulas were measured and calculated3 (Fig. 1G) , and the lowest DI of 0.05 was achieved by 17.5%w / v AA / 0.0075%w / v bis recipe with an EF of 9.6×, and the largest EF of 10.5× was achieved by 15%w / v AA / 0.005%w / v bis formula with DI of 0.13. Both DIs indicate an overall stronger gel compared with the TREx formula, which obtained a DI of above 0.20 at a 10× expanded state (Fig. 1G) . The results obtained from the DI values of the selected formulas (0.05 and 0.13) demonstrate that they exhibit satisfactory mechanical strength. 3 The highest EF formula is potentially ideal for cultured cell samples, whereas the high mechanical strength formula could be used for larger tissue samples, which would need firmer gel for handling and transfer.

[0163] BOOST reveals ultrastructural details of cultured cells, tissue sections, and FFPE samples

[0164] To visualize the overall high-quality morphology with less time spent on staining, microwave-compatible proteomic covalent staining were tested with NHS esters and nucleic acid staining with SYTOX Green for a wide range of biological samples (e.g., cultured cells, tissue sections, and mouse and human FFPE samples) (Fig. 2A) . As a result, 4-12 times faster morphological staining was achieved compared to other reported methods (Fig. 2B) . 2-4, 6, 7

[0165] For cultured cells, U2-OS cells were stained with ATTO 488 NHS ester under two staining conditions (i.e., 1 hour at room temperature as previous protocols suggested3, 4, 6 and 10 minutes under microwave irradiation) . No significant differences were found in the staining (Fig. 7A) , both revealed ultrastructural details of organelles such as mitochondria by their morphological characteristics. Three NHS esters that are conjugated with ATTO dyes (ATTO 488, ATTO 565, ATTO 647N) owning different hydrophobicity on expanded U2-OS cells were tested. Variations in the intensity of the nucleus labeling amongst the three were observed, but all NHS esters were compatible with microwave irradiation and showed no major difference in the mitochondria structure visualization (Fig. 7B) . It was established that the post-BOOST proteomic staining by NHS ester dyes with simultaneous SYTOX Green staining under the microwave. The staining time is 15 minutes for all three types of samples (Fig. 2A) , which is considerably shorter than other protocols for post-processing proteomic staining (Fig. 2B) . Using BOOST with the proteomic staining strategy, a mitosis U2-OS cell with down to 25 nm resolution (Fig. 2C) was visualized. SYTOX Green and NHS ester staining was visualized and showed complementary structures of nucleolus, outlined by the differential compartment labeling in the nucleolar granular components (Fig. 2D) .

[0166] For tissue sections, rapid and homogenous NHS ester staining on various types of 100-μm thick vibratome-cut mouse tissues was demonstrated. In the mouse brain, well-resolved postsynaptic densities and presynaptic dense projections (Fig. 2E (i) ) was observed. In the mouse testicle, BOOST resolved the annulus dividing the midpiece and principal piece of sperm (Fig. 2E (ii) ) . Nuclear envelopes with densely stained nuclear pore complexes as well as the endoplasmic reticulum and mitochondria in hepatocytes, were clearly discernable (Fig. 2E (iii) ) . In mouse cardiomyocytes, the densely labeled A-band was observed with the intercalated M-line (Fig. 2E (iv) ) . The podocyte foot processes and continuous glomerular basement membrane were clearly distinguishable in the mouse kidney (Fig. 2E (v) ) . Besides these nanoscopic details, it was also validated that the preservation of integrity on a larger scale across a wide range of types of tissues (Fig. 8A) .

[0167] Unlike the high-quality lateral visualization, the uniform staining of thick tissue throughout the thickness always poses an issue, even staining at the expanded state. 7 Notably, it was observed that a greatly increased staining uniformity of a 100-μm thick section under 15-minute microwave processing compared to 1-hour incubation under standard conditions (Fig. 8B) , likely due to the microwave enables increased diffusion and simultaneously, the NHS ester and amine reaction rate. 37 With the uniform staining in thick tissues, it was demonstrated that the preservation of nanoscale structural integrity in 3D (Fig. 9) . It was demonstrated that the use of BOOST to visualize tangling sperms within the mouse testicle, the continuous glomerular basement membrane, and the ultrastructure in cardiomyocytes (Fig. 9) . In addition to the single NHS strategy, the dual NHS ester labeling approach was found to label complementary ultrastructures36 and potentially enable better visualization of morphological contrasts. It was tested that dual NHS ester labeling for expanded tissue sections such as brain (Fig. 10A) and kidney (Fig. 10B) . It was observed that different NHS ester stained different structures (Fig. 10) , in particular, ATTO 565 NHS ester showed strong labeling signals on the nucleus (Fig. 10) .

[0168] Importantly, BOOST was utilized with FFPE samples. As FFPE samples have a highly cross-linked nature, 38 a step of 30-minute microwave-assisted antigen retrieval step in Tris-EDTA buffer (pH 9) was integrated before anchoring to reverse heavy chemical crosslinks. The role of microwave treatment for antigen retrieval has been established. 16, 39 It was verified that the importance of the antigen retrieval step for the BOOST; absence or insufficient antigen retrieval would lead to insufficient anchoring, therefore, fractures at an expanded state (Fig. 11) . The mouse lung tumor FFPE sample was tested and found the whole section was well expanded by BOOST, with the ultrastructural details of the tumor region being clearly discerned (Fig. 2F) . BOOST on the human prostate tumor FFPE samples was tested; after processing the sample, the morphology (NHS ester staining) of the tumor region was revealed with drastically improved details using the same microscope setup (Fig. 2G) , with mitochondria in the prostate cancer cells also became discernable (Fig. 2H) . To evaluate the distortion over a large scale of FFPE samples, the sample distortion was analyzed after BOOST processing on a millimeter macroscale using mouse lung and human prostate FFPE samples stained with NHS ester. Low distortion was confirmed with under 2%over a millimeter (Fig. 12) .

[0169] BOOST is compatible and accelerates immunostaining

[0170] Microwave-accelerated immunostaining for three types of gel-embedded biological samples (i.e., cultured cells, tissue sections, and FFPE sections) (Fig. 3A) were tested. Microwave-accelerated immunohistostaining, immunocytochemistry, and immunofluorescence have long been tested15, 18, 24, 40 and benefits with microwave irradiation during antigen-antibody incubation were also verified. 17 The microwave-assisted immunostaining of gel-embedded samples was achieved within an hour (Fig. 3B) , which was ～10-80 times faster than other protocols for immunostaining of gel-embedded samples. 2, 4, 25, 27

[0171] To ensure the structures were uniformly expanded on the nanoscale, the error introduced by expansion by comparing microtubules immunostained and imaged before and after BOOST were quantified (Fig. 3C) . The pre-BOOST images were processed with Sparse deconvolution41 to enhance the resolution for more accurate distortion assessments. The distortion measured was under 3%across the 10 μm distance measured, indicating low distortions (Fig. 3D) .

[0172] It was verified that BOOST is compatible with immunostaining both before and after the expansion procedure, with immunostaining after the expansion procedure producing strong signals (Fig. 13A and 13B) . This is consistent with works of molecular decrowding with ExM to improve epitope accessibility and to get better immunostaining results. 10, 33 It was hypothesized that immunostaining after BOOST would be a preferred method to achieve improved staining results.

[0173] BOOST was validated by staining ultrastructural details in cells that were not distinguishable using conventional optical microscopes at a non-expanded state. It was demonstrated that the visualization of nuclear pores using immunostaining with antibodies for nuclear pore complex (NPC) (anti-NUP 153 and anti-NUP 96) (Fig. 3E) . It was quantified that 120 NPCs measured from four replicates (Fig. 3F) and obtained NPC sizes of 964 nm ± 53 nm (99.5 nm ± 5.5 nm when translated into original size using average EF = 9.7×) . This further translates the local EF of 9.0× calculated from NPC sizes of 107 nm, with a 7.7%deviation from the average EF determined with the macroscopic method, which is more than acceptable as suggested by TREx. 3 The microscopic distortion of BOOST when applied to more complex FFPE samples was further evaluated. Pre-BOOST and post-BOOST images stained with keratin antibody and nuclear stain (Fig. 3G) was compared and found the distortion was in the range of 1-2% (Fig. 3H-3I) across 100 μm assessed, showing more than acceptable level of distortions.

[0174] Next, the microwave-accelerated post-BOOST immunostaining procedure was tested for other types of samples. For 100 μm mouse tissue sections, post-BOOST epitope preservation and immunolabeling were verified using caveolin-1 to visualize cardiac blood vessels (Fig. 3J (i) ) , vimentin to stain kidney podocytes (Fig. 3J (ii) ) , and synaptophysin to label the neuron synapses (Fig. 3J (iii) ) . For human FFPE samples, post-BOOST immunolabeling was used to visualize five protein markers (i.e., keratin, caveolin-1, vimentin, α-tubulin, and ATPIF1) in prostate tumors (Fig. 3K (i) , (ii) , (iii) , (iv) and (v) ) . Antibody specificity under microwave acceleration with post-BOOST staining was validated with secondary antibody-only negative controls for the above specimens (Fig. 14) . Microwave-accelerated immunostaining and standard 2-day immunostaining using post-BOOST FFPE human prostate cancer section at a ～2-fold expansion state was compared. Identical staining patterns against α-tubulin and prostate-specific membrane antigen (PSMA) was observed (Fig. 13C) .

[0175] BOOST is capable of rapidly expanding large samples to ～10-fold

[0176] The anchoring, gelation, hydrolysis, and wash and expand steps of BOOST were adjusted to expand larger biological samples with original sizes ranging from hundreds of micrometers to a few millimeters and achieved ～10× expansion and obtained millimeter-to-centimeter-size expanded samples, which has not been reported by any current protocols. The homogenous expansion of organoids and whole lymph nodes was demonstrated, which only took ～2 hours and ～3 hours, respectively (Fig. 4A) .

[0177] Specifically, BOOST was demonstrated to characterize the cellular composition and organization in three dimensions and morphology and ultrastructure of ～500 μm airway organoids with an EF of 10.1× when employing 15%w / v AA  / 0.005%w / v bis gel formulation. With the staining of SYTOX Green and NHS ester, the 3D morphology of the whole organoid in detail (Fig. 4B) was reconstructed. Combining microwave-assisted immunostaining, the distribution of β-tubulin IV on cilia of the airway organoid was visualized, and the microtubule structures within the cilia were also discernable (Fig. 4C) .

[0178] It was further demonstrated that the capability of BOOST to expand even larger samples, using lymph nodes in the range of several millimeters. The robustness of BOOST enabled millimeter-sized samples to achieve an EF beyond just 4× by existing techniques involving millimeter-sized sample. 12, 13 The BOOST protocol in the processing time for sufficient anchoring, gelation, hydrolysis, and staining was adjusted to achieve whole lymph node visualization at ～9× fold with 17.5%w / v AA  / 0.0075%w / v bis gel formulation in ～4.5 hours (Fig. 4A) . The embedding of a lymph node with a measured vertical size of 1.95 mm was demonstrated; the lymph node was later expanded to 2.8-fold in PBS after denaturation / hydrolysis; and a further expansion in water led to a final vertical size of ～1.75 cm, indicating a 9× macroscopic EF with almost transparent appearance under normal lighting (Fig. 4D) . Proteomic staining was then combined to image the 3D morphology of the whole lymph node in detail; it was imaged across the middle region of the lymph node to confirm the uniformity of the NHS ester labeling (Fig. 4E) . A further magnified region was imaged to visualize morphological details of the expanded lymph node (Fig. 4F-4G) . Hence, BOOST achieved a ～10-fold expansion of millimeter-sized three-dimensional samples that was not feasible before.

[0179] Discussion

[0180] A new hour-scale and robust workflow for expanding diverse biological specimens to boost ExM's throughput and adoption in biological investigations (Fig. 12) . BOOST has made significant advances in the following aspects: (1) BOOST has dramatically improved the throughput of ExM by innovatively using a series of microwave-assisted chemistries for all major ExM procedures (i.e., monomer infiltration, anchoring, gelation, denaturation, staining, and expansion) . (2) BOOST is highly robust and versatile. It uses common reagents and instruments, and it works effectively on various sample types, including cultured cells, tissues, organoids, and FFPE samples, and is also compatible with morphological staining and immunostaining. (3) BOOST has pioneered the single-step ～10-fold linear expansion of millimeter-sized large 3D biological specimens.

[0181] The improved throughput of BOOST was achieved largely due to the innovative implementation of microwave-compatible ExM chemistries. Microwave irradiation accelerates mainly monomer infiltration, anchoring, gelation, denaturation / hydrolysis, and staining chemistries, with the most significant acceleration for the denaturation step. The improvement in the throughput was particularly evident for expanding FFPE samples, as previously a homogenous linear expansion of 10-fold for FFPE samples was achieved by Magnify. BOOST reduced the whole workflow from days in Magnify4 to less than 4 hours, inclusive of staining for ultrastructure and proteins of interest. The significant enhancement in throughput may facilitate time-sensitive applications, such as nanoscale pathology. Researchers have previously utilized ExM techniques to obtain ultrastructural details in renal pathological samples yet only with 4-fold expansion. 8, 42 This reduction in processing times, when coupled with 10-fold expansion, could provide a crucial advantage for clinical applications.

[0182] The robustness and versatility of BOOST were demonstrated by the gel rigidity, non-proteolytic digestion, and compatibility with various samples and different staining protocols. Importantly, BOOST utilized a simple gel formulation with only AA and bis and avoided SA, a gel monomer present in most ExM gel formulations to date. 28 The absence of SA helps to avoid potential issues, such as variable impurities from vendors, potential tissue shrinkage, and uneven distribution of ionic residues, as reported by other studies. 4, 27, 28 The use of heat and chaotropic reagents for denaturation improved epitope preservation and enabled high-quality post-expansion staining facilitated by protein decrowding. 26, 28, 33 All the reagents used in the BOOST workflow are reliable and easily accessible, which could potentially boost the adoption of the technique for biological investigations.

[0183] It is noteworthy that BOOST successfully accomplished a single-step ～10-fold expansion of large 3D biological specimens, a task previously unattainable. This improvement is likely attributable to the enhanced monomer infiltration, anchoring, homogenous gelation, and denaturing within large specimens facilitated by microwave irradiation. In contrast to conventional 2D imaging of tissue sections, 3D imaging excels in capturing the intricacy of biological samples. The advanced capabilities of 3D imaging are crucial for comprehending cellular composition, and interactions between cells in intact biological samples. Microscopy imaging of large 3D volumes remains challenging. To attain large volumes of 3D information, BOOST could be coupled with a light sheet microscope equipped with an objective that is designed to achieve a large working distance with good NA for fast and detailed acquisition. The expansion factor using a salinity gradient to achieve the mapping of desired volumes and resolution for specific applications was also adjusted. For instance, a macroscale overview at a shrunken state in high salinity conditions and then locate the targeted region of interest for higher resolution imaging at a fully expanded state could be performed.

[0184] In developing the current BOOST protocol, our primary focus was on enhancing the speed and reliability of major ExM steps. To foster the future adoption of BOOST in both research and clinical settings, several potential advancements could be explored. For instance, compatibility with immunostaining and preservation of proteins was demonstrated. Validation of the preservation of other biomolecules, such as RNA, should be considered. The processing of a broad range of sample types and developed detailed protocols in this study was demonstrated, but specific types of tissues may require further optimization. The application of microwave-assisted processing may also be extended to other steps of the workflow, including long-verified sample fixation and washing. 19 Additionally, the integration of computational methods with BOOST could potentially enhance resolution to a further scale, which may prove advantageous for specific applications.

[0185] References

[0186] 1. Chen, F., Tillberg, P.W. &Boyden, E.S. Expansion microscopy. Science 347, 543-548 (2015) .

[0187] 2. Louvel, V. et al. iU-ExM: nanoscopy of organelles and tissues with iterative ultrastructure expansion microscopy. Nature Communications 14, 7893 (2023) .

[0188] 3. Damstra, H.G. et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx) . eLife 11, e73775 (2022) .

[0189] 4. Klimas, A. et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology 41, 858-869 (2023) .

[0190] 5. Truckenbrodt, S. et al. X10 expansion microscopy enables 25‐nm resolution on conventional microscopes. EMBO reports 19, e45836 (2018) .

[0191] 6. M’Saad, O. &Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications 11, 3850 (2020) .

[0192] 7. Mao, C. et al. Feature-rich covalent stains for super-resolution and cleared tissue fluorescence microscopy. Science Advances 6, eaba4542 (2020) .

[0193] 8. Kylies, D. et al. Expansion-enhanced super-resolution radial fluctuations enable nanoscale molecular profiling of pathology specimens. Nature Nanotechnology 18, 336-342 (2023) .

[0194] 9. Shaib, A.H. et al. Visualizing proteins by expansion microscopy. bioRxiv, 2022.502284 (2023) .

[0195] 10. Sarkar, D. et al. Revealing nanostructures in brain tissue via protein decrowding by iterative expansion microscopy. Nature Biomedical Engineering 6, 1057-1073 (2022) .

[0196] 11. Pownall, M.E. et al. Chromatin expansion microscopy reveals nanoscale organization of transcription and chromatin. Science 381, 92-100 (2023) .

[0197] 12. Sim, J. et al. Nanoscale resolution imaging of the whole mouse embryos and larval zebrafish using expansion microscopy. bioRxiv, 2021.2005.2018.443629 (2021) .

[0198] 13. Steib, E. et al. TissUExM enables quantitative ultrastructural analysis in whole vertebrate embryos by expansion microscopy. Cell Reports Methods 2, 100311 (2022) .

[0199] 14. Amrutha, N. Microwaves: A Revolution in Histoprocessing. The Journal of Contemporary Dental Practice 15, 149-152 (2014) .

[0200] 15. Boon, M.E. &Kok, L.P. Microwaves for immunohistochemistry. Micron 25, 151-170 (1994) .

[0201] 16. Cuevas, E.C. et al. Microwave antigen retrieval in immunocytochemistry: a study of 80 antibodies. Journal of Clinical Pathology 47, 448-452 (1994) .

[0202] 17. Jackson, P., Lalani, E.N. &Boutsen, J. Microwave-stimulated immunogold silver staining. The Histochemical Journal 20-20, 353-358 (1988) .

[0203] 18. Hougaard, D.M., Larsson, L.I. &Tornehave, D. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology 113, 0019-0023 (2000) .

[0204] 19. Leong, A.S.Y. &Sormunen, R.T. Microwave Procedures for Electron Microscopy and Resin-Embedded Sections. Micron 29, 397-409 (1998) .

[0205] 20. Mayers, C.P. Histological fixation by microwave heating. Journal of Clinical Pathology 23, 273-275 (1970) .

[0206] 21. Leong, A.S.Y. Microwaves and Turnaround Times in Histoprocessing. American Journal of Clinical Pathology 121, 460-462 (2004) .

[0207] 22. Horscroft, N.J. &Roy, P. Thermal Denaturation of Proteins for SDS-PAGE Analysis by Microwave Irradiation. BioTechniques 22, 224-226 (1997) .

[0208] 23. Cook, J.P., Goodall, G.W., Khutoryanskaya, O.V. &Khutoryanskiy, V.V. Microwave‐Assisted Hydrogel Synthesis: A New Method for Crosslinking Polymers in Aqueous Solutions. Macromolecular Rapid Communications 33, 332-336 (2012) .

[0209] 24.  T.E., Giberson, R.T., Demaree, R. &Day, J.R. Microwave-assisted immunostaining: a new approach yields fast and consistent results. Journal of Neuroscience Methods 137, 133-139 (2004) .

[0210] 25. Tillberg, P.W. et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology 34, 987-992 (2016) .

[0211] 26. Ku, T. et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology 34, 973-981 (2016) .

[0212] 27. Park, H.E. et al. Scalable and Isotropic Expansion of Tissues with Simply Tunable Expansion Ratio. Advanced Science 6, 1901673 (2019) .

[0213] 28. Truckenbrodt, S. Expansion Microscopy: Super-Resolution Imaging with Hydrogels. Analytical Chemistry 95, 3-32 (2023) .

[0214] 29. Zhou, Y. &Jin, L. Hydrolysis-induced large swelling of polyacrylamide hydrogels. Soft Matter 16, 5740-5749 (2020) .

[0215] 30. Hussam-Aldeen Kalaleh, M. T., Yomen Atassi Preparation of poly (sodium acrylate-co-acrylamide) superabsorbent copolymer via alkaline hydrolysis of acrylamide using microwave irradiation. arXiv, 1502.03639 (2015) .

[0216] 31. Xiao, N., Chen, Y., Chen, A. &Feng, L. Enhanced Bio-hydrogen Production from Protein Wastewater by Altering Protein Structure and Amino Acids Acidification Type. Scientific Reports 4, 3992 (2014) .

[0217] 32. Laemmli, U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, 680-685 (1970) .

[0218] 33. Valdes, P.A. et al. Improved immunostaining of nanostructures and cells in human brain specimens through expansion-mediated protein decrowding. Science Translational Medicine 16, eabo0049 (2024) .

[0219] 34. Lai, H.M. et al. Rationalisation and Validation of an Acrylamide-Free Procedure in Three-Dimensional Histological Imaging. PLOS ONE 11, e0158628 (2016) .

[0220] 35. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Cell Biology 2016, 1-9 (2016) .

[0221] 36. Sheard, T.M.D. et al. Differential labelling of human sub-cellular compartments with fluorescent dye esters and expansion microscopy. Nanoscale 15, 18489-18499 (2023) .

[0222] 37. Lee, J.H. et al. Rapid and Facile Microwave‐Assisted Surface Chemistry for Functionalized Microarray Slides. Advanced Functional Materials 22, 872-878 (2012) .

[0223] 38. Hoffman, E.A., Frey, B.L., Smith, L.M. &Auble, D.T. Formaldehyde Crosslinking: A Tool for the Study of Chromatin Complexes. Journal of Biological Chemistry 290, 26404-26411 (2015) .

[0224] 39. Leong, A.S.Y. Microwaves in diagnostic immunohistochemistry. European Journal of Morphology 34, 381-384 (1996) .

[0225] 40. Katoh, K. Rapid fixation and immunofluorescent staining of cultured cells using microwave irradiation. Journal of Histotechnology 34, 29-34 (2011) .

[0226] 41. Zhao, W. et al. Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy. Nature Biotechnology 40, 606-617 (2022) .

[0227] 42. Bucur, O. &Zhao, Y. Nanoscale Imaging of Kidney Glomeruli Using Expansion Pathology. Frontiers in Medicine 5, 00322 (2018) .

[0228] 43. Thevathasan, J.V. et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods 16, 1045-1053 (2019) .

[0229] 44. Chiu, M.C. et al. A bipotential organoid model of respiratory epithelium recapitulates high infectivity of SARS-CoV-2 Omicron variant. Cell Discovery 8, 57 (2022) .

[0230] 45. Chozinski, T.J. et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods 13, 485-488 (2016) .

[0231] 46. Bullard, et al.

[0232] bioRxiv 2024.05.11.593228; doi: https:  / / doi. org / 10.1101 / 2024.05.11.593228 Those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments of the invention described herein. Such equivalents are intended to be encompassed by the following claims.

Claims

1.A method for imagining biomolecules in a sample under microwave irradiation, comprising the steps of:subjecting the sample to conjugation with the biomolecules within the sample through fixatives to preserve structural and molecular information, then(i) anchor: anchoring the biomolecules within the sample with one or more anchoring reagent to form gel-reactive chemical groups;(ii) gelation: subjecting the sample, a first one or more monomer, and a one or more crosslinker agent to gelation, forming a swellable neutral material, wherein the gel-reactive chemical groups of the biomolecules within the sample are further anchored to the swellable neutral material;(iii) denaturation and hydrolysis: subjecting the sample to denaturation and the swellable neutral material to hydrolysis to form a swellable polyelectrolyte material;(iv) expansion: swelling the swellable polyelectrolyte material to form an expanded sample;(v) stain: staining the sample either before or after steps (i) (ii) , (iii) , or (iv) ; and(vi) image: imaging the expanded sample.wherein the microwave irradiation accelerates steps (i) , (ii) , (iii) , (iv) , and / or (v) in comparison to these steps being conducted without microwave irradiation;wherein the method is completed no more than 3.0 hours; andthe method achieves at most 25-fold single step linear expansion factor.2.The method of claim 1, wherein the sample is a cell, tissue slice or block, lymph node, organoid, or a Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) sample.3.The method of claims 1 or 2, wherein the biomolecule is a protein or a nucleic acid.4.The method of any one of claims 1-3 wherein the first one or more monomers are methacrylates, acrylates, acrylamides, acrylic acids and / or its salt derivatives, monoalkylacrylamides including but not limited to methyl, ethyl, propyl or isopropyl acrylamide or N, N-dimethylacrylamide 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acids and its salt derivatives, dialkylacrylamides such as dimethylacrylamide and diethylacrylamides, or vinyl alcohols.5.The method of any one of claims 1-4, wherein the one or more crosslinker agent is N, N’-methylenebisacrylamide, N, N’-ethylenebisacrylamide, N, N’- (Propane-1, 3-diyl) diacrylamide, N, N’ (Butane-1, 4-diyl) diacrylamide, N, N’ hexamethylenebisacrylamide, N, N'- (1, 2-Dihydroxyethylene) bisacrylamide, piperazine diacrylamide, hexahydro-1, 3, 5-tris (1-oxoallyl) -1, 3, 5-triazine, N, N'- (Disulfanediylbis (ethane-2, 1-diyl) ) diacrylamide, poly (ethylene glycol) diacrylamide, N, N- (2-amino-1, 4-phenylene) diacrylamide, or N, N'- (2-Aminopropane-1, 3-diyl) diacrylamide.6.The method of any one of claims 1-5, wherein during step (i) amine groups on the biomolecules reacts with an anchoring reagent to form a reactive group, which further reacts with a second one or more monomer to form the stable anchor.7.The method of claim 6, wherein the second one or more monomer are methacrylates, acrylates, acrylamides, acrylic acids and / or its salt derivatives, monoalkylacrylamides including but not limited to methyl, ethyl, propyl or isopropyl acrylamides or N, N-dimethylacrylamide 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acids and its salt derivatives, dialkylacrylamides such as dimethylacrylamide and diethylacrylamides, or vinyl alcohols.8.The method of claims 6 or 7, wherein during step (ii) promotes free radical polymerization between the first one or more monomer and the one or more crosslinker agent to form the swellable neutral material and the microwave irradiation promotes biomolecular tethering of the biomolecules to the swellable neutral material by improving infiltration of the first one or more monomer and the second one or more monomer into the swellable neutral material.9.The method of claim 6, wherein the anchoring reagent is bifunctional or multifunctional molecules such as aldehydes and / or acrylamide mixture, epoxides, glutaraldehyde, Acrylic acid N-hydroxysuccinimide ester and Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester, or a combination thereof, optionally, wherein the bifunctional or multifunctional molecule is not succinimidyl ester of 6- ( (acryloyl) amino) hexanoic acid (AcX) .10.The method of any one of claims 1-9, wherein during step (iii) the microwave irradiation promotes hydrolysis of the swellable neutral material into the swellable polyelectrolyte under alkaline conditions.11.The method of any one of claims 1-10, wherein during step (iii) the denaturation utilizes heat, one or more chaotropic reagents, and / or one or more enzyme, optionally, wherein the enzyme is not Proteinase K.12.The method of claim 11, wherein the chaotropic agent is sodium dodecyl sulfate, urea, guanidine hydrochloride, Tris-HCl, Ethylenediaminetetraacetic acid or salt derivatives, Triton X-100, Tween 20, sodium chloride, boric acid or salt derivatives.13.The method of any one of claims 1-12, wherein step (v) is repeated one or more times.14.The method of any one of claims 1-13, wherein the staining is proteomic staining, nucleic acid staining, or immunostaining, or a combination thereof.15.The method of any one of claims 1-14, wherein during step (v) the sample is stained with one or more fluorescent dyes and / or one or more antibodies.16.The method of claim 15, wherein the one or more fluorescent dyes are nuclear stains or morphological dyes.17.The method of claim 16, wherein the morphological dyes are such as NHS ester conjugated with a fluorescent dye, maleimide conjugated with a fluorescent dye, hydrazide conjugated with a fluorescent dye, cadaverine conjugated with a fluorescent dye, lipid or synthesized lipid with long alkyl chain conjugated with a fluorescent dye.18.The method of claim 16, wherein the nuclear dyes are SYTOX Green, DAPI, or Hoechst.19.The method of any one of claims 1-18, wherein during step (v) the microwave irradiation promotes uniformity of the one or more fluorescent dyes within the sample.20.The method of any one of claims 1-19, wherein step (v) further comprises a washing step to remove unbound or nonspecifically bound antibodies or dyes.21.The method of any one of claims 1-20, wherein step (v) further comprises a blocking step to prevent nonspecific binding of the antibody.22.The method of any one of claims 1-21, further comprising step (vii) antigen retrieval: wherein the sample is subjected to microwave irradiation in a buffer solution to reverse heavy chemical crosslinks and step (vii) is conducted before step (ii) .

Images