Therapeutic ly6k mRNA vaccine for cancer

Abstract

Provided herein are a fusion polypeptide comprises (i) a first polypeptide comprising LY6K protein; and (ii) a second polypeptide comprising major histocompatibility complex (MHC) class I transmembrane and trafficking domain (MITD), nucleic acids encoding the fusion polypeptide, a vaccine comprising an RNA polynucleotide that encodes the fusion polypeptide, wherein the vaccine is formulated in a lipid nanoparticle, and a method of treating a cancer in the subject by administering to the subject a therapeutically effective amount of the vaccine.

Description

THERAPEUTIC LY6K MRNA VACCINE FOR CANCERCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0001] This application claims the benefit of, and priority to, PCT Application No. PCT / CN2024 / 070626, filed January 4, 2024 and PCT Application No. PCT / CN2023 / 141617, filed December 25, 2023. The contents of these applications are incorporated herein by reference in their entireties for all purposesFIELD OF THE INVENTION

[0002] The present disclosure relates to a vaccine comprising an RNA polynucleotide that comprises at least one open reading frame (ORF) encoding the LY6K protein, and lipid nanoparticle (LNP) composition thereof. The present disclosure also provides a method of treating cancer in the subject.BACKGROUND

[0003] Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer worldwide (890,000 new cases and 450,000 deaths annually) and occurs in the mucosal surfaces of four major anatomical sites: oral cavity, sinonasal cavity, pharynx and larynx. The major cause of HNSCC are tobacco, alcohol and human papillomavirus (HPV) infection.

[0004] HNSCC of the oral cavity is generally treated with surgical resection, followed by adjuvant chemotherapy plus radiotherapy. Molecularly targeted agents, such as the epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitor cetuximab, have shown modest success in locally advanced disease. Finally, two immune-checkpoint inhibitors (ICIs) targeting PD1 (nivolumab and pembrolizumab) are approved for the treatment of recurrent and / or metastatic (R / M) HNSCC. Unfortunately, only 15–20%of patients with HNSCC achieve a durable response to these agents despite a twofold to threefold higher expression of PD1 and PDL1 within the tumor. Thus, there is an unmet need to develop new modalities and therapies that can improve therapeutic outcomes and prolong survival for patients with cancer.

[0005] Lung cancer is one of the most commonly diagnosed cancers, and the leading cause of cancer-related mortality worldwide (Siegel 2016) . In 2020, an estimated 228, 820 new cases of lung cancer were to be diagnosed in the United States, and 135, 720 people were estimated to die from the disease (American Cancer Society 2020) . Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for 80-85%of all lung cancers, and is composed of several histopathological subtypes, the most common of which are adenocarcinoma (40-60%) and squamous cell carcinoma (30%) . The majority of patients with NSCLC are often found to have advanced cancer at the time of diagnosis.

[0006] Systemic therapy with platinum-based doublet regimens, with or without maintenance therapy was until recently the standard first-line treatment for patients with advanced NSCLC whose tumors do not have an epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation, an anaplastic lymphoma kinase (ALK) mutation, or a c-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase (ROS1) fusion (Besse 2014, Ettinger 2016, Reck 2014) . This is still the standard of care for patients in countries where therapies with immune checkpoint inhibitors are not approved or available. Chemotherapy for metastatic NSCLC is not curative and despite optimal treatment, patients have a median overall survival (OS) of approximately 8 to 12 months, and a 5-year survival rate of approximately 18% (Siegel, 2016) . Therefore, newer therapeutic approaches are needed that will improve long-term survival and quality of life (QOL) in patients with lung cancer, particularly advanced NSCLC.

[0007] Messenger RNA (mRNA) has emerged as a new category of pharmaceutical agent for various therapeutic applications, including viral vaccines, protein replacements, immunotherapy, and gene editing. To function in vivo, mRNA requires safe, effective and stable delivery systems that protect the nucleic acid from degradation and that allow cellular uptake and mRNA release. To date, the most successful delivery system for mRNA in clinical trials are lipid-based carrier vehicles which are dissolved in ethanol and then mixed with an aqueous solution of the nucleic acid to form lipid nanoparticles (LNPs) . The LNP compositions of the present disclosure can induce an immune response and stimulate T effector cells in vivo and, accordingly are useful in treating cancer.SUMMARY

[0008] In one aspect, the present disclosure provides a fusion polypeptide comprises, in order from the N-terminal, (i) a first polypeptide comprising LY6K protein; and (ii) a second polypeptide comprising major histocompatibility complex (MHC) class I transmembrane and trafficking domain (MITD) , preferably, the first polypeptide and the second polypeptide are connected by a linker; or preferably, the second polypeptide is linked to C terminal of the first polypeptide by a linker, more preferably, the linker comprises a sequence of (G4S) n, n≥1.

[0009] In one embodiment, the fusion polypeptide comprises a signal peptide. Preferably, the signal peptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.

[0010] In one embodiment, the LY6K protein is a full-length LY6K protein or its variant.

[0011] In one embodiment, the LY6K protein comprises an endogenous signal peptide. Preferably, the endogenous signal peptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.

[0012] In one embodiment, the LY6K protein does not comprises a signal peptide.

[0013] In one embodiment, the LY6K protein comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-3; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-3.

[0014] In one embodiment, the MITD comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, 24, 25, and 26; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 24, 25, and 26.

[0015] In one embodiment, the MITD comprises a transmembrane domain sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 16-19, and intracellular domain sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21-23.

[0016] In one embodiment, the fusion polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 and 5; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 and 5.

[0017] In one aspect, the present disclosure provides a nucleic acid molecule comprises, in order from the 5’-terminal, (i) a first polynucleotide encoding LY6K protein; and (ii) a second polynucleotide encoding major histocompatibility complex (MHC) class I transmembrane and trafficking domain (MITD) .

[0018] In one embodiment, the nucleic acid molecule comprising a polynucleotide sequence that encodes the fusion polypeptide.

[0019] In one embodiment, the first polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 31 and 37; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 31 and 37.

[0020] In one embodiment, the first polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32 and 38; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32 and 38.

[0021] In one embodiment, the second polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 33 and 39; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 33 and 39.

[0022] In one embodiment, the nucleic acid molecule comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 30 and 36; or a nucleic acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 30 and 36.

[0023] In one aspect, the present disclosure provides a RNA polynucleotide, comprising, in order from the 5’-terminal, (i) a first polynucleotide encoding LY6K protein; and (ii) a second polynucleotide encoding major histocompatibility complex (MHC) class I transmembrane and trafficking domain (MITD) .

[0024] In one embodiment, the RNA polynucleotide having an open reading frame encoding the fusion polypeptide.

[0025] In one embodiment, an initiator codon that encodes the fusion polypeptide is AUG.

[0026] In one embodiment, a terminator codon that encodes the fusion polypeptide is selected from UGA, UAA or UAG.

[0027] In one embodiment, the first polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 and 13; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 and 13.

[0028] In one embodiment, the first polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 28 and 29; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 28 and 29.

[0029] In one embodiment, the second polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 and 14; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 and 14.

[0030] In one embodiment, the RNA polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7 and 12, and a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to SEQ ID NOs: 7 and 12.

[0031] In some aspect, the present disclosure provides a cancer associate antigen vaccine, comprising an RNA polynucleotide that comprises at least one open reading frame (ORF) encoding the fusion polypeptide.

[0032] In one embodiment, the RNA polynucleotide comprises a messenger RNA (mRNA) .

[0033] In one embodiment, the RNA polynucleotide further comprises a 5’ UTR. Preferably, the 5’ UTR comprises a sequence of SEQ ID NO: 45.

[0034] In one embodiment, the RNA polynucleotide further comprises a 3’ UTR. Preferably, the 3’ UTR comprises a sequence of SEQ ID NO: 46 or SEQ ID NO: 47.

[0035] In one embodiment, the open reading frame is codon-optimized.

[0036] In one embodiment, the RNA polynucleotide further comprises at least one 5’ terminal cap, a 3’ polyA tail, and / or a Kozak sequence.

[0037] In one embodiment, the 5’ terminal cap comprises a sequence of SEQ ID NO: 49. In one embodiment, the 3’ polyA tail comprises a sequence of SEQ ID NO: 48.

[0038] In one embodiment, the RNA polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 41-44; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 41-44.

[0039] In one embodiment, the RNA polynucleotide is unmodified.

[0040] In one embodiment, the RNA polynucleotide comprises at least one modified nucleotide.

[0041] In one embodiment, the vaccine is formulated in a lipid nanoparticle (LNP) .

[0042] In one embodiment, the LNP comprises an ionizable cationic lipid, phosphatidylcholine, cholesterol, and PEG-lipid.

[0043] In some aspect, the present disclosure provides composition comprising (i) the fusion polypeptide, the nucleic acid molecule, the RNA polynucleotide, or the vaccine; and (ii) a pharmaceutically acceptable carrier.

[0044] In some aspect, the present disclosure provides a method of inducing an antigen specific immune response in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the fusion polypeptide, the nucleic acid molecule, the RNA polynucleotide, the vaccine, or the composition to produce an antigen specific immune response.

[0045] In one embodiment, the antigen specific immune response comprises a T cell response.

[0046] In one embodiment, the antigen specific immune response comprises a B cell response.

[0047] In some aspect, the present disclosure provides a method of treating a cancer in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the fusion polypeptide, the nucleic acid molecule, the RNA polynucleotide, the vaccine, or the composition.

[0048] In one embodiment, the cancer is selected from the group consisting of lung cancer, prostate cancer, breast cancer, esophageal cancer, colorectal cancer, bladder cancer, gastric cancer, head and neck cancer, liver cancer, renal cancer, glioma, endometrial cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, melanoma, and mesothelioma.

[0049] In one embodiment, the subject is human.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0050] FIG. 1 shows western blot analysis of Ly6k protein expression level of two mRNA (LY6K-1 and LY6K-2) of different nucleotide sequence.

[0051] FIG. 2 shows the IFN-γ Enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay of mice spleen on days 0, 3, and 7 after mRNA-LNP injection.

[0052] FIG. 3 shows the IFN-γ Enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay of mice lymph nodes on days 0, 3, and 7 after mRNA-LNP injection.

[0053] FIG. 4 shows mice body weight change after immunization.

[0054] FIG. 5 shows tumor volume change in mice after administration.DETAILED DESCRIPTION

[0055] It is to be understood that this disclosure is not limited to the particular methodologies, protocols and reagents described herein as these may vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to limit the scope of the present disclosure which will be limited only by the appended claims. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meanings as commonly understood by one of ordinary skill in the art.

[0056] As used herein, the singular form “a” , “an” and “the” include plural references unless the context clearly dictates otherwise. For example, the term “a substitution” or “at least one substitution” may include a plurality of substitutions.

[0057] Unless expressly specified otherwise, the term “comprising” is used in the context of the present document to indicate that further members may optionally be present in addition to the members of the list introduced by “comprising” . It is, however, contemplated as a specific embodiment of the present disclosure that the term “comprising” encompasses the possibility of no further members being present, i.e. for the purpose of this embodiment “comprising” is to be understood as having the meaning of “consisting of” .

[0058] As used herein, the term “identical” or percent “identity” in the context of two or more nucleic acid or polypeptide sequences, refers to two or more sequences or subsequences that are the same or have a specified percentage of amino acid residues or nucleotides that are the same, when compared and aligned for maximum correspondence. Methods of alignment of sequences for comparison are well known in the prior art. Once aligned, the number of matches is determined by counting the number of positions where an identical nucleotide or amino acid residue is present in both sequences. The percent sequence identity is determined by dividing the number of matches either by the length of the sequence set forth in the identified sequence, or by an articulated length (such as 100 consecutive nucleotides or amino acid residues from a sequence set forth in an identified sequence) , followed by multiplying the resulting value by 100. For example, a peptide sequence that has 1166 matches when aligned with a test sequence having 1554 amino acids is 75.0 percent identical to the test sequence (1166÷1554*100=75.0) . FUSION POLYPEPTIDE

[0059] The term “fusion polypeptide” refers to a polypeptide containing polypeptides or segments of polypeptides from different sources, such as a biologically active segment of LY6K and a biologically active segment of major histocompatibility complex (MHC) class I transmembrane and trafficking domain (MITD) . A fusion protein may be produced by joining two or more polynucleotides that originally coded for the separate proteins or protein segments into a single fusion polynucleotide. Besides the polynucleotide sequences encoding for the separate proteins, a fusion polynucleotide may comprise other polynucleotide sequences such as those encoding translation interrupter sequences or those encoding amino acid sequences which otherwise traffic or process an expressed protein.

[0060] In one aspect, the present disclosure provides a fusion polypeptide comprises, in order from the N-terminal, (i) a first polypeptide comprising LY6K protein; and (ii) a second polypeptide comprising major histocompatibility complex (MHC) class I transmembrane and trafficking domain (MITD) . In one embodiment, the fusion polypeptide comprises a signal peptide. In one embodiment, the LY6K protein is a full-length LY6K protein. In one embodiment, the LY6K protein comprises an endogenous signal peptide.

[0061] In one embodiment, the LY6K protein comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-3, or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-3.

[0062] In one embodiment, the MITD comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 24, 25, and 26, or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 24, 25, and 26.

[0063] In one embodiment, the fusion polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 and 5, or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 and 5.

[0064] The terms “major histocompatibility complex” and the abbreviation “MHC” include MHC class I and MHC class II molecules and relate to a complex of genes which occurs in all vertebrates. MHC proteins or molecules are important for signaling between lymphocytes and antigen presenting cells or diseased cells in immune reactions, wherein the MHC proteins or molecules bind peptides and present them for recognition by T cell receptors. The proteins encoded by the MHC are expressed on the surface of cells, and display both self antigens (peptide fragments from the cell itself) and non-self antigens (e.g., fragments of invading microorganisms) to a T cell.

[0065] The MHC region is divided into three subgroups, class I, class II, and class III. MHC class I proteins contain an α-chain and β2-microglobulin (not part of the MHC encoded by chromosome 15) . They present antigen fragments to cytotoxic T cells. On most immune system cells, specifically on antigen-presenting cells, MHC class II proteins contain α-and β-chains and they present antigen fragments to T-helper cells. MHC class III region encodes for other immune components, such as complement components and some that encode cytokines. RNA POLYNUCLEOTIDE

[0066] In one aspect, the present disclosure provides a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence that encodes the fusion polypeptide. In one embodiment, the nucleic acid molecule comprises, in order from the 5’-terminal, (i) a first polynucleotide encoding LY6K protein; and (ii) a second polynucleotide encoding major histocompatibility complex (MHC) class I transmembrane and trafficking domain (MITD) .

[0067] In one embodiment, the first polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 and 13, or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 and 13.

[0068] In one embodiment, the first polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 28 and 29, or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 28 and 29.

[0069] In one embodiment, the second polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 and 14, or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 and 14.

[0070] In one embodiment, the nucleic acid molecule comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7 and 12, and a nucleic acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7 and 12.

[0071] In one aspect, the present disclosure provides an RNA polynucleotide having an open reading frame encoding the fusion polypeptide. In one embodiment, an initiator codon that encodes the fusion polypeptide is AUG. In one embodiment, a terminator codon that encodes the fusion polypeptide is selected from UGA, UAA or UAG.

[0072] In some aspect, the present disclosure provides a cancer associate antigen vaccine, comprising an RNA polynucleotide that comprises at least one open reading frame (ORF) encoding the fusion polypeptide.

[0073] In one embodiment, the RNA polynucleotide comprises a messenger RNA (mRNA) .

[0074] In one embodiment, the RNA polynucleotide further comprises a 5’ UTR, preferably, the 5’ UTR comprises a sequence of SEQ ID NO: 45.

[0075] In one embodiment, the RNA polynucleotide further comprises a 3’ UTR. preferably, the 3’ UTR comprises a sequence of SEQ ID NO: 46 or SEQ ID NO: 47.

[0076] In one embodiment, the open reading frame is codon-optimized.

[0077] In one embodiment, the RNA polynucleotide further comprises at least one 5’ terminal cap, a 3’ polyA tail, and / or a Kozak sequence.

[0078] In one embodiment, the RNA polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 41-44; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 41-44.

[0079] As used herein, the term “Messenger RNA” (mRNA) refers to any polynucleotide that encodes a (at least one) polypeptide (anaturally-occurring, non-naturally-occurring, or modified polymer of amino acids) and can be translated to produce the encoded polypeptide in vitro, in vivo, in situ or ex vivo. The skilled artisan will appreciate that, except where otherwise noted, polynucleotide sequences set forth in the instant application will recite “T” s in a representative DNA sequence but where the sequence represents RNA (e.g., mRNA) , the “T” s would be substituted for “U” s. Thus, any of the RNA polynucleotides encoded by a DNA identified by a particular sequence identification number may also comprise the corresponding RNA (e.g., mRNA) sequence encoded by the DNA, where each “T” of the DNA sequence is substituted with “U. ”

[0080] The basic components of an mRNA molecule typically include at least one coding region, a 5’ untranslated region (UTR) , a 3’ UTR, a 5’ cap and a poly-A tail. Polynucleotides of the present disclosure may function as mRNA but can be distinguished from wild-type mRNA in their functional and / or structural design features, which serve to overcome existing problems of effective polypeptide expression using nucleic-acid based therapeutics.

[0081] Polynucleotides (e.g., mRNAs) of the present disclosure, in some embodiments, are codon optimized. Codon optimization methods are known in the art and may be used as provided herein. Codon optimization, in some embodiments, may be used to match codon frequencies in target and host organisms to ensure proper folding; bias GC content to increase mRNA stability or reduce secondary structures; minimize tandem repeat codons or base runs that may impair gene construction or expression; customize transcriptional and translational control regions; insert or remove protein trafficking sequences; remove / add post translation modification sites in encoded protein (e.g., glycosylation sites) ; add, remove or shuffle protein domains; insert or delete restriction sites; modify ribosome binding sites and mRNA degradation sites; adjust translational rates to allow the various domains of the protein to fold properly; or reduce or eliminate problem secondary structures within the polynucleotide. Codon optimization tools, algorithms and services are known in the art, non-limiting examples include services from GeneArt (Life Technologies) , DNA2.0 (Menlo Park Calif. ) and / or proprietary methods. In some embodiments, the open reading frame (ORF) sequence is optimized using optimization algorithms.

[0082] As used herein, the term “5’ untranslated region” (UTR) refers to a region of an mRNA that is directly upstream (i.e., 5’) from the start codon (i.e., the first codon of an mRNA transcript translated by a ribosome) that does not encode a polypeptide.

[0083] As used herein, the term “3’ untranslated region” (UTR) refers to a region of an mRNA that is directly downstream (i.e., 3’) from the stop codon (i.e., the codon of an mRNA transcript that signals a termination of translation) that does not encode a polypeptide.

[0084] As used herein, the term “open reading frame” is a continuous stretch of DNA beginning with a start codon (e.g., methionine (ATG) ) , and ending with a stop codon (e.g., TAA, TAG or TGA) and encodes a polypeptide.

[0085] As used herein, the term “polyA tail” is a region of mRNA that is downstream, e.g., directly downstream (i.e., 3’) , from the 3’ UTR that contains multiple, consecutive adenosine monophosphates. A polyA tail may contain 10 to 300 adenosine monophosphates. For example, a polyA tail may contain 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 or 300 adenosine monophosphates. In some embodiments, a polyA tail contains 50 to 250 adenosine monophosphates. In a relevant biological setting (e.g., in cells, in vivo) the poly (A) tail functions to protect mRNA from enzymatic degradation, e.g., in the cytoplasm, and aids in transcription termination, and / or export of the mRNA from the nucleus and translation.

[0086] As used herein, the term “vaccine” refers to a pharmaceutical composition comprising an immunogen that can elicit a prophylactic or therapeutic immune response in a subject. Typically, a vaccine elicits an antigen-specific immune response to an antigen of a pathogen, for example, a viral pathogen. Vaccines, as provided herein, comprise at least one (one or more) ribonucleic acid (RNA) polynucleotide having an open reading frame encoding at least one LY6K antigenic polypeptide. The term “nucleic acid” in its broadest sense, includes any compound and / or substance that comprises a polymer of nucleotides. These polymers are referred to as polynucleotides. LNP

[0087] In one embodiment, the vaccine is formulated in a lipid nanoparticle (LNP) . In one embodiment, the LNP comprises an ionizable cationic lipid, phosphatidylcholine, cholesterol, and PEG-lipid.

[0088] In the context of the present disclosure, the term “lipid nanoparticle” or “LNP” relates to a structured entity formed by molecules or molecule complexes. In one embodiment, the term “lipid nanoparticle” relates to a micro-or nano-sized structure, such as a micro-or nano-sized compact structure dispersed in a medium. The term “RNA-lipid nanoparticle” relates to a particle that contains RNA. As used in the present disclosure, “nanoparticle” refers to a particle having an average diameter suitable for intravenous administration. An “RNA-lipid nanoparticle” can be used to deliver nucleic acid to a target site of interest (e.g., cell, tissue, organ, and the like) . RNA-lipid nanoparticle includes lipid nanoparticle (LNP) -based formulations. Generally, the RNA-lipid nanoparticle described herein are obtainable by mixing an RNA containing phase with a lipid containing phase. This can be mixing an ethanol phase or other water-miscible solvent comprising lipids, such as cationic lipids like DODMA, and additional lipids, with an aqueous phase comprising RNA. Another option is mixing an aqueous phase comprising the lipids, for example comprising lipids in form of liposomes or other types of lipid dispersions, with another aqueous phase comprising RNA. Methods for preparing RNA-lipid nanoparticle described herein may involve obtaining a colloid comprising at least one cationic or cationically ionizable lipid or lipid-like material and mixing the colloid with RNA to obtain nucleic acid particles.

[0089] In some embodiments, the nucleic acid vaccine compositions of the present disclosure may be formulated in a lipid nanoparticle (LNP) . In general, LNPs can be characterized as small solid or semi-solid particles possessing an exterior lipid layer with a hydrophilic exterior surface that is exposed to the non-LNP environment, an interior space which may aqueous (vesicle like) or non-aqueous (micelle like) , and at least one hydrophobic inter-membrane space. LNP membranes may be lamellar or non-lamellar and may be comprised of 1, 2, 3, 4, 5 or more layers. In some embodiments, LNPs may comprise a cargo or a payload into their interior space, into the inter membrane space, onto their exterior surface, or any combination thereof.

[0090] LNPs useful herein are known in the art and generally comprise cholesterol, a phospholipid, a polyethylene glycol (PEG) derivative, and an ionizable lipid. In some embodiments a lipid nanoparticle may be comprised of at least one cationic lipid, at least one non-cationic lipid, at least one sterol, at least one additional LNP functional component, or any combination thereof.

[0091] In some embodiments, the LNP comprises at least one cationic lipid in an amount of about 0.1 to 100 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one cationic lipid in an amount of about 20 to 60 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one cationic lipid in an amount of about 50 to 85 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one cationic lipid in an amount of less than about 20 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one cationic lipid in an amount of more than about 60 mol%or about 85 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one cationic lipid in an amount of about 95 mol%or less. In some embodiments, the LNP comprises a cationic lipid in an amount of less than or equal to about 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, and 5 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one cationic lipid in an amount of more than or equal to about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, and 95 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one cationic lipid in an amount from about 20 to 30 mol%, 20 to 35 mol%, 20 to 40 mol%, 20 to 45 mol%, 20 to 50 mol%, 20 to 55 mol%, 20 to 60 mol%, 20 to 65 mol%, 20 to 70 mol%, 20 to 75 mol%, 20 to 80 mol%, 20 to 85 mol%, 20 to 90 mol%, 25 to 35 mol%, 25 to 40 mol%, 25 to 45 mol%, 25 to 50 mol%, 25 to 55 mol%, 25 to 60 mol%, 25 to 65 mol%, 25 to 70 mol%, 25 to 75 mol%, 25 to 80 mol%, 25 to 85 mol%, 25 to 90 mol%, 30 to 40 mol%, 30 to 45 mol%, 30 to 50 mol%, 30 to 55 mol%, 30 to 60 mol%, 30 to 65 mol%, 30 to 70 mol%, 30 to 75 mol%, 30 to 80 mol%, 30 to 85 mol%, 30 to 90 mol%, 35 to 40 mol%, 35 to 45 mol%, 35 to 50 mol%, 35 to 55 mol%, 35 to 60 mol%, 35 to 65 mol%, 35 to 70 mol%, 35 to 75 mol%, 35 to 80 mol%, 35 to 85 mol%, 35 to 90 mol%, 40 to 45 mol%, 40 to 50 mol%, 40 to 55 mol%, 40 to 60 mol%, 40 to 65 mol%, 40 to 70 mol%, 40 to 75 mol%, 40 to 80 mol%, 40 to 85 mol%, 40 to 90 mol%, 45 to 55 mol%, 45 to 60 mol%, 45 to 65 mol%, 45 to 70 mol%, 45 to 75 mol%, 45 to 80 mol%, 45 to 85 mol%, 45 to 90 mol%, 50 to 60 mol%, 50 to 65 mol%, 50 to 70 mol%, 50 to 75 mol%, 50 to 80 mol%, 50 to 85 mol%, 50 to 90 mol%, 55 to 65 mol%, 55 to 70 mol%, 55 to 75 mol%, 55 to 80 mol%, 55 to 85 mol%, 55 to 90 mol%, 60 to 70 mol%, 60 to 75 mol%, 60 to 80 mol%, 60 to 85 mol%, 60 to 90 mol%, 65 to 75 mol%, 65 to 80 mol%, 65 to 85 mol%, 65 to 90 mol%, 70 to 80 mol%, 70 to 85 mol%, 70 to 90 mol%, 75 to 85 mol%, 75 to 90 mol%, 80 to 90 mol%or 85 to 95 mol%.

[0092] In some embodiments, the LNP comprises at least one non-cationic lipid in an amount of about 0.1 to 100 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one non-cationic lipid in an amount of about 5 to 35 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one cationic lipid in an amount of about 5 to 25 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one non-cationic lipid in an amount of less than about 5 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one non-cationic lipid in an amount of more than about 25 mol%or about 35 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one non-cationic lipid in an amount of about 95 mol%or less. In some embodiments, the LNP comprises at least one non-cationic lipid in an amount of less than or equal to about 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, and 5 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one non-cationic lipid in an amount of more than or equal to about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, and 95 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one non-cationic lipid in an amount from about 5 to 15 mol%, 5 to 25 mol%, 5 to 35 mol%, 5 to 45 mol%, 5 to 55 mol%, 10 to 20 mol%, 10 to 30 mol%, 10 to 40 mol%, 10 to 50 mol%, 15 to 25 mol%, 15 to 35 mol%, 15 to 45 mol%, 20 to 30 mol%, 20 to 40 mol%, 20 to 50 mol%, 25 to 35 mol%, 25 to 45 mol%, 30 to 40 mol%, 30 to 50 mol%, and 35 to 45 mol%.

[0093] In some embodiments, the LNP comprises at least one sterol in an amount of about 0.1 to 100 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one sterol in an amount of about 20 to 45 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one sterol in an amount of about 25 to 55 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one sterol in an amount of less than about 20 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one sterol in an amount of more than about 45 mol%or about 55 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one sterol in an amount of about 95 mol%or less. In some embodiments, the LNP comprises at least one sterol in an amount of less than or equal to about 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, and 5 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one sterol in an amount of more than or equal to about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, and 95 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one sterol in an amount from about 10 to 20 mol%, 10 to 30 mol%, 10 to 40 mol%, 10 to 50 mol%, 10 to 60 mol%, 15 to 25 mol%, 15 to 35 mol%, 15 to 45 mol%, 15 to 55 mol%, 15 to 65 mol%, 20 to 30 mol%, 20 to 40 mol%, 20 to 50 mol%, 20 to 60 mol%, 25 to 35 mol%, 25 to 45 mol%, 25 to 55 mol%, 25 to 65 mol%, 30 to 40 mol%, 30 to 50 mol%, 30 to 60 mol%, 35 to 45 mol%, 35 to 55 mol%, 35 to 65 mol%, 40 to 50 mol%, 40 to 60 mol%, 45 to 55 mol%, 45 to 65 mol%, 50 to 60 mol%, and 55 to 65 mol%.

[0094] In some embodiments, the LNP comprises at least one additional LNP functional component in an amount of about 0.1 to 100 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one additional LNP functional component in an amount of about 0.5 to 15 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one additional LNP functional component in an amount of about 15 to 40 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one additional LNP functional component in an amount of less than about 0.1 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one additional LNP functional component in an amount of more than about 15 mol%or about 40 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one additional LNP functional component in an amount of about 95 mol%or less. In some embodiments, the LNP comprises at least one additional LNP functional component in an amount of less than or equal to about 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, and 5 mol%. In some embodiments, the LNP comprises at least one additional LNP functional component in an amount of more than or equal to about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, and 95 mol%.

[0095] In some embodiments, the LNP includes about 30-60 mol%of at least one cationic lipid, about 0-30 mol%of at least one non-cationic lipid (e.g., a phospholipid) , about 18.5-48.5 mol%of at least one sterol (e.g., cholesterol) , and about 0-10 mol%of at least one additional LNP functional component (e.g., a PEGylated lipid) .

[0096] In some embodiments, the LNPs can be characterized by their size. In some embodiments, the size of an LNP can be defined as the diameter of its largest circular cross section, referred to herein simply as its diameter. In some embodiments, the LNPs may have a diameter between 30 nm to about 150 nm. In some embodiments, the LNP may have diameters ranging between about 40 to 150 nm, 50 to 150 nm, 60 to 150 nm, about 70 to 150 nm, or 80 to 150 nm, 90 to 150 nm, 100 nm to 150 nm, 110 to 150 nm, 120 to 150 nm, 130 to 150 nm, or 140 to 150 nm.

[0097] Uniformity may be expressed in some embodiments as the polydispersity index (PDI) of the population. In some embodiments, uniformity may be expressed in some embodiments as the disparity of the population. The terms “polydispersity index” and “disparity” are understood herein to be equivalent and may be used interchangeably. In some embodiments, a population of LNPs resulting from a given formulation will have a PI of between about 0.1 and 1. In some embodiments, a population of LNPs resulting from a giving formulation will have a PI of less than about 1, less than about 0.5, less than about 0.4, less than about 0.3, less than about 0.2, less than about 0.1. In some embodiments, a population of LNPs resulting from a given formulation will have a PI of between about 0.1 to 1, 0.1 to 0.8, 0.1 to 0.6, 0.1 to 0.4, 0.1 to 0.2, 0.2 to 1, 0.2 to 0.8, 0.2 to 0.6, 0.2 to 0.4, 0.4 to 1, 0.4 to 0.8, 0.4 to 0.6, 0.6 to 1, 0.6 to 0.8, and 0.8 to 1.

[0098] In some embodiments, the LNP may fully or partially encapsulate a cargo, such as nucleic acid molecules of the present disclosure. In some embodiments, essentially 0%of the cargo present in the final formulation is exposed to the environment outside of the LNP (i.e., the cargo is fully encapsulated) . In some embodiments, the cargo is associated with the LNP but is at least partially exposed to the environment outside of the LNP. In some embodiments, the LNP may be characterized by the %of the cargo not exposed to the environment outside of the LNP, e.g., the encapsulation efficiency. For the sake of clarity, an encapsulation efficiency of about 100%refers to an LNP formulation where essentially all the cargo is fully encapsulated by the LNP, while an encapsulation rate of about 0%refers to an LNP where essentially none of the cargo is encapsulated in the LNP, such as with an LNP where the cargo is bound to the external surface of the LNP. In some embodiments, an LNP may have an encapsulation efficiency of less than about 100%, less than about 95%, less than about 85%, less than about 80%, less than about 75%, less than about 70%, less than about 65%, less than about 60%, less than about 55%, less than about 50%, less than about 45%, less than about 40%, less than about 35%, less than about 30%, less than about 25%, less than about 20%, less than about 15%, less than about 10%, or less than 5%. In some embodiments, an LNP may have an encapsulation efficiency of between about 90 to 100%, 80 to 100%, 70 to 100%, 60 to 100%, 50 to 100%, 40 to 100%, 30 to 100%, 20 to 100%, 10 to 100%, 80 to 90%, 70 to 90%, 60 to 90%, 50 to 90%, 40 to 90%, 30 to 90%, 20 to 90%, 10 to 90%, 70 to 80%, 60 to 80%, 50 to 80%, 40 to 80%, 30 to 80%, 20 to 80%, 10 to 80%, 60 to 70%, 50 to 70%, 40 to 70%, 30 to 70%, 20 to 70%, 10 to 70%, 40 to 50%, 30 to 50%, 20 to 50%, 10 to 50%, 30 to 40%, 20 to 40%, 10 to 40%, 20 to 30%, 10 to 30%, and 10 to 20%.

[0099] In some embodiments, the lipid nanoparticles may have a diameter from about 10 to 500 nm.

[0100] In some embodiments, the lipid nanoparticle may have a diameter greater than 100 nm, greater than 150 nm, greater than 200 nm, greater than 250 nm, greater than 300 nm, greater than 350 nm, greater than 400 nm, greater than 450 nm, greater than 500 nm, greater than 550 nm, greater than 600 nm, greater than 650 nm, greater than 700 nm, greater than 750 nm, greater than 800 nm, greater than 850 nm, greater than 900 nm, greater than 950 nm or greater than 1000 nm. Pharmaceutical composition

[0101] In some aspect, the present disclosure provides composition comprising (i) the fusion polypeptide, the nucleic acid molecule, the RNA polynucleotide, or the vaccine; and (ii) a pharmaceutically acceptable carrier.

[0102] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable carriers” refers to a material or composition which, when combined with an active ingredient, is compatible with the active ingredient and does not cause toxic or otherwise unwanted reactions when administered to a subject, particularly a mammal. Examples of pharmaceutically acceptable carriers include solvents, surfactants, suspending agents, buffering agents, lubricating agents, emulsifiers, absorbents, dispersion media, coatings, and stabilizers. TREATMENT

[0103] In some aspect, the present disclosure provides a method of inducing an antigen specific immune response in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the fusion polypeptide, the nucleic acid molecule, the RNA polynucleotide, the vaccine, or the composition to produce an antigen specific immune response. In one embodiment, the antigen specific immune response comprises a T cell response. In one embodiment, the antigen specific immune response comprises a B cell response.

[0104] As used herein, the term “immune response” refers to any detectable response of a cell or cells of the immune system of a host mammal to a stimulus (such as an immunogen) , including, but not limited to, innate immune responses (e.g., activation of Toll receptor signaling cascade) , cell mediated immune responses (e.g., responses mediated by T cells, such as antigen-specific T cells, and non-specific cells of the immune system) , and humoral immune responses (e.g., responses mediated by B cells, such as generation and secretion of antibodies into the plasma, lymph, and / or tissue fluids) . Examples of immune responses include an alteration (e.g., increase) in Toll-like receptor activation, lymphokine (e.g., cytokine (e.g., Th1, Th2 or Th17 type cytokines) or chemokine) expression or secretion, macrophage activation, dendritic cell activation, T cell (e.g., CD4+ or CD8+ T cell) activation, NK cell activation, B cell activation (e.g., antibody generation and / or secretion) , binding of an immunogen (e.g., antigen (e.g., immunogenic polypeptide) ) to an MHC molecule, induction of a cytotoxic T lymphocyte ( “CTL” ) response, induction of a B cell response (e.g., antibody production) , and, expansion (e.g., growth of a population of cells) of cells of the immune system (e.g., T cells and B cells) , and increased processing and presentation of antigen by antigen presenting cells. The term “immune response” also encompasses any detectable response to a particular substance (such as an antigen or immunogen) by one or more components of the immune system of a vertebrate animal in vitro.

[0105] In some aspect, the present disclosure provides a method of treating a cancer in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the fusion polypeptide, the nucleic acid molecule, the RNA polynucleotide, the vaccine, or the composition.

[0106] As used herein, the term “effective amount” refers to an amount of agent that is sufficient to generate a desired response. For instance, this can be the amount necessary to inhibit viral replication or to measurably alter outward symptoms of the viral infection.

[0107] In one embodiment, the cancer is selected from the group consisting of lung cancer, prostate cancer, breast cancer, esophageal cancer, colorectal cancer, bladder cancer, gastric cancer, head and neck cancer, liver cancer, renal cancer, glioma, endometrial cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, melanoma, and mesothelioma (Cancer Res. 2007 Dec 15; 67 (24) : 11601-11. Ann Gastroenterol Surg. 2020 Dec 14; 5 (2) : 194-203. Oncotarget. 2016 Aug 23; 7 (34) : 55677-55689. Oncotarget. 2016 Mar 8; 7 (10) : 11165-93. ) .

[0108] As used herein, the term “subject” refers to either a human or a non-human mammal. The term “mammal” refers to any animal species of the Mammalia class. Examples of mammals include: humans; non-human primates such as monkeys; laboratory animals such as rats, mice, and guinea pigs; domestic animals such as cats, dogs, rabbits, cattle, sheep, goats, horses, and pigs; and captive wild animals such as lions, tigers, elephants, and the like. In one embodiment, the subject is human. Examples

[0109] The disclosure is further described by the following illustrative examples. The examples do not limit the disclosure in any way. They merely serve to clarify the disclosure. Example 1: Antigen design

[0110] The human major histocompatibility complex (MHC) class I transmembrane and trafficking domain (MITD) (Table 1) was fused to the C-terminal of the full-length LY6K antigens (Table 2) to generate a fusion polypeptide (SEQ ID NO: 1) .

[0111] Table 1. Amino Acid Sequences information of MITD

[0112] Different encoding mRNA sequences which encoding the target antigen (with MITD) were designed with proprietary codon optimization algorithms, LY6K-1 and LY6K-2, which can improve mRNA better stability and translational efficiency, and further protein expression.

[0113] Table 2. Amino Acid Sequence information

[0114] Table 3. Encoding mRNA sequence information

[0115] Table 4. CDS DNA sequence information

[0116] Table 5. mRNA sequences of construct Example 2: Plasmid design

[0117] The nucleotide sequences of full-length antigen, which contains the optimized 5’-Untranslated regions (UTR) , 3-UTR and polyA tail. The plasmid was extracted after amplification in E. coli, were cloned into the multiple cloning site (MCS) of pUC57-kan plasmid backbone (Genscript) using homologous recombination. Example 3: mRNA preparation

[0118] The plasmid was linearized with the BspQI restriction enzyme (New England Biolabs, R0712L) . After purified using QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Cat.: 278704) , the linearized plasmid DNA was in vitro transcribed into mRNA by High yield T7 IVT kit (Hongene, Cat.: ON-040) following the manufacturer’s instructions, which containing the modified mRNA molecules (N1-Methyl-pseudouridine, Hongene, Cat.: R5-064) and m7G (5') ppp (5') (2'-OMeA) pG (Hongene, Cat.: ON-134) . Then the transcribed mRNA was recovered through RNA Cleanup Kit (NEW ENGLAND BioLabs, Cat. T2050L) following the manufacturer’s instructions. The purified mRNA was stored at -80℃. Example 4: mRNA-LNP preparation

[0119] A mix of lipids containing the ionizable lipid, phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-conjugated lipid was dissolved in ethanol. The molar ratio of ionizable lipid (DLin-MC3-DMA) , phosphatidylcholine (DSPC) , cholesterol and Pegylated lipid (PEG2000-DMG) was 50: 10: 38.5: 1.5. And mRNA was dissolved in a sterile and RNase-free 10 mM sodium acetate buffer (pH 4.0) prior to preparation (the N: P ratio was 6: 1) . Lipid nanoparticles were prepared by a rapid mixing of lipids mixture containing ethanol phase with an aqueous phase containing the RNA using a microfluidic mixing device (AITESEN, model L2, one volume of lipid mixture in ethanol and three volumes of RNA in 10 mM sodium acetate buffer) at a total flow rate of 20 mL / min, and directly mixed and diluted with 10 volumes of 1x phosphate buffered saline (PBS) . The lipid nanoparticles containing RNA were subjected to diafiltration and ultrafiltration using Amicon Ultra-15 Centrifugal filters (Millipore) and / or Tangential Flow Filtration. The final lipid nanoparticle products were stored in 10%sucrose (w / v) in 5 mM Tris buffer (pH 8.0) and filtered through 0.22 μm filter in sterile condition. The mRNA-LNP was stored at -80℃ till use. Example 5: In vitro protein expression

[0120] The target mRNA was mixed with lipofectamine to transfect HEK293T cell lines. The cell lysates were collected and the target antigen expression was measured by western blot.

[0121] For in vitro expression assay, HEK293T cells were harvested by Trypsin-EDTA digestion and inoculated into 24-well plate (300000 cells / well) . 1 μg mRNA was mixed with 1 μL of lipofectamine (Invitrogen, LMRNA015) and incubated for 15 minutes at room temperature. Then the mixture was transfected to HEK293T cells. After 24 hours’ incubation, the cell was washed and cell lysate was prepared using RIPA (Pierce, Cat. 89901) with protease and phosphatase Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific, Cat. 78441) . After incubation on ice, spin the tubes > 12000 rpm and collect the supernatant. The total protein concentration was quantitated with BCA protein assay kit (Pierce, Cat. 23225) . 10 μg protein was loaded on SDS-PAGE and the Ly6k protein expression level was measured Western Blot. Two mRNAs of different nucleotide sequences which encoding the full-length LY6K antigen, can translate into the protein product with expected molecular weight. Both mRNAs showed similar protein expression levels (FIG. 1) . Example 6: In vivo immunogenicity in mice

[0122] The target encapsulated mRNA-LNP (LY6K-1) was injected into female C57BL / 6 mice (Shanghai BK) via intramuscular (IM) injection at both sites of gastrocnemius muscle (0.1 mL / mouse) . The dose of mRNA is 10 μg / mouse, and the mRNA-LNP was injected on Day 0, Day3 and Day 7. On Day 7 and Day 14, mice were euthanized, and the spleen and inguinal and popliteal lymph nodes were collected for the IFN-γ Enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay. Example 7: ELISPOT assay

[0123] The antigen-specific immunogenicity was measured by ELISPOT assay with the ex vivo stimulation of target peptide pools. Briefly, the mouse spleen or lymph nodes were grinded with a sterile syringe pushrod and filtered with a 70 μm cell-strainer to isolate single cell suspension. The single splenocytes or lymphocytes were inoculated into IFN-γ ELISPOT plates (Mabtech, Cat. 3321-4AST-10) and incubate with the target peptide pools for 40-44 hours, then the IFN-γ spots were determined following the manufacture’s instructions.

[0124] LY6K mRNA-LNP (LY6K-1) were injected into C57BL / 6 mice via IM on D0, D3 and D7, and the T cell response in spleen and lymph nodes were measured on D7 and D14. LY6K mRNA-LNP vaccination induced LY6K antigen-specific immune response in mouse spleen and lymph nodes (FIG. 2 and FIG. 3) . Example 8: Transgenic cell line generation and anti-tumor efficacy study

[0125] The full-length of human wild-type Ly6k gene (SEQ ID NO: 27) was cloned into the genomic DNA of murine colon cancer MC38 cell line through PiggyBAC transposase system. In brief, the full-length wild-type antigen Ly6k gene was inserted into the cloning vectors, which contains puromycin resistance gene. Then the PiggyBAC transposase plasmid (provided by Shanghai Model Organisms Center) and LY6K cloning vector plasmid (provided by Shanghai Model Organisms Center) were co-transfected into MC38 cells through Lipofectamine 3000 (Thermofisher, L3000015) . The Ly6k gene was randomly inserted into the genome DNA of MC38 cells. The transgenic MC38-Ly6K cells containing human Ly6K were enriched with puromycin treatment and then single cell clones were selected with limited dilution method. The LY6K transgenic MC38 single cell clones were confirmed through q-PCR sequencing and protein expression, and passed the mycoplasma test before in vivo study.

[0126] For in vivo efficacy study, 3x105 LY6K transgenic MC38 cancer cells were inoculated into the right flank of female C57BL / 6 mice (Shanghai Model Organisms Center, Inc. ) . The dose level of LY6K mRNA-LNP (LY6K-1) was 10 μg / mouse via intramuscular injection and the dosing volume was 0.1 mL / mouse. The LY6K mRNA-LNP was injected on Day 0, Day 3, Day 7, Day 14, Day 21, Day 28, and Day 35, and the MC38-hLy6k cancer cells were inoculated on Day 9. The mouse body weight and tumor volume were measure three times per week.

[0127] Anti-tumor efficacy study: the MC38-hLy6k transgenic cancer cells were inoculated into C57BL / 6 mice (D9) , and 10 μg / mouse LY6K mRNA-LNP were vaccinated with prophylactic dosing schedule (Day 0, Day 3, Day 7, Day 14, Day 21, Day 28, and Day 35) . This dosing schedule induced transient but recoverable body weight loss. The mice were well tolerated with this mRNA-LNP immunization schedule (FIG. 4) . In prophylactic treatment schedule, LY6K mRNA-LNP immunization effectively inhibited the tumor growth, and the tumor growth inhibition rate (TGI%) was 90.87%on Day 35 (FIG. 5) . EQUIVALENTS

[0128] All references, patents and patent applications disclosed herein are incorporated by reference with respect to the subject matter for which each is cited, which in some cases may encompass the entirety of the document.

Claims

1.A fusion polypeptide comprises, in order from the N-terminal, (i) a first polypeptide comprising LY6K protein; and (ii) a second polypeptide comprising major histocompatibility complex (MHC) class I transmembrane and trafficking domain (MITD) , preferably, the first polypeptide and the second polypeptide are connected by a linker.2.The fusion polypeptide of claim 1, wherein the fusion polypeptide comprises a signal peptide.3.The fusion polypeptide of claim 1 or 2, wherein the LY6K protein is a full-length LY6K protein or its variant.4.The fusion polypeptide of any one of claims 1-3, wherein the LY6K protein comprises an endogenous signal peptide, preferably, the endogenous signal peptide comprises a sequence of SEQ ID NO: 6.5.The fusion polypeptide of claim 1, wherein the LY6K protein dose not comprises a signal peptide.6.The fusion polypeptide of any one of claims 1-3, wherein the LY6K protein comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-3; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-3.7.The fusion polypeptide of any one of claims 1-6, wherein the MITD comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, 24, 25, and 26; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 24, 25, and 26.8.The fusion polypeptide of any one of claims 1-7, wherein the fusion polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 and 5; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 and 5.9.A nucleic acid molecule, comprising, in order from the 5’-terminal, (i) a first polynucleotide encoding LY6K protein; and (ii) a second polynucleotide encoding major histocompatibility complex (MHC) class I transmembrane and trafficking domain (MITD) .10.The nucleic acid molecule of claim 9, comprising a polynucleotide sequence that encodes the fusion polypeptide of any one of claims 1-8.11.The nucleic acid molecule of claim 9 or 10, wherein the first polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 31 and 37; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 31 and 37.12.The nucleic acid molecule of claim 9 or 10, wherein the first polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32 and 38; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32 and 38.13.The nucleic acid molecule of any one of claims 9-12, wherein the second polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 33 and 39; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 33 and 39.14.The nucleic acid molecule of any one of claims 9-13, wherein the nucleic acid molecule comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 30 and 36; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 30 and 36.15.An RNA polynucleotide comprising, in order from the 5’-terminal, (i) a first polynucleotide encoding LY6K protein; and (ii) a second polynucleotide encoding major histocompatibility complex (MHC) class I transmembrane and trafficking domain (MITD) .16.The RNA polynucleotide of claim 15, having an open reading frame encoding the fusion polypeptide any one of claims 1-8.17.The RNA polynucleotide of claim 15 or 16, wherein an initiator codon that encodes the fusion polypeptide is AUG.18.The RNA polynucleotide of any one of claims 15-17, wherein a terminator codon that encodes the fusion polypeptide is selected from UGA, UAA or UAG.19.The RNA polynucleotide of any one of claims 15-18, wherein the first polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 and 13; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 and 13; and / orthe first polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 28 and 29; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 28 and 29.20.The RNA polynucleotide of any one of claims 15-19, wherein the second polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 and 14; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 and 14.21.The RNA polynucleotide of any one of claims 15-20, wherein the RNA polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7 and 12; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7 and 12.22.A cancer associate antigen vaccine, comprising an RNA polynucleotide that comprises at least one open reading frame (ORF) encoding the fusion polypeptide any one of claims 1-8 or the RNA polynucleotide of any one of claims 15-20.23.The vaccine of claims 22, wherein the RNA polynucleotide is a mRNA.24.The vaccine of claim 22 or 23, wherein the RNA polynucleotide further comprises a 5’ UTR, preferably, the 5’ UTR comprises a sequence of SEQ ID NO: 45.25.The vaccine of any one of claims 22-24, wherein the RNA polynucleotide further comprises a 3’ UTR, preferably, the 3’ UTR comprises a sequence of SEQ ID NO: 46 or SEQ ID NO: 47.26.The vaccine of any one of claims 22-25, wherein the RNA polynucleotide is codon-optimized.27.The vaccine of any one of claims 22-26, wherein the RNA polynucleotide further comprises at least one 5’ terminal cap, a 3’ polyA tail, and / or a Kozak sequence.28.The vaccine of any one of claims 22-27, wherein the RNA polynucleotide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 41-44; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 41-44.29.The vaccine of any one of claims 22-28, wherein the RNA polynucleotide is unmodified.30.The vaccine of any one of claims 22-28, wherein the RNA polynucleotide comprises at least one modified nucleotide.31.The vaccine of any one of claims 22-30, wherein the vaccine is formulated in a lipid nanoparticle (LNP) .32.A composition comprising (i) the fusion polypeptide any one of claims 1-8, the nucleic acid molecule of any one of claims 9-14, the RNA polynucleotide of any one of claims 15-21, or the vaccine of any one of claims 22-31; and (ii) a pharmaceutically acceptable carrier.33.A method of inducing an antigen specific immune response in a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the fusion polypeptide any one of claims 1-8, the nucleic acid molecule of any one of claims 9-14, the RNA polynucleotide of any one of claims 15-21, or the vaccine of any one of claims 22-31, or the composition of claim 32 to produce an antigen specific immune response.34.The method of claim 33, wherein the antigen specific immune response comprises a T cell response.35.The method of claim 33, wherein the antigen specific immune response comprises a B cell response.36.A method of treating a cancer in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the fusion polypeptide of any one of claims 1-8, the nucleic acid molecule of any one of claims 9-14, the RNA polynucleotide of any one of claims 15-21, or the vaccine of any one of claims 22-31, or the composition of claim 32.37.The method of claim 36, wherein the cancer is selected from the group consisting of lung cancer, prostate cancer, breast cancer, esophageal cancer, colorectal cancer, bladder cancer, gastric cancer, head and neck cancer, liver cancer, renal cancer, glioma, endometrial cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, melanoma, and mesothelioma, preferably head and neck squamous cancer, or lung squamous cancer.38.The method of any one of claims 33-37, wherein the subject is human.

Images