Cover glass compensation

Abstract

A nucleic acid sequencing method comprises (a) positioning a flow cell in a flow cell imaging system. The flow cell includes a substrate and a coverslip, and the flow cell imaging system includes an optical subsystem including an immersion objective and a compensator assembly configured to selectively apply one of a plurality of pre-determined optical corrections. The acid sequencing method also includes receiving manufacturing variability data about the coverslip positioned in the flow cell imaging system, selectively applying one of the plurality of pre-determined optical corrections to the optical subsystem based on the received manufacturing variability data about the coverslip positioned in the flow cell imaging system.

Description

COVER GLASS COMPENSATION

[0001] CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims priority to and the benefit of the filing date of United States provisional patent application serial number 63 / 596,756 filed November 7, 2023 for "Cover Glass Compensation, " the entire contents of which are hereby incorporated by this reference.

[0003] RELATED FIELDS

[0004] The present invention relates generally to method and apparatuses in life science, more specifically, to apparatuses and methods to correct aberrations of flow cells for improved analytical accuracy and efficiency.BACKGROUND

[0005] Many current nucleic acid sequencing systems and processes, particularly massively parallel systems and processes, utilize sensitive, high numerical aperture optical technologies to capture images of hundreds of thousands, if not millions or more, of discrete light emission events on a substrate of a flow cell. Given the high sensitivity and accuracy required of such systems and processes, small manufacturing variations or defects of any components that are part of the optical path can have undesirable effects. There remains room for improvement in state-of-the-art systems and processes for addressing this manufacturing variability.SUMMARY

[0006] One general aspect includes a method of nucleic acid sequencing (a) positioning a flow cell in a flow cell imaging system, where: (i) the flow cell may include a substrate and a coverslip spaced from the substrate to define a liquid gap therebetween, where the substrate is configured to hold a spaced array of nucleic acid samples; and (ii) the flow cell imaging system may include an optical subsystem, the optical subsystem may include an immersion objective, the optical subsystem may include a compensator assembly configured to selectively apply one of a plurality of pre-determined optical corrections. The acid also includes (b) receiving  manufacturing variability data about the coverslip positioned in the flow cell imaging system. The acid also includes (c) based on the received manufacturing variability data about the coverslip positioned in the flow cell imaging system, selectively applying one of the plurality of pre-determined optical corrections to the optical subsystem.

[0007] Implementations may include one or more of the following features. The method where the immersion objective has a numerical aperture of 1 or greater. The manufacturing variability data about the coverslip may include an average thickness of the coverslip positioned in the flow cell imaging system of the coverslip. Receiving the manufacturing variability data about the coverslip may include determining the manufacturing variability data about the coverslip using a measurement device. The coverslip is selected from a set of coverslips with a thickness tolerance variability of at least + / -10 m. Before positioning the flow cell in a flow cell imaging system, pre-measuring the manufacturing variability data of the coverslip, storing the manufacturing variability data in a database, and making a mark associating with said pre-measured manufacturing variability data in the database on the coverslip. The mark may include at least one of a barcode, datamatrix, and QR code. The manufacturing variability data may include the average thickness of the coverslip. Different groups of coverslips are distributed into different containers. Pre-measuring the manufacturing variability data of the coverslip, storing the manufacturing variability data in the database, and making the mark are performed during the manufacturing of the coverslip. Before positioning the flow cell in a flow cell imaging system, pre-measuring the manufacturing variability data of a plurality of coverslips, and categorizing each coverslip into different groups based on a tolerance variability of + / -15 m. After positioning a flow cell in a flow cell imaging system, a first liquid is provided into the liquid gap, and a second liquid is provided on the coverslip, the first and the second liquids are the same. The compensator assembly may include one or more re-positionable phase plates configured to apply one of the pluralities of pre-determined optical corrections based on the manufacturing variability data. The method is that one or more re-positionable phase plates are arranged on a plane and configured to apply one of the plurality of pre-determined optical corrections by selectively rotating or pulling the phase plates to proper positions. The immersion objective may include a placeholder for accepting and switching the re-positionable phase plates in the optical subsystem, and the placeholder is revolvable or slidable. The compensator assembly is positioned within the immersion objective.  The immersion objective may include a first lens group having a positive refractive power, a second lens group having a positive refractive power, and a third lens group having a negative refractive power, where the compensator assembly is provided between the first lens group and the second lens group. The immersion objective may include a first lens component including a plano-convex lens having its plane surface facing the flow cell and a meniscus lens having a concave surface cemented to the plano-convex lens, a second lens component including a single lens with positive refractive power, and a third lens component including a doublet lens, where the compensator assembly is provided between the first lens component and the second lens component. Implementations of the described techniques may include hardware, a method or process, or computer software on a computer-accessible medium.

[0008] One general aspect includes a system of nucleic acid sequencing. The system of nucleic acid also includes a radiation source; a detector; and an optical imaging system, controlled by a controller; wherein the optical imaging system may include an immersion objective, and a compensator assembly configured to selectively apply one of a plurality of pre-determined optical corrections; and where the immersion objective may include a placeholder configured to hold the compensator assembly. Other embodiments of this aspect include corresponding computer systems, apparatus, and computer programs recorded on one or more computer storage devices, each configured to perform the actions of the methods.

[0009] Implementations may include one or more of the following features. The system where the placeholder is revolvable or slidable. The immersion objective may include a first lens group having a positive refractive power, a second lens group having a positive refractive power and a third lens group having a negative refractive power, where the compensator is provided between the first lens group and the second lens group. The immersion objective may include a first lens component including a plano-convex lens having its plane surface facing the flow cell and a meniscus lens having a concave surface cemented to the plano-convex lens, a second lens component including a single lens with a positive refractive power, and a third lens component including a doublet lens, where the compensator is provided between the first lens component and the second lens component. Implementations of the described techniques may include hardware, a method or process, or computer software on a computer-accessible medium.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0010] FIG. 1A schematically illustrates an example of a flow cell according to some embodiments.

[0011] FIG. 1B schematically illustrates an example of a flow cell contacting with a front element lens according to some embodiments.

[0012] FIG. 2 schematically illustrates an example imaging system according to some embodiments.

[0013] FIG. 3 schematically illustrates the position mode A and mode B for the tagged analytes 180.

[0014] FIG. 4 schematically illustrates an example of a coverslip with an irregular surface.

[0015] FIG. 5 schematically illustrates another example imaging system according to some embodiments.

[0016] FIGS. 6A and 6B schematically illustrate an example of sorting coverslips according to some embodiments.

[0017] FIG. 7 schematically illustrates an example compensating structure according to some embodiments.

[0018] FIG. 8 schematically illustrates an example structure of the immersion objective according to some embodiments.

[0019] FIG. 9 schematically illustrates the positions of the compensator according to some embodiments.

[0020] FIG. 10 schematically illustrates RMS wavefronts of the system with compensator disposed of in different positions according to some embodiments.

[0021] DETAILED DESCRIPTION OF SPECIFIC EMBODIMENTS

[0022] Merely by way of example, the invention has been applied to a method and system for measuring manufacturing variability data of flow cells, storing the data, associating the data with the flow cell, achieving the manufacturing variability data, and adjusting the optical subsystem to compensate for the aberration. The optical subsystem comprises a compensator assembly configured to selectively apply one of a plurality of pre-determined optical corrections. The manufacturing variability may be pre-measured before the detection and stored in correlation to the flow cell by a mark associated with said pre-measured manufacturing variability data in the database. Adjusting the optical subsystem includes providing a compensator assembly configured selectively applying one of a plurality of pre-determined optical corrections.

[0023] Flow cell

[0024] FIG. 1A schematically illustrates an example of a flow cell 100. The flow cell 100 includes a substrate 110 and a coverslip 130, which is positioned facing and spaced apart from the substrate 110, thereby defining a liquid passageway 120 between them. The liquid passageway 120 is configured to receive the first liquid 121.

[0025] The substrate 110 is configured to receive analyte 180 for analysis. The analyte 180 may be nucleic acid material such as DNA or RNA to be sequenced, or other biological or non-biological  / synthetic material to be analyzed. In one specific example, the analyte 180 may be DNA nanoballs or other discrete nucleic acid samples to be sequenced or otherwise analyzed. The analyte 180 may be arranged in a spaced array of discrete units, either partially or entirely across the flow cell 100. Although not shown in the figures, the flow cell 100 may include an array of discrete attachment sites, spaced apart from one another, where individual analyte units may be held spaced apart from adjacent analyte units. It should be understood that arrays may include up to millions or billions of discrete analyte sites, spaced at pitches that may be on the order of tens or hundreds of nanometers.

[0026] Flow cell 100 is configured for reagents and other liquids to flow through liquid passageway 120 in order to perform sequencing or other reactions on the analyte 180. In one  example, during sequencing reactions, fluorescently tagged molecules may selectively bind to some of the analyte 180. As discussed in greater detail below, an optical imaging system may be used to stimulate and detect fluorescent emissions from tagged analyte 180 in order to generate sequencing or other data associated with the analyte 180.

[0027] In some embodiment, the substrate 110 and coverslip 130 may be made of a material or materials that is substantially transparent to radiation wavelength (s) used to stimulate emissions from tagged analyte 180, and also substantially transparent to radiation wavelength (s) of the emissions from tagged analyte 180 sites. The substrate 110 and coverslip 130 may also be of a material or materials that do not generate substantial emissions in the wavelength range (s) of the stimulated emissions from tagged analyte 180 sites (e.g., via fluorescence of the substrate material itself or by inelastic photon scattering processes like Raman Scatter) . As used in this paragraph, “substantially” and “substantial” refer to levels that would interfere with stimulation and / or detection of the emissions from tagged analyte 180 sites. In one implementation, the coverslip 130 is made of glass or another suitably optically transparent material.

[0028] In some embodiments, the substrate 110 and coverslip 130 may be made of different materials. The coverslip 130 may be made of a material or materials that is substantially transparent to radiation wavelength (s) used to stimulate emissions from tagged analyte 180, and also substantially transparent to radiation wavelength (s) of the emissions from tagged analyte 180 sites. The substrate 110 may be made of a material or materials that is not transparent to radiation wavelength (s) as the coverslip 130. In one embodiment, the substrate 110 is made of Si, and the coverslip is made of SiO2.

[0029] The substrate 110 and the coverslip 130 of the flow cell 100 may be secured together by an adhesive material, such as UV / Visible light curable adhesives mixed with polystyrene beads with a specific size or Pressure-sensitive adhesive (PSA) with specific thickness to define as spacing structure. The UV / Visible light curable adhesives can be dispensed on one of the glass surfaces as multiple adhesive dots or lines or specific channel features and bond the substrate 110 and the coverslip 130 together. Another approach can be using pre-cut PSA tape with defined channel shapes to bond the substrate 110 and the coverslip 130.

[0030] In some embodiments, as referred to in FIG. 1A, the flow cell 100 is held by a holder 150. The holder 150 contacts the flow cell 100 at the flow cell’s edges / perimeter so that the flow cell 100 can be imaged through the coverslip 130 or both the substrate 110 and the coverslip 130 without interference by the holder 150. In some embodiments, the substrate 110 is thicker than the coverslip 130. The space 140 defined by the coverslip 130 and the holder 150 is able to receive immersion liquid. However, the immersion fluid is not necessarily confined to the space defined by the coverslip 130 and the holder 150, as illustrated in FIGS. 1a and 1b. In some embodiments, the objective may be immersed in a puddle of immersion liquid on the top of the coverslip 130. This puddle would then move with the objective as it scans across the top of the coverslip.

[0031] In some embodiment, a second liquid 141 may be introduced onto the coverslip 130, as illustrated in FIG. 1B. The second liquid 141 may be, but not necessarily, the same as the first liquid 121. In these embodiments, once the flow cell is situated in a supporting fixture, such as a holder 150, a second liquid 141 may be introduced onto the coverslip 130. This second liquid 141 may function as an immersion medium for an objective lens. In some embodiments, and with reference to FIGS. 1B and 2, when the flow cell 100 is employed within the optical imaging system 200, it comprises a substrate 110, a first liquid 121, a coverslip 130, and a second liquid 141. The substrate 110 is configured to accommodate a tagged analyte 180 situated upon it and can be composed of various materials, including but not limited to silica. The first liquid 121 overlays the substrate 110 and the tagged analyte 180, the coverslip 130 overlays the first liquid 121, and the second liquid 141 overlays the coverslip 130. Being transparent, the coverslip 130 permits high-resolution microscopy or imaging of the tagged analyte 180.

[0032] In high-resolution fluorescence detection systems intended for sequencing, the second liquid 141, overlaying the coverslip 130, is preferably the same liquid as the first liquid 121 (e.g., oil, water, etc. ) . The chemical composition of this liquid may be changed from application to application to accommodate different optimization objectives. The index of refraction for the first and second liquids may change with temperature and other conditions. This second liquid 141 is positioned between the coverslip 130 of the flow cell 100 and objective 210. Objective 210 may comprise a first lens element 250 that is designed to make  contact with the second liquid 141 as illustrated in FIG. 1B. In some embodiment, the first liquid 121 is the same as the second liquid 141, both having a high refractive index. Both the objective lens and the specimen are immersed in the second and first transparent liquids, thereby increasing the numerical aperture of the objective lens and controlling the aberration. In some embodiments, the first liquid 121 and the second liquid 141 have the same or substantially the same index of refraction.

[0033] Optical imaging system

[0034] FIG. 2 schematically illustrates an example of an optical imaging system 200 in which the flow cell 100 as illustrated in FIG. 1A is utilized. In the example of Figure 2, radiation from radiation source 204 is directed to flow cell 100 to stimulate emissions from tags associated with the analyte sample (such as tagged analyte 180 in FIG. 1A) in the flow cell 100. The emissions are imaged by detector 222. Optical imaging system 200 is controlled by controller 226, which may be one or more computers or other devices configured to control the various components of the optical imaging system 200 and to process data collected by the various components of the system.

[0035] In the example of Figure 2, radiation source 204 may be a radiation source 204 configured to emit laser light that stimulates fluorescent emissions by fluorescently tagged analyte 180 in the flow cell 100. The light from the radiation source 204 passes through conditioning optics 206 (e.g., beam delivery and beam shaping optics) , directing optics 208, and objective 210 to the flow cell 100. Directing optics 208 may be a dichroic beam splitter or other optical component configured to reflect light wavelengths from radiation source 204 while allowing other light wavelengths (including the fluorescent emissions from tagged analyte 180) to pass through the directing optics 208 along the optical path 228 to the detector 222. Although Figure 2 only shows a single radiation source 204 for stimulating fluorescent emissions by tagged analyte 180, additional radiation sources operating at different wavelengths may be included, in conjunction with additional conditioning and directing optics for those additional radiation sources.

[0036] X-Y stage 202 translates the flow cell 100 in x and y directions (perpendicular to the optical axis 210a of objective 210) , allowing the laser beam from radiation source 204 to be scanned across the flow cell 100.

[0037] In Figure 2, detector 222 images fluorescent emissions from tagged analyte 180. Detector 222 may be any suitable camera or other device configured to image stimulated emissions from tags associated with tagged analyte 180. Detector 222 may include a charge-coupled device image sensor (CCD) , a complementary metal oxide semiconductor image sensor (CMOS) , or another suitable image sensor. Detector 222 may be a time delay and integration (TDI) detector.

[0038] In the example of Figure 2, the optical imaging system 200 includes an autofocus sub-system that facilitates imaging fluorescent emissions. In the example of Figure 2, the autofocus sub-system includes a radiation source 214 (e.g., an infra-red laser) , directing optics 218, 220, and a detector 216 that receives light reflected from the radiation source 214 by surfaces of the flow cell 100. The controller 226 receives data from the detector 216, and based on that data, actuates z-translation stage 212 to translate the objective 210 in the z direction, along the optical axis 210a of the objective 210.

[0039] In some embodiments, the objective 210 collects light from the flow cell 100. In a sequencing application, this would usually involve collecting fluorescent light emitted from the incorporated nucleotides. The tube lens 224 takes the light from the objective 210 and focuses it onto the detector 222.

[0040] The detector 222 may be a sensitive camera or photomultiplier tube that can accurately record the different fluorescent signals. These signals are then converted into digital data, which can be analyzed by a computer to determine the sequence of the DNA. The detector 222 may be a Charge-Coupled Device (CCD) or a Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) in a digital camera, or a photomultiplier tube (PMT) in more advanced systems. The choice of detector 222 can affect the sensitivity and speed of the detection system.  In some embodiments, the optical system may further comprise a filter (not shown in the figures) that is used to separate the different wavelengths of light that come from the different fluorescent markers attached to the nucleotides.

[0041] Aberrations

[0042] Optical aberrations refer to imperfections in images formed by optical systems. These aberrations can distort, blur, and diminish the quality of the resultant image. It has been observed that, with an increase in the numerical aperture (NA) of the objective lens 210, the aberrations of the flow cell are exacerbated. Concurrently, the irregularities associated with the flow cell become more pronounced, leading to potential inaccuracies or inefficiencies in analytical measurements.

[0043] In certain embodiments, the coverslip 130 is constructed from a transparent material, for instance, silicon dioxide (SiO2) . However, producing high-quality, high-uniformity coverslips from such materials can be expensive. Coverslips available at a reasonable cost often exhibit irregularities on their surface as illustrated in FIG. 4 and the irregularities can introduce aberrations into the optical system, thereby affecting detection results.

[0044] In the optical system illustrated in FIG. 2, variations in the effective refractive index of the flow cell components --caused by manufacturing irregularities, or by variations in the refractive index of the immersion liquid –and environmental factors (like temperature) that affect the refractive index of the first and second liquids, can all induce optical aberrations.

[0045] Table 1 demonstrates the aberrations exhibited by coverslips manufactured from Fused Silica and Corning SG glass respectively. The experiments conducted used coverslips with different average thicknesses. The average thickness of a coverslip may be measured using a micrometer or microscope with a calibrated eyepiece reticle, as illustrated in FIG. 4 and discussed in the following.

[0046] With regard to the coverslip made of Fused Silica, it possesses a refractive index of 1.4585 at 0.5876 μm and a dispersion number (Vd) of 68. If average thicknesses t_avg of the coverslips vary from coverslip to coverslip by ±10 um and the optical imaging system is refocused to adjust the optical system to account for this variance from coverslip to coverslip,  for example, the working distance between the front element 250 and the coverslip 130 is changed to capture the image. However, the optical system will induce a spherical aberration Z11 of 118 milli-lambda, and a higher order spherical aberration (Zernike polynomial) Z22 of -42.5 milli-lambda. Milli-lambda = 1 / 1000 of lambda with lambda = 587.6nm. The "refocused" herein means the change of the thickness between the front element 250 and the coverslip 130, i.e., changing the working distance (WD) between the front surface 251 of the front element 250 and the top surface 131 of the coverslip 130, as illustrated in FIG. 1B.

[0047] In the case of the Corning Soda Lime Glass coverslip, the refractive index (n) is 1.5234 at 0.5876 μm, with an absorption coefficient (k) of 3.8974 e-7 and dispersion number (Vd) of 63.97. If the average thicknesses of the coverslips t_avg vary by ±10 um, upon refocusing the optical system to retrieve the image, the optical system will induce a spherical aberration Z11 of 140 milli-lambda, and a higher order spherical aberration Z22 of -46 milli-lambda.

[0048] Table 1

[0049] Upon comparison, Fused Silica has demonstrated superior performance compared to the Corning Soda Lime Glass in terms of the aberration introduced by the average thickness variance. In other words, fused silica inherently leads to fewer aberrations and enhances optical system performance due to its material properties.

[0050] In addition, the NA of an optical system is a measure of its ability to gather light and resolve fine specimen detail at a fixed object distance. A larger NA indicates that the lens can collect light over a larger solid angle and from a wider range of incident angles. This results in higher resolution and enhanced image detail as more diffraction orders are collected by the optics. However, a larger NA also means that the optical system becomes more sensitive to the change of the components the light passes through, such as the coverslip of a flow cell, the first liquid 121 and second liquid 141, etc. The variations in the average thickness of the flow cell components due to manufacturing irregularities, or variations in the refractive index of the immersion liquid, may induce optical aberrations at high NA.

[0051] Table 2 shows the spherical aberration with different NAs of the coverslips made of Fused silica. With the change of coverslip 130, the optical imaging system 200 is adjusted to refocus on the tagged analytes 180. However, with changing the working distance (WD) between the front surface 251 of the front element 250 and the top surface 131 of the coverslip 130, as illustrated in FIG. 1B, the data indicates an escalating severity of aberration as the NA increases.

[0052] Tables 2-1 and 2-2 show the aberration with different NAs of the cover slip made of Fused silica. The data indicates an escalating severity of aberration as the numerical aperture (NA) increases. Specifically, for an NA of 1.1, the spherical aberration Z11 measures -59.09, and the higher order spherical aberration Z22 measures -18.57. At a larger NA of 1.2, the spherical aberration Z11 and astigmatism aberration Z22 measure -118 and -42.5 respectively. These results substantiate that larger numerical apertures   lead to heightened optical aberrations for the same tolerance.

[0053] Table 2-1: 1.1 NA

[0054] Table 2-2: 1.2 NA

[0055] Table 3 shows how a typical lens design with an NA 1.2 objective would react to typical changes in the optical path and the claimed compensation strategy in different implementations. In row 1 we just change the working distance (WD) by +10μm. This change corresponds to increasing the distance between the microscope objective's first lens and the cover slip. It leads to a large defocus of nearly 5 lambda, a spherical aberration (Z11) of 280 mlambda, and a third order spherical (Z22) of 48 mlambda.

[0056] In line 2 we change only the refractive index of the immersion liquid by 0.01, which leads to a defocus of -2, 276 lambda, spherical aberration of -579 mlambda, and higher order spherical aberration of -159 mlambda.

[0057] In line 3 we change only the cover slip thickness by +10 μm, which causes 4 lambda defocus, 85 ml spherical, 5 mlambda higher order spherical.

[0058] Generally, the surface irregularity of the cover glass can also contribute to the aberration. The immersion of an optical system in a liquid can reduce the irregularity effect. In the case of water, the refractive index is approximately 1.33, while the refractive index of air is approximately 1.0. The difference between the refractive indices of glass and the water is 0.17. In contrast, the difference between the refractive indices of air and glass is approximately 0.5. In the immersion detection, the irregularity of the coverslip is reduced. Lines 5, 6, 7 of table 3 show that the cover glass thickness tolerance can be effectively compensated using phase plates (PP) . PP are one embodiment of a predetermined optical aberration (correction) . Typically a glass plate figured with an aspherical form with <5μm peak to valley. Freeform surfaces are also possible but not needed to correct rotationally symmetric errors like spherical aberrations.

[0059] Table 3

[0060] In addition, as shown in FIG. 3, within the flow cell 100, the tagged analytes 180, such as single-stranded DNA, are mounted on the underside of the coverslip 130 (e.g., SiO2 coverslip) in mode A and on the substrate 110 (e.g., Si-wafer substrate) in mode B. When the composition of the first liquid 121 differs from that of the second liquid 141, transitioning from mode A to mode B and merely adjusting the WD can result in residual wavefront errors in mode B. Furthermore, as the composition of the first liquid 121 varies between batches, a simple WD adjustment might be insufficient to accurately focus on the tagged analytes 180 in mode B. The first liquid 121 is preferably the same as the second liquid 141 for better performance.

[0061] Spherical aberration in a flow cell-based nucleic acid sequencing system can detrimentally affect image quality, especially in high-resolution imaging. To focus on the tagged analytes 180 in different flow cells, considering the varying coverslips and both first and second liquids, the optical imaging system 200 may need adjustments to compensate for variations in the flow cell.

[0062] In some embodiments, a sensor (not shown in the figures) is incorporated into the system. The sensor is configured to detect wavefront aberrations introduced by the changing of the flow cell coverslip or the first and second liquids and relay this information to a computer system. The optical system may also include a liquid crystal compensating plate (e.g., spatial light modulators) configured to adjust its shape or refractive index to correct for the detected wavefront aberrations.

[0063] However, the adjustment of the optical imaging system 200 for each coverslip complicates detection. Each coverslip may necessitate unique correction, leading to increased  costs from integrating feedback mechanisms like wavefront sensors, confocal sensor, or WLI interferometer. In the absence of such a sensor, measurement using a camera and an advanced algorithm becomes essential. This approach, however, sacrifices robustness and demands longer development time.

[0064] A need arises for methods or apparatuses capable of effectively counteracting optical aberrations caused by manufacturing inconsistencies and variations in the refractive index of liquids, especially within systems utilizing a large NA. Such compensatory methods or apparatuses would facilitate the use of more affordable, non-uniform coverslips in flow cell designs, without compromising the quality of optical detection outcomes. This approach would aid in cost reduction while either maintaining or enhancing the performance of the optical systems in which they are implemented. In this context, we are primarily concerned with focus aberration z4, spherical aberration z11, and higher-order spherical aberration z22.

[0065] Manufacturing variability data

[0066] To focus on the tagged analytes 180 in various flow cells, even if the front element 250 of objective 210 is adjusted to alter the WD, certain aberrations remain uncorrectable in systems with a large NA. While the sensor system described above can compensate for aberrations induced by the flow cell, such a corrective mechanism might be cost-prohibitive due to the requirement for individualized corrections for each flow cell. To enhance wavefront aberration correction, the manufacturing variability of the flow cell can be pre-determined, and this data can be stored for subsequent use. These concepts and embodiments detailed below improve the performance of the optical system, considering both quality and cost efficiency.

[0067] In some embodiments, the complexity of the system may be reduced by pre-measuring the flow cell, including, but not limited to, the average thickness of the coverslip.

[0068] The method of nucleic acid sequencing involves positioning a flow cell 100 within an optical imaging system 200. The substrate 110 is designed to hold a spaced array of analytes 180 (e.g., nucleic acid samples) . The optical imaging system 200 may comprise an objective 210 and a compensator 280, the latter being configured to selectively apply one from a set of pre-determined optical corrections. The method also includes receiving manufacturing  variability data about the flow cell positioned in the imaging system and based on the received manufacturing variability data about the flow cell, selectively applying one of the plurality of pre-determined optical corrections to the optical subsystem by the compensator 280.

[0069] In some embodiment, the manufacturing variability data about the flow cell may comprise the manufacturing variability data for the coverslip. The data may include an average thickness of the coverslip.

[0070] In some embodiment, the average thickness of a coverslip may be measured using a micrometer or microscope with a calibrated eyepiece reticle, and measured by equidistant points and calculated by t_avg=1 / NΣti, jwherein i and j locate the equidistant points on a transverse plane and N is the number of the equidistant points taken into accounted. In some embodiment, the average thickness can be calculated within the clear aperture wherein the beam scans across, as shown in FIG. 4. While the present disclosure describes a method for calculating the average thickness, it should be understood that this is provided by way of example and not limitation. Other methods for calculating the average thickness can also be utilized within the scope of the invention.

[0071] In some embodiments, this pre-measurement may be finished during manufacture. The results of these measurements are subsequently stored within a database. Each coverslip can then be identified by an associated code, such as a barcode, datamatrix, QR code, or other identification systems, which correlates to the premeasured data. Prior to the utilization of the coverslip, the premeasured data can be retrieved via the aforementioned code, and the coverslip can be categorized into a bin corresponding to its average thickness (t_avg) . It should be noted that this code may be scanned before the coverslip of the flow cell is subjected to optical analysis.

[0072] In some embodiments, the thickness of the coverslips, denoted as t_xy, may be determined by a sensor positioned on the side of the flow cell. This sensor assesses the t_xy of the lens prior to the microscope's interaction with the sample. The measured thickness t_xy is recorded and stored in correlation to the specific position. An average value, derived from either a portion or the entirety of the data, is subsequently computed.

[0073] In some embodiments, the thickness of a coverslip may be measured using a confocal sensor or white light interferometer. Measuring equidistant points wherein i and j locate the equidistant points on a transverse plane and N is the number of the equidistant points taken into account, one can calculate an average thickness t_avg.

[0074] An illustrative example of this concept is provided in FIGS. 6A and 6B. Here, the premeasured data of the coverslips possessing different serial numbers are retrieved via the code and then the coverslips are assigned to distinct bins based on their respective t_avg. The average thickness t_avg of each coverslip of the flow cell is premeasured and stored in the database. The coverslip is allocated to a bin, contingent upon the calculated average thickness (t_avg) . The bins are configured to accommodate coverslips with a variation tolerance, for example, + / -10 um, + / -15 um, or + / -20 um.

[0075] In some embodiments, to establish an accurate correspondence between the thickness and location, a reference position (x, y) is recorded both prior to and following this measurement process, thereby facilitating the identification of coverslip thickness at any given side.

[0076] As shown in tables above, if t_avg is altered by ±10 um and the optical system is refocused to capture the image, the optical system will induce big spherical aberration Z11 and a higher order spherical aberration Z22. In real use, the t_avg may be altered by +-20 um or even more.

[0077] In some embodiments, the manufacturing variability data may encompass the refractive index of a liquid. The refractive index, as exemplified by the first liquid 121 and the second liquid 141, can undergo alterations based on temperature fluctuations and other environmental conditions. As set forth in the described embodiments, an increase in the NA is associated with an amplified sensitivity to aberrations due to changes in the refractive index. The liquid information, comprising but not limited to the components of the liquid or the refractive index of the liquid may be premeasured and stored in a data base. This information may be retrieved before the utilization. For example, as the composition of the first liquid 121 varies between batches, and refractive index for the first liquid may change with temperature and other conditions. The refractive index may be pre-measured before the detection and stored  in correlation to the flow cell by a mark associating with said pre-measured manufacturing variability data in the database on the coverslip. The flow cell with different refractive indices of liquid may also distributed in different containers before using as discussed above.

[0078] In some embodiments, the manufacturing variability data comprises both the average thickness of the coverslip and the refractive index of the liquid.

[0079] Compensator

[0080] Given knowledge of the average thickness of the coverslip and / or the refractive index of the liquid, the optical system may be engineered to offset the aberration predicated on this average thickness and / or the refractive index of the liquid. In some embodiments, one or more phase compensators may be introduced as a compensator assembly configured to selectively apply optical corrections to the aberrations brought by the flow cell due to the irregularities or the refractive index change.

[0081] In some embodiments, the phase compensator is specifically tailored to accommodate different coverslip thicknesses according to the assigned bin number of the flow cell or other data associated with the flow cell indicative of the particular manufacturing irregularities and / or refractive index associated with that particular flow cell.

[0082] In some embodiments, the phase compensator may be integrated within a mechanism by a placeholder that is either a slider or a revolver. The slider mechanism can be manipulated manually or semi-automatically, facilitated by a designated loading dock. Additionally, the cassette housing the slider can be interchanged or replaced as necessary.

[0083] In some embodiments, as referred to in FIG. 8, an example of immersion microscope objective lens is provided. The immersion microscope objective lens comprises, in order from an object: a first lens group G1 having positive refractive power, a second lens group G2 having a positive refractive power and a third lens group G3 having a negative refractive power. The first lens group G1 comprises a first lens component including a plano-convex lens L11 having its plane surface facing the flow cell 100 and a meniscus lens L12 having a concave surface cemented to the plano-convex lens L11, a second lens component  including a single lens L2 with a positive refractive power, and a third lens component L3 including a doublet lens.

[0084] The phase compensator 280 can be situated anywhere along the optical detection path. However, through various experiments, positions A and B, as depicted in FIG. 9, have been found to be more optimal in at least some implementations.

[0085] As illustrated in FIG. 9, the compensator plate 280 may be positioned between the first lens group G1 and the second lens group G2 at position B. In some other embodiments, the compensator 280 may be situated between the first lens component L1 and the second lens component L2 at position A.

[0086] In certain embodiments, the phase compensator can be situated between the objective lens and the tube lens, denoted as position C in FIG. 9. While this position offers excellent accessibility, its performance may be inferior, with the same objective and other optics, compared to position A, which lies between the first and second lens groups, and position B, situated between the first lens component L1 and the second lens L2 of the first lens group G1.

[0087] In certain embodiments, the second lens group G2 may comprise a lens component in which a negative lens L41 and a positive lens L42 are cemented together. The following conditional expressions should be met: r1 = infinity, 0.1 < | r2  / F | < 1.5, n12 -n11 > 0.3, and n3Gp > 1.63. Here, n11 and n12 represent the refractive indices at the d-line for the plano-convex lens (with its plane surface facing the object) of the first lens component L11 and the meniscus lens L12 (with its convex surface facing the image) of the first lens component, respectively. r1 indicates the radius of curvature of the lens surface of the plano-convex lens L11 that contacts the immersion liquid. r2 signifies the radius of curvature of the cemented surface of the first lens component L12. F stands for the focal length of the entire objective lens system. n3Gp represents the refractive index at the d-line of the positive lens L82, which is situated closest to the image of the third lens group G3. In certain embodiments, the second lens group G2 might also include a triplet lens L5 and a doublet lens L6. In some instances, n12-n11 equals 1.7725-1.4585, which results in 0.314, and n3Gp has a value of 1.6477.

[0088] As observed in FIG. 10, both positions, A and B, offer commendable optical performance. However, spatial considerations are paramount during the fabrication of objective 210. In certain embodiments, the revolving or sliding placeholder configured to hold one or more compensator, is an integral component of the immersion objective.

[0089] In some embodiments, there are design considerations that facilitate the accommodation of the phase plate at various positions within the optical system. Specifically, these positions, exemplified by but not limited to position A, B, and / or C, are tailored to provide mechanical support that's easily accessible by the phase plate. This design flexibility can manifest in features such as a revolver mechanism or a slider mechanism integrated into the objective. These mechanisms provide ease of access and adjustment for different compensator configurations, ensuring optimal performance and versatility of the optical system.

[0090] Doublet and Triplet lens elements are combinations of two or three lenses that are designed to correct for chromatic and spherical aberration. They're typically glued together.

[0091] In some embodiments, a method of nucleic acid sequencing comprises (a) positioning a flow cell 100 in a flow cell imaging system 200, wherein: (i) the flow cell 100 comprises a substrate 110 and a coverslip 130 spaced from the substrate 110 to define a liquid gap 120 therebetween, wherein the substrate 110 is configured to hold a spaced array of nucleic acid samples; and (ii) the flow cell imaging system 200 comprises an optical subsystem, the optical subsystem comprising an immersion objective 210, the optical subsystem further comprising a compensator assembly 280 configured to selectively apply one of a plurality of pre-determined optical corrections; (b) receiving manufacturing variability data about the coverslip 130 positioned in the flow cell imaging system 200; and (c) based on the received manufacturing variability data about the coverslip 130 positioned in the flow cell imaging system 200, selectively applying one of the plurality of pre-determined optical corrections to the optical subsystem.

[0092] In some embodiments, the immersion objective 210 has a numerical aperture of 1 or greater and the manufacturing variability data about the coverslip 130 comprises an average thickness of the coverslip positioned in the flow cell imaging system 200 of the coverslip 130.

[0093] In some embodiments, receiving the manufacturing variability data about the coverslip 130 comprises determining the manufacturing variability data about the coverslip 130 using a measurement device. By using the measurement device, the coverslip is selected from a set of coverslips with a thickness tolerance variability of at least + / -10 μm.

[0094] In some embodiments, before positioning the flow cell in a flow cell imaging system 200, pre-measuring the manufacturing variability data of the coverslip 130, storing the manufacturing variability data in a database, and making a mark associating with said pre-measured manufacturing variability data in the database on the coverslip 130. The mark comprises at least one of a barcode, datamatrix, and QR code. The manufacturing variability data comprises an average thickness of the coverslip 130.

[0095] In some embodiments, before positioning the flow cell 100 in a flow cell imaging system 200, pre-measuring the manufacturing variability data of a plurality of coverslips 130, and categorizing each coverslips into different groups based on a tolerance variability of + / -15 μm. The different groups of coverslips are distributed into different containers.

[0096] In some embodiments, pre-measuring the manufacturing variability data of the coverslip, storing the manufacturing variability data in the database, and making the mark are performed during manufacturing the coverslip 130.

[0097] In some embodiments, after positioning a flow cell 100 in a flow cell imaging system 200, a first liquid 121 is provided into the liquid gap and a second liquid 141 is provided on the coverslip, the first and the second liquids are the same.

[0098] In some embodiments, the compensator assembly 280 comprises one or more re-positionable phase plates configured to apply one of the plurality of pre-determined optical corrections based on the manufacturing variability data. The one or more re-positionable phase plates are arranged on a plane and configured to apply one of the plurality of pre-determined optical corrections by selectively rotating or pulling the phase plates to proper positions.

[0099] In some embodiments, the compensator assembly 280 is positioned within the immersion objective 210. The immersion objective 210 comprises a first lens group having a positive refractive power, a second lens group having a positive refractive power and a third  lens group having a negative refractive power, wherein the compensator assembly is provided between the first lens group and the second lens group. In some other embodiments, the immersion objective 210 comprises a first lens component including a plano-convex lens having its plane surface facing the flow cell and a meniscus lens having a concave surface cemented to the plano-convex lens, a second lens component including a single lens with a positive refractive power, and a third lens component including a doublet lens, wherein the compensator assembly is provided between the first lens component and the second lens component.

[0100] Various features described herein, e.g., methods, apparatus, computer readable media and the like, can be realized using a combination of dedicated components, programmable processors, and / or other programmable devices. Processes described herein can be implemented on the same processor or different processors. Where components are described as being configured to perform certain operations, such configuration can be accomplished, e.g., by designing electronic circuits to perform the operation, by programming programmable electronic circuits (such as microprocessors) to perform the operation or a combination thereof. Further, while the embodiments described above may make reference to specific hardware and software components, those skilled in the art will appreciate that different combinations of hardware and / or software components may also be used and that particular operations described as being implemented in hardware might be implemented in software or vice versa.

[0101] Specific details are given in the above description to provide an understanding of the embodiments. However, it is understood that the embodiments may be practiced without these specific details. In some instances, well-known circuits, processes, algorithms, structures, and techniques may be shown without unnecessary detail in order to avoid obscuring the embodiments.

[0102] While the principles of the disclosure have been described above in connection with specific apparatus and methods, it is to be understood that this description is made only by way of example and not as a limitation on the scope of the disclosure. Embodiments were chosen and described in order to explain the principles of the invention and practical applications to  enable others skilled in the art to utilize the invention in various embodiments and with various modifications, as are suited to a particular use contemplated. It will be appreciated that the description is intended to cover modifications and equivalents.

[0103] Also, it is noted that the embodiments may be described as a process which is depicted as a flowchart, a flow diagram, a data flow diagram, a structure diagram, or a block diagram. Although a flowchart may describe the operations as a sequential process, many of the operations can be performed in parallel or concurrently. In addition, the order of the operations may be re-arranged. A process is terminated when its operations are completed, but could have additional steps not included in the figure. A process may correspond to a method, a function, a procedure, a subroutine, a subprogram, etc.

[0104] A recitation of “a” , “an” , or “the” is intended to mean “one or more” unless specifically indicated to the contrary. Patents, patent applications, publications, and descriptions mentioned here are incorporated by reference in their entirety for all purposes. None is admitted being prior art.

Claims

1.A method of nucleic acid sequencing comprising:(a) positioning a flow cell in a flow cell imaging system, wherein:(i) the flow cell comprises a substrate and a coverslip spaced from the substrate to define a liquid gap therebetween, wherein the substrate is configured to hold a spaced array of nucleic acid samples; and(ii) the flow cell imaging system comprises an optical subsystem, the optical subsystem comprising an immersion objective, the optical subsystem further comprising a compensator assembly configured to selectively apply one of a plurality of pre-determined optical corrections;(b) receiving manufacturing variability data about the coverslip positioned in the flow cell imaging system; and(c) based on the received manufacturing variability data about the coverslip positioned in the flow cell imaging system, selectively applying one of the plurality of pre-determined optical corrections to the optical subsystem.2.The method of claim 1, wherein the immersion objective has a numerical aperture of 1 or greater.3.The method of claim 1, wherein the manufacturing variability data about the coverslip comprises an average thickness of the coverslip positioned in the flow cell imaging system of the coverslip.4.The method of claim 3, wherein receiving the manufacturing variability data about the coverslip comprises determining the manufacturing variability data about the coverslip using a measurement device.5.The method of claim 3, wherein the coverslip is selected from a set of coverslips with a thickness tolerance variability of at least + / -10 μm.6.The method of claim 1, wherein before positioning the flow cell in a flow cell imaging system, pre-measuring the manufacturing variability data of the coverslip, storing the manufacturing variability data in a database, and making a mark associating with said pre-measured manufacturing variability data in the database on the coverslip.7.The method of claim 6, wherein the mark comprises at least one of a barcode, datamatrix, and QR code.8.The method of claim 6, wherein the manufacturing variability data comprises an average thickness of the coverslip.9.The method of claim 1, wherein before positioning the flow cell in a flow cell imaging system, pre-measuring the manufacturing variability data of a plurality of coverslips, and categorizing each coverslips into different groups based on a tolerance variability of + / -15 μm.10.The method of claim 9, wherein different groups of coverslips are distributed into different containers.11.The method of claim 6, wherein pre-measuring the manufacturing variability data of the coverslip, storing the manufacturing variability data in the database, and making the mark are performed during manufacturing the coverslip.12.The method of claim 1, wherein after positioning a flow cell in a flow cell imaging system, a first liquid is provided into the liquid gap and a second liquid is provided on the coverslip, the first and the second liquids are the same.13.The method of claim 1, wherein the compensator assembly comprises one or more re-positionable phase plates configured to apply one of the plurality of pre-determined optical corrections based on the manufacturing variability data.14.The method of claim 13, the one or more re-positionable phase plates are arranged on a plane and configured to apply one of the plurality of pre-determined optical corrections by selectively rotating or pulling the phase plates to proper positions.15.The method of claim 1, wherein the compensator assembly is positioned within the immersion objective.16.The method of claim 15, wherein the immersion objective comprises a first lens group having a positive refractive power, a second lens group having a positive refractive power and a third lens group having a negative refractive power, wherein the compensator assembly is provided between the first lens group and the second lens group.17.The method of claim 15, wherein the immersion objective comprises a first lens component including a plano-convex lens having its plane surface facing the flow cell and a meniscus lens having a concave surface cemented to the plano-convex lens, a second lens component including a single lens with a positive refractive power, and a third lens component including a doublet lens, wherein the compensator assembly is provided between the first lens component and the second lens component.18.The method of claim 13, wherein the immersion objective comprises a placeholder for accepting and switching the re-positionable phase plates in the optical subsystem, and the placeholder is revolvable or slidable.19.A system of nucleic acid sequencing, comprising:a radiation source;a detector; andoptical imaging system, controlled by a controller;wherein the optical imaging system comprises an immersion objective, and a compensator assembly configured to selectively apply one of a plurality of pre-determined optical corrections; andwherein the immersion objective comprises a placeholder configured to hold the compensator assembly.20.The system of claim 19, wherein the placeholder is revolvable or slidable.21.The system of claim 19, wherein the immersion objective comprises a first lens group having a positive refractive power, a second lens group having a positive refractive power and a third lens group having a negative refractive power, wherein the compensator is provided between the first lens group and the second lens group.22.The system of claim 19, wherein the immersion objective comprises a first lens component including a plano-convex lens having its plane surface facing the flow cell and a meniscus lens having a concave surface cemented to the plano-convex lens, a second lens component including a single lens with a positive refractive power, and a third lens component including a doublet lens, wherein the compensator is provided between the first lens component and the second lens component.

Images