Methods for increasing transfer cell density in seed culture and realizing high cell density inoculation in production cultures

Abstract

The present application discloses methods for increasing transfer cell density in seed cultures and realizing high cell density inoculation in production cultures. The method for increasing the transfer cell density of a culture comprises cultivating cells by perfusion in a seed culture; and subjecting the seed culture to concentration by perfusion.

Description

Methods for increasing transfer cell density in seed culture and realizing high cell density inoculation in production culturesTechnical field

[0001] The present application relates to the field of cell culture technology, in particular to a method for high seeding density culture to enhance target product expression.Background

[0002] The production of genetically engineered proteins through mammalian cell culture is a commonly used method for obtaining therapeutic proteins such as monoclonal antibodies. The evolution of mammalian cell culture technology has significantly advanced the development and biomanufacturing of biopharmaceutical products, e.g., therapeutic proteins such as antibodies, fusion proteins, and enzymes. Following is a brief introduction to the commonly used production processes in the biopharmaceutical industry.

[0003] At present, the biopharmaceutical industry at home and abroad mainly use the fed-batch process to express and produce monoclonal antibodies or fusion proteins by engineered mammalian cell lines.

[0004] CN201210057859.7 points out that the traditional fed-batch process (FB) , as a conventional method, requires process development and optimization to obtain desired production performance. In cGMP (Current Good Manufacture Practices) production, it often requires repeatedly validated, bulky cell culture equipment and complex supporting systems. The traditional fed-batch culture of mammalian cells has some insurmountable drawbacks, such as low cell biomass, low protein expression in a single batch, inability to eliminate harmful metabolic products, and complex process control. CN202010592471.1 also states that during the fed-batch process, the medium components are not fully replenished to the site where the proliferation of cells is consumed, which weakens the nutritional supplemental effect of the fed-batch culture and thus affects the proliferation effect of cells.

[0005] Perfusion is a continuous cell culture mode wherein the fresh culture medium is continuously fed into the reactor during the process, and the expression products are  continuously harvested along with the discharged cell culture medium. CN201210057859.7 points out that the perfusion process can significantly increase the cell biomass and the protein concentration. However, this process mode consumes a large amount of medium, and the harvest volume also requires sufficient storage space and special downstream processing designs. Therefore, the perfusion process mode is often used for protein products that have poor stability and are prone to changes in quality parameters, and require real-time harvest.

[0006] The process model disclosed in PCT / US2008 / 072612 combines the characteristics of early-stage perfusion and fed-batch culture to achieve a higher protein yield. However, this process model fails to strengthen the accumulation of seed densities in the expansion stage, and occupies the production facilities of large-scale reactors for a long time during the cell exponential proliferation stage, resulting in longer production duration and lower facility usage efficiency.

[0007] WO 2021 / 021973 discloses an intensified fed-batch (IFB) process developed based on the characteristics of the above cell culture processes. At the seed expansion stage (N-1) , nutrient-enhanced medium, batch feeding, and perfusion process are applied to rapidly and efficiently accumulate a large number of cells. When inoculated into the production stage (N) reactor, the initial inoculation density is increased (10-30 × 106 cells / ml) , and a higher peak cell density is achieved during cultivation, thereby accumulating higher protein production and improving batch yield and efficiency. However, there are many challenges for the inoculation density and yield in IFB to continue to reach higher levels: if the culture is extended during the expansion stage, cell density cannot effectively reach higher levels due to limited proliferation potentials; if the perfusion culture time is extended, more perfusion culture medium is needed to meet the cellular consumption. At the same time, the conditions for controlling high seeding density culture are difficult to maintain stable, such as dissolved oxygen (DO) , pH, pCO2, foam control, etc.

[0008] CN201580062059.6 adopts optimized perfusion culture technology to support the acquisition of ultra-high cell density culture media, which can be cryopreserved at high cell density while maintaining excellent cell survival rates and quality. The highest cell density reported in its implementation example reaches 100 × 106 viable cells / mL. This report indirectly demonstrates that the cell culture media with ultra-high cell density can be successfully prepared using alternating tangential flow membrane filtration (ATF) facilities.  The content mentioned in this patent does not involve concentration by perfusion nor subsequent high seeding density culture and protein production.

[0009] To further increase the cell density in seed stage to achieve higher density inoculation for target protein production, the commonly used cell culture process faces the following problems:

[0010] Firstly, regardless of the process used, the final density of the seed culture will vary depending on the differences among cell lines or clones. Many of these cells grow slowly and is difficult to reach a high density, resulting in unfavorable inoculation density for production. In addition, for cells with slower growth rates and lower final density, more resources are often needed to optimize the culture process of the seed culture to achieve the expected goals.

[0011] Secondly, based on the current expansion of seed culture, there are many challenges when the inoculation density and the yield of IFB continue to reach higher levels. If the culture is extended during the expansion stage, the cell density may not be able to reach a higher level effectively; if the perfusion time is extended, more perfusion culture media is needed to meet the cellular consumption. At the same time, the conditions for controlling high cell density culture are difficult to maintain stable, such as DO, pH, pCO2, foam control, etc.; if the inoculation density is increased without an adequately increased transfer cell density, the dilution ratio from N-1 to production will decrease, affecting cell culture status and protein synthesis in production.

[0012] There is still a need in this field to find a method that significantly increases the cell density of a seed culture, achieves high seeding density inoculation and culture, significantly increases target protein yield, and significantly shortens production time and perfusion medium consumption, thereby improving the protein production output of cells with efficient use of facilities and culture media.Summary

[0013] To solve the above technical problem, one aspect of the present application provides a method for increasing transfer cell density of a culture, comprising:

[0014] Cultivating cells by perfusion in a seed culture; and

[0015] Subjecting the seed culture to concentration by perfusion.

[0016] In another aspect, the present application provides a method of high cell density inoculation in production, comprising:

[0017] a. Obtaining a seed culture, wherein the seed culture is obtained by the method for increasing transfer cell density of a culture, comprising: cultivating cells by perfusion in a seed culture; and subjecting the seed culture to concentration by perfusion;

[0018] b. Inoculating the concentrated seed culture into a production culture medium; and

[0019] c. Cultivating cells in the production culture medium to produce a target product.

[0020] Abbreviations Description of drawings

[0021] The following is a more detailed explanation of the present application in conjunction with the accompanying drawings, in which:

[0022] Figure 1 is a schematic diagram of N-1 perfusion and concentration to achieve high density inoculation in different production process modes according to an embodiment of the present application.

[0023] Figure 2a-b show the cell density (a) and viability (b) curves of Clone A N-1 perfusion and concentration according to an embodiment of the present application.

[0024] Figure 3a-d show the UIFB production performance using different N-1 concentration parameter setups according to an embodiment of the present application, and traditional fed-batch (TFB) performance of Clone A on cell growth (a) , viability (b) , lactate metabolism (c) , and product titer (d) .

[0025] Figure 4a-b show the product quality comparison between two UIFB processes with different perfusion and filtration conditions according to an embodiment of the present application, and TFB of Clone A, including product purity and charge variants (a) , and N-glycan distribution (b) .

[0026] Figure 5a-b show the cell density (a) and viability (b) curves of Clone B N-1 perfusion and concentration process according to an embodiment of the present application.

[0027] Figure 6a-d show the comparison of TFB, IFB, IPFB, UIFB and UI-IPFB production processes using Clone B, according to an embodiment of the present application, in terms of cell growth (a) , viability (b) , lactate metabolism (c) , product titer (d) , product purity (e) , and charge variants (f) .

[0028] Figure 7a-f show the comparison of TFB, IFB, IPFB and UIFB, UI-IPFB production processes using Clone A, according to an embodiment of the present application, in terms of N-1 cell growth (a) , production cell growth (b) , viability (c) , lactate (d) , IVCD and Qp (e) , and relative product titer (f) .

[0029] Figure 8a-e show the comparison between 3 L and 250 L UI-IPFB production using  Clone A, according to an embodiment of the present application, in terms of N-1 cell growth (a) , production cell growth (b) , viability (c) , lactate (d) , product titer (e) .

[0030] Figure 9a-f show the comparison of Clone C UI-IPFB performance according to an embodiment of the present application between 2 hours and 24 hours concentration on N-1 cell growth (a) , N-1 viability (b) , production cell growth (c) , lactate (d) , product titer (e) , and product quality results.

[0031] Figure 10a-g show the comparison between high-seeding UIPC and UI-CFB versus low-seeding IPC and CFB processes using Clone A, according to an embodiment of the present application, in terms of N-1 cell growth (a) , production cell growth (b) , viability (c) , IVCD (d) , product titer (e) , Qp (f) , and product quality results (g) .

[0032] Figure 11a-f show N-1 perfusion and high flux concentration, and UI-IPFB cell culture performance of Clone A on N-1 stage VCD (a) , production VCD (b) , and titer (c) ; and the cell culture performance of Clone C on N-1 stage VCD (d) , production VCD (e) , and titer (f) .

[0033] Figure 12a-b show N-1 cell growth profile of Clone A and B with a high concentration ratio, according to an embodiment of the present application, in terms of N-1 cell growth (a) , and N-1 viability (b) .Detailed description

[0034] The present application relates to a method for increasing transfer cell density of a culture. The method for increasing transfer cell density of a culture comprises cultivating cells by perfusion in a seed culture. In the present application, the seed culture can be any liquid culture medium known in the art that is suitable for cultivating cells, and can be adjusted according to the cells to be cultivated. In an embodiment of the present application, cell density refers to viable cell density (VCD) . In an embodiment of the present application, the cells express a target product. In an embodiment of the present application, the target product includes a target protein or polypeptide. In an embodiment of the present application, the cells are genetically engineered to express a target protein or polypeptide. In an embodiment of the present application, the cells include mammalian cells. In an embodiment of the present application, the mammalian cell is a cell that recombinantly expresses a target protein or polypeptide, also known as a host cell. "Host cell" as used herein refers to a mammalian derived cell line selected and domesticated according to production conditions in the pharmaceutical industry to produce biologics. The post-translational modification of the expressed protein has advantages in maintaining the biological activity, stability, and  antigenicity of the protein. Many cell lines can be obtained from commercial sources, such as American Type Culture Collection (ATCC) . Non-limiting Cases of mammalian cells that can be used in the present application include CHO, BHK, HEK293, etc. In a preferred embodiment of the present application, the mammalian cells include Chinese Hamster Ovary cells (CHO) , such as CHO-K1 cells. In an embodiment of the present application, the target protein includes a therapeutic protein. In an embodiment of the present application, the target protein is an exogenous protein, including, for example, a fusion protein, antibody, or enzyme. "Exogenous protein" as used herein refers to a target protein encoded by a gene foreign to the host cell in the field of genetic engineering, wherein by DNA recombination technology, the protein with practical value is effectively amplified and expressed in the host cell. In an embodiment of the present application, the target protein is a monoclonal antibody, including but not limited to antibodies targeting tumor specific antigens, tumor related antigens, and / or autoimmune related antigens. In the present application, the step of cultivation can be any process that can cause cell proliferation in the culture medium. In an embodiment of the present application, the step of cultivation comprises perfusion culture. In an embodiment of the present application, the duration of the step of cultivation is 1-10 days, preferably 2-5 days. In an embodiment of the present application, the inoculation density of the perfusion culture is 0.3-10 × 106 cells / mL, preferably 1-3 × 106 cells / mL. In the present application, the conditions of the step of cultivation may comprise any parameters suitable for the proliferation of the cells to be cultured, including but not limited to, for example, temperature, humidity, DO, pH, pCO2, foam control. In an embodiment of the present application, the temperature of the step of cultivation is 35.5-37.5℃, preferably 36-37℃, more preferably about 36.5℃. In an embodiment of the present application, the CO2 ventilation ratio for the step of cultivation is set to 5-10%, preferably 6-8%. In an embodiment of the present application, the pH of the step of cultivation is 6.6 to 7.4, preferably about 6.7 to 7.2. In an embodiment of the present application, the humidity of the step of cultivation is 70-85%, preferably about 80%. In an embodiment of the present application, the DO of the step of cultivation is 30-50%, preferably about 40%. In an embodiment of the present application, the cell density of the step of cultivation is 10-200 ×106 cells / mL, preferably 20-100 × 106 cells / mL. In an embodiment of the present application, the flux rate for perfusion is 5-20 liters per square meter hour (LMH) . In an embodiment of  the present application, the flux rate for perfusion is 10-16 LMH. In an embodiment of the present application, the flux rate for perfusion is about 5, 10, 12.5, 16 or 20 LMH.

[0035] The method for increasing transfer cell density of a culture further comprises subjecting the seed culture to concentration by perfusion. In an embodiment of the present application, the seed culture is concentrated by using a perfusion device including a filtration device to filter the culture medium and allowing the volume of the discharged waste culture medium to be greater than that of the added new culture medium. In the present application, the suitable filtration device can be any tangential flow filtration device known in the art that is suitable for filtering cells. In an embodiment of the present application, the step of concentration by perfusion comprises the use of a tangential flow filtration device. In an embodiment of the present application, the tangential flow filtration device includes an ATF device and a TFF device. In an embodiment of the present application, the tangential flow filtration device includes a hollow fiber membrane, which can include an ultrafiltration membrane or a microfiltration membrane, such as a 50 kDa ultrafiltration membrane or a 0.2 micron microfiltration membrane, preferably a microfiltration membrane. In an embodiment of the present application, the step of concentration by perfusion begins on the last day of the step of cultivation or after the end of the step of cultivation. In an embodiment of the present application, the step concentration by perfusion lasts for 1-24 hours, preferably 2-5 hours. In an embodiment of the present application, the step of concentration by perfusion lasts for 1-24 hours, preferably 2-10 hours, and more preferably 3-5 hours. In another embodiment of the present application, the step of concentration by perfusion starts 1-3 days, e.g., 1 or 2 days before the end of the step of cultivation. In another embodiment of the present application, the step of concentration by perfusion lasts for 24-72 hours, preferably 24-48 hours, more preferably about 24 hours. In an embodiment of the present application, the cell density of the step of concentration by perfusion is at least 1.5 times, preferably at least 2 times that of the step of cultivation before concentration. In an embodiment of the present application, the filtration ratio of the perfusion concentration step is 40-140. In the present application, the "filtration ratio" refers to the value of the liquid flow rate entering the tangential flow filtration device divided by the liquid flow rate passing through the tangential flow filtration device. In an embodiment of the present application, the cell density of the step of concentration by perfusion is 40-400 × 106 cells / mL or higher, e.g., 100-120 × 106  cells / mL, or 180-200 × 106 cells / mL, or 300-400×106 cells / mL. In an embodiment of the present application, the culture obtained in the step of concentration by perfusion can be used as the seed culture for subsequent cell culture, or directly cryopreserved or used, or other known and suitable uses in the art. In an embodiment of the present application, the flux rate for perfusion is 5-20 liters per square meter hour (LMH) . In an embodiment of the present application, the flux rate for perfusion is 10-16 LMH. In an embodiment of the present application, the flux rate for perfusion is about 5, 10, 12.5, 16 or 20 LMH.

[0036] The present application also relates to a method of high cell density inoculation in production. The method of high cell density inoculation in production comprises obtaining a concentrated seed culture, wherein the seed culture comprises the culture obtained by a method for increasing transfer cell density of a culture, comprising: cultivating cells by perfusion in a seed culture; and subjecting the seed culture to concentration by perfusion. In an embodiment of the present application, the method for increasing transfer cell density of a culture is described as above.

[0037] The method of high cell density inoculation in production further comprises inoculating the concentrated seed culture into a production culture medium. In an embodiment of the present application, the inoculation dilution ratio of this step is at least 3, preferably 4-6. In an embodiment of the present application, the inoculation density of this step is 10-100 × 106 cells / mL, e.g., 10-20× 106 cells / mL, 20-25 × 106 cells / mL, 30-60 × 106 cells / mL, 40-80 × 106 cells / mL, or 50-80 × 106 cells / mL. In the present application, the production culture medium included in this step can be any known culture medium in the art that can promote cellular proliferation or target protein expression.

[0038] The method of high cell density inoculation in production further comprises cultivating cells in the production culture medium to produce a target product. In the present application, this step can be any process that enables cellular proliferation or expression of target proteins. In an embodiment of the present application, the cell culture of this step lasts for 6-20 days, preferably 8-18 days, more preferably about 12～14 days. In an embodiment of the present application, this step comprises shifting the temperature of cell culture or maintaining a constant temperature of cell culture. In an embodiment of the present application, this step comprises reducing the temperature of cell culture. In an embodiment of the present application, this step comprises maintaining a temperature of cell culture that is basically  constant. In an embodiment of the present application, reduction of the temperature of cell culture begins on the 0-5th day after inoculation. In one embodiment of the present application, reduction of the temperature of cell culture begins on the 0-1st day after inoculation. In one embodiment of the present application, reduction of the temperature of cell culture begins within 8 hours after inoculation. In an embodiment of the present application, reduction of the temperature of cell culture begins on the first day after inoculation. In an embodiment of the present application, reduction of the temperature of cell culture comprises conducting cell culture at a temperature lower than the temperature of the seed solution. In an embodiment of the present application, the temperature of the culture is 29-37 ℃, preferably 36-37℃, more preferably about 36.5℃, and the shifted temperature of cell culture in this step is 29-35℃, preferably 30-34℃, more preferably about 31-33℃. In an embodiment of the present application, reduction of the temperature of cell culture comprises first cultivating cells at an initial temperature, and then cultivating cells at a shifted temperature after reaching predetermined conditions, wherein the shifted temperature is lower than the initial temperature. In an embodiment of the present application, the initial temperature is 36-37℃, preferably 35-37℃, more preferably about 36.5℃. In an embodiment of the present application, the shifted temperature is 25-35℃, preferably 30-32℃, more preferably about 31℃. In an embodiment of the present application, the predetermined conditions include a predetermined time, such as cultivating cells at an initial temperature for 12-48 hours, preferably about 24 hours. In an embodiment of the present application, the predetermined conditions include a predetermined cell density, such as a cell density of 16-20 × 106 cells / mL. In an embodiment of the present application, the step comprises fed-batch culture with feed medium and / or medium exchange and / or perfusion. In an embodiment of the present application, the step comprises fed-batch culture with feed medium. In an embodiment of the present application, the step comprises medium exchange by perfusion. In an embodiment of the present application, the step comprises continuous perfusion culture with a constant exchange of medium by perfusion. In the present application, the culture medium included in the medium exchange by perfusion may be any known culture medium in the art that can promote cellular proliferation or express target proteins. In an embodiment of the present application, the culture medium included in the medium exchange by perfusion is the same as the culture medium included in the seed culture. In an embodiment of the present  application, the culture medium included in the medium exchange by perfusion is different from the culture medium included in the seed culture. In an embodiment of the present application, the exchange amount for the medium exchange by perfusion can be a culture medium with a volume 0.5 to 6 times, 1.5 to 3 times, or 1.5 to 2 times the initial working volume. In an embodiment of the present application, the medium exchange by perfusion may last for 6-48 hours. In an embodiment of the present application, the medium exchange by perfusion may begin on the 2-7th day and / or the 5-12th day after inoculation. In an embodiment of the present application, this step comprises intermittent perfusion fed-batch culture. In an embodiment of the present application, this step comprises continuous perfusion production, such as intensified perfusion culture or concentrated fed-batch culture.

[0039] Through the method of the present application, during and / or after the stage of the perfusion seed culture, the culture is concentrated and filtered using a perfusion device of a hollow fiber membrane. By increasing the discharge of the cell culture waste liquid, the final density of the cells is concentrated to 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, or even 5.0 times the original cell density; simultaneously maintaining the necessary conditions for cell culture, including temperature, dissolved oxygen, pH, aeration, medium supply, etc., minimizing the concentration time to eliminate adverse effects on cell state. Transferring the concentrated seed solution to the N production bioreactor significantly increases the initial inoculation VCD. The schematic diagram of this process is shown in Figure 1. Some main process features description and comparison are listed in Table 1.

[0040] Table 1 Production Cell Culture Process and Feature Comparison

[0041] The following will provide a clear and complete description of the technical solution of the present application in conjunction with specific examples. It is evident that the described embodiments are a part of the present application, rather than the entire examples. Based on the examples in the present application, all other examples obtained by those skilled in the art without any creative work fall within the scope of protection in the present application.

[0042] Example

[0043] The following will provide a more detailed description of the technical solution of the present invention in conjunction with specific examples. The following examples are only exemplary and do not constitute any limitation to the technical solution of the present invention. The specific technical parameters such as materials, steps, conditions, values, or numerical ranges in the following examples are only exemplary and are not exhaustive or limited.

[0044] The cells used in the following examples are CHO-K1 cell lines from WuXi Biologics. that are stably transfected to express different types of monoclonal antibodies, like IgG1 and IgG4. Clone A (WuXia 3.0 cell line 196-N079-05-20) was used in Examples 1, 3, 5, 6 and 7, Clone B (WuXia 2.0 cell line 154A-01-010) was used in Example 2 and 7, and Clone C (WuXia 3.0 cell line 196-N079-06-08) was used in Examples 4 and 6.

[0045] The following culture media used in the following examples are Actipro (Hyclone, Cat No.: SH31037) ; CD CHO (Gibco, Cat No.: 12490) ; Cell Boost 7a (HyClone, Cat No.: SH31026) ; Cell Boost 7b (HyClone, Cat No.: SH31027) ; WXBM and WXFM (proprietary in-house medium from WuXi Biologics. ) . The information of main equipment related to the  experiment examples are listed in Table 2. Further details related to materials and media preparation are listed in Table 3 and Table 4, respectively.

[0046] In addition to the specific methods, equipment, and materials used in the examples, based on the mastery of the prior art by those skilled in the art and the records of the present invention, any method, equipment, and material of the prior art that are similar or equivalent to the methods, equipment, and materials described in the examples of the present invention can also be used to implement the present invention.

[0047] Table 2 List of Main Experimental Equipment

[0048] Table 3 List of Main Materials

[0049] Table 4 List of Formulations for Main Culture Media

[0050] To provide a clearer description of the technical solution of the present invention, further description will be given in conjunction with the examples.

[0051] Example 1: N-1 perfusion and concentration for UIFB production with Clone A

[0052] To evaluate the effect of ATF perfusion parameters on the N-1 concentration process, the study with different perfusion rates and filtration ratios during the N-1 concentration phase was performed using Clone A, and the concentrated high cell density seed culture was used to inoculate production bioreactors. The detailed process parameters for N-1 and production bioreactors were summarized in Table 5 andTable 6, respectively.

[0053] For vial thaw, one vial of frozen cells was firstly thawed at 37.0±1.0℃ for 120-150 seconds in a water bath. The cells were then transferred into a shake flask with pre-warmed passage medium (CD CHO) . Followed by that, the shake flask was transferred to a shaking incubator with the settings as follows: 36.5℃ culture temperature; 110 rpm shaker speed with a 50 mm orbital diameter; and 6%. CO2. At least 5 min later, one sample was taken from the shake flask for VCD and viability measurement. Based on the results, the seeding cell density was adjusted to the target VCD of 0.10～0.20 × 106 cells / mL. After 72 ± 12 hours of culture, the cells were ready for passaging when the transfer cell density was within 1.5～2.2 × 106 cells / mL. For the cell expansion before N-1 in the following examples, cells were thawed and passaged in shake flasks with the same conditions and settings.

[0054] During the N-1 concentration, the perfusion flow could be terminated or maintained, and the harvest flow was increased as specified in Table 5. Within 2～5 hours of concentration, the cell culture volume was reduced to around 50%of the initial culture volume. In this example, the effects of different conditions of N-1 concentration, as well as the results of cell culture performance and protein production during the UIFB production stage were investigated.

[0055] Table 5 Parameters for N-1 Perfusion Concentration Process

[0056] Table 6 TFB and UIFB Production Bioreactor Parameters

[0057] Results

[0058] As shown in Figure 2a-b, different N-1 concentration parameters listed in Table 5 had no obvious impact on the N-1 VCD and viability. In the study, the N-1 peak VCD of Cell line A reached ～50 × 106 cell / mL after 3-day perfusion and was then concentrated to ～100 × 106 cell / mL within 2-3 hours via the ATF controller.

[0059] As shown in Figure 3a-d, the UIFB process with high seeding density significantly increased the peak VCD to ～30 × 106 cell / mL, compared to ～15 × 106 cell / mL in the TFB process. Due to the higher inoculation cell density, the titer increased from 3.0 g / L to 5.0 ～6.0 g / L on Day 8～10, 60%～100%higher than the one of the TFB control.

[0060] As shown in Figure 4a-b, comparable PQA results between the UIFB conditions and the  TFB control were obtained in terms of product-related purity and N-glycosylation. All process conditions showed comparable levels of aggregation and fragmentation. As for charge variants, a slightly higher main peak and a lower acidic peak were observed in the UIFB conditions. In N-glycan analysis, UIFB showed a slightly lower level of Man5 and G0 species than that from the TFB control. Other than that, there was no significant difference in other glycosylation patterns.

[0061] Example 2: N-1 perfusion and concentration for UI-IPFB production with Clone B

[0062] In this study, the N-1 perfusion and concentration process with different ATF2 filtration ratios was further evaluated with Clone B. The ATF flow and harvest rates were adjusted according to Table 7 to achieve the targeted ATF filtration ratios during the N-1 concentration process.

[0063] Table 7 Investigation of Filtration Ratios in N-1 Concentration

[0064] After N-1, five different production cultures were inoculated using seeds from representative conditions including batch seed expansion, perfusion seed expansion and concentrated perfusion seed expansion. The production culture modes included traditional fed-batch (TFB) , the intensified fed-batch (IFB) , and intermittent perfusion fed-batch (IPFB) , ultra-intensified fed-batch culture (UIFB) , and ultra-intensified intermittent-perfusion fed-batch (UI-IPFB) . The seeding density, perfusion schedules and controlled parameters are listed in Table 8.

[0065] Table 8 Production Parameters of Different Culture Modes

[0066] Results

[0067] As shown in Figure 5a-b, with different ATF filtration ratios from 40 to 140, the final transfer VCD post concentration reached 180-200 × 106 cells / mL from 50-60 × 106 cells / mL post Day 6 of N-1 perfusion expansion. In all the evaluated ATF filtration ratios during concentration, no fouling of the hollow fiber membrane or increased transmembrane pressure was observed. Also, no differences in cell growth and viability were identified among the different N-1 conditions. As such, the concentrated seeds from N-1 BR#01 and BR#04 were used to inoculate both UIFB and UI-IPFB production bioreactors.

[0068] From Figure 6a-d, the initial seeding densities were 1.0× 106 cells / mL for TFB, 10× 106 cells / mL for IFB and IPFB, and 35× 106 cells / mL for UIFB and UI-IPFB. During the culture, the peak cell densities of TFB, IFB, UIFB and UI-IPFB reached 26, 30, 49 and 49 × 106 cells / mL, respectively. For the UIFB process, lactate rapidly accumulated to ～3 g / L on Day 8, and the cell viability began to gradually decrease and dropped below 60%on Day 10. Similarly, IFB promoted lactate accumulation from Day 10 and reached ～3 g / L on Day 13, with the viability declined to ～60%simultaneously. For UI-IPFB with intermittent perfusion during cultivation, no increase in lactate was observed, and the cell viability remained ～70%till Day 13.

[0069] As a result, UI-IPFB produced 12.1 g / L of protein on Day 13, twice the titer of UIFB. In comparison to IFB, the titer of UIFB reached 6.1 g / L on Day 8 vs. 4.6 g / L from IFB on Day 13. Due to the better cell density and viability maintenance in IPFB, the final titer was 6.3 g / L, which  was comparable to the titer of UIFB and 1.3～1.4 folds of TFB and IFB.

[0070] From Figure 6, it was found that the product-related purity as illustrated in the SEC and CE profiles was all similar among the different production culture modes. For charge distributions from iCIEF, different production modes generated a comparable profile, except that the ones with intermittent perfusion in IPFB and UI-IPFB showed a higher main peak and a lower acidic peak.

[0071] Example 3: UIFB, IPFB, and UI-IPFB production with Clone A

[0072] In this study, the comparison of different culture modes was performed using Clone A in 3 L bench scale bioreactors. Then, the best production performance from the UI-IPFB process was further scaled up to 250 L single-use bioreactors.

[0073] Process parameter setup for N-1 and Production stage

[0074] N-1 perfusion and concentration in 3 L bioreactor and 50 L single-use bioreactor followed the operation as described in Table 9. And the production process parameters for 3 L and 250 L production are listed in Table 10.

[0075] Table 9 N-1 Process Parameters in 3 L and 50 L Scales

[0076] Table 10 Production Parameters with Different Culture Modes

[0077] Results

[0078] As shown in Figure 7, with the N-1 concentrated culture, the production seeding density of UIFB and UI-IPFB was doubled to ～20×106 cell / mL, while that of TFB, IFB and IPFB was 1.0×106 cell / mL and 10×106 cell / mL, respectively.

[0079] The UI-IPFB culture seeded at 20×106 cell / mL showed improved performance with the peak VCD reaching ～35×106 cell / mL, the highest among all conditions, and viability sustained above 60%until Day 14. However, the IFB process seeded at 10×106 cell / mL and UIFB at 20×106 cell / mL ended up with early termination due to viability crush to ～50%. In addition, lactate also spiked on Day 8 and 9, respectively. No obvious difference in Qp was found between TFB and IFB. Owing to the joint benefit from the ultra-high seeding and the IPFB culture mode, the cumulative Integral of Viable Cell Density (IVCD) of UI-IPFB rose by 40-70%, compared to the IFB and UIFB controls. Moreover, the lactate spike was also suppressed effectively with the IPFB condition. The Qp from UI-IPFB increased by ～70%compared to IFB and UIFB controls. Overall, the final titer reached ～4 folds of the TFB and ～2 folds of the IFB and UIFB controls.

[0080] As shown in Figure 8, the UI-IPFB process of Cell line A was scaled up from 3 L to 250 L single-use bioreactor (SUB) using a 50 L SUB for N-1 perfusion and concentration, which exhibited highly comparable in-process trends in cell growth, lactate metabolism, and protein production. The highly comparable performance demonstrated process scalability of both N-1 perfusion and concentration as well as UI-IPFB production in large-scale manufacturing.

[0081] Example 4: N-1 concentration strategies for UI-IPFB with Clone C

[0082] N-1 perfusion and concentration strategies

[0083] As listed in Table 11, for the concentration Approach I, the N-1 culture was concentrated by reducing ～50%culture volume within 2～3 hours post N-1 perfusion on Day 6 through increasing the harvest flow rate to 10 VVD. While for Approach II, the N-1 culture concentration was initiated from Day 5 till the end of perfusion on Day 6 to reduce the culture volume by ～50%through increasing the ATF harvest flow rate by additional 0.5 VVD while keeping the perfusion rate unchanged. The N-1 cell culture performance was evaluated with these two concentration approaches.

[0084] For UI-IPFB production, the inoculation from the two concentrated approaches followed a similar split ratio of 4: 1, with the initial densities reaching 35 and 45×106 cell / mL, respectively. The detailed production parameters from both seeds followed the similar UI-IPFB operation as listed in Table 10.

[0085] Table 11 N-1 Process Parameters with Different Concentration Approaches

[0086] Results

[0087] As shown in Figure 9, with the two different N-1 concentration approaches, the transfer VCD reached ～179 and ～136 ×106 cell / mL, respectively. To keep a similar split ratio of 4: 1 from N-1 to production stage, the resulted seeding densities were ～37 and ～50×106 cell / mL, respectively. The higher seeding density raised the peak VCD to over 70 ×106 cell / mL in comparison to ～58×106 cell / mL from the lower seeding density. Except for VCD, both production conditions shared a similar viability profile. At the end of production, the two UI-IPFB conditions with two different seeding densities produced 18.0 g / L and 15.6 g / L of products, respectively, compared to ～4.0 g / L in TFB (data not shown) . Comparable PQA results between the N-1 24 hours and 2 hours concentration conditions were obtained in terms of product-related purity, charge variants and N-glycosylation.

[0088] This study showed that both of the concentration approaches in N-1 perfusion  expansion could serve for the same purpose of increasing transfer cell density. The choice of concentration strategies could be determined according to the comparative cell growth performance for each cell line from both approaches.

[0089] Example 5: High cell density inoculation for continuous production with Clone A

[0090] In this study, the effect of high seeding density achieved by N-1 perfusion and concentration in continuous culture processes, such as IPC and CFB, were further evaluated. In comparison to the conventional IPC and CFB processes seeded with a low seeding density from a 3-day batch expansion.

[0091] Cell culture process in production stage

[0092] The N-1 perfusion and concentration culture process used in this study followed the same procedure as described in Example 4. For all conditions in this example, bench-scale production was performed in 3 L glass bioreactors connected with an ATF2 hollow fiber. The pore size of the ATF hollow fiber filters used in production were 50 kDa and 0.20 um for CFB and IPC, respectively. The pH was controlled within the range of 6.7-7.2, and DO was controlled at 40%. Constant agitation was set at 285 rpm and shifted to 320 rpm when oxygen requirements reached the preset criteria of 0.2 VVM. During production, the initial temperature was set at 36.5 ℃ and then shifted to 33℃ when VCD reach 40～45×106 cell / mL. The perfusion rate for CFB and IPC was 1.0 VVD when VCD exceeded 20×106 cell / mL, and 0.3～0.5 VVD when VCD was below 20×106 cell / mL. A certain ratio of feed media was mixed in the perfusion media to support high density cell culture and production.

[0093] Results

[0094] The study result of high seeding density continuous processes was shown in Figure 10. The N-1 peak VCD of Clone A reached ～60 × 106 cell / mL after 3-day perfusion and then concentrated to ～120 × 106 cell / mL (Figure 10a) . With the concentrated culture, the production seeding density reached ～30×106 cell / mL with a split ratio of 4: 1.

[0095] As shown in Figure 10, UI-CFB and UIPC cultures showed a reduction in the cell exponential growth phase and reached the peak VCD of ～60×106 cell / mL on Day 3, while the low seeding density of 0.5×106 cell / mL ended up with extended culture duration due to a longer cell proliferation stage, although a similar peak VCD was obtained on Day 9, 6 days later the UI-CFB and UIPC conditions. As a result, the cumulative IVCD of the UI-CFB and UIPC conditions rose by 15～20%compared to their corresponding CFB and IPC controls. Moreover, the high seeding density obtained from N-1 perfusion and concentration also contributed to higher Qp and final productivity. The Qp of UI-CFB and UIPC was increased  by ～100%and ～25%, respectively, compared to the low-seeding CFB and IPC (Figure 10f) . The accumulative volumetric productivity reached 2 folds of low-seeding CFB in the UI-CFB condition, and 1.5 folds of low-seeding IPC in the UIPC production (Figure 10e) . Overall, comparable product-related purities from SEC and SE-SDS were observed in the different conditions studied, except that a slightly higher level of aggregation as seen from HMW species was detected in the UIPC, CFB and UI-CFB (Figure 10g) . For charge variants, lower acidic species was found in the UI-CFB products, and higher basic modifications were identified in both CFB and UI-CFB conditions. In terms of N-glycan modifications, lower galactosylation as shown in %G1F and %G2F and higher Man5 were found in the UIPC condition compared to the IPC control, while no significant difference was found between the CFB and the UI-CFB products.

[0096] Example 6: High Flux Study for N-1 Concentration with Clone A &C

[0097] In this study, both Clone A and Clone C were used to perform the N-1 concentration robustness study. For the culture media, both commercial and in-house proprietary basal and feed media for the cell line were used for the comparison of different cell culture processes in this study. The high flux range with both microfiltration (MF) and ultrafiltration (UF) were evaluated to demonstrate the robustness of N-1 perfusion and concentration for UI-IPFB in this study.

[0098] Process parameters for N-1 and production stage

[0099] ATF hollow fiber filters with different pore sizes, including 0.20 um microfiltration filter (MF) , and 50 KDa ultrafiltration filter (UF) , were used in the study. The normal recommended flux rate for ATF perfusion was defined to be less than 5 liters per square meter hour (LMH) , and the optimal range was 1～3 LMH. In this study, the high flux rates of 5, 10, 12.5, 16 and 20 LMH was evaluated. Other than this, the N-1 perfusion culture and the following UI-IPFB production used in this study followed the same parameters as shown in Table 9 and Table 10.

[0100] Results

[0101] As shown in Figure 11, no obvious difference was observed when both MF and UF were used with a high flux using Clone A (Figure 11a) and C (Figure 11d) .

[0102] For clone A, the N-1 perfusion culture reached 40～45×106 cell / mL on Day 5, and then the culture was concentrated to 90-100×106 cell / mL by both MF and UF with an ATF flux range of 5～16 LMH. During the cell culture concentration, there was no evidence of ATF hollow fiber membrane blockage and leakage. The cultures with the highest flux of 16 LMH and the one of 5 LMH were then inoculated into the UI-IPFB production bioreactors to  demonstrate their performance. Comparable cell culture performance and productivity results were achieved. The final productivity reached 11～13 g / L on Day 14.

[0103] For Clone C, the N-1 culture VCD was 60-70×106 cell / mL on Day 6, and then the culture was concentrated to 120～140×106 cell / mL by MF with both low and high fluxes of 5 and 20 LMH, respectively. After that, the concentrated seeds were inoculated into the UI-IPFB production with an initial VCD of 30～35×106 cell / mL. The peak VCD reached ～50×106 cell / mL in high flux linkage condition, similar to the control seeded from the normal flux concentration condition. Ultimately, a similar titer was obtained from both conditions.

[0104] Example 7: N-1 Perfusion and Concentration with Clone A and B

[0105] In this study, the N-1 culture with a highly concentrated ratio was evaluated with Clone A and Clone B. For culture media, both commercial and in-house proprietary basal and feed media were used for N-1 perfusion in this study.

[0106] Result

[0107] As shown in Figure 12, as high as 6.8 times of concentration following N-1 perfusion was achieved, and a final cell density of ≥400×106 cell / mL was obtained with no sign of ATF membrane fouling. The result showed that the concentrated cell density in N-1 perfusion and concentration may increase to 400×106 cell / mL or more, and the concentration multiples could be 2, 3, 4, 5, 6, 7 or more.

[0108] In summary, the present invention has the following advantages compared to the prior art:

[0109] 1. The present invention significantly increases transfer cell densities in N-1 seed cultures, or significantly reduces the time needed to reach the same cell density in cell expansion;

[0110] 2. UIFB with a much higher seeding density than IFB is demonstrated by using seeds from cell culture concentration during or after N-1 perfusion expansion. The present invention increases initial seeding VCD, total cell biomass, and improves protein production in a fed-batch production culture;

[0111] 3. UI-IPFB with a much higher seeding density in comparison to an IFB or IPFB production process is realized by cell culture concentration during or after N-1 perfusion expansion. The UI-IPFB culture mode resolves the likely cell viability decline and poor productivity which often occur in an IFB or UIFB process by using  limited cycles of intermittent perfusion in production to remove toxic by-product accumulation, replenish cell culture with fresh media, and thus improve cell culture performance. The UI-IPFB is demonstrated to significantly improve protein production with similar or better product quality;

[0112] 4. For multiple cell lines studied, it is shown that UI-IPFB could achieve remarkable productivity improvement compared to TFB, IFB or UIFB. In terms of scalability, UI-IPFB is proven to be scalable and bears the features of both operational simplicity of a fed-batch culture and superior cell status in a perfusion process.

[0113] 5. UI-IPFB offered more competitive manufacturing COG due to greatly enhanced titer with no need for facility and equipment modifications.

[0114] 6. The high seeding density achieved by N-1 perfusion and concentration in continuous UIPC and UI-CFB processes also provides greatly improved volumetric and cell-specific productivity with a shortened production phase, compared to the conventional low-seeding IPC and CFB processes.

[0115] The above are only specific embodiment examples of the present application and do not constitute any restrictions on the protection scope of the present application. For those skilled in the art, different forms of changes or modifications can also be made based on the above explanation. It is not necessary or possible to provide a list and explanation of all implementation methods here. Any similar technical solutions formed by equivalent transformation or equivalent replacement fall within the protection scope of claims in the present application.

Claims

1.A method for increasing transfer cell density of a culture, comprising:Cultivating cells by perfusion in a seed culture; andSubjecting the seed culture to concentration by perfusion.2.The method according to claim 1, wherein the cells express a target product, preferably a recombinant protein or polypeptide; and / or optionally, the cells include mammalian cells.3.The method according to claim 1, wherein the step of cultivation comprises perfusion culture; optionally, the duration of the step of cultivation is 1-10 days, preferably 2-5 days; and / or optionally, the inoculation density of the perfusion culture is 0.3-10 × 106 cells / mL or higher.4.The method according to claim 1, wherein the step of concentration by perfusion starts on the last day of the step of cultivation or after the end of the step of cultivation, or starts 1-3 days before the end of the step of cultivation; optionally, the step of concentration by perfusion lasts for 1-24 hours, preferably 2-5 hours; and / or optionally, the cell density of the step of concentration by perfusion is at least 1.5 times, preferably at least 2 times that of the step of cultivation before concentration.5.The method according to claim 1, wherein the step of concentration by perfusion comprises use of a tangential flow filtration device; optionally, the tangential flow filtration device includes an ATF device and a TFF device; optionally, the tangential flow filtration device includes a hollow fiber membrane; optionally, the hollow fiber membrane includes an ultrafiltration membrane or a microfiltration membrane; and / or optionally, the cell density of the step of concentration by perfusion is 40-400 × 106 cells / mL or higher.6.A method of high cell density inoculation in production, comprising:a. Obtaining a concentrated seed culture, wherein the seed culture is obtained by the method according to any one of claims 1-5;b. Inoculating the concentrated seed culture into a production culture medium; andc. Cultivating cells in the production culture medium to produce a target product.7.The method according to claim 6, wherein the inoculation dilution ratio of step b is at least 3, preferably 4-6.8.The method according to claim 6, wherein step c comprises shifting the temperature of cell culture or maintaining a constant temperature of cell culture.9.The method according to claim 6, wherein step c comprises fed-batch culture with feed medium and / or medium exchange and / or perfusion, and / or comprises continuous perfusion culture with a constant exchange of medium by perfusion.

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