T7 RNA polymerase mutant and application thereof

Abstract

Provided is a T7 RNA polymerase mutant and an application thereof. The above-described T7 RNA polymerase mutant can solve the problem of high in vitro transcription by-products in the prior art.

Description

T7 RNA polymerase mutant and application thereof

[0001] Sequence Listing

[0002] The Sequence Listing written in the xml file titled: “PN287377FPSW-SequenceListing. xml” ; created on September 18, 2024, and 4,972 bytes in size, is hereby incorporated by reference.Technical Field

[0003] The present application relates to the field of RNA polymerases, and in particular, to a T7 RNA polymerase mutant and an application thereof.Background

[0004] Bacteriophage T7 RNA polymerases have emerged as the enzyme of choice for In Vitro Transcription (IVT) reactions. These enzymes, also referred to as DNA-dependent RNA polymerases, require a DNA template to synthesize RNA transcripts in a promoter-dependent mechanism. RNA transcripts generated by IVT reactions are generally used in RNA therapeutics and RNA diagnostics. mRNA transcribed by T7 and other phage RNA polymerases often contain transcription by-products like double-stranded RNA (dsRNA) and short abortive transcripts. dsRNA originates from self-templated 3’ extension, RNA-dependent RNA polymerase activity (RdRp) and RNA primed transcription (Kariko et al, 2011) . These contaminants of IVT are immunostimulatory. And affect the potency and safety profile of RNA products, especially for therapeutics. Transcripts need to be purified to remove unwanted side products and this often leads to low yield products, costly and time intensive process.

[0005] The single point mutant S43Y mutant of T7 RNA polymerase reported by Wu et al, 2021, effectively reduces the RdRp activity of T7 RNA polymerase by weakening the RNA binding activity of the enzyme and increasing the 3’ homogeneity of the run-off transcript. This leads to the reduction of dsRNA in the IVT reaction. The C-helix and C-terminal foot double mutant, G47A+884G, designed and reported by Moderna, reduces dsRNA content by improving the 3’ homogeneity of the transcript, but the RNA yield of this mutant was significantly lower when synthesizing long-stranded RNA or under high-yield conditions (Dousis, A et al, 2022) . In general, it has been reported that C-helix mutations of T7 RNA polymerase are important for reducing self-templated 3’ extended dsRNA (Dousis et al 2022; Yu, et al 2024) .Summary

[0006] The present application is mainly intended to provide a T7 RNA polymerase mutant and an application thereof, to solve the problem in the prior art of high by-product dsRNA in RNA prepared using a T7 RNA polymerase.

[0007] In order to implement the above objective, a first aspect of the present application provides a T7 RNA polymerase mutant. The T7 RNA polymerase mutant includes mutations at any one or more of the following sites: F182, V186, N165, R307, C216, or Q184.

[0008] Further, the mutation at the site F182 is F182A, F182R, F182E, F182L, F182K, or F182M, the mutation at the site V186 is V186A or V186I, the mutation at the site N165 is N165A, the mutation at the site R307 is R307H, the mutation at the site C216 is C216L, and the mutation at the site Q184 is Q184E.

[0009] Further, the mutations further include mutations at any one or more of the following sites: S43, G47 or G788; optionally, the mutation at the site S43 is S43Y; optionally, the mutation at the site G47 is G47A or G47W; and optionally, the mutation at the site G788 is G788A.

[0010] Further, the mutations include any one of the following groups of amino acid mutations: F182A, F182A+N165A, F182A+C216L, F182A+G788A, or V186A+R307H.

[0011] Further, a reference sequence of the mutation site on the T7 RNA polymerase mutant is SEQ ID NO: 1.

[0012] Further, the T7 RNA polymerase mutant at least contains a motif as shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4, or contains a motif that is of more than 90%identity to any one of the SEQ ID NOs: 2-4.

[0013] Further, the T7 RNA polymerase mutant is of more than 80%identity to a reference sequence SEQ ID NO: 1.

[0014] Further, the T7 RNA polymerase mutant further includes a fused tag and / or a linker.

[0015] Further, the T7 RNA polymerase mutant has RNA polymerase activity.

[0016] Further, the T7 RNA polymerase mutant has one or more of the following characteristics in RNA synthesis application: reducing a content of double-stranded RNA, reducing an immune stimulation response, not affecting an RNA synthesis yield, not affecting a content of circular RNA, or not affecting the expression of the protein encoded by the RNA in cells.

[0017] In order to implement the above objective, a second aspect of the present application provides a DNA molecule. The DNA molecule encodes the T7 RNA polymerase mutant.

[0018] In order to implement the above objective, a third aspect of the present application provides a recombinant vector. The recombinant vector contains the DNA molecule.

[0019] In order to implement the above objective, a fourth aspect of the present application provides a host cell. The host cell contains the DNA molecule and / or the recombinant vector.

[0020] In order to implement the above objective, a fifth aspect of the present application provides a kit. The kit includes the T7 RNA polymerase mutant; optionally, the kit further includes other substances required for RNA synthesis; and optionally, the kit further includes any one or more of the following: a buffer solution, a nucleoside triphosphate or a RNase inhibitor.

[0021] In order to implement the above objective, a sixth aspect of the present application provides a method for preparing an RNA. The method includes: A1) mixing template DNA connected with a T7 promoter with the T7 RNA polymerase mutant to obtain a transcription reaction mixture; and A2) incubating the transcription reaction mixture to achieve IVT, so as to obtain the RNA.

[0022] Further, the RNA includes an RNA drug.

[0023] Further, the RNA includes a non-coding RNA or a coding RNA; and the non-coding RNA includes microRNA, siRNA, piRNA, rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, SLRNA, SRPRNA, mRNA like non-coding RNA, non-coding RNA without a polyA tail, or oligonucleotides.

[0024] Further, the RNA includes circular RNA (circRNA) .

[0025] In order to implement the above objective, a seventh aspect of the present application provides a gene editing method. The gene editing method includes: B1) performing transcription on a guide RNA coding sequence connected with a T7 promoter with the T7 RNA polymerase mutant, so as to obtain a guide RNA; and B2) binding the guide RNA to a gene editing protein to perform gene editing on a target sequence.

[0026] In order to implement the above objective, an eighth aspect of the present application provides a protein expression method. The protein expression method includes: C1) performing transcription on a target protein coding sequence connected with a T7 promoter with the T7 RNA polymerase mutant, so as to obtain a mRNA; and C2) translating the mRNA in vivo or in vitro to obtain a target protein.

[0027] In order to implement the above objective, a ninth aspect of the present application provides an RNA molecule. The RNA molecule is prepared with the method for preparing an RNA. Optionally, the content of dsRNA in the RNA molecule reduces by at least 20%compared to  the content of dsRNA in an RNA molecule obtained by the same preparation method using a wild-type T7 RNA polymerase.

[0028] With the technical solutions of the present application, RNA transcription is performed with the T7 RNA polymerase mutant; and compared to the wild-type T7 RNA polymerase, there is less by-product dsRNA in a reaction product, thereby reducing stress on subsequent purification steps.Brief Description of the Drawings

[0029] The drawings, which form a part of the present application, are used to provide a further understanding of the present application. The exemplary embodiments of the present application and the description thereof are used to explain the present application, but do not constitute improper limitations to the present application. In the drawings:

[0030] Fig. 1 shows a sequence of H-subdomain in a T7 RNA polymerase according to embodiments of the present application.

[0031] Fig. 2 shows the content of dsRNA produced by different T7 RNA polymerase mutants according to Embodiment 1 of the present application.

[0032] Fig. 3 shows RNA synthesis yields of wild-type and T7 RNA polymerase mutants (F182A) at 37℃, 42℃, and 44℃ according to Embodiment 1 of the present application.

[0033] Fig. 4 shows the proportion of dsRNA in a product when wild-type and T7 RNA polymerase mutants (F182A) are transcribed at 37℃ and 44℃ according to Embodiment 1 of the present application.

[0034] Fig. 5 is a result diagram of the proportion of double-stranded RNA accounting for a total RNA product according to Embodiment 2 of the present application.

[0035] Fig. 6 is a result diagram of the proportion of double-stranded RNA accounting for a total RNA product according to Embodiment 3 of the present application.

[0036] Fig. 7 is a result diagram of wild-type and T7 RNA polymerase mutants (F182A) in circRNA synthesis according to Embodiment 4 of the present application.

[0037] Detailed Description of the Embodiments

[0038] It is to be noted that the embodiments in the present application and the features in the embodiments may be combined with one another without conflict. The present application will be described below in detail with reference to the embodiments.

[0039] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this application belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can also be used in the practice or testing of the present application, the preferred methods and materials are now described.

[0040] All publications and patents cited in this specification are herein incorporated by reference as if each individual publication or patent were specifically and individually indicated to be incorporated by reference and are incorporated herein by reference to disclose and describe the methods and / or materials in connection with which the publications are cited. The citation of any publication is for its application prior to the filing date and should not be construed as an admission that the present application is not entitled to antedate such publication by virtue of prior application. Further, the dates of publication provided could be different from the actual publication dates that may need to be independently confirmed.

[0041] It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory only and are not restrictive of the invention as claimed. In this application, the use of the singular includes the plural unless specifically stated otherwise. In this application, the term “or” is used to mean “and / or” unless explicitly indicated to refer to alternatives only or the alternatives are mutually exclusive. As used herein “another” may mean at least a second or more. Furthermore, the use of the term “including” , as well as other forms, such as “includes” and “included” , is not limiting. Also, terms such as “element” or “component” encompass both elements and components comprising one unit and elements and components that comprise more than one subunit unless specifically stated otherwise. Also, the use of the term “portion” can include part of a moiety or the entire moiety.

[0042] As used herein, the singular forms “a” , “an” and “the” include plural references unless the context clearly dictates otherwise.

[0043] Term explanation:

[0044] The terms “protein” , “polypeptide” and “peptide” can be used interchangeably in the present application to refer to an amino acid residue polymer, which includes a polymer in which one or more amino acid residues are chemical analogues of natural amino acid residues. The proteins  and polypeptides of the present application may be produced recombinantly or through chemical synthesis. The terms “mutein” , “mutant protein” , or “mutant” can be used interchangeably in the present application to refer to such a protein which has a substitution, insertion, deletion and / or addition of one or more amino acid residues compared to an amino acid sequence of a parental protein.

[0045] As used herein, the amino acid residues are abbreviated below: Alanine (Ala; A) , Asparagine (Asn; N) , Aspartic acid (Asp; D) , Arginine (Arg; R) , Cysteine (Cys; C) , Glutamate (Glu; E) , Glutamine (Gln; Q) , Glycine (Gly; G) , Histidine (His; H) , Isoleucine (Ile; I) , Leucine (Leu; L) , Lysine (Lys; K) , Methionine (Met; M) , Phenylalanine (Phe; F) , Proline (Pro; P) , Serine (Ser; S) , Threonine (Thr; T) , Tryptophan (Trp; W) , Tyrosine (Tyr; Y) , and Valine (Val; V) .

[0046] The terms “homology” or “identity” are used to refer to a sequence matching situation between two polypeptides or between two nucleic acids. Therefore, the mutant of the present application further includes a homologue of the amino acid sequence thereof. The “identity” may be calculated by known methods including, but not limited to, the following: Computational Molecular Biology (Lesk , A.M. Editor) Oxford University Press, New York (1988) ; Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith , D .W. Editor) Academic Press New York (1993) ; Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin , A.M . and Griffin , H .G. Editor) Humana Press, New Jersey (1994) ; Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje , G. Editor) Academic Press (1987) ; and Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J. Editor) Stockton Press, New York (1991) .

[0047] A specific amino acid position (number) in the protein of the present application may be determined by comparing an amino acid sequence of a target protein with a reference sequence (such as SEQ ID NO: 1) using a standard sequence comparison tool, for example, two sequences are compared with a Smith-Waterman algorithm or a CLUSTALW2 algorithm, and the above sequence is considered to be aligned when a comparison score is the highest. The comparison score may be calculated according to the methods in Wilbur, W.J. and Lipman, D. J. (1983) Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 726-730. Default parameters are preferably used in a ClustalW2 (1.82) algorithm: protein gap open penalty = 10.0; protein gap extension penalty = 0.2; protein matrix = Gonnet; protein / DNA end gap = -1; and protein / DNAGAPDIST = 4. An AlignX program (a part of a vectorNTI group) is preferably used to fit the default parameters of multiple comparisons (gap open penalty: 10og gap extension penalty 0.05) , and the position of the specific amino acid in the target protein is determined by comparing the amino acid sequence of the protein with SEQ ID NO: 1.

[0048] It is to be understood that, the amino acids in the mutein of the present application are numbered based on the reference sequence SEQ ID NO: 1. When certain specific mutein is of 80%or above identity to the sequence shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid number of the mutein may have misalignment relative to the amino acid number of SEQ ID NO: 1, for example, misalignment of 1-5 positions to an N-terminal or C-terminal of the amino acid. With a conventional sequence comparison technology in the art, a person skilled in the art may generally understand that such misalignment is within a reasonable range, and should believe that mutein being of 80% (e.g, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%) identity due to the misalignment of the amino acid numbers and having the same or similar T7 RNA polymerase activity is also within the range of the mutein of the present application.

[0049] Furthermore, the mutant of the present application may also be modified. A modification (usually without changing a primary structure) form includes: a chemically-derived form of the mutein in vivo or in vitro, such as acetylation or carboxylation. Modification further includes glycosylation, such as those produced through glycosylation modification in the synthesis and processing of the mutein or in further processing steps. Such modification may be completed by exposing the mutein to an enzyme that performs glycosylation (e.g., mammalian glycosylase or deglycosylase) . The modification form further includes a sequence having phosphorylated amino acid residues (e.g., phosphotyrosine, phosphoserine, phosphothreonine) , and further includes mutein that has been modified to improve its resistance to protein hydrolysis or to optimize solubility properties.

[0050] The present application further provides polynucleotide encoding the T7 RNA polymerase mutant, which may also be polynucleotide further including additional encoding and / or non-coding sequences. A person skilled in the art is well aware that, due to the degeneracy of genetic codes, the amino acid sequence disclosed herein may be encoded by various different nucleic acid sequences. Generation of other nucleic acid sequences encoding the same protein is within the competence of a person of ordinary skill in the art, such that the present application covers the nucleic acid sequences encoding the same protein due to the degeneracy of genetic codes. For example, in order to achieve high expression of a heterologous gene in a target host organism such as prokaryotic bacteria, the above gene may be optimized with a codon preferred by the host organism, so as to realize better expression. The present application further includes a polynucleotide that hybridizes with the above polynucleotide sequence under stringent conditions and has at least 50%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%match degree between the two sequences. In some implementations, the stringent conditions may refer to conditions of 6M urea, 0.4%SDS, 0.5 x SSC or hybridization conditions equivalent thereto,  or to conditions of higher strictness, or hybridization with a denaturant such as 50% (v / v) formamide, 0.1%calf serum, 0.1%Ficoll, 42℃, etc. In various conditions, a temperature may be approximately more than 40℃, for example, when the conditions with higher strictness are required, the temperature may be, for example, approximately 50℃, and may further be approximately 65℃.

[0051] The terms “polynucleotide” , “nucleotide sequence” , “nucleic acid sequence” , “nucleic acid molecule” and “nucleic acid” can be used interchangeably, including DNA, RNA or hybrids thereof, which may be double-stranded or single-stranded.

[0052] The term “encoding” refers to the intrinsic properties of specific nucleotide sequences in the polynucleotide, such as a gene, cDNA or mRNA, serving as templates for the synthesis of other polymers and macromolecules in biological processes having defined nucleotide sequences (i.e., rRNA, tRNA, and mRNA) or defined amino acid sequences as well as the resulting biological properties. Therefore, if the transcription and translation of mRNA corresponding to the gene produces a protein in a cell or other biological systems, the gene encodes the protein.

[0053] The term “vector” is an element that allows the vector to be integrated into a host cell genome or to replicate autonomously within the cell independently of the genome. The vector may contain any element that ensures self-replication. The vector generally carries genes that are not part of the central metabolism of the cell, and generally is in the form of double-stranded DNA. The selection of the vector generally depends on the compatibility of the vector with the host cell into which the vector is to be introduced. If the vector is used, the selection of the vector depends on a method for transforming a host cell well known to those skilled in the art. For example, a plasmid vector may be used.

[0054] As used herein, the term “promoter” has the meaning known to those skilled in the art, and refer to a non-coding nucleotide sequence that is located upstream of a gene and can initiate the expression of a downstream gene. A constitutive promoter is such a nucleotide sequence: when being operatively connected with polynucleotide encoding or defining a gene product, the promoter results in the production of the gene product in the cell under most or all physiological conditions of the cell. An inducible promoter is such a nucleotide sequence: when being operatively connected with polynucleotide encoding or defining the gene product, the promoter results in the production of the gene produce in the cell essentially only when an inducer corresponding to the above promoter is present in the cell. A tissue-specific promoter is such a nucleotide sequence: when being operatively connected with the polynucleotide encoding or  defining the gene product, the promoter results in the production of the gene product in the cell essentially only when the cell is a tissue-type cell corresponding to the promoter.

[0055] As mentioned in the Background, unexpected by-products, for example, the content of double-stranded RNA, are present in RNA prepared with a T7 RNA polymerase in the prior art. Furthermore, when an RNA produce is administered as a drug, the by-products (e.g. double-stranded RNA, short RNA transcripts) therein may stimulate an immune system to release cytokine, thus reducing the safety of RNA therapeutic drugs.

[0056] A new T7 RNA polymerase mutant is developed in the present application to solve one of the above problems, and a series of protection solutions are proposed in the present application based on this.

[0057] A first typical implementation of the present application provides a T7 RNA polymerase mutant. The T7 RNA polymerase mutant includes mutations at any one or more of the following sites: F182, V186, N165, R307, C216, or Q184.

[0058] Mutation sites in the T7 RNA polymerase mutant are selected from any one or more sites described above, and the mutation sites correspond to F182, V186, N165, R307, C216, and Q184 sites on a wild-type T7 RNA polymerase. Since the T7 RNA polymerase in the prior art includes various wild-type sequences, although different wild-type sequences have different amino acid sequences but have similar structures and active sites, mutations occur at the corresponding sites or equivalent sites, that is, the T7 RNA polymerase mutant of the present application can be obtained.

[0059] In some implementations, a reference sequence of the mutation site in the T7 RNA polymerase mutant is SEQ ID NO: 1.

[0060] In some implementations, the T7 RNA polymerase mutant is of more than 80%identity (including but not limited to 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, more than 99.8%, or even more than 99.9%) to the reference sequence SEQ ID NO: 1.

[0061] In some implementations, a site in H-subdomain is mutated to an amino acid that is conductive to forming a helical structure. In some implementations, the mutation at the site F182 is F182A, F182R, F182E, F182L, F182K, or F182M, the mutation at the site V186 is V186A or V186I, the mutation at the site N165 is N165A, the mutation at the site R307 is R307R, the mutation at the site C216 is C216L, and the mutation at the site Q184 is Q184E.

[0062] In the present application, for the type of the amino acid, the letter before numbers represents an original amino acid, and the letter after the numbers represents a mutated amino acid. For example, “F182A” indicates that an amino acid at an original 182 site is F, and the mutation is A.

[0063] In some implementations, the mutations include any one of the following groups of amino acid mutations: F182A, F182A+N165A, F182A+C216L, F182A+G788A, or V186A+R307H.

[0064] In some implementations, the mutations further include any one or more of the following mutations: S43, G47, or G788. In some implementations, the mutation at the site S43 is S43Y. In some implementations, the mutation at the site G47 is G47A or G47W. In some implementations, the mutation at the site G788 is G788A.

[0065] In some implementations, the T7 RNA polymerase mutant has polymerase activity.

[0066] Transcription of a DNA template by RNA polymerases occurs in three distinct phases. The first step involves recognition and binding of the RNA polymerase to the promoter region of the template. Binding of the polymerase to the promoter opens the DNA duplex to create a transcription bubble and forms the initiation complex. In the initiation phase, RNA polymerase can synthesize short RNA transcripts approximately 8 to 12 nucleotides long while remaining  bound to the promoter. Transition to the elongation complex is marked by structural conformational changes. In the elongation phase, RNA polymerase can processively transcribe the full-length RNA transcript until the termination signal or the end of templated is reached by the polymerase. The exact dynamics of the switch from the initiation complex to the elongation complex is not fully understood, however, it has been hypothesized that the transition to the elongation complex is crucial in reducing transcription by-products. Structural changes from the initiation complex and elongation complex have been reported showing regions of marked changes. The N-terminal domain of the RNA polymerase undergoes significant structural changes from the initiation to the elongation complex.

[0067] The H-subdomain (residues 151-190) is one of such regions that undergoes structural changes in the elongation complex. The H-subdomain plays a role in enlarging the active site of the RNA polymerase and abolishing the promoter binding. Part of the H-subdomain is a helix (residues 151-164) and loop (residues 165-190) in the initiation complex. In the elongation complex, the H-subdomain refolds to the top of the RNA polymerase and the loop regions can be observed to be converted into a helix. We hypothesized that engineered variant enzymes that favor such a structure switch would produce more full-length RNA transcripts and reduce dsRNA by-products. This can be achieved by replacing the amino acids with ones that have a high likelihood toward forming helix structures. The amino acids with high helix forming propensities are alanine, methionine, leucine, glutamine, lysine and arginine. Amino acids in the loop regions of the H-subdomain were mutated to these amino acids and the effect on double-stranded RNA production was monitored. Therefore, the content of the double-stranded RNA in the IVT product can be reduced.

[0068] In some implementations, the T7 RNA polymerase mutant at least contains a motif as shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4, or contains a motif that is of more than 90%identity to any one of the SEQ ID NOs: 2-4.

[0069] The T7 RNA polymerase mutant has the above H-subdomain, for example, the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NOs: 2-4. Some existing T7 RNA polymerases also have similar H-subdomain.

[0070] The motif shown in SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence at positions 151-190 in the reference sequence SEQ ID NO: 1. The motif shown in SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence at positions 151-164 in the reference sequence SEQ ID NO: 1. The motif shown in SEQ ID NO: 4 is an amino acid sequence at positions 165-190 in the reference sequence SEQ ID NO: 1. Sequence comparison results of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4 are shown in Fig. 1.

[0071] In some implementations, an IVT reaction is performed with the T7 RNA polymerase mutant, such that the content of the double-stranded RNA can be reduced. In some implementations, RNA synthesis yields are not affected.

[0072] In some implementations, RNA synthesis such as circular RNA synthesis is performed with the T7 RNA polymerase mutant, such that an immune stimulation response can be reduced, for example, lower IFN-β. In some implementations, with the T7 RNA polymerase mutant, one or more of RNA synthesis yields, the content of circular RNA, and the expression of the protein encoded by the RNA in cells are not affected.

[0073] In some implementations, for the IVT reaction performed with the T7 RNA polymerase mutant, the proportion of the content of the double-stranded RNA accounting for a total RNA product is less than 60%, more preferably less than 50%, 40%, 30%, 20%, or 10%.

[0074] In some implementations, the RNA is prepared with the T7 RNA polymerase mutant. Compared to the content of dsRNA in an RNA molecule obtained by the same preparation method using a wild-type T7 RNA polymerase, the content of dsRNA in the RNA molecule as a reaction product reduces, preferably reduces by at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%.

[0075] It is clear to those skilled in the art that, the structure of a protein may be altered without adversely affecting its activity and functionality. For example, one or more conservative amino acid substitutions may be introduced in the amino acid sequence of the protein without adversely affecting the activity and / or three-dimensional structures of protein molecules. Examples of the conservative amino acid substitutions, as well as implementations, are well known to those of skill in the art. Specifically, a amino acid residue may be substituted by another amino acid residue belonging to the same group as the site to be substituted, that is, a non-polar amino acid residue is used to substitute another non-polar amino acid residue, a polar uncharged amino acid residue is used to substitute another polar uncharged amino acid residue, an alkaline amino acid residue is used to substitute another alkaline amino acid residue, and an acidic amino acid residue is used to substitute another acidic amino acid residue. Such substituted acidic amino acid residues may or may not be encoded by genetic codes. The  conservative substitutions in which an amino acid is replaced with other amino acids belonging to the same group fall within the scope of the present application as long as the substitution does not lead to inactivation of the biological activity of the protein. Therefore, the protein of the present application may contain one or more conservative substitutions in the amino acid sequence. These conservative substitutions are preferably produced through replacement according to Table 1. In addition, the present application further covers proteins containing one or more other non-conservative substitutions, as long as the non-conservative substitutions do not significantly affect the functions and biological activity required by the proteins of the present application. Conservative amino acid replacement may be performed at one or more predicted non-essential amino acid residues. The “non-essential” amino acid residues are amino acid residues that may be altered (deleted, substituted or replaced) without changing biological activity, and “essential” amino acid residues are required for biological activity. “Conservative amino acid replacement” refers to replacement in which an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. Amino acid replacement may be performed in a non-conserved region of the T7 RNA polymerase. Generally, such replacement is not performed on conservative amino acid residues or amino acid residues located in a conserved motif, where such residues are required for the activity of the proteins. However, a person skilled in the art should know that, a functional variant may have fewer conserved or non-conserved alterations in a conserved region.

[0076] Table 1

[0077] It is well known in the art that one or more amino acid residues may be altered (replaced, deleted, truncated, or inserted) from the N-and / or C-terminal of a protein while still retaining its functional activity. Therefore, the protein in which one or more amino acid residues are altered from the N-and / or C-terminal of the T7 RNA polymerase and simultaneously retains the required functional activity is also within the scope of the present application. These alterations may include alterations that are introduced by modern molecular methods such as PCR. The methods include PCR amplification that alters or extends a protein coding sequence with the aid of the inclusion of an amino acid coding sequence among oligonucleotides used in the PCR amplification.

[0078] It should be recognized that the proteins may be altered in various manners, including amino acid replacement, deletions, truncations, and insertions, and the methods for such operations are commonly known in the art. For example, an amino acid sequence variant of an ACC protein may be prepared through mutation of DNA, and may also be completed through other forms of mutagenesis and / or through directed evolution, for example, the substitution, deletion, and / or insertion of one or more amino acids are performed with known mutagenesis, recombination, and / or shuffling methods in combination with related screening methods.

[0079] A person skilled in the art can understand that, these tiny amino acid alterations in the T7 RNA polymerase of the present application may occur (e.g., naturally-occurring mutations) or be generated (e.g., using an r-DNA technology) without losing the functions or activity of the proteins. If these mutations occur in a catalytic domain, active site, or other functional structure domains of the protein, the nature of the peptide may change, but the peptide retains its activity. If the existing mutations is not close to the catalytic domain, active site, or other functional structure domains, a small impact may be expected.

[0080] A person skilled in the art may identify the essential amino acids of the T7 RNA polymerase according to methods known in the art, for example, site-directed mutagenesis, protein evolution, or analyses of bioinformatics. The catalytic domain, active site, or other functional structure domains of the protein can also be determined through the physical analysis of the structure, for example, are determined through the following technologies: nuclear magnetic resonance, crystallography, electron diffraction, or photoaffinity labeling, in combination with mutations in amino acids at putative key sites.

[0081] In some implementations, the T7 RNA polymerase mutant further includes a fused tag and / or linker.

[0082] In some studies, for ease of the purification, detection, or functional research of the protein, the T7 RNA polymerase mutant may be flexibly modified to introduce a fused tag and / or a linker.

[0083] A tag is a short peptide sequence, generally consists of several amino acid residues, and may be identified by specific affinity chromatography media, thereby realizing the purification of a target protein. Common tags include a His tag (containing a plurality of histidine residues, which are often used for Ni-affinity chromatography) , a Flag tag, a GST tag (aglutathione S-transferase tag, which is often used for glutathione affinity chromatography) , etc. These tags facilitate the purification of the protein, and may also be used to detect the protein.

[0084] The linker is a short peptide or polypeptide sequence connecting the protein and other molecules or structures. In the T7 RNA polymerase mutant, the linker may be used to connect an enzyme and the tag or other proteins or biomolecules, so as to achieve specific biological functions or study purposes.

[0085] The introduced tag and the introduction of the linker are generally located on the N-terminal or C-terminal of the protein without affecting the activity of the T7 RNA polymerase mutant its own. A person skilled in the art may perform flexible settings and category selection according to existing technologies and actual requirements.

[0086] The above fact of “reducing an immune stimulation response” is that in the RNA product prepared with the T7 RNA polymerase mutant of the present application, compared to an RNA product prepared with a wild-type protein, the content of dsRNA is reduced, thereby greatly reducing the stimulation of the dsRNA to the immune system, for example, IFN-β expression may be reduced.

[0087] A second typical implementation of the present application provides a DNA molecule. The DNA molecule encodes the T7 RNA polymerase mutant.

[0088] The mutein and polynucleotide of the present application are preferably provided in the form of separation, and are better purified to homogeneity.

[0089] A third typical implementation of the present application provides a recombinant vector. The recombinant vector contains the DNA molecule.

[0090] The term “recombinant” when used with reference to a polypeptide (e.g., antibody, antigen) or a polynucleotide, refers to a polypeptide or polynucleotide that is produced by a recombinant method.

[0091] The recombinant vector contains an expression regulatory element that encodes the T7 RNA polymerase mutant of the present application or a bioactive fragment thereof or a nucleic acid sequence of a fusion protein and is operatively connected with the recombinant vector. The expression vector further contains at least one origin of replication to realize self-replication. The selection of the vector generally depends on the compatibility of the vector with the host cell into which the vector is to be introduced. The vector may an autonomously replicating vector, that is, acts as a vector for the presence of an extrachromosomal entity. The replication of the vector is not dependent on the replication of chromosomes, such as plasmids, extrachromosomal elements, microchromosomes, or artificial chromosomes. The vector may contain any element that ensures self-replication. Alternatively, the vector may be a vector that is integrated into a genome when being introduced into a host cell and is replicated with the chromosomes into which the vector is integrated. Furthermore, a single vector or plasmid or two or more vectors or plasmids that together contain the total DNA to be introduced into the genome of the host cell, or transposons, may be used.

[0092] The vector may be of the type of, for example, plasmids, viruses, cosmid, phages, and the like, which are well known to those of skill in the art and described numerous times in the art. In some implementations, the expression vector in the present application is the plasmid. The expression vector may contain a promoter, a ribosome binding site for translation initiation, a polyadenylation site, a transcription terminator, an enhancer, and the like. The expression vector may also contain one or more selectable marker genes, so as to select the host cell containing the vector.

[0093] The vector of the present application may contain an element that allows the vector to be integrated into a host cell genome or to replicate autonomously within the cell independently of the genome. For the integration into the genome of the host cell, the vector may rely on a polynucleotide sequence encoding polypeptide or any other element of the vector suitable for integration into the genome by homologous or non-homologous recombination. Alternatively,  the vector may contain additional nucleotide sequences for directing integration into the host cell genome by homologous recombination at an accurate position on the chromosome. In order to improve the possibility of integration at the accurate position, the integration element shall preferably contain a sufficient number of nucleic acids, for example, 100 to 10,000 base pairs, preferably 400 to 10,000 base pairs, and more preferably 800 to 10,000 base pairs, which have high identity with a corresponding target sequence to increase the probability of homologous recombination. The integration element may be any sequence that is homologous to the target sequence in the host cell genome. Furthermore, the integration element may be a non-coding or coding nucleotide sequence. In another aspect, the vector may be integrated into the genome of the host cell through non-homologous recombination. For autonomous replication, the vector may further contain an origin of replication that may cause the vector to autonomously replicate in the host cell. The origin of replication may be any plasmid replicon that functions in the cell to mediate autonomous replication. The term “origin of replication” or “plasmid replicon” is defined as the nucleotide sequence that can cause the plasmid or vector to replicate in vivo.

[0094] A fourth typical implementation of the present application provides a host cell. The host cell contains the DNA molecule and / or the above recombinant vector.

[0095] The term “host cell” means a cell that has been transformed, or is capable of being transformed, with a nucleic acid sequence and thereby expresses a gene of interest. The term includes the progeny of the parent cell, whether or not the progeny is identical in morphology or in genetic make-up to the original parent cell, so long as the gene of interest is present.

[0096] In some implementations, the host cell does not have totipotency, that is, does not have the ability to proliferate from a single cell into an animal or a plant.

[0097] A fifth typical implementation of the present application provides a kit. The kit includes the T7 RNA polymerase mutant; optionally, the kit further includes other substances required for RNA synthesis; and optionally, the kit further includes any one or more of the following: a buffer solution and a nucleoside triphosphate (NTPs) or a RNase (ribonuclease) inhibitor.

[0098] With the components in the kit, using the nucleoside triphosphate as a raw material, and transcribing a DNA template in the buffer solution using the T7 RNA polymerase mutant, target RNA, which includes linear RNA or circular RNA, can be efficiently obtained through preparation, and the content of impurities (dsRNA) in the RNA product obtained through preparation is low. During application, a degradation amount of the RNA may also be decreased with the RNase inhibitor.

[0099] The buffer solution includes any reagent in the prior art that can be used to transcribe the T7 RNA polymerase mutant. The buffer solution includes, but is not limited to, an HEPES buffer solution, a phosphate buffer solution, a Tris-HCl buffer solution, and the like. The buffer solution may optionally contain components that include, but are not limited to, Mg2+, Dithiothreitol (DTT) , NaCl, etc., which may be flexibly adjusted and selected by a person skilled in the art.

[0100] A sixth typical implementation of the present application provides a method for preparing an RNA. The method includes the following operations.

[0101] A1) mixing a template DNA which connecting with a T7 promoter with the T7 RNA polymerase mutant to obtain a transcription reaction mixture; and A2) incubating the transcription reaction mixture to achieve In Vitro Transcription (IVT) , so as to obtain the RNA.

[0102] In a preferred embodiment, the RNA includes an RNA drug.

[0103] In a preferred embodiment, the RNA includes a non-coding RNA or a coding RNA. The non-coding RNA includes microRNA, siRNA, piRNA, rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, SLRNA, SRPRNA, mRNA like non-coding RNA, non-coding RNA without a polyA tail, or oligonucleotides.

[0104] In a preferred embodiment, the RNA includes circular RNA.

[0105] A seventh typical implementation of the present application provides a gene editing method. The gene editing method includes: B1) performing transcription on a guide RNA coding sequence connected with a T7 promoter with the T7 RNA polymerase mutant, so as to obtain a guide RNA; and B2) binding the guide RNA to a gene editing protein to perform gene editing on a target sequence.

[0106] The gene editing protein includes, but is not limited to, nuclease for Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) , Tanscription Activator-like (TAL) Effector Nucleases (TALEN) , and Zinc Finger Nuclease (ZFN) editing tools. In some implementations, the gene editing protein is a Cas protein, and is also named as a CRISPR enzyme or a Cas effector protein, and the type of the protein includes, but is not limited to, a Cas9 protein, a Cas12 protein, a Cas13 protein, a Cas14 protein, a Csm1 protein, or a FDK1 protein.

[0107] An eighth typical implementation of the present application provides a protein expression method. The protein expression method includes: C1) performing transcription on a target  protein coding sequence connected with a T7 promoter with the T7 RNA polymerase mutant, so as to obtain a mRNA; and C2) translating the mRNA in vivo or in vitro to obtain a target protein.

[0108] The phrase "translating in vivo" refers to the process that occurs inside cells, particularly on the ribosomes of prokaryotic or eukaryotic cells, where genetic information is translated into proteins using mRNA as a template.

[0109] The phrase "translating in vitro" refers to the process conducted under laboratory conditions, utilizing artificially constructed in vitro translation systems, such as cell-free translation systems, to simulate the intracellular translation process and convert mRNA into proteins. This process does not depend on the integrity of cellular structures.

[0110] A ninth typical implementation of the present application provides an RNA molecule. The RNA molecule is prepared with the method for preparing an RNA.

[0111] Optionally, the content of dsRNA in the RNA molecule reduces by at least 20%compared to the content of dsRNA in an RNA molecule obtained by the same preparation method using a wild-type T7 RNA polymerase.

[0112] The beneficial effects of the present application are further described in detail below with reference to specific embodiments.

[0113] Embodiment 1

[0114] Expression and Purification of T7 RNA Polymerase

[0115] Wild-type T7 was cloned into the pTrc99KN plasmid and transformed into E. coli T7 Express high efficiency competent cells (New England Biolabs) . The cells were grown at 28℃ in 4 L to an OD600 of 70. Expression was induced by addition of 0.25 mmol / L IPTG and grown for an additional 4 hours at 28℃. Designed mutants of T7 RNA polymerase were cloned into the pGro7 plasmid and Sequence confirmed plasmids were transformed into E. coli T7 Express high efficiency competent cells (New England Biolabs) . Cells were grown at 28℃ in 4 L to an OD600 of 80 after which expression was induced with 0.2%arabinose and grown further for 4 hours at 28℃.

[0116] Cells were harvested by centrifugation at 4000 rpm, 4℃ for 15 minutes. Wet cell pastes were resuspended in phosphate buffer (pH 7.5) containing 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT and 10%glycerol. PMSF was added to a final concentration of 1 mM. Lysis was achieved by 5 rounds of homogenization. Lysate was clarified by centrifugation at 13500 rpm for 30 minutes. Clarified lysates were first purified by hydrophobic interaction chromatography using Butyl  column (GE) , followed by affinity chromatography using Ni-TED resin. A final purification is done using CHT type II columns after which the protein is dialyzed in T7 storage buffer and stored at -20℃ until further use.

[0117] In vitro transcription reaction (IVT)

[0118] In vitro transcription reactions were carried out in a total reaction volume of 50 μL containing 1x RNA polymerase reaction buffer, 100 U of T7 RNA polymerase, 0.5 mM nucleotide triphosphates (NTPs) , 1 U / μL RNase inhibitor, and 1 μg linear firefly luciferase (Fluc) dsDNA template. The linear Fluc template was generated by restriction enzyme digest with StuI (New England Biolabs) and purified by DNA purification columns (Cytiva) . All reaction components were mixed and incubated at 37℃, 42℃ or 44℃ for 2 hours. After 2 hours of incubation, DNase I (2U) and 1x DNase I buffer were added to the IVT mixture to digest the dsDNA template. RNA was purified using RNA purification columns (New England Biolabs) . Purified RNA was quantified spectrophotometrically using nanodrop.

[0119] Detection methods for RNA product and by-product content (dsRNA ELISA Assay)

[0120] Double stranded RNA (dsRNA) content was quantified by J2-based sandwich ELISA (Exalpha Biologics) using FLuc RNA transcribed from the linear FLuc DNA template. Briefly, 96-well Nunc immunoplates (Thermofisher) were coated with the mouse monoclonal J2 antibody (IgG2a) overnight at 4℃ and blocked for 2 hours at 37℃ using 1%BSA in PBS. RNA samples and poly (I: C) dsRNA controls were added to the washed plates and incubated at 37℃ for 1 hour. The mouse monoclonal antibody K2 (IgM) was used as the detector antibody following a wash step. After 1 hour incubation at 37℃, the HRP-conjugated goat-anti mouse secondary antibody was added to washed plates, followed by a 1 hour incubation at 37℃. Finally, after a final wash, the TMB substrate was added and incubated at room temperature for 30 minutes. The reaction was quenched with 2 M sulphuric acid and signal was read at 450 nm using a SpectraMax M5 plate reader. dsRNA present in the total RNA input was determined using a standard curve of poly (I: C) dsRNA standards. dsRNA content is presented as a percentage of the total RNA input.

[0121] Result

[0122] In this application, it was observed that the F182 positional mutation decreased the dsRNA content of T7 RNA polymerase, and by preparing both wild-type ( “WT” ) and mutant T7 RNA polymerase (F182A / R / E / L / K / M) , the F182 mutation showed superior performance to WT in reducing the dsRNA by-product.

[0123] Figure2 shows the double stranded RNA content (dsRNA%) produced by different variants of T7 RNA polymerase. This experiment was carried out by measuring the dsRNA content of each T7 mutant compared to wild-type (WT) T7 without any mutations by ELISA. The F182 position was explored by substituting with other amino acids that have helix forming propensities to compare the effect of these amino acids on dsRNA formation. In addition to the F182A mutation, F182E, F182R, F182L, F182K, and F182M also produce lower dsRNA levels compared to WT.

[0124] RNA synthesis yield and dsRNA content were tested under different reaction conditions (37℃, 42℃ and 44℃) . The results, as shown in Figures 3 and 4, indicate that the RNA synthesis yield under different reaction conditions F182 were largely unaffected by the amino acid substitutions, and F182A was able to improve the dsRNA content.

[0125] Embodiment 2

[0126] The study also designed mutants at other positions on the H-Subdomain of the T7 RNA polymerase, e.g., positions 165, 186, and compared them to C-Helix position mutants, e.g., S43A+884G, G47A+884G. Figure 5 shows the wild-type T7 RNA polymerase, the F182A mutant, the V186A+R307H double mutant, the N165A mutant, as well as the S43A+884G mutant, the G47A+884G mutant, and the double-stranded RNA in the reaction product of each T7 RNA polymerase was measured as a percentage of the total RNA product by ELISA of the total RNA product (dsRNA%) .

[0127] Embodiment 3

[0128] The study further designed F182A-based double mutants and single mutants at other positions, and Figure 6 demonstrates the wild-type T7 RNA polymerase (WT) , F182A mutant F182A + N165A double mutant , F182A + C216L mutant, F182A + G788A mutant, R307H mutant, Q184E mutant, and V186I mutant , were subjected to IVT under the same conditions to measure the dsRNA content of the reaction products of each T7 RNA polymerase, based on the fact that the F182A single mutant and double mutant still demonstrated superior dsRNA reduction.

[0129] Embodiment 4

[0130] circRNA was synthesized by IVT with WT or F182A T7 RNA. After the reaction RNA was purified by RNA purification columns. The total IVT yield, circularization efficiency were determined.

[0131] Immunostimulatory effect of synthesized RNA

[0132] Interferon beta (IFN-β) response in A549 cellsA549 cells were cultured in DMEM until nearly complete confluency. 50 ng of RNA was transfected into 1 x 10^4 cells and grown for 24 hours. Aliquots of the supernatant were taken and analyzed for IFN-β content using Human IFN-beta Quantikine QuicKit ELISA (R&D Systems) following the manufacturer's protocol. IFN-β levels in the supernatants were quantified using a standard curve in pg / mL.

[0133] Result

[0134] The effect of F182A on the synthesis of circRNA, and stimulation of IFN-β, and cellular expression of the RNA product was further investigated, and the results are shown in Fig. 7. The F182A mutant did not affect the transcriptional ability of T7 RNA polymerase; the F182A mutant transcribed circRNA efficiently and was efficiently expressed in A549 cells by measuring the Fluc luminescence in cell lysates; the F182A mutant transcribed circRNA has very low immunostimulatory effect as measured by IFN-β stimulation.

[0135] The study compared the F182A mutant and WT T7 under the similar conditions.

[0136] The results showed that

[0137] (1) For IVT yield, circRNA%, F182A and WT performed similarly;

[0138] (2) Fluc (Firefly luciferase) expression: Fluc RNA transcribed by F812A and WT was expressed to the same degree in A549 cells.

[0139] (3) For IFN-β (interferon-β) , F182A stimulates less IFN-β compared to WT (6.7 pg / mL vs 1450 pg / mL respectively) .

[0140] Results are displayed in Figure 7.

[0141] From the above description, it can be seen that the above embodiment of the present application achieves the following technical effect: RNA transcription of a DNA template using the above-described T7 RNA polymerase mutant is able to reduce the proportion of by-products (double-stranded RNA) in the reaction product, while basically not affecting the yield of RNA synthesis, and furthermore, the synthesis of circular RNA using the above-described T7 RNA polymerase mutant , compared to wild-type T7 RNA polymerase, has lower immunostimulation and does not affect the efficiency of circular RNA synthesis and expression efficiency.

[0142] The above are only the preferred embodiments of the present application and are not intended to limit the present application. For those skilled in the art, the present application may have  various modifications and variations. Any modifications, equivalent replacements, improvements and the like made within the spirit and principle of the present application all fall within the scope of protection of the present application.

Claims

1.A T7 RNA polymerase mutant, comprising mutations at any one or more of the following sites: F182, V186, N165, R307, C216, or Q184.2.The T7 RNA polymerase mutant according to claim 1, whereinthe mutation at the site F182 is F182A, F182R, F182E, F182L, F182K, or F182M,the mutation at the site V186 is V186A or V186I,the mutation at the site N165 is N165A,the mutation at the site R307 is R307H,the mutation at the site C216 is C216L, andthe mutation at the site Q184 is Q184E.3.The T7 RNA polymerase mutant according to claim 1 or 2, wherein the mutations further comprise mutations at any one or more of the following sites: S43, G47, or G788, whereinoptionally, the mutation at the site S43 is S43Y,optionally, the mutation at the site G47 is G47A or G47W, andoptionally, the mutation at the site G788 is G788A.4.The T7 RNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 3, wherein the mutations comprise any one of the amino acid mutation combinations selected from the group consisting of: F182A, F182A+N165A, F182A+C216L, F182A+G788A, or V186A+R307H.5.The T7 RNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 4, wherein a reference sequence of the mutation site on the T7 RNA polymerase mutant is SEQ ID NO: 1.6.The T7 RNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 5, at least containing a motif as shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4, or containing a motif that is of more than 90%identity to any one of the SEQ ID NOs: 2-4.7.The T7 RNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 6, wherein the T7 RNA polymerase mutant is of more than 80%identity to a reference sequence SEQ ID NO: 1.8.The T7 RNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 7, further comprising a fused tag and / or a linker.9.The T7 RNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 8, having an RNA polymerase activity.10.The T7 RNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 9, having one or more of the following characteristics in RNA synthesis application: reducing a content of double-stranded RNA, reducing an immune stimulation response, not affecting an RNA synthesis yield, not affecting a content of circular RNA, or not affecting the expression of the protein encoded by the RNA in cells.11.A DNA molecule, wherein the DNA molecule encods the T7 RNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 10.12.A recombinant vector, comprising the DNA molecule according to claim 11.13.A host cell, comprising the DNA molecule according to claim 11 and / or the recombinant vector according to claim 12.14.A kit, wherein the kit comprises the T7 RNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 10,optionally, the kit further comprises other substances required for RNA synthesis; andoptionally, the kit further comprises any one or more of the following: a buffer solution, a nucleoside triphosphate or a RNase inhibitor.15.A method for preparing an RNA, comprising:A1) mixing a template DNA which connecting with a T7 promoter with the T7 RNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 10 to obtain a transcription reaction mixture; andA2) incubating the transcription reaction mixture to achieve In Vitro Transcription (IVT) , so as to obtain the RNA.16.The method according to claim 15, wherein the RNA comprises an RNA drug.17.The method according to claim 15 or 16, wherein the RNA comprises a non-coding RNA or a coding RNA;the non-coding RNA comprises microRNA, siRNA, piRNA, rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, SLRNA, SRPRNA, mRNA like non-coding RNA, non-coding RNA without a polyA tail, or oligonucleotides; andoptionally, the RNA comprises a circular RNA (circRNA) .18.A gene editing method, comprising:B1) performing transcription on a guide RNA coding sequence, which connecting with a T7 promoter, with the T7 RNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 10, so as to obtain a guide RNA; andB2) binding the guide RNA to a gene editing protein to perform gene editing on a target sequence.19.A protein expression method, comprising:C1) performing transcription on a target protein coding sequence, which connecting with a T7 promoter, with the T7 RNA polymerase mutant according to any one of claims 1 to 10, so as to obtain a mRNA; andC2) translating the mRNA in vivo or in vitro to obtain a target protein.20.An RNA molecule, prepared by the method according to any one of claims 15 to 17, whereinoptionally, the content of dsRNA in the RNA molecule reduces compared to the content of dsRNA in an RNA molecule obtained by the same preparation method using a wild-type T7 RNA polymerase.

Images