Compositions and Methods for Inactivating Glutamine Synthetase Gene Expression

Abstract

The present disclosure provides methods and compositions for inactivating a glutamine synthetase (GS) gene. Zinc finger DNA-binding domains engineered to bind in a GS gene and fusion proteins comprising a zinc finger DNA-binding domain and a cleavage domain are provided herein. Methods of using the zinc finger proteins and fusions thereof to inactivate GS in a cell or cell line are also provided.

Description

Compositions and Methods for Inactivating Glutamine Synthetase Gene ExpressionFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present disclosure relates to the fields of genome engineering, cell culture, generation of cell lines and protein production, in particular to compositions and methods for inactivating glutamine synthetase gene expression.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Glutamine synthetase (GS) is a key enzyme in the synthesis of the amino acid L-glutamine. Lack of L-glutamine will seriously affect protein synthesis and cell growth in cells. At present, GS is often used as a selection marker gene in the CHO cell recombinant protein expression system. During the screening process, the GS inhibitor methionine sulfoximine (MSX) needs to be used to achieve selection. GS-negative cell lines are nutritionally deficient for L-glutamine because they cannot synthesize active L-glutamine independently. The cells can only grow in a medium supplemented with glutamine. By taking advantage of this nutritional deficiency, exogenous GS and the coding gene of the target protein can be co-transfected into the cell, and cells in which the GS gene has been stably integrated can be screened by using a medium without glutamine. In addition, the additional addition of the GS inhibitor MSX to the culture medium can further enhance the screening pressure, thereby improving the expression of the target protein.

[0003] Previously, some methods for cell gene editing have been reported, including reports on the use of zinc finger nucleases (ZFNs) for GS knockout. Through the fusion of an engineered zinc finger protein binding domain for a specified target sequence and the Fok I catalytic domain, the DNA encoding the ZFN and the Fok I catalytic domain is transiently transfected and co-proliferated and expressed with the cells to be edited. As the cells grow and the ZFN is expressed, the ZFN can form double-stranded DNA breaks (DSBs) at the selected genomic location. Then, through the cell's own DNA repair mechanism or through homology-directed repair methods, non-homologous end rejoining (NHEJ) -mediated DSB repair errors are corrected to achieve the knockout of the target locus in mammalian cells and the selected genome, thereby achieving the purpose of gene editing.

[0004] The literature mentioned that the GS gene has 7 exons in CHO cells, and provided some protein combinations that can target the sixth exon of the GS gene in CHO cells for destruction and knockout, which can partially or completely inactivate the expression of this part of the GS genome. These combinations can cause around 10%chromosome modification in CHO-K1 cells, and homozygotes of a given mutation were obtained by isolating a single cell line, which cannot grow in the absence of exogenous glutamine.SUMMARY OF THE INVENTION

[0005] Disclosed herein are compositions for the partial or complete inactivation of a GS gene. Also disclosed herein are methods of making and using these compositions, for example to inactivate GS in a cell to produce cell lines in which a GS gene is inactivated. GS disrupted cell lines are useful, for example, in production of recombinant proteins.

[0006] In one aspect, the present disclosure provides zinc finger DNA-binding domains engineered to bind in a GS gene. Any of the zinc finger DNA-binding domains described herein may include 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more zinc finger recognition regions, each having a recognition helix that binds to a target subsite in a GS gene. In certain embodiments, the zinc finger DNA-binding domains comprise 5 or 6 fingers (wherein the individual zinc finger recognition regions are designated F1, F2, F3, F4, F5 and F6) and comprise the amino acid sequence shown in Table 1.

[0007] In some embodiments, the zinc finger DNA-binding domain comprising five or six zinc finger recognition regions ordered F1 to F5 or F6 from N-terminus to C-terminus, wherein the recognition regions are selected from the group consisting of: (i) F1: DCRDLAR (SEQ ID NO: 13) ; F2: TSGELVR (SEQ ID NO: 12) ; F3: RADNLTE (SEQ ID NO: 11) ; F4: RSDELVR (SEQ ID NO: 10) ; F5: RRDELNV (SEQ ID NO: 9) ; F6: QRAHLER (SEQ ID NO: 8) ; or (ii) F1: RSDHLTT (SEQ ID NO: 14) ; F2: TSGELVR (SEQ ID NO: 12) ; F3: RSDHLTT (SEQ ID NO: 14) ; F4: QSSNLVR (SEQ ID NO: 15) ; F5: RADNLTE (SEQ ID NO: 11) .

[0008] In another aspect, a pair of zinc finger DNA-binding domains is provided herein. Each zinc finger DNA-binding domain comprises five or six zinc finger recognition regions ordered F1 to F5 or F6 from N-terminus to C-terminus, wherein the recognition regions of each zinc finger DNA-binding domain are selected from the group consisting of: (i) F1: DCRDLAR (SEQ ID NO: 13) ; F2: TSGELVR (SEQ ID NO: 12) ; F3: RADNLTE (SEQ ID NO: 11) ; F4: RSDELVR (SEQ ID NO: 10) ; F5: RRDELNV (SEQ ID NO: 9) ; F6: QRAHLER (SEQ ID NO: 8) ; and (ii) F1: RSDHLTT (SEQ ID NO: 14) ; F2: TSGELVR (SEQ ID NO: 12) ; F3: RSDHLTT (SEQ ID NO: 14) ; F4: QSSNLVR (SEQ ID NO: 15) ; F5: RADNLTE (SEQ ID NO: 11) .

[0009] In another aspect, the present disclosure provides fusion proteins comprising any of the zinc finger proteins or any pair of the zinc finger proteins described herein and at least one cleavage domain or at least one cleavage half-domain. In certain embodiments, the cleavage domain is a FokI cleavage domain. In certain embodiments, the cleavage half-domain is a wild-type FokI cleavage half-domain. In other embodiments, the cleavage half-domain is an engineered FokI cleavage half-domain. In certain embodiments, the fusion protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 5. In certain embodiments, each of the pair of fusion proteins comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and 5 respectively.

[0010] In yet another aspect, the present disclosure provides a polynucleotide encoding any of the polypeptides or proteins described herein. In certain embodiments, the polynucleotide encodes any of the zinc finger proteins described herein. In certain embodiments, a pair of polynucleotide encodes any pair of the zinc finger proteins is provided. In certain embodiments, the polynucleotide encodes the fusion protein described herein. In certain embodiments, a pair of the polynucleotide encodes any pair of the fusion proteins described herein. In certain embodiments, the polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, 17, 18 or 19.

[0011] In yet another aspect, the present disclosure provides an isolated cell comprising any of the proteins and / or polynucleotides as described herein. In certain embodiments, GS is inactivated (partially or fully) in the cell.

[0012] In addition, methods of using the zinc finger proteins and fusions thereof to inactivate GS in a cell or cell line are provided. Thus, in another aspect, the present disclosure provides a method for inactivating a cellular GS gene (e.g., an endogenous GS gene) in a cell, the method comprising introducing into the cell a nucleic acid encoding the fusion protein described herein. In some embodiments, the method comprises introducing into the cell one or more nucleic acids encoding the pair of fusion proteins described herein. The fusion protein or the pair of fusion proteins bind to a target site and cleave the GS gene.

[0013] In certain embodiments, the pair of fusion proteins dimerize to cleave the GS gene. In certain embodiments, the method can efficiently knock out the entire or the portion of the corresponding GS coding gene in CHO cells, thereby achieving the purpose of constructing a host cell with GS gene knockout.

[0014] In yet another aspect, the disclosure provides a method of producing a recombinant protein of interest in a host cell, the method comprising the steps of: (a) providing a host cell comprising an endogenous GS gene; (b) inactivating the endogenous GS gene of the host cell by any of the methods described herein; and (c) introducing an expression vector comprising a transgene and an exogenous GS gene into the host cell, wherein the transgene comprising a sequence encoding a protein of interest, and wherein the host cell is cultured in glutamine-deficient medium. In certain embodiments, the protein of interest comprises an antibody, e.g., a monoclonal antibody. For example, the monoclonal antibodies may be, and are not limited to, anti-PD-1 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-TIGIT antibody, anti-HER2-antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD137 antibody and anti-CD233 antibody. The monoclonal antibodies may be, and are not limited to, Nivolumab, Pembrolizumab, Toripalimab, Avelumab, Durvalumab, Trastuzumab, Rituximab, Bevacizuma, Adalimumab, and Alemtuzumab.

[0015] In yet another aspect, the disclosure provides a method of producing a cell or cell line in which a glutamine synthetase (GS) gene is inactivated, the method comprising (a) inactivating the GS gene in a cell by any of the methods described herein; and (b) culturing the cell under conditions suitable for generating a cell line in which the GS gene is partially or fully inactivated.

[0016] In certain embodiments, the knocked-out cells cannot express active glutamine synthetase and thus cannot survive in a culture medium without glutamine added.

[0017] In any of the cells and methods described herein, the cell or cell line can be for example, but not limited to a COS, CHO (e.g., CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV) , VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2 / 0-Ag14, HeLa, HEK293 (e.g., HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) , NIH3T3, perC6, insect cell such as Spodopetra fugiperda (Sf) , or fungal cell such as Saccharomyces, Pichia and Schizosaccharomyces.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0018] FIG. 1 illustrates ZFP target region and zinc finger protein recognition regions.

[0019] FIG. 2 illustrates the gene editing efficiency tested by T7E1 kit. In the figure, lane 1 refers to ZFN DNA, lane 2 refers to ZFN RNA, lane 3 refers to negative control, lane 4 refers to positive control, and lane 5 refers to blank.

[0020] FIG. 3 illustrates the viability tendency in different medium. In the figure, GSKO Clone1 / 2-GLN refers to CHO K1 GSKO clone passaged in the medium without glutamine; GSKO Clone1 / 2 +GLN refers to CHO K1 GSKO clone passaged in the medium with glutamine; CHOK1 WT-GLN refers to CHO K1 (wild type) passaged in the medium with glutamine.

[0021] FIG. 4 illustrates the VCD tendency in different medium. In the figure, GSKO-GLN refers to CHO K1 GSKO passaged in the medium without glutamine; GSKO+GLN refers to CHO K1 GSKO passaged in the medium with glutamine; WT-GLN refers to CHO K1 (wild type) passaged in the medium with glutamine.

[0022] FIG. 5 exhibits a map of the GS expression vector used in Example 3.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0023] Described herein are zinc finger DNA-binding domains or fusion proteins and methods for partial or complete inactivation of a GS gene. Also disclosed are methods of producing a cell or cell line in which a glutamine synthetase (GS) gene is inactivated. Inactivation of GS in a target cell can be used to produce cell lines for expression of recombinant proteins, for example monoclonal antibodies with high productivity and high quality.

[0024] Practice of the methods, as well as preparation and use of the compositions disclosed herein employ, unless otherwise indicated, conventional techniques in molecular biology, biochemistry, chromatin structure and analysis, computational chemistry, cell culture, recombinant DNA and related fields as are within the skill of the art. These techniques are fully explained in the literature. See, for example, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley &Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, “Chromatin” (P. M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds. ) , Academic Press, San Diego, 1999; and METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, “Chromatin Protocols” (P. B. Becker, ed. ) Humana Press, Totowa, 1999.

[0025] DEFINITIONS

[0026] As used herein, the terms “nucleic acid, ” “polynucleotide, ” and “oligonucleotide” are used interchangeably and refer to a deoxyribonucleotide or ribonucleotide polymer, in linear or circular conformation, and in either single-or double-stranded form. For the purposes of the present disclosure, these terms are not to be construed as limiting with respect to the length of a polymer. The terms can encompass known analogues of natural nucleotides, as well as nucleotides that are modified in the base, sugar and / or phosphate moieties (e.g., phosphorothioate backbones) . In general, an analogue of a particular nucleotide has the same base-pairing specificity; i.e., an analogue of A will base-pair with T.

[0027] As used herein, the terms “polypeptide, ” “peptide” and “protein” are used interchangeably to refer to a polymer of amino acid residues. The term also applies to amino acid polymers in which one or more amino acids are chemical analogues or modified derivatives of a corresponding naturally-occurring amino acids.

[0028] As used herein, the term “binding protein” is a protein that is able to bind non-covalently to another molecule. A binding protein can bind to, for example, a DNA molecule (aDNA-binding protein) , an RNA molecule (an RNA-binding protein) and / or a protein molecule (aprotein-binding protein) . In the case of a protein-binding protein, it can bind to itself (to form homodimers, homotrimers, etc. ) and / or it can bind to one or more molecules of a different protein or proteins. A binding protein can have more than one type of binding activity. For example, zinc finger proteins have DNA-binding, RNA-binding and protein-binding activity.

[0029] A “zinc finger DNA binding protein” (or binding domain) is a protein, or a domain within a larger protein, that binds DNA in a sequence-specific manner through one or more zinc fingers, which are regions of amino acid sequence within the binding domain whose structure is stabilized through coordination of a zinc ion. The term zinc finger DNA binding protein is often abbreviated as “zinc finger protein” or ZFP. Zinc finger binding domains can be “engineered” to bind to a predetermined nucleotide sequence. Non-limiting examples of methods for engineering zinc finger proteins are design and selection. A designed zinc finger protein is a protein not occurring in nature whose design / composition results principally from rational criteria. Rational criteria for design include application of substitution rules and computerized algorithms for processing information in a database storing information of existing ZFP designs and binding data.

[0030] As used herein, the term “recombination” refers to a process of exchange of genetic information between two polynucleotides. For the purposes of this disclosure, “homologous recombination (HR) ” refers to the specialized form of such exchange that takes place, for example, during repair of double-strand breaks in cells. This process requires nucleotide sequence homology, uses a “donor” molecule to template repair of a “target” molecule (i.e., the one that experienced the double-strand break) , and is variously known as “non-crossover gene conversion” or “short tract gene conversion, ” because it leads to the transfer of genetic information from the donor to the target. Without wishing to be bound by any particular theory, such transfer can involve mismatch correction of heteroduplex DNA that forms between the broken target and the donor, and / or “synthesis-dependent strand annealing, ” in which the donor is used to resynthesize genetic information that will become part of the target, and / or related processes. Such specialized HR often results in an alteration of the sequence of the target molecule such that part or all of the sequence of the donor polynucleotide is incorporated into the target polynucleotide.

[0031] As used herein, the term “cleavage” refers to the breakage of the covalent backbone of a DNA molecule. Cleavage can be initiated by a variety of methods including, but not limited to, enzymatic or chemical hydrolysis of a phosphodiester bond. Both single-stranded cleavage and double-stranded cleavage are possible, and double-stranded cleavage can occur as a result of two distinct single-stranded cleavage events. DNA cleavage can result in the production of either blunt ends or staggered ends. In certain embodiments, fusion polypeptides are used for targeted double-stranded DNA cleavage. An “cleavage half-domain” is a polypeptide sequence which, in conjunction with a second polypeptide (either identical or different) forms a complex having cleavage activity (preferably double-strand cleavage activity) . The terms “first and second cleavage half-domains; ” “+ and -cleavage half-domains” and “right and left cleavage half-domains” are used interchangeably to refer to pairs of cleavage half-domains that dimerize. An “engineered cleavage half-domain” is a cleavage half-domain that has been modified so as to form obligate heterodimers with another cleavage half-domain (e.g., another engineered cleavage half-domain) . See, also, U.S. Patent Publication Nos. 2005 / 0064474; 2007 / 0218528 and 2008 / 0131962, incorporated herein by reference in their entireties.

[0032] As used herein, the term “target site” or “target sequence” is a nucleic acid sequence that defines a portion of a nucleic acid to which a binding molecule will bind, provided sufficient conditions for binding exist. For example, the sequence 5′-GAATTC-3′is a target site for the Eco RI restriction endonuclease.

[0033] As used herein, the term “endogenous” molecule is one that is normally present in a particular cell at a particular developmental stage under particular environmental conditions. For example, an endogenous nucleic acid can comprise a chromosome, the genome of a mitochondrion, chloroplast or other organelle, or a naturally-occurring episomal nucleic acid. Additional endogenous molecules can include proteins, for example, transcription factors and enzymes.

[0034] By contrast, an “exogenous” molecule is a molecule that is not normally present in a cell, but can be introduced into a cell by one or more genetic, biochemical or other methods. “Normal presence in the cell” is determined with respect to the particular developmental stage and environmental conditions of the cell. An exogenous molecule can comprise, for example, a functioning version of a malfunctioning endogenous molecule or a malfunctioning version of a normally-functioning endogenous molecule. An exogenous molecule can also be the same type of molecule as an endogenous molecule but derived from a different species than the cell is derived from. For example, a human nucleic acid sequence may be introduced into a cell line originally derived from a mouse or hamster.

[0035] As used herein, the term “fusion” molecule is a molecule in which two or more subunit molecules are linked, preferably covalently. The subunit molecules can be the same chemical type of molecule, or can be different chemical types of molecules. Examples of the first type of fusion molecule include, but are not limited to, fusion proteins (for example, a fusion between a ZFP DNA-binding domain and a cleavage domain) and fusion nucleic acids (for example, a nucleic acid encoding the fusion protein described supra) . Examples of the second type of fusion molecule include, but are not limited to, a fusion between a triplex-forming nucleic acid and a polypeptide, and a fusion between a minor groove binder and a nucleic acid.

[0036] Expression of a fusion protein in a cell can result from delivery of the fusion protein to the cell or by delivery of a polynucleotide encoding the fusion protein to a cell, wherein the polynucleotide is transcribed, and the transcript is translated, to generate the fusion protein. Trans-splicing, polypeptide cleavage and polypeptide ligation can also be involved in expression of a protein in a cell. Methods for polynucleotide and polypeptide delivery to cells are presented elsewhere in this disclosure.

[0037] As used herein, the term “gene expression” refers to the conversion of the information, contained in a gene, into a gene product. A gene product can be the direct transcriptional product of a gene (e.g., mRNA, tRNA, rRNA, antisense RNA, shRNAs, micro RNAs (miRNAs) ribozyme, structural RNA or any other type of RNA) or a protein produced by translation of a mRNA. Gene products also include RNAs which are modified, by processes such as capping, polyadenylation, methylation, and editing, and proteins modified by, for example, methylation, acetylation, phosphorylation, ubiquitination, ADP-ribosylation, myristilation, and glycosylation. “Modulation” of gene expression refers to a change in the activity of a gene. Modulation of expression can include, but is not limited to, gene activation and gene repression. Gene inactivation refers to any reduction in gene expression as compared to a cell that does not include a ZFP as described herein. Thus, gene inactivation may be complete (knock-out) or partial (e.g., a hypomorph in which a gene exhibits less than normal expression levels or a product of a mutant gene that shows partial reduction in the activity it influences) .

[0038] The terms “operative linkage” and “operatively linked” (or “operably linked” ) are used interchangeably with reference to a juxtaposition of two or more components (such as sequence elements) , in which the components are arranged such that both components function normally and allow the possibility that at least one of the components can mediate a function that is exerted upon at least one of the other components. By way of illustration, a transcriptional regulatory sequence, such as a promoter, is operatively linked to a coding sequence if the transcriptional regulatory sequence controls the level of transcription of the coding sequence in response to the presence or absence of one or more transcriptional regulatory factors. A transcriptional regulatory sequence is generally operatively linked in cis with a coding sequence, but need not be directly adjacent to it. For example, an enhancer is a transcriptional regulatory sequence that is operatively linked to a coding sequence, even though they are not contiguous.

[0039] With respect to fusion polypeptides, the term “operatively linked” can refer to the fact that each of the components performs the same function in linkage to the other component as it would if it were not so linked. For example, with respect to a fusion polypeptide in which a ZFP DNA-binding domain is fused to a cleavage domain, the ZFP DNA-binding domain and the cleavage domain are in operative linkage if, in the fusion polypeptide, the ZFP DNA-binding domain portion is able to bind its target site and / or its binding site, while the cleavage domain is able to cleave DNA in the vicinity of the target site.

[0040] As used herein, the term “monoclonal antibody” refers to an antibody composition having a homogeneous antibody population. The term is not limited regarding the species or source of the antibody, nor is it intended to be limited by the manner in which it is made. The term encompasses whole immunoglobulins as well as fragments such as Fab, F (ab′) 2, Fv, and other fragments, as well as chimeric and humanized homogeneous antibody populations that exhibit immunological binding properties of the parent monoclonal antibody molecule.

[0041] Zinc Finger Nucleases

[0042] Described herein are zinc finger nucleases (ZFNs) that can be used for inactivation of a GS gene. ZFNs comprise a zinc finger protein (ZFP) and a nuclease (cleavage) domain.

[0043] A. Zinc Finger Proteins

[0044] Zinc finger binding domains can be engineered to bind to a sequence of choice. An engineered zinc finger binding domain can have a novel binding specificity, compared to a naturally-occurring zinc finger protein. Engineering methods include, but are not limited to, rational design and various types of selection. Rational design includes, for example, using databases comprising triplet (or quadruplet) nucleotide sequences and individual zinc finger amino acid sequences, in which each triplet or quadruplet nucleotide sequence is associated with one or more amino acid sequences of zinc fingers which bind the particular triplet or quadruplet sequence.

[0045] Selection of target sites; ZFPs and methods for design and construction of fusion proteins (and polynucleotides encoding same) are known to those of skill in the art and described in detail in U.S. Patent Application Publication Nos. 20050064474 and 20060188987, incorporated by reference in their entireties herein.

[0046] In addition, as disclosed in these and other references, zinc finger domains and / or multi-fingered zinc finger proteins may be linked together using any suitable linker sequences. The proteins described herein may include any combination of suitable linkers between the individual zinc fingers of the protein.

[0047] A number of zinc finger binding domains have been engineered to bind to nucleotide sequences in the GS gene are shown. The target sequences (SEQ ID NO: 6 and 7) and zinc-finger designs of ZFN-S3-R (F1-F6) and ZFN-S4-L (F1’ -F5’ ) are shown in Table 1. ZFN-S3-R contains 6 recognition regions, and ZFN-S4-L contains 5 recognition regions.

[0048] Table 1. ZFN design and its target sequence in the CHO GS gene

[0049] As described below, in certain embodiments, a five-, or six-recognition region as shown in Table 1 is fused to a cleavage domain of a Type IIs restriction endonuclease such as FokI. One or more pairs of such zinc finger / nuclease fusions are used for targeted cleavage.

[0050] For targeted cleavage, the near edges of the binding sites can separated by 5 or more nucleotide pairs, and each of the fusion proteins can bind to an opposite strand of the DNA target. All pairwise combinations of the proteins shown in Table 1 can be used for targeted cleavage of a GS gene. Following the present disclosure, ZFNs can be targeted to any sequence in a GS gene.

[0051] B. Cleavage Domains

[0052] The ZFNs also comprise a nuclease (cleavage domain, cleavage half-domain) . The cleavage domain portion of the fusion proteins disclosed herein can be obtained from any endonuclease or exonuclease. Exemplary endonucleases from which a cleavage domain can be derived include, but are not limited to, restriction endonucleases and homing endonucleases. See, for example, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, Mass. ; and Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388. Additional enzymes which cleave DNA are known (e.g., S1 Nuclease; mung bean nuclease; pancreatic DNase I; micrococcal nuclease; yeast HO endonuclease; see also Linn et al. (eds. ) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993) . One or more of these enzymes (or functional fragments thereof) can be used as a source of cleavage domains and cleavage half-domains.

[0053] Restriction endonucleases (restriction enzymes) are present in many species and are capable of sequence-specific binding to DNA (at a recognition site) , and cleaving DNA at or near the site of binding. Certain restriction enzymes (e.g., Type IIS) cleave DNA at sites removed from the recognition site and have separable binding and cleavage domains. For example, the Type IIS enzyme Fok I catalyzes double-stranded cleavage of DNA, at 9 nucleotides from its recognition site on one strand and 13 nucleotides from its recognition site on the other. Thus, in one embodiment, fusion proteins comprise the cleavage domain (or cleavage half-domain) from at least one Type IIS restriction enzyme and one or more zinc finger binding domains, which may or may not be engineered.

[0054] An exemplary Type IIS restriction enzyme, whose cleavage domain is separable from the binding domain, is Fok I. This particular enzyme is active as a dimer. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10, 570-10, 575. Accordingly, for the purposes of the present disclosure, the portion of the Fok I enzyme used in the disclosed fusion proteins is considered a cleavage half-domain. Thus, for targeted double-stranded cleavage and / or targeted replacement of cellular sequences using zinc finger-Fok I fusions, two fusion proteins, each comprising a FokI cleavage half-domain, can be used to reconstitute a catalytically active cleavage domain. Alternatively, a single polypeptide molecule containing a zinc finger binding domain and two Fok I cleavage half-domains can also be used. In certain embodiments, the cleavage domain comprises one or more engineered cleavage half-domain (also referred to as dimerization domain mutants) that minimize or prevent homodimerization, as described, for example, in U.S. Patent Publication Nos. 20050064474; 20060188987 and 20080131962, the disclosures of all of which are incorporated by reference in their entireties herein. Amino acid residues at positions 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, and 538 of Fok I are all targets for influencing dimerization of the Fok I cleavage half-domains.

[0055] Delivery

[0056] The ZFNs described herein may be delivered to a target cell by any suitable means. Suitable cells include but not limited to eukaryotic and prokaryotic cells and / or cell lines. Non-limiting examples of such cells or cell lines include COS, CHO (e.g., CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV) , VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2 / 0-Ag14, HeLa, HEK293 (e.g., HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) , and perC6 cells as well as insect cells such as Spodopetra fugiperda (Sf) , or fungal cells such as Saccharomyces, Pichia and Schizosaccharomyces.

[0057] ZFNs as described herein may be delivered using vectors containing sequences encoding one or more of the ZFNs. Any vector systems may be used including, but not limited to, plasmid vectors, retroviral vectors, lentiviral vectors, adenovirus vectors, poxvirus vectors; herpesvirus vectors and adeno-associated virus vectors, etc. Furthermore, it will be apparent that any of these vectors may comprise one or more ZFN encoding sequences. Thus, when one or more pairs of ZFNs are introduced into the cell, the ZFNs may be carried on the same vector or on different vectors. When multiple vectors are used, each vector may comprise a sequence encoding one or multiple ZFNs.

[0058] Conventional viral and non-viral based gene transfer methods can be used to introduce nucleic acids encoding engineered ZFPs in cells (e.g., mammalian cells) and target tissues. Such methods can also be used to administer nucleic acids encoding ZFPs to cells in vitro. In certain embodiments, nucleic acids encoding ZFPs are administered for in vivo or ex vivo gene therapy uses. Non-viral vector delivery systems include DNA plasmids, naked nucleic acid, and nucleic acid complexed with a delivery vehicle such as a liposome or poloxamer. Viral vector delivery systems include DNA and RNA viruses, which have either episomal or integrated genomes after delivery to the cell.

[0059] Methods of non-viral delivery of nucleic acids encoding engineered ZFPs include electroporation, lipofection, microinjection, biolistics, virosomes, liposomes, immunoliposomes, polycation or lipid: nucleic acid conjugates, naked DNA, artificial virions, and agent-enhanced uptake of DNA. Sonoporation using, e.g., the Sonitron 2000 system (Rich-Mar) can also be used for delivery of nucleic acids.

[0060] Applications

[0061] The disclosed methods and compositions can be used for inactivation of a GS genomic sequence. As noted above, inactivation includes partial or complete repression of GS gene expression in a cell. Inactivation of a GS gene can be achieved, for example, by a single cleavage event, by cleavage followed by non-homologous end joining, by cleavage at two sites followed by joining so as to delete the sequence between the two cleavage sites, by targeted recombination of a missense or nonsense codon into the coding region, by targeted recombination of an irrelevant sequence (i.e., a “stuffer” sequence) into the gene or its regulatory region, so as to disrupt the gene or regulatory region, or by targeting recombination of a splice acceptor sequence into an intron to cause mis-splicing of the transcript. Thus, the methods and compositions described herein allow for the generation of GS-deficient cell lines for use in recombinant protein production, for example monoclonal antibody production.

[0062] Sequences used in the present disclosure

[0063] The following examples are offered to illustrate but not to limit the invention. In order to facilitate understanding, the specific embodiments are provided to help interpret the technical proposal, that is, these embodiments are only for illustrative purposes, but not in any way to limit the scope of the invention. Unless otherwise specified, embodiments do not indicate the specific conditions, are in accordance with the conventional conditions or the manufacturer's recommended conditions.

[0064] EXAMPLES

[0065] Example 1: Design and construction of ZFN plasmid for GS knock out

[0066] 1.1 Glutamine synthetase (GS) ZFNs

[0067] Zinc finger nuclease (ZFN) technology identifies specific sites through the α helix structure composed of different amino acid sequences, and then cuts by nuclease to achieve the purpose of gene editing. ZFN target sites in exon 6 of the CHO GS gene were selected for the design of ZFNs because this region encodes amino acids critical for the catalytic function of the GS protein.

[0068] In this example, one pair of ZFN sequences (SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5) targeted to the target site (SEQ ID NO: 1) in exon 6 of GS gene of Chinese hamster ovary cell (CHO) genome were designed. The target sequences and the finger designs of these ZFNs are shown in Table 1.

[0069] The Fok1 gene fragment containing 5’ UTR with the T7 promoter and 3’ UTR was synthesized and cloned into the in-house vector pWX4.0 to generate the intermediate vector, then the ZFP gene fragments were synthesized and cloned into the intermediate vector respectively to generate the final ZFN plasmids (pWX4.0-S3-R and pWX4.0-S4-L) that comprises the ZFN-S3-R DNA and the ZFN-S4-L DNA respectively. Both DNAs respectively contain ZFP and FokI genes according to the present disclosure, the sequences thereof are shown in SEQ ID NO: 6 and 8. Finally, the ZFN plasmids (pWX4.0-S3-R and pWX4.0-S4-L) were midi-prepped for transfection use.

[0070] 1.2 Transfection of host cell

[0071] 50 μg the ZFN plasmids (pWX4.0-S3-R and pWX4.0-S4-L) were mixed with 1×107 CHO-K1 (ATCC No. : CCL 61) host cell, and then put into the Bio-rad electroconverter using the proper procedure to start the transfection. After transfection, the cells were added into the pre-warmed CD CHO complete medium and cultured in a CO2 static incubator at 30℃, 6%CO2.

[0072] 48 hours post transfection, culture temperature was shifted to 36.5℃ and the cells were then harvested two days later to prepare genome DNA. The primers GS-EX6-FP (SEQ ID NO: 2) and GS-EX6-RP (SEQ ID NO: 3) were used to amplify the target region of GS gene. The gene editing efficiency were tested using T7E1 kit (Vazyme, Cat#EN303) . As shown in the FIG. 2 and lane 1, the gene editing efficiency of ZFN DNA (pWX4.0-S3-R and pWX4.0-S4-L) was 27.0%.

[0073] Double-stranded DNAs of S3-R (containing ZFP and FokI genes) and S4-L (containing ZFP and FokI genes) were obtained by PCR amplification using ZFN plasmids (pWX4.0-S3-R and pWX4.0-S4-L) as templates respectively and the poly (A) sequences were introduced at the 3' end of each double-stranded DNA by primer. Finally, mRNA synthesis was performed by using the double-stranded DNAs above as the templates, in vitro transcription, capping reaction and RNA cleanup processes were performed to prepare the final ZFN RNAs (RNA-S3-R and RNA-S4-L, SEQ ID NO: 7 and 9) following the manufacturer’s instructions.

[0074] 10 μg ZFN RNA (RNA-S3-R and RNA-S4-L) were also used for another transfection follow the protocol described before. The cells were harvested to prepare genome DNA. The gene editing efficiency were tested using T7E1 kit. As shown in the FIG. 2 and lane 2, the gene editing efficiency of ZFN RNA (RNA-S3-R and RNA-S4-L) was 60.0%.

[0075] CHO K1 (wild type) cell were harvested to prepare genome DNA and treated with T7E1 kit as negative control. The result was shown in the FIG. 2 and lane 3. Control template in the kit were treated by T7E1 as positive control and result was shown in the FIG. 2 and lane 4.

[0076] Example 2: GS gene knock out by ZFN

[0077] The wild type CHO-K1 was transfected with RNA (RNA-S3-R and RNA-S4-L) encodes the ZFN protein according to the present disclosure. After transfection, single cell clone were isolated by FACS and sorted into new 96-well plates. Pictures were taken on the sorting day and one day after sorting day as evidence to verify monoclones. The glutamine dependency assay was performed both in well plate and spin tube. 14 days post sorting, cells were passaged in the medium with glutamine and without glutamine in parallel. The clones can’ t survive in the medium without glutamine and the verified monoclones were picked and expanded into 24-well plates and finally into spin tubes for clone passage. After expanded into spin tube, clones were performed with another round of glutamine dependency assay. The clones selected and sequenced by NGS to confirm whether the GS gene was successfully knocked out.

[0078] The NGS test results for some clones were shown in Table 2. The sequencing revealed that GS gene was knocked out by ZFN protein according to the present disclosure. For example, in GS KO Clone 1, the deletions of certain nucleotides result in a shift in the open reading frame or an in-frame deletion of critical amino acids; in GS KO Clone 2, the substitutions and deletions of certain nucleotides result in a shift in the open reading frame or an in-frame mutation of critical amino acids as well. Therefore, the clones are expected to produce no active GS enzyme.

[0079] Table 2. GS gene knock out sequencing result

[0080] The host cell clones were also test for killing curve using the CD CHO complete medium without glutamine to see if the cells can survive in media without glutamine.

[0081] The viability tendency are shown in FIG. 3. The viable cell density (VCD) tendency are shown in FIG. 4. As predicted, GS knock out host cell clones almost cannot grow in the absence of exogenous L-glutamine, in contrast to wild-type CHO cells.

[0082] Example 3: Expression of monoclonal antibody (mAb) in GS- / -host cell

[0083] 1. mAb vector construction

[0084] An in-house developed anti-PD-1 antibody was used in this example. The heavy chain and light chain of the antibody were constructed to the in-house GS expression vector (pWX138-LC-HC-GS-127A, the map of which is shown in FIG. 5) . The promotor for GS is SV40. The GS expression vector (pWX138-LC-HC-GS-127A) was midi-prepped for transfection use.

[0085] 2. Transfection and pool selection

[0086] The CHO K1 GS knock out host cell clone 1 according to the present disclosure was prepared for transfection. 1 x 107 host cells were prepared and mixed with 20μg plasmid (pWX138-LC-HC-GS-127A) for transfection. After transfection, the cells were added into 10mL fresh pre-warmed CD CHO medium with glutamine, mixed well and then incubated in a static incubator with a culture condition of 36.5 ℃ and 6%CO2.

[0087] 24 hours post transfection, the pools were centrifuged. The supernatant was discarded and then re-suspended in pre-warmed BM3-2 media without glutamine and with MSX. Pools were passaged every 2 to 4 days at a proper seed density. The culture conditions were: 36.5 ℃, 6%CO2, 85%humidity and 225RPM.

[0088] When the viability recovered to 95%, the pools were inoculated to fed-batch using the platform fed-batch process. After 14 days fed-batch culture, cells were harvested. The titer was tested for the supernatant. The harvest supernatant was also purified for one-step protein A purification and sent for product quality analysis including SEC, icIEF and N-glycan.

[0089] Size exclusion chromatography (SEC) is commonly used to monitor the aggregation or high molecular weight species (HMWs) of the biomolecules. For the analysis, 10 μg of protein sample is injected into the Waters ACQUITY BEH column (4.6×150 mm, 1.7 μm particle size) via a high performance liquid chromatography equipped with UV detector. The molecule is eluted using mobile phase with 50 mM phosphate buffer, 300 mM sodium chloride at pH 6.8 ± 0.1 under an isocratic gradient. The separation is achieved as the HMWs is excluded from the pore and eluates before the low molecular weight species (LMWs) . The raw data is processed with Empower 3 and the relative percentage of HMWS, monomer and LMWS is reported.

[0090] iCIEF is a purity analysis method used to monitor the percentage of charge variant species. The isoelectric point (pI) is an intrinsic property of a specific protein molecule and is the pH at which the protein molecule does not carry net electrical charge. Under an external electric field, the charge variants move along a continuous pH gradient formed by ampholytes and stop at where the pH equals pI. The electropherogram is obtained at 280 nm.

[0091] For this protein, 20 μg of protein sample was mixed with 80 μL master mix, which was composed of 0.5 μL of pI 6.61, 0.5 μL of pI 9.22, 2 μL of Pharmalyte 3-10, 2 μL of Pharmalyte 5-8, 35 μL of 1%methyl cellulose, and 40.0 μL of ultrapure water. The mixture was then analyzed with capillary isoelectric focusing electrophoresis system iCE3. The detection parameters were summarized in Table 3. In the electropherogram, the peaks on the left of the main peak were referred as acidic peaks, and the peaks on the right of the main peak were referred as basic peaks. The pI value and the relative percentage of the acidic peaks, main peak, and basic peaks were quantitated and reported using the chromatographic software (Empower 3) .

[0092] Table 3. Capillary Isoelectric Focusing Analyzer Parameters

[0093] *:The temperature is set to 5 ℃, and the actual range is 3 ℃ -7 ℃.

[0094] N-glycan analysis was performed by Agilent Gly-X N-Glycan Rapid Release and Labeling with InstantPC Kit. After glycoprotein denaturation, N-glycans were released from protein by Gly-X N-Glycanase at 50℃ for 5 min. Then the sample was labeled by Gly-X InstantPC Dye Solution at 50℃ for 5 min. The labeled glycans were separated by Gly-X InstantPC Cleanup Module to remove excess InstantPC labeling and protein and then detected by hydrophilic interaction liquid chromatography with ACQUITY  BEH Amide Column. Fluorescence chromatograms were acquired with the detector set at excitation wavelength of 285 nm and emission wavelength of 345 nm by UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography) . Finally, glycoforms were identified by their retention time and quantified by their relative peak area.

[0095] The results are shown in Table 4. The monoclonal antibody expressed by GS- / -host cells has high productivity and product quality.

[0096] Table 4. Productivity and Product Quality of GS Pool

Claims

1.A zinc finger DNA-binding domain comprising five or six zinc finger recognition regions ordered F1 to F5 or F6 from N-terminus to C-terminus,wherein the recognition regions are selected from the group consisting of:(i) F1: DCRDLAR (SEQ ID NO: 13) ;F2: TSGELVR (SEQ ID NO: 12) ;F3: RADNLTE (SEQ ID NO: 11) ;F4: RSDELVR (SEQ ID NO: 10) ;F5: RRDELNV (SEQ ID NO: 9) ;F6: QRAHLER (SEQ ID NO: 8) ; or(ii) F1: RSDHLTT (SEQ ID NO: 14) ;F2: TSGELVR (SEQ ID NO: 12) ;F3: RSDHLTT (SEQ ID NO: 14) ;F4: QSSNLVR (SEQ ID NO: 15) ;F5: RADNLTE (SEQ ID NO: 11) .2.A pair of zinc finger DNA-binding domains, wherein each zinc finger DNA-binding domain comprises five or six zinc finger recognition regions ordered F1 to F5 or F6 from N-terminus to C-terminus,wherein the recognition regions of each zinc finger DNA-binding domain are selected from the group consisting of:(i) F1: DCRDLAR (SEQ ID NO: 13) ;F2: TSGELVR (SEQ ID NO: 12) ;F3: RADNLTE (SEQ ID NO: 11) ;F4: RSDELVR (SEQ ID NO: 10) ;F5: RRDELNV (SEQ ID NO: 9) ;F6: QRAHLER (SEQ ID NO: 8) ; and(ii) F1: RSDHLTT (SEQ ID NO: 14) ;F2: TSGELVR (SEQ ID NO: 12) ;F3: RSDHLTT (SEQ ID NO: 14) ;F4: QSSNLVR (SEQ ID NO: 15) ;F5: RADNLTE (SEQ ID NO: 11) .3.A fusion protein comprising the zinc finger DNA-binding domain according to claim 1 and at least one cleavage domain or at least one cleavage half-domain.4.The fusion protein according to claim 3, wherein the fusion protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 5.5.A pair of fusion proteins, wherein each fusion protein comprises one of the pair of zinc finger DNA-binding domains according to claim 2 and at least one cleavage domain or at least one cleavage half-domain.6.The fusion protein according to claim 3 or the pair of fusion proteins according to claim 5, wherein the cleavage domain is a FokI cleavage domain, or wherein the cleavage half-domain is a wild-type FokI cleavage half-domain or an engineered FokI cleavage half-domain.7.A polynucleotide encoding the zinc finger DNA-binding domain according to claim 1.8.A polynucleotide encoding the fusion protein according to claim 4.9.The polynucleotide according to claim 8 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, 17, 18 or 19.10.An isolated cell comprising the polynucleotide according to any one of claims 7-9.11.A method of inactivating an endogenous cellular GS gene in a cell, the method comprising introducing into the cell a nucleic acid encoding the fusion protein according to claim 3, such that the fusion protein is expressed in the cell, whereby the fusion protein binds to a target site and cleaves the GS gene.12.A method of inactivating an endogenous cellular GS gene in a cell, the method comprising introducing into the cell one or more nucleic acids encoding the pair of fusion proteins according to claim 5, such that the pair of fusion proteins are expressed in the cell, whereby the fusion proteins bind to a target site and cleave the GS gene.13.The method of claim 12, wherein the pair of fusion proteins dimerize to cleave the GS gene.14.A method of producing a recombinant protein of interest in a host cell, the method comprising the steps of:(a) providing a host cell comprising an endogenous GS gene;(b) inactivating the endogenous GS gene of the host cell by the method of claim 11 or 12; and(c) introducing an expression vector comprising a transgene and an exogenous GS gene into the host cell, wherein the transgene comprising a sequence encoding a protein of interest, and wherein the host cell is cultured in glutamine-deficient medium.15.The method according to claim 14, wherein the protein of interest is a monoclonal antibody; preferably, the monoclonal antibody comprises anti-PD-1 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-TIGIT antibody, anti-HER2-antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD137 antibody and , anti-CD233 antibody;more preferably, the monoclonal antibody comprises Nivolumab, Pembrolizumab, Toripalimab, Avelumab, Durvalumab, Trastuzumab, Rituximab, Bevacizuma, Adalimumab, and Alemtuzumab.16.A method of producing a cell or a cell line in which a glutamine synthetase (GS) gene is inactivated, the method comprising(a) inactivating the GS gene in a cell according to the method of claim 11 or 12; and(b) culturing the cell under conditions suitable for generating a cell line in which the GS gene is partially or fully inactivated.17.The method according to claim 16, wherein the cell or the cell line is a mammalian cell selected from the group consisting of a COS cell, a CHO cell, a VERO cell, a MDCK cell, a WI38 cell, a V79 cell, a B14AF28-G3 cell, a BHK cell, a HaK cell, a NS0 cell, a SP2 / 0-Ag14 cell, a HeLa cell, an HEK293 cell, and a perC6 cell.18.A cell or a cell line produced by the method according to claim 16 or 17.

Images