Methods and devices for fluorescence-based analyte detection

Abstract

Disclosed here is a device and method to detect the presence or absence of a target molecule by detecting fluorescence resonance energy transfer (FRET) signal generated when two labeled probes bind to the target molecule. The method is a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or a nucleic acid hybridization assay.

Description

METHODS AND DEVICES FOR FLUORESCENCE-BASED ANALYTE DETECTION

[0001] CROSS-REFERENCE

[0002] This application claims the benefit of PCT Application No. PCT / CN2024 / 119781, filed October 1, 2024, which application is incorporated herein by reference in its entiretyBACKGROUND

[0003] Forster Resonance Transfer (also known as fluorescence resonance energy transfer or FRET) involves energy transfer between two light-sensitive materials (chromophores) : a donor chromophore and a receptor chromophore. When a donor chromophore absorbs a photon, it enters an electronically excited state. Some of the absorbed energy is transferred to the surrounding environment during a process called relaxation, and the remaining energy is released in a form of a lower energy photon (fluorescent photon) . When a receptor chromophore is present nearby, the receptor chromophore absorbs the fluorescent photon released by the donor chromophore and enters an electronically excited state. After a similar relaxation process, the receptor chromophore releases a lower energy photon that can be detected as a fluorescent signal. The FRET process can be used in biological methods to confirm the close proximity of the donor chromophore and the receptor chromophore, for example, in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) .SUMMARY

[0004] Provided herein is a photobleaching method to reduce background signals and increase the sensitivity of the FRET signals when conducting FRET-based assays.

[0005] In one aspect of the present disclosure, provided here is a method for detecting a presence or absence of a target molecule in a sample, comprising:

[0006] (a) exposing a solution of a sample containing or suspected of containing a target molecule with a first wavelength range of light configured to photobleach fluorophores in the solution for a first time period;

[0007] (b) turning off the first wavelength range of light at the end of the first time period;

[0008] (c) exposing the solution obtained in (b) with a second wavelength range of light for a second time period, and detecting a first signal with a third wavelength from the solution;

[0009] (d) turning off the second wavelength range of light at the end of the second time period;

[0010] (e) contacting the solution obtained in (d) with a first probe and a second probe;

[0011] (f) exposing the solution obtained in (e) with the second wavelength range of light for a third time period configured to detect a fluorescence resonance energy transfer (FRET) signal; and

[0012] (g) detecting a presence or absence of the target molecule in the sample;

[0013] wherein the first probe, the second probe, and the target molecule, if all present, bring the first probe and the second probe within an excitation distance for FRET when the first probe and the second probe bind to the target molecule.

[0014] In some embodiments, the method further comprising, at least in (a) , increasing transmittance of the solution at the end of the first time period. In some embodiments, the method further comprising, at least in (a) , increasing temperature of the solution at the end of the first time period. In some embodiments, the method further comprising, at least in (a) , reducing autofluorescence and background noise from the solution after the first time period. In some embodiments, the method further comprising, at least in (a) , increasing transmittance of the solution at the end of the first time period, increasing temperature of the solution at the end of the first time period, and reducing autofluorescence and background noise from the solution after the first time period. In some embodiments, (i) the first probe is a first antibody, (ii) the second probe is a second antibody, and (iii) the target molecule is a protein. In some embodiments, the protein comprises (i) a first epitope recognized by the first antibody and (ii) a second epitope recognized by the second antibody. In some embodiments, the method is a Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . In some embodiments, in (f) and / or (g) , temperature of the solution is from about 33 ℃ to about 38 ℃. In some embodiments, in (f) and / or (g) , the temperature of the solution is about 37 ℃. In some embodiments, the first probe is a first nucleic acid molecule, (ii) the second probe is a second nucleic acid molecule, and (iii) the target molecule is a third nucleic acid molecule. In some embodiments, (i) the first nucleic acid comprise a first sequence complementary to a first section of the third nucleic acid molecule, (ii) the second nucleic acid comprise a second sequence complementary to a second section of the third nucleic acid molecule, and (iii) the first section does not overlap with the second section. In some embodiments, in (f) and / or (g) , temperature of the solution is from about 33 ℃ to about 38 ℃. In some embodiments, in (f) and / or (g) , the temperature of the solution is about 37 ℃. In some embodiments, the method further comprises heating or cooling the solution via a thermal device. In some embodiments, the method further comprises: measuring temperature of the solution using a temperature sensor. In some embodiments, the temperature sensor is laser thermometer, infrared thermistor, other thermistor, or thermocouple. In some embodiments, the thermal device is an electric heating coil, a Peltier module, a heat block, or a high-intensity light source. In some embodiments, the method further comprises mixing or shaking the solution of the sample via a 3D mixer. In some embodiments, the method further comprises counting emitted photons within the second wavelength range within the third time period via a photon counter and an optical filter configured to select the light within the second wavelength range. In some embodiments, the method further comprises counting emitted photons within the second wavelength range within the second time period via the photon counter and the optical filter. In some embodiments, the method further comprises using an excitation light source to illuminate the solution during the third time period. In some embodiments, the first probe and the second probe are solution-phase probes. In some embodiments, the method further comprises adding the first probe and the second probe to the solution obtained in (d) . In some embodiments, there is no washing from (a) to (g) . In some embodiments, the detecting in (g) is based in part on a difference between the FRET signal in (g) and the first signal in (c) . In some embodiments, the FRET signal is generated from interactions between one or more donor fluorophores on the first probe and one acceptor fluorophore on the second probe. In some embodiments, a ratio of the first probe to the second probe is from 1: 1 to 10: 1. In some embodiments, the contacting in (e) comprises contacting the solution with two or more first probes and two or more second probes. In some embodiments, a limit of detection for the target molecule in the sample is no higher than 40.0 pg / m. In some embodiments, one or more operations of the method are controlled by at least one processor, and wherein the one or more operations comprise: turning on and turning off a light source, the heating or cooling the solution.

[0015] In another aspect of the present disclosure, provided here is a method of reducing background noise in a fluorescence-based assay, comprising:

[0016] (a) exposing a solution of a sample comprising an interfering fluorophore with a first wavelength range of light configured to photobleach the interfering fluorophore in the solution for a first time period;

[0017] (b) turning off the first wavelength range of light at the end of the first time period; and

[0018] (c) performing a fluorescence-based assay,

[0019] wherein a signal-to-noise (SNR) level of the fluorescence-based assay is higher than another SNR level of another fluorescence-based assay without photobleaching in (a) .

[0020] In some embodiments, the method further comprises, at least in (a) , increasing transmittance of the solution at the end of the first time period. In some embodiments, the method further comprises, at least in (a) , increasing temperature of the solution at the end of the first time period. In some embodiments, the method further comprises, at least in (a) , reducing autofluorescence and background noise from the solution after the first time period. In some embodiments, the method further comprises, at least in (a) , increasing transmittance of the solution at the end of the first time period, increasing temperature of the solution at the end of the first time period, and reducing autofluorescence and background noise from the solution after the first time period. In some embodiments, the first wavelength range comprises white light. In some embodiments, the first wavelength range comprises light wavelength from about 400 nm to about 700 nm. In some embodiments, the first wavelength range comprises light wavelength from about 375 nm to about 780 nm. In some embodiments, the first time period is from about 10 seconds to about 40 minutes. In some embodiments, the first time period is at least 10 seconds. In some embodiments, the first time period is from about 10 seconds to about 10 minutes. In some embodiments, the first time period is from about 10 minutes to about 20 minutes. In some embodiments, the first time period is from about 20 minutes to about 30 minutes. In some embodiments, the first time period is from about 30 minutes to about 40 minutes. In some embodiments, the first time period is no more than 40 minutes. In some embodiments, the first time period is no more than 30 minutes. In some embodiments, the method further comprises: detecting a target molecule in the fluorescence-based assay, and wherein a limit of detection for the target molecule is no higher than 40.0 pg / mL. In some embodiments, one or more operations of the method are controlled by at least one processor, and wherein the one or more operations comprise: turning on and turning off a light source, and / or heating or cooling the solution.

[0021] In some embodiments, the fluorescence-based assay comprises a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay. In some embodiments, the FRET assay is time-resolved FRET assay. In some embodiments, the fluorescence-based assay comprises a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay, and the first time period is from about 10 seconds to about 40 minutes. In some embodiments, the fluorescence-based assay comprises a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay, the first time period is from about 10 seconds to about 40 minutes, and the FRET assay is time-resolved FRET assay.

[0022] INCORPORATION BY REFERENCE

[0023] All publications, patents, and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication, patent, or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference. To the extent publications and patents or patent applications incorporated by reference contradict the disclosure contained in the specification, the specification is intended to supersede and / or take precedence over any such contradictory material.BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0024] The novel features of the invention are set forth with particularity in the appended claims. A better understanding of the features and advantages of the present invention will be obtained by reference to the following detailed description that sets forth illustrative embodiments, in which the principles of the invention are utilized, and the accompanying drawings (also “figure” and “FIG. ” herein) , of which:

[0025] FIG. 1 shows a diagram of an example of FRET ELISA;

[0026] FIG. 2 shows a diagram of an example photobleaching on a sample;

[0027] FIG. 3 shows a diagram of an example recording fluorescence in a biological sample;

[0028] FIG. 4 shows a diagram of an example FRET detection of a nucleic acid target using two probes;

[0029] FIG. 5 shows a computer system that is programmed or otherwise configured to implement methods provided herein;

[0030] FIG. 6 shows counts (normalized by peak value) difference with vs without photobleaching under 560 nm excitation;

[0031] FIG. 7 shows spectra from 500-610 nm under 560 nm excitation using 30w or 60w white light, respectively, to bleach a blood serum sample;

[0032] FIG. 8 shows optical density of an example plasma sample at the detection window (665 + / -10 nm) when the light source peak emission window is (490 + / -10 nm) before and after photobleaching;

[0033] FIG. 9 shows optical density of an example serum sample at the detection window (665 + / -10 nm) when the light source peak emission window is (490 + / -10 nm) before and after photobleaching;

[0034] FIG. 10 shows effects of reaction time of PB serum on the relative fluorescence unit (RFU) of a FRET detection after photobleaching; and

[0035] FIG. 11 shows the relationship of RFU vs. antigen when using a FRET detection method after photobleaching in PB serum and serum.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0036] While various embodiments of the invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Numerous variations, changes, and substitutions may occur to those skilled in the art without departing from the invention. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed.

[0037] Definitions

[0038] As used herein, the singular forms “a” , “an” , and “the” include plural references unless the context clearly dictates otherwise.

[0039] As used herein, the term “PCR” generally refers to a polymerase chain reaction (PCR) process that can be used for the qualitative and quantitative determination of nucleic acid sequences. PCR can involve the measurement of the amount of amplification product (or amplicon) as a function of amplification cycle, and use such information to determine the amount of the nucleic acid sequence corresponding to the amplicon that was present in the original sample.

[0040] The term “fluorescence-based detection” as used herein generally refers to a detection scheme that uses a wavelength-specific optical excitation light source to excite fluorophore constructs that may subsequently re-emit light in a different wavelength. A fluorescence detection device or instrument (e.g., fluorescence sensor) may measure the emission signal, which may represent the quantity of the fluorophore construct, in the presence of a much larger excitation signal.

[0041] The term “analyte” as used herein generally refers to a molecular species to be detected. Non-limiting examples include small molecules, such as organic compounds drugs, hormones, lipids, steroids, or metabolites; polynucleotides such as deoxyribonucleic acid (DNA) molecules, ribonucleic acid (RNAO molecules, and peptide nucleic acid (PNA) molecules; polypeptides such as proteins, peptides, antibodies, antigens, enzymes, and receptors; as well as tissues, organelles, and other receptor probes.

[0042] The term “probe” or “capture probe” may be used interchangeably and generally refers to a molecular species or other markers that can bind and / or interact to a specific analyte. Probes can comprise molecules and can be bound to the substrate, molecules, or other solid surface, directly or via a linker. Non-limiting examples of linkers include amino acids, polypeptides, nucleotides, oligonucleotides, and chemical linkers. A plurality of probes can be immobilized to a substrate, molecule or other solid surface and can be referred to as a probe array. A plurality of probes of a probe array may be arranged uniformly, for example as an arrangement of spots, or non-uniformity. For example, the probe can be an antibody or antibodies; the probe can be a nucleic acid molecule or nucleic acid molecules.

[0043] The term “reporter” or “reporter molecule” as used herein, generally refers to a molecular structure that can be attached to a molecule (e.g., an analyte or a probe) , to permit detection of molecule, distinguishable, or traceable by providing a characteristic which may not be intrinsic to the analyte molecule. Examples of labels may include luminescent molecules (e.g., fluorophores) , reduction-oxidation (redox) species, or enzymes. In some cases, labels may comprise fluorophores with long lifetimes, such as, for example, lanthanide chelates and transition metal chelates, which may be luminescent or phosphorescent.

[0044] A quantitative PCR or Q-PCR process can be described in the following non-limiting example. A PCR reaction is carried out with a pair of primers designed to amplify a given nucleic acid sequence in a sample. The appropriate enzymes and nucleotides, such as deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) , are added to the reaction, and the reaction is subjected to a number of amplification cycles. The amount of amplicon generated from each cycle is detected, but in the early cycles, the amount of amplicon can be below the detection threshold. The amplification may be occurring in two phases, an exponential phase, followed by a non-exponential plateau phase. During the exponential phase, the amount of PCR product approximately doubles in each cycle. As the reaction proceeds, however, reaction components are consumed, and ultimately one or more of the components becomes limiting. At this point, the reaction slows and enters the plateau phase. Initially, the amount of amplicon remains at or below background levels, and increases are not detectable, even though amplicon product accumulates exponentially. Eventually, enough amplified product accumulates to yield a detectable signal. The cycle number at which this occurs is called the threshold cycle, or Ct or CT. Since the Ct value is measured in the exponential phase when reagents are not limited, Q-PCR can be used to calculate the initial amount of template present in the reaction. The Ct of a reaction may be determined mainly by the amount of nucleic acid sequence corresponding to amplicon present at the start of the amplification reaction. If a large amount of template is present at the start of the reaction, relatively few amplification cycles may be required to accumulate enough products to give a signal above background. Thus, the reaction may have a low, or early, Ct. In contrast, if a small amount of template is present at the start of the reaction, more amplification cycles may be required for the fluorescent signal to rise above background. Thus, the reaction may have a high, or late, Ct. Methods and systems provided herein allow for the measurement of the accumulation of multiple amplicons in a single fluid in a single amplification reaction, and thus the determination of the amount of multiple nucleic acid sequences in the same sample with the methodology of Q-PCR described above.

[0045] The term “nucleotide, ” as used herein, generally refers to a molecule that can serve as the monomer, or subunit, of a nucleic acid, such as deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) . A nucleotide may be a deoxynucleotide triphosphate (dNTP) or an analog thereof (e.g., a molecule having a plurality of phosphates in a phosphate chain, such as 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, or more phosphates) . A nucleotide may generally include adenosine (A) , cytosine (C) , guanine (G) , thymine (T) and uracil (U) , or variants thereof. A nucleotide may include any subunit that can be incorporated into a growing nucleic acid strand. Such subunit can be an A, C, G, T, or U, or any other subunit that is specific to one or more complementary A, C, G, T, or U, or complementary to a purine (e.g., A or G, or variant thereof) or a pyrimidine (e.g., C, T, or U, or variant thereof) . A subunit can enable individual nucleic acid bases of group of bases (e.g., AA, TA, AT, GC, CG, CT, TC, GT, TC, AC, CA, or uracil counterparts thereof) to be resolved. A nucleotide may be labeled or unlabeled. A labeled nucleotide may yield a detectable signal, such as an optical, electrostatic, or electrochemical signal.

[0046] The terms “polynucleotide, ” “oligonucleotide, ” “nucleotide, ” “nucleic acid, ” and “nucleic acid molecule” generally refer to a polymeric form of nucleotides (polynucleotides) of various lengths, either ribonucleotide s (RNA) or deoxyribonucleotides (DNA) . Examples of nucleotide sequences are sequences corresponding to natural or synthetic RNA or DNA including genomic DNA and messenger RNA. The length of the sequence can be any length that can be amplified into nucleic acid amplification products, or amplicons, for example, up to about 20, 40, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 00, 800, 21000, 1200, 1500, 2000, 5000, 12000, or more than 10000 nucleotides in length.

[0047] The terms “peptide, ” “polypeptide, ” and “protein” as used herein generally refer to a compound comprising amino acid residues covalently linked by peptide bonds. Polypeptides may include any peptide or protein comprising two or more amino acids joined to each other by peptide bonds. Examples of polypeptides may include, for example, biologically active fragments, substantially homologous polypeptides, oligopeptides, homodimers, heterodimers, polypeptides and variants thereof, modified polypeptides, derivatives, analogs, fusion proteins, or combinations thereof. A polypeptide may be a natural peptide, a recombinant peptide, or a combination thereof.

[0048] As used herein, the term “label” generally refers to a specific molecular structure that can be attached to a target molecule, to make the target molecule distinguishable and traceable by providing a unique characteristic not intrinsic to the target molecule.

[0049] As used herein, the term “photobleaching” generally refers to the photochemical alteration of a dye or a fluorophore molecule such that it is unable to fluoresce. This can be caused by cleavage of covalent bonds or non-specific reactions between the fluorophore and surrounding molecules. Loss of activity caused by photobleaching can be affected by increasing or reducing the intensity or time-span of light exposure, by increasing or decreasing the concentration of fluorophores, by reducing or increasing the frequency and thus the photon energy of the input light, or by employing less robust or more robust fluorophores with regard to their abilities towards bleaching. Dyes such as, for example, Alexa Fluors or DyLight Fluors, are less prone to photobleaching. Thus, photobleaching may be used to remove, modify or in some instance extinguish signals from a signal-emitting moiety. Photobleaching may be performed by exposing fluorophores to a wavelength of light of suitable wavelength, energy and duration to permanently and irreversibly extinguish the ability of the fluorophore to emit further signals.

[0050] As used herein, the term “fluorescence resonance energy transfer” or FRET generally refers to non-radioactive energy transfer between chemical and / or protein fluorophores. Fluorescent resonance energy transfer (FRET) is a process in which one fluorophore (the acceptor) can be promoted to an excited electronic state through quantum mechanical coupling with and receipt of energy from an electronically excited second fluorophore (the donor) . This transfer of energy results in a decrease in visible fluorescence emission by the donor and an increase in fluorescent energy emission by the acceptor.

[0051] For FRET to occur efficiently, the absorption and emission spectra between the donor and acceptor have to overlap. Dye pairs are characterized by their spectral overlap properties. Emission spectrum of donor must overlap acceptor absorption spectrum. Extent of overlap determines the efficiency of energy transfer. Extent of overlap also determines the optimal distance for which the assay is sensitive. Where the overlap of spectra is large, the transfer is efficient, so it is sensitive to longer distances. The selection of donor / acceptor depends upon the distances considered. Significant energy transfer can only occur when the donor and acceptor are sufficiently closely positioned since the efficiency of energy transfer is highly dependent upon the distance between donor and acceptor fluorophores, for example, within 10 nm or 100 angstrom. The fluorophores can be chemical fluorophores and / or protein fluorophores. In some embodiments n, the first component of the FRET pair may be a lanthanide such as a chelate of europium (III) (Eu (III) ) or terbium (III) (Tb(III) ) which serves as a fluorescent donor and the second component of the FRET pair may be an activated ester of cyanine 5 (Cy5) or tetramethylrhodamine (TMR) which serve as energy acceptors of Eu (III) and Tb (III) . Other first and second component pairs that may find use for FRET include, for example, fluorescein and rhodamine; FITC and rhodamine; and fluorescein and trinitrophenyl, and other components as are known In the art. The FRET pair can be selected based on their wavelength of their absorption or emission bands.

[0052] As used herein, the term “fluorophore” refers to a chemical compound, which when excited by exposure to a particular wavelength of light, emits light at a different wavelength. As used herein, the term “fluorophore” refers to any molecule known in the art that can be used for FRET, including dyes, fluorescent proteins, and quantum dots.

[0053] As used herein, the term “excitable distance” refers to the distance at which FRET can occur between a donor molecule and an acceptor molecule. In some embodiments, the excitable distance can be when the donor molecule and the acceptor molecule are within from about 3 angstrom to about 10 angstrom, from about 10 angstrom to about 20 angstrom, from about 20 angstrom to about 30 angstrom, or from about 30 angstrom to about 40 angstrom of each other. In some embodiments, the excitable distance can be within 10 angstrom. In some embodiments, for fluorescent proteins, the excitable distance can be from about 10 angstrom to about 100 angstrom, or about 50 angstrom to about 90 angstrom.

[0054] As used herein, a “FRET pair” refers to two probes attached with different reporter molecules (donor and acceptor molecules) . These two probes can bind within an excitable distance, and since the probes are labeled with fluorophores that have overlapping donor emission and acceptor absorption spectrums, and suitable dipole orientation, they can emit FRET signals. In some embodiments, the FRET pair may be a couple of fluorescent proteins.

[0055] Whenever the term “at least, ” “greater than, ” or “greater than or equal to” precedes the first numerical value in a series of two or more numerical values, the term “at least, ” “greater than” or “greater than or equal to” applies to each of the numerical values in that series of numerical values. For example, greater than or equal to 1, 2, or 3 is equivalent to greater than or equal to 1, greater than or equal to 2, or greater than or equal to 3.

[0056] As used herein, a “thermal device” generally refers to a thermal control device adapted to provide improved control of temperature and efficient switching between at least two different temperature zones. For example, the thermal control device can be a Peltier module which can be a thermoelectric module or thermoelectric cooler and which can be a solid-state device that transfers heat from one side to the other depending on the applied electrical current. The Peltier module may act as a miniature heat pump, creating a temperature difference between the two surfaces of the module and increasing or decreasing the temperature depending on the applied electrical current. Other examples include a thermoelectric cooler that is controlled in coordination with another thermal manipulation device. The thermal manipulation device can include a heater, a cooler, another thermoelectric cooler, or any suitable means for modifying temperature. In some embodiments, the thermal manipulation device can further include use of one or more thermal sensors (e.g. thermocouples) , a thermal capacitor, a thermal buffer, a thermal insulator or any combination of these elements. In some embodiments, the thermal manipulation device includes a thermal-resistive heater. In some embodiments, the thermal control device is adapted for one-sided heating of a reaction vessel, while in other embodiments, the device is adapted for two-sided heating (e.g. opposing major faces) . It is appreciated that any of the features described herein may be applicable to either approach and is not limited to the particular embodiment in which the feature is described.

[0057] Whenever the term “no more than, ” “less than, ” or “less than or equal to” precedes the first numerical value in a series of two or more numerical values, the term “no more than, ” “less than, ” or “less than or equal to” applies to each of the numerical values in that series of numerical values. For example, less than or equal to 3, 2, or 1 is equivalent to less than or equal to 3, less than or equal to 2, or less than or equal to 1.

[0058] FRET ELISA

[0059] A traditional enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a process to detect the presence of a target protein in a tissue or a solution. In one type of traditional sandwich ELISA, a capturing antibody and a detection antibody, each capable of binding to a different epitope of the same protein to be detected and / or quantitated, are used to capture and detect the protein (target) . The process usually involves plating the capturing antibody on a surface of a substrate in a container; when a solution containing the protein target flows by the surface, the first epitope of the protein binds to the capturing antibody. Once this binding reaction takes place, a reagent comprising the detection antibody is injected into the same container and reaching the surface; the detection antibody subsequently binds to a different epitope of the same protein (target) . The detection antibody is typically labeled with a tag that can be functionalized to display a color that can be detected by instruments. This method requires that excessive reagents and sample be washed away because the excessive reagents can give rise to noise and render quantitative determination of antigen concentration impossible.

[0060] In some embodiments of the present disclosure, FRET-based detection can be used in a Sandwich ELISA as shown in FIG. 1. The capture antibody is attached with a donor tag (FRET donor) and can bind to a protein target. The capture antibody is mixed with a sample in a reaction chamber. The protein target (oval) in the sample binds to the capture antibody. The unbound protein targets in the sample remain in the reaction chamber. The detection antibody with an acceptor tag (FRET acceptor) in turn is introduced to the reaction chamber and can bind to the protein target (at a different binding site from that for the capture antibody) , including those protein targets bound to the capture antibodies. Upon excitation by the excitation photon flux (e.g., radiating the reaction chamber by an excitation light (not shown) ) , the donor tag (FRET donor) emits fluorescence (i.e., donor emission) at a certain wavelength. When bindings occur between the binding partners (forming a binding complex of capture antibody, target protein, and detection antibody) , the FRET donor and FRET acceptor molecules are brought into proximity. The donor emission can be absorbed by the acceptor tag (FRET acceptor) which, in turn, emits another fluorescence (i.e., FRET emission) that can be detected by a detector (not shown) . In some embodiments, a narrow band pass filter (not shown) can be used to block all wavelengths except that of the emitted FRET fluorescence. FRET molecule pairs are commercially available in the art (e.g., from Invitrogen) , and may be used according to the manufacturer's protocol. FRET emissions are detected using optical imaging techniques, such as a CCD camera. In the above example, a FRET acceptor can be attached to the capturing antibody while a FRET donor can be attached to the detection antibody, and this configuration of FRET ELISA can also work. In the above example, both the capture antibody and the detection antibody are solution-phase antibodies. In some embodiments, this example can be modified as follows: the capture antibodies are immobilized on a solid substrate. With the immobilized capture probes, in some embodiments, the steps of the FRET-based ELISA assay remain the same, and no washing step is used. With the immobilized capture probes, in other embodiments, after the sample and the capture antibodies are mixed, optionally, the unbound protein targets can be washed away from the reaction chamber. In some embodiments, after the detection antibodies are added to the reaction chamber, optionally, the unbound detection antibodies can be washed away from the reaction chamber. In some embodiments, with the immobilized capture probes, one or more washing steps are involved in the FRET-based ELISA assay. In some embodiments, the ratio of the capture antibodies to the detection antibodies is from about 1: 2 to about 10: 1, such as about 1: 2, about 2: 3, about 1: 1, about 3: 2, about 2: 1, about 3: 1, about 4: 1, about 5:1, about 6: 1, about 7: 1, about 8: 1, about 9: 1, or about 10: 1, such as from 1: 2 to 2: 3, from 2: 3 to 1:1, from 1: 1 to 3: 2, from 3: 2 to 2: 1, from 2: 1 to 3: 1, from 3: 1 to about 4: 1, from 4: 1 to 5: 1, from 5:1 to 6: 1, from 6: 1 to 7: 1, from 7: 1 to 8: 1, from 8: 1 to 9: 1, or from 9: 1 to 10: 1. In some embodiments, the ratio of the capture antibodies to the detection antibodies is more than 10: 1.

[0061] In FRET-ELISA described above, the capturing antibody carries a “donor” tag (triangle) that can absorb a photon of certain frequency (e.g., excitation photon flux) and become excited to a higher-energy state; when the donor tag returns to ground state, it emits a photon with longer wavelength, or lower energy. If a detection antibody carrying an “acceptor” tag (square) that can absorb this photon is nearby, the acceptor tag may absorb the photon and enters an excited state; when the acceptor tag returns to the ground state, the acceptor tag may emit an even longer wavelength photon, henceforth referred to as the “emission photon” . The energy transfer process between the donor tag and the acceptor tag can be highly sensitive to the distance between the donor tag and the acceptor tag. The probability of the FRET process taking place becomes insignificant when the distance between the donor tag and the acceptor tag is beyond 10 angstrom. Therefore, fluorescence photons are emitted when the capturing antibody and detection antibody both bind to the antigen. Since the unbound antibodies cannot emit photons, there is no need to wash off excessive reagent, making this a wash-free ELISA assay.

[0062] For the aforementioned reasons, FRET can be used to detect the presence of capturing antibody –antigen –detection antibody conjugate. If the absence of the antigen, the capturing antibody –antigen –detection antibody conjugate cannot be formed, and the capturing antibody and the detection antibody are unlikely to be placed within 10 angstrom of each other, hence, the emission photon is unlikely to be emitted.

[0063] However, in many applications, there are auto-fluorescent species present in the tissue or liquid sample being examined, i.e. even without the presence of antigen of concern, some photons within the fluorescence emission wavelength range can still be detected, even in the absence of the antigen. A conventional method to overcome this issue is to use donor-acceptor pairs with much longer lifetime. After receiving an excitation, the auto-fluorescent species typically produce an emission photon within 5-6 nanoseconds (ns) ; therefore, if the acceptor emission can sustain significantly longer (>10 ns) , the photons received after 10 ns are likely from the capturing antibody –antigen –detection antibody conjugate. This FRET method is called Time-resolved FRET (TR-FRET) . The instrument used for TR-FRET has very high time-resolution. The excitation light is usually a pulse of several hundred of picoseconds (ps) , and the photon counter is gated to a precision of several nano-seconds (ns) . Consequently, TR-FRET instruments are typically bulky, costly, and difficult to operate, maintain and transport.

[0064] In one embodiment, the present disclosure discloses a novel set of methods and apparatus to reduce or eliminate the auto-fluorescence noise that may be present in many biological samples. For example, a FRET ELISA method of the present disclosure may comprise the following steps:

[0065] 1. A beam of high-intensity light (it can be white light or light within a range of wavelengths) is focused on a transparent sample container, such as a cuvette (Figure 2) . The exposure time to high-intensity light can range from about 10 seconds to about 40 minutes, depending on the samples to be tested.

[0066] 2. The high-intensity light may has 3 effects: 1) it may increase the transmittance of the fluid sample under examination across a wide spectrum, thereby increasing the number of photons emitted by the acceptors and detected by the photon counter; 2) it may photo-bleach the fluorophores in the fluid sample, thus reducing the autofluorescence and the background noise; 3) it may heat up the fluid sample, and brings the fluid sample temperature closer to the optimal antibody-antigen reaction temperature, which typically is close to 37 ℃.

[0067] 3. Optionally, the biological sample in the container is further heated to and kept at 37 ℃using a heating circuit and temperature sensor, such as a thermistor to achieve a close-loop temperature control of the fluid sample.

[0068] 4. After turning off the high-intensity light source in Step 1, use a monochrome light source, e.g., with wavelength of 490 + / -10 nm as an excitation source, and focus the light on the container in FIG. 3. And use a photon counter to detect emission photons from the sample within a certain wavelength range, e.g. with wavelength about 600 + / -10 nm. Place an optical filter that allows light with wavelength about 600 + / -10 nm to pass through in front of the photon counter. The intensity recorded by the photon counter is the residual auto-fluorescence after step 1.

[0069] 5. Add capturing antibody (pre-labeled with a fluorescent donor tag optimized to absorb photons at ～490 nm) , and detection antibody (pre-labeled with a fluorescent acceptor tag optimized to emit photons at ～600 nm) into the container.

[0070] 6. Optionally, a 3D mixing DC motor is placed below the fluid sample to speed up the antibody-antigen binding reaction.

[0071] 7. Use the same monochrome light source in step 4, e.g. with wavelength of 490 + / -10 nm as an excitation source, and focus the light on the container in FIG. 3. Use a photon counter to detect emission photons from the sample within a certain wavelength range, e.g. with wavelength about 600 + / -10 nm. Place an optical filter that allows light with wavelength about 600 + / -10 nm to pass through in front of the photon counter, and record the emission photon intensity by the photon counter.

[0072] 8. The intensity recorded in step 7, minus the intensity recorded in Step 4, may be proportional to the concentration of the antigen in the biological sample (FIG. 3) . The photon counter may continuously count the number of photons emitted from the container for several milliseconds or several seconds as needed.

[0073] As shown in FIG. 2, a diagram shows the method of using photobleaching of the present disclosure. A beam of high-intensity light is focused on a transparent sample container through a set of lenses. The intensity of auto-fluorescence can be reduced after the exposure to high-intensity light.

[0074] As shown in FIG. 3, a diagram shows the recording of the fluorescence emitted from the biological sample under illumination. A beam of light is focused on the biological sample, causing the emission of fluorescence from the sample (including the FRET emission) . The emission fluorescence passes through an optical filter, and the filtered emission fluorescence is recorded by the photon counter. This method and instrument can be used to detect the background auto-fluorescent emission as well as the emission from the donor-acceptor conjugates.

[0075] Nucleic Acid Detection

[0076] The energy transfer dyes (FRET pair) , methods, and kits disclosed herein may be used in a wide variety of methods for detecting the presence of a target molecule (e.g., a DNA or RNA molecule) in a sample by labeling two probes specifically designed to hybridize onto the target molecule adjacent to each other. The target molecule can be a nucleic acid in the sample without amplification or the amplicons after amplification.

[0077] As shown in FIG. 4, a nucleic acid target (shown as a ribonucleic acid (RNA) transcript) can form a tertiary hybridization complex with another two nucleic acids (DNA probe 1 and DNA probe 2) . DNA probe 2 is attached with a donor reporter molecule while DNA probe 1 is attached with an acceptor reporter molecule. The donor reporter molecule and the acceptor reporter molecule are a FRET pair. After exposed to an excitation light, a FRET emission from the acceptor reporter molecule is expected.

[0078] In some embodiments, there are a plurality of DNA probes having a donor reporter molecule, and there a plurality of DNA probes having an acceptor reporter molecule. In some embodiments, the ratio of the DNA probes having a donor reporter molecule to the DNA probes having an acceptor reporter molecule is from about 1: 2 to about 10: 1, such as about 1: 2, about 2: 3, about 1: 1, about 3: 2, about 2: 1, about 3: 1, about 4: 1, about 5: 1, about 6: 1, about 7: 1, about 8: 1, about 9: 1, or about 10: 1, such as from 1: 2 to 2: 3, from 2: 3 to 1: 1, from 1: 1 to 3: 2, from 3: 2 to 2: 1, from 2: 1 to 3: 1, from 3: 1 to about 4: 1, from 4: 1 to 5: 1, from 5: 1 to 6: 1, from 6: 1 to 7: 1, from 7: 1 to 8:1, from 8: 1 to 9: 1, or from 9: 1 to 10: 1. In some embodiments, the ratio of the DNA probes having a donor reporter molecule to the DNA probes having an acceptor reporter molecule is more than 10: 1.

[0079] Compositions, kits, methods, systems and devices provided herein can be used for performing nucleic acid amplification reaction on a plurality of nucleotide sequences in a fluid. The presence, quantity and / or binding activity of the amplified products (i.e., amplicons) may be simultaneously detected and monitored in real-time as the reaction proceeds. Methods of amplification may include, for example, polymerase chain reaction (PCR) .

[0080] The amplification method can be temperature cycling or isothermal. The amplification method can be exponential or linear. For amplifications with temperature cycling, a temperature cycle may generally correspond to an amplification cycle. Isothermal amplifications can in some cases have amplification cycles, such as denaturing cycles, and in other cases, the isothermal amplification reaction will occur monotonically without any specific amplification cycle.

[0081] The amplification method may be used to amplify specific regions (i.e., target regions) , or nucleotide sequences of a nucleic acid molecule (e.g., DNA, RNA) . This region can be, for example, a single gene, a part of a gene, or a non-coding sequence.

[0082] The amplification method may comprise: (1) a template that contains the region of the nucleic acid sequence to be amplified; (2) one or more primers, which are complementary to the target region at the 5' and 3' ends of the region that is to be amplified; (3) a polymerase (e.g. Taq polymerase) , used to synthesize a copy of the region to be amplified; (4) deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) ; (5) a buffer solution, which provides a suitable chemical environment for optimum activity and stability of the polymerase; and / or (6) a divalent cation such as magnesium or manganese ions.

[0083] A primer may be a nucleic acid strand, or a related molecule that serves as a starting point for nucleic acid replication. A primer may often be required because some nucleic acid polymerases cannot begin synthesizing a new strand from scratch, but can only add to an existing strand of nucleotides. The length of the primers may vary. Primers with longer or shorter lengths may be used, dependent upon, the application. For example, in some cases, chemically synthesized DNA molecules with a length about 10 to about 30 bases may be used as primers. In some cases, the length of primers can be for example about 20-30 nucleotides, and the sequence of the primers are complementary to the beginning and the end of the target fragment to be amplified. The primers may anneal (adhere) to the template at these starting and ending points, where polymerase binds and begins the synthesis of the new strand. In some cases, degenerate primers may be used. Degenerate primers comprise mixtures of similar, but not identical, primers.

[0084] As provided in the present disclosure, primers or probes may or may not be labeled with a reporter molecule (e.g., a label) . The reporter molecule may be configured to facilitate and / or enable the detection and / or monitoring of the presence, quantity, concentration or binding activity of the primers, amplicons, or the probes. The reporter molecules can be optical, electrical or electrochemical. Examples of reporter molecules may include, but not limited to fluorescent, quenchers, fluorophores, members of a fluorescence resonance energy transfer (FRET) pair, redox species, or combinations thereof.

[0085] Fluorescent Labels

[0086] A wide variety of fluorescent molecules (e.g., small molecules, fluorescent proteins and quantum dots) can be utilized in the present disclosure. Non-limiting examples of fluorescent molecules (or fluorophores) may include: 1, 5 IAEDANS; 1, 8-ANS; 4-Methylumbelliferone; 5-carboxy-2, 7-dichlorofluorescein; 5-Carboxyfluorescein (5-FAM) ; 5-Carboxynapthofluorescein; 5-Carboxytetramethylrhodamine (5-TAMRA) ; 5-FAM (5-Carboxyfluorescein) ; 5-HAT (Hydroxy Tryptamine) ; 5-Hydroxy Tryptamine (HAT) ; 5-ROX (carboxy-X-rhodamine) ; 5-TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine) ; 6-Carboxyrhodamine 6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-Amino-4-methylcoumarin; 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) ; 7-Hydroxy-4-methylcoumarin; 9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine; ABQ; Acid Fuchsin; ACMA (9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine) ; Acridine Orange; Acridine Red; Acridine Yellow; Acriflavin; Acriflavin Feulgen SITSA; Aequorin (Photoprotein) ; AFPs-AutoFluorescent Protein- (Quantum Biotechnologies) ; Alexa Fluor 350TM; Alexa Fluor 430TM; Alexa Fluor 488TM; Alexa Fluor 532TM; Alexa Fluor 546TM; Alexa Fluor 568TM; Alexa Fluor 594TM; Alexa Fluor 633TM; Alexa Fluor 647TM; Alexa Fluor 660TM; Alexa Fluor 680TM; Alizarin Complexion; Alizarin Red; Allophycocyanin (APC) ; AMC, AMCA-S; AMCA (Aminomethylcoumarin) ; AMCA-X; Aminoactinomycin D; Aminocoumarin; Anilin Blue; Anthrocyl stearate; Aminomethylcoumarin (AMCA) ; APC (Allophycocyanin) ; APC-Cy7; APTRA-BTC; APTS; Astrazon Brilliant Red 4G; Astrazon Orange R; Astrazon Red 6B; Astrazon Yellow 7 GLL; Atabrine; ATTO-TAGTM CBQCA; ATTO-TAGTM FQ; Auramine; Aurophosphine G; Aurophosphine; BAO 9 (Bisaminophenyloxadiazole) ; BCECF (high pH) ; BCECF (low pH) ; Berberine Sulphate; Beta Lactamase; Bimane; Bisbenzamide; Bisbenzimide (Hoechst) ; bis-BTC; Blancophor FFG; Blancophor SV; BOBOTM-1; BOBOTM-3; Bodipy 492 / 515; Bodipy 493 / 503; Bodipy 500 / 510; Bodipy 505 / 515; Bodipy 530 / 550; Bodipy 542 / 563; Bodipy 558 / 568; Bodipy 564 / 570; Bodipy 576 / 589; Bodipy 581 / 591; Bodipy 630 / 650-X; Bodipy 650 / 665-X; Bodipy 665 / 676; Bodipy FI; Bodipy FL ATP; Bodipy FI-Ceramide; Bodipy R6G SE; Bodipy TMR; Bodipy TMR-X conjugate; Bodipy TMR-X, SE; Bodipy TR; Bodipy TR ATP; Bodipy TR-X SE; BO-PROTM-1; BO-PROTM-3; Brilliant Sulphoflavin FF; BTC; BTC-SN; Calcein; Calcein Blue; Calcium CrimsonTM; Calcium Green; Calcium Green-1 Ca. sup. 2+Dye; Calcium Green-2 Ca. sup. 2+; Calcium Green-SN Ca.sup. 2+; Calcium Green-C18 Ca. sup. 2. sup. +; Calcium Orange; Calcofluor White; Carboxy-X-rhodamine (5-ROX) ; Cascade BlueTM; Cascade Yellow; Catecholamine; CCF2 (GeneBlazer) ; CFDA; Chlorophyll; Chromomycin A; Chromomycin A; CL-NERF; CMFDA; Coumarin Phalloidin; C-phycocyanine; CPM Methylcoumarin; CTC; CTC Formazan; Cy2TM; Cy3.1 8; Cy3.5TM; Cy3TM; Cy5.1 8; Cy5.5TM; Cy5TM; Cy7TM; cyclic AMP Fluorosensor (FiCRhR) ; Dabcyl; Dansyl; Dansyl Amine; Dansyl Cadaverine; Dansyl Chloride; Dansyl DHPE; Dansyl fluoride; DAPI; Dapoxyl; Dapoxyl 2; Dapoxyl 3′DCFDA; DCFH (Dichlorodihydrofluorescein Diacetate) ; DDAO; DHR (Dihydrorhodamine 123) ; Di-4-ANEPPS; Di-8-ANEPPS (non-ratio) ; DiA (4-Di-16-ASP) ; Dichlorodihydrofluorescein Diacetate (DCFH) ; DiD-Lipophilic Tracer; DiD (DiIC18 (5) ) ; DIDS; Dihydrorhodamine 123 (DHR) ; Dil (DiIC18 (3) ) ; Dinitrophenol; DiO (DiOC18 (3) ) ; DiR; DiR (DiIC18 (7) ) ; DM-NERF (high pH) ; DNP; Dopamine; DTAF; DY-630-NHS; DY-635-NHS; ELF 97; Eosin; Erythrosin; Erythrosin ITC; Ethidium Bromide; Ethidium homodimer-1 (EthD-1) ; Euchrysin; EukoLight; Europium (III) chloride; EYFP; Fast Blue; FDA; Feulgen (Pararosaniline) ; FIF (Formaldehyde Induced Fluorescence) ; FITC; Flazo Orange; Fluo-3; Fluo-4; Fluorescein (FITC) ; Fluorescein Diacetate; Fluoro-Emerald; Fluoro-Gold (Hydroxystilbamidine) ; Fluor-Ruby; Fluor X; FM 1-43TM; FM 4-46; Fura RedTM (high pH) ; Fura RedTM / Fluo-3; Fura-2; Fura-2 / BCECF; Genacryl Brilliant Red B; Genacryl Brilliant Yellow 10GF; Genacryl Pink 3G; Genacryl Yellow 5GF; GeneBlazer (CCF2) ; Gloxalic Acid; Granular blue; Haematoporphyrin; Hoechst 33258; Hoechst 33342; Hoechst 34580; HPTS; Hydroxycoumarin; Hydroxystilbamidine (FluoroGold) ; Hydroxytryptamine; Indo-1, high calcium; Indo-1, low calcium; Indodicarbocyanine (DiD) ; Indotricarbocyanine (DiR) ; Intrawhite Cf; JC-1; JO-JO-1; JO-PRO-1; LaserPro; Laurodan; LDS 751 (DNA) ; LDS 751 (RNA) ; Leucophor PAF; Leucophor SF; Leucophor WS; Lissamine Rhodamine; Lissamine Rhodamine B; Calcein / Ethidium homodimer; LOLO-1; LO-PRO-1; Lucifer Yellow; Lyso Tracker Blue; Lyso Tracker Blue-White; Lyso Tracker Green; Lyso Tracker Red; Lyso Tracker Yellow; LysoSensor Blue; LysoSensor Green; LysoSensor Yellow / Blue; Mag Green; Magdala Red (Phloxin B) ; Mag-Fura Red; Mag-Fura-2; Mag-Fura-5; Mag-indo-1; Magnesium Green; Magnesium Orange; Malachite Green; Marina Blue; Maxilon Brilliant Flavin 10 GFF; Maxilon Brilliant Flavin 8 GFF; Merocyanin; Methoxycoumarin; Mitotracker Green FM; Mitotracker Orange; Mitotracker Red; Mitramycin; Monobromobimane; Monobromobimane (mBBr-GSH) ; Monochlorobimane; MPS (Methyl Green Pyronine Stilbene) ; NBD; NBD Amine; Nile Red; Nitrobenzoxadidole; Noradrenaline; Nuclear Fast Red; Nuclear Yellow; Nylosan Brilliant lavin E8G; Oregon Green; Oregon Green 488-X; Oregon GreenTM; Oregon GreenTM 488; Oregon GreenTM 500; Oregon GreenTM 514; Pacific Blue; Pararosaniline (Feulgen) ; PBFI; PE-Cy5; PE-Cy7; PerCP; PerCP-Cy5.5; PE-TexasRed [Red 613] ; Phloxin B (Magdala Red) ; Phorwite AR; Phorwite BKL; Phorwite Rev; Phorwite RPA; Phosphine 3R; PhotoResist; Phycoerythrin B [PE] ; Phycoerythrin R [PE] ; PKH26 (Sigma) ; PKH67; PMIA; Pontochrome Blue Black; POPO-1; POPO-3; PO-PRO-1; PO-PRO-3; Primuline; Procion Yellow; Propidium lodid (PL) ; PyMPO; Pyrene; Pyronine; Pyronine B; Pyrozal Brilliant Flavin 7GF; QSY 7; Quinacrine Mustard; Red 613 [PE-TexasRed] ; Resorufin; RH 414; Rhod-2; Rhodamine; Rhodamine 110; Rhodamine 123; Rhodamine 5 GLD; Rhodamine 6G; Rhodamine B; Rhodamine B 200; Rhodamine B extra; Rhodamine BB; Rhodamine BG; Rhodamine Green; Rhodamine Phallicidine; Rhodamine Phalloidine; Rhodamine Red; Rhodamine WT; Rose Bengal; R-phycocyanine; R-phycoerythrin (PE) ; S65A; S65C; S65L; S65T; SBFI; Serotonin; Sevron Brilliant Red 2B; Sevron Brilliant Red 4G; Sevron Brilliant Red B; Sevron Orange; Sevron Yellow L; SITS; SITS (Primuline) ; SITS (Stilbene Isothiosulphonic Acid) ; SNAFL calcein; SNAFL-1; SNAFL-2; SNARF calcein; SNARF1; Sodium Green; SpectrumAqua; SpectrumGreen; SpectrumOrange; Spectrum Red; SPQ (6-methoxy-N- (3-sulfopropyl) quinolinium) ; Stilbene; Sulphorhodamine B can C; Sulphorhodamine Extra; SYTO 11; SYTO 12; SYTO 13; SYTO 14; SYTO 15; SYTO 16; SYTO 17; SYTO 18; SYTO 20; SYTO 21; SYTO 22; SYTO 23; SYTO 24; SYTO 25; SYTO 40; SYTO 41; SYTO 42; SYTO 43; SYTO 44; SYTO 45; SYTO 59; SYTO 60; SYTO 61; SYTO 62; SYTO 63; SYTO 64; SYTO 80; SYTO 81; SYTO 82; SYTO 83; SYTO 84; SYTO 85; SYTOX Blue; SYTOX Green; SYTOX Orange; Tetracycline; Tetramethylrhodamine (TRITC) ; Texas RedTM; Texas Red-XTM conjugate; Thiadicarbocyanine (DiSC3) ; Thiazine Red R; Thiazole Orange; Thioflavin 5; Thioflavin S; Thioflavin TCN; Thiolyte; Thiozole Orange; Tinopol CBS (Calcofluor White) ; TMR; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; TriColor (PE-Cy5) ; TRITC TetramethylRodaminelsoThioCyanate; True Blue; TruRed; Ultralite; Uranine B; Uvitex SFC; WW 781; X-Rhodamine; XRITC; Xylene Orange; Y66F; Y66H; Y66W; YO-PRO-1; YO-PRO-3; YOYO-1; YOYO-3, Sybr Green, Thiazole orange (interchelating dyes) , Alexa Fluor dye series (e.g., Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, and 750) , Cy Dye fluorophore series (e.g., Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7) , Oyster dye fluorophores (e.g., Oyster-500, -550, -556, 645, 650, 656) , DY-Labels series (e.g., DY-415, -495, -505, -547, -548, -549, -550, -554, -555, -556, -560, -590, -610, -615, -630, -631, -632, -633, -634, -635, -636, -647, -648, -649, -650, -651, -652, -675, -676, -677, -680, -681, -682, -700, -701, -730, -731, -732, -734, -750, -751, -752, -776, -780, -781, -782, -831, -480XL, -481XL, -485XL, -510XL, -520XL, -521XL) , ATTO fluorescent labels (e.g., ATTO 390, 425, 465, 488, 495, 520, 532, 550, 565, 590, 594, 610, 611X, 620, 633, 635, 637, 647, 647N, 655, 680, 700, 725, 740) , CAL Fluor and Quasar dyes (e.g., CAL Fluor Gold 540, CAL Fluor Orange 560, Quasar 570, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, CAL Fluor Red 635, Quasar 670) , quantum dots (e.g., Qdot 525, Qdot565, Qdot585, Qdot605, Qdot655, Qdot705, Qdot 800) , fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, or combinations thereof.

[0087] A variety of different report molecules or label moieties are readily employed in forming a FRET pair (donor and acceptor pair for FRET) . Such groups may include fluorescein labels, rhodamine labels, cyanine labels (i.e., Cy3, Cy5, and the like, generally available from Cytiva, part of Danaher and previously the Amersham Biosciences division of GE Healthcare) , the Alexa family of fluorescent dyes and other fluorescent and fluorogenic dyes available from Molecular Probes / Invitrogen / Life Technologies, Inc., and described in “The Handbook-AGuide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Eleventh Edition” (2010) (available from Thermo Fisher Scientific) , semiconductor nanocrystals and other nanoparticle labels (e.g.,  nanocrystals available from Invitrogen, Inc. (Life Technologies) ) . A variety of other labeling moieties for use with labeled compounds (e.g., nucleoside polyphosphates and other biomolecules and reaction components) , and which would be applicable to the compounds of the present invention are described in, e.g., Published U.S. Patent Application No. 2003 / 0124576, the full disclosure of which is incorporated herein in its entirety for all purposes. Additional examples of useful FRET labels include, e.g., those described in U.S. Pat. Nos. 5,654,419, 5,688,648, 5,853,992, 5,863,727, 5,945,526, 6,008,373, 6,150,107, 6,335,440, 6,348,596, 6,479,303, 6,545,164, 6,849,745 and 6,696,255, and Published U.S. Patent Application No. 2003 / 0143594, the disclosures of which are incorporated herein by reference for all purposes. In some embodiments, the chromophores in a FRET pair are fluorophores. Molecules that can be used in FRET may include fluorophores as described above, fluorescein, 5-carboxyfluorescein (FAM) , 2'7'-dimethoxy-4'5'-dichloro-6-carboxyfluorescein (JOE) , rhodamine, 6-carboxyrhodamine (R6G) , N, N, N', N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA) , 6-carboxy-X-rhodamine (ROX) , 4- (4'-dimethylaminophenylazo) benzoic acid (DABCYL) , and 5- (2'-aminoethyl) aminonaphthalene-1-sulfonic acid (EDANS) . For example, a FRET pair may comprise a Cy3 donor dye and Cy3.5 acceptor dye, a Cy5 donor dye and a Cy5.5 acceptor dye. ALEXA Fluors (Molecular Probes / Invitrogen) and DYLIGHT Fluors (Thermo Fisher Scientific) . These fluorophores have an emission spectra that span a wide range, including ultraviolet, near-ultraviolet, visible, near-infrared, and infrared ranges. Representative donor fluorescent moieties that can be used with various acceptor fluorescent moieties in FRET technology include fluorescein, Lucifer Yellow, B-phycoerythrin, 9-acridineisothiocyanate, Lucifer Yellow VS, 4-acetamido-4′-isothio-cyanatostilbene-2, 2′-disulfonic acid, 7-diethylamino-3- (4′-isothiocyanatophenyl) -4-methylcoumarin, succinimdyl 1-pyrenebutyrate, and 4-acetamido-4′-isothiocyanatostilbene-2-, 2′-disulfonic acid derivatives, chelates of Lanthanide ions (e.g., Europium, Dysprosium, Samarium or Terbium) . Representative acceptor fluorescent moieties, depending upon the donor fluorescent moiety used, include LC-Red 640, LC-Red 705, Cy5, Cy5.5, Lissamine rhodamine B sulfonyl chloride, tetramethyl rhodamine isothiocyanate, rhodamine x isothiocyanate, erythrosine isothiocyanate, fluorescein, diethylenetriamine pentaacetate, allophycocyanin, XL665, d2. Donor and acceptor fluorescent moieties can be obtained, for example, from Molecular Probes (Junction City, Oreg. ) or Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo. ) .

[0088] In some cases, the acceptor of the FRET pair may be used to quench the fluorescence of the donor. The acceptor may have little to no fluorescence. In some cases, the FRET acceptors that are useful for quenching may be referred to as quenchers. Non-limiting examples of quenchers may include, Black Hole Quencher Dyes (e.g., BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, BHQ-10) , QSY Dye fluorescent quenchers (e.g., QSY7, QSY9, QSY21, QSY35) , Dabcyl and Dabsyl, Cy5Q, Cy7Q, Dark Cyanine dyes (which can be used, for example, in conjunction with donor fluors such as Cy3B, Cy3, or Cy5) , DY-Quenchers (e.g., DYQ-660 and DYQ-661) , ATTO fluorescent quenchers (e.g., ATTO 540Q, 580Q, 612Q) , or combinations thereof.

[0089] FRET between two different fluorophores can be assayed by several methods: looking at the change in color of the fluorescence, measuring the fluorescence lifetime of the donor, examining the changes upon photobleaching either the donor or acceptor or both donor / acceptor fluorophore. Regardless of the approach, most of these assays share common features of the instrumentation. Examples of such are the EnVision Plate Reader (Molecular Devices) , ViewLux ultraHTS Microplate Imager (PerkinElmer) , OPTIMA Microplate Readers, FLUOstar and POLARstar (BMG Labtech) . Preferred measurement is by time-resolved fluorimetry.

[0090] FRET between two different fluorophores can be assayed by high-content cell screening using an instrument that detects changes in fluorescence in cells or in particular subcellular localizations. Examples of such instrumentation are the INCell Analyzer (GE Healthcare) , ImageXpress Micro High Content Screening System (Molecular Devices) , Opera, Operetta (PerkinElmer) , and Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader (Thermo Scientific) .

[0091] Photobleaching

[0092] Photobleaching is the irreversible loss of a fluorophore’s ability to emit light after repeated excitation, and it represents a primary limitation in quantitative fluorescence assays. Upon absorbing a photon, a fluorophore normally relaxes to the ground state by emitting a second photon. A small fraction of excitations, however, populate reactive triplet or radical states that readily interact with molecular oxygen or other constituents of the medium, producing covalent modifications that disrupt the fluorophore’s electronic structure. Once altered, the molecule can no longer fluoresce, causing a progressive decay in signal intensity that biases time-lapse measurements, reduces dynamic range, and introduces spatial artifacts in imaging experiments.

[0093] The rate at which photobleaching occurs depends on both physical and chemical factors. High irradiance, prolonged exposure, and excitation at short (higher-energy) wavelengths accelerate bleaching, as do elevated oxygen levels, metal ions, and other reactive species in the buffer. Conversely, lowering light intensity or duty cycle, selecting long-wavelength excitation when possible, scavenging dissolved oxygen with enzymatic or antioxidant systems (e.g., glucose oxidase–catalase, Trolox) , and using intrinsically photostable dyes such as the Alexa Fluor or Janelia Fluor series markedly slow the process. Instrumental approaches-including light-sheet or spinning-disk confocal illumination that restrict excitation to the focal plane, or computer-controlled shutters that open only during data acquisition-further minimize photodamage. For demanding applications, low-temperature or cryogenic imaging can almost abolish photochemical reactions.

[0094] Although photobleaching is viewed as a source of signal loss, judicious application of controlled photobleaching may improve signal-to-noise ratios by suppressing unwanted background fluorescence. Pre-acquisition photobleach exposures may exploit the fact that endogenous autofluorophores and / or adventitiously bound dyes may be less photostable than the specifically bound probes added after the photobleach. By illuminating the assay solution at the excitation wavelength or at a wider spectrum, these labile interfering species may be driven into non-fluorescent states, lowering the baseline intensity before the data collection begins and thereby enhancing contrast. This approach may be particularly valuable when the assay includes lipofuscin, plant samples containing chlorophyll, or live-cells, or the like.

[0095] In some embodiments, selection of excitation wavelengths for background reduction may require careful consideration of specific fluorophore properties, since photobleaching rates depend on multiple factors including photon energy, molecular structure, and environmental conditions, rather than following simple wavelength-dependent rules.

[0096] Calibration may be needed for background-reduction photobleaching. Pilot experiments on sacrificial samples may be used to determine the light dose that may suppresses background yet retains sufficient probe fluorescence for downstream imaging. Combining mild photobleaching with chemical quenchers (e.g., copper sulfate or Sudan Black B for lipofuscin-rich specimens) may provide additive benefits. Possible illuminating devices include but are not limited to: broad-spectrum white or blue-dominant LED arrays, near-UV / visible mercury or xenon lamps.

[0097] In some embodiments, with a photobleaching step as disclosed herein, the FRET detection method of the present disclosure (either antibody-based or nucleic acid molecule-based detection method) can comprise a limit of detection (LOD) of no more than 100 pg / mL, 90 pg / mL, 80 pg / mL, 70 pg / mL, 60 pg / mL, 50 pg / mL, 40 pg / mL, 30 pg / mL, 20 pg / mL, 10 pg / mL, 9 pg / mL, 8 pg / mL, 7 pg / mL, 6 pg / mL, 5 pg / mL, 4 pg / mL, 3 pg / mL, 2 pg / mL, or 1 pg / mL for the target molecule (either a protein target or a nucleic acid target) . An example of calculating LOD can be found in Example 5.4. The term “limit of detection” or LOD, as used herein, generally refers to 3 × SDblank / slope in a graph plotted by relative fluorescence unit (RFU) vs concentration of the target molecule, where SDblank represents RFU in the absence of the target molecule, and slope represents the gradient of the line RFU vs. concentration of the target molecule.

[0098] In some embodiments, the FRET detection method of the present disclosure with a photobleaching step (either antibody-based or nucleic acid molecule-based method) can comprise an improved limit of detection (LOD) when compared with a corresponding FRET detection method without a photobleaching step. In some embodiment, the improved LOD with the photobleaching step is about at least 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, or 20%better than the LOD without the photobleaching step. In some embodiment, the improved LOD with the photobleaching step is about 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, or 20%better that the LOD without the photobleaching step. In some embodiment, the improved LOD with the photobleaching step is from about 5%to about 20%, from about 5%to about 18%, from about 5%to about 16%, from about 5%to about 14%, from about 5%to about 12%, from about 7%to about 20%, from about 7%to about 18%, from about 7%to about 16%, from about 7%to about 14%, from about 7%to about 12%, from about 9%to about 20%, from about 9%to about 18%, from about 9%to about 16%, from about 9%to about 14%, from about 9%to about 12%, from about 11%to about 20%, from about 11%to about 18%, from about 11%to about 16%, from about 11%to about 14%, or from about 11%to about 12%, better than the LOD without the photobleaching step.

[0099] Probe Arrays

[0100] As described herein, the terms “array” and “microarray” can be used interchangeably. A probe array may comprise a surface having a plurality of probes attached thereto, where the array can be used for the real-time measurement and / or detection of the presence, amount, concentration, and / or binding characteristics of multiple analytes (e.g., amplicons or antigens or target proteins) . In some cases, one or more probes may be located on a plurality of discrete, isolated and independently addressable locations. In some embodiments, the probes can be antibodies. In some embodiments, the probes can be nucleic acid molecules.

[0101] In some cases, the method disclosed here may detect small amount of target molecules (e.g., nucleic acid molecules) without amplifying the target molecules to increase the amount of detectable targets. The disclosed method can exhibit high sensitivity for a nucleic acid-based detection method due to its low level of limit of detection (LOD) of the target nucleic acid. Thus, amplification of the target nucleic acid molecule before the detection may be optional. In some cases, the array may be incorporated into the reaction chamber in which the amplification reaction or antibody-antigen binding reaction takes place. The array may be part of the wall or base of the chamber. The array may mate with other components, forming a seal, and creating a reaction chamber for carrying out the amplification reaction or the antibody-antigen binding reaction

[0102] In some embodiments, the probes disclosed herein can be solution-based and free flowing in the solution. In some embodiments, some of the probes can be immobilized to a substrate. The substrate may be solid or semi-solid. The substrate may be biological, non-biological, organic, inorganic, or a combination of any of these, existing as a form of particles, strands, precipitates, gels, sheets, tubing, spheres, containers, capillaries, pads, slices, films, plates, slides, semiconductor integrated chips, etc. The substrate may take on any surface configurations (e.g., flat) . For example, the substrate may contain raised or depressed regions on which synthesis or deposition may take place. In some cases, the substrate may be chosen to provide appropriate light-absorbing characteristics. For example, the substrate may be a polymerized Langmuir Blodgett film, functionalized glass, Si, Ge, GaAs, Gap, SiO2, SiN4, modified silicon, or any one of a variety of gels or polymers such as (poly) tetrafluoroethylene, (poly) vinylidenedifluoride, polystyrene, polycarbonate, or combinations thereof.

[0103] The substrate may be a homogeneous solid and / or unmoving mass with dimensions much larger than the probes. In some cases, the probes may be confined and / or immobilized within a certain distance of the substrate. The mass of the substrate may be at least 100 times larger than that of the probe. The surface of the substrate may be planar or non-planar. Examples of non-planar substrates may include spherical magnetic beads, spherical glass beads, and solid metal and / or semiconductor and / or dielectric particles. In cases where the substrate comprises a planar surface, the roughness of the surface may vary. In some cases, the roughness of the substrate surface may be less than or equal to about 1000 nanometers (nm) , 750 nm, 500 nm, 250 nm, 100 nm, 90 nm, 80 nm, 70 nm, 60 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm, 20 nm, 10 nm, 5 nm, 1 nm, 0.75 nm, 0.5 nm, 0.25 nm, 0.1 nm, 0.05 nm, 0.25 nm, 0.01 nm, 0.005 nm, or 0.001 nm. In some cases, the surface of the substrate may have a roughness greater than or equal to about 0.0001 nm, 0.0005 nm, 0.001 nm, 0.005 nm, 0.01 nm, 0.05 nm, 0.1 nm, 0.5 nm, 1 nm, 5 nm, 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, or 500 nm. In some cases, the roughness of the substrate surface may be between nay of the two values described herein, for example, about 75 nm.

[0104] The substrate can be optically clear, allowing transmission of the light through the substrate, and excitation and / or detection to occur as the light passing through the substrate. The substrate can also be translucent or opaque. In some cases, the substrate can be reflective, allowing for light to pass through the surface layer containing probes and reflect back to a detector.

[0105] In some cases, the array may be incorporated into the reaction chamber in which the amplification reaction or antibody-antigen binding reaction takes place. The array may be part of the wall or base of the chamber. The array may mate with other components, forming a seal, and creating a reaction chamber for carrying out the amplification reaction or the antibody-antigen binding reaction.

[0106] The substrate can be made of various materials. Non-limiting examples of materials may include silica, silicon, plastic, glass, metal, metal-alloy, nanopore, polymer, and nylon. Surface of the substrate can be treated with a layer of chemicals prior to attaching probes to enhance the binding and / or to inhibit non-specific binding during use. For example, the substrate may comprise glass slide, which can be coated with self-assembled monolayer (SAM) coatings, such as coatings of as aminoalkyl silanes, or of polymeric materials, such as acrylamide and proteins. A variety of can be used, for example,   (Surmodics) ,   (Mosaic Technologies) ,  (Schleicher and Schuell) ,  and  (CEL Technologies) .

[0107] Probes may be associated with, attached to, or bonded to the substrate. The association, attachment or bonding of the probes may be reversible or irreversible. The association, attachment or bonding of the probes may be chemical, biological, or biochemical. In some cases, the probes may be associated with, attached to or bonded with the substrate via a linker. The linker may be any type of molecules (chemical or biological) that can link the probes with the substrate. In some cases, the linker can be a chemical bond. For example, the probes can be attached covalently to the surface of the substrate.

[0108] A number of different chemical surface modifiers can be added to substrates to attach the probes to the substrates. Examples of chemical surface modifiers may include, but not limited to, N-hydroxy succinimide (NHS) groups, amines, aldehydes, epoxides, carboxyl groups, hydroxyl groups, hydrazides, hydrophobic groups, membranes, maleimides, biotin, streptavidin, thiol groups, nickel chelates, photoreactive groups, boron groups, thioesters, cysteines, disulfide groups, alkyl and acyl halide groups, glutathiones, maltoses, azides, phosphates, phosphines, and combinations thereof. In one cases, substrate surfaces reactive towards amines may be utilized. Examples of such surfaces may include NHS-esters, aldehyde, epoxide, acyl halide, and thio-ester. Molecules (e.g., proteins, peptides, and glycopeptides) with free amine groups may react with such surfaces to form covalent bond with the surfaces. Nucleic acid probes with internal or terminal amine groups can also be synthesized, (e.g., from IDT or Operon) and bound (e.g., covalently or non-covalently) to surfaces using similar chemistries.

[0109] Surface of the substrate may or may not be reactive towards amines. In cases where an amine-reactive substrate is needed, the substrate surface may be converted into amine-reactive substrates with coatings. Non-limiting examples of coatings may include amine coatings (which can be reacted with bis-NHS cross-linkers and other reagents) , thiol coatings (which can be reacted with maleimide-NHS cross-linkers, etc. ) , gold coatings (which can be reacted with NHS-thiol cross linkers, etc. ) , streptavidin coatings (which can be reacted with bis-NHS cross-linkers, maleimide-NHS cross-linkers, biotin-NHS cross-linkers, etc. ) , BSA coatings (which can be reacted with bis-NHS cross-linkers, maleimide-NHS cross-linkers, etc. ) , or combinations thereof. Alternatively, in some cases, the probes, rather than the substrate, can be reacted with specific chemical modifiers to make them reactive to the respective surfaces.

[0110] A number of multi-functional cross-linking agents can be used to convert the chemical reactivity of one type of surface to another. The agents can be homo-functional or hetero-functional. The agents can be bi-functional, tri-functional, or tetra-functional, for example, a bi-functional cross-linking agent X-Y-Z, with X and Z being two reactive groups, and Y being a connecting linker. Further, if X and Z are the same group, such as NHS-esters, the resulting cross-linker, NHS-Y-NHS, is a homo-bi-functional cross-linker and may connect an amine surface with amine-group-containing molecules (to immobilize them) . For example, if X is NHS-ester and Z is a maleimide group, the resulting cross-linker, NHS-Y-maleimide, is a hetero-bi-functional cross-linker and may link an amine surface (or a thiol surface) with thio-group (or amino-group) containing probes. Examples of such agents may include, but not limited to NHS-esters, thio-esters, alkyl halides, acyl halides (e.g., iodoacetamide) , thiols, amines, cysteines, histidines, di-sulfides, maleimide, cis-diols, boronic acid, hydroxamic acid, azides, hydrazines, phosphines, photoreactive groups (e.g., anthraquinone, benzophenone) , acrylamide (e.g., acrydite) , affinity groups (e.g., biotin, streptavidin, maltose, maltose binding protein, glutathione, glutathione-S-transferase) , aldehydes, ketones, carboxylic acids, phosphates, hydrophobic groups (e.g., phenyl, cholesterol) , and combinations thereof. Such cross-linkers can be reacted with the surface or with the probes or with both, in order to conjugate a probe to a surface.

[0111] Additionally or alternatively, a substrate may include thiol reactive surfaces such as acrylate, maleimide, acyl halide and thio-ester surfaces. Such surfaces can covalently link proteins, peptides, glycopeptides, etc., via a thiol group. Nucleic acid probes containing pendant thiol-groups can also be easily synthesized.

[0112] Various alternative surface modification techniques may be utilized in the present disclosure, for example, photo-crosslinkable surfaces and thermally cross-linkable surfaces. Examples of such techniques may include Mosiac Technologies (Waltham, Mass. ) , ExiqonTM(Vedbaek, Denmark) , Schleicher and Schuell (Keene, N. H. ) , SurmodicsTM (St. Paul, Minn. ) , XenoporeTM (Hawthorne, N. J. ) , Pamgene (Netherlands) , Eppendorf (Germany) , Prolinx (Bothell, Wash. ) , Spectral Genomics (Houston, Tex. ) , and CombimatrixTM (Bothell, Wash. ) .

[0113] Various materials may be used to fabricate the surface of the substrate. Exemplary materials may include glass, metal (e.g., gold, silicon, copper, titanium, and aluminum) , metal oxides (e.g., titanium oxide, iron oxide) , silicon-based material (e.g., silicon, silica) , plastics, polymer (e.g., polystyrene, polyethylene, polypropylene) , zeolites, and combinations thereof. In some cases, the devices and systems provided herein may comprise LED (Light Emitting Diode) and OLED (Organic Light Emitting Diode) surfaces. An array of LEDs or OLEDs can be used at the base of a probe array. Such systems may be advantageous since they provide easy optoelectronic methods of result readout. In some cases, the results can be read-out using a naked eye.

[0114] The probes in the present disclosure may or may not be labeled with a reporter molecule. The reporter molecule can be bound to the probe by various methods, such as hybridization. In some cases, specific labels can be attached to the probes within the addressable locations, in addition to the labels that are incorporated. In such systems, captured targets can result in two labels coming into intimate proximity with each other in the location. This interaction between labels can create unique detectable signals. For example, when the labels on the target and probe, respectively, are fluorescent donor and acceptor moieties that can participate in a fluorescent resonance energy transfer (FRET) phenomenon, FRET signals can be detected. However, in some cases the interaction is not FRET.

[0115] In some cases, the analyte (e.g., dNTPs or detection antibodies) in the reaction mixture is labeled with a first type of reporter molecule and the surface of an array is labeled with a second type of report molecule, wherein the second type of report molecule is not linked to or associated with the probe (e.g., a surface bound reporter molecule) . Binding of the analyte to the probe will bring two types of reporter molecules into close proximity and therefore results in a change of the signals (e.g., an increase or a decrease) detected from the surface of the array or the reaction mixture. Such signal change may then be used to, e.g., determine a presence or absence of the analyte. For example, the analyte and the array surface may be labeled with a quencher and a light-emitting reporter molecule (e.g., a fluorophore) , respectively, and the fluorescence from the fluorophore on the surface is quenched (or reduced) upon binding of the analyte to the probe. While the quencher does not emit a light signal, there is no signal from the reaction mixture (or solution) interfering with the signal from the array, which then substantially diminishes the noise at the array surface and enables the real-time measurement of signals at the array surface. Alternatively, in some examples, quenching moieties (e.g., quenchers) are attached to the array surface and the analyte is tagged with a light-emitting reporter (e.g., a fluorescent label) . Upon binding of the analyte to the surface-bound probe, a decrease of fluorescent signals from the reaction mixture can be detected.

[0116] Time-resolved fluorophores may be used as labels for the detection of probes in a sandwich assay. Non-limiting examples include Western Blots, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) , Enzyme-Linked Immuno SPOT (ELISPOT) , FluoroSpot assay, protein arrays, or any combination thereof. In sandwich assays, the time-resolved fluorophores may be used as a direct method for detection, in which the fluorophore is conjugated to a primary detection antibody. Alternatively, or in addition to, the time-resolved fluorophore may be used as an indirect method for detection, for example, the fluorophore may be conjugated to a secondary antibody. ELISPOT assays may be used to quantitatively measure the frequency of cytokine secretion for a single cell. The ELISASPOT assay may be a form of immunostaining that uses antibodies to detect an analyte, including but not limited to, any biological or chemical substance (e.g., protein analytes or chemical analytes) . FluoroSpot assays may use fluorescence to analyze multiple analytes, for example, by detecting the secretion of more than one type of protein or other analytes.

[0117] Time-resolved fluorophores may be used as labels in cell sorting, counting, or detecting methods. An example may be flow cytometry, in chick cells may be labeled with a fluorophore. For example, cells may be sorted and counted by their fluorescence profiles. Alternatively, or in addition to, the specific cellular characteristics or functions may be identified by their fluorescence profiles.

[0118] Time-resolved fluorophores may be used in application where solid-phase and immobilized capture probes are labeled. An example may include inverse fluorophore assays. Time-resolved fluorophores may be used in assays in which chemical reactions may be monitored while a target analyte is introduced a reacting reagent. The target molecule or the reacting reagent may include time-resolved fluorophores. Examples may include, but are not limited to, Sanger Sequencing and Next Generation Sequencing (NGS) assays such as sequence-by-synthesis (SBS) , and pyrosequencing. Further examples may include FRET sandwich ELISA.

[0119] Sample Containers

[0120] In some embodiment, the sample container to hold the solution of the sample to be analyzed is a cuvette. In some embodiments, other containers are of acceptable receptacle, container or vessel geometries. Thus, the assays can be conducted in a tube, vial, dish, flow cell, cassette, cartridge, microfluidic chip, and any other similar type of containers. In other embodiments, the container can be composed of a plethora of materials, in any shape and of any type. Therefore, the assay format may also be applied to a flattened plastic or glass cassette or cartridge in which assay components might be magnetically pulled along a channel or path by an external magnet. Hence, several embodiments or geometries for the assay vessel are envisioned, including cuvettes having a translucent or open surface area pervious to irradiation at the exciting wavelength so as to enable a fluorescent assay. For example, the cuvette translucent surface area, may be formed as a square, rectangular, round, oval, or flat container, beads, vial, tube, cylinder, cassette, or cartridge. The preferred embodiment is a multiwall microtiter plate.

[0121] In embodiments, the receptacle comprises: a cuvette, multiwell plate, tube, flask, disk, beads, vial, cassette, flow cell, cartridge, microfluidic chip or combinations thereof, which permit irradiation at the wavelength of the donor fluorophore and measurement at the wavelength of the acceptor fluorophore.

[0122] In embodiments, the methods and assays described herein are provided in a high-throughput screening assay format. The benefits of such formats are easily identifiable, such as for example, screening of large patient samples for diagnostic or prognostic purposes, screening for new drugs, research, and the like.

[0123] Detection System

[0124] Also provided herein is a detection system having at least one detector that is configured to capture, detect and / or monitor signals from the array. Various signals may be produced, such as optical or electromagnetic signals. The signals may be correlated with the presence, amount, concentration, and / or binding characteristics of one or more species (e.g., primers, amplicons, nucleic acid sequences, reporter molecules, polymerases, dNTPs, antigens, peptides, proteins, or any other analytes and reagents) . The signals can be reflective or indicative of the progress of one or more reactions (e.g., PCR amplification or antigen binding reaction) . The signals can be detected at a single time point or multiple time points, or in real-time.

[0125] The detection system may comprise a single detector or a plurality of detectors (e.g., an array of detector) . The detector (s) may be fixed or movable. The detectors may scan the probe array such that a given detector detects signals from different addressable locations of the array during the reaction process. In cases where a plurality of detectors is comprised in the detection system, the number of detectors may correspond to the same independently addressable locations contained in a probe array. For example, a fixed detector array may be used, wherein each of the detectors may correspond to an individual addressable location of a probe array. Any number of detectors may be utilized in the detection system as provided herein, for example, about 1, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 7,500, 10,000, 25,000, 50,000, 75,000, 100,000, 250,000, 500,000, 750,000, or 1,000,000 detectors. The detectors may be comprised in the integrated sensors of the sensor array. Depending upon the type of singles to be detected, various types of detectors may be used, for example, optical detectors, electrical detectors, electrochemical detectors, or electrostatic detectors. Examples of optical detectors may include but not limited to charge-coupled device (CCDs) arrays (including cooled CCDs) , complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) imagers, n-type metal-oxide semiconductor (NMOS) , active-pixel sensors (APS) , or photomultiplier tubes (PMTs) . The detectors can also include wavelength-selective components such as optical filters to allow measurement of selective wavelengths. Examples of other detectors may include electrodes.

[0126] The detector can sample (e.g., acquire measurements) at a rate of at least about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 400, 500, 1000, 10, 000, or 100, 000 times per minute. The detector can sample at a rate of at least about 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, or 120 Hz.

[0127] The detection system can comprise a light source. The light source can comprise at least one lamp, such as an incandescent, halogen, fluorescent, gas-discharge, arc, or light emitting diode (LED) . The light source can comprise a laser. The light source can produce a specific wavelength or range or wavelengths, such as UV. The light source can comprise filters for controlling the output wavelength or wavelengths. The light source can comprise multiple light sources, of the same or of different types, which can be used separately or in combination.

[0128] The detector can comprise various optical elements, including but not limited to filters, lenses, collimators, mirrors, reflectors, beam splitters, and diffusers. The detector can comprise a filter or a plurality of filters, including but not limited to wavelength filters (e.g., color filters, UV filters, IR filters) , dichroic filters, and polarizing filters. The filters can comprise multiple filters, of the same or of different types, which can be used separately or in combination. The detector can comprise elements (e.g., signal processing unit) for removing image distortion or aberration, such as barrel or fisheye distortion, pincushion distortion, mustache distortion, monochromatic aberrations (e.g., piston, tilt, defocus, spherical aberration, coma, astigmatism, field curvature, image distortion) , or chromatic aberrations (e.g., axial, longitudinal, lateral, transverse) . Such elements can comprise computer systems programmed to implement instructions for partially or fully correcting image distortion. For example, Brown’s distortion model or the Brown-Conrady model can be used to correct for radial distortion and tangential distortion. In some examples, the detector can measure emitted photons coming from individual addressable locations. These photons can be correlated to the presence and / or activity of reporter molecules in that location.

[0129] In some cases, signals that signify hybridization reactions are only generated at, and are confined to the pixels of the addressable array while the reaction volume which includes all the targets creates minimum background optical signal. This unique characteristic not only improve the detectable signal-to-interference (or signal-to-noise) , but also enables multiplexing capabilities as the pixel-level measurements remains independent of one another. This is despite the fact that the reaction chamber and aqueous sample is shared among all of them.

[0130] Fluorescent analysis can be carried out using, for example, a photon counting epifluorescent microscope system (containing the appropriate dichroic mirror and filters for monitoring fluorescent emission at the particular range) , a photon counting photomultiplier system, or a fluorimeter. Excitation to initiate energy transfer, or to allow direct detection of a fluorophore, can be carried out with an argon ion laser, a high intensity mercury (Hg) arc lamp, a xenon lamp, a fiber optic light source, or other high intensity light source appropriately filtered for excitation in the desired range.

[0131] Computer Systems

[0132] The present disclosure provides computer systems that are programmed to implement methods of the disclosure. Any step of the methods disclosed herein can be executed by one or more computer systems. FIG. 5 shows a computer system 501 that is programmed or otherwise configured to implement the methods described herein, e.g., methods for detecting a presence or absence of an analyte. The computer system 501 can regulate various aspects of excitation light generation, acquisition of output signal, and signal processing of the present disclosure, such as, for example, generating pulsed excitation light for the detection of a presence or absence of an analyte. The computer system 501 part of a system configured for detection of an analyte. The computer system may be integrated with the detection system. Alternatively, or in addition to, the computer system may be an external computer system coupled to the detection system via wired connection or wireless connection (e.g., Wi-Fi or Bluetooth connection) .

[0133] The computer system 501 includes a central processing unit (CPU, also “processor” and “computer processor” herein) 505, which can be a single core or multi core processor, or a plurality of processors for parallel processing. The computer system 501 also includes memory or memory location 510 (e.g., random-access memory, read-only memory, flash memory) , electronic storage unit 515 (e.g., hard disk) , communication interface 520 (e.g., network adapter) for communicating with one or more other systems, and peripheral devices 525, such as cache, other memory, data storage and / or electronic display adapters. The memory 510, storage unit 515, interface 520 and peripheral devices 525 are in communication with the CPU 505 through a communication bus (solid lines) , such as a motherboard. The storage unit 515 can be a data storage unit (or data repository) for storing data. The computer system 501 can be operatively coupled to a computer network ( “network” ) 530 with the aid of the communication interface 520. The network 530 can be the Internet, an internet and / or extranet, or an intranet and / or extranet that is in communication with the Internet. The network 530 in some cases is a telecommunication and / or data network. The network 530 can include one or more computer servers, which can enable distributed computing, such as cloud computing. The network 530, in some cases with the aid of the computer system 501, can implement a peer-to-peer network, which may enable devices coupled to the computer system 501 to behave as a client or a server.

[0134] The CPU 505 can execute a sequence of machine-readable instructions, which can be embodied in a program or software. The instructions may be stored in a memory location, such as the memory 510. The instructions can be directed to the CPU 505, which can subsequently program or otherwise configure the CPU 505 to implement methods of the present disclosure. Examples of operations performed by the CPU 505 can include fetch, decode, execute, and writeback.

[0135] The CPU 505 can be part of a circuit, such as an integrated circuit. One or more other components of the system 501 can be included in the circuit. In some cases, the circuit is an application specific integrated circuit (ASIC) .

[0136] The storage unit 515 can store files, such as drivers, libraries and saved programs. The storage unit 515 can store user data, e.g., user preferences and user programs. The computer system 501 in some cases can include one or more additional data storage units that are external to the computer system 501, such as located on a remote server that is in communication with the computer system 501 through an intranet or the Internet.

[0137] The computer system 501 can communicate with one or more remote computer systems through the network 530. For instance, the computer system 501 can communicate with a remote computer system of a user (e.g., laboratory technician, researcher, etc. ) . Examples of remote computer systems include personal computers (e.g., portable PC) , slate or tablet PC’s (e.g.,  iPad,  Galaxy Tab) , telephones, Smart phones (e.g.,  iPhone, Android-enabled device,  ) , or personal digital assistants. The user can access the computer system 501 via the network 530.

[0138] Methods as described herein can be implemented by way of machine (e.g., computer processor) executable code stored on an electronic storage location of the computer system 501, such as, for example, on the memory 510 or electronic storage unit 515. The machine executable or machine readable code can be provided in the form of software. During use, the code can be executed by the processor 505. In some cases, the code can be retrieved from the storage unit 515 and stored on the memory 510 for ready access by the processor 505. In some situations, the electronic storage unit 515 can be precluded, and machine-executable instructions are stored on memory 510.

[0139] The code can be pre-compiled and configured for use with a machine having a processer adapted to execute the code, or can be compiled during runtime. The code can be supplied in a programming language that can be selected to enable the code to execute in a pre-compiled or as-compiled fashion.

[0140] Aspects of the systems and methods provided herein, such as the computer system 501, can be embodied in programming. Various aspects of the technology may be thought of as “products” or “articles of manufacture” typically in the form of machine (or processor) executable code and / or associated data that is carried on or embodied in a type of machine readable medium. Machine-executable code can be stored on an electronic storage unit, such as memory (e.g., read-only memory, random-access memory, flash memory) or a hard disk. “Storage” type media can include any or all of the tangible memory of the computers, processors or the like, or associated modules thereof, such as various semiconductor memories, tape drives, disk drives and the like, which may provide non-transitory storage at any time for the software programming. All or portions of the software may at times be communicated through the Internet or various other telecommunication networks. Such communications, for example, may enable loading of the software from one computer or processor into another, for example, from a management server or host computer into the computer platform of an application server. Thus, another type of media that may bear the software elements includes optical, electrical and electromagnetic waves, such as used across physical interfaces between local devices, through wired and optical landline networks and over various air-links. The physical elements that carry such waves, such as wired or wireless links, optical links or the like, also may be considered as media bearing the software. As used herein, unless restricted to non-transitory, tangible “storage” media, terms such as computer or machine “readable medium” refer to any medium that participates in providing instructions to a processor for execution.

[0141] Hence, a machine readable medium, such as computer-executable code, may take many forms, including but not limited to, a tangible storage medium, a carrier wave medium or physical transmission medium. Non-volatile storage media include, for example, optical or magnetic disks, such as any of the storage devices in any computer (s) or the like, such as may be used to implement the databases, etc. shown in the drawings. Volatile storage media include dynamic memory, such as main memory of such a computer platform. Tangible transmission media include coaxial cables; copper wire and fiber optics, including the wires that comprise a bus within a computer system. Carrier-wave transmission media may take the form of electric or electromagnetic signals, or acoustic or light waves such as those generated during radio frequency (RF) and infrared (IR) data communications. Common forms of computer-readable media therefore include for example: a floppy disk, a flexible disk, hard disk, magnetic tape, any other magnetic medium, a CD-ROM, DVD or DVD-ROM, any other optical medium, punch cards paper tape, any other physical storage medium with patterns of holes, a RAM, a ROM, a PROM and EPROM, a FLASH-EPROM, any other memory chip or cartridge, a carrier wave transporting data or instructions, cables or links transporting such a carrier wave, or any other medium from which a computer may read programming code and / or data. Many of these forms of computer readable media may be involved in carrying one or more sequences of one or more instructions to a processor for execution.

[0142] The computer system 501 can include or be in communication with an electronic display 535 that comprises a user interface (UI) 540 for providing, for example, operating parameters of the system, system status, or outputs of methods described elsewhere herein. Examples of UI’s include, without limitation, a graphical user interface (GUI) and web-based user interface.

[0143] Methods and systems of the present disclosure can be implemented by way of one or more algorithms. An algorithm can be implemented by way of software upon execution by the central processing unit 505. The algorithm can, for example, process output signals for determination of a presence or absence of an analyte.

[0144] Examples

[0145] Example 1.

[0146] Below is an example procedure according to the present disclosure:

[0147] (a) Photobleach:

[0148] Wavelength: from about 375 nm to about 780 nm. A white light can be used for the photobleaching step.

[0149] Power: from about 0.5 W to about 50 W, with the light focused on the solution sample.

[0150] Time period: From about 2 minutes to about 5 minutes, from about 5 minutes to about 10 minutes, from about 10 minutes to about 20 minutes, from about 20 minutes to about 30 minutes, from about 30 minutes to about 40 minutes, from about 40 minutes to about 50 minutes, and from about 50 minutes to about 60 minutes. This can be determined by checking the changes of fluorescence intensity after the photobleaching over time.

[0151] (b) Excitation

[0152] Wavelength: The wavelength depends on the donor reporter molecule on the probe.

[0153] Power: from about 0.5 W to about 50 W.

[0154] (c) Reporter molecules

[0155] The FRET pair can be selected from available FRET pairs. The solution-phase donor / acceptor probe concentrations can be from about 100 nmol / mL (nM) to about 10 mmol / mL (mM) .

[0156] The solution-phase capture antibody (for example, in some Sandwich ELISA) can be from about 10 nM to about 1 mM.

[0157] Example 2.

[0158] In this example, two oligonucleotide probes (e.g., probe 1: 5’ -CTGAT TAGAG AGAGA A-TAMRA-3’ (SEQ ID NO: 1) , and probe 2: 5’ -TET-ATGTC TGAGC TGCAG-3’ (SEQ ID NO: 2) ) , each containing a fluorescent moiety (together forming a FRET pair) , can hybridize to a target nucleic acid molecule (e.g., 3’ -GACTA ATCTC TCTCT TACAG GCACT ACAGA CTCGA CGTCC-5’ (SEQ ID NO: 3) ) at particular positions determined by the complementarity of probe 1 and probe 2 to the target nucleic acid molecule sequence. The target nucleic acid can be an amplification product. Each of probe 1 and probe 2 can be labeled with a fluorescent moiety of a FRET pair (e.g., the donor dye can be Europium isothiocyanate (Eu-ITC) chelate; the acceptor dye can be Alexa Fluor NHS ester, each dye may have a linker to the oligonucleotide; the linker can be independently C4-C6 alkyl linker or C4-C6 alkoxy linker, or the like; and these probes can be ordered from providers such as Integrated DNA Technologies (IDT) , Sigma Aldrich (Merck) , etc. The probes are generally designed to hybridize in close proximity to each other when both hybridized to the target nucleic acid molecule. In some embodiments, the FRET pair can be a time-resolved FRET (TR-FRET) system, which can leverages the long-lived fluorescence of lanthanide chelates (like europium) and the brightness and spectral diversity of Alexa Fluor dyes. In some cases, a donor fluorescent moiety, for example, fluorescein, is excited at 470 nm by the light source of the  Instrument. During FRET, the fluorescein transfers its energy to an acceptor fluorescent moiety such as 640 (LC Red 640) or 705 (LC Red 705) . The acceptor fluorescent moiety then emits light of a longer wavelength, which is detected by the optical detection system of the instrument. Efficient FRET can only take place when the fluorescent moieties are in direct, local proximity and when the emission spectrum of the donor fluorescent moiety overlaps with the absorption spectrum of the acceptor fluorescent moiety.

[0159] Using the conditions described in Example 1, after photobleaching, upon hybridization of the probe 1 and probe 2 to the amplification product at the appropriate positions, a FRET signal is generated. Hybridization temperatures can range from about 35 ℃, to about 65 ℃, for about 10 sec to about 1 min.

[0160] Example 3.

[0161] In this experiment, a 560 nm excitation LED is used to excite a blood serum sample and autofluorescence is detected in the 500-650 nm wavelength range with or without photobleaching. The photobleaching is done by using a 60W white light source to bleach the blood serum sample for about 5 minutes, after which the 560 nm excitation LED is used to excite the same blood serum sample.

[0162] The light transmissivity of serum sample under 560 nm excitation LED without a photobleaching step shows a peak at about 551 nm, with significant light coming through from about 510 nm to about 550 nm, which is likely to elicit some autofluorescence from about 550 nm to about 600 nm.

[0163] The light transmissivity of serum sample under 560 nm excitation LED after a photobleaching step (60W white light for about 5 minutes) is recorded as well. To demonstrate the differences in light transmissivity with or without photobleaching, FIG. 6 shows the relative light intensity (counts at each wavelength / peak count) under 560 nm excitation after the photobleaching, minus relative light intensity under 560 nm excitation without photobleaching. A positive value from about 500 nm to about 550 nm might indicate increased light transmissivity; a negative value at longer wavelengths (>550 nm) might indicate reduced autofluorescence.

[0164] Experiment 4.

[0165] In this experiment, two samples are radiated with white light having different power. A 60W white light source and a 30W white light source are used to bleach two similar blood serum samples, respectively, for 5 minutes; then a 560 nm excitation LED is used to excite both samples to detect autofluorescence in the 500-650 nm wavelength range, respectively, to compare the effect of photobleaching power on noise reduction.

[0166] FIG. 7 shows the comparison between using 30W white light and using 60W white light to photobleach a blood serum sample. A 560 nm excitation light is used to elicit autofluorescence from about 504 nm to about 610 nm. The normalized count difference between without photobleaching and with photobleaching is calculated at follows: (Count without bleaching –Count with bleaching)  /  (Count without bleaching + Count with bleaching) . The dashed line indicates the normalized count difference under 30W white light source, and the solid line indicates the normalized count difference under 60W white light source. The 60W bleaching white light shows a reduced autofluorescence from about 520 nm and at other longer wavelengths.

[0167] Experiment 5.

[0168] Background: This experiment is to test the effects of photobleaching ( “PB” ) on background noise. A pair of donor –acceptor dyes was selected: the donor is Europium-isothiocyanate (Eu-ITC) chelate; the acceptor is Alexa Fluor 647 NHS ester. The acceptor dye’s peak fluorescent emission frequency is 665 nm. The presence of background noise (optical intensity) in the absence of antigen / antibody complex or dye at the 665 + / -10 nm detection window was expressed as a percentage of the emission at the peak excitation wavelength window.

[0169] The noise in the absence of the donor dye and acceptor dye may have three main sources:

[0170] (1) The excitation light source directly emits residual photons in the 665 + / -10 nm detection window.

[0171] (2) The fluorescent emission from certain molecular species in plasma or serum.

[0172] (3) The thermal emission from the sample or vial or container.

[0173] When donor and acceptor dyes are present, there may be an additional sources of noise in the detection window:

[0174] The fluorescent emission from the donor observed in the detection window. Although the optical density of the donor emission is very low at the wavelengths within the detection window, the sheer number of donor molecules is typically many times larger than that of the antigen molecules. Therefore, the noise from this source cannot be omitted.

[0175] About liquid sample transparency: The photobleaching may increase the transparency of the liquid sample, thus increasing the number of photons for the entire spectra of the excitation light source, including those within the 665 + / -10 nm.

[0176] Procedure: All photobleaching procedures are performed as follows: a 30W white light source is focused on the sample / container for 10 min. The photo counts at the selected wavelength windows are recorded at different time points. Throughout these photobleaching experiments the relative fluorescence units (RFU) at the detection window (e.g., 665 + / -10 nm) is defined as the photon counts (pdetection) at the detection window (665 + / -10 nm) divided by the photo counts (pexcitation) at the excitation light source peak emission window (e.g., 490 + / -10 nm or 560 + / -10 nm) .

[0177] for example,  or

[0178] where p665, p560, and p490 are the photon counts measured by the instrument at 665 + / -10 nm, 560 + / -10 nm, and 490 + / -10 nm respectively.

[0179] Results:

[0180] Experiment 5.1. Background noise detection.

[0181] A sample of water is excited under 490 nm or 560 nm, and the optical intensity at 665 nm is measured. The relative fluorescence unit (RFU) is defined as the ratio of optical intensity at 665 nm to the optical density at 490 nm or 560 nm, respectively.

[0182] Conclusion: The RFU under 560 nm excitation is approximately 6× the RFU under 490 nm excitation.

[0183] Experiment 5.2. Background noise and liquid sample transparency in plasma.

[0184] RSU under 490 nm Excitation (FIG. 8) :

[0185] Before Bleaching: 0.00323 + / -0.00013

[0186] After Bleaching: 0.00291 + / -0.00015

[0187] 30 min after Bleaching: 0.00291 + / -0.00019

[0188] 85 min after Bleaching: 0.00285 + / -0.00009

[0189] 17 hr after Bleaching: 0.00275 + / -0.00006

[0190] As shown in FIG. 8, photobleaching reduces the RFU under 490 nm by approximately 10%. At the 30 min, 85 min, and 17 hr time points after the photobleaching, the RFU under 490 nm remained stable at about 0.00028. The slight decrease observed over time may be due to the reduced thermal emission from the sample and the sample container at lower temperatures (the photobleaching has a heating effect on the sample and container, and then they cooled down) .

[0191] RSU under 560 nm Excitation:

[0192] Before Bleaching: 0.01619 + / -0.00008

[0193] After Bleaching: 0.01712 + / -0.00033

[0194] 30 min after Bleaching: 0.01693 + / -0.00008

[0195] 85 min after Bleaching: 0.01652 + / -0.00017

[0196] 17 hr after Bleaching: 0.01572 + / -0.00031

[0197] When compared to the results from 490 nm excitation, the RFU under 560 nm is increased by approximately 6× (similar to the results obtained in Experiment 5.1) . Because 560 nm excitation is closer to the 665 nm detection window than 490 nm excitation, and the “leakage” from the 560 nm excitation to the 665 nm detection window is higher than that of the 490 nm excitation. In addition, photobleaching results in a slight increase in RFU under 560 nm immediately after photobleaching. Without being bound to any particular theory, these results may be due to three competing factors: (1) the photobleaching –may induce an increase in transparency and result in more photon counts from the excitation light source; (2) the heating effect of photobleaching may further increase the thermal emission observed at the detection window; and (3) the photobleaching may remove the fluorescent emission from some molecular species observed at the detection window. An overnight waiting period (17 hr) may remove Factor (2) and drive the RFU at the detection window back to pre-bleaching levels, but Factors (1) and (3) remain in effect.

[0198] Without being bound to any particular theory, the photobleaching-induced increase in transparency and reduction in fluorescent emission from the samples may appear to be permanent and sustained, and the temperature-related thermal emission may be transient.

[0199] Experiment 5.3. Background Noise and Liquid Sample Transparency in Serum.

[0200] OD under 490 nm Excitation (FIG. 9) :

[0201] Before Bleaching: 0.00332 + / -0.00015

[0202] After Bleaching: 0.00293 + / -0.00005

[0203] 30 min after Bleaching: 0.00282 + / -0.00002

[0204] 17 hr after Bleaching: 0.00281 + / -0.00002

[0205] OD under 560 nm Excitation:

[0206] Before Bleaching: 0.01483 + / -0.00010

[0207] After Bleaching: 0.01473 + / -0.00021

[0208] 30 min after Bleaching: 0.01538 + / -0.00044

[0209] 17 hr after Bleaching: 0.01479 + / -0.00029

[0210] Conclusions: Photobleaching reduced fluorescence emission at 665 nm, under both 490 nm and 560 nm excitation frequencies. Similar effects are observed in both serum and plasma samples.

[0211] Experiment 5.4. RFU-Antigen Concentration Calibration Curve Comparison –Linearity and Slope in Buffer, Serum and Photobleached Serum

[0212] Serum from a healthy adult was divided into 2 groups (5 samples in each group) . In one group (photobleached serum group) a 60W incandescence light bulb was used to photo-bleach the samples for about 5 minutes. In the other group (non-photobleached serum group) the serum samples were not subjected to photobleaching. A buffer group (5 entries) was used as a control.

[0213] In each group (i.e., photobleached serum ( “PB serum” ) group, non-photobleached serum (“serum” ) group, and buffer group) , various amounts of TNF-alpha (analyte or target to be detected) were added: 0 pg / mL, 39 pg / mL, 78 pg / mL, 156 pg / mL, 313 pg / mL, 625 pg / mL, 1250 pg / mL and 2500 pg / mL. Two antibodies with a pair of FRET labels, one tagged with a FRET donor dye while the other tagged with a FRET acceptor dye, were added to members of each group. TNF-alpha and the two antibodies are available from commercial providers, e.g., revvity, Inc., Thermo Fisher Scientific, ATTO-TEC GmbH, etc.

[0214] In one embodiment, in this TNF-alpha FRET assay, when TNF-alpha is present, the two antibodies bind to different epitopes on the TNF-alpha molecule, bringing the fluorophores (i.e., the pair of FRET labels) into close proximity. This proximity allows FRET to occur, and the resulting signal can be measured. The intensity of the signal measured at the FRET acceptor dye emission wavelength is proportional to the concentration of TNF-alpha in the sample.

[0215] In this case, the peak emission wavelength of the FRET donor dye is about 620 nm, and the peak emission wavelength of the FRET acceptor dye is about 665 nm. Hence, we define the relative fluorescence unit (henceforth referred to as RFU) as the following:

[0216] where p665 and p620 are the photon counts measured by the instrument at 665 + / -20 nm and 620 + / -20nm respectively. RFU is a measurement of the number of bound acceptors as a percentage of total number of donors; this percentage in turn reflects the concentration of antigen in the sample.

[0217] The antibody-TNF-alpha reaction was performed at about 37 ℃ for about 20 minutes, about 30 minutes, and about 40 minutes (data not shown) , respectively.

[0218] Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer (TR-FRET) was used in this study. The excitation light source was turned off 100 μs before the optical intensity were measured at about 620 nm and about 650 nm, respectively.

[0219] Results:

[0220] 1. Effect of Reaction Time

[0221] Shown in FIG. 10 are RFU results for samples of the PB serum after the photobleaching and after 20 min or 30 min reaction time, respectively, for the antibodies to react with TNF-alpha. At 20 min reaction time the results demonstrated linearity (R2>0.999) . At 30 min reaction time the obtained RFU showed a marked increase when compared to the RFU at 20 min reaction time.

[0222] 2. Linearity of antigen concentration –RFU curve for photobleached and non-photobleached serums

[0223] FIG. 11 shows the sensitivity of optical density to antigen concentration. Photobleached serum showed a greater slope (higher sensitivity) to antigen concentration changes. The antibody-antigen reaction time in this experiment was 30 minutes. As shown in FIG. 11, photobleaching resulted in greater sensitivity in terms of RFU to the changes of antigen concentration. This is important in the low antigen sensitivity range (e.g., from sub-pg / mL to pg / mL) .

[0224] The calculated limit of detection (LOD) , defined as 3 × SDblank / slope, are 35.0 and 42.1 pg / mL, respectively, for photobleached serums (PB Serum) and non-photobleached serums (Serum) in FIG. 11, where SDblank represents the standard deviation of RFU in the absence of the target antigen (e.g., TNF-alpha) .

[0225] These results in serum (see FIGs. 9-11) are generally similar to those in plasma (see FIG. 8) except that under 560 nm excitation the RFU seems slightly lower, but due to limited sample size this remains inconclusive. Combining all results, the following conclusions may be drawn:

[0226] (1) Photobleaching may result in a decrease of RFU under 490 nm-excitation due to the reduced fluorescent emissions from the fluid sample,

[0227] (2) Photobleaching may result in a less pronounced RFU change under 560 nm-excitation due to 2 competing factors: (i) the increase in transparency of the liquid samples due to photobleaching, and the resulting increase in photon counts in the 665 nm detection window; and (ii) the decrease in photon counts in the detection window from the fluorescent emissions from molecular species in the blood or serum sample.

[0228] (3) Thermal emission under higher temperatures in the sample and container may also increase the photon counts in the 665 nm detection window.

[0229] (4) The increase in sample transparency and the decrease in fluorescent emission from molecular species in the liquid sample may be permanent and sustainable, whilst the thermal emission related to the temperature of the sample and container may be transient and reversible.

[0230] In some embodiments, the results show that 1) longer reaction time may result in higher RFU; that 2) the RFU-antigen concentration curve may be linear; that 3) photobleaching may result in a better sensitivity of RFU to the antigen concentration; and that 4) photobleaching may result in shorter reaction time and an extension of measurement range at very low antigen concentrations.

[0231] Applications

[0232] Below are example applications of the present disclosure. Other applications are possible.

[0233] 1. Using photobleaching to increase transmittance of fluid sample, reduce autofluorescence noise, and heat the fluid sample.

[0234] 2. Use temperature sensor (e.g. laser thermometer, thermistor or thermocouple) and a heating circuit (electric heating coil, or a high-intensity light source) to control the fluid sample temperature.

[0235] 3. Using a DC motor 3D mixer to shake the fluid sample to ensure optimal mixing of antibody and fluid sample;

[0236] 4. Using a photon counter and optical filter to continuously count emitted photons within a spectral range (e.g. 600 + / -10 nm) .

[0237] 5. Using an excitation light source to continuously or with short pulse illuminate the fluid sample during above photon counting process.

[0238] 6. Using a DC motor to shake the fluid sample holder (e.g. a cuvette) during antibody-antigen binding reaction.

[0239] 7. Using a donor-receptor pair to label the capturing and detection antibodies respectively.

[0240] 8. Mixing antibody solutions (both capturing and detection antibodies) directly with fluid samples, thus eliminating the need to coat the sample container with capturing antibody before use.

[0241] While preferred embodiments of the present invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. It is not intended that the invention be limited by the specific examples provided within the specification. While the invention has been described with reference to the aforementioned specification, the descriptions and illustrations of the embodiments herein are not meant to be construed in a limiting sense. Numerous variations, changes, and substitutions will now occur to those skilled in the art without departing from the invention. Furthermore, it shall be understood that all aspects of the invention are not limited to the specific depictions, configurations or relative proportions set forth herein which depend upon a variety of conditions and variables. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed in practicing the invention. It is therefore contemplated that the invention shall also cover any such alternatives, modifications, variations or equivalents. It is intended that the following claims define the scope of the invention and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby.

Claims

1.A method for detecting a presence or absence of a target molecule in a sample, comprising:(a) exposing a solution of a sample containing or suspected of containing a target molecule with a first wavelength range of light configured to photobleach fluorophores in the solution for a first time period;(b) turning off the first wavelength range of light at the end of the first time period;(c) exposing the solution obtained in (b) with a second wavelength range of light for a second time period, and detecting a first signal with a third wavelength from the solution;(d) turning off the second wavelength range of light at the end of the second time period;(e) contacting the solution obtained in (d) with a first probe and a second probe;(f) exposing the solution obtained in (e) with the second wavelength range of light for a third time period configured to detect a fluorescence resonance energy transfer (FRET) signal; and(g) detecting a presence or absence of the target molecule in the sample;wherein the first probe, the second probe, and the target molecule, if all present, bring the first probe and the second probe within an excitation distance for FRET when the first probe and the second probe bind to the target molecule.2.The method of claim 1, further comprising, at least in (a) , increasing transmittance of the solution at the end of the first time period.3.The method of claim 1, further comprising, at least in (a) , increasing temperature of the solution at the end of the first time period.4.The method of claim 1, further comprising, at least in (a) , reducing autofluorescence and background noise from the solution after the first time period.5.The method of claim 1, further comprising, at least in (a) , increasing transmittance of the solution at the end of the first time period, increasing temperature of the solution at the end of the first time period, and reducing autofluorescence and background noise from the solution after the first time period.6.The method of any one of claims 1-5, wherein (i) the first probe is a first antibody, (ii) the second probe is a second antibody, and (iii) the target molecule is a protein.7.The method of claim 6, wherein the protein comprises (i) a first epitope recognized by the first antibody and (ii) a second epitope recognized by the second antibody.8.The method of any one of claims 1-7, wherein the method is a Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) .9.The method claim 8, wherein in (f) and / or (g) , temperature of the solution is from about 33 ℃to about 38 ℃.10.The method of claim 9, wherein in (f) and / or (g) , the temperature of the solution is about 37 ℃.11.The method of any one of claims 1-5, wherein (i) the first probe is a first nucleic acid molecule, (ii) the second probe is a second nucleic acid molecule, and (iii) the target molecule is a third nucleic acid molecule.12.The method of claim 11, wherein (i) the first nucleic acid comprise a first sequence complementary to a first section of the third nucleic acid molecule, (ii) the second nucleic acid comprise a second sequence complementary to a second section of the third nucleic acid molecule, and (iii) the first section does not overlap with the second section.13.The method of claim 12, wherein in (f) and / or (g) , temperature of the solution is from about 33 ℃ to about 38 ℃.14.The method of claim 13, wherein in (f) and / or (g) , the temperature of the solution is about 37 ℃.15.The method of any one of claims 9, 10, 13 or 14, further comprising heating or cooling the solution via a thermal device.16.The method of claim 15, further comprising: measuring temperature of the solution using a temperature sensor.17.The method of claim 16, wherein the temperature sensor is laser thermometer, infrared thermistor, thermistor or thermocouple.18.The method of any one of claims 15-17, wherein the thermal device is an electric heating coil, a Peltier module, a heat block, or a high-intensity light source.19.The method of any one of claims 1-18, further comprising mixing or shaking the solution of the sample via a 3D mixer.20.The method of any one of claims 1-19, further comprising counting emitted photons within the second wavelength range within the third time period via a photon counter and an optical filter configured to select the light within the second wavelength range.21.The method of claim 20, further comprising counting emitted photons within the second wavelength range within the second time period via the photon counter and the optical filter.22.The method of any one of claims 1-21, further comprising using an excitation light source to illuminate the solution during the third time period.23.The method of any one of claims 1-22, wherein the first probe and the second probe are solution-phase probes.24.The method of claim 23, further comprising adding the first probe and the second probe to the solution obtained in (d) .25.The method of any one of claims 1-24, wherein there is no washing from (a) to (g) .26.The method of any one of claims 1-25, wherein the detecting in (g) is based in part on a difference between the FRET signal in (g) and the first signal in (c) .27.The method of any one of claims 1-26, wherein the FRET signal is generated from interactions between one or more donor fluorophores on the first probe and one acceptor fluorophore on the second probe.28.The method of any one of claims 1-27, wherein the contacting in (e) comprises contacting the solution with two or more first probes and two or more second probes.29.The method of any one of claims 1-28, wherein a ratio of the plurality of donor probes to the plurality of acceptor probe is from 1: 1 to 10: 1.30.The method of any one of claims 1-29, wherein a limit of detection for the target molecule in the sample is no higher than 40.0 pg / mL.31.The method of any one of claims 1-30, wherein one or more operations of the method are controlled by at least one processor, and wherein the one or more operations comprise: turning on and turning off a light source, and / or the heating or cooling the solution.32.A method of reducing background noise in a fluorescence-based assay, comprising:(a) exposing a solution of a sample comprising an interfering fluorophore with a first wavelength range of light configured to photobleach the interfering fluorophore in the solution for a first time period;(b) turning off the first wavelength range of light at the end of the first time period; and(c) performing a fluorescence-based assay,wherein a signal-to-noise (SNR) level of the fluorescence-based assay is higher than another SNR level of another fluorescence-based assay without photobleaching in (a) .33.The method of claim 32, further comprising, at least in (a) , increasing transmittance of the solution at the end of the first time period.34.The method of claim 32, further comprising, at least in (a) , increasing temperature of the solution at the end of the first time period.35.The method of claim 32, further comprising, at least in (a) , reducing autofluorescence and background noise from the solution after the first time period.36.The method of claim 35, further comprising, at least in (a) , increasing transmittance of the solution at the end of the first time period, increasing temperature of the solution at the end of the first time period, and reducing autofluorescence and background noise from the solution after the first time period.37.The method of claim 32, wherein the first wavelength range comprises white light.38.The method of claim 32, wherein the first wavelength range comprises light wavelength from about 400 nm to about 700 nm39.The method of claim 32, wherein the first wavelength range comprises light wavelength from about 375 nm to about 780 nm.40.The method of any one of claims 32-39, wherein the first time period is from about 10 seconds to about 40 minutes.41.The method of any one of claims 32-39, wherein the first time period is at least 10 seconds.42.The method of any one of claims 32-39, wherein the first time period is no more than 40 minutes.43.The method of any one of claims 32-42, further comprising: detecting a target molecule in the fluorescence-based assay, and wherein a limit of detection for the target molecule is no higher than 40.0 pg / mL.44.The method of any one of claims 32-43, wherein one or more operations of the method are controlled by at least one processor, and wherein the one or more operations comprise: turning on and turning off a light source, and / or heating or cooling the solution.

Images