Bi-specific molecules targeting sirpa and claudin 18.2

Abstract

Provided are anti-SIRPα antibodies or antigen-binding fragments thereof, bi-specific molecules targeting SIRPα and Claudin 18.2, pharmaceutical compositions, and the uses of such molecules in preventing, diagnosing, or treating cancer diseases.

Description

BI-SPECIFIC MOLECULES TARGETING SIRPA AND CLAUDIN 18.2TECHNICAL FIELD

[0001] The present disclosure relates to an anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof and the bi-specific molecules targeting SIRPα (signal regulatory protein alpha) and Claudin 18.2 (claudin 18 isotype 2) and uses thereof.BACKGROUND

[0002] The statements in this section merely provide background information related to the present disclosure and do not necessarily constitute prior art.

[0003] With the deepening research in the field of cancer therapy, the research, development and application of molecular targeted therapeutic drugs for cancer have received more and more attention. Owing to the advantages of strong targetability, minimal side effects and remarkable therapeutic effects, antibody drugs have rapidly become hot spot of targeted cancer therapy.

[0004] However, tumor cells can continually divide and grow by modifying their own surface antigens and changing the microenvironment around the tumor tissue to escape the surveillance, recognition and attack of the innate immune system, i.e., the so-called tumor immune escape. For example, tumor cells inhibit the immune function of macrophages and significantly inhibit the activity of immune cells by highly expressing CD47 which binds to the inhibitory receptor signal-regulatory protein α (SIRPα, or SIRPA) on the surface of macrophages. (Willingham S B, et al. The CD47-signal regulatory protein Alpha (SIRPα) interaction is a therapeutic target for human solid tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2012, 109 (17) : 6662-6667) .

[0005] SIRPα (Signal regulatory protein α, SIRPA) is a regulatory membrane glycoprotein from SIRP family. It is mainly expressed by myeloid cells and also by stem cells or neurons. SIRPα acts as inhibitory receptor and interacts with a broadly expressed transmembrane protein CD47. This interaction negatively controls effector function of innate immune cells such as host cell phagocytosis.

[0006] Therefore, the inhibitory effect of CD47 on immune cells can be relieved by blocking the CD47-SIRPα signaling pathway, such as, SIRPα-Fc fusion protein, and exhibit certain anti-tumor activity. The wild-type SIRPα-Fc fusion protein does not have potent efficacy due to its low affinity to CD47.

[0007] Claudin 18 (CLDN 18.2) belongs to the claudin family, which has at least 27 members in mammals (Furuse M. et al., J Cell Biol., 1998, 141, 1539) . Claudin 18 has two different splice variants, Claudin 18.1 or CLDN 18.1 and Claudin 18.2 or CLDN 18.2. (Sanada Y. et al., J Pathol., 2006, 208, 633) . CLDN 18.2 is a CD20-like differentiation protein overly expressed in various types of cancers,  for example, gastric, esophageal, pancreatic, and non-small cell lung cancers. This molecule therefore is a valuable target for treatment of such cancers.

[0008] Generally, there is a need to develop a novel tumor-targeting molecules.SUMMARY

[0009] For the above-mentioned purpose, the present disclosure relates to anti-SIRPα antibodies as describes herein. In particular, the present disclosure relates to anti-SIRPα single-chain fragment variable, bi-specific molecules and pharmaceutical compositions based on the anti-SIRPα single-chain fragment variable and uses thereof.

[0010] Provided herein is novel anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof, which includes a heavy chain variable domain (VH) and a heavy chain variable domain (VL) . The VH of anti-SIRPαantibody or antigen binding fragment thereof includes HCDR1, HCDR2, and HCDR3 having amino acid sequences at least 80%, such as about 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 20, 21, and 23, respectively; (2) SEQ ID NOs: 20, 22, and 23, respectively; (3) SEQ ID NOs: 20, 47, and 48, respectively. The VL of anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof includes LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having amino acid sequences at least 80%, such as about 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 24, 26, and 28, respectively; (2) SEQ ID NOs: 25, 27, and 28, respectively.

[0011] In some embodiments, the HCDR1 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, the HCDR2 has the amino acid sequence shown as X1DPEDX2ETK (SEQ ID NO: 60) , the HCDR3 has the amino acid sequence shown as DRGLX3Y (SEQ ID NO: 61) , the LCDR1 has the amino acid sequence shown as X4ASX5SVSSSYLY (SEQ ID NO: 45) , the LCDR2 has the amino acid sequence shown as YSX6SNX7AS (SEQ ID NO: 46) , and the LCDR3 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28, X1 is V or I, X2 is A or G, X3 is V or A, X4 is R or S, X5 is Q or S, X6 is A or T, X7 is R or L.

[0012] In some embodiments, the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 21 and 23, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 24, 26 and 28, respectively.

[0013] In some embodiments, the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 22 and 23, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 25, 27 and 28, respectively.

[0014] In some embodiments, the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 47 and 48, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 25, 27 and 28, respectively.

[0015] In some embodiments, the VH of the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof includes FR1, FR2, FR3, and FR4 having amino acid sequences at least 80%, such as about 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 29, 30, 32, and 33, respectively; (2) SEQ ID NOs: 29, 31, 32, and 33, respectively; (3) SEQ ID NOs: 49, 50, 51, and 33, respectively.

[0016] In some embodiments, the VL of the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof includes FR1, FR2, FR3, and FR4 having amino acid sequences at least 80%, such as about 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 37, respectively; (2) SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 38, respectively; (3) SEQ ID NOs: 34, 52, 53, and 37, respectively.

[0017] In some embodiments, the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof includes the VH having an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to one of amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 14, 16, 18, and 54; and / or the VL having an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to one of amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 15, 17, 19, and 55.

[0018] In some embodiments, the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15.

[0019] In some embodiments, the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17

[0020] In some embodiments, the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19.

[0021] In some embodiments, the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55.

[0022] In some embodiments, the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof binds to human and / or mouse SIRPα.

[0023] In some embodiments, the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof is a Fab, a Fab', a F (ab') 2, an Fv fragment, or a single-chain fragment variable (scFv) . In some embodiments, the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof is scFv, of which the VH and VL are linked via a first peptide linker, optionally the first peptide linker includes (Gly4Ser) 4. In some embodiments, in the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof, N-terminus of the VH is linked to C-terminus of the VL.

[0024] In some embodiments, the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof is a chimeric antibody or a humanized antibody.

[0025] In another aspect, provided herein is a bi-specific molecule, which includes

[0026] (1) a SIRPα binding domain, which contains a heavy chain variable domain (VH) and a heavy chain variable domain (VL) , wherein VH includes HCDR1, HCDR2, and HCDR3 having amino acid sequences about 80%to about 100%, e.g., about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more to about 100%, identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 20, 21, and 23, respectively; (2) SEQ ID NOs: 20, 22, and 23, respectively; (3) SEQ ID NOs: 20, 47, and 48, respectively. VL includes LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having amino acid sequences about 80%to about 100%, e.g., about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 24, 26, and 28, respectively; (2) SEQ ID NOs: 25, 27, and 28, respectively; and

[0027] (2) a second domain binding to a target antigen, the second domain is fused to the SIRPα binding domain.

[0028] In some embodiments, in the SIRPα binding domain, the HCDR1 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, the HCDR2 has the amino acid sequence shown as X1DPEDX2ETK (SEQ ID NO: 60) , the HCDR3 has the amino acid sequence shown as DRGLX3Y (SEQ ID NO: 61) , the LCDR1 has the amino acid sequence shown as X4ASX5SVSSSYLY (SEQ ID NO: 45) , the LCDR2 has the amino acid sequence shown as YSX6SNX7AS (SEQ ID NO: 46) , and the LCDR3 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28, X1 is V or I, X2 is A or G, X3 is V or A, X4 is R or S, X5 is Q or S, X6 is A or T, X7 is R or L.

[0029] In some embodiments, in the SIRPα binding domain, (1) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 21 and 23, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 24, 26 and 28, respectively; (2) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 22 and 23, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID  NOs: 25, 27 and 28, respectively; or (3) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 47 and 48, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 25, 27 and 28, respectively.

[0030] In some embodiments, in the bi-specific molecule, the VH of SIRPα binding domain includes FR1, FR2, FR3, and FR4 having amino acid sequences at least 80%, such as about 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 29, 30, 32, and 33, respectively; (2) SEQ ID NOs: 29, 31, 32, and 33, respectively; (3) SEQ ID NOs: 49, 50, 51, and 33, respectively; and / or the VL of SIRPα binding domain includes FR1, FR2, FR3, and FR4 having amino acid sequences at least 80%, such as about 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 37, respectively; (2) SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 38, respectively; (3) SEQ ID NOs: 34, 52, 53, and 37, respectively.

[0031] In some embodiments, in the bi-specific molecule, the VH of SIRPα binding domain includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to one of amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 14, 16, 18, and 54, respectively; and / or the VL of SIRPαbinding domain includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to one of amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 15, 17, 19, and 55, respectively.

[0032] In some embodiments, in the SIRPα binding domain, (1) the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15; (2) the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17; (3) the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19; or (4) the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55.

[0033] In some embodiments, in the bi-specific molecule, the SIRPα binding domain is scFv, of which the VH and VL are linked via a first polypeptide linker, optionally the first polypeptide linker includes (Gly4Ser) 4. In some embodiments, the N-terminus of the VH is linked to C-terminus of the VL.

[0034] In some embodiments, the second domain binds to target antigen expressing on surface of cancer cells. The target antigen may be immune checkpoint molecules, such as CD47, PD1, Claudin 18.2, or CTLA-4. In some embodiments, the second domain binds to Claudin 18.2 and / or CD47, preferably Claudin 18.2.

[0035] In some embodiments, the second domain includes: a) a heavy chain variable region (VH) including CDR1, CDR2, and CDR3, wherein the VH CDR1, CDR2, and CDR3 have amino acid sequences about 80%to about 100%identical to amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 39, 40, and 41, respectively; and b) a light chain variable region (VL) including CDR1, CDR2, and CDR3, wherein the VL CDR1, CDR2, and CDR3 have amino acid sequences about 80%to about 100%identical to amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 42, 43, and 44, respectively.

[0036] In some embodiments, the second domain includes a VH having amino acid sequence at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, and a VL having amino acid sequence at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10.

[0037] In some embodiments, the second domain includes a light chain constant region (CL) , which is a kappa (κ) or lamda (λ) light chain. In some embodiments, the CL includes an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 or 13.

[0038] In some embodiments, the second domain includes a heavy chain constant region (CH) having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11.

[0039] In some embodiments, the bi-specific molecule is a symmetric bispecific molecule, of which the SIRPα binding domains are fused to C-terminus of the heavy chain constant region of the second domains, at the N-terminus of the heavy chain variable domain of SIRPα binding domains. Preferably, the SIRPα binding domains and the second domain are covalently linked via a second peptide linker having the formula (Gly4Ser) n, where n is an integer from 1 to 5, e.g., 1, 2, 3, 4, 5. In some embodiments, the first domain and the second domain are covalently linked via (Gly4Ser) 3.

[0040] In some embodiments, the bi-specific molecule includes a heavy chain and a light chain, the heavy chain includes an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 56, 58 or 59; and the light chain includes an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 57.

[0041] In some embodiments, the heavy chain of the bi-specific molecule includes an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7; and the light chain of the bi-specific molecule includes an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.

[0042] In some embodiments, the heavy chain of the bi-specific molecule includes an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5; and the light chain of the bi-specific molecule includes an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.

[0043] In some embodiments, the bi-specific molecules block the interaction of CD47 and SIRPα, remove SHP-1 / 2 inhibition, and / or engage Fc receptors on immune effector cells (e.g., macrophages) to activate phagocytosis.

[0044] In some embodiments, the bi-specific molecule enhances immune effector cells phagocytosis of cancer cells expressing target antigen to which the second domain binds, such as human Claudin 18.2 and human SIRPα.

[0045] In another aspect, the present disclosure provides an isolated polynucleotide encoding an anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof or a bi-specific molecule described above.

[0046] In another aspect, the present disclosure provides a construct including a polynucleotide described above.

[0047] In another aspect, the present disclosure provides an antibody expressing system including the construct described above or having a genome integrated with an exogenous polynucleotide described above, preferably, the expressing system is a cell expression system.

[0048] In another aspect, the present disclosure provides a method for producing the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof or the bi-specific molecule described above, which includes: under conditions suitable for expressing the antibody, expressing the antibody or protein using the antibody expressing system described above.

[0049] In another aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition including an anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof or the bi-specific molecule described above, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0050] In another aspect, the present disclosure provides a kit including the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof or the bi-specific molecule, the isolated polynucleotide, or a construct provided herein.

[0051] In another aspect, the present disclosure provides the use of an anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof, the bi-specific molecule or a pharmaceutical composition provided herein in the manufacture of a therapeutic agent for preventing, diagnosing, or treating a disease, disorder, or condition. In some embodiments, the disease, disorder, or condition is cancer. In some embodiments, at least a cancer cell expresses Claudin 18.2, preferably human Claudin 18.2.

[0052] In some embodiments, the cancer is a solid tumor. In some embodiments, the cancer includes esophageal cancer, hepatic cancer, lung cancer, melanoma, gastric cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, colon cancer, kidney cancer, bladder cancer, breast cancer, classic Hodgkin lymphoma, hematological malignancies, head and neck cancer and nasopharyngeal cancer, cancer of the gallbladder and the metastasis thereof, a Krukenberg tumor, peritoneal metastasis, and / or lymph node metastasis.

[0053] In another aspect, the present disclosure provides a method of treating a subject having cancer, including administrating to the subject a therapeutically effective amount of anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof, the bi-specific molecule, or a pharmaceutical composition provided herein. In some embodiments, the subject is mammal animals comprising human, mouse, and cynomolgus monkey.

[0054] In another aspect, the present disclosure provides a method of decreasing the rate of tumor growth, including contacting a tumor cell with an effective amount of anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof, the bi-specific molecule, or a pharmaceutical composition provided herein.

[0055] In another aspect, the present disclosure provides a method of killing a tumor cell, including contacting a tumor cell with an effective amount of anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof, the bi-specific molecule, or a pharmaceutical composition provided herein.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0056] The following is a brief description of the drawings, which are presented for the purposes of illustrating the exemplary embodiments disclosed herein and not for the purposes of limiting the same.

[0057] Figure 1 shows antigen binding profile of wildtype control group and library2 in the 1st round of yeast library sorting detected by FACS (Fluorescence activated Cell Sorting) .

[0058] Figure 2 shows antigen binding profile of wildtype control group and library2 in the 1st round of yeast library sorting detected by FACS (Fluorescence activated Cell Sorting) .

[0059] Figure 3 shows comparation of binding potency between the wildtype control group and clone 201 detected by FACS (Fluorescence activated Cell Sorting) .

[0060] Figure 4A is a schematic drawing of an anti-Claudin18.2 / SIRPα bispecific molecule, of which two anti-SIRPα scFv are fused to the C terminus of the anti-Claudin18.2 antibody heavy chain via a linker.

[0061] Figure 4B shows SEC (Size-Exclusion Chromatography) spectrum of AE016_201, the purity of each composition in the protein samples is listed in the table below the SEC spectrum.

[0062] Figure 5 shows binding curve of AE016_201 to SIRPα detected by the Octet.

[0063] Figure 6 shows CHO-K1 SIRPα binding curves of AE016_201 and anti-SIRPα antibody in the IgG4 isotype detected by FACS. EC50 values are listed in the table below the binding curves.

[0064] Figure 7 shows long term stability of the AE016_201 at 4℃.

[0065] Figure 8A shows the binding curves of representative bispecific antibodies to Raji / hClaudin18.2 cells by FACS detection. Anti-Claudin18.2 antibody hu26. H1L2 is used as control.

[0066] Figure 8B shows the binding curves of representative bispecific antibodies to CHOK1 / SIRPα cells by FACS detection. Anti-SIRPα antibody hu025.060 is used as control.

[0067] Figure 9 shows that the anti-Claudin18.2 / SIRPα bispecific antibodies stimulate BMDM phagocytosis against MC38 / hCD47 / hClausin18.2 cell better than single or combination treatment.

[0068] Figure 10 shows that in vivo anti-tumor efficacy of anti-Claudin18.2 / SIRPα in MC38 / hClaudin18.2 / hSIRPα syngeneic model.DETAILED DESCRIPTION

[0069] The present disclosure is explained in greater detail below. This description is not intended to be a detailed catalog of all the different ways in which the invention may be implemented, or all the features that may be added to the instant invention. For example, features illustrated with respect to one embodiment may be incorporated into other embodiments, and features illustrated with respect to a particular embodiment may be deleted from that embodiment. In addition, numerous variations and additions to the various embodiments suggested herein will be apparent to those skilled in the art in light of the instant disclosure which do not depart from the instant invention. Hence, the following description is intended to illustrate some particular embodiments of the invention, and not to exhaustively specify all permutations, combinations and variations thereof.

[0070] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the disclosure pertains. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice for testing of the present disclosure, the preferred materials and methods are described herein. In describing and claiming the present disclosure, the following terminology will be used.

[0071] Other features and advantages of the present disclosure will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.

[0072] Term

[0073] The term “antibody” (used interchangeably in the plural) is an immunoglobulin molecule capable of specifically binding to a target, such as carbohydrate, polynucleotides, lipids, polypeptides, etc., through at least one antigen recognition site located in the variable region of the immunoglobulin molecule. As used herein, the term “antibody” includes not only intact (i.e., full-length) polyclonal or monoclonal antibodies, but also antigen-binding fragments thereof (e.g., Fab, Fab', F (ab') 2, Fv) , single-chain (scFv) , mutants thereof, fusion proteins comprising antibody moieties, humanized antibodies, chimeric antibodies, diabodies, nanobodies, linear antibodies, single chain antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies) , and any other modified constructs of immunoglobulin molecules comprising antigen recognition sites with the desired specificity, including glycosylation variants of antibodies, amino acid sequence variants of antibodies, and covalently modified antibodies. Antibodies include antibodies of any class, such as IgD, IgE, IgG, IgA, or IgM (or subclasses thereof) , and the antibody need not be of any particular class. Depending on the antibody amino acid sequence of their heavy chain constant domains, immunoglobulins can be divided into different classes. There are five main classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and several of these can be further divided into subclasses (isotypes) , such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2. The heavy chain constant domains that correspond to the different classes of immunoglobulins are called α、δ、ε、γand μ, respectively. The subunit structures and three-dimensional configurations of different classes of immunoglobulins are well known.

[0074] A typical antibody molecule includes a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) . The variable region is a region with large changes in amino acid composition and arrangement at the N-terminal of the antibody molecule. The site of specific binding, that is, the antigen-binding site, is used to determine the specificity of antibody recognition. The VH and VL regions can be further subdivided into hypervariable regions, also known as “complementarity determining regions” (CDRs) , interspersed with more conserved regions known as “framework regions” (FR) . Each VH and VL is generally composed of three CDRs and four FRs arranged in the following order from amino terminus to carboxy terminus: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0075] As used herein, the term “single-chain variable fragment” or “scFv” is a fusion protein of the variable regions of the heavy (VH) and light chains (VL) of an immunoglobulin (e.g., mouse or human) covalently linked to form a VH: : VL heterodimer. The heavy (VH) and light chains (VL) are either joined directly or joined by a peptide-encoding linker or spacer, which connects the N-terminus of the VH with the C-terminus of the VL, or the C-terminus of the VH with the N-terminus of the VL. Those of skill in the art would be able to select the appropriate configuration for use in the present invention.

[0076] The term “bispecific molecule” as used herein, refers to an antibody that displays a double binding specificity and affinity for two particular epitopes or a composition of antibodies in which all antibodies display a double binding specificity and affinity for two particular epitopes.

[0077] An “Fc region” (fragment crystallizable region) or “Fc domain” or “Fc fragment” refers to the C-terminal region of the heavy chain of an antibody that mediates the binding of the immunoglobulin to host tissues or factors, including binding to Fc receptors located on various cells of the immune system (e.g., effector cells) or to the first component (Clq) of the classical complement system. Thus, an Fc region comprises the constant region of an antibody excluding the first constant region immunoglobulin domain (e.g., CH1 or CL) . Fc may also refer to this region in isolation or in the context of an Fc-comprising protein polypeptide.

[0078] The term “fusion” or “fused” when used with respect to amino acid sequences (e.g., peptide, polypeptide or protein) refers to combination of two or more amino acid sequences, for example by chemical bonding or recombinant means, into a single amino acid sequence. A fusion amino acid sequence may be produced by genetic recombination of two encoding polynucleotide sequences, and can be expressed by a method of introducing a construct containing the recombinant polynucleotides into a host cell.

[0079] The term “percent (%) sequence identity” is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to the amino acid residues in a reference polypeptide sequence, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved in various ways using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. For example, the identity can be determined using the BLAST program of the NCBI database.

[0080] The term “humanized antibody” refers to a molecule having an antigen-binding site substantially derived from an immunoglobulin from a non-human species, where the rest of the immunoglobulin structure of the molecule is based on the structure and / or sequence of a human immunoglobulin. The antigen binding site may include a complete variable domain fused to a constant domain, or only include a complementarity determining region (CDR) grafted into an appropriate framework region in the variable domain. The antigen binding site can be wild-type, or modified by one or more amino acid substitutions. For example, modifications are made to allow the antibody to be more similar to human immunoglobulins. Some forms of humanized antibodies retain all CDR sequences (e.g., a humanized single-domain antibody including all three CDRs from alpaca) . Other forms have one or more CDRs that have been altered relative to the original antibody.

[0081] A “chimeric antibody” refers to an antibody in which the variable regions are derived from one species and the constant regions are derived from another species, such as an antibody in which the variable regions are derived from a mouse or alpaca antibody and the constant regions are derived from a human antibody.

[0082] A “therapeutically effective amount” of an agent, such as a pharmaceutical composition, refers to an amount effective for achieving the desired therapeutic or prophylactic result at a dosage level and for a period of time. A therapeutically effective amount of an agent can, for example, eliminate, reduce, delay, minimize or prevent the adverse effects of a disease.

[0083] The term “pharmaceutically acceptable carrier” refers to an ingredient other than the active ingredient in a pharmaceutical composition that is not toxic to the subject. The pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, buffers, excipients, stabilizers or preservatives.

[0084] The term “treating / preventing” (and its grammatical variants) refers to an attempt to alter the natural progress of a disease in a treated individual and can be prevention or clinical intervention implemented during the course of clinical pathology. The desired effect of treatment includes, but is not limited to, preventing the occurrence or recurrence of diseases, alleviating the symptoms, relieving any direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing the metastasis, slowing the rate of disease progression, improving or lessening the disease states, and relieving or improving the prognosis. In some embodiments, the antibody of the present disclosure is useful for delaying the development of a disease or delaying the progression of a disorder.

[0085] As used herein, the term “about” or “approximately” refers to a quantity, level, value, number, frequency, percentage, identity, dimension, size, amount, weight or length that varies by as much as 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1%to a reference quantity, level, value, number, frequency, percentage, identity, dimension, size, amount, weight or length. In particular embodiments, the terms “about” or “approximately” when preceding a numerical value indicates the value plus or minus a range of 20%, 15%, 10%, or 5%.

[0086] In the present disclosure, “amino acid” refers to an organic compound containing amine (-NH2) and carboxyl (-COOH) functional groups, along with a side chain specific to each amino acid. the names of amino acids are represented as standard single-letter or three-letter codes, which are shown as below:

[0087] Generally, nomenclatures used in connection with, and techniques of, cell and tissue culture, pathology, oncology, molecular biology, immunology, microbiology, genetics and protein and nucleic acid chemistry and hybridization described herein are those well-known and commonly used in the art. The methods and techniques of the present disclosure are generally performed according to conventional methods well-known in the art and as described in various general and more specific references that are cited and discussed throughout the present specification unless otherwise indicated. See, e.g., Green and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012) ; Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, Zhiqiang An (Editor) , Wiley, (2009) ; and Antibody Engineering, 2nd Ed., Vols 1 and 2, Ontermann and Dubel, eds., Springer-Verlag, Heidelberg (2010) .

[0088] Anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof

[0089] The present disclosure provides examples of novel anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof, which includes a heavy chain variable domain (VH) and a heavy chain variable domain (VL) . The VH includes complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3, and the VL includes CDR1, CDR2, and CDR3.

[0090] In some embodiments, the CDR1 of VH (i.e., HCDR1) is different from an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 by no more than 5, 4, 3, 2, 1, 0 amino acids. The CDR2 of VH (i.e., HCDR2) is different from an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, 22 or 47 by no more than 5, 4, 3, 2, 1, 0 amino acids. The CDR3 of VH (i.e., HCDR3) is different from an amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 or 48 by no more than 3, 2, 1, 0 amino acids.

[0091] In some embodiments, the CDR1 of VL (i.e., LCDR1) is different from an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 or 25 by no more than 5, 4, 3, 2, 1, 0 amino acids. The CDR2 of VL (i.e., LCDR2)  is different from an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 or 27 by no more than 5, 4, 3, 2, 1, 0 amino acids. The CDR3 of VL (i.e., LCDR3) is different from an amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 by no more than 5, 4, 3, 2, 1, 0 amino acids.

[0092] In some embodiments, the VH of anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof includes CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences at least 80%, such as about 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 20, 21, and 23, respectively; (2) SEQ ID NOs: 20, 22, and 23, respectively; (3) SEQ ID NOs: 20, 47, and 48, respectively.

[0093] In some embodiments, CDR1, CDR2, and CDR3 of VH of anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 20, 21, and 23, respectively; SEQ ID NOs: 20, 22, and 23, respectively; or SEQ ID NOs: 20, 47, and 48, respectively.

[0094] In some embodiments, the VL of anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof includes CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences at least 80%, such as about 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 24, 26, and 28, respectively; (2) SEQ ID NOs: 25, 27, and 28, respectively.

[0095] In some embodiments, CDR1, CDR2, and CDR3 of VL of anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 24, 26, and 28, respectively; or SEQ ID NOs: 25, 27, and 28, respectively.

[0096] In some embodiments, the HCDR1 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, the HCDR2 has the amino acid sequence shown as X1DPEDX2ETK (SEQ ID NO: 60) , the HCDR3 has the amino acid sequence shown as DRGLX3Y (SEQ ID NO: 61) , the LCDR1 has the amino acid sequence shown as X4ASX5SVSSSYLY (SEQ ID NO: 45) , the LCDR2 has the amino acid sequence shown as YSX6SNX7AS (SEQ ID NO: 46) , and the LCDR3 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28, X1 is V or I, X2 is A or G, X3 is V or A, X4 is R or S, X5 is Q or S, X6 is A or T, X7 is R or L.

[0097] In some embodiments, the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 21 and 23, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 24, 26 and 28, respectively.

[0098] In some embodiments, the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 22 and 23, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 25, 27 and 28, respectively.

[0099] In some embodiments, the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 47 and 48, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 25, 27 and 28, respectively.

[0100] In some embodiments, the VH of the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof includes FR1, FR2, FR3, and FR4. The FR1 of VH is different from an amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 or 49 by no more than 3, 2, 1, 0 amino acids. The FR2 of VH is different from an amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, 31 or 50 by no more than 5, 4, 3, 2, 1, 0 amino acids. The FR3 of VH is different from an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32 or 51 by no more than 3, 2, 1, 0 amino acids. The FR4 of VH is different from an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 by no more than 3, 2, 1, 0 amino acids.

[0101] In some embodiments, FR1, FR2, FR3, and FR4 of the VH of the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof have amino acid sequences about 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 29, 30, 32, and 33, respectively; SEQ ID NOs: 29, 31, 32, and 33, respectively; or SEQ ID NOs: 49, 50, 51, and 33, respectively.

[0102] In some embodiments, FR1, FR2, FR3, and FR4 of the VH of the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 29, 30, 32, and 33, respectively; SEQ ID NOs: 29, 31, 32, and 33, respectively; or SEQ ID NOs: 49, 50, 51, and 33, respectively.

[0103] In some embodiments, the VL of the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof includes FR1, FR2, FR3, and FR4. The FR1 of VL is different from an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 by no more than 3, 2, 1, 0 amino acids. The FR2 of VL is different from an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or 52 by no more than 3, 2, 1, 0 amino acids. The FR3 of VL is different from an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 36 or 53 by no more than 3, 2, 1, 0 amino acids. The FR4 of VL is different from an amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 or 38 by no more than 5, 4, 3, 2, 1, 0 amino acids.

[0104] In some embodiments, FR1, FR2, FR3, and FR4 of the VL of the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof have an amino acid sequence about 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 37, respectively; SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 38, respectively; or SEQ ID NOs: 34, 52, 53, and 37, respectively.

[0105] In some embodiments, FR1, FR2, FR3, and FR4 of the VL of the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 37, respectively; SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 38, respectively; or SEQ ID NOs: 34, 52, 53, and 37, respectively.

[0106] In some embodiments, the VH comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 29, 30, 32,  and 33, respectively; and the VL comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 37, respectively.

[0107] In some embodiments, the VH comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 29, 31, 32, and 33, respectively; and the VL comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34, 35, 36 and 38, respectively.

[0108] In some embodiments, the VH comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 49, 50, 51 and 33, respectively; and the VL comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34, 52, 53, and 37, respectively.

[0109] In some embodiments, the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof includes the VH, which has an amino acid sequence 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more identical to one of amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 14, 16, 18, and 54.

[0110] In some embodiments, the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof includes the VL, which has an amino acid sequence 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more identical to one of amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 15, 17, 19, and 55.

[0111] In some embodiments, the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15.

[0112] In some embodiments, In some embodiments, the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17.

[0113] In some embodiments, In some embodiments, the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19.

[0114] In some embodiments, In some embodiments, the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ  ID NO: 54; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55.

[0115] In some embodiments, the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof includes a VH having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14, and a VL having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15; or VH having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, and a VL having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17; or a VH having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and a VL having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19; or a VH having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54, and a VL having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55.

[0116] In some embodiments, the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof binds to human and / or mouse SIRPα, preferably binds to human SIRPα.

[0117] In some embodiments, the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof is a Fab, a Fab', a F (ab') 2, an Fv fragment, or a single-chain fragment variable (scFv) , preferably, scFv, and the VH and VL are linked via a first peptide linker. In certain embodiments, N-terminus of the VH is fused to C-terminus of the VL.

[0118] In some embodiments, the first peptide linker includes (Gly4Ser) 4. In some embodiments, the first peptide linker is (Gly4Ser) 4.

[0119] In some embodiments, the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof is a chimeric antibody or a humanized antibody.

[0120] The anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof provided herein specifically binds to human SIRPα, and thus blocks the interaction between CD47 and SIRPα, upregulating the immune response and enhancing the unwanted host cell (such as tumor cells) phagocytosis.

[0121] On the basis of use of the specific complementarity determining regions in the present disclosure, humanized antibodies designed according to techniques in the art are all embraced in the present disclosure. The humanized antibody further improves the drug safety, and effectively reduces the immunogenicity of the antibody. The humanized antibody with modified framework region obtained in the present disclosure still maintains a high affinity, making it feasible for use in practical clinical application.

[0122] Bi-specific molecule

[0123] The present disclosure relates to a bi-specific molecule based on the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof described above. The bi-specific molecule includes a SIRPα binding domain and a second domain binding to a target antigen, wherein the second domain is fused to the SIRPα binding domain.

[0124] The SIRPα binding domain contains a heavy chain variable domain (VH) and a heavy chain variable domain (VL) . The VH of SIRPα binding domain includes HCDR1, HCDR2, and HCDR3 having amino acid sequences at least 80%, e.g., 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 21, and 23, respectively; or SEQ ID NOs: 20, 22, and 23, respectively; or SEQ ID NOs: 20, 47, and 48, respectively. In some embodiments, the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 of SIRPα binding domain have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 21, and 23, respectively; or SEQ ID NOs: 20, 22, and 23, respectively; or SEQ ID NOs: 20, 47, and 48, respectively.

[0125] The VL of SIRPα binding domain includes LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having amino acid sequences at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 24, 26, and 28, respectively; or SEQ ID NOs: 25, 27, and 28, respectively. In some embodiments, the LCDR1, LCDR2, and LCDR3 of SIRPα binding domain have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 24, 26, and 28, respectively; or SEQ ID NOs: 25, 27, and 28, respectively.

[0126] In some embodiments, in the SIRPα binding domain, the HCDR1 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, the HCDR2 has the amino acid sequence shown as X1DPEDX2ETK (SEQ ID NO: 60) , the HCDR3 has the amino acid sequence shown as DRGLX3Y (SEQ ID NO: 61) , the LCDR1 has the amino acid sequence shown as X4ASX5SVSSSYLY (SEQ ID NO: 45) , the LCDR2 has the amino acid sequence shown as YSX6SNX7AS (SEQ ID NO: 46) , and the LCDR3 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28, X1 is V or I, X2 is A or G, X3 is V or A, X4 is R or S, X5 is Q or S, X6 is A or T, X7 is R or L.

[0127] In some embodiments, in the SIRPα binding domain, (1) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 21 and 23, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 24, 26 and 28, respectively; (2) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 22 and 23, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 25, 27 and 28, respectively; or (3) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 47 and 48, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 25, 27 and 28, respectively.

[0128] In some embodiments, the VH of SIRPα binding domain includes FR1, FR2, FR3, and FR4 having amino acid sequences at least 80%, such as about 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%identical to the amino acid sequences set forth in: SEQ ID NOs: 29, 30, 32, and 33, respectively; or SEQ ID NOs: 29, 31, 32, and 33, respectively; or SEQ ID NOs: 49, 50, 51, and 33, respectively. In some embodiments, the VH FR1, FR2, FR3, and FR4 of SIRPα binding domain have  amino acid sequences set forth in: SEQ ID NOs: 29, 30, 32, and 33, respectively; or SEQ ID NOs: 29, 31, 32, and 33, respectively; or SEQ ID NOs: 49, 50, 51, and 33, respectively.

[0129] In some embodiments, the VL of SIRPα binding domain includes FR1, FR2, FR3, and FR4 having amino acid sequences at least 80%, such as about 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%identical to the amino acid sequences set forth in: SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 37, respectively; or SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 38, respectively; or SEQ ID NOs: 34, 52, 53, and 37, respectively. In some embodiments, the VL FR1, FR2, FR3, and FR4 of SIRPα binding domain have amino acid sequences set forth in: SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 37, respectively; or SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 38, respectively; or SEQ ID NOs: 34, 52, 53, and 37, respectively.

[0130] In some embodiments, in the SIRPα binding domain, the VH includes FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 29, 30, 32, and 33, respectively; and the VL includes FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 37, respectively.

[0131] In some embodiments, in the SIRPα binding domain, the VH includes FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 29, 31, 32, and 33, respectively; and the VL includes FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34, 35, 36 and 38, respectively.

[0132] In some embodiments, in the SIRPα binding domain, the VH includes FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 49, 50, 51 and 33, respectively; and the VL includes FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34, 52, 53, and 37, respectively.

[0133] In some embodiments, the VH of SIRPα binding domain includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identical to one of amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 14, 16, 18, and 54, respectively. In some embodiments, the VH of SIRPα binding domain have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 14, 16, 18, and 54, respectively.

[0134] In some embodiments, the VL of SIRPα binding domain includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to one of amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 15, 17, 19, and 55, respectively. In some embodiments, the VL of SIRPα binding domain have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 15, 17, and 19, respectively.

[0135] In some embodiments, in the SIRPα binding domain, the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set  forth in SEQ ID NO: 14; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15.

[0136] In some embodiments, in the SIRPα binding domain, the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17.

[0137] In some embodiments, in the SIRPα binding domain, the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19.

[0138] In some embodiments, in the SIRPα binding domain, the VH includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54; and the VL includes an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55.

[0139] In some embodiments, the VH of SIRPα binding domain includes or has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14, and the VL of SIRPα binding domain includes or has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15; or the VH of SIRPα binding domain includes or has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, and the VL of SIRPα binding domain includes or has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17; or the VH of SIRPα binding domain includes or has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and the VL of SIRPα binding domain includes or has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19; or the VH of SIRPα binding domain includes or has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54, and the VL of SIRPα binding domain includes or has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55.

[0140] In some embodiments, the SIRPα binding domain is a Fab, a Fab', a F (ab') 2, an Fv fragment, or a single-chain fragment variable (scFv) , preferably, the SIRPα binding domain is scFv, of which the VH and VL are linked via a first polypeptide linker.

[0141] In some embodiments, the first polypeptide linker includes or is (Gly4Ser) 4.

[0142] In some embodiments, the N-terminus of the VH is linked to C-terminus of the VL.

[0143] The second domain binds to target antigen expressing on surface of cancer cells. The target antigen may be immune checkpoint molecules, such as CD47, PD1, Claudin 18.2, or CTLA-4. In some embodiments, the second domain binds to Claudin 18.2 and / or CD47, preferably Claudin 18.2.

[0144] In some embodiments, the second domain includes:

[0145] a) a heavy chain variable region (VH) including CDR1, CDR2, and CDR3, wherein the VH CDR1 have amino acid sequences at least 80%, such as 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more  identical to amino acid sequence of SEQ ID NO: 39; VH CDR2 have amino acid sequences at least 80%, such as 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identical to amino acid sequence of SEQ ID NO: 40; VH CDR3 have amino acid sequences at least 80%, such as 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identical to amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; and

[0146] b) a light chain variable region (VL) including CDR1, CDR2, and CDR3, wherein the VL CDR1 have amino acid sequences at least 80%, such as 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identical to amino acid sequence of SEQ ID NO: 42; the VL CDR2 have amino acid sequences at least 80%, such as 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identical to amino acid sequence of SEQ ID NO: 43; the VL CDR3 have amino acid sequences at least 80%, such as 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identical to amino acid sequence of SEQ ID NO: 44.

[0147] In some embodiments, the second domain includes VH CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 39, 40, and 41, respectively; and VL CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 42, 43, and 44, respectively.

[0148] In some embodiments, the second domain includes a VH having amino acid sequence at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, and a VL having amino acid sequence at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the second domain includes a VH having amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, and a VL having amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10.

[0149] In some embodiments, the second domain includes a light chain constant region (CL) , which is a kappa (κ) or lamda (λ) light chain. The light chain constant region (kappa) has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and the light chain constant region (Lamda) has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13:

[0150] In some embodiments, the second domain includes a heavy chain constant region (CH) , preferably a human IgG1 CH. In some embodiments, the human IgG1 CH has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.

[0151] In some embodiments, the bi-specific molecule is a symmetric bispecific molecule, of which the N-terminus of the heavy chain variable domain of the SIRPα binding domain is fused to C-terminus of the heavy chain constant region of the second domains. Preferably, the SIRPα binding domains and the second domain are covalently linked via a second peptide linker having the formula (Gly4Ser) n, where n is an integer from 1 to 5, e.g., 1, 2, 3, 4, 5. In some embodiments, the SIRPα binding domain and the second domain are covalently linked via (Gly4Ser) 3.

[0152] The bi-specific molecule includes a heavy chain and a light chain. In some embodiments, the heavy chain includes an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical  to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 56, 58 or 59; and the light chain includes an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 57.

[0153] In some embodiments, the heavy chain includes an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7; and the light chain includes an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.

[0154] In some embodiments, the heavy chain includes an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5; and the light chain includes an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.

[0155] In some embodiments, the heavy chain has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 56, 58 or 59; and the light chain has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 57.

[0156] In some embodiments, the heavy chain has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7; and the light chain has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.

[0157] In some embodiments, the heavy chain has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5; and the light chain has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.

[0158] In some embodiments, the bi-specific molecules block the interaction of CD47 and SIRPα, remove SHP-1 / 2 inhibition, and / or engage Fc receptors on immune effector cells (e.g., macrophages) to activate phagocytosis. “SHP” refers to tyrosine phosphatase inhibitor. The “effector cells” are immune cells that can perform immune effector functions, such as macrophages, natural killing cells, monocytes, cytotoxic T cells.

[0159] In some embodiments, the bi-specific molecule enhances immune effector cells phagocytosis of cancer cells expressing target antigen to which the second domain binds, such as human Claudin 18.2 and human SIRPα.

[0160] The bi-specific molecule of the present application has the advantages of high dual target binding affinity and specificity, and thereby further enhancing the anti-tumor immune function.

[0161] The bi-specific molecule provided shows higher affinity to SIRPα (e.g., human SIRPα) , In some embodiments, bi-specific molecule binds to human SIRPα with KD no more than 9.9E-7 M, or no more than 9.9E-8 M detected by Octet rule. In general, the KD value, or affinity constant, is the equilibrium dissociation constant, or a ratio of Kd / Ka, between the antibody and its target antigen. Kd refers to dissociation constant, and Ka refers to association constant.

[0162] In some embodiments, the bi-specific molecule binds to SIRPα (e.g., human SIRPα, CHOK1 cells overexpressing human SIRPα) with EC50 no more than 3 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1 nM detected by FACS (Fluorescence activated Cell Sorting) .

[0163] Thermal stability is the ability of a protein to maintain its structural and functional integrity under different temperature environment and is an intrinsic property of antibodies that can influence product stability, such as aggregation, during manufacturing and storage. The melting temperature (Tm) value may predict their thermal stability in general. Tm values of the bi-specific molecule provided herein range from 40-70℃, preferably 55-60℃, such as 48℃, 50℃, 55℃, or 57℃, indicating that the antibodies have good thermal stability.

[0164] Good stability under low pH conditions is important for antibodies because the purification process often involves exposure to acidic solution conditions and the commonly used low pH virus inactivation. Low pH usually causes soluble, insoluble aggregates and accelerates fragmentations. The bi-specific molecule provided herein has good stability under pH 3.0-3.5 conditions.

[0165] The bi-specific molecule provided herein has good freeze-thaw stability. Freeze-thaw stability is often explored to determine the susceptibility of antibodies to temperature cycling which products are frequently exposed. For example, drug substance is often frozen to enable long-term storage. Drug product may be exposed to frozen temperature as part of the lyophilization process. The major degradation pathway of freeze-thaw is aggregates, including precipitates, particles, and soluble particles.

[0166] The bi-specific molecule provided herein has good stability under a 4℃ condition for at least 7, 14, 28, 28 days, and under a 40℃ condition for at least 14 days, the purity of the bi-specific molecule changes little.

[0167] Polynucleotide

[0168] The present disclosure provides an isolated polynucleotide encoding an anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof or a bi-specific molecule described above.

[0169] The polynucleotide is polymers of DNA, RNA, DNA / RNA hybrids, or modifications thereof. In some embodiments, the polynucleotide is polymers of DNA. The polynucleotide is polymers of RNA. DNA or RNA encoding an anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof or a bi-specific molecule described above is readily isolated and sequenced using conventional procedures (e.g., by using oligonucleotide probes that are capable of binding specifically to genes encoding the heavy and light chains of the antibody) . The encoding DNA or RNA may also be obtained by synthetic methods.

[0170] The isolated polynucleotide encoding an anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof or a bi-specific molecule described above can be inserted into a construct for further cloning (amplification of the DNA) or for expression, using recombinant techniques known in the art.

[0171] Many constructs are available. The construct components generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter (e.g., SV40, CMV, EF-1α) , and a transcription termination sequence.

[0172] Construct

[0173] Provided herein is a construct includes the isolated polynucleotide provided above. A method of constructing the construct is known to those skilled in the art. For example, the construct can be obtained by in-vitro recombinant DNA technology, DNA synthesis technology, or in-vivo recombinant technology. More specifically, it can be constructed by inserting the isolated polynucleotide into a polyclonal site of an expression vector. The expression vector in the present disclosure generally refers to various commercially available expression vectors well known in the art, for example, bacterial plasm ids, bacteriophages, yeast plasmids, plant cell-infected viruses, mammalian cell-infected viruses such as adenovirus, retrovirus or other vectors. The vector may also include one or more regulatory sequences operably linked to the polynucleotide sequence, where the regulatory sequence may include a suitable promoter sequence. The promoter sequence is usually operably linked to a sequence coding the amino acid sequence to be expressed. The promoter can be any nucleotide sequence that exhibits transcriptional activity in the selected host cell, including mutated, truncated and hybrid promoters, and can be obtained from a gene encoding an extracellular or intracellular polypeptide homologous or heterologous to the host cell. The regulatory sequence may further include a suitable transcription terminator sequence, a sequence recognized by the host cell to terminate the transcription. The terminator sequence is linked to the 3′end or terminus of the nucleotide sequence encoding the polypeptide, and any terminator that is functional in the host cell of choice may be used in the present disclosure.

[0174] Generally, a suitable vector may contain an origin of replication capable in at least one organism, a promoter sequence, a convenient restriction enzyme site and one or more selectable markers. For example, these promoters may include, but not limited to, the lac or trp promoter of Escherichia coli (E. coli) ; the lambda phage PL promoter; and eukaryotic promoters (including CMV immediate-early promoter, HSV thymidine kinase promoter, early and late SV40 promoters, methanol oxidase promoter of Pichia pastoris) , and some other known promoters that are capable of controlling gene expression in prokaryotic cells or eukaryotic cells or viruses. Marker genes can be used to provide phenotypic characters for selection of transformed host cells. For example, marker genes may include, but not limited to, dihydrofolate reductase, neomycin resistance and green fluorescent protein (GFP) for eukaryotic cell culture, or tetracycline resistance or ampicillin resistance for E. coli. When the polynucleotide is expressed, the expression vector may further include an enhancer sequence. If an enhancer sequence is inserted into the vector, the transcription will be enhanced. Enhancer is a cis- acting factor of DNA, typically containing about 10 to 300 base pairs. Enhancer acts on a promoter to enhance gene transcription.

[0175] Antibody Expressing System

[0176] The present disclosure provides an antibody expression system is provided, which includes a construct provided above or incorporates an exogenous polynucleotide provided above in the genome. Any cell suitable for the expression of an expression vector can be used as a host cell. For example, the host cell can be a prokaryotic cell, such as a bacterial cell; or a lower eukaryotic cell, such as a yeast cell; or a higher eukaryotic cell, such as a mammalian cell, specifically including, but not limited to, Escherichia coli, Streptomyces; bacterial cells of Salmonella typhimurium; or fungal cells such as yeast, and filamentous fungi; plant cells; insect cells derived from Drosophila S2 or Sf9; animal cells such as CHO, COS, HEK293 cells, or Bowes melanoma cells, or a combination thereof. Methods for constructing the expression system should be known to those skilled in the art, for example, including, but not limited to, microinjection, gene gun method, electroporation, virus-mediated transformation, electron bombardment, precipitation with calcium phosphate, or a combination thereof.

[0177] Pharmaceutical Compositions

[0178] The present disclosure relates to a pharmaceutical composition including an anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof described above or a bi-specific molecule described above, and a pharmaceutically acceptable carrier. Preferably, the composition is a pharmaceutical composition, which contains the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof described above or a bi-specific molecule described above and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0179] Generally, these substances can be formulated in a non-toxic, inert and pharmaceutically acceptable aqueous carrier medium, wherein the pH is usually about 5-8, preferably about 6-8, although the pH can be changed according to properties of the formulated substances and disease conditions to be treated. The formulated pharmaceutical composition can be administered by conventional routes, including (but not limited to) intratumoral administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, or topical administration.

[0180] The pharmaceutical composition of the present disclosure contains a safe and effective amount (such as 0.001-99 wt %, preferably 0.01-95 wt %, more preferably 0.1-90 wt %) of the single domain antibody or the fusion protein provided and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Such carrier includes (but is not limited to) saline, buffer, glucose, water, glycerol, ethanol and combinations thereof. A pharmaceutical preparation should be matched with the administration mode. The pharmaceutical composition of the present application can be prepared into an injection form, for example, the pharmaceutical composition is prepared by conventional methods with physiological saline or an aqueous solution containing glucose and other adjuvants. The pharmaceutical composition  such as an injection and a solution should be manufactured under sterile conditions. The dosage of active ingredients is a therapeutically effective amount, such as about 10 μg / kg body weight to about 100 mg / kg body weight per day. In addition, the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof described above or a bi-specific molecule described above can also be used with other therapeutic agents.

[0181] Kit

[0182] The present disclosure provides a kit containing the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof, the bi-specific molecule, the isolated polynucleotide, the construct, and / or the pharmaceutical composition provided herein. Such kits can further include, if desired, one or more of various conventional pharmaceutical kit components, such as, for example, containers with one or more pharmaceutically acceptable carriers, additional containers etc., as will be readily apparent to a person skilled in the art. Instructions, either as inserts or a labels, indicating quantities of the components to be administered, guidelines for administration, and / or guidelines for mixing the components, can also be included in the kit.

[0183] Use

[0184] The present disclosure provides a use of the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof, the bi-specific molecule, or the pharmaceutical composition described above in the manufacture of a therapeutic agent for preventing, diagnosing, or treating a disease, disorder, or condition.

[0185] In some embodiments, the disease, disorder, or condition is a tumor, and at least a tumor cell expresses SIRPα, preferably human SIRPα. In some embodiments, at least a tumor cell expresses Claudin 18.2, preferably human Claudin 18.2. In certain embodiments, the tumor is a solid tumor. Generally, the tumor includes benign tumors and malignant tumors (also called as cancer) .

[0186] Examples of diseases associated with Claudin 18.2 expressing cells that can be diagnosed, treated and / or prevented in the present disclosure may include all Claudin 18.2 expressing cancers and tumor entities. In some embodiments, the diseases include, but not limited to, esophageal cancer, hepatic cancer, lung cancer, melanoma, gastric cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, colon cancer, kidney cancer, bladder cancer, breast cancer, classic Hodgkin lymphoma, hematological malignancies, head and neck cancer nasopharyngeal cancer, cancer of the gallbladder and the metastasis thereof, a Krukenberg tumor, peritoneal metastasis, and lymph node metastasis, which may be early, intermediate, or advanced, such as, metastatic cancers.

[0187] In another aspect, provided herein is a method of treating a subject having cancer, including administrating to the subject a therapeutically effective amount of anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof, the bi-specific molecule, or the pharmaceutical composition provided herein.

[0188] The “therapeutically effective amount” of the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof, the bi-specific molecule described above, or a pharmaceutical composition provided in the present disclosure preferably causes a reduction in the severity of disease symptoms and increased frequency and duration of asymptomatic period of a disease, disorder or condition, or prevents injury or disability due to illness or suffering. For example, for the treatment of tumors (including, for example, melanoma, lymphoma, bladder cancer, non-small cell lung cancer, head and neck cancer, and colon cancer) , relative to untreated subjects, the “therapeutically effective amount” preferably inhibits the cell growth or tumor growth by at least about 10%, preferably at least about 20%, more preferably at least about 30%, more preferably at least about 40%, more preferably at least about 50%, more preferably at least about 60%, more preferably at least about 70%, more preferably at least about 80%. The ability to inhibit tumor growth can be evaluated in an animal model system that predicts the efficacy against human tumors, or evaluated by detecting the ability to inhibit cell growth. Such inhibition can be determined in vitro by assays well known to those skilled in the art. The therapeutically effective amount of the anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof described above, the bi-specific molecule, and the pharmaceutical compositions is often able to reduce the tumor size, or otherwise relieve the symptoms of a subject. Those skilled in the art can select an appropriate therapeutically effective dose according to the actual situation, for example, the tumor size of the subject, the severity of the subject's symptoms, and the particular composition or route of administration chosen. A prescription for treatment (e.g., decision on dosage, etc. ) may be determined by a physician commonly considering factors including, but not limited to, the disease being treated, status of the patient, delivery site, route of administration and other factors. A prophylactically effective amount refers to an amount effective for achieving the desired prophylactic effect at a dose and for a period of time required. Usually, but not necessarily, since a prophylactic dose is administered to a subject before the onset of a disease or at an early stage of the disease, the “prophylactically effective amount” is usually lower than the “therapeutically effective amount” .

[0189] The subject is mammal animals, such as human, mouse, and cynomolgus monkey.

[0190] The present disclosure provides a method of decreasing the rate of tumor growth, including contacting a tumor cell with an effective amount of anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof, the bi-specific molecule, or the pharmaceutical composition described above.

[0191] The present disclosure provides a method of killing a tumor cell, including contacting a tumor cell with an effective amount of anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof, the bi-specific molecule, or the pharmaceutical composition described above.

[0192] EXAMPLES

[0193] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0194] Example 1: Reagents generation

[0195] 1.1. Wildtype antibody

[0196] The amino acid sequences of wildtype antibodies, anti-Claudin 18.2 antibody and anti-SIRPαscFv (Seq. 2534m1v3) , generated from hybridoma and humanization by in-house developed, were shown in Table 1.

[0197] Table 1 Amino acid sequences of wildtype antibodies (single-letter code)

[0198] 1.2. Stable cell lines

[0199] Human SIRPα stably expressing cell line CHOK1 / SIRPα has been generated for chimeric antibody in vitro assays. For cell line generation, CHOK1 cell was transfected with human-SIRPα (Uniprot Access# P78324, AA Met1-Lys504) expression lentivirus and selectively cultured in medium containing 10 g / mL puromycin for 2 weeks. Single cell clones were then isolated by limited dilution and screened by FACS to obtain the monoclonal cell lines stably expressing SIRPα.

[0200] 1.3. Recombinant proteins

[0201] Human SIRPα extracellular domain (ECD, Uniprot Access# P78324, AA Met1-Arg369) recombinant proteins with or without biotinylating were purchased from SinoBiological (Cat: 30014-H08H-B and Cat: 30014-H08H) .

[0202] Example 2: Library construction and antibody screening

[0203] 2.1. Random mutation Library construction

[0204] The mutations were randomly introduced into template of anti-SIRPα scFv 2534m1V3. Firstly, random mutation PCR were carried out with the GeneMorph II Random Mutagenesis Kit. Then the PCR products were separated on a 1%agarose gel. A DNA marker DL2000 was used to indicate the length of the DNA band. The DNA band around 750bp were excised and purified by the NucleoSpin  Gel and PCR Clean-up Kit according to its protocol. In the next step, the mutated DNA was amplified by the same primers with the PrimeSTAR Max DNA Polymerase kit. The PCR products were separated on a 1%agarose gel and purified by the NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit according to its protocol. 12ug of the mutated DNA were mixed with 8ug of linearized yeast-display vector and then concentrated into 20ul double distilled water. The concentrated DNA mixture was transferred into yeast BEY100 by electroporation. A mutated library with 2.8E8 diversity was yield and expanded in the SDCAA medium.

[0205] 2.2. Stable colonies enrichment by MACS

[0206] Yeast library was induced in SGRCAA medium at 30℃ for overnight and then was used for the 1st round MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting) .

[0207] 2.8E9 induced yeasts from the initial library were washed twice with 0.1%PBSA (Phosphate NaCl Buffer) and incubated with biotinylated SIRPα (bio-SIRPα) in 50mL 0.1%PBSA at R. T. (room temperature) for 2h. The mixture was then washed with 0.1%PBSA and was incubated with streptavidin labeled magnetic beads in 50mL 0.1%PBSA at R. T. for 1h. The yeasts that displayed SIRPα-binder were captured by the magnetic beads and the yeast-magnetic beads complexes were separated by a magnet set from the library. The yeasts captured by beads were expanded in SDCAA medium and induced in the SG medium, forming a new library, labeled as library1.

[0208] In 2nd round MACS, 2.3E8 yeasts from library1 was washed and resuspended in 3M guanidine solution and incubate at 4℃ for overnight on a rotator with a proper-speed rotation. In the next day, the yeasts were washed and incubated with 5nM bio-SIRPα in 0.5M guanidine solution at R. T. for 2h. The mixture was then washed with 0.1%PBSA and incubated with streptavidin labeled magnetic beads in at R. T. for 1h. The yeasts that displayed SIRPα-binder were captured by the magnetic beads and the yeast-magnetic beads complexes were separated by a magnet set from the library1. Then the yeasts captured by beads were expanded in SDCAA medium and induced in the SG medium, forming a new library, labeled as library 2.

[0209] 2.3. Stable colonies enrichment by Sorting

[0210] In the 1st round sorting, 3E7 yeasts from the library 2 were washed and resuspended in 3M guanidine and incubate at 4℃ for overnight on a rotator with a proper-speed rotation. In the next day, yeasts were washed and incubated with 5nM bio-SIRPα in 0.5M guanidine at R. T. for 2h. The mixture was then washed and resuspended in 0.1%PBSA containing PE-streptavidin (PE-conjugated streptavidin) and FITC-anti-HA antibody (fluorescein isothiocyanate conjugated hemagglutinin Tag antibody) and incubated at R. T. for 0.5h. The wildtype of 2534m1V3 (anti-SIRPα scFv) was displayed on a yeast as a control (wildtype control in the following text) and do the same treatment. The two groups of yeast were washed and injected into the S3e cell sorter. Based on the antigen binding profile  of the wildtype control group, as gate 1 in the Figure 1 as control, the desired yeast population, gate R2, in the Library2 was collected into a FACS tube. The yeasts were then expanded in the SDCAA medium and induced in the SG medium, forming a new library, labeled as library 3.

[0211] In the 2nd round sorting, 3E7 yeasts from the library 3 were harvested and washed twice with 0.1%PBSA. The yeasts were resuspended in 2ml PBS (phosphate buffer saline) containing 1M guanidine and 1nM bio-SIRPα and incubated at R. T. for 2h on a rotator with a proper-speed rotation. The mixture was then washed and resuspended in 0.1%PBSA containing PE-streptavidin and FITC-anti-HA antibody and incubated at R. T. for 0.5h. The wildtype control was treated in the same procedure. The two groups of yeast were injected into the S3e cell sorter. Based on the antigen binding profile of the wildtype control group, as gate 1 in the Figure 2 as control, the desired yeast population gate 2 in the library 3 was collected into a FACS tube. The yeasts were then expanded in the SDCAA medium and plated on to SD (Sabouraud Dextrose) agar plates.

[0212] 2.4. Screening of stable colonies

[0213] Colonies on the plates were picked and induced in SG medium in a 96-deep-well plate at 30℃for overnight. Wildtype clone was also induced as a control. Induced yeasts were aliquoted into a new 96-well-low-absorption-plate and washed twice with 0.1%PBSA. The yeasts were resuspended with PBS containing 1M guanidine and 1nM bio-SIRPα and incubated at R. T. for 2h. The mixture was then washed with 0.1%PBSA and resuspended in 0.1%PBSA containing PE-streptavidin and FITC-anti-HA antibody and incubated at R. T. for 0.5h. The yeast was washed and injected into the BD Celesta for signal collection. 380 colonies were picked and screened.

[0214] The comparation between the mutated colonies and wildtype control were based on the scFv displayed level and SIRPα binding potency. Colonies with both improved scFv displayed level and binding potency were defined as improved ones and all the improved colonies are sequenced. Clone 201, as shown in Figure 3, had improved both in scFv displaying level and antigen binding potency. The sequence of clone 201 was shown as SEQ ID NO: 4.

[0215] Example 3: Bispecific antibody (BsAb) generation and characterization

[0216] 3.1. BsAb generation

[0217] As shown in Figure 4A, the bispecific antibody is a symmetrical structure with an anti-SIRPa scFv (Seq. 2534m1v3) fused to the C terminal of the Fc of the Claudin 18.2 antibody in Example 1.1. The wildtype bispecific antibody has been generated with the IgG1 isotype and used as a control.

[0218] The sequence of clone 201 were synthesized and cloned into the C terminal of the Fc fragment of a claudin 18.2 antibody with a (G4S) 3 linker, and co-electroporated with the light chain into CHO cell line and expressed in a 30mL medium, yield BsAb antibodies AE016_201. As a control, the wt (short for wildtype) BsAb, 005-08, was also expressed in 30ml medium. The sequences of AE016_201 are  list in Table 2. The expressed protein was harvested on day 5 and purified by one-step protein-A affinity chromatography. The protein was measured, and the productivity was shown in Table 3. Compared to the wt control, the mutants yielded 7 times improved products. The purity of the products after on-step purification were also analyzed by the SEC. AE016_201 had a purity higher than 90%in the SEC characterization as Table 3 and Figure 4B shows.

[0219] Table 2 Amino acid sequences of AE016_201 (single-letter code)

[0220] Table 3 Productivity and one-step purity of the mutants in 30mL expression system

[0221] 3.2. BsAb characterization

[0222] 3.2.1. Binding affinity

[0223] The binding affinity of AE016_201 and wt BsAb to human SIRPα ECD recombinant protein was determined using Bio-Layer Interferometry (Octet) . The association and dissociation curves were fit with 1: 1 binding model, and the Kon / Koff / KD value for AE016_201 was calculated and summarized in Table 4. The binding curve was showed in Figure 5. AE016_201 showed comparable affinity with wt BsAb.

[0224] Table 4 Affinity of AE016_201 to SIRPα detected by the Octet

[0225] 3.2.2. Cell line binding

[0226] The SIRPα overexpressed cells CHOK1 / SIRPα was harvested by TrypLE digesting and centrifugating. Cells were resuspended in FACS buffer containing DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline) and 2%FBS (Fetal Bovine Serum) for 30 min. 1E5 cells were aliquoted into each well in the 96-well plate with diluted antibodies. The concentration of the antibodies used were 100 nM for first well and then 5 times diluted for the remaining wells. After incubating at 4 ℃ for 60 min, cells were washed twice with FACS buffer and resuspended with the secondary antibody AF647 anti human Fc antibody. The cells were then incubated at 4 ℃ for 30 min in dark. After that the cells were washed twice with FACS buffer and resuspended in FACS buffer and analyzed on the flow cytometry. An anti-SIRPα antibody 2534m1V3 in the IgG4 isotype was used as control. The binding curve and EC50 were calculated by the software GraphPad Prism 9 as shown in Figure 6.

[0227] 3.2.3. Tm value testing

[0228] Thermal stability is the ability of a protein to maintain its structural and functional integrity under different temperature environment and is an intrinsic property of antibodies that can influence product stability, such as aggregation, during manufacturing and storage.

[0229] The melting temperature (Tm) values of AE016_201 in 10 mM Histidine and 10 mM Glycine buffer (HG buffer) , PBS, or 20 mM Histidine buffer was measured to predict their thermal stability. Briefly, hit antibodies AE016_201 were resolved in HGS or PBS or 20 mM Histidine buffer. The Tm values were then detected by DSF (Differential Scanning Fluorimetry) using QuantStudio 7 Flex Real time PCR system. The Tm1 value of the AE016_201 in different buffer was listed in Table 5, indicating their good thermal stability in different buffers.

[0230] Table 5 Tm1 value of AE016_201 in different buffers

[0231] 3.2.4. Long term stability testing in the 4℃

[0232] To determine the long-term stability of the variants in the 4 ℃, 200 μl of the proteins were kept in 4 ℃, and 20 μl of the samples at the day 7, 14, 21, and 28 were loaded to the SEC column at a speed  of 0.5 ml / min. The purity of the samples at different time were shown in the Figure 7. It shows that AE016_201 was stable in the 4℃ after a long-time storage.

[0233] 3.2.5. Freezing and thaw stability testing

[0234] To determine the stability of the variants after repeated Freezing and thawing, 50 μl of the proteins in the concentration of 1 mg / ml was first frozen and stored in -80℃ for 1 h, and then kept in the R. T. for 1 h. Repeat this procedure for 3 times (3xFT) and then 20 μl samples were loaded at a speed of 0.5ml / min and analyzed by SEC. The purity of the samples after 3xFT were shown in the Table 6. It shows that AE016_201 was stable after 3xFT treatment.

[0235] Table 6 The purity variation of AE016_201 before and after 3xFT treatment

[0236] △monomer was the purity variation of samples after and before 3xFT treatment.

[0237] 3.2.6. Low pH stability testing

[0238] To determine the stability of the variants after low pH treatment, 1 μL citrate acid was added into 50 μL samples, the pH of the sample solutions at that condition is 3.63. The samples were kept at RT for 2 h and then were neutralized with 15 μL Tris 9.0. Then 17 μl PBS was added into 33 μl of the samples to make 2 mg / mL stock for SEC test. 20μl of the stock solution was loaded into the SEC column and run at a speed of 0.5 ml / min. The purity before and after treated with low pH of AE016_201 was shown in Table 7.

[0239] Table 7 The purity variation of AE016_201 before and after low pH treatment

[0240] △monomer was the purity variation of samples after and before low pH treatment.

[0241] 3.2.7. Accelerated stability testing

[0242] Thermal stress at temperatures exceeding normal storage conditions can accelerate degradation, thereby increasing the detectability of potential degradation pathways to provide information about long-term degradation at intended storage conditions.

[0243] The thermal stress tests of AE016_201 in HGS was performed at 40 ℃ for 14 days. SEC-purity were detected to monitor insoluble or soluble aggregates. As shown in Table 8, the purity of AE016_201 in HG buffer changed little after 14 days of incubation at 40 ℃.

[0244] Table 8 The purity variation of AE016_201 in 40℃ for 1 and 2 weeks

[0245] Example 4: Reengineering the AE016_201

[0246] 4.1. Reengineering the AE016_201 and characterization

[0247] Based on the structure comparison and sequence alignment of the scFv part in BsAb 005-08 and AE016_201, reengineering of AE016_201 was carried out by back mutation to create a new mutant AE016_201.003. The mutation design for AE016_201.003 is R486S, Q489S, A514T, R517L, V641I, and A646G in the CDR and / or FR region of anti-SPRPα antibody. The sequence of AE016_201.003 was shown in Table 9. The mutant AE016_201.003 was expressed in CHO cell line in a 30 ml medium. The production was 91 mg / L with a purity of 97.3%after one-step purification. The affinity, Tm value, and freezing and thaw stability (FT) was assessed as described above. The results were summarized in the Table 10.

[0248] Table 9 Amino acid sequence of AE016_201.003 (single-letter code)

[0249] Table 10 Property of the mutant AE016_201.003

[0250] Example 5: Anti-Claudin18.2 Antibodies

[0251] Anti-Claudin18.2 antibodies were generated from hybridoma and humanization by in-house development. For expression, the DNA encoding the light chain and the heavy chain in either the same expression vector or separate expression vectors were used to transfect CHO cell for transfection. The culture media were harvested and the fusion protein was purified by Protein A Sepharose column. Table 11 shows the VH and VL of hu26. H1L2.

[0252] Table 11. Amino acid sequences of the variable regions for anti-Claudin18.2 antibody hu26. H1L2

[0253] CDRs were underlined and were defined using Kabat definition.

[0254] Example 6: Anti-SIRPα Antibodies

[0255] Anti-SIRPα antibodies were generated from hybridoma and humanization by in-house development. For expression, the DNA encoding the light chain and the heavy chain in either the same expression vector or separate expression vectors were used to transfect CHO cell for transfection. The culture media were harvested and the fusion protein was purified by Protein A Sepharose column. Table 12 shows the VH and VL of hu025.060 (ES0040025) , hu025.201, hu025.003, and hu025.003. SS.

[0256] Table 12. Amino acid sequences of the variable regions for anti-SIRPα antibodies or scFv

[0257] CDRs were underlined and were defined using Kabat definition.

[0258] Example 7: Anti-Claudin18.2 / SIRPα Bispecific antibody construction and characterization

[0259] 7.1 Anti-Claudin18.2 / SIRPα Bispecific antibody construction and expression

[0260] Anti-Claudin18.2 / SIRPα bispecific antibodies were constructed as an anti-Claudin18.2 antibody (hu26. H1L2) with anti-SIRPα scFv (hu025.201, hu025.003, hu025.003. SS) at the C-terminus of heavy chain. A flexible (Gly4Ser) 3 linker was genetically linked to the N-terminus of the anti-SIRPα scFv. The schematic drawing of the anti-Claudin18.2 / SIRPα bispecific antibodies was shown in Figure 4A. The amino acid sequence of the resultant bispecific antibodies were shown below:

[0261] Table 13. Amino acid sequence of ES028.26.201 (single-letter code)

[0262] Table 14. Amino acid sequence of ES028.26.003 (single-letter code)

[0263] Table 15. Amino acid sequence of ES028.26.003. SS (single-letter code)

[0264] For expression, the DNA encoding the light chain and the heavy chain in either the same expression vector or separate expression vectors were used to transfect CHO-K1 cells for transfection. The culture media were harvested, and the fusion protein was purified by Protein A Sepharose column.

[0265] 7.2 Anti-Claudin18.2 / SIRPα Bispecific antibody binding affinities

[0266] The Anti-Claudin18.2 / SIRPα bispecific protein were characterized for binding affinity against human Claudin18.2 or SIRPα using Octet assay (ForeBio) according to manufacturer’s manual, separately. Briefly, the antibodies were coupled on sensors and then the sensors were dipped into Claudin18.2 or SIRPα protein gradients (start at 200 nM, with 2-fold dilution and totally 8 doses) . Their binding responses were measured in real-time, and results were fit globally. The affinity data of the tested antibody are summarized in Table 13 and Table 14.

[0267] Table 13. Binding affinity of bispecific antibody to human SIRPα

[0268] Table 14. Binding affinity of bispecific antibody to human Claudin18.2

[0269] 7.3 Binding of Anti-Claudin18.2 / SIRPα bispecific antibody to Claudin18.2 and SIRPα by FACS

[0270] Approximately 100,000 Raji lymphoma cells overexpressing human Claudin18.2 (Raji / hClaudin18.2) , generated by lentivirus stable transfection, were washed with wash buffer and incubated with 100 μl serial dilution of Claudin18.2 / SIRPα bispecific protein for 30 minutes on ice. Cells were then washed twice with wash buffer and incubated with 100 μl of AF647 anti-human Fc antibody for 30 minutes on ice. Cells were then washed twice with wash buffer and analyzed on a FACS Canto II analyzer (BD Biosciences) . As shown in Figure 8A, the anti-Claudin18.2 / SIRPαbispecific antibodies bound to Raji / hClaudin18.2 cell in a dose-dependent manner. The bispecific antibodies ES028.26.201, ES028.26.003, ES028.26.003. SS bound Raji / hClaudin18.2 similar to anti-Claudin18.2 monoclonal antibody hu26. H1L2.

[0271] CHOK1 cells overexpressing human SIRPα (CHOK1 / SIRPα) were washed with wash buffer and incubated with 100 μl serial dilution of Claudin18.2 / SIRPα bispecific protein for 30 minutes on ice. Cells were then washed twice with wash buffer and incubated with 100 μl of AF647 anti-human Fc antibody for 30 minutes on ice. Cells were then washed twice with wash buffer and analyzed on a FACS Canto II analyzer (BD Biosciences) . As shown in Figure 8B, the anti-Claudin18.2 / SIRPαbispecific antibodies ES028.26.201, ES028.26.003, ES028.26.003. SS bound to CHOK1 / SIRPα cell in a dose-dependent manner, similar to anti-SIRPα monoclonal antibody hu025.060.

[0272] 7.4 Anti-Claudin18.2 / SIRPα bispecific antibody enhances in vitro macrophage phagocytosis of Claudin18.2+ cancer cells

[0273] Mouse MC38 colon tumor cells expressing human CD47 and human Claudin18.2 were labeled with the fluorescent dye CFSE and incubated with mouse bone marrow derived macrophages (BMDMs) prepared from C57BL6 / hCD47 / hSIRPα knock-in mice either in the presence of anti-Claudin18.2 antibody hu26. H1L2, anti-SIRPα antibody hu025.060, the combination of anti-Claudin18.2 and anti-SIRPα antibody, anti-Claudin18.2 / SIRPα bispecific antibody. After 2 hours, the macrophages were harvested, stained with a fluorescently labeled anti-mouse macrophage antibody, and analyzed by flow cytometry. CD11b+CFSE+ double positive events identify macrophages that have phagocytosed CFSE-labeled tumor cell. Phagocytic index was shown for three separate samples.

[0274] As shown in Figure 9, anti-Claudin18.2 antibody hu28H1L2 induced ～25%phagocytosis by antibody dependent cellular phagocytosis (ADCP) and anti-SIRPα antibody barely induce phagocytosis. The combination of anti-Claudin18.2 and anti-SIRPα antibody significantly improve the phagocytosis. Anti-Claudin18.2 / SIRPα bispecific antibody ES028.26.201, ES028.26.003, ES028.26.003. SS induced stronger phagocytosis in a dose dependent manner compared to combination and mono-treatment.

[0275] 7.5 Anti-Claudin18.2 / SIRPα bispecific antibody enhances in vivo anti-tumor efficacy

[0276] Human SIRPα / CD47 double knock-in mice (Shanghai Model Organisms Center, Inc) were inoculated with hCD47 / hCLDN18.2 overexpression MC38 cells (stably transfected with lentivirus in Shanghai Model Organisms Center) . Mice were grouped according to tumor volume into 5 groups when the mean tumor volume reached ～60-100 mm3. Mice were i.p. dosed with the same molar concentration of hu26. H1L2, ES028.26.201, ES028.26.003, ES028.26.003. SS, or vehicle. Dosing schedule was BIW for 5 doses. Tumor volumes were measured twice per week. 3 days post the 5th dosing, mice were sacrificed, and tumors were weighted. Statistics were carried out by 2-way anova comparing the mean tumor volume of different treatment groups to that of control group.

[0277] Relative tumor inhibition rate, TGI (%) was calculated as below:

[0278] TGI%= (1-T / C) × 100%. (T and C are the relative tumor volume (RTV) or tumor weight (TW) of the treatment group and the control group at a specific time point, respectively) .

[0279] T / C %= TRTV  / CRTV × 100% (TRTV: mean RTV of the treatment group; CRTV: mean RTV of the vehicle control group;

[0280] RTV = Vt / V0, V0 is the tumor volume of the animal at the time of grouping, Vt is the tumor volume of animal after treatment) ;

[0281] T / C can also be calculated based tumor weight as below:

[0282] T / C %= TTW  / CTW × 100% (TTW: mean tumor weight of the treatment group at the end; CTW: mean tumor weight of the vehicle control group at the end) .

[0283] As shown in Figure 10, anti-Claudin18.2 antibody hu26. H1L2 monotherapy did not inhibit tumor growth similar to vehicle treatment. Anti-Claudin18.2 / SIRPα bispecific antibody ES028.26.201, ES028.26.003, ES028.26.003. SS, induces strong tumor growth inhibition compared to monotherapy or vehicle treatment.

[0284] While particular embodiments have been described, alternatives, modifications, variations, improvements, and substantial equivalents that are or may be presently unforeseen may arise to applicants or others skilled in the art. Accordingly, the appended claims as filed and as they may be amended are intended to embrace all such alternatives, modifications, variations, improvements, and substantial equivalents.

Claims

1.An anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable domain (VH) and a heavy chain variable domain (VL) , whereinVH comprises HCDR1, HCDR2, and HCDR3 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 20, 21, and 23, respectively; (2) SEQ ID NOs: 20, 22, and 23, respectively; (3) SEQ ID NOs: 20, 47, and 48, respectively;VL comprises LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 24, 26, and 28, respectively; (2) SEQ ID NOs: 25, 27, and 28, respectively.2.The anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of claim 1, wherein the HCDR1 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, the HCDR2 has the amino acid sequence shown as X1DPEDX2ETK (SEQ ID NO: 60) , the HCDR3 has the amino acid sequence shown as DRGLX3Y (SEQ ID NO: 61) , the LCDR1 has the amino acid sequence shown as X4ASX5SVSSSYLY (SEQ ID NO: 45) , the LCDR2 has the amino acid sequence shown as YSX6SNX7AS (SEQ ID NO: 46) , and the LCDR3 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28, X1 is V or I, X2 is A or G, X3 is V or A, X4 is R or S, X5 is Q or S, X6 is A or T, X7 is R or L.3.The anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of claim 1 or 2, wherein(1) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 21 and 23, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 24, 26 and 28, respectively;(2) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 22 and 23, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 25, 27 and 28, respectively; or(3) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 47 and 48, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 25, 27 and 28, respectively.4.The anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-3, wherein the VH comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 29, 30, 32, and 33, respectively; (2) SEQ ID NOs: 29, 31, 32, and 33, respectively; (3) SEQ ID NOs: 49, 50, 51, and 33, respectively; and / orthe VL comprises FR1, FR2, FR3, and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 37, respectively; (2) SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 38, respectively; (3) SEQ ID NOs: 34, 52, 53, and 37, respectively.5.The anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-3, wherein(1) the VH comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 29, 30, 32, and 33, respectively; and the VL comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 37, respectively;(2) the VH comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 29, 31, 32, and 33, respectively; and the VL comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34, 35, 36 and 38, respectively; or(3) the VH comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 49, 50, 51 and 33, respectively; and the VL comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34, 52, 53, and 37, respectively.6.The anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-5, wherein(1) said VH comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14; and said VL comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15;(2) said VH comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16; and said VL comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17;(3) said VH comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18; and said VL comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19;(4) said VH comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54; and said VL comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55.7.The anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-6, whereinsaid VH comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14, and said VL comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15; orsaid VH comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, and said VL comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17; orsaid VH comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and said VL comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19; orsaid VH comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54, and said VL comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55.8.The anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-7, wherein said anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment binds to human and / or mouse SIRPα.9.The anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-8, wherein said anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment is a Fab, Fab', F (ab') 2, Fv fragment, or a single-chain fragment variable (scFv) .10.The anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-9, wherein said anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment is scFv, of which the VH and VL are linked via a first peptide linker, optionally the first peptide linker includes (Gly4Ser) 4.11.The anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of claim 10, wherein N-terminus of the VH is linked to C-terminus of the VL.12.The anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-11, wherein said anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment is a chimeric antibody or a humanized antibody.13.A bi-specific molecule, comprising:(1) a SIRPα binding domain, which comprises a heavy chain variable domain (VH) and a heavy chain variable domain (VL) , wherein VH comprises HCDR1, HCDR2, and HCDR3 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 20, 21, and 23, respectively; (2) SEQ ID NOs: 20, 22, and 23, respectively; (3) SEQ ID NOs: 20, 47, and 48, respectively; VL comprises LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 24, 26, and 28, respectively; (2) SEQ ID NOs: 25, 27, and 28, respectively; and(2) a second domain binding to a target antigen, the second domain is fuse to the SIRPα binding domain.14.The bi-specific molecule of claim 13, in the SIRPα binding domain, the HCDR1 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, the HCDR2 has the amino acid sequence shown as X1DPEDX2ETK (SEQ ID NO: 60) , the HCDR3 has the amino acid sequence shown as DRGLX3Y (SEQ ID NO: 61) , the LCDR1 has the amino acid sequence shown as X4ASX5SVSSSYLY (SEQ ID NO: 45) , the LCDR2 has the amino acid sequence shown as YSX6SNX7AS (SEQ ID NO: 46) , and the LCDR3 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28, X1 is V or I, X2 is A or G, X3 is V or A, X4 is R or S, X5 is Q or S, X6 is A or T, X7 is R or L.15.The bi-specific molecule of claim 13 or 14, wherein in the SIRPα binding domain,(1) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 21 and 23, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 24, 26 and 28, respectively;(2) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 22 and 23, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 25, 27 and 28, respectively; or(3) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 47 and 48, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 have amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 25, 27 and 28, respectively.16.The bi-specific molecule of any one of claims 13-15, wherein the VH of SIRPα binding domain comprises FR1, FR2, FR3, and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 29, 30, 32, and 33, respectively; (2) SEQ ID NOs: 29, 31, 32, and 33, respectively; (3) SEQ ID NOs: 49, 50, 51, and 33, respectively; and / orthe VL of SIRPα binding domain comprises FR1, FR2, FR3, and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in: (1) SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 37, respectively; (2) SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 38, respectively; (3) SEQ ID NOs: 34, 52, 53, and 37, respectively.17.The bi-specific molecule of any one of claims 13-16, wherein, in the SIRPα binding domain,(1) the VH comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 29, 30, 32, and 33, respectively; and the VL comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34, 35, 36, and 37, respectively;(2) the VH comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 29, 31, 32, and 33, respectively; and the VL comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34, 35, 36 and 38, respectively; or(3) the VH comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 49, 50, 51 and 33, respectively; and the VL comprises FR1, FR2, FR3 and FR4 having amino acid sequences about 80%to about 100%identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34, 52, 53, and 37, respectively.18.The bi-specific molecule of any one of claims13-17, wherein the VH of SIRPα binding domain comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to one of amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 14, 16, 18, and 54; and / orthe VL of SIRPα binding domain comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to one of amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 15, 17, 19, and 55.19.The bi-specific molecule of any one of claims 13-18, wherein in the SIRPα binding domain,(1) said VH comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14; and said VL comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15;(2) said VH comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16; and said VL comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17;(3) said VH comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18; and said VL comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19;(4) said VH comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54; and said VL comprises an amino acid sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55.20.The bi-specific molecule of any one of claims 13-19, wherein the VH of SIRPα binding domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14, and the VL of SIRPα binding domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15; orthe VH of SIRPα binding domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, and the VL of SIRPα binding domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17; orthe VH of SIRPα binding domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and the VL of SIRPα binding domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19; orthe VH of SIRPα binding domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54, and the VL of SIRPα binding domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55.21.The bi-specific molecule of any one of claims 13-20, wherein the SIRPα binding domain is scFv, of which the VH and VL are linked via a first polypeptide linker, optionally the first polypeptide linker includes (Gly4Ser) 4.22.The bi-specific molecule of any one of claims 13-21, wherein in the SIRPα binding domain, the N-terminus of the VH is linked to C-terminus of the VL.23.The bi-specific molecule of any one of claims 13-22, wherein the second domain binds to target antigen expressing on surface of cancer cells.24.The bi-specific molecule of any one of claims 13-23, wherein the second domain binds to Claudin 18.2 and / or CD47, preferably Claudin 18.2.25.The bi-specific molecule of any one of claims 13-24, wherein the second domain comprises:a) a heavy chain variable region (VH) comprising CDR1, CDR2, and CDR3, wherein the VH CDR1, CDR2, and CDR3 have amino acid sequences about 80%to about 100%identical to amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 39, 40, and 41, respectively; andb) a light chain variable region (VL) comprising CDR1, CDR2, and CDR3, wherein the VL CDR1, CDR2, and CDR3 have amino acid sequences about 80%to about 100%identical to amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 42, 43, and 44, respectively.26.The bi-specific molecule of any one of claims 13-25, wherein the second domain comprises a VH having amino acid sequence at least about 80%identical to amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, and a VL having amino acid sequence at least about 80%identical to amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10.27.The bi-specific molecule of any one of claims 13-26, wherein the second domain comprises a light chain constant region (CL) , wherein the light chain is a kappa (κ) or lamda (λ) light chain.28.The bi-specific molecule of claim 27, wherein the CL comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 or 13.29.The bi-specific molecule of any one of claims 13-28, wherein the second domain comprises a heavy chain constant region (CH) having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11.30.The bi-specific molecule of any one of claims 13-29, wherein the bi-specific molecule is a symmetric bispecific molecule.31.The bi-specific molecule of any one of claims 27-30, wherein the N-terminus of the heavy chain variable domain of the SIRPα binding domain is fused to C-terminus of the heavy chain constant region of the second domains.32.The bi-specific molecule of any one of claims 13-31, wherein the SIRPα binding domains and the second domain are covalently linked via a second peptide linker having the formula (Gly4Ser) n, where n is an integer from 1 to 5.33.The bi-specific molecule of any one of claims 13-32, wherein the SIRPα binding domain and the second domain are covalently linked via (Gly4Ser) 3.34.The bi-specific molecule of any one of claims 13-33, comprising a heavy chain and a light chain, wherein the heavy chain comprises an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 56, 58 or 59; and the light chain comprises an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 57; orthe heavy chain comprises an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7; and the light chain comprises an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8;the heavy chain comprises an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5; and the light chain comprises an amino acid sequence at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.35.The bi-specific molecule of any one of claims 13-34, wherein the bi-specific molecules block the interaction of CD47 and SIRPα, remove SHP-1 / 2 inhibition, and / or engage Fc receptors on immune effector cells (e.g., macrophages) to activate phagocytosis.36.The bi-specific molecule of any one of claims 13-35, wherein the bi-specific molecule enhances immune effector cells phagocytosis of cancer cells expressing target antigen to which the second domain binds.37.The bi-specific molecule of any one of claims 13-36, wherein the bi-specific molecule binds to human Claudin 18.2 and human SIRPα.38.An isolated polynucleotide encoding an anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-12 or encoding a bi-specific molecule of any one of claims 13-37.39.A construct comprising a polynucleotide of claim 38.40.An antibody expressing system, comprising a construct including an isolated polynucleotide of claim 38 or having a genome integrated with an exogenous polynucleotide of claim 38, wherein preferably, the expressing system is a cell expression system.41.A method for producing an anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-12 or a bi-specific molecule of any one of claims 13-37, comprising: under conditions suitable for expressing the antibody, expressing the antibody or protein using the antibody expressing system of claim 40.42.A pharmaceutical composition comprising an anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-12 or a bi-specific molecule of any one of claims 13-37, and a pharmaceutically acceptable carrier.43.A kit comprising an anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-2 or a bi-specific molecule of any one of claims 13-37, an isolated polynucleotide of claim 38, or a construct of claim 39.44.Use of an anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-12 or a bi-specific molecule of any one of claims 13-37 or a pharmaceutical composition of claim 42 in the manufacture of a therapeutic agent for preventing, diagnosing, or treating a disease, disorder, or condition.45.The use of claim 44, wherein the disease, disorder, or condition is a tumor.46.The use of claim 45, wherein at least a tumor cell expresses Claudin 18.2, preferably human Claudin 18.2.47.The use of claim 45 or 46, wherein the tumor is a solid tumor.48.The use of any one of claims 44-47, wherein the tumor comprises esophageal cancer, hepatic cancer, lung cancer, melanoma, gastric cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, colon cancer, kidney cancer, bladder cancer, breast cancer, classic Hodgkin lymphoma, hematological malignancies, head and neck cancer and nasopharyngeal cancer, cancer of the gallbladder and the metastasis thereof, a Krukenberg tumor, peritoneal metastasis, and / or lymph node metastasis.49.A method of treating a subject having cancer, comprising administrating to the subject a therapeutically effective amount of anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-12 or a bi-specific molecule of any one of claims 13-37 or a pharmaceutical composition of claim 42.50.The method of claim 49, wherein the subject is mammal animals comprising human, mouse, and cynomolgus monkey.51.A method of decreasing the rate of tumor growth, comprising contacting a tumor cell with an effective amount of anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-12 or a bi-specific molecule of any one of claims 13-37 or a pharmaceutical composition of claim 42.52.A method of killing a tumor cell, comprising contacting a tumor cell with an effective amount of anti-SIRPα antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-12 or a bi-specific molecule of any one of claims 13-37 or a pharmaceutical composition of claim 42.

Images