Method for extracting bioactive extracts from oryza and / or camellia plants and use thereof

Abstract

A method for extracting bioactive extracts, comprising: (1) contacting a fragmented plant material of Oryza and / or Camellia plants with a polar solvent, followed by separation to yield a crude extract; and (2) fermenting the crude extract with a microorganism, and purifying a fermented product to yield desired bioactive extracts. These bioactive extracts are used to prepare compositions for skin care products, gastric health products, and aquaculture food products. Further provided are the compositions comprising the bioactive extracts.

Description

METHOD FOR EXTRACTING BIOACTIVE EXTRACTS FROM ORYZA AND / OR CAMELLIA PLANTS AND USE THEREOFFIELD OF TECHNOLOGY

[0001] The present disclosure relates to the technical field of plant active substance extraction, and particularly relates to a method for extracting bioactive extracts from Oryza and / or Camellia plants and use thereof.BACKGROUND

[0002] Rice is the seed of the grass species Oryza sativa or Oryza glaberrema, a cereal belonging to the family Poaceae, which is cultivated worldwide and is a staple food source for over half of the world’s human population. Prior to human consumption, the rice grain is typically dried and then milled to remove the outer layers, i.e., the husk and bran which consist primarily of insoluble fibre, and to isolate the carbohydrate-rich endosperm.

[0003] Rice bran has historically been disposed of or used only for animal feed. More recently, however, the bran layer has been identified as comprising an assortment of phytochemicals and other bioactive compounds having a potentially vast and diverse array of human health benefits. Indeed, rice bran is now known to comprise assorted oils, vitamins, and minerals having antioxidant, anti-inflammatory, and anti-cancer properties, among others. For example, polyphenols such as phenolic acids and flavonoids have been identified in rice bran oils and, as a chemical class, are generally understood to have health promoting effects including antioxidant effects, antibacterial effects, anti-cancer effects, cardioprotective effects, immune system promoting and anti-inflammatory effects, and skin promoting effects from UV radiation.

[0004] Plants of the genus Camellia, including Camellia sinensis or green tea, are similarly associated with health promoting effects. Camillia spp. plants are typically grown in tropical and subtropical climates (e.g., in China, Japan, and Korea) , where the leaves, buds, or stems of the plants are used to prepare teas and other beverages that are consumed worldwide. Camellia sinensis plants, in particular, have been used in traditional herbal medicines to treat various ailments from promoting wound healing, aiding digestion, and improving cardiac and mental health, to regulating body temperature. Such uses indicate that the plant species may contain a large number of bioactive compounds having therapeutic and / or regenerative activity. Certain bioactive compounds, such as the previously mentioned phenolic acids and flavonoids, as well as caffeine, vitamins, minerals, amino acids including L-theanine, and trace elements such as, e.g., magnesium, iron, copper, phosphorus, potassium, calcium, selenium, zinc, and chromium, have been found in Camellia sinensis plant species.

[0005] Various methods of extracting bioactive compounds from Oryza sativa and Camellia sinensis are known in the art. However, given the diversity in molecular structures and associated solubility profiles among these bioactive compounds, the extraction techniques inevitably recover only a selection of what may be present in a harvested plant. As indicated above, crude rice bran oil is known to contain numerous bioactive compounds, only some of which are saponifiable; therefore, it is considered that rice bran oil extracted using traditional techniques fails to include a large amount of unsaponifiable matter, which could exert useful physiological effects on the human body.

[0006] Additionally, routine extraction methods used on Oryza sativa and Camellia sinensis, plant species include solvents or mixtures of solvents, such as acetone, acetic acid, or acidified methanol, which can be difficult to remove from the extract and potentially harmful to human cells. That is, the methods utilize solvents which should not be included in a formulation used in or on an animal, particularly on a human. Furthermore, routine extraction methods often utilize harsh conditions, including high temperatures, which can denature or degrade bioactive compounds into a less effective or inactive form.

[0007] It would be advantageous to identify new processes for extracting and preparing useful substances from plants of the genus Oryza and / or plants of the genus Camellia, comprising optimal extraction conditions allowing for effective and inexpensive extraction of bioactive compounds having potential physiological and biochemical activity.SUMMARY

[0008] The present disclosure provides a method for extracting bioactive extracts from Oryza and / or Camellia plants, as well as the use of the bioactive extracts. The method of the present disclosure effectively enhances the bioavailability of bioactive compounds in Oryza and / or Camellia plants. Moreover, the extracts prepared from Oryza and / or Camellia plants by the method of the present disclosure exhibit unexpected biological activity that is useful for improving human skin health, repairing gastric mucosa in animals, and increasing aqua-farmed animal weights.

[0009] Accordingly, an aspect of the present disclosure provides a method for extracting bioactive extracts from Oryza and / or Camellia plants, comprising: (1) contacting a fragmented plant material of Oryza and / or Camellia plants with a polar solvent, followed by separation to yield a crude extract; and (2) fermenting the crude extract with a microorganism, and purifying the fermented product to yield bioactive extracts from Oryza and / or Camellia plants.

[0010] In another aspect, there is provided a bioactive extract prepared from Oryza and / or Camellia plants by the method disclosed herein.

[0011] In another aspect, there is provided a use of the bioactive extract from Oryza and / or Camellia plants as described above in the preparation of one or more of the following compositions: A) a composition for skin care products; B) a composition for gastric health products; and C) a composition for aquaculture food products.

[0012] In another aspect, there is provided a composition comprising the bioactive extract prepared from Oryza and / or Camellia plants by the method disclosed herein, wherein a mass concentration of the bioactive extract in the composition is in a range of 0.1-10%w / v.

[0013] The method for extracting bioactive extracts from Oryza and / or Camellia plants disclosed herein has the following beneficial effects:

[0014] The extraction method of the present disclosure employs polar solvents to extract bioactive compounds that would typically degrade during conventional extraction processes in the prior art. Additionally, it incorporates a fermentation step to enhance the bioavailability of bioactive compounds in Oryza and / or Camellia plants, enabling effective and low-cost extraction and utilization of bioactive compounds with potential physiological and biochemical activities.

[0015] Surprisingly, the inventors have identified that the bioactive extracts prepared from Oryza and / or Camellia plants are capable of inducing the synthesis of collagen and elastin in dermal fibroblasts, which can improve the strength, elasticity, resilience, pigmentation, and general appearance of skin. Furthermore, the bioactive extracts of the present disclosure exhibit unexpected biological activity that is useful for repairing gastric mucosa in animals and increasing aqua-farmed animal weights.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0016] FIG. 1 shows total ion current chromatogram in negative ion mode according to Example 1 of the present disclosure.

[0017] FIG. 2 shows mRNA expression for col type 1 and col type 3 in fibroblasts treated with an extract prepared according to Example 2 of the present disclosure.

[0018] FIG. 3 shows hematoxylin and eosin (H&E) staining results of the 3-D skin model according to Example 3 of the present disclosure: (a) control group, without any treatment; and (b) treated group, treated with an extract prepared according to the present disclosure.

[0019] FIG. 4 shows Masson’s Trichrome staining results of mouse skin samples according to Example 3 of the present disclosure: (a) control group, topical application of cream without bioactive extract; and (b) treated group, topical application of cream with an extract prepared according to the present disclosure.

[0020] FIG. 5 shows immunofluorescence staining results of mouse skin samples according to Example 3 of the present disclosure: (a) control group, topical application of cream without bioactive extract; and (b) treated group, topical application of cream with an extract prepared according to the present disclosure. Wherein, background cell nucleases are stained with DAPI (blue) .

[0021] FIG. 6 shows (a) the hydration level of mouse skin treated with either an extract prepared according to Example 4 of the present disclosure or a control on day 14 and day 28 post-treatment, and (b) the strength of mouse skin treated with either an extract prepared according to Example 4 of the present disclosure or a control on day 14 and day 28 post-treatment (*p < 0.05, ***p < 0.005, n = 6) .

[0022] FIG. 7 shows elasticity of mouse skin treated with either an extract prepared according to Example 4 of the present disclosure or a control at day 14 and day 28 post-treatment, where elasticity is reported as (a) gross elasticity (R2, calculated as the ratio of complete relaxation and penetrations immediately after suction) , (b) net elasticity (R5, calculated as the ratio of the elastic part of the suction phase and immediate recovery during the relaxation phase) , and (c) biological elasticity (R7, calculated as the ratio of the elastic part of the suction phase and maximum penetration immediately after suction) (*p < 0.05, **p < 0.01) .

[0023] FIG. 8 shows the thickness of the epidermis in mouse skin at 14 days post-treatment according to Example 4 of the present disclosure: (a) treated group, topical application of cream with an extract prepared according to the present disclosure; (b) control group, topical application of cream without bioactive extract.

[0024] FIG. 9 shows Masson staining for collagen distribution in mouse skin collected on day 14 and day 28 post-treatment with either (a) cream containing an extract prepared according to Example 4 of the present disclosure or (b) cream without bioactive extract, and (c) total collagen levels in the collected mouse skin samples (***p < 0.005, ****p < 0.001) .DETAILED DESCRIPTION

[0025] The following is a detailed description of the disclosure provided to aid those skilled in the art in practising the present disclosure. The person skilled in the art may make modifications and variations in the embodiments described herein without departing from the scope of the present disclosure.

[0026] When a numerical range is disclosed herein, such range is considered continuous and inclusive of both the minimum and maximum values of the range, as well as every value between said minimum and maximum. Furthermore, when the range refers to integers, it includes every integer between the minimum and maximum values. Additionally, where multiple ranges describe features or characteristics, the ranges may be combined. In other words, unless otherwise indicated, all ranges disclosed herein should be understood to encompass all subranges falling therein. For example, a specified range of "1 to 10" shall be considered to include all subranges between the minimum value of 1 and the maximum value of 10. Exemplary subranges of 1 to 10 include but are not limited to 1 to 6.1, 3.5 to 7.8, 5.5 to 10, etc.

[0027] It should be understood that the recitation of one or more method steps herein does not preclude the existence of additional method steps before or after the combined steps, or the insertion of other method steps between explicitly recited steps, unless otherwise specified. Moreover, unless otherwise specified, the numbering of method steps serves solely as a convenient tool for identifying the steps, and neither restricts their sequence nor limits the scope of implementable embodiments of the present disclosure. Any alteration or adjustment to their relative relationships shall be deemed within the implementable scope of the present disclosure, provided no substantive change is made to the technical content.

[0028] A first aspect of the present disclosure provides a method for extracting bioactive extracts from Oryza and / or Camellia plants, comprising: (1) contacting a fragmented plant material of Oryza and / or Camellia plants with a polar solvent, followed by separation to yield a crude extract; and (2) fermenting the crude extract with a microorganism, and purifying the fermented product to yield bioactive extracts from Oryza and / or Camellia plants.

[0029] In the present disclosure, active ingredients are extracted from Oryza and / or Camellia plants using polar solvents under specific controlled conditions. This method facilitates the gentle extraction of bioactive compounds, thereby minimizing the degradation of these active ingredients to the greatest extent during the extraction process. The fragmented plant material is brought into contact with the polar solvent to extract chemical components from the plant material, including bioactive compounds soluble in the polar solvent. The remaining plant solids are separated from the liquid (i.e., the polar solvent) to obtain a crude extract. Subsequently, the crude extract is fermented with microorganisms (e.g., yeast) to break down any large chemical compounds (such as proteins, peptides, or carbohydrates) into smaller chemical compounds (e.g., amino acids or sugars) , making them more easily absorbable when administered to a subject (e.g., in skin care products) .

[0030] The term “plant material” refers to all or part of the plant which comprises bioactive components. Plant material includes, but is not limited to, husks, bran, leaves, stems, bark, roots, flowers, fruits, cuttings, cells, and combinations thereof. In some embodiments, the plant material may comprise bran, leaves, and / or stems. In some embodiments, the plant material subjected to the extraction process may comprise from 60%to 90%, 60%to 70%, 70%to 80%, or 80%to 90%by weight (dry) of bran, leaves, and / or stems of the plant.

[0031] The term “bioactive compounds” refers to active components that are able to exert effects on innate biological pathways in a subject, for example, by induction or suppression of physiological pathways, including upregulation or downregulation of protein synthesis, such as collagen and / or elastin synthesis. Examples of bioactive compounds include proteins, minerals, vitamins, and phytochemicals, such as phenolic compounds (e.g., catechins, flavonoids, anthocyanins, and phenolic acids) . In some embodiments, the extract comprises bioactive compounds capable of upregulating (also referred to herein as inducing) collagen and / or elastin synthesis. In some embodiments, the extract comprises at least 3, at least 4, at least 5, or at least 6 bioactive compounds capable of upregulating collagen and / or elastin synthesis. The balance of the extract is made up of other plant products and byproducts, and optionally the polar solvent (e.g., water) .

[0032] The term “other plant products and byproducts” refers to naturally occurring byproducts and other substances arising during the extraction process and may include hydrocarbon compounds, amino acids, chlorophyll, or any other bioactive compound. Examples of other plant products and byproducts present in the extract include, but are not limited to, alkaloids, glycosides, steroids, triterpenoids, tannins, flavonoids, and proteins. These plant products and byproducts are typically polar solvent-soluble components. Plant solids (i.e., the fibrous plant material or pulp) are not within the scope of this term.

[0033] In the method of the present disclosure, in step (1) , the extraction time is in a range of 10 to 120 min, for example, 10 to 20min, 20 to 30min, 30 to 40min, 40 to 50min, 50 to 60min, 60 to 70min, 70 to 80min, 80 to 90min, 90 to 100min, 100 to 110min, or 110 to 120min.

[0034] The extraction temperature described in step (1) is in a range of 50 to 120℃, for example, 50 to 60℃, 60 to 70℃, 70 to 80℃, 80 to 90℃, 90 to 100℃, 100 to 110℃, or 110 to 120℃.

[0035] In one embodiment, the polar solvent in step (1) is one or more of water and polar organic solvents.

[0036] The use of water as the polar solvent is advantageous because it is inexpensive, accessible, and safe; thus, it is suitable for further application of the extracts in pharmaceutical and cosmetic products. In some embodiments, the aqueous extraction is performed under vacuum at a pressure of about 1 mbar to about 20 mbar, for example, 1-2 mbar, 2-4 mbar, 4-6 mbar, 6-8 mbar, 8-10 mbar, 10-12 mbar, 12-14 mbar, 14-16 mbar, 16-18 mbar, or 18-20 mbar.

[0037] Examples of suitable polar organic solvents include short-chain polar organic solvents containing between 1 and 6 carbon atoms, such as linear or branched short chain alcohols (C1-C6 alcohols, examples being methanol, ethanol, and isopropanol) , glycerine, and acetone. In some embodiments, combinations of solvents may also be used, such as water and alcohol to yield a hydroalcoholic extract, or water and glycerine to yield a hydroglycolic extract. In an alternative embodiment, a sequential extraction using different solvents may be practised, and the extracts combined.

[0038] As the types and composition of bioactive compounds vary widely in plant materials, particularly in Oryza sativa and Camellia sinensis, extraction efficiency can be affected by the extraction techniques and extraction conditions. Methods for extracting the bioactive compounds from Oryza sativa and Camellia sinensis plant materials are known in the art, including conventional and advanced processes. Examples of conventional extraction methods include, but are not limited to, decoction, infusion, agitation, or maceration, which are applied based on the diffusion of bioactive compounds from plant materials to the solvent. Examples of advanced techniques include, but are not limited to, ultrasonic-assisted extraction, microwave-assisted extraction, supercritical fluid extraction, and ultrahigh-pressure extraction, which may have advantages relating to increased extraction efficiency or shortened extraction time. Factors that affect the extraction efficiency include, for example, type of solvent used, agitation conditions, pre-leaching time, extraction temperature, length of extraction, sample-to-solvent ratio, particle size of the initial plant material, and extraction pH.

[0039] During this process, the polar solvent is contacted with the fragmented plant material to extract polar-solvent soluble compounds from the plant material, which subsequently dissolve and are admixed with the polar solvent. The extract is produced with the use of a polar solvent, such as water, ethanol, methanol, acetone, or mixtures thereof.

[0040] In some embodiments, continuous agitation is utilised to enhance the efficiency of the extraction process. In some embodiments, continuous agitation is provided by mechanical forces, such as with the use of shaking, stirring, wave, rotary, or tumbling motions. In some embodiments where rotational or tumbling motion is applied, the rotational or tumbling motion is provided at a rate of about 50-800 rpm, for example 50-100 rpm, 100-150 rpm, 150-200 rpm, 200-250 rpm, 250-300 rpm, 300-350 rpm, 350-400 rpm, 400-450 rpm, 450-500 rpm, 500-550 rpm, 550-600 rpm, 600-650 rpm, 650-700 rpm, 700-750 rpm, or 750-800 rpm.

[0041] In some embodiments, in step (1) , the ratio of the mass of fragmented plant material to the volume of the polar solvent is (1-20 kg) : 100 L, for example, (1-2 kg) : 100 L, (2-3 kg): 100 L, (3-4 kg) : 100 L, (4-5 kg) : 100 L, (5-6 kg) : 100 L, (6-7 kg) : 100 L, (7-8 kg) : 100 L, (8-9 kg) : 100 L, (9-10 kg) : 100 L, (10-11 kg) : 100 L, (11-12 kg) : 100 L, (12-13 kg) : 100 L, (13-14 kg): 100 L, (14-15 kg) : 100 L, (15-16 kg) : 100 L, (16-17 kg) : 100 L, (17-18 kg) : 100 L, (18-19 kg): 100 L, or (19-20 kg) : 100 L.

[0042] In some embodiments, the plant of the genus Oryza in step (1) is one or more of Oryza sativa L. (Asian rice) and Oryza glaberrema Steud. (African rice) . In some embodiments, the plant of the genus Camellia in step (1) is one or more of Camellia sinensis L. (tea plant) and Camellia oleifera Abel. (oil-tea camellia) .

[0043] The fragmented plant material in step (1) may be obtained by any number of ways known in the art, for example, chopping, grinding, shredding, agitating, compacting, crushing, or any other suitable mechanical forces. The plant material is fragmented to increase the surface area of the plant material being processed. In one embodiment, the plant material is fragmented into about 1 cm2 to about 25 cm2 pieces. The fragmented plant material may be of any shape (e.g., a square, rectangle, polygon, circle, etc. ) . For example, fragmented plant material may have four sides of an approximately equal length of about 1 cm, about 2 cm, about 3 cm, about 4 cm, or about 5 cm, and have a surface area of about 1 cm2 to about 25 cm2. Alternatively, fragmented plant material may be approximately circular with a longest dimension of about 1 cm, about 2 cm, about 3 cm, about 4 cm, or about 5 cm, and also have a surface area of about 1 cm2 to about 25 cm2. Apparatus suitable for fragmenting plant material is known in the art. Example equipment suitable for this step includes industrial or household grinding or milling machines, cutting or shearing devices (e.g., scissors, shears, and the like) , or macerating devices (e.g., a mortar and pestle) . In one embodiment, a grinding machine is used.

[0044] In some embodiments, the fragmented plant material includes bran from Oryza sativa L. and / or Oryza glaberrema Steud. In some embodiments, the fragmented plant material includes leaves from Camellia sinensis L. and / or Camellia oleifera Abel. In some embodiments, the fragmented plant material includes bran from Oryza sativa L. and / or Oryza glaberrema Steud. and leaves from Camellia sinensis L. and / or Camellia oleifera Abel.

[0045] In some embodiments, the fragmented plant material includes bran from Camellia sinensis L. and bran from Oryza sativa L. In some embodiments, the fragmented plant material includes bran from Camellia sinensis L. and bran from Oryza glaberrema Steud. In some embodiments, the fragmented plant material includes bran from Camellia oleifera Abel. and bran from Oryza sativa L. In some embodiments, the fragmented plant material includes bran from Camellia oleifera Abel. and bran from Oryza glaberrema Steud.

[0046] In some embodiments, the fragmented plant material includes leaves from Camellia sinensis L. and bran from Oryza sativa L.

[0047] In some embodiments, step (1) may further comprise a drying step prior to soaking the fragmented plant material, which specifically involves drying the fragmented plant material until its moisture content is not greater than 15%. For example, the moisture content after drying may be not greater than 1%, 1-2%, 2-3%, 3-4%, 4-5%, 5-6%, 6-7%, 7-8%, 8-9%, 9-10%, 10-11%, 11-12%, 12-13%, 13-14%, or 14-15%. In some embodiments, the fragmented plant material is dried until its moisture content is not greater than 10%.

[0048] In some embodiments, fragmented plant material may be dried using hot air drying, vacuum drying, freeze-drying, microwave drying, or other methods.

[0049] In some embodiments, the fragmented plant material is dried using hot air drying at a temperature in a range of 50-120℃, for example, 50-55℃, 55-60℃, 60-65℃, 65-70℃, 70-75℃, 75-80℃, 80-85℃, 85-90℃, 90-95℃, 95-100℃, 100-105℃, 105-110℃, 110-115℃ or 115-120℃. In some embodiments, the fragmented plant material is dried for a period of about 15-90 min, for example, 15-20min, 20-25min, 25-30min, 30-35min, 35-40min, 40-45min, 45-50min, 50-55min, 55-60min, 60-65min, 65-70min, 70-75min, 75-80min, 80-85min, or 85-90min.

[0050] In some embodiments, the fragmented plant material is dried using vacuum drying at a gauge vacuum pressure in a range of 100–1000 mbar, for example, 100–150 mbar, 150–200 mbar, 200–250 mbar, 250–300 mbar, 300–350 mbar, 350–400 mbar, 400–450 mbar, 450–500 mbar, 500–550 mbar, 550–600 mbar, 600–650 mbar, 650–700 mbar, 700–750 mbar, 750–800 mbar, 800–850 mbar, 850–900 mbar, 900–950 mbar, or 950–1000 mbar.

[0051] In some embodiments, the particle size of the fragmented plant material is further reduced by grinding to improve the efficiency of downstream steps. In some embodiments, the fragmented dried plant material is subjected to grinding to be reduced to a particle size of not greater than about 2000 μm, for example, not greater than100 μm, 100–150 μm, 150–200 μm, 200–250 μm, 250–300 μm, 300–400 μm, 400–500 μm, 500–600 μm, 600–700 μm, 700–800 μm, 800–900 μm, 900–1000 μm, 1000–1100 μm, 1100–1200 μm, 1200–1300 μm, 1300–1400 μm, 1400–1500 μm, 1500–1600 μm, 1600–1700 μm, 1700–1800 μm, 1800–1900 μm, or 1900–2000 μm.

[0052] In some embodiments, the grinding may be performed using grinding or milling machines.

[0053] In another step, the crude extract is fermented in the presence of a microorganism to yield the extract. Various fermentation methods are known in the art. Examples include batch, fed-batch, open, and continuous fermentation. When batch fermentation is used, all compounds to be fermented are combined with a microorganism, and the microorganism proceeds to consume any nutrients present in the compounds. The microorganisms progress through a series of growth phases, including a lag phase in which the microorganism adjusts to the environment, an exponential growth phase in which exponential growth of the microorganism occurs, a slow growth phase in which non-exponential growth of the microorganism occurs, and finally a stationary phase in which the microorganism begins to die (i.e., all nutrients have been consumed) . Factors including microorganism species, nutrient content, process temperature, and vessel size can be used to adjust the rate and extent to which fermentation proceeds.

[0054] In step (2) , the fermentation has a duration of 1-14 days, for example, 1–2 days, 2–3 days, 3–4 days, 4–5 days, 5–6 days, 6–7 days, 7–8 days, 8–9 days, 9–10 days, 10–11 days, 11–12 days, 12–13 days, or 13–14 days.

[0055] In step (2) , the fermentation is at a temperature ranging from 7℃ to 25℃, for example, 7–8 ℃, 8–9 ℃, 9–10 ℃, 10–11 ℃, 11–12 ℃, 12–13 ℃, 13–14 ℃, 14–15 ℃, 15–16 ℃, 16–17 ℃, 17–18 ℃, 18–19 ℃, 19–20 ℃, 20–21 ℃, 21–22 ℃, 22–23 ℃, 23–24 ℃, or 24–25 ℃.

[0056] In step (2) , the microorganism may include a fungal species, including one or more of Aspergillus oryzae and Aspergillus sojae.

[0057] In some embodiments, the microorganism is Aspergillus oryzae, e.g., A. oryzae RIB40 or A. oryzae 14160.

[0058] In some embodiments, the crude extract contains monosaccharides and / or disaccharides, including, but not limited to, glucose, fructose, galactose, sucrose, xylose, mannose, rhamnose, arabinose, and ribose.

[0059] In some embodiments, at the time fermentation commences, the crude extract has a total monosaccharide content ranging from 0.1 to 100 g / mL, for example, 0.1–1 g / mL, 1–5 g / mL, 5–10 g / mL, 10–20 g / mL, 20–30 g / mL, 30–40 g / mL, 40–50 g / mL, 50–60 g / mL, 60–70 g / mL, 70–80 g / mL, 80–90 g / mL, or 90–100 g / mL.

[0060] In some embodiments, the fermentation is in a vessel size ranging from 0.1 L to 100 L, for example, 0.1–1 L, 1–5 L, 5–10 L, 10–20 L, 20–30 L, 30–40 L, 40–50 L, 50–60 L, 60–70 L, 70–80 L, 80–90 L, or 90–100 L.

[0061] In step (2) , the extract is purified to remove volatile organic compounds produced by the microorganism during fermentation. Any number of methods known in the art are suitable for removing or reducing the volatile organic compounds following fermentation, for example, by centrifugation, evaporation, condensation, chromatography, crystallization, liberation, and lyophilisation.

[0062] In some embodiments, the volatile organic compounds are removed under vacuum using rotary evaporation at a pressure ranging from 10 to 400 mbar, for example, 10–20 mbar, 20–30 mbar, 30–40 mbar, 40–50 mbar, 50–60 mbar, 60–70 mbar, 70–80 mbar, 80–90 mbar, 90–100 mbar, 100–110 mbar, 110–120 mbar, 120–130 mbar, 130–140 mbar, 140–150 mbar, 150–160 mbar, 160–170 mbar, 170–180 mbar, 180–190 mbar, 190–200 mbar, 200–250 mbar, 250–300 mbar, 300–350 mbar, or 350–400 mbar. The temperature for the vacuum rotary evaporation ranges from 20 to 80℃, for example, 20–30 ℃, 30–40 ℃, 40–50 ℃, 50–60 ℃, 60–70 ℃, or 70–80 ℃.

[0063] In some embodiments, the method of the disclosure comprises removing or reducing the amount of polar solvent following purification of the extract, to yield a concentrated extract or powdered extract. Methods to remove or reduce the polar solvent are stated above. Alternatively, or additionally, to removing or reducing the amount of polar solvent, the extract or concentrated extract can be further fractionated to separate the extract or concentrated extract into portions comprising specific compounds. In some embodiments, the polar solvent is removed under vacuum, optionally using lyophilisation. The pressure of the vacuum ranges from 0.001–1 mbar, for example, 0.001–0.005 mbar, 0.005–0.01 mbar, 0.01–0.05 mbar, 0.05–0.1 mbar, 0.1–0.5 mbar, or 0.5–1 mbar. The temperature for the lyophilisation ranges from -80 to -20 ℃, for example, -80 to -70 ℃, -70 to -60 ℃, -60 to -50 ℃, -50 to -40 ℃, -40 to -30 ℃, or -30 to -20 ℃.

[0064] The extracts prepared by the method of the present disclosure are distinct from essential oils produced from a plant. Essential oils are extracts of the volatile components of the plant material. The volatile components are those capable of separation from the plant material through distillation on the application of heat. The essential oil components may comprise nonpolar compounds, including aromatic compounds, terpenes, and other volatile hydrocarbon products. The term “volatile organic compound” refers to an organic compound that has a boiling point (an initial boiling point) in the range of 50℃ to 250℃, measured at atmospheric pressure (i.e., 1 atm or around 101 kPa) . The plant components extracted into the polar solvent (e.g., aqueous extracts) are non-volatile compounds, which differ from volatile compounds in essential oils.

[0065] The extracts produced according to the methods disclosed herein are also distinct from fermented beverages (e.g., beer, cider, spirits, kombucha, and teas) produced from a plant (e.g., grains such as barley, wheat, rye, and rice; fruits; and teas such as Camellia sinensis) . Fermented beverages may contain chemical compounds from the plant material from which they are produced, but unlike the extracts of the present disclosure, fermented beverages are produced by fermenting plant solids (as opposed to chemical compounds extracted from the plant) and often with the intention of retaining volatile organic compounds (i.e., short chain alcohols, particularly ethanol) produced by the microorganism as a byproduct of anaerobic respiration.

[0066] In some embodiments, the extracts prepared from Oryza and / or Camellia plants by the method of the present disclosure comprise one or more bioactive compounds selected from the group consisting of: catechin, epicatechin, epigallocatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, anthocyanins, gallic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, ellagic acid, quinic acid, tea gallate, caffeine, theophylline, theobromine, theanine, glutamic acid, arginine, serine, aspartic acid, γ-aminobutyric acid, B-complex vitamins, vitamin C, vitamin E, and mineral elements, and a mineral oxide thereof.

[0067] The extract contains bioactive compounds (some of which have been metabolized by microorganisms) and is substantially free of monosaccharides and / or disaccharides.

[0068] The B-complex vitamins include one or more of thiamine, nicotinic acid, riboflavin, vitamin B-12, and vitamin B-6.

[0069] The mineral elements include one or more of P, K, Ca, Mg, Fe, Mn, Al, S, Si, Zn, Cu, and F.

[0070] The extraction method of the present disclosure can extract at least 60%of the bioactive extract from plants, for example, 60–65%, 65–70%, 70–75%, 75–80%, 80–85%, 85–90%, 90–95%, or 95–100%. Specifically, if the plant material contains 1 gram of bioactive compounds per kilogram, at least 60%of the total bioactive extract is recovered according to the extraction method of the present disclosure, which is approximately 0.6 grams per kilogram.

[0071] In a second aspect, there is provided a bioactive extract prepared from Oryza and / or Camellia plants by the method disclosed herein.

[0072] In a third aspect, there is provided a use of the bioactive extract from Oryza and / or Camellia plants as described above in the preparation of one or more of the following compositions: A) a composition for skin care products; B) a composition for gastric health products; and C) a composition for aquaculture food products.

[0073] The term “skin care product” refers to a product that can be applied to a subject in need thereof to treat or prevent a cosmetic skin condition. In some embodiments, the cosmetic skin condition comprises a sign of chronological aging or photoaging of the skin, including the skin of the face, body, and scalp. The term “chronological aging” refers to a decline in skin thickness, tone, elasticity, hydration, hair density, or general appearance resulting from the passage of time. The term “photoaging” refers to aberrant skin pigmentation (either hyper-or hypo-pigmentation) and / or accelerated decline in skin thickness, tone, elasticity, hydration, or general appearance resulting from exposure of the skin to UV radiation. In some embodiments, the cosmetic skin condition includes one or more of thinning skin, wrinkled skin, dry skin, sagging skin, hair loss, hyperpigmentation, or hypopigmentation.

[0074] In some embodiments, the skin care product is one or more of: lotion, cream, moisturizer, serum, makeup, lip gloss, lipstick, lip balm, facial mask, facial cleanser, body wash, and hand soap.

[0075] The term “gastric health product” refers to a product that can be consumed by a subject to treat or prevent a gastric mucosa condition. The gastric mucosa condition includes gastric mucosa irritation, gastric mucosa inflammation, and gastric ulcer.

[0076] In some embodiments, the gastric health product is one or more of: tablet, capsule, powder, beverage, or a food bar.

[0077] The term “aquaculture food product” refers to a product that can be consumed by a farmed aquatic animal, such as a fish, to increase the weight of the aquatic animal relative to an aquatic animal that does not consume a food product comprising an extract as disclosed herein or consumes a similar food product not comprising an extract as disclosed herein.

[0078] In some embodiments, the aquaculture food product is in the form of a pellet.

[0079] In a fourth aspect, there is provided a composition comprising the bioactive extract prepared from Oryza and / or Camellia plants by the method disclosed herein, wherein a mass concentration of the bioactive extract in the composition is in a range of 0.1-10%w / v, for example, 0.1–0.2%w / v, 0.2–0.3%w / v, 0.3–0.4%w / v, 0.4–0.5%w / v, 0.5–0.6%w / v, 0.6–0.7%w / v, 0.7–0.8%w / v, 0.8–0.9%w / v, 0.9–1%w / v, 1–2%w / v, 2–3%w / v, 3–4%w / v, 4–5%w / v, 5–6%w / v, 6–7%w / v, 7–8%w / v, 8–9%w / v, or 9–10%w / v.

[0080] In some embodiments, the composition of the present disclosure is formulated for topical administration or oral administration.

[0081] In some embodiments, the composition may further comprise one or more excipients or carriers. Suitable excipients and carriers for use in skin care products, particularly skin care products for topical administration, are well known in the art. Non-limiting examples of excipients and carriers include chelating agents, humectants, gums, viscosity modifiers, anionic emulsifiers, non-ionic emulsifiers, consistency facers, lipids, preservatives, pH adjustors, and solubilizers. In some embodiments, the composition may further include one or more active ingredient (s) , essential oil (s) or fragrance (s) , and / or other plant extract (s) .

[0082] While the present disclosure describes the preparation and use of extracts from plants, specific bioactive compounds may be isolated from the plant extract (and optionally purified) , and those actives may also be used in the methods of the present disclosure. In this context, the term “extract” also extends to an isolated bioactive compound from the extract.

[0083] The term “subject” encompasses mammals and non-mammals. Examples of mammals include, but are not limited to, any member of the Mammalian class: humans; non-human primates such as chimpanzees, and other apes and monkey species; farm animals such as cattle, horses, sheep, goats, swine; domestic animals such as rabbits, dogs, and cats; and laboratory animals including rodents, such as rats, mice and guinea pigs, and the like. Examples of non-mammals include, but are not limited to, birds, fish, and the like. In one embodiment, the subject is a human.

[0084] The terms "treat" , "treating" , or "treatment" refer to both therapeutic and prophylactic (or preventative) measures, wherein the aim is to reduce the symptoms of, prevent, or ameliorate a disease, condition, or a characteristic feature thereof in a subject. Alternatively, these terms may also refer to slowing, lessening, or postponing the progression of a disease, condition, or a characteristic feature thereof in a subject. Subjects in need of treatment include those who have the disease, condition, or a characteristic feature thereof, as well as those who have a propensity for or risk of developing said disease, condition, or a characteristic feature thereof. Treatment further encompasses ameliorating or preventing the worsening of existing signs of the condition, addressing the underlying metabolic or physiological processes that lead to the condition’s development, and inducing regression of the condition. EXAMPLES

[0085] The present disclosure will now be described in further detail with reference to the accompanying non-limiting examples.

[0086] Example 1 –Production of an Extract

[0087] (1) Dehydration of Oryza sativa and Camellia sinensis plant materials

[0088] Dried green tea (Tachvalue Mekong Company Ltd) and dried rice bran (Delifa LLC) were purchased and used without further modification.

[0089] (2) Aqueous extraction of bioactive compounds from Oryza sativa and Camellia sinensis plant materials

[0090] The dried green tea leaves (100 g) and dried rice bran (1 kg) were loaded into separate vessels, each containing water (10 L) , and heated to temperatures of 90℃ and 100℃, respectively. The temperature of each vessel was maintained for 30 min. After boiling, the solutions were filtered (200 mesh or 74 μm) to remove large pieces of green tea leaves or rice bran from the respective solutions. The two filtered solutions were then combined and allowed to cool to room temperature, providing a crude extract.

[0091] (3) Fermentation of a crude extract

[0092] The crude extract (20 L) was loaded into a 50 L vessel. Yeast (Aspergillus oryzae, A. oryzae RIB 40, 20 g) was added, and the mixture was allowed to ferment for 1 week at a temperature ranging from 18 to 22℃. After that time, the yeast was removed from the bottom of the vessel and discarded. Filtration (200 mesh) was again used to remove residual large particles (i.e., tea leaves and / or rice bran) . The extract was heated to 80 ℃to expel residual volatile organic compounds, and, if required, additional filtration was performed to ensure a maximum particle size of 100 μm in the extract.

[0093] (4) Dehydration of an extract

[0094] The extract was dried into a powder using either spray drying or lyophilization, following methods familiar to a person skilled in the art to yield 175 g of dried powder enriched with bioactive compounds.

[0095] (5) UPLC-Q-TOF-MS / MS analysis of the extract

[0096] A sample of the extract (0.5 g) was placed in a centrifuge tube (15 mL) into which 80%methanol (5 mL) was added before centrifugation (13,000 rpm, 10 min) . The resulting supernatant was filtered (0.22 μm) for UPLC-Q-TOF-MS / MS analysis under the following conditions:

[0097] UPLC: ZORBAX Extend C18 (2.1 mm×100 mm, 1.8 μm, Agilent) , 0.3 mL / min flow rate, 1 μL injection volume, 45℃ column temperature, binary mobile phase (A: 0.1%formic acid in water, B: acetonitrile) with a gradient elution program (0-0.01 min, 5%B; 0.01-9.00 min, 5%-82%B; 9.00-20.00 min, 82%-95%B; 20.00-26.00 min, 95%B; and 26.00-28.00 min, 95%-5%B.

[0098] Q-TOF-MS / MS: electrospray ion source (ESI) scanning in the positive and negative ions; MS conditions: scan range, 100–1500 m / z (MS) and 50–1000 m / z (MS / MS) ; Curtain gas, 35 psi; Ion spray voltage floating, -4500 V or 5000 V; Ion source temperature, 500 ℃; Declustering potential, -60 V or 60 V. To obtain the fragmentation information of the metabolites, MS / MS mode was used, with nitrogen as the collision gas. The collision energy was run at an alternating voltage from -40 to 40 eV (low energy to high energy) . Collision energy spread, 10 eV.

[0099] The results of the UPLC-Q-TOF-MS / MS are shown in FIG. 1 as a total ion chromatograph in negative mode. Eight chemical compounds, including lipids (i.e., γ-tocotrienols, δ-tocotrienols, and squalene) and polyphenols, were identified based on ions, secondary fragment ions, reference substances, and literature data. The retention times and spectrometric data of the compounds are shown in Table 1.

[0100] Table 1. Chemical Constituents Identified in the Extract

[0101] Example 2 –in vitro application of extract

[0102] Human fibroblast cells were plated in a 10 cm cell culture dish (2 × 105 cells per mL) under aseptic condition and incubated (37℃, 5%CO2, 95%humidity) . After 24 h, one population of fibroblasts was treated with the extract (1%wt / vol) prepared according to the methods of Example 1. A second fibroblast population was left untreated as a control. At 72 h post-treatment, cells were harvested for RNA isolation.

[0103] RNA was extracted from fibroblasts using standard materials and methods. cDNA template for PCR amplification was prepared by reverse transcription. PCR quantification was performed using custom-designed primers (Table 1) for collagen type I (col type 1) and collagen type III (col type 3) . Target gene mRNA expression levels (i.e., col type 1 and col type 3) in the respective fibroblast populations were analysed with reference gene 18s. As evidenced from FIG. 2, treatment of fibroblasts with the extract upregulates both col type 1 and col type 3, with col type 1 mRNA expression in the treated cells being approximately 1.5-fold greater than the control. Since young, healthy appearing skin contains higher overall levels of collagen, as well as a significantly higher fraction of col type 1 relative to col type 3 (col type 1: col type 3 of 85: 15) , than aged, wrinkled appearing skin, these results demonstrate that treatment with the extract induces a youthful fibroblast phenotype.

[0104] Table 2. Nucleotide Sequences of the Custom-Designed Primers

[0105] Example 3 –in vivo application of extract

[0106] 3-D Skin Model

[0107] Beneficial health properties of the extract of Example 1 were evaluated further on a 3-D skin model by comparing skin treated with the extracts with a control.

[0108] The in vitro 3-D skin model was prepared as a hydrogel from human fibroblasts and epidermal cells. Primary human fibroblast cells (3 × 106, purchased from ATCC) were mixed with a collagen type I (rat tail, Sigma Cat No. C3867) (2 μL) and placed in a transwell (24-well plate) and incubated (37℃, 5%CO2, 95%humidity) . Once the 3-D fibroblast structure was formed, human epidermal cells (2 × 106, HaCat from ATCC) were placed on top of the 3D human fibroblast to facilitate the formation of a multilayer of epidermal cells, thereby generating a 3-D skin model.

[0109] The in vitro 3-D skin model was immersed in cell growth medium containing either 1%(wt / vol) extract (treatment) or no extract (control) for 3 days, after which the 3-D skin models were collected and processed for sectioning and Masson’s staining to assess collagen content. Specifically, the skin was sliced and stained (H&E) , and the staining showed that the cells (i.e., fibroblasts and epidermal cells) and the epidermis in the 3-D skin model treated with the extract were healthier appearing and thicker, respectively, than those in the control (see FIG. 3) .

[0110] Specifically, FIG. 3 shows sections of the H&E-stained collagen hydrogel with a lightly stained “dermis” layer beneath a brightly stained “epidermis” layer. As with human skin, the “dermis” is much thicker than the epidermis and filled with fibroblasts, while the “epidermis” layer is populated with epidermal cells. In FIG. 3 (a) , the control skin model, the epidermis is present as an inconsistently thin layer (stained light pink) , and the epidermal cells are spaced apart with unstained gaps in between. The fibroblasts in the dermal layer have warped appearing nuclei (stained blue) . In FIG. 3 (b) , the treated skin model, the epidermis is present as a consistently thick layer (stained dark pink) . The epidermal cells are in close contact with one another giving a healthy appearance, and the fibroblasts are distributed throughout the dermis and show intact nuclei (stained blue) .

[0111] Animal Model

[0112] Two groups of BALB / c mice were used in this study (n = 10 in each group) . Both groups were maintained under normal conditions with normal diet. A cream containing the extract (see Table 3) was applied to the flank of animals in the treated group, while a cream having no extract was applied to the flank of animals in the control group. Treatment continued daily for a period of 28 days. Animals were then sacrificed, and the skin on the flank was harvested and stained for collagen (Masson’s trichrome staining, FIG. 4) and elastin (immunofluorescence staining, FIG. 5) .

[0113] FIG. 4 shows sections of skin harvested from BALB / c mice and subjected to Masson’s trichrome staining. In FIG. 4 (a) , skin from control mice, the full thickness of the skin is shown. Notably, collagen (stained blue) within the dermis is interspersed with numerous white patches, giving it a webbed appearance. Additionally, the epidermis (visualised by staining of nuclei in epidermal cells) is very thin. Two sebaceous glands are also observed, the leftmost being identified by the arrow. In FIG. 4 (b) , skin from the treated mice, the full thickness of skin is similarly shown. Collagen (stained blue) within the dermis is very dense with few white patches present, giving a more solid appearance than in the control. The epidermis also appears denser than in the control sample. Arrows denote three sebaceous glands within the dermis.

[0114] FIG. 5 shows sections of skin harvested from BALB / c mice and subjected to immunofluorescence staining for elastin (red) and cell nuclei (DAPI, blue) . In FIG. 5 (a) , skin from control mice, the dermis contains only a few dense patches of elastin (stained red) , and diffuse, faintly stained elastin is present in the adipose layer below. A thin band of epidermal cells (stained blue) are seen running along the top of the dermis (i.e., in the epidermis) , and additional cell nuclei (stained blue) distributed within the dermis, particularly the upper section interposed in the elastin. Additional groups of cell nuclei (stained blue) are grouped around voids, which are presumably sebaceous glands. In FIG. 5(b) , sectioned skin from treated mice, elastin (stained red) is distributed throughout the dermis with a dense, web-like appearance. Elastin staining is also visible to a much lesser extent in the adipose layer and to a similar extent as in the control samples. Cell nuclei (stained blue) are visible in the epidermis, dermis, and adipose layers. A layer of nuclei extends as a band across the top of the dermis (i.e., in the epidermis) and between the dermis and adipose. The nuclei in the lower band are grouped around unstained voids, presumably sebaceous glands.

[0115] Table 3. Formulation of Treatment and Control Creams

[0116] Preparation Method of the Cream in Table 3

[0117] The treatment cream was formulated by blending the compounds of phase A to form a homogenous mixture and the compounds of phase B to form a slurry. Phase A was then added to phase B to form a gel that was subsequently heated to 75 ℃. The compounds of phase C were added under high shear stirring and mixed to form a smooth, glossy, homogenous emulsion and re-heated to 75℃. Next, the mixture was cooled to 40℃ under low shear stirring, and the phase D compounds were stirred through (low shear stirring until homogenous) . The mixture was cooled to 25℃, allowed to set overnight, and, if necessary, pH-adjusted to pH 5 to 5.5. The control cream was formulated via the same protocol; however, the extract was replaced with water in phase A.

[0118] As seen in FIG. 4, the skin of animals treated with a cream containing the extract has a higher collagen density and a more uniform collagen distribution in the dermis than animals which received the cream alone. This result is evidenced by the stain in the treated skin being brighter and more regular (having fewer unstrained spaces) than the control skin. Unexpectedly, treatment with the extract also induced hair follicle pockets, indicating a further potential yet related benefit of stimulating hair growth. It is known to those skilled in the art that hair loss commonly increases (or onsets) with age; thus, the ability of the extract to stimulate hair growth provides further evidence of its ability to induce a youthful skin phenotype.

[0119] From FIG. 5, it is evident that topical application of the extract also induces elastin expression, as elastin staining is significantly brighter in treated animals than in control animals. Elastin provides the flexibility, which is associated with youthful skin and which decreases with age, causing skin to become more transparent and fragile. The induction of elastin, therefore, also leads to younger and healthier skin, or a more youthful skin phenotype.

[0120] Example 4 –in vivo evaluation of formulated extract in skin care

[0121] The cream of Example 3 was applied once daily to the dorsal region of a second set of BALB / c mice (treated and control) in the following tests to assess skin hydration, skin strength, and skin elasticity, as well as epidermal thickness and collagen density in the skin. The coated area was covered with a bandage to prevent the mouse from ingesting the cream.

[0122] Skin Hydration

[0123] Hydration ( CM 825) and trans-epidermal water loss (TEWL,  TM HEX, Courage + Khazaka Electronic GmbH, Cologne, Germany) were evaluated following repetitive application of the cream (treated or control) . Both parameters were recorded at baseline (D0) , after 1 h and 24 h of application, and then again on days 14 and 28 (D14 and D28) .

[0124] As shown in FIG. 6a, treatment with a cream formulated with the extract of the present disclosure significantly increased skin hydration at both day 14 and day 28 post-treatment when compared to the same cream absent the extract (i.e., the control treatment) .

[0125] Skin Strength

[0126] Skin strength was assessed in the test group and in the control group at days 14 and 28 post-treatment. Briefly, tissue samples collected from the dorsal region of the mice were sectioned into strips (20 × 50 mm) and mounted between the grips of a mechanical tester (Bioplus) . Stress-strain curves were created by elongating the strips (10 mm / min) while tensile force and sample length were recorded. Young’s modulus and tensile strength were extracted from the curves (see FIG. 6b) .

[0127] As shown in FIG. 6b, treatment with a cream formulated with the extract of the present disclosure significantly increased skin tensile strength at both day 14 and day 28 post-treatment when compared to the same cream absent the extract (i.e., the control treatment) .

[0128] Skin Elasticity

[0129] Animals were harvested for elastic analysis of the skin, which was evaluated in vivo using a suction cutometer (Cutometer Dual MPA 580, Courage + Khazaka Electronic GmbH, Cologne, Germany) . Specifically, skin elasticity was measured via laser detection of skin displacement following suction (300 mbar) of the skin with a 2mm suction probe and subsequent release thereof. From these tests, gross elasticity (R2, calculated as the ratio of complete relaxation and penetration immediately after suction) , net elasticity (R5, calculated as the ratio of the elastic part of the suction phase and immediate recovery during the relaxation phase) , and biological elasticity (R7, calculated as the ratio of the elastic part of the suction phase and maximum penetration immediately after suction) were evaluated (n = 5 “suction / release” per parameter measured in triplicate)

[0130] As shown in FIG. 7, the elasticity of skin treated with a cream formulated with the extract of the present disclosure improved relative to control samples in terms of gross elasticity, net elasticity, and biological elasticity at day 14 post-treatment, attaining significant improvements at day 28 post-treatment.

[0131] Skin Thickness

[0132] Epidermal thickness is a key indicator of skin aging; as skin ages, the epidermis will thin, leading to increased skin dehydration and contributing to reduced strength, elasticity, and an aged appearance. In this experiment, harvested tissue samples were stained (H&E) , visualised, and the thickness of the epidermis was evaluated.

[0133] The results indicated that a treatment of skin with the extract of the present disclosure effects significant changes in epidermal thickness compared to those treated with a control cream (see FIG. 8) . Notably, the epidermis in treated skin visibly increased after 14 days of repetitive treatment, while the epidermis in skin harvested from the control group remained visually unchanged.

[0134] FIG. 8 shows sections of skin harvested from BALB / c mice and subjected to H&E staining. In FIG. 8 (a) , sectioned skin from treated mice, the epidermal and dermal layers of the skin are shown. The epidermis is captured as a thick band of epidermal cells (stained blue) , the thickness of which is denoted by a measuring bar in the top and bottom images. The dermis is stained brightly as pink ribbons, having intact cell nuclei (stained blue) scattered throughout. FIG. 8 (b) , sectioned skin from control mice, similarly shows the dermal and epidermal layers of the skin. The epidermis is present as a thin band of blue, the thickness also being marked by measuring bars in the top and bottom images. Like the treated skin, the dermis is visible as brightly stained pink ribbons with cell nuclei (stained blue) present throughout. Groupings of cell nuclei are also present around four sebaceous glands in the dermis.

[0135] Skin Collagen Density

[0136] The level and types of collagen in skin also influence skin health and aging. A higher density and even distribution of collagen contribute to healthier and younger looking skin. Collagen density and distribution were also analysed by staining (Modified Masson’s Trichrome) and visualizing harvested dorsal skin sections.

[0137] Specifically, skin tissue slides were placed in staining jars and deparaffinised by submerging into three series of absolute xylene (4 min) followed by 100%, 95%, 90%, 80%and 70%of ethanol (4 min at each concentration) . The slides were then submerged in warmed Bouin’s solution (60℃ for 45 minutes) . Next, the slides were washed in running tap water until the yellow colour in the samples disappeared. To differentiate nuclei, the slides were then immersed in modified Weigert’s haematoxylin (8 min) and washed in running water (2 min) . In order to stain cytoplasms and erythrocytes, the slides were submerged in anionic dyes, acid fuschin (C. I. 42590, Merck, Germany) (5 min) , and then washed with running tap water (2 min) . The slides were next treated with phosphomolybidic acid solution (10 min) as a mordant and immediately thereafter submerged into methyl blue (C. I. 42780, Merck, Germany) solution (5 min) to stain fibroblast and collagen. After that, the slides were washed in running water (2 min) and treated with 1%acetic acid solution (1 min) . Slides were then dehydrated into a series of alcohol (70%, 80%, 95%and 100%; 1 min each) . Finally, the slides were dipped into absolute xylene (1 min) , mounted with a cover slip using DPX mounting, and observed via microscopic analysis (FIG. 9) .

[0138] FIG. 9 shows sections of skin harvested from BALB / c mice and subjected to Masson’s staining. Two sections are shown for treated and control mice. In FIG. 9 (a) , sections from treated mice, the dermis is stained with dark ribbons of collagen (blue) . A thick epidermis layer is also observed as a pink band running across the top of the dermis. In FIG. 9 (b) , sections from control mice, the dermis is lightly stained with diffuse ribbons of collagen (stained blue) running throughout. The epidermis is present as thinner pink band running across the top of the dermis.

[0139] The results (shown in FIG. 9a) indicate that collagen in skin treated with an extract of the present disclosure has a better distribution of collagen compared to skin treated with a control. Furthermore, the total collagen content was significantly higher in skin treated with the extract than in skin treated with the control (see FIG. 9b) at day 14 and at day 28 post-treatment.

[0140] Conclusion

[0141] Treating skin with an extract obtained by the methods of the present disclosure significantly improves skin health, including skin hydration, strength, and elasticity, which may be attributable to epidermal thickening, increased total collagen content, and improved collagen distribution.

[0142] Example 5 –in vivo evaluation of formulated extract in gastric mucosa care

[0143] A feed containing the extract of Example 1 was prepared by dissolution in sterile water (10 g extract per 100 mL water or 10%wt / vol) . The feed was diluted (to 5%wt / vol) and administered (100 μL) to BALB / c mice with gastric ulcers using a gavage (final consumption of 250 mg / kg body weight) .

[0144] Following 7 days of treatment, the mice were harvested, and gastric mucosa samples were prepared in formalin-fixed paraffin blocks. Sections were then prepared for H&E staining, and slides were evaluated by a pathologist. Animals fed with the extract of the present disclosure showed up to 50%ulcer repair, and their gastric mucosa appeared healthier compared to animals not receiving the extract as a supplement.

[0145] Example 6 –in vivo evaluation of formulated extract in an aquaculture feed

[0146] A fish feed containing the extract of Example 1 was prepared. Specifically, a first feed was prepared for groupers, and a second feed was prepared for pomfrets. The respective feeds were formulated by adding final concentrations of 5% (wt / vol) extract to the standard fish feeds (Ho Kinh Doanh Ton Chi Thanh, BR number: 37B8008193, Vietnam) . The respective fish (n = 300) were housed in net “tanks” (3 × 3 m) .

[0147] The feed was fed to populations of groupers and pomfrets for six months. After the six-month trial, an average 30%increase in the harvest of both fish types was observed compared to populations that were fed a control feed.

[0148] The extraction method of the present disclosure employs polar solvents to extract bioactive compounds that would typically degrade during conventional extraction processes in the prior art. Additionally, it incorporates a fermentation step to enhance the bioavailability of bioactive compounds in Oryza and / or Camellia plants, enabling effective and low-cost extraction and utilization of bioactive compounds with potential physiological and biochemical activities. Moreover, the bioactive extracts prepared from Oryza and / or Camellia plants are capable of inducing the synthesis of collagen and elastin in dermal fibroblasts, which can improve the strength, elasticity, resilience, pigmentation, and general appearance of skin. Furthermore, the bioactive extracts of the present disclosure exhibit unexpected biological activity that is useful for repairing gastric mucosa in animals and increasing aqua-farmed animal weights.

[0149] It should be understood that the examples and embodiments described herein are for illustrative purposes only and that various modifications or changes in light thereof will be suggested to persons skilled in the art and are to be included within the purview of this application. Such alterations, modifications, and improvements are intended to be part of the present disclosure, and are intended to be within the scope of the disclosure.

Claims

1.A method for extracting bioactive extracts from Oryza and / or Camellia plants, comprising:(1) contacting a fragmented plant material of Oryza and / or Camellia plants with a polar solvent, followed by separation to yield a crude extract; and(2) fermenting the crude extract with a microorganism, and purifying a fermented product to yield bioactive extracts from Oryza and / or Camellia plants.2.The method of claim 1, wherein in step (1) :an extraction time is in a range of 10 to 120 min;and / or, an extraction temperature is in a range of 50 to 120℃;and / or, the polar solvent is one or more of water and polar organic solvents;and / or, a ratio of a mass of the fragmented plant material to a volume of the polar solvent is a range of (1-20 kg) : 100 L;and / or, the Oryza plant is one or more of Oryza sativa L. and Oryza glaberrema Steud. ;and / or, the Camellia plant is one or more of Camellia sinensis L. and Camellia oleifera Abel. ;and wherein in step (2) :a fermentation time is in a range of 1 to 14 days;and / or, a fermentation temperature is in a range of 7 to 25℃;and / or, the microorganism is a fungal species, comprising one or more of Aspergillus oryzae and Aspergillus sojae;and / or, the fermented product is purified to remove volatile organic compounds produced by the microorganism during fermentation.3.The method of claim 1, further comprising drying the fragmented plant material to a moisture content of not greater than 15%before contacting the fragmented plant material with the polar solvent.4.The method of claim 3, wherein after drying, the fragmented plant material is subjected to grinding to be reduced to a particle size of not greater than about 2000 μm, and then is contacted with the polar solvent.5.The method of claim 1, wherein the bioactive extracts prepared from Oryza and / or Camellia plants comprise one or more bioactive compounds selected from the group consisting of: catechin, epicatechin, epigallocatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, anthocyanins, gallic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, ellagic acid, quinic acid, tea gallate, caffeine, theophylline, theobromine, theanine, glutamic acid, arginine, serine, aspartic acid, γ-aminobutyric acid, B-complex vitamins, vitamin C, vitamin E, mineral elements, and a mineral oxide thereof.6.The method of claim 5, wherein the B-complex vitamins comprise one or more of thiamine, nicotinic acid, riboflavin, vitamin B-12, and vitamin B-6; and / or the mineral elements comprise one or more of P, K, Ca, Mg, Fe, Mn, Al, S, Si, Zn, Cu, and F.7.A bioactive extract of Oryza and / or Camellia plants prepared by the method of any one of claims 1 to 6.8.A use of the bioactive extract of claim 7 in the preparation of one or more of the following compositions:A) a composition for skin care products;B) a composition for gastric health products; andC) a composition for aquaculture food products.9.The use of claim 8, wherein the skin care product is one or more of: lotion, cream, moisturizer, serum, makeup, lip gloss, lipstick, lip balm, facial mask, facial cleanser, body wash, and hand soap;and / or the gastric health product is consumable by a subject to treat or prevent a gastric mucosa condition;and / or the gastric health product is one or more of: tablet, capsule, powder, beverage, and a food bar.10.A composition comprising the bioactive extract of claim 7, wherein a mass concentration of the bioactive extract in the composition is in a range of 0.1-10%w / v.

Images