Small Interfering RNAs Targeting ANT2 and Uses Thereof for Disease Treatment

Abstract

Provided are interfering RNAs such as small interfering RNAs (siRNAs) targeting the messengerRNA of adenine nucleotide translocator 2 (ANT2), pharmaceutical compositions comprising such, and therapeutic uses thereof for treating diseases associated with ANT2, for example,cancer and metabolic diseases.

Description

Small Interfering RNAs Targeting ANT2 and Uses Thereof for Disease Treatment

[0001] CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims the benefit of the filing dates of PCT / CN2024 / 120597, filed September 24, 2024, the entire contents of which is incorporated by reference herein.

[0003] SEQUENCE LISTING

[0004] The instant application contains a Sequence Listing which has been filed electronically in XML format and is hereby incorporated by reference in its entirety. Said XML copy, created on September 22, 2025, is named _063661-508001WO. xml and is 958, 935 bytes in size.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0005] Adenine nucleotide translocator 2 (ANT2) , also known as ADP / ATP translocase 2 or solute carrier family 25 member 5 (SLC25A5) , is an isoform of the Adenine nucleotide translocases (ANTs) . ANT2 functions as an antiporter for ADP / ATP exchange between mitochondrial and matrix and cytoplasm and plays a key role in maintaining mitochondrial membrane potential, supporting ATP synthesis, and inhibiting apoptosis. ANT2 is ubiquitously expressed in somatic tissues, and it is the predominant ANT isoform in the liver.

[0006] ANT2 is involved in the ATP synthesis pathway, mitochondrial death pathway, and cardiac myocyte apoptosis signaling. Overexpression of ANT2 has been linked to tumor cell growth, which may be attributable to the anti-apoptosis effect of ANT2. As such, ANT2 is suggested to be a target for cancer therapy. Further, due to its roles in energy metabolism and ATP synthesis, ANT2 may also be a target for treatment of metabolic diseases.SUMMARY OF THE INVENTION

[0007] The present disclosure is based, at least in part, on the development of interfering RNAs (e.g., modified by specific modification patterns as disclosed herein) , which effectively inhibits ANT2 both in vitro and in vivo. Accordingly, such ANT2-targeting interfering RNAs are expected to exhibit desired therapeutic effects in treating diseases associated with ANT2 such as cancer and metabolic disorders (e.g., obesity, fatty liver, fibrosis) , liver disease, kidney disease (e.g., obesity-induced chronic kidney disease) .

[0008] In some aspect, provided herein is an interfering RNA targeting an ADP / ATP translocase 2 (ANT2) messenger RNA (mRNA) . In some instances, the interfering RNA may comprise a targeting nucleotide sequence complementary to a fragment of an ANT2 mRNA set forth below:

[0009] (i) 5’-GUGACUGCCUGGUUAAGA-3’ (SEQ ID NO: 2) ;

[0010] (ii) 5’-UGUGUACCCUCUUGAUUU-3’ (SEQ ID NO: 3) ;

[0011] (iii) 5’-GCAGAUCACUGCAGAUAA-3’ (SEQ ID NO: 4) ;

[0012] (iv) 5’-GGUGCAUGGUCCAAUGUU-3’ (SEQ ID NO: 5) ;

[0013] (v) 5’-CUGACCAGUUUUCUCUUAA-3’ (SEQ ID NO: 6) ;

[0014] (vi) 5’-CUCUUAAAGCCAUUUCCAU-3’ (SEQ ID NO: 7) ;

[0015] (vii) 5’-UCUUAAAGCCAUUUCCAUG-3’ (SEQ ID NO: 8) ;

[0016] (viii) 5’-AUGAUGAUGAUGGGACUCA-3’ (SEQ ID NO: 9) ;

[0017] (ix) 5’-UGAUGAUGAUGGGACUCAA-3’ (SEQ ID NO: 10) ; or

[0018] (x) 5’-AACUUCGCCUUCAAAGAUA-3’ (SEQ ID NO: 11) .

[0019] In one example, the target nucleotide sequence in the anti-ANT2 interfering RNA is complementary to SEQ ID NO: 2. In another example, the target nucleotide sequence in the anti-ANT2 interfering RNA is complementary to SEQ ID NO: 3. In yet another example, the target nucleotide sequence in the anti-ANT2 interfering RNA is complementary to SEQ ID NO: 6. In yet another example, the target nucleotide sequence in the anti-ANT2 interfering RNA is complementary to SEQ ID NO: 7.

[0020] In some embodiments, the interfering RNA provided herein is a small interfering RNA (siRNA) comprising a sense strand and an antisense strand, the sense strand and antisense strand forming a double-stranded molecule via base pairing; wherein the antisense strand comprising the targeting nucleotide sequence. In some examples, the sense strand has a length of 19-20 nucleotides. Alternatively, or in addition, the antisense strand has a length of 21-22 nucleotides.

[0021] In some examples, the interfering RNA may comprise the sense strand and the antisense strand, which comprise the top and bottom nucleotide sequences listed below respectively:

[0022] (1) 5’-GUGACUGCCUGGUUAAGAX1-3’ (SEQ ID NO: 12) and 5’-X2UCUUAACCAGGCAGUCACN1N2-3’ (SEQ ID NO: 13) ;

[0023] (2) 5’-UGUGUACCCUCUUGAUUUX1-3’ (SEQ ID NO: 14) , and 5’-X2AAAUCAAGAGGGUACACAN1N2-3’ (SEQ ID NO: 15) ;

[0024] (3) 5’-GCAGAUCACUGCAGAUAAX1-3’ (SEQ ID NO: 16) , and 5’-X2UUAUCUGCAGUGAUCUGCN1N2-3’ (SEQ ID NO: 17) ;

[0025] (4) 5’-GGUGCAUGGUCCAAUGUUX1-3’ (SEQ ID NO: 18) , and 5’-X2AACAUUGGACCAUGCACCN1N2-3’ (SEQ ID NO: 19) ,

[0026] (5) 5’-CUGACCAGUUUUCUCUUAAX1-3’ (SEQ ID NO: 20) , and 5’-X2UUAAGAGAAAACUGGUCAGN1N2-3’ (SEQ ID NO: 21) ;

[0027] (6) 5’-CUCUUAAAGCCAUUUCCAUX1-3’ (SEQ ID NO: 22) , and 5’-X2AUGGAAAUGGCUUUAAGAGN1N2-3’ (SEQ ID NO: 23) ;

[0028] (7) 5’-UCUUAAAGCCAUUUCCAUGX1-3’ (SEQ ID NO: 24) , and 5’-X2CAUGGAAAUGGCUUUAAGAN1N2-3’ (SEQ ID NO: 25) ;

[0029] (8) 5’-AUGAUGAUGAUGGGACUCAX1-3’ (SEQ ID NO: 26) , and 5’-X2UGAGUCCCAUCAUCAUCAUN1N2-3’ (SEQ ID NO: 27) ;

[0030] (9) 5’-UGAUGAUGAUGGGACUCAAX1-3’ (SEQ ID NO: 28) and 5’-X2UUGAGUCCCAUCAUCAUCAN1N2-3’ (SEQ ID NO: 29) ; or

[0031] (10) 5’-AACUUCGCCUUCAAAGAUAX1-3’ (SEQ ID NO: 30) and 5’-X2UAUCUUUGAAGGCGAAGUUN1N2-3’ (SEQ ID NO: 31) .

[0032] In any of the above formulas, X1 and X2 each independently, are A and U, respectively or vice versa. Alternatively, X1 and X2 each independently, are G and C, respectively, or vice versa. Further, each of N1 and N2 in each of the sense chains and antisense chains above, independently, can be any of A, U, G, and C. In one example, N2 is U. In some examples, the interfering RNA comprises a sense strand and an antisense strand comprising (e.g., consisting of) SEQ ID NOs: 12 and 13, respectively. In other examples, the interfering RNA comprises a sense strand and an antisense strand comprising (e.g., consisting of) SEQ ID NOs: 14 and 15, respectively. In yet other examples, the interfering RNA comprises a sense strand and an antisense strand comprising (e.g., consisting of) SEQ ID NOs: 20 and 21, respectively. In still other examples, the interfering RNA comprises a sense strand and an antisense strand comprising (e.g., consisting of) SEQ ID NOs: 22 and 23, respectively.

[0033] Specific examples of the sense strand (top) and the antisense strand (bottom) of the interfering RNAs provided herein are listed below:

[0034] (1) 5’-GUGACUGCCUGGUUAAGAA-3’ (SEQ ID NO: 32) , and 5’-UUCUUAACCAGGCAGUCACCG-3’ (SEQ ID NO: 41) ;

[0035] (1-1) 5’-GUGACUGCCUGGUUAAGAA-3’ (SEQ ID NO: 32) and 5’-UUCUUAACCAGGCAGUCACCU-3’ (SEQ ID NO: 33) ;

[0036] (2) 5’-UGUGUACCCUCUUGAUUUA-3’ (SEQ ID NO: 34) , and 5’-UAAAUCAAGAGGGUACACAAU-3’ (SEQ ID NO: 35) ;

[0037] (2-1) 5’-UGUGUACCCUCUUGAUUUA-3’ (SEQ ID NO: 34) , and 5’-UAAAUCAAGAGGGUACACAAA-3’ (SEQ ID NO: 43) ;

[0038] (3) 5’-GCAGAUCACUGCAGAUAAA-3’ (SEQ ID NO: 36) , and 5’-UUUAUCUGCAGUGAUCUGCUU-3’ (SEQ ID NO: 37) ;

[0039] (4) 5’-GGUGCAUGGUCCAAUGUUA-3’ (SEQ ID NO: 38) , and 5’-UAACAUUGGACCAUGCACCCU-3’ (SEQ ID NO: 39) ,

[0040] (5) 5’-CUGACCAGUUUUCUCUUAAA-3’ (SEQ ID NO: 44) , and 5’-UUUAAGAGAAAACUGGUCAGAU-3’ (SEQ ID NO: 45) ;

[0041] (6) 5’-CUCUUAAAGCCAUUUCCAUA-3’ (SEQ ID NO: 46) , and 5’-UAUGGAAAUGGCUUUAAGAGAA-3’ (SEQ ID NO: 47) ;

[0042] (7) 5’-UCUUAAAGCCAUUUCCAUGA-3’ (SEQ ID NO: 48) , and 5’-UCAUGGAAAUGGCUUUAAGAGA-3’ (SEQ ID NO: 49) ;

[0043] (8) 5’-AUGAUGAUGAUGGGACUCAA-3’ (SEQ ID NO: 50) , and 5’-UUGAGUCCCAUCAUCAUCAUCA-3’ (SEQ ID NO: 51) ;

[0044] (9) 5’-UGAUGAUGAUGGGACUCAAA-3’ (SEQ ID NO: 52) and 5’-UUUGAGUCCCAUCAUCAUCAUC-3’ (SEQ ID NO: 53) ; or

[0045] (10) 5’-AACUUCGCCUUCAAAGAUAA-3’ (SEQ ID NO: 54) and 5’-UUAUCUUUGAAGGCGAAGUUAA-3’ (SEQ ID NO: 55) .

[0046] In some examples, the interfering RNA comprises a sense strand and an antisense strand comprising (e.g., consisting of) SEQ ID NOs: 32 and 41, respectively. In other examples, the interfering RNA comprises a sense strand and an antisense strand comprising (e.g., consisting of) SEQ ID NOs: 34 and 43, respectively. In yet other examples, the interfering RNA comprises a sense strand and an antisense strand comprising (e.g., consisting of) SEQ ID NOs: 44 and 45, respectively. In still other examples, the interfering RNA comprises a sense strand and an antisense strand comprising (e.g., consisting of) SEQ ID NOs: 46 and 47, respectively.

[0047] Any of the interfering RNAs provided herein may comprise one or more modifications. In some embodiments, the modifications comprise one or more modified nucleotides, one or more modified inter-nucleotide bonds, or a combination thereof. In some examples, the modifications comprise 2’-fluoro modified nucleotides, 2’-O-methyl modified nucleotides, or a combination thereof. Alternatively, or in addition, the modifications comprise one or more phosphorothioate bonds.

[0048] In one example, the interfering RNA can be a double-stranded siRNA comprising the following modification pattern:

[0049] 5’-m*f*mffmmffmmmmfmfmfm*m*m-3’

[0050] 3’-m*m*mmmmmmmffffmfmm*m*m-5’;

[0051] in which m represents 2’-O-methyl nucleotides, f represents 2’-fluoro nucleotides, and *represents PS bonds.

[0052] In some embodiments the interfering RNA provided herein can be conjugated with a targeting ligand. In some examples, the targeting ligand comprises one or more N-Acetylgalactosamine (GalNAc) moieties. In one example, the targeting ligand is a trivalent GalNAc moiety. In some instances, the interfering RNA provided herein is a siRNA comprising the sense strand and the antisense strand. In some examples, the targeting ligand is attached to the 3’ end of the sense strand.

[0053] In some embodiments, the interfering RNA provided herein may comprise a 5’ end cap, for example, an (E) -vinylphosphonate moiety. In some examples, the interfering RNA is a siRNA comprising the sense strand and the antisense strand and the 5’ end cap is attached to the 5’ end of the antisense strand. In other embodiments, the interfering RNA provided herein is free of any 5’ end cap.

[0054] In some examples, the interfering RNA provided herein can be an siRNA comprising a sense strand and an antisense strand, wherein the sense strand and the antisense strand are set forth below at the top and bottom of each of (a) - (d) , respectively:

[0055] (a) 5’-mG*mU*mGmAfCmUfGfCfCfUmGmGmUmUmAmAmGmAmA-3’ (SEQ ID NO: 56) , and 5’-mU*fU*mCfUfUmAmAfCfCmAmGmGmCfAmGfUmCfAmC*mC*mG -3’ (SEQ ID NO: 57) ;

[0056] (b) 5’-mU*mG*mUmGfUmAfCfCfCfUmCmUmUmGmAmUmUmUmA-3’ (SEQ ID NO: 58) , and 5’-mU*fA*mAfAfUmCmAfAfGmAmGmGmGfUmAfCmAfCmA*mA*mA-3’ (SEQ ID NO: 59) ;

[0057] (c) 5’-mC*mU*mGmAmCfCmAfGfUfUfUmUmCmUmCmUmUmAmAmA-3’ (SEQ ID NO: 60) , and 5’-mU*fU*mUfAfAmGmAfGfAmAmAmAmCfUmGfGm UfCmAmG*mA*mU-3’ (SEQ ID NO: 61) ; or

[0058] (d) 5’-mC*mU*mCmUmUfAmAfAfGfCfCmAmUmUmUmCmCmAmUmA-3’ (SEQ ID NO: 62) , and 5’-mU*fA*mUfGfGmAmAfAfUmGmGmCmUfUmUfAmAfG mAmG*mA*mA-3’ (SEQ ID NO: 63) .

[0059] In any of the above sequences, m represents 2’-O-methyl nucleotides, f represents 2’-fluoro nucleotides, and *represents PS bonds.

[0060] In some specific examples, any of the siRNAs disclosed above may comprise a targeting moiety, which may be conjugated to the 3’ end of the sense strand. In some instances, the targeting moiety may comprise one or more GalNAc moieties. Alternatively or in addition, the 5’ end of the antisense strand is conjugated to a cap, e.g., an (E) -vinylphosphonate moiety.

[0061] In some examples, the siRNA targeting ANT2 as disclosed herein comprises a targeting moiety, which contains three GalNAc moieties. Such an siRNA may be free of the 5’ end cap. In one specific example, the siRNA has a sense stand set forth as SEQ ID NO: 277 and an antisense strand set forth as SEQ ID NO: 281 or 285.

[0062] In other aspects, provided herein is a pharmaceutical composition comprising any of the interfering RNA molecules set forth herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0063] Further, the present disclosure features a method for treating a liver disease or a metabolic disorder (e.g., obesity) in a subject, the method comprising: administering to a subject in need thereof an effective amount of a pharmaceutical composition comprising any of an interfering RNA (e.g., those provided herein) and a pharmaceutically acceptable carrier. In some instances, the interfering RNA targets an ANT2 mRNA. In some embodiments, the subject may be a human patient having or at risk of the liver disease or the metabolic disorder.

[0064] Also within the scope of the present disclosure are any of the interfering RNAs provided herein or pharmaceutical compositions providing such for use in treating a liver disease, and uses of such interfering RNA or pharmaceutical composition for manufacturing a medicament for use in treating the target liver disease.

[0065] The details of one or more embodiments of the invention are set forth in the description below. Other features or advantages of the present invention will be apparent from the following drawings and detailed description of several embodiments, and also from the appended claims.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0066] The following drawings form part of the present specification and are included to further demonstrate certain aspects of the present disclosure, which can be better understood by reference to the drawing in combination with the detailed description of specific embodiments presented herein.

[0067] FIGs. 1A-1C include diagrams showing in vivo efficacy of exemplary modified ANT2-targeting siRNAs in C57BL6 mice. FIG. 1A: 1 mg / kg. FIG. 1B: 3 mg / kg. FIG. 1C: 10 mg / kg.

[0068] FIGs. 2A-2C include graphs showing the knockdown efficacy and mitochondrial biogenesis markers in hepatic tissue of high-fat diet-fed C57BL / 6 mice treated with 10 mg / kg A6G-M8-G or vehicle for eight weeks. FIG. 2A: Hepatic ANT2 mRNA expression. FIG. 2B: Hepatic PGC1α mRNA expression. FIG. 2C: Relative mitochondrial DNA level (mitochondrial DNA / nuclear DNA ratio) . Data were analyzed by unpaired t-test.

[0069] FIGs. 3A-3C include graphs showing the effects of A6G-M8-G on body weight and adipose tissue mass of high-fat diet-fed C57BL / 6 mice treated for eight weeks, compared to either vehicle or chow-fed controls. FIG. 3A: Food intake-to-body weight ratio. FIG. 3B: Percent change in body weight. FIG. 3C: White and brown adipose tissue weight.

[0070] FIGs. 4A-4D include graphs showing the effects of A6G-M8-G on blood lipid levels and hepatic fat accumulation in high-fat diet-fed C57BL / 6 mice treated for eight weeks, compared to vehicle control. FIG. 4A: Total cholesterol levels. FIG. 4B: High-density lipoprotein (HDL) levels. FIG. 4C: Low-density lipoprotein (LDL) levels. FIG. 4D: Oil Red O staining of liver tissue sections. Data were analyzed by unpaired t-test and are presented as mean ± SD.

[0071] FIGs. 5A-5C include graphs showing the effects of A6G-M8-G on glucose metabolism in high-fat diet-fed C57BL / 6 mice treated for eight weeks, compared to vehicle control. FIG. 5A: Fasting glucose levels. FIG. 5B: Glucose tolerance (IPGTT) . FIG. 5C: Insulin resistance (ITT) . Data were analyzed by unpaired t-test and are presented as mean ± SD.

[0072] FIGs. 6A-6B include graphs showing the knockdown efficacy and mitochondrial biogenesis markers in hepatic tissue of diet-induced obese (DIO) mice treated with 10 mg / kg A6G-M8-G or vehicle. FIG. 6A: Hepatic ANT2 mRNA expression. FIG. 6B: Hepatic PGC1αmRNA expression. Data were analyzed by unpaired t-test.

[0073] FIGs. 7A-7C include graphs showing the effects of A6G-M8-G on food intake, body weight, and adipose tissue mass in DIO mice treated for eight weeks, compared to vehicle control. FIG. 7A: Food intake-to-body weight ratio. FIG. 7B: Body weight gain. FIG. 7C: White and brown adipose tissue mass.

[0074] FIGs. 8A-8C include graphs showing the effects of A6G-M8-G on glucose metabolism in DIO mice treated for eight weeks, compared to vehicle control. FIG. 8A: Fasting glucose levels. FIG. 8B: Glucose tolerance (IPGTT) . FIG. 8C: Insulin resistance (ITT) . Data were analyzed by unpaired t-test and are presented as mean ± SD.

[0075] FIGs. 9A-9D include graphs showing the effects of A6G-M8-G on blood lipid levels and hepatic fat accumulation in DIO mice treated for eight weeks, compared to vehicle control. FIG. 9A: Total cholesterol levels. FIG. 9B: High-density lipoprotein (HDL) levels. FIG. 9C: Low-density lipoprotein (LDL) levels. FIG. 9D: Oil Red O staining of liver tissue sections. Data were analyzed by unpaired t-test and are presented as mean ± SD.

[0076] FIGs. 10A-10B include graphs showing the knockdown efficacy and mitochondrial biogenesis markers in hepatic tissue of Diet-Induced Obese (DIO) mice treated with 10 mg / kg A6G-M8-G or vehicle for four weeks. FIG. 10A: Hepatic ANT2 mRNA expression. FIG. 10B: Hepatic PGC1α mRNA expression. Data were analyzed by unpaired t-test.

[0077] FIGs. 11A-11C include graphs showing the effects of A6G-M8-G and semaglutide on food intake, body weight, and adipose tissue mass in DIO mice treated for four weeks, compared to vehicle control. FIG. 11A: Food intake-to-body weight ratio. FIG. 11B: Body weight gain. FIG. 11C: White and brown adipose tissue mass.

[0078] FIGs. 12A-12C include graphs showing the knockdown efficacy and mitochondrial biogenesis markers in hepatic tissue of high-fat diet-fed C57BL / 6 mice treated with 10 mg / kg A6G-M8-G or vehicle for eight weeks. FIG. 12A: Hepatic ANT2 mRNA expression. FIG. 12B: Hepatic PGC1α mRNA expression. FIG. 12C: Relative mitochondrial DNA level (mitochondrial DNA / nuclear DNA ratio) . Data were analyzed by unpaired t-test.

[0079] FIGs. 13A-13C include graphs showing the effects of A6G-M8-G and semaglutide on body weight, adipose tissue mass, and muscle mass in high-fat diet-fed C57BL / 6 mice treated for eight weeks. FIG. 13A: Percent change in body weight. FIG. 13B: White and brown adipose tissue weights. FIG. 13C: Muscle mass. Data were analyzed by unpaired t-test and are presented as mean ± SD.

[0080] FIGs. 14A-14C include graphs showing the effects of A6G-M8-G on blood lipid levels in high-fat diet-fed C57BL / 6 mice treated for eight weeks, compared to vehicle control. FIG. 14A: Total cholesterol levels. FIG. 14B: High-density lipoprotein (HDL) levels. FIG. 14C: Low-density lipoprotein (LDL) levels.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0081] RNA interference or “RNAi” is a process in which double-stranded RNAs (dsRNA) block gene expression when it is introduced into host cells. (Fire et al. (1998) Nature 391, 806-811) . Short dsRNA directs gene-specific, post-transcriptional silencing in many organisms, including vertebrates, and has provided a new tool for studying gene function. RNAi may involve mRNA degradation.

[0082] The present disclosure is based, at least in part, on the development of interfering RNAs targeting the messenger RNA (mRNA) of ANT2. Such interfering RNAs may target specific regions within the ANT2 mRNA as provided herein to achieve high inhibitory activity against ANT2. Knocking out the Ant2 gene in liver or in kidney was found to reduce fat accumulation in liver or kidney in mouse models. Cho et al., Nature Communication, 8: 14477 (2017) and Permyakova et al., J. American Society of Nephrology, 2024. Accordingly, the anti-ANT2 interfering RNAs provided herein are expected to reduce fat accumulation and lowering fasting glucose levels, thereby benefiting treatment of obesity and other metabolic syndrome disorders.

[0083] Accordingly, provided herein are interfering RNAs targeting the mRNA of ANT2, pharmaceutical compositions comprising such, and therapeutic uses thereof for inhibiting ANT2 and / or for treating diseases associated with ANT2, for example, cancer such as solid tumors or metabolic diseases such as fatty liver, diabetes, and obesity.

[0084] Short-interfering RNA (siRNA) , upon entering the cytosol interacts with several proteins to form an RNA-induced silencing complex (RISC) and knocks down the expression of target genes based on sequence complementarity. By targeting a suitable site within the ANT2 mRNA, for example, the specific target sites disclosed herein, the interfering RNAs such as siRNAs disclosed herein can reduce the level of ANT significantly, thereby achieving the desired therapeutic effects (e.g., anti-cancer effects or improved metabolic parameters such as those associated with obesity) .

[0085] The present disclosure is based, at least in part, on the development of interfering RNAs such as siRNA molecules that can inhibit ANT2 mRNA efficiently. Modifications of the interfering RNAs, e.g., by the specific modification patterns disclosed herein, may further enhance the inhibitory activity of the modified interfering RNAs (e.g., siRNAs) .

[0086] Accordingly, provided herein are siRNAs targeting ANT2, including modified versions, and therapeutic uses thereof for treating ANT2-associated diseases such as cancer or metabolic diseases such as fatty liver, diabetes, and obesity.

[0087] I. Interfering RNAs Targeting ANT2

[0088] Double-stranded RNA (dsRNA) directs the sequence-specific silencing of mRNA through a process known as RNA interference (RNAi) . It has been demonstrated that 21-23 nt fragments of dsRNA are sequence-specific mediators of RNA silencing, e.g., by causing RNA degradation. While not wishing to be bound by theory, it may be that a molecular signal, which may be merely the specific length of the fragments, present in these 21-23 nt fragments recruits cellular factors that mediate RNAi.

[0089] Described herein are interfering RNA molecules targeting the mRNA of ANT2, for example, targeting specific regions within the ANT2 mRNA, and methods of using such for inhibiting ANT2, thereby achieving the desired therapeutic effects. As an example, the nucleotide sequence of human ANT2 mRNA is provided below (SEQ ID NO: 1) . Regions in boldface are the exemplary target sites as disclosed herein.

[0090] A. ANT2-Targeting Interfering RNAs

[0091] As used herein, the term “interfering RNA” refers to any RNA molecule that can be used in inhibiting a target gene, including both mature RNA molecules that are directly involved in RNA interference (e.g., the 21-23nt dsRNA disclosed herein) or a precursor molecule that produces the mature RNA molecule.

[0092] An interfering RNA comprises a fragment (e.g., the anti-sense strand of any of the siRNA molecules provided herein) that is complementary (completely or partially) to a target site within the ANT2 mRNA. The fragment may be 100%complementary to the target site. Alternatively, the fragment may be partially complementary, e.g., including one or more mismatches but sufficient to form double-strand at the target site to mediate RNA interference.

[0093] Exemplary targeting sites within the mRNA of ANT2 are provided below:

[0094] (i) 5’-GUGACUGCCUGGUUAAGA-3’ (SEQ ID NO: 2) ;

[0095] (ii) 5’-UGUGUACCCUCUUGAUUU-3’ (SEQ ID NO: 3) ;

[0096] (iii) 5’-GCAGAUCACUGCAGAUAA-3’ (SEQ ID NO: 4) ;

[0097] (iv) 5’-GGUGCAUGGUCCAAUGUU-3’ (SEQ ID NO: 5) ;

[0098] (v) 5’-CUGACCAGUUUUCUCUUAA-3’ (SEQ ID NO: 6) ;

[0099] (vi) 5’-CUCUUAAAGCCAUUUCCAU-3’ (SEQ ID NO: 7) ;

[0100] (vii) 5’-UCUUAAAGCCAUUUCCAUG-3’ (SEQ ID NO: 8) ;

[0101] (viii) 5’-AUGAUGAUGAUGGGACUCA-3’ (SEQ ID NO: 9) ;

[0102] (ix) 5’-UGAUGAUGAUGGGACUCAA-3’ (SEQ ID NO: 10) ; or

[0103] (x) 5’-AACUUCGCCUUCAAAGAUA-3’ (SEQ ID NO: 11) .

[0104] In some examples, the target site can be (i) , (ii) , (v) , or (vi) listed above. In one specific example, the target site can be (i) .

[0105] Interfering RNAs specific to any of the target sites listed above may comprise a targeting sequence (e.g., located at the antisense strand) complementary to the target site. In some instances, the targeting sequence may be 100%complementary to the target site, e.g., any one of (i) , (ii) , (vi) , and (vii) . Nucleotide sequences provided herein, in which modifications are not specifically noted, are meant to encompass both unmodified sequences and modified sequences of any manner.

[0106] In some embodiments the interfering RNA discloses herein may be a siRNA, i.e., a double-strand RNA (dsRNA) that contains two separate and complementary RNA chains. Such an siRNA may comprise a sense chain having a nucleotide sequence corresponding to the target site of the ANT2 mRNA and an antisense chain complementary to the sense chain (and the target genomic site) . It would have been known to those skilled in the art that the sense chain and / or the antisense chain does not need to be completely the same or complementary to the target site. One or more mismatches would be allowed as long as the siRNA can still target the genomic site via base-pairing to mediate the RNA interference process. In some instances, the sense chain and / or the antisense chain (whole or a portion thereof) is completely the same or complementary to the target genomic site. In some instances, the sense strand may contain one or two nucleotides overhang at the 5’ end, the 3’ end, or both, relative to the target site sequence. In some examples, the nucleotide overhang may be located at the 3’ end of the sense strand relative to the target site. Exemplary nucleotides for use as the overhang may be A, U, or G. In some examples, the 3’ end overhang nucleotide of the sense chain and the 5’-end nucleotide of the antisense chain may form a base pair, e.g., A / U pair or G / C pair.

[0107] In other embodiments, the interfering RNA discloses here can be a short hairpin RNA (shRNA) , which is an RNA molecule forming a tight hairpin structure. Both siRNAs and shRNAs can be designed based on the sequence of the target sites in the ANT2 mRNA.

[0108] In some embodiments, the interfering RNA disclosed herein (e.g., an siRNA molecule) may contain a sense chain and an antisense chain, which form a double-stranded RNA molecule. In some examples, the sense chain may have 19-23 nucleotides (e.g., 19-21 nts such as 19 nts or 20 nts) and the antisense chain may have 21-25 nucleotides (e.g., 21-23 nts such as 21 nts or 22 nts) with one or two nucleotides overhang at the 3’ end of the antisense chain. The overhang nucleotides can be any of A, G, C, and U. In some instances, the 3’ end nucleotide may be U. Alternatively or in addition, the antisense strand may carry one 3’-end overhang nucleotide that is complementary to the corresponding nucleotide at the target site in the ANT2 mRNA.

[0109] Exemplary ANT2-targeting siRNAs are provided in Table 1 below, each of which is within the scope of the present disclosure. Specific examples include A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65.

[0110] In some instances, the siRNA disclosed herein may comprise the same sense chain and / or same antisense chain as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) . In other instances, the siRNA disclosed herein may comprise a sense chain that is at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 95%, or higher) identical to the sense chain of A6 and / or comprise an antisense chain that is at least 80%(e.g., at least 85%, at least 90%, at least 95%, or higher) identical to the antisense chain of A6. In other instances, the siRNA disclosed herein may comprise a sense chain that is at least 80%(e.g., at least 85%, at least 90%, at least 95%, or higher) identical to the sense chain of A8 and / or comprise an antisense chain that is at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 95%, or higher) identical to the antisense chain of A8. In other instances, the siRNA disclosed herein may comprise a sense chain that is at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 95%, or higher) identical to the sense chain of A47 and / or comprise an antisense chain that is at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 95%, or higher) identical to the antisense chain of A47. In other instances, the siRNA disclosed herein may comprise a sense chain that is at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 95%, or higher) identical to the sense chain of A59 and / or comprise an antisense chain that is at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 95%, or higher) identical to the antisense chain of A59.

[0111] The “percent identity” of two nucleic acids is determined using the algorithm of Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, 1990, modified as in Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77, 1993. Such an algorithm is incorporated into the NBLAST and XBLAST programs (version 2.0) of Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990. BLAST nucleotide searches can be performed with the NBLAST program, score=100, wordlength-12 to obtain nucleotide sequences homologous to the nucleic acid molecules of the invention. Where gaps exist between two sequences, Gapped BLAST can be utilized as described in Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 (17) : 3389-3402, 1997. When utilizing BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of the respective programs (e.g., XBLAST and NBLAST) can be used.

[0112] In other embodiments, the ANT2-targeting siRNA described herein may contain up to 6 (e.g., up to 6, 5, 4, 3, or 2) nucleotide variations as compared with the sense chain and antisense chain (collectively or separately) of a reference siRNA, such as those listed in Table 1, for example, A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) .

[0113] B. Modifications of ANT2-Targeting Interfering RNAs

[0114] Any of the ANT2-targeting interfering RNAs (e.g., siRNAs) provided herein may be modified, e.g., containing non-naturally-occurring nucleobases, sugars, or covalent internucleoside linkages (backbones) . Such a modified oligonucleotide confers desirable properties, for example, enhanced cellular uptake, improved affinity to the target nucleic acid, increased in vivo stability, enhance in vivo stability (e.g., resistant to nuclease degradation) , and / or reduce immunogenicity.

[0115] In some examples, the ANT2-targeting interfering RNAs (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) described herein has a modified backbone, including those that retain a phosphorus atom (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 3,687,808; 4,469,863; 5,321,131; 5,399,676; and 5,625,050) and those that do not have a phosphorus atom (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 5,034,506; 5,166,315; and 5,792,608) . Examples of phosphorus-containing modified backbones include, but are not limited to, phosphorothioates, chiral phosphorothioates, phosphorodithioates, phosphotriesters, aminoalkyl-phosphotriesters, methyl and other alkyl phosphonates including 3'-alkylene phosphonates, 5'-alkylene phosphonates and chiral phosphonates, phosphinates, phosphoramidates including 3'-amino phosphoramidate and aminoalkylphosphoramidates, thionophosphoramidates, thionoalkylphosphonates, thionoalkylphosphotriesters, selenophosphates and boranophosphates having 3'-5' linkages, or 2'-5' linkages. Such backbones also include those having inverted polarity, i.e., 3' to 3', 5' to 5' or 2' to 2' linkage. Modified backbones that do not include a phosphorus atom are formed by short chain alkyl or cycloalkyl internucleoside linkages, mixed heteroatom and alkyl or cycloalkyl internucleoside linkages, or one or more short chain heteroatomic or heterocyclic internucleoside linkages. Such backbones include those having morpholino linkages (formed in part from the sugar portion of a nucleoside) ; siloxane backbones; sulfide, sulfoxide and sulfone backbones; formacetyl and thioformacetyl backbones; methylene formacetyl and thioformacetyl backbones; riboacetyl backbones; alkene containing backbones; sulfamate backbones; methyleneimino and methylenehydrazino backbones; sulfonate and sulfonamide backbones; amide backbones; and others having mixed N, O, S and CH2 component parts.

[0116] In other examples, the ANT2-targeting interfering RNAs (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) described herein include one or more substituted sugar moieties. Such substituted sugar moieties can include one of the following groups at their 2'position: OH; F; O-alkyl, S-alkyl, N-alkyl, O-alkenyl, S-alkenyl, N-alkenyl; O-alkynyl, S-alkynyl, N-alkynyl, and O-alkyl-O-alkyl. In these groups, the alkyl, alkenyl and alkynyl can be substituted or unsubstituted C1 to C10 alkyl or C2 to C10 alkenyl and alkynyl. They may also include at their 2'position heterocycloalkyl, heterocycloalkaryl, aminoalkylamino, polyalkylamino, substituted silyl, an RNA cleaving group, a reporter group, an intercalator, a group for improving the pharmacokinetic properties of an oligonucleotide, or a group for improving the pharmacodynamic properties of an oligonucleotide. Preferred substituted sugar moieties include those having 2'-methoxyethoxy, 2'-dimethylaminooxyethoxy, and 2'-dimethylaminoethoxyethoxy. See Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504.

[0117] Alternatively, or in addition, the ANT2-targeting interfering RNAs (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) described herein include one or more modified native nucleobases (i.e., adenine, guanine, thymine, cytosine and uracil) . Modified nucleobases include those described in U.S. Pat. No. 3,687,808, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley &Sons, 1990, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, CRC Press, 1993. Certain of these nucleobases are particularly useful for increasing the binding affinity of the interfering RNA molecules to their targeting sites. These include 5-substituted pyrimidines, 6-azapyrimidines and N-2, N-6 and O-6 substituted purines (e.g., 2-aminopropyl-adenine, 5-propynyluracil and 5-propynylcytosine) . See Sanghvi, et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278) .

[0118] Alternatively, or in addition, the ANT2-targeting interfering RNAs (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) as described herein may comprise one or more locked nucleic acids (LNAs) . An LNA, often referred to as inaccessible RNA, is a modified RNA nucleotide, in which the ribose moiety is modified with an extra bridge connecting the 2'oxygen and 4’ carbon. This bridge “locks” the ribose in the 3’-endo (North) conformation, which is often found in the A-form duplexes. LNA nucleotides can be used in any of the ANT2-targeting interfering RNAs (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) described herein. In some examples, up to 50% (e.g., 40%, 30%, 20%, or 10%) of the nucleotides in an interfering RNA are LNAs.

[0119] In some embodiments, any of the ANT2-targeting interfering RNAs (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) described herein may be conjugated to a ligand or encapsulated into vesicles that can facilitate the delivery of siRNA to desired cells / tissues and / or facilitate cellular uptake. Suitable ligands include, but are not limited to, carbohydrate, peptide, antibody, polymer, small molecule, cholesterol and aptamer.

[0120] In some examples, the ANT2-targeting siRNAs, for example, A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) can be modified following a specific modification pattern provided in Table 11 below.

[0121] Table 11. Exemplary Modification Patterns for siRNAs *m represents 2’-O-methyl nucleotide and f represents 2’-fluoro nucleotides.

[0122] In some examples, the ANT2-targeting siRNAs are modified following one of the patterns of M3, M8, M9, and M15. In specific examples, the ANT2-targeting siRNAs are modified following the pattern of M8. Specific examples are provided in Tables 9A and 9B below.

[0123] Any of the ANT2-targeting interfering RNAs (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) as described herein can be prepared by conventional methods, e.g., chemical synthesis or in vitro transcription. Their intended bioactivity as described herein can be verified by, e.g., those described in the Examples below. Vectors for expressing any of the ANT2-targeting interfering RNAs (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) are also within the scope of the present disclosure.

[0124] In some embodiments, any of the ANT2-targeting interfering RNAs (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) as described herein may be conjugated with a targeting ligand, which is capable of binding to a specific organ, tissue or type of cells. Conjugation with such a targeting ligand can facilitate delivery of the interfering RNA to the specific organ / tissue / cell to enhance therapeutic effects and / or lower side effects arising from global delivery.

[0125] Any targeting ligand known in the art for site-specific drug delivery can be used for conjugation with the ANT2-targeting interfering RNAs disclosed herein. One example includes target ligands comprising one or more N-Acetylgalactosamine (GalNAc) moieties. Such target ligands can facilitate delivery of therapeutic agents attached to it to liver cells. In some instances, the target ligand used herein may comprise three GalNAc moieties. Examples of GalNAc-containing target ligands can be found, e.g., in WO2022 / 222986, the relevant disclosures of which are incorporated by reference for the subject matter and purpose referenced herein.

[0126] II. Pharmaceutical Compositions

[0127] Any of the interfering RNAs (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) as disclosed herein, unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A and 10B below) may be formulated into a suitable pharmaceutical composition. The pharmaceutical compositions as described herein can further comprise pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or stabilizers in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions. Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover. Such carriers, excipients or stabilizers may enhance one or more properties of the active ingredients in the compositions described herein, e.g., bioactivity, stability, bioavailability, and other pharmacokinetics and / or bioactivities.

[0128] Acceptable carriers, excipients, or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations used, and may comprise buffers such as phosphate, citrate, and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid and methionine; preservatives (such as octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; benzoates, sorbate and m-cresol) ; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; proteins, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, serine, alanine or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates including glucose, mannose, or dextrans; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counter-ions such as sodium; metal complexes (e.g., Zn-protein complexes) ; and / or non-ionic surfactants such as TWEENTM (polysorbate) , PLURONICSTM (nonionic surfactants) , or polyethylene glycol (PEG) .

[0129] In some examples, the pharmaceutical composition described herein includes pulmonary compatible excipients. Suitable such excipients include, but not limited to, richloromono-fluoromethane, dichloro-difluoromethane, dichloro-tetrafluoroethane, chloropenta-fluoroethane, monochloro-difluoroethane, difluoroethane, tetrafluoroethane, heptafluoropropane, octafluoro-cyclobutane, purified water, ethanol, propylene glycol, glycerin, PEG (e.g., PEG400, PEG 600, PEG 800 and PEG 1000) , sorbitan trioleate, soya lecithin, lecithin, oleic acid, Polysorbate 80, magnesium stearate and sodium laury sulfate, methylparaben, propylparaben, chlorobutanol, benzalkonium chloride, cetylpyridinium chloride, thymol, ascorbic acid, sodium bisulfite, sodium metabisulfite, EDTA, sodium hydroxide, tromethamine, ammonia, HCl, H2SO4, HNO3, citric acid, CaCl2, CaCO3, sodium citrate, sodium chloride, disodium EDTA, saccharin, menthol, ascorbic acid, glycine, lysine, gelatin, povidone K25, silicon dioxide, titanium dioxide, zinc oxide, lactose, lactose monohydrate, lactose anhydrate, mannitol, and dextrose.

[0130] In other examples, the pharmaceutical composition described herein can be formulated in sustained-release format. Suitable examples of sustained-release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers which matrices are in the form of shaped articles, e.g., films, or microcapsules. Examples of sustained-release matrices include polyesters, hydrogels (for example, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) , or poly (vinylalcohol) ) , polylactides (U.S. Pat. No. 3,773,919) , copolymers of L-glutamic acid and 7 ethyl-L-glutamate, non-degradable ethylene-vinyl acetate, degradable lactic acid-glycolic acid copolymers such as the LUPRON DEPOTTM (injectable microspheres composed of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate) , sucrose acetate isobutyrate, and poly-D-(-) -3-hydroxybutyric acid.

[0131] The pharmaceutical compositions to be used for in vivo administration must be sterile. This is readily accomplished by, for example, filtration through sterile filtration membranes. Therapeutic compositions are generally placed into a container having a sterile access port, for example, an intravenous solution bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle or a sealed container to be manually accessed.

[0132] The pharmaceutical compositions described herein can be in unit dosage forms such as solids, solutions or suspensions, or suppositories, for administration by inhalation or insufflation, intrathecal, intrapulmonary or intracerebral routes, oral, parenteral or rectal administration.

[0133] For preparing solid compositions, the principal active ingredient can be mixed with a pharmaceutical carrier, e.g., conventional tableting ingredients such as corn starch, lactose, sucrose, sorbitol, talc, stearic acid, magnesium stearate, dicalcium phosphate or gums, and other pharmaceutical diluents, e.g., water, to form a solid preformulation composition containing a homogeneous mixture of a compound of the present invention, or a non-toxic pharmaceutically acceptable salt thereof. When referring to these preformulation compositions as homogeneous, it is meant that the active ingredient is dispersed evenly throughout the composition so that the composition may be readily subdivided into equally effective unit dosage forms such as powder collections, tablets, pills and capsules. This solid preformulation composition is then subdivided into unit dosage forms of the type described above containing a suitable amount of the active ingredient in the composition.

[0134] Suitable surface-active agents include, in particular, non-ionic agents, such as polyoxyethylenesorbitans (e.g.,  20, 40, 60, 80 or 85) and other sorbitans (e.g.,  20, 40, 60, 80 or 85) . Compositions with a surface-active agent will conveniently comprise between 0.05 and 5%surface-active agent, for example, between 0.1 and 2.5%. It will be appreciated that other ingredients may be added, for example mannitol or other pharmaceutically acceptable vehicles, if necessary.

[0135] Suitable emulsions may be prepared using commercially available fat emulsions, such as INTRALIPIDTM, LIPOSYNTM, INFONUTROLTM, LIPOFUNDINTM, and LIPIPHYSANTM. The active ingredient may be either dissolved in a pre-mixed emulsion composition or alternatively it may be dissolved in an oil (e.g., soybean oil, safflower oil, cottonseed oil, sesame oil, corn oil or almond oil) and an emulsion formed upon mixing with a phospholipid (e.g., egg phospholipids, soybean phospholipids or soybean lecithin) and water. It will be appreciated that other ingredients may be added, for example glycerol or glucose, to adjust the tonicity of the emulsion. Suitable emulsions will typically contain up to 20%oil, for example, between 5 and 20%.

[0136] Pharmaceutical compositions for inhalation or insufflation include solutions and suspensions in pharmaceutically acceptable, aqueous or organic solvents, or mixtures thereof, and powders. The liquid or solid compositions may contain suitable pharmaceutically acceptable excipients as set out above. In some embodiments, the compositions are administered by the oral or nasal respiratory route for local or systemic effect. In some embodiments, the compositions are composed of particle sized between 10 nm to 100 mm.

[0137] In some embodiments, any of the ANT2-tageting interfering RNAs (e.g., siRNA such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A and 10B below) can be encapsulated or attached to a liposome, which can be prepared by methods known in the art, such as described in Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985) ; Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980) ; and U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545. Liposomes with enhanced circulation time are disclosed in U.S. Pat. No. 5,013,556. Particularly useful liposomes can be generated by the reverse phase evaporation method with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized phosphatidylethanolamine (PEG-PE) . Liposomes are extruded through filters of defined pore size to yield liposomes with the desired diameter.

[0138] In some embodiments, any of the ANT2-tageting interfering RNAs (e.g., siRNA such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A and 10B below) may also be entrapped in microcapsules prepared, for example, by coacervation techniques or by interfacial polymerization, for example, hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly- (methylmethacylate) microcapsules, respectively, in colloidal drug delivery systems (for example, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nano-particles and nanocapsules) or in macroemulsions. Such techniques are known in the art, see, e.g., Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000) .

[0139] Any of the pharmaceutical compositions comprising the ANT2-targeting interfering RNAs (e.g., siRNA such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A and 10B below) as disclosed herein, may further comprise a component that enhances transport of the composition from endosomes and / or lysosomes to cytoplasm. Examples include a pH-sensitive agent (e.g., a pH-sensitive peptide) .

[0140] In some embodiments, any of the pharmaceutical compositions herein may further comprise a second therapeutic agent based on the intended therapeutic uses of the composition.

[0141] III. Therapeutic Applications

[0142] In some aspects, the present disclosure provides uses of any of the interfering RNAs (e.g., siRNA such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A and 10B below) as disclosed herein or any of the compositions comprising such for inhibiting ANT2 in target cells (e.g., in cancer cells or hepatic cells) , and / or for treating diseases associated with ANT2, for example, cancer or metabolic diseases such as fatty liver, diabetes, and obesity.

[0143] To practice the method disclosed herein, an effective amount of the pharmaceutical composition described herein that contains at least one ANT2-targeting interfering RNA (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) as disclosed herein can be administered to a subject (e.g., a human) in need of the treatment via a suitable route, such as intravenous administration, e.g., as a bolus or by continuous infusion over a period of time, by intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutaneous, intra-articular, intrasynovial, intrathecal, oral, inhalation or topical routes. Commercially available nebulizers for liquid formulations, including jet nebulizers and ultrasonic nebulizers are useful for administration. Liquid formulations can be directly nebulized and lyophilized powder can be nebulized after reconstitution.

[0144] As used herein, “an effective amount” refers to the amount of each active agent required to confer therapeutic effect on the subject, either alone or in combination with one or more other active agents. In some embodiments, the therapeutic effect is reduced levels of ANT2 protein and thus reduced ANT2 activity, which may lead to enhanced apoptosis levels in target cells such as in cancer cells. In other embodiments, the therapeutic effect can be reduced levels of ANT2 protein and thus reduced ANT2 activity, which may lead to improved metabolic parameters and liver steatosis in the target cells such as liver cells, and further improve systemic fat homeostasis, glucose tolerance, and insulin sensitivity. Determination of whether an amount of the ANT2-targeting interfering RNA achieved the therapeutic effect would be evident to one of skill in the art. Effective amounts vary, as recognized by those skilled in the art, depending on the particular condition being treated, the severity of the condition, the individual patient parameters including age, physical condition, size, gender and weight, the duration of the treatment, the nature of concurrent therapy (if any) , the specific route of administration and like factors within the knowledge and expertise of the health practitioner. These factors are well known to those of ordinary skill in the art and can be addressed with no more than routine experimentation. It is generally preferred that a maximum dose of the individual components or combinations thereof be used, that is, the highest safe dose according to sound medical judgment.

[0145] Empirical considerations, such as the half-life, generally will contribute to the determination of the dosage. Frequency of administration may be determined and adjusted over the course of therapy, and is generally, but not necessarily, based on treatment and / or suppression and / or amelioration and / or delay of a target disease / disorder. Alternatively, sustained continuous release formulations of an interfering RNA (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) as disclosed herein may be appropriate. Various formulations and devices for achieving sustained release are known in the art.

[0146] In one example, dosages for an ANT2-targeting interfering RNA (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) as described herein may be determined empirically in individuals who have been given one or more administration (s) of the ANT2-targeting interfering RNA. Individuals are given incremental dosages of the antagonist. To assess efficacy of the antagonist, an indicator of the disease / disorder can be followed.

[0147] Generally, for administration of any of the ANT2-targeting interfering RNA (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) as described herein, an initial candidate dosage can be about 2 mg / kg. For the purpose of the present disclosure, a typical daily dosage might range from about any of 0.1 μg / kg to 3 μg / kg to 30 μg / kg to 300 μg / kg to 3 mg / kg, to 30 mg / kg to 100 mg / kg or more, depending on the factors mentioned above. For repeated administrations over several days or longer, depending on the condition, the treatment is sustained until a desired suppression of symptoms occurs or until sufficient therapeutic levels are achieved to alleviate a target disease or disorder, or a symptom thereof. An exemplary dosing regimen comprises administering an initial dose of about 2 mg / kg, followed by a weekly maintenance dose of about 1 mg / kg of the ANT2-targeting interfering RNA (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) , or followed by a maintenance dose of about 1 mg / kg every other week. However, other dosage regimens may be useful, depending on the pattern of pharmacokinetic decay that the practitioner wishes to achieve. For example, dosing from one-four times a week is contemplated. In some embodiments, dosing ranging from about 3 μg / mg to about 2 mg / kg (such as about 3 μg / mg, about 10 μg / mg, about 30 μg / mg, about 100 μg / mg, about 300 μg / mg, about 1 mg / kg, and about 2 mg / kg) may be used. In some embodiments, dosing frequency is once every week, every 2 weeks, every 4 weeks, every 5 weeks, every 6 weeks, every 7 weeks, every 8 weeks, every 9 weeks, or every 10 weeks; or once every month, every 2 months, or every 3 months, or longer. The progress of this therapy is easily monitored by conventional techniques and assays. The dosing regimen (including the ANT2-targeting interfering RNAs used (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) can vary over time.

[0148] In some embodiments, for an adult patient of normal weight, doses ranging from about 0.3 to 5.00 mg / kg may be administered. The particular dosage regimen, i.e., dose, timing and repetition, will depend on the particular individual and that individual's medical history, as well as the properties of the individual agents (such as the half-life of the agent, and other considerations well known in the art) .

[0149] For the purpose of the present disclosure, the appropriate dosage of an ANT2-targeting interfering RNA (e.g., siRNA such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) as described herein will depend on the specific siRNA, the type and severity of the disease / disorder, whether the siRNA is administered for preventive or therapeutic purposes, previous therapy, the patient's clinical history and response to the antagonist, and the discretion of the attending physician. A clinician may administer an ANT2-targeting interfering RNA (e.g., siRNA A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) as disclosed herein, until a dosage is reached that achieves the desired result. In some embodiments, the desired result is a decrease in tumor burden, a decrease in cancer cells, or increased immune activity.

[0150] In some embodiments, the expected treatment effects may comprise improved systemic fat homeostasis, glucose tolerance, insulin sensitivity, and / or liver steatosis. Methods of determining whether a dosage resulted in the desired result would be evident to one of skill in the art. Administration of one or more ANT2-targeting interfering RNAs (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) can be continuous or intermittent, depending, for example, upon the recipient's physiological condition, whether the purpose of the administration is therapeutic or prophylactic, and other factors known to skilled practitioners. The administration of an ANT2-targeting interfering RNA (e.g., siRNA such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) may be essentially continuous over a preselected period of time or may be in a series of spaced dose, e.g., either before, during, or after developing a target disease or disorder.

[0151] As used herein, the term “treating” refers to the application or administration of a composition including one or more active agents to a subject, who has a target disease or disorder, a symptom of the disease / disorder, or a predisposition toward the disease / disorder, with the purpose to cure, heal, alleviate, relieve, alter, remedy, ameliorate, improve, or affect the disorder, the symptom of the disease, or the predisposition toward the disease or disorder.

[0152] Alleviating a target disease / disorder includes delaying the development or progression of the disease or reducing disease severity. Alleviating the disease does not necessarily require curative results. As used therein, “delaying” the development of a target disease or disorder means to defer, hinder, slow, retard, stabilize, and / or postpone progression of the disease. This delay can be of varying lengths of time, depending on the history of the disease and / or individuals being treated. A method that “delays” or alleviates the development of a disease, or delays the onset of the disease, is a method that reduces probability of developing one or more symptoms of the disease in a given time frame and / or reduces extent of the symptoms in a given time frame, when compared to not using the method. Such comparisons are typically based on clinical studies, using a number of subjects sufficient to give a statistically significant result.

[0153] “Development” or “progression” of a disease means initial manifestations and / or ensuing progression of the disease. Development of the disease can be detectable and assessed using standard clinical techniques as well known in the art. However, development also refers to progression that may be undetectable. For purpose of this disclosure, development or progression refers to the biological course of the symptoms. “Development” includes occurrence, recurrence, and onset. As used herein “onset” or “occurrence” of a target disease or disorder includes initial onset and / or recurrence.

[0154] Conventional methods, known to those of ordinary skill in the art of medicine, can be used to administer the pharmaceutical composition to the subject, depending upon the type of disease to be treated or the site of the disease. This composition can also be administered via other conventional routes, e.g., administered orally, parenterally, by inhalation spray, topically, rectally, nasally, buccally, vaginally or via an implanted reservoir. The term “parenteral” as used herein includes subcutaneous, intracutaneous, intravenous, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional, and intracranial injection or infusion techniques. In addition, it can be administered to the subject via injectable depot routes of administration such as using 1-, 3-, or 6-month depot injectable or biodegradable materials and methods. In some embodiments, the composition can be administered via a nasal route, for example, intranasal spray, nasal spray, or nasal drops.

[0155] Injectable compositions may contain various carriers such as vegetable oils, dimethylactamide, dimethyformamide, ethyl lactate, ethyl carbonate, isopropyl myristate, ethanol, and polyols (glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, and the like) . For intravenous injection, water soluble ANT2-targeting interfering RNAs (e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) can be administered by the drip method, whereby a pharmaceutical formulation containing the interfering RNA and a physiologically acceptable excipients is infused. Physiologically acceptable excipients may include, for example, 5%dextrose, 0.9%saline, Ringer’s solution or other suitable excipients. Intramuscular preparations, e.g., a sterile formulation of a suitable soluble salt form of the siRNA disclosed herein, can be dissolved and administered in a pharmaceutical excipient such as Water-for-Injection, 0.9%saline, or 5%glucose solution.

[0156] In one embodiment, an ANT2-targeting interfering RNA (e.g., siRNA such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) , is administered via site-specific or targeted local delivery techniques. Examples of site-specific or targeted local delivery techniques include various implantable depot sources of the siRNA or local delivery catheters, such as infusion catheters, an indwelling catheter, or a needle catheter, synthetic grafts, adventitial wraps, shunts and stents or other implantable devices, site specific carriers, direct injection, or direct application. See, e.g., PCT Publication No. WO 00 / 53211 and U.S. Pat. No. 5,981,568.

[0157] Targeted delivery of therapeutic compositions containing a polynucleotide, expression vector, or subgenomic polynucleotides can also be used. Receptor-mediated DNA delivery techniques are described in, for example, Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11: 202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed. ) (1994) ; Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263: 621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269: 542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266: 338.

[0158] Therapeutic compositions containing a polynucleotide (e.g., the ANT2-targeting siRNAs described herein or vectors for producing such) can be administered in a range of about 100 ng to about 200 mg of DNA for local administration in a gene therapy protocol. In some embodiments, concentration ranges of about 500 ng to about 50 mg, about 1 μg to about 2 mg, about 5 μg to about 500 μg, and about 20 μg to about 100 μg of DNA or more can also be used during a gene therapy protocol.

[0159] The term “about” or “approximately” used herein means within an acceptable error range for the particular value as determined by one of ordinary skill in the art, which will depend in part on how the value is measured or determined, i.e., the limitations of the measurement system. For example, “about” can mean within an acceptable standard deviation, per the practice in the art. Alternatively, “about” can mean a range of up to ± 20%, preferably up to ± 10%, more preferably up to ± 5%, and more preferably still up to ± 1%of a given value. Alternatively, particularly with respect to biological systems or processes, the term can mean within an order of magnitude, preferably within 2-fold, of a value. Where particular values are described in the application and claims, unless otherwise stated, the term “about” is implicit and in this context means within an acceptable error range for the particular value.

[0160] The terms “subject, ” “individual, ” and “patient” are used interchangeably herein and refer to a mammal being assessed for treatment and / or being treated. Subjects may be human, but also include other mammals, particularly those mammals useful as laboratory models for human disease, e.g., mouse, rat, rabbit, dog, etc. A human subject who needs the treatment may be a human patient having, at risk for, or suspected of having a target disease / disorder, such as a liver disease (e.g., fatty liver) or metabolic disorder (e.g., obesity) .

[0161] The ANT2-targeting interfering RNAs provided herein, e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) can be used to treat various types of cancer via, for example, enhancing apoptosis in cancer cells. Exemplary target cancer for the treatment provided herein include lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer) , liver cancer, breast cancer, prostate cancer, or pancreatic cancer.

[0162] In addition, the ANT2-targeting interfering RNAs provided herein, e.g., siRNAs such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) can be used to treat metabolic diseases such as obesity, fatty liver, and fibrosis, type II diabetes, dyslipidemia, insulin resistance, or a metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD) . In other embodiments, the ANT-targeting interfering RNAs provided herein can be used for treating as liver diseases, kidney diseases including obesity-induced chronic kidney diseases.

[0163] Treatment efficacy for a target disease / disorder can be assessed by methods well-known in the art.

[0164] IV. Combined Therapy

[0165] Also provided herein are combined therapies using any of the compositions described herein, comprising one or more of the ANT2-targeting interfering RNA (e.g., siRNA such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) and a second therapeutic agent, such as an immunotherapeutic agent, a chemotherapeutic agent, a radiotherapeutic agent, or surgery. The term combination therapy, as used herein, embraces administration of these agents (e.g., the ANT2-targeting interfering RNA and an anti-cancer therapy) in a sequential manner, that is, wherein each therapeutic agent is administered at a different time, as well as administration of these therapeutic agents, or at least two of the agents, in a substantially simultaneous manner. Sequential or substantially simultaneous administration of each agent can be affected by any appropriate route including, but not limited to, oral routes, intravenous routes, intramuscular, subcutaneous routes, direct absorption through mucous membrane tissues, and pulmonary delivery routes. The agents can be administered by the same route or by different routes.

[0166] Exemplary anti-cancer therapeutic agents for co-use with the ANT2-targeting interfering RNAs provided herein include, but are not limited to, chemotherapy (e.g., abemaciclib, gemcitabine, cisplatin, carboplatin, vincristine, cyclophosphamide, doxorubicin, paclitaxel, docetaxel, premetrexed, erlobinib, and crizotinib) , immunotherapy (e.g., nivalumab, atezolizumab, pembrolizumab, durvalumab, and amivantamab) , surgery, or a combination thereof.

[0167] Any of the anti-ANT interfering RNAs provided here can also be co-used with therapeutic agents for treating metabolic diseases such as obesity, as well as other target diseases provided herein.

[0168] Combination therapy can also embrace the administration of the agents described herein (e.g., the composition and an anticancer agent) in further combination with other biologically active ingredients (e.g., a different anticancer agent) and non-drug therapies (e.g., surgery) .

[0169] It should be appreciated that any combination of a composition described herein and a second therapeutic agent (e.g., an anticancer agent) may be used in any sequence for treating a target disease. The combinations described herein may be selected on the basis of a number of factors, which include but are not limited to the effectiveness of inhibiting cancer cell growth and / or enhancing apoptosis in cancer cells or at least one symptom associated with the cancer.

[0170] V. Kits for Treating ANT2-Associated Diseases

[0171] The present disclosure also provides kits for use in treating ANT2-associated diseases such as cancer. Such kits can include one or more containers comprising the ANT2-targeting interfering RNA (e.g., siRNA such as A6, A6G, A8, A8A, A9, A21, A47, A59, A60, A61, A62, and A65 (e.g., A6G, A8A, A47, or A59) ) , unmodified or modified such as those following the modification patterns provided in Table 11 above (e.g., the modified siRNAs provided in Tables 9A, 9B, 10A, and 10B below) or a composition comprising such as described herein and optionally one or more of the second therapeutic agents as also described herein.

[0172] In some embodiments, the kit can comprise instructions for use in accordance with any of the methods described herein. The included instructions can comprise, for example, a description of administration of the siRNA compound and optionally a description of administration of the second therapeutic agent (s) to improve medical conditions of the ANT2-associated disease such as cancer or metabolic diseases such as fatty liver disease, diabetes, and obesity. The kit may further comprise a description of selecting an individual suitable for treatment based on identifying whether that individual has the disease or is at risk for the disease. In still other embodiments, the instructions comprise a description of administering one or more agents of the disclosure to an individual at risk of an ANT2-associated disease such as cancer or metabolic disease such as fatty liver disease, diabetes, and obesity.

[0173] The instructions relating to the use of the siRNA compound to achieve the intended therapeutic effects generally include information as to dosage, dosing schedule, and route of administration for the intended treatment. The containers may be unit doses, bulk packages (e.g., multi-dose packages) or sub-unit doses. Instructions supplied in the kits of the invention are typically written instructions on a label or package insert (e.g., a paper sheet included in the kit) , but machine-readable instructions (e.g., instructions carried on a magnetic or optical storage disk, or QR code) are also acceptable.

[0174] The label or package insert may indicate that the composition is used for the intended therapeutic utilities. Instructions may be provided for practicing any of the methods described herein.

[0175] The kits provided herein are in suitable packaging. Suitable packaging includes, but is not limited to, chambers, vials, bottles, jars, flexible packaging (e.g., sealed Mylar or plastic bags) , and the like. Also contemplated are packages for use in combination with a specific device, such as an inhaler, nebulizer, ventilator, nasal administration device (e.g., an atomizer) or an infusion device such as a minipump. A kit may have a sterile access port (for example the container may be an intravenous solution bag or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle) . The container may also have a sterile access port (for example the container may be an intravenous solution bag or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle) .

[0176] Kits may optionally provide additional components such as buffers and interpretive information. Normally, the kit comprises a container and a label or package insert (s) on or associated with the container. In some embodiments, the invention provides articles of manufacture comprising contents of the kits described above.

[0177] General techniques

[0178] The practice of the present disclosure will employ, unless otherwise indicated, conventional techniques of molecular biology (including recombinant techniques) , microbiology, cell biology, biochemistry, and immunology, which are within the skill of the art. Such techniques are explained fully in the literature, such as Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed. 1984) ; Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. 1987) ; Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D.G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc. ) ; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds. ) : Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987) ; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds. 1987) ; PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994) ; Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991) ; Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999) ; Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997) ; Antibodies (P. Finch, 1997) ; Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989) ; Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000) ; Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) ; The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995) ; DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985) ; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames &S.J. Higgins eds. (1985>>; Transcription and Translation (B.D. Hames &S.J. Higgins, eds. (1984>>; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986>>; Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986>>; and B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984) ; F.M. Ausubel et al. (eds. ) .

[0179] Without further elaboration, it is believed that one skilled in the art can, based on the above description, utilize the present invention to its fullest extent. The following specific embodiments are, therefore, to be construed as merely illustrative, and not limitative of the remainder of the disclosure in any way whatsoever. All publications cited herein are incorporated by reference for the purposes or subject matter referenced herein.

[0180] EXAMPLES

[0181] While the present disclosure has been described with reference to the specific embodiments thereof, it should be understood by those skilled in the art that various changes may be made and equivalents may be substituted without departing from the true spirit and scope of the disclosure. In addition, many modifications may be made to adapt a particular situation, material, composition of matter, process, process step or steps, to the objective, spirit, and scope of the present disclosure. All such modifications are intended to be within the scope of the disclosure.

[0182] Example 1: Screening for Unmodified Anti-ANT2 siRNAs in Liver Cells

[0183] siRNA candidates targeting SLA25A5 (ANT2) were designed and selected using a computer-based algorithm, taking into account off-target possibility, conservation across different species, and potential targeting sites in view of the secondary structure of the ANT2 mRNA. The sequences of unmodified siRNA candidates are shown in Table 1.

[0184] Table 1. Unmodified Sense and Antisense Strand Sequences of ANT2-Targeting siRNAs

[0185] The human hepatocellular carcinoma (HepG2) cell line was maintained in minimum essential medium (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA) containing 10%fetal bovine serum (Gibco, ThermoFisher Scientific) at 37 ℃ with 5%CO2.

[0186] The unmodified siRNA candidates listed in Table 1 above were synthesized and transfected into human hepatocellular carcinoma (HepG2) cells at a concentration of 1 nM, 0.1 nM, or 0.02 nM following the below protocol.

[0187] HepG2 cells were seeded at 5× 105 cells / well in 24-well culture plates. After 18 hr incubation, the medium was replaced with 500 ul of fresh growth medium. The complex composition of siRNA and RNAiMax for each well was prepared as following: (1) 1 ul of siRNA was added to 50 ul of Opti-MEM; (2) 1.5 ul of RNAiMax was added to 50 ul of Opti-MEM; (3) Gently mix (1) and (2) and incubate at room temperature for 10 minutes. Transfection was carried out by adding 100ul of siRNA / RNAiMax complex to each well. Cells were then incubated for 24 hr prior to RNA purification.

[0188] The transfection experiments at each concentration were each performed in duplicates. At 24 hr post-transfection, the ANT2 mRNA levels in the transfected cells were measured via RT-qPCR under the following conditions. Total RNA was extracted with a RNeasy Micro Kit (Qiagen) following the manufacturer’s instructions. Reverse transcription reaction was conducted with an Evo M-MLV RT kit with gDNA clean treatment (Accurate Biology) and 400 ng of total cellular RNA. The qPCR was carried out with 1 uL of diluted cDNA, 0.5 uL of each forward and reverse primers (see Table 2 below) (final concentration of 500 nM for each primer) and 5 uL of 2x SYBR green master mix in a total volume of 10 ul in a 384-well plate on a LightCycler 480 (Roche Diagnostics) . Each sample was detected in triplicate. Primers for ANT2 and GAPDH (Table 4) were synthesized from Integrated DNA Technologies. The cycling conditions were as follows: 95℃ for 5 min, and 45 cycles of 95℃ for 10 sec, 60℃ for 10 sec and 72℃ for 13 sec. Gene expression fold changes were calculated using the ΔΔCt method and normalized against mock transfected controls (ANT2 mRNA level in control cells not transfected with ANT2-targeting siRNA) . IC50 values were calculated using GraphPad Prism.

[0189] Table 2. Sequences of the qPCR Primers for Amplifying ANT2 and GAPDH

[0190] The results of these primary screenings are provided in Table 3. The data are presented as average (AVE) mRNA remaining (%) relative to the control, along with the standard deviation (SD) .

[0191] Table 3. ANT2 Inhibition Activities of Anti-ANT2 siRNA Candidates

[0192] Example 2: Screening for Modified Anti-ANT2 siRNAs in Liver Cells

[0193] The siRNA selected from the primary screening experiments described in Example 1 above were chemically modified via various modification patterns as shown in Tables 4A (sense strand) and 4B (antisense strand) .

[0194] Table 4A. Exemplary of Modified siRNAs Targeting ANT2 - Sense Strand m: 2’-O-methyl; f: 2’-fluro; *: PS bond

[0195] Table 4B. Exemplary of Modified siRNAs Targeting ANT2 - Antisense Strand m: 2’-O-methyl; f: 2’-fluro; *: PS bond

[0196] The modified siRNAs were transfected into HepG2 cells at concentrations ranging from 10 nM to 4 pM. At 24 hr post-transfection, ANT2 mRNA levels in the transfected cells were measured via RT-qPCR. See Example 1 above for assay conditions. IC50 values for each of the siRNAs tested were measured in two separate experiments and the results are provided in Table 5 below. Data are presented as average IC50 values with standard deviation (SD) .

[0197] Table 5. IC50 Values of Exemplary ANT2-Targeting siRNAs

[0198] Example 3: Further Screening for Modified Anti-ANT2 siRNAs in Liver Cells

[0199] A second batch of siRNAs was designed, selected and chemically modified using the M8 modification pattern disclosed herein. The sequences of these siRNAs are listed in Tables 6A (sense strand) and 6B (antisense strand) .

[0200] Table 6A. Exemplary of Modified siRNAs Targeting ANT2 - Sense Strand m: 2’-O-methyl; f: 2’-fluro; *: PS bond

[0201] Table 6B. Exemplary of Modified siRNAs Targeting ANT2 - Antisense Strand m: 2’-O-methyl; f: 2’-fluro; *: PS bond

[0202] These siRNAs were transfected into HepG2 cells at a concentration of 0.1 or 0.02 nM following the approaches provided above. At 24 hr post-transfection, ANT2 mRNA levels in the transfected cells were measured via RT-qPCR using the primers provided in Table 2 above. The ANT2 mRNA expression levels (%) in siRNA transfected cells were normalized to those in control cells, which were not transfected with the ANT2-targeting siRNA. The results are provided in Table 7 below.

[0203] Table 7. Inhibition Activities of Exemplary ANT2-Targeting siRNAs

[0204] Modified siRNAs exhibiting good inhibitory potency were selected based on the results provided in Table 7 and the selected modified siRNAs were further analyzed in HepG2 cells for inhibiting ANT2 at a concentration ranging from 10 nM to 4 pM. Table 8 below listings the IC50 values of these selected modified siRNAs. All data is presented as average IC50 values and standard deviation (SD) of three independent experiments.

[0205] Table 8. IC50 Values of Exemplary siRNAs Analyzed in HepG2 Cells

[0206] Example 4: In Vivo Efficacy of ANT2-Targeting siRNAs in Mice

[0207] The exemplary siRNAs listed in Table 9A and Table 9B below were conjugated with a trivalent GalNAc targeting ligand at the 3’ end of the sense strand.

[0208] Table 9A. Exemplary Trivalent GalNAc-Conjugated and Modified siRNAs - Sense Strand m: 2’-O-methyl; f: 2’-fluro; *: PS bond; VP: 5'-E-VP; triG: trivalent GalNAc

[0209] Table 9B. Exemplary Trivalent GalNAc-Conjugated and Modified siRNAs - Antisense Strand m: 2’-O-methyl; f: 2’-fluro; *: PS bond; VP: 5'-E-VP

[0210] The conjugated siRNAs were delivered to C57BL6 mice via subcutaneous administration at a dose of 1 mg / kg, 3 mg / kg, or 10 mg / kg. Mice were euthanized 72 hours post-administration. Liver samples were obtained, and total RNAs were extracted using  reagent (Invitrogen) following manufacturer’s instructions. ANT2 mRNA levels were evaluated by RT-qPCR following the protocol provided above. The fold changes in ANT2 mRNA levels were compared those in the saline control, group as shown in FIGs. 1A-1C.

[0211] Example 5: Evaluation of An Exemplary ANT2 siRNA on Systemic Fat Homeostasis, Insulin Sensitivity, and Liver Steatosis in a High-Fat-Diet-Induced Obesity Mouse Model

[0212] This example examines the preventive and therapeutic effects of an exemplary ANT2 siRNA, A6G-M8-G (SEQ ID NOs. 277 and 285 for sense and antisense strands, respectively) , in a high-fat-diet (HFD) -Induced Obesity Mouse Model. Specifically, this example evaluates the ability of A6G-M8-G to (i) prevent HFD-induced weight gain, and (ii) treat established HFD-induced obesity. The parameters evaluated include body weight, adipose tissue accumulation, insulin resistance, glucose tolerance, serum lipid levels, and hepatic steatosis.

[0213] Table 10A. Exemplary Trivalent GalNAc-Conjugated and Modified siRNAs - Sense Strand m: 2’-O-methyl; f: 2’-fluro; *: PS bond; triG: trivalent GalNAc

[0214] Table 10B. Exemplary Trivalent GalNAc-Conjugated and Modified siRNAs - Antisense Strand m: 2’-O-methyl; f: 2’-fluro; *: PS bond

[0215] Preventive Effects of ANT2 siRNA on Obesity and Metabolic Parameters in HFD Mice

[0216] Five-to six-week-old C57BL / 6 mice were fed a high-fat-diet and concurrently administered the ANT2-targeting siRNA (A6G-M8-G) at a dose of 10 mg / kg or vehicle (saline) via subcutaneous injection once per week for eight weeks. Body weight was measured weekly throughout the dosing period. Beginning in the third week of feeding, food intake was measured weekly. An intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) was performed at the start of week 8, followed by an insulin tolerance test (ITT) at the end of the same week (week 8) . The day after ITT completion, all mice were weighed, and blood samples were collected for biochemical analysis. Tissues were harvested, weighed, and snap-frozen for storage. Liver samples were homogenized in reagent, total RNA was extracted, and subsequently treated with DNase to eliminate genomic DNA contamination. ANT2 and PGC1α mRNA levels were quantified by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) , using GAPDH as the internal reference gene. Total DNA was extracted using a Qiagen DNeasy Blood &Tissue Kit. Mitochondrial DNA content was assessed by quantification of a unique mitochondrial DNA region relative to a unique nuclear B2M gene region using qPCR.

[0217] Hematology and clinical chemistry analyses revealed no adverse findings. Administration of A6G-M8-G suppressed ANT2 mRNA expression in the liver compared to the saline control group (FIG. 2A) . Further, the mRNA expression of the mitochondrial biogenesis marker PGC1α and the relative mitochondrial DNA level (mitochondrial DNA / nuclear DNA ratio) were significantly elevated compared to the control group, indicating an increased mitochondrial mass following A6G-M8-G administration (FIGs. 2B and 2C) .

[0218] Although A6G-M8-G administration did not alter the food intake / body weight (BW) ratio compared to the control group (FIG. 3A) , A6G-M8-G reduced HFD-induced weight gain (FIG. 3B) . Specifically, A6G-M8-G significantly reduced fat accumulation in white adipose tissue without affecting brown adipose tissue mass (FIG. 3C) . Total cholesterol (FIG. 4A) , high-density lipoprotein (HDL) (FIG. 4B) , and low-density lipoprotein (LDL) (FIG. 4C) levels in the blood were also significantly lower compared to the control group. Oil Red O staining in liver tissue sections demonstrated reduced hepatic fat accumulation in A6G-M8-G mice compared to the control (FIG. 4D) . Additionally, fasting glucose (FIG. 5A) , glucose tolerance (FIG. 5B) , and insulin resistance (FIG. 5C) were significantly improved in the animals administered A6G-M8-G compared to the control.

[0219] Therapeutic Effects of ANT2 siRNA on Obesity and Metabolic Parameters in HFD Mice

[0220] Male C57BL / 6 mice were fed a high-fat diet until they reached body weights greater than 40 g. Seven diet-induced obese (DIO) mice weighing over 40 g were then administered subcutaneous injections of the ANT2-targeting siRNA, A6G-M8-G, at a dose of 10 mg / kg (n=4) or vehicle (saline; n=3) once per week for eight consecutive weeks. Body weight was measured weekly throughout the dosing period. Beginning in the third week of feeding, food intake was measured weekly. An intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) was performed at the start of week 8, followed by an insulin tolerance test (ITT) at the end of the same week (week 8) . The day after ITT completion, all mice were weighed, and blood samples were collected for biochemical analysis. Tissues were harvested, weighed, and snap-frozen for storage. Blood and tissue samples were processed as described above.

[0221] As shown in FIG. 6A, administration of A6G-M8-G suppressed ANT2 mRNA expression in the liver of DIO mice compared to the saline control group. As shown in FIG. 6B, A6G-M8-G increased expression of the mitochondrial biogenesis marker PGC1α mRNA compared to the control group.

[0222] In DIO mice, although the food intake normalized to body weight (i.e., food intake-to-body weight ratio) in the A6G-M8-G group was initially lower than that in the control group, no sustained difference was observed throughout the study (FIG. 7A) . A6G-M8-G treatment attenuated HFD-induced weight gain in DIO mice (FIG. 7B) ; however, A6G-M8-G treatment did not significantly reduce white or brown adipose tissue mass (FIG. 7C) . Further, while fasting glucose remained unchanged (FIG. 8A) , a significantly improved glucose tolerance (FIG. 8B) and insulin resistance (FIG. 8C) was observed in the A6G-M8-G-treated DIO mice compared to the control group. Total cholesterol (FIG. 9A) , high-density lipoprotein (HDL) (FIG. 9B) , and low-density lipoprotein (LDL) (FIG. 9C) levels in the blood were significantly lower in the treated group compared to the control group. Additionally, Oil Red O staining in liver tissue sections indicated a trend toward reduced hepatic fat (FIG. 9D) .

[0223] In sum, the results reported in this Example demonstrate that administration of A6G-M8-G significantly suppressed ANT2 mRNA expression in the liver compared to the saline control, alleviated obesity markers, and improved several metabolic parameters associated with HFD-induced obesity in both preventive and treatment models of diet-induced obesity.

[0224] Example 6: Evaluation of An Exemplary ANT2 siRNA in Comparison with Semaglutide on Body weight and Systemic Fat Homeostasis in a High-Fat-Diet-Induced Obesity Mouse Model

[0225] This example describes the comparative effects of administration of an ANT2-targeting siRNA (A6G-M8-G; SEQ ID NOs: 277 and 285 for the sense and antisense strands, respectively) and semaglutide on food intake and body weight in treating diet-induced obese (DIO) mice.

[0226] DIO mice (n=5 per group) were administered either vehicle (saline) , A6G-M8-G, or semaglutide via subcutaneous injection once per week for four consecutive weeks. Tissue and blood samples were harvested and processed as described in Example 5. Consistent with the findings inExample 5, treatment with A6G-M8-G significantly reduced hepatic ANT2 mRNA expression (FIG. 10A) and significantly increased hepatic PGC1α mRNA expression (FIG. 10B) compared to the control group.

[0227] In the A6G-M8-G treatment group, the food intake-to-body weight ratio initially declined before returning to levels comparable to the control group (FIG. 11A) , consistent with the findings from Example 5. In contrast, semaglutide significantly reduced this ratio during the first week; however, the ratio subsequently increased and eventually exceeded that of the control group (FIG. 11A) . Additionally, A6G-M8-G significantly reduced body weight and fat accumulation in both white and brown adipose tissues at the end of four weeks; by comparison, the effects observed in the semaglutide group were more pronounced than those in the A6G-M8-G group (FIGs. 11B and 11C) .

[0228] Example 7: Evaluation of An Exemplary ANT2 siRNA in Reducing Fat Accumulation Without Compromising Muscle Mass in a High-Fat-Diet-Induced Obesity Mouse Model

[0229] This example evaluates the effects of administering an ANT2-targeting siRNA (A6G-M8-G; SEQ ID NOs: 277 and 285 for the sense and antisense strand, respectively) on body weight, fat accumulation, and muscle mass in high-fat diet (HFD) -fed C57BL / 6 mice, in comparison with semaglutide treatment.

[0230] Five-to six-week-old male C57BL / 6 mice were administered either 10 mg / kg of A6G-M8-G once per week, 30 nmol / kg of semaglutide once daily or vehicle (saline) via subcutaneous injection for 8 weeks. Each treatment group consisted of six mice. All 18 mice were maintained on a high-fat diet throughout the treatment period. Body weight was recorded daily. At the end of the experiment, all mice were weighed, and blood samples were collected for hematology and clinical chemistry analysis. Selected tissues were dissected, weighed, and snap-frozen for storage. Blood and tissue samples were processed as described in Example 5.

[0231] Consistent with the findings in Example 5, treatment with A6G-M8-G significantly reduced hepatic ANT2 mRNA expression (FIG. 12A) , and significantly increased hepatic PGC1α mRNA expression (FIG. 12B) compared to the control group. The relative mitochondrial DNA level (mitochondrial DNA / nuclear DNA ratio) was also significantly elevated compared to the control (FIG. 12C) , indicating increased mitochondrial mass following A6G-M8-G administration.

[0232] As shown in FIGs. 13A and 13B, A6G-M8-G significantly reduced body weight and fat accumulation in white adipose tissue, but not in brown adipose tissue, after eight weeks of treatment. Additionally, total cholesterol (FIG. 14A) , high-density lipoprotein (HDL) (FIG. 14B) , and low-density lipoprotein (LDL) (FIG. 14C) levels in the blood were significantly lower in the A6G-M8-G-treated group than in the control group.

[0233] Although semaglutide produced a greater reduction in body weight and white adipose tissue than A6G-M8-G, this effect was accompanied by a concomitant loss of muscle mass (FIGs. 13A-13C) . In contrast, A6G-M8-G was associated with a reduction in HFD-induced weight gain and fat accumulation, without negatively impacting muscle mass (FIGs. 13A-13C) .

[0234] In sum, these results demonstrated the metabolic benefits of A6G-M8-G over semaglutide. For example, A6G-M8-G reduced HFD-induced weight gain and fat accumulation, improved lipid profiles, and increased mitochondrial mass without affecting muscle mass, whereas semaglutide, despite its greater effects in weight and fat reduction, was associated with muscle loss.

[0235] OTHER EMBODIMENTS

[0236] All of the features disclosed in this specification may be combined in any combination. Each feature disclosed in this specification may be replaced by an alternative feature serving the same, equivalent, or similar purpose. Thus, unless expressly stated otherwise, each feature disclosed is only an example of a generic series of equivalent or similar features.

[0237] From the above description, one skilled in the art can easily ascertain the essential characteristics of the present invention, and without departing from the spirit and scope thereof, can make various changes and modifications of the invention to adapt it to various usages and conditions. Thus, other embodiments are also within the claims.

[0238] EQUIVALENTS

[0239] While several inventive embodiments have been described and illustrated herein, those of ordinary skill in the art will readily envision a variety of other means and / or structures for performing the function and / or obtaining the results and / or one or more of the advantages described herein, and each of such variations and / or modifications is deemed to be within the scope of the inventive embodiments described herein. More generally, those skilled in the art will readily appreciate that all parameters, dimensions, materials, and configurations described herein are meant to be exemplary and that the actual parameters, dimensions, materials, and / or configurations will depend upon the specific application or applications for which the inventive teachings is / are used. Those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific inventive embodiments described herein. It is, therefore, to be understood that the foregoing embodiments are presented by way of example only and that, within the scope of the appended claims and equivalents thereto, inventive embodiments may be practiced otherwise than as specifically described and claimed. Inventive embodiments of the present disclosure are directed to each individual feature, system, article, material, kit, and / or method described herein. In addition, any combination of two or more such features, systems, articles, materials, kits, and / or methods, if such features, systems, articles, materials, kits, and / or methods are not mutually inconsistent, is included within the inventive scope of the present disclosure.

[0240] All definitions, as defined and used herein, should be understood to control over dictionary definitions, definitions in documents incorporated by reference, and / or ordinary meanings of the defined terms.

[0241] All references, patents and patent applications disclosed herein are incorporated by reference with respect to the subject matter for which each is cited, which in some cases may encompass the entirety of the document.

[0242] The indefinite articles “a” and “an, ” as used herein in the specification and in the claims, unless clearly indicated to the contrary, should be understood to mean “at least one. ”

[0243] The phrase “and / or, ” as used herein in the specification and in the claims, should be understood to mean “either or both” of the elements so conjoined, i.e., elements that are conjunctively present in some cases and disjunctively present in other cases. Multiple elements listed with “and / or” should be construed in the same fashion, i.e., “one or more” of the elements so conjoined. Other elements may optionally be present other than the elements specifically identified by the “and / or” clause, whether related or unrelated to those elements specifically identified. Thus, as a non-limiting example, a reference to “A and / or B” , when used in conjunction with open-ended language such as “comprising” can refer, in one embodiment, to A only (optionally including elements other than B) ; in another embodiment, to B only (optionally including elements other than A) ; in yet another embodiment, to both A and B (optionally including other elements) ; etc.

[0244] As used herein in the specification and in the claims, “or” should be understood to have the same meaning as “and / or” as defined above. For example, when separating items in a list, “or” or “and / or” shall be interpreted as being inclusive, i.e., the inclusion of at least one, but also including more than one, of a number or list of elements, and, optionally, additional unlisted items. Only terms clearly indicated to the contrary, such as “only one of” or “exactly one of, ” or, when used in the claims, “consisting of, ” will refer to the inclusion of exactly one element of a number or list of elements. In general, the term “or” as used herein shall only be interpreted as indicating exclusive alternatives (i.e. “one or the other but not both” ) when preceded by terms of exclusivity, such as “either, ” “one of, ” “only one of, ” or “exactly one of. ” “Consisting essentially of, ” when used in the claims, shall have its ordinary meaning as used in the field of patent law.

[0245] As used herein in the specification and in the claims, the phrase “at least one, ” in reference to a list of one or more elements, should be understood to mean at least one element selected from any one or more of the elements in the list of elements, but not necessarily including at least one of each and every element specifically listed within the list of elements and not excluding any combinations of elements in the list of elements. This definition also allows that elements may optionally be present other than the elements specifically identified within the list of elements to which the phrase “at least one” refers, whether related or unrelated to those elements specifically identified. Thus, as a non-limiting example, “at least one of A and B” (or, equivalently, “at least one of A or B, ” or, equivalently “at least one of A and / or B” ) can refer, in one embodiment, to at least one, optionally including more than one, A, with no B present (and optionally including elements other than B) ; in another embodiment, to at least one, optionally including more than one, B, with no A present (and optionally including elements other than A) ; in yet another embodiment, to at least one, optionally including more than one, A, and at least one, optionally including more than one, B (and optionally including other elements) ; etc.

[0246] It should also be understood that, unless clearly indicated to the contrary, in any methods claimed herein that include more than one step or act, the order of the steps or acts of the method is not necessarily limited to the order in which the steps or acts of the method are recited.

Claims

1.An interfering RNA targeting an ADP / ATP translocase 2 (ANT2) messenger RNA (mRNA) , wherein the interfering RNAcomprises a targeting nucleotide sequence complementary to a fragmentof an ANT2 mRNAset forth below:(i) 5’ -GUGACUGCCUGGUUAAGA-3’ (SEQ ID NO: 2) ;(ii) 5’ -UGUGUACCCUCUUGAUUU-3’ (SEQ ID NO: 3) ;(iii) 5’ -GCAGAUCACUGCAGAUAA-3’ (SEQ ID NO: 4) ;(iv) 5’ -GGUGCAUGGUCCAAUGUU-3’ (SEQ ID NO: 5) ;(v) 5’ -CUGACCAGUUUUCUCUUAA-3’ (SEQ ID NO: 6) ;(vi) 5’ -CUCUUAAAGCCAUUUCCAU-3’ (SEQ ID NO: 7) ;(vii) 5’ -UCUUAAAGCCAUUUCCAUG-3’ (SEQ ID NO: 8) ;(viii) 5’ -AUGAUGAUGAUGGGACUCA-3’ (SEQ ID NO: 9) ;(ix) 5’ -UGAUGAUGAUGGGACUCAA-3’ (SEQ ID NO: 10) ; or(x) 5’ -AACUUCGCCUUCAAAGAUA-3’ (SEQ ID NO: 11) .2.The interfering RNA of claim 1, which is a small interfering RNA (siRNA) comprising a sense strand and an antisense strand, the sense strand and antisense strand forming a double-stranded molecule via base pairing; wherein the antisense strand comprising the targeting nucleotide sequence.3.The interfering RNA of claim 2, wherein the sense strand has a length of 19-20 nucleotides, and / or whereinthe antisense strand has a length of 21-22 nucleotides.4.The interfering RNA of claim 3, which comprises the sense strand and the antisense strand comprises the top and bottom nucleotide sequences. respectively:(1) 5’ -GUGACUGCCUGGUUAAGAX1-3’ (SEQ ID NO: 12) and 5’-X2UCUUAACCAGGCAGUCACN1N2-3’ (SEQ ID NO: 13) ;(2) 5’ -UGUGUACCCUCUUGAUUUX1-3’ (SEQ ID NO: 14) , and 5’-X2AAAUCAAGAGGGUACACAN1N2-3’ (SEQ ID NO: 15) ;(3) 5’ -GCAGAUCACUGCAGAUAAX1-3’ (SEQ ID NO: 16) , and 5’-X2UUAUCUGCAGUGAUCUGCN1N2-3’ (SEQ ID NO: 17) ;(4) 5’ -GGUGCAUGGUCCAAUGUUX1-3’ (SEQ ID NO: 18) , and 5’-X2AACAUUGGACCAUGCACCN1N2-3’ (SEQ ID NO: 19) ,(5) 5’ -CUGACCAGUUUUCUCUUAAX1-3’ (SEQ ID NO: 20) , and 5’-X2UUAAGAGAAAACUGGUCAGN1N2-3’ (SEQ ID NO: 21) ;(6) 5’ -CUCUUAAAGCCAUUUCCAUX1-3’ (SEQ ID NO: 22) , and 5’-X2AUGGAAAUGGCUUUAAGAGN1N2-3’ (SEQ ID NO: 23) ;(7) 5’ -UCUUAAAGCCAUUUCCAUGX1-3’ (SEQ ID NO: 24) , and 5’-X2CAUGGAAAUGGCUUUAAGAN1N2-3’ (SEQ ID NO: 25) ;(8) 5’ -AUGAUGAUGAUGGGACUCAX1-3’ (SEQ ID NO: 26) , and 5’-X2UGAGUCCCAUCAUCAUCAUN1N2-3’ (SEQ ID NO: 27) ;(9) 5’ -UGAUGAUGAUGGGACUCAAX1-3’ (SEQ ID NO: 28) and 5’-X2UUGAGUCCCAUCAUCAUCAN1N2-3’ (SEQ ID NO: 29) ; or(10) 5’ -AACUUCGCCUUCAAAGAUAX1-3’ (SEQ ID NO: 30) and 5’-X2UAUCUUUGAAGGCGAAGUUN1N2-3’ (SEQ ID NO: 31) ;wherein X1 and X2 in each of the sense chain and antisense chain of each of (1) - (10) , independently, are A and U, respectively or vice versa, or G and C, respectively, or vice versa; andwherein each of N1 and N2 in each of the sense chain and antisense chain of each of (1) -(10) , independently, is A, U, G, or C; optionally wherein N2 is U.5.The interfering RNA of claim 4, which comprises the sense strand and the antisense strand comprises the top and bottom nucleotide sequences. respectively:(1) 5’ -GUGACUGCCUGGUUAAGAA-3’ (SEQ ID NO: 32) , and 5’-UUCUUAACCAGGCAGUCACCG-3’ (SEQ ID NO: 41) ;(1-1) 5’ -GUGACUGCCUGGUUAAGAA-3’ (SEQ ID NO: 32) and 5’-UUCUUAACCAGGCAGUCACCU-3’ (SEQ ID NO: 33) ;(2) 5’ -UGUGUACCCUCUUGAUUUA-3’ (SEQ ID NO: 34) , and 5’-UAAAUCAAGAGGGUACACAAU-3’ (SEQ ID NO: 35) ;(2-1) 5’ -UGUGUACCCUCUUGAUUUA-3’ (SEQ ID NO: 34) , and 5’-UAAAUCAAGAGGGUACACAAA-3’ (SEQ ID NO: 43) ;(3) 5’ -GCAGAUCACUGCAGAUAAA-3’ (SEQ ID NO: 36) , and 5’-UUUAUCUGCAGUGAUCUGCUU-3’ (SEQ ID NO: 37) ;(4) 5’ -GGUGCAUGGUCCAAUGUUA-3’ (SEQ ID NO: 38) , and 5’-UAACAUUGGACCAUGCACCCU-3’ (SEQ ID NO: 39) ,(5) 5’ -CUGACCAGUUUUCUCUUAAA-3’ (SEQ ID NO: 44) , and 5’-UUUAAGAGAAAACUGGUCAGAU-3’ (SEQ ID NO: 45) ;(6) 5’ -CUCUUAAAGCCAUUUCCAUA-3’ (SEQ ID NO: 46) , and 5’-UAUGGAAAUGGCUUUAAGAGAA-3’ (SEQ ID NO: 47) ;(7) 5’ -UCUUAAAGCCAUUUCCAUGA-3’ (SEQ ID NO: 48) , and 5’-UCAUGGAAAUGGCUUUAAGAGA-3’ (SEQ ID NO: 49) ;(8) 5’ -AUGAUGAUGAUGGGACUCAA-3’ (SEQ ID NO: 50) , and 5’-UUGAGUCCCAUCAUCAUCAUCA-3’ (SEQ ID NO: 51) ;(9) 5’ -UGAUGAUGAUGGGACUCAAA-3’ (SEQ ID NO: 52) and 5’-UUUGAGUCCCAUCAUCAUCAUC-3’ (SEQ ID NO: 53) ; or(10) 5’ -AACUUCGCCUUCAAAGAUAA-3’ (SEQ ID NO: 54) and 5’-UUAUCUUUGAAGGCGAAGUUAA-3’ (SEQ ID NO: 55) .6.The interfering RNA of any one of claims 1-5, wherein the interfering RNA comprises one or more modifications.7.The interfering RNA of claim 6, wherein the modifications comprise one or more modified nucleotides, one or more modified inter-nucleotide bonds, or a combination thereof.8.The interfering RNA of claim 7, which comprises 2’ -fluoro modified nucleotides, 2’ -O-methyl modified nucleotides, or a combination thereof.9.The interfering RNA of claim 7 or 8, which comprises one or more phosphorothioate bonds.10.The interfering RNA of claim 7, which is a double-stranded siRNAcomprising the following modification pattern:5’-m*f*mffmmffmmmmfmfmfm*m*m-3’3’-m*m*mmmmmmmffffmfmm*m*m-5’ ;wherein m represents 2’ -O-methyl nucleotides, f represents 2’ -fluoro nucleotides, and *represents PS bonds.11.The interfering RNA of any one of claims 1-10, which is conjugated with a targeting ligand.12.The interfering RNA of claim 11, wherein the targeting ligand comprises one or more N-Acetylgalactosamine (GalNAc) moieties, optionally wherein the targeting ligand is a trivalent GalNAc moiety.13.The interfering RNA of claim 11 or claim 12, wherein the interfering RNA is a siRNA comprising the sense strand and the antisense strand, and wherein the targeting ligand is attached to the 3’ end of the sense strand.14.The interfering RNA of any one of claims 1-13, which comprises a 5’ end cap, optionally wherein the 5’ end cap is an (E) -vinylphosphonate moiety.15.The interfering RNA of claim14, whichis a siRNA comprising the sense strand and the antisense strand, and wherein the 5’ endcap is attached to the 5’ end of the antisense strand.16.The interfering RNA of claim 1, which is ansiRNA comprising a sense strand and an antisense strand, whereinthe sense strand and the antisense strand are set forth below at the top and bottom of each of (a) - (d) , respectively:(a) 5’ -mG*mU*mGmAfCmUfGfCfCfUmGmGmUmUmAmAmGmAmA-3’ (SEQ ID NO: 56)5’-mU*fU*mCfUfUmAmAfCfCmAmGmGmCfAmGfUmCfAmC*mC*mG-3 (SEQ ID NO: 57) ;(b) 5’ -mU*mG*mUmGfUmAfCfCfCfUmCmUmUmGmAmUmUmUmA-3’ (SEQ ID NO: 58)5’-mU*fA*mAfAfUmCmAfAfGmAmGmGmGfUmAfCmAfCmA*mA*mA-3’ (SEQ ID NO: 59) ;(c) 5’ -mC*mU*mGmAmCfCmAfGfUfUfUmUmCmUmCmUmUmAmAmA-3’ (SEQ ID NO: 60)5’-mU*fU*mUfAfAmGmAfGfAmAmAmAmCfUmGfGmUfCmAmG*mA*mU-3’ (SEQ ID NO: 61) ; or(d) 5’ -mC*mU*mCmUmUfAmAfAfGfCfCmAmUmUmUmCmCmAmUmA-3’ (SEQ ID NO: 62)5’-mU*fA*mUfGfGmAmAfAfUmGmGmCmUfUmUfAmAfGmAmG*mA*mA-3’ (SEQ ID NO: 63) ;wherein m represents 2’ -O-methyl nucleotides, f represents 2’ -fluoro nucleotides, and *represents PS bonds.17.The interfering RNA of claim16, wherein the 3’ end of the sense strand is conjugated to a targeting moiety, which optionally comprises one or more GalNAc moieties, and / or wherein the 5’ end of the antisense strand is conjugated to a cap, which optionally is an (E) -vinylphosphonate moiety.18.The interfering RNA of claim 17, wherein the targeting moiety comprises three GalNAc moieties; optionally wherein the interfering RNAis free of the 5’ end cap.19.A pharmaceutical composition comprising an interfering RNA of any one of claims 1-18 and a pharmaceutically acceptable carrier.20.Amethod for treating a liver disease or a metabolic disease in a subject, the method comprising:administering to a subject in need thereof an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an interfering RNA and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the interfering RNAtargets an ANT2 mRNA.21.The method of claim 20, wherein the subject is a human patient having or at risk for the liver disease or the metabolic disease.22.The method of claim 21, wherein the human patient has or is at risk for the metabolic disease, which is obesity.23.The method of any one of claims 20-22, wherein the interfering RNA is set forth in any one of claims 1-18.

Images