A circular RNA and relevant constructs and a method using the same

Abstract

Provided is a circular RNA which can be regulated by microRNAs, a pharmaceutical composition comprising the circular RNA and a method of using the same. Also provided is a method of enhancing targeting expression of circular RNA through microRNA regulation.

Description

A circular RNA and relevant constructs and a method using the sameTechnical Field

[0001] The present disclosure relates to the field of molecular biology. In particular, provided is a circular RNA which can be regulated by microRNAs. Also provided is a pharmaceutical composition comprising the circular RNA.Background

[0002] Synthetic messenger RNA (mRNA) has attracted attention as an emerging application for mRNA-based therapies and vaccinations. Circular RNA is a novel class of natural or synthetic RNA molecules, which forms a head-tail topology through covalent linkage and lacks the free ends necessary for exonuclease-mediated degradation, rendering them resistant to several mechanisms of RNA turnover and granting them extended lifespans and persistent gene expression as compared to their linear mRNA counterparts (Zhao X, Zhong Y, Wang X, Shen J, An W. Advances in Circular RNA and Its Applications. Int J Med Sci. 2022 May 27; 19 (6) : 975-985. ) . Even so, maintaining specificity and reducing off-target expression of circular RNA as a potential therapeutic platform remain challenging.

[0003] microRNAs (miRNA, miR) are small single-stranded, tissue-specific, non-coding RNA molecules, which bind target mRNA and circular RNA transcripts, and function in post-transcriptional regulation of gene expression (Gebert LFR, MacRae IJ. Regulation of microRNA function in animals. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Jan; 20 (1) : 21-37., and Kameda S, Ohno H, Saito H. Synthetic circular RNA switches and circuits that control protein expression in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2023 Feb 28; 51 (4) : e24. ) . A mature miRNA is typically about 19-24 nucleotides in length and is generated by two RNase-III-type enzymes, Drosha in the nucleus and Dicer in the cytoplasm, from an endogenous transcript (Gebert LFR, MacRae IJ. Regulation of microRNA function in animals. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Jan; 20 (1) : 21-37. ) .

[0004] As the miRNAs exhibit tissue-specific expression patterns, they can be used as an indicator to distinguish between various tissues, organs, and cell types. Moreover, binding sequences for tissue-specific microRNAs could be incorporated into the UTRs to affect mRNA decay and translation in different cellular populations, leading to tissue-specific control of RNA expression at the translational level, which would allow the delivered RNA to only work in the target tissue. This targeting strategy is promising for RNA delivery, which will reduce off-target side effects of circular RNA medicines and target expression to particular organs, tissues and cell types.Summary

[0005] In the first aspect, provided is a circular RNA comprising a coding region encoding a polypeptide of interest (POI) , and an untranslated region operably linked to the coding region; wherein the untranslated region comprises one or more miRNA binding sites which display Watson-Crick complementarity to a seed region of one or more miRNAs.

[0006] In some embodiments, the untranslated region comprises an internal ribosome entry site (IRES) element which is operably linked to the coding region.

[0007] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a primary miRNA binding site.

[0008] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a secondary miRNA binding site.

[0009] In a preferable embodiment, the one or more miRNA binding sites are located within the IRES element.

[0010] In some embodiments, the untranslated region comprising one or more miRNA binding sites enhances expression of the POI in a target cell or tissue.

[0011] In a preferable embodiment, the IRES element comprising one or more miRNA binding sites enhances expression of the POI in a target cell or tissue.

[0012] In some embodiments, the seed region contains the sequence of positions 2-8 or 2-7 in the 5’ end of a miRNA.

[0013] In some embodiments, the untranslated region further displays Watson-Crick complementarity to nucleotides 14-17 or 14-16 of one or more miRNAs.

[0014] In some embodiments, the untranslated region further displays Watson-Crick complementarity to nucleotide 1 of one or more miRNAs.

[0015] In some embodiments, the miRNA is a mature miRNA.

[0016] In some embodiments, the miRNA is selected from the group consisting of miR-122-5p, miR-155-5p, let-7a-5p, miR-17-5p, miR-20a-5p and miR-142-3p.

[0017] In some embodiments, the untranslated region comprises HCV 5’UTR or the modified HCV 5’UTR.

[0018] In some embodiments, the untranslated region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 123 or 133, or the nucleotide sequence having at least 85%identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 123 or 133.

[0019] In some embodiments, the circular RNA further comprises one or more elements as follows: a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1 and exon2.

[0020] In the second aspect, provided is a cyclization precursor RNA, wherein the cyclization precursor RNA is circularized to form the circular RNA according to the present disclosure.

[0021] In some embodiments, the cyclization precursor RNA comprises a coding region and an untranslated region according to the present disclosure.

[0022] In some embodiments, the cyclization precursor RNA further comprises one or more elements as follows: a 5’ homologous arm, a 3’ intron, exon2, a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1, a 5’ intron, a 3’ homologous arm and an intact group I intron.

[0023] In the third aspect, provided is a nucleic acid molecule, wherein the nucleic acid molecule is transcribed to form the cyclization precursor RNA according to the present disclosure.

[0024] In the fourth aspect, provided is an expression vector, wherein the expression vector comprises the nucleic acid molecule according to the present disclosure.

[0025] In the fifth aspect, provided is a host cell, wherein the host cell comprises the circular RNA, the cyclization precursor RNA, the nucleic acid molecule or the expression vector according to the present disclosure.

[0026] In the sixth aspect, provided is a pharmaceutical composition comprising the circular RNA or the cyclization precursor RNA according to the present disclosure.

[0027] In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated as lipid nanoparticles, lipopolyplexes or lipoplexes.

[0028] In some embodiments, the circular RNA or the cyclization precursor RNA is present as naked form.

[0029] In the seventh aspect, provided is the use of the circular RNA, the cyclization precursor RNA or the pharmaceutical composition according to the present disclosure in the manufacture of a medicament for the expression of a POI in a target cell or tissue.

[0030] In the eighth aspect, provided is the use of the circular RNA, the cyclization precursor RNA or the pharmaceutical composition according to the present disclosure in the manufacture of a medicament for preventing or treating a disease.

[0031] In the ninth aspect, provided is a method of enhancing targeting expression of circular RNA through microRNA regulation, wherein the method comprises circularizing the cyclization precursor RNA according to the present disclosure to form the circular RNA according to the present disclosure.

[0032] In the tenth aspect, provided is a method of enhancing targeting expression of circular RNA through microRNA regulation, wherein the method comprises introducing one or more miRNA binding sites into a circular RNA comprising a coding region encoding a polypeptide of interest (POI) , and an untranslated region operably linked to the coding region; wherein the one or more miRNA binding sites are introduced into the untranslated region; and wherein the one or more miRNA binding sites display Watson-Crick complementarity to the seed region of one or more miRNAs.

[0033] In the eleventh aspect, provided is a method of enhancing targeting expression of circular RNA through microRNA regulation, wherein the method comprises introducing one or more miRNA binding sites into a circular RNA comprising a coding region encoding a polypeptide of interest (POI) , and an untranslated region comprising an internal ribosome entry site (IRES) element which is operably linked to the coding region; wherein the one or more miRNA binding sites are introduced into the IRES element; and wherein the one or more miRNA binding sites display Watson-Crick complementarity to the seed region of one or more miRNAs.

[0034] In the twelfth aspect, also provided is a circular RNA comprising a coding region encoding a polypeptide of interest (POI) , and an untranslated region operably linked to the coding region; wherein the untranslated region comprises one or more miRNA binding sites which display Watson-Crick complementarity to a seed region of one or more miRNAs, wherein the untranslated region is derived from HCV 5’ UTR, wherein the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding to one or more miRNAs, wherein the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure.

[0035] In the thirteenth aspect, also provided is a cyclization precursor RNA, wherein the cyclization precursor RNA is circularized to form the circular RNA according to the twelfth aspect.Brief Description of the Drawings

[0036] FIG. 1A shows the schematic diagram of miR-122-5p binding sites in the HCV 5’UTR and its complementarity with miR-122-5p. FIG. 1B shows the schematic diagram of miR-155-5p binding sites in the modified HCV 5’UTR and its complementarity with miR-155-5p. FIG. 1C shows the schematic diagram of let-7a-5p binding sites in the modified HCV 5’UTR and its complementarity with let-7a-5p. FIG. 1D shows the schematic diagram of miR-20a-5p binding sites in the modified HCV 5’UTR and its complementarity with miR-20a-5p. FIG. 1E shows the schematic diagram of miR-17-5p binding sites in the modified HCV 5’UTR and its complementarity with miR-17-5p. FIG. 1F shows the schematic diagram of miR-142-3p binding sites in the modified HCV 5’UTR and its complementarity with miR-142-3p.

[0037] FIG. 2 shows the schematic diagram of precursor and circular RNA in the PIE circularization system.

[0038] FIG. 3 shows the schematic diagram of linear RNA harboring miRNA binding sites in the HCV 5’UTR.

[0039] FIG. 4 shows IVIS Spectrum images (6 h post-injection) of female BALB / c mice i. v. administrated with 10 μg of circular RNA-LNPs.

[0040] FIG. 5 shows IVIS Spectrum images (6 h post-injection) of female BALB / c mice i. v. administrated with 10 μg of circular RNA-LNPs.

[0041] FIG. 6 shows the schematic diagram of precursor and circular RNA in the Cis circularization system 1 (abbreviated as Cis system-1) .

[0042] FIG. 7 shows the schematic diagram of precursor and circular RNA in the Cis circularization system 2 (abbreviated as Cis system-2) .

[0043] FIG. 8 shows the schematic diagram of the FLuc-mRNA reference.

[0044] FIG. 9 shows IVIS Spectrum images (6 h post-injection) of female BALB / c mice i. v. administrated with 10 μg or 20 μg of circular RNA-LNPs.

[0045] FIG. 10 (A and B) shows the results of RNA structure predictions performed by RNAstructure software for the natural HCV 5’UTR and the modified HCV 5’UTR with miR-155-5p binding sites.

[0046] FIG. 11 (A, B, C and D) shows the results of RNA structure predictions performed by RNAstructure software for the modified HCV 5’UTR with let-7a-5p, miR-20a-5p, miR-17-5p or miR-142-3p binding sites.

[0047] FIG. 12 (A, B, C and D) shows the results of RNA structure predictions performed by mfold software for the natural HCV 5’UTR and the modified HCV 5’UTR with miR-155-5p, miR-20a-5p or miR-142-3p binding sites.Detailed DescriptionDefinitions

[0048] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of skill in the art. In addition, the terms and experimental procedures relating to biochemistry, molecular biology, cell and tissue culture, microbiology and immunology are those widely used in the art. Meanwhile, for better understanding of the present disclosure, definitions and explanations of relevant terms are provided below.

[0049] As used herein, the expression “at least one” or “one or more” means 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more. Unless clearly indicated to the contrary, “a” and “an” as used herein should be understood as “at least one” .

[0050] When a certain amount, concentration, value or parameter is set forth in the form of a range, a preferred range, or a preferred upper limit or a preferred lower limit, it should be understood that it is equivalent to specifically revealing any range formed by combining any upper limit or preferred value with any lower limit or preferred value, regardless of whether said range is explicitly recited. Unless otherwise stated, the numerical ranges listed herein are intended to include the endpoints of the range and all integers and fractions (decimals) within the range. For example, the expression “i is an integer of 1 to 20” means that i is any integer of 1 to 20, for example, i can be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20. Other similar expressions such as n and m should also be understood in a similar manner.

[0051] As used herein, the term “optional” or “optionally” means the event described subsequent thereto may, but not necessarily happen, and the description includes the cases wherein said event or circumstance happens or does not happen.

[0052] The expressions “comprising” , “including” , “containing” and “having” are open-ended, and do not exclude additional unrecited elements, steps, or ingredients. The expression “consisting of” excludes any element, step, or ingredient not designated. The expression “consisting essentially of” means that the scope is limited to the designated elements, steps or ingredients, or groups of elements, steps or ingredients that are optionally present that do not substantially affect the essential and novel characteristics of the claimed subject matter. It should be understood that the expression “comprising” encompasses the expressions “consisting essentially of” and “consisting of” .

[0053] As used herein, “sequence identity” has an art-recognized meaning and the percent of sequence identity between two nucleic acids or polypeptides can be calculated by aligning the two sequences using published algorithms, such as the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) and the Fast Adaptive Shrinkage / Thresholding Algorithm (FASTA) . While there are a number of methods to measure identity between two polynucleotides or polypeptides, the term “identity” is well known to skilled artisans (Carrillo, H., Lipman, D. The Multiple Sequence Alignment Problem in Biology. SIAM J Appl Math. 1988 October 1; 48 (5) : 1073–1082. ) .

[0054] The terms “nucleic acid” and “polynucleotide” are used interchangeably herein to describe a polymer of any length, e.g., greater than about 2 bases, greater than about 10 bases, greater than about 100 bases, greater than about 500 bases, greater than 1000 bases, or up to about 10,000 or more bases, composed of nucleotides, e.g., deoxyribonucleotides or ribonucleotides, and may be produced enzymatically or synthetically, which can hybridize with naturally occurring nucleic acids in a sequence-specific manner analogous to that of two naturally occurring nucleic acids, e.g., can participate in Watson-Crick base pairing interactions. Naturally occurring nucleic acids are comprised of nucleotides including guanine, cytosine, adenine, thymine, and uracil (G, C, A, T, and U respectively) .

[0055] The terms “ribonucleic acid” and “RNA” as used herein mean a polymer composed of ribonucleotides.

[0056] The terms “deoxyribonucleic acid” and “DNA” as used herein mean a polymer composed of deoxyribonucleotides.

[0057] The term “mutation” herein denotes the replacement of at least one nucleotide in a predetermined nucleotide sequence with a different nucleotide and the addition and / or deletion of at least one nucleotide. The term “point mutation” denotes a type of mutation in DNA or RNA, the cell’s genetic material, in which one single nucleotide base is added, deleted or changed.

[0058] As used herein, the term “vector” refers to the vehicle used to introduce exogenous polynucleotides into host cells, and when the vector is transformed into the appropriate host cell, exogenous polynucleotides are amplified or expressed. Vectors usually remain episomal but can be designed to integrate genes or parts of them into chromosomes of the genome. As used herein, the definition of vectors comprises but not limited to plasmids, linearized plasmids, viral vectors, clays, bacteriophage vectors, bacteriophages, artificial chromosomes (e.g., yeast artificial chromosomes and mammalian artificial chromosomes) , etc.

[0059] As used herein, “host cells” are those used to receive, hold, replicate, or amplify vectors. Host cells can also be used to express polynucleotides or vector-encoded peptides. They can be eukaryotic or prokaryotic. Prokaryotic cells such as E. coli or Bacillus subtilis, fungal cells such as yeast cells or Aspergillus, insect cells (such as S2 Drosophila cells or Sf9) , and animal cells (such as human cervical cancer cells (HeLa cells) , human embryonic kidney cells (HEK cells, such as HEK 293 cells) , Chinese hamster ovary (CHO) cells, human hepatocellular carcinoma (HCC) cells (such as Huh7 cells) , human lung adenocarcinoma cells (such as A549 cells) and other mammalian cells) are suitable for expression.

[0060] As used herein, “treating” a subject with a disease or condition means administering or applying a composition, a procedure or a regimen to the subject in an attempt to cure the disease or condition, or to arrest, alleviate, ameliorate or eliminate the symptoms of the disease or condition. Accordingly, the term “treatment” encompasses prophylaxis, therapy and / or cure. The term “prophylaxis” refers to the prevention of a potential disease and / or the prevention of worsening of symptoms or progression of a disease.

[0061] As used herein, the term “subject” includes human and non-human subjects, such as experimental animals (e.g., mouse, rabbit, and rat and non-human primates) , and preferably refers to human.

[0062] As used herein, the terms “circRNA” , “circular polyribonucleotide” , “circular RNA” or “oRNA” are used interchangeably and refer to a polyribonucleotide that forms a circular structure through covalent bonds.

[0063] As used herein, an “internal ribosome entry site” or “IRES” refers to an RNA sequence or structural element ranging in size from 10 nt to 1000 nt or more, capable of initiating translation of a polypeptide in the absence of a typical RNA cap structure. IRES sequences are usually derived from some eukaryotic and viral RNAs upstream of a translation initiation codon.

[0064] As used herein, the terms “miRNA” , “microRNA” or “miR” are used interchangeably and refer to non-encoded RNA of a small single chain molecule. A mature miRNA is typically about 19-24 nucleotides in length, and they are generated by two RNase-III-type enzymes, Drosha in the nucleus and Dicer in the cytoplasm, from an endogenous transcript (Gebert LFR, MacRae IJ. Regulation of microRNA function in animals. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Jan; 20 (1) : 21-37. ) . “miRNA” , “microRNA” or “miR” widely exists in plants, animals and some viruses. They can bind target mRNA and circular RNA transcripts and function in post-transcriptional regulation of gene expression.

[0065] As used herein, the term “expression” includes any step involved in polypeptide production, including but not limited to: transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification, and secretion.

[0066] As used herein, the terms “miRNA binding sites” or “miRNA sites” are used interchangeably and comprise the “primary miRNA binding site” and / or “secondary miRNA binding site” . The “primary miRNA binding site” refers to a stretch of nucleotides within a polynucleotide that is capable of forming a duplex with a seed region of a natural miRNA sequence. The “secondary miRNA binding site” refers to a stretch of nucleotides which comprises “primary miRNA binding site” displaying Watson-Crick complementarity to a seed region of one or more miRNAs, and optionally other polynucleotides contributing to regulating expression. For example, it may further comprise the nucleotides displaying Watson-Crick complementarity to nucleotides 14-17 or 14-16 of one or more miRNAs and / or the nucleotide displaying Watson-Crick complementarity to nucleotide 1 of one or more miRNAs. For example, it may further comprise the nucleotides displaying Watson-Crick complementarity to one or more of nucleotides 9-22 of one or more miRNAs and / or the nucleotide displaying Watson-Crick complementarity to nucleotide 1 of one or more miRNAs.

[0067] Production of the miRNA in cells generally has the following procedures: miRNA genes are transcribed by RNA polymerase, which results in the production of primary miRNA (pri-miRNA) transcripts. The pri-miRNA is treated with the Microprocessor complex comprising Drosha and DGCR8 within a nucleus to form precursor miRNAs (pre-miRNAs) with a stem-loop structure of about 70 nt, and these pre-miRNAs are transported outside the cell nucleus, then treated with cytosolic Dicer enzyme, which cleaves the loop structure to liberate a miRNA duplex. The guide strand (also called miR) of the miRNA duplex is selected for loading into Argonaute to determine the specificity of sequence complementarity between the miRNA and its target RNA, while the other passenger strand (also called miR*) is ejected from the Argonaute and degraded. An arm of pre-miRNA from which the mature miRNA is derived is designated, “5p” means that the miRNA is from a 5’arm of pre-miRNA hairpin, and “3p” means that the miRNA is from a 3’ arm of pre-miRNA hairpin. In the present disclosure, unless specially designated by a 3P or 5P name, miR mentioned by a number can refer to any one of two types of miRNAs originated from opposite arms of the same pre-miRNA (see e.g., US2023060661A1 and Medley JC, Panzade G, Zinovyeva AY. microRNA strand selection: Unwinding the rules. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2021 May; 12 (3) : e1627. ) .

[0068] The miRNA mimic technology (miRNA mimic) herein is used for “miRNA-gain of function” research, which is primarily used to mimic the function of its corresponding endogenous miRNA. To be brief, this approach is to generate a double-stranded miRNA mimic designed and synthesized for a given endogenous miRNA mature body structure, which becomes a single-stranded miRNA under the action of intracellular endonuclease Dicer, thereby mimicking an endogenous miRNA, can bind specifically to its target RNA and produce regulation of RNA expression. A guide strand of miRNA mimic is with a sequence identical to the endogenous miRNA. A passenger strand sequence of miRNA mimic is complementary to the guide strand sequence, and with two nucleotides UU-overhang at the 3’ end. (Wang P, Zhou Y, Richards AM. Effective tools for RNA-derived therapeutics: siRNA interference or miRNA mimicry. Theranostics. 2021 Aug 11; 11 (18) : 8771-8796. ) .

[0069] As used herein, the term “stem-loop” , also known as a “hairpin” , refers to a secondary structure that can occur in single-stranded nucleic acids. The stem-loop may occur when two regions of the same strand pair with each other to form a double-stranded region that ends in an unpaired loop.

[0070] As used herein, the term “Gibbs free energy” refers to the energy released by folding an unfolded nucleic acid molecule (e.g., RNA or DNA, etc. ) , or, conversely, the amount of energy that must be added in order to unfold a folded nucleic acid molecule (e.g., RNA or DNA, etc. ) . The “lowest Gibbs free energy” of a nucleic acid molecule (e.g., DNA, RNA, etc. ) describes the lowest value of Gibbs free energy observed for the nucleic acid molecule when assessed for various secondary structures thereof. The more negative Gibbs free energy a structure has, the more likely is its formation.

[0071] The Gibbs free energy parameters can be determined using any method known in the art, for example, an RNA secondary structure predicting tool such as RNAfold, (see e.g., Gruber AR, Lorenz R, Bernhart SH,  R, Hofacker IL. The Vienna RNA websuite. Nucleic Acids Res. 2008 Jul 1; 36 (Web Server issue) : W70-4. ) , mfold (see e.g., Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 2003 Jul 1; 31 (13) : 3406-15. ) and RNAstructure (see e.g., Reuter JS, Mathews DH. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 2010 Mar 15; 11: 129. ) , or by experimental methods such as optical melting experiments, in conjunction with NMR or crystallography.

[0072] As used herein, “polyA” means a polynucleotide or a portion of a polynucleotide consisting of nucleotides comprising adenine. The poly (A) tail (or sequence) is a homopolymeric sequence as it contains all adenosine nucleotides.

[0073] As used herein, “Operably-linked” refers to the association of nucleic acid sequences on a single nucleic acid fragment so that the function of one is affected by the other. For example, a promoter is operably-linked with a coding sequence or functional RNA when it is capable of affecting the expression of that coding sequence or functional RNA (i.e., the coding sequence or functional RNA is under the transcriptional control of the promoter) . Coding sequences can be operably-linked to regulatory sequences (such as the untranslated region described herein) in sense or antisense orientation.

[0074] As used herein and unless otherwise specified, the term “lipid” refers to a group of organic compounds that include, but are not limited to, esters of fatty acids and are generally characterized by being poorly soluble in water, but soluble in many nonpolar organic solvents. While lipids generally have poor solubility in water, there are certain categories of lipids (e.g., lipids modified by polar groups, e.g., DMG-PEG2000) that have limited aqueous solubility and can dissolve in water under certain conditions. Known types of lipids include biological molecules such as fatty acids, waxes, sterols, fat-soluble vitamins, monoglycerides, diglycerides, triglycerides, and phospholipids. Lipids can be divided into at least three classes: (1) “simple lipids, ” which include fats and oils as well as waxes; (2) “compound lipids, ” which include phospholipids and glycolipids (e.g., DMPE-PEG2000) ; and (3) “derived lipids” such as steroids. Further, as used herein, lipids also encompass lipidoid compounds. The term “lipidoid compound, ” also simply “lipidoid” , refers to a lipid-like compound (e.g. an amphiphilic compound with lipid-like physical properties) .

[0075] The term “lipid nanoparticle” or “LNP” refers to a particle having at least one dimension on the order of nanometers (nm) (e.g., 1 to 1,000 nm) , which contains one or more types of lipid molecules. The LNP provided herein can further contain at least one non-lipid payload molecule (e.g., one or more nucleic acid molecules) . In some embodiments, the LNP comprises a non-lipid payload molecule either partially or completely encapsulated inside a lipid shell. Particularly, in some embodiments, wherein the payload is a negatively charged molecule, and the lipid components of the LNP comprise at least one cationic lipid or ionizable cationic lipid. Without being bound by the theory, it is contemplated that the cationic lipids or ionizable cationic lipids can interact with the negatively charged payload molecules and facilitate incorporation and / or encapsulation of the payload into the LNP during LNP formation. Other lipids that can form part of an LNP as provided herein include but are not limited to neutral lipids and charged lipids, such as steroids, polymer conjugated lipids, and various zwitterionic lipids.

[0076] The term “cationic lipid” refers to a lipid that is either positively charged at any pH value or hydrogen ion activity of its environment, or capable of being positively charged in response to the pH value or hydrogen ion activity of its environment (e.g., the environment of its intended use) . Thus, the term “cationic” encompasses both “permanently cationic” and “cationisable. ” In certain embodiments, the positive charge in a cationic lipid results from the presence of a quaternary nitrogen atom. In certain embodiments, the cationic lipid comprises a zwitterionic lipid that assumes a positive charge in the environment of its intended use (e.g., at physiological pH) . In preferred embodiments, the cationic lipid is an ionizable cationic lipid. The term “ionizable cationic lipid” refers to an ionizable lipid that is positively charged at acidic pH to condense RNAs into a composition, such as LNPs, but is neutral at physiological pH to minimize toxicity (Han X, Zhang H, Butowska K, Swingle KL, Alameh MG, Weissman D, Mitchell MJ. An ionizable lipid toolbox for RNA delivery. Nat Commun. 2021 Dec 13; 12 (1) : 7233. ) .

[0077] The term “polymer conjugated lipid” refers to a molecule comprising both a lipid portion and a polymer portion. An example of a polymer conjugated lipid is a pegylated lipid (PEG-lipid) , in which the polymer portion comprises a polyethylene glycol.

[0078] The term “neutral lipid” encompasses any lipid molecules existing in uncharged forms or neutral zwitterionic forms at a selected pH value or within a selected pH range. In some embodiments, the selected useful pH value or range corresponds to the pH condition in an environment of the intended uses of the lipids, such as the physiological pH. As non-limiting examples, neutral lipids that can be used in connection with the present disclosure include, but are not limited to, phosphotidylcholines such as 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) , 1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) , 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) , phophatidylethanolamines such as 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) , 2- ( (2, 3-bis (oleoyloxy) propyl) dimethylammonio) ethyl hydrogen phosphate (DOCP) , sphingomyelins (SM) , ceramides. Neutral lipids as provided herein may be synthetic or derived (isolated or modified) from a natural source or compound.

[0079] The term “steroid” refers to a class of compounds with cyclopentane polyhydrophenanthrene as the parent nucleus, including sterols and their derivatives. Steroid compounds do not contain fatty acids and are non-saponifiable lipids. Steroids can be used as structural lipids in the lipid component of nanoparticle compositions herein. As a non-limiting example, steroids that may be used in connection with the present disclosure include but are not limited to cholesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, stigmasterol, and mixtures thereof.

[0080] The term “charged lipid” encompasses any lipid molecules that exist in either positively charged or negatively charged forms at a selected pH or within a selected pH range. In some embodiments, the selected pH value or range corresponds to the pH condition in an environment of the intended uses of the lipids, such as the physiological pH. As non-limiting examples, neutral lipids that can be used in connection with the present disclosure include, but are not limited to, phosphatidylserines, phosphatidic acids, phosphatidylglycerols, phosphatidylinositols, sterol hemisuccinates, dialkyl trimethylarnmonium-propanes, (e.g., DOTAP, DOTMA) , dialkyl dimethylaminopropanes, ethyl phosphocholines, dimethylaminoethane carbamoyl sterols (e.g., DC-Chol) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine sodium salt (DOPS-Na) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho- (1'-rac-glycerol) sodium salt (DOPG-Na) , and 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate sodium salt (DOPA-Na) . Charged lipids as provided herein may be synthetic or derived (isolated or modified) from a natural source or compound.

[0081] As used herein, and unless otherwise specified, the term “pharmaceutically acceptable salt” includes both acid and base addition salts.

[0082] Examples of pharmaceutically acceptable acid addition salts include, but are not limited to, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and the like, and organic acids such as, but not limited to, acetic acid, 2, 2-dichloroacetic acid, adipic acid, alginic acid, ascorbic acid, aspartic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid, 4-acetamidobenzoic acid, camphoric acid, camphor-10-sulfonic acid, capric acid, caproic acid, caprylic acid, carbonic acid, cinnamic acid, citric acid, cyclamic acid, dodecylsulfuric acid, ethane-1, 2-disulfonic acid, ethanesulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, formic acid, fumaric acid, galactaric acid, gentisic acid, glucoheptonic acid, gluconic acid, glucuronic acid, glutamic acid, glutaric acid, 2-oxo-glutaric acid, glycerophosphoric acid, glycolic acid, hippuric acid, isobutyric acid, lactic acid, lactobionic acid, lauric acid, maleic acid, malic acid, malonic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, mucic acid, naphthalene-1, 5-disulfonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, 1-hydroxy-2-naphthoic acid, nicotinic acid, oleic acid, orotic acid, oxalic acid, palmitic acid, pamoic acid, propionic acid, pyroglutamic acid, pyruvic acid, salicylic acid, 4-aminosalicylic acid, sebacic acid, stearic acid, succinic acid, tartaric acid, thiocyanic acid, p-toluenesulfonic acid, trifluoroacetic acid, undecylenic acid, and the like.

[0083] Examples of pharmaceutically acceptable base addition salt include, but are not limited to, salts prepared from addition of an inorganic base or an organic base to a free acid compound. Salts derived from inorganic bases include, but are not limited to, the sodium, potassium, lithium, ammonium, calcium, magnesium, iron, zinc, copper, manganese, aluminum salts and the like. In one embodiment, the inorganic salts are the ammonium, sodium, potassium, calcium, and magnesium salts. Salts derived from organic bases include, but are not limited to, salts of primary, secondary, and tertiary amines, substituted amines including naturally occurring substituted amines, cyclic amines and basic ion exchange resins, such as ammonia, isopropylamine, trimethylamine, diethylamine, triethylamine, tripropylamine, diethanolamine, ethanolamine, deanol, 2-dimethylaminoethanol, 2-diethylaminoethanol, dicyclohexylamine, lysine, arginine, histidine, caffeine, procaine, hydrabamine, choline, betaine, benethamine, benzathine, ethylenediamine, glucosamine, methylglucamine, theobromine, triethanolamine, tromethamine, purines, piperazine, piperidine, N-ethylpiperidine, polyamine resins and the like. In one embodiment, the organic bases are isopropylamine, diethylamine, ethanolamine, trimethylamine, dicyclohexylamine, choline and caffeine.

[0084] A compound provided herein may contain one or more asymmetric centers and may thus give rise to enantiomers, diastereomers, and other stereoisomeric forms that may be defined, in terms of absolute stereochemistry, as (R) -or (S) -or, as (D) -or (L) -for amino acids. Unless otherwise specified, a compound provided herein is meant to include all such possible isomers, as well as their racemic and optically pure forms. Optically active (+) and (-) , (R) -and (S) -, or (D) -and (L) -isomers may be prepared using chiral synthons or chiral reagents, or resolved using conventional techniques, for example, chromatography and fractional crystallization. Conventional techniques for the preparation / isolation of individual enantiomers include chiral synthesis from a suitable optically pure precursor or resolution of the racemate (or the racemate of a salt or derivative) using, for example, chiral high pressure liquid chromatography (HPLC) . When the compounds described herein contain olefinic double bonds or other centers of geometric asymmetry, and unless specified otherwise, it is intended that the compounds include both E and Z geometric isomers. Likewise, all tautomeric forms are also intended to be included.

[0085] As used herein, and unless otherwise specified, the term “isomer” refers to different compounds that have the same molecular formula. “Stereoisomers” are isomers that differ only in the way the atoms are arranged in space. “Atropisomers” are stereoisomers from hindered rotation about single bonds. “Enantiomers” are a pair of stereoisomers that are non-superimposable mirror images of each other. A mixture of a pair of enantiomers in any proportion can be known as a “racemic” mixture. “Diastereoisomers” are stereoisomers that have at least two asymmetric atoms, but which are not mirror-images of each other.

[0086] “Stereoisomers” can also include E and Z isomers, or a mixture thereof, and cis and trans isomers or a mixture thereof. In certain embodiments, a compound described herein is isolated as either the E or Z isomer. In other embodiments, a compound described herein is a mixture of the E and Z isomers.

[0087] “Tautomers” refers to isomeric forms of a compound that are in equilibrium with each other. The concentrations of the isomeric forms will depend on the environment the compound is found in and may be different depending upon, for example, whether the compound is a solid or is in an organic or aqueous solution.

[0088] It should be noted that if there is a discrepancy between a depicted structure and a name for that structure, the depicted structure is to be accorded more weight.

[0089] As used herein, and unless otherwise specified, the term “pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient” includes without limitation any adjuvant, carrier, excipient, glidant, sweetening agent, diluent, preservative, dye / colorant, flavor enhancer, surfactant, wetting agent, dispersing agent, suspending agent, stabilizer, isotonic agent, solvent, or emulsifier which has been approved by the United States Food and Drug Administration as being acceptable for use in humans or domestic animals.

[0090] The term “coding region” refers to a portion in an encoding nucleic acid sequence that is translated into a peptide or polypeptide. The term “untranslated region” or “UTR” refers to the portion of an encoding nucleic acid that is not translated into a peptide or polypeptide. Depending on the orientation of a UTR with respect to the coding region of a nucleic acid molecule, a UTR is referred to as the 5’ -UTR if located to the 5’ -end of a coding region, and a UTR is referred to as the 3’ -UTR if located to the 3’ -end of a coding region.

[0091] The term “mRNA” as used herein refers to a message RNA molecule comprising one or more open reading frames (ORFs) that can be translated by a cell or an organism provided with the mRNA to produce one or more peptides or protein products. The region containing the one or more ORFs is referred to as the coding region of the mRNA molecule. In certain embodiments, the mRNA molecule further comprises one or more untranslated regions (UTRs) .

[0092] The terms “polypeptide” and “protein” are used interchangeably herein to refer to a polymer of amino acid residues linked by covalent peptide bonds. That is, a description directed to a polypeptide applies equally to a description of a protein, and vice versa. The terms apply to naturally occurring amino acid polymers as well as amino acid polymers in which one or more amino acid residues is a non-naturally occurring amino acid (e.g., an amino acid analog) . As used herein, the terms encompass amino acid chains of any length, including full length proteins (e.g., antigens) .

[0093] As used herein, “off target” refers to any unintended effect on any one or more targets, genes, or cellular transcripts.

[0094] As used herein, the term “open reading frame” or “ORF” refers to a continuous polynucleotide sequence, for example, a DNA sequence or RNA sequence, comprising a start codon, a subsequent region comprising a plurality of amino acid-encoding codons, and a terminal stop codon, wherein the region comprising the plurality of amino acid-encoding codons contains no stop codons.

[0095] The names of the circular RNAs and linear RNA used herein (such as circNLuc122-bs, circFLuc122-bs, circNLuc122-bsm, circFLuc122-bsm, circNLuc155-bs, circNLuc155-bsm, circFLuclet-7a-bs, circFLuclet-7a-bsm, circFLuc20a-bs, circFLuc20a-bsm, circFLuc17-bs, circFLuc17-bsm, circFLuc142-bs , circFLuc142-bsm, circFLuc122-bsm-s1c3, circFLuc122-bsm-s2c3, circFLuc122-bsm-s1c15-16, circFLuc122-bsm-s2c15-16, circFLuc122-bsm-s1s2c15-16 and linear-FLuc122-bs) are used only to distinguish or identify RNAs or products but are not intended to indicate that such names are characteristic of RNAs or products of the present disclosure. Those skilled in the art should understand that, for example, for the purpose of distinguishing or identifying, other RNAs or products may also use such names, but do not refer to the same or equivalent RNAs or products. Similarly, the names used in examples are for illustration only, and the RNAs or products of the present disclosure are limited by the features described in the appended claims. Circular RNA

[0096] In one aspect, provided is a circular RNA produced by a cyclization precursor RNA of the present disclosure. The cyclization precursor RNA herein can be obtained by in vitro transcription of a nucleic acid molecule comprising a DNA molecule of the cyclization precursor, and then the circular RNA of the present disclosure is produced by circularization. Alternatively, the circular RNA of the present disclosure can be directly generated by circularizing the cyclization precursor RNA of the present disclosure.

[0097] Provided herein is a circular RNA comprising a coding region encoding a polypeptide of interest (POI) , and an untranslated region operably linked to the coding region; wherein the untranslated region comprises one or more miRNA binding sites which display Watson-Crick complementarity to a seed region of one or more miRNAs.

[0098] In some embodiments, the circular RNA of the present disclosure is used for expression of a POI in a host cell.

[0099] In some embodiments, the untranslated region is located at the upstream of the coding region.

[0100] The terms “Watson-Crick complementarity” or “Watson-Crick base pairing” can be used interchangeably and refer to the principle of complementary base pairing. In molecular biology, two nucleotides on complementary DNA or RNA strands that are connected via hydrogen bonds are called a base pair. In canonical Watson-Crick base pairing in DNA, adenine (A) forms a base pair with thymine (T) using two hydrogen bonds, and guanine (G) forms a base pair with cytosine (C) using three hydrogen bonds. In canonical Watson-Crick base pairing in RNA, thymine is replaced by uracil (U) . DNA with high GC-content is more stable to denaturation or melting than DNA with low GC-content. Watson-Crick base pairing is also the mechanism by which mRNA codons are recognized by anticodons on tRNA molecules during protein translation.

[0101] The terms “seed region” or “seed sequence” of a miRNA refers to a sequence in the region of positions 2-8 or 2-7 of a mature miRNA, which typically has perfect Watson-Crick complementarity to the miRNA binding site and is situated mostly at positions from the miRNA 5’ end. When referring to a miRNA binding site, it is to be understood as having complementarity (typically complete) with the seed sequence of the miRNA. The “seed region” or “seed sequence” is highly conserved and even a slight change in sequence may alter its targeting. (see e.g., Gebert LFR, MacRae IJ. Regulation of microRNA function in animals. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Jan; 20 (1) : 21-37.; and Ameres SL, Zamore PD. Diversifying microRNA sequence and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013 Aug; 14 (8) : 475-88. ) .

[0102] A miRNA seed region may include positions 2-8 or 2-7 of a mature miRNA. The binding sites that complement miRNA nucleotides 2-8 with adenine opposite miRNA nucleotide 1 (t1A) are the strongest, followed by those complementing nucleotides 2-8 without a t1A and nucleotides 2-7 with a t1A.

[0103] In some embodiments, a miRNA seed region may comprise 7 nucleotides (e.g., nucleotides 2-8 of a mature miRNA) , wherein the seed-complementary site in the corresponding miRNA binding site is flanked by an adenine (A) opposed to miRNA position 1.

[0104] In some embodiments, a miRNA seed region may comprise 6 nucleotides (e.g., nucleotides 2-7 of a mature miRNA) , wherein the seed-complementary site in the corresponding miRNA binding site is flanked by an adenine (A) opposed to miRNA position 1.

[0105] In some embodiments, the 3’ end pairing can contribute to target recognition and / or regulating expression, particularly nucleotides 14-16 of a mature miRNA.

[0106] In some embodiments, the nucleotide 1 (of a mature miRNA) pairing can contribute to regulating expression.

[0107] As used herein, a “gene of interest (GOI) ” or “a polynucleotide sequence of interest” is a DNA sequence that is transcribed into RNA and in some instances translated into a polypeptide in vivo when placed under the control of appropriate regulatory sequences. A gene or polynucleotide of interest can include, but is not limited to, prokaryotic sequences, cDNA from eukaryotic mRNA, genomic DNA sequences from eukaryotic (e.g., mammalian) DNA, and synthetic DNA sequences. For example, a gene of interest may encode a native polypeptide (i.e. a polypeptide found in nature) or fragment thereof; a variant polypeptide (i.e. a mutant of the native polypeptide having less than 100%sequence identity with the native polypeptide) or fragment thereof; an engineered polypeptide or peptide fragment, a therapeutic peptide or polypeptide, an imaging marker, a selectable marker, and the like.

[0108] A “polypeptide of interest (POI) ” is a polypeptide encoded by a “gene of interest (GOI) ” or “a polynucleotide sequence of interest” , a polypeptide of concern, or a target polypeptide to be expressed. For example, a polypeptide of interest may comprise a native polypeptide (i.e. a polypeptide found in nature) or fragment thereof; a variant polypeptide (i.e. a mutant of the native polypeptide having less than 100%sequence identity with the native polypeptide) or fragment thereof; an engineered polypeptide or peptide fragment, a therapeutic peptide or polypeptide, an imaging marker, a selectable marker, or the like.

[0109] In some embodiments, the untranslated region comprises an internal ribosome entry site (IRES) element which is operably linked to the coding region.

[0110] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a primary miRNA binding site. The primary binding site displays Watson-Crick complementarity to a seed region of one or more miRNAs.

[0111] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a secondary binding site. The secondary binding site displays Watson-Crick complementarity to a seed region, nucleotides 14-17 or 14-16 and nucleotide 1 of one or more miRNAs.

[0112] In some embodiments, the one or more miRNA binding sites are located within the IRES element.

[0113] In some embodiments, the untranslated region comprising one or more miRNA binding sites enhances expression of the POI in a target cell or target tissue.

[0114] In some embodiments, the IRES element comprising one or more miRNA binding sites enhances expression of the POI in a target cell or target tissue.

[0115] In a preferable embodiment, provided is a circular RNA comprising a coding region encoding a polypeptide of interest (POI) , and an untranslated region comprising an internal ribosome entry site (IRES) element which is operably linked to the coding region; wherein the IRES element comprises one or more miRNA binding sites which display Watson-Crick complementarity to a seed region of one or more miRNAs; wherein the IRES element comprising one or more miRNA binding sites enhances expression of the POI in a target cell or tissue.

[0116] In some embodiments, the seed region contains the sequence of positions 2-8 or 2-7 in the 5’ end of a miRNA.

[0117] In a preferable embodiment, the seed region contains the sequence of positions 2-8 in the 5’ end of a miRNA.

[0118] In some embodiments, the untranslated region further displays Watson-Crick complementarity to nucleotides 14-17 or 14-16 of one or more miRNAs.

[0119] In some embodiments, the IRES element further displays Watson-Crick complementarity to nucleotides 14-17 or 14-16 of one or more miRNAs.

[0120] In some embodiments, the untranslated region further displays Watson-Crick complementarity to nucleotide 1 of one or more miRNAs.

[0121] In some embodiments, the IRES element further displays Watson-Crick complementarity to nucleotide 1 of one or more miRNAs.

[0122] In some embodiments, the untranslated region further displays Watson-Crick complementarity to one or more of nucleotides 9-22 of one or more miRNAs.

[0123] In some embodiments, the IRES element further displays Watson-Crick complementarity to one or more of nucleotides 9-22 of one or more miRNAs.

[0124] In some embodiments, the untranslated region comprises one or two miRNA binding sites.

[0125] In some embodiments, the one or two miRNA binding sites are located within the IRES element.

[0126] In some embodiments, the miRNA is a mature miRNA.

[0127] In a preferable embodiment, the miRNA is selected from the group consisting of miR-122-5p, miR-155-5p, let-7a-5p, miR-17-5p, miR-20a-5p and miR-142-3p.

[0128] miR-122 is specifically expressed and highly abundant in the liver, where it constitutes 70%of the total miRNA population. Several research has been reported that miR-122 binds to two sites in the 5’UTR of HCV RNA and positively regulates the HCV RNA abundance during the life cycle, in part by stimulating its translation and stability (Jopling CL, Yi M, Lancaster AM, Lemon SM, Sarnow P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific MicroRNA. Science. 2005 Sep 2; 309 (5740) : 1577-81. ) . miR-122-5p arises from the 5’ arm of the pre-miR-122 hairpin.

[0129] miR-155 is encoded by the host gene, MIRHG155, originally identified as the B-cell Integration Cluster (BIC) gene. The BIC gene is composed of 3 exons that span a 13 kb region within human chromosome 21 (Hsa21) and harbors a 1500 bp noncoding primary-miRNA-155 (pri-miR-155) transcript in exon 3, which is processed to the mature miR-155. Once the endogenous pri-miR-155 is transcribed, it undergoes sequential processing in the nucleus to a 65 nucleotide (nt) long stem-loop precursor, pre-miR-155, which is further processed in the cytoplasm generating ～22-nt duplexes. The miR-155 duplex contains 2 strands denoted by the suffix-5p (from the 5’ arm of pre-miR, miR-155-5p) or suffix-3p (from the 3’arm of pre-miR, miR-155-3p) . miR-155-5p is the more abundant and functionally dominant form (see e.g., Mahesh G, Biswas R. MicroRNA-155: A Master Regulator of Inflammation. J Interferon Cytokine Res. 2019 Jun; 39 (6) : 321-330. ) .

[0130] miR-155 has been shown to promote M1 macrophage polarization. It is also reported that miR-155 promotes pro-inflammatory responses via the JNK pathway, inhibits M2 polarization and promotes pro-inflammatory responses via the P13K / Akt1 pathway (see e.g., Essandoh K, Li Y, Huo J, Fan GC. MiRNA-Mediated Macrophage Polarization and its Potential Role in the Regulation of Inflammatory Response. Shock. 2016 Aug; 46 (2) : 122-31. ) .

[0131] Let-7 miRNA was first discovered in Caenorhabditis elegans and it is highly conserved in human tissues. The human let-7 family of miRNA contains 12 members of miRNA (let-7a-1, 7a-2, 7a-3, 7b, 7c, 7d, 7e, 7f-1, 7f-2, 7g, 7i, and mir-98) . let-7 was found to suppress anchorage-independent growth and cell-cycle progression in cancer cells by repressing cell cycle regulators such as cyclins A, D1, D3, and CDK4. Let-7a also suppressed MYC expression and abolished MYC-induced cell growth in Burkitt lymphoma cells (see e.g., Su JL, Chen PS, Johansson G, Kuo ML. Function and regulation of let-7 family microRNAs. Microrna. 2012; 1 (1) : 34-9. ) . let-7a-5p is produced from the 5’ -arm of the pre-let-7a-2 (see e.g., Papoutsoglou P, Rodrigues-Junior DM, Morén A, Bergman A, Pontén F, Coulouarn C, Caja L, Heldin CH, Moustakas A. The noncoding MIR100HG RNA enhances the autocrine function of transforming growth factor β signaling. Oncogene. 2021 May; 40 (21) : 3748-3765. ) .

[0132] The miR-17～92 cluster contained a total of 6 microRNA members including the miR-17 family (miR-17 and miR-20a) , the miR-18 family (miR-18a) , the miR-19 family (miR-19a-3p and miR-19b-3p) , and miR-92a-3p (see e.g., Zhang Y, Li S, Jin P, Shang T, Sun R, Lu L, Guo K, Liu J, Tong Y, Wang J, Liu S, Wang C, Kang Y, Zhu W, Wang Q, Zhang X, Yin F, Sun YE, Cui L. Dual functions of microRNA-17 in maintaining cartilage homeostasis and protection against osteoarthritis. Nat Commun. 2022 May 4; 13 (1) : 2447. ) . miR-17-5p and miR-20a-5p arise from the 5’ arm of the miR-17-5p precursor and miR‐20a precursor, respectively. It is reported that miR-17-5p and miR-20a-5p are highly expressed in HEK293T cells, which was detected by the miRNA sensor array (Tian W, Dong X, Liu X, Wang G, Dong Z, Shen W, Zheng G, Lu J, Chen J, Wang Y, Wu Z, Wu X. High-throughput functional microRNAs profiling by recombinant AAV-based microRNA sensor arrays. PLoS One. 2012; 7 (1) : e29551. )

[0133] The classical stem-loop structure of miR142 encodes for two species of mature microRNAs; miR142-5p and miR142-3p. miR-142 is abundant in cells of hematopoietic origin, and therefore, aptly plays a role in lineage differentiation of hematopoietic cells. It is also reported that miR-142 plays its quintessential role in regulating immune response. (see e.g., Sharma S. Immunomodulation: A definitive role of microRNA-142. Dev Comp Immunol. 2017 Dec; 77: 150-156. )

[0134] In some embodiments, the miRNA comprises the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25 or 127.

[0135] In some embodiments, the miRNA is miR-122-5p. In some embodiments, the miRNA comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21.

[0136] In some embodiments, the miRNA is miR-155-5p. In some embodiments, the miRNA comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22.

[0137] In some embodiments, the miRNA is let-7a-5p. In some embodiments, the miRNA comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23.

[0138] In some embodiments, the miRNA is miR-17-5p. In some embodiments, the miRNA comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24.

[0139] In some embodiments, the miRNA is miR-20a-5p. In some embodiments, the miRNA comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25.

[0140] In some embodiments, the miRNA is miR-142-3p. In some embodiments, the miRNA comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 127.

[0141] In some embodiments, the miRNA comprises a seed region, wherein the seed region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 98 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 99.

[0142] In some embodiments, the miRNA comprises a seed region, wherein the seed region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 100.

[0143] In some embodiments, the miRNA comprises a seed region, wherein the seed region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 101.

[0144] In some embodiments, the miRNA comprises a seed region, wherein the seed region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 102.

[0145] In some embodiments, the miRNA comprises a seed region, wherein the seed region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 128.

[0146] In some embodiments, the miRNA is miR-122-5p, wherein the seed region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 98 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 99.

[0147] In some embodiments, the miRNA is miR-155-5p, wherein the seed region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 100.

[0148] In some embodiments, the miRNA is let-7a-5p, wherein the seed region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 101.

[0149] In some embodiments, the miRNA is miR-20a-5p, wherein the seed region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 102.

[0150] In some embodiments, the miRNA is miR-17-5p, wherein the seed region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 102.

[0151] In some embodiments, the miRNA is miR-142-3p, wherein the seed region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 128.

[0152] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a primary miRNA binding site; and the untranslated region comprises one or more primary miRNA binding sites which independently comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 143 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 144.

[0153] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a primary miRNA binding site; and the untranslated region comprises one or more primary miRNA binding sites which independently comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 145 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 146.

[0154] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a primary miRNA binding site; and the untranslated region comprises one or more primary miRNA binding sites which independently comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 147 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 148.

[0155] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a primary miRNA binding site; and the untranslated region comprises one or more primary miRNA binding sites which independently comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 149 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 150.

[0156] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a primary miRNA binding site; and the untranslated region comprises one or more primary miRNA binding sites which independently comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 151 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 152.

[0157] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a primary miRNA binding site; and the untranslated region comprises one or more primary miRNA binding sites which independently comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 153 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 154.

[0158] In some embodiments, the untranslated region comprises two primary miRNA binding sites which respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 143 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 144.

[0159] In some embodiments, the untranslated region comprises two primary miRNA binding sites which respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 145 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 146.

[0160] In some embodiments, the untranslated region comprises two primary miRNA binding sites which respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 147 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 148.

[0161] In some embodiments, the untranslated region comprises two primary miRNA binding sites which respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 149 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 150.

[0162] In some embodiments, the untranslated region comprises two primary miRNA binding sites which respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 151 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 152.

[0163] In some embodiments, the untranslated region comprises two primary miRNA binding sites which respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 153 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 154.

[0164] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a secondary miRNA binding site; and the untranslated region comprises one or more secondary miRNA binding sites which independently comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 103 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 104.

[0165] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a secondary miRNA binding site; and the untranslated region comprises one or more secondary miRNA binding sites which independently comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 105 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 106.

[0166] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a secondary miRNA binding site; and the untranslated region comprises one or more secondary miRNA binding sites which independently comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 107 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 108.

[0167] In some embodiments, the miRNA binding sites comprise a secondary miRNA binding site; and the untranslated region comprises one or more secondary miRNA binding sites which independently comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 109 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 110.

[0168] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a secondary miRNA binding site; and the untranslated region comprises one or more secondary miRNA binding sites which independently comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 111 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 112.

[0169] In some embodiments, the miRNA binding site comprises a secondary miRNA binding site; and the untranslated region comprises one or more secondary miRNA binding sites which independently comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 129 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 130.

[0170] In some embodiments, the untranslated region comprises two secondary miRNA binding sites which respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 103 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 104.

[0171] In some embodiments, the untranslated region comprises two secondary miRNA binding sites which respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 105 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 106.

[0172] In some embodiments, the untranslated region comprises two secondary miRNA binding sites which respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 107 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 108.

[0173] In some embodiments, the untranslated region comprises two secondary miRNA binding sites which respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 109 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 110.

[0174] In some embodiments, the untranslated region comprises two secondary miRNA binding sites which respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 111 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 112.

[0175] In some embodiments, the untranslated region comprises two secondary miRNA binding sites which respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 129 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 130.

[0176] In some embodiments, the miRNA is miR-122-5p, the untranslated region comprises two primary miRNA binding sites, and the two primary miRNA binding sites respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 143 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 144.

[0177] In some embodiments, the miRNA is miR-122-5p, the untranslated region comprises two secondary miRNA binding sites, and the two secondary miRNA binding sites respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 103 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 104.

[0178] In some embodiments, the miRNA is miR-155-5p, the untranslated region comprises two primary miRNA binding sites, and the two primary miRNA binding sites respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 145 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 146.

[0179] In some embodiments, the miRNA is miR-155-5p, the untranslated region comprises two secondary miRNA binding sites, and the secondary miRNA two binding sites respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 105 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 106.

[0180] In some embodiments, the miRNA is let-7a-5p, the untranslated region comprises two primary miRNA binding sites, and the two primary miRNA binding sites respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 147 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 148.

[0181] In some embodiments, the miRNA is let-7a-5p, the untranslated region comprises two secondary miRNA binding sites, and the two secondary miRNA binding sites respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 107 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 108.

[0182] In some embodiments, the miRNA is miR-20a-5p, the untranslated region comprises two primary miRNA binding sites, and the two primary miRNA binding sites respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 149 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 150.

[0183] In some embodiments, the miRNA is miR-20a-5p, the untranslated region comprises two secondary miRNA binding sites, and the two secondary miRNA binding sites respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 109 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 110.

[0184] In some embodiments, the miRNA is miR-17-5p, the untranslated region comprises two primary miRNA binding sites, and the two primary miRNA binding sites respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 151 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 152.

[0185] In some embodiments, the miRNA is miR-17-5p, the untranslated region comprises two secondary miRNA binding sites, and the two secondary miRNA binding sites respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 111 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 112.

[0186] In some embodiments, the miRNA is miR-142-3p, the untranslated region comprises two primary miRNA binding sites, and the two primary miRNA binding sites respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 153 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 154.

[0187] In some embodiments, the miRNA is miR-142-3p, the untranslated region comprises two secondary miRNA binding sites, and the two secondary miRNA binding sites respectively comprise the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 129 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 130.

[0188] In some embodiments, the untranslated region comprises HCV 5’UTR or the modified HCV 5’UTR.

[0189] Hepatitis C virus (HCV) , belonging to the family of Flaviviridae, is a positive strand RNA virus propagated primarily in the liver, which has a single stranded RNA genome of about 9600 nucleotides that contains a 5’UTR with two miR-122 binding sites (S1 and S2) , a single large open reading frame (ORF) encoding the viral polyprotein and a 3’UTR. The HCV 5’UTR comprises four distinctly structured domains, among which domain II-IV contain an IRES that enables cap-independent translation of the viral polyprotein, domain I is not essential for translation.

[0190] Domain I is typically of 1-47 nt or 1-42 nt and is located within the most 5’ segment of the 5’UTR, which contains two annealing sites for miR-122, and can fold into a small G: C rich hairpin structure (stem-loop I, SLI) . Adjacent to domain I, domain II can also form a hairpin structure (stem-loop II, SLII) , which is essential for IRES function. Natural domains I and II (containing SLI and SLII) are typically 1-118 nt within the most 5’ segment of the 5’UTR. In some embodiments, domains I and II (containing SLI and SLII) are 1-119 nt within the most 5’ segment of the 5’UTR. In some embodiments, domains I and II (containing SLI and SLII) are 1-120 nt within the most 5’ segment of the 5’UTR. In some embodiments, domains I and II (containing SLI and SLII) are 1-121 nt within the most 5’ segment of the 5’UTR. In some embodiments, domains I and II (containing SLI and SLII) are 1-122 nt within the most 5’ segment of the 5’UTR.

[0191] In some embodiments, the miR-122-5p binding site S1 in domain I of the modified HCV 5’UTR comprises one or more point mutations; wherein the modified HCV 5’UTR still enhances expression of the POI in a target cell or tissue when S1 comprises the said one or more point mutations.

[0192] In some embodiments, the modified HCV 5’UTR comprises the replacement of two native miR-122-5p binding sites S1 and S2 in domain I with two primary binding sites displaying Watson-Crick complementarity to a seed region of another mature miRNA (such as miR-155-5p, let-7a-5p, miR-20a-5p, miR-17-5p, miR-142-3p) .

[0193] In some embodiments, the modified HCV 5’UTR comprises the replacement of the native miR-122-5p binding site S2 in domain I with a primary binding site displaying Watson-Crick complementarity to a seed region of another mature miRNA (such as miR-155-5p, let-7a-5p, miR-20a-5p, miR-17-5p, miR-142-3p) and the replacement of the native miR-122-5p binding site S1 in domain I with a mutated primary miRNA binding site comprising one or more point mutations, thereby not displaying Watson-Crick complementarity to the said seed region; wherein the modified HCV 5’UTR still enhances expression of the POI in a target cell or tissue when the mutated binding site comprises the said one or more point mutations.

[0194] In some embodiments, the untranslated region comprises or is HCV 5’UTR. In some embodiments, the untranslated region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.

[0195] In some embodiments, the untranslated region comprises or is the modified HCV 5’UTR comprising the replacement of two native miR-122-5p binding sites S1 and S2 in domain I with two primary miR-155-5p binding sites. In some embodiments, the untranslated region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or the nucleotide sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3.

[0196] In some embodiments, the untranslated region comprises or is the modified HCV 5’UTR comprising the replacement of two native miR-122-5p binding sites S1 and S2 in domain I with two primary let-7a-5p binding sites. In some embodiments, the untranslated region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or the nucleotide sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5.

[0197] In some embodiments, the untranslated region comprises or is the modified HCV 5’UTR comprising the replacement of two native miR-122-5p binding sites S1 and S2 in domain I with two primary miR-20a-5p binding sites. In some embodiments, the untranslated region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 or the nucleotide sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7.

[0198] In some embodiments, the untranslated region comprises or is the modified HCV 5’UTR comprising the replacement of two native miR-122-5p binding sites S1 and S2 in domain I with two primary miR-17-5p binding sites. In some embodiments, the untranslated region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 or the nucleotide sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9.

[0199] In some embodiments, the untranslated region comprises or is the modified HCV 5’UTR comprising the replacement of two native miR-122-5p binding sites S1 and S2 in domain I with two primary miR-142-3p binding sites. In some embodiments, the untranslated region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 123 or the nucleotide sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 123.

[0200] In some embodiments, the untranslated region comprises or is the modified HCV 5’UTR comprising a native miR-122-5p binding site S2 in domain I and the replacement of the native miR-122-5p binding sites S1 in domain I with a mutated primary miR-122-5p binding site S1. In some embodiments, the untranslated region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 133 or the nucleotide sequence having at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 133.

[0201] In some embodiments, the circular RNA further comprises one or more elements as follows: a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1 and exon2.

[0202] In some embodiments, the circular RNA further comprises one or more elements as follows: a 3’UTR (preferably a Hemoglobin Subunit Alpha 1 (HBA1) short 3’UTR) , a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1, exon2, and one or more internal homology regions.

[0203] As used herein, the “permuted intron-exon (PIE) ” refers to a ribozymatic method for RNA circularization, utilizing a permuted group I catalytic intron which has been reported to be more applicable to long RNA circularization and requires only the addition of GTP and Mg2+as cofactors. The permuted intron-exon (PIE) splicing strategy consists of fused partial exons flanked by half-intron sequences. In vitro, these constructs undergo the double transesterification reactions characteristic of group I catalytic introns, but because the exons are already fused, they are excised as covalently 5’ to 3’ linked circles. (see e.g., Wesselhoeft RA, Kowalski PS, Anderson DG. Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells. Nat Commun. 2018 Jul 6; 9 (1) : 2629. ) .

[0204] As used herein, the “Cis circularization system” refers to a circularization system based on group I introns, which are capable of self-circularizing with high efficiency without introducing extraneous fragments. This system retains the complete core domain of the ribozyme, which is more conducive to the correct folding of the ribozyme than the traditional PIE system.

[0205] For example, the system involves an RNA construct comprising, from 5’ end to 3’ end, a first pairing sequence; a guanine (ωG) ; a nucleotide sequence of interest (GOI) comprising a target site at its 3’ end; an internal guide sequence (IGS) ; a nucleotide sequence encoding a ribozyme core which has the catalytic activity of a group I intron ribozyme; and a second pairing sequence; wherein the 5' end nucleotide of the IGS and the 3' end nucleotide of the target site form a non-Watson-Crick base pair to define the 5’ splice site (the first splice site) ; the first and second pairing sequences form a duplex-containing structure upstream of the ωG to define the 3’ splice site (the second splice site) ; and the RNA construct is capable of generating a circular RNA comprising the nucleotide sequence of interest through the catalytic activity of the ribozyme core.

[0206] In some embodiment, the ribozyme core comprises a nucleotide sequence encoding the scaffold domain and catalytic domain of a group I intron; preferably, the ribozyme core comprises or consists of the sequence from the IGS end to the sequence before the P9.0 duplex of a group I intron.

[0207] In some embodiments, the ribozyme core sequence is derived from a group IC1 (e.g., from Tetrahymena sp. (e.g., T. thermophile, T. cosmopolitanis, T. hyperangularis, T. malaccensis or T. pigmentosa) or Pneumocystis sp. (e.g., Pneumocystis carinii) , IC2, IC3 (e.g., from Anabaena sp. PCC7120 or Azoarcus sp. BH72) or IA2 (e.g., from Bacteriophage Twort) intron.

[0208] In some embodiments, the ribozyme core is derived from a Tetrahymena sp. group I intron; for example, a Tetrahymena thermophila group I intron.

[0209] This system mimics the formation of a P1 duplex, selects an arbitrary sequence (for example, 'nnnnnu'or 'nnnnnc') in a gene of interest as the target site sequence (simply guaranteeing that the target site sequence is unique in the RNA construct) and place the sequence downstream the target site to the 3’ end of the gene of interest at the 5’ region of the GOI and the sequence from the 5’ end of the gene of interest to the target site at the 3’ region of the GOI, and then designing a corresponding IGS.

[0210] As used herein, definitions of IGS and the paired regions, for example, P1, P2, P4-P6, P3-P9, P9.0, P9a / 9b, P9.1, P9.1a, P9.2 and P10 duplexes and P1 extension, of a group I intron are known in the art and can be determined, for example, with reference to the following documents: Burke JM, Belfort M, Cech TR, Davies RW, Schweyen RJ, Shub DA, Szostak JW, Tabak HF. Structural conventions for group I introns. Nucleic Acids Res. 1987 Sep 25; 15 (18) : 7217-21.; Stahley M. R. and Strobel S. A., RNA splicing: group I intron crystal structures reveal the basis of splice site selection and metal ion catalysis, Current Opinion in Structural Biology, 2006 16 (3) : 319-326; and Woodson S. A. Structure and assembly of group I introns. Curr Opin Struct Biol. 2005 15 (3) : 324-30. Representative sequences and secondary structures of group I introns are available, for example, on the website https:  / / crw2-comparative-rna-web. org / group-i-introns / .

[0211] The nucleotide sequence of interest comprises a target site (e.g., ‘NNNNNU’ ) that can pair with the internal guide sequence (IGS) (e.g., ‘GNNNNN’ ) to determine the 5' splice site. The 5’ recognizer sequence (R1) comprises a first pairing sequence and a 3’ end nucleotide ‘G’ (also referred to as “ωG” ) . The 3’ recognizer sequence (R2) comprises a second pairing sequence that can pair with the first pairing sequence to form a duplex which helps to determine the 3’ splice site downstream the ωG. The ribozyme core is capable of catalyzing the formation of a circular RNA comprising the nucleotide sequence of interest by joining the nucleotide immediately downstream the ωG and the 3' end nucleotide of the target site (e.g., the 3’ end ‘U’ if the target site is ‘NNNNNU’ ) .

[0212] In some embodiments, R1 further comprises a 5’ homology arm sequence located upstream of the first pairing sequence and R2 further comprises a 3’ homology arm sequence located downstream of the second pairing sequence, and the 5’ and 3’ homology arm sequences are substantially complementary.

[0213] In one embodiment, the system is designed with ribozyme T (Tetrahymena thermophile) , where the backsplicing site is located in the ORF. In one embodiment, the system is designed with ribozyme T (Tetrahymena thermophile) , where the backsplicing site is located in the spacer.

[0214] In some embodiments, the Cis circularization system as described herein comprises Cis circularization system 1 (abbreviated as Cis system-1) and Cis circularization system 2 (abbreviated as Cis system-2) .

[0215] For the 1st splicing, the ribozyme can recognize the target site (e.g., ‘NNNNNU’ ) at the 5’ORF (Cis system-1) or at the 3’spacer (Cis system-2) in RNA via specific complementary base parings including G·U wobble base pair with internal guide sequence (IGS, ‘GNNNNN’ ) forming P1 helix structure. The 5’ end nucleotide of the IGS and the 3’ end nucleotide of the target site form a non-Watson-Crick base pair was also defined as the 5’ splice site (the first splice site) . The target site (e.g., ‘NNNNNU’ ) is attacked by the 3’ hydroxyl group (3’ -OH) of exogenous guanosine, which can bind to a G-binding site within the ribozyme’s catalytic core and act as a nucleophile, resulting in the generation of a 3’ -OH on the uridine at the 3’ end of the target site (e.g., ‘NNNNNU’ ) . For the 2nd splicing, the first and second pairing sequences form a duplex-containing structure upstream of the ωG to define the 3’ splice site (the second splice site) . After that, ωG is attacked by the 3’ -OH of the uridine at the 3’ end of the above cleaved target site ( ‘NNNNNU’ ) , resulting in a ligation inside of RNA, thereby generating a circular RNA.

[0216] As used herein, the term “wobble base pairing” refers to a type of non-Watson-Crick base pairing. Wobble base pairing may be formed between hypoxanthine and uracil (I-U, I for inosine) , guanine and uracil (G-U) , adenine and cytosine (A-C) , hypoxanthine and adenine (I-A) , or hypoxanthine and cytosine (I-C) , but not limited to.

[0217] As used herein, the terms “duplex” , “double-stranded region” and “helix” are used interchangeably to refer to a double-stranded structure comprising at least one base pair. A duplex may comprise a Watson-Crick base pair, a non-Watson-Crick base pair or a combination thereof.

[0218] The first and second pairing sequences can pair with each other to form a duplex-containing structure upstream of the ωG to define the 3’ splice site downstream the ωG. The duplex-containing structure may comprise at least one base pair and have a minimum free energy (MFE) of less than -18.9 kJ / mol and a melting temperature of at least 35.0 ℃. The duplex-containing structure may comprise one or more base pairs, e.g., 1-50, 5-45, 10-40, 15-35, 15-20, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 base pairs, consecutive or interrupted by one or more mismatches. Examples of duplex-containing structures may include but are not limited to stem structures, stem-loop structures and stem-loop alternating structures. The duplex-containing structure may comprise a base pair selected from A-U, G-C, G-A, A-A, U-U, A-C, G-U and a combination thereof. The duplex-containing structure may optionally comprise one or more structures selected from a bulge loop, an interior loop and a hairpin loop.

[0219] The first and second pairing sequences may independently comprise 2-100 nucleotides, for example, 2-90, 5-90, 10-80, 20-60, 30-50, 40-45, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 20, or 25 nucleotides. In some embodiments, the first pairing sequence comprises 2-20, 2-12, 4-10, 6, 7 or 8 nucleotides. In some embodiments, the second pairing sequence comprises 2-100, 5-80, 8-60, 10-50, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 or 100, preferably 5-80 or 8-60 nucleotides. The first and second pairing sequences may share a sufficient level of sequence identity to one another’s reverse complement to allow the 5’ and 3’ ends of the RNA construct to form the duplex-containing structure. The percent sequence identity between the first and second pairing sequences can be any percent of sequence identity that allows for hybridization to occur.

[0220] The base pairs formed between the first and second pairing sequences may be located anywhere upstream of the ωG, preferably upstream and adjacent to the ωG, for example, immediately upstream of the ωG, or located a few (e.g., 1-50, 10-40, 20-30, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20) nucleotides upstream of the ωG. Preferably, the relative location of the duplex formed to the ωG in the RNA construct is substantially identical to that of the P9.0 duplex to the ωG in the group I intron from which the ribozyme core is derived.

[0221] In some preferable embodiments, the first and second pairing sequences form at least one base pair upstream and adjacent to the ωG, such that base pairing between the first and second pairing sequences simulates the formation of a P9.0 duplex upstream the ωG during the circularization reaction. The duplex formed adjacent to the ωG may be also referred to as a “P9.0 duplex mimic” .

[0222] As used herein, a “spacer” refers to a region of a polynucleotide sequence ranging from 1 nucleotide to hundreds or thousands of nucleotides separating two other elements along a polynucleotide sequence. The sequences can be defined or can be random. A spacer is typically non-coding.

[0223] In some embodiments, the circular RNA is prepared by a PIE circularization system. In some embodiments, the circular RNA further comprises a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1 and exon2. In some embodiments, the circular RNA further comprises a 3’UTR (preferably a Hemoglobin Subunit Alpha 1 (HBA1) short 3’UTR) , a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1, exon2, and two internal homology regions. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the 5’ spacer region is shown in SEQ ID NO: 198. In an exemplary embodiment, the sequence of the 3’ spacer region is shown in SEQ ID NO: 199. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the exon1 is shown in SEQ ID NO: 203. In an exemplary embodiment, the sequence of the exon2 is shown in SEQ ID NO: 202. In an exemplary embodiment, the sequence of the 3’UTR is shown in SEQ ID NO: 221.

[0224] In some embodiments, the circular RNA is prepared by a Cis circularization system. In some embodiments, the circular RNA further comprises a 5’ spacer region. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the 5’ spacer region is shown in SEQ ID NO: 207.

[0225] In some embodiments, the circular RNA is prepared by a Cis circularization system. In some embodiments, the circular RNA further comprises a 5’ spacer region and a 3’ spacer region. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the 5’ spacer region is shown in SEQ ID NO: 212. In an exemplary embodiment, the sequence of the 3’ spacer region is shown in SEQ ID NO: 214.

[0226] In some embodiments, the POI is a polypeptide having an activity of disease prophylaxis or treatment.

[0227] In some embodiments, the disease includes but not limited to, infectious diseases, cancers, genetic disorders, cardiovascular diseases, autoimmune diseases and rare diseases.

[0228] In another aspect, also provided is a circular RNA comprising a coding region encoding a polypeptide of interest (POI) , and an untranslated region operably linked to the coding region; wherein the untranslated region comprises one or more miRNA binding sites which display Watson-Crick complementarity to a seed region of one or more miRNAs, wherein the untranslated region is derived from HCV 5’ UTR, wherein the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol (e.g., lower than -50, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -60, -61, -62, -63, -64, -65, -66, -67, -68, -69, -70, -75, -80 kcal / mol and the like) upon binding to one or more miRNAs.

[0229] In some embodiments, the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure.

[0230] In some embodiments, the secondary structure comprises an SLI structure and a functional SLII structure, wherein the functional SLII structure promotes the assembly of the 80S ribosome and translation initiation.

[0231] In some embodiments, the untranslated region comprises an internal ribosome entry site (IRES) element which is operably linked to the coding region.

[0232] In some embodiments, the one or more miRNA binding sites are located within the IRES element.

[0233] In some embodiments, the miRNA is a mature miRNA.

[0234] In some embodiments, the untranslated region mainly forms non-canonical alternative SLII structures (SLIIalt) in the absence of binding to one or more miRNAs.

[0235] In some embodiments, the binding of one or more miRNAs leads to a conformational change of the SLII structure, from non-canonical SLIIalt structures to the functional SLII structure.

[0236] In some embodiments, the binding of one or more miRNAs promotes the transition of certain SLIIalt structures to more stable canonical SLII structures.

[0237] In some embodiments, the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0238] In some embodiments, the SLI and SLII structures are located within the 1-118 nt, 1-119 nt, 1-120 nt, 1-121 nt or 1-122 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0239] In some embodiments, the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and the SLI and SLII structures are located within the 1-118 nt, 1-119 nt, 1-120 nt, 1-121 nt or 1-122 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0240] In some embodiments, the untranslated region comprises one or more miR-122-5p binding sites, and the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding miR-122-5p, wherein the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure, wherein the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and wherein the SLI and SLII structures are located within the 1-118 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0241] In some embodiments, the untranslated region comprises one or more miR-155-5p binding sites, and the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding miR-155-5p, wherein the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure, wherein the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and wherein the SLI and SLII structures are located within the 1-119 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0242] In some embodiments, the untranslated region comprises one or more let-7a-5p binding sites, and the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding let-7a-5p, wherein the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure, wherein the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and wherein the SLI and SLII structures are located within the 1-120 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0243] In some embodiments, the untranslated region comprises one or more miR-17-5p binding sites, and the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding miR-17-5p, wherein the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure, wherein the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and wherein the SLI and SLII structures are located within the 1-120 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0244] In some embodiments, the untranslated region comprises one or more miR-20a-5p binding sites, and the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding miR-20a-5p, wherein the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure, wherein the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and wherein the SLI and SLII structures are located within the 1-120 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0245] In some embodiments, the untranslated region comprises one or more miR-142-3p binding sites, and the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding miR-142-3p, wherein the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure, wherein the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and wherein the SLI and SLII structures are located within the 1-120 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0246] In some embodiments, the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding one or more miRNAs, whereby improving the stability of the untranslated region and enhancing expression of the POI.

[0247] In some embodiments, the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding one or more miRNAs, whereby improving the stability of the circular RNA and enhancing expression of the POI.

[0248] In some embodiments, binding of one or more miRNAs lead to a conformational change of the untranslated region, which in-turn results in enhanced expression of the POI.

[0249] In some embodiments, binding of one or more miRNAs lead to a conformational change of the IRES element, which in-turn results in enhanced expression of the POI.

[0250] In some embodiments, the secondary structure and energy of the untranslated region are analyzed by using in silico RNA structure analysis. In some embodiments, the secondary structure and energy of the untranslated region are analyzed by using a structure prediction software. In some embodiments, the secondary structure and energy of the untranslated region are analyzed by using the structure prediction software ‘RNAstructure’ or ‘mfold’ . Cyclization precursor RNA

[0251] As used herein, the term “cyclization precursor RNA molecule” refers to an RNA precursor which is able to be cyclized to form the circular RNA, and it is generally formed by transcription of a DNA molecule of a cyclization precursor.

[0252] In one aspect, provided is a cyclization precursor RNA, wherein the cyclization precursor RNA is circularized to form the circular RNA according to the present disclosure.

[0253] In some embodiments, the cyclization precursor RNA comprises a coding region encoding a POI, and an untranslated region operably linked to the coding region as described above; wherein the untranslated region comprises one or more miRNA binding sites which display Watson-Crick complementarity to the seed region of one or more miRNAs.

[0254] In some embodiments, the untranslated region comprising one or more miRNA binding sites enhances expression of the POI in a target cell or target tissue.

[0255] In some embodiments, the cyclization precursor RNA comprises a coding region encoding a POI, and an untranslated region comprising an internal ribosome entry site (IRES) element which is operably linked to the coding region as described above; wherein the IRES element comprises one or more miRNA binding sites which display Watson-Crick complementarity to the seed region of one or more miRNAs; and wherein the IRES element comprising one or more miRNA binding sites enhances expression of the POI in a target cell or target tissue.

[0256] In some embodiments, the cyclization precursor RNA further comprises one or more elements as follows: a 5’ homologous arm, a 3’ intron, exon2, a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1, a 5’ intron, a 3’ homologous arm and an intact group I intron (ribozyme) .

[0257] In some embodiments, the cyclization precursor RNA further comprises one or more elements as follows: a 3’UTR (preferably a Hemoglobin Subunit Alpha 1 (HBA1) short 3’UTR) , one or more internal homology regions, a 5’ homologous arm, a 3’ intron, exon2, a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1, a 5’ intron, a 3’ homologous arm and an intact group I intron (ribozyme) .

[0258] In some embodiments, the cyclization precursor RNA further comprises one or more elements as follows: a 3’UTR (preferably a Hemoglobin Subunit Alpha 1 (HBA1) short 3’UTR) , one or more internal homology regions, a 5’ recognizer sequence (R1) , a 3’ intron, exon2, a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1, a 5’ intron, a 3’ recognizer sequence (R2) , an intact group I intron (ribozyme) , transcription start site (for example, GG) , one or more additional spacers, a PolyA sequence and one or more restriction enzyme cutting sites.

[0259] In some embodiments, the cyclization precursor RNA further comprises one or more elements as follows: a 3’UTR (preferably a Hemoglobin Subunit Alpha 1 (HBA1) short 3’UTR) , one or more internal homology regions, a 5’ homologous arm, a 3’ intron, exon2, a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1, a 5’ intron, a 3’ homologous arm, an intact group I intron (ribozyme) , transcription start site (for example, GG) , one or more additional spacers, a PolyA sequence and one or more restriction enzyme cutting sites.

[0260] As used herein, two “homology arm sequences” or “homology arms” complement, or are complementary, to one another when the two regions share a sufficient level of sequence identity to one another’s reverse complement to allow hybridization to occur. As used herein, a “homology arm sequence” is any contiguous sequence that can form base pairs with preferably at least about 50% (e.g., at least about 60%, at least about 65%, at least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 85%, at least about 90%, at least about 95%, about 100%) of another sequence (another homology arm sequence) in the RNA construct.

[0261] In some embodiments, the 5’ homologous arm, the 3’ intron, the 5’ intron, and the 3’ homologous arm play a role in a process of formation of the circular RNA by cleaving the cyclization precursor RNA. The intron has a ribozyme property, for example, by using the ribozyme property of the 5’ intron, the connection between the 5’ intron and the first exon exon1 is broken under the trigger of GTP, the cleavage site can also further cause the connection between the 3’ intron and the second exon exon2 to be broken, and the second exon Exon2 is linked to the first exon Exon1 to form the circular RNA.

[0262] In some embodiments, the cyclization precursor RNA is circularized with a PIE circularization system to form the circular RNA according to the present disclosure. In some embodiments, the cyclization precursor RNA further comprises a 5’ homologous arm, a 3’ intron, exon2, a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1, a 5'intron and a 3’ homologous arm. In some embodiments, the cyclization precursor RNA further comprises a 3’UTR (preferably a Hemoglobin Subunit Alpha 1 (HBA1) short 3’UTR) , two internal homology regions, a 5’ homologous arm, a 3’ intron, exon2, a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1, a 5'intron and a 3’ homologous arm. In some embodiments, the cyclization precursor RNA comprises, from 5’ end to 3’ end, a 5’ homologous arm, a 3’ intron, exon2, a 5’ spacer region, the untranslated region according to the present disclosure, optionally Kozak sequence (GCCACC) , a coding region (ORF) , a 3’ spacer region, exon1, a 5’ intron and a 3’ homologous arm. In some embodiments, the cyclization precursor RNA comprises, from 5’ end to 3’ end, a 5’ homologous arm, a 3’ intron, exon2, a 5’ internal homology region, a 5’ spacer region, the untranslated region according to the present disclosure, optionally Kozak sequence (GCCACC) , a coding region (ORF) , a 3’UTR (preferably a Hemoglobin Subunit Alpha 1 (HBA1) short 3’UTR) , a 3’ spacer region, a 3’ internal homology region, exon1, a 5’ intron and a 3’homologous arm. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the 5’ homologous arm is shown in SEQ ID NO: 196. In an exemplary embodiment, the sequence of the 3’ homologous arm is shown in SEQ ID NO: 197. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the 5’ spacer region is shown in SEQ ID NO: 198. In an exemplary embodiment, the sequence of the 3’ spacer region is shown in SEQ ID NO: 199. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the 3’ intron is shown in SEQ ID NO: 200. In an exemplary embodiment, the sequence of the 5’ intron is shown in SEQ ID NO: 201. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the exon1 is shown in SEQ ID NO: 203. In an exemplary embodiment, the sequence of the exon2 is shown in SEQ ID NO: 202. In an exemplary embodiment, the sequence of the 3’UTR is shown in SEQ ID NO: 221.

[0263] In some embodiments, the cyclization precursor RNA is circularized with the Cis circularization system 1 (abbreviated as Cis system-1) to form the circular RNA according to the present disclosure. In some embodiment, the cyclization precursor RNA further comprises a 5’ homologous arm, an intact group I intron (ribozyme) , a 5’ spacer region and a 3’ homologous arm. In some embodiments, the cyclization precursor RNA comprises, from 5’ end to 3’ end, a 5’ homologous arm, a 3’ coding region (ORF) , a 5’ spacer region, the untranslated region according to the present disclosure, optionally Kozak sequence (GCCACC) , a 5’ coding region (ORF) , an intact group I intron (ribozyme) and a 3’ homologous arm. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the 5’ homologous arm is shown in SEQ ID NO: 204. In an exemplary embodiment, the sequence of the 3’ homologous arm is shown in SEQ ID NO: 205. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the 5’ spacer region is shown in SEQ ID NO: 207. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the intact group I intron (ribozyme) is shown in SEQ ID NO: 209.

[0264] In some embodiments, the cyclization precursor RNA is circularized with the Cis circularization system 2 (abbreviated as Cis system-2) to form the circular RNA according to the present disclosure. In some embodiment, the cyclization precursor RNA further comprises a 5’ homologous arm, an intact group I intron (ribozyme) , a 5’ spacer region, a 3’ homologous arm and a 3’ homologous arm. In some embodiments, the cyclization precursor RNA comprises, from 5’ end to 3’ end, a 5’ homologous arm, a 5’ spacer region, the untranslated region according to the present disclosure, optionally Kozak sequence (GCCACC) , a coding region (ORF) , a 3’ spacer region, an intact group I intron (ribozyme) and a 3’ homologous arm. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the 5’ homologous arm is shown in SEQ ID NO: 210. In an exemplary embodiment, the sequence of the 3’ homologous arm is shown in SEQ ID NO: 211. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the 5’ spacer region is shown in SEQ ID NO: 212. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the 3’ spacer region is shown in SEQ ID NO: 214. In an exemplary embodiment, the nucleotide sequence of the intact group I intron (ribozyme) is shown in SEQ ID NO: 213.

[0265] In some embodiments, the present disclosure provides a nucleic acid molecule, which can be transcribed to form the above cyclization precursor RNA. In order to enable the nucleic acid molecule to be further transcribed to form the RNA molecule, the nucleic acid molecule can also include a regulatory sequence. For example, the regulatory sequence is a T7 promoter linked at the upstream of the 5’ homologous arm.

[0266] In some embodiments, the present disclosure provides an expression vector, which comprises the above nucleic acid molecule. Wherein the vector linking the nucleic acid molecule can be various vectors commonly used in the art. Further, the nucleic acid molecule includes a restriction enzyme cutting site, so that the expression vector is digested to obtain a linearized vector suitable for transcription.

[0267] Also provided is a method of enhancing targeting expression of circular RNA through microRNA regulation, wherein the method comprises circularizing the cyclization precursor RNA according to the present disclosure to form the circular RNA of the disclosure.

[0268] Also provided is a method of enhancing targeting expression of circular RNA through microRNA regulation, wherein the method comprises introducing one or more miRNA binding sites into a circular RNA comprising a coding region encoding a polypeptide of interest (POI) , and an untranslated region operably linked to the coding region; wherein the one or more miRNA binding sites are introduced into the untranslated region; and wherein the one or more miRNA binding sites display Watson-Crick complementarity to the seed region of one or more miRNAs.

[0269] Also provided is a method of enhancing targeting expression of circular RNA through microRNA regulation, wherein the method comprises introducing one or more miRNA binding sites into a circular RNA comprising a coding region encoding a polypeptide of interest (POI) , and an untranslated region comprising an internal ribosome entry site (IRES) element which is operably linked to the coding region; wherein the one or more miRNA binding sites are introduced into the IRES element; and wherein the one or more miRNA binding sites display Watson-Crick complementarity to the seed region of one or more miRNAs.

[0270] In another aspect, also provided is a cyclization precursor RNA, wherein the cyclization precursor RNA is circularized to form the circular RNA comprising a coding region encoding a polypeptide of interest (POI) , and an untranslated region operably linked to the coding region; wherein the untranslated region comprises one or more miRNA binding sites which display Watson-Crick complementarity to a seed region of one or more miRNAs, wherein the untranslated region is derived from HCV 5’ UTR, wherein the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol (e.g., lower than -50, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -60, -61, -62, -63, -64, -65, -66, -67, -68, -69, -70, -75, -80 kcal / mol and the like) upon binding to one or more miRNAs.

[0271] In some embodiments, the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure.

[0272] In some embodiments, the secondary structure comprises an SLI structure and a functional SLII structure, wherein the functional SLII structure promotes the assembly of the 80S ribosome and translation initiation.

[0273] In some embodiments, the untranslated region comprises an internal ribosome entry site (IRES) element which is operably linked to the coding region.

[0274] In some embodiments, the one or more miRNA binding sites are located within the IRES element.

[0275] In some embodiments, the miRNA is a mature miRNA.

[0276] In some embodiments, the untranslated region mainly forms non-canonical alternative SLII structures (SLIIalt) in the absence of binding to one or more miRNAs.

[0277] In some embodiments, the binding of one or more miRNAs leads to a conformational change of the SLII structure, from non-canonical SLIIalt structures to the functional SLII structure.

[0278] In some embodiments, the binding of one or more miRNAs promotes the transition of certain SLIIalt structures to more stable canonical SLII structures.

[0279] In some embodiments, the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0280] In some embodiments, the SLI and SLII structures are located within the 1-118 nt, 1-119 nt, 1-120 nt, 1-121 nt or 1-122 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0281] In some embodiments, the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and the SLI and SLII structures are located within the 1-118 nt, 1-119 nt, 1-120 nt, 1-121 nt or 1-122 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0282] In some embodiments, the untranslated region comprises one or more miR-122-5p binding sites, and the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding miR-122-5p, wherein the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure, wherein the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and wherein the SLI and SLII structures are located within the 1-118 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0283] In some embodiments, the untranslated region comprises one or more miR-155-5p binding sites, and the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding miR-155-5p, wherein the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure, wherein the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and wherein the SLI and SLII structures are located within the 1-119 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0284] In some embodiments, the untranslated region comprises one or more let-7a-5p binding sites, and the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding let-7a-5p, wherein the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure, wherein the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and wherein the SLI and SLII structures are located within the 1-120 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0285] In some embodiments, the untranslated region comprises one or more miR-17-5p binding sites, and the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding miR-17-5p, wherein the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure, wherein the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and wherein the SLI and SLII structures are located within the 1-120 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0286] In some embodiments, the untranslated region comprises one or more miR-20a-5p binding sites, and the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding miR-20a-5p, wherein the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure, wherein the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and wherein the SLI and SLII structures are located within the 1-120 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0287] In some embodiments, the untranslated region comprises one or more miR-142-3p binding sites, and the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding miR-142-3p, wherein the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure, wherein the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and wherein the SLI and SLII structures are located within the 1-120 nt of the most 5’ segment of the untranslated region.

[0288] In some embodiments, the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding one or more miRNAs, whereby improving the stability of the untranslated region and enhancing expression of the POI.

[0289] In some embodiments, the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding one or more miRNAs, whereby improving the stability of the circular RNA and enhancing expression of the POI.

[0290] In some embodiments, binding of one or more miRNAs lead to a conformational change of the untranslated region, which in-turn results in enhanced expression of the POI.

[0291] In some embodiments, binding of one or more miRNAs lead to a conformational change of the IRES element, which in-turn results in enhanced expression of the POI.

[0292] In some embodiments, the secondary structure and energy of the untranslated region are analyzed by using in silico RNA structure analysis. In some embodiments, the secondary structure and energy of the untranslated region are analyzed by using a structure prediction software. In some embodiments, the secondary structure and energy of the untranslated region are analyzed by using the structure prediction software ‘RNAstructure’ or ‘mfold’ . Modified nucleotides

[0293] In some embodiments, the RNA described herein may have modified nucleosides.

[0294] In some embodiments, the RNA described herein comprises at least one modified nucleotide.

[0295] Preferably, at least one modified nucleotide is selected from 1-methyladenosine, 2-methyladenosine, N6-methyladenosine, 2’ -0-methyladenosine, 2-methylthio-N6-methyladenosine, N6-isopentenyladenosine, 2-methylthio-N6-isopentenyladenosine, N6-threonylcarbamoyladenosine, 2-methylthio-N6-threonyl carbamoyladenosine, N6-methyl-N6-threonylcarbamoyladenosine, N6-hydroxynorvalylcarbamoyladenosine, 2-methylthio-N6-hydroxynorvalyl carbamoyladenosine, inosine, 3-methylcytidine, 2’ -0-methylcytidine, 2-thiocytidine, N4-acetylcytidine, lysidine, 1-methylguanosine, 7-methylguanosine, 2’ -0-methylguanosine, queuosine, epoxyqueuosine, 7-cyano-7-deazaguanosine, 7-aminomethyl-7-deazaguanosine, pseudouridine, N-1-methylpseudouridine, dihydrouridine, 5-methyluridine, 2'-0-methyluridine, 2-thiouridine, 4-thiouridine, 5-methyl-2-thiouridine, 3- (3-amino-3-carboxypropyl) uridine', 5-hydroxyuridine, 5-methoxyuridine, uridine 5-oxyacetic acid, uridine 5-oxyacetic acid methyl ester, 5-aminomethyl-2-thiouridine, 5-methylaminomethyluridine, 5-methylaminomethyl-2-thiouridine, 5-methylaminomethyl-2-selenouridine, 5-carboxymethylaminomethyluridine, 5-carboxymethylaminomethyl-2'-0-methyluridine, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5- (isopentenylaminomethyl) uridine, 5- (isopentenylaminomethyl) -2-thiouridine, 2-aminoadenosine or 5- (isopentenylaminomethyl) -2'-0-methyluridine, 3-methyl adenosine, C5 propynyl-cytidine, C5 propynyl-uridine, C5-bromouridine, C5-fluorouridine, C5-iodouridine, C5-propynyl-uridine, C5-propynyl-cytidine, C5-methylcytidine, 7-deazaadenosine, 7-deazaguanosine, 8-oxoadenosine, 8-oxoguanosine or 0 (6) -methylguanine. Pharmaceutical Composition

[0296] In one aspect, the circular RNA or the cyclization precursor RNA described herein is formulated for in vitro and in vivo delivery. Particularly, in some embodiments, the circular RNA or the cyclization precursor RNA is formulated into a lipid-containing pharmaceutical composition.

[0297] The pharmaceutical composition of the present invention may comprise one or more components to, for example, increase stability of the circular RNA or the cyclization precursor RNA, increase cell transfection of the circular RNA or the cyclization precursor RNA, permit sustained or delayed release of the circular RNA or the cyclization precursor RNA, change the biodistribution of the circular RNA or the cyclization precursor RNA, increase the translation of encoded POI in vivo, and / or alter the release profile of the encoded POI in vivo.

[0298] In some embodiments, the pharmaceutical composition may include one or more pharmaceutically acceptable excipients or accessory ingredients such as, but not limited to, one or more solvents, dispersion media, diluents, dispersion aids, suspension aids, granulating aids, disintegrants, fillers, glidants, liquid vehicles, binders, surface active agents, isotonic agents, thickening or emulsifying agents, buffering agents, lubricating agents, oils, preservatives, and other species. Excipients such as waxes, butters, coloring agents, coating agents, flavorings, and perfuming agents may also be included. Pharmaceutically acceptable excipients are well known in the art (see for example Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro; Lippincott, Williams &Wilkins, Baltimore, Md., 2006) .

[0299] In some embodiments, the circular RNA or the cyclization precursor RNA of the present invention is present as naked (free) form.

[0300] In some aspects, the pharmaceutical composition may comprise lipidoids, liposomes, lipid nanoparticles (LNPs) , polymers, lipoplexes, lipopolyplexes, core-shell nanoparticles, peptides, proteins, cells transfected with the circular RNA or the cyclization precursor RNA (e.g., for transplantation into an individual) , hyaluronidase, nanoparticle mimics, aqueous solution and combinations thereof.

[0301] Lipopolyplex is a core-shell structure composed of nucleic acid, polycation and lipid. As a non-viral gene delivery vector, lipopolyplex combining the advantages of polyplex and lipoplex has shown superior colloidal stability, reduced cytotoxicity, extremely high gene transfection efficiency (see e.g., Chen W, Li H, Liu Z, Yuan W. Lipopolyplex for Therapeutic Gene Delivery and Its Application for the Treatment of Parkinson’s Disease. Front Aging Neurosci. 2016 Apr 5; 8: 68. ) . In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises or is formulated as a lipopolyplex. In some embodiments, the circular RNA or the cyclization precursor RNA of the present invention may be formulated in a pharmaceutical composition using lipopolyplexes.

[0302] The term "lipoplex" relates to a particle that contains lipids, in particular cationic lipids, and RNA. Electrostatic interactions between positively charged liposomes and negatively charged RNA result in complexation and spontaneous formation of RNA lipoplex particles. Positively charged liposomes may be generally synthesized using a cationic lipid, such as DOTMA, and additional lipids, such as DOPE. In one embodiment, an RNA lipoplex particle is a nanoparticle. In one embodiment, the lipoplex is obtainable by mixing the RNA with liposomes. In one embodiment, the lipoplex is obtainable by mixing the RNA with lipids. In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises or is formulated as a lipoplex. In some embodiments, the circular RNA or the cyclization precursor RNA of the present invention may be formulated in a pharmaceutical composition using lipoplexes.

[0303] In some embodiments, the pharmaceutical compositions of the invention can include one or more excipients provided in a ratio to optimize the properties of the circular RNA or the cyclization precursor RNA. In some embodiments, the circular RNA or the cyclization precursor RNA of the present invention may be formulated in a pharmaceutical composition using self-assembled nucleic acid nanoparticles. In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises at least one circular RNA or cyclization precursor RNA, such as 1, 2, 3, 4 or 5 circular RNA or cyclization precursor RNA.

[0304] The pharmaceutical compositions described herein may be prepared by any method known or hereafter developed in the art of pharmacology. In general, such preparatory methods include the step of associating the circular RNA or the cyclization precursor RNA with an excipient and / or one or more other accessory ingredients. In some embodiments, the pharmaceutical composition may be prepared, packaged, and / or sold in bulk, as a single unit dose, and / or as a plurality of single unit doses. As used herein, a “unit dose” refers to a discrete amount of the pharmaceutical composition comprising a predetermined amount of the circular RNA or the cyclization precursor RNA. The amount of the circular RNA or the cyclization precursor RNA may generally be equal to the dosage of the circular RNA or the cyclization precursor RNA which would be administered to an individual and / or a convenient fraction of such a dosage including, but not limited to, one-half or one-third of such a dosage.

[0305] In some embodiments, the relative amounts of the circular RNA or the cyclization precursor RNA, the pharmaceutically acceptable excipient, and / or any additional ingredients in the pharmaceutical composition may vary, depending upon the identity, size, and / or condition of the individual being administered the pharmaceutical composition as well as the route by which the pharmaceutical composition is to be administered. In some embodiments, the pharmaceutical composition may comprise between 0.1%and 99% (w / w) of the circular RNA or the cyclization precursor RNA. Lipid nanoparticles (LNPs)

[0306] In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises an LNP. In some embodiments, the circular RNA or the cyclization precursor RNA is formulated in the LNP, such as those described in International Publication No. WO2012170930, herein incorporated by reference in its entirety. In some embodiments, the particle size of the LNP may be increased and / or decreased. The change in particle size may be able to help counter biological reactions such as, but not limited to, inflammation or may increase the biological effect of the circular RNA or the cyclization precursor RNA when administered to an individual.

[0307] In some embodiments, the LNP comprises between about 20 molar percent to about 65 molar percent of a cationic lipid. In some embodiments, the LNP comprises between about 30 molar percent to about 55 molar percent of a cationic lipid. In some embodiments, the LNP comprises greater than about 30 molar percent of a cationic lipid, such as greater than any of about 35 molar percent, 40 molar percent, 45 molar percent, 50 molar percent, 55 molar percent, or greater, of a cationic lipid. In some embodiments, the LNP comprises less than about 55 molar percent of a cationic lipid, such as less than any of about 50 molar percent, 45 molar percent, 40 molar percent, 35 molar percent, 30 molar percent, or less, of a cationic lipid.

[0308] In some embodiments, the LNP comprises between about 5 molar percent to about 40 molar percent of a phospholipid. In some embodiments, the LNP comprises greater than about 5 molar percent of a phospholipid, such as greater than any of about 10 molar percent, 15 molar percent, 20 molar percent, 25 molar percent, 30 molar percent, 35 molar percent, 40 molar percent, or greater, of a phospholipid. In some embodiments, the LNP comprises less than about 40 molar percent of a phospholipid, such as less than any of about 35 molar percent, 30 molar percent, 25 molar percent, 20 molar percent, 15 molar percent, 10 molar percent, 5 molar percent, or less, of a phospholipid.

[0309] In some embodiments, the LNP comprises between about 20 molar percent to about 50 molar percent of a sterol. In some embodiments, the LNP comprises greater than about 20 molar percent of a sterol, such as greater than any of about 25 molar percent, 30 molar percent, 35 molar percent, 40 molar percent, 45 molar percent, 50 molar percent, or greater, of a sterol. In some embodiments, the LNP comprises less than about 50 molar percent of a sterol, such as less than any of about 45 molar percent, 40 molar percent, 35 molar percent, 30 molar percent, 25 molar percent, 20 molar percent, or less, of a sterol.

[0310] In some embodiments, the LNP comprises a cationic lipid, a phospholipid, a sterol, and a polymer conjugated lipid, such as any of the cationic lipids, phospholipids, sterols, and polymer conjugated lipids described herein. In some embodiments, the LNP comprises i) between about 30 molar percent to about 55 molar percent of a cationic lipid, ii) between about 5 molar percent to about 40 molar percent of a phospholipid, iii) between about 20 molar percent to about 50 molar percent of a sterol; and iv) a polymer conjugated lipid.

[0311] In some embodiments, the LNP comprises a total lipid to circular RNA or cyclization precursor RNA weight ratio of about 10: 1 to about 30: 1, such as any of about 10: 1 to about 20:1, about 15: 1 to about 25: 1, and about 20: 1 to about 30: 1. In some embodiments, the LNP comprises a total lipid to circular RNA or cyclization precursor RNA weight ratio of greater than about 10: 1, such as greater than any of about 15: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, or greater. In some embodiments, the LNP comprises a total lipid to circular RNA or cyclization precursor RNA weight ratio of less than about 30: 1, such as less than any of about 25: 1, 20: 1, 15: 1, 10: 1, or less. In some embodiments, the total lipid to circular RNA or cyclization precursor RNA weight ratio may be adjusted depending on the other components of the pharmaceutical composition, the individual to be administered, and / or the route of administration. The amount of circular RNA or cyclization precursor RNA in an LNP, for example, be measured using absorption spectroscopy (e.g., ultraviolet-visible spectroscopy) . i. Cationic Lipid

[0312] In some embodiments, the LNP comprises a cationic lipid, also referred to herein as an “ionizable lipid. ” Cationic lipids that may be comprised in the LNPs provided herein are known in the art. For example, the cationic lipid may include, but is not limited to, the cationic lipids described in International Publication Nos. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865 and WO2008103276, U.S. Pat. Nos. 7,893,302, 7,404,969 and 8,283,333 and U.S. Patent Publication No. US20100036115 and US20120202871; each of which is herein incorporated by reference in their entirety. In some embodiments, the cationic lipid is selected from the non-limiting group consisting of 3- (didodecylamino) -N1, N1, 4-tridodecyl-1-piperazineethanamine (KL10) , 14, 25-ditridecyl-15, 18, 21, 24-tetraaza-octatriacontane (KL25) , 1, 2-dilinoleyloxy-N, N-dimethylaminopropane (DLin-DMA) , 2, 2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl- [1, 3] -dioxolane (DLin-K-DMA) , heptatriaconta-6, 9, 28, 31-tetraen-19-yl 4- (dimethylamino) butanoate (DLin-MC3-DMA) , 2, 2-dilinoleyl-4- (2-dimethylaminoethyl) - [1, 3] -dioxolane (DLin-KC2-DMA) , 1, 2-dioleyloxy-N, N-dimethylaminopropane (DODMA) , 2- ( {8- [ (3β) -cholest-5-en-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-dimethyl-3- [ (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-yloxy] propan-1-amine (Octyl-CLinDMA) , (2R) -2- ( {8- [ (3β) -cholest-5-en-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-dimethyl-3- [ (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-yloxy] pro pan-1-amine (Octyl-CLinDMA (2R) ) , and (2S) -2- ( {8- [ (3β) -cholest-5-en-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-di methyl-3- [ (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-yloxy] prop an-1-amine (Octyl-CLinDMA (2S) ) , or a pharmaceutically acceptable salt or stereoisomer thereof. In addition to these, the cationic lipid may also be a lipid including a cyclic amine.

[0313] In some embodiments, the cationic lipid may be synthesized by methods known in the art and / or as described in International Publication Nos. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724 and WO201021865; each of which is herein incorporated by reference in their entirety.

[0314] It should be understood in the present description, that combinations of substituents and / or variables of the depicted formulae are permissible only if such contributions result in stable compounds. Other ionizable lipids

[0315] As described herein, in some embodiments, an LNP provided herein comprises one or more charged or ionizable lipids in addition to a lipid of Series 01, 02, 03, or 04, e.g., a lipid according to Formulae (01-I) , (01-II) , (02-I) , (03-I) , or (04-I) (and sub-formulas thereof, see e.g., WO2023098842) . Without being bound by the theory, it is contemplated that certain charged or zwitterionic lipid components of a nanoparticle composition resemble the lipid component in the cell membrane, thereby improving cellular uptake of the nanoparticle. Exemplary charged or ionizable lipids that can form part of the present nanoparticle composition include but are not limited to 3- (didodecylamino) -N1, N1, 4-tridodecyl-1-piperazineethanamine (KL10) , N1- [2- (didodecylamino) ethyl] -N1, N4, N4-tridodecyl-1, 4-piperazinediethanamine (KL22) , 14, 25-ditridecyl-15, 18, 21, 24-tetraaza-octatriacontane (KL25) , 1, 2-dilinoleyloxy-N, N-dimethylaminopropane (DLinDMA) , 2, 2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl- [1, 3] -dioxolane (DLin-K-DMA) , heptatriaconta-6, 9, 28, 31-tetraen-19-yl 4- (dimethylamino) butanoate (DLin-MC3-DMA) , 2, 2-dilinoleyl-4- (2-dimethylaminoethyl) - [1, 3] -dioxolane (DLin-KC2-DMA) , 1, 2-dioleyloxy-N, N-dimethylaminopropane (DODMA) , 2- ({8- [ (3β) -cholest-5-en-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-dimethyl-3 [ (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-yloxy] propan-1-amine (Octyl-CLinDMA) , (2R) -2- ( {8- [ (3β) -cholest-5-en-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-dimethyl-3- [ (9Z, 12Z) --octadeca-9, 12-dien-1-yloxy] propan-1-amine (Octyl-CLinDMA (2R) ) , (2S) -2- ( {8- [ (3β) -cholest-5-en-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-dimethyl-3- [ (9Z-, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-yloxy] propan-1-amine (Octyl-CLinDMA (2S) ) , (12Z, 15Z) -N, N-dimethyl-2-nonylhenicosa 12, 15-den-1-amine, N, N-dimethyl-1- { (1S, 2R) -2-octylcyclopropyl} heptadecan-8-amine. Additional exemplary charged or ionizable lipids that can form part of the present nanoparticle composition include the lipids (e.g., lipid 5) described in Sabnis S, Kumarasinghe ES, Salerno T, Mihai C, Ketova T, Senn JJ, Lynn A, Bulychev A, McFadyen I, Chan J, Almarsson  Stanton MG, Benenato KE. A Novel Amino Lipid Series for mRNA Delivery: Improved Endosomal Escape and Sustained Pharmacology and Safety in Non-human Primates. Mol Ther. 2018 Jun 6; 26 (6) : 1509-1519., the entirety of which is incorporated herein by reference.

[0316] In some embodiments, suitable cationic lipids include N- [1- (2, 3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) ; N- [1- (2, 3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTAP) ; 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DOEPC) ; 1, 2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DLEPC) ; 1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DMEPC) ; 1, 2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (14: 1) ; N1- [2- ( (1S) -1- [ (3-aminopropyl) amino] -4- [di (3-amino-propyl) amino] butylcarboxamido) ethyl] -3, 4-di [oleyloxy] -benzamide (MVL5) ; dioctadecylamido-glycylspermine (DOGS) ; 3b- [N- (N', N'-dimethylaminoethyl) carbamoyl] cholesterol (DC-Chol) ; dioctadecyldimethylammonium bromide (DDAB) ; SAINT-2, N-methyl-4- (dioleyl) methylpyridinium; 1, 2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium bromide (DMRIE) ; 1, 2-dioleoyl-3-dimethyl-hydroxyethyl ammonium bromide (DORIE) ; 1, 2-dioleoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium chloride (DORI) ; di-alkylated amino acid (DILA2) (e.g., C18: 1-norArg-C16) ; dioleyldimethylammonium chloride (DODAC) ; 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (POEPC) ; 1, 2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (MOEPC) ; (R) -5- (dimethylamino) pentane-1, 2-diyl dioleate hydrochloride (DODAPen-Cl) ; (R) -5-guanidinopentane-1, 2-diyl dioleate hydrochloride (DOPen-G) ; and (R) -N, N, N-trimethyl-4, 5-bis (oleoyloxy) pentan-1-aminium chloride (DOTAPen) . Also suitable are cationic lipids with headgroups that are charged at physiological pH, such as primary amines (e.g., DODAG N', N'-dioctadecyl-N-4, 8-diaza-10-aminodecanoylglycine amide) and guanidinium head groups (e.g., bis-guanidinium-spermidine-cholesterol (BGSC) , bis-guanidiniumtren-cholesterol (BGTC) , PONA, and (R) -5-guanidinopentane-1, 2-diyl dioleate hydrochloride (DOPen-G) ) . Yet another suitable cationic lipid is (R) -5- (dimethylamino) pentane-1, 2-diyl dioleate hydrochloride (DODAPen-Cl) . In certain embodiments, the cationic lipid is a particular enantiomer or the racemic form, and includes the various salt forms of a cationic lipid as above (e.g., chloride or sulfate) . For example, in some embodiments, the cationic lipid is N- [1- (2, 3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTAP-Cl) or N- [1- (2, 3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium sulfate (DOTAP-Sulfate) . In some embodiments, the cationic lipid is an ionizable cationic lipid such as, e.g., dioctadecyldimethylammonium bromide (DDAB) ; 1, 2-dilinoleyloxy-3-dimethylaminopropane (DLinDMA) ; 2, 2-dilinoleyl-4- (2dimethylaminoethyl) - [1, 3] -dioxolane (DLin-KC2-DMA) ; heptatriaconta-6, 9, 28, 31-tetraen-19-yl 4- (dimethylamino) butanoate (DLin-MC3-DMA) ; 1, 2-dioleoyloxy-3-dimethylaminopropane (DODAP) ; 1, 2-dioleyloxy-3-dimethylaminopropane (DODMA) ; and morpholinocholesterol (Mo-CHOL) . In certain embodiments, a lipid nanoparticle includes a combination or two or more cationic lipids (e.g., two or more cationic lipids as above) .

[0317] Additionally, in some embodiments, the charged or ionizable lipid that can form part of the present nanoparticle composition is a lipid including a cyclic amine group. Additional cationic lipids that are suitable for the formulations and methods disclosed herein include those described in WO2015199952, WO2016176330, and WO2015011633, the entire contents of each of which are hereby incorporated by reference in their entireties. Additionally, in some embodiments, the charged or ionizable lipid that can form part of the present nanoparticle composition is a lipid including a cyclic amine group. Additional cationic lipids that are suitable for the formulations and methods disclosed herein include those described in WO2015199952, WO2016176330, and WO2015011633, the entire contents of each of which are hereby incorporated by reference in their entireties. ii. Phospholipid

[0318] In some embodiments, the LNP comprises a phospholipid. Exemplary phospholipids are described in US20180000953A1, the contents of which is incorporated by reference in its entirety. In some embodiments, the phospholipid may include one or more (poly) unsaturated lipids. In some embodiments, a phospholipid of the LNP includes a phospholipid moiety and one or more fatty acid moieties, one or more of which may be unsaturated. In some embodiments, the phospholipid moiety may be selected from the non-limiting group consisting of phosphatidyl choline, phosphatidyl ethanolamine, phosphatidyl glycerol, phosphatidyl serine, phosphatidic acid, 2-lysophosphatidyl choline, and a sphingomyelin. In some embodiments, the fatty acid moiety may be selected from the non-limiting group consisting of lauric acid, myristic acid, myristoleic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, alpha-linolenic acid, erucic acid, arachidic acid, arachidonic acid, phytanoic acid, eicosapentaenoic acid, behenic acid, docosapentaenoic acid, and docosahexaenoic acid. In some embodiments, the phospholipid is selected from the group consisting of 1, 2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC) , 1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-phosphocholine (DMPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) , 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) , 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , 1, 2-diundecanoyl-sn-glycero-phosphocholine (DUPC) , 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) , 1, 2-di-O-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine (18: 0 Diether PC) , 1-oleoyl-2-cholesterylhemisuccinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (OChemsPC) , 1-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine (C16 Lyso PC) , 1, 2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1, 2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1, 2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) , 1, 2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ME 16.0 PE) , 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1, 2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1, 2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1, 2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1, 2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac- (1-glycerol) sodium salt (DOPG) , and sphingomyelin, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Non-natural species including natural species with modifications and substitutions including branching, oxidation, cyclization, and alkynes are also contemplated. iii. Sterol

[0319] In some embodiments, the LNP comprises a sterol. In some embodiments, the sterol is a structural lipid. In some embodiments, the sterol is cholesterol fecosterol, sitosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, ergosterol, tomatidine, tomatine, ursolic acid, or alpha-tocopherol, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. iv. Polymer conjugated lipid

[0320] In some embodiments, the LNP comprises one or more polymer conjugated lipids, such as PEGylated lipids (PEG lipids) . Without being bound by the theory, it is contemplated that a polymer conjugated lipid component in a nanoparticle composition can improve of colloidal stability and / or reduce protein absorption of the nanoparticles. Exemplary cationic lipids that can be used in connection with the present disclosure include but are not limited to PEG-modified phosphatidylethanolamines, PEG-modified phosphatidic acids, PEG-modified ceramides, PEG-modified dialkylamines, PEG-modified diacylglycerols, PEG-modified dialkylglycerols, and mixtures thereof. For example, a PEG lipid may be PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, PEG-DSPE, Ceramide-PEG2000, or Chol-PEG2000.

[0321] In some embodiments, the polymer conjugated lipid is a pegylated lipid. For example, some embodiments include a pegylated diacylglycerol (PEG-DAG) such as 1- (monomethoxy-polyethyleneglycol) -2, 3-dimyristoylglycerol (PEG-DMG) , a pegylated phosphatidylethanoloamine (PEG-PE) , a PEG succinate diacylglycerol (PEG-S-DAG) such as 4-O- (2’ , 3’ -di (tetradecanoyloxy) propyl-1-O- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) butanedioate (PEG-S-DMG) , a pegylated ceramide (PEG-cer) , or a PEG dialkoxypropylcarbamate such as ω-methoxy (polyethoxy) ethyl-N- (2, 3-di (tetradecanoxy) propyl) carbamate or 2, 3-di (tetradecanoxy) propyl-N- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) carbamate.

[0322] In some embodiments, the polymer conjugated lipid is present in a concentration ranging from 0.5 to 5 molar percent. In some embodiments, the polymer conjugated lipid is present in a concentration ranging from 1.0 to 2.5 molar percent. In one embodiment, the polymer conjugated lipid is present in a concentration of about 1.7 molar percent. In one embodiment, the polymer conjugated lipid is present in a concentration of about 1.5 molar percent.

[0323] In some embodiments, the molar ratio of cationic lipid to the polymer conjugated lipid ranges from about 35: 1 to about 25: 1. In one embodiment, the molar ratio of cationic lipid to polymer conjugated lipid ranges from about 100: 1 to about 20: 1.

[0324] In some embodiments, the molar ratio of cationic lipid to the polymer conjugated lipid ranges from about 35: 1 to about 25: 1. In one embodiment, the molar ratio of cationic lipid to polymer conjugated lipid ranges from about 100: 1 to about 20: 1.

[0325] In some embodiments, the pegylated lipid has the following Formula: or a pharmaceutically acceptable salt, tautomer or stereoisomer thereof, wherein:  R12 and R13 are each independently a straight or branched, saturated or unsaturated alkyl chain containing from 10 to 30 carbon atoms, wherein the alkyl chain is optionally interrupted by one or more ester bonds; and w has a mean value ranging from 30 to 60.

[0326] In some embodiments, R12 and R13 are each independently straight, saturated alkyl chains containing from 12 to 16 carbon atoms. In other embodiments, the average w ranges from 42 to 55, for example, the average w is 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 or 55. In some specific embodiments, the average w is about 49.

[0327] In some embodiments, the pegylated lipid has the following Formula: wherein the average w is about 49. Additional components

[0328] In some embodiments, the LNP may comprise one or more additional components. For example, the LNP may comprise one or more small hydrophobic molecules, such as a vitamin (e.g., vitamin A or vitamin E) , permeability enhancer molecules, carbohydrates (e.g., similar sugars or polysaccharides) , polymers, therapeutic agents, surface altering agents, or other components. In some embodiments, a polymer may be included in and / or used to encapsulate or partially encapsulate the LNP. A polymer may be biodegradable and / or biocompatible.

[0329] Therapeutic agents may include, but are not limited to, cytotoxic, chemotherapeutic, and other therapeutic agents. Cytotoxic agents may include, for example, taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, teniposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracinedione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, maytansinoids, rachelmycin, and analogs thereof. Radioactive ions may also be used as therapeutic agents and may include, for example, radioactive iodine, strontium, phosphorous, palladium, cesium, iridium, cobalt, yttrium, samarium, and praseodymium. Other therapeutic agents may include, for example, antimetabolites (e.g., methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, and 5-fluorouracil, and decarbazine) , alkylating agents (e.g., mechlorethamine, thiotepa, chlorambucil, rachelmycin, melphalan, carmustine, lomustine, cyclophosphamide, busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, mitomycin C, and cis-dichlorodiamine platinum (II) (DDP) , and cisplatin) , anthracyclines (e.g., daunorubicin and doxorubicin) , antibiotics (e.g., dactinomycin, bleomycin, mithramycin, and anthramycin) , and anti-mitotic agents (e.g., vincristine, vinblastine, taxol, and maytansinoids) .

[0330] In some embodiments, the pharmaceutical composition and / or LNP comprises a proteinaceous compound capable of providing an additional activation signal for immune effector cells. Such compounds may comprise, but are not limited to CD28 engagers, ICOS engagers, 41 BB engagers, OX40 engagers, CD27 engagers, CD30 engagers, NKG2D engagers, IL2-R engagers or IL12-R engagers. In some embodiments, the “proteinaceous compounds” providing an activation signal for immune effector cells may be, e.g., a further primary activation signal, or costimulatory (second) signal or any other accessory (third) activation signal. Examples are a T cell receptor (TCR) or TCR-like signal. Preferred formats of proteinaceous compounds comprise additional bispecific antibodies and fragments or derivatives thereof, e.g., bispecific scFv. Proteinaceous compounds can comprise, but are not limited to, antibody fragments, such as scFv fragments, specific for 4-1BB, OX 40, CD27, CD70 or the receptors for B7-RP1, B7-H3 as well as antibody fragments specific for the TCR or superantigens. Superantigens directly bind to certain subfamilies of TCR variable regions in an MHC-independent manner thus mediating the primary T cell activation signal. The proteinaceous compound may also provide an activation signal for an immune effector cell which is a non-T cell. Examples of immune effector cells which are non-T cells comprise, for example, NK cells.

[0331] Surface-altering agents may include, but are not limited to, anionic proteins (e.g., bovine serum albumin) , surfactants (e.g., cationic surfactants such as dimethyldioctadecyl-ammonium bromide) , sugars or sugar derivatives (e.g., cyclodextrin) , nucleic acids, polymers (e.g., heparin, polyethylene glycol, and poloxamer) , mucolytic agents (e.g., acetylcysteine, mugwort, bromelain, papain, clerodendrum, bromhexine, carbocisteine, eprazinone, mesna, ambroxol, sobrerol, domiodol, letosteine, stepronin, tiopronin, gelsolin, thymosin 134, dornase alfa, neltenexine, and erdosteine) , and DNases (e.g., rhDNase) . In some embodiments, the surface-altering agent may be disposed within an LNP and / or on the surface of an LNP in the pharmaceutical composition (e.g., by coating, adsorption, covalent linkage, or other processes) .

[0332] The disclosure features methods of delivering the circular RNA or the cyclization precursor RNA to a mammalian cell or organ, producing a POI in a mammalian cell, and treating a disease or disorder in a mammal in need thereof comprising administering to a mammal and / or contacting a mammalian cell with a pharmaceutical composition including the circular RNA. Application

[0333] In one aspect, provided is the use of the circular RNA, the cyclization precursor RNA or the pharmaceutical composition according to the present disclosure in the manufacture of a medicament for the expression of a POI in a target cell or tissue.

[0334] In some embodiments, the expression of a POI in a target cell or tissue is enhanced.

[0335] In one aspect, provided is the use of the circular RNA, the cyclization precursor RNA or the pharmaceutical composition according to the present disclosure in the manufacture of a medicament for preventing or treating a disease.

[0336] In some embodiments, the disease is selected from the group consisting of infectious diseases, cancers, genetic disorders, cardiovascular diseases, autoimmune diseases and rare diseases.

[0337] In one aspect, provided is the circular RNA, the cyclization precursor RNA or the pharmaceutical composition according to the present disclosure for pharmaceutical use.

[0338] In one aspect, provided is a method of preventing or treating a disease in a subject comprising administrating to the subject the circular RNA, the cyclization precursor RNA or the pharmaceutical composition according to the present disclosure.Beneficial Effects

[0339] In one aspect, the application of the circular RNAs and the pharmaceutical composition herein will achieve at least one of the following technical effects: (1) the expression of the POI encoded in a target cell or target tissue will be enhanced or  regulated by endogenous miRNA and synthetic miRNA mimics; (2) the expression of POI encoded will be targeted to a particular cell or target tissue; and (3) the off-target expression of RNA will be reduced.Examples

[0340] The examples in this section are offered by way of illustration, and not by way of limitation. Unless otherwise stated, commonly used molecular biology, biochemistry and cell biology techniques are utilized to prepare the circular / linear RNA in the examples. Unless otherwise stated, the instruments and reagents used in the examples are commercially available. Example 1: Up-regulation of circular / linear RNA expression with miR-122-5p

[0341] This example designs and prepares circular / linear RNA harboring miR-122-5p binding sites, and verifies the different regulation patterns of circular / linear RNA expression with miR-122-5p. Methods: 1. The design of circular RNA sequences

[0342] For the design of circular RNAs harboring miR-122-5p binding sites, HCV 5’UTR with two miR-122-5p binding sites was inserted into the circular RNA backbone (based on the PIE circularization system) , as an IRES, which was followed by ORF sequences encoding firefly luciferase (FLuc) and nano-luciferase (NLuc) , respectively. The schematic diagram of precursor and circular RNA in the PIE circularization system used in the experiments is shown in FIG. 2.

[0343] Specifically, HCV 5’UTR nucleotides 22 to 28 (ACACUCC) and 38 to 43 (CACUCC) display Watson-Crick base pair complementarity to the seed sequence in the 5’ end of miR-122-5p which encompasses nucleotides 2-7 and / or 2-8 (GGAGUG and / or GGAGUGU) (see FIG. 1A) . For the design of the circular RNA harboring mutated miR-122-5p binding sites, the nucleotides (C27 and C42) complementary to the seed nucleotide in position 3 (G) of miR122 were mutated to their complements (C27G and C42G; ACACUGC and CACUGC) , such that the mutation sites are not predicted to bind the seed region (GGAGUG and / or GGAGUGU) in mature miR-122-5p molecules. 2. Preparation of plasmid DNA

[0344] For the generation of plasmid DNA, synthesized DNA fragment harboring HCV 5’UTR with two miR-122-5p binding sites was assembled into a double-digested plasmid backbone by a homologous recombinational cloning strategy. These products were transformed into the  Stable Competent E. coli (New England Biolabs) . Plasmid DNA was extracted from the E. coli transformants and confirmed by DNA sequencing. 3. Preparation of plasmid-based DNA templates

[0345] For the preparation of DNA templates encoding firfly luciferase (FLuc) or nano-luciferase (NLuc) , the corresponding plasmid DNA described above was linearized by restriction endonuclease or BspmI (New England Biolabs) . The resulting linearized DNA templates were then purified and used for circular RNA preparation. 4. Preparation of circular RNA

[0346] For the preparation of circular RNA, a one-step circularization reaction is performed. The plasmid-based DNA template (0.5 μg) was incubated with the 1 U / μL RNase Inhibitor (Novoprotein) , 1×transcription buffer (Novoprotein; containing 6 mM MgCl2) , 5 U / μL T7 RNA polymerase (Kactus Biosystems) , 4 U / mL Pyrophosphatase Inorganic (Novoprotein) , 5 mM NaCl (Invitrogen) , 30 mM MgCl2 (Invitrogen) , 10 mM DTT (Thermo Fisher Scientific) and four nucleotides (10 mM ATP, 10 mM CTP, 10 mM GTP and 10 mM UTP; Glycogene) in 20 μL final volume. Circularization reaction is performed at 41℃ for 3 hours. Then, DNase I (4 U / reaction) was added to the mixture and incubated for a further 30 minutes at 37℃ to remove the DNA templates. The obtained RNA was purified with Rnase R (Kactus Biosystems) to remove linear RNAs, then followed by column purification with Monarch RNA Cleanup Kit and quantified using NanoDrop. The resulting circular RNAs were used for cell transfection assays below. Table 1-1 provides specific information about the resulting circular RNAs.

[0347] Table 1-1: Circular RNAs encoding NLuc and FLuc 5. The design of linear RNA sequence

[0348] For the design of linear RNA harboring miR-122-5p binding site, HCV 5’UTR with two miR-122-5p binding sites as described above was inserted into linear RNA as an IRES, which were followed by ORF sequences encoding firefly luciferase (FLuc) . The schematic diagram of linear RNA harboring miR-122-5p binding site used in the experiments is shown in FIG. 3. 6. Preparation of plasmid DNA

[0349] For the generation of plasmid DNA, synthesized DNA fragment harboring HCV 5’UTR with two miR-122-5p binding sites was assembled into a double-digested plasmid backbone by a homologous recombinational cloning strategy. These products were transformed into the  Stable Competent E. coli (New England Biolabs) . Plasmid DNA was extracted from the E. coli transformants and confirmed by DNA sequencing. 7. Preparation of PCR-amplified DNA templates

[0350] For the preparation of PCR-amplified templates encoding firfly luciferase (FLuc) , the corresponding plasmid DNA described above was amplified by  High-Fidelity DNA Polymerases (New England Biolabs) using specific primer pairs. The resulting PCR-amplified DNA template was then purified and used for linear RNA preparation. 8. Preparation of linear RNA

[0351] Table 1-2 provides specific information about the resulting linear RNAs. For the preparation of linear RNA, a PCR-amplified DNA template was used for RNA in vitro transcription. The PCR-amplified DNA template (0.25 μg) was incubated with the 1 U / μL RNase Inhibitor (Novoprotein) , 1×transcription buffer (Novoprotein; containing 6 mM MgCl2) , 5 U / μL T7 RNA polymerase (Kactus Biosystems) , 4 U / mL Pyrophosphatase Inorganic (Novoprotein) , 5 mM NaCl (Invitrogen) , 20 mM MgCl2 (Invitrogen) , 10 mM DTT (Thermo Fisher Scientific) and four nucleotides (10 mM ATP, 10 mM CTP, 10 mM GTP and 10 mM UTP; Glycogene) in 20 μL final volume. The reaction is performed at 37℃ for 3 hours. Then, DNase I (4U / reaction) was added to the IVT mixture and incubated for a further 30 minutes at 37℃ to remove the DNA template. The obtained RNA was purified with POROSTM Oligo (dT) 25 Affinity Resin (Thermo Fisher Scientific) . The resulting linear RNAs were used for cell transfection assays below. Table 1-2 provides specific information about the resulting linear RNAs.

[0352] Table 1-2: miRNA binding site in linear RNA encoding FLuc 9. Preparation of the FLuc-mRNA reference

[0353] The schematic diagram of the FLuc-mRNA reference used in the experiments is shown in FIG. 8 and the nucleotide sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 195. The plasmid DNA, the PCR-amplified DNA templates or the linear RNA of the FLuc-mRNA reference were prepared as described above. After transcription, the obtained uncapped-mRNA was denatured at 75 ℃ for 10 min and cooled on ice for another 10 min. The denatured mRNA (7.5 μg) was incubated with the 1 U / μL RNase Inhibitor (Novoprotein) , 1×capping buffer (Kactus Biosystems) , 1 U / μL Vaccinia capping enzyme (Kactus Biosystems) , 1.5 mM GTP, 0.4 mM SAM, 2.5 U / μL mRNA cap’ 2-O-methytransferase in 20 μL final volume. Reaction is performed at 37℃ for 4 hours. The capped mRNA was then purified by POROSTM Oligo (dT) 25 Affinity Resin (Thermo Fisher Scientific) . The resulting mRNAs were used for cell transfection assays below. 10. Cells culture and circular / linear RNAs transfection

[0354] HEK293T and A549 cell lines were acquired from ATCC. Huh7 cell line was acquired from the Cell Bank of Chinese Academy of Sciences. Hepatocytes were provided by Beijing Daxiang Biotech Co., Ltd. HEK293T, A549, Huh7 and Hepatocytes cells were seeded in 96-well flat-bottomed plates at a density of 2×104 cells / well for 24 hours. The cells were transfected with 100 ng circular RNAs (e.g., Table 1-11) , or 100 ng circular RNA only (control) , 100 ng circular RNA and negative control miRNA mimic (NC mimic, the guide strand and passenger strand -sequences are set forth in SEQ ID NO: 36 and 37, respectively) or miR-122-5p mimic (the guide strand and passenger strand sequences are set forth in SEQ ID NO: 26 and 27, respectively) using lipofectamine 3000. The miRNA mimic concentrations were set to five gradients of 0.1 pM, 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM in Table 1-3, Table 1-4 and Table 1-6, and set to one gradient of 1 nM in Table 1-5, Table 1-7, Table 1-8, Table 1-9 and Table 1-10. In Table 1-5, the cells were transfected with 100 ng circular RNA, 100 ng FLuc-mRNA reference and NC mimic or miR-122-5p mimic using lipofectamine 3000. The ratio (NLuc / FLuc, termed as relative NLuc expression level) in Table 1-5 was computed for the NLuc measurements from each individual sample. The miRNA mimic concentration was set to one gradient of 1 nM. In Table 1-14, Table 1-15 and Table 1-16, the cells were transfected with 100 ng circular RNA only (control) or 100 ng linear RNA only (control) , 100 ng circular RNA or 100 ng linear RNA and NC mimic or miR-122-5p mimics using lipofectamine 3000. The guide strand and passenger strand sequences of NC mimic are set forth in SEQ ID NO: 36 and 37, respectively. The guide strand and passenger strand sequences of miR-122-5p mimic are set forth in SEQ ID NO: 26 and 27, respectively. The guide strand and passenger strand sequences of mutated miR-122-5p mimics (miR-122-5p p1 mimic, miR-122-5p p2 mimic, miR-122-5p p3 mimic, miR-122-5p p4 mimic, miR-122-5p p5 mimic, miR-122-5p p6 mimic, miR-122-5p p7 mimic, miR-122-5p p8 mimic, miR-122-5p p9-p10 mimic, miR-122-5p p11-p13 mimic, miR-122-5p p14 mimic, miR-122-5p p15 mimic, miR-122-5p p16 mimic, miR-122-5p p15-p16 mimic, miR-122-5p p17-p22 mimic) are set forth in SEQ ID NO: 38 and 39, 40 and 41, 42 and 43, 44 and 45, 46 and 47, 48 and 49, 50 and 51, 52 and 53, 54 and 55, 56 and 57, 58 and 59, 60 and 61, 62 and 63, 64 and 65, 66 and 67, respectively. The miRNA mimic concentration was set to one gradient of 1 nM. After 24h of transfection, the FLuc or NLuc expression level was detected respectively. 11. Luciferase assay in cells

[0355] For the detection of firfly luciferase (FLuc) or nano-luciferase (NLuc) expression level, an equal volume of substrate (ONE-GloTM luciferase assay substrate for FLuc or  luciferase assay for NLuc; Promega) was added to the culture medium in each well at least 5 minutes prior to quantifying luminescence by the SpectraMax iD3. Mix for optimal consistency. The blank (cell only) was also detected. All experiments were performed in triplicate to calculate averages. 12. Preparation of circular RNA-LNP

[0356] Briefly, a cationic lipid (Compound C1) , DSPC, cholesterol, and PEG-lipid were solubilized in ethanol at a molar ratio of 50: 10: 38.5: 1.5, and circular RNAs were diluted in 10 to 50 mM citrate buffer, pH = 4. The LNPs were prepared at a total lipid to RNA weight ratio of approximately 10: 1 to 30: 1 by mixing the ethanolic lipid solution with the aqueous RNA solution at a volume ratio of 1: 3 using a microfluidic apparatus, total flow rate ranging from 9-30mL / min. Ethanol was thereby removed and replaced by DPBS using dialysis. Finally, the lipid nanoparticles were filtered through a 0.2 μm sterile filter.

[0357] The Compound C1 has the following Formula:

[0358] Lipid nanoparticle size was determined by dynamic light scattering using a Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern UK) using a 173° backscatter detection mode. The encapsulation efficiency of lipid nanoparticles was determined using a Quant-it Ribogreen RNA quantification assay kit (Thermo Fisher Scientific, UK) according to the manufacturer’s instructions.

[0359] The apparent pKa of LNP formulations correlates with the delivery efficiency of LNPs for nucleic acids in vivo. The apparent pKa of each formulation was determined using an assay based on fluorescence of 2- (p-toluidino) -6-napthalene sulfonic acid (TNS) . LNP formulations comprising of cationic lipid  / DSPC / cholesterol  / DMG-PEG (50  / 10  / 38.5 / 1.5 mol %) in PBS were prepared as described above. TNS was prepared as a 300uM stock solution in distilled water. LNP formulations were diluted to 0.1mg / ml total lipid in 3 mL of buffered solutions containing 50 mM sodium citrate, 50 mM sodium phosphate, 50 mM sodium borate, and 30mM sodium chloride where the pH ranged from 3 to 9. An aliquot of the TNS solution was added to give a final concentration of 0.1mg / ml and following vortex mixing fluorescence intensity was measured at room temperature in a Molecular Devices Spectramax iD3 spectrometer using excitation and emission wavelengths of 325 nm and 435 nm. A sigmoidal best fit analysis was applied to the fluorescence data and the pKa value was measured as the pH giving rise to half –maximal fluorescent intensity. 13. Luciferase assay in mice

[0360] Female BALB / c mice (8-month-old) were purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing, China) . Fifteen mice were randomly divided into three groups (n = 5 / group) . Circular RNA-LNP was i. v. administrated at 10 mg into mice. PBS (200 μL) was also i. v. administrated into mice as a negative control. Mice were then anesthetized for the whole-body, liver and spleen bioluminescence imaging at 6 h post-injection time point. Results:

[0361] Table 1-3: The NLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-122-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-122-5p mimic in Huh7 cells. The expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected miR-122-5p mimic, indicating that miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0362] Table 1-4: The NLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-122-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-122-5p mimic but not by the NC mimic in HEK293T cells. The expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected miR-122-5p mimic, indicating miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0363] Table 1-5: The NLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-122-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-122-5p mimic but not by the NC mimic in A549 cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0364] Table 1-6: The NLuc expression of the circular RNA with two point mutations (C27G and C42G) in the miR-122-5p binding sites is not induced by the NC mimic or the miR-122-5p mimic in HEK293T cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0365] Table 1-7: The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-122-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-122-5p mimic in HEK293T cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0366] Table 1-8: The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-122-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-122-5p mimic in Huh7 cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0367] Table 1-9: The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-122-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-122-5p mimic in A549 cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0368] Table 1-10: The FLuc expression of the circular RNA with two point mutations (C27G and C42G) in the miR-122-5p binding sites is not induced by the NC mimic or the miR-122-5p mimic in HEK293T cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA with two native miR-122-5p binding sites only (control) .

[0369] miR-122 is highly specific to hepatocytes and is not expressed in HeLa or HEK293T cells (see e.g., Jopling, CL, Yi, M, Lancaster, AM, Lemon, SM, and Sarnow, P (2005) . Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific MicroRNA. Science 309: 1577-1581., and Tian, W, Dong, X, Liu, X, Wang, G, Dong, Z, Shen, W, et al. (2012) . High-throughput functional microRNAs profiling by recombinant AAV-based microRNA sensor arrays. PLoS One 7: e29551. ) .

[0370] Table 1-11 shows that circFLuc122-bs (the engineered circular RNA with two miR-122-5p binding sites) exhibited significantly higher luciferase expression levels compared to circFLuc122-bsm (the engineered circular RNA with two point mutations (C27G and C42G) in the miR-122-5p binding sites) in hepatocytes, with up to a 3-fold increase. However, the expression of circFLuc122-bsm was not lower than circFLuc122-bs in HeLa and HEK293T cells, confirming that endogenous miRNAs can be used to induce protein expression from synthetic circular RNAs in a cell-specific manner. Data were normalized to the expression level of the circular RNA with two native miR-122-5p binding sites.

[0371] Figure 4 shows the IVIS Spectrum images (6 h post-injection) of female BALB / c mice which were injected with 10 μg of the FLuc-encoding circular RNA-LNP by the intravenous route. Table 1-12 shows the statistical data of the relative light unit (RLU) in the mice, which indicates the Fluc expression of circular RNAs. Both demonstrate the expression of the engineered circular RNAs with two miR-122-5p binding sites is induced by the endogenous miR-122-5p in mice. Data were normalized to the expression level of the engineered circular RNA with two miR-122-5p binding sites.

[0372] Figure 5 shows the IVIS Spectrum images (6 h post-injection) of female BALB / c mice which were injected with 10 μg of the FLuc-encoding circular RNA-LNP by the intravenous route in the whole body, liver and spleen.

[0373] Table 1-13 shows the statistical data of the relative light unit (RLU) in the mice, which indicates the FLuc expression of circular RNAs. Circular RNAs with native miR-122 binding sites (circFLuc122-bs) exhibited significantly higher expression in the liver (5.8-fold increase) and whole body (5.3-fold increase) than those with mutated binding sites (circFLuc122-bsm) , while no significant difference in expression levels was observed between the two in the spleen, demonstrating the expression of the engineered circular RNAs with two miR-122-5p binding sites is induced by the endogenous miR-122-5p in mice. Data were normalized to the expression level of the engineered circular RNA with two miR-122-5p binding sites.

[0374] Table 1-14: The Fluc expression of the engineered circular RNAs with two miR-122-5p binding sites is regulated by the synthetic miR-122-5p mimic and mutated miR-122-5p mimics (miR-122-5p p1 mimic, miR-122-5p p2 mimic, miR-122-5p p3 mimic, miR-122-5p p4 mimic, miR-122-5p p5 mimic, miR-122-5p p6 mimic, miR-122-5p p7 mimic, miR-122-5p p8 mimic, miR-122-5p p9-p10 mimic, miR-122-5p p11-p13 mimic, miR-122-5p p14 mimic, miR-122-5p p15 mimic, miR-122-5p p16 mimic, miR-122-5p p15-p16 mimic, miR-122-5p p17-p22 mimic) in HEK293T cells. The FLuc expression of the engineered circular RNAs induced by the mutated miR-122-5p mimics harboring mutations in the seed regions (i.e. GGAGUG) is lower than that of the engineered circular RNAs induced by the unmutated miR-122-5p mimic and mutated miR-122-5p mimics harboring mutations outside the seed regions. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0375] Table 1-15: The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-122-5p binding sites is regulated by the synthetic miR-122-5p mimic and mutated miR-122-5p mimics in Huh7 cells. The FLuc expression of the engineered circular RNAs induced by the mutated miR-122-5p mimics harboring mutations in the seed regions (i.e. GGAGUG) is lower than that of the engineered circular RNAs induced by the unmutated miR-122-5p mimic and mutated miR-122-5p mimics harboring mutations outside the seed regions. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0376] Table 1-16: In HEK293T cells, the corresponding synthetic miR-122-5p mimic induces the FLuc expression of the engineered linear RNA with two miR-122-5p binding sites and circular RNAs with two miR-122-5p binding sites. The FLuc expression of the engineered circular RNAs induced by the miR-122-5p mimic is higher than that of the engineered linear RNA. Data were normalized to the expression level of the linear RNA only (control) .

[0377] Summary-1: Endogenous miR-122-5p in mice liver and synthetic miR-122-5p mimic both significantly upregulate the expression level of circular RNAs harboring two miR-122-5p binding sites.

[0378] The NLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-122-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-122-5p mimic but not by the NC mimic in HEK293T cells, Huh7 cells and A549 cells. Additionally, the expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected miR-122-5p mimic, indicating the miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. Once two mutations (C27G and C42G) occur in the miR-122 binding sites of the circular RNA, the NLuc expression of the circular RNA is not induced by the miR-122-5p mimic in HEK293T cells. Also, the FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-122-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-122-5p mimic but not by the NC mimic in HEK293T, Huh7 and A549 cells. The FLuc expression of the circular RNA with two mutations (C27G and C42G) in the miR-122-5p binding sites is not induced by the miR-122-5p mimic in HEK293T cells. It can be seen that the miR-122-5p binding sites display Watson-Crick base pair complementarity to miR-122-5p seed region (2-7 nt; p2-p7) , which is necessary for regulation. Example 2: Up-regulation of circular RNA expression with miR-155-5p

[0379] This Example designs and prepares circular RNA harboring miR-155-5p binding sites, and verifies the regulation of circular RNA expression with miR-155-5p. Methods: 1. The design of circular RNA sequences

[0380] To design circular RNAs with miR-155-5p binding sites, the HCV 5'UTR with two native miR-122-5p binding sites S1 and S2 in domain I was replaced by the modified HCV 5'UTR comprising two miR-155-5p binding sites. The resulting sequence was inserted into the circular RNA backbone (PIE circularization system) , as an artificial IRES, which was followed by ORF sequences encoding nano-luciferase (NLuc) .

[0381] Specifically, the modified HCV 5’UTR nucleotides 22 to 28 (AGCAUUA) and 37 to 44 (AGCAUUAA) display Watson-Crick base pair complementarity to the seed sequence in the 5’ end of miR-155-5p which encompasses nucleotides 2-8 (UAAUGCU) (see FIG. 1B) . For the design of the circular RNA with mutated miR-155-5p binding sites, the nucleotides (A28 and A43) complementary to the seed nucleotide in position 2 (U) of miR-155-5p were mutated to other nucleotides (A28C and A43C; AGCAUUC and AGCAUUCA) , such that the mutation sites are not predicted to bind seed region (UAAUGCU) in mature miR-155-5p molecules. 2. Preparation of DNA templates and circular RNA

[0382] The DNA templates and circular RNAs were prepared as described in Example 1. For example, for the generation of plasmid DNA, a synthesized DNA fragment harboring HCV 5’UTR with two miR-155-5p binding sites was assembled into a double-digested plasmid backbone by a homologous recombinational cloning strategy. These products were transformed into the Stable Competent E. coli (New England Biolabs) . Plasmid DNA was extracted from the E. coli transformants and confirmed by DNA sequencing. Table 2-1 provides specific information about the resulting circular RNAs.

[0383] Table 2-1: Circular RNAs encoding NLuc 3. Cells culture and circular RNAs transfection

[0384] HEK293T, Huh7 and A549 cells were seeded in 96-well flat-bottomed plates at a density of 2×104 cells / well for 24 hours. The cells were transfected with 100 ng circular RNA only (control) , 100 ng circular RNA and negative control miRNA mimic (NC mimic, the guide strand and passenger strand sequences are set forth in SEQ ID NO: 36 and 37, respectively) or miR-155-5p mimic (the guide strand and passenger strand sequences are set forth in SEQ ID NO: 28 and 29, respectively) using lipofectamine 3000. The miRNA mimic concentrations were set to five gradients of 0.1 pM, 1 pM, 10 pM, 100 pM and 1nM in Table 2-2 and Table 2-5, and set to one gradient of 1 nM in Tabled 2-3 and Table 2-4. In Table 2-4, the cells were transfected with 100 ng circular RNA, 100 ng FLuc-mRNA reference and NC mimic or miR-155-5p mimic using lipofectamine 3000. The ratio (NLuc / FLuc, termed as relative NLuc expression level) in Table 2-4 was computed for the NLuc measurements from each individual sample. The miRNA mimic concentration was set to one gradient of 1 nM. After 24h of transfection, the NLuc expression level was detected.

[0385] CD14+ monocytes were purchased from (Schbio Biotechology) and preserved in liquid nitrogen before use. Monocyte were seeded 1×105 cells / well in 96 well plate and cultured in 1640 medium with 10%FBS and 50 ng / mL GM-CSF (Kactus Biosystems) for macrophage differentiation for 6 days. Culture medium was changed every two days, and one day before transfection, GM-CSF containing medium was replaced by normal 1640 with 10%FBS. Circular RNAs were transfected by lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) at 100 ng / well. After 24h of transfection, luciferase activity was measured by  Luciferase Assay System (Promoge) in Table 2-6. 4. Luciferase assay in cells

[0386] The luciferase assays in cells were performed as described in Example 1. 5. Preparation of circular RNA-LNP

[0387] The circular RNA-LNP formulation was prepared as described in Example 1. Results:

[0388] Table 2-2: The NLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-155-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-155-5p mimic in HEK293T cells. The expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected miR-155-5p mimic, indicating that the miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0389] Table 2-3: The NLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-155-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-155-5p mimic in Huh7 cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0390] Table 2-4: The NLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-155-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-155-5p mimic in A549 cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0391] Table 2-5: The NLuc expression of the circular RNA with two point mutations (A28C and A43C) in the miR-155-5p binding sites is not induced by the NC mimic or the miR-155-5p mimic in HEK293T cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0392] Table 2-6: The circular RNA with miR-155-5p binding sites is highly expressed in microphage. Data were normalized to the expression level of the circular RNA harboring two mutated miR-155-5p binding sites.

[0393] Summary-2: Endogenous miR-155-5p in macrophage and synthetic miR-155-5p mimic both significantly upregulate the expression level of the circular RNA harboring two miR-155-5p binding sites.

[0394] The NLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-155-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-155-5p mimic but not by the NC mimic in HEK293T cells, Huh7 cells and A549 cells. Additionally, the expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected miR-155-5p mimic, indicating the miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. Once two mutations (A28C and A43C) occur in the miR-155-5p binding sites of the circular RNA, the NLuc expression of the circular RNA is not induced by the miR-155-5p mimic in HEK293T cells. It is reported that hsa-miR-155-5p is highly expressed in macrophages, which was detected by RNA-seq (Essandoh K, Li Y, Huo J, Fan GC. MiRNA-Mediated Macrophage Polarization and its Potential Role in the Regulation of Inflammatory Response. Shock. 2016 Aug; 46 (2) : 122-31. ) . We also find that the circular RNA containing the miR-155-5p binding sites expresses at a 7.4-fold higher level in microphages when compared to the circular RNA with point mutations, which is in line with previous reports. In the HEK293T cells and Huh7 cells, there is no significant difference between their expression level. Example 3: Up-regulation of circular RNA expression with let-7a-5p

[0395] This Example designs and prepares circular RNA harboring let-7a-5p binding sites, and verifies the regulation of circular RNA expression with let-7a-5p. Methods: 1. The design of circular RNA sequences

[0396] To design circular RNAs with let-7a-5p binding sites, the HCV 5'UTR with two native miR-122-5p binding sites S1 and S2 in domain I of HCV 5'UTR was replaced by the modified HCV 5'UTR comprising two let-7a-5p binding sites. The resulting sequence was inserted into the circular RNA backbone (Cis circularization system 1, abbreviated as Cis system-1) , as an artificial IRES, which was followed by ORF sequences encoding firfly-luciferase (FLuc) . The schematic diagram of precursor and circular RNA in the Cis circularization system used in the experiments is shown in FIG. 6.

[0397] Specifically, the modified HCV 5’UTR nucleotides 22 to 28 (CUACCUC) and 38 to 45 (CUACCUCA) display Watson-Crick base pair complementarity to the seed sequence in the 5’ end of let-7a-5p which encompasses nucleotides 2-8 (GAGGUAG) (see FIG. 1C) . For the design of the circular RNA harboring mutated let-7a-5p binding sites, the nucleotides (U27 and U43) complementary to the seed nucleotide in positions 3 (A) of let-7a-5p were mutated to their complements (U27A and U43A; CUACCAC and CUACCACA) , such that the mutation sites are not predicted to bind the seed region (GAGGUAG) in mature let-7a-5p molecules. 2. Preparation of DNA templates and circular RNA

[0398] The DNA templates and circular RNAs were prepared as described in Example 1. Table 3-1 provides specific information about the resulting circular RNAs.

[0399] Table 3-1: Circular RNAs encoding FLuc 3. Cells culture and circular RNAs transfection

[0400] HEK293T and Huh7 cells were seeded in 96-well flat-bottomed plates at a density of 2×104 cells / well for 24 hours. The cells were transfected with 100 ng circular RNA only (control) , 100 ng circular RNA and let7a-5p mimic (the guide strand and passenger strand sequences are set forth in SEQ ID NO: 30 and 31, respectively) using lipofectamine 3000. The miRNA mimic concentrations were set to two gradients of 100 pM and 1 nM in Table 3-2 and Table 3-3. In Table 3-4 and Table 3-5, the cells were transfected with 100 ng circular RNA only (control) 100 ng circular RNA and NC mimic or let7a-5p mimics using lipofectamine 3000. The guide strand and passenger strand sequences of NC mimic are set forth in SEQ ID NO: 36 and 37, respectively. The guide strand and passenger strand sequences of miR-122-5p mimic are set forth in SEQ ID NO: 26 and 27, respectively. The guide strand and passenger strand sequences of mutated let7a-5p mimics (let7a-5p p1 mimic, let7a-5p p2 mimic, let7a-5p p3 mimic, let7a-5p p4 mimic, let7a-5p p5 mimic, let7a-5p p6 mimic, let7a-5p p7 mimic, let7a-5p p8 mimic, let7a-5p p9-p10 mimic, let7a-5p p11-p13 mimic, let7a-5p p14 mimic, let7a-5p p15 mimic, let7a-5p p16 mimic, let7a-5p p15-p16 mimic, let7a-5p p17-p22 mimic) are set forth in SEQ ID NO: 68 and 69, 70 and 71, 72 and 73, 74 and 75, 76 and 77, 78 and 79, 80 and 81, 82 and 83, 84 and 85, 86 and 87, 88 and 89, 90 and 91, 92 and 93, 94 and 95, 96 and 97, respectively. The miRNA mimic concentration was set to one gradient of 1 nM. After 24 h of transfection, the FLuc expression level was detected. 4. Luciferase assay in cells

[0401] The luciferase assays in cells were performed as described in Example 1. 5. Preparation of circular RNA-LNP

[0402] The circular RNA-LNP formulation was prepared as described in Example 1. Results:

[0403] Table 3-2: The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two let-7a-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic let-7a-5p mimic in HEK293T cells. The expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected let-7a-5p mimic, indicating that miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. The FLuc expression of the circular RNA with two point mutations (U27A and U43A) in the let-7a-5p binding sites is not induced by the let-7a-5p mimic in HEK293T cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0404] Table 3-3: The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two let-7a-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic let-7a-5p mimic in Huh7 cells. The expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected let-7a-5p mimic, indicating that miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. The FLuc expression of the circular RNA with two point mutations (U27A and U43A) in the let-7a-5p binding sites is not induced by the let-7a-5p mimic in Huh7 cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0405] Table 3-4: The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two let-7a-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic let-7a-5p mimic but not by the NC mimic in HEK293T cells. The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two let-7a-5p binding sites is regulated by the synthetic let-7a-5p mimic and mutated let-7a-5p mimics in HEK293T cells. The FLuc expression of the engineered circular RNAs induced by the mutated let-7a-5p mimics harboring mutations in the seed regions (i.e. GAGGUAG) is lower than that of the engineered circular RNAs induced by the unmutated let-7a-5p mimic and mutated let-7a-5p mimics harboring mutations outside the seed regions. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0406] Table 3-5: The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two let-7a-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic let-7a-5p mimic but not by the NC mimic in Huh7 cells. The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two let-7a-5p binding sites is regulated by the synthetic let-7a-5p mimic and mutated let-7a-5p mimics in Huh7 cells. The FLuc expression of the engineered circular RNAs induced by the mutated let-7a-5p mimics harboring mutations in the seed regions (i.e. GAGGUAG) is lower than that of the engineered circular RNAs induced by the unmutated let-7a-5p mimic and mutated let-7a-5p mimics harboring mutations outside the seed regions. Data were normalized to the expression level of the circular RNA only (control) .

[0407] Summary-3: Synthetic let-7a-5p mimic significantly upregulates the expression level of the circular RNA harboring two let-7a-5p binding sites in HEK293T and Huh7 cell.

[0408] The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two let-7a-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic let-7a-5p mimic but not by the NC mimic in HEK293T cells and Huh7 cells. Additionally, the expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected let-7a mimic, indicating the miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. Once two mutations (U27A and U43A) occur in the let-7a-5p binding sites of the circular RNA, the FLuc expression of the circular RNA is not induced by the let-7a-5p mimic in HEK293T cells and Huh7 cells. It can be seen that let-7a-5p binding sites display Watson-Crick base pair complementarity to let-7a-5p seed region (2-8 nt; p2-p8) , which is necessary for regulation. Example 4: Up-regulation of circular RNA expression with miR-20a-5p Methods: 1. The design of circular RNA sequences

[0409] To design circular RNAs with miR-20a-5p binding sites, the HCV 5’UTR with two native miR-122-5p binding sites S1 and S2 in domain I of HCV 5’UTR was replaced by the modified HCV 5’UTR comprising two miR-20a-5p binding sites. The resulting sequence was inserted into the circular RNA backbone (Cis circularization system 1, abbreviated as Cis system-1) , as an artificial IRES, which was followed by ORF sequences encoding firfly-luciferase (FLuc) .

[0410] Specifically, the modified HCV 5’UTR nucleotides 22 to 28 (GCACUUU) and 38 to 45 (GCACUUUA) display Watson-Crick base pair complementarity to the seed sequence in the 5’ end of miR-20a-5p which encompasses nucleotides 2-8 (AAAGUGC) (see FIG. 1D) . For the design of the circular RNA harboring mutated miR-20a-5p binding sites, the nucleotides (U27 and U43) complementary to the seed nucleotide in positions 3 (A) of miR-20a-5p were mutated to their complements (U27A and U43A; GCACUAU and GCACUAUA) , such that the mutation sites are not predicted to bind the seed region (AAAGUGC) in mature miR-20a-5p molecules. 2. Preparation of DNA templates and circular RNA

[0411] The DNA templates and circular RNAs were prepared as described in Example 1. Table 4-1 provides specific information about the resulting circular RNAs.

[0412] Table 4-1: Circular RNA encoding FLuc 3. Cells culture and circular RNAs transfection

[0413] HEK293T and Huh7 cells were seeded in 96-well flat-bottomed plates at a density of 2×104 cells / well for 24 hours. The cells were transfected with 100 ng circular RNA only (control) , 100 ng circular RNA and miR-20a-5p mimic (the guide strand and passenger strand sequences are set forth in SEQ ID NO: 34 and 35, respectively) or the miR-20a antagomir using lipofectamine 3000. The miRNA mimic concentrations were set to two gradients of 100 pM and 1nM in Table 4-2 and Table 4-3. The concentration of the antagomir (purchased from Beijing Tsingke Biotech Co., Ltd. ) was set to three gradients of 0.1 nM, 1 nM and 10 nM in Table 4-4. After 24 h of transfection, the FLuc expression level was detected. 4. Luciferase assay in cells

[0414] The luciferase assays in cells were performed as described in Example 1. 5. Preparation of circular RNA-LNP

[0415] The circular RNA-LNP formulation was prepared as described in Example 1. Results:

[0416] Table 4-2: The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-20a-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-20a-5p mimic in HEK293T cells. The expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected miR-20a-5p mimic, indicating that miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. The FLuc expression of the circular RNA with two point mutations (U27A and U43A) in the miR-20a-5p binding sites is not induced by the miR-20a-5p mimic in HEK293T cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA with two miR-20a-5p binding sites only (control) .

[0417] Table 4-3: The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-20a-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-20a-5p mimic in Huh7 cells. The expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected miR-20a-5p mimic, indicating that miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. The FLuc expression of the circular RNA with two point mutations (U27A and U43A) in the miR-20a-5p binding sites is not induced by the miR-20a-5p mimic in Huh7 cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA with two miR-20a-5p binding sites only (control) .

[0418] Table 4-4: By adding miR-20a antagomir into HEK293T cells to block the activity of endogenous miR-20a, the circFLuc20a-bs expression was significantly inhibited in a dose-dependent manner; however, this was not observed in the circFLuc20a-bsm, which confirms the miR-20a-responsive circular RNA responds efficiently to endogenous miR-20a. Data were normalized to the expression level of the circular RNA with two miR-20a-5p binding sites only.

[0419] Summary-4: Endogenous miR-20a-5p in HEK293T and synthetic miR-20a-5p mimic both significantly upregulate the expression level of the circular RNA harboring two miR-20a-5p binding sites.

[0420] The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-20a-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-20a-5p mimic in HEK293T cells and Huh7 cells. Additionally, the expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected miR-20a-5p mimic, indicating the miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. Once two mutations (U27A and U43A) occur in the miR-20a-5p binding sites of the circular RNA, the FLuc expression of the circular RNA is not induced by the miR-20a-5p mimic in HEK293T cells and Huh7 cells. It is reported that miR-20a-5p is highly expressed in HEK293T cells, which was detected by the miRNA sensor array (Tian W, Dong X, Liu X, Wang G, Dong Z, Shen W, Zheng G, Lu J, Chen J, Wang Y, Wu Z, Wu X. High-throughput functional microRNAs profiling by recombinant AAV-based microRNA sensor arrays. PLoS One. 2012; 7 (1) : e29551. ) . We also find that the circular RNA with miR-20a-5p binding sites expresses at a 4.1-fold higher level in HEK293T cells when compared to the circular RNA with point mutations, which is in line with previous reports. Example 5: Up-regulation of circular RNA expression with miR-17-5p Methods 1. The design of circular RNA sequences

[0421] To design circular RNAs with miR-17-5p binding sites, the HCV 5'UTR with two native miR-122-5p binding sites S1 and S2 in domain I of HCV 5'UTR was replaced by the modified HCV 5'UTR comprising two miR-17-5p binding sites. The resulting sequence was inserted into the circular RNA backbone (Cis circularization system 1, abbreviated as Cis system-1) , as an artificial IRES, which was followed by ORF sequences encoding firfly-luciferase (FLuc) .

[0422] Specifically, the modified HCV 5’UTR nucleotides 22 to 28 (GCACUUU) and 38 to 45 (GCACUUUG) (see FIG. 1E) display Watson-Crick base pair complementarity to the seed sequence in the 5’ end of miR-17-5p which encompasses nucleotides 2-8 (AAAGUGC) . For the design of the circular RNA harboring mutated miR-17-5p binding sites, the nucleotides (U27 and U43) complementary to the seed nucleotide in positions 3 (A) of miR-17-5p were mutated to their complements (U27A and U43A; GCACUAU and GCACUAUG) , such that the mutation sites are not predicted to bind the seed region (AAAGUGC) in mature miR-17-5p molecules. 2. Preparation of DNA templates and circular RNA

[0423] The DNA templates and circular RNAs were prepared as described in Example 1. Table 5-1 provides specific information about the resulting circular RNAs.

[0424] Table 5-1: Circular RNA encoding FLuc 3. Cells culture and circular RNAs transfection

[0425] HEK293T and Huh7 cells were seeded in 96-well flat-bottomed plates at a density of 2×104 cells / well for 24 hours. The cells were transfected with 100 ng circular RNA only (control) , 100 ng circular RNA and miR-17-5p mimic (the guide strand and passenger strand sequences are set forth in SEQ ID NO: 32 and 33, respectively) or the miR-17 antagomir using lipofectamine 3000. The miRNA mimic concentrations were set to two gradients of 100 pM and 1nM in Table 5-2 and Table 5-3. The concentration of the antagomir (purchased from Beijing Tsingke Biotech Co., Ltd. ) was set to three gradients of 1 nM, 10 nM and 20 nM in Table 5-4. After 24 h of transfection, the FLuc expression level was detected. 4. Luciferase assay in cells

[0426] The luciferase assays in cells were performed as described in Example 1. 5. Preparation of circular RNA-LNP

[0427] The circular RNA-LNP formulation was prepared as described in Example 1. Results:

[0428] Table 5-2: The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-17-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-17-5p mimic in HEK293T cells. The expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected miR-17-5p mimic, indicating that miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. The FLuc expression of the circular RNA with two point mutations (U27A and U43A) in the miR-17-5p binding sites is not induced by the miR-17-5p mimic in HEK293T cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA with two miR-17-5p binding sites only (control) .

[0429] Table 5-3: The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-17-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-17-5p mimic in Huh7 cells. The expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected miR-17-5p mimic, indicating that miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. The FLuc expression of the circular RNA with two point mutations (U27A and U43A) in the miR-17-5p binding sites is not induced by the miR-17-5p mimic in Huh7 cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA with two miR-17-5p binding sites only (control) .

[0430] Table 5-4: By adding miR-17 antagomir into HEK293T cells to block the activity of endogenous miR-17, the circFLuc17-bs expression was significantly inhibited in a dose-dependent manner; however, this was not observed in the circFLuc17-bsm, which confirms the miR-17-responsive circular RNA responds efficiently to endogenous miR-17. Data were normalized to the expression level of the circular RNA with two miR-17-5p binding sites only.

[0431] Summary-5: Endogenous miR-17-5p in HEK293T and synthetic miR-17-5p mimic both significantly upregulate the circular RNA expression harboring two miR-17-5p binding sites.

[0432] The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-17-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-17 mimic in HEK293T cells and Huh7 cells. Additionally, the expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected miR-17-5p mimic, indicating the miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. Once two mutations (U27A and U43A) occur in the miR-17-5p binding sites of the circular RNA, the FLuc expression of the circular RNA is not induced by the miR-17-5p mimic in HEK293T cells and Huh7 cells. It is reported that miR-17-5p is highly expressed in HEK293T cells, which was detected by the miRNA sensor array (Tian W, Dong X, Liu X, Wang G, Dong Z, Shen W, Zheng G, Lu J, Chen J, Wang Y, Wu Z, Wu X. High-throughput functional microRNAs profiling by recombinant AAV-based microRNA sensor arrays. PLoS One. 2012; 7 (1) : e29551. ) . We also find that the circular RNA with miR-17-5p binding sites expresses at a 22-fold higher level in HEK293T cells when compared to the circular RNA with point mutations, which is in line with previous reports. Example 6: Up-regulation of circular RNA expression with miR-142-3p Methods 1. The design of circular RNA sequences

[0433] To design circular RNAs with miR-142-3p binding sites, the HCV 5'UTR with two native miR-122-5p binding sites S1 and S2 in domain I of HCV 5'UTR was replaced by the modified HCV 5'UTR comprising two miR-142-3p binding sites. The resulting sequence was inserted into the circular RNA backbone (Cis circularization system 2, abbreviated as Cis system-2) , as an artificial IRES, which was followed by ORF sequences encoding firfly-luciferase (FLuc) . The schematic diagram of precursor and circular RNA in the Cis circularization system used in the experiments is shown in FIG. 7.

[0434] Specifically, the modified HCV 5’UTR nucleotides 22 to 28 (ACACUAC) and 38 to 45 (ACACUACA) (see FIG. 1F) display Watson-Crick base pair complementarity to the seed sequence in the 5’ end of miR-142-3p which encompasses nucleotides 2-8 (GUAGUGU) . For the design of the circular RNA harboring mutated miR-142-3p binding sites, the nucleotides (A27 and A43) complementary to the seed nucleotide in positions 3 (U) of miR-142-3p were mutated to their complements (A27U and A43U; ACACUUC and ACACUUCA) , such that the mutation sites are not predicted to bind the seed region (GUAGUGU) in mature miR-142-3p molecules. 2. Preparation of DNA templates and circular RNA

[0435] The DNA templates and circular RNAs were prepared as described in Example 1. Table 6-1 provides specific information about the resulting circular RNAs.

[0436] Table 6-1: Circular RNA encoding FLuc 3. Cells culture and circular RNAs transfection

[0437] HEK293T cells were seeded in 96-well flat-bottomed plates at a density of 2×104 cells / well for 24 hours. The cells were transfected with 100 ng circular RNA only (control) , 100 ng circular RNA and miR-142-3p mimic (the guide strand and passenger strand sequences are set forth in SEQ ID NO: 167 and 168, respectively) using lipofectamine 3000. The miRNA mimic concentrations were set to two gradients of 100 pM and 1 nM in Table 6-2. The miRNA mimic concentrations were set to one gradient of 1 nM in Table 6-3. After 24 h of transfection, the FLuc expression level was detected. 4. Luciferase assay in cells

[0438] The luciferase assays in cells were performed as described in Example 1. 5. Preparation of circular RNA-LNP

[0439] The circular RNA-LNP formulation was prepared as described in Example 1. 6. Luciferase assay in mice

[0440] Female BALB / c mice, aged 8 months, were purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing, China) . For the circFLuc142-bs-LNP and circFLuc142-bsm-LNP injection, a total of fifteen mice were randomly allocated into five groups (n=3) . Each mouse received an intravenous (i. v. ) administration of 10 μg or 20 μg circular RNA-LNP. For the control group, 200 μL of PBS was administered as a negative control. The mice were then anesthetized for the whole-body, liver and spleen bioluminescence imaging conducted 6 hours after the injection. Results:

[0441] Table 6-2: The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-142-3p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-142-3p mimic in HEK293T cells. The expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected miR-142-3p mimic, indicating that miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. The FLuc expression of the circular RNA with two point mutations (A27U and A43U) in the miR-142-3p binding sites is not induced by the miR-142-3p mimic in HEK293T cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA with two miR-142-3p binding sites only (control) .

[0442] Table 6-3: The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-142-3p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-142-3p mimic in Huh7 cells. The FLuc expression of the circular RNA with two point mutations (A27U and A43U) in the miR-142-3p binding sites is not induced by the miR-142-3p mimic in Huh7 cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA with two miR-142-3p binding sites only (control) .

[0443] Figure 9 shows IVIS Spectrum images (6 h post-injection) of female BALB / c mice that received an i. v. injection of 10 μg or 20 mg of FLuc-encoding circular RNA-LNP, which demonstrates increased spleen expression of the circular RNA containing miR-142 binding sites (circFLuc142-bs) compared to the circular RNA with mutated binding sites (circFLuc142-bsm) .

[0444] Summary-6: Exogenous and endogenous miR-142-3p mimic both significantly upregulate the circular RNA expression harboring two miR-142a-3p binding sites.

[0445] The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-142-3p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-142-3p mimic in HEK293T and Huh7 cells. Additionally, the expression level of the circular RNA increases by the amount of the transfected miR-142-3p mimic, indicating the miRNA induces circular RNA expression in a dose-dependent manner. Once two mutations (A27U and A43U) occur in the miR-142-3p binding sites of the circular RNA, the FLuc expression of the circular RNA is not induced by the miR-142-3p mimic in HEK293T and Huh7 cells. Moreover, the circFLuc142-bs exhibited significantly higher expression (2.3-to 2.5-fold increase) in the spleen compared to circFLuc142-bsm after a single dose of 10 μg or 20 μg, while no significant difference in expression levels was observed between the two in the whole body and liver. Example 7: Regulation of circular RNA expression with miR-122-5p Methods 1. The design of circular RNA sequences

[0446] For the design of circular RNAs harboring miR-122-5p binding site, HCV 5’UTR with two miR-122-5p binding sites was inserted into the circular RNA backbone (based on the Cis circularization system 2, abbreviated as Cis system-2) , as an IRES, which was followed by ORF sequences encoding firefly luciferase (FLuc) , respectively. The schematic diagram of precursor and circular RNA in the Cis circularization system used in the experiments is shown in FIG. 7.

[0447] Specifically, HCV 5’UTR nucleotides 22 to 28 (ACACUCC) and 38 to 43 (CACUCC) display Watson-Crick base pair complementarity to the seed sequence in the 5’ end of miR-122-5p which encompasses nucleotides 2-7 and / or 2-8 (GGAGUG and / or GGAGUGU) (see FIG. 1A) .

[0448] For the design of the circular RNA harboring one mutated miR-122-5p binding site (s1c3, circFLuc122-bsm-s1c3) , the nucleotide (C27) complementary to the seed nucleotide in position 3 (G) of miR122 was mutated to its complement (C27G; ACACUGC) , such that the mutation site is not predicted to bind the seed region (GGAGUG) in mature miR-122-5p molecules.

[0449] For the design of the circular RNA harboring one mutated miR-122-5p binding site (s2c3, circFLuc122-bsm-s2c3) , the nucleotide (C42) complementary to the seed nucleotide in position 3 (G) of miR122 was mutated to their complement (C42G; CACUGC) , such that the mutation site is not predicted to bind the seed region (GGAGUGU) in mature miR-122-5p molecules.

[0450] For the design of the circular RNA harboring two mutated miR-122-5p binding sites (circFLuc122-bsm) , the nucleotides (C27 and C42) complementary to the seed nucleotide in position 3 (G) of miR122 were mutated to their complements (C27G and C42G; ACACUGC and CACUGC) , such that the mutation sites are not predicted to bind the seed region (GGAGUG and / or GGAGUGU) in mature miR-122-5p molecules.

[0451] For the design of the circular RNA harboring one mutated miR-122-5p binding site s1c15-16 (circFLuc122-bsm-s1c15-16) , the nucleotides (C2, C3) complementary to the nucleotide in position 15 (G) 16 (G) of miR122 were mutated to their complements (C2G, C3G) , such that the mutation sites are not predicted to bind the nucleotide in position 15 (G) and 16 (G) in mature miR-122-5p molecules.

[0452] For the design of the circular RNA harboring one mutated miR-122-5p binding site s2c15-16 (circFLuc122-bsm-s2c15-16) , the nucleotides (C30, C31) complementary to the nucleotide in position 15 (G) and 16 (G) of miR122 were mutated to their complements (C30G and C31G) , such that the mutation sites are not predicted to bind the nucleotides in position 15 (G) and 16 (G) in mature miR-122-5p molecules.

[0453] For the design of the circular RNA harboring two mutated miR-122-5p binding sites (s1s2c15-16, circFLuc122-bsm-s1s2c15-16) , the nucleotides (C2, C3 and C30 and C31) complementary to the nucleotide in position 15 (G) and 16 (G) of miR122 were both mutated to their complements (C2G, C3G and C31G, C32G) , such that the mutation sites are not predicted to bind the nucleotide in position 15 (G) and 16 (G) in mature miR-122-5p molecules. 2. Preparation of DNA templates and circular RNA

[0454] The DNA templates and circular RNAs were prepared as described in Example 1. Table 7-1 provides specific information about the resulting circular RNAs.

[0455] Table 7-1: Circular RNA encoding FLuc 3. Cells culture and circular RNAs transfection

[0456] HEK293T and Huh7 cells were seeded in 96-well flat-bottomed plates at a density of 2×104 cells / well for 24 hours. The cells were transfected with 100 ng circular RNA only (control) , 100 ng circular RNA and miR-122-5p mimic (the guide strand and passenger strand sequences are set forth in SEQ ID NO: 26 and 27, respectively) using lipofectamine 3000. The miRNA mimic concentrations were set to one gradient of 1 nM in Table 7-2, Table 7-3, Table 7-4 and Table 7-5. After 24 h of transfection, the FLuc expression level was detected. 4. Luciferase assay in cells

[0457] The luciferase assays in cells were performed as described in Example 1. 5. Preparation of circular RNA-LNP

[0458] The circular RNA-LNP formulation was prepared as described in Example 1. Results:

[0459] Table 7-2: The FLuc expressions of the engineered circular RNA with two miR-122-5p binding sites and the engineered circular RNA with one-point mutation (C27G) at the S1 binding site are both induced by the corresponding synthetic miR-122-5p mimic but not by the NC mimic in HEK293T cells. The FLuc expressions of the circular RNA with two-point mutations (C27G and C42G) and the engineered circular RNA with one-point mutation in the S2 binding site (C42G) in the miR-122-5p binding sites are neither induced by the miR-122-5p mimic nor by the NC mimic in HEK293T cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA with two miR-122-5p binding sites only (control) .

[0460] Table 7-3: The FLuc expressions of the engineered circular RNA with two miR-122-5p binding sites and the engineered circular RNA with one-point mutation (C27G) at the S1 binding site are both induced by the corresponding synthetic miR-122-5p mimic but not by the NC mimic in Huh7 cells. The FLuc expressions of the circular RNA with two-point mutations (C27G and C42G) and the engineered circular RNA with one-point mutation in the S2 binding site (C42G) in the miR-122-5p binding sites are neither induced by the miR-122-5p mimic nor by the NC mimic in Huh7 cells. Data were normalized to the expression level of the circular RNA with two miR-122-5p binding sites only (control) .

[0461] Table 7-4: The FLuc expression of the circular RNA with one or two-point mutations at C2G, C3G or / and C30G, C31G in the HCV 5’UTR are induced by the miR-122-5p mimic but not by the NC mimic in HEK293T cells. Data were normalized to the expression level of circFLuc122-bsm-s1c15-16.

[0462] Table 7-5: The FLuc expression of the circular RNA with one or two-point mutations at C2G, C3G or / and C30G, C31G in the HCV 5’UTR are induced by the miR-122-5p mimic but not by the NC mimic in Huh7 cells. Data were normalized to the expression level of circFLuc122-bsm-s1c15-16.

[0463] Summary-7: Synthetic miR-122-5p mimic significantly upregulates the circular RNA expression harboring two miR-122a-5p binding sites.

[0464] The FLuc expression of the engineered circular RNAs with two miR-122-5p binding sites is induced by the corresponding synthetic miR-122-5p mimic in HEK293T and Huh7 cells. Once one mutation (C42G in S2) occurs in the miR-122-5p binding site S2 of the circular RNA, the FLuc expression of the circular RNA is not induced by the miR-122-5p mimic in HEK293T and Huh7 cells, which indicates that the S2 binding site complementary to the miRNA seed region is necessary for this regulation, other sites complementary to the miRNA contributes to this regulation. Example 8: miRNA binding alters the secondary structure of SLII in the natural and  modified HCV 5’UTR Methods 1. RNA structure prediction analysis

[0465] RNA structure predictions were done using two RNA prediction software. ‘RNAstructure’ is available online at https:  / / rna. urmc. rochester. edu / RNAstructureWeb / . Briefly, the RNA sequence was loaded into the RNAstructure web servers using the ‘Predict a Secondary Structure’ or ‘Predict a Bimolecular Secondary Structure’ mode. The mfold is available online at https:  / / www. unafold. org / . Dot-bracket files were generated using the RNA fold command in RNAstructure or mfold, and then VARNA was used to generate the folded RNA images from the dot-bracket files.

[0466] The HCV 5’UTR favors a non-canonical alternative SLII structure (SLIIalt) in the absence of miR-122. Interactions with miR-122 stimulate the formation of an SLII structure required for HCV IRES activity based on SHAPE analysis and computational predictions (Schult, P, Roth, H, Adams, RL, Mas, C, Imbert, L, Orlik, C, Ruggieri, A, Pyle, AM, and Lohmann, V (2018) . microRNA-122 amplifies hepatitis C virus translation by shaping the structure of the internal ribosomal entry site. Nat Commun 9: 2613; Amador-Canizares, Y, Panigrahi, M, Huys, A, Kunden, RD, Adams, HM, Schinold, MJ, and Wilson, JA (2018) . miR-122, small RNA annealing and sequence mutations alter the predicted structure of the Hepatitis C virus 5’ UTR RNA to stabilize and promote viral RNA accumulation. Nucleic Acids Res 46: 9776-9792; Chahal, J, Gebert, LFR, Gan, HH, Camacho, E, Gunsalus, KC, MacRae, IJ and Sagan, SM (2019) . miR-122 and Ago interactions with the HCV genome alter the structure of the viral 5’ terminus. Nucleic Acids Res 47: 5307-5324. ) , further promoting the assembly of the 80S ribosome and translation initiation. Structure prediction software was used to analyze the structure and energy of the natural HCV 5’UTR sequences, with a focus on the SLI and SLII region (1-118 nt, 1-119 nt, 1-120 nt, 1-121 nt or 1-122 nt) . RNAstructure predicted that HCV 5’UTR alone would favor the formation of a series of non-canonical SLIIalt structures over the functional SLII structure with a free energy (ΔG) of -35.3 kcal / mol in the absence of miR-122. In the presence of miR-122, however, it is predicted that the miRNA binding promotes the transition of certain SLIIalt structures to more stable canonical SLII structures (a ΔG of -63 kcal / mol) (See FIG. 10) . This result aligns with the previous studies showing that miR-122 binding induces a conformation switch to the functional SLII structure by SHAPE analysis. Similarly, secondary structure predictions were performed for the modified HCV 5’UTR harboring miR-155, miR-20a, let-7a, miR-142 or miR-17 binding sites using RNAstructure software. The predictions showed that non-canonical SLIIalt structures are still in favor in the absence of their corresponding miRNAs (ΔG is between -38.6 and -36.1 kcal / mol in the case of miR-155; and ΔG is between -42.4 and -38.2 kcal / mol in the case of miR-20a) . However, miRNA annealing promotes a transition to the functional SLII structure and improves its stability (ΔG is -60.1, -61.8, -66.5, -61.8, -52.1 kcal / mol, respectively) (See FIG. 10 and FIG. 11) . This indicates that the conformational shift of the SLII structure may also be the reason of the enhanced circular RNA expression with miR-155-5p, let-7a-5p, miR-20a-5p, miR-17-5p and miR-142-3p. Additionally, the similar results were obtained using mfold software for predicting SLI and SLII regions of 5’UTRs containing miR-122, miR-155, miR-142 and miR-20a binding sites, and they demonstrate that, among all the SLIIalt structures formed by SLI+SLII, there are also functional SLII structures (S3 / S7 / S4 / S3, shown in bold) , which are not optimal in terms of energy, thus they are rated relatively low, meaning they are relatively more difficult to form, and account for a smaller proportion (See FIG. 12) .

[0467] Summary-8: Binding of miRNAs lead to conformational change of the IRES, which in-turn results in up-regulation of downstream genes.

[0468] RNA secondary structure prediction suggests that SLIIalt is more likely to form in the absence of miRNA, while miRNA interactions promote the folding of the functional SLII, which might further promote the assembly of the 80S ribosome and translation initiation. Additionally, in silico RNA structure analysis reveals a large change in the lowest free energy upon miRNA annealing (-35.3 vs. -63 kcal / mol in the case of miR-122; -36.1 vs. -60.1 kcal / mol in the case of miR-155; -39.9 vs. -61.8 kcal / mol in the case of miR-20a; -36.6 vs. -66.5 kcal / mol in the case of miR-17) , which may stabilize the engineered circRNA by improving thermodynamic stability or preventing the cleavage of endonucleases. This could provide an alternative possibility for the miRNA-induced translational activation of circRNAs.Sequence Listing Exemplary Cyclization Precursor RNA and Linear RNA sequences

Claims

1.A circular RNA comprising a coding region encoding a polypeptide of interest (POI) , and an untranslated region operably linked to the coding region;wherein the untranslated region comprises one or more miRNA binding sites which display Watson-Crick complementarity to a seed region of one or more miRNAs.2.The circular RNA according to claim 1, wherein the untranslated region comprises an internal ribosome entry site (IRES) element which is operably linked to the coding region;preferably, the miRNA binding site comprises a primary miRNA binding site;more preferably, the miRNA binding site comprises a secondary miRNA binding site;more preferably, the one or more miRNA binding sites are located within the IRES element.3.The circular RNA according to claim 1 or 2, wherein the untranslated region comprising one or more miRNA binding sites enhances expression of the POI in a target cell or tissue;preferably, the IRES element comprising one or more miRNA binding sites enhances expression of the POI in a target cell or tissue.4.The circular RNA according to any one of claims 1-3, wherein the seed region contains the sequence of positions 2-8 or 2-7 in the 5’ end of a miRNA;preferably, the seed region contains the sequence of positions 2-8 in the 5’ end of a miRNA.5.The circular RNA according to any one of claims 1-4, wherein the untranslated region further displays Watson-Crick complementarity to nucleotides 14-17 or 14-16 of one or more miRNAs;preferably, the IRES element further displays Watson-Crick complementarity to nucleotides 14-17 or 14-16 of one or more miRNAs.6.The circular RNA according to any one of claims 1-5, wherein the untranslated region further displays Watson-Crick complementarity to nucleotide 1 of one or more miRNAs;preferably, the IRES element further displays Watson-Crick complementarity to nucleotide 1 of one or more miRNAs.7.The circular RNA according to any one of claims 1-6, wherein the untranslated region comprises one or two miRNA binding sites;preferably, wherein the one or two miRNA binding sites are located within the IRES element.8.The circular RNA according to any one of claims 1-3, wherein the miRNA is a mature miRNA,preferably, the miRNA is selected from the group consisting of miR-122-5p, miR-155-5p, let-7a-5p, miR-17-5p, miR-20a-5p and miR-142-3p.9.The circular RNA according to any one of claims 1-8, wherein the miRNA comprises the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25 or 127.10.The circular RNA according to claims 8 or 9, wherein the miRNA comprises a seed region comprising(a) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 98 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 99;(b) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 100;(c) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 101;(d) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 102; or(e) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 128.11.The circular RNA according to any one of claims 1-10,wherein the miRNA binding sites comprises a primary miRNA binding site;wherein the untranslated region comprises one or more primary miRNA binding sites which independently comprise:(a) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 143 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 144;(b) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 145 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 146;(c) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 147 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 148;(d) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 149 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 150;(e) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 151 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 152; or(f) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 153 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 154.12.The circular RNA according to claim 11, wherein the untranslated region comprises two primary miRNA binding sites which respectively comprise:(a) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 143 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 144;(b) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 145 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 146;(c) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 147 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 148;(d) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 149 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 150;(e) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 151 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 152; or(f) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 153 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 154.13.The circular RNA according to any one of claims 1-10,wherein the miRNA binding sites comprises a secondary miRNA binding site;wherein the untranslated region comprises one or more secondary miRNA binding sites which independently comprise:(a’) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 103 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 104;(b’) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 105 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 106;(c’) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 107 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 108;(d’) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 109 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 110;(e’) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 111 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 112; or(f’) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 129 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 130.14.The circular RNA according to claim 13, wherein the untranslated region comprises two secondary miRNA binding sites which respectively comprise:(a’) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 103 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 104;(b’) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 105 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 106;(c’) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 107 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 108;(d’) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 109 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 110;(e’) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 111 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 112; or(f’) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 129 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 130.15.The circular RNA according to any one of claims 1-7, the untranslated region comprises HCV 5’ UTR or the modified HCV 5’ UTR.16.The circular RNA according to claim 15, wherein the miR-122-5p binding site S1 in domain I of the modified HCV 5’ UTR comprises one or more point mutations.17.The circular RNA according to claim 15, the modified HCV 5’ UTR comprises the replacement of two native miR-122-5p binding sites S1 and S2 in domain I with two primary miRNA binding sites displaying Watson-Crick complementarity to a seed region of another mature miRNA;preferably, another mature miRNA is selected from the group consisting of miR-122-5p, miR-155-5p, let-7a-5p, miR-17-5p, miR-20a-5p and miR-142-3p.18.The circular RNA according to claim 15, the modified HCV 5’ UTR comprises the replacement of the native miR-122-5p binding site S2 in domain I with a primary miRNA binding site displaying Watson-Crick complementarity to a seed region of another mature miRNA and the replacement of the native miR-122-5p binding site S1 in domain I with a mutated primary miRNA binding site comprising one or more point mutations, thereby not displaying Watson-Crick complementarity to the said seed region;preferably, another mature miRNA is selected from the group consisting of miR-122-5p, miR-155-5p, let-7a-5p, miR-17-5p, miR-20a-5p and miR-142-3p.19.The circular RNA according to claim 1, wherein the untranslated region comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 123 or 133, or the nucleotide sequence having at least 85%identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 123 or 133.20.The circular RNA according to any one of claims 1-19, wherein the circular RNA further comprises one or more elements as follows: a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1 and exon2;preferably, the circular RNA is prepared by a PIE circularization system, and further comprises a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1 and exon2;preferably, the circular RNA is prepared by a Cis circularization system, and further comprises a 5’ spacer region.preferably, the circular RNA is prepared by a Cis circularization system, and further comprises a 5’ spacer region and a 3’ spacer region.21.The circular RNA according to any one of claims 1-20, wherein the POI is a polypeptide having an activity of disease prophylaxis or treatment;preferably, the disease is selected from the group consisting of infectious diseases, cancers, genetic disorders, cardiovascular diseases, autoimmune diseases and rare diseases.22.A cyclization precursor RNA, wherein the cyclization precursor RNA is circularized to form the circular RNA according to any one of claims 1-21.23.The cyclization precursor RNA according to claim 22, wherein the cyclization precursor RNA comprises a coding region and an untranslated region as defined in any one of claims 1-21;wherein the cyclization precursor RNA further comprises one or more elements as follows: a 5’ homologous arm, a 3' intron, exon2, a 5’ spacer region, a 3' spacer region, exon1, a 5' intron, a 3' homologous arm and an intact group I intron;preferably, the cyclization precursor RNA further comprises a 5’ homologous arm, a 3’ intron, exon2, a 5’ spacer region, a 3’ spacer region, exon1, a 5' intron and a 3’ homologous arm;preferably, the cyclization precursor RNA further comprises a 5’ homologous arm, an intact group I intron, a 5’ spacer region and a 3' homologous arm;preferably, the cyclization precursor RNA further comprises a 5’ homologous arm, an intact group I intron, a 5’ spacer region, a 3’ spacer region and a 3' homologous arm.24.A nucleic acid molecule, wherein the nucleic acid molecule is transcribed to form the cyclization precursor RNA according to claims 22 or 23.25.An expression vector, wherein the expression vector comprises the nucleic acid molecule according to claim 24.26.A host cell, wherein the host cell comprises the circular RNA according to any one of claims 1-21, the cyclization precursor RNA according to claims 22 or 23, the nucleic acid molecule according to claim 24 or the expression vector according to claim 25.27.A pharmaceutical composition comprising the circular RNA according to any one of claims 1-22, or the cyclization precursor RNA according to claims 22 or 23.28.The pharmaceutical composition according to claim 27, wherein the pharmaceutical composition is formulated as lipid nanoparticles, lipopolyplexes or lipoplexes.29.The pharmaceutical composition according to claims 27, wherein the circular RNA or the cyclization precursor RNA is present as naked form.30.Use of the circular RNA according to any one of claims 1-21, the cyclization precursor RNA according to claims 22 or 23, or the pharmaceutical composition according to any one of claims 27-29 in the manufacture of a medicament for the expression of a POI in a target cell or tissue.31.Use of the circular RNA according to any one of claims 1-21, the cyclization precursor RNA according to claims 22 or 23, or the pharmaceutical composition according to any one of claims 27-29 in the manufacture of a medicament for preventing or treating a disease,preferably, the disease is selected from the group consisting of infectious diseases, cancers, genetic disorders, cardiovascular diseases, autoimmune diseases and rare diseases.32.A method of enhancing targeting expression of circular RNA through microRNA regulation, wherein the method comprises circularizing the cyclization precursor RNA according to claims 22 or 23 to form the circular RNA according to any one of claims 1-21.33.A method of enhancing targeting expression of circular RNA through microRNA regulation, wherein the method comprises introducing one or more miRNA binding sites into a circular RNA comprising a coding region encoding a polypeptide of interest (POI) , and an untranslated region operably linked to the coding region;wherein the one or more miRNA binding sites are introduced into the untranslated region; andwherein the one or more miRNA binding sites display Watson-Crick complementarity to the seed region of one or more miRNAs.34.A method of enhancing targeting expression of circular RNA through microRNA regulation, wherein the method comprises introducing one or more miRNA binding sites into a circular RNA comprising a coding region encoding a polypeptide of interest (POI) , and an untranslated region comprising an internal ribosome entry site (IRES) element which is operably linked to the coding region;wherein the one or more miRNA binding sites are introduced into the IRES element; andwherein the one or more miRNA binding sites display Watson-Crick complementarity to the seed region of one or more miRNAs.35.A circular RNA comprising a coding region encoding a polypeptide of interest (POI) , and an untranslated region operably linked to the coding region;wherein the untranslated region comprises one or more miRNA binding sites which display Watson-Crick complementarity to a seed region of one or more miRNAs,wherein the untranslated region is derived from HCV 5’ UTR,wherein the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding to one or more miRNAs,wherein the secondary structure comprises an SLI structure and an SLII structure,preferably, the untranslated region mainly forms non-canonical alternative SLII structures (SLIIalt) in the absence of binding to one or more miRNAs,preferably, the SLI structure is located within the 1-47 nt or 1-42 nt of the most 5’ segment of the untranslated region, and / orthe SLI and SLII structures are located within the 1-118 nt, 1-119 nt, 1-120 nt, 1-121 nt or 1-122 nt of the most 5’ segment of the untranslated region,preferably, the untranslated region forms a secondary structure having the lowest Gibbs free energy (ΔG) of lower than -50 kcal / mol upon binding one or more miRNAs, whereby improving the stability of the circular RNA and enhancing expression of the POI.36.A cyclization precursor RNA, wherein the cyclization precursor RNA is circularized to form the circular RNA according to claim 35.

Images