Use of dr-18 and m1 virus in preparation of Anti-tumor drug

Abstract

The present disclosure belongs to the field of biomedicine, and relates to use of DR-18 and an M1 virus in the preparation of an anti-tumor drug. The present disclosure first identifies a combination of the M1 virus and the DR-18 has synergistic anti-tumor effects. The present disclosure also relates to an anti-tumor drug composition including the M1 virus and the DR-18, as well as use of the M1 virus and the DR-18 in the preparation of an anti-tumor drug.

Description

USE OF DR-18 AND M1 VIRUS IN PREPARATION OF ANTI-TUMOR DRUGFIELD OF INVENTION

[0001] The present disclosure belongs to the field of biomedicine and relates to use of DR-18 and an M1 virus in the preparation of an anti-tumor drug.BACKGROUND

[0002] Malignant tumors are the leading cause of death threatening human health. According to the Global Cancer Statistics, there were 19.29 million new cancer cases and 9.95 million cancer-related deaths in 2020 (SUNG H, FERLAY J, SIEGEL R L, et al., Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries [J] . CA Cancer J Clin, 2021, 0: 1-41) . The global cancer burden is expected to be 28.4 million cases in 2040, a 47%rise from 2020, with a largest increase in countries with low to medium development levels, at 95%and 64%, respectively (CAO Maomao, CHEN Wanquing. Interpretation of GLOBOCAN 2020 Global Cancer Statistics [J] . Chinese Journal of the Frontiers of Medical Science (Electronic Version) , 2021, 13 (3) : 63-69) . Therefore, people have a great demand for efficient and cost-effective anti-cancer drugs (Wanqing Chen, Rongshou Zheng, et al. Cancer Statistics in China, 2015 [J] . CA Cancer J Clin, 2016, 6 (6) : 115-132) .

[0003] Traditional treatments for malignant tumors include surgery, radiotherapy, and chemotherapy, which have seen significant progress over the past decades, but still fail to substantially improve a long-term survival rate of patients, especially for patients with refractory cancers such as liver cancer, glioma, pancreatic cancer, and osteosarcoma. Cytotoxic drugs and molecular-targeted drugs are currently used as first-line clinical anti-tumor drugs, but they have limitations, such as severe side effects and / or easy to develop drug resistance. Therefore, there is an urgent need for highly effective and low-toxicity new treatment methods and drugs for malignant tumors.

[0004] At present, immunotherapy is a cancer treatment attracting extensive attention. Unlike the direct effect of traditional surgery, radiotherapy, chemotherapy and targeted drugs, immunotherapy kills tumors by activating a patient’s immune system, with a little impact on normal tissues of the patient. Immunotherapy has been shown to be effective for some advanced cancers and can even prevent tumor recurrence, achieving a complete cure. Immunotherapy drugs that have been approved for clinical use by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) include: (1) immune checkpoint inhibitors, such as PD-1 antibodies (Nivolumab, Pembrolizumab, and the like) , PD-L1 antibodies (Atezolizumab) , and CTLA-4 antibodies (Ipilimumab) ; (2) several monoclonal antibodies targeting surface tumor-associated antigens, such as Rituximab, an anti-CD20 monoclonal antibody; (3) two immunostimulatory cytokines (interferon IFN-α) and interleukin-2 (IL-2) ; (4) immunogenic cell death inducers, such as cyclophosphamide and oxaliplatin; (5) adoptive chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy (CART) ; (6) Bacillus Calmette-Guérin vaccine (BCG) ; (7) dendritic cell-based cancer vaccines; and (8) oncolytic viruses (OVs) , and the like.

[0005] Oncolytic virus therapy is an emerging novel anti-tumor immunotherapy that combines targeted therapy, immunotherapy and gene therapy. It can selectively infect and directly kill tumor cells, and then activate the anti-tumor immune response by exposing tumor / virus antigens and releasing cytokines, thereby directly or indirectly inhibiting tumors. In addition, oncolytic viruses themselves can serve as vectors to carry suicide genes, immunoregulatory genes, pro-apoptosis genes, anti-angiogenesis genes, and the like, to further modulate the tumor microenvironment and promote the efficacy of anti-tumor drugs. Compared with the conventional clinical therapies available at present, the oncolytic virus therapy has the advantages of strong killing effect, high safety, and lower cost.

[0006] Since the oncolytic virus therapy has various unique anti-tumor mechanisms, many teams and scholars are dedicated to researching and developing the therapy. However, only four oncolytic virus products have been approved for marketing and clinical use in cancer treatment to date, including RIGVIR approved for marketing in Latvia in 2003, Recombinant Human Adenovirus 5 Injection (H101) approved for marketing in China in 2005, IMLYGIC (T-Vec) approved for marketing in the U.S. in 2015, and Delytact approved for marketing in Japan in 2021.

[0007] In addition, a variety of oncolytic viruses are in the preclinical research stage. From an initial natural virus to a gene-edited virus, the oncolytic viruses have also developed from herpes viruses to more than ten common viruses, with adenovirus being a most commonly used oncolytic virus due to its ease of gene editing and flexibility of usage. Other common viruses include herpes simplex virus, vaccinia virus, Newcastle disease virus, measles virus, reovirus, coxsackievirus, poliovirus, and the like.

[0008] IL-18 is an immune-activating cytokine capable of stimulating T cells, NK cells, and bone marrow cells, and has the capability of activating anti-tumor immune cells, making it become a candidate molecule for treating cancers. However, IL-18 binding protein (IL-18BP) generated in a tumor microenvironment can serve as a secretory immune checkpoint molecule, competitively binding to IL-18 and blocking its binding to a receptor, which limits the effect of IL-18-based immunotherapy and prevents immune cells from activating the anti-tumor immune response. DR-18 (amodified IL-18) can be obtained by performing site-directed mutagenesis on key amino acids at the IL-18BP binding site. DR18 can effectively avoid binding to IL-18BP, and then effectively bind to an IL-18 receptor and activate anti-tumor immune response. By making use of specific replication feature of the oncolytic virus in tumors, DR18, which has a significant immune activation effect, can be specifically and highly concentrated at a tumor site, such that its concentration in a tumor is significantly higher than in other normal tissues, therapeutic effects are not only improved, but the potential risks of systemic exposure are reduced as well.SUMMARY

[0009] In some embodiments, the present disclosure provides use of DR-18 in the preparation of an anti-tumor drug used in combination with an M1 virus.

[0010] In some embodiments, the present disclosure provides use of an M1 virus in the preparation of an anti-tumor drug used in combination with DR-18.

[0011] In some embodiments, the present disclosure provides use of DR-18 in the preparation of an anti-tumor synergist or a drug resistance reversal agent for an M1 virus. In the other aspect, the present disclosure provides use of an M1 virus in the preparation of an anti-tumor synergist or a drug resistance reversal agent for DR-18.

[0012] The drug resistance reversal agent means substances that can reverse the tumor's resistance to the drug, for example, when some oncolytic viruses are used as anti-tumor drugs to treat tumors, there are some tumors that are not very sensitive to the oncolytic viruses, or these tumors are resistant to the oncolytic viruses, in which case, DR-18 (as a drug resistance reversal agent) can be used in combination with the oncolytic viruses to reverse the tumor's resistance to the viruses; or conversely, when some anti-tumor agents are used to treat tumors, some tumors are less sensitive or resistant to the drugs, in which case, an oncolytic virus (as a drug resistance reversal agent) can be used in combination with these substances to reverse the tumor’s resistance to the substances.

[0013] DR-18 is a mutated form of IL-18 that binds to and activates an IL-18 receptor and its downstream pathways, but does not bind to IL-18BP. For example, U.S. Patent (Publication No. 2019 / 0070262) and Zhou et al., Nature (2020) 583: 609-614, disclose some human-derived DR-18 and mouse-derived DR-18.

[0014] In some embodiments, the DR-18 is human-derived DR-18; and in some embodiments, the human-derived DR-18 contains at least one mutation relative to wild-type human-derived IL-18.

[0015] In some embodiments, the human-derived DR-18 contains one or more of the following mutations relative to the wild-type human-derived IL-18: M51K, K53S, Q56L, P57A, M60L, S105D, D110S and N111R; and in some embodiments, the human-derived DR-18 contains the following mutations relative to the wild-type human-derived IL-18: M51K, K53S, Q56L, P57A, M60L, S105D, D110S and N111R.

[0016] In some embodiments, the human-derived DR-18 includes a sequence having at least 85%, or at least 90%, or at least 91%, or at least 92%, or at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%, or at least 100%sequence identity to a sequence shown in SEQ ID NO: 3.

[0017] In some embodiments, an amino acid sequence of the human-derived DR-18 includes a sequence having at least 85%, or at least 90%, or at least 91%, or at least 92%, or at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%, or at least 100%sequence identity to a sequence shown in SEQ ID NO: 1; and in some embodiments, an amino acid sequence of the wild-type human-derived IL-18 is as shown in SEQ ID NO: 3.

[0018] In some embodiments, the DR-18 is mouse-derived DR-18; and in some embodiments, the human-derived DR-18 contains at least one mutation relative to wild-type mouse-derived IL-18.

[0019] In some embodiments, the mouse-derived DR-18 contains one or more of the following mutations relative to the wild-type mouse-derived IL-18: N1H, M50A, K52G, E55R, V56A and L59K; and in some embodiments, the mouse-derived DR-18 contains the following mutations relative to the wild-type mouse-derived IL-18: N1H, M50A, K52G, E55R, V56A and L59K.

[0020] In some embodiments, the mouse-derived DR-18 includes a sequence having at least 85%, or at least 90%, or at least 91%, or at least 92%, or at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%, or at least 100%sequence identity to a sequence shown in SEQ ID NO: 4.

[0021] In some embodiments, an amino acid sequence of the mouse-derived DR-18 is as shown in SEQ ID NO: 2; and in some embodiments, an amino acid sequence of the wild-type mouse-derived IL-18 is as shown in SEQ ID NO: 4.

[0022] As used in the present disclosure, “human-derived DR-18” and “DR18” can be used interchangeably; “murine-derived DR-18” , “mouse-derived DR-18” and “mDR18” can be used interchangeably.

[0023] As used in the present disclosure, the terms “mutation” , “mutant” or “variant” mean changes in a nucleic acid or polypeptide sequence relative to a reference sequence (the reference sequence can be a naturally occurring normal or “wild-type” sequence) , including translocations, deletions, insertions, and substitutions / point mutations. The terms “mutant” or “variant” used herein mean nucleic acid or protein that contains a mutation.

[0024] As used in the present disclosure, the term “wild-type” means a gene or gene product isolated from a natural source. A wild-type gene is a gene most commonly observed in a population and is therefore arbitrarily designated as the “normal” or “wild-type” form of the gene. In contrast, the terms “modified, ” “variant, ” or “mutant” mean a gene or a gene product that has a sequence and / or functional modification (that is, altered characteristics) relative to a wild-type gene or gene product.

[0025] In some embodiments, the present disclosure provides a technical solution for treating a tumor by combining the DR-18 and the M1 virus. In some embodiments, the term “combination” is broadly interpreted, for example, including a drug combination, a drug kit, and a combination of the DR-18 gene and the M1 virus gene at a molecular level.

[0026] As used in the present disclosure, the term “drug combination” means a product obtained by mixing or combining more than one active ingredients, including both fixed combination and non-fixed combinations of the active ingredients. As used in the present disclosure, the terms “co-administration” or “combination administration” and the like are intended to encompass the administration of selected therapeutic drugs to a single patient, and are intended to include a therapeutic schedule in which the drugs are not necessarily administered by the some route of administration or at the same time.

[0027] As used in the present disclosure, the term “fixed combination” means that the active ingredients (such as the M1 virus and the DR-18) are administered to a patient simultaneously in the form of a single entity or dosage.

[0028] As used in the present disclosure, the term “non-fixed combination” means that the active ingredients (such as the M1 virus and the DR-18) are administered to a patient as separate entities simultaneously, together or sequentially without specific time limits, where the administration can provide, preferably at the same time, a therapeutically effective level of both compounds in vivo. For example, a non-fixed combination can be two capsules, each of which contains one active ingredient, with the aim of treating the patient in vivo with the two active ingredients together.

[0029] As used in the present disclosure, the term “combination” or “combined use” means that two or more active substances can be administered to a subject together in a mixture, or simultaneously as a single formulation separately, or sequentially as a separate formulation in any order (such as simultaneously, sequentially, or intermittently) .

[0030] As used in the present disclosure, the term “drug combination” includes: recombining a target gene (such as DR18 in the present disclosure) into an M1 virus genome, thereby obtaining a recombinant M1 virus capable of exerting the pharmaceutical activities of both the M1 virus and the DR18 drug.

[0031] As used in the present disclosure, the term “combined with. . . ” when referring to the administration of multiple reagents to a subject means that a first reagent is administered along with at least one other reagent (that is, a second, a third, a fourth, a fifth, and the like) to the subject. As used in the present disclosure, under the condition that biological effect generated by the first reagent persists in the subject when the second reagent is administered, such that therapeutic effects of the first and second reagents are additive, the first reagent (such as the DR-18) is considered to be administered in combination with the second reagent (such as the M1 virus) , in which case, the administration of the first reagent (such as the DR-18) provides therapeutic effects over an extended period of time, while the administration of the second reagent (such as the M1 virus) provides therapeutic effects while the therapeutic effects of the first reagent are ongoing. Therefore, the second reagent is considered to be administered in combination with the first reagent, even though the first reagent may be administered at a time point far away from (such as days or weeks) that of the administration of the second reagent. In some embodiments, the first reagent is considered to be administered in combination with the second reagent when the first and second reagents are administered simultaneously (within 30 minutes of each other) , concurrently or sequentially. In some embodiments, the first reagent is considered to be administered “concurrently” with the second reagent when the first and second reagents are administered within approximately 24 hours of each other (such as within approximately 12 hours, 6 hours, 2 hours, or 30 minutes of each other) . The term “combined with. . . ” should also be understood to be applicable to situations where the first and second reagents are formulated together in a single pharmaceutically acceptable formulation, and the combined formulation is then administered to the subject. In some embodiments, the DR-18 and the M1 virus are administered or applied sequentially, for example, one or more other reagents are administered after one reagent is administered. In some embodiments, the DR-18 and the M1 virus are administered simultaneously, for example, two or more reagents are administered at the same time or approximately at the same time; and the two or more reagents may be present in two or more separate formulations, or be combined into a single formulation (that is, a combined formulation) ; and no matter whether these reagents are administered sequentially or simultaneously, as used in the present disclosure, they are considered to be administered / applied in combination.

[0032] In some embodiments, the present disclosure provides use of DR-18 in the preparation of an anti-tumor drug combination, where the drug combination includes an M1 virus combined with the DR-18.

[0033] In some embodiments, the present disclosure provides use of an M1 virus in the preparation of an anti-tumor pharmaceutical composition, where the pharmaceutical composition includes DR-18 combined with the M1 virus.

[0034] In some embodiments, the pharmaceutical composition is a drug composition or a drug kit; in some embodiments, the drug composition contains a mixture of the DR-18 and the M1 virus; in some embodiments, the drug kit contains separately packaged M1 virus and separately packaged DR-18; and in some embodiments, the drug composition is a recombinant M1 virus with a DR-18 nucleotide sequence inserted into a genome.

[0035] In some embodiments, the present disclosure provides a pharmaceutical composition for treating a tumor, including:

[0036] DR-18, and an M1 virus.

[0037] In some embodiments, the present disclosure provides a drug kit, including:

[0038] DR-18, and M1 virus.

[0039] In some embodiments, the drug kit includes separately packaged DR-18 and separately packaged M1 virus.

[0040] A drug kit differs from a drug composition in that the DR-18 has a dosage form different from the M1 virus and is packaged separately (such as a pill, capsule, tablet, or ampoule containing the DR-18; and another pill, capsule, tablet, or ampoule containing the M1 virus) . In some embodiments, the M1 virus, the DR-18, and a combination of the M1 virus and the DR-18 may also contain one or more adjuvants. The adjuvant means a component in the drug formulation capable of improving the therapeutic efficacy of the drug. The drug kit can include the separately packaged DR-18 and the separately packaged M1 virus. The administration of the DR-18 and the M1 virus in the drug kit can be administered simultaneously or sequentially in any order, for example, the DR-18 can be administered before or after the M1 virus, or the DR-18 and the M1 virus can be administered simultaneously. In various embodiments, the patients can be mammals.

[0041] In some embodiments, the drug composition / drug kit further includes a pharmaceutically acceptable carrier.

[0042] In some embodiments, a ratio of the DR-18 to the M1 virus is approximately 0.01-200 mg: 103-109 PFU; in some embodiments, the ratio of the DR-18 to the M1 virus is approximately 0.1-200 mg: 104-109 PFU; and in some embodiments, the ratio of the DR-18 to the M1 virus is approximately 0.1-100 mg: 105-109 PFU.

[0043] In some embodiments, a dosage is as follows: a dosage range of the DR-18 is approximately 0.01-10 mg / kg, while a titer of the M1 virus is approximately MOI 103-109 PFU / kg; in some embodiments, the dosage range of the DR-18 is approximately 0.1-5 mg / kg, while the titer of the M1 virus is approximately MOI 104-109 PFU / kg; and in some embodiments, the dosage range of the DR-18 is approximately 0.05-0.5 mg / kg, while the titer of the M1 virus is approximately MOI 105-109 PFU / kg.

[0044] In some embodiments, the dosage form of the drug includes injection, tablet, capsule or patch; and in some embodiments, the dosage form of the drug is intraperitoneal injection, intratumoral injection, or intravenous injection.

[0045] In one aspect, the present disclosure provides use of the combination in treating a tumor.

[0046] In some embodiments, the tumor is a solid tumor or a hematological tumor.

[0047] In some embodiments, the solid tumor is selected from one or more of intestinal cancer, pancreatic cancer, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, prostate cancer, glioma, melanoma, nasopharyngeal carcinoma, lung cancer, osteosarcoma, gastric cancer, adrenal cortical carcinoma, accessory adrenocortical carcinoma, anal cancer, appendiceal cancer, astrocytoma, atypical teratoma, rhabdomyosarcoma, basal cell carcinoma, cholangiocarcinoma, bone cancer, brain tumor, bronchial tumor, Burkitt lymphoma, carcinoid tumor, cardiac tumor, bile duct epithelial carcinoma, chordoma, colorectal cancer, craniopharyngioma, ductal carcinoma in situ, embryonal tumor, endometrial carcinoma, ependymoma, esophageal carcinoma, olfactory neuroblastoma, intracranial germ cell tumor, extragonadal germ cell tumor, eye cancer, fallopian tube cancer, gallbladder cancer, head and neck cancer, hypopharyngeal cancer, Kaposi's sarcoma, renal cancer, Langerhans cell histiocytosis, laryngeal cancer, lip cancer, oral cavity cancer, Merkel cell carcinoma, malignant mesothelioma, multiple endocrine neoplasia syndrome, mycosis fungoides, sinonasal cancer, neuroblastoma, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, pancreatic neuroendocrine tumor, islet cell tumor, papillomatosis, paraganglioma, parathyroid carcinoma, penile cancer, pharyngeal cancer, pituitary tumor, pleuropulmonary blastoma, primary peritoneal carcinoma, retinoblastoma, salivary gland tumors, sarcoma, Sezary syndrome, skin cancer, small cell lung cancer, small intestine cancer, soft tissue sarcoma, squamous-cell carcinoma, testicular cancer, thymoma and thymic carcinoma, thyroid cancer, urethral cancer, uterine cancer, endometrial and uterine sarcoma, vaginal cancer, vascular tumor, vulvar cancer, or solitary myeloma.

[0048] In some embodiments, the hematological tumor is selected from one or more of B-cell acute lymphoblastic leukemia (BALL) , T-cell acute lymphoblastic leukemia (TALL) , acute lymphoblastic leukemia (ALL) , chronic myeloid leukemia (CML) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , B-cell prolymphocytic leukemia, blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm, Burkitt lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, hairy cell leukemia, small cell lymphoma, large cell lymphoma, follicular lymphoma, MALT lymphoma, Mantle zone lymphoma, marginal zone lymphoma, multiple myeloma, non-Hodgkin lymphoma, plasmablastic lymphoma, plasmacytoid dendritic cell neoplasm, Waldenstrom's macroglobulinemia and pre-leukemia.

[0049] In some embodiments, the present disclosure provides a method for treating a tumor, including administering any of the drug combinations to a subject with the tumor.

[0050] In some embodiments, the human-derived DR-18 amino acid sequence is as shown in SEQ ID NO: 5.

[0051] In some embodiments, the mouse-derived DR-18 amino acid sequence is as shown in SEQ ID NO: 6.

[0052] In some embodiments, when some oncolytic viruses are used in combination with the DR-18, unexpected and diverse effects are observed. The inventors discovered some phenomena obvious antagonistic or inhibitory effects. However, in contrast to these phenomena, the combination of the M1 virus and the DR-18 showed obvious synergistic effects in various tumor tests, which is a surprising and promising discovery for future development.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0053] FIG. 1 is a gene structural diagram of an oncolytic virus M1 according to Example 1.

[0054] FIG. 2 is a gene structural diagram of an armed oncolytic virus M1-mDR18 according to Example 1.

[0055] FIG. 3 is a gene structural diagram of a pUC57-Brick plasmid recombined with an oncolytic virus M1 according to Example 1.

[0056] FIG. 4 is a gene structural diagram of a pUC57-Brick plasmid recombined with a mouse-derived DR18 gene according to Example 1.

[0057] FIG. 5 shows influence of various OVs-SNs on activity of DR18 according to Example 2, where *indicates P < 0.05, **indicates P <0.01, ***indicates P <0.001, and ns indicates that differences are not statistically significant.

[0058] FIG. 6 shows body weight change curves of animals treated with various OVs or OV combined with mDR18 according to Example 3, where n.s. indicates that differences are not statistically significant.

[0059] FIG. 7 shows tumor volume growth curves of an M1+mDR18 combination group according to Example 3, where *indicates P < 0.05, **indicates P <0.01, ***indicates P <0.001, and n.s. indicates that differences are not statistically significant.

[0060] FIG. 8 shows tumor volume growth curves of an ADV+mDR18 combination group according to Example 3, where *indicates P < 0.05, **indicates P <0.01, ***indicates P <0.001, and n.s. indicates that differences are not statistically significant.

[0061] FIG. 9 shows tumor volume growth curves of a VSV+mDR18 combination group according to Example 3, where *indicates P < 0.05, **indicates P <0.01, ***indicates P <0.001, and n.s. indicates that differences are not statistically significant.

[0062] FIG. 10 shows body weight change curves of animals treated with various OVs or OV combined with mDR18 according to Example 4, where n.s. indicates that differences are not statistically significant.

[0063] FIG. 11 shows tumor volume growth curves of an M1+mDR18 combination group according to Example 4, where *indicates P < 0.05, **indicates P <0.01, ***indicates P <0.001, and n.s. indicates that differences are not statistically significant.

[0064] FIG. 12 shows tumor volume growth curves of an ADV+mDR18 combination group according to Example 4, where *indicates P < 0.05, **indicates P <0.01, ***indicates P <0.001, and n.s. indicates that differences are not statistically significant.

[0065] FIG. 13 shows body weight change curves of animals (n.s. indicates that differences are not statistically significant) according to Example 5, where A is a mouse breast cancer EMT6 tumor-bearing model; B is a mouse renal cancer Renca tumor-bearing model; C is a mouse plasma cell myeloma MPC-11 tumor-bearing model; D is a mouse pancreatic cancer Pan02 tumor-bearing model; and E is a mouse bladder cancer MB49 tumor-bearing model.

[0066] FIG. 14 shows tumor volume growth curves according to Example 5, where *indicates P < 0.05, **indicates P <0.01, ***indicates P <0.001, and n.s. indicates that differences are not statistically significant; and A is a mouse breast cancer EMT6 tumor-bearing model; B is a mouse renal cancer Renca tumor-bearing model; C is a mouse plasma cell myeloma MPC-11 tumor-bearing model; D is a mouse pancreatic cancer Pan02 tumor-bearing model; and E is a mouse bladder cancer MB49 tumor-bearing model.DETAILED DESCRIPTIONS OF THE EMBODIMENTS

[0067] The technical solutions of the present disclosure are further described below in conjunction with specific embodiments, which do not represent the limitations to the scope of protection of the present disclosure. Some non-essential modifications and adjustments made by others based on the concepts of the present disclosure still fall within the scope of protection of the present disclosure.

[0068] Unless otherwise specified, materials and experimental methods used in the present disclosure are conventional materials and methods.

[0069] Example 1 Constructing an armed oncolytic virus M1 (M1-mDR18)

[0070] 1. Experimental material:

[0071] 1.1 Experimental cells: Vero cells (African green monkey kidney cells) , sourced from ATCC.

[0072] 1.2 Experimental plasmids: an M1 gene (with a gene structure shown in FIG. 1) and a mouse-derived DR18 gene (with a gene structure shown in FIG. 2) were recombined into pUC57-Brick plasmids according to a virus seed design by synthesizing the M1 gene and the mouse-derived DR18 gene, and the plasmids were purchased from GenScript Biotech Corporation. A gene structure of the pUC57-Brick plasmid recombined with oncolytic virus M1 was shown in FIG. 3, and a gene structure of the pUC57-Brick plasmid recombined with the mouse-derived DR18 gene was shown in FIG. 4.

[0073] 1.3 Experiment reagents: Lipofectamine MessengerMAX Transfection Reagent, Opti-MEM, XbaI endonuclease, mMESSAGE mMACHINETM SP6 Transcription Kit, DNA purification and recovery kit, Proteinase K, and RNase-free water.

[0074] 1.4 Experimental instruments: centrifuge, biosafety cabinet, water bath, inverted microscope, carbon dioxide incubator.

[0075] 2. Experimental methods

[0076] 2.1 Plasmid linearization:

[0077] 10 μg of plasmids were added to a PCR tube, 5 μL of XbaI endonuclease, 5 μL of buffer solution, and an appropriate volume of RNase-free water was added to bring a total volume up to 50 μL, the PCR tube was incubated at 37℃ for 60 minutes in a water bath, 5 μL of Proteinase K was added to each tube and incubates at 55℃ for another 30 minutes.

[0078] 2.2 DNA recovery:

[0079] DNA recovery was performed according to the instructions of a DNA purification and recovery kit.

[0080] 2.3 In vitro transcription:

[0081] In vitro transcription was performed according to the instructions of an mMESSAGE mMACHINETM SP6 Transcription Kit.

[0082] 2.4 RNA transfection:

[0083] 250 μL of Opti-MEM medium and 7.5 μL of MessengerMAX were added to a 1.5 mL sterile centrifuge tube, 125 μL of Opti-MEM medium and all the RNA transcribed in vitro were added to another centrifuge tube, solutions in the two centrifuge tubes were mixed thoroughly and incubated at room temperature for 10 minutes, and the mixed solution was then dropped onto the Vero cells.

[0084] 2.5 Virus collection:

[0085] When approximately 90%of the cells floated up, and supernatant was collected into a cryopreservation tube to obtain an original armed oncolytic virus M1 (M1-mDR18) .

[0086] 2.6 Virus amplification and concentration:

[0087] The original armed oncolytic virus M1 (M1-mDR18) was inoculated onto the Vero cells. When approximately 90%of the cells floated up, and supernatant was collected and concentrated using a hollow fiber ultrafiltration membrane column to obtain an armed oncolytic virus M1 (M1-mDR18) working solution.

[0088] Example 2: Evaluating the influence of supernatant of different tumor cells infected with oncolytic viruses on the activity of DR18 using an IL-18 reporter cell model

[0089] IL-18 reporter cell model: the reporter cells expressed IL-18 receptor, downstream pathway molecule and luciferase of IL-18. After being bound to a receptor, the IL-18 mediated luciferase expression, its reading represented an activation effect of a pathway. The pathway is crucial for the in vivo activation of anti-tumor immunity by DR18 and can indirectly reflect the anti-cancer activity of DR18.

[0090] 1. Experimental material:

[0091] 1.1 Oncolytic viruses: M1: oncolytic virus M1; ADV: oncolytic adenovirus with E1a-CR2-24bp gene and E3 region gene knockout; VSV: attenuated oncolytic vesicular stomatitis virus with G gene knockout, and M gene V48R and M51R mutations; REO: serum type 3 oncolytic reovirus. The viruses were sourced from commercially available products, custom products constructed according to conventional methods, or products constructed by Guangzhou Virotech Pharmaceutical Co., Ltd. according to conventional methods.

[0092] 1.2 Experimental cells: IL-18 reporter cells (H_IL18 Reporter 293 Cell Line) , prostate cancer cells (PC-3M-2B4, DU145) , bladder cancer cells (J82, HT1376) , renal cancer cells (786-O) , cervical cancer cells (HCC94) , intestinal cancer cells (HCT116) , liver cancer cells (Hep3B) , lung cancer cells (SK-MES-1, HCC-2935) , breast cancer cells (MDA-MB-231) , glioma cells (LN18, U-138MG) , melanoma cells (A375) , osteosarcoma cells (MNNG / HOS) , and pancreatic cancer cells (Capan2) . Cells were purchased from ATCC, National Collection of Authenticated Cell Cultures, China Center for Type Culture Collection, Guangzhou Jennio Biotech Co., Ltd., Guangzhou Cellcook Biotech Co., Ltd., Foxy Bio, Tongpai (Shanghai) Biotechnology Co., Ltd., and the like.

[0093] 1.3 Experimental reagents: human-derived DR18 recombinant protein (SEQ ID NO: 1) , DMEM culture medium, MEM culture medium, RPMI 1640 culture medium, McCoy’s 5A culture medium, IMDM culture medium, and EMEM culture media, Fetal Bovine Serum, Puromycin, Blasticidin, G418, and ONE-GloTM Luciferase Assay System.

[0094] 1.4 Experimental instruments: inverted microscope, biosafety cabinet, carbon dioxide incubator and microplate reader.

[0095] 2. Experimental methods

[0096] 2.1 Establishment of a tumor cell model:

[0097] Appropriate culture conditions and passaging ratios were selected according to the cell line specifications for cell amplification and passage. When the cells entered a logarithmic growth phase and had sufficient amount, the cells were inoculated into a T25 cell culture flask at 3×104 / cm2.

[0098] 2.2 Oncolytic virus infection of tumor cells:

[0099] 16-24 hours after tumor cell inoculation, observation was performed under a microscope to ensure that the cells were completely attached to a wall, and each of the tumor cells was infected with the virus at an MOI of 1 PFU / cell according to a number of cells on the plate.

[0100] 2.3 Collection and inactivation of infected supernatant:

[0101] 48 hours after tumor cells was infected with the oncolytic virus, cytopathic condition of the cells was observed under a microscope and photographed; and supernatant (SN) of cells infected with the virus was inactivated by ultraviolet irradiation inactivation or filtration through a 0.1 μm filter according to the virus characteristics, the inactivated supernatant was collected into a 4.5 mL cryopreservation tube and stored at -80℃. Non-infected supernatant was collected in the same way as a control.

[0102] 2.4 Influence of infected supernatant on DR18 biological activity:

[0103] (1) The IL-18 reporter cells were revived and sub-cultured. When the cells entered a logarithmic growth phase and had sufficient amount, 90 μL of culture medium was inoculated into a middle well of a 96-well plate at 1.5×104 / well, and 200 μL of PBS per well was added to surrounding cells for sealing.

[0104] (2) The cells were cultured in a 37℃, 5%CO2 cell culture incubator for 16-24 hours, the 96-well plate was taken out, and observation was performed under a microscope to ensure that the cells were completely attached to a wall and were in good morphology; and the DR18 protein was diluted at 3-fold geometric dilution gradient with the inactivated supernatant and the control supernatant obtained in the Step 2.3 and mixed thoroughly, and 10 μL of the diluted supernatant was added to each well.

[0105] (3) After the DR18 protein was added, the cells were incubated at 37℃ with 5%CO2cell culture incubator for 16 hours.

[0106] (4) 100 μL of ONE-GloTM substrate was added and reacted for 3 minutes in the dark to allow the cells to lyse completely; and cell lysate was transferred to a 96-well luminescent plate, and luciferase was detected with the microplate reader.

[0107] 2.5 Data processing:

[0108] relative light unit (RLU) of each of the wells was obtained by the test, and relative light rate of cells in each of the cells was calculated according to a formula: relative light rate (%of Max) = (RLU sample–RLUblank)  /  (RLUmaximum–RLUblank) ×100%, a fitting curve was plotted using software, and half maximal effective concentration (EC50) values of DR18 biological activity were calculated using an [Agonist] vs. response -Variable slope (four parameters) analysis equation. The EC50 values of each group were normalized to obtain an EC50 relative value (Relative value) = EC50 treatment group / EC50 control group.

[0109] 2.6 Statistical analysis:

[0110] * indicated P < 0.05, **indicated P <0.01, ***indicated P <0.001, indicating that difference in the data was statistically significant.

[0111] 3. Experimental results:

[0112] 3.1 Effects of the inactivated supernatant of different tumor cells infected with oncolytic viruses on the activity of DR18 were shown in FIG. 5 and Table 1.

[0113] [Corrected under Rule 26, 28.02.2025]Table 1 Effects of inactivated supernatant of different tumor cellsinfected with oncolytic viruses on the activity of DR18 (*indicates P <0.05, **indicates P <0.01, and ***indicates P <0.001)

[0114] The DR18 recombinant protein was subjected to Gradient dilution by the supernatants of different tumor cells infected with different oncolytic viruses, the IL-18 reporter cells were treated for 16 hours, Luciferase light unit was then detected on a machine, and a fitting curve was plotted, and an EC50 value of each treatment group was calculated, see FIG. 5. Statistical analysis results were shown in Table 1.

[0115] The results indicated that, compared with the uninfected control group (CON) , the prostate cancer cells (PC-3M-2B4, DU145) , bladder cancer cells (J82, HT1376) , renal cancer cells (786-O) , cervical cancer cells (HCC94) , intestinal cancer cells (HCT116) , liver cancer cells (Hep3B) , lung cancer cells (SK-MES-1) , breast cancer cells (MDA-MB-231) , glioma cells (LN18, U-138MG) , melanoma cells (A375) , osteosarcoma cells (MNNG / HOS) , and pancreatic cancer cells (Capan2) infected with oncolytic virus (M1) could significantly enhance the biological activity of DR18.

[0116] Compared with the control group not infected with the virus, the prostate cancer cells (DU145) , bladder cancer cells (J82) , cervical cancer cells (HCC94) , lung cancer cells (SK-MES-1) , glioma cells (LN18, U-138MG) , osteosarcoma cells (MNNG / HOS) , and pancreatic cancer cells (Capan2) infected with the oncolytic vesicular stomatitis virus (VSV) could significantly enhance the biological activity of DR18; while the renal cancer cells (786-O) and breast cancer cells (MDA-MB-231) infected with the oncolytic vesicular stomatitis virus inhibited the biological activity of DR18.

[0117] Compared with the control group not infected with the virus, the prostate cancer cells (PC-3M-2B4) , bladder cancer cells (J82, HT1376) , cervical cancer cells (HCC94) , liver cancer cells (Hep3B) , lung cancer cells (SK-MES-1) , glioma cells (LN18, U-138MG) , osteosarcoma cells (MNNG / HOS) , and pancreatic cancer cells (Capan2) infected with the oncolytic adenovirus (ADV) could significantly enhance the biological activity of DR18; while the prostate cancer cells (DU145) and intestinal cancer cells (HCT116) infected with the oncolytic vesicular stomatitis virus inhibited the biological activity of DR18.

[0118] Compared with the control group not infected with the virus, the bladder cancer cells (J82, HT1376) , cervical cancer cells (HCC94) , liver cancer cells (Hep3B) , lung cancer cells (SK-MES-1, HCC-2935) , glioma cells (U-138MG) , and pancreatic cancer cells (Capan2) infected with the oncolytic reovirus (REO) could significantly enhance the biological activity of DR18; while the prostate cancer cells (DU145) and renal cancer cells (786-O) infected with the oncolytic vesicular stomatitis virus inhibited the biological activity of DR18.

[0119] The experimental results indicated that the supernatants of oncolytic viruses infected with different tumor cells had differential influence on the activity of DR18, among which the enhancing effects of M1 were stronger than those of other oncolytic viruses.

[0120] Example 3: Safety and efficacy study of mDR18 combined with oncolytic viruses in immunocompetent mouse liver cancer model

[0121] 1. Experimental material:

[0122] 1.1 Oncolytic viruses: M1: oncolytic virus M1; ADV: oncolytic adenovirus with E1a-CR2-24bp gene and E3 region gene knockout; and VSV: attenuated oncolytic vesicular stomatitis virus with G gene knockout, and M gene V48R and M51R mutations. The viruses were purchased from BrainVTA (Wuhan) Co., Ltd, Fubio Biotechnology, and the like, or constructed by Guangzhou Virotech Pharmaceutical Co., Ltd.

[0123] 1.2 Recombinant protein: modified recombinant mouse-derived interleukin-18 (mDR18) protein (SEQ ID NO: 2) .

[0124] 1.3 Tumor cells: mouse liver cancer cell line H22, purchased from China Center for Type Culture Collection.

[0125] 1.4 Experimental animals: BALB / c female mice aged 5-7 weeks.

[0126] 2. Experimental methods

[0127] 2.1 Establishing a tumor-bearing mouse model:

[0128] Tumor cells were revived and sub-cultured. When the cells entered a logarithmic growth phase and had sufficient amount, the cells were collected, counted, and prepared into a cell suspension, and H22 cells were inoculated into subcutaneous backs of BALB / c mice at 2×106 cells / mouse.

[0129] 2.2 Grouping and administration:

[0130] After the tumor was formed, mice with a tumor volume of 100±40 mm3 were taken and randomly divided into 8 groups, that is, an excipient control group, an mDR18 monotherapy group, an M1 monotherapy group, an M1+mDR18 combined-therapy group, an ADV monotherapy group, an ADV+mDR18 combined-therapy group, a VSV monotherapy group, and a VSV+mDR18 combined-therapy group, with 5 animals in each group; and the mDR18 was administrated at a dose of 0.32 mg / kg via intraperitoneal injection, an administration cycle was 2 times each week, and administration was performed a total of 5 times; each of the oncolytic viruses was administered at a dose of 2×106 PFU per mouse via intratumoral injection, and administration was performed once in total. A day on which the tumor was inoculated was taken as D0, and mice were observed for 21 days after administration.

[0131] 2.3 Mouse body weight and tumor measurement:

[0132] During tumor formation and drug administration, body weights and tumor growth of mice were measured every 3-4 days.

[0133] 2.4 Data processing:

[0134] The measured data were statistically analyzed and a tumor volume growth curve of each group of mice was plotted.

[0135] A calculation formula for the tumor volume (TV) was as follows: V = 1 / 2×a×b2, where a and b represented a long diameter and a short diameter of the tumor, respectively.

[0136] 2.5 Statistical analysis:

[0137] * indicated P < 0.05, **indicated P <0.01, ***indicated P <0.001, indicating that difference in the data was statistically significant.

[0138] 3. Experimental results:

[0139] The body weights of the animals in each group during the experiment were shown in FIG. 6, and the body weights of animals in each group maintained a steady increase during the experiment. Compared with the excipient control group, there were no significant differences in the monotherapy groups and the combined-therapy groups, indicating that administration of 0.32 mg / kg of mDR18 via intraperitoneal injection twice a week or a single intratumoral injection of 2×106 PFU per mouse of each oncolytic virus did not cause any apparent drug-related side effects in the immunocompetent mouse model.

[0140] A tumor volume change curve was plotted based on the tumor growth records, as shown in FIG. 7, for efficacy evaluation. The results indicated that compared with the excipient control group, the mDR18 (P<0.01) monotherapy or the M1+mDR18 (P<0.001) combined therapy could significantly inhibit the tumor growth in the liver cancer tumor-bearing mouse model. Furthermore, compared with the mDR18 monotherapy, the M1+mDR18 (P<0.001) combined therapy could significantly enhance the tumor inhibition effect on the liver cancer tumor-bearing mouse model; and compared with the M1 monotherapy, the M1+mDR18 (P<0.001) combined therapy could significantly enhance the tumor inhibition effect on the liver cancer tumor-bearing mouse model.

[0141] A tumor volume change curve was plotted based on the tumor growth records, as shown in FIG. 8, for efficacy evaluation. The results indicated that compared with the excipient control group, the mDR18 (P<0.01) monotherapy or the ADV+mDR18 (P<0.001) combined therapy could significantly inhibit the tumor growth in the liver cancer tumor-bearing mouse model; no statistically significant difference was identified between the mDR18 monotherapy and the ADV+mDR18 combined therapy in terms of tumor inhibition effects, indicating that the ADV+mDR18 combined therapy had no synergistic effect.

[0142] A tumor volume change curve was plotted based on the tumor growth records, as shown in FIG. 9, for efficacy evaluation. The results indicated that compared with the excipient control group, the mDR18 (P<0.01) monotherapy or the VSV+mDR18 (P<0.001) combined therapy could significantly inhibit the tumor growth in the liver cancer tumor-bearing mouse model; no statistically significant difference was identified between the mDR18 monotherapy and the VSV+mDR18 combined therapy in terms of tumor inhibition effects, indicating that the VSV+mDR18 had no synergistic effect.

[0143] Example 4: Safety and efficacy study of mDR18 combined with oncolytic viruses in immunocompetent mouse intestinal cancer model

[0144] 1. Experimental material:

[0145] 1.1 Oncolytic viruses: M1: oncolytic virus M1; and ADV: oncolytic adenovirus with E1a-CR2-24bp gene and E3 region gene knockout. The viruses were purchased from Fubio Biotechnology, and the like, or constructed by Guangzhou Virotech Pharmaceutical Co., Ltd.

[0146] 1.2 Recombinant protein: modified recombinant mouse-derived interleukin-18 (mDR18) protein.

[0147] 1.3 Tumor cells: Mouse intestinal cancer cell line CT26, and cells were purchased from Guangzhou Jennio Biotech Co., Ltd.

[0148] 1.4 Experimental animals: BALB / c female mice aged 5-7 weeks.

[0149] 2. Experimental methods

[0150] 2.1 Establishing a tumor-bearing mouse model:

[0151] Tumor cells were revived and sub-cultured. When the cells entered a logarithmic growth phase and had sufficient amount, the cells were collected, counted, and prepared into a cell suspension, and CT26 cells were inoculated into subcutaneous backs of BALB / c mice at 2×106 cells / mouse.

[0152] 2.2 Grouping and administration:

[0153] After the tumor was formed, mice with a tumor volume of 100±40 mm3 were taken and randomly divided into 6 groups, that is, an excipient control group, an mDR18 monotherapy group, an M1 monotherapy group, an M1+mDR18 combined-therapy group, an ADV monotherapy group, an ADV+mDR18 combined-therapy group, with 4 animals in each group; and the mDR18 was administrated at a dose of 0.32 mg / kg via intraperitoneal injection, an administration cycle was 2 times each week, and administration was performed a total of 5 times; each of the oncolytic viruses was administered at a dose of 2×106 PFU per mouse via intratumoral injection, and administration was performed once in total. A day on which the tumor was formed was taken as D0, and mice were observed for 14 days after administration.

[0154] 2.3 Mouse body weight and tumor measurement:

[0155] During tumor formation and drug administration, body weights and tumor growth of mice were measured every 3-4 days.

[0156] 2.4 Data processing:

[0157] The measured data were statistically analyzed and a tumor volume growth curve of each group of mice was plotted.

[0158] A calculation formula for the tumor volume (TV) was as follows: V = 1 / 2×a×b2, where a and b represented a long diameter and a short diameter of the tumor, respectively.

[0159] 2.5 Statistical analysis:

[0160] * indicated P < 0.05, **indicated P <0.01, ***indicated P <0.001, indicating that difference in the data was statistically significant.

[0161] 3. Experimental results:

[0162] The body weights of the animals in each group during the experiment were shown in FIG. 10, and the body weights of animals in each group maintained a steady increase during the experiment. Compared with the excipient control group, there were no significant differences in the monotherapy groups and the combined-therapy groups, indicating that administration of 0.32 mg / kg of mDR18 via intraperitoneal injection twice a week or a single intratumoral injection of 2×106 PFU per mouse of each oncolytic virus did not cause any apparent drug-related side effects in the immunocompetent mouse model.

[0163] A tumor volume change curve was plotted based on the tumor growth records, as shown in FIG. 11, for efficacy evaluation. The results indicated that compared with the excipient control group, the mDR18 (P<0.001) monotherapy or the M1+mDR18 (P<0.001) combined therapy could significantly inhibit the tumor growth in the liver cancer tumor-bearing mouse model. Furthermore, compared with the M1 monotherapy, the M1+mDR18 (P<0.01) combined therapy could significantly enhance the tumor inhibition effect on the liver cancer tumor-bearing mouse model, indicating that the M1+mDR18 combined therapy had synergistic effect.

[0164] A tumor volume change curve was plotted based on the tumor growth records, as shown in FIG. 12, for efficacy evaluation. The results indicated that compared with the excipient control group, the mDR18 (P<0.001) monotherapy or the ADV+mDR18 (P<0.05) combined therapy could significantly inhibit the tumor growth in the liver cancer tumor-bearing mouse model; no statistically significant difference was identified between the mDR18 monotherapy and the ADV+mDR18 combined therapy in terms of tumor inhibition effects, indicating that the ADV+mDR18 combined therapy had no synergistic effect.

[0165] Example 5: Safety and efficacy study of recombinant oncolytic virus M1 carrying mDR18 in immunocompetent mouse tumor-bearing model

[0166] 1. Experimental material:

[0167] 1.1 Oncolytic viruses: M1-mDR18: recombinant oncolytic virus M1 expressing mouse DR18 gene (that is, the armed oncolytic virus M1 (M1-mDR18) in Example 1) . The virus was constructed by Guangzhou Virotech Pharmaceutical Co., Ltd..

[0168] 1.2 Tumor cells: Mouse breast cancer cells EMT6, mouse renal cancer cells Renca, mouse plasma cell myeloma cells MPC-11, mouse pancreatic cancer cells Pan02, and mouse bladder cancer cells MB49, and the cells were obtained from GemPharmatech Co., Ltd.

[0169] 1.3 Experimental animals: BALB / c female mice aged 6-8 weeks; and C57BL / 6 female mice aged 6-8 weeks.

[0170] 2. Experimental methods

[0171] 2.1 Establishing a tumor-bearing mouse model:

[0172] Tumor cells were revived and sub-cultured. When the cells entered a logarithmic growth phase and had sufficient amount, the cells were collected, counted, and prepared into a cell suspension: (1) EMT6 cells were inoculated at 2×106 cells per mouse into an upper thigh on a right dorsal side of the BALB / c mice; (2) Renca cells were inoculated at 5×105 cells per mouse into an upper thigh on a right dorsal side of the BALB / c mice; (3) MPC-11 cells were inoculated at 3×105 cells per mouse into an upper thigh on a right dorsal side of the BALB / c mice; (4) Pan02 cells were inoculated at 5×106 cells per mouse into a subcutaneous right forelimb of the C57BL / 6; and (5) MB49 cells were inoculated at 5×106 cells per mouse into a subcutaneous right forelimb of the C57BL / 6.

[0173] 2.2 Grouping and administration:

[0174] After the tumor was formed, mice with a tumor volume of 60-100 mm3 were taken and randomly divided into 2 groups, that is, an excipient control group and a M1-mDR18 group, with 5 animals in each group; and the M1-mDR18 was administered at a dose of 6×106 CCID50 per mouse via tail intravenous injection, administration was given once a day for 5 consecutive days, and administration was performed a total of 5 times. A day of administration was taken as D0, and mice were observed for 1 month after administration or until an ethical end point.

[0175] 2.3 Mouse body weight and tumor measurement:

[0176] During tumor formation and drug administration, body weights and tumor growth of mice were measured every 3-4 days.

[0177] 2.4 Data processing:

[0178] The measured data were statistically analyzed and a tumor volume growth curve of each group of mice was plotted.

[0179] A calculation formula for the tumor volume (TV) was as follows: V = 1 / 2×a×b2, where a and b represented a long diameter and a short diameter of the tumor, respectively.

[0180] 2.5 Statistical analysis:

[0181] * indicated P < 0.05, **indicated P <0.01, ***indicated P <0.001, indicating that difference in the data was statistically significant.

[0182] 3. Experimental results:

[0183] The body weights of the animals in each group during the experiment were shown in FIG. 13, and the body weights of animals in each group maintained a steady increase during the experiment, indicating that five consecutive intravenous injections of M1-mDR18 at a dose of 6×106 CCID50 per mouse did not cause any apparent drug-related side effects in the immunocompetent mouse model.

[0184] A tumor volume change curve was plotted based on the tumor growth records, as shown in FIG. 14, for efficacy evaluation. The results indicated that compared with an excipient control group, the recombinant oncolytic virus M1-mDR18 carrying DR18 could significantly inhibit the tumor growth of the mouse breast cancer EMT6 (P<0.05) , mouse renal cancer Renca (P<0.001) , mouse plasma cell myeloma MPC-11 (P<0.001) , mouse pancreatic cancer Pan02 (P<0.001) , and mouse bladder cancer MB49 (P<0.001) in vivo.

[0185] Human-derived DR18 amino acid sequence SEQ ID NO: 1

[0186]

[0187] mDR18 amino acid sequence SEQ ID NO: 2

[0188]

[0189] Wild-type human-derived IL-18 amino acid sequence SEQ ID NO: 3

[0190]

[0191] Wild-type mouse-derived IL-18 amino acid sequence SEQ ID NO: 4

[0192]

[0193] Human-derived DR18 amino acid sequence SEQ ID NO: 5

[0194]

[0195] Mouse-derived DR18 amino acid sequence SEQ ID NO: 6

[0196]

[0197] The embodiments described in the present disclosure are only illustrative examples but does not limit implementations of the present disclosure. Any other changes, modifications, substitutions, combinations and simplifications made without departing from the spirit and principle of the present disclosure shall be equivalent replacement methods, and fall within the scope of protection of the present disclosure.

Claims

1.Use of DR-18 in the preparation of an anti-tumor drug used in combination with an M1 virus.2.Use of an M1 virus in the preparation of an anti-tumor drug used in combination with DR-18.3.The use according to claim 1 or 2, wherein the DR-18 is human-derived DR-18;preferably, the human-derived DR-18 contains at least one mutation relative to wild-type human-derived IL-18;preferably, the human-derived DR-18 contains one or more of the following mutations relative to the wild-type human-derived IL-18: M51K, K53S, Q56L, P57A, M60L, S105D, D110S and N111R;preferably, the human-derived DR-18 contains the following mutations relative to the wild-type human-derived IL-18: M51K, K53S, Q56L, P57A, M60L, S105D, D110S and N111R;preferably, the human-derived DR-18 comprises a sequence having at least 85%, or at least 90%, or at least 91%, or at least 92%, or at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%, or at least 100%sequence identity to a sequence shown in SEQ ID NO: 3;preferably, an amino acid sequence of the human-derived DR-18 comprises a sequence having at least 85%, or at least 90%, or at least 91%, or at least 92%, or at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%, or at least 100%sequence identity to a sequence shown in SEQ ID NO: 1; andpreferably, an amino acid sequence of the wild-type human-derived IL-18 is as shown in SEQ ID NO: 3.4.The use according to any one of claims 1-3, wherein the DR-18 is mouse-derived DR-18;preferably, the mouse-derived DR-18 contains at least one mutation relative to wild-type mouse-derived IL-18;preferably, the mouse-derived DR-18 contains one or more of the following mutations relative to the wild-type mouse-derived IL-18: N1H, M50A, K52G, E55R, V56A and L59K;preferably, the mouse-derived DR-18 comprises a sequence having at least 85%, or at least 90%, or at least 91%, or at least 92%, or at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%, or at least 100%sequence identity to a sequence shown in SEQ ID NO: 4;preferably, the mouse-derived DR-18 contains the following mutations relative to the wild-type mouse-derived IL-18: N1H, M50A, K52G, E55R, V56A and L59K;preferably, an amino acid sequence of the mouse-derived DR-18 is as shown in SEQ ID NO: 2; andpreferably, an amino acid sequence of the wild-type mouse-derived IL-18 is as shown in SEQ ID NO: 4.5.A pharmaceutical composition for treating a tumor, comprising:DR-18, andan M1 virus.6.The pharmaceutical composition according to claim 5, wherein the pharmaceutical composition is a drug composition or a drug kit;preferably, the drug composition contains a mixture of the DR-18 and the M1 virus;preferably, the drug kit contains separately packaged M1 virus and separately packaged DR-18; andpreferably, the drug composition is a recombinant M1 virus with a DR-18 nucleotide sequence inserted into a genome.7.The pharmaceutical composition according to claim 5 or 6, wherein the DR-18 is human-derived DR-18;preferably, the human-derived DR-18 contains at least one mutation relative to wild-type human-derived IL-18;preferably, the human-derived DR-18 contains one or more of the following mutations relative to the wild-type human-derived IL-18: M51K, K53S, Q56L, P57A, M60L, S105D, D110S and N111R;preferably, the human-derived DR-18 comprises a sequence having at least 85%, or at least 90%, or at least 91%, or at least 92%, or at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%, or at least 100%sequence identity to a sequence shown in SEQ ID NO: 3;preferably, the human-derived DR-18 contains the following mutations relative to the wild-type human-derived IL-18: M51K, K53S, Q56L, P57A, M60L, S105D, D110S and N111R;preferably, an amino acid sequence of the human-derived DR-18 is as shown in SEQ ID NO: 1;preferably, an amino acid sequence of the wild-type human-derived IL-18 is as shown in SEQ ID NO: 3;preferably, the DR-18 is mouse-derived DR-18;preferably, the mouse-derived DR-18 contains at least one mutation relative to wild-type mouse-derived IL-18;preferably, the mouse-derived DR-18 comprises a sequence having at least 85%, or at least 90%, or at least 91%, or at least 92%, or at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%, or at least 100%sequence identity to a sequence shown in SEQ ID NO: 4;preferably, an amino acid sequence of the mouse-derived DR-18 comprises a sequence having at least 85%, or at least 90%, or at least 91%, or at least 92%, or at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%, or at least 100%sequence identity to a sequence shown in SEQ ID NO: 2;preferably, an amino acid sequence of the wild-type mouse-derived IL-18 is as shown in SEQ ID NO: 4; andpreferably, the drug composition / drug kit further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.8.The pharmaceutical composition according to any one of claims 5-7, wherein a ratio of the DR-18 to the M1 virus is approximately 0.01-200 mg: 103-109 PFU;preferably approximately 0.1-200 mg: 104-109 PFU;and preferably approximately 0.1-100 mg: 105-109 PFU;preferably, a dosage is as follows: a dosage range of the DR-18 is approximately 0.01-10 mg / kg, while a titer of the M1 virus is approximately MOI 103-109 PFU / kg;preferably, the dosage range of the DR-18 is approximately 0.1-5 mg / kg, while the titer of the M1 virus is approximately MOI 104-109 PFU / kg;and preferably, the dosage range of the DR-18 is approximately 0.05-0.5 mg / kg, while the titer of the M1 virus is approximately MOI 105-109 PFU / kg;preferably, a dosage form of the drug comprises injection, tablet, capsule or patch; andpreferably, the dosage form of the drug is intraperitoneal injection, intratumoral injection, or intravenous injection.9.Use of the pharmaceutical composition according to any one of claims 5-8 in the preparation of a drug for treating a tumor.10.The use / pharmaceutical composition according to any one of claims 1-9, wherein the tumor is a solid tumor or a hematological tumor;preferably, the solid tumor is selected from one or more of intestinal cancer, pancreatic cancer, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, prostate cancer, glioma, melanoma, nasopharyngeal carcinoma, lung cancer, osteosarcoma, gastric cancer, adrenal cortical carcinoma, accessory adrenocortical carcinoma, anal cancer, appendiceal cancer, astrocytoma, atypical teratoma, rhabdomyosarcoma, basal cell carcinoma, cholangiocarcinoma, bone cancer, brain tumor, bronchial tumor, Burkitt lymphoma, carcinoid tumor, cardiac tumor, bile duct epithelial carcinoma, chordoma, colorectal cancer, craniopharyngioma, ductal carcinoma in situ, embryonal tumor, endometrial carcinoma, ependymoma, esophageal carcinoma, olfactory neuroblastoma, intracranial germ cell tumor, extragonadal germ cell tumor, eye cancer, fallopian tube cancer, gallbladder cancer, head and neck cancer, hypopharyngeal cancer, Kaposi's sarcoma, renal cancer, Langerhans cell histiocytosis, laryngeal cancer, lip cancer, oral cavity cancer, Merkel cell carcinoma, malignant mesothelioma, multiple endocrine neoplasia syndrome, mycosis fungoides, sinonasal cancer, neuroblastoma, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, pancreatic neuroendocrine tumors, islet cell tumor, papillomatosis, paraganglioma, parathyroid carcinoma, penile cancer, pharyngeal cancer, pituitary tumor, pleuropulmonary blastoma, primary peritoneal carcinoma, retinoblastoma, salivary gland tumors, sarcoma, Sezary syndrome, skin cancer, small cell lung cancer, small intestine cancer, soft tissue sarcoma, squamous-cell carcinoma, testicular cancer, thymoma and thymic carcinoma, thyroid cancer, urethral cancer, uterine cancer, endometrial and uterine sarcoma, vaginal cancer, vascular tumor, vulvar cancer, or solitary myeloma; andpreferably, the hematological tumor is selected from one of more of B-cell acute lymphoblastic leukemia (BALL) , T-cell acute lymphoblastic leukemia (TALL) , acute lymphoblastic leukemia (ALL) , chronic myeloid leukemia (CML) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , B-cell prolymphocytic leukemia, blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm, Burkitt lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, hairy cell leukemia, small cell lymphoma, large cell lymphoma, MALT lymphoma, Mantle zone lymphoma, marginal zone lymphoma, multiple myeloma, non-Hodgkin lymphoma, plasmablastic lymphoma, plasmacytoid dendritic cell neoplasm, Waldenstrom's macroglobulinemia and pre-leukemia.11.A method for treating a tumor, comprising administering the pharmaceutical composition according to any one of claims 5-8 to a subject with the tumor.

Images