iRNA COMPOSITION AND METHOD OF USING SAME

Abstract

The present disclosure relates to RNA interference (RNAi) agents.

Description

iRNA COMPOSITION AND METHOD OF USING SAME

[0001] CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims priority to PCT / CN2024 / 107839, titled "iRNA COMPOSITION AND METHOD OF USING SAME" , filed on July 26, 2024, 202510998120.3 titled "iRNA COMPOSITION AND METHOD OF USING SAME" , filed on July 18, 2025, 202510998073.2 titled "Modified Double-Stranded Oligonucleotides and Uses Thereof" , filed on July 18, 2025, the entire contents of which are hereby incorporated by reference.TECHNICAL FIELD

[0003] The present disclosure relates to RNA interference (RNAi) agents for inhibiting INHBE, such as double-stranded RNAi agents, pharmaceutical compositions comprising the INHBE RNAi agents, and methods of using same.BACKGROUND

[0004] Body fat distribution is a critical risk factor for cardiovascular and metabolic diseases including type 2 diabetes (T2D) , coronary heart disease (CHD) , circulating lipids, and blood pressure, while there is a lack of therapeutic options to modify improper fat storage. By genome-wide association studies (GWAS) , INHBE has been successfully identified as a genetic variant correlated with fat distribution and reduced risk of diabetes and coronary disease. INHBE encodes inhibin βE subunit, a member of the transforming growth factor-β (TGF-β) , which dimerizes to form activin E, a hepatokine whose signaling has not been fully-characterized. INHBE expression was found to increase in human livers from subjects with insulin resistance. And its elevated expression was also observed in high fat diet (HFD) induced mouse obesity model. On the other hand, INHBE suppression reduced body weight by loss of fat mass rather than lean mass.

[0005] Due to the lack of treatments for modifying excessive fat stores, there’s a need for development of new therapies to selectively and efficiently modulate metabolic syndrome associated genes like INHBE, e.g., INHBE RNAi agents, which is potential to bring durable and safe management of body weight for subjects with such a need.SUMMARY

[0006] The present disclosure provides an iRNA composition that causes cleavage of the RNA transcript of the INHBE gene mediated by an RNA-induced silencing complex (RISC) . The INHBE can be located within a cell, such as a cell of a subject, such as a human subject.

[0007] The present disclosure relates to a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) agent that inhibits the expression of INHBE, wherein the dsRNA agent comprises a sense strand and an antisense strand, the sense strand being as follows: 5’-Q1-X-Q2-3’, wherein Q1 and Q2 are 0, 1 or 2 nucleotide sequences selected from A, U, T, C, and G nucleotide motifs; X is a sequence containing positions 1 to n1 of the sense strand sequence as shown in Table 1-1, Table 1-3, Table 4-1, Table 5-1, Table 6-1, Table 7-1, Table 8-1 or Table 11-1, and n1 is position 18, 19, 20, or 21; the antisense strand being as follows: 5’-Q3-Y-Q4-3’, wherein Q3 and Q4 are 0, 1 or 2 nucleotide sequences selected from A, U, T, C, and G nucleotide motifs; Y is a sequence containing positions n2 to n3 of the antisense strand sequence as shown in Table 1-1, Table 1-3, Table 4-1, Table 5-1, Table 6-1, Table 7-1, Table 8-1 or Table 11-1, n2 is position 1 or 2, and n3 is position 18, 19, 20, 21, 22, or 23.

[0008] The present disclosure further relates to a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) agent that inhibits the expression of INHBE, wherein the dsRNA agent comprises a sense strand and an antisense strand, the nucleotides in the antisense strand contain a region complementary to the transcript of INHBE, and the complementary region contains at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, or at least 19 consecutive nucleotides that differ by 0, 1, 2, or 3 nucleotides from one of the antisense strand sequences listed in Table 1-1, Table 1-3, Table 4-1, Table 5-1, Table 6-1, Table 7-1, Table 8-1 or Table 11-1. The dsRNA agent comprises at least one modified nucleotide, or all or substantially all nucleotides on the sense strand and the antisense strand are modified nucleotides.

[0009] The present disclosure further relates to a dsRNA agent, which comprises a sense strand and an antisense strand, wherein , the sense strand comprises a nucleotide sequence X, the antisense strand comprises a nucleotide sequence Y, the nucleotide sequence X and the nucleotide sequence Y are at least partially reverse-complementary to form a double-stranded region; and, each nucleotide in the sense strand and the antisense strand is independently a fluorinated modified nucleotide or a non-fluorinated modified nucleotide; and, the fluorinated modified nucleotide is located in the nucleotide sequence X and the nucleotide sequence Y; and, in the 5'to 3'direction, sequence X has the general formula:

[0010] 5' (N) NsNsNsNsNsNsNZNZNZNsNsNsNsNsNsNsNsNsNs-3'

[0011] in the 5' to 3' direction, sequence Y has the general formula:

[0012] 5' (N) NsNFNiNiNiNiNiNiNiNiNiNdNiNFNiNFNsNsNsNsNs-3'

[0013] Wherein: NF each independently represents a 2'-fluorine-modified nucleotide; Nd each independently represents a 2'-deoxy-modified nucleotide; Ns each independently represents a 2'-O-methyl (2'-OMe) -modified ribonucleotide; Ni independently represents a 2'-O-methyl (2'-OMe) modified ribonucleotide or 2'-deoxy (DNA) -modified nucleotide; NZ each independently represents either a 2'-fluorine-modified ribonucleotide or a 2'-deoxy (DNA) -modified nucleotide.

[0014] The present disclosure further relates to a dsRNA agent, wherein the at least one modified nucleotide includes: 2'-O-methyl nucleotide, 2'-fluoro nucleotide, 2'-deoxynucleotide, locked nucleic acid, unlocked nucleic acid (UNA) , glycol nucleic acid (GNA) , 2'-F-arabinose nucleotide, 2'-methoxyethyl nucleotide, abasic nucleotides, ribitol, reverse nucleotides, reverse abasic nucleotides, reverse 2'-OMe nucleotide, reverse 2'-deoxynucleotide, 2'-amino modified nucleotide, 2'-alkyl modified nucleotide, morpholino nucleotide and 3'-OMe nucleotide, nucleotides containing a 5'-phosphorothioate group, or terminal nucleotides linked to cholesterol derivatives or dodecanoate bisdecylamide groups, 2'-amino modified nucleotides, phosphoramidates, or unnatural bases containing nucleotides. Preferably, the dsRNA agent further comprises E-vinylphosphonate nucleotide at the 5' end of the sense strand and / or antisense strand; or comprises at least one phosphorothioate internucleoside linkage in the sense strand and / or antisense strand.

[0015] In a specific embodiment, the length of the double-stranded region of the dsRNA agent is selected from 19 to 30 nucleotide pairs, or 19 to 25 nucleotide pairs, or 19 to 21 nucleotide pairs, or 19 to 23 nucleotide pairs, or 21 to 23 nucleotide pairs; or the length of each strand independently does not exceed 30 nucleotides; or the length of each strand independently does not exceed 25 nucleotides; or the length of each strand independently does not exceed 21 nucleotides. In a specific embodiment, the length of the sense strand does not exceed 19, 20 or 21 nucleotides, the length of the antisense strand does not exceed 21, 22 or 23 nucleotides.

[0016] In a specific embodiment, the dsRNA agent has two blunt ends; or at least one strand thereof contains a 3’ overhang of at least 1 nucleotide; or at least one strand thereof contains 3’ overhangs of at least 2 nucleotides.

[0017] In a specific embodiment, the dsRNA agent further comprises a ligand including but not limited to L96 or QLR-15. Since RNA cannot directly penetrate the cell membrane, a vector is required to carry the nucleic acid drug to the cytoplasm of the target cell in the target organ. Any vector that can bring the nucleic acid drug of the present disclosure into the cytoplasm is suitable for the present disclosure. Vectors and methods known in the art include, but are not limited to: GalNac vectors, viral delivery (retrovirus, adenovirus, lentivirus, baculovirus, AAV) , liposomal nanoparticles LNP, polymeric carriers, cell-penetrating peptide vectors, bacterial delivery (tkRNAi) , direct chemical modification of siRNAs to increase stability, etc., and the use of vectors is not limited. Those skilled in the art should understand that displacements and mutations can be made on the basis of the core sequence of the present disclosure, which can achieve the active effects of the present disclosure, or even better effects; therefore, as long as the core sequence X or Y of the present disclosure is used, the nucleic acid drugs in which displacements and mutations are made on the basis of the core sequence X or Y of the present disclosure, are within the scope of protection of the present disclosure; or nucleic acid drugs that only differ from the sequence of the present disclosure by 0, 1, 2, or 3 nucleotides are also within the scope of protection of the present disclosure.

[0018] In a specific embodiment, the present disclosure relates to a dsRNA agent, in at least one or two phosphate ester group in the phosphor-sugar backbone of at least one strand of the sense strand and antisense strand, said phosphate ester group has a modifying group. In a specific embodiment, wherein said modified phosphate ester group is a phosphorothioate group formed by substitution of at least one oxygen atom in the phosphodiester bond with a sulfur atom.

[0019] The present disclosure further relates to a dsRNA agent, wherein said phosphorothioate linkage is present in at least one location selected from the group consisting of: between nucleotides 1 and 2 at the 5'-end of the sense strand; between nucleotides 2 and 3 at the 5'-end of the sense strand; between nucleotides 1 and 2 at the 3'-end of the sense strand; between nucleotides 2 and 3 at the 3'-end of the sense strand; between nucleotides 1 and 2 at the 5'-end of the antisense strand; between nucleotides 2 and 3 at the 5'-end of the antisense strand; between nucleotides 1 and 2 at the 3'-end of the antisense strand; and between nucleotides 2 and 3 at the 3'-end of the antisense strand.

[0020] The present disclosure further relates to a dsRNA agent, wherein the 5'-terminal nucleotide of the antisense strand is a 5'-phosphorylated nucleotide or 5'-phosphate analog-modified nucleotide; preferably, said 5'-phosphate analog is 5'-E-vinylphosphonate.

[0021] The present disclosure further relates to an oligonucleotide conjugate, and further comprising a ligand.

[0022] The present disclosure further relates to an oligonucleotide conjugate, wherein said ligand comprises a linker and a conjugate group, and wherein the double-stranded oligonucleotide is conjugated to the conjugate group via the linker.

[0023] The present disclosure further relates to an oligonucleotide conjugate, wherein said double-stranded oligonucleotide, linker, and conjugate group are covalently or non-covalently linked in sequence.

[0024] The present disclosure further relates to an oligonucleotide conjugate, wherein each conjugate group optionally binds to a cell surface receptor.

[0025] The present disclosure further relates to an oligonucleotide conjugate, wherein each conjugate group is selected from a ligand that binds to the asialoglycoprotein receptor (ASGPR) on mammalian hepatocyte surfaces.

[0026] The present disclosure further relates to an oligonucleotide conjugate, wherein at least one or each conjugate group is galactose or N-acetylgalactosamine (GalNAc) .

[0027] The present disclosure further relates to an oligonucleotide conjugate, wherein the ligand is one or more GalNAc derivatives attached via a monovalent, divalent, trivalent or tetravalent branched linker.

[0028] The present disclosure further relates to an oligonucleotide conjugate, wherein the ligand is conjugated to the sense strand, and preferably the sense chain is conjugated to a ligand attached at the 3'end.

[0029] A method for preparing dsRNA-GalNAc conjugates, comprising the following steps: preparing a ligand-containing carrier, synthesizing a sense strand, synthesizing an antisense strand using a universal carrier, annealing the sense strand and the antisense strand to form the dsRNA-GalNAc conjugate.

[0030] The oligonucleotide conjugate, wherein said ligand comprises a structure represented by Formula (vii) :

[0031] In an embodiment, the expression of INHBE was reduced by at least 40%, 50%, 60%, 70%or 80%in animals.

[0032] The present disclosure relates to a pharmaceutical composition for inhibiting the expression of a gene encoding INHBE. Optionally, the pharmaceutical composition may also comprise a pharmaceutically acceptable carrier, a buffer solution, a non-buffer solution, or an additional therapeutic agent. Alternatively, the composition is packaged in a kit, a container, a wrapper, a dispenser, a prefilled syringe or a vial.

[0033] In one specific embodiment, the pharmaceutical composition further comprises physiological saline and may further comprise a pH adjustment agent, such as sodium hydroxide, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, or the like.

[0034] The present disclosure relates to a cell comprising the dsRNA agent, and preferably, the cell is a mammalian cell, optionally a human cell.

[0035] The present disclosure relates to a conjugate comprising the dsRNA agent or the pharmaceutical composition of the present disclosure.

[0036] The present disclosure relates to a method for inhibiting the expression of INHBE gene, the method comprising contacting the cell with the dsRNA agent or the pharmaceutical composition of the present disclosure, thereby inhibiting the expression of the INHBE gene in the cell.

[0037] The present disclosure relates to a method or a use for treating or preventing a subject suffering from a condition that would benefit from reduced expression of INHBE, the method comprising contacting the cell with the dsRNA agent or the pharmaceutical composition of the present disclosure, thereby inhibiting the expression of the INHBE gene in the cell.

[0038] In one specific embodiment, the cell is in the body of a subject, and preferably, the subject is a human; and / or the subject suffers from INHBE-associated condition; and / or the cell is in the body of a subject and the dsRNA agent is administered subcutaneously to the subject; and / or the cell is in the body of a subject and the dsRNA is administered subcutaneously or intravenously (IV) to the subject; and / or contacting the cell with the dsRNA agent inhibits the expression of INHBE by at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%or 95%.

[0039] Use of a dsRNA agent or a pharmaceutical composition in the manufacture of a medicament for combination therapy with another therapeutic agent for treating an INHBE-associated disease.

[0040] In one specific embodiment, the condition is a INHBE-associated disease, including but not limited to metabolic disorders, type 2 diabetes, obesity, hypertriglyceridemia, hypercholesterolemia, lipodystrophy, fatty liver disease, cardiovascular disease, and high blood pressure, etc.Brief Description of Drawings

[0041] Figure 1A and Figure 1B: Results of human INHBE knockdown by modified siRNA conjugates;

[0042] Figure 2A and Figure 2B: Results of human INHBE knockdown by modified siRNA conjugates.

[0043] DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENT

[0044] Terms

[0045] All publications, patents and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication, patent or patent application is specifically and individually indicated to be incorporated by reference.

[0046] Before the present disclosure is described in detail below, it is to be understood that the present disclosure is not limited to the specific methodologies, embodiments and agents described herein, as these may vary. It is also to be understood that the terms used herein are merely for description of specific embodiments, and are not intended to limit the scope of the present disclosure. Unless defined otherwise, all the technical and scientific terms used herein have the same meanings as commonly understood by those of ordinary skill in the art to which the present disclosure pertains.

[0047] The articles "a" and "an" are used herein to refer to one or to more than one (i.e., to at least one) of the grammatical object of the article. By way of example, "an element" means one element or more than one element, e.g., a plurality of elements.

[0048] The term "or" is used herein to mean, and is used interchangeably with, the term "and / or, " unless context clearly indicates otherwise.

[0049] Certain embodiments disclosed herein include numerical ranges, and certain aspects of the present disclosure may be described in terms of ranges. Unless stated otherwise, it should be understood that numerical ranges or descriptions in terms of ranges are merely for the purposes of conciseness and convenience and should not be considered to strictly limit the scope of the present disclosure. Accordingly, descriptions in terms of ranges should be considered to specifically disclose all possible subranges and all possible specific numerical points within such ranges, as if such subranges and numerical points are expressly written herein. For example, description of a range from 1 to 6 should be considered to specifically disclose subranges from 1 to 3, 1 to 4, 1 to 5, 2 to 4, 2 to 6, 3 to 6, etc., as well as specific numerical points within such ranges, such as 1, 2, 3, 4, 5, and 6. The above principles apply equally regardless of whether the numerical range stated is broad or narrow. When described in terms of a range, the range includes the endpoints of the range.

[0050] When referring to measurable values such as amounts and temporary durations, the term “about” is meant to include a variation of ±20%, or in some cases ±10%, or in some cases ±5%, or in some cases ±1%, or in some cases ±0.1%, of the specified value.

[0051] As used herein, “target sequence” refers to the contiguous portion of the nucleotide sequence of the mRNA molecule formed during the transcription of INHBE gene, including mRNA that is the primary transcription product and the product of RNA processing. The target portion of the sequence is at least long enough to serve as a substrate for iRNA-directed cleavage at or near the nucleotide sequence portion of the mRNA molecule formed during the transcription of the INHBE gene. In one embodiment, the target sequence is within the protein coding region of INHBE.

[0052] The target sequence may be about 18 to 35 nucleotides in length, for example about 18 to 30 nucleotides in length. For example, the target sequence may be about 19 to 30 nucleotides, 19 to 29, 19 to 28, 19 to 27, 19 to 26, 19 to 25, 19 to 24, 19 to 23, 19 to 22, 19 to 21, 19 to 20, 20 to 30, 20 to 29, 20 to 28, 20 to 27, 20 to 26, 20 to 25, 20 to 24, 20 to 23, 20 to 22, 20 to 21, 21 to 30, 21 to 29, 21 to 28, 21 to 27, 21 to 26, 21 to 25, 21 to 24, 21 to 23 or 21 to 22 nucleotides in length. In some embodiments, the target sequence is about 19 to about 30 nucleotides in length. In other embodiments, the target sequence is about 19 to about 25 nucleotides in length. In other embodiments, the target sequence is about 19 to about 23 nucleotides in length. In some embodiments, the target sequence is about 19 to about 21 nucleotides in length. Ranges and lengths between those listed above are also considered as a part of the present disclosure.

[0053] As used herein, the term "nucleotide overhang" refers to at least one unpaired nucleotide that protrudes from the duplex structure of an iRNA, e.g., a dsRNA. For example, when a 3'-end of one strand of a dsRNA extends beyond the 5'-end of the other strand, or vice versa, there is a nucleotide overhang. A dsRNA can comprise an overhang of at least one nucleotide; alternatively, the overhang can comprise at least two nucleotides, at least three nucleotides, at least four nucleotides, at least five nucleotides or more. A nucleotide overhang can comprise or consist of a nucleotide / nucleoside analog, including a deoxynucleotide / nucleoside. The overhang (s) can be on the sense strand, the antisense strand or any combination thereof. Furthermore, the nucleotide (s) of an overhang can be present on the 5'-end, 3'-end or both ends of either an antisense or sense strand of a dsRNA.

[0054] In one embodiment, the antisense strand of a dsRNA has a 1-10 nucleotide, e.g., a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 nucleotide, overhang at the 3'-end and / or the 5'-end. In one embodiment, the sense strand of a dsRNA has a 1-10 nucleotide (s) , e.g., a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 nucleotide (s) , overhang at the 3 '-end and / or the 5 '-end. In another embodiment, one or more of the nucleotides in the overhang is replaced with a nucleoside thiophosphate.

[0055] "Blunt" or "blunt end" means that there are no unpaired nucleotides at that end of the double stranded RNAi agent, i.e., no nucleotide overhang. A "blunt ended" RNAi agent is a dsRNA that is double-stranded over its entire length, i.e., no nucleotide overhang at either end of the molecule. The RNAi agents of the invention include RNAi agents with nucleotide overhangs at one end (i.e., agents with one overhang and one blunt end) or with nucleotide overhangs at both ends.

[0056] The term "antisense strand" or "guide strand" refers to the strand of an iRNA, e.g., a dsRNA, which includes a region that is substantially complementary to a target sequence, e.g., a INHBE mRNA. As used herein, the term "region of complementarity" refers to the region on the antisense strand that is substantially complementary to a sequence, for example a target sequence, e.g., an INHBE nucleotide sequence, as defined herein. Where the region of complementarity is not fully complementary to the target sequence, the mismatches can be in the internal or terminal regions of the molecule. Generally, the most tolerated mismatches are in the terminal regions, e.g., within 5, 4, 3, 2, or 1 nucleotide (s) of the 5'-and / or 3'-terminus of the iRNA. In one embodiment, a double-stranded RNAi agent of the invention include a nucleotide mismatch in the antisense strand. In another embodiment, a double-stranded RNAi agent of the invention include a nucleotide mismatch in the sense strand. In one embodiment, the nucleotide mismatch is, for example, within 5, 4, 3, 2, or 1 nucleotide (s) from the 3 '-terminus of the iRNA. In another embodiment, the nucleotide mismatch is, for example, in the 3 '-terminal nucleotide of the iRNA.

[0057] The term "sense strand, " or "passenger strand" as used herein, refers to the strand of an iRNA that includes a region that is substantially complementary to a region of the antisense strand as that term is defined herein.

[0058] The terms “silencing” , “reducing” , “inhibiting” , “suppressing” or “down-regulating” and other similar terms are used interchangeably and include any level of inhibition.

[0059] The term “INHBE” is also known as inhibin subunit beta E and activin E. INHBE belongs to the transforming growth factor-β (TGF-β) family and participates in body fat distribution. The sequence of a human INHBE mRNA transcript is accessible from Genebank, Uniprot and OMIM.

[0060] The term “sequence-containing strand” refers to an oligonucleotide containing a strand of nucleotides, described by reference to the sequence using standard nucleotide nomenclature.

[0061] Generally, “G” , “C” , “A” , “T” and “U” each respectively represent nucleotides containing guanine, cytosine, adenine, thymine and uracil as bases. However, it should be understood that the term “ribonucleotide” or “nucleotide” may also refer to modified nucleotides. It is well known to those skilled in the art that guanine, cytosine, adenine and uracil can be replaced by other moieties without substantially altering the base pairing properties of the oligonucleotides containing the nucleotides bearing such replaced moieties. For example, without limitation, a nucleotide containing inosine as its base may base-pair with a nucleotide containing adenine, cytosine, or guanine. Therefore, a nucleotide containing uracil, guanine or adenine in the nucleotide sequence of the dsRNA characterized by the present disclosure can be replaced with a nucleotide containing, for example, inosine. In another example, adenine and cytosine at any position in the oligonucleotide can be replaced with guanine and uracil, respectively, to form G-U wobble base pair with the target mRNA. Sequences containing such replaced moieties are suitable for use in the compositions and methods characterized by the present disclosure.

[0062] The terms “sequence” and “nucleotide sequence” refer to contiguous or sequential nucleobases or nucleotides, described by consecutive letters using standard nomenclature. Nucleic acid molecules may contain unmodified and / or modified nucleotides. Nucleotide sequences may contain unmodified and / or modified nucleotides.

[0063] The terms “base” , “nucleotide base” or “nucleobase” refers to a heterocyclic pyrimidine or purine compound that is a component of a nucleotide, and includes the primary purine bases adenine and guanine, and the primary pyrimidine bases cytosine, thymine and uracil. Nucleobases can be further modified to include, without limitation, universal bases, hydrophobic bases, promiscuous bases, size-expanded bases, and fluorinated bases. The synthesis of such modified nucleobases, including phosphoramidite compounds containing modified nucleobases, is known in the art.

[0064] The term “nucleotide” has the same meaning as commonly understood in the art. Thus, the term “nucleotide” as used herein refers to a glycoside containing a sugar moiety, a base moiety and a covalent linking group (linker) such as a phosphate or phosphorothioate internucleoside linking group, and encompasses naturally occurring nucleotides such as DNA or RNA, and non-naturally occurring nucleotides containing modified sugar and / or base moieties, which are also referred to herein as nucleotide analogs. Herein, a single nucleotide may be referred to as a monomer or unit.

[0065] As used herein, unless stated otherwise, the term “complementary” when used to describe a first nucleobase or nucleotide sequence (e.g., RNAi agent sense strand or targeted mRNA) in relation to a second nucleobase or nucleotide sequence (e.g., RNAi agent antisense strand or single-stranded antisense oligonucleotide) , means the ability of an oligonucleotide or polynucleotide containing a first nucleotide sequence to hybridize (form base pair hydrogen bonds) under mammalian physiological conditions (or other suitable in vivo or in vitro conditions) and form a duplex or double helical structure under certain standard conditions with an oligonucleotide containing a second nucleotide sequence. Those of ordinary skill in the art will be able to select the set of conditions most suitable for a hybridization test. Complementary sequences include Watson-Crick base pairs or non-Watson-Crick base pairs, and include natural or modified nucleotides or nucleotide mimics, at least to the extent that the above hybridization requirements are met. Sequence identity or complementarity is independent of modifications. For example, Am and Af as defined herein are complementary to U (or T) and identical to A for purposes of determining identity or complementarity.

[0066] As used herein, “perfectly complementary” or “fully complementary” means that in a hybridized pair of nucleobase or nucleotide sequence molecules, all (100%) the bases in a contiguous sequence of a first oligonucleotide will hybridize with the same number of bases in a contiguous sequence of a second oligonucleotide. The contiguous sequence can comprise all or part of the first or second nucleotide sequence. However, where a first sequence is referred to as "substantially complementary" with respect to a second sequence herein, the two sequences can be fully complementary, or they can form one or more, but generally not more than 5, 4, 3 or 2 mismatched base pairs upon hybridization for a duplex up to 30 base pairs, while retaining the ability to hybridize under the conditions most relevant to their ultimate application, e.g., inhibition of gene expression via a RISC pathway. However, where two oligonucleotides are designed to form, upon hybridization, one or more single stranded overhangs, such overhangs shall not be regarded as mismatches with regard to the determination of complementarity. For example, a dsRNA comprising one oligonucleotide 21 nucleotides in length and another oligonucleotide 23 nucleotides in length, wherein the longer oligonucleotide comprises a sequence of 21 nucleotides that is fully complementary to the shorter oligonucleotide, can yet be referred to as "fully complementary" for the purposes described herein.

[0067] As used herein, the terms “link” or “conjugate” when referring to the linkage between two compounds or molecules, means that the two compounds or molecules are linked by a covalent bond. Unless stated otherwise, the terms “link” and “conjugate” as used herein may refer to the linkage between a first compound and a second compound, with or without any intervening atoms or atomic groups.

[0068] As used herein, a polynucleotide that is "substantially complementary to at least part of a messenger RNA (mRNA) refers to a polynucleotide that is substantially complementary to a contiguous portion of the mRNA of interest (e.g., an mRNA encoding an INHBE gene) . For example, a polynucleotide is complementary to at least a part of an INHBE mRNA if the sequence is substantially complementary to a non-interrupted portion of an mRNA encoding an INHBE gene.

[0069] The terms “individual” or “subject” as used herein refers to any animal, such as a mammal or marsupial. Individuals contemplated by the present disclosure include, but are not limited to, humans, non-human primates (such as cynomolgus or rhesus monkeys or other types of macaques) , mice, pigs, horses, donkeys, cattle, sheep, rats, and poultry of any kind.

[0070] The term “disease” or “condition” or “disorder” or the like as used herein refers to any change or imbalance that impairs or interferes with the normal function of cells, tissues or organs. For example, the “disease” includes, but is not limited to, tumors, pathogenic infections, autoimmune diseases, T cell dysfunctions, or immune tolerance deficiency (such as transplantation rejection) .

[0071] The term “treatment” as used herein refers to clinical intervention in an attempt to modify the course of a disease in an individual or to treat a cell-induced disease process, either prophylactically or interventionally in the clinical pathological process. Therapeutic effects include, but are not limited to, preventing the occurrence or recurrence of the disease, alleviating symptoms, reducing the direct or indirect pathological consequences of any disease, preventing metastasis, slowing down the progression of the disease, improving or alleviating the condition, alleviating or improving the prognosis, etc. In general, the majority of nucleotides of each strand of a dsRNA molecule are ribonucleotides, but as described in detail herein, each or both strands can also include one or more non-ribonucleotides, e.g., a deoxyribonucleotide and / or a modified nucleotide. In addition, as used in this specification, an "RNAi agent" may include ribonucleotides with chemical modifications; an RNAi agent may include substantial modifications at multiple nucleotides. As used herein, the term "modified nucleotide" refers to a nucleotide having, independently, a modified sugar moiety, a modified internucleotide linkage, and / or modified nucleobase. Thus, the term modified nucleotide encompasses substitutions, additions or removal of, e.g., a functional group or atom, to internucleoside linkages, sugar moieties, or nucleobases. The modifications suitable for use in the agents of the invention include all types of modifications disclosed herein or known in the art. Any such modifications, as used in a siRNA type molecule, are encompassed by "RNAi agent" for the purposes of this specification and claims.

[0072] Another modification of the RNA of an iRNA of the invention involves chemically linking to the RNA one or more ligands, moieties or conjugates that enhance the activity, cellular distribution or cellular uptake of the iRNA. Such moieties include but are not limited to lipid moieties such as a cholesterol moiety, cholic acid, a thioether, e.g., beryl-S-tritylthiol, a thiocholesterol, an aliphatic chain, e.g., dodecandiol or undecyl residues, a phospholipid, e.g., di-hexadecyl-rac-glycerol or triethyl-ammonium 1, 2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-phosphonate, a polyamine or a polyethylene glycol chain, or adamantane acetic acid, a palmityl moiety, or an octadecylamine or hexylamino-carbonyloxycholesterol moiety.

[0073] In one embodiment, a ligand alters the distribution, targeting or lifetime of an iRNA agent into which it is incorporated. In preferred embodiments a ligand provides an enhanced affinity for a selected target, e.g., molecule, cell or cell type, compartment, e.g., a cellular or organ compartment, tissue, organ or region of the body, as, e.g., compared to a species absent such a ligand. Preferred ligands will not take part in duplex pairing in a duplexed nucleic acid. Representative patents for the preparation of RNA conjugates herein include (but are not limited to) CN108064294B paragraph

[0635] -

[0714] .

[0074] The nucleic acids featured in the invention can be synthesized and / or modified by methods well established in the art, such as those described in "Current protocols in nucleic acid chemistry, " Beaucage, S. L. et al. (Edrs. ) , John Wiley &Sons, Inc., New York, NY, USA, which is hereby incorporated herein by reference. Modifications include, for example, end modifications, e.g., 5'-end modifications (phosphorylation, conjugation, inverted linkages) or 3'-end modifications (conjugation, DNA nucleotides, inverted linkages, etc. ) ; base modifications, e.g., replacement with stabilizing bases, destabilizing bases, or bases that base pair with an expanded repertoire of partners, removal of bases (abasic nucleotides) , or conjugated bases; sugar modifications {e.g., at the 2'-position or 4'-position) or replacement of the sugar; and / or backbone modifications, including modification or replacement of the phosphodiester linkages. Specific examples of iRNA compounds useful in the embodiments described herein include, but are not limited to RNAs containing modified backbones or no natural internucleoside linkages. RNAs having modified backbones include, among others, those that do not have a phosphorus atom in the backbone. For the purposes of this specification, and as sometimes referenced in the art, modified RNAs that do not have a phosphorus atom in their internucleoside backbone can also be considered to be oligonucleosides. In some embodiments, a modified iRNA will have a phosphorus atom in its internucleoside backbone.Examples

[0075] The present disclosure is further described below in conjunction with specific examples. It should be understood that these examples serve only to illustrate the present disclosure and are not limiting the scope of the present disclosure. The experimental methods in which no specific conditions are specified in the following examples are usually performed according to conventional conditions such as those described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, Science Press, 2002, or according to the conditions recommended by the manufacturer.

[0076] Example 1 Design and synthesis of oligonucleotide sequences

[0077] Test 1 Design of siRNA

[0078] An antisense strand was used to target a specific location of INHBE gene (NCBI GeneID: 83729, NM_031479.5) , wherein, starting from the nucleic acid at the 5’ end, there were 21 or 23 bases that were complementary to and paired with the target gene.

[0079] A detailed list of unmodified INHBE sense strand and antisense strand nucleotide sequences is as shown in Table 1-1.

[0080] Table 1-1 Unmodified INHBE sense strand and antisense strand nucleotide sequences

[0081] Table 1-2 shows the abbreviations for one or more nucleotides in the nucleic acid sequence listing. It can be understood that these monomers are linked to each other via 5’-3’-phosphodiester bonds when they are present in oligonucleotides.

[0082] Table 1-2 List of abbreviations

[0083] A detailed list of modified INHBE sense strand and antisense strand nucleotide sequences is as shown in Table 1-3, Table 4-1, Table 5-1, Table 6-1, Table 7-1, Table 8-1 or Table 11-1.

[0084] Table 1-3 Modified INHBE sense strand and antisense strand nucleotide sequences

[0085] Test 2 Synthesis of siRNA

[0086] The synthesis of siRNA was the same as the usual solid-phase synthesis of phosphoramidite. On a synthesizer, nucleoside phosphoramidite monomers were linked one by one according to the synthesis procedure, starting from a universal CPG carrier. 5- (Ethylthio) -1H-tetrazole (ETT) was used as an activator (0.6 M acetonitrile solution) , 0.22 M PADS was dissolved in a 1: 1 (volume ratio) solution of acetonitrile and trimethylpyridine as a vulcanizing agent, and an iodopyridine / aqueous solution was used as an oxidant. After the completion of solid-phase synthesis, the oligonucleotides were cleaved from the solid support, and soaked in a 3: 1 solution of 28%ammonia water and ethanol at 50 ℃ for 16 h. Centrifugation was then performed. The supernatant was transferred to another centrifugal tube. After the completion of concentration and evaporation to dryness, purification was performed using C18 reversed-phase chromatography, wherein the mobile phase was 0.1 M TEAA and acetonitrile. DMTr was removed using a 3%trifluoroacetic acid solution. The target oligonucleotide was collected and then lyophilized, identified as the target product by LC-MS, and quantified by UV (260 nm) .

[0087] The obtained single-stranded oligonucleotides were annealed according to the complementary pairing in the equimolar ratio to finally obtain the double-stranded siRNAs as shown in Table 1-3, Table 4-1, Table 5-1, Table 6-1, Table 7-1, Table 8-1 or Table 11-1. The double-stranded siRNA was dissolved in 1 × PBS and adjusted to the concentration required for the experiment.

[0088] Test 3 Synthesis of QLR-15

[0089] Scheme:

[0090] Experimental procedure:

[0091] To a solution of (2R, 3R) -2-aminobutane-1, 3-diol (200 g, 1.0 eq. ) in pyridine (3.10 kg) was added by DMTrCl (710.00 g, 1.1 eq. ) at 0 ℃. The reaction was stirred at 0 ℃ for 12 hours. The mixture was concentrated and purified by silica column chromatography to give compound X939 (369.50 g) . LCMS: 99.5%, MS (ESI) m / z = 408.17 [M+H] +, Calculated: 408.22.2D-NMR (HMBC) confirmed the structure. 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 7.41 (d, J = 7.6 Hz, 2H) , 7.33-7.25 (m, 6H) , 7.21 (t, J = 7.3 Hz, 1H) , 6.88 (d, J = 8.9 Hz, 4H) , 4.37 (s, 1H) , 3.73 (s, 6H) , 3.63 (dd, J = 11.4, 5.9 Hz, 1H) , 3.02 (dd, J = 8.8, 5.4 Hz, 1H) , 2.84 (dd, J = 8.8, 6.2 Hz, 1H) , 2.57 (dd, J = 10.7, 5.5 Hz, 1H) , 1.45 (s, 2H) , 0.96 (d, J = 6.3 Hz, 3H) .

[0092] To a solution of compound 2 (16.00 g, 1.0 eq. ) in DMF (600 mL) was added EDCI (11.60 g, 1.7 eq. ) , compound 1 (7.90 g, 1.0 eq. ) and TEA (10.90 g, 3.0 eq. ) . The reaction was stirred at room temperature for 4 hours. The mixture was quenched by 5%NaHCO3 solution and extracted by EtOAc. The combined organic layer was washed by 5%NaHCO3 solution, dried over Na2SO4, filtered. After concentration, the residue was purified by silica column chromatography to give compound 3 (9.00 g) . LCMS: 98.6%, MS (ESI) m / z = 651.36 [M+H] +, Calculated: 651.31.

[0093] To a solution of compound 3 (9.00 g, 1.0 eq. ) in 2-MeTHF (100 mL) was added by Pd (OH) 2 / C (0.90 g) under N2 protecting. The reaction was then stirred at H2 atmosphere for 3 hours. The mixture was filtered under N2 protecting and the filter cake was washed by 2-MTHF. The combined organic layer was concentrated to give compound 4 (7.00 g) as colorless oil. LCMS: 99.1%, MS (ESI) m / z = 561.52 [M+H] +, Calculated: 561.27.

[0094] To a solution of compound 4 (4.00 g, 1.0 eq. ) in DCM (100mL) was added EDCI (2.10 g, 1.5 eq. ) , compound X939 (2.90 g, 1.0 eq. ) and DIPEA (1.80 g, 2.0 eq. ) . The reaction was stirred at room temperature for 12 hours. The mixture was washed by 5%NaHCO3 solution, 10%NaCl solution and dried over Na2SO4. The solution was filtered and concentrated, and the residues was purified by pre-HPLC to give compound 5 (5.00 g) . LCMS: 99.3%, MS (ESI) m / z = 950.53 [M+H] +, Calculated: 950.47.

[0095] To a solution of compound 5 (5.00 g, 1.0 eq. ) in DCM (50 mL) was added 3- ( (bis (diisopropylamino) phosphaneyl) oxy) propanenitrile (2.38 g, 1.5 eq. ) , diisoropyl ammonium tetrazolide (0.90 g, 1.0 eq. ) , successively. The reaction was stirred at room temperature for 2 hours. The mixture was quenched by 10%NaHCO3 solution. The organic layer was collected and concentrated. The residue was purified by silica column chromatography to give QLR-15 (1.80 g) . LCMS: 99.6%, MS (ESI) m / z = 1150.73 [M+H] +; Calculated: 1150.57. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.44-7.38 (m, 2H) , 7.34-7.24 (m, 6H) , 7.20 (dd, J = 14.6, 7.3 Hz, 1H) , 6.91 (d, J = 8.9 Hz, 1H) , 6.81 (dd, J = 11.9, 4.8 Hz, 4H) , 6.51-6.37 (m, 1H) , 5.83 (d, J = 9.0 Hz, 1H) , 5.35 (d, J = 3.2 Hz, 1H) , 5.18 (dd, J = 11.2, 3.3 Hz, 1H) , 4.60 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H) , 4.40-4.07 (m, 5H) , 3.94-3.84 (m, 2H) , 3.82-3.72 (m, 6H) , 3.71-3.42 (m, 5H) , 3.27-3.05 (m, 4H) , 2.63-2.31 (m, 2H) , 2.27-2.17 (m, 3H) , 2.16-2.08 (m, 4H) , 2.05-1.89 (m, 9H) , 1.83-1.71 (m, 1H) , 1.70-1.46 (m, 7H) , 1.42-1.31 (m, 2H) , 1.24 (d, J = 6.2 Hz, 1H) , 1.20 (d, J = 6.4 Hz, 2H) , 1.18-1.10 (m, 10H) , 0.98 (d, J = 6.8 Hz, 2H) .

[0096] Synthesis of QLR-15-CPG and QLR-15-PS

[0097] Experimental procedure:

[0098] To a solution of QLR-15-5 (1.00 g, 1.0 eq. ) in DCM (20 mL) was added TEA (0.21 g, 2.0 eq. ) and succinic anhydride (0.16 g, 1.5 eq. ) . The reaction was stirred at room temperature for 18 hours. The mixture was washed by 5%NaCl solution (18 mL) four times. The organic layer was dried over Na2SO4, filtered and concentrated at 35 ℃ to give QLR-15-succinate (0.80 g) . LCMS: 97.6%, MS (ESI) m / z =1050.52 [M+H] +, calculated: 1050.48. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.24 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 8.08 (t, J = 5.2 Hz, 1H) , 7.89 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.40-7.34 (m, 2H) , 7.34-7.26 (m, 2H) , 7.23-7.18 (m, 5H) , 6.88-6.82 (m, 4H) , 5.23 (d, J = 3.3 Hz, 1H) , 5.17-5.07 (m, 1H) , 5.02-4.98 (m, 1H) , 4.57 (d, J = 8.5 Hz, 1H) , 4.06-3.98 (m, 3H) , 3.91-3.86 (m, 1H) , 3.73 (d, J = 12.4 Hz, 8H) , 3.41-3.36 (m, 1H) , 3.08-2.90 (m, 3H) , 2.84-2.80 (m, 1H) , 2.39-2.31 (m, 2H) , 2.21-2.12 (m, 3H) , 2.11 (s, 3H) , 2.07-2.02 (m, 1H) , 2.05-2.02 (m, 2H) , 2.00-1.96 (m, 3H) , 1.89-1.84 (m, 3H) , 1.78-1.76 (m, 3H) , 1.54-1.37 (m, 8H) , 1.27-1.19 (m, 2H) , 1.03 (d, J = 6.3 Hz, 3H) .

[0099] To a solution of QLR-15-succinate (0.60 g, 1.0 eq. ) in MeCN (100 mL) was added HBTU (0.24 g, 2.0 eq. ) , DIPEA (0.15 g, 2.0 eq. ) and CPG  (10.00 g) , successively. The reaction was shaken at 25℃ for 20 hours. The suspension was filtered and the filter cake was washed by MeCN five times. The filter cake was suspended in a solution of pyridine (27.50 g) , Ac2O (5.90 g) and TEA (0.14 g) . The mixture was sealed and stirred for 1 hour. The filter cake was obtained after filtration and washed by MeCN five times. QLR-15-CPG (10.20 g) was obtained after drying under vacuum (DMT loading: 25.77 μmol / g) .

[0100] To a solution of QLR-15-succinate (1.30 g, 1.0 eq. ) in MeCN (50 mL) was added HBTU (0.52 g, 2.0 eq. ) , DIPEA (0.32 g, 2.0 eq. ) and Oligo-OH Resin (5.00 g) , successively. The reaction was shaken at 25℃ for 20 hours. The suspension was filtered and the filter cake was washed by MeCN five times. The filter cake was suspended in a solution of pyridine (27.50 g) , Ac2O (5.90 g) and TEA (0.14 g) . The mixture was sealed and stirred for 1 hour. The filter cake was obtained after filtration and washed by MeCN five times. QLR-15-PS (4.60 g) was obtained after drying under vacuum (DMT loading: 143.9 μmol / g) .

[0101] Test 4 Synthesis of siRNA conjugate

[0102] L96 or QLR-15 was linked at the 3’ end of a sense strand. The specific operations are as follows: L96 or QLR-15 was linked to a resin, and starting from the resin, nucleoside monomers were linked one by one in the 3’-5’ direction according to a nucleotide arrangement sequence. Each linking of a nucleoside monomer involved a four-step reaction of deprotection, coupling, capping, and oxidation or vulcanization, which were conventional operations in the art, see section “Synthesis of siRNA” for details. The GalNAc (L96 or QLR-15) -conjugated siRNA conjugates targeting INHBE were obtained.

[0103] It should be noted that L96 or QLR-15 was provided as an exemplary ligand. On the basis of known ligand-related technologies in the art, those skilled in the art can also choose other ligands other than L96 or QLR-15 to be conjugated with the modified siRNAs in Table 1-3, Table 4-1, Table 5-1, Table 6-1, Table 7-1, Table 8-1 or Table 11-1 as long as the ligands have properties similar to those of L96 or QLR-15 that can promote the delivery of an iRNA preparation to the liver.

[0104] Example 2 Screening of siRNA conjugates in Cell line

[0105] Hep3B cells were obtained from ATCC cell bank. The cells were cultured at 37℃ in a 5%CO2 incubator. The Hep3B cell medium contains a cell medium (EMEM, GibcoTM 670086; 10%serum, Gibco-10099-141; 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin, Gibco-15140122) .

[0106] Hep3B cells (1x104 cells / well, passage number = 15～20) were inoculated into 96-well cell plates, and siRNA compounds conjugated with L96 were transfected into cells with RNAiMax (Invitrogen, 13778500) according to the instructions. Each siRNA was set up with 2 cell duplicates and 2 transfection concentrations (10 nM and 1 nM) in parallel. After 24 h transfection, RNA was extracted with the Novyzan RNA extraction kit (RC112-C2) according to the instructions, and TaqMan FastTM 1-step premixed solution (Applied Biosystems, 4444434) , human GAPDH and human INHBE Taqman probes were used to quantify mRNA levels, and GAPDH mRNA expression was used to homogenize INHBE mRNA expression. Non-transfected siRNA cells were used as blank controls.

[0107] The mRNA expression levels of each sample target gene were calculated by ΔCT relative quantification, the relative expression of the target gene was represented by 2-ΔΔCT, and the calculation formula was as follows:

[0108] ΔCT = average Ct value of target gene (INHBE) -average Ct value of reference gene (GAPDH) ;

[0109] ΔΔCT=ΔCT (administration group) -ΔCT (RNAiMax control group) ;

[0110] Relative expression of mRNA =2-ΔΔCT and the results were as shown in Table 2-1.

[0111] Table 2-1 Effect of siRNA conjugates on INHBE exogenous expression system in Hep3B cell line

[0112] Example 3 Screening of siRNA conjugates in Mice Expressing INHBE

[0113] Multiple INHBE-targeting siRNA conjugates conjugated with L96 were respectively dissolved in DPBS (Thermo, 14190144) to form 4 mg / ml siRNA stock solutions. CD1 female mice aged 6-8 weeks (4 mice in each group) were used, the siRNA drugs were injected subcutaneously into the nape at an administration concentration of 3 mg / kg and with an administration volume of 10 mL / kg, while PBS was administered to the blank control group at the same dose. On day 3 (calculated in terms of the time point of administration as day 0) , pcDNA3.4 plasmid (From Genscript) expressing human INHBE was injected into the tail vein under high pressure, and 50 mg was taken from the liver tissue of the test group and the blank group 18 hours later, preserved at -80℃ after rapid freezing with liquid nitrogen.

[0114] According to the instructions, use the Novagen RNA extraction kit (RC112-C2) to extract RNA, and use the TaqMan FastTM 1-step reagent mixture (Applied Biosystems, 4444434) , plasmid Neo gene, and the human INHBE Taqman probe to quantify mRNA levels by TaqMan Fast method. Normalize the INHBE mRNA expression by Neo mRNA expression, and normalize the results of the DPBS group. The relative expression of the target gene is expressed as 2-ΔΔCT, the calculation formula was as follows:

[0115] ΔCT = average Ct value of target gene (INHBE) -average Ct value of reference gene (Neo) ;

[0116] ΔΔCT=ΔCT (administration group) -ΔCT (DPBS control group) ;

[0117] Relative expression of mRNA =2-ΔΔCT, and the results were as shown in Table 3-1.

[0118] Table 3-1 Inhibitory activity of siRNAs in HDI mice

[0119] For compounds that performed well under a single dose of 3 mg / kg, we used the same HDI model method to conduct subsequent dose-dependent experiments, including test doses of 1 mg / kg, 3 mg / kg and 10 mg / kg, to further validate their inhibitory activity against human INHBE, and the results are shown in Table 3-2.

[0120] Table 3-2 Inhibitory activity of siRNAs at different doses in HDI mice

[0121] -, not detected.

[0122] Example 4 Screening of siRNA conjugates in humanized INHBE mice

[0123] Some selected siRNA conjugates including AD-001905, AD-001912, AD-001918, AD-001927, AD-001934, AD-001943, AD-001999, AD-002001with different modification patterns and conjugated with L96 GalNAc, were tested in humanized INHBE mice. The chemically modified siRNAs are shown in Table 4-1.

[0124] Multiple INHBE-targeting siRNA conjugates were respectively dissolved in DPBS (Thermo, 14190144) to prepare 4 mg / ml siRNA stock solutions. The humanized INHBE (hINHBE) mice were obtained from Biocytogen. hINHBE mice aged 6-8 weeks (4 mice in each group) were used, the siRNAs were injected subcutaneously into the nape at dose of 10 mg / kg with an administration volume of 10 mL / kg, while PBS was administered to the blank control group at the same volume. On day 14 and day 28 (calculated in terms of the time point of administration as day 0) , 50 mg of liver tissue were taken and preserved at -80℃ after rapid freezing with liquid nitrogen.

[0125] According to the instructions, use the Novagen RNA extraction kit (RC112-C2) to extract RNA, and use the TaqMan FastTM 1-step reagent mixture (Applied Biosystems, 4444434) , mouse GAPDH gene and the human INHBE Taqman probe to quantify mRNA levels by TaqMan Fast method. Normalize the INHBE mRNA expression by mouse GAPDH mRNA expression, and then normalize the results to DPBS group. The relative expression of the target gene is expressed as 2-ΔΔCT, the calculation formula was as follows:

[0126] ΔCT = average Ct value of target gene (INHBE) -average Ct value of reference gene (GAPDH) ;

[0127] ΔΔCT=ΔCT (administration group) -ΔCT (DPBS control group) ;

[0128] Relative expression of mRNA =2-ΔΔCT, and the results were as shown in Figure 1A and Figure 1B.

[0129] Table 4-1 Modified siRNA duplexes

[0130] Example 5 SAR study on siRNA duplex conjugated with L96 GalNAc

[0131] siRNA sequences with different DNA modification patterns and conjugated with L96 GalNAc were tested in Hep3B cell line. The chemically modified siRNAs are shown in Table 5-1. The source of cell line, cell culture, siRNA transfection, RNA extraction and calculation of relative expression are the same as Example 2. The results of siRNAs at 10 nM and 1 nM are shown in Table 5-2. The selected siRNAs were then tested by a series of concentrations from 20 nM to 0.0013 nM and the IC50 were calculated. The results are shown in Table 5-3.

[0132] Table 5-1 DNA modified siRNA duplexes

[0133] Table 5-2 Effect of siRNAs on INHBE (Remaining level) in Hep3B cell line

[0134] Table 5-3 Effect of siRNAs by a series of concentrations on INHBE in Hep3B cell line

[0135] Example 6 GalNAc bridge test in humanized INHBE mice

[0136] siRNA sequences AD-001912, AD-001943 and AD-001944 with different DNA modification patterns and conjugated with L96 or QLR-15 GalNAc were tested in humanized INHBE mice. The chemically modified siRNAs are shown in Table 6-1. Multiple INHBE-targeting siRNA conjugates were respectively dissolved in DPBS (Thermo, 14190144) to prepare 4 mg / ml siRNA stock solutions. The humanized INHBE (hINHBE) mice were obtained from Biocytogen. hINHBE mice aged 6-8 weeks (4 mice in each group) were used, the siRNAs were injected subcutaneously into the nape at dose of 10 mg / kg with an administration volume of 10 mL / kg, while PBS was administered to the blank control group at the same volume. On day 14 and day 28 (calculated in terms of the time point of administration as day 0) , 50 mg of liver tissue were taken and preserved at -80℃after rapid freezing with liquid nitrogen.

[0137] According to the instructions, use the Novagen RNA extraction kit (RC112-C2) to extract RNA, and use the TaqMan FastTM 1-step reagent mixture (Applied Biosystems, 4444434) , mouse GAPDH gene and the human INHBE Taqman probe to quantify mRNA levels by TaqMan Fast method. Normalize the INHBE mRNA expression by mouse GAPDH mRNA expression, and then normalize the results to DPBS group. The relative expression of the target gene is expressed as 2-ΔΔCT, the calculation formula was as follows:

[0138] ΔCT = average Ct value of target gene (INHBE) -average Ct value of reference gene (GAPDH) ;

[0139] ΔΔCT=ΔCT (administration group) -ΔCT (DPBS control group) ;

[0140] Relative expression of mRNA =2-ΔΔCT, and the results were as shown in Figure 2A and Figure 2B.

[0141] Table 6-1 Modified siRNA conjugates

[0142] Example 7 SAR study on siRNA duplex conjugated with QLR-15 GalNAc

[0143] siRNA sequences with different DNA modification patterns and conjugated with L96 or QLR-15 GalNAc were tested in Hep3B cell line. The chemically modified siRNAs are shown in Table 7-1. The source of cell line, cell culture, siRNA transfection, RNA extraction and calculation of relative expression are the same as Example 2. The results of siRNAs at 10 nM and 1 nM were shown in Table 7-2. The selected siRNAs were then tested by a series of concentrations from 20 nM to 0.0064 nM and the IC50 were calculated. The results are shown in Table 7-3.

[0144] Table 7-1 DNA modified siRNA conjugates

[0145] Table 7-2 Effect of siRNAs on INHBE exogenous expression system in Hep3B cell line

[0146] Table 7-3 Effect of siRNAs by a series of concentrations on INHBE in Hep3B cell line

[0147] Example 8 SAR study on siRNA duplex conjugated with QLR-15 GalNAc

[0148] siRNA sequences AD-001912, AD-001943, AD-001999 and AD-002001 with different DNA modification patterns and conjugated with QLR-15 GalNAc were tested in Hep3B cell line. The chemically modified siRNAs are shown in Table 8-1. The source of cell line, cell culture, siRNA transfection, RNA extraction and calculation of relative expression are the same as Example 2. After being transfected into Hep3B cell line with low passage number (passage = 5～8) , the siRNAs were tested by a series of concentrations from 20 nM to 0.0064 nM and the IC50 were calculated. The results are shown in Table 8-2.

[0149] Table 8-1 Chemical modified siRNA conjugates

[0150] Note: Am (ps2) =2'-O-methyladenosine-3'-phosphorodithioate; Im=2'-O-methyluridine-3'-phosphate

[0151] Table 8-2 Effect of siRNAs by a series of concentrations on INHBE in Hep3B cell line

[0152] Example 9 Test of chemically modified siRNAs in humanized INHBE mice

[0153] siRNA sequences with different DNA modification patterns and conjugated with QLR-15 GalNAc were tested in humanized INHBE mice. The chemically modified siRNAs are shown in Table 8-1. Multiple INHBE-targeting siRNA conjugates were respectively dissolved in DPBS (Thermo, 14190144) to prepare 4 mg / ml siRNA stock solutions. The humanized INHBE (hINHBE) mice were obtained from Biocytogen. hINHBE mice aged 6-8 weeks (4 mice in each group) were used, the siRNAs were injected subcutaneously into the nape at dose of 10 mg / kg with an administration volume of 10 mL / kg, while PBS was administered to the blank control group at the same volume. On day 14 and day 28 (calculated in terms of the time point of administration as day 0) , 50 mg of liver tissue were taken and preserved at -80℃ after rapid freezing with liquid nitrogen.

[0154] According to the instructions, use the Novagen RNA extraction kit (RC1 12-C2) to extract RNA, and use the TaqMan FastTM 1-step reagent mixture (Applied Biosystems, 4444434) , mouse GAPDH gene and the human INHBE Taqman probe to quantify mRNA levels by TaqMan Fast method. Normalize the INHBE mRNA expression by mouse GAPDH mRNA expression, and then normalize the results to DPBS group. The relative expression of the target gene is expressed as 2-ΔΔCT, the calculation formula was as follows:

[0155] ΔCT = average Ct value of target gene (INHBE) -average Ct value of reference gene (GAPDH) ;

[0156] ΔΔCT=ΔCT (administration group) -ΔCT (DPBS control group) ;

[0157] Relative expression of mRNA =2-ΔΔCT.

[0158] Some of the siRNAs with chemical optimization could achieve at least 70%of INHBE knockdown at day 14 and day 28 post dosing, and some others could achieve at least 80%of INHBE knockdown at day 14 and day 28 post dosing.

[0159] Example 10 Selected siRNAs in primary human hepatocytes

[0160] siRNA sequences were tested in primary human hepatocytes. The chemically modified siRNAs are shown in Table 1-3. The cells were acquired from BioIVT and incubated with the siRNA for 48 hours to allow for free uptake of test articles. To measure INHBE expression, mRNA was extracted as previously described and qPCR was performed with hINHBE (Hs. PT. 58.20871536, IDT) as gene of interest, and RPL23 (Hs. PT. 58.20871536. g, IDT) as the housekeeping gene. A range of concentrations from 0.0128 nM to 200 nM was used to assess potency. IC50 values were determined via nonlinear regression in GraphPad Prism 10.0, and they are presented in Table 10-1.

[0161] Table 10-1 Effect of siRNAs conjugates in primary human hepatocytes

[0162] Example 11 SAR study on siRNA duplex with DNA incorporation

[0163] siRNA sequences with different DNA modification patterns and conjugated with L96 were tested in primary human hepatocytes. The chemically modified siRNAs are shown in Table 11-1. The cells were acquired from BioIVT and incubated with the siRNA for 48 hours to allow for free uptake of test articles. To measure INHBE expression, mRNA was extracted as previously described and qPCR was performed with hINHBE (Hs. PT. 58.20871536, IDT) as gene of interest, and RPL23 (Hs. PT. 58.20871536. g, IDT) as the housekeeping gene. A range of concentrations from 0.0128 nM to 200 nM was used to assess shifts in potency due to changes in chemical modification patterns. IC50 values (calculated as above) are presented in Table 11-2, and the potency shifts (also calculated via nonlinear regression in GraphPrism 10.0) resulting from DNA incorporation are in Table 11-3.

[0164] Table 11-1 Chemical modified siRNA duplex

[0165] Table 11-2 Effect of siRNAs conjugates in primary human hepatocytes

[0166] Table11-3 Effect of siRNAs conjugates in primary human hepatocytes

[0167] *indicates a statistically significant shift in potency as noted by an asterix

[0168] The embodiments of the present disclosure described above are exemplary only, and any person skilled in the art can recognize or can determine numerous equivalents of specific compounds, materials and operations without the need for unconventional tests. All these equivalents are within the scope of the present disclosure and are included in the claims.

Claims

1.A double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) agent for inhibiting the expression of INHBE, wherein the dsRNA agent comprises a sense strand and an antisense strand, wherein the antisense strand comprises a region complementary to the transcript of INHBE, and the complementary region comprises at least 15 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides from the nucleotide sequences of any one of the antisense strands listed in Table 1-1.2.A double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) agent for inhibiting the expression of INHBE, wherein the dsRNA agent comprises a sense strand and an antisense strand,wherein the sense strand has the structure as shown in formula (i) :5’-Q1-X-Q2-3’, formula (i)wherein Q1 and Q2 are 0, 1 or 2 nucleotides selected from A, U, T, C, and G nucleotide motifs; X is a sequence comprising positions 1 to n1 of any sense strand sequence as shown in Table 1-1, and n1 is position 18 or 19;the antisense strand has the structure as shown in formula (ii) :5’-Q3-Y-Q4-3’, formula (ii)wherein Q3 and Q4 are 0, 1 or 2 nucleotides selected from A, U, T, C, and G nucleotide motifs; Y is a sequence containing positions n2 to n3 of any antisense strand sequence as shown in Table 1-1, n2 is position 1 or 2, and n3 is position 18, 19, 20 or 21.3.The dsRNA agent according to claim 1 or 2, wherein the dsRNA agent comprises at least one modified nucleotide.4.The dsRNA agent according to claim 1 or 2, wherein all or substantially all nucleotides on the antisense strand are modified nucleotides, and preferably all nucleotides on the sense strand and antisense strand are modified nucleotides.5.The dsRNA agent according to claim 1 or 2, which comprises a sense strand and an antisense strand, wherein(1) the sense strand comprises a nucleotide sequence X, the antisense strand comprises a nucleotide sequence Y, the nucleotide sequence X and the nucleotide sequence Y are at least partially reverse-complementary to form a double-stranded region; and,(2) each nucleotide in the sense strand and the antisense strand is independently a fluorinated modified nucleotide or a non-fluorinated modified nucleotide; and,(3) the fluorinated modified nucleotide is located in the nucleotide sequence X and the nucleotide sequence Y;and,(4) in the 5′to 3′direction, sequence X has the general formula (iii) :5'(N) NsNsNsNsNsNsNZNZNZNsNsNsNsNsNsNsNsNsNs-3'in the 5′to 3′direction, sequence Y has the general formula (iv) :5'(N) NsNFNiNiNiNiNiNiNiNiNiNdNiNFNiNFNsNsNsNsNs-3'Wherein:NF each independently represents a 2′-fluorine-modified nucleotide;Nd each independently represents a 2′-deoxy-modified nucleotide;Ns each independently represents a 2′-O-methyl (2′-OMe) -modified ribonucleotide;Ni independently represents a 2’-O-methyl (2’-OMe) modified ribonucleotide or 2’-deoxy (DNA) -modified nucleotide;NZ each independently represents either a 2′-fluorine-modified ribonucleotide or a 2′-deoxy (DNA) -modified nucleotide and;(5) the dsRNA targets and inhibits INHBE.6.The dsRNA agent according to claim 3 or 4, wherein the at least one modified nucleotide includes: 2'-O-methyl nucleotide, 2'-fluoro nucleotide, 2'-deoxynucleotide, locked nucleic acid (LNA) , unlocked nucleic acid (UNA) , glycol nucleic acid (GNA) , 2'-F-arabinose nucleotide, 2'-methoxyethyl nucleotide, abasic nucleotides, ribitol, reverse nucleotides, reverse abasic nucleotides, reverse 2'-OMe nucleotide, reverse 2'-deoxynucleotide, 2'-amino modified nucleotide, 2'-alkyl modified nucleotide, morpholino nucleotide and 3'-OMe nucleotide, nucleotides containing a 5'-phosphorothioate group, or terminal nucleotides linked to cholesterol derivatives or dodecanoate bisdecylamide groups, 2'-amino modified nucleotides, phosphoramidates, or unnatural bases containing nucleotides.7.The dsRNA agent according to any one of claims 1 to 6, wherein in at least one phosphate ester group in the phosphor-sugar backbone of at least one strand of the sense strand and antisense strand, said phosphate ester group has a modifying group.8.The dsRNA agent according to claim 7, wherein the modified phosphate ester group is a phosphorothioate group formed by substitution of at least one oxygen atom in the phosphodiester bond with a sulfur atom.9.The dsRNA agent according to claim 7 or 8, wherein the phosphorothioate linkage is present in at least one location selected from the group consisting of:Between nucleotides 1 and 2 at the 5′-end of the sense strand;Between nucleotides 2 and 3 at the 5′-end of the sense strand;Between nucleotides 1 and 2 at the 3′-end of the sense strand;Between nucleotides 2 and 3 at the 3′-end of the sense strand;Between nucleotides 1 and 2 at the 5′-end of the antisense strand;Between nucleotides 2 and 3 at the 5′-end of the antisense strand;Between nucleotides 1 and 2 at the 3′-end of the antisense strand; andBetween nucleotides 2 and 3 at the 3′-end of the antisense strand.10.The dsRNA agent according to any one of claims 1-9, wherein the 5′-terminal nucleotide of the antisense strand is a 5′-phosphorylated nucleotide or 5′-phosphate analog-modified nucleotide; preferably, said 5′-phosphate analog is 5′-E-vinylphosphonate.11.A double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) agent for inhibiting the expression of INHBE wherein the modified dsRNA agent comprises a sense strand and an antisense strand, wherein the antisense strand comprises a region complementary to the transcript of INHBE, and the complementary region comprises at least 15 consecutive nucleotides differing no more than 3 nucleotides from the nucleotide sequences of any one of the antisense strand listed in Table 1-3, Table 4-1, Table 5-1, Table 6-1, Table 7-1, Table 8-1 or Table 11-1.12.A double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) agent for inhibiting the expression of INHBE, wherein the dsRNA agent comprises a sense strand and an antisense strand,Wherein the sense strand has the structure as shown in formula (v) :5’-Q1-X-Q2-3’, formula (v)wherein Q1 and Q2 are 0, 1 or 2 nucleotide sequences selected from A, U, T, C, and G nucleotide motifs; X is a sequence containing positions 1 to n1 of any sense strand sequence as shown in Table 1-3, Table 4-1, Table 5-1, Table 6-1, Table 7-1, Table 8-1 or Table 11-1; and n1 is position 18 or 19;wherein the antisense strand has the structure as shown in formula (vi) :5’-Q3-Y-Q4-3’, formula (vi)wherein Q3 and Q4 are 0, 1 or 2 nucleotides selected from A, U, T, C, and G nucleotide motifs; Y is a sequence containing positions n2 to n3 of any antisense strand sequence as shown in Table 1-3, Table 4-1, Table 5-1, Table 6-1, Table 7-1, Table 8-1 or Table 11-1, n2 is position 1 or 2, and n3 is position 18, 19, 20 or 21.13.The dsRNA agent according to any one of the preceding claims, wherein the length of the double-stranded region is selected from:(i) 19 to 30 nucleotide pairs; or(ii) 19 to 25 nucleotide pairs; or(iii) 19 to 21 nucleotide pairs; or(iv) 19 to 23 nucleotide pairs; or(v) 21 to 23 nucleotide pairs; or(vi) each strand independently does not exceed 25 nucleotides; or(vii) each strand independently does not exceed 23 nucleotides; or(viii) each strand independently does not exceed 21 nucleotides.14.The dsRNA agent according to any one of the preceding claims, wherein the dsRNA agent has(i) two blunt ends; or(ii) at least one strand contains a 3’ overhang of at least 1 nucleotide; or(iii) at least one strand contains a 3’ overhang of at least 2 nucleotides.15.The dsRNA agent according to any one of the preceding claims, wherein:I) the sequence of sense strand or X in sense strand is GmsCmsUmUmGmAmGfGmAfUfCmUmUmCfCfGmAmUmAm,the sequence of antisense strand or Y in antisense strand is UmsAfsUmCmGmGmAmAmGmAmUmCmCmUfCmAfAmGmCmsAmsAm; orII) the sequence of sense strand or X in sense strand is GmsCmsUmUmGmAmGfGmAfUfCmUmUmCfCfGmAmUmAm,the sequence of antisense strand or Y in antisense strand is UmsAfsUmCmGfGmAfAmGmAmUmCmCmUfCmAmAmGmCmsAmsAm; orIII) the sequence of sense strand or X in sense strand is GmsCmsUmUmGmAmGfGfAfUmCmUmUmCmCmGmAmUmAm,the sequence of antisense strand or Y in antisense strand is UmsAdsUmCmGdGmAdAmGmAmUmCdCmUfCmAmAmGmCmsAmsAm; orIV) the sequence of sense strand or X in sense strand is GmsCmsUmUmGmAmGfGdAfUmCmUmUmCmCmGmAmUmAm,the sequence of antisense strand or Y in antisense strand is UmsAfsUmCmGmGmAmAmGmAdUmCdCmUfCmAfAmGmCmsAmsAm; orV) the sequence of sense strand or X in sense strand is GmsCmsUmUmGmAmGfGfAdUmCmUmUmCmCmGmAmUmAm,the sequence of antisense strand or Y in antisense strand is UmsAfsUmCdGmGmAmAmGmAmUmCdCmUfCmAfAmGmCmsAmsAm; orVI) the sequence of sense strand or X in sense strand is GmsCmsUmUmGmAmGdGfAfUmCmUmUmCmCmGmAmUmAm,the sequence of antisense strand or Y in antisense strand is UmsAfsUmCdGmGmAmAmGmAmUmCdCmUfCmAfAmGmCmsAmsAm; orVII) the sequence of sense strand or X in sense strand is GmsCmsUmUmGmAmGfGdAfUmCmUmUmCmCmGmAmUmAm,the sequence of antisense strand or Y in antisense strand is UmsAfsUmCdGmGmAmAmGmAmUmCdCmUfCmAfAmGmCmsAmsAm; orVIII) the sequence of sense strand or X in sense strand is CmsAmsAmUmAmUmGfAmCfUfCmAmCmUfUfGmAmCmAm,the sequence of antisense strand or Y in antisense strand is UmsGfsUmCmAmAmGmUmGmAmGmUmCmAfUmAfUmUmGmsCmsCm; orIX) the sequence of sense strand or X in sense strand is CmsAmsAmUmAmUmGfAmCfUfCmAmCmUfUfGmAmCmAm,the sequence of antisense strand or Y in antisense strand is UmsGfsUmCmAfAmGfUmGmAmGmUmCmAfUmAmUmUmGmsCmsCm; orX) the sequence of sense strand or X in sense strand is CmsAmsAmUmAmUmGfAfCdUmCmAmCmUmUmGmAmCmAm,the sequence of antisense strand or Y in antisense strand is UmsGfsUmCdAmAmGmUmGmAmGmTdCmAfUmAfUmUmGmsCmsCm; orXI) the sequence of sense strand or X in sense strand is CmsAmsAmUmAmUmGdAfCfUmCmAmCmUmUmGmAmCmAm,the sequence of antisense strand or Y in antisense strand is UmsGfsUmCdAmAmGmUmGmAmGmTdCmAfUmAfUmUmGmsCmsCm; orXII) the sequence of sense strand or X in sense strand is CmsAmsAmUmAmUmGfAdCfUmCmAmCmUmUmGmAmCmAm,the sequence of antisense strand or Y in antisense strand is UmsGfsUmCdAmAmGmUmGmAmGmTdCmAfUmAfUmUmGmsCmsCm.16.An oligonucleotide conjugate comprising the double-stranded oligonucleotide according to any one of claims 1-15, further comprising a ligand.17.The oligonucleotide conjugate according to claim 16, wherein the ligand comprises a linker and a conjugate group, and wherein the double-stranded oligonucleotide is conjugated to the conjugate group via the linker.18.The oligonucleotide conjugate according to claim 17, wherein the double-stranded oligonucleotide, linker, and conjugate group are covalently or non-covalently linked in sequence.19.The oligonucleotide conjugate according to any one of claims 16-18, wherein each conjugate group optionally binds to a cell surface receptor.20.The oligonucleotide conjugate according to claim 19, wherein each conjugate group is selected from a ligand that binds to the asialoglycoprotein receptor (ASGPR) on mammalian hepatocyte surfaces.21.The oligonucleotide conjugate according to claim 20, wherein at least one or each conjugate group is galactose or N-acetylgalactosamine (GalNAc) .22.The oligonucleotide conjugate according to any one of claims 16-21, wherein the ligand is one or more GalNAc derivatives attached via a monovalent, divalent, trivalent or tetravalent branched linker.23.The oligonucleotide conjugate according to any one of claim 16-22, wherein the ligand is conjugated to the sense strand, and preferably the sense chain is conjugated to a ligand attached at the 3'end.24.The oligonucleotide conjugate according to any one of claim 16-23, wherein said ligand comprises a structure represented by Formula (vii) : 25.The oligonucleotide conjugate according to any one of claim 16-24, wherein said conjugates are QLAD-003220, QLAD-004458, QLAD-003151, QLAD-003132, QLAD-003117, QLAD-003135, QLAD-003126, QLAD-004465, QLAD-004466, QLAD-004467, QLAD-004468 or QLAD-004469.26.A pharmaceutical composition comprising the dsRNA agent according to any one of the preceding claims for inhibiting the expression of the gene encoding INHBE; preferably, in which the expression of INHBE was reduced by at least 50%in animals.27.The pharmaceutical composition according to claim 26, wherein the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier, a buffer solution, a non-buffer solution, or an additional therapeutic agent.28.The pharmaceutical composition according to claim 26 or 27, wherein the pharmaceutical composition is packaged in a kit, a container, a wrapper, a dispenser, a prefilled syringe or a vial.29.The pharmaceutical composition according to any one of claims 26-28, wherein the pharmaceutical composition is formulated for subcutaneous administration or is formulated for intravenous (IV) administration.30.A cell comprising the dsRNA agent according to any one of the preceding claims.31.The cell according to claim 30, wherein, the cell is a mammalian cell, optionally a human cell.32.A method for inhibiting the expression of INHBE gene, comprising contacting the cell with the dsRNA agent according to any one of claims 1-15, or the conjugate according to claim 16-25, or the pharmaceutical composition according to any one of claims 26-29, thereby inhibiting the expression of the INHBE gene in the cell.33.A method for treating or preventing a subject suffering from a condition that would benefit from reduced expression of INHBE, comprising administering to the subject a therapeutically or prophylactically effective amount of the dsRNA agent according to any one of claims 1-15, or the conjugate according to claim 16-25, or the pharmaceutical composition according to any one of claims 26-29, thereby treating or preventing the subject suffering from a condition that would benefit from reduced expression of INHBE.34.The method according to claim 32 or 33, wherein(i) the cell is in the body of a subject, and preferably, the subject is a human; and / or(ii) the subject suffers from INHBE -related condition; and / or(iii) the cell is in the body of a subject and the dsRNA agent is administered subcutaneously to the subject; and / or(iv) the cell is in the body of a subject and the dsRNA is administered intravenously (IV) to the subject; and / or(v) contacting the cell with the dsRNA agent, thereby the expression of INHBE is inhibited by at least 50%.35.The method according to claim 33 or 34, wherein the condition is an INHBE -associated disease, including but not limited to metabolic disorders, type 2 diabetes, obesity, hypertriglyceridemia, hypercholesterolemia, lipodystrophy, fatty liver disease, cardiovascular disease, and high blood pressure.

Images