Linkers, linker conjugates and conjugate compounds thereof

Abstract

The present disclosure provides a linker or a linker conjugate having the formula (II), L-D (II), conjugate compounds having the formula (V), Targeting agent- (L-D)z (V), and a pharmaceutical composition comprising the linker or the linker conjugate or the conjugate compounds.

Description

LINKERS, LINKER CONJUGATES AND CONJUGATE COMPOUNDS THEREOF

[0001] CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims the priority to PCT Application No. PCT / CN2024 / 114914, filed on August 27, 2024, PCT Application No. PCT / CN2024 / 114922, filed on August 27, 2024, and PCT Application No. PCT / CN2025 / 088033, filed on April 9, 2025. The contents of the prior PCT applications are considered as a part of the present disclosure and are incorporated herein in its entirety.TECHNICAL FIELD

[0003] The present disclosure relates to the pharmaceutical filed, specifically to linkers, linker conjugates and conjugate compounds thereof.BACKGROUND

[0004] Antibody-drug conjugates (ADCs) are innovative biopharmaceutical products in which a monoclonal antibody is linked to a small molecule drug with a linker. ADCs ideally combine the specificity of antibodies and high potency of cytotoxic drugs by delivering potent cytotoxic drugs to antigen-expressing cells, thereby enhancing their targeted cytotoxic activity and safety. Recently, with the FDA approval of and two camptothecin derivatives, SN-38 and DXd, have been validated as ADC payloads. SN-38 is a relatively weak toxin, while the linker used by is unstable. Interstitial lung disease (ILD) is a serious adverse effect associated with DXd ADCs.

[0005] Although ADCs has shown good clinical effects and application prospects, there is still room for improvement, especially in the linker part. As a bridge of ADCs, the linker needs to be exquisitely designed, requiring both stability and specific cleavability in tumor cells, as well as pharmaceutical convenience, such as good hydrophilicity. Therefore, there is still room and demand for optimizing the linker of ADC.SUMMARY

[0006] For the any one of above-mentioned purpose, the present disclosure provides a linker, a linker conjugate and conjugate compounds thereof. The linker and the linker conjugate have improved hydrophilicity and stability. The ADCs comprising the linker in the present application show great hydrophilicity and reduce degree of aggregation, which is important to the pharmaceutical preparation and storage. Furthermore, the linker payloads and the ADCs in the present disclosure are more stabilized in vivo.

[0007] In one aspect, the present disclosure provides a linker or a linker conjugate having the following formula (II) ,

[0008] L-D (II) ,

[0009] a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof,

[0010] wherein,

[0011] D is selected from at least one of leaving group or drug unit, optionally, the leaving group comprises halogen,  -OMs, -OTs or -OTf;

[0012] “-” is a suitable binding way connecting the parts of the left and the right of “-” ;

[0013] L has the following formula (III) ,

[0014] L1-L2-L3- (III)

[0015] wherein,

[0016] L2 is absent or -O-C (=O) -;

[0017] L3 is absent or a linker moiety;

[0018] L1 has the following formula (IV)

[0019] wherein,

[0020] R1 is -Q1-Q2-Q3, wherein,

[0021] Q1 is selected from absent, -O- (CH2) n3-C (=O) NH- (CH2) n3-, -O- (CH2) n3-C (=O) - (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -O- (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -C (=O) NH- (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -C (=O) NH- (CH2) n3-C (=O) NH- (CH2) n3-, - (CH2) n3-N (R10) -C (=O) - (CH2) n3-NHC (=O) -, -C (=O) NH- (CH2) n3-C (=O) -,

[0022] Q2 is selected from absent,  - (CH2) n3- (OCH2CH2) n4-, - (CH2CH2O) n4-(CH2) n3-, - (CH2) n4-or - (CH2) n3C (=O) NH (CH2) n3-;

[0023] Q3 is selected from

[0024] B is selected from

[0025] R2 is selected from H, - (CH2) n5-NH-C (=O) - (CH2) n5-R7, - (CH2) n5-C (=O) -NH- (CH2) n5-R7, - (C0-C6 alkylene) -C (=O) -R7, - (C0-C15-alkylene) -R7 or - (CH2) n5-N (-C (=O) CH3) - (CH2) n5-R7;

[0026] R7 is selected from C1-C6 alkyl or hydrophilic motif;

[0027] R3 is selected from H, -C1-C6-alkylene-OH, -C1-C6-alkylene-COOH or

[0028] R4 is selected from H or C1-C6 alkyl;

[0029] R5 is selected from H, C1-C6 alkyl, - (C0-C6 alkylene-OH) or - (C0-C10 alkylene) -NH-C (=O) NH2;

[0030] R10 is selected from H or C1-C6 alkyl;

[0031] m and n are independently selected from 1-20;

[0032] n2 and n3 is independently selected from 0-10;

[0033] n4 is independently selected from 0-20;

[0034] n5 is independently selected from 0-5.

[0035] In one aspect, the present disclosure provides a method of preparing the linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to the present disclosure.

[0036] In one aspect, the present disclosure provides a conjugate compound, the conjugate compounds having the following formula (V) ,

[0037] Targeting agent- (L-D) z (V)

[0038] wherein,

[0039] L is the L according to the present disclosure;

[0040] “-” is a suitable binding way connecting the parts of the left and the right of “-” ;

[0041] D is the drug unit, optionally, the drug unit is a function molecule with a reactive amino group and / or a reactive hydroxyl, more optionally, the drug unit comprises at least one of the groups consisting of a topoisomerase inhibitor, a microtubule-targeting agent (MTA) , a poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor, an ATR inhibitor, a STING agonist, a toll-like receptor agonist, an RNA polymerase inhibitor, a DNA alkylating agent and a tyrosine kinase inhibitor, most optionally, the drug unit comprises at least one of the groups consisting of Exatecan, DXd, SN38, MMAE, MMAF, Eribulin, VE-822, Talazoparib, or Rucaparib, or the drug unit comprises at least one selected from the groups consisting of the following,

[0042] z is an integer of 1 to 20;

[0043] the targeting agent comprises an antibody, peptide, RNA, or DNA molecule.

[0044] In one aspect, the present disclosure provides a method of preparing the conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to the present disclosure.

[0045] In one aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to the present disclosure or the conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to the present disclosure.

[0046] In one aspect, the present disclosure provides use of the linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to the present disclosure or the conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to the present disclosure in the manufacture of a drug for preventing or treating a disease.

[0047] In one aspect, the present disclosure provides a method of preventing or treating a disease in a subject in need thereof, comprising administrating to the subject a therapeutically effective amount of the linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to the present disclosure or the conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to the present disclosure.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0048] Figure 1 shows the HIC chromatogram of ADC1-1, ADC2-1 and Trastuzumab- (MC-GGFG-DXd) 8.

[0049] Figure 2 depicts the line graphs depicting the percent of growth inhibition for OVCAR3 cells with increasing concentrations of ADC1-3 and ADC2-2 in vitro cytotoxicity assay.

[0050] Figure 3 depicts the line graphs depicting the percent of growth inhibition for NCI-N87 cells with increasing concentrations of ADC1-2 and Trastuzumab-M1- (MC-GGFG-DXd) 4 in vitro cytotoxicity assay.

[0051] Figure 4 shows the chromatograms of Hydrophobic interaction chromatography-High performance liquid chromatography (abbreviated HIC-HPLC) of ADC1-1 and ADC1-2.

[0052] Figure 5 shows the chromatograms of HIC-HPLC of ADC1-3 and ADC2-1.

[0053] Figure 6 shows the chromatograms of HIC-HPLC of ADC2-2 and Trastuzumab- (MC-GGFG-DXd) 8.

[0054] Figure 7 shows the chromatograms of HIC-HPLC of Trastuzumab-M1- (MC-GGFG-DXd) 4.

[0055] Figure 8 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of ADC 2-3.

[0056] Figure 9 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of ADC 2-4.

[0057] Figure 10 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of ADC 2-5.

[0058] Figure 11 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of ADC 2-6.

[0059] Figure 12 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of ADC 3-1.

[0060] Figure 13 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of ADC 3-2.

[0061] Figure 14 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of ADC 3-3.

[0062] Figure 15 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of ADC 3-4.

[0063] Figure 16 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of ADC 5-1.

[0064] Figure 17 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of ADC 6-1.

[0065] Figure 18 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of ADC 4-1.

[0066] Figure 19 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of ADC 7-1.

[0067] Figure 20 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of Farletuzumab-mut 4- (LW017) 6.

[0068] Figure 21 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW022) 6.

[0069] Figure 22 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW023) 6.

[0070] Figure 23 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of Trastuzumab- (LW028) 2.

[0071] Figure 24 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW028) 4.

[0072] Figure 25 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW028) 6.

[0073] Figure 26 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of Trastuzumab- (LW031) 2.

[0074] Figure 27 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of Farletuzumab-mut 25-LALA- (LW031) 4.

[0075] Figure 28 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of Farletuzumab-LALA- (LW031) 6.

[0076] Figure 29 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of Farletuzumab-LALA- (LW031) 8.

[0077] Figure 30 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of Farletuzumab-mut 4- (LW011) 4.

[0078] Figure 31 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of ADC 3-5.

[0079] Figure 32 shows the chromatograms of HIC-HPLC and chromatograms of SEC of Farletuzumab-mut 25-LALA- (MC-VC-PAB-MMAE) 4.

[0080] Figure 33 shows the curve of the stability of CES1C enzyme cleavage of LW042 and MC-VC-PAB-MMAE in example 3.1, wherein, the y-axis is remaining amount of the linker-payload and the x-axis is days after incubation in 37℃.

[0081] Figure 34 shows release curve of the free payload during human plasma incubation in example 3.2, wherein, the y-axis is released rate of the free payload and the x-axis is days after incubation in 37℃.

[0082] Figure 35 depicts the line graphs depicting the percent of growth inhibition for OVCAR3 cells with increasing concentrations of ADC 3-4 and Farletuzumab-LALA- (MC-GGFG-DXd) 8 in vitro cytotoxicity assay.

[0083] Figure 36 depicts the inhibition curve of the tumor volume of ADC 3-5 at the dose of 2.5mpk.

[0084] Figure 37 shows the chromatograms of HIC-HPLC of ADC 7-2.

[0085] Figure 38 shows the chromatograms of SEC of ADC 7-2.

[0086] Figure 39 shows release curve of the free payload during mouse plasma incubation in example 3.3, wherein, the y-axis is released rate of the free payload and the x-axis is days after incubation in 37℃.DETAILED DESCRIPTION

[0087] The present disclosure is explained in greater detail below. This description is not intended to be a detailed catalog of all the different ways in which the invention may be implemented, or all the features that may be added to the instant invention. For example, features illustrated with respect to one embodiment may be incorporated into other embodiments, and features illustrated with respect to a particular embodiment may be deleted from that embodiment. In addition, numerous variations and additions to the various embodiments suggested herein will be apparent to those skilled in the art in light of the instant disclosure which do not depart from the instant invention. Hence, the following description is intended to illustrate some particular embodiments of the invention, and not to exhaustively specify all permutations, combinations and variations thereof.

[0088] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the disclosure pertains. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice for testing of the present disclosure, the preferred materials and methods are described herein. In describing and claiming the present disclosure, the following terminology will be used.

[0089] As used herein, the term “and / or” refers to either “and” or “or” unless indicated otherwise.

[0090] As used herein, the term “substituted” refers to that the specified group or moiety bears one or more suitable substituents wherein the substituents may connect to the specified group or moiety at one or more positions. For example, an aryl substituted with -OH may indicate that -OH connects to one atom of the aryl with a bond.

[0091] As used herein, the term “alkyl” refers to a fully saturated branched or unbranched hydrocarbon moiety having up to 20 carbon atoms. As herein defined, alkyl may also be a C1-C6 alkyl. Representative alkyl groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, sec-butyl, iso-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, n-hexyl, 3-methylhexyl, 2, 2-dimethylpentyl, 2, 3-dimethylpentyl, n-heptyl, n-octyl, n-nonyl, n-decyl, and the like.

[0092] As used herein, the term “alkylene” refers to a divalent alkyl radical. Any of the mentioned monovalent alkyl groups may be an alkylene by abstraction of a second hydrogen atom from the alkyl. As herein defined, alkylene may also be a C0-C6 alkylene. An alkylene may further be a C1-C4 alkylene. Representative alkylene groups include, but are not limited to, -CH2-, -CH (CH3) -, -C (CH3) 2-, -CH2CH2-, -CH2-CH (CH3) -, -CH2C (CH3) 2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, and the like.

[0093] As used herein, the term “halogen” refers to fluorine, chlorine, bromine or iodine.

[0094] As used herein, the term “amino” refers to a substituent containing at least one nitrogen atom, e.g., NH2.

[0095] As used herein, the term “salt” or “salts” refers to an acid addition or base addition salt of a compound of the present invention. “Salt” include in particular “a pharmaceutical acceptable salt” . The term “a pharmaceutically acceptable salt” refers to salt that retain the biological effectiveness and properties of the compounds of this invention and, which typically are not biologically or otherwise undesirable. In many cases, the compounds of the present invention are capable of forming acid and / or base salts by virtue of the presence of amino and / or carboxyl groups or groups similar thereto. When both a basic group and an acid group are present in the same molecule, the compounds of the present invention may also form internal salts, e.g., zwitterionic molecules.

[0096] As used herein, the term “stereoisomer” refers to mean a stable isomer that has at least one chiral atom or restricted rotation giving rise to perpendicular dissymmetric planes (e.g., certain biphenyls, allenes, and spiro compounds) and can rotate plane-polarized light. Because asymmetric centers and other chemical structure exist in the compounds of the disclosure which may give rise to stereoisomerism, the disclosure contemplates stereoisomers and mixtures thereof. The compounds of the disclosure and their salts include asymmetric carbon atoms and may therefore exist as single stereoisomers, racemates, and as mixtures of enantiomers and diastereomers. Typically, such compounds will be prepared as a racemic mixture. If desired, however, such compounds can be prepared or isolated as pure stereoisomers, i.e., as individual enantiomers or diastereomers, or as stereoisomer-enriched mixtures. As discussed in more detail below, individual stereoisomers of compounds are prepared by synthesis from optically active starting materials containing the desired chiral centers or by preparation of mixtures of enantiomeric products followed by separation or resolution, such as conversion to a mixture of diastereomers followed by separation or recrystallization, chromatographic techniques, use of chiral resolving agents, or direct separation of the enantiomers on chiral chromatographic columns. Starting compounds of particular stereochemistry are either commercially available or are made by the methods described below and resolved by techniques well-known in the art.

[0097] As used herein, the term “enantiomer” refers to a pair of stereoisomers that are non-superimposable mirror images of each other.

[0098] As used herein, the term “diastereomer” refers to optical isomers which are not mirror images of each other.

[0099] As used herein, the term “racemate” refers to a mixture containing equal parts of individual enantiomers.

[0100] As used herein, the term “solvate” refers to a complex of variable stoichiometry formed by a solute, for example, a compound of Formula (I) and solvent, for example, water, ethanol, or acetic acid. This physical association may involve varying degrees of ionic and covalent bonding, including hydrogen bonding. In certain instances, the solvate will be capable of isolation, for example, when one or more solvent molecules are incorporated in the crystal lattice of the crystalline solid. In general, such solvents selected for the purpose of the disclosure do not interfere with the biological activity of the solute. Solvates encompasses both solution-phase and isolatable solvates. Representative solvates include hydrates, ethanolates, methanolates, and the like.

[0101] Linkers or linker conjugates

[0102] In one aspect, the present disclosure provides a linker or a linker conjugate having the following formula (II) , L-D (II) , a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof,

[0103] wherein,

[0104] D is selected from at least one of leaving group or drug unit, optionally, the leaving group comprises halogen,  -OMs, -OTs or -OTf;

[0105] “-” is a suitable binding way connecting the parts of the left and the right of “-” ;

[0106] L has the following formula (III) ,

[0107] L1-L2-L3- (III)

[0108] wherein,

[0109] L2 is absent or -O-C (=O) -;

[0110] L3 is absent or a linker moiety;

[0111] L1 has the following formula (IV)

[0112] wherein,

[0113] R1 is -Q1-Q2-Q3, wherein,

[0114] Q1 is selected from absent, -O- (CH2) n3-C (=O) NH- (CH2) n3-, -O- (CH2) n3-C (=O) - (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -O- (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -C (=O) NH- (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -C (=O) NH- (CH2) n3-C (=O) NH- (CH2) n3-, - (CH2) n3-N (R10) -C (=O) - (CH2) n3-NHC (=O) -, -C (=O) NH- (CH2) n3-C (=O) -,

[0115] Q2 is selected from absent,  - (CH2) n3- (OCH2CH2) n4-, - (CH2CH2O) n4- (CH2) n3-, - (CH2) n4-or - (CH2) n3C (=O) NH (CH2) n3-;

[0116] Q3 is selected from

[0117] B is selected from

[0118] R2 is selected from H, - (CH2) n5-NH-C (=O) - (CH2) n5-R7, - (CH2) n5-C (=O) -NH- (CH2) n5-R7, - (C0-C6 alkylene) -C (=O) -R7, - (C0-C15-alkylene) -R7 or - (CH2) n5-N (-C (=O) CH3) - (CH2) n5-R7;

[0119] R7 is selected from C1-C6 alkyl or hydrophilic motif;

[0120] R3 is selected from H, -C1-C6-alkylene-OH, -C1-C6-alkylene-COOH or

[0121] R4 is selected from H or C1-C6 alkyl;

[0122] R5 is selected from H, C1-C6 alkyl, - (C0-C6 alkylene-OH) or - (C0-C10 alkylene) -NH-C (=O) NH2;

[0123] m and n are independently selected from 1-20;

[0124] n2 and n3 are independently selected from 0-10;

[0125] n4 is independently selected from 0-20;

[0126] n5 is independently selected from 0-5.

[0127] As used herein, the term “hydrophilic motif” refers to oleophobic groups, which have groups that are soluble in, or readily affinity for water. The hydrophilic motif may attract water molecules or dissolve in water. Compounds with the hydrophilic motif are easily wetted by water. In other words, by introducing the hydrophilic motif, hydrophobic compounds are more soluble in aqueous solution or hydrophobicity of hydrophobic compounds are shielded.

[0128] In some embodiments, Q1 is selected from absent, -C (=O) NH- (CH2) 1-5-NHC (=O) -, - (CH2) 1-5-NH-C (=O) - (CH2) 1-5-NHC (=O) -, - (CH2) 1-5-N (CH3) -C (=O) - (CH2) 1-5-NHC (=O) -, -O (CH2) 1-5-C (=O) - (CH2) 1-5-NHC (=O) -, -O- (CH2) 1-5-NHC (=O) - (CH2) 0-5-,  -O (CH2) 1-5-C (=O) -NH- (CH2) 1-5-, -C (=O) NH- (CH2) 1-5-C (=O) NH- (CH2) 1-5-, -C (=O) NH- (CH2) 1-5-C (=O) -,  In some embodiments, Q1 is selected from absent, -CH2-NH-C (=O) -CH2-NHC (=O) -, -CH2-N (CH3) -C (=O) -CH2-NHC (=O) -, -OCH2-C (=O) -CH2-NHC (=O) -, -OCH2CH2-NH-C (=O) -,  -OCH2-C (=O) -NH-CH2-, -C (=O) NH-CH2-C (=O) NH-CH2-, -C (=O) NH-CH2CH2-NHC (=O) -or -C (=O) NH- (CH2) 3-C (=O) -. In some embodiments, Q1 is selected from -C (=O) NH-CH2CH2-NHC (=O) -.

[0129] In some embodiments, Q2 is selected from absent,  -CH2- (OCH2CH2) 1-10-, - (CH2CH2O) 1-10- (CH2) 0-3-, - (CH2) 1-15-or - (CH2) 0-3C (=O) NH- (CH2) 0-3-. In some embodiments, Q2 is selected from -CH2- (OCH2CH2) 4-, -CH2- (OCH2CH2) 2-, - (CH2CH2O) 4- (CH2) 2-, - (CH2CH2O) 2- (CH2) 2-, - (CH2) 5-, - (CH2) 4-, -CH2-, -CH2C (=O) NH-CH2CH2-or -C (=O) NH-CH2-. In some embodiments, Q2 is selected from - (CH2CH2O) 4- (CH2) 2-.

[0130] In some embodiments, Q3 is selected from In some embodiments, Q3 is selected from In some embodiments, Q3 is selected from

[0131] In some embodiments, R2 is selected from H, - (CH2) 0-3-NH-C (=O) - (CH2) 0-3-R7, - (CH2) 0-3-C (=O) -NH- (CH2) 0-3-R7, - (CH2) 0-3-C (=O) -R7, - (C0-C15-alkylene) -R7 or - (CH2) 0-5-N (-C (=O) CH3) - (CH2) 0-3-R7. In some embodiments, R2 is selected from H, -NH-C (=O) -R7, -C (=O) -NH-CH2-R7, - (CH2) 2-C (=O) NH-CH2-R7, -CH2-C (=O) NH-CH2-R7, -CH2-C (=O) -NH- (CH2) 2-R7, - (CH2) 2-C (=O) -NH- (CH2) 2-R7, -CH2-NH-C (=O) -R7, -CH2-C (=O) -R7, - (CH2) 2-C (=O) -R7, - (CH2) 2-R7, -CH2-R7, -R7, - (CH2) 2-N (-C (=O) CH3) -CH2-R7 or -CH2-N (-C (=O) CH3) -CH2-R7. In some embodiments, R2 is selected from -C (=O) -NH-CH2-R7, - (CH2) 2-R7, -CH2-R7 or -CH2-NH-C (=O) -R7.

[0132] In some embodiments, R7 is selected from -C1 alkyl, -C2 alkyl, -C3 alkyl, -C4 alkyl, -C5 alkyl, -C6 alkyl or hydrophilic motif. In some embodiments, the hydrophilic motif is selected from In some embodiments, R7 is selected from -CH3,

[0133] In some embodiments, R3 is selected from H, - (C1 alkylene) -OH, - (C2 alkylene) -OH, - (C3 alkylene) -OH, - (C4 alkylene) -OH, - (C5 alkylene) -OH, - (C6 alkylene) -OH, - (C1 alkylene) -COOH, - (C2 alkylene) -COOH, - (C3 alkylene) -COOH, - (C4 alkylene) -COOH, - (C5 alkylene) -COOH, - (C6 alkylene) -COOH or In some embodiments, R3 is selected from H, -CH2CH2-COOH, -CH2-OH or -NH-S (O2) -NH2. In some embodiments, R3 is selected from H.

[0134] In some embodiments, R4 is selected from H, C1 alkyl, C2 alkyl, C3 alkyl, C4 alkyl, C5 alkyl or C6 alkyl. In some embodiments, R4 is selected from H, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3 or -CH (CH3) 2. In some embodiments, R4 is selected from H,

[0135] In some embodiments, R5 is selected from H, C1 alkyl, C2 alkyl, C3 alkyl, C4 alkyl, C5 alkyl, C6 alkyl, -OH, - (C1 alkylene) -OH, - (C2 alkylene) -OH, - (C3 alkylene) -OH, - (C4 alkylene) -OH, - (C5 alkylene) -OH, - (C6 alkylene) -OH, -NH-C (=O) NH2, - (C1 alkylene) -NH-C (=O) NH2, - (C2 alkylene) -NH-C (=O) NH2, - (C3 alkylene) -NH-C (=O) NH2, - (C4 alkylene) -NH-C (=O) NH2, - (C5 alkylene) -NH-C (=O) NH2, - (C6 alkylene) -NH-C (=O) NH2, - (C7 alkylene) -NH-C (=O) NH2, - (C8 alkylene) -NH-C (=O) NH2, - (C9 alkylene) -NH-C (=O) NH2 or - (C10 alkylene) -NH-C (=O) NH2. In some embodiments, R5 is selected from H, -CH3,

[0136] In some embodiments, R10 is selected from H, C1 alkyl, C2 alkyl, C3 alkyl, C4 alkyl, C5 alkyl or C6 alkyl. In some embodiments, R10 is selected from H or -CH3.

[0137] In some embodiments, m and n are independently selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20.

[0138] In some embodiments, n2 and n3 is independently selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.

[0139] In some embodiments, n4 is independently selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20.

[0140] In some embodiments, n5 is selected from 0, 1, 2, 3, 4 or 5.

[0141] In some embodiments, L1 has the following formula (IV-1)

[0142] wherein, R1, R2, R3, R4 and R5 are same as those of the present disclosure.

[0143] In some embodiments, R1 is -Q1-Q2-Q3,

[0144] Q1 is selected from -O- (CH2) n3-C (=O) NH- (CH2) n3-, -O- (CH2) n3-C (=O) - (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -O- (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -C (=O) NH- (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -C (=O) NH- (CH2) n3-C (=O) NH- (CH2) n3-, - (CH2) n3-N (R10) -C (=O) - (CH2) n3-NHC (=O) -or

[0145] Q2 is selected from - (CH2) n3- (OCH2CH2) n4-, - (CH2CH2O) n4- (CH2) n3-, - (CH2) n4-or - (CH2) n3C (=O) NH (CH2) n3-;

[0146] Q3 is selected from

[0147] R2 is selected from H, - (CH2) n5-NH-C (=O) - (CH2) n5-R7, - (CH2) n5-C (=O) -NH- (CH2) n5-R7, - (C0-C3 alkylene) -C (=O) -R7, - (C0-C6 alkylene) -R7 or - (CH2) n5-N (-C (=O) CH3) - (CH2) n5-R7;

[0148] R7 is selected from C1-C6 alkyl or hydrophilic motif, the hydrophilic motif is selected from

[0149] R3 is selected from H, -C1-C6-alkylene-OH or -C1-C6-alkylene-COOH ;

[0150] R10 is selected from H or C1-C6 alkyl;

[0151] m and n are independently selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20;

[0152] n2 and n3 are independently selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;

[0153] n4 is independently selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20;

[0154] n5 is independently selected from 0, 1, 2, 3, 4 or 5.

[0155] In some embodiments, Q1 is selected from -O (CH2) 1-5-C (=O) - (CH2) 1-5-NHC (=O) -, -O (CH2) 1-5-NH-C (=O) -, -O (CH2) 1-5-C (=O) -NH- (CH2) 1-5-, -C (=O) NH- (CH2) 1-5-NHC (=O) -, -C (=O) NH- (CH2) 1-5-C (=O) NH- (CH2) 1-5-, - (CH2) 1-5-NH-C (=O) - (CH2) 1-5-NHC (=O) -, - (CH2) 1-5-N (CH3) -C (=O) - (CH2) 1-5-NHC (=O) -or Q2 is selected from -CH2- (OCH2CH2) 1-10, - (CH2CH2O) 1-10- (CH2) 0-5-, - (CH2) 1-15-or - (CH2) 0-3C (=O) NH (CH2) 0-5-; Q3 is selected from  R2 is selected from H, -NH-C (=O) -R7, -C (=O) -NH-CH2-R7, - (CH2) 2-C (=O) -NH-CH2-R7, --CH2-C (=O) -NH-CH2-R7, -CH2-C (=O) -NH- (CH2) 2-R7, -CH2-NH-C (=O) -R7, -CH2-C (=O) -R7, -CH2CH2-R7, -CH2-R7, -R7, - (CH2) 2-N (-C (=O) CH3) -CH2-R7 or -CH2-N (-C (=O) CH3) -CH2-R7; R7 is selected from -CH3,

[0156] In some embodiments, Q1 is selected from -CH2-NH-C (=O) -CH2-NHC (=O) -, -CH2-N (CH3) -C (=O) -CH2-NHC (=O) -, -OCH2-C (=O) -CH2-NHC (=O) -, -OCH2CH2-NH-C (=O) -, -OCH2-C (=O) -NH-CH2-, -C (=O) NH-CH2-C (=O) NH-CH2-, -C (=O) NH-CH2CH2-NHC (=O) -or  Q2 is selected from -CH2- (OCH2CH2) 4-, -CH2-OCH2CH2O- (CH2) 2-, -(CH2CH2O) 2- (CH2) 2-, - (CH2CH2O) 4- (CH2) 2-, - (CH2) 5-, - (CH2) 4-, - (CH2) 2-or -CH2-; Q3 is selected from

[0157] In some embodiments, R1 is selected from In some embodiments, R1 is selected from

[0158] In some embodiments, R2 is selected from H, - (CH2) 0-3-NH-C (=O) - (CH2) 0-3-R7, - (CH2) 0-3-C (=O) -NH- (CH2) 0-3-R7, - (CH2) 0-3-C (=O) -R7, - (C0-C5 alkylene) -R7 or - (CH2) 0-5-N (-C (=O) CH3) - (CH2) 0-3-R7; R7 is selected from -C1 alkyl, -C2 alkyl, -C3 alkyl, -C4 alkyl, -C5 alkyl, -C6 alkyl, R3 is selected from H, - (C1 alkylene) -OH, - (C2 alkylene) -OH, - (C3 alkylene) -OH, - (C4 alkylene) -OH, - (C5 alkylene) -OH, - (C6 alkylene) -OH, - (C1 alkylene) -COOH, - (C2 alkylene) -COOH, - (C3 alkylene) -COOH, - (C4 alkylene) -COOH, - (C5 alkylene) -COOH, - (C6 alkylene) -COOH.

[0159] In some embodiments, R2 is selected from H, -NH-C (=O) -R7, -C (=O) -NH-CH2-R7, - (CH2) 2-C (=O) -NH-CH2-R7, -CH2-C (=O) -NH-CH2-R7, -CH2-C (=O) -NH- (CH2) 2-R7, -CH2-NH-C (=O) -R7, -CH2CH2-R7, -CH2-R7, -R7, - (CH2) 2-N (-C (=O) CH3) -CH2-R7 or -CH2-N (-C (=O) CH3) -CH2-R7; R7 is selected from -CH3,  R3 is selected from H, -CH2CH2-COOH or -CH2-OH.

[0160] In some embodiments, R2 is selected from H, -NH-C (=O) -CH3,  R3 is selected from H, -CH2CH2-COOH or -CH2-OH. In some embodiments, R2 is selected from R3 is selected from H.

[0161] In some embodiments, R4 is selected from H or C1-C3 alkyl; R5 is selected from H, C1-C3 alkyl or

[0162] In some embodiments, R4 is selected from H or R5 is H, -CH3 or

[0163] In some embodiments, B is selected from

[0164] In some embodiments, L1 has the following formula (IV-2)

[0165] wherein,

[0166] R1 is -Q1-Q2-Q3,

[0167] Q1 is selected from -O- (CH2) n3-C (=O) - (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -O- (CH2) n3-C (=O) NH- (CH2) n3-, -O- (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -C (=O) NH- (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, or - (CH2) n3-N (R10) -C (=O) - (CH2) n3-NHC (=O) -;

[0168] Q2 is selected from - (CH2) n3- (OCH2CH2) n4-or - (CH2CH2O) n4- (CH2) n3-;

[0169] Q3 is selected from

[0170] n3 is independently selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;

[0171] n4 is independently selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20.

[0172] In some embodiments, Q1 is selected from -O (CH2) 1-5-C (=O) - (CH2) 1-5-NHC (=O) -, -O-(CH2) 1-5-C (=O) NH- (CH2) 0-5-, -O- (CH2) 1-5-NHC (=O) - (CH2) 0-5-, - (CH2) 1-5-NH-C (=O) - (CH2) 1-5-NHC (=O) -, - (CH2) 1-5-N (CH3) -C (=O) - (CH2) 1-5-NHC (=O) -or -C (=O) NH- (CH2) 1-5-NHC (=O) -; Q2 is - (CH2) 0-3- (OCH2CH2) 1-10-or - (CH2CH2O) 1-15- (CH2) 0-3-; Q3 is

[0173] In some embodiments, Q1 is selected from -C (=O) NH-CH2CH2-NHC (=O) -, -CH2-N (CH3) -C (=O) -CH2-NHC (=O) -, -OCH2-C (=O) -NH-or -OCH2-C (=O) -CH2-NHC (=O) -; Q2 is selected from -CH2-OCH2CH2O- (CH2) 2-, - (CH2CH2O) 2- (CH2) 2-, -CH2- (OCH2CH2) 4-or - (CH2CH2O) 4- (CH2) 2-; Q3 is

[0174] In some embodiments, R1 is selected from

[0175] In some embodiments, L1 is selected from any one of the following:

[0176] In some embodiments, L2 is absent or -O-C (=O) -; L3 is absent.

[0177] In some embodiments, D is the drug unit.

[0178] In some embodiments, the drug unit is a function molecule with a reactive amino group and / or a reactive hydroxyl. In some embodiments, the drug unit comprises at least one of the groups consisting of a topoisomerase inhibitor, a microtubule-targeting agent (MTA) , a poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor, an ATR inhibitor, a STING agonist, a toll-like receptor agonist, an RNA polymerase inhibitor, a DNA alkylating agent and a tyrosine kinase inhibitor. In some embodiments, the drug unit is selected from Exatecan, DXd, SN38, MMAE, MMAF, Eribulin, SN38, Talazoparib, or Rucaparib or the compound, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or the drug unit comprises at least one selected from the groups consisting of the following,

[0179] In some embodiments, the drug unit is selected from at least one of the groups consisting of Exatecan, DXd, MMAE, MMAF, Eribulin, Rucaparib, VE-822, SN38, BRYT1003-1047, BRYT1003-1054 or BRYT1003-1069.

[0180] As used herein, the term “drug unit” refers to any cytotoxic molecule or any molecule of medical interest bears at least one substituted group or a partial structure allowing connection to L. The drug unit may kill cancer cells and / or inhibit growth, proliferation, or metastasis of cancer cells, thereby reducing, alleviating, or eliminating one or more symptoms of a disease or disorder.

[0181] As used herein, the term “areactive amino group” refers to the amino group with chemically reactive, which could connect the drug unit and the L.

[0182] As used herein, the term “areactive hydroxyl group” refers to the hydroxyl group with chemically reactive, which could connect the drug unit and the L.

[0183] In some embodiments, the L and the drug unit could be connected with a “N-chemical group” bond or a “O-chemical group” bond.

[0184] As used herein, the term “Exatecan” refers to the following structure:

[0185] As used herein, the term “DXd” refers to the following structure:

[0186] As used herein, the term “SN38” refers to the following structure:

[0187] As used herein, the term “MMAE” refers to the following structure:

[0188] As used herein, the term “MMAF” refers to the following structure:

[0189] As used herein, the term “Eribulin” refers to the following structure:

[0190] As used herein, the term “VE-822” refers to the following structure:

[0191] As used herein, the term “Talazoparib” refers to the following structure:

[0192] As used herein, the term “Rucaparib” refers to the following structure:

[0193] In some embodiments, the linker conjugate is selected from any one of the following

[0194] In one aspect, the present disclosure provides a method of preparing the linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to the present disclosure.

[0195] Conjugate Compounds

[0196] In one aspect, the present disclosure provides conjugate compounds, the conjugate compounds having the following formula (V) ,

[0197] Targeting agent- (L-D) z (V)

[0198] wherein,

[0199] L is the L according to any one of the present disclosure;

[0200] “-” is a suitable binding way connecting the parts of the left and the right of “-” ;

[0201] D is the drug unit, optionally, the drug unit is a function molecule with a reactive amino group and / or a reactive hydroxyl, more optionally, the drug unit comprises at least one of the groups consisting of a topoisomerase inhibitor, a microtubule-targeting agent (MTA) , a poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor, an ATR inhibitor, a STING agonist, a toll-like receptor agonist, an RNA polymerase inhibitor, a DNA alkylating agent and a tyrosine kinase inhibitor, most optionally, the drug unit comprises at least one of the groups consisting of Exatecan, DXd, SN38, MMAE, MMAF, Eribulin, VE-822, Talazoparib, or Rucaparib, or the drug unit comprises at least one selected from the groups consisting of the following,

[0202] z is an integer of 1 to 20;

[0203] the targeting agent comprises an antibody, peptide, RNA, or DNA molecule.

[0204] In some embodiments, z is selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20.

[0205] In some embodiments, z refers to the theoretical amount of -L-D linked to the targeting agents.

[0206] As used herein, the term “DAR” refers to the drug-antibody ratio which is the average amount of -L-D (the linker-payload) linked to the antibody.

[0207] As used herein, the term “Dx” or “the ADC with Dx” refers to the ADC in which the theoretical average number of payloads coupling to a single antibody molecule is about x. For example, D2 or the ADC with D2 means that about two drug molecules (e.g., 1.6, 2.0, 2.4 molecules) are coupled to one single antibody molecule on average. In some embodiments, x is selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20.

[0208] In some embodiments, when z is 1, the DAR referring to -L-D could be 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3 or 1.4. In some embodiments, when z is 2, the DAR referring to -L-D could be 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3 or 2.4. In some embodiments, when z is 3, the DAR referring to -L-D could be 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3 or 3.4. In some embodiments, when z is 4, the DAR referring to -L-D could be 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3 or 3.4. In some embodiments, when z is 5, the DAR referring to -L-D could be 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3 or 5.4. In some embodiments, when z is 6, the DAR referring to -L-D could be 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3 or 6.4. In some embodiments, when z is 7, the DAR referring to -L-D could be 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 or 7.4. In some embodiments, when z is 8, the DAR referring to -L-D could be 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3 or 8.4.

[0209] In some embodiments, there is no specific limitation to the targeting agent. According to the antigens associated with the disease, those skilled in the art can select suitable targeting agent.

[0210] In some embodiments, the conjugate compounds are antibody drug conjugates.

[0211] In some embodiments, the antibody is a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a mono-specific antibody or a multi-specific antibody.

[0212] As used herein, the term “antibody” refers to any immunoglobulin that binds to a specific antigen. A native intact antibody comprises two heavy chains and two light chains. Each heavy chain consists of a variable region and a first, second, and third constant region, while each light chain consists of a variable region and a constant region. The heavy chain from any vertebrate species can be assigned to one of five different classes (or isotypes) : IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM.

[0213] As used herein, the term “Fc region” refers to a monomeric, dimeric or heterodimeric protein having at least an immunoglobulin CH2 and CH3 domain. The CH2 and CH3 domains can form at least a part of the dimeric region of the protein / molecule (e.g., antibody) .

[0214] In some embodiments, the antibody is a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody or an antigen-binding moiety thereof.

[0215] As used herein, the term “human antibody” refers to one which possesses an amino acid sequence which corresponds to that of an antibody produced by a human or a human cell or derived from anon-human source that utilizes human antibody repertoires or other human antibody-encoding sequences. This definition of a human antibody specifically excludes a humanized antibody comprising non-human antigen-binding residues.

[0216] As used herein, the term “humanized antibody” refers to a chimeric antibody comprising amino acid residues from non-human heavy chain variable regions (HVRs) and amino acid residues from human FRs. In certain embodiments, a humanized antibody will comprise substantially all or at least one, and typically two, variable domains, in which all or substantially all of the HVRs (e.g., CDRs) correspond to those of a non-human antibody, and all or substantially all of the FRs correspond to those of a human antibody. A humanized antibody optionally may comprise at least a portion of an antibody constant region derived from a human antibody. A “humanized form” of an antibody, e.g., a non-human antibody, refers to an antibody that has undergone humanization.

[0217] As used herein, the term “chimeric antibody” refers to an antibody in which a portion of the heavy and / or light chain is derived from a particular source or species, while the remainder of the heavy and / or light chain is derived from a different source or species.

[0218] In some embodiments, the antibody means an immunoglobulin and is a molecule containing an antigen-binding site immunospecifically binding to an antigen. In some embodiment, the class of the antibody is IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, or IgY. In some embodiments, the class of the antibody is IgG.

[0219] In some embodiments, the class of the antibody is IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4. In some embodiments, the antibody is IgG1 or IgG4.

[0220] In some embodiments of the present application, the antibody comprises at least one mutation in the Fc region. In some embodiments, the at least one mutation modulates effector function, or attenuates or eliminates Fc-g receptor binding.

[0221] In some embodiments, the one or more mutations are to stabilize the antibody and / or to increase half-life. In some instances, the one or more mutations are to modulate Fc receptor interactions, to reduce or eliminate Fc effector functions such as FcγR, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) , or complement-dependent cytotoxicity (CDC) . In additional instances, the one or more mutations are to modulate glycosylation.

[0222] In some embodiments, the one or more mutations are located in the Fc region. In some instances, the Fc region comprises a mutation at residue position L234, L235, or a combination thereof. In some instances, the mutations comprise L234 and L235. In some instances, the mutations comprise L234A and L235A. In some cases, the residue positions are in reference to IgGl.

[0223] In some embodiments, the Fc region comprises a mutation at residue position L234, L235, D265, N21, K46, L52, or P53, or a combination thereof. In some instances, the mutations comprise L234 and L235 in combination with a mutation at residue position K46, L52, or P53.

[0224] In some embodiments, the Fc region comprises mutations at L234, L235, and K46. In some cases, the Fc region comprises mutations at L234, L235, and L52. In some cases, the Fc region comprises mutations at L234, L235, and P53. In some cases, the Fc region comprises mutations at D265 and N21. In some cases, the residue position is in reference to IgGl.

[0225] In some instances, the Fc region comprises L234A, L235A, D265A, N21G, K46G, L52R, or P53G, or a combination thereof. In some instances, the Fc region comprises L234A and L235A in combination with K46G, L52R, or P53G. In some cases, the Fc region comprises L234A, L235A, and K46G. In some cases, the Fc region comprises L234A, L235A, and L52R. In some cases, the Fc region comprises L234A, L235A, and P53G. In some cases, the Fc region comprises D265A and N21G. In some cases, the residue position is in reference to IgGl.

[0226] In some embodiments, the Fc region comprises a mutation at residue position L233, L234, D264, N20, K45, L51, or P52. In some instances, the Fc region comprises mutations at L233 and L234. In some instances, the Fc region comprises mutations at L233 and L234 in combination with a mutation at residue position K45, L51, or P52. In some cases, the Fc region comprises mutations at L233, L234, and K45. In some cases, the Fc region comprises mutations at L233, L234, and L51. In some cases, the Fc region comprises mutations at L233, L234, and K45. In some cases, the Fc region comprises mutations at L233, L234, and P52. In some instances, the Fc region comprises mutations at D264 and N20. In some cases, equivalent positions to residue L233, L234, D264, N20, K45, L51, or P52 in an IgGl, IgG2, IgG3, or IgG4 framework are contemplated.

[0227] In some embodiments, the Fc region comprises L233A, L234A, D264A, N20G, K45G, L51R, or P52G. In some instances, the Fc region comprises L233A and L234A. In some instances, the Fc region comprises L233A and L234A in combination with K45G, L51R, or P52G. In some cases, the Fc region comprises L233A, L234A, and K45G. In some cases, the Fc region comprises L233A, L234A, and L51R. In some cases, the Fc region comprises L233A, L234A, and K45G. In some cases, the Fc region comprises L233A, L234A, and P52G. In some instances, the Fc region comprises D264A and N20G.

[0228] In some embodiments, the human IgG constant region is modified to alter antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and / or complement-dependent cytotoxicity (CDC) , e.g., with an amino acid modification described in Natsume et al., 2008 Cancer Res, 68 (10) : 3863-72; Idusogie et al., 2001 J Immunol, 166 (4) : 2571-5; Moore et al., 2010 mAbs, 2 (2) : 181-189; Lazar etal, 2006 PNAS, 103 (11) : 4005-4010, Shields etal, 2001 JBC, 276 (9) : 6591-6604; Stavenhagen etal., 2007 Cancer Res, 67 (18) : 8882-8890; Stavenhagen etal., 2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164; Alegre et al, 1992 J Immunol, 148: 3461-3468; Reviewed in Kaneko and Niwa, 2011 Biodrugs, 25 (1) : 1-11.

[0229] In some embodiments, the antibody of IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 is human or humanized antibody. The information of IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 can be obtained on NCBI or UniProt (https:  / / www. uniprot. org / ) .

[0230] In some embodiments, the antibody is bispecific antibodies. In some embodiments of the present application, the antibody is IgG1 like bispecific antibodies.

[0231] In some embodiment, those skilled in the art can select suitable method to prepare the bispecific antibodies. In some embodiments, the bispecific antibodies can be obtained by Knobs-in-holes technology (Ridgway J B B, Presta L G, Paul C. 'Knobs-into-holes'engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization [J] . Protein Engineering (7) : 617 (2023-08-11) . ) , format chain exchange (FORCE) technology, a common light chain format technology (De Nardis C, Hendriks L J A, Poirier E, et al . Anew approach for generating bispecific antibodies based on a common light chain format and the stable architecture of human immunoglobulin G1 [J] . Journal of Biological Chemistry, 2017: jbc. M117.793497. ) , controlled Fab arm exchange technology (Yanakieva De, Pekar L, Evers A, et al. Beyond bispecificity: Controlled Fab arm exchange for the generation of antibodies with multiple specificities [J] . MABS, 2022, 14 (1) , e2018960) , CrossMAb technology (Klein C, Schaefer W, Regula J T. The use of CrossMAb technology for the generation of bi-and multispecific antibodies [J] . MABS, 2016, 8 (6) , P1010-P1020. ) or their combination.

[0232] As used herein, the term “knobs-into-holes” is used in its broadest sense and encompasses various situations, such as the CH1 domain of one heavy chain with the knob mutations and the CH1 domain of the other heavy chain with the hole mutations, the CH2 domain of one heavy chain with the knob mutations and the CH2 domain of the other heavy chain with the hole mutations, and / or the CH3 domain of one heavy chain with the knob mutations and the CH3 domain of the other heavy chain with the hole mutations. For example, and generally, “knobs-into-holes” may refer to an intra-interface modification between two antibody heavy chains in the CH3 domains: i) in the CH3 domain of one heavy chain (first CH3 domain) , an amino acid residue is substituted with another amino acid residue bearing a large side chain, thereby creating a protrusion ( “knob” ) in the interface in the first CH3 domain; ii) in the CH3 domain of the other heavy chain (second CH3 domain) , an amino acid residue is substituted with another amino acid residue bearing a smaller side chain, thereby creating a cavity ( “hole” ) within the interface in the second CH3 domain, in which a protrusion ( “knob” ) in the first CH3 domain can be placed.

[0233] In some embodiments, the antibody is selected from any one of cytotoxic antibodies, inhibitors of cell proliferation, regulators of cell activation and interaction, regulators of the human immune system, neutralizations of antigens, antibodies that are immunospectific for viral antigens or antibodies that are immunospectific for microbial antigens.

[0234] In some embodiment, the antibody can be target-specific antibodies. In some embodiment, without the limitation, the antibody can be anti-HER2 antibody, anti-FAP antibody, anti-OX-40 antibody, anti-41BB antibody, anti-Angiopoietin-2 antibody, anti-ant-IL-4Rα antibody, anti-BCMA antibody, anti-Blys antibody, anti-BTNO2 antibody, anti-C5 antibody, anti-CD122 antibody, anti-CD13 antibody, anti-CD133 antibody, anti-CD137 antibody, anti-CD138 antibody, anti-CD16a antibody, anti-CD19 antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD22 antibody, anti-CD27 antibody, anti-CD28 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD30 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD38 antibody, anti-CD40 antibody, anti-CD47 antibody, anti-CD-8 antibody, anti-CD79 antibody, anti-CEA antibody, anti-CGPR / CGRPR antibody, anti-CSPGs antibody, anti-CTLA4 antibody, anti-CTLA-4domains antibody, anti-DLL-4 antibody, anti-EGFR antibody, anti-EpCAM antibody, anti-factor IXa antibody, anti-factor X antibody, anti-GITR antibody, anti-GP130 antibody, anti-Her3 antibody, anti-HSG antibody, anti-ICOS antibody, anti-IGF1 antibody, anti-IGF1 / 2 antibody, anti-IGF-1R antibody, anti-IGF2 antibody, anti-IGFR antibody, anti-IL-1 antibody, anti-IL-12 antibody, anti-IL-12p40 antibody, anti-IL-13 antibody, anti-IL-17A antibody, anti-IL-1β antibody, anti-IL-23 antibody, anti-IL-5 antibody, anti-IL-6 antibody, anti-IL-6R antibody, anti-Lag-3 antibody, anti-LAG3 antibody, anti-MAG antibody, anti-Met antibody, anti-NgR antibody, anti-NogoA antibody, anti-OMGp antibody, anti-OX40 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PDGFR antibody, anti-PDL-1 antibody, anti-PSMA antibody, anti-RGMA antibody, anti-RGMB antibody, anti-SARS-CoV-2 antibody, anti-Te38 antibody, anti-TIM-3 antibody, anti-TNF antibody, anti-TNFα antibody, anti-TROP-2 antibody, anti-TWEAK antibody, anti-VEGF antibody, or anti-VEGFR antibody.

[0235] In some embodiments, the target of the antibody comprises HER2, Trop2, HER3, EGFR, Nectin4, CD19, CD30, CD79b, C-Met, B7H3, B7H4, LIV-1, ROR1, ROR2, CDH6, CDH3, FOLR1, PSMA, 5T4, MUC1, MUC16, MUC18, PTK7, ADAM9, LRRC-15, DLL3, MSLN, FGFR2b, FGFR3, CLDN6, Claudin18.2, CD38, CD37, CD70, CD73, CD74, NaPi2b, CEACAM5, CD20, CD25, CCR8, BCMA, GPRC5D, GPC3, CDH17, PD-L1, TNFα, GD2, TfR1, CD22, CD33, FAP, CD44, SnT or CD47.

[0236] In some embodiments, the antibody could be Transtuzumab, Sacituzumab, Belantamab, Risankizumab, Eptinezumab, Teprotumumab, Polatuzumab, Tafasitamab, Rovelizumab, Romosozumab, Dostarlimab, Enfortumab, Ublituximab, Trastuzumab-M1 or Farletuzumab-M1, wherein, Trastuzumab-M1 and Farletuzumab-M1 independently comprise a heavy chain and a light chain, the heavy chain of Trastuzumab-M1 comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 1, the light chain of Trastuzumab-M1 comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 2; or the heavy chain of Farletuzumab-M1 comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain of Farletuzumab-M1 comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4.

[0237] In some embodiments, the antibody is selected from trastuzumab, farletuzumab or mutant antibody, the mutant antibody comprises a heavy chain and a light chain, (1) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 1, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 2; and / or, (2) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4; and / or, (3) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 5, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 6; and / or, (4) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8; and / or, (5) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 9, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 10.

[0238] In some embodiments, the antibody could be obtained commercially or produced by any method known to those skilled in the art.

[0239] In some embodiments, the conjugate compounds are selected from any of the following

[0240] the antibody is selected from trastuzumab, farletuzumab or mutant antibody, wherein, the mutant antibody comprises a heavy chain and a light chain, (1) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 1, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 2; and / or, (2) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4; and / or, (3) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 5, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 6; and / or, (4) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8; and / or, (5) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 9, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 10;

[0241] z is selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15.

[0242] In some embodiments, in ADC 1, z is 8, the antibody is trastuzumab.

[0243] In some embodiments, in ADC 1, z is 4, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 1, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 2.

[0244] In some embodiments, in ADC 1, z is 4, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4.

[0245] In some embodiments, in ADC 2, z is 8, the antibody is trastuzumab.

[0246] In some embodiments, in ADC 2, z is 4, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4.

[0247] In some embodiments, in ADC 2, z is 2, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8.

[0248] In some embodiments, in ADC 2, z is 6, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4.

[0249] In some embodiments, in ADC 2, z is 8, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8.

[0250] In some embodiments, in ADC 3, z is 2, the antibody is trastuzumab.

[0251] In some embodiments, in ADC 3, z is 4, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 9, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 10.

[0252] In some embodiments, in ADC 3, z is 6 or 8, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 5, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 6, or, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8.

[0253] In some embodiments, in ADC 4, z is6, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8.

[0254] In some embodiments, in ADC 5, z is 6, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4.

[0255] In some embodiments, in ADC 6, z is 6, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 5, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 6.

[0256] In some embodiments, in ADC 7, z is 6 or 8, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8.

[0257] In one aspect, the present disclosure provides a method of preparing the conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to the present disclosures.

[0258] A pharmaceutical composition

[0259] In one aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to the present disclosure or the conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to the present disclosure.

[0260] In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises one or more of pharmaceutically acceptable carrier.

[0261] Pharmaceutical compositions provided herein may be formulated in any manner known in the art, such as, pharmaceutical compositions provided herein can be formulated for parenteral (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) administration in dosage unit form (i.e., physically discrete units containing a predetermined quantity of active compound for ease of administration and uniformity of dosage) .

[0262] Pharmaceutical compositions are formulated to be compatible with their intended route of administration (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) .

[0263] Pharmaceutical acceptable carriers for use in the pharmaceutical compositions disclosed herein may include, for example, pharmaceutically acceptable liquid, gel, or solid carriers, aqueous vehicles, nonaqueous vehicles, antimicrobial agents, isotonic agents, buffers, antioxidants, anesthetics, suspending / dispending agents, sequestering or chelating agents, diluents, adjuvants, excipients, or non-toxic auxiliary substances, other components known in the art, or various combinations thereof.

[0264] Suitable components may include, for example, antioxidants, fillers, binders, disintegrants, buffers, preservatives, lubricants, flavorings, thickeners, coloring agents, emulsifiers or stabilizers such as sugars and cyclodextrins. Suitable antioxidants may include, for example, methionine, ascorbic acid, EDTA, sodium thiosulfate, platinum, catalase, citric acid, cysteine, thioglycerol, thioglycolic acid, thiosorbitol, butylated hydroxyanisole, butylated hydroxytoluene, and / or propyl gallate. As disclosed herein, inclusion of one or more antioxidants such as methionine in a composition comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof and conjugate compounds provided herein decreases oxidation of the antibody or antigen-binding fragment thereof. This reduction in oxidation prevents or reduces loss of binding affinity, thereby improving antibody stability and maximizing shelf-life. Therefore, in certain embodiments, pharmaceutical compositions are provided that comprise one or more antibodies or antigen-binding fragments thereof as disclosed herein and one or more antioxidants such as methionine.

[0265] In some embodiments, the pharmaceutical compositions can be a liquid solution, suspension, or emulsion. In some embodiments, the pharmaceutical compositions are formulated into an injectable composition. The injectable pharmaceutical compositions may be prepared in any conventional form, such as for example liquid solution, suspension, emulsion, or solid forms suitable for generating liquid solution, suspension, or emulsion. Preparations for injection may include sterile and / or non-pyretic solutions ready for injection, sterile dry soluble products, such as lyophilized powders, ready to be combined with a solvent just prior to use, including hypodermic tablets, sterile suspensions ready for injection, sterile dry insoluble products ready to be combined with a vehicle just prior to use, and sterile and / or non-pyretic emulsions. The solutions may be either aqueous or nonaqueous.

[0266] Use of the linker or the linker conjugate or the conjugate compounds

[0267] In one aspect, the present disclosure provides use of the linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to the present disclosure or the conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to the present disclosure in the manufacture of a drug for preventing or treating a disease.

[0268] A method of preventing or treating a disease

[0269] In one aspect, the present disclosure provides a method of preventing or treating a disease in a subject in need thereof, comprising administrating to the subject a therapeutically effective amount of the linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to the present disclosure or the conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to the disclosure.

[0270] As use herein, the term “treat a disease” or “treating a disease” refers to alleviating or ameliorating the disease (i.e., slowing or arresting the development of the disease or at least one of the clinical symptoms thereof) ; or alleviating or ameliorating at least one physical parameter or biomarker associated with the disease, including those which may not be discernible to the patient. For cancer, “treating” may refer to dampen or slow the tumor or malignant cell growth, proliferation, or metastasis, or some combination thereof. For tumors, “treating” includes removal of all or part of the tumor, inhibiting or slowing tumor growth and metastasis, delaying the development of a tumor, or some combination thereof.

[0271] As used herein, the term “prevent” or “preventing” of any disease refers to the prophylactic treatment of the disease; or delaying the onset or progression of the disease.

[0272] As use herein, the term “subject” refers to mammals, primates (e.g., humans, male or female) , dogs, rabbits, guinea pigs, pigs, rats and mice. In certain embodiments, the subject is a primate. In yet other embodiments, the subject is a human.

[0273] As used herein, the term "a therapeutically effective amount" refers to an amount of the compound, the linker conjugate or the conjugate compounds of the present disclosure that will elicit the biological or medical response of a subject, for example, ameliorate symptoms, alleviate conditions, slow or delay disease progression, or prevent a disease, etc. The therapeutically effective amount will vary with the type and severity of the condition to be alleviated. It is to be further understood that for any particular subject, specific dosage regimens should be adjusted over time according to the individual need and the professional judgment of the person administering or supervising the administration of the compositions. In some embodiment, the therapeutically effective amount is based on a variety of factors, such as the type of disease, the age, weight, sex, medical condition of the patient, the severity, of the condition, the route of administration, and the particular antibody employed. In some embodiments, the therapeutically effective amount can vary widely, but can be determined routinely using standard methods. In some embodiment, the therapeutically effective amount can be adjusted based on the pharmacokinetic or pharmacodynamic parameters, which may include clinical effects such as toxic effects and / or laboratory values.

[0274] In some embodiments, the disease comprises a tumor or cancer. In some embodiments, the disease is an autoimmune disease and the like.

[0275] In some embodiments, the cancer can include, but not limited to, carcinoma, lymphoma, blastema, sarcoma, and leukemia or lymphoid malignancies. More particular examples of the cancer include squamous cell cancer (e.g., epithelial squamous cell cancer) , lung cancer including small-cell lung cancer, non-small cell lung cancer ( “NSCLC” ) , adenocarcinoma of the lung and squamous carcinoma of the lung, cancer of the peritoneum, hepatocellular cancer, gastric or stomach cancer including gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, endometrial or uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney or renal cancer, prostate cancer, vulval cancer, thyroid cancer, hepatic carcinoma, anal carcinoma, penile carcinoma, as well as head and neck cancer.

[0276] It will be readily apparent to those skilled in the art that other suitable modifications and adaptations of the present disclosure described herein are obvious and may be made using suitable equivalents without departing from the scope of the disclosure or the embodiments disclosed herein. Having now described the disclosure in detail, the same will be more clearly understood by reference to the following examples, which are included for purposes of illustration only and are not intended to be limiting. Further, unless specifically described otherwise, the reagent and the solvent described in the description can be easily obtained from a commercial supplier.

[0277] EXAMPLES

[0278] The disclosure is further described in the following examples, which do not limit the scope of the disclosure described in the claims.

[0279] Reagent and Manufacturer

[0280] Unless stated otherwise, all commercially available starting building blocks could be purchased from commercial vendors. LCMS analyses were performed on ACQUITY UPLC system which is commercially available from Waters, HPLC 1260 Infinity II is commercially available from Angilent, prep-HPLC 1220 Infinity II is commercially available from Angilent.

[0281] DX8951f is commercially available from Haoyuan Chemexpress. VE-288 and Rucaparib is commercially available from Bidepharm. MC-VC-PAB-MMAE (CAS Number: 646502-53-6) is commercially available from MedChemExpress and the catalog number is HY-15575.

[0282] Abbreviations

[0283] Example 1. Synthesis of Linker conjugates of the present disclosure

[0284] Example 1.1. Synthesis of intermediates-LKs

[0285] Example 1.1.1. Synthesis of LK-1

[0286] Step1: To a solution of compound 1 (2.0 g, 10.0 mmol, 1.0 eq) in DMF (20mL) was added K2CO3 (1.38 g, 10.0 mmol, 1.0 eq) followed by tert-Butyl N- (2-bromoethyl) carbamate (2.5g, 11.0mmol, 1.1eq) . The mixture was stirred for 4h at 60℃. The mixture was poured into ice-water (200mL) and extracted with EtOAc (50mL*3) . The combined organic layer was washed with brine (50mL) , dried over Na2SO4 and filtered. The filtrate was concentrated and purified by flash column (EtOAc / petroleum ether = 0%～50%) to give product 2 (2.8 g, 82.4%yield) as brown solid. Exact mass calc. for C15H20N2O7: 340.13, found: 341.31, (M+H) +.

[0287] Step2: To a solution of compound 2 (2.8 g, 8.2 mmol, 1.0 eq) in THF (30mL) was added DIBAL-H (12.3mL, 12.3mmol, 1.2eq) at 0℃ under N2 atmosphere. The mixture was stirred for 0.5 h at 0℃ then stirred for 2h at r.t. . The mixture was poured into ice-water (2 00mL) and extracted with EtOAc (50mL*3) . The combined organic layer was washed with brine (50mL) , dried over Na2SO4 and filtered. The filtrate was concentrated and purified by flash column (EtOAc / petroleum ether = 0%～50%) to give product 3 (1.5 g, 58.4%yield) as brown solid. Exact mass calc. for C14H20N2O6: 312.13, found: 313.34, (M+H) +.

[0288] Step3: To a solution of compound 3 (1.5 g, 4.8 mmol, 1.0 eq) in DCM (30mL) was added imidazole (591.5mg, 7.2mmol, 1.5eq) followed by TBDPS-Cl (1.5mL, 5.8mmol, 1.2eq) . The mixture was stirred for 3 h at r.t. . The mixture was diluted with DCM (20mL) and washed with water (20mL) and brine (20mL) . The organic layer was dried over Na2SO4 and filtered. The filtrate was concentrated and purified by flash column (EtOAc / petroleum ether = 0%～50%) to give product 4 (2.5 g, 94.5%yield) as brown solid. Exact mass calc. for C30H38N2O6Si: 550.25, found: 551.41, (M+H) +.

[0289] Step4: To a solution of compound 4 (2.5 g, 4.5 mmol, 1.0 eq) in MeOH (30mL) was added Pd / C (250mg) under N2 atmosphere. The mixture was degassed 3 times and purged with H2. The mixture was stirred for 4h at r.t. under H2 atmosphere. The mixture was filtered through a Celite and the filtrate was concentrated to give product 5 (2.2 g, 93.1%yield) as brown solid. Exact mass calc. for C30H40N2O4Si: 520.28, found: 521.45, (M+H) +.

[0290] Step5: To a solution of compound 5 (1.1 g, 2.1 mmol, 1.0 eq) in DCM (30mL) and MeOH (5mL) was added FmocVal-Cit (1.0g, 2.1mmol, 1.0eq) followed by EEDQ (760.2mg, 3.1mmol, 1.5eq) . The mixture was stirred for 16h at r.t. The mixture was concentrated and purified by RP-column (MeCN / water=30～95%) to give product 6 (1.2 g, 57.7%yield) as yellow solid. Exact mass calc. for C56H70N6O10Si: 1014.49, found: 1015.66, (M+H) +.

[0291] Step6: To a solution of compound 6 (1.2 g, 2.1 mmol, 1.0 eq) in THF (10mL) was added pyridine-HF (1.0 mL, 65%-70%HF) . The mixture was stirred for 5h at r.t. . The reaction was quenched by adding ice-water (10mL) , then concentrated and the precipitate was collected by filtration. The filter cake was dried over vacuum to give product 7 (805.5 mg, 89.6%yield) as yellow solid. Exact mass calc. for C40H52N6O9: 760.38, found: 761.54, (M+H) +.

[0292] Step7: To a solution of compound 7 (800.0 mg, 1.1 mmol, 1.0 eq) in DMF (10mL) was added DIPEA (366.1 uL, 2.1mmol, 2.0 eq) followed by bis (4-nitrophenyl) carbonate (639.7mg, 2.1mmol, 2.0eq) . The mixture was stirred for 3h at r.t. . The reaction mixture was purified by RP-column (MeCN / water=15～95%) to give product LK-1 (650.0 mg, 66.8%yield) as yellow solid. Exact mass calc. for C47H55N7O13: 926.39, found: 927.53, (M+H) +.

[0293] Example 1.1.2. Synthesis of LK-2

[0294] Step1: To a solution of compound 1 (1.31g, 3.0 mmol, 1.0 eq) and N-Boc-Ethylenediamine (0.58g, 3.6mmol, 1.2eq) in DMF (20mL) was added DIPEA (1.0mL, 6.0mmol, 2.0eq) followed HATU (1.3g, 3.3mmol, 1.1eq) at r.t. . The mixture was stirred for 2h at r.t. . The mixture was poured into ice-water (120mL) and extracted with EtOAc (40mL*3) . The combined organic layer was washed with brine (40mL) , dried over Na2SO4 and filtered. The filtrate was concentrated and purified by flash column (EtOAc / petroleum ether = 0%～50%) to give product 2 (1.5g, 86.5%yield) as light yellow solid. Exact mass calc. for C31H39N3O6Si: 577.26, found: 578.53, (M+H) +.

[0295] Step2: To a solution of compound 2 (1.5 g, 2.6 mmol, 1.0 eq) in MeOH (20mL) and EtOAc (10mL) was added Pd / C (150mg) under N2 atmosphere. The mixture was degassed 3 times and purged with H2, then stirred for 5 h at r.t. The mixture was filtered through a Celite pad, the filtrate was concentrated to give crude product 3 (1.3 g, yield 91.4%) . Exact mass calc. for C31H41N3O4Si: 547.29, found: 548.45, (M+H) +.

[0296] Step3: To a solution of compound 3 (1.3 g, 2.4 mmol, 1.0 eq) and Fmoc-Val-Cit (1.2 g, 2.4 mmol, 1.0 eq) in DCM (30mL) and MeOH (5mL) was added EEDQ (880.3mg, 3.6mmol, 1.5eq) . The mixture was degassed 3 times and purged with N2, then stirred for 16 h at r.t. . The mixture was concentrated and purified by flash column (MeOH / DCM= 0%～10%) to give product 4 (2.0 g, 82.1%yield) as yellow solid. Exact mass calc. for C57H71N7O9Si: 1025.51, found: 1026.68, (M+H) +.

[0297] Step4: To a solution of compound 4 (2.0 g, 2.0 mmol, 1.0 eq) in THF (30mL) was added TBAF (4.0mL, 4.0mmol, 2.0eq, 1M in THF) under N2 atmosphere. The mixture was stirred for 4h at r.t. . The mixture was concentrated and purified by flash column (MeOH / DCM=0%～10%) to give product 5 (1.3 g, 84.7%yield) as yellow solid. Exact mass calc. for C41H53N7O9: 787.39, found: 788.56, (M+H) +.

[0298] Step5: To a solution of compound 5 (1.3 g, 1.7 mmol, 1.0 eq) in DMF (15mL) was added DIPEA (592.7uL, 3.4mmol, 2.0eq) followed by Bis (4-nitrophenyl) carbonate (602.3mg, 2.0mmol, 1.2eq) . The mixture was stirred for 3h at r.t. . The mixture was concentrated and purified by flash column (MeOH / DCM=0～10%) to give product LK-2 (1.2 g, 76.3%yield) as yellow solid. Exact mass calc. for C48H56N8O13: 952.40, found: 953.57, (M+H) +.

[0299] Example 1.2. Synthesis of Linker conjugates

[0300] Example 1.2.1. Synthesis of LD38

[0301] Step1: To a solution of compound LK-3 (100.0 mg, 117.9 umol, 1.0 eq, synthesized as WO2020236841A2) and dx8951f (75.1 mg, 141.5umol, 1.2eq) in DMF (1.0 mL) was added DIPEA (62.8 uL, 0.36mmol, 3.0eq) at r.t. . The mixture was stirred for 4 h at r.t. . The mixture was purified by RP-column (MeCN / water = 20%～100%) to give product 1 (50 mg, 37.1%yield) as yellow solid. Exact mass calc. for C63H63FN8O12: 1142.45, found: 1143, 61, (M+H) +.

[0302] Step2: To a solution of compound 1 (25.0 mg, 21.9umol, 1.0 eq) in DMF (0.5mL) was added pyrrolidine (25uL) . The mixture was stirred for 0.5 h at r.t. To the mixture DIPEA (34.9 uL, 0.2mmol, 10.0eq) was added followed by N-Acetoxysuccinimide (34.3mg, 0.2 mmol, 10eq) . The mixture was stirred for 1h at r.t. . The mixture was purified by RP-column (MeCN / water =20%～95%) to give product 2 (15 mg, yield 71.2%) . Exact mass calc. for C49H54FN9O11: 963.39, found: 964.57, (M+H) +.

[0303] Step3: To a solution of compound 2 (15 mg, 0.041 mmoles, 1.0 equiv) and azide acetic acid (3.2 mg, 31.1ummol, 2.0 equiv. ) in DMF (1 mL) . The mixture was degassed 3 times and purged with N2. A solution of sodium abscorbate (4.6 mg, 23.3umol, 1.5eq) in water (0.1mL) and a solution of Cu2SO4 (1.0mg, 4.7umol, 0.3eq) in water (0.1mL) were added. The mixture was stirred for 3 hours and was purified by RP-column (10-100%MeCN / H2O, 0.1%TFA modifier) to give product 3 (5 mg, 31.4%yield) . Exact mass calc. for C49H55FN12O12: 1022.40, found: 1021.53, (M-H) -.

[0304] Step4: To a solution of 3 (5.0 mg, 4.9umole, 1.0 equiv) and N- (2-Aminoethyl) maleimide Hydrochloride (1.4 mg, 9.8umol, 2.0 equiv. ) in DMF (1 mL) was added DIPEA (3.4uL, 19.6umol, 4.0eq) followed by HATU (2.0mg, 5.4umol, 1.2eq) . The mixture was stirred for 2 hours and was purified by prep-HPLC (20-60%MeCN / H2O, 0.1%TFA modifier) to give product LD38 (3.0 mg, 51.7%yield) . Exact mass calc. for C57H63FN14O14: 1186.46, found: 1187.53, (M+H) +.

[0305] Example 1.2.2. Synthesis of LD4

[0306] Step1: Compound 2 was obtained used the procedure described in Example 1.2.1, step 1, however LK-3 was replaced by LK-2 (also named compound 1, 120 mg, 0.13mmol, 1.0eq) . Product 2 (100 mg, 80.0umol, 63.6%yield) . Exact mass calc. for C66H73FN10O14: 1248.53, found: 1249.70, (M+H) +.

[0307] Step2: Compound 3 was obtained used the procedure described in Example 1.2.1, step 2, however compound 1 in example 1.2.1 was replaced by product 2 in example 1.2.2 (60 mg, 48.0umol, 1.0eq) . Product 3 (45.0 mg, 42.1umol, 87.6%yield) . Exact mass calc. for C53H65FN10O13: 1068.47, found: 1069.62, (M+H) +.

[0308] Step3: To a solution of compound 3 (45.0 mg, 42.0 umol, 1.0 eq) in DCM (1.0 mL) was added TFA (200uL) . The mixture was stirred for 1 h at r.t. and was concentrated to give crude product 4 (40.0 mg, crude) as brown solid. Exact mass calc. for C48H57FN10O11: 968.42, found: 969.60, (M+H) +.

[0309] Step4: To a solution of compound 4 (10.0 mg, 10.3 umol, 1.0 eq) in DMF (0.5 mL) was added DIPEA (5.4uL, 31.0umol, 3.0eq) followed by 2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl 6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoate (4.8mg, 15.5umol, 1.5eq) . The mixture was stirred for 1 h at r.t. . Then the mixture was purified by prep-HPLC (MeCN / water = 20～95%) to give product LD4 (5.0 mg, 4.3umol, 41.7%yield) as yellow solid. Exact mass calc. for C58H68FN11O14: 1161.49, found: 1162.68, (M+H) +.

[0310] Example 1.2.3. Synthesis of LD3 (also named LW011)

[0311] 4- ( (S) -2- ( (S) -2-acetamido-3-methylbutanamido) -5-ureidopentanamido) -2- ( (1- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -15-oxo-3, 6, 9, 12-tetraoxa-16-azaoctadecan-18-yl) carbamoyl) benzyl ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamate was obtained used the procedure described in Example 1.2.2, step 4, however 2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl 6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoate was replaced with 2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl 1- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 6, 9, 12-tetraoxapentadecan-15-oate (6.9 mg, 15.5umol, 1.5eq) . LD3 (5.0 mg, 3.9umol, 37.4%yield) . Exact mass calc. for C63H78FN11O18: 1295.55, found: 1296.74, (M+H) +.

[0312] Similar to the synthesis of LD3, the linker-payload listed in the following table can be obtained.

[0313] Example 1.2.4. Synthesis of LD5

[0314] Step1: Compound 2 was obtained used the procedure described in Example 1.2.2, step 4, however 2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl 6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoate was replaced with 2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl 2, 2-dimethyl-4-oxo-3, 8, 11-trioxa-5-azatetradecan-14-oate (40.0 mg, 41.3μmol, 1.0eq) . Product 2 (25.0 mg, 20.4 μmol, 49.3%yield) . Exact mass calc. for C60H78FN11O16: 1227.56.55, found: 1228, 74, (M+H) +.

[0315] Step2: Compound 3 was obtained used the procedure described in Example 1.2.2, step 3, however the compound 3 in example 1.2.2 was replaced with the compound 2 in example 1.2.4 (25.0 mg, 22.2umol, 1.0eq) . Product 3 (20.0 mg, crude) . Exact mass calc. for C55H70FN11O14: 1127.51, found: 1128.69, (M+H) +.

[0316] Step3: LD5 was obtained used the procedure described in Example 1.2.2, step 4, however 2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl 6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoate was replaced with 2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl 2- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) acetate (6.2 mg, 24.4μmol, 1.5eq) . LD5 (4.0 mg, 3.2μmol, 19.4%yield) . Exact mass calc. for C61H73FN12O17: 1264.52, found: 1265, 74, (M+H) +.

[0317] Example 1.2.5. Synthesis of LD7 (also named LW015)

[0318] Step1: To a solution of D-glucamine (1.1 g, 6.0 mmol, 1.0 eq) and 3-tert-Butoxy-3-oxopropanoic acid (960.0mg, 6.0mmol, 1.0eq) in DMF (15mL) was added DIPEA (2.1mL, 12.0mmol, 1.0eq) followed by HATU (2.7 g, 7.2mmol, 1.2eq) at 0℃. The mixture was stirred for 2h at 0℃. The mixture was quenched by adding water (3mL) . The mixture was purified by RP-column (MeCN / water = 5～95%) to give product tert-butyl 3-oxo-3- ( ( (2S, 3R, 4R, 5R) -2, 3, 4, 5, 6-pentahydroxyhexyl) amino) propanoate (compound 2, 1.5 g, 4.6mmol, 77.3%yield) . Exact mass calc. for C13H25NO8: 323.16, found: 324, 31, (M+H) +.

[0319] Step2: To a solution of compound 2 (500.0 mg, 1.5mmol, 1.0 eq) in DCM 5.0 mL) was added TFA (1.0mL) . The mixture was stirred for 1 h at r.t. and was concentrated to give crude product 3-oxo-3- ( ( (2S, 3R, 4R, 5R) -2, 3, 4, 5, 6-pentahydroxyhexyl) amino) propanoic acid (compound 3, 400 mg, crude) . Exact mass calc. for C9H17NO8: 267.23, found: 268.38, (M+H) +.

[0320] Step3: To a solution of compound 4 (45.0 mg, 42.0 μmol, 1.0 eq) in DMF (1.0 mL) was added pyrrolidine (200μL) . The mixture was stirred for 1 h at r.t. . The mixture was purified by RP-column (MeCN / water = 30%～90%) to give product 5 (30.0 mg, 81.1%) . Exact mass calc. for C51H63FN10O12: 1026.46, found: 1027.63, (M+H) +.

[0321] Step4: To a solution of compound 5 (30.0 mg, 29.2umol, 1.0eq) and compound 3 (9.4 mg, 35.1umol, 1.2 eq) in DMF (1.0 mL) was added DIPEA (10.2 uL, 58.4umol, 2.0eq ) followed by HATU (13.3mg, 35.0umol, 1.2eq) at 0℃. The mixture was stirred for 1 h at 0℃. The mixture was purified by RP-column (MeCN / water = 20%～90%) to give product compound 6 (25.0 mg, 67.1%yield) . Exact mass calc. for C60H78FN11O19: 1275.55, found: 1276.77, (M+H) +.

[0322] Step5: Compound 7 was obtained used the procedure described in example 1.2.2, step3, however compound 3 in example 1.2.2 was replaced with compound 6 in example 1.2.5 (25 mg, 19.6μmol, 1.0eq) . Product 7 (20 mg, crude) , which was used in next step directly, without further purification. Exact mass calc. for C55H70FN11O17: 1175.49, found: 1176.68, (M+H) +.

[0323] Step6: LD7 was obtained used the procedure described in example 1.2.2, step4. However compound 4 in example 1.2.2 was replaced by compound 7 (10 mg, 8.5 μmol, 1.0 eq) . 2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl 6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoate was replaced with 2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl 1- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 6, 9, 12-tetraoxapentadecan-15-oate (6.9 mg, 15.5umol, 1.5eq) . LD7 (1.8 mg, 14.1%yield) . Exact mass calc. for C70H91FN12O24: 1502.63, found: 1503.81, (M+H) +.

[0324] Similar to the synthesis of LD7, the linker-payload listed in the following table can be obtained.

[0325] Example 1.2.8. Synthesis of LW042

[0326] Synthesis of intermediate (Compound 1)

[0327] Step1: To a mixture of 1_1 (9.0g, 50.0mmol, 1.0eq, purchased from Bide pharma) and N-Boc-EthylenediaMine (12.7 g, 75.4mmol, 1.5eq) in DMF (100mL) was added DBU (1.5 mL, 10.1mmol, 0.2 eq) . The mixture was stirred for 16 hrs at room temperature. LCMS showed 1_1 was consumed completely. The mixture was poured into water (1L) and extracted with EtOAc (500mL*3) . The organic layer was dried over Na2SO4 and filtered. The filtrate was concentrated and purified by flash-column (EtOAc / Petroleum ether = 0～50%) to give product 1_2 (8.0 g, 47%yield) . Exact mass calc. for C15H21N3O6: 339.14, found: 340.4, (M+H) +.

[0328] Step2: To a mixture of 1_2 (8.0g, 23.6mmol, 1.0eq) and imidazole (3.2 g, 47.2mmol, 2.0 eq) in DCM (100mL) was added TBDPS-Cl (7.8g, 28.3mmol, 1.2 eq) . The mixture was stirred for 16hrs at room temperature. LCMS showed 1_2 was consumed completely. The mixture was washed with water (50mL*2) , dried over Na2SO4 and filtered. The filtrate was concentrated and purified by flash-column (EtOAc / Petroleum ether = 0～50%) to give product 1_3 (9.0 g, 66.1%yield) . Exact mass calc. for C31H39N3O6Si : 577.26, found: 578.8, (M+H) +.

[0329] Step3: To a solution of compound 1_3 (9.0 g, 15.6 mmol, 1.0 eq) in MeOH (100mL) was added Pd / C (0.9 g) under N2 atmosphere. The mixture was degassed 3 times and purged with H2, then stirred for 16 h at r.t. The mixture was filtered through a Celite pad, the filtrate was concentrated to give crude product 1_4 (8.0 g, yield 93.8 %) . Exact mass calc. for C31H41N3O4Si: 547.29, found: 548.45, (M+H) +.

[0330] Step4: To a solution of compound 1_4 (8.0 g, 14.6 mmol, 1.0 eq) and Fmoc-Val-Cit (7.3 g, 14.6 mmol, 1.0 eq) in DCM (100mL) and MeOH (20mL) was added EEDQ (5.4 g, 21.9 mmol, 1.5eq) . The mixture was degassed 3 times and purged with N2, then stirred for 16 h at r.t.. The mixture was concentrated and purified by flash column (MeOH / DCM= 0%～10%) to give product 1_5 (3.6 g, 24.0 %yield) as white solid. Exact mass calc. for C57H71N7O9Si: 1025.51, found: 1026.5, (M+H) +.

[0331] Step5: To a solution of compound 1_5 (3.6 g, 3.5 mmol, 1.0 eq) in THF (40mL) was added HF-Py (1.0 mL, 7.0 mmol, 2.0eq, 1M in THF) under N2 atmosphere. The mixture was stirred for 2h at r.t. LCMS showed 1_5 was remained and another 1 mL of HF-Py was added. The mixture was stirred for 2h at r.t. LCMS showed 1_5 was consumed completely. The mixture was concentrated to remove THF and the residue was poured into ice-water (30mL) . The precipitate was collected by filtration and dried over vacuum to give product 1_6 (2.8 g, crude) as white solid. Exact mass calc. for C41H53N7O9: 787.39, found: 788.6, (M+H) +.

[0332] Step6: To a solution of compound 1_6 (2.8g, 3.5 mmol, 1.0 eq) in DMF (30mL) was added DIPEA (1.6mL, 7.0 mmol, 2.0eq) followed by Bis (4-nitrophenyl) carbonate (1.3 g, 4.2mmol, 1.2eq) . The mixture was stirred for 3h at r.t. . The mixture was poured into MTBE (200mL) . The precipitate was collected by filtration and dried over vacuum to give product 1_7 (2.2 g, 65%yield) as yellow solid. Exact mass calc. for C48H56N8O13: 952.40, found: 953.57, (M+H) +.

[0333] Step7: To a mixture of DX8951 (278.9 mg, 0.52mmol, 1.0eq) in DMF (5mL) was added DIPEA (1.1mL, 1.1mmol, 2.0eq) followed by 1_7 (500mg, 0.52mmol, 1.0eq) , the mixture was stirred for 16h at room temperature. LCMS showed 1_7 was consumed completely, DX8951 was remained and desired MS was detected. The mixture was poured into ice-water (50mL) , the precipitate was collected by filtration. The filter cake was washed with water and dried over vacuum. The crude product was purified by flash column (MeOH / DCM=0～10%) to give product 1_8 (370 mg, 56.5%yield) as brown solid.

[0334] Step8: To the mixture of 1_8 (370 mg, 0.30mmol, 1.0eq) in DMF (3mL) was added pyrrolidine (1.5mL, 17.5mmol, 5eq) . The mixture was stirred for 0.5 h at room temperature. LCMS showed reaction was completed and desired MS was detected. The mixture was poured into MTBE (20mL) and the precipitate was collected by filtration. The filter cake was washed with MTBE (5mL) and dried over vacuum to give product 1 (300 mg, 98.6%yield) as yellow solid, which was used in next step directly without further purification. Exact mass calc. for C51H63FN10O12: 1026.46, found: 1027.7 (M+H) +.

[0335] Synthesis of LW042

[0336] Step1: To a mixture of D-gluconolactone (1.8g, 10.1mmol, 1.0eq, purchased from Adamas) and β-alanine t-butyl ester hydrochloride (1.8 g, 10.1mmol, 1.0eq, purchased from Bide pharma) in DMF (20mL) was added DBU (2.3mL, 15.2mmol, 1.5eq) . The mixture was stirred for 16hrs at room temperature. LCMS showed β-alanine t-butyl ester hydrochloride was consumed completely. The mixture was purified by RP-column (MeCN / water = 0～50%) to give product (3.5 g, impure, DBU was remained) . The impure product was used in next step directly without further purification. Exact mass calc. for C13H25NO8: 323.16, found: 324.3, (M+H) +.

[0337] Step2: To a solution of compound B (3.5 g, 1.0 eq) in DCM (15.0 mL) was added TFA (5.0mL) . The mixture was stirred for 1 h at r.t. and was concentrated to give crude product, which was purified by RP-column (MeCN / water = 0～50%) and the eluent was lyophilized to give product C (1.5g, 55.5%yield of two steps) as white solid. Exact mass calc. for C9H17NO8: 267.10, found: 268.3, (M+H) +.

[0338] Step3: To a solution of compound 1 (105 mg, 0.1mmol, 1.0eq) and compound C (32.8 mg, 0.12 mmol, 1.2 eq) in DMF (1.0 mL) was added DIPEA (53.5 uL, 0.31mmol, 3.0eq) followed by HATU (13.3mg, 35.0umol, 1.2eq) at room temperature. The mixture was stirred for 1h at 0℃. The mixture was purified by RP-column (MeCN / water = 20%～90%) to give product compound 2 (100 mg, 76.6%yield) . Exact mass calc. for C60H78FN11O19: 1275.55, found: 1276.7, (M+H) +.

[0339] Step4: To a solution of compound 2 (100.0 mg, 78.4umol, 1.0eq) in DCM (1.0 mL) was added TFA (400uL) . The mixture was stirred for 1 h at r.t. LCMS showed compound 2 was consumed completely. The mixture was concentrated to give crude product 3 (90.0 mg, crude) , which was used in next step directly, without further purification. Exact mass calc. for C55H70FN11O17: 1175.49, found: 1176.7, (M+H) +.

[0340] Step5: To a solution of compound 3 (90.0 mg, 76.5 umol, 1.0 eq) in DMF (1.0 mL) was added DIPEA (40.0 uL, 0.23mmol, 3.0eq) followed by Mal-PEG4-NHS ester (37.2 mg, 84.2 umol, 1.1eq) . The mixture was stirred for 1 h at r.t. . Then the mixture was purified by prep-HPLC (MeCN / water = 10～95%) to give product LW042 (35.0 mg, 30.4%yield) . Exact mass calc. for C70H91FN12O24: 1502.63, found: 1503.8, (M+H) +; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.10 (s, 1H) , 8.16 (d, J = 7.4 Hz, 1H) , 8.05 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.96 -7.86 (m, 2H) , 7.78 (d, J = 10.8 Hz, 1H) , 7.70 (dt, J = 13.0, 4.9 Hz, 3H) , 7.46 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.31 (s, 1H) , 7.01 (s, 2H) , 5.99 (s, 1H) , 5.44 (s, 2H) , 5.29 (d, J = 7.6 Hz, 3H) , 5.21 (s, 2H) , 4.39 (q, J = 7.3 Hz, 1H) , 4.21 (t, J = 7.7 Hz, 1H) , 3.97 (d, J = 3.6 Hz, 1H) , 3.91 (d, J = 3.7 Hz, 1H) , 3.67 -3.52 (m, 14H) , 3.52 -3.45 (m, 13H) , 3.40 -3.07 (m, 14H) , 2.98 (d, J = 17.8 Hz, 2H) , 2.38 (s, 4H) , 2.29 (t, J = 6.5 Hz, 2H) , 2.19 (s, 1H) , 1.90 (ddd, J = 31.3, 14.8, 7.0 Hz, 3H) , 1.71 -1.53 (m, 2H) , 1.43 (s, 2H) , 0.85 (dd, J =12.9, 6.9 Hz, 9H) .

[0341] Example 1.2.9. Synthesis of LD58 (LW034)

[0342] Step 1: A reaction mixture of β-Alanine tertbutyl ester hydrochloride (1.82 g, 10.0 mmol, 1.0eq) , D-glucose (18.1g, 100.2 mmol, 10.0eq) , NaBH3CN (5.0 g, 80.2 mmol, 8.0eq) and potassium dihydrogen phosphate (0.82g, 6.0 mmol) in water (40 mL) and ethanol (65 mL) was stirred at 50 ℃ under N2 atmosphere for 24 hr. The solvents were evaporated, and the residue was purified by RP-Column (MeCN / water (0.1%TFA) = 0～50%) to give the desired product LW034_1A (2.0 g, 42.2%yield) as white solid. Exact mass calc. for: C19H39NO12: 473.25, found: 474.5 (M+H) +.

[0343] Step 2: To a mixture of LW034_1A (2.0 g, 4.2mmol, 1.0eq) in DCM (20mL) was added TFA (4mL, ) . The mixture was stirred for 0.5 h at room temperature. LCMS showed LW034_1A was consumed completely, and desired MS was detected. The mixture was concentrated to give product LW034_1 (2.3g, crude) , which was used in next step directly without further purification. Exact mass calc. for C15H31NO12: 417.18, found: 418.4 (M+H) +.

[0344] Step3: To mixture of VE-822 (92.8 mg, 0.2 mmol, 1.0eq) in DMF (3.0 mL) was added DIPEA (140uL, 0.8 mmol, 4.0eq) followed by compound 1_7 (238.5 mg, 1.25mmol, 1.0eq, prepared as Example 1.2.8) . The mixture was stirred for 2h at room temperature, LCMS showed VE822 was consumed completely and desired MS was detected. To the mixture pyrrolidine (83.7uL, 1.0 mmol, 5eq) was added. The mixture was stirred for 0.5 h at room temperature. LCMS showed reaction was completed and desired MS was detected. The mixture was purified by RP-column, to give product LW034_2 (220 mg, 94.8%yield of two steps) as yellow solid. Exact mass calc. for C51H66N12O11S: 1054.47, found: 1054.5 (M+H) +.

[0345] Step4: To a mixture of LW034_2 (70.0 mg, 66.4umol, 1.0eq) and LW034_1 (52.9 mg, 99.5 umol, 1.5eq, ) in DMF (1mL) was added DIPEA (34.8uL, 0.2mmol, 3.0eq) followed by HATU (37.8 mg, 99.5umol, 1, 5eq) . The mixture was stirred for 1h at room temperature. LCMS showed LW034_2 was consumed completely, and desired MS was detected. The mixture was purified by RP-column (MeCN / Water = 5～50%) and the eluent was concentrated and lyophilized to give product LW034_3 (50 mg, 60.5%yield) as yellow solid. Exact mass calc. for C66H95N13O22S: 1453.64, found: 1454.6 (M+H) +.

[0346] Step5: To a mixture of LW034_3 (50.0 mg, 34.4umol, 1.0eq) in DCM (3mL) was added TFA (1mL, ) . The mixture was stirred for 0.5 h at room temperature. LCMS showed LW034_3 was consumed completely, and desired MS was detected. The mixture was concentrated to give product LW034_4 (46 mg, crude) , which was used in next step directly without further purification. Exact mass calc. for C61H87N13O20S: 1353.59 found: 1354.6 (M+H) +.

[0347] Step6: To a mixture of LW034_4 (46.0 mg, crude) in DMF (3mL) was added DIPEA (12uL, 67.9umol, 2.0eq) followed by Mal-PEG4-NHS ester (15.0mg, 34.0umol, 1.0eq) . The mixture was stirred for 1 h at room temperature. LCMS showed LW034_4 was consumed completely, and desired MS was detected. The mixture was purified by prep-HPLC (MeCN / water = 35～45%) , the eluent was concentrated and lyophilization to give product LW034 (10 mg, 17.5%yield) as yellow solid. Exact mass calc. for: C76H108N14O27S: 1680.72, found: 1681.8 (M+H) +. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.2 (s, 1H) , 8.95 (s, 1H) , 8.53 (s, 1H) , 8.43 (s, 1H) , 8.38 (d, J = 8.3 Hz, 2H) , 8.28 (d, J = 7.3 Hz, 1H) , 8.19 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 8.00 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 7.94 (d, J = 8.2 Hz, 3H) , 7.78 (s, 1H) , 7.73 –7.58 (m, 2H) , 7.43-7.32 (m, 3H) , 7.24-7.11 (m, 2H) , 7.01 (s, 2H) , 6.03 (s, 1H) , 5.41 (s, 3H) , 5.20 (s, 2H) , 4.88 –4.35 (m, 9H) , 4.29 (t, J = 7.6 Hz, 1H) , 4.00 (s, 2H) , 3.69 (d, J = 5.0 Hz, 2H) , 3.64 –3.46 (m, 17H) , 3.42-3.19 (m, 22H) , 2.99 (s, 2H) , 2.85 (s, 3H) , 2.80-2.67 (m, 2H) , 2.31 (t, J = 6.5 Hz, 2H) , 1.97 (s, 1H) , 1.68-1.60 (m, 2H) , 1.45-1.36 (m, 2H) , 1.19 (d, J = 6.7 Hz, 6H) , 0.85 (dd, J = 14.8, 6.6 Hz, 6H) .

[0348] Example 1.2.10. Synthesis of LW049

[0349] Step1: To a mixture of compound 1 (14.8 mg, 58.4umol, 2.0eq, prepared as example 1.2.8) and LW049-1 (30.0mg, 29.2umol, 1.0eq) in DMF (2mL) was added DIPEA (25.5uL, 0.15mmol, 5.0 eq) followed by HATU (16.7mg, 43.8umol, 1.5eq) . The mixture was stirred for 0.5h. LCMS showed LW049-1 was consumed completely, and desired MS was detected. The mixture was purified by RP-column (MeOH / water (0.1%TFA) =10%～80%) . The eluent was concentrated and lyophilizated to give product LW049_2 (27 mg, 73.2%yield) .

[0350] Step2: To a mixture of LW049_2 (27 mg, 21.4umol, 1.0eq) in DCM (1mL) was added TFA (300uL) at temperature. The mixture was stirred for 0.5h. LCMS showed LW049_2 was consumed completely, and desired MS was detected. The mixture was concentrated and lyophilizated to give crude product LW049_3 (25 mg) .

[0351] Step3: To a mixture of LW049_3 (25 mg, 21.5umol, 1.0eq) and DIPEA (11.3uL, 64.5umol, 2.0eq) in DMF (1mL) was added Mal-PEG4-NHS ester (10.5mg, 23.7umol, 1.1eq) at room temperature. The mixture was stirred for 1h. LCMS showed LW049_3 was consumed completely, and desired MS was detected. The mixture was purified by prep-HPLC (MeCN / water (0.1%TFA) =35%～60%) . The eluent was concentrated and lyophilizated to give product (2.84 mg) . Exact mass calc. for: C70H93FN12O21S: 1488.63, found: 1490.3 (M+H) +. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.16 (s, 1H) , 8.38 (t, J = 5.4 Hz, 1H) , 8.14 (d, J = 7.4 Hz, 1H) , 8.06 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.98 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.91 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 7.77 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 7.73 (d, J = 2.1 Hz, 1H) , 7.69 (d, J = 8.6 Hz, 1H) , 7.46 (d, J = 8.5 Hz, 1H) , 7.31 (s, 1H) , 7.01 (s, 2H) , 6.05 (s, 1H) , 5.44 (s, 2H) , 5.38 –5.19 (m, 5H) , 4.40 (q, J = 7.2 Hz, 1H) , 4.16 (t, J = 7.7 Hz, 1H) , 3.60 -3.45 (m, 16H) , 3.48-3.43 (m, 7H) , 3.33 -3.06 (m, 9H) , 2.99 (m, 8H) , 2.47 (s, 1H) 2.38 (d, J = 1.9 Hz, 3H) , 2.34 -2.12 (m, 6H) , 2.04 -1.81 (m, 7H) , 1.65 (s, 2H) , 1.44 (s, 2H) , 0.87 (dd, J = 11.2, 7.0 Hz, 9H) .

[0352] Comparative Example 1: Synthesis of Linker conjugates

[0353] Comparative Example 1.1. Synthesis of LW017

[0354] Step1: To mixture of Rucaparib (64.7 mg, 0.2 mmol, 1.0eq) in DMF (3.0 mL) was added DIPEA (140uL, 0.8 mmol, 4.0eq) followed by compound Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP (152.3 mg, 0.2 mmol, 1.0eq, purchased from Bide pharm) . The mixture was stirred for 2h at room temperature, LCMS showed Rucaparib was consumed completely and desired MS was detected. To the mixture pyrrolidine (83.7uL, 1.0 mmol, 5eq) was added. The mixture was stirred for 0.5 h at room temperature. LCMS showed reaction was completed and desired MS was detected. The mixture was purified by RP-column, to give product LW017_1 (120 mg, 82.3%yield of two steps) as yellow solid. Exact mass calc. for C38H45FN8O6: 728.34, found: 729.6 (M+H) +.

[0355] Step2: To a mixture of LW017_1 (72.0 mg, 0.1 mmol) in DMF (2mL) was added DIPEA (34.8 uL, 0.2mmol, 2.0eq) followed by Mal-heptanoic NHS ester (30.8mg, 0.1mmol, 1.0eq) . The mixture was stirred for 1 h at room temperature. LCMS showed LW017_1 was consumed completely, and desired MS was detected. The mixture was purified by prep-HPLC (MeCN / water = 35～45%) , the eluent was concentrated and lyophilization to give product LW017 (35.0 mg, 38.0 %yield) as white solid. Exact mass calc. for: C48H56FN9O9: 921.42, found: 922.7 (M+H) +.

[0356] Similar to the synthesis of LW017, the linker-payload listed in the following table can be obtained.

[0357] Comparative Example 1.3. Synthesis of LW031

[0358] Step1: To a solution of compound 1_8 (60.0 mg, 48.0 umol, 1.0eq) in DCM (2 mL) was added TFA (400uL) . The mixture was stirred for 1 h at r.t. LCMS showed compound 1_8 was consumed completely. The mixture was concentrated to give crude product 3 (60.0 mg, crude) , which was used in next step directly, without further purification. Exact mass calc. for C61H65FN10O12: 1148.48, found: 1149.8, (M+H) +.

[0359] Step2: To a solution of compound LW031_1 (60.0 mg, 48.0 umol, 1.0eq) and compound 4 (15.4 mg, 57.6umol, 1.2 eq) in DMF (1.0 mL) was added DIPEA (16.7 uL, 96.0umol, 2.0eq ) followed by HATU (21.9mg, 57.6umol, 1.2eq) at 0℃. The mixture was stirred for 1 h at 0℃. The mixture was purified by RP-column (MeCN / water = 20%～90%) to give product compound LW031_2 (40.0 mg, 59.6%yield) . Exact mass calc. for C70H80FN11O19: 1397.56, found: 1398.9, (M+H) +.

[0360] Step3: To the mixture of LW031_2 (40.0 mg, 0.29mmol, 1.0eq) in DMF (3mL) was added pyrrolidine (12.0uL, 0.14 mmol, 5eq) . The mixture was stirred for 0.5 h at room temperature. LCMS showed reaction was completed and desired MS was detected. The mixture was purified by RP-column (MeCN / water = 20%～90%) to give product LW031_3 (25.0 mg, 74.3%yield) as yellow solid, Exact mass calc. for C55H70FN11O17: 1175.49, found: 1176.8 (M+H) +.

[0361] Step4: To a mixture of LW031_3 (25.0 mg, 21.3umol, 1.0eq) in DMF (1mL) was added DIPEA (7.5 uL, 42.5umol, 2.0eq) followed by Mal-PEG4-NHS ester (9.4mg, 21.3umol, 1.0eq) . The mixture was stirred for 1 h at room temperature. LCMS showed LW031_3 was consumed completely, and desired MS was detected. The mixture was purified by prep-HPLC (MeCN / water = 35～45%) , the eluent was concentrated and lyophilization to give product LW031 (5.0 mg, 15.7%yield) as yellow solid. Exact mass calc. for: C70H91FN12O24: 1502.63, found: 1503.8 (M+H) +.

[0362] Similar to the synthesis of LW031, the linker-payload listed in the following table can be obtained.

[0363] Example 2. Synthesis of ADCs

[0364] Synthesis of D8 (the ADC in which eight of the linker conjugates are coupled to one single antibody molecule) :

[0365] (1) EDTA (0.338 mM) and TCEP (0.135 mM) were added to a solution of a monoclonal antibody (0.017 mM, in 20 mM BES buffer, pH 7.0) and the reaction mixture was allowed to stay at 37 ℃ for 3.5h;

[0366] (2) Linker conjugate (0.203 mM) in DMA was introduced and the reaction was continued at 24 ℃ for 1 h. DMA was added to ensure that the final DMA concentration is 10% (v / v) ;

[0367] (3) the product ADC was purified using desalting column (Thermo, type: 40K, 0.5 mL, REF: 87766, Lot SJ251704) .

[0368] Synthesis of D4 (the ADC in which four of the linker conjugates are coupled to one single antibody molecule) :

[0369] (1) TCEP (2.4 eq, 0.04mM) and an antibody (0.0167mM) were incubated in the presence of Zn2+ (30 eq, 0.3 mM) in a buffer system BES (20mM, pH7.0) for 4 h at 4℃;

[0370] (2) EDTA (80 eq, 1.34 mM) and linker conjugate (7 eq, 0.1169 mM) were introduced to react with reduced thiol groups resulted from step (1) for 1 hour at room temperature (20℃～25℃) ;

[0371] (3) then recovering the resultant antibody-drug conjugate followed by a purification step using a de-salting column (Thermo, type: 40K, 0.5 mL, REF: 87766, Lot SJ251704) .

[0372] Synthesis of D2 (the ADC in which two of the linker conjugates are coupled to one single antibody molecule) :

[0373] (1) ZnCl2 (0.51 mM, 30eq) and reductant TCEP-NO (0.027mM, 1.6eq) were added to a solution of a monoclonal antibody (0.017 mM, 1eq. ) in BES buffer (pH7.0, 20 mM) and the reaction mixture was allowed to stay at 4 ℃ for 1h;

[0374] (2) EDTA-2Na (1.36 mM, 80eq. ) and the linker-payload (0.085 mM, 5eq. ) in DMA was introduced and the reaction was continued at room temperature for 0.5h;

[0375] (3) then recovering the resultant antibody-drug conjugate followed by a purification step using an ultrafiltration column (Briscale, Type: 30K, 4ml, Cat. No. ULRC0300040P, Lot 2B5614A03) .

[0376] Synthesis of D6 (the ADC in which six of the linker conjugates are coupled to one single antibody molecule) :

[0377] (1) ZnCl2 (0.99 mM, 30eq. ) and reductant TCEP (0.112 mM, 3.4eq. ) were added to a solution of a monoclonal antibody (0.033 mM, 1eq. ) in BES buffer (pH7.0, 20 mM) and the reaction mixture was allowed to stay at 25 ℃ for 1h;

[0378] (2) EDTA-2Na (2.64 mM, 80eq. ) and the linker-payload (0.26 mM, 8eq. ) in DMA was introduced and the reaction was continued at room temperature for 1h;

[0379] (3) then recovering the resultant antibody-drug conjugate followed by a purification step using an ultrafiltration column (Briscale, Type: 30K, 4ml, Cat. No. ULRC0300040P, Lot 2B5614A03) .

[0380] Homogeneity assay

[0381] The ADCs distribution was analyzed using HIC-HPLC (Agilent1200) with a TSK gel Butyl-NPR column (4.6 mm IDX 3.5cm) (commercially available from Tosoh Biosciences) at a flow rate of 0.5 mL / min at 30 ℃. Solvent A was 1.5 M (NH4) 2SO4 and 50 mM potassium phosphate pH 7. Solvent B was 75%v / v 50 mM potassium phosphate pH 7 and 25%v / v isopropanol. The washout procedure is as follows:

[0382] SEC assay

[0383] The ADCs monomeric purity is analyzed using SEC-HPLC (Agilent1200) with a BioCore SEC-300 column (5μm, 7.8×300mm) (commercially available from NanoChrom) at a flow rate of 0.75 mL / min at 30 ℃. Mobile phase is 0.25 M KCl and 20 mM potassium phosphate pH 7.

[0384] DAR value assay

[0385] The DAR value is tested by MMAE test through HIC-HPLC or LC-MS.

[0386] Example 2.1.1: Synthesis of ADC 1-1 (Trastuzumab- (LD3) 8)

[0387] ADC 1-1 was prepared by the method of the Synthesis of D8, wherein, the linker conjugate is LD3, and the antibody was trastuzumab (Roche) . The DAR of ADC1-1 is 7.9. Figure 4A shows chromatograms of Hydrophobic interaction chromatography-High performance liquid chromatography (abbreviated HIC-HPLC) of ADC1-1.

[0388] Example 2.1.2: Synthesis of ADC 1-2 (Trastuzumab-M1- (LD3) 4)

[0389] ADC 1-2 was prepared by the method of the Synthesis of D4, wherein, the linker conjugate is LD3, and the antibody was trastuzumab-M1. The DAR of ADC 1-2 is 4.13. Figure 4B shows chromatograms of HIC-HPLC of ADC1-2.

[0390] The heavy chain of trastuzumab-M1:

[0391] The light chain of trastuzumab-M1:

[0392] Example 2.1.3: Synthesis of ADC 1-3 (Farletuzumab-M1- (LD3) 4)

[0393] ADC 1-3 was prepared by the method of the Synthesis of D4, wherein, the linker conjugate is LD3, and the antibody was farletuzumab-M1. The DAR of ADC 1-3 is 3.95. Figure 5A shows chromatograms of HIC-HPLC of ADC 1-3.

[0394] The heavy chain of farletuzumab-M1:

[0395] The light chain of farletuzumab -M1:

[0396] Example 2.1.4: Synthesis of ADC 1-4 (Farletuzumab-mut 4- (LW011) 4)

[0397] ADC 1-4 was prepared by the method of the Synthesis of D4, wherein, the linker conjugate is LD3 (also named LW011) and the antibody was Farletuzumab-mut 4 (also named trastuzumab-M1) . The heavy chain of Farletuzumab-mut 4 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain of Farletuzumab-mut 4-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. The DAR of ADC 1-4 is 4.12. Figure 30A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 30B shows chromatograms of SEC.

[0398] Example 2.2.1: Synthesis of ADC 2-1 (Trastuzumab- (LD7) 8)

[0399] ADC 2-1 was prepared by the method of the Synthesis of D8, wherein, the linker conjugate is LD7, and the antibody was trastuzumab. The DAR of ADC 2-1 is 7.9. Figure 5B shows chromatograms of HIC-HPLC of ADC 2-1.

[0400] Example 2.2.2: Synthesis of ADC 2-2 (Farletuzumab-M1- (LD7) 4)

[0401] ADC 2-2 was prepared by the method of the Synthesis of D4, wherein, the linker conjugate is LD7 and the antibody was farletuzumab-M1. The DAR of ADC 2-2 is 3.8. Figure 6A shows chromatograms of HIC-HPLC of ADC 2-2.

[0402] Example 2.2.3: Synthesis of ADC 2-3 (Farletuzumab-LALA- (LW015) 2)

[0403] ADC 2-3 was prepared by the method of the Synthesis of D2, wherein, the linker conjugate is LD7 (also named LW015) and the antibody was Farletuzumab-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. The DAR of ADC 2-3 is 1.79. Figure 8A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 8B shows chromatograms of SEC.

[0404] Example 2.2.4: Synthesis of ADC 2-4 (Farletuzumab-mut 4- (LW015) 4)

[0405] ADC 2-4 was prepared by the method of the Synthesis of D4, wherein, the linker conjugate is LD7 (also named LW015) and the antibody was Farletuzumab-mut 4 (also named Farletuzumab-M1) . The heavy chain of Farletuzumab-mut 4 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain of Farletuzumab-mut 4 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. The DAR of ADC 2-4 is 4.02. Figure 9Ashows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 9B shows chromatograms of SEC.

[0406] Example 2.2.5: Synthesis of ADC 2-5 (Farletuzumab-mut 4- (LW015) 6)

[0407] ADC 2-5 was prepared by the method of the Synthesis of D6, wherein, the linker conjugate is LD7 (also named LW015) and the antibody was Farletuzumab-mut 4 (also named Farletuzumab-M1) . The heavy chain of Farletuzumab-mut 4 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain of Farletuzumab-mut 4 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. The DAR of ADC 2-5 is 6.15. Figure 10A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 10B shows chromatograms of SEC.

[0408] Example 2.2.6: Synthesis of ADC 2-6 (Farletuzumab-LALA- (LW015) 8)

[0409] ADC 2-6 was prepared by the method of the Synthesis of D8, wherein, the linker conjugate is LD7 (also named LW015) and the antibody was Farletuzumab-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. The DAR of ADC 2-6 is 7.90. Figure 11A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 11B shows chromatograms of SEC.

[0410] Example 2.3.1: Synthesis of ADC 3-1 (Trastuzumab- (LW042) 2)

[0411] ADC 3-1 was prepared by the method of the Synthesis of D2, wherein, the linker conjugate is LW042 and the antibody was trastuzumab. The DAR of ADC 3-1 is 2.09. Figure 12A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 12B shows chromatograms of SEC.

[0412] Example 2.3.2: Synthesis of ADC 3-2 (Farletuzumab-mut 25-LALA- (LW042) 4)

[0413] ADC 3-2 was prepared by the method of the Synthesis of D4, wherein, the linker conjugate is LW042 and the antibody was Farletuzumab-mut 25-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-mut 25-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, the light chain of Farletuzumab-mut 25-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10. The DAR of ADC 3-2 is 4.08. Figure 13A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 13B shows chromatograms of SEC.

[0414] Example 2.3.3: Synthesis of ADC 3-3 (Farletuzumab-LALA- (LW042) 6)

[0415] ADC 3-3 was prepared by the method of the Synthesis of D6, wherein, the linker conjugate is LW042 and the antibody was Farletuzumab-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. The DAR of ADC 3-3 is 6.08. Figure 14A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 14B shows chromatograms of SEC.

[0416] Example 2.3.4: Synthesis of ADC 3-4 (Farletuzumab-LALA- (LW042) 8)

[0417] ADC 3-4 was prepared by the method of the Synthesis of D8, wherein, the linker conjugate is LW042 and the antibody was Farletuzumab-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. The DAR of ADC 3-4 is 7.94. Figure 15A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 15B shows chromatograms of SEC.

[0418] Example 2.3.5: Synthesis of ADC 3-5 (Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW042) 8)

[0419] ADC 3-5 was prepared by the method of the Synthesis of D8, wherein, the linker conjugate is LW042 and the antibody was Farletuzumab-mut4-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, the light chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6. The DAR of ADC 3-5 is 8. Figure 31A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 31B shows chromatograms of SEC.

[0420] Example 2.4.1: Synthesis of ADC 5-1 (Farletuzumab-mut 4- (LW020) 6)

[0421] ADC 5-1 was prepared by the method of the Synthesis of D6, wherein, the linker conjugate is LW020 and the antibody was Farletuzumab-mut 4 (also named Farletuzumab-M1) . The heavy chain of Farletuzumab-mut 4 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain of Farletuzumab-mut 4 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. The DAR of ADC 5-1 is 6.17. Figure 16A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 16B shows chromatograms of SEC.

[0422] Example 2.5.1: Synthesis of ADC 6-1 (Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW030) 6)

[0423] ADC 6-1 was prepared by the method of the Synthesis of D6, wherein, the linker conjugate is LW030 and the antibody was Farletuzumab-mut 4-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-mut 4-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, the light chain of Farletuzumab-mut 4-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6. The DAR of ADC 6-1 is 6.12. Figure 17A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 17B shows chromatograms of SEC.

[0424] Example 2.6.1: Synthesis of ADC 4-1 (Farletuzumab-LALA- (LW034) 6)

[0425] ADC 4-1 was prepared by the method of the Synthesis of D6, wherein, the linker conjugate is LW034 and the antibody was Farletuzumab-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. The DAR of ADC 4-1 is 5.92. Figure 18A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 18B shows chromatograms of SEC.

[0426] Example 2.7.1: Synthesis of ADC 7-1 (Farletuzumab-LALA- (LW049) 6)

[0427] ADC 7-1 was prepared by the method of the Synthesis of D6, wherein, the linker conjugate is LW049 and the antibody was Farletuzumab-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. The DAR of ADC 7-1 is 5.92. Figure 19A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 19B shows chromatograms of SEC.

[0428] Example 2.7.2: Synthesis of ADC 7-2 (Farletuzumab-LALA - (LW049) 8)

[0429] ADC 7-2 was prepared by the method of the Synthesis of D8, wherein, the linker conjugate is LW049 and the antibody was Farletuzumab-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. The DAR of ADC 7-2 is 8.00. Figure 37 shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 38 shows chromatograms of SEC.

[0430] Comparative Example 2: Synthesis of ADCs

[0431] Comparative Example 2.1: Synthesis of Farletuzumab-mut 4- (LW017) 6

[0432] Farletuzumab-mut 4- (LW017) 6 was prepared by the method of the Synthesis of D6, wherein, the linker conjugate is LW017 and the antibody was Farletuzumab-mut 4 (also named Farletuzumab-M1) . The heavy chain of Farletuzumab-mut 4 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain of Farletuzumab-mut 4 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. The DAR of Farletuzumab-mut 4- (LW017) 6 is 6.22. Figure 20A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 20B shows chromatograms of SEC.

[0433] Comparative Example 2.2: Synthesis of Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW022) 6

[0434] Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW022) 6 was prepared by the method of the Synthesis of D6, wherein, the linker conjugate is LW022 and the antibody was Farletuzumab-mut 4-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-mut 4-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, the light chain of Farletuzumab-mut 4 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6. The DAR of Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW022) 6 is 5.98. Figure 21A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 21B shows chromatograms of SEC.

[0435] Comparative Example 2.3: Synthesis of Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW023) 6

[0436] Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW023) 6 was prepared by the method of the Synthesis of D6, wherein, the linker conjugate is LW023 and the antibody was Farletuzumab-mut 4-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-mut 4-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, the light chain of Farletuzumab-mut 4 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6. The DAR of Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW023) 6 is 6.23. Figure 22A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 22B shows chromatograms of SEC.

[0437] Comparative Example 2.4: Synthesis of Trastuzumab- (LW028) 2

[0438] Trastuzumab- (LW028) 2 was prepared by the method of the Synthesis of D2, wherein, the linker conjugate is LW028 and the antibody was Trastuzumab. The DAR of Trastuzumab-(LW028) 2 is 2.09. Figure 23A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 23B shows chromatograms of SEC.

[0439] Comparative Example 2.5: Synthesis of Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW028) 4

[0440] Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW028) 4 was prepared by the method of the Synthesis of D4, wherein, the linker conjugate is LW028 and the antibody was Farletuzumab-mut 4-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-mut 4-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, the light chain of Farletuzumab-mut 4-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:6. The DAR of Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW028) 4 is 3.97. Figure 24A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 24B shows chromatograms of SEC.

[0441] Comparative Example 2.6: Synthesis of Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW028) 6

[0442] Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW028) 6 was prepared by the method of the Synthesis of D6, wherein, the linker conjugate is LW028 and the antibody was Farletuzumab-mut 4-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-mut 4-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, the light chain of Farletuzumab-mut 4-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:6. The DAR of Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW028) 6 is 6.26. Figure 25A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 25B shows chromatograms of SEC.

[0443] Comparative Example 2.7: Synthesis of Trastuzumab- (LW031) 2

[0444] Trastuzumab- (LW031) 2 was prepared by the method of the Synthesis of D2, wherein, the linker conjugate is LW031 and the antibody was Trastuzumab. The DAR of Trastuzumab-(LW031) 2 is 2.09. Figure 26A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 26B shows chromatograms of SEC.

[0445] Comparative Example 2.8: Synthesis of Farletuzumab-mut 25-LALA- (LW031) 4

[0446] Farletuzumab-mut 25-LALA- (LW031) 4 was prepared by the method of the Synthesis of D4, wherein, the linker conjugate is LW031 and the antibody was Farletuzumab-mut 25-LALA . The heavy chain of Farletuzumab-mut 25-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, the light chain of Farletuzumab-mut 25-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10. The DAR of Trastuzumab-mut 25-LALA- (LW031) 4 is 4.02. Figure 27A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 27B shows chromatograms of SEC.

[0447] Comparative Example 2.9: Synthesis of Farletuzumab-LALA- (LW031) 6

[0448] Farletuzumab-LALA- (LW031) 6 was prepared by the method of the Synthesis of D6, wherein, the linker conjugate is LW031 and the antibody was Farletuzumab-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. The DAR of Farletuzumab-LALA- (LW031) 6 is 5.93. Figure 28A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 28B shows chromatograms of SEC.

[0449] Comparative Example 2.10: Synthesis of Farletuzumab-LALA- (LW031) 8

[0450] Farletuzumab-LALA- (LW031) 8 was prepared by the method of the Synthesis of D8, wherein, the linker conjugate is LW031 and the antibody was Farletuzumab-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. The DAR of Farletuzumab-LALA- (LW031) 6 is 7.94. Figure 29A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 29B shows chromatograms of SEC.

[0451] Comparative Example 2.11: Synthesis of Trastuzumab-M1- (MC-GGFG-DXd) 4

[0452] Trastuzumab-M1- (MC-GGFG-DXd) 4 was prepared by the method of the Synthesis of D8, wherein, the linker conjugate is MC-GGFG-DXd (Levena biopharma) , and the antibody was trastuzumab-M1. Figure 7 shows chromatograms of HIC-HPLC of Trastuzumab-M1- (MC-GGFG-DXd) 4.

[0453] Comparative Example 2.12: Synthesis of Farletuzumab-LALA- (MC-GGFG-DXd) 8

[0454] Farletuzumab-LALA- (MC-GGFG-DXd) 8 was prepared by the method of the Synthesis of D8, wherein, the linker conjugate is MC-GGFG-DXd (Levena biopharma) , and the antibody was Farletuzumab-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of Farletuzumab-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.

[0455] Comparative Example 2.13: Synthesis of Farletuzumab-mut 25-LALA- (MC-VC-PAB-MMAE) 4

[0456] Farletuzumab-mut 25-LALA- (MC-VC-PAB-MMAE) 4 was prepared by the method of the Synthesis of D4, wherein, the linker conjugate is MC-VC-PAB-MMAE, and the antibody was Farletuzumab-mut 25-LALA. The heavy chain of Farletuzumab-mut 25-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, the light chain of Farletuzumab-mut 25-LALA is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10. The DAR of Farletuzumab-mut 25-LALA- (MC-VC-PAB-MMAE) 4 is 4. Figure 32A shows chromatograms of HIC-HPLC, and figure 32B shows chromatograms of SEC.

[0457] Example 3. Stability experiment of the linker conjugate in the present disclosure

[0458] 3.1 Stability of CES1C enzyme cleavage

[0459] Recombinant mouse Ces1C was purchased from CUSABIO TECHNOLOGY. 0.25 μM enzyme was incubated with 25 μM of the linker-payloads in PBS (pH7.5, 20mM) . Enzymatic reactions were carried out at 37℃ for 2.68 days as indicated. LW042 and MC-VC-PAB-MMAE which contain maleimide group were first incubated with 2 equivalents N-Acetyl-Cysteine at 37℃for 30 min before Ces1C cleavage test.

[0460] Prepare the protein precipitation reagent by saturating methanol and acetonitrile (methanol / acetonitrile=3 / 5) with sodium chloride (NaCl) . Add the protein precipitation reagent to the samples at a ratio 3 / 1 to precipitate enzyme. Vortex the samples for 10 min. Centrifuge the samples at 15000 g for 10 minutes at 4℃ to pellet the precipitated protein. Transfer the supernatant containing the free drug fraction released from Ces1C cleavage test to clean vials for analysis.

[0461] The supernatant were analyzed using C18-HPLC (Agilent1200) with Sepax Amethyst C18-H (5 μm, 4.6 x 250 mm) (commercially available from Sepax Technologies, Inc. ) at a flow rate of 1 mL / min at 30 ℃. Solvent A is H2O (0.15%TFA) . Solvent B is ACN (0.15%TFA) . The washout procedure is as follows:

[0462] The results of the CES1C enzyme cleavage are as follows:

[0463] As show in the above table and Figure 33, the intensity of the initial absorption peak of LW042 remained unchanged and no free DX8951 (the payload of LW042) was found during the detection at 370nm. In contrast, it was observed that the intensity of the initial absorption peak of MC-VC-PAB-MMAE continuously decreased during the detection at 248nm. The results indicate that MC-VC-PAB-MMAE is highly sensitive to CES1C enzyme cleavage, with a fitted enzyme cleavage half-life of approximately 1.2 days, whereas LW042 is completely insensitive to CES1C enzyme cleavage.

[0464] 3.2 Stability of human plasma

[0465] The stability test of human plasma was conducted at Centre Testing International Group Co., Ltd. The test samples were ADC 3-4 (Farletuzumab-LALA- (LW042) 8) and Farletuzumab-mut 25-LALA- (MC-VC-PAB-MMAE) 4.1μM ADC samples were incubated in human plasma at 37℃. Samples were taken at 0, 1, 3, 5, and 7 days respectively. The concentrations of free payload (DX8951 and MMAE) were detected by LC-MS, and the proportion of free small molecules was calculated. The results are as follows:

[0466] Based on the above results, the release curve of the free payload during human plasma incubation was provided (Figure 34) . As indicated by the release curve of the free payload during plasma incubation, the release rate of MMAE is significantly faster than that of DX8951. Observing the slope of the curve, the release rate of MMAE is 3.72 times greater than that of DX8951.

[0467] Both the CES1C cleavage test and the incubation test in human plasma support the finding that the linker design in the present disclosure, especially LW042, significantly benefits the improvement of stability in circulation.

[0468] 3.3 Stability of mouse plasma

[0469] The stability test of mouse plasma was conducted at Shanghai Niyan Biotechnology Co., Ltd. The test samples were ADC 3-4 (Farletuzumab-LALA- (LW042) 8) , ADC 7-2 (Farletuzumab-LALA - (LW049) 8) and Farletuzumab-mut 25-LALA- (MC-VC-PAB-MMAE) 4. 100ug / ml ADC samples were incubated in mouse plasma at 37℃. Samples were taken at 0, 1, 3, 5, and 7 days respectively. The concentrations of free payload (DX8951 and MMAE) were detected by LC-MS, and the proportion of free small molecules was calculated. The results are as follows:

[0470] Based on the above results, the release curve of the free payload during mouse plasma incubation was provided (Figure 39) . The results indicate that MMAE exhibits the fastest decline in mouse plasma, with as much as 25%of the small molecules dissociating from Farletuzumab-mut 25-LALA- (MC-VC-PAB-MMAE) 4 within 7 days. In contrast, ADC 3-4 and ADC 7-2 demonstrate a negligible detachment rate of DX8951.

[0471] Example 4. Hydrophilic experiment and aggregation experiment of the ADCs in the present disclosure

[0472] Example 4.1

[0473] The ADCs (ADC1-1, ADC2-1, Trastuzumab- (MC-GGFG-DXd) 8 as comparative example) hydrophilicity were analyzed using HIC-HPLC (Agilent1200) with Proteomix HIC Butyl-NP5 column (5 μm, 4.6 x 35 mm) (commercially available from Sepax Technologies, Inc. ) at a flow rate of 0.5 mL / min at 30 ℃. Solvent A was 1.5 M (NH4) 2SO4 and 50 mM potassium phosphate pH 7. Solvent B was 75%v / v 50 mM potassium phosphate pH 7 and 25%v / v isopropanol. The washout procedure is as follows:

[0474] Trastuzumab- (MC-GGFG-DXd) 8 (also named D8-GGFG-DXd) was prepared by the method of the Synthesis of D8, wherein, the linker conjugate is MC-GGFG-DXd (Levena biopharma) , and the antibody was trastuzumab (Roche) . Figure 6B shows chromatograms of HIC-HPLC of Trastuzumab- (MC-GGFG-DXd) 8.

[0475] Figure 1 is the HIC chromatogram of ADC1-1 (Trastuzumab- (LD3) 8) , ADC2-1 (Trastuzumab- (LD7) 8) and D8-GGFG-DXd. In the Figure 1, the small peaks behind each main peak is free linker conjugate that is not coupled to the antibody. The retention time of major peaks suggests that ADCs with DAR8 prepared with LD3 and LD7 exhibit notably superior hydrophilicity compared to those prepared with MC-GGFG-DXd. Meanwhile, the retention time of minor peaks also demonstrates superior hydrophilicity of LD3 and LD7 compared to that of MC-GGFG-DXd.

[0476] Example 4.2

[0477] The hydrophilic ability was evaluated by HIC-HPLC, wherein, the peak retention time is shorter, the hydrophilicity is better.

[0478] The aggregation was evaluated by SEC-HPLC, wherein, Aggr. (aggregation, %) represents the content of the ADC polymer, Mono. (monomer, %) represents the content of the ADC monomer and Frag. (Fragment, %) represents the content of the antibody fragments. In the chromatograms of SEC, Aggr. + Mono. + Frag. =100%

[0479] Table 1

[0480] Table 1 shows the hydrophilicity and the degree of aggregation of the ADCs.

[0481] Compared with Farletuzumab-mut 4- (LW017) 6, the main peak retention time of ADC 5-1 is shorter. Compared with Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW022) 6 and Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW023) 6, the main peak retention time of ADC 6-1 is shorter. The results suggest that the ADC 5-1 exhibits enhanced hydrophilicity compared to Farletuzumab-mut 4- (LW017) 6, and the ADC 6-1 exhibits enhanced hydrophilicity compared to Farletuzumab-mut 4-LALA-(LW022) 6 and Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW023) 6, which demonstrates that the position linked with the targeting agent will influence hydrophilicity of the linker payload and the ADCs. In the disclosure, positioning it ortho to the payload enhances the hydrophilicity of the linker payload and the ADCs. Additionally, the aggregation of ADC 6-1 is lower than Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW022) 6 and Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW023) 6, which demonstration that increasing the hydrophilicity of the ADC is conducive to reducing the degree of aggregation reaction of the ADCs and improving physical stability of the ADCs.

[0482] Compared with ADC 5-1, the hydrophilicity of the ADC 6-1 is increased and the degree of aggregation of the ADC 6-1 is reduced, which demonstrates that the hydrophilic motif enhances the hydrophilicity of the linker payload and the ADCs and reduces the degree of aggregation of the ADCs.

[0483] Compared with Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW022) 6, the hydrophilicity of Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW023) 6 is increased and the degree of aggregation of the Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW023) 6 is reduced, which demonstrates that the PEG group enhances the hydrophilicity of the linker payload and the ADCs and reduces the degree of aggregation of the ADCs.

[0484] Table 2

[0485] In table 2, compared with the corresponding ADCs comprising LW028, the main peak retention time of the ADCs comprising LW015 or LW011 is shorter and the aggregation of the ADCs comprising LW015 or LW011 is lower, which demonstrates that hydrophilicity of the ADCs comprising LW015 or LW011 is better. The result shows that the hydrophilicity of the linker payload and the ADCs could be enhanced by positioning the position linked with the targeting agent ortho to the payload.

[0486] Table 3

[0487] In table 3, compared with the corresponding ADCs comprising LW028 or LW031, the main peak retention time of the ADC 3-2, ADC 3-3, ADC 4-1 and ADC 7-1 is shorter, which shows that hydrophilicity of the ADC 3-2, ADC 3-3, ADC 4-1 and ADC 7-1 is better. Furthermore, the degree of aggregation of the ADC 3-3, ADC 3-4, ADC 4-1 and ADC 7-1 is less.

[0488] Additionally, in the ADCs comprising LW042, their hydrophilicity and the degree of aggregation remain largely unaffected as the DAR value increasing.

[0489] The present disclosure increases the hydrophilicity of the linker payloads and the ADCs, and reduces degree of aggregation of the ADCs by positioning the position linked with the targeting agent ortho to the payload and introducing the hydrophilic motif. Thus, the ADCs of the present disclosure have great physical stability. Furthermore, the linker payloads and the ADCs in the present disclosure are more stabilized in vivo. Additionally, the ADCs of the present disclosure have a suitable drug metabolism rate and reduced side effects with off-target.

[0490] Example 5. In vitro cytotoxicity of the ADCs in the present disclosure in cancer cell lines

[0491] The cytotoxicity in vitro of the ADCs were tested on NCI-N87 gastric cancer cells (granted by Dr. Ruihua Chao) and OVCAR3 ovarian cancer cells (granted by Dr. Min Hong) along with the comparative example Trastuzumab-M1- (MC-GGFG-DXd) 4 and Farletuzumab-LALA- (MC-GGFG-DXd) 8.

[0492] Re-suspend cells with proper medium (RPMI-1640 (22400-089, GIBCO) ) and adjust cell density to recommended information (1500cell / well、2000cell / well、2500cell / well or 5000cell / well) . Add 90 μL-100 μL cell suspension medium to each well of assay plate. Incubate cells at 37℃, 5%CO2, 95%air and 100%relative humidity overnight.

[0493] Preparation of compound stock plate (10X stock plates) : Serially dilute the stock solution from highest concentration down to lowest in medium according to plate map. Diluted stock to 1X with proper medium. Add 10 μL-25 μL the ADCs to each well as plate map. Incubate the assay plate in incubator for 4、5 or 7 days.

[0494] Equlibrate assay plate and CCK8 assay (C005, TargetMol) or CellTiter-Glo Assay (G7573, Promega) to room temperature for nearly 30 minutes. Add 15 μL CCK8 or 50 μL CellTiter-Glo Assay reagent to each well. Skake and incubate the plate at room temperature for 10 minutes to 4 h before signal reading. Detect the plate using absorbance or luminescence.

[0495] Data analysis: Inhibition rate (IR) of the tested ADCs was determined by the following formula: IR (%) = [1- (PC-Blank)  /  (NC-Blank) ] *100%, wherein, the PC hole: adding the ADCs, the medium and the cells; the NC hole: adding the medium and the cells; and the Blank hole: adding the medium. The data were interpreted by GraphPad Prism.

[0496] Table 4. IC50 in OVCAR3 of ADC1-3 and ADC2-2

[0497] Table 5. IC50 in NCI-N87 of ADC1-2 and Trastuzumab-M1- (MC-GGFG-DXd) 4

[0498] Table 4 shows the IC50 in OVCAR3 of ADC1-3, ADC2-2, ADC 3-4 and Farletuzumab-LALA- (MC-GGFG-DXd) 8, figure 2 shows the killing curves of ADC1-3 and ADC2-2 in OVCAR3 and figure 35 shows the killing curves of ADC 3-4 and Farletuzumab-LALA- (MC-GGFG-DXd) 8. Table 5 shows the IC50 in NCI-N87 of ADC1-2 and Trastuzumab-M1- (MC-GGFG-DXd) 4, and figure 3 shows the killing curves of ADC1-2 and Trastuzumab-M1- (MC-GGFG-DXd) 4 in NCI-N87. As the results demonstrate the ADCs using hydrophilic linker conjugate of the present disclosure, such as LD3, LD7 and LW042, exhibit relative strong cell growth inhibition ability, which indicated the ADCs using the hydrophilic linker conjugate, such as LD3, LD7 and LW042, can release payload efficiently.

[0499] Example 6. Activity of the ADCs in vivo of the present disclosure

[0500] The cytotoxicity in vivo of the ADCs were tested on OVCAR-3 CDX model (operated in ClinBridge Biotech Co. Ltd. ) .

[0501] The OVCAR-3 cell culture methods correspond with those used in in vitro experiments. Female C-NKG mice (n=112; age: 6-8 weeks; weight: 18-22 g) were procured from Cyagen Biosciences Inc. (Suzhou facility) . All animals were housed in SPF conditions with a 12h light / dark cycle.

[0502] Each mouse will be inoculated subcutaneously at the right upper flank with OVCAR-3 tumor cells (1×107 / mouse) in 0.2 mL of blank medium for tumor development. Take special care to ensure subcutaneous delivery of cells by lifting up the fold of skin with one hand and injection of cells with the other. During implantation, use new syringe and needle for every mouse to minimize tumor ulceration. Carefully wipe off any droplets on the skin with a Kim Wipe after injection to further minimize chance for tumor ulceration. The animals will be randomized and treatment will be started when the average tumor volume reaches approximately ～140 mm3 (CV < 0.3) for efficacy study. The test article administration and the animal numbers in each group are shown in the following experimental design table.

[0503] Data analysis:

[0504] TGITV = [1 - (ΔT  / ΔC) ] × 100%

[0505] Where:

[0506] ΔT represents the change in tumor volume in the treated group during a specific period.

[0507] ΔC represents the change in tumor volume in the vehicle group during the same period.

[0508] Na: number of animals per group.

[0509] Table 6 Tumor growth inhibition in OVCAR3 CDX of Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW042) 8

[0510] Tumor volumn (mm3) b: Average tumor volumn±SEM.

[0511] Pc: For comparison between two groups, an independent sample t-test will be used. For comparison among three or more groups, a one-way ANOVA will be performed. Data will be presented by MS Excel and analyzed by GraphPad Prism 6.0. Survival data will be analyzed via Log-rank (Mantel-Cox) test in GraphPad Prism. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001) , p< 0.05 is considered to be statistically significant.

[0512] As showed in the table 6 and Figure 36, Farletuzumab-mut 4-LALA- (LW042) 8 demonstrates significant inhibition of tumor growth in the OVCAR3 CDX model, further supporting the potential of the unique hydrophilic linker design for innovative ADC drugs in the present application.

[0513] All of the articles and methods disclosed and claimed herein can be made and executed without undue experimentation in light of the present disclosure. While the articles and methods of this disclosure have been described in terms of preferred embodiments, it will be apparent to those of skill in the art that variations may be applied to the articles and methods without departing from the spirit and scope of the disclosure. All such variations and equivalents apparent to those skilled in the art, whether now existing or later developed, are deemed to be within the spirit and scope of the disclosure as defined by the appended claims. All patents, patent applications, and publications mentioned in the specification are indicative of the levels of those of ordinary skill in the art to which the disclosure pertains. All patents, patent applications, and publications are herein incorporated by reference in their entirety for all purposes and to the same extent as if each individual publication was specifically and individually indicated to be incorporated by reference in its entirety for any and all purposes. The disclosure illustratively described herein suitably may be practiced in the absence of any element (s) not specifically disclosed herein. Thus, it should be understood that although the present disclosure has been specifically disclosed by preferred embodiments and optional features, modification and variation of the concepts herein disclosed may be resorted to by those skilled in the art, and that such modifications and variations are considered to be within the scope of this invention as defined by the appended claims.

Claims

A linker or a linker conjugate having the following formula (II) ,L-D (II) ,a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof,wherein,D is selected from at least one of leaving group or drug unit, optionally, the leaving group comprises halogen, -OMs, -OTs or -OTf;“-” is a suitable binding way connecting the parts of the left and the right of “-” ;L has the following formula (III) ,L1-L2-L3- (III)wherein,L2 is absent or -O-C (=O) -;L3 is absent or a linker moiety;L1 has the following formula (IV) ,wherein,R1 is -Q1-Q2-Q3, wherein,Q1 is selected from absent, -O- (CH2) n3-C (=O) NH- (CH2) n3-, -O- (CH2) n3-C (=O) - (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -O- (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -C (=O) NH- (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -C (=O) NH- (CH2) n3-C (=O) NH- (CH2) n3-, - (CH2) n3-N (R10) -C (=O) - (CH2) n3-NHC (=O) -, -C (=O) NH- (CH2) n3-C (=O) -, Q2 is selected from absent, -(CH2) n3- (OCH2CH2) n4-, - (CH2CH2O) n4-(CH2) n3-, - (CH2) n4-or - (CH2) n3C (=O) NH (CH2) n3-;Q3 is selected fromB is selected fromR2 is selected from H, - (CH2) n5-NH-C (=O) - (CH2) n5-R7, - (CH2) n5-C (=O) -NH- (CH2) n5-R7, - (C0-C6 alkylene) -C (=O) -R7, - (C0-C15 alkylene) -R7 or - (CH2) n5-N (-C (=O) CH3) - (CH2) n5-R7;R7 is selected from C1-C6 alkyl or hydrophilic motif;R3 is selected from H, -C1-C6-alkylene-OH, -C1-C6-alkylene-COOH orR4 is selected from H or C1-C6 alkyl;R5 is selected from H, C1-C6 alkyl, - (C0-C6 alkylene-OH) or - (C0-C10 alkylene) -NH-C (=O) NH2;R10 is selected from H or C1-C6 alkyl;m and n are independently selected from 1-20;n2 and n3 is independently selected from 0-10;n4 is independently selected from 0-20;n5 is independently selected from 0-5.The linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to claim 1, wherein, L1 has the following formula (IV-1)wherein, R1, R2, R3, R4 and R5 are same as those of claim 1.The linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to claim 1 or claim 2, wherein,R1 is -Q1-Q2-Q3,Q1 is selected from -O- (CH2) n3-C (=O) NH- (CH2) n3-, -O- (CH2) n3-C (=O) - (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -O- (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -C (=O) NH- (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -C (=O) NH- (CH2) n3-C (=O) NH- (CH2) n3-, - (CH2) n3-N (R10) -C (=O) - (CH2) n3-NHC (=O) -orQ2 is selected from - (CH2) n3- (OCH2CH2) n4-, - (CH2CH2O) n4- (CH2) n3-, - (CH2) n4-or - (CH2) n3C (=O) NH (CH2) n3-;Q3 is selected fromR2 is selected from H, - (CH2) n5-NH-C (=O) - (CH2) n5-R7, - (CH2) n5-C (=O) -NH- (CH2) n5-R7, - (C0-C3 alkylene) -C (=O) -R7, - (C0-C6 alkylene) -R7 or - (CH2) n5-N (-C (=O) CH3) - (CH2) n5-R7;R7 is selected from C1-C6 alkyl or hydrophilic motif, the hydrophilic motif is selected fromR3 is selected from H, -C1-C6-alkylene-OH or -C1-C6-alkylene-COOH;R10 is selected from H or C1-C6 alkyl;m and n are independently selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20;n2 and n3 are independently selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;n4 is independently selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20;n5 is independently selected from 0, 1, 2, 3, 4 or 5.The linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to any one of claims 1-3, wherein,Q1 is selected from -CH2-NH-C (=O) -CH2-NHC (=O) -, -CH2-N (CH3) -C (=O) -CH2-NHC (=O) -, -OCH2-C (=O) -CH2-NHC (=O) -, -OCH2CH2-NH-C (=O) -, -OCH2-C (=O) -NH-CH2-, -C (=O) NH-CH2-C (=O) NH-CH2-, -C (=O) NH-CH2CH2-NHC (=O) -orQ2 is selected from -CH2- (OCH2CH2) 4-, -CH2-OCH2CH2O- (CH2) 2-, - (CH2CH2O) 2- (CH2) 2-, - (CH2CH2O) 4- (CH2) 2-, - (CH2) 5-, - (CH2) 4-, - (CH2) 2-or -CH2-;Q3 is selected fromR2 is selected from H, -NH-C (=O) -R7, -C (=O) -NH-CH2-R7, - (CH2) 2-C (=O) -NH-CH2-R7, --CH2-C (=O) -NH-CH2-R7, -CH2-C (=O) -NH- (CH2) 2-R7, -CH2-NH-C (=O) -R7, -CH2-C (=O) -R7, -CH2CH2-R7, -CH2-R7, -R7, - (CH2) 2-N (-C (=O) CH3) -CH2-R7 or -CH2-N (-C (=O) CH3) -CH2-R7;R7 is selected from -CH3, The linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to any one of claims 1-4, wherein,R1 is selected fromR2 is selected from H, -NH-C (=O) -CH3, R3 is selected from H, -CH2CH2-COOH or -CH2-OH.The linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to any one of claims 1-5, wherein, R4 is selected from H or C1-C3 alkyl; R5 is selected from H, C1-C3 alkyl oroptionally, R4 is selected from H, -CH3 or -CH (CH3) 2, R5 is selected from H, -CH3 orThe linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to claim 1, wherein, L1 has the following formula (IV-2)wherein,R1 is -Q1-Q2-Q3,Q1 is selected from -O- (CH2) n3-C (=O) - (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -O- (CH2) n3-C (=O) NH- (CH2) n3-, -O- (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, -C (=O) NH- (CH2) n3-NHC (=O) - (CH2) n3-, or - (CH2) n3-N (R10) -C (=O) - (CH2) n3-NHC (=O) -;Q2 is selected from - (CH2) n3- (OCH2CH2) n4-or - (CH2CH2O) n4- (CH2) n3-;Q3 is selected fromn3 is independently selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;n4 is independently selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20.The linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to claim 1 or 7, wherein, Q1 is selected from -C (=O) NH-CH2CH2-NHC (=O) -, -CH2-N ( CH3) -C (=O) -CH2-NHC (=O) -, -OCH2-C (=O) -NH-or -OCH2-C (=O) -CH2-NHC (=O) -; Q2 is selected from -CH2-OCH2CH2O- (CH2) 2-, - (CH2CH2O) 2- (CH2) 2-, -CH2- (OCH2CH2) 4-or - (CH2CH2O) 4- (CH2) 2-; Q3 isThe linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to claim 1, 7 or 8, wherein, R1 is selected fromThe linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to any one of claims 1-9, wherein, L1 is selected from any one of the following:The linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to any one of claims 1-10, wherein, L2 is absent or -O-C (=O) -; L3 is absent.The linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to any one of claims 1-11, wherein, D is the drug unit, optionally, the drug unit is a function molecule with a reactive amino group and / or a reactive hydroxyl, more optionally, the drug unit comprises at least one of the groups consisting of a topoisomerase inhibitor, a microtubule-targeting agent (MTA) , a poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor, an ATR inhibitor, a STING agonist, a toll-like receptor agonist, an RNA polymerase inhibitor, a DNA alkylating agent and a tyrosine kinase inhibitor, most optionally, the drug unit comprises at least one of the groups consisting of Exatecan, DXd, SN38, MMAE, MMAF, Eribulin, VE-822, Talazoparib, or Rucaparib, or the drug unit comprises at least one selected from the groups consisting of the following,The linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to any one of claims 1-12, wherein, the linker conjugate is selected from any one of the followingA method of preparing the linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to any one of claims 1-13.A conjugate compound, or the pharmaceutically acceptable salts, wherein, the conjugate compounds having the following formula (V) ,Targeting agent- (L-D) z (V)wherein,L is the L according to any one of claims 1-13;“-” is a suitable binding way connecting the parts of the left and the right of “-” ;D is the drug unit, optionally, the drug unit is a function molecule with a reactive amino group and / or a reactive hydroxyl, more optionally, the drug unit comprises at least one of the groups consisting of a topoisomerase inhibitor, a microtubule-targeting agent (MTA) , a poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor, an ATR inhibitor, a STING agonist, a toll-like receptor agonist, an RNA polymerase inhibitor, a DNA alkylating agent and a tyrosine kinase inhibitor, most optionally, the drug unit comprises at least one of the groups consisting of Exatecan, DXd, SN38, MMAE, MMAF, Eribulin, VE-822, Talazoparib, or Rucaparib, or the drug unit comprises at least one selected from the groups consisting of the following,z is an integer of 1 to 20;the targeting agent comprises an antibody, peptide, RNA, or DNA molecule.The conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to claim 15, wherein, the antibody is a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a mono-specific antibody or a multi-specific antibody, optionally, the antibody is a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody or an antigen-binding moiety thereof, more optionally, the target of the antibody comprises HER2, Trop2, HER3, EGFR, Nectin4, CD19, CD30, CD79b, C-Met, B7H3, B7H4, LIV-1, ROR1, ROR2, CDH6, CDH3, FOLR1, PSMA, 5T4, MUC1, MUC16, MUC18, PTK7, ADAM9, LRRC-15, DLL3, MSLN, FGFR2b, FGFR3, CLDN6, Claudin18.2, CD38, CD37, CD70, CD73, CD74, NaPi2b, CEACAM5, CD20, CD25, CCR8, BCMA, GPRC5D, GPC3, CDH17, PD-L1, TNFα, GD2, TfR1, CD22, CD33, FAP, CD44, SnT or CD47.The conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to claim 15 or 16, wherein, the conjugate compounds are selected from any of the followingoptionally, the antibody is selected from trastuzumab, farletuzumab or mutant antibody, wherein, the mutant antibody comprises a heavy chain and a light chain, (1) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 1, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 2; and / or, (2) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4; and / or, (3) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 5, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 6; and / or, (4) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8; and / or, (5) the heavy chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 9, the light chain comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 10;optionally, z is selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15.The conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to any one of claims 15-17, wherein,in ADC 1, z is 8, the antibody is trastuzumab; and / or,in ADC 1, z is 4, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 1, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 2; and / or,in ADC 1, z is 4, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4; and / or,in ADC 2, z is 8, the antibody is trastuzumab; and / or,in ADC 2, z is 4, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4; and / or,in ADC 2, z is 2, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8; and / or,in ADC 2, z is 6, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4; and / or,in ADC 2, z is 8, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8; and / or,in ADC 3, z is 2, the antibody is trastuzumab; and / or,in ADC 3, z is 4, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 9, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 10; and / orin ADC 3, z is 6 or 8, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 5, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 6, or, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8; and / or,in ADC 4, z is 6, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8 ; and / or,in ADC 5, z is 6, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4; and / or,in ADC 6, z is 6, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 5, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 6; and / or,in ADC 7, z is 6 or 8, the heavy chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7, the light chain of the antibody comprises the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 8.A method of preparing the conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to any one of claims 15-18.A pharmaceutical composition comprising the linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to any one of claims 1-13 or the conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to any one of claims 15-18.Use of the linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to any one of claims 1-13 or the conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to any one of claims 15-18 in the manufacture of a drug for preventing or treating a disease.A method of preventing or treating a disease in a subject in need thereof, comprising administrating to the subject a therapeutically effective amount of the linker or the linker conjugate, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, enantiomer, diastereomer, racemate, solvate, prodrug, or deuterated counterpart thereof according to any one of claims 1-13 or the conjugate compounds or the pharmaceutically acceptable salts thereof according to any one of claims 15-18.

Images