Anti-claudin18.2 nanobody, chimeric antigen receptor and uses thereof

Abstract

This application provides an anti-Claudin18.2 nanobody, a chimeric antigen receptor, and uses thereof. This application provides a nanobody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Claudin18.2, a chimeric antigen receptor, a host cell, an immunoconjugate, a pharmaceutical composition, a kit, and a related method and related uses.

Description

ANTI-CLAUDIN18.2 NANOBODY, CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR AND USES THEREOFTECHNICAL FIELD

[0001] This application relates to the field of immunology, and specifically relates to a nanobody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Claudin18.2, a chimeric antigen receptor, a host cell, an immunoconjugate, a pharmaceutical composition, a kit, and a related method and related uses.BACKGROUND ART

[0002] Claudin18.2 (CLDN18.2) is a tumor-specific antigen expressed in a variety of cancers, including pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer, etc. (Zhang, D., Huang, G., Liu, J., &Wei, W. Claudin18.2-targeted cancer theranostics. Am J Nucl Med Mol Imaging. 64-69. (2023) . ) . In cancer treatment, targeted drugs against CLDN18.2 are a hot research direction. Some targeted drugs have entered the clinical trial stage, including but not limited to antibodies, CAR-T, and ADCs, such as the ADC drug CMG901 against Claudin18.2, and the like.

[0003] Pancreatic cancer is a common pancreatic tumor, which is a malignant tumor of the digestive tract with a high degree of malignancy and difficult diagnosis and treatment. About 90%of pancreatic cancers are ductal adenocarcinomas originating from pancreatic duct epithelium. Its morbidity and mortality have increased significantly in recent years, and its 5-year survival rate is very low. It is one of the malignant tumors with the worst prognosis (Zhao, Z., &Liu, W. Pancreatic Cancer: A Review of Risk Factors, Diagnosis, and Treatment. Technol Cancer Res Treat. 1533033820962117. (2020) . ) . The clinical symptoms of pancreatic cancer are insidious and atypical, the early diagnosis rate is not high, the surgical mortality rate is high, and the cure rate is almost zero. There is an urgent need to develop novel treatment regimens.

[0004] Cell therapy refers to the process of obtaining cells with specific functions through bioengineering methods, followed by in vitro expansion, special culture, and other treatments to endow these cells with functions such as enhancing immunity, and killing pathogens and tumor cells, thereby achieving the goal of treating a particular disease. Cell therapy mainly includes immune cell therapy and stem cell therapy. Immune cell therapy generally refers to the process where certain types of immune cells, such as T cells, NK cells, etc., are subjected to targeted treatment in vitro and then transfused back into the human body, enabling them to exhibit functions like killing tumor cells and eliminating viruses (Albinger, N., Hartmann, J., &Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. (2021) . 513-527. (2021) . ) . Modification of chimeric antigen receptors (CARs) can endow immune cells with more powerful anti-tumor functions. The CAR structure includes an extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular domain, where the extracellular domain is derived from an antibody, determines the specificity and affinity of antigen recognition, and serves as the basis for the safety and efficacy of CAR-T therapy. At present, the specific recognition of target proteins by single chain Fvs (ScFvs) of monoclonal antibodies based on human or other species is widely used. However, they have the following drawbacks: given that the ScFvs have equivalent affinity to nanobodies, the ScFvs have a larger molecular weight compared with the nanobodies, thus having certain limitations in both molecule expression and function exertion; and the ScFvs are derived from their parental monoclonal antibodies, and may therefore have certain deficiencies in aspects such as activity and stability.

[0005] Heavy-chain antibody (HCAb) is an antibody that naturally lacks the light chain, which was discovered in the peripheral blood of alpacas, and contains only one heavy-chain variable region (VHH) as well as two conventional CH2 and CH3 regions. By cloning its variable region, a single domain antibody (sdAb) consisting only of the heavy-chain variable region can be obtained, called a nanobody (VHH) . VHH has a molecular weight of only 15 KD, which is the smallest known unit that can bind to the target antigen (Yang, E. Y., &Shah, K. Nanobodies: Next Generation of Cancer Diagnostics and Therapeutics. Front Oncol. 1182. (2020) . ) . The advantages of nanobodies mainly include the following. 1. Small size and stronger penetrability: Due to their small size, nanobodies can easily penetrate into human tissues, including the interior of tumors, reaching locations inaccessible to conventional antibodies. 2. Stronger thermal and chemical stability: Nanobodies can maintain stability under high temperatures and extreme pH conditions, and can even remain functional at a temperature of 90℃. 3. Stronger affinity: Nanobodies can recognize cryptic epitopes and exhibit stronger affinity. 4. Avoiding complement reactions: Nanobodies have only one domain and lack the Fc fragment of conventional antibodies, thus avoiding complement reactions induced by the Fc fragment. 5. Lower immunogenicity: Nanobodies have low immunogenicity, which makes them have a lower risk of inducing immune responses in clinical applications. 6. Ease of production and modification: Nanobodies can be highly expressed in microbial systems (e.g., yeast) and are easy to modify and optimize. Therefore, nanobodies have broad application prospects in tumor treatment, nervous system disease treatment, infectious disease treatment, etc., and have gradually become an emerging force in the new generation of biomedicine and clinical diagnostic reagents.

[0006] In order to provide safer and more effective therapies for diseases, there is a need in the art for novel anti-Claudin18.2 nanobodies.SUMMARY OF THE INVENTION

[0007] In a first aspect, this application provides a nanobody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Claudin18.2, where the nanobody or antigen-binding fragment thereof includes CDR1, CDR2, and CDR3, where the amino acid sequence of the CDR1 is as set forth in SEQ ID NO. 7, the amino acid sequence of the CDR2 is as set forth in SEQ ID NO. 8, and the amino acid sequence of the CDR3 is as set forth in SEQ ID NO. 9.

[0008] In a second aspect, this application provides a chimeric antigen receptor including the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application.

[0009] In a third aspect, this application provides a nucleic acid encoding the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application or the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application.

[0010] In a fourth aspect, this application provides a vector including the nucleic acid according to the third aspect of this application.

[0011] In a fifth aspect, this application provides a host cell including the nucleic acid according to the third aspect of this application or the vector according to the fourth aspect of this application.

[0012] In a sixth aspect, this application provides an immunoconjugate including the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application or the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application, and a payload linked thereto.

[0013] In a seventh aspect, this application provides a pharmaceutical composition including the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application, the nucleic acid according to the third aspect of this application, the vector according to the fourth aspect of this application, the host cell according to the fifth aspect of this application, or the immunoconjugate according to the sixth aspect of this application, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0014] In an eighth aspect, this application provides use of the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application, the nucleic acid according to the third aspect of this application, the vector according to the fourth aspect of this application, the host cell according to the fifth aspect of this application, the immunoconjugate according to the sixth aspect of this application, or the pharmaceutical composition according to the seventh aspect of this application for the manufacture of a medicament for treating a disease associated with abnormal expression of Claudin18.2.

[0015] In a ninth aspect, this application provides a method for treating a disease associated with abnormal expression of Claudin18.2, the method including administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application, the nucleic acid according to the third aspect of this application, the vector according to the fourth aspect of this application, the host cell according to the fifth aspect of this application, the immunoconjugate according to the sixth aspect of this application, or the pharmaceutical composition according to the seventh aspect of this application.

[0016] In a tenth aspect, this application provides a kit including the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application, the nucleic acid according to the third aspect of this application, the vector according to the fourth aspect of this application, the host cell according to the fifth aspect of this application, the immunoconjugate according to the sixth aspect of this application, or the pharmaceutical composition according to the seventh aspect of this application.

[0017] In an eleventh aspect, this application provides use of the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application, the nucleic acid according to the third aspect of this application, the vector according to the fourth aspect of this application, the host cell according to the fifth aspect of this application, the immunoconjugate according to the sixth aspect of this application, or the pharmaceutical composition according to the seventh aspect of this application for the manufacture of a reagent for detecting or diagnosing a disease associated with abnormal expression of Claudin18.2.

[0018] In a twelfth aspect, this application provides a method for detecting the expression level of Claudin18.2 protein in a sample, the method including: contacting the sample with the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, and detecting the binding of the nanobody or antigen-binding fragment thereof to Claudin18.2 protein.

[0019] The nanobody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Claudin18.2 provided in this application has good binding ability to Claudin18.2 or tumor cells expressing Claudin18.2, and has high specificity and affinity. In addition, both CAR-T and CAR-NK formed based on the nanobody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Claudin18.2 provided in this application can significantly inhibit tumor cell proliferation, significantly reduce tumor volume, and improve survival rate, thereby enabling more effective treatment of diseases associated with abnormal expression of Claudin18.2.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0020] FIG. 1 shows the technical roadmap for obtaining an anti-CLDN18.2 nanobody (A) and the SDS-PAGE (polyacrylamide) protein electrophoresis identification results of six antibody clones (B) .

[0021] FIG. 2 shows the binding specificities of 2-F09, 2-B08, 11-F09, 4-H09, 2-A12, 6-H09, positive control (PC) , and negative control (NC) to CHO-K1 cells, CHO-K1 cells stably transfected with the human CLDN18.1-coding sequence (CHO-K1 / 18.1) , CHO-K1 cells stably transfected with the human CLDN18.2-coding sequence (CHO-K1 / 18.2) , and CHO-K1 cells stably transfected with the mouse CLDN18.2-coding sequence (CHO-K1 / Mouse 18.2) , respectively.

[0022] FIG. 3 shows the relative binding affinities of the VHHs of 2-B08, 11-F09, and 4-H09, and the ScFv of KLST-18.2, after chimerization with the human IgG1 Fc portion, to CHO-K1 cells stably transfected with the human CLDN18.2-coding sequence (A) and the mouse CLDN18.2-coding sequence (B) .

[0023] FIG. 4 shows the relative binding affinities of humanized 2-B08-HM1, 2-B08-HM2, 2-B08-HM3, and 2-B08-HM4, and non-humanized 2-B08, after chimerization with the human IgG1 Fc portion, to CHO cells stably transfected with the human CLDN18.2-coding sequence (A) and the mouse CLDN18.2-coding sequence (B) .

[0024] FIG. 5 shows the comparison of the relative binding affinities of humanized 2-B08-HM2 and 2-B08-HM4, and non-humanized 2-B08, after chimerization with the human IgG1 Fc portion, to CLDN18.2 protein.

[0025] FIG. 6 shows the plasmid maps for constructing CAR-NK (A) and CAR-T (B) cells.

[0026] FIG. 7 shows the positive rate measurements of HM1, HM2, HM3, HM4, 2B08, 11F09, 4H09, and 8E5-2I CAR-NK.

[0027] FIG. 8 shows the comparison of the in vitro cytotoxicities of NK cells, and HM1, HM2, HM3, HM4, 2B08, 11F09, 4H09, and 8E5-2I CAR-NK cells from one of the two healthy donors (102 or 108) , against the NUGC-4-Luciferase cell line at different time points.

[0028] FIG. 9 shows the positive rate measurements of 2B08 CAR-NK92, 2B08-HM2 CAR-NK92, and 2B08-HM4 CAR-NK92.

[0029] FIG. 10 shows the comparisons of the measurements of the in vitro cytotoxicities (A) and cytokine secretion (B) of 2B08 CAR-NK92, 2B08-HM2 CAR-NK92, and 2B08-HM4 CAR-NK92 cells against the NUGC-4-Luciferase cell line.

[0030] FIG. 11 shows the positive rate measurements of HM2 CAR-T, 8E5-2I CAR-T, and flag CAR-T.

[0031] FIG. 12 shows the comparison of the in vitro cytotoxicities of HM2, 8E5-2I, and flag CAR-T cells against the tumor cell line.

[0032] FIG. 13 shows the cytokine secretion measurements of HM2, 8E5-2I, and flag CAR-T.

[0033] FIG. 14 depicts the comparison chart of the effect on tumor volume over time (A) and the comparison chart of survival time (B) in the in vivo treatment of the subcutaneous xenograft tumor model of pancreatic cancer CLDN18.2-AsPC-1 in immunodeficient mice with CLDN18.2-CAR T.

[0034] FIG. 15 depicts the comparison chart of the effect on tumor volume over time (A) and the comparison chart of survival time (B) in the in vivo treatment of the subcutaneous xenograft tumor model of CLDN18.2 CXCL9-AsPC-1 expressing chemokine CXCL9 in immunodeficient mice with CLDN18.2-CAR T.DETAILED DESCRIPTION OF EMBODIMENTS

[0035] Unless otherwise stated, the terms used herein have the meanings commonly understood by those skilled in the art. For those skilled in the art, they can vary depending on the desired properties and effects sought to be obtained through this application, and each numerical parameter should be interpreted according to the significant figure digits and conventional rounding methods or in a manner understood by those skilled in the art. In general, the nomenclatures used herein and the experimental procedures of organic chemistry, medicinal chemistry, and biology described herein are well known in the art and are commonly used in the art. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein generally have the same meanings as is commonly understood by those of ordinary skill in the art to which this application belongs. Where multiple definitions exist for the terms used herein, the definitions in this section prevail unless otherwise stated.

[0036] When used herein, the expression "A and / or B" includes three situations: (1) A; (2) B; and (3) A and B. The expression "A, B and / or C" includes seven situations: (1) A; (2) B; (3) C; (4) A and B; (5) A and C; (6) B and C; and (7) A, B, and C. The meanings of similar expressions can be inferred by analogy.

[0037] As used herein, the terms "comprising" , "including" , and "containing" mean that other elements other than those listed are not excluded.

[0038] In a first aspect, this application provides a nanobody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Claudin18.2, where the nanobody or antigen-binding fragment thereof includes CDR1, CDR2, and CDR3, where the amino acid sequence of the CDR1 is as set forth in SEQ ID NO. 7, the amino acid sequence of the CDR2 is as set forth in SEQ ID NO. 8, and the amino acid sequence of the CDR3 is as set forth in SEQ ID NO. 9.

[0039] The nanobody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Claudin18.2 provided in this application has good binding ability to Claudin18.2 or tumor cells expressing Claudin18.2, and has high specificity and affinity, thereby enabling more effective treatment of diseases associated with abnormal expression of Claudin18.2.

[0040] In this application, the terms "nanobody" , "VHH" , "single domain antibody" , and "sdAb" are used indiscriminately and refer to variable domains of a single heavy chain of those types of antibodies found in camelids. In the absence of a light chain, the nanobody each has three CDRs, denoted as CDR1, CDR2, and CDR3, respectively. It is the smallest antigen-binding fragment with full functionality. Usually, after obtaining an antibody that naturally lacks the light chain and heavy chain constant region 1 (CH1) , the variable region of the heavy chain of the antibody is cloned, and a nanobody (Nb) consisting of only one heavy-chain variable region is constructed, also known as VHH. A nanobody / single domain antibody, as a novel type of small molecule antibody fragment, is obtained by cloning the heavy-chain variable region (VHH) of naturally occurring heavy-chain antibodies in camelids. It has excellent biological properties: a molecular weight of 12-15 kDa, which is one-tenth that of a full-length antibody, thus exhibiting excellent tissue penetration; high specificity; and good water solubility.

[0041] The term "antigen-binding fragment" as used herein refers to one or more portions of an antibody that retain specificity for binding to a target antigen. Antigen-binding fragments include, but are not limited to, VHHs, CDR-containing fragments, and the like.

[0042] In some embodiments, the nanobody or antigen-binding fragment thereof may be a humanized antibody or a chimeric antibody. In some embodiments, the nanobody or antigen-binding fragment thereof may be a monoclonal antibody. In some embodiments, the nanobody or antigen-binding fragment thereof may be a monovalent antibody, a bivalent antibody, or a multivalent antibody. In some embodiments, the nanobody or antigen-binding fragment thereof may be part of a bispecific antibody or a multispecific antibody. In some embodiments, the nanobody or antigen-binding fragment thereof may be fused to other fragments or molecules. In some embodiments, the antigen-binding fragment may be a Fab.

[0043] The term "specific binding" as used herein refers to a non-covalent interaction between a nanobody or antigen-binding fragment thereof and an antigen. The strength of interaction or affinity can be expressed by the equilibrium dissociation constant (KD or Kd) of the antigen and the corresponding antibody: the smaller the KD value, the stronger the binding strength between the epitope and the antibody. The equilibrium dissociation constant (KD) is calculated as the ratio of Koff / Kon, where the "association rate constant (Kon) " and "dissociation rate constant (Koff) " can be determined by calculating the concentration and the actual association and dissociation rates. (See Nature 361: 186-87 (1993) ) .

[0044] In this application, the term "affinity" refers to the binding ability between a macromolecule and the antigen to which it binds, in particular the binding ability between a nanobody and the antigen to which it binds, for example the binding ability between the nanobody of this application and the Claudin18.2 protein. The affinity of the nanobody described in this application can be measured in vitro by several methods, including surface plasmon resonance or by ELISA assay.

[0045] In this application, the term "variable" refers to certain portions of the variable region of an antibody that differ in sequence, which give rise to the binding and specificity of the various specific antibodies for their particular antigens. The variability is concentrated in three segments in the heavy-chain variable region known as complementarity determining regions (CDRs) or hypervariable regions. The variable region of the naturally occurring heavy chain each contains four FR regions (the more conserved portions of the variable region) , which are generally in a β-sheet configuration. They are linked by three CDRs forming a linking loop, which can form a partial β-sheet structure. The CDRs in each chain are closely brought together by the FR regions and together with the CDRs of the other chain form the antigen-binding site of the antibody. The constant regions are not directly involved in the binding of the antibody to the antigen, but they exhibit different effector functions, such as involvement in antibody-dependent cytotoxicity of the antibody.

[0046] It is well known to those skilled in the art that the amino acid positions / boundaries of the variable regions and CDRs in an antibody sequence can be determined using various rules known in the art (e.g., numbering systems such as Kabat, IMGT, Chothia, AbM, Contact, etc. ) , and that when the numbering systems used are different, the amino acid positions / boundaries of the variable regions and CDRs can change accordingly. When used herein, the positions / boundaries of the variable regions and CDRs are determined according to the IMGT numbering scheme unless otherwise indicated.

[0047] In some embodiments, the heavy-chain variable region of the nanobody or antigen-binding fragment thereof includes the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs. 1-6, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or at least 99.5%sequence identity to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs. 1-6.

[0048] In some embodiments, the nanobody or antigen-binding fragment thereof includes the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs. 1-6, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or at least 99.5%sequence identity to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs. 1-6.

[0049] When used herein, the term "identity" refers to the degree of similarity between a pair of sequences (nucleotides or amino acids) . Identity is determined by dividing the number of identical residues by the total number of residues and multiplying the quotient by 100 to obtain a percentage. Gaps are not counted when evaluating identity. Thus, two copies of an identical sequence have 100%identity, but sequences with deletions, additions, or substitutions may have a lower degree of identity. Those skilled in the art know that there are some computer programs that can be used to determine sequence identity, such as those that employ algorithms such as BLAST. BLAST nucleotide searches are performed using the NBLAST program, and BLAST protein searches are conducted using the BLASTP program, with the default parameters of each program used.

[0050] The nanobody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein may include one or more glycosylation sites in the heavy-chain variable region. As is well known to those skilled in the art, the presence of one or more glycosylation sites in the heavy-chain variable region may enhance antibody immunogenicity or alter the pharmacokinetics of the antibody due to altered antigen binding.

[0051] The nanobody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein can be conjugated to other factors chemically or by genetic engineering. These factors provide the effect of targeting the antibody to the desired functional site or enhance or provide other properties to the antibody.

[0052] The nanobody or antigen-binding fragment thereof disclosed herein can be labeled chemically or by genetic engineering to provide a detectable nanobody including a detectable moiety. Detectable moieties include, but are not limited to, enzymes, prosthetic groups, fluorescent materials, luminescent materials, bioluminescent materials, radioactive materials, positron-emitting metals, and non-radioactive paramagnetic metal ions.

[0053] Labeling for the purposes of detection, analysis and / or diagnosis depends on the particular detection, analysis and / or diagnosis method used, such as immunohistochemical staining of (tissue) samples, flow cytometry, laser scanning cytometry, fluorescence immunoassay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) , radioimmunoassay (RIA) , bioassays (e.g., phagocytosis assay) , Western blotting, and the like. Suitable markers for detection, analysis, and diagnosis methods known in the art are well known to those skilled in the art.

[0054] In a second aspect, this application provides a chimeric antigen receptor including the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application.

[0055] Both CAR-T and CAR-NK formed based on the nanobody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Claudin18.2 provided in this application can significantly inhibit tumor cell proliferation, significantly reduce tumor volume, and improve survival rate, thereby enabling more effective treatment of diseases associated with abnormal expression of Claudin18.2.

[0056] In some embodiments, the chimeric antigen receptor further includes one or more selected from the group consisting of: a signal peptide, a hinge region, a transmembrane domain, an intracellular signaling region (acostimulatory signaling domain and an intracellular signaling domain) , a self-cleaving peptide, a detection tag, and a detection tag signal peptide.

[0057] In some embodiments, the signal peptide includes a signal peptide of the following molecules: the α or β chain of a T cell receptor, CD3ζ, CD3ε, CD4, CD5, CD8, CD9, CD28, CD16, CD22, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, GITR, ICOS, or IgG6.

[0058] In some embodiments, the hinge region includes a hinge region of the following molecules: CD8, CD28, IgG1, IgG4, 4-1BB, PD-1, CD34, OX40, CD3ε, IL-2 receptor, IL-7 receptor, or IL-11 receptor.

[0059] In some embodiments, the transmembrane domain includes a transmembrane domain of the following molecules: CD8, CD28, CD27, CD137, IgG1, IgG4, 4-1BB, PD-1, CD34, CD3ε, CD8α, IL-2 receptor, IL-7 receptor, or IL-11 receptor.

[0060] In some embodiments, the costimulatory signaling domain includes a costimulatory signaling domain of the following molecules: 4-1BB, CD28, ICOS, CD27, CD19, LIGHT, CD40, OX40, CD2, CD226, or CD278.

[0061] In some embodiments, the intracellular signaling domain includes an intracellular signaling domain of the following molecules: CD3ζ, FcεRIγ, CD27, CD28, CD134, CD137, MyD88, CD40, OX40, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, TCRζ, CD4, CD5, CD8, CD21, CD22, CD79a, CD79b, CD278, FcεRI, DAP10, DAP12, CD66d, or FYN.

[0062] In some embodiments, the self-cleaving peptide is selected from P2A, T2A, E2A, and F2A.

[0063] In some embodiments, the detection tag is tEGFR.

[0064] In some embodiments, the detection tag signal peptide is a tEGFR signal peptide.

[0065] In some embodiments, the chimeric antigen receptor includes the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, a transmembrane region, and an intracellular signaling region, which are tandemly linked in sequence.

[0066] In some embodiments, the chimeric antigen receptor includes the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, a CD8 transmembrane region, and a CD3ζ intracellular signaling region, which are tandemly linked in sequence.

[0067] In some embodiments, the chimeric antigen receptor includes the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, a CD8 transmembrane region, and OX40 and CD3ζ intracellular signaling regions, which are tandemly linked in sequence.

[0068] In some embodiments, the chimeric antigen receptor includes the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, a CD8 transmembrane region, and CD137 and CD3ζ intracellular signaling regions, which are tandemly linked in sequence.

[0069] In some embodiments, the chimeric antigen receptor includes the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, a CD28 transmembrane region, and CD28 and CD3ζ intracellular signaling regions, which are tandemly linked in sequence.

[0070] In some embodiments, the chimeric antigen receptor includes the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, a CD28 transmembrane region, and CD28, CD137 and CD3ζ intracellular signaling regions, which are tandemly linked in sequence.

[0071] In a third aspect, this application provides a nucleic acid encoding the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application or the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application.

[0072] When used herein, the term "nucleic acid" refers to a polynucleotide, which is a deoxyribonucleotide or ribonucleotide in a single-stranded or double-stranded form, and a polymer thereof. Nucleic acids can be obtained using standard molecular biology techniques. For antibodies expressed by hybridomas, cDNAs encoding the light and heavy chains of antibodies produced by hybridomas can be obtained by standard PCR amplification or cDNA cloning techniques. For antibodies obtained from an immunoglobulin gene library (e.g., using phage display technology) , nucleic acids encoding the antibodies can be recovered from a variety of phage clones that are members of the library.

[0073] In some embodiments, the nucleic acid includes the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs. 10-15, or a nucleotide sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or at least 99.5%sequence identity to the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs. 10-15.

[0074] In a fourth aspect, this application provides a vector including the nucleic acid according to the third aspect of this application.

[0075] Various vectors can be used to express the nucleic acids encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, and chimeric antigen receptor of this application. Vectors include cloning vectors and expression vectors. Both viral-based and non-viral expression vectors can be used to produce antibodies in mammalian host cells. Non-viral vectors and systems include plasmids, episomal vectors (typically having expression cassettes for expressing proteins or RNAs) , and human artificial chromosomes (see, for example, Harrington et al., Nat Genet. 15: 345, 1997, the contents of which are hereby incorporated herein by reference) . Vectors of viral origin include, but are not limited to, lentiviral vectors, retroviral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated virus vectors, poxvirus vectors, and herpes virus vectors.

[0076] In a fifth aspect, this application provides a host cell including the nucleic acid according to the third aspect of this application or the vector according to the fourth aspect of this application.

[0077] In some embodiments, mammalian host cells are used to express and produce the nanobody or antigen-binding fragment thereof, and chimeric antigen receptor of this application. For example, they may be hybridoma cell lines expressing endogenous immunoglobulin genes or mammalian cell lines containing exogenous expression vectors. These include any normal non-immortalized or normal or abnormal immortalized animal or human cells. For example, many suitable host cell lines capable of secreting intact immunoglobulins have been developed, including CHO cell lines, various COS cell lines, HeLa cells, myeloma cell lines, transformed B cells, and hybridomas. Exemplary host cells include, but are not limited to, Chinese hamster ovary (CHO) cells, human embryonic kidney (HEK) cells (e.g., HEK293, HEK293T, and HEK293F) , monkey kidney (COS) cells (e.g., COS-1 and COS-7) , baby hamster kidney (BHK) cells (e.g., BHK-21) , African green monkey kidney cells (e.g., BSC-1) , HeLa cells, human hepatocellular carcinoma cells (e.g., Hep G2) , myeloma cells (e.g., NS0, 653, and SP2 / 0) , lymphoma cells, oocytes, and cells from transgenic animals (e.g., breast epithelial cells) , or any derived, immortalized, or transformed cells thereof.

[0078] In some embodiments, the host cell is an immune cell, which includes, but is not limited to, a T cell, a B cell, an NK cell, an NKT cell, a CTL cell, a dendritic cell, a myeloid cell, a monocyte, a macrophage, or any combination thereof. In some embodiments, the immune cell is a T cell or an NK cell.

[0079] In some embodiments, the host cell further carries an exogenous cytokine-coding sequence. In some embodiments, the host cell further expresses another chimeric antigen receptor that recognizes a different tumor antigen; or further expresses a chemokine receptor; or further expresses a protein capable of blocking TGF beta signaling; or further expresses a safety switch. In some embodiments, the chemokine receptor includes: CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CCR4, CCR5, and CCR6.

[0080] In a sixth aspect, this application provides an immunoconjugate including the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application or the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application, and a payload linked thereto.

[0081] When used herein, the term "immunoconjugate" is intended to encompass biologically active substances formed by linking the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application or the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application to a payload together by any means, including, but not limited to, antibody-drug conjugates (ADCs) , proteolysis-targeting chimera (PROTAC) -antibody conjugates (DACs) , radionuclide-drug conjugates (RDCs) , and fusion proteins.

[0082] The nanobody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Claudin18.2 or chimeric antigen receptor can be linked directly or indirectly to the payload. In some embodiments, the nanobody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Claudin18.2 or chimeric antigen receptor is indirectly linked to the payload via a linker. Thus, in some embodiments, the immunoconjugate further includes a linker for linking the nanobody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Claudin18.2 or chimeric antigen receptor to the payload together.

[0083] The linker may be a cleavable linker or a non-cleavable linker. For example, acid-labile linkers (e.g., hydrazones) , protease-sensitive (e.g., peptidase-sensitive) linkers, photolabile linkers, dimethyl linkers, or disulfide-containing linkers may be used (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) ; and U.S. Pat. No. 5,208,020) .

[0084] The cleavable linker may include a peptide unit including 2-20 amino acids; and preferred peptide units are selected from -valine-citrulline- (-Val-Cit-) , -glycine-glycine-phenylalanine-glycine- (-Gly-Gly-Phe-Gly-) , -valine-alanine- (-Val-Ala-) , -valine-lysine- (-Val-Lys-) , -valine-arginine- (-Val-Arg-) , -phenylalanine-citrulline- (-Phe-Cit-) , -phenylalanine-lysine- (-Phe-Lys-) , -phenylalanine-arginine- (-Phe-Arg-) , and combinations thereof.

[0085] In some embodiments, the payload includes a toxin, a PROTAC, a molecular glue, a polymer, a protein (including but not limited to an antibody or antigen-binding fragment thereof) , a drug, a radionuclide, a nucleic acid compound, a glucocorticoid, or a detectable marker.

[0086] When used herein, a toxin (also known as cytotoxin) is intended to encompass any agent that inhibits or prevents cell function and / or causes cell destruction. Representative toxins include, but are not limited to, antibiotics, tubulin inhibitors, DNA damaging agents, and agents that disrupt protein synthesis or the function of essential proteins (such as protein kinases, phosphatases, topoisomerases, and cyclins) . Tubulin inhibitors include, but are not limited to, dolastatin, auristatin cytotoxic molecules, and maytansine cytotoxic molecules; DNA damaging agents include, but are not limited to, calicheamicin, duocarmycin, antramycin derivatives PBD, camptothecins, and camptothecin derivatives (SN-38 and Dxd) ; auristatin cytotoxic molecules include, but are not limited to, MMAE or MMAF or derivatives thereof; and maytansine cytotoxic molecules include, but are not limited to, DM1, DM4, or derivatives thereof.

[0087] When used herein, PROTAC refers to a heterobifunctional degrader, where one end is linked to a ligand that binds to a target protein, the other end is linked to a ligand of an E3 ligase, and the two ends are linked via a suitable spacer group. PROTAC degrades the target protein through the ubiquitin proteasome system (UPS) , and the general process is as follows: the PROTAC molecule binds to the target protein and the E3 ligase to form a ternary complex, so that the target protein is ubiquitinated, and then the ubiquitinated target protein is recognized and degraded by the proteasome 26S in the cell.

[0088] When used herein, a molecular glue refers to a small molecule degrader that interacts with an E3 ligase or a target protein to form a ternary complex by inducing or stabilizing the protein-protein interaction between the E3 ligase and the target protein, causing ubiquitination and degradation of the target protein.

[0089] In some embodiments, nucleic acid compounds include any one or more of sgRNA, mRNA, siRNA, shRNA, and antisense RNA.

[0090] When the payload is an antibody or antigen-binding fragment thereof, the immunoconjugate is a fusion protein, such as a bispecific antibody, a multispecific antibody, a bivalent antibody, a multivalent antibody, and the like. In some embodiments, the payload is a molecule that targets a tumor surface marker or a molecule that targets a surface marker of an immune cell.

[0091] In some embodiments, the immunoconjugate is an antibody-drug conjugate (ADC) , a PROTAC-antibody conjugate (DAC) , a radionuclide-drug conjugate (RDC) , or a fusion protein.

[0092] In some embodiments, the immunoconjugate is an antibody-drug conjugate (ADC) , where the payload includes a biologically active small molecule drug, which may include, but is not limited to, toxins, cell differentiation factors, stem cell trophic factors, steroids, drugs for treating autoimmune diseases, anti-inflammatory drugs, drugs for treating infectious diseases, cytokines, chemotherapeutic agents, immunomodulators, anti-angiogenic agents, anti-proliferative agents, pro-apoptotic agents, glucocorticoids, nucleic acid compounds, and polymers. Biologically active small molecule drugs may include existing active drug units for use in ADCs, such as those disclosed in the Chinese Invention Patent Publication No. CN110997010A.

[0093] In some embodiments, the immunoconjugate is a PROTAC-antibody conjugate (DAC) , where the payload includes a proteolysis-targeting chimera (PROTAC) .

[0094] In some embodiments, the immunoconjugate is a radionuclide-drug conjugate (RDC, also known as radionuclide-conjugated drug) , where the payload includes a radionuclide that achieves therapeutic purposes through the irradiation of its α, β, or Auger rays. Commonly used radionuclides include, but are not limited to, iodine-131, radium-223, thallium-201, arsenic-211, rhodium-188, lutetium-177, and the like.

[0095] In some embodiments, the immunoconjugate is a bispecific antibody, a multispecific antibody, a bivalent antibody, or a multivalent antibody. In some embodiments, the molecule that targets a surface marker of an immune cell is an antibody that binds to a T cell surface marker and forms a T cell-engaged bifunctional antibody with the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application.

[0096] In a seventh aspect, this application provides a pharmaceutical composition including the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application, the nucleic acid according to the third aspect of this application, the vector according to the fourth aspect of this application, the host cell according to the fifth aspect of this application, or the immunoconjugate according to the sixth aspect of this application, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0097] The term "pharmaceutically acceptable carrier" includes pharmaceutically acceptable salts, pharmaceutically acceptable materials, compositions, or carriers, such as liquid or solid fillers, diluents, excipients, solvents, or encapsulating materials, which are involved in carrying or delivering the antibody or antigen-binding fragment thereof of this application in a subject, or carrying or delivering the antibody or antigen-binding fragment thereof of this application to a subject, so that it can perform its intended function. Each carrier must be "acceptable" in the sense of being compatible with the other ingredients of the formulation and not harmful to the subject. Some examples of materials that can be used as pharmaceutically acceptable carriers include: sugars such as lactose, glucose, and sucrose; starches, such as corn starch and potato starch; cellulose and derivatives thereof, such as sodium carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose, and cellulose acetate; powdered tragacanth gum; malt; gelatin; talc; excipients such as cocoa butter and suppository waxes; oils such as peanut oil, cottonseed oil, safflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil, and soybean oil; glycols such as propylene glycol; polyols such as glycerol, sorbitol, mannitol, and polyethylene glycol; esters such as ethyl oleate and ethyl laurate; agar; buffering agents such as magnesium hydroxide and aluminum hydroxide; alginic acid; pyrogen-free water; isotonic saline; Ringer's solution; ethanol; phosphate buffer solutions; diluents; granulating agents; lubricants; adhesives; disintegrants; wetting agents; emulsifiers; colorants; mold release agents; coating agents; sweeteners; flavoring agents; perfuming agents; preservatives; antioxidants; plasticizers; gelling agents; thickeners; hardeners; setting agents; suspending  agents; surfactants; moisturizers; carriers; stabilizers; and other non-toxic compatible substances for use in pharmaceutical formulations; or any combination thereof.

[0098] The pharmaceutical composition may further include an excipient. Specific excipients include buffering agents, surfactants, preservatives, fillers, polymers, and stabilizers, which may be used with the antibody or antigen-binding fragment thereof. Buffering agents are used to control the pH of the composition. Surfactants are used to stabilize proteins, inhibit protein aggregation, inhibit protein adsorption onto surfaces, and assist protein refolding. Exemplary surfactants include Tween 80, Tween 20, Brij 35, Triton X-10, Pluronic F127, and sodium dodecyl sulfate. Preservatives are used to inhibit microbial growth. Examples of preservatives include benzyl alcohol, m-cresol, and phenol. Fillers are used during the lyophilization process, thereby increasing the volume. Hydrophilic polymers (such as dextran, hydroxyethyl starch, polyethylene glycol, and gelatin) can be used to stabilize proteins. Polymers having non-polar moieties (such as polyethylene glycol polymers) can also be used as surfactants. Protein stabilizers may include polyols, saccharides, amino acids, amines, and salts. Suitable saccharides include sucrose and trehalose. Amino acids include histidine, arginine, glycine, methionine, proline, lysine, glutamic acid, and mixtures thereof. Proteins such as human serum albumin can also competitively adsorb onto surfaces and reduce antibody aggregation. It should be noted that a particular molecule can be used for a variety of purposes. For example, histidine can act as a buffering agent and an antioxidant. Glycine can be used as a buffering agent and a filler.

[0099] The antibody or antigen-binding fragment thereof, chimeric antigen receptor, nucleic acid, vector, host cell, immunoconjugate, and pharmaceutical composition of this application may be suitably developed to be suitable for the following routes of administration including inhalation, oral, nasal, rectal, parenteral, sublingual, transdermal, transmucosal (e.g., sublingual, lingual, (trans) buccal, (trans) urethral, vaginal (e.g., transvaginal and intravaginal) , (trans) nasal, and (trans) rectal) , intravesical, intrapulmonary, intraduodenal, intragastric, intrathecal, subcutaneous, intramuscular, intradermal, intraarterial, intravenous, intrabronchial, inhalation, and topical administration. Suitable compositions and dosage forms include, for example, tablets, capsules, sachets, pills, gel caps, lozenges, dispersions, suspensions, solutions, syrups, granules, beads, transdermal patches, gels, powders, pellets, slurries, pastilles, creams, pastes, ointments, lotions, discs, suppositories, liquid sprays for nasal or oral administration, dry powder or aerosol formulations for inhalation, compositions and formulations for intravesical administration, and the like.

[0100] In an eighth aspect, this application provides use of the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application, the nucleic acid according to the third aspect of this application, the vector according to the fourth aspect of this application, the host cell according to the fifth aspect of this application, the immunoconjugate according to the sixth aspect of this application, or the pharmaceutical composition according to the seventh aspect of this application for the manufacture of a medicament for treating a disease associated with abnormal expression of Claudin18.2.

[0101] In some embodiments, the disease associated with abnormal expression of Claudin18.2 includes a cancer. In some embodiments, the disease associated with abnormal expression of Claudin18.2 includes a solid tumor.

[0102] In some embodiments, the disease associated with abnormal expression of Claudin18.2 includes gastric cancer (e.g., gastrointestinal cancer) , pancreatic cancer, lung cancer (e.g., small cell lung cancer, non-small cell lung cancer (NSCLC) , lung adenocarcinoma, or lung squamous cell carcinoma) , esophageal cancer, liver cancer (e.g., hepatocellular carcinoma / hepatoma) , squamous cell carcinoma, peritoneal cancer, brain tumor (e.g., glioblastoma / glioblastoma multiforme (GBM) , non-glioblastoma brain tumor, or meningioma) , glioma (e.g., ependymoma, astrocytoma, anaplastic astrocytoma, oligodendroglioma, or mixed glioma such as oligoastrocytoma) , cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer (e.g., hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma / hepatoma, or hepatic carcinoma) , bladder cancer (e.g., urothelial carcinoma) , breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, rectal cancer, endometrial or uterine cancer, salivary gland cancer, renal cancer (e.g., renal rhabdomyoma) , prostate cancer, vulvar cancer, penile cancer, anal cancer (e.g., anal squamous cell carcinoma) , thyroid cancer, head and neck cancer (e.g., nasopharyngeal carcinoma) , skin cancer (e.g., melanoma or squamous cell carcinoma) , osteosarcoma, Ewing's sarcoma, chondrosarcoma, soft tissue sarcoma (e.g., rhabdomyosarcoma, fibrosarcoma, or Kaposi's sarcoma) , carcinoid, eye cancer (e.g., retinoblastoma) , mesothelioma, lymphocytic / lymphoblastic leukemia (e.g., acute lymphocytic / lymphoblastic leukemia (ALL) , chronic lymphoblastic / lymphocytic leukemia (CLL) , or acute myeloid / myeloblastic leukemia (AML) of T-cell lineage and B-cell precursor lineage, including mast cell leukemia, chronic myeloid / myelocytic / myeloblastic leukemia (CML) , or hairy cell leukemia (HCL) ) , Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma, chronic myelomonocytic leukemia (CMML) , follicular lymphoma (FL) , diffuse large B-cell lymphoma (DLCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , Burkitt's lymphoma (BL) , mycosis fungoides, Sézary syndrome, cutaneous T-cell lymphoma, mast cell tumor, medulloblastoma, nephroblastoma, solitary plasmacytoma, myelodysplastic syndrome, chronic and non-chronic myeloproliferative disorder, central nervous system tumor, pituitary adenoma, vestibular schwannoma, primitive neuroectodermal tumor, ependymoma, choroid plexus papilloma, polycythemia vera, thrombocythemia, gallbladder carcinoma, idiopathic myelofibrosis, and pediatric cancer, such as pediatric sarcoma (e.g., neuroblastoma, rhabdomyosarcoma, and osteosarcoma) .

[0103] In some embodiments, the disease associated with abnormal expression of Claudin18.2 includes gastric cancer, esophageal cancer, intestinal cancer, pancreatic cancer, Wilms tumor, lung cancer, ovarian cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, head and neck cancer, chronic myeloid leukemia, or gallbladder cancer.

[0104] When used herein, the term "treating" refers to the administration of the nanobody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Claudin18.2, the chimeric antigen receptor, the nucleic acid, the vector, the host cell, the pharmaceutical composition, or the immunoconjugate described in this application to prevent, ameliorate, or eliminate a disease or one or more symptoms associated with the disease, and includes, but is not limited to: (i) preventing the disease or disease state from occurring in a mammal, particularly when such mammal is predisposed to the disease state but has not yet been diagnosed as having it; (ii) inhibiting the disease or disease state, i.e., arresting its development; (iii) relieving the disease or disease state, i.e., causing regression of the disease or disease state; and (iv) reducing any direct or indirect pathological consequences of the disease or disease state.

[0105] In the context of cancer, the term "treating" includes any or all of the following: inhibiting or slowing the growth of cancer cells, inhibiting the proliferation of cancer cells, reducing the number of cancer cells, reducing the rate of infiltration of cancer cells into surrounding organs, reducing the rate or extent of tumor metastasis, reducing the overall tumor burden (reducing tumor volume and / or tumor weight) , and ameliorating one or more symptoms associated with cancer.

[0106] When used herein, the term "cancer" has the same meaning as the term "tumor" unless the context clearly contradicts or indicates otherwise.

[0107] In a ninth aspect, this application provides a method for treating a disease associated with abnormal expression of Claudin18.2, the method including administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application, the nucleic acid according to the third aspect of this application, the vector according to the fourth aspect of this application, the host cell according to the fifth aspect of this application, the immunoconjugate according to the sixth aspect of this application, or the pharmaceutical composition according to the seventh aspect of this application.

[0108] When used herein, the term "subject" includes an animal, such as a vertebrate, preferably a mammal, such as a dog, a cat, a pig, a cow, a sheep, a horse, a rodent (e.g., a mouse, a rat, or a guinea pig) , or a primate (e.g., a gorilla, a chimpanzee, and a human) .

[0109] When used herein, the term "therapeutically effective amount" refers to any amount of a drug or agent that, when used alone or in combination with another therapeutic agent, provides a therapeutic effect, such as protecting a subject from the onset of a disease or promoting disease regression. A "therapeutically effective amount" may vary depending on a number of factors, such as the disease state and its severity, the mode of administration, and the age of the mammal to be treated, and may be determined by those skilled in the art based on their own knowledge in combination with information such as the disclosure of this application.

[0110] In a tenth aspect, this application provides a kit including the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application, the nucleic acid according to the third aspect of this application, the vector according to the fourth aspect of this application, the host cell according to the fifth aspect of this application, the immunoconjugate according to the sixth aspect of this application, or the pharmaceutical composition according to the seventh aspect of this application.

[0111] In some embodiments, the kit is used to detect the presence and / or expression abundance of Claudin18.2 in a sample.

[0112] As used herein, "sample" means herein a portion of a larger element. Preferably, the sample is a substance of biological origin. It includes cells and / or other molecular entities to be characterized and / or identified in terms of, for example, physical, biochemical, chemical and / or physiological characteristics, for example, it refers to any sample derived from a subject of interest that is expected or known to include cells and / or molecular entities to be characterized. Samples include, but are not limited to, tissue samples (e.g., tumor tissue samples) , primary or cultured cells or cell lines, cell supernatants, cell lysates, platelets, sera, plasma, vitreous humor, lymph fluid, synovial fluid, follicular fluid, semen, amniotic fluid, milk, whole blood, blood-derived cells, urine, cerebrospinal fluid, saliva, sputum, tear fluid, sweat, mucus, tumor lysates, tissue cultures, tissue extracts such as homogenized tissues, tumor tissues, cell extracts, and combinations thereof.

[0113] In an eleventh aspect, this application provides use of the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, the chimeric antigen receptor according to the second aspect of this application, the nucleic acid according to the third aspect of this application, the vector according to the fourth aspect of this application, the host cell according to the fifth aspect of this application, the immunoconjugate according to the sixth aspect of this application, or the pharmaceutical composition according to the seventh aspect of this application for the manufacture of a reagent for detecting or diagnosing a disease associated with abnormal expression of Claudin18.2.

[0114] In this application, the reagent may be used alone or may be used in combination with an instrument, apparatus, device, or system. In vitro detection of human samples (e.g., various body fluids, cells, tissue samples, etc. ) can be performed using the reagent during disease prevention, diagnosis, therapeutic monitoring, prognostic observation, health status evaluation, and hereditary disease prediction.

[0115] In a twelfth aspect, this application provides a method for detecting the expression level of Claudin18.2 protein in a sample, the method including: contacting the sample with the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect of this application, and detecting the binding of the nanobody or antigen-binding fragment thereof to Claudin18.2 protein.

[0116] The various embodiments and preferred options provided above with respect to this application may be combined with each other (as long as they are not inherently contradictory to each other) , and the various embodiments formed by such combinations are all considered as part of the disclosure of this application.

[0117] Examples Hereinafter, exemplary examples of this application are described with  reference to the accompanying drawings, which include various details of the examples of this application to facilitate understanding. It should be understood that they are to be considered merely exemplary and are in no way intended to limit the scope of protection of this application. The scope of protection of this application is defined only by the claims. Accordingly, those of ordinary skill in the art should recognize that various changes and modifications may be made to the examples described here without departing from the scope of this application. Similarly, descriptions of well-known functions and structures are omitted from the following description for clarity and conciseness.

[0118] The experimental methods in the following examples, unless otherwise specified, are all conventional methods and are carried out according to the techniques or conditions described in the literature in the art or according to the product instructions. The materials, reagents, etc. used in the following examples are all commercially available unless otherwise specified.

[0119] Example 1. Preparation and Screening of Anti-Claudin18.2 Nanobodies Standard biological protocols were used to obtain antibody fragments. Briefly, according to the technical roadmap for obtaining an anti-CLDN18.2 nanobody as shown in FIG. 1A, mammalian cells highly expressing human CLDN18.2 were constructed to immunize the alpacas 4-5 times at multiple subcutaneous immunization sites, and the immune titer was monitored. Peripheral blood was collected from the alpacas, and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated. The lymphocytes were lysed, RNA was extracted, and the RNA was reverse-transcribed into cDNA. VHH sequences were amplified from the cDNA and subcloned into a phage display vector, which was electrotransformed into competent E. coli cells, and a nanobody phage display library was constructed. The mammalian cells highly expressing human CLDN18.1 were used for negative screening. The non-specific clones capable of binding to blank cells and human CLDN18.1 in the display library were removed, and then the mammalian cells highly expressing human CLDN18.2 were used to enrich candidate antibodies. The above process was repeated 3-4 times for enrichment of positive clones. Phage ELISA was used to determine the monoclonal positive rate after four rounds of panning, and the positive nanobody clones capable of binding to CLDN18.2 were selected for sequencing analysis to obtain the nucleic acid and amino acid sequences of candidate antibodies binding to the target protein CLDN18.2.

[0120] The candidate antibody clones were each expressed in vitro, and the identification results are shown in FIG. 1B: the SDS-PAGE (polyacrylamide) protein electrophoresis identification results of 2-F09 (hereinafter also referred to as 2F09) , 2-B08 (hereinafter also referred to as 2B08) , 6-H09 (hereinafter also referred to as 6H09) , 11-F09 (hereinafter also referred to as 11F09) , 4-H09 (hereinafter also referred to as 4H09) , and 2-A12 (hereinafter also referred to as 2A12) antibody clones.

[0121] Using CHO-K1 cells (Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences, SCSP-507) , CHO-K1 cells stably transfected with the human CLDN18.1-coding sequence (SEQ ID NO: 20) (CHO-K1 / 18.1) , CHO-K1 cells stably transfected with the human CLDN18.2-coding sequence (SEQ ID NO: 21) (CHO-K1 / 18.2) , and CHO-K1 cells stably transfected with the mouse CLDN18.2-coding sequence (SEQ ID NO: 22) (CHO-K1 / Mouse 18.2) , the binding specificities of the antibodies to the cells were evaluated by flow cytometry, and the experimental results are shown in FIG. 2. The affinities of the antibodies for CHO-K1, CHO-K1 / 18.1, CHO-K1 / 18.2, and CHO-K1 / Mouse 18.2 were further compared by flow cytometry, and the experimental results are shown in FIG. 3.

[0122] FIG. 2 shows that the positive control (PC, including the KLST-18.2-coding sequence of SEQ ID NO: 23) , 2-B08, 11-F09, and 4-H09 subclones specifically bound to CHO-K1 / 18.2 and CHO-K1 / Mouse 18.2 and did not bind to CHO-K1 and CHO-K1 / 18.1; 2-F09 and 2-A12 subclones also bound to CHO-K1 / 18.2 and CHO-K1 / Mouse 18.2, did not bind to CHO-K1, but weakly bound to CHO-K1 / 18.1; and the negative control (NC, including the sequence of SEQ ID NO: 24) and 6-H09 did not bind to CHO-K1, CHO-K1 / 18.1, CHO-K1 / 18.2, and CHO-K1 / Mouse 18.2.

[0123] FIG. 3 shows that the relative binding affinities of the VHHs of 2-B08, 11-F09, and 4-H09, and the ScFv of KLST-18.2, after chimerization with the human IgG1 Fc portion (SEQ ID NO: 25) , to CHO-K1 cells stably transfected with the human CLDN18.2-coding sequence (A) and the mouse CLDN18.2-coding sequence (B) were satisfactory.

[0124] The relevant amino acid sequence information of 2-B08 is shown in Table 1 below, and the relevant nucleotide sequence information thereof is shown in Table 2 below.

[0125] Table 1. Relevant amino acid sequence information of 2-B08

[0126] Table 2. Relevant nucleotide sequence information of 2-B08

[0127] Example 2. Preparation, Screening, and Identification of Humanized Antibodies of 2B08 According to the results of the screening experiment in Example 1, nanobody  2B08 was selected and humanized by CDR &SDR Grafting and Back mutation. Humanized antibody sequences were synthesized, and then humanized antibody expression vectors were constructed. The expression vectors prepared above were subjected to large-scale plasmid extraction to prepare transfection-grade plasmids. During the design phase, potential glycosylation sites, antibody aggregation, immunogenic sites, post-translational modifications, etc., in the humanized antibodies were predicted using models. Potential glycosylation sites, immunogenic sites, deamidation, isomerization, oxidation, glycosylation, etc. were modified using structural models to avoid unfavorable physicochemical properties for antibody development, such as antibody aggregation, isoelectric points, etc., thereby enhancing the binding activity and developability of the modified antibodies. The humanized antibody expression vectors prepared above were transiently transfected into mammalian cells 293F. The recombinant antibodies were purified using Protein A, concentrated, and then quantified using the BCA method.

[0128] Using the purified antibodies, the binding of the humanized antibodies to cells overexpressing CLDN18.2 was detected by FACS, and the specific binding of the candidate antibodies to the target protein before and after humanization was confirmed. The candidate humanized nanobodies were diluted in a gradient manner and then subjected to FACS with overexpressing cell lines. Curves were plotted with the molar concentrations of the antibodies as the abscissas and the MFI values as the ordinates, and the molar concentration of each antibody was calculated. The four humanized nanobodies were compared with the original antibody 2B08 by flow cytometry, and the experimental results are shown in FIG. 4. The results showed that the binding strengths of humanized 2-B08-HM1 (hereinafter also referred to as HM1) , 2-B08-HM2 (hereinafter also referred to as HM2) , 2-B08-HM3 (hereinafter also referred to as HM3) , and 2-B08-HM4 (hereinafter also referred to as HM4) to CHO-CLDN18.2 and CHO-Mouse CLDN18.2 were consistent with that of the original antibody 2B08.

[0129] The binding strengths of humanized antibodies 2-B08-HM2 and 2-B08-HM4, and non-humanized antibody 2-B08 to CLDN18.2 protein (Acrobiosystems Co., Ltd., CL2-H85D4) were further compared by ELISA, and the experimental results are shown in FIG. 5. The results showed that 2-B08-HM2 and 2-B08-HM4 had similar target binding capabilities to non-humanized antibody 2B08.

[0130] The relevant amino acid sequence information of 2-B08-HM1, 2-B08-HM2, 2-B08-HM3, 2-B08-HM4, and 2-B08-HM5 is shown in Table 3 below, and the relevant nucleotide sequence information thereof is shown in Table 4 below.

[0131] Table 3. Relevant amino acid sequence information of 2-B08-HM1, 2-B08-HM2, 2-B08-HM3, 2-B08-HM4, and 2-B08-HM5

[0132] Table 4. Relevant nucleotide sequence information of 2-B08-HM1, 2-B08-HM2, 2-B08-HM3, 2-B08-HM4, and 2-B08-HM5

[0133] Example 3. Construction of Chimeric Antigen Receptor Plasmids (CAR Plasmids) and Virus Packaging The construction of NK cell chimeric antigen receptor plasmids (CAR  plasmids) was performed. As shown in the plasmid map in FIG. 6A, chimeric antigen receptor-retroviral plasmids that expressed humanized antibodies HM1, HM2, HM3, and HM4, non-humanized antibodies 2B08, 11F09, 4H09, and 8E5-2I (the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 16, and the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 17) , and flag (the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 18, and the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 19) were constructed using pRV-P2A-puro (synthesized by Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., SEQ ID NO: 26) as the vector. These plasmids included CD8a SP (SEQ ID NO: 27) , CD8 Hinge (SEQ ID NO: 28) , CD8 TM (SEQ ID NO: 29) , OX40 (SEQ ID NO: 30) , CD3 zeta (SEQ ID NO: 31) , T2A (SEQ ID NO: 32) , IgE SP (SEQ ID NO: 33) , IL15 (SEQ ID NO: 34) , Linker (SEQ ID NO: 35) , IL15RA (SEQ ID NO: 36) , P2A (SEQ ID NO: 37) , and puro (SEQ ID NO: 38) .

[0134] The construction of T cell chimeric antigen receptor plasmids (CAR plasmids) was carried out. As shown in the plasmid map in FIG. 6B, chimeric antigen receptor-retroviral plasmids that expressed humanized antibody HM2, control antibody 8E5-2I, and flag were constructed using pRV-P2A-puro as the vector. These plasmids included CD8a SP, CD8 Hinge, CD8 TM, OX40, CD3 zeta, P2A, and puro.

[0135] 293T cells cultured to passages 6-10 (Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences, SCSP-502) were seeded into 6-well culture plates at a density of 1 × 106 cells per well. They were cultured overnight at 37℃ with 5%CO2 for transfection, and the culture medium was DMEM containing 10%fetal bovine serum (Gibico) .

[0136] 1.5 μg of each of the CAR retroviral plasmids expressing HM1, HM2, HM3, HM4, 11F09, 4H09, 8E5-2I, and flag, and 1.5 μg of packaging plasmid pCL-10A1 (Novus Biologicals, NBP2-29542) were dissolved in 150 μL of blank DMEM culture medium. 6 μg PEI (1 μg / μl) was dissolved in 150 μl of serum-free DMEM culture medium and the mixture was mixed well.

[0137] The plasmid mixture was added to the PEI mixture, and the resultant was mixed well and incubated at room temperature for 20 min to form a transfection complex. 300 μL of the transfection complex was added dropwise to 6-well plates containing 2 ml of DMEM culture medium with 10%FBS. After 6-8 h, the medium of the transfected 293T cells was replaced with DMEM culture medium containing 10%FBS. The cells were incubated at 37℃ for 72 h, and the viral supernatant was collected.

[0138] Example 4. Construction and Cytotoxicity Determination of CAR NK Cells 1. Preparation of CAR-positive NK cell line 1.1. 12-well plates were coated with retronectin by adding 1 ml of retronectin  solution (in PBS) at 25 μg / ml to each well, and incubating the plates at 4℃ overnight. NK cells cultured for 1 week (peripheral blood mononuclear cells purchased from Zhejiang FTZ Maishun Biotechnology Co., Ltd., catalog number PB003F-W; NK cells were obtained by culturing from peripheral blood mononuclear cells with reference to the method published in https:  / / doi. org / 10.1084 / jem. 20201529) were seeded into retronectin-coated 12-well plates, with a cell number of 5 × 10^5 and a culture medium volume of 1 ml in each well. 1.2. 2 ml of retroviral supernatant was added to each well. The plates were  centrifuged at 32℃ for 90 min and then transferred to a cell incubator. 1.3. After overnight incubation, 1.7 ml of the supernatant was discarded. 1.7  ml of retroviral supernatant was added to each well. The plates were centrifuged at 32℃ for 90 min and then transferred to the cell incubator. 1.4. Expansion culture: The infected cells were passaged at a density of 5 × 10^5 cells / mL every other day, and recombinant human IL-2 (Novoprotein, GMP-CD66-1 mg) with a final concentration of 1000 U / mL was supplemented in the lymphocyte culture medium.

[0139] 2. Expression of NK cell chimeric antigen receptors 2.1. On Day 15 of culture, 1 × 10^6 retrovirus-infected NK cells were taken  into a centrifuge tube and centrifuged for collection. 2.2. For the control groups, 100 μl of Rabbit Anti-Camelid VHH Cocktail [PE]  (Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., A02018-200) (diluted 1.5: 100) antibody was added to the cells, which were incubated on ice and used as the control after resuspension. For the experimental groups, 100 μl of Rabbit Anti-Camelid VHH Cocktail [PE] (diluted 1.5: 100) antibody was added to the cells, which were incubated on ice for 30 min. 2.3. The cells were resuspended in 1 ml of PBS (2%FBS) , the suspension was  centrifuged at 4℃, and then the supernatant was discarded. 200 μl of PBS (2%FBS) was added, and the mixture was transferred to a flow cytometry tube. The PE channel was detected with a flow cytometer to determine the proportion of CAR-positive NK cells. The results are shown in FIG. 7, where HM1, HM2, HM3, HM4, and 8E5-2I were humanized antibodies and therefore could not be detected by Rabbit Anti-Camelid VHH Cocktail [PE] .

[0140] 2.4. Cytotoxicity determination: NUGC-4 target cells expressing the luciferase-coding sequence (SEQ ID NO: 39) (Cobioer Biosciences Co., Ltd., CBP60493) were seeded into 96-well plates at 5 × 10^4 cells per well. HM1, HM2, HM3, HM4, 2B08, 11F09, 4H09, and 8E5-2I NK cells, and NK cells 102NK and 108NK from two healthy donors (effector cells) were added at effector-to-target ratios of 1: 1, 1: 4, 1: 16, and 1: 64. Three replicate wells were set for each group, and the average value of the three replicate wells was calculated. The detection times were 48 h, 96 h, 144 h, 192 h, 240 h, and 288 h. The experimental groups and control groups were each as follows. Each experimental group: target cells + the above effector cells. Target cell group: luciferase signals spontaneously released by target cells. Blank group (no target cells and no effector cells, with other conditions the same as those of the experimental groups) : luciferase signals from the culture medium.

[0141] 3. Luciferase detection of target cells in experimental groups Detection method: GMOne-Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit  (Genomeditech) was used. For specific details, refer to the instructions of the GMOne-Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit. The cytotoxicity calculation formula is as follows:

[0142] The results are shown in FIG. 8. The results showed that HM1, HM2, HM3, HM4, 2B08, 11F09, 4H09, and 8E5-2I NK cells exhibited significant in vitro cytotoxicity against NUGC-4 cells weakly expressing CLDN18.2. Since NK cells are natural killer cells and have a killing mechanism independent of CAR signal against NUGC-4 cells, NK cells 102NK and 108NK from the two healthy donors also exhibited strong cytotoxicity at an early stage. However, as the killing time was extended, it could be observed that the killing capacity of NK cells was decreasing, and the CAR-NK cells still maintained a high capacity to kill the target cells.

[0143] Example 5. Cytotoxicity and Cytokine Secretion Determination of CAR NK92 Cells 1. Preparation of CAR-positive NK92 cell line 1.1. 12-well plates were coated with retronectin by adding 1 ml of retronectin  solution (in PBS) at 25 μg / ml to each well, and incubating the plates at 4℃ overnight. NK92 cells (Cobioer Biosciences Co., Ltd., CBP60980) were seeded into retronectin-coated 12-well plates, with a cell number of 6 × 10^6 and a culture medium volume of 3 ml in each well. 1.2. 200 μl of 2B08-CAR, 2B08-HM2-CAR, and 2B08-HM4-CAR viruses were added to each well. The plates were centrifuged at 32℃ for 90 min and then transferred to a cell incubator. 1.3. Expansion culture: The infected cells were passaged at a density of 5 × 10^5 cells / mL every other day, and recombinant human IL-2 (Novoprotein, GMP-CD66-1 mg) with a final concentration of 1000 U / mL was supplemented in the lymphocyte culture medium.

[0144] 2. Expression of NK92 cell chimeric antigen receptors 2.1. 96 h after infection of NK92 cells with the viruses, 2B08 CAR-NK92, 2B08- HM2 CAR-NK92, and 2B08-HM4 CAR-NK92 were taken and stained with cetuximab (MedChemExpress, HY-P9905) and anti-Human-Fc-PE (ThermoFisher, 12-4998-82) . 2.2. The non-transduced NK92 cells were used as the control to determine the  positive rate of CLDN18.2 CAR-NK92, and the results are shown in FIG. 9. The results showed that the positive rates of 2B08 CAR-NK92, 2B08-HM2 CAR-NK92, and 2B08-HM4 CAR-NK92 were 39.2%, 22.98%, and 20.1%, respectively.

[0145] 2.3. Cytotoxicity determination: The expression level of CLDN18.2 in NUGC-4 target cells expressing the luciferase-coding sequence (Cobioer Biosciences Co., Ltd., CBP60493) is 88.6%. NUGC-4 target cells were seeded into 96-well plates at 1 × 10^4 cells per well. 2B08 CAR-NK92, 2B08-HM2 CAR-NK92, and 2B08-HM4 CAR-NK92 cells (effector cells) were added at effector-to-target ratios of 1: 1, 2.5: 1, 5: 1, and 10: 1. Three replicate wells were set for each group, and the average value of the three replicate wells was calculated. The non-transduced NK92 cells were selected as the control. The detection time was at 6 h of co-culture. The experimental groups and control groups were each as follows. Each experimental group: target cells + the above effector cells. Target cell group: luciferase signals spontaneously released by target cells. Blank group: luciferase signals from the culture medium. The fluorescence value was read, and the luciferase activity was detected to reflect the lytic ability of recombinant CAR-NK92 cells against target cells.

[0146] 3. Luciferase detection of target cells in experimental groups Detection method: GMOne-Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit (Genomeditech) was used. For specific details, refer to the instructions of the GMOne-Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit. The cytotoxicity calculation formula is as follows:

[0147] The results are shown in FIG. 10A. The results showed that 2B08 CAR-NK92, 2B08-HM2 CAR-NK92, and 2B08-HM4 CAR-NK92 cells exhibited significant in vitro cytotoxicity against NUGC-4-Luciferase cells positive for CLDN18.2 expression, which was significantly better than NK92 cells.

[0148] 4. Assay for in vitro induction of cytokine release by CLDN18.2 CAR-NK92 cells 4.1. In order to verify the cytokine secretion of the constructed CAR-NK92  cells after co-incubation with target cells, the cytokines released by 2B08 CAR-NK92, 2B08-HM2 CAR-NK92, and 2B08-HM4 CAR-NK92 cells were detected respectively. After co-culturing at effector-to-target ratios of 1: 1, 2.5: 1, 5: 1, and 10: 1 for 18 h, the supernatants were collected, and the IFN-γ released during co-culture of CAR NK92 lymphocytes and target cells in the supernatant was detected by sandwich ELISA.

[0149] The experimental results are shown in FIG. 10B. The results showed that when co-incubated with NUGC-4-Luciferase cells positive for CLDN18.2 expression, 2B08 CAR-NK92, 2B08-HM2 CAR-NK92, and 2B08-HM4 CAR-NK92 cells were capable of releasing IFN-γ, whereas the NK92 control group did not release IFN-γ, and there were significant differences.

[0150] Example 6. Cytotoxicity and Cytokine Secretion Determination of CAR-T Cells 1. Retroviral infection of T lymphocytes 1.1. Cells were cultured in lymphocyte culture medium (Gibco, 0870112DK)  at a density of about 1.46 × 106 cells / mL, and Dynabeads magnetic beads (Gibco) and recombinant human IL-2 (Novoprotein, GMP-CD66-1 mg) with a final concentration of 250 U / mL were added at a magnetic bead-to-cell ratio of 1: 1 for stimulation and culture for 48 h. 1.2. 24-well plates were coated with retronectin by adding 0.5 ml of retronectin solution (in PBS) at 25 μg / ml to each well, and incubating the plates at 4℃overnight. Then, the retronectin solution (in PBS) in the 24-well plates was discarded, and the plates were washed twice with 1 ml of PBS. 1 ml of retroviral supernatant was added to each well of the retronectin-coated 24-well plates, and the plates were centrifuged at 32℃ for 90 min. 1.3. The viral supernatant was aspirated and discarded, and the cells were  seeded into the retronectin-coated 24-well plates, with a cell number of 5 × 105 and a culture medium volume of 0.5 ml in each well. Additional 0.5 ml of retroviral supernatant was added to each well. The plates were centrifuged at 32℃ for 90 min and then transferred to a cell incubator. 1.4. Expansion culture: The infected cells were passaged at a density of 5 × 105 cells / mL every other day, and recombinant human IL-2 with a final concentration of 250 U / mL was supplemented in the lymphocyte culture medium.

[0151] 2. Expression of T lymphocyte chimeric antigen receptors 2.1. On Day 11 of culture, 1 × 10^6 retrovirus-infected T cells were  centrifuged at 400 g and 4℃ for 5 min, and the supernatant was discarded. 2.2. For control group 1, 100 μl of Rabbit Anti-Camelid VHH Cocktail [PE]  (diluted 3: 200) antibody was added to the cells, which were incubated on ice and used as the control after resuspension. For the HM2 group, 100 μl of Rabbit Anti-Camelid VHH Cocktail [PE] (diluted 3: 200) antibody was added to the cells, which were incubated on ice for 30 min. For control group 2, anti-G4S (CST, 69782S) (diluted 1: 50) antibody was added to the cells, which were incubated on ice and used as the control after resuspension. For the 8E5-2I group, 100 μl of anti-G4S (diluted 1: 50) antibody was added to the cells, which were incubated on ice for 30 min. For control group 3, anti-DYKDDDDK (Biolegend, 63732) (diluted 1: 50) antibody was added to the cells, which were incubated on ice and used as the control after resuspension. For the flag group, 100 μl of anti-DYKDDDDK (diluted 1: 50) antibody was added to the cells, which were incubated on ice for 30 min.

[0152] 2.3. The cells were resuspended in 1 ml of PBS (2%FBS) , the suspension was centrifuged at 4℃, and then the supernatant was discarded. 200 μl of PBS (2%FBS) was added, and the mixture was transferred to a flow cytometry tube. The proportion of CAR-positive T cells was detected with a flow cytometer, and the results are shown in FIG. 11. The results showed that the infection rates of HM2 CAR-T, 8E5-2I CAR-T, and flag CAR-T (control) were 96.4%, 97.52%, and 36.18%, respectively.

[0153] 3. Cytotoxicity determination of CLDN18.2-targeting CART cells 3.1. Target cells: The expression level of CLDN18.2 in AsPC-1 cells  expressing human Claudin18.2 and the luciferase-coding sequence (Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences, SCSP-5080) is 87.07%. CLDN18.2 AsPC-1-Luciferase cells were seeded into 96-well plates at 5 × 104 cells per well.

[0154] 3.2. Effector cells: HM2 CAR-T, 8E5-2I CAR-T, and flag CAR-T were added at effector-to-target ratios of 4: 1, 1: 1, or 1: 4. Three replicate wells were set, and the average value of the three replicate wells was calculated. The detection time was at 24 h.

[0155] 3.3. The experimental groups and control groups were each as follows. HM2 cell experimental group: target cells + HM2 CAR T cells. 8E5-2I cell experimental group: target cells + 8E5-2I CAR T cells. Target cell group: luciferase signals released by target cells plated as the control. Flag group: target cells + flag CAR-T cells. Blank group: luciferase signals from the culture medium.

[0156] 3.4. Detection method: GMOne-Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit (Genomeditech) was used. For specific details, refer to the instructions of the GMOne-Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit. The cytotoxicity calculation formula is as follows:

[0157] 3.5. The cell killing results at different effector-to-target ratios are shown in FIG. 12. The results showed that both HM2 CAR-T and 8E5-2I CAR-T showed good killing effects on AsPC-1 cells positive for CLDN18.2 expression. The killing rate of HM2 CAR-T cells against AsPC-1 cells reached 65%or more at an effector-to-target ratio of 4: 1. The results also showed that the killing effect of flag CAR-T cells on cells positive for CLDN18.2 expression was not significant.

[0158] 4. Assay for in vitro induction of cytokine release by CLDN18.2 CAR-T cells 4.1. In order to verify the cytokine secretion of the constructed CAR-T cells  after co-incubation with target cells, the cytokines released by T cells transfected with empty vector (flag CAR-T cells) , HM2 CAR-T cells, and 8E5-2I CAR-T cells were detected respectively. After co-culturing at an effector-to-target ratio of 1: 1 for 18 h, the supernatants were collected, and the IFN-γ, TNF-α, and GM-CSF released during co-culture of CAR T lymphocytes and target cells in the supernatant were detected by sandwich ELISA.

[0159] 4.2. The experimental results are shown in FIG. 13. The results showed that when co-incubated with target cells, HM2 CAR-T cells and 8E5-2I CAR-T cells secreted the cytokines IFN-γ, TNF-α, and GM-CSF, and the secretion levels of HM2 CAR-T cells were significantly higher than those of 8E5-2I CAR-T cells; whereas the flag CAR-T cell control group did not secrete the above cytokines, and there were statistically significant differences. For the release of the cytokines IFN-γ, TNF-α, and GM-CSF, the P-values of HM2 CAR-T cells vs. flag CAR-T cells were 0.0080, 0.0018, and 0.0006, respectively.

[0160] Example 7. In vivo activity of CLDN18.2 CAR-T cells in AsPC-1-bearing mice The experiment of anti-tumor treatment of T cells transfected with an empty  vector (flag CAR-T cells) and HM2 CAR-T cells against subcutaneous xenograft tumors of CLDN18.2 AsPC-1 cells was performed.

[0161] 1) Inoculation of CLDN18.2 AsPC-1 subcutaneous xenograft tumor: The expression level of CLDN18.2 in AsPC-1 cells expressing the human Claudin18.2-coding sequence (Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences, SCSP-5080) is 99.3%. CLDN18.2 AsPC-1 cells in logarithmic growth phase and growing well were collected, and their density was adjusted to 6 × 107 / mL using DPBS. 8-week-old female NPSG mice (purchased from Phenotek Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. ) were subcutaneously injected in the axillary part of the right foreleg with 50 μL of the cell suspension (3 × 106 cells / mouse) , and the day of tumor cell inoculation was designated as D0.

[0162] 2) Experimental grouping: On D10 after tumor inoculation, tumor size was measured, and NPSG mice were divided into HM2 group as the experimental group and flag group as the negative control group based on the tumor size, with 5 mice in the flag cell group as the negative control and 6 mice in the HM2 cell group as the experimental group.

[0163] 3) Adoptive transfer of T cells: On D11, 1.0 × 107 CAR-T cells resuscitated overnight were infused via the tail vein. The T cells transfected with an empty vector (flag group) were used as the control, and the growth of subcutaneous xenograft tumors was observed and measured.

[0164] The experimental results are shown in FIGs. 14A and B. The results showed that on Day 17 of HM2 CAR T cell treatment, the tumor inhibition rate against CLDN18.2 AsPC-1 xenograft tumors was 100%. According to ethics, when the tumor volume in a mouse is higher than 2000 mm3, it is judged as dead. On Day 21 after tumor inoculation and growth, the mice in the flag group began to die, the survival rate was 80%, and the tumor volume in one mouse in the HM2 CAR T treatment group was 0. On Day 41 after tumor inoculation and growth, all mice in the flag control group died, and all tumor volumes measured in the HM2 CAR T treatment group were 0, which lasted until Day 50 after tumor inoculation and growth.

[0165] Example 8. In vivo activity of CLDN18.2 CAR-T cells in CLDN18.2 CXCL9-AsPC-1-bearing mice The experiment of anti-tumor treatment of T cells transfected with an empty  vector (flag CAR-T cells) , HM2 CAR-T cells, and 8E5-2I CAR-T cells against subcutaneous xenograft tumors of CLDN18.2 CXCL9-AsPC-1 cells was performed.

[0166] 1) Inoculation of CLDN18.2 CXCL9-AsPC-1 subcutaneous xenograft tumors: The expression level of CLDN18.2 in AsPC-1 cells (Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences, SCSP-5080) expressing human Claudin18.2-and human CXCL9-coding sequence (SEQ ID NO: 40) is 99.9%. CLDN18.2 CXCL9-AsPC-1 cells in logarithmic growth phase and growing well were collected, and their density was adjusted to 6 × 107 / mL using DPBS. 8-week-old female NPSG mice were subcutaneously injected in the axillary part of the right foreleg with 50 μL of the cell suspension (3 × 106 cells / mouse) , and the day of tumor cell inoculation was designated as D0.

[0167] 2) Experimental grouping: On D6 after tumor inoculation, tumor size was measured, and NPSG mice were divided into HM2 group as the experimental group, 8E5-2I group as the positive control, and flag group as the negative control based on the tumor size, with 5 mice in each group of the T cell flag group as the negative control, the 8E5-2I cell group as the positive control group, and the HM2 cell group as the experimental group.

[0168] 3) Adoptive transfer of T cells: On D7, 1.0 × 107 CAR-T cells (HM2 CAR-T, 8E5-2I CAR-T, and flag CAR-T) resuscitated after cryopreservation were infused via the tail vein, and the growth of subcutaneous xenograft tumors was observed and measured.

[0169] The experimental results are shown in FIG. 15. The results showed that the tumor inhibition rate of HM2 CAR T cells against CLDN18.2 CXCL9-AsPC-1 xenograft tumors was 100%. According to ethics, when the tumor volume in a mouse is higher than 2000 mm3, it is judged as dead. On Day 24 after tumor growth, the mice in the flag group began to die (FIG. 15B) . On Day 28, the treatment effect on CLDN18.2 AsPC-1 xenograft tumors in the HM2 group was statistically significantly different from that in the flag CAR-T group, with a P value of 0.0030.

Claims

1.A nanobody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to Claudin18.2, wherein the nanobody or antigen-binding fragment thereof comprises CDR1, CDR2, and CDR3, whereinthe amino acid sequence of the CDR1 is as set forth in SEQ ID NO. 7, the amino acid sequence of the CDR2 is as set forth in SEQ ID NO. 8, and the amino acid sequence of the CDR3 is as set forth in SEQ ID NO. 9.2.The nanobody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, comprising the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs. 1-6, or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs. 1-6.3.A chimeric antigen receptor comprising the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 or 2.4.A nucleic acid capable of encoding the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 or 2 or the chimeric antigen receptor according to claim 3.5.The nucleic acid according to claim 4, comprising the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs. 10-15, or a nucleotide sequence having at least 80%sequence identity to the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs. 10-15.6.A vector comprising the nucleic acid according to claim 4 or 5.7.A host cell comprising the nucleic acid according to claim 4 or 5 or the vector according to claim 6.8.An immunoconjugate comprising the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 or 2 or the chimeric antigen receptor according to claim 3, and a payload linked thereto.9.A pharmaceutical composition comprising the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 or 2, the chimeric antigen receptor according to claim 3, the nucleic acid according to claim 4 or 5, the vector according to claim 6, the host cell according to claim 7, or the immunoconjugate according to claim 8, and a pharmaceutically acceptable carrier.10.Use of the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 or 2, the chimeric antigen receptor according to claim 3, the nucleic acid according to claim 4 or 5, the vector according to claim 6, the host cell according to claim 7, the immunoconjugate according to claim 8, or the pharmaceutical composition according to claim 9 for the manufacture of a medicament for treating a disease associated with abnormal expression of Claudin18.2.11.A kit comprising the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 or 2, the chimeric antigen receptor according to claim 3, the nucleic acid according to claim 4 or 5, the vector according to claim 6, the host cell according to claim 7, the immunoconjugate according to claim 8, or the pharmaceutical composition according to claim 9.12.Use of the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 or 2, the chimeric antigen receptor according to claim 3, the nucleic acid according to claim 4 or 5, the vector according to claim 6, the host cell according to claim 7, the immunoconjugate according to claim 8, or the pharmaceutical composition according to claim 9 for the manufacture of a reagent for detecting or diagnosing a disease associated with abnormal expression of Claudin18.2.13.A method for detecting the expression level of Claudin18.2 protein in a sample for non-diagnostic purposes, the method comprising: contacting the sample with the nanobody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 or 2, and detecting the binding of the nanobody or antigen-binding fragment thereof to Claudin18.2 protein.

Images