Methods, systems and kits of detecting a panel of retinopathy of prematurity-associated proteins in preterm infant

Abstract

A method is provided for detecting expression levels of a panel of retinopathy of prematurity (ROP)-associated proteins in a preterm infant. The method involves obtaining a tear sample from the infant and extracting a protein expression profile therefrom. Expression levels of a panel of ROP-associated proteins, including one or more upregulated and downregulated proteins, are detected in the protein expression profile. For each upregulated protein, a log2 fold change (Log2FC) value is calculated relative to a corresponding baseline expression level, and similarly for each downregulated protein. A list is then generated that includes upregulated proteins with Log2FC values greater than or equal to a positive threshold, and downregulated proteins with Log2FC values less than or equal to a negative threshold.

Description

METHODS, SYSTEMS AND KITS OF DETECTING A PANEL OF RETINOPATHY OF PREMATURITY-ASSOCIATED PROTEINS IN PRETERM INFANTInventors: Wai Ching LAM; Chuen LAM; Ying Hon SZE; Hoi Ying Alicia LIU; and Pak Man CHENGCross-Reference to Related Applications:

[0001] The present application claims priority from U.S. Provisional Utility Patent applications no. 63 / 693,209 filed September 11, 2024 and no. 63 / 767,518 filed March 05, 2025; the disclosures of which are incorporated herein by reference in its entirety.Field of the Invention:

[0002] The present invention generally relates to the fields of medicine and bioinformatics. More specifically the present invention relates to methods, systems and kits for detecting a panel of retinopathy of prematurity (ROP) -associated proteins in preterm infants.Background of the Invention:

[0003] Retinopathy of prematurity (ROP) is a serious ophthalmic condition characterized by the abnormal proliferation of blood vessels in the retina of premature infants. This pathological neovascularization typically arises at the junction between the vascularized and avascular zones of the immature retina and can progress to form fibrous scar tissue. The contraction of this fibrotic tissue may ultimately result in retinal detachment, leading to permanent vision loss. ROP is recognized as the leading cause of preventable childhood blindness worldwide. With the advancement of neonatal care improving the survival rates of preterm infants, the global incidence of ROP has risen significantly. Despite its clinical relevance, the underlying causes and pathophysiology of ROP remain incompletely understood.

[0004] The progression of ROP can be rapid and severe. Clinically, ROP is classified into five stages, ranging from mild demarcation lines between the vascularized and avascular retina (Stage 1) to the formation of a ridge (Stage 2) , pathological neovascularization (Stage 3) , subtotal retinal detachment (Stage 4) , and lastly complete retinal detachment (Stage 5) . The disease is also topographically divided into three concentric retinal zones centered around the optic disc: zone I: the innermost circle encompassing the macula and optic disc; zone II: the mid-peripheral retina; and zone III: the outer crescent-shaped peripheral retina. Timely identification of disease progression is critical, as early intervention with anti-VEGF (vascular endothelial growth factor) therapy or laser photocoagulation can arrest the advancement of the disease and preserve vision.

[0005] Currently, indirect fundus ophthalmoscopy is regarded as the gold standard for ROP screening. However, this method requires specialized instruments and relies heavily on subjective assessment by experienced ophthalmologists. Inconsistencies in the interpretation of subtle retinal features and variation in disease staging across practitioners can lead to diagnostic variability. Moreover, the examination procedure often necessitates repeated pupil dilation using cycloplegic or mydriatic agents, which can be physiologically stressful for fragile preterm infants and may cause undesirable side effects. Although image-based ROP screening has been introduced, it suffers from limited prognostic capacity, typically identifying ROP only after its onset, rather than enabling prediction or early risk assessment. Consequently, many infants may not receive timely medical attention, resulting in irreversible retinal damage.

[0006] There is an urgent clinical need and significant technological gap for reliable, non-invasive diagnostic assays that can detect or predict the onset of ROP through measurable biomarkers. Traditional approaches involving direct retinal tissue sampling are highly invasive and present substantial risks, including the possibility of permanent retinal injury. None of the currently available technologies can accurately forecast the development of ROP in high-risk preterm infants. Therefore, the present invention addresses this critical unmet need by providing a non-invasive, biomarker-based solution that enables early detection or prediction of ROP, facilitating proactive clinical intervention and reducing the risk of blindness in this vulnerable patient population.Summary of the Invention:

[0007] It is an objective of the present invention to provide the methods and systems to solve the aforementioned technical problems.

[0008] In accordance with a first aspect of the present invention, a method of detecting expression levels of a penal of ROP-associated proteins in a preterm infant is provided. The method includes: obtaining a tear sample from a preterm infant; extracting a protein expression profile of the tear sample; and detecting expression levels of a panel of ROP-associated proteins in the protein expression profile, wherein the panel of ROP-associated proteins includes one or more of upregulated proteins and one or more of downregulated proteins.

[0009] The method further includes: calculating from the detected expression levels, for each of the one or more upregulated proteins, an upregulated log2 fold change (Log2FC) value relative to a corresponding baseline expression level, and for each of the one or more downregulated proteins, a downregulated Log2FC value relative to a corresponding baseline expression level; and generating a list including: the upregulated proteins having upregulated Log2FC values greater than or equal to a positive threshold, and the downregulated proteins having downregulated Log2FC values less than or equal to a negative threshold.

[0010] In accordance with one embodiment, the set of upregulated proteins includes one or more of: beta-2-microglobulin (B2M) , fatty acid–binding protein 5 (FABP5) , protein S100-A4 (S100A4) , secretoglobin family 1D member 1 (SCGB1D1) , interleukin-1 receptor antagonist (IL1RN) , glutathione reductase (GSR) , GTP-binding nuclear protein Ran (RAN) , eukaryotic initiation factor 4A-I (EIF4A1) , polymeric immunoglobulin receptor (PIGR) , NAD (P) H dehydrogenase 1 (NQO1) , cysteine-rich protein 1 (CRIP1) , membrane-associated phospholipase A2 (PLA2G2A) , DNA dC→dU-editing enzyme APOBEC-3A (APOBEC3A) , cartilage acidic protein 1 (CRTAC1) , and C-X-C motif chemokine 17 (CXCL17) .

[0011] In accordance with another embodiment, the set of downregulated proteins includes one or more of: antithrombin-III (SERPINC1) , fructose-1, 6-bisphosphatase 1 (FBP1) , apolipoprotein D (APOD) , apolipoprotein A-I (APOA1) , apolipoprotein A-IV (APOA4) , adenylate kinase isoenzyme 1 (AK1) , beta-hexosaminidase subunit alpha (HEXA) , hemopexin (HPX) , alpha-fetoprotein (AFP) , serotransferrin (TF) , protein AMBP (AMBP) , inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 (ITIH2) , transthyretin (TTR) , retinol-binding protein 4 (RBP4) , beta-2-glycoprotein 1 (APOH) , alpha-2-HS-glycoprotein (AHSG) , and ganglioside GM2 activator (GM2A) .

[0012] In accordance with yet another embodiment, the positive threshold is 0.58.

[0013] In accordance with yet another embodiment, the negative threshold is -0.58.

[0014] In accordance with yet another embodiment, the baseline expression levels of the upregulated proteins and the downregulated proteins are obtained from tear samples of healthy preterm infants.

[0015] In accordance with yet another embodiment, the protein expression profile is acquired using data-independent acquisition (DIA) mass spectrometry and quantified using a machine learning–based analysis pipeline.

[0016] In accordance with a second aspect of the present invention, a system for detecting expression levels of a panel of ROP-associated proteins in a preterm infant is provided. The system includes: a sample acquisition module configured to receive a tear sample from a preterm infant; a protein profiling module configured to extract a protein expression profile from the tear sample; a protein detection module configured to detect expression levels of a panel of ROP-associated proteins in the protein expression profile, wherein the panel includes one or more upregulated proteins and one or more downregulated proteins.

[0017] The system further includes a computational module configured to: calculate from the detected expression levels, for each of the one or more upregulated proteins, an upregulated Log2FC value relative to a corresponding baseline expression level; calculate, for each of the one or more downregulated proteins, a downregulated Log2FC value relative to a corresponding baseline expression level; and generate a list including the upregulated proteins having upregulated Log2FC values greater than or equal to a positive threshold, and the downregulated proteins having downregulated Log2FC values less than or equal to a negative threshold.

[0018] In accordance with one embodiment, the upregulated proteins include one or more of B2M, FABP5, S100A4, SCGB1D1, IL1RN, GSR, RAN, EIF4A1, PIGR, NQO1, CRIP1, PLA2G2A, APOBEC3A, CRTAC1 and CXCL17; and the downregulated proteins include one or more of SERPINC1, FBP1, APOD, APOA1, APOA4, AK1, HEXA, HPX, AFP, TF, AMBP, ITIH2, TTR, RBP4, APOH, AHSG, and GM2A.

[0019] In accordance with another embodiment, the baseline expression levels of the upregulated and downregulated proteins derived from tear samples of healthy preterm infants.

[0020] In accordance with yet another embodiment, the positive threshold is 0.58 and the negative threshold is -0.58.

[0021] In accordance with yet another embodiment, the protein profiling module comprises a DIA mass spectrometer.

[0022] In accordance with a third aspect of the present invention, a kit for detecting a panel of ROP-associated proteins in a preterm infant is provided. The kit includes a protein assay for detecting the presence or expression level of a panel of ROP-associated proteins in a biological sample obtained from a preterm infant. Specifically, the panel of ROP-associated proteins includes one or more of: B2M, FABP5, S100A4, SCGB1D1, IL1RN, GSR, RAN, EIF4A1, PIGR, NQO1, CRIP1, PLA2G2A, APOBEC3A, CRTAC1, CXCL17, SERPINC1, FBP1, APOD, APOA1, APOA4, AK1, HEXA, HPX, AFP, TF, AMBP, ITIH2, TTR, RBP4, APOH, AHSG, and GM2A.

[0023] In accordance with one embodiment, the protein assay includes a mass spectrometry-based assay, an antibody-based immunoassay, a protein microarray, and an aptamer-based detection system

[0024] In accordance with yet another embodiment, the biological sample includes a tear fluid sample, a blood sample, a serum sample, and a plasma sample obtained from the preterm infant.Brief Description of the Drawings:

[0025] Embodiments of the invention are described in more details hereinafter with reference to the drawings, in which:

[0026] FIG. 1 depicts a flowchart of a method for detecting expression levels of a panel of ROP-associated proteins in a preterm infant in accordance with one embodiment of the present invention;

[0027] FIG. 2 depicts a schematic block diagram of a system for detecting expression levels of a panel of ROP-associated proteins in a preterm infant in accordance with one embodiment of the present invention;

[0028] FIGs. 3A-3D depict the characteristics of tear samples, in which FIG. 3A shows the gender ratio; FIG. 3B illustrates the statistical postmenstrual age; FIG. 3C exhibits the body weight characteristics; and FIG. 3D demonstrates the histogram of ROP severity in zone and stages rated by registered ophthalmologist;

[0029] FIGs. 4A-4B depict the volcano plot of quantified tear proteins by two analysis pipelines, in which FIG. 4A shows the DIA-NN in library-free mode and FIG. 4B depicts the PeakView with spectral library;

[0030] FIG. 5 depicts the differentially expressed proteins in common between DIA-NN and PeakView analysis workflow;

[0031] FIG. 6 depicts the differentially expressed proteins in common between library-free quantification using DIA-NN and Spectronaut;

[0032] FIGs. 7A-7B depict the functional enrichment visualization, in which FIG. 7A shows the biological process enrichment and FIG. 7B illustrates the molecular function enrichment; and

[0033] FIG. 8 depicts the receiver operating characteristic (ROC) analysis showing the retrospective analysis of the SERPINC1 protein, with an area under curve (AUC) value of 0.758.Detailed Description:

[0034] In the following description, the systems and methods of providing a ROP-associated protein list of a preterm infant and the likes are set forth as preferred examples. It will be apparent to those skilled in the art that modifications, including additions and / or substitutions may be made without departing from the scope and spirit of the invention. Specific details may be omitted so as not to obscure the invention; however, the disclosure is written to enable one skilled in the art to practice the teachings herein without undue experimentation.

[0035] ROP can develop when the immature retinal blood vessels have not reached the edge of the retina. The severity of the ROP is often described from stage 1 to 5. Stage 1 ROP is defined as the demarcation line, a whitish line visible between the normal vascularized retina and the peripheral retina in which there are no blood vessels. Stage 2 ROP is a visible ridge, with height and width between the vascular retina and peripheral retina. Stage 3 ROP is the abnormal new blood vessels in the ridge. The blood vessels grow, proliferate and are visible in the ridge. Stage 4 ROP is sub-total retinal detachment, of which vitreoretinal surgery may be indicated. Finally, stage 5 ROP is total retinal detachment with poor treatment outcome, leading to permanent vision loss. The three zones of ROP are centered on the optic disc. Zone I is the small circle of retina around the optic disc, with radius of the circle being twice the distance from the macula to the center of the optic disc. Zone II is the ring-shaped section of the retina surrounding zone I, which extends to the edge of the retina on the nasal side. Zone III is a crescent-shaped area of the temporal retina.

[0036] In accordance with a first aspect of the present invention, a method for detecting expression levels of a panel of ROP-associated proteins in a preterm infant is provided. As shown in FIG. 1, the method begins by obtaining a tear sample from the subject infant (S101) . Tear fluid collection may be conducted using minimally invasive techniques, such as the application of Schirmer’s strips or other ophthalmologically accepted sampling devices, to collect a sufficient volume of tear fluid from the ocular surface.

[0037] Once collected, the tear sample is processed to extract a comprehensive protein expression profile (S102) . This step typically involves protein isolation, denaturation, enzymatic digestion, and subsequent preparation of peptide fragments suitable for mass spectrometry analysis. The extracted protein profile is then subjected to high-throughput proteomic analysis to identify and quantify the expression levels of specific proteins of interest (S103) . In a preferred embodiment, the protein expression profile is acquired using data-independent acquisition (DIA) mass spectrometry, which enables accurate, reproducible, and high-coverage quantification of tear proteins. The resulting data is further analyzed using a machine learning–based analysis pipeline, such as a neural network-driven algorithm, to enhance detection fidelity and resolve complex expression patterns.

[0038] In one embodiment, the method specifically focuses on detecting the expression levels of a predefined panel of ROP-associated proteins. The panel includes both upregulated and downregulated proteins associated with ROP pathophysiology. The upregulated proteins in the panel include one or more of the following: beta-2-microglobulin (B2M) , fatty acid-binding protein 5 (FABP5) , protein S100-A4 (S100A4) , secretoglobin family 1D member 1 (SCGB1D1) , interleukin-1 receptor antagonist (IL1RN) , glutathione reductase (GSR) , GTP-binding nuclear protein Ran (RAN) , eukaryotic initiation factor 4A-I (EIF4A1) , polymeric immunoglobulin receptor (PIGR) , NAD (P) H dehydrogenase 1 (NQO1) , cysteine-rich protein 1 (CRIP1) , membrane-associated phospholipase A2 (PLA2G2A) , DNA dC→dU-editing enzyme APOBEC-3A (APOBEC3A) , cartilage acidic protein 1 (CRTAC1) , and C-X-C motif chemokine 17 (CXCL17) .

[0039] The downregulated proteins in the ROP panel, on the other hand, include one or more of the following: antithrombin-III (SERPINC1) , fructose-1, 6-bisphosphatase 1 (FBP1) , apolipoprotein D (APOD) , apolipoprotein A-I (APOA1) , apolipoprotein A-IV (APOA4) , adenylate kinase isoenzyme 1 (AK1) , beta-hexosaminidase subunit alpha (HEXA) , hemopexin (HPX) , alpha-fetoprotein (AFP) , serotransferrin (TF) , protein AMBP (AMBP) , inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 (ITIH2) , transthyretin (TTR) , retinol-binding protein 4 (RBP4) , beta-2-glycoprotein 1 (APOH) , alpha-2-HS-glycoprotein (AHSG) , and ganglioside GM2 activator (GM2A) .

[0040] To assess the extent of differential expression of these proteins in the tear sample of the preterm infant, the method further includes calculating a log2 fold change (Log2FC) value for each protein (S104) . Specifically, for each upregulated protein in the panel, an upregulated Log2FC value is calculated by comparing the measured expression level in the infant’s tear sample to a corresponding baseline expression level. Similarly, a downregulated Log2FC value is calculated for each downregulated protein using the same comparison. The baseline expression levels are preferably derived from a reference dataset of protein expression profiles obtained from tear samples of healthy preterm infants who are not diagnosed with ROP.

[0041] Once the Log2FC values are computed, the method proceeds to generate a list of proteins that meet certain diagnostic thresholds (S105) . Upregulated proteins with Log2FC values greater than or equal to a predetermined positive threshold, preferably 0.58, are included in the list. Likewise, downregulated proteins with Log2FC values less than or equal to a negative threshold, preferably -0.58, are also included in the list. This protein list may serve as a molecular signature of ROP-associated tear biomarkers and can be used to support subsequent clinical decision-making or risk stratification.

[0042] The method in accordance with the embodiments of the present invention enables a robust, minimally invasive, and data-driven approach to detect potential ROP biomarkers in preterm infants at risk for disease progression. By utilizing quantitative proteomics and machine learning-based analysis, the invention facilitates early identification of molecular changes associated with ROP, allowing for more timely diagnosis and intervention.

[0043] In accordance with a second aspect of the present invention, a system for detecting expression levels of a panel of ROP-associated proteins in a preterm infant is provided. Referring to FIG. 2, the system 200 is designed to operate across multiple stages, beginning with a sample acquisition module 201 configured to receive a tear sample from a preterm infant. The sample acquisition module 201 may include sample collection tools such as the Schirmer’s strips or microcapillary collection devices capable of obtaining minimally invasive ocular surface tear samples.

[0044] The system 200 further includes a protein profiling module 202. Once the tear sample is collected, it is transferred to the protein profiling module 202 configured to extract a protein expression profile from the tear sample. The protein profiling module 202 may implement protein stabilization, lysis, reduction, alkylation, enzymatic digestion (e.g., trypsin digestion) , and subsequent peptide purification steps. In a preferred configuration, the protein profiling module 202 incorporates a DIA mass spectrometer, which enables high-throughput and reproducible quantification of tear fluid proteins. The DIA workflow may be coupled with a neural network–based computational pipeline or other machine learning-driven algorithm to support spectral deconvolution, protein identification, and quantification.

[0045] The system 200 further includes a protein detection module 203. Following protein profiling, the sample is processed by the protein detection module 203 configured to detect expression levels of a panel of ROP-associated proteins within the protein expression profile. This panel includes one or more upregulated proteins and one or more downregulated proteins associated with ROP pathogenesis.

[0046] In one embodiment, the upregulated proteins include one or more of the following: B2M, FABP5, S100A4, SCGB1D1, IL1RN, GSR, RAN, EIF4A1, PIGR, NQO1, CRIP1, PLA2G2A, APOBEC3A, CRTAC1, and CXCL17.

[0047] Similarly, the downregulated proteins include one or more of: SERPINC1, FBP1, APOD, APOA1, APOA4, AK1, HEXA, HPX, AFP, TF, AMBP, ITIH2, TTR, RBP4, APOH, AHSG, and GM2A.

[0048] A computational module 204 is included in the system 200 and configured to perform several key computational steps. The computational steps include calculating, for each of the one or more upregulated proteins, an upregulated Log2FC value relative to a corresponding baseline expression level; and calculating, for each of the one or more downregulated proteins, a downregulated Log2FC value relative to its corresponding baseline. The baseline expression levels for both upregulated and downregulated proteins are derived from tear samples collected from healthy preterm infants who do not exhibit ROP symptoms. This reference set provides a comparative control for identifying significant deviations in protein expression associated with disease onset.

[0049] Once Log2FC values are calculated, the computational module 204 generates a list comprising (i) upregulated proteins having Log2FC values greater than or equal to a predetermined positive threshold, and (ii) downregulated proteins having Log2FC values less than or equal to a predetermined negative threshold. In one exemplary implementation, the positive threshold is set at 0.58, and the negative threshold is set at -0.58, based on statistically validated fold-change cutoffs commonly used in proteomic differential expression analysis.

[0050] Altogether, the system 200 provides an integrated platform for detecting and quantifying tear-based biomarkers of ROP in preterm infants using a combination of biological sampling, mass spectrometric profiling, and computational analysis. The output of the system 200-namely the generated list of ROP-associated proteins with significant expression changes-may be used for diagnostic, prognostic, or therapeutic guidance in clinical neonatal care settings.

[0051] In accordance with a third aspect of the present invention, a kit for detecting a panel of ROP-associated proteins in a preterm infant is provided. The kit includes a protein assay that is configured to detect the presence or the expression level of such proteins in a biological sample obtained from the preterm infant. The panel of ROP-associated proteins includes one or more selected from the group consisting of: B2M, FABP5, S100A4, SCGB1D1, IL1RN, GSR, RAN, EIF4A1, PIGR, NQO1, CRIP1, PLA2G2A, APOBEC3A, CRTAC1, CXCL17, SERPINC1, FBP1, APOD, APOA1, APOA4, AK1, HEXA, HPX, AFP, TF, AMBP, ITIH2, TTR, RBP4, APOH, AHSG, and GM2A. These proteins, either alone or in combination, provide biomarkers that are indicative of disease state or risk, and the kit is designed to enable their reliable and reproducible detection in a clinically relevant setting.

[0052] The term “protein assay” used herein is intended to broadly encompass any suitable analytical or detection methodology capable of identifying, quantifying, or otherwise characterizing proteins of interest. Accordingly, the scope of “protein assay” as used in the present invention is not intended to be limited to any single methodology, but rather encompasses all techniques that can reliably detect or measure the expression level of one or more of the ROP-associated proteins in a biological sample.

[0053] In certain embodiments, the protein assay of the kit may include a mass spectrometry-based assay. Examples of such assays include liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS / MS) , which provides highly sensitive and quantitative analysis of targeted peptides, DIA-based proteomics that allows comprehensive profiling of complex samples, multiple reaction monitoring (MRM) for precise targeted protein quantitation, and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry, which enables rapid and high-throughput identification of proteins. Each of these mass spectrometry techniques may be utilized within the kit depending on laboratory infrastructure and the desired resolution of protein detection.

[0054] In other embodiments, the protein assay may include an antibody-based immunoassay. Suitable immunoassay formats include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) , which allows high-throughput quantitative detection of specific proteins in microplate format; Western blotting, which confirms protein presence and molecular weight through separation and immunodetection; and Luminex bead-based multiplex immunoassay, which enables simultaneous measurement of multiple ROP-associated proteins in a single sample. The inclusion of such antibody-based detection methods ensures compatibility with widely available clinical and research laboratory technologies.

[0055] In yet another embodiment, the protein assay may include a protein microarray, in which immobilized antibodies or aptamers are configured to specifically bind to the ROP-associated proteins of the panel. Such arrays allow high-throughput screening of many proteins simultaneously from a limited sample volume, making them particularly well-suited for precious or low-volume clinical specimens such as tear fluid from preterm infants.

[0056] In some embodiments, the protein assay includes an aptamer-based detection system. Aptamers, which are short nucleic acid or peptide molecules with high binding affinity, can be engineered to bind one or more ROP-associated proteins with high specificity. An aptamer-based system incorporated into the kit thus provides an alternative detection modality that is stable, reproducible, and adaptable to both conventional and point-of-care diagnostic platforms.

[0057] The biological sample to be analyzed using the kit may include any clinically accessible fluid derived from a preterm infant. Suitable samples include tear fluid, blood, serum, and plasma samples. The flexibility of sample choice expands the utility of the kit across different clinical workflows and patient care settings.

[0058] Collectively, the kit provides a versatile and comprehensive platform for the detection of ROP-associated proteins in preterm infants. By enabling detection through multiple assay formats-including mass spectrometry-based proteomics, antibody-based immunoassays, protein microarrays, and aptamer-based systems-the kit ensures adaptability to various laboratory environments and diagnostic requirements. Moreover, the option of analyzing diverse biological samples such as tear fluid or blood enhances clinical applicability while minimizing invasiveness for vulnerable preterm patients.

[0059] EXAMPLES

[0060] Definition of preterm infants

[0061] Infants whose birth weight is ≤ 1500 g or gestational age of ≤ 30 weeks in the neonatal intensive care unit at Queen Mary Hospital (Hong Kong) are recruited. Registered pediatric ophthalmologists / retinal specialists start the experiments when the infants reach 4 weeks chronologic age or 31 weeks postmenstrual age, whichever is later.

[0062] A cross-sectional study is conducted. Prior to administering pupil dilation drops for each ROP screening test, tear films are collected with Schirmer’s strips from each eye of the ROP and non-ROP preterm infants. During the ROP screening test, ROP diagnosis is made according to the latest International Classification for Retinopathy of Prematurity (Third Edition) .

[0063] Example 1. Development of the ROP protein panel

[0064] Tear fluid samples are collected to investigate the differential expression of proteins associated with ROP. Schirmer’s strips are utilized for tear collection. The procedure involves bending the notch of each strip to a 90-degree angle and gently pulling down the patient’s lower eyelid to place the bent end along the inner lid margin. Tear fluid is absorbed onto the strip until a minimum of 20 mm of the strip is moistened. Immediately after removal, the strips are dry-heated to preserve the collected proteins and stored in Eppendorf tubes at room temperature for transport to the laboratory for proteomic analysis.

[0065] Tear samples are collected by licensed ophthalmologists at Queen Mary Hospital in Hong Kong. A total of 33 tear samples are obtained from 34 preterm infants, including 4 infants diagnosed with ROP and 19 without ROP. Samples are collected from both eyes on the same day, prior to clinical diagnosis, resulting in 13 ROP-associated samples and 21 non-ROP samples. The cohort includes 20 male and 14 female infants (FIG. 3A) . No statistically significant differences are observed between the ROP and non-ROP groups in terms of postmenstrual age (37.4 ± 2.9 vs. 35.8 ± 2.0 weeks, p = 0.103; FIG. 3B) or body weight (37.4 ± 2.9 g vs. 35.8 ± 2.0 g, p = 0.297; FIG. 3C) . The majority of ROP diagnoses corresponds to stage 2 disease located in zone 2 of the retina (FIG. 3D) . Statistical comparisons are conducted using an unpaired Student’s t-test with unequal variance.

[0066] The total protein concentration in tear samples ranges from 3.5 to 9.5 mg / mL for basal and reflex tears and is higher in newborns, reaching concentrations between 11 and 13 mg / mL. For protein extraction, each Schirmer’s strip is cut into 2 mm fragments and placed into a new centrifuge tube. Proteins are eluted using 5%SDS buffer and vortexed at room temperature for 1 hour, followed by centrifugation to separate the extract. Protein concentration is quantified using the bicinchoninic acid (BCA) protein assay. The extracted proteins are then reduced, alkylated, enzymatically digested, purified, and reconstituted in 0.1%formic acid at a peptide concentration of 0.5 μg / μL for mass spectrometry-based proteomic analysis. Data acquisition is performed using the Sequential Window Acquisition of All Theoretical Mass Spectra (SWATH-MS) technique. The resulting data are analyzed using the DIA-NN pipeline in library-free mode and PeakView software. Protein identification and quantification are performed by matching to in silico tryptic digested peptide profiles derived from the UniProt human protein database using a neural network–powered analysis.

[0067] Using DIA-NN, 332 proteins are quantified at a 1%false discovery rate (FDR) . Of these, 53 proteins exhibit statistically significant differential expression between ROP and non-ROP groups, defined by a Log2FC ≥ 0.58 or ≤ -0.58 and p <0.05 (FIG. 4A) . In parallel, analysis using PeakView involves the generation of a human tear fluid-specific spectral library created from pooled samples acquired through data-dependent acquisition (DDA) in duplicate. Using this approach, 417 proteins are quantified at 1%FDR, with 73 proteins showing statistically significant differences in expression (FIG. 4B) .

[0068] A comparative analysis of the DIA-NN and PeakView workflows identifies 15 proteins that are significantly differentially expressed between ROP and non-ROP groups in both platforms (p < 0.05, 1%FDR) . Expression levels are presented as Log2FC with corresponding mean ± standard deviation (SD) values. These differentiated proteins include:

[0069] Upregulated in ROP: B2M (1.59 ± 0.04) , FABP5 (1.19 ± 0.37) , S100A4 (1.26 ± 0.10) , SCGB1D1 (1.36 ± 0.12) , IL1RN (1.06 ± 0.28) , GSR (0.82 ± 0) , RAN (0.65 ± 0.02) , and EIF4A1 (1.13 ± 0.76) ;

[0070] Downregulated in ROP: SERPINC1 (-0.91 ± 0.35) , FBP1 (-0.92 ± 0.14) , APOD (-1.00 ± 0.05) , APOA1 (-1.39 ± 0.60) , APOA4 (-1.51 ± 0.40) , and AK1 (-1.44 ± 0.27) (FIG. 5) .

[0071] To further identify tear proteins associated with ROP, a Direct DIA library-free approach (direct-DIA+) is implemented using Spectronaut software. Protein identification is conducted by searching against the Homo sapiens reference proteome comprising 20, 434 reviewed entries. The analysis utilizes the benchmarked “BGS Factory Setting (Default) ” parameters. Specifically, trypsin / P is designated as the proteolytic enzyme, allowing up to two missed cleavages. Carbamidomethylation is defined as a fixed modification, while acetylation at the N-terminus and oxidation of methionine residues are included as variable modifications. Peptide lengths are constrained to a range of 7 to 52 amino acids. A 1%FDR threshold is applied at both the peptide precursor and protein levels to ensure high-confidence identification. Protein abundances are quantified using the MaxLFQ algorithm, and automatic normalization is enabled.

[0072] Parallel analysis is conducted using DIA-NN in library-free mode. An in silico predicted spectral library is generated based on the same FASTA file and used for DIA-based searching and quantification. Trypsin / P is selected as the digestion enzyme with allowance for two missed cleavages. Carbamidomethylation of cysteine and N-terminal methionine excision, along with oxidation (M) and acetylation (N-term) , are specified as modifications. Peptides are restricted to 7-52 amino acids in length, and precursor charges are limited to the range of 2 to 5. Both mass accuracy and MS1 accuracy are set to 0 to enable automatic determination. “Match between runs” is activated to facilitate inter-sample comparability. Retention time (RT) -dependent cross-run normalization and the “robust LC (high precision) ” quantification strategy are employed to enhance data consistency.

[0073] Using this proteomic workflow, a total of 18 proteins are found to be significantly differentially expressed between ROP and non-ROP groups (1%FDR, p < 0.05) . The upregulated proteins in the ROP group include: PIGR (1.25 ± 0.35) , NQO1 (1.2 ± 0.28) , CRIP1 (1.1 ± 0.14) , PLA2G2A (1.2 ± 0) , APOBEC3A (0.85 ± 0.07) , CRTAC1 (0.8 ± 0.14) , and CXCL17 (1.05 ± 0.21) . In contrast, several proteins are significantly downregulated in ROP, including HEXA (-0.7 ± 0.14) , HPX (-0.8 ± 0.14) , AFP (-0.9 ± 0.14) , TF (-0.8 ± 0) , AMBP (-1.1 ± 0.14) , ITIH2 (-1 ± 0.14) , TTR (-1.1 ± 0.42) , RBP4 (-1.3 ± 0.14) , APOH (-1.15 ± 0.35) , AHSG (-1.5 ± 0.14) , and GM2A (-2.15 ± 0.64) (FIG. 6) . These proteins are implicated in pathways related to vascular development, cell survival, angiogenesis, and metabolic dysregulation, emphasizing their potential relevance in mediating responses to hypoxia and oxidative stress in ROP pathophysiology.

[0074] Example 2: Protein functional enrichment and biomarker analysis for ROP screening

[0075] A functional enrichment visualization is carried out using STRING’s integrated Gene Ontology (GO) annotation tools. A panel of thirty-three differentially expressed proteins is analyzed for overrepresented biological processes and molecular functions. The analysis identifies significant enrichment in pathways associated with lipid metabolism and antioxidant activity, both of which are known to play key roles in vascular development and oxidative stress responses -processes that are pathologically dysregulated in ROP. These enrichment findings offer valuable insight into the underlying mechanisms potentially driving disease progression in affected infants (see FIGs. 7A-7B) .

[0076] To further evaluate the clinical utility of the identified proteins, a single-protein biomarker analysis is conducted using receiver operating characteristic (ROC) curve analysis. The protein antithrombin-III (SERPINC1) is selected for this evaluation based on its consistent differential expression across multiple analysis pipelines. The ROC analysis yields an area under the curve (AUC) value of 0.758, demonstrating a statistically significant discriminatory power for distinguishing between ROP and non-ROP cases. Retrospective fitting of SERPINC1 protein expression data results in a sensitivity of 81%and a specificity of 62%, as determined by likelihood ratio analysis (see FIG. 8) . These results underscore the diagnostic potential of using individual protein biomarkers, such as SERPINC1, as part of a non-invasive tear-based assay for ROP screening. The results also establish a foundation for the future development of multiplex biomarker panels to enhance diagnostic performance and clinical applicability.

[0077] As used herein, terms “approximately” , “basically” , “substantially” , and “about” are used for describing and explaining a small variation. When being used in combination with an event or circumstance, the term may refer to a case in which the event or circumstance occurs precisely, and a case in which the event or circumstance occurs approximately. As used herein with respect to a given value or range, the term “about” generally means in the range of ±10%, ±5%, ±1%, or ±0.5%of the given value or range. The range may be indicated herein as from one endpoint to another endpoint or between two endpoints. Unless otherwise specified, all the ranges disclosed in the present disclosure include endpoints. When reference is made to “substantially” the same numerical value or characteristic, the term may refer to a value within ±10%, ±5%, ±1%, or ±0.5%of the average of the values.

[0078] The functional units and modules of the systems, and / or methods in accordance with the embodiments disclosed herein may be implemented using computing devices, computer processors, or electronic circuitries including but not limited to application-specific integrated circuits (ASIC) , field programmable gate arrays (FPGA) , central processing units (CPU) , graphical processing units (GPU) , and other programmable logic devices configured or programmed according to the teachings of the present disclosure. Computer instructions or software codes running in computing devices, computer processors, or programmable logic devices can readily be prepared by practitioners skilled in the software or electronic art based on the teachings of the present disclosure.

[0079] All or portions of the methods in accordance with the embodiments may be executed in one or more computing devices including server computers, personal computers, laptop computers, and mobile computing devices such as smartphones and tablet computers.

[0080] Each of the functional units and modules in accordance with various embodiments also may be implemented in distributed computing environments and / or Cloud computing environments, wherein the whole or portions of machine instructions are executed in a distributed fashion by one or more processing devices interconnected by a communication network, such as an intranet, Wide Area Network (WAN) , Local Area Network (LAN) , the Internet, and other forms of data transmission medium.

[0081] The foregoing description of the present invention has been provided for the purposes of illustration and description. It is not intended to be exhaustive or to limit the invention to the precise forms disclosed. Many modifications and variations will be apparent to the practitioner skilled in the art.

[0082] The embodiments were chosen and described in order to best explain the principles of the invention and its practical application, thereby enabling others skilled in the art to understand the invention for various embodiments and with various modifications that are suited to the particular use contemplated.

Claims

1.A method of diagnosing retinopathy of prematurity (ROP) in a preterm infant by detecting and calculation from expression levels of a penal of ROP-associated proteins in the preterm infant, comprising:obtaining a tear sample from the preterm infant;extracting a protein expression profile of the tear sample;detecting expression levels of a panel of ROP-associated proteins in the protein expression profile, wherein the panel of ROP-associated proteins comprises one or more of upregulated proteins and one or more of downregulated proteins;calculating from the detected expression levels, for each of the one or more upregulated proteins, an upregulated log2 fold change (Log2FC) value relative to a corresponding baseline expression level, and for each of the one or more downregulated proteins, a downregulated Log2FC value relative to a corresponding baseline expression level; andgenerating a protein list serving as a molecular signature of ROP-associated tear biomarkers to support subsequent clinical decision-making or risk stratification, the protein list comprising:the upregulated proteins having upregulated Log2FC values greater than or equal to a positive threshold, andthe downregulated proteins having downregulated Log2FC values less than or equal to a negative threshold;wherein the upregulated proteins comprise one or more of: beta-2-microglobulin (B2M) , fatty acid–binding protein 5 (FABP5) , protein S100-A4 (S100A4) , secretoglobin family 1D member 1 (SCGB1D1) , interleukin-1 receptor antagonist (IL1RN) , glutathione reductase (GSR) , GTP-binding nuclear protein Ran (RAN) , eukaryotic initiation factor 4A-I (EIF4A1) , polymeric immunoglobulin receptor (PIGR) , NAD (P) H dehydrogenase 1 (NQO1) , cysteine-rich protein 1 (CRIP1) , membrane-associated phospholipase A2 (PLA2G2A) , DNA dC→dU-editing enzyme APOBEC-3A (APOBEC3A) , cartilage acidic protein 1 (CRTAC1) , and C-X-C motif chemokine 17 (CXCL17) ; and the downregulated proteins comprise one or more of: antithrombin-III (SERPINC1) , fructose-1, 6-bisphosphatase 1 (FBP1) , apolipoprotein D (APOD) , apolipoprotein A-I (APOA1) , apolipoprotein A-IV (APOA4) , adenylate kinase isoenzyme 1 (AK1) , beta-hexosaminidase subunit alpha (HEXA) , hemopexin (HPX) , alpha-fetoprotein (AFP) , serotransferrin (TF) , protein AMBP (AMBP) , inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 (ITIH2) , transthyretin (TTR) , retinol-binding protein 4 (RBP4) , beta-2-glycoprotein 1 (APOH) , alpha-2-HS-glycoprotein (AHSG) , and ganglioside GM2 activator (GM2A) .2.The method of claim 1, wherein the positive threshold is 0.58.3.The method of claim 1, wherein the negative threshold is -0.58.4.The method of claim 1, wherein the baseline expression levels of the upregulated proteins and the downregulated proteins are obtained from tear samples of healthy preterm infants.5.The method of claim 1, wherein the protein expression profile is acquired using data-independent acquisition (DIA) mass spectrometry and quantified using a machine learning–based analysis pipeline.6.A system for diagnosing ROP in a preterm infant by detecting and calculation from expression levels of a panel of ROP-associated proteins in a preterm infant, comprising:a sample acquisition module configured to receive a tear sample from a preterm infant;a protein profiling module configured to extract a protein expression profile from the tear sample;a protein detection module configured to detect expression levels of a panel of ROP-associated proteins in the protein expression profile, wherein the panel comprises one or more upregulated proteins and one or more downregulated proteins; anda computational module configured to:calculate from the detected expression levels, for each of the one or more upregulated proteins, an upregulated Log2FC value relative to a corresponding baseline expression level;calculate, for each of the one or more downregulated proteins, a downregulated Log2FC value relative to a corresponding baseline expression level; andgenerate a protein list serving as a molecular signature of ROP-associated tear biomarkers to support subsequent clinical decision-making or risk stratification, the protein list comprising:the upregulated proteins having upregulated Log2FC values greater than or equal to a positive threshold, andthe downregulated proteins having downregulated Log2FC values less than or equal to a negative threshold.7.The system of claim 6, wherein the upregulated proteins comprise one or more of: B2M, FABP5, S100A4, SCGB1D1, IL1RN, GSR, RAN, EIF4A1, PIGR, NQO1, CRIP1, PLA2G2A, APOBEC3A, CRTAC1, and CXCL17.8.The system of claim 6, wherein the downregulated proteins comprise one or more of: SERPINC1, FBP1, APOD, APOA1, APOA4, AK1, HEXA, HPX, AFP, TF, AMBP, ITIH2, TTR, RBP4, APOH, AHSG, and GM2A.9.The system of claim 6, wherein the baseline expression levels of the upregulated and downregulated proteins derived from tear samples of healthy preterm infants.10.The system of claim 6, wherein the positive threshold is 0.58 and the negative threshold is -0.58.11.The system of claim 6, wherein the protein profiling module comprises a DIA mass spectrometer.12.A kit for detecting a panel of ROP-associated proteins in a preterm infant, comprising:a protein assay for detecting the presence or expression level of a panel of ROP-associated proteins in a biological sample obtained from a preterm infant;wherein the panel of ROP-associated proteins comprises one or more of: B2M, FABP5, S100A4, SCGB1D1, IL1RN, GSR, RAN, EIF4A1, PIGR, NQO1, CRIP1, PLA2G2A, APOBEC3A, CRTAC1, CXCL17, SERPINC1, FBP1, APOD, APOA1, APOA4, AK1, HEXA, HPX, AFP, TF, AMBP, ITIH2, TTR, RBP4, APOH, AHSG, and GM2A.13.The kit of claim 12, wherein the protein assay comprises a mass spectrometry-based assay, an antibody-based immunoassay, a protein microarray, and an aptamer-based detection system.14.The kit of claim 12, wherein the biological sample comprises a tear fluid sample, a blood sample, a serum sample, and a plasma sample obtained from the preterm infant.

Images