A method for treating spinal muscular atrophy

Abstract

The present disclosure described herein provides, inter alia, a method for treating genetic disorders such as spinal muscular atrophy (SMA) in a subject, comprising the initial administration of an adeno-associated virus (AAV) -based gene therapy shortly after the birth of said subject, followed by the re-administration of an AAV-based gene therapy. The present disclosure also provides an isolated nucleic acid encoding a codon-optimized hSMN1 gene, a viral vector comprising the isolated nucleic acid, a composition comprising the viral vector, and a method for treating for treating spinal muscular atrophy in a subject comprising administration of the composition.

Description

A METHOD FOR TREATING SPINAL MUSCULAR ATROPHYTECHNICAL FIELDThe present invention generally relates to improved methods for treating genetic disorders via adeno-associated virus (AAV) -based gene therapy. In particular, the present invention relates to methods for treating genetic disorders such as spinal muscular atrophy via the re-administration of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors.BACKGROUNDGene therapy refers to the introduction of foreign normal target genes into target cells to correct or compensate for diseases caused by genetic defects or abnormalities, including gene modification and gene replacement, and the development of gene vectors has played an important role in gene therapy. Among many vectors, viral vectors are widely used in gene therapy due to their long-term gene expression and high infection efficiency, especially adeno-associated virus vectors with significant advantages.Adeno-associated virus is one of the most widely used vectors in gene therapy. Recombinant adeno-associated virus (recombinant AAV, rAAV) or recombinant adeno-associated virus vector is non-pathogenic, low immunogenic, strong specificity and long-term expression. The expression of the target gene and other characteristics make it stand out among many viruses and become the best among them.Although AAV-mediated gene therapy is expected to be long-lasting, it is anticipated that re-administration of the therapy may be necessary because of the potential decrease of transgene expression over time as a result of the natural turnover of transduced cells. Repeated AAV treatment might also be needed if the initial treatment does not result in a sufficient level of therapeutic protein expression or in the case of pediatric indications caused by fast liver growth leading to the loss of vector genomes and subsequent decline of transgene expression. Accordingly, in the gene therapy field, re-administration of adeno-associated virus (AAV) is an important topic because a decrease in therapeutic protein expression might occur over time. However, an efficient re-administration with the same AAV serotype is impossible due to serotype-specific, anti-AAV neutralizing antibodies (NABs) and binding antibodies that are produced after initial AAV treatment. In addition, anti-AAV antibodies to one serotype can also potentially cross-react with other AAV serotypes because of the presence of conserved residues that could lead to overlapping epitopes. This high homology between AAV serotypes also predicts that patients are likely to have antibodies to multiple serotypes, thus further frustrating the re-administration of AAV treatment.Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a genetic, neuromuscular disease caused by mutation or deletion of motor neuron 1 (SMN1) gene, which mainly affects motor neurons, leading to muscle atrophy and loss of motor function. SMA has a great impact on the patients′ quality of life and survival.Currently, there are five main clinical types based on the age of onset and disease severity, i.e., Type 0 SMA (In Utero SMA) , Type I SMA (Infantile SMA) , Type II SMA (Intermediate SMA) , Type III SMA (Juvenile SMA) and Type IV SMA (Adult onset SMA) .Among them, Type I SMA (Infantile SMA) presents symptoms between 0 and 6 months, and this form of SMA is the most common and severe subtype. Patients show significant motor dysfunction and difficulty breathing within several months of life, and death usually occurs within the first 2 years.At present, three drugs have been approved by FDA for the treatment of SMA, which includes antisense oligonucleotide (Spinraza, Nusinersen) , rAAV gene therapy (Onasemnogene abeparvovec, Zolgensma) , and small-molecular drug (Evrysdi, Risdiplam) , but all these therapeutic drugs still have some shortcomings. For example, Nusinersen has to be administered by repeated intrathecal injections (lumbar punctures) , which not only make the treatment process cumbersome and expensive but also increase the chance of ventricular system infection; Zolgensma has limited clinical applications due to the narrow therapeutic window (before 2 years of age) , high dose requirements (1.1 × 10^14 gc / kg) , and expensive costs ($2, 125,000) ; Risdiplam requires long-term and repeated administration, leading to some side-effects such as headache, nausea, and diarrhea.In contrast with antisense oligonucleotides and small-molecular drugs that require long-term and repeated treatment, recombinant adeno-associated virus (rAAV) gene therapy has shown great advantages in long-term gene expression and safety. But, in fact, the cells carrying therapeutic gene may be diluted due to cell division in the growth and development of the patients, resulting in reduced therapeutic efficacy of rAAV-mediated gene therapy. Therefore, rAAV gene therapy is likely to require a second injection to solve the problem of decreasing drug concentration during the middle and late stages of treatment for patients, especially for type I SMA that has an earlier onset.However, strong humoral immune responses against the AAV capsid will be generally triggered after the rAAV injection, and specific binding antibodies and neutralizing antibodies will be produced, leading to an obstruction of the re-injection of the same serotype rAAV. In recent years, some progress has been made in the re-injection of rAAV, including the use of rituximab to deplete B cells, the use of rapamycin to modulate the immunogenicity of rAAV vectors, the use of immunoglobulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes (IdeS) to cleave immunoglobulin G (IgG) , the use of CTLA4 to block the T-cell co-stimulatory pathway, and the anchoring of AAV to the surface of erythrocytes to delay recognition by the immune system, but the exact mechanism remains unclear.Therefore, it is still a great challenge to re-inject the same rAAV vector-mediated gene therapy drug in the treatment of genetic disorders, for example, in the late stage of treatment of SMA patients. Moreover, it has not been reported whether the re-injection can further improve the survival time and quality of life for patients of genetic disorders such as SMA as expected.SUMMARYThe present invention is based on the surprising finding that an initial injection of rAAV for treating genetic disorders within a short period of time after birth will cause a long-term gene expression and immune response deficiency, with no or less immune response produced. As a result, the re-administration of rAAV in the treatment of for treating genetic disorders is enabled, and will not cause the clearance of the rAAV of second injection.The present disclosure provides the following invention.[1] A method for treating genetic disorders in a subject, comprising the initial administration of an adeno-associated virus (AAV) -based gene therapy shortly after the birth of said subject, followed by the re-administration of an AAV-based gene therapy.[2] The method of [1] , wherein the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on the day selected from the group consisting of postnatal day 1 to postnatal day 13.[3] The method of any one of [1] to [2] , wherein the subject to be treated is human.[4] The method of any one of [1] to [3] , wherein the initial administration and the re-administration are conducted via intravenous injection.[5] The method of any one of [1] to [4] , wherein the adeno-associated virus (AAV) -based gene therapies for the initial administration and the re-administration are different.[6] The method of any one of [1] to [4] , wherein the adeno-associated virus (AAV) -based gene therapies for the initial administration and the re-administration are of different serotype.[7] The method of any one of [1] to [4] , wherein the adeno-associated virus (AAV) -based gene therapies for the initial administration and the re-administration are of same serotype.[8] The method of any one of [1] to [4] , wherein the adeno-associated virus (AAV) -based gene therapies for the initial administration and the re-administration are the same.[9] The method of any one of [1] to [8] , wherein the genetic disorder is spinal muscular atrophy.

[0010] The method of [9] , wherein the spinal muscular atrophy is Type I spinal muscular atrophy.

[0011] The method of any one of [1] to

[0010] , wherein the AAV-based gene therapy is an rAAV vector.

[0012] The method of

[0011] , wherein the AAV-based gene therapy is an rAAV9 vector.

[0013] The method of

[0012] , wherein the AAV-based gene therapy is an rAAV9 vector comprising a hSMN1 gene.

[0014] The method of

[0013] , wherein the hSMN1 gene is a codon-optimized hSMN1 gene comprising the nucleotide sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 1.

[0015] The method of

[0014] , wherein the hSMN1 gene is a codon-optimized hSMN1 gene comprising or consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

[0016] The method of any one of

[0011] to

[0015] , wherein the amount of the rAAV vector in the initial administration is lower than the amount of the rAAV vector in the re-administration.

[0017] The method of any one of

[0011] to

[0015] , wherein the amount of the rAAV vector in the initial administration is equal to the amount of the rAAV vector in the re-administration.

[0018] The method of any one of

[0011] to

[0015] , wherein the amount of the rAAV vector in the initial administration is higher than the amount of the rAAV vector in the re-administration.

[0019] The method of any one of [1 ] to

[0018] , wherein the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs in postnatal year 3 or later.

[0020] An isolated nucleic acid encoding a codon-optimized hSMN1 gene which comprises the nucleotide sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 1.

[0021] The isolated nucleic acid of

[0020] , wherein the codon-optimized hSMN1 gene comprises or consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

[0022] A viral vector comprising the isolated nucleic acid of any one of

[0020] to

[0021] .

[0023] The viral vector of

[0022] , wherein the viral vector is a retrovirus, a lentivirus, a poxvirus, an adenovirus, or an adeno-associated virus (rAAV) .

[0024] The viral vector of

[0023] , wherein the viral vector is a recombinant adeno-associated virus (rAAV) .

[0025] A composition for the treatment of spinal muscular atrophy comprising the viral vector of any one of

[0022] to

[0024] .

[0026] The composition of

[0025] , wherein the composition is a pharmaceutical composition further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.

[0027] The composition of any one of

[0025] to

[0026] , wherein the composition is administered via intravenous injection.

[0028] A method for treating spinal muscular atrophy in a subject, comprising administration of the composition of any one of

[0025] to

[0027] to the subject.

[0029] A method for treating spinal muscular atrophy in a subject, comprising administering therapeutically effective amount of the composition of any one of

[0025] to

[0027] to the subject.

[0030] The method of any one of

[0028] to

[0029] , wherein the composition is administered via intravenous injection.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGSSome embodiments of this disclosure are herein described, by way of example only, with reference to the accompanying drawings. With specific reference now to the drawings in detail, it is stressed that the particulars shown are by way of example and for purposes of illustrative discussion of embodiments of this disclosure. In this regard, the description taken with the drawings makes apparent to those skilled in the art how embodiments of this disclosure may be practiced.FIG. 1 shows the effect of codon-optimization of hSMN1 gene on the SMN protein expression level in cells. Fig. 1A shows the comparison of SMN protein expression level from HEK293T cells transfected with pdsAAV-CB-EGFP, pdsAAV-CB-SMN1, pdsAAV-CB-coSMN1, and untreated cells. Fig. 1B shows the comparison of SMN protein expression level from U-87 MG cells infected with scAAV9-EGFP, scAAV9-SMN1, scAAV9-coSMN1, and untreated cells. Fig. 1C shows the comparison of “gems” formation from U-87 MG cells infected with scAAV9-EGFP, scAAV9-SMN1, scAAV9-coSMN1, and untreated cells, wherein DAPI and SMN respectively represents the stained DAPI antibody or the stained SMN antibody, Merge represents the picture of these two antibodies put together, and Zoom is the enlarged picture of the representative area.FIG. 2 shows the comparison of the phenotype from untreated SMNΔ7 mice and SMNΔ7 mice treated with scAAV9-SMN1 and scAAV9-coSMN1.FIG. 3 shows the comparison of motor functions (surface righting, hindlimb suspension, and negative geotaxis) from wild type mice, untreated SMNΔ7 mice and SMNΔ7 mice treated with scAAV9-SMN1 and scAAV9-coSMN1.FIG. 4 shows the comparison of the number of motor neurons in cervical and lumbar spinal cord from wild type mice, untreated SMNΔ7 mice and SMNΔ7 mice treated with scAAV9-SMN1 and scAAV9-coSMN1.FIG. 5 shows the comparison of survival time from untreated SMNΔ7 mice and SMNΔ7 mice treated with scAAV9-SMN1 and scAAV9-coSMN1.FIG. 6 shows the comparison of in vivo luminescence imaging of neonatal mice injected with rAAV9 vector at different ages.FIG. 7 shows the comparison of rAAV9-specific IgG antibody concentration produced by injecting rAAV9 vector in the neonatal mice of different ages.FIG. 8 shows the comparison of rAAV9-specific neutralizing antibody concentration produced by injecting rAAV9 vector in the neonatal mice of different ages.FIG. 9 shows the comparison of the phenotype from SMA mice injected with PBS, one-dose of scAAV9-coSMN1, and two-doses of scAAV9-coSMN1.FIG. 10 shows the comparison of the number of motor neurons in cervical and lumbar spinal cord from SMA mice injected with PBS, one-dose of scAAV9-coSMN1, and two-doses of scAAV9-coSMN1.FIG. 11 shows the comparison of survival time from SMA mice injected with PBS, one-dose of scAAV9-coSMN1, and two-doses of scAAV9-coSMN1.DETAILED DESCRIPTIONIt is to be appreciated that certain aspects, modes, embodiments, variations and features of the present disclosure are described below in various levels of detail in order to provide a substantial understanding of the present technology.In the first aspect, the present invention relates to improved methods for the treatment of genetic disorders involving the re-administration of adeno-associated virus (AAV) -based gene therapy.In one embodiment, the present invention provides a method for treating genetic disorders in a subject, comprising the initial administration of an adeno-associated virus (AAV) -based gene therapy shortly after the birth of said subject, followed by the re-administration of an AAV-based gene therapy.As used herein, the term “treatment” , or “treating” is defined as the application or administration of a therapeutic agent to a patient, or application or administration of a therapeutic agent to an isolated tissue or cell line from a patient, who has a disorder with the purpose to cure, heal, alleviate, relieve, alter, remedy, ameliorate, improve or affect the disease or disorder, or symptoms of the disease or disorder. The term “treatment” or “treating” is also used herein in the context of administering agents prophylactically.As used herein, the term “genetic disorder” is defined as a disease caused by genetic abnormalities.In certain embodiments, the genetic disorder is spinal muscular atrophy (SMA) , which is a genetic disorder characterized by the loss of spinal motor neurons in the anterior horn of the spinal cord, resulting in atrophy of the voluntary muscles of the limbs and trunk. The molecular basis of SMA is the loss of both copies of survival motor neuron gene 1 (SMN1) , which encodes a protein that is part of a multi-protein complex thought to be involved in snRNP biogenesis and recycling.The clinical spectrum of SMA disorders has been divided into the following five groups:1) Type 0 SMA (In Utero SMA) begins before birth. Usually, the first symptom of Type 0 SMA is reduced movement of the fetus that can first be observed between 30 and 36 weeks of pregnancy. After birth, these newborns have little movement and have difficulties with swallowing and breathing.2) Type I SMA (Infantile SMA or Werdnig-Hoffmann disease) presents symptoms between 0 and 6 months. Patients never achieve the ability to sit, and death usually occurs within the first 2 years without ventilatory support.3) Type II SMA (Intermediate SMA) has an age of onset at 7-18 months. Patients achieve the ability to sit unsupported, but never stand or walk unaided. Prognosis in this group is largely dependent on the degree of respiratory involvement.4) Type III SMA (Juvenile SMA or Kugelberg-Welander disease) is generally diagnosed after 18 months. Type 3 SMA individuals are able to walk independently at some point during their disease course but often become wheelchair-bound during youth or adulthood.5) Type IV SMA (Adult onset SMA) . Weakness usually begins in late adolescence in the tongue, hands, or feet, then progresses to other areas of the body. The course of adult SMA is much slower and has little or no impact on lifc expectancy.All the forms of spinal muscular atrophy are accompanied by progressive muscle weakness and atrophy subsequent to the degeneration of the neurons from the anterior horn of the spinal cord.In certain embodiments, the genetic disorder is Type 0, Type I, Type II, Type III, or Type IV spinal muscular atrophy (SMA) . In certain embodiments, the genetic disorder is Type I spinal muscular atrophy (SMA) .The treatment of spinal muscular atrophy (SMA) includes one or more of the following effects: (i) reduction or amelioration of the severity of SMA; (ii) delay of the onset of SMA; (iii) inhibition of the progression of SMA; (iv) reduction of hospitalization of a subject; (v) reduction of hospitalization length for a subject; (vi) increase of the survival of a subject; (vii) improvement of the quality of life of a subject; (viii) reduction of the number of symptoms associated with SMA; (ix) reduction of or amelioration of the severity of one or more symptoms associated with SMA; (x) reduction of the duration of a symptom associated with SMA; (xi) prevention of the recurrence of a symptom associated with SMA; (xii) inhibition of the development or onset of a symptom of SMA; and / or (xiii) inhibition of the progression of a symptom associated with SMA. More particular, “treating SMA” denotes one or more of the following beneficial effects: (i) improvement of the phenotype such as the body size and weight; (ii) an increase in motor function; and / or (iii) increase of the survival of a subject.As used herein, the term “gene therapy” refers to a method of changing the expression of an endogenous gene by exogenous administration of a gene, i.e., a wild-type or modified SMN1 gene. As used herein, gene therapy also refers to the replacement of a defective SMN1 gene, or replacement of a missing SMN1 gene, by introducing a functional gene or portion of a gene corresponding to the defective or missing SMN1 gene into somatic or stem cells of an individual in need. Gene therapy can be accomplished by “ex vivo” methods, in which differentiated or somatic stem cells are removed from the individual′s body followed by the introduction of a normal copy of the defective gene into the explanted cells using a viral vector as the gene delivery vehicle. In addition, in vivo transfer involves direct gene transfer into cells in the individual in situ using a broad range of viral vectors (e.g., AAV) , liposomes, nanoparticles, protein: DNA complexes, modified nucleic acids or naked DNA in order to achieve a therapeutic outcome.As used herein, the term “adeno-associated viruses (AAVs) ” refer to small replication-deficient adenovirus-dependent viruses from the Parvoviridae family. They have an icosaedrical capsid of 20-25 nm in diameter and a genome of 4.8 kb flanked by two inverted terminal repeats (ITRs) . After uncoating in a host cell, the AAV genome can persist in a stable episome state by forming high molecular weight head-to-tail circular concatemers, or can integrate into the host cell genome. Both scenarios provide long-term and high-level transgene expression.Adeno-associated virus (AAV) is considered as one of the most promising viral vectors for human gene therapy. AAV has the ability to efficiently infect dividing as well as non-dividing human cells. The wild-type AAV viral genome integrates into a single chromosomal site in the host cell′s genome, and most importantly, even though AAV is present in many humans it has not been associated with any disease. Recombinant adeno-associated viruses are derived from wild-type adeno-associated viruses, and wild-type genes can be removed from viral sequences by using molecular methods and replaced with non-natural nucleic acids such as reporter transgenes. The introduction of non-natural sequences, such as reporting transgenes, therefore defines a viral vector as a “recombinant” vector, which in the case of AAV may be referred to as “rAAV” . As used herein, the terms “recombinant adeno-associated virus” , “recombinant adeno-associated virus vector” , “rAAV” , or “recombinant AAV virus” are generally interchangeable.As used herein, the term “transgene” is used to refer to a non-native nucleic acid with respect to the AAV nucleic acid sequence. It is used to refer to a polynucleotide that can be introduced into a cell or organism. Transgenes include any polynucleotide, such as a gene that encodes a polypeptide or protein, a polynucleotide that is transcribed into an inhibitory polynucleotide, or a polynucleotide that is not transcribed (e.g., lacks an expression control element, such as a promoter that drives transcription) . A transgene is preferably inserted between inverted terminal repeat (ITR) sequences. A transgene may also be an expression construct comprising an expression regulatory element such as a promoter or transcription regulatory sequence operably linked to a coding sequence and a 3′ termination sequence.As used herein, the term “administering” is meant to refer to a means of providing the composition to the subject in a manner that results in the composition being inside the subject′s body. Such an administration can be by any route including, without limitation, subcutaneous, intradermal, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal, sublingual, buccal, and intramuscular.In certain embodiments, the administration of an rAAV-based gene therapy is by injection (e.g., via intravenous injection, direct injection to the CNS, or any other suitable route) . In certain embodiments, the administration of a recombinant SMN1 gene (e.g., in an rAAV) for treating SMA is by injection (e.g., via intravenous injection, direct injection to the CNS, or any other suitable route) . In certain embodiments, both the initial administration and the re-administration are conducted via intravenous injection.In certain embodiments, the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on the day selected from the group consisting of postnatal day 1 to postnatal day 13. In further embodiments, the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 1. In further embodiments, the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 2. In further embodiments, the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 3. In further embodiments, the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 4. In further embodiments, the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 5. In further embodiments, the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 6. In further embodiments, the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 7. In further embodiments, the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 8. In further embodiments, the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 9. In further embodiments, the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 10. In further embodiments, the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 11. In further embodiments, the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 12. In further embodiments, the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 13. In weaning period, 1 mice day = 6.43 human days (see Dutta, Sulagna, and Pallav Sengupta. "Men and mice: relating their ages. " Life sciences 152 (2016) : 244-248. ) .The timing of the re-administration is not specifically limited and can be determined by factors including the level of expression necessary to obtain the therapeutic effect. In some embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs at any appropriate time. In certain embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 14 or later. In certain embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 30 or later. In further embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 60 or later. In further embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 90 or later. In further embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 120 or later. In further embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 150 or later. In further embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs on postnatal day 200 or later. In further embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs in postnatal year 1 or later. In further embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs in postnatal year 2 or later. In further embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs in postnatal year 3 or later. In further embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs in postnatal year 4 or later. In further embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs in postnatal year 6 or later. In further embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs in postnatal year 8 or later. In further embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs in postnatal year 10 or later. In further embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs in postnatal year 20 or later. In further embodiments, the re-administration of the AAV-based gene therapy occurs in postnatal year 30 or later. In entire lifespans, 1 mice day = 40 human days (see Dutta, Sulagna, and Pallav Sengupta. 2016) .In certain embodiments, the adeno-associated virus (AAV) -based gene therapies for the initial administration and the re-administration are different. In certain embodiments, the adeno-associated virus (AAV) -based gene therapies for the initial administration and the re-administration are of different serotype. In certain embodiments, the adeno-associated virus (AAV) -based gene therapies for the initial administration and the re-administration are of same serotype. In certain embodiments, the adeno-associated virus (AAV) -based gene therapies for the initial administration and the re-administration are same.As used herein, the term “serotype” refers to a distinct variant within a species of virus that is determined based on the viral cell surface antigens.In the methods disclosed herein, AAV of any serotype can be used. The serotype of the viral vector used in certain embodiments of the invention is selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrhl0, and others. Other serotype besides those listed herein are also contemplated. In certain embodiments, AAV9 is used. The herein disclosed compositions and methods may also use AAV chimeric vectors, whereby portions of AAV are fused with other similar vectors, such as Adenovirus.As used herein, the term “subject” refers to a mammal. Mammals include, but are not limited to, domesticated animals (e.g., cows, sheep, cats, dogs, and horses) , primates (e.g., humans and non-human primates such as monkeys) , rabbits, and rodents (e.g., mice and rats) .In certain embodiments, the subject is a human. In a particular embodiment of the invention the subject is a human with spinal muscular atrophy (SMA) . In another specific embodiment, the subject is a human with Type I SMA.In certain embodiments, the AAV-based gene therapy is an rAAV vector. In certain embodiments, the AAV-based gene therapy is an rAAV9 vector.The amount of the rAAV vector of the invention which will be effective in the treatment of genetic disorders such as SMA is not specifically limited and can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vivo and / or in vitro assays may optionally be employed to help predict optimal dosage ranges. The dosage of the rAAV vector of the invention administered to the subject in need thereof will vary based on several factors including, without limitation, the specific type or stage of the disease treated, the subject′s age or the level of expression necessary to obtain the therapeutic effect. One skilled in the art can readily determine, based on its knowledge in this field, the dosage range required based on these factors and others.In certain embodiments, the amount of the rAAV vector in the initial administration is lower than the amount of the rAAV vector in the re-administration. In certain embodiments, the amount of the rAAV vector in the initial administration is equal to the amount of the rAAV vector in the re-administration. In certain embodiments, the amount of the rAAV vector in the initial administration is higher than the amount of the rAAV vector in the re-administration.In certain embodiments, the AAV-based gene therapy is an rAAV vector comprising an hSMN1 gene. In further embodiments, the hSMN1 gene is a codon-optimized hSMN1 gene comprising the nucleotide sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 1. In further embodiments, the hSMN1 gene is a codon-optimized hSMN1 gene comprising or consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.Codon optimization is a technique that facilitates improved heterologous gene expression in a host cell by virtue of changing individual codons to synonymous codons that are more frequently used in a host or reference species, i.e. the species of the host cell. Different methods for optimizing codon have been described. These include methods in which the most common codon for a given amino acid in reference species is used at all positions in the heterologous gene, i.e. each given amino acid in the optimized sequence is encoded by a single codon which is the codon most commonly used for the given amino acid in the reference species. Thus, in the final sequence of the optimized gene the number of codons used equals the number of amino acids in that sequence. In another method, instead of applying the same “most common” codon at all positions throughout the sequence of the heterologous gene, the codons in the heterologous gene are modified so that the frequency of codon usage across all codons for each amino acid in the heterologous gene is the same that in the reference species. For example, if proline (Pro) is encoded by codons at the following frequencies in a reference species: CCU (10%) , CCC (30%) , CCA (10%) and CCG (50%) ; but at different frequencies in the species from which the heterologous gene is derived, then the sequence of the heterologous gene is modified so that the codons encoding Pro are present at the same frequencies as the reference species, i.e. CCU (10%) , CCC (30%) , CCA (10%) and CCG (50%) .In the second aspect, the present invention provides an isolated nucleic acid encoding a codon-optimized hSMN1 gene which comprises the nucleotide sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 1. In a preferred embodiment, the codon-optimized hSMN1 gene comprises or consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.Nucleotide sequences encoding the human SMN1 are known in the art. See, e.g., GenBank Accession Nos. NM_001297715.1; NM_000344.3; NM_022874.2, DQ894095, NM_000344, NM_022874, and BC062723 for non-limiting examples of nucleotide sequences of human SMN1. A non-limiting example of an amino acid sequence for wild-type human SMN protein is provided in UniProtKB / Swiss-Prot: Q16637.1.As used herein, a monomeric unit of DNA or RNA consisting of a sugar moiety (pentose) , a phosphate, and a nitrogenous heterocyclic base. The base is linked to the sugar moiety via the glycosidic carbon (1′ carbon of the pentose) and that combination of base and sugar is a nucleoside. When the nucleoside contains a phosphate group bonded to the 3′ or 5′ position of the pentose it is referred to as a nucleotide. A sequence of operatively linked nucleotides is typically referred to herein as a “base sequence” or “nucleotide sequence” , and is represented herein by a formula whose left to right orientation is in the conventional direction of 5′-terminus to 3′-terminus.As used herein, the term “identity” or “identical” refers to the overall relatedness between polymeric molecules, e.g., between nucleic acid molecules (e.g., DNA molecules and / or RNA molecules) and / or between polypeptide molecules. In some embodiments, polymeric molecules are considered to be “substantially identical” to one another if their sequences are at least 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99%identical. Calculation of the percent identity of two nucleic acid or polypeptide sequences, for example, can be performed by aligning the two sequences for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second sequences for optimal alignment and non-identical sequences can be disregarded for comparison purposes) . In certain embodiments, the length of a sequence aligned for comparison purposes is at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or substantially 100%of the length of a reference sequence. The nucleotides at corresponding positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same residue (e.g., nucleotide or amino acid) as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which needs to be introduced for optimal alignment of the two sequences.Whether any two polynucleotide or polypeptide sequences have an identity can be determined using computer algorithms known in the art (e.g., “FASTA” program using default parameters disclosed by Pearson et al. (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444] ) . For example, identity may be determined using BLAST from the National Center for Biotechnology Information database or ClustalW.In the third aspect, the present invention provides a viral vector comprising the isolated nucleic acid as described above.As used herein, the term “viral vector” refers to a synthetic or artificial viral particle in which an expression cassette containing a gene of interest is packaged in a viral capsid or envelope, where any viral genomic sequences also packaged within the viral capsid or envelope are replication-deficient; i.e., they cannot generate progeny virions but retain the ability to infect target cells.As used herein, an “expression cassette” refers to a nucleic acid molecule which comprises the hSMN1 sequence operably linked to a promoter, and may include other regulatory sequences. In some aspects, the expression cassette is packaged into the capsid of a viral vector (e.g., a viral particle) . Typically, such an expression cassette for generating a viral vector contains an hSMN1 sequence described herein flanked by packaging signals of the viral genome and other expression control sequences such as those described herein. For example, for an AAV viral vector, the packaging signals are the 5′inverted terminal repeat (ITR) and the 3′ ITR. When packaged into the AAV capsid, the ITRs in conjunction with the expression cassette, are referred to herein as the “recombinant AAV (rAAV) genome” or “vector genome” within an rAAV particle or capsid.The term “expression” is used herein in its broadest meaning and comprises the production of RNA or of RNA and protein. Expression may be transient or may be stable.In certain embodiments, the genome of the viral vector does not include genes encoding the enzymes required to replicate (the genome can be engineered to be “gutless” -containing only the transgene of interest flanked by the signals required for amplification and packaging of the artificial genome) , but these genes may be supplied during production. Therefore, it is deemed safe for use in gene therapy since replication and infection by progeny virions cannot occur except in the presence of the viral enzyme required for replication.In certain embodiments, the viral vector may be a retrovirus, a lentivirus, a poxvirus, an adenovirus, or an adeno-associated virus (rAAV) . In further embodiments, the viral vector is a recombinant adeno-associated virus (rAAV) .In the fourth aspect, the present invention provides a composition for the treatment of spinal muscular atrophy comprising the viral vector as described above.Any of the compositions described herein can be pharmaceutical compositions further comprising a pharmaceutically acceptable carrier. A pharmaceutical acceptable carrier, as used herein, refers to a carrier that is compatible with the active ingredient and / or gene therapy agent (e.g., the rAAV) of the composition (and preferably, capable of stabilizing the active ingredient) and not deleterious to the subject to be administered. Pharmaceutically acceptable carriers can be any suitable pharmaceutically acceptable carrier known in the art including, but not limited to, excipients, buffers, one or more suitable salts, surface-active agents, antioxidants, etc.In certain embodiments, a composition comprising the viral vector as described above is administered to the subject via any suitable route, e.g., via injection, infusion, or via other suitable technique. In certain embodiments, the composition is administered via intravenous injection.Compositions to be used in the present methods can comprise pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or stabilizers in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions.Compositions to be used for in vivo administration may be sterile. This can be accomplished by any means known in the art including, but not limited to, filtration through sterile filtration membranes.Compositions described herein can be in suitable unit dosage forms known in the art such as, but not limited to tablets, pills, capsules, powders, granules, solutions or suspensions, or suppositories.In the fifth aspect, the present invention provides a method for treating for treating spinal muscular atrophy in a subject, comprising administration of the composition as described above to the subject.In certain embodiments, the method for treating for treating spinal muscular atrophy in a subject, comprises administering therapeutically effective amount of the composition as described above to the subject.The therapeutically effective amount of the composition as described above depends on the disease or condition to be treated and may be determined by the persons skilled in the art. For example, an “therapeutically effective amount” may be measured by its ability to stabilize the progression of disease.In certain embodiments, the administration of the composition as described above can be conducted via any suitable route, e.g., via injection, infusion, or via other suitable technique. In certain embodiments, the composition is administered via intravenous injection.Reference throughout this specification to “one embodiment” , “another embodiment” , “a preferred embodiment (s) ” , “some embodiments” , or “a certain embodiment (s) ” , means that a particular feature, structure or characteristic described in connection with the embodiment (s) is included in at least one or more embodiments of the present disclosure. Also, the particular feature (s) , structure (s) , or characteristic (s) in one embodiment may be combined with those in one or more other embodiments in any suitable manner.The present disclosure illustratively described herein suitably may be practiced in the absence of any element or elements, limitation or limitations that are not specifically disclosed herein. As used herein, the term “comprising” is intended to mean that the compositions and methods include the recited elements, but not excluding others. “Consisting essentially of” when used to define compositions and methods, shall mean excluding other elements of any essential significance to the composition or method. “Consisting of” shall mean excluding more than trace elements of other ingredients for claimed compositions and substantial method steps. Embodiments defined by each of these transition terms are within the scope of this disclosure. Accordingly, it is intended that the methods and compositions can include additional steps and components (comprising) or alternatively including steps and compositions of no significance (consisting essentially of) or alternatively, intending only the stated method steps or compositions (consisting of) . Further, in each instance herein any of the terms “comprising” , “consisting essentially of” , and “consisting of” , may be replaced with either of the other two terms.It is to be understood that the present disclosure is not limited to particular uses, methods, reagents, compounds, compositions or biological systems, which can, of course, vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to be limiting.Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the meaning commonly understood by a person skilled in the art to which this disclosure belongs. However, for convenience and completeness, particular terms and their meanings are set forth below and throughout the specification.As used in this specification and the appended claims, the singular forms “a” , “an” , and “the” include plural references unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, refcrences to “the method” includes one or more methods, and / or steps of the type described herein and / or which will become apparent to those persons skilled in the art upon reading this disclosure and so forth.The term “about” or “approximately” means within a statistically meaningful range of a value. Such a range can be within an order of magnitude, typically within 20%, more typically still within 10%, and even more typically within 5%of a given value or range. The allowable variation encompassed by the term “about” or “approximately” depends on the particular system under study, and can be readily appreciated by one of ordinary skill in the art. Whenever a range is recited within this application, every whole number integer within the range is also contemplated as an embodiment of the present disclosure.As used herein, the term "substantially" or "essentially" refers to a quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length that is about or at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%or higher compared to a reference quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length. In some embodiments, the terms "essentially the same" or "substantially the same" refer a range of quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length that is about the same as a reference quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length.EXAMPLESThe following examples demonstrate some embodiments of the present invention. However, it is to be understood that these examples are for illustration only and do not purport to be wholly definitive as to conditions and scope of this invention.Furthermore, the following examples were carried out using standard techniques, which are well known and routine to those of skill in the art, except where otherwise described in detail. As noted above, the following examples are presented for illustrative purpose, and should not be construed in any way limiting the scope of this invention.Example 1Evaluation of the therapeutic effect of codon-optimized hSMN1 gene on the type I SMA diseaseStep 1Detection of the effect of codon-optimization of hSMN1 gene on the SMN protein expression level in cellsFirstly, in the preparation of plasmids, hSMN1 gene was codon-optimized, taking into consideration the factors such as the codon bias of hSMN1 gene in the host for expression, the GC content, the secondary structure of RNA, the CpG island, the cryptic splicing site and the negative regulatory element, and the resulting sequence was shown below,Plasmid pdsAAV-CB-EGFP was a gift from DONG Biao′s Lab, and was used as a control. Plasmids pdsAAV-CB-SMN1 and pdsAAV-CB-coSMN1 were constructed via the following protocol.Fragments SMN1 and coSMN1 were obtained from the cDNA of HEK293 (CRL-1573, ATCC) and a synthetic plasmid containing coSMN1 fragment (General Biosystems (Anhui) Co., Ltd. ) via PCR, respectively. The nucleotide sequence of the fragment SMN1 is shown below,Both the resulted fragments were inserted into the AgeI and SacI sites of pdsAAV-CB-EGFP respectively by using two restriction enzymes AgeI and EcoRV, wherein the 3′ overhangs of SacI sites were removed by T4 polymerase (New England Biolabs) . All the restriction enzymes used were commercially available from NEB.Then, plasmids pdsAAV-CB-EGFP (plasmid control group) , pdsAAV-CB-SMN1 and pdsAAV-CB-coSMN1 were transfected into HEK293T cells (CRL-3216, ATCC) with PolyJet transfection reagent (SignaGen Laboratories, Catalog No.: SL100688) , respectively. Un-transfected cells were used as controls. Three replicates were conducted for each treatment and control. Cells were collected 24 h after transfection to extract total protein. The SMN protein expression level was then detected by Western blot. The results showed that the SMN protein level was increased about 2-fold in cells transfected with the codon-optimized plasmid, as compared with the transfection of a wild-type plasmid (Figure 1A) .Subsequently, to further verify the effect of the codon optimization, rAAVs containing various plasmids (scAAV9-EGFP (control group) , scAAV9-SMN1, and scAAV9-coSMN1) were prepared using a three-plasmid packaging method. In brief, HEK293 cells (CRL-1573, ATCC) were co-transfected by AAV helper plasmid pRC (agift from DONG Biao′s Lab) (containing AAV9 Cap and AAV2 Rep) , Ad helper plasmid pAd (agift from DONG Biao′sLab) and plasmid containing target genes (pdsAAV-CB-EGFP, pdsAAV-CB-SMN1, or pdsAAV-CB-coSMN1) . The cells were collected 72 hours after transfection. Then, the rAAVs were purified via twice cesium chloride (Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Catalog No.: A620054) density gradient centrifugation and dialyzed for future use.Next, U-87 MG cells (HTB-14, ATCC) were infected with the rAAVs containing various plasmids (scAAV9-EGFP (control group) , scAAV9-SMN1, and scAAV9-coSMN1) at an MOI of 75,000, and the SMN protein expression level was detected by Western blot or Immunofluorescence 48 h after infection. Results from Western blot showed that there was a small increase in SMN protein level in cells infected with scAAV9-SMN1 compared to untreated cells or scAAV9-EGFP-infected cells, whereas the SMN protein level were significantly elevated in cells infected with scAAV9-coSMN1 (Figure 1B) . Similarly, immunofluorescence results also showed that the number of “gems” was significantly increased in the nuclei of cells infected with scAAV9-coSMN1 compared to untreated cells and scAAV9-SMN1-infected cells (Fig. 1C) .In summary, the codon-optimized therapeutic gene hSMN1 can not only increase the SMN protein expression levels in cells, but also form more “gems” in the nucleus, which lays the foundation for the treatment of SMA disease.Step 2Evaluation of the therapeutic effect of codon-optimized hSMN1 gene on the type I SMA miceNon-codon-optimized scAAV9-SMN1 and codon-optimized scAAV9-coSMN1 (5×10^10 vg per mice) was injected into the type I SMA mice (SMNΔ7) model (The Jackson Laboratory, #005025) on postnatal day 1 (PND1) with facial vein injection. The effectiveness of codon optimization of the hSMN1 gene in treating type I SMA mice was explored by monitoring the parameters such as mice phenotypes, motor functions, motor neuron changes, and survival curves.In order to monitor the motor functions, a test for the righting reflex was conducted on a mouse of postnatal day 2 to 21 to assess the motor ability for the mouse to flip onto its feet from a supine position. In brief, a mouse was placed on its back on a tabletop and kept still for 5 second. Then, the mouse was released and the time taken for it to right itself through 180° was recorded. The mouse failed to pass the test ifit did not right itself through 180° in 30 second, and the time was recorded as 30 second. The test was repeated in triplicate. Further, a hindlimb suspension test was conducted on a mouse of postnatal day 4 to 21 to evaluate the mice’s hindlimb strength. In brief, a 50 ml centrifuge tube padded with cotton to one-third location was used and placed on a centrifuge tube rack. The mouse was placed gently face down into the tube with its hind legs hung over the rim. Then the mouse was released and the hindlimb posture was observed and scored. The test was repeated in triplicate. In addition, a negative geotaxis test was conducted on a mouse of postnatal day 4 to 21 to assess the motor coordination. In brief, the mouse was placed face down on a 45° inclined plane and kept still for 5 second. Then, the mouse was released and the time to rotate 180° was recorded. The mouse failed to pass the test if it did not rotate 180° in 2 minutes. The test was repeated in triplicate.Firstly, phenotypic results showed that the body size and weight of SMA mice treated with rAAV carrying codon-optimized hSMN1 gene were significantly larger than those of SMA mice treated with rAAV carrying non-codon-optimized hSMN1 gene (Figure 2) . Secondly, compared with the motor function of untreated SMA mice, the motor function of SMA mice treated with rAAV (scAAV9-SMN1 or scAAV9-coSMN1) were both somewhat recovered, and the SMA mice treated with rAAV carrying codon-optimized hSMN1 gene showed significantly better recovery (Figure 3) . In addition, Nissl staining also showed that the motor neurons in the cervical and lumbar enlargements of the spinal cord were significantly increased in the SMA mice treated with rAAV carrying codon-optimized hSMN1 gene than rAAV carrying non-codon-optimized hSMN1 gene at day 11 after the treatment (Figure 4) . Moreover, the Kaplan-Meier survival curve showed that the average lifespan of untreated SMNΔ7 mice was 15.7 ± 2.5 days (Median survival = 15.5 d) , SMNΔ7 mice treated with scAAV9-SMN1 was 26.1 ± 4.0 days (Median survival = 25 d) , and SMNΔ7 mice treated with scAAV9-coSMN1 was extended to 52.1 ± 25.7 days (Median survival = 51.5 d) , with the longest survival time extended to 101 days (Figure 5) .The above results indicate that codon optimization of the hSMN1 gene could significantly improve the phenotype, motor function, motor neurons, and survival time of SMA mice.Example 2Exploration of the re-administration of rAAV9 in neonatal miceStep 1rAAV injections in miceFirstly, rAAV9-Antares (5×10^10 vg per mice) or PBS was injected into the wild-type neonatal mice (WT) at different ages (postnatal days 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, and 14) by facial vein injection or tail vein injection. The rAAV9-Antares was prepared according to the protocol as described in Step 1 of Example 1.Secondly, on day 30 after the first injection, mice were given a secondary injection of rAAV9-Luciferase (5 × 10^11 vg per mice) using tail vein injection. Both Antares and Luciferase can be used for in vivo imaging assays without interfering with each other. The rAAV9-Luciferase was prepared according to the protocol as described in Step 1 of Example 1.Step 2Detection of the fluorescence expressionFour weeks after the first injection (rAAV9-Antares) , and 2, 4, 6, 8 weeks after the second injection (rAAV9-Luciferase) , each group of mice to be imaged was injected with the corresponding Antares substrate (Diphenylterazine (DTZ) , MCE, Catalog No.: HY-111382) (0.3 μmol per mice) or Luciferase substrate (D-Luciferin, Biovision, Catalog No.: 7902-1G) (15 mg / g) by intraperitoneal injection, and then placed into an anesthesia box containing isoflurane. After completely anesthetized (about 5 min) , the mice were transferred to the In Vivo Imager, and each mouse was kept anesthetized by aligning its mouth and nose with the isoflurane outlet. Finally, the imaging parameters of the In Vivo Imager were set, and the imaging was started at the time point of 15 min from the Antares substrate injection or 10 min from the Luciferase substrate injection in order to detect the expression of Antares or Luciferase in the mice. The results showed that Antares expression could be successfully detected in all mice firstly injected with rAAV9-Antares, but long-term expression of Luciferase was detected only in mice that underwent the first injection on postnatal day 1 and day 2 (Figure 6) .Step 3Detection of rAAV9-specific binding antibody (IgG)Subsequently, blood was collected via the retroorbital venous plexus using capillary tubes at 3, 7, 14, 21, 28 days after primary injection of rAAV9-Antares (5×10^10 vg per mice) , and 3, 7, 14, 21, 28, 42, 56 days after secondary injection of rAAV9-Luciferase (5×10^11 vg per mice) . After standing for 2 h at room temperature, the blood was centrifuged at 4,000 rpm for 30 min at 4℃, and the supernatant was collected and stored at -80℃ for further use. Next, ELISA plates (Corning, Catalog No.: 42592) were coated with 1 ×10^10 particles of rAAV9-empty each well in carbonate buffer (15 mM sodium carbonate, 35 mM sodium bicarbonate [pH 9.6] ) overnight at chromatography cabinet (Shanghai Tianfeng Industrial Company, Catalog No.: TF-CX-2) , and the IgG standard (Beijing Bersee Technology Co., Ltd., Catalog No.: B1102) was used to generate standard curve for estimating rAAV9-specific IgG concentrations in serum samples. The rAAV9-empty was prepared according to the protocol as described in Step 1 of Example 1 with the exception that no plasmid containing target genes was used for cotransfection. The next day, ELISA plates were taken out from the chromatography cabinet and patted dry with absorbent paper. After three times washes with PBS buffer (dried powder commercially available from Beijing Bersee Technology Co., Ltd., Catalog No.: PM5090) containing 0.05%Tween-20 (Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Catalog No.: A600560) (PBST) (300 μL / well, 5 min for each wash, and the same for subsequent cleaning of ELISA plates) , the plates were blocked with 5%BSA solution (Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Catalog No.: A600332) (300 μL / well) at room temperature for 90 min. After blocking and washing the ELISA plates, serum samples were diluted (100-fold dilution) and added to the washed ELISA plates (100 μL / well) . After incubation at room temperature for 90 min, the ELISA plates were washed and 100 μL of diluted secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG-HRP, 1: 5,000, Abbkine Scientific Co., Ltd, Catalog No.: A21010) was added to each well. The plates were then incubated for 90 min at room temperature. 100 μL of TMB substrate (SeraCare, Catalog No.: 5120-0074) was added to each well for color development after three washes. After 3 min, the reaction was stopped with 1 M hydrochloric acid (100 μL / well) . Finally, the ELISA plates were placed in a multifunctional microplate reader (Bio-Tek, Cytation 3) to detect the absorbance at 450 nm and 630 nm (background value) , and the rAAV9-specific IgG antibody concentration was estimated according to the IgG standard curve. It was found that different levels of IgG antibodies could be detected in the serum samples of neonatal mice at different ages after the first injection of ssAAV9-Antares, but the IgG antibody concentration in neonatal mice of PND1 and PND2 was extremely low (＜ 0.5 μg / mL) (Figure 7) .Step 4Detection of rAAV9-specific neutralizing antibody (NAb)Next, the rAAV9-specific neutralizing antibody (NAb) concentration contained in mouse serum was detected using AAVR-HeLa cells (agift from DONG Biao′s Lab, see section “Materials and Methods” in ZHENG Zhaoyue et. al., Enhanced sensitivity of neutralizing antibody detection for different AAV serotypes using HeLa cells with overexpressed AAVR, Front Pharmacol, doi: 10.3389 / fphar. 2023. 1188290 for the construction of a stable cell line) , which are more sensitive to detection rAAV9-specific NAbs. Firstly, AAVR-HeLa cells (1×10^4 / well) were seeded in 96-well plates and incubated in an incubator at 37℃ with 5%CO2 for 24 h. Secondly, 40 μL of diluted serum samples (4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, and 1024-fold dilution) were mixed with equal volumes of diluted rAAV9-Lucifcrase (MOI= 100,000) , and incubated for 1 h at 37℃. 20 μL of the mixture was then respectively added to the pre-plated cells (in triplicate) in each group, and incubated for 48 h at 37℃ with 5%CO2. After the medium was removed from the wells of the plates, pre-cooled PBS buffer (200 μL / well) was added to wash the cells. Subsequently, 100 μL of cell lysis buffer (contained in the Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit, Beyotime Biotechnology, Catalog No.: RG006) was added to each well and the cells were lysed at 37℃ for 7 min. After the cells were fully lysed, the cells were centrifuged at 5,600 rpm at 4℃ for 20 min and the supernatant was collected. Finally, after 30 μL of the supernatant was added to the luciferase assay plate (Shanghai WHB Scientific Co., Ltd., WHB-96-01) , the plate was placed to a multifunctional microplate reader (Bio-Tek, Cytation 3) at 37℃. Then, 30 μL of cellular Luciferase substrate (contained in the Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit, Beyotime Biotechnology, Catalog No.: RG006) was added using a multi-channel pipette (commercially available from Fisherbrand) , and the fluorescence intensity was measured at a gain value of 240. The results showed that the NAb concentration contained in mice injected with a first dose of rAAV within the first 3 days after birth was below the lower limit of detection (below 1: 4) , consistent with the results of a first injection of PBS, but the NAb concentration in neonatal mice injected thereafter gradually increased with age (Figure 8) .Example 3Evaluation of the therapeutic effect of re-administration of rAAV on the type 1 SMA mice modelStep 1Preparation of rAAVFirstly, HEK293 cells (CRL-1573, ATCC) were counted using a cell counter (Countstar, Catalog No.: IC1000) and evenly distributed into 2 L roller bottles (Corning, Catalog No.: 430849) . Then the cells were cultured in a roller bottle system (Crystal Technology &Industries, Inc., Catalog No.: CGIII-30-F) at 37℃ and 5%CO2 until the cell density reaches to 80%, and transfected with the calcium phosphate transfection reagent. After 6-8 h of transfection, the medium in the roller bottles was replaced with fresh serum-free DMEM medium (Gibco, Catalog No.: C11995500BT) for continued culture of 72 h. Secondly, the transfected cell suspension was transferred into a centrifuge flask (ThermoFisher, Catalog No.: 3141-0500) and centrifuged at 2,000 rpm for 20 min to collect the cells. Next, the cells were resuspended using resuspension solution (150 mM NaC1 with 50 mM Tris-HCl) and the virus was released into the supernatant using an Ultrasonic crushing instrument (Branson ultrasonics corproaion, S-450D) . Subsequently, Benzonase (Sino Biological Inc., Catalog No.: SSNP01) was added to remove nucleic acid impurities (including DNA and RNA) , and rAAV was purified twice using cesium chloride density gradient centrifugation method. The virus bands were then extracted with a syringe and added to a dialysis bag (Thermos, Catalog No.: 66110) and dialyzed in a chromatography cabinet overnight. Finally, the dialyzed virus was dispensed into 1.5 mL centrifuge tubes and stored at -80℃ for further use.Step 2Assessment of the therapeutic effect of re-inj ection of rAAV on the type I SMA mice modelType I SMA mice (SMNΔ7) model (The Jackson Laboratory, #005025) received the first rAAV (scAAV9-coSMN1, 5 × 10^10 vg per mice) inj ection on postnatal day 1 (PND1) using facial vein injection, and the second rAAV (scAAV9-coSMN1, 5 × 10^ 11 vg per mice) or PBS (control) injection on postnatal day 30 (PND30) using tail vein injection. Then the phenotypes, motor neuron changes, and survival curve of the treated mice were examined to investigate the effectiveness of the rAAV re-injection regimen for the treatment of type I SMA mice model. The results of phenotype showed that the mice treated by the re-injection regimen were significantly larger than the SMNΔ7 mice treated by a single injection, and appeared healthier overall (Figure 9) . Secondly, Nissl staining also showed that the motor neurons in the cervical and lumbar enlargements of the spinal cord were significantly increased in the SMAΔ7 mice treated with the re-injection regimen at the middle and late stages of treatment (PND45) (Figure 10) . In addition, the Kaplan-Meier survival curve showed that the average lifespan of SMNΔ7 mice treated with a single treatment of scAAV9-coSMN1 was extended to 52.1 ± 25.7 days (Median survival = 51.5 d) , with the longest survival time extended to 101 days; whereas average lifespan of SMNΔ7 mice treated with 2 × scAAV9-coSMN1 was extended to 118.4 ± 69.52 days (Median survival = 99.5 d) , and half of the mice in the group survived for ≥ 101 days, with the longest survival time extended to 253 days (Figure 11) . These results suggest that the rAAV re-injection regimen can further improve the therapeutic efficacy of SMNΔ7 mice compared with a single injection regimen.One skilled in the art would readily appreciate that the methods, compositions, and products described herein are representative of exemplary embodiments, and not intended as limitations on the scope of this disclosure. It will be readily apparent to one skilled in the art that varying substitutions and modifications may be made to the present disclosure disclosed herein without departing from the scope and spirit of this disclosure.All patents and publications mentioned in the specification are indicative of the levels of those skilled in the art to which the present disclosure pertains. All patents and publications are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication was specifically and individually indicated as incorporated by reference.The present disclosure is not to be limited in terms of the particular embodiments described in this application, which are intended as single illustrations of individual aspects of the disclosure. Many modifications and variations of the disclosure can be made without departing from its spirit and scope, as will be apparent to those skilled in the art. Such modifications and variations are intended to fall within the scope of the appended claims. The present disclosure is to be limited only by the terms of the appended claims, along with the full scope of equivalents to which such claims are entitled.

Claims

1.A method for treating genetic disorders in a subject, comprising the initial administration of an adeno-associated virus (AAV) -based gene therapy shortly after the birth of said subject, followed by the re-administration of an AAV-based gene therapy.2.The method of claim 1, wherein the initial administration of the AAV-based gene therapy occurs on the day selected from the group consisting of postnatal day 1 to postnatal day 13.3.The method of any of claims 1-2, wherein the subject to be treated is human.4.The method of any of claims 1-3, wherein the initial administration and the re-administration are conducted via intravenous injection.5.The method of any of claims 1-4, the adeno-associated virus (AAV) -based gene therapies for the initial administration and the re-administration are the same.6.The method of any of claims 1-5, wherein the genetic disorder is spinal muscular atrophy, and wherein the AAV-based gene therapy is an rAAV vector comprising a codon-optimized hSMN1 gene which comprises the nucleotide sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 1.7.An isolated nucleic acid encoding a codon-optimized hSMN1 gene comprising the nucleotide sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 1.8.A viral vector comprising the isolated nucleic acid of claim 7.9.A composition for the treatment of spinal muscular atrophy comprising the viral vector of claim 8.10.A method for treating for treating spinal muscular atrophy in a subject, comprising administration of the composition of claim 9 to the subject.

Images