Enzymatic treatment of a material comprising corn protein

Abstract

The present invention relates to a method of treating a material comprising corn protein with a protein deamidase. The enzymatically treated material has improved water holding capacity, emulsifying capacity, and / or improved corn protein solubility compared to a material obtained using the same method but without the use of a protein deamidase.

Description

ENZYMATIC TREATMENT OF A MATERIAL COMPRISING CORN PROTEIN

[0001] REFERENCE TO A SEQUENCE LISTING

[0002] This application contains a Sequence Listing in computer readable form, which is incorporated herein by reference.FIELD OF THE INVENTION

[0003] The present invention relates to an enzymatic treatment of a material comprising corn protein. Particularly, the present invention relates to a method of treating a material comprising corn protein with a protein deamidase to obtain an improved protein solubility, emulsifying capacity and / or water holding capacity of the treated material.BACKGROUND

[0004] The growing world population demands sustainably produced protein-rich foods. Corn protein is a valuable source of protein for nutrition, which is less expensive than most animal proteins and has the sustainability benefits of being plant based. In the meanwhile, corn protein is not considered to be allergenic, which makes it suitable for widespread use and decreases the cleaning cost associated with mixed allergen / non-allergen production.

[0005] It is known that corn protein can be recovered from corn gluten meal. Corn gluten meal is commercially available as a byproduct of corn wet milling processes and is known to be one of the richest concentrates of proteins having a fair level of carbohydrates. But nowadays, although corn gluten meal finds widespread use as a high-protein supplement in feeds for livestock, poultry and pets, its use for human consumption is limited due to some limitaitons, for example, low protein solubility and / or water holding capacity.

[0006] Water holding capacity plays an important role in maintaining the quality of food and feed and can affect the taste, nutrition, tenderness, appearance and other edible qualities of food or feed. A high water holding capacity also maintains a good stable structure of the product and reduce the water loss during processing and storage, whereby the shelf life of the food and feed product can be extended.

[0007] Protein solubility and emulsifying capacity is important for the production of various foods, such as beverages, soups, and sauces using proteins. Good protein solubility and emulsifying capacity can make the product have better flavor, taste, texture and stability, and may enable the use of the protein in a wider range of product formats.

[0008] There remains a need to treat a material comprising corn protein to enhance its suitability for use in food-grade products. Also, there remains a need to improve the quality of a material comprising corn protein, such as corn gluten meal, for application in feeds for livestock, poultry and pets as high-protein supplement.SUMMARY OF THE INVENTION

[0009] The inventors of the present invention have found that treating a material comprising corn protein (for example corn gluten meal) with a protein deamidase can obtain an improved corn protein solubility, and much surprisingly, the enzymatically treated material (for example, corn gluten residual) has a significantly improved water holding capacity and / or emulsifying capacity, even if the enzymatically treated material obtained, such as corn gluten residual, may contain less corn protein content.

[0010] Accordingly, in one aspect, the present invention relates to a method of improving the water holding capacity of a material comprising corn protein, which comprises treating the material with a protein deamidase.

[0011] In another aspect, the present invention relates to a method of improving the emulsifying capacity of a material comprising corn protein, which comprises treating the material with a protein deamidase.

[0012] Another aspect of the present invention relates to a method of improving the protein solubility of a material comprising corn protein, which comprises treating the material with a protein deamidase.

[0013] The inventors have surprisingly found that the effect of the protein deamidase on the solubility of the corn proteins could be enhanced by pre-washing the raw material. That is, after pre-washing of the material comprising corn protein, even if there was a loss of initial soluble protein, the remaining protein fraction could still achieve the same effect under the action of less protein deamidase as the unwashed raw material under the action of higher enzyme dosage. This has been experimentally confirmed with the data shown in at least Example 3 disclosed herein.

[0014] Based on further findings reported in Examples 4 and 5 herein, the present inventors believe that the benefit of a pre-washing step before the protein deamidase treatment is particularly pronounced if the corn material is derived or obtained as a by-product from other industrial processes, such as if the corn material is a corn gluten meal. In Examples 4 and 5 disclosed herein, it was found that organic acids, such as lactic acid, is present in at least corn gluten meal and may have a negative impact on the performance of the protein deamidase.

[0015] In a preferred embodiment, the material comprising corn protein is subjected to a washing step before treatment with the protein deamidase. In some embodiments of the invention, the step of washing the material comprising corn protein before treatment with the protein deamidase enables better performance of the protein deamidase. In particular, the step of washing the material comprising corn protein before treatment with the protein deamidase enables improved corn protein solubility, using a lower dosage of protein deamidase, compared to a material comprising corn protein produced in the same way but without the step of pre-washing. Furthermore, the step of pre-washing the corn material prior to protein deamidase treatment has the added benefit of reducing impurities in the corn material.

[0016] In a further aspect, the present invention relates to a method of treating material comprising corn protein and starch, which comprises treating the material with a protein deamidase.

[0017] In some embodiments of the present invention, the protein deamidase is a protein glutaminase.

[0018] In some embodiments of the present invention, the material further comprises starch and / or fiber.

[0019] In some embodiments of the present invention, the material is selected from corn gluten meal, corn protein concentrate and corn protein isolate.

[0020] In some embodiments of the present invention, the enzymatically treated material has improved emulsifying capacity, water holding capacity and / or improved corn protein solubility compared to a material obtained using same method but without the use of a protein deamidase.

[0021] In other aspects, the present invention also relates to a food or beverage or feed comprising the material obtained by the method according to the present invention.

[0022] SEQUENCES

[0023] SEQ ID NO: 1: Protein deamidase derived from Chryseobacterium viscerum (the strain has formerly been referred to as Chryseobacterium sp-62563) having the mature polypeptide sequence shown as SEQ ID NO: 2.

[0024] SEQ ID NO: 2: Mature polypeptide sequence of protein deamidase derived from Chryseobacterium viscerum.

[0025] SEQ ID NO: 3: Protein deamidase derived from Chryseobacterium proteolyticum having the mature polypeptide sequence shown as SEQ ID NO: 4.

[0026] SEQ ID NO: 4: Mature polypeptide sequence of protein deamidase derived from Chryseobacterium proteolyticum.

[0027] SEQ ID NO: 5: Protein deamidase derived from Chryseobacterium gambrini having the mature polypeptide sequence shown as SEQ ID NO: 6.

[0028] SEQ ID NO: 6: Mature polypeptide sequence of protein deamidase derived from Chryseobacterium gambrini.

[0029] SEQ ID NO: 7: Protein deamidase derived from Chryseobacterium culicis having the mature polypeptide sequence shown as SEQ ID NO: 8.

[0030] SEQ ID NO: 8: Mature polypeptide sequence of protein deamidase derived from Chryseobacterium culicis.

[0031] SEQ ID NO: 9: Protein deamidase derived from Chryseobacterium defluvii having the mature polypeptide sequence shown as SEQ ID NO: 10.

[0032] SEQ ID NO: 10: Mature polypeptide sequence of protein deamidase derived from Chryseobacterium defluvii.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0033] In accordance with this detailed description, the following definitions apply. Note that the singular forms "a, " "an, " and "the" include plural references unless the context clearly dictates otherwise.

[0034] Reference to "about" a value or parameter herein includes aspects that are directed to that value or parameter per se. For example, description referring to "about X" includes the aspect "X" . When used in combination with measured values, "about" includes a range that encompasses at least the uncertainty associated with the method of measuring the particular value and can include a range of plus or minus two standard deviations around the stated value.

[0035] Unless defined otherwise or clearly indicated by context, all percentages are percentage by weight (percent w / w or “% (w / w) ” ) .

[0036] Furthermore, it will be appreciated that embodiments described in connection with one of the aspects described herein may equally be applied to the other aspects, unless otherwise stated.

[0037] Unless defined otherwise or clearly indicated by context, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.

[0038] The invention relates to a method of treating a material comprising corn protein (for example a corn gluten meal) with a protein deamidase to obtain an improved corn protein solubility, and much surprisingly, the enzymatically treated material (for example, corn gluten residual) has a significantly improved water holding capacity and / or emulsifying capacity, even if the enzymatically treated material obtained may have a lower corn protein content.

[0039] Accordingly, in one aspect, the present invention relates to a method of improving the water holding capacity of a material comprising corn protein, which comprises treating the material with a protein deamidase.

[0040] Also, in one aspect, the present invention relates to a method of improving the emulsifying capacity of a material comprising corn protein, which comprises treating the material with a protein deamidase.

[0041] In another aspect, the present invention relates to a method of treating a material comprising corn protein and starch, which comprises treating the material with a protein deamidase..

[0042] In some embodiments of the present invention, the material further comprises starch and / or fiber, preferably, the material further comprises corn starch and / or corn fiber.

[0043] In some embodiments of the present invention, the material has a corn protein content of at least 10% (w / w, dry basis, corn protein / dry substance) , such as at least 30% (w / w) , at least 40% (w / w) , at least 50% (w / w) , at least 60% (w / w) , at least 70% (w / w) , at least 80% (w / w) , at least 90% (w / w) . For example, the material may have a corn protein content in the range of 10%-99% (w / w) , 30%-95% (w / w) , 40%-90% (w / w) , 50%-80% (w / w) .

[0044] In some embodiments of the present invention, the material further contains a starch content in dry sustance in the range of no more than 50% (w / w, dry basis) , no more than 40% (w / w) , no more than 30% (w / w) , no more than 20% (w / w) , no more than 10% (w / w) , no more than 5% (w / w) .

[0045] In some embodiments of the present invention, the material comprising corn protein is selected from corn gluten meal, corn protein concentrate, corn protein isolate or dried distillers grains with solubles (DDGS) .

[0046] In some embodiments of the present invention, the material comprising corn protein is selected from corn gluten meal, corn protein isolate or dried distillers grains with solubles (DDGS) .

[0047] Corn gluten meal is commercially available as a byproduct of corn milling from ADM, Cargill and Tate & Lyle. Typcially, it can be made by drying the liquid gluten stream separated from corn during corn wet milling processing. In the wet milling process of corn, the following fractions are obtained: corn starch, corn oil, defatted corn germ, corn hulls, corn steep liquor, and corn protein. Typcially, the corn protein primarily comprises: prolamine, glutenin, globulin and albumin.

[0048] Corn gluten slurry is typically separated from the starch stream by centrifugation to yield a thick, yellow slurry of corn gluten slurry containing 15 to 20 percent solids. Such corn gluten slurry can be filtered and dried to produce solid corn gluten meal (about 55-65 percent protein) .

[0049] In some embodiments of the present invention, corn gluten meal is quite insoluble in water and is typically composed of corn protein, starch and fiber. In some embodiments of the present invention, the corn gluten meal contains a protein content of 30%-90% (w / w, dry basis) , 40%-80% (w / w, dry basis) , 50%-70% (w / w, dry basis) . In some embodiments of the present invention, the corn gluten meal contains a starch content of 1%-50% (w / w, dry basis) or 5%-30% (w / w, dry basis) .

[0050] In some embodiments, the material has a starch content in the range of 5-25% (w / w, dry basis) , such as in the range of 10-20% (w / w, dry basis) .

[0051] In some embodiments, the material is a corn gluten meal having a starch content in the range of 10-25% (w / w, dry basis) .

[0052] In some embodiments of the present invention, the corn gluten meal comprises at least 25% (w / w, dry basis) corn protein.

[0053] In some embodiments of the present invention, the corn gluten meal comprises at least 55% (w / w, dry basis) corn protein and typically can be used to obtain a corn protein concentrate product comprising 55%-80% (w / w, dry basis) corn protein.

[0054] In some embodiments of the present invention, the material comprising corn protein may be a corn protein concentrate, for example, which has been described in U.S. Patent No. 9,226,515. A typical analysis of such corn protein concentrate (e.g., Empyreal (R) 75, Cargill, Incorporated, Wayzata, MN) comprises about 75 wt%to 80 wt%protein on a dry weight basis, about 4.5 %fat, about 5 %starch, and other nutrients (as-is basis) , and has a bright yellow or gold color.

[0055] In some embodiments of the present invention, the corn gluten meal may be destarched to further increase the protein concentration. Typically, the destarched corn gluten meal comprises at least 70% (w / w, dry basis) corn protein, and can be used to obtain a corn protein isolate product comprising 80%-98% (w / w, dry basis) protein content. In some embodiments of the present invention, the materials comprising corn protein is a corn protein isolate.

[0056] In some embodiments of the present invention, the corn gluten meal contains around 30%-80% (w / w) moisture. In some embodiments of the present invention, the corn gluten meal is further dried or partially dried to obtain the form in powder, granule or flake, the water content of the dried corn gluten meal can be 1%-20% (w / w) .

[0057] In an embodiment, the corn material is a byproduct from starch production which is obtained by corn wet milling.

[0058] In an embodiment, the corn material is corn gluten meal produced by wet milling and is not dried prior to the enzymatic treatment with the protein deamidase. Without wishing to be bound by any particular theory, the inventors believe that, while the protein deamidase is effective in improving functionality of any type of corn material, in particular good enzymatic deamidation can be achieved when using a corn gluten meal which has not been thermally dried prior to the protein deamidase treatment.

[0059] In some embodiments of the present invention, the corn gluten material may be obtained from dried distillers grains with solubles (DDGS) , which is a byproduct of the ethanol production process, which can be commercially available from POET and ADM. For example, the distiller's dried grain can include corn gluten, starch and fiber. For example, the distiller's dried grain contains at least 30% (w / w, dry basis) corn protein content, the distiller's dried grain can include about 1%-20% (w / w, dry basis) starch.

[0060] The material comprising corn gluten may preferably be incubated with the enzyme at a temperature of 20-70℃, preferably 40-60℃, such as 45-55℃. It is to be understood that the temperature may be adjusted during the incubation. The reaction time may be controlled, for example, within a range of 5 minutes to 1 days, preferably within a range of 10 minutes to 360 minutes, and more preferably within a range of 30 minutes to 120 minutes. In an embodiment, the treatment with the protein deamidase is carried out at a temperature of 40-60℃ for 30-90 minutes, such as for around 60 minutes.

[0061] In some embodiments of the present invention, any suitable alkali such as sodium hydroxide, potassium hydroxide and calcium hydroxide can be used for such pH adjustment. In some embodiments, the enzymatic treatment is performed at a pH value between about 3.0 and about 10.0, for example between about 4.5 and about 9, preferably between about 5 and about 8.

[0062] In some embodiments of the present invention, the material comprising corn protein is suspended in water to provide a slurry of material, wherein the slurry has a 3%-40% (w / w) dry substances, 5%-25% (w / w) dry substances, preferably, 10%-15% (w / w) dry substances, during protein deamidase treatment.

[0063] In some embodiments of the present invention, the enzymatically treated material has improved emulsification capacity, water holding capacity and / or improved corn protein solubility compared to a material produced in the same way but without the treatment with the protein deamidase.

[0064] In some embodiments of the present invention, the enzymatically treated material has improved water holding capacity and / or improved corn protein solubility compared to a material produced in the same way but without the treatment with the protein deamidase.

[0065] In some embodiments of the present invention, the enzymatically treated material is at least partially dried, preferably dried.

[0066] In some embodiments of the present invention, the at least partially dried material has improved emulsification capacity, water holding capacity and / or improved corn protein solubility compared to a at least partially dried material produced in the same way but without the treatment with the protein deamidase.

[0067] In some embodiments of the present invention, the at least partially dried material has improved water holding capacity and / or improved corn protein solubility compared to a at least partially dried material produced in the same way but without the treatment with the protein deamidase.

[0068] In some embodiments, the material comprising corn protein is subjected to a washing step before treatment with the protein deamidase. In the context of the invention, this may also be referred to as a pre-washing step. As reported herein at least in Example 3, the present inventors have found that by subjecting the material comprising corn protein, such as a corn gluten meal, to a washing step before treatment with the protein deamidase, at least the solubility of the corn proteins could be enhanced, even if there was a loss of soluble protein. Further, when washing the material prior to the protein deamidase treatment, a lower enzyme dosage is needed to achieve on par protein solubility as compared to a control sample which has not been subjected to a pre-washing step.

[0069] Thus, in some embodiments, the material comprising corn protein is subjected to a washing step before treatment with the protein deamidase. In some embodiments, the material comprising corn protein and starch, preferably corn starch, is subjected to a washing step before treatment with the protein deamidase.

[0070] In some embodiments, the step of washing the material before treatment with the protein deamidase enables better performance of the protein deamidase.

[0071] Any suitable liquid may be used for the washing step, including, for example, water, organic solvents, and buffer solutions. Examples of suitable washing solutions to use in the method disclosed herein include: water-based solutions; salt solutions, such as sodium chloride or potassium chloride, or phosphate buffer solutions; acidic solutions, such as mild acidic solutions based on, e.g., acetic acid or citric acid; alkaline solutions, such as solutions containing sodium hydroxide or ammonium hydroxide; enzyme-based washing solutions; and organic solvent solutions, such as ethanol-or hexane-based solvents.

[0072] The choice of washing solution can for example be based on the raw material, including level of purity of the raw material, amount of soluble components in the raw material, pH, and general quality of the protein in the raw material. These examples represent some of the potential washing solutions that could be utilized in the process described in the patent. The specific choice of washing solution would depend on the desired outcome and the characteristics of the raw material. A person of skill in the art will know how to determine the best suitable conditions for the washing step.

[0073] In some embodiments, the material comprising corn protein is washed with water prior to treatment with the protein deamidase.

[0074] In some embodiments, the material comprising corn protein is washed with an organic solvent solution prior to treatment with the protein deamidase.

[0075] In some embodiments, the material comprising corn protein is washed with a phosphate buffer solution prior to treatment with the protein deamidase.

[0076] In some embodiments, the washing step is performed at:

[0077] a pH in the range of 3.0-10.0;

[0078] a temperature in the range of 15-99℃; and

[0079] for a duration of 10 minutes to 5 hours.

[0080] Preferably, the washing step is performed at:

[0081] a pH in the range of 3.0-8.0;

[0082] a temperature in the range of 20-90℃; and

[0083] for a duration of 20 minutes to 60 minutes.

[0084] Without wishing to be bound by any particular theory, it is believed that by performing the washing step at an acidic pH, such as at a pH between 3.0-8.0, there is a lower protein loss. Furthermore, performing the washing step at a temperature in the range of 20-90℃ enables the use of further enzymes, such as alpha-amylases or other hydrolyzing enzymes, for the enzymatic treatment of the material comprising corn protein. The use of one or more hydrolyzing enzymes is particularly preferred when the material comprises corn protein and starch, for example corn starch.

[0085] In an embodiment, the washing step is performed at:

[0086] a pH in the range of 3.0-8.0, such as at a pH of about 7.0;

[0087] a temperature in the range of 40-90℃; and

[0088] for a duration of 20 minutes to 60 minutes, such as for about 30 minutes,

[0089] wherein one or more hydrolyzing enzymes are present during the washing step.

[0090] In an embodiment, the washing step is performed at:

[0091] a pH in the range of 3.0-8.0, such as at a pH of about 7.0;

[0092] a temperature in the range of 40-90℃; and

[0093] for a duration of 20 minutes to 60 minutes, such as for about 30 minutes,

[0094] wherein one or more hydrolyzing enzymes selected from the group of a cellulase, a hemicellulase, an alpha-amylase, a pullulanase, a xylanase, or any combination thereof, is present during the washing step.

[0095] In a preferred embodiment, the washing step is performed at:

[0096] a pH in the range of 3.0-8.0, such as at a pH of about 7.0;

[0097] a temperature in the range of 40-90℃; and

[0098] for a duration of 20 minutes to 60 minutes, such as for about 30 minutes,

[0099] wherein at least an alpha-amylase is present during the washing step.

[0100] In some embodiments, there is no enzymes present during the washing step.

[0101] In some embodiments, the step of washing the material comprising corn protein is performed with a dry substance (DS) content that contribute to good flowability, such as, for example, a DS content of 1-25% (w / w) . Preferably, the DS content is in the range of 5-25% (w / w) , such as in the range of 10-20% (w / w) , such as in the range of 15-20% (w / w) . In the context of the invention, the terms “dry substance content” or “DS content” may also be referred to as dry matter content and is to be understood as the percentage of solids in a mixture of substances. The higher this proportion, the drier the mixture. The unit of DS content is [%by weight] . While DS is not always related to flowability, it may be an important parameter to check to determine if water removal is necessary and how much energy will be consumed when drying a product with certain DS value.

[0102] In some embodiment, the liquid used for the washing treatment, i.e. the washing solution, is removed by centrifugation, decanting and / or filtration, after the washing step.

[0103] In some embodiments, after washing and removal of the liquid used for washing treatment, the washed material comprising corn protein is rehydrated to a DS content of 1-25% (w / w) , such as a DS content of about 10-20% (w / w) .

[0104] In the methods of the invention, the material comprising corn protein may be subjected to further processing, such as, e.g., treatment with further enzymes, including, e.g., further hydrolyzing enzymes. This is particularly preferred for a material comprising corn protein and starch and / or fiber.

[0105] For example, the material may be treated with one or more hydrolyzing enzymes selected from the group of cellulases, pectinases, hemicellulases, xylanases, beta-glucanases, mannanases, glucanases, glucoamylases, iso-amylases, alpha-amylases, pullulanases, beta-amylases, and mixtures thereof. In a preferred embodiment, the one or more hydrolyzing enzymes is selected from the group of a cellulase, a hemicellulase, an alpha-amylase, a pullulanase, a xylanase, or any combination thereof.

[0106] The hydrolyzing enzyme may be added simultaneously and / or sequentially with protein deamidase. In a preferred embodiment, the material comprising corn protein is treated with the one or more hydrolozing enzymes before treatment with the protein deamidase.

[0107] If a washing step is included in the method, the hydrolyzing enzyme may be added before, during, or after the washing step. In a preferred embodiment, if a washing step is included in the method, the one or more hydrolyzing enzyme is added during the washing step or after the washing step, but before the protein deamidase treatment.

[0108] In the context of the present invention, the one or more hydrolyzing enzymes may be selected within the same group of enzymes, such as, e.g., within the group of alpha-amylases, and / or may be selected from different groups of hydrolyzing enzymes, such as, e.g., from the group of alpha-amylases and from the group of beta-glucanases.

[0109] In an embodiment, the one or more hydrolyzing enzymes is selected from cellulases, hemicellulases and / or pullulanase. For example, the cellulases, hemicellulases and pullulanases may be used in the methods of the invention to hydrolyze residual cellulose and / or branched starch in the corn material. In particular, cellulases, hemicellulases and pullulanases are preferably included in the methods of the invention when the corn material is a corn gluten cake or a corn gluten meal.

[0110] The alpha-amylase may be any alpha-amylase suitable for the methods according to the invention. In some embodiments, the alpha-amylase is a bacterial endo-alpha-amylase, preferably obtained from, or a variant of, an endo-alpha-amylase obtained from, Bacillus, preferably from Bacillus amyloliquefaciens. An example of a bacterial endo-alpha-amylase is  available from Novozymes A / S.

[0111] In some embodiments, the alpha-amylase is a fungal endo-alpha-amylase, preferably obtained from, or a variant of, an endo-alpha-amylase obtained from, Aspergillus, preferably from Aspergillus oryzae. An example of a fungal endo-alpha-amylase is available from Novozymes A / S.

[0112] For example, the material comprising corn protein will benefit from alpha-amylase treatment if starch content is approximately 10-20% (w / w) in the material.

[0113] After the enzymatic deamidation of the material comprising corn protein, heat treatment may be performed. The heat treatment also inactivates the protein deamidase. In some embodiments, the heat treatment is 80-125℃ for 5-30 minutes. For example, the heat treatment is 85-121℃ for 10-20 minutes. In some embodiments, the heat treatment is 90℃ for 5, 10, 15, 20, 25, or 30 minutes. In some preferred embodiments, the heat treatment is carried out at 90℃for 10 minutes. In some embodiments, the heat treatment is 85℃ for 5, 10, 15, 20, 25, or 30 minutes. In some preferred embodiments, the heat treatment is carried out at 85℃ for 15 minutes. In some embodiments, the heat treatment is 115℃ for 2, 5, 10, 15, or 20 minutes. In some embodiments, the heat treatment is 120℃ for 2, 5, 10, 15, or 20 minutes.

[0114] In some embodiments, the heat treatment further comprises an Ultra High Temperature (UHT) treatment at a temperature in the range of 126-150℃ for 1-120 seconds, such as at a temperature in the range of 130-145℃ for 1-90 seconds.

[0115] In some embodiments, the heat treatment, and also inactivation of the protein deamidase, is an Ultra High Temperature (UHT) treatment. The UHT treatment may be direct or indirect. In some embodiments, the UHT treatment is carried out at a temperature in the range of 121-150℃ for 1-120 seconds. In some embodiments, the UHT treatment is at a temperature in the range of 130-145℃ for 1-90 seconds. In further embodiments, the UHT treatment is 135-154℃ for 1-10 seconds. In further embodiments, the UHT treatment is 140-150℃ for 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 seconds. In further embodiments, the UHT treatment is 140-145℃ for 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 seconds. In some embodiments, the UHT treatment is 143℃ for 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 seconds.

[0116] In some embodiment, the heat treatment is performed in two steps, comprising a first step of heat treatment at a temperature in the range of 80-125℃ for 5-30 minutes, such as at a temperature in the range of 85-121℃ for 10-20 minutes, followed by a UHT treatment at a temperature in the range of 126-150℃ for 1-120 seconds, such as at a temperature in the range of 130-145℃ for 1-90 seconds.

[0117] In some embodiments, after treatment of the material comprising corn protein with the protein deamidase, the material is dried. In some embodiments, after the treatment with the protein deamidase, the material comprising corn protein is freeze-or spray-dried.

[0118] An embodiment relates to a method for improving water holding capacity, protein solubility and / or emulsifying capacity of a material comprising corn protein, which method comprises the steps of:

[0119] i. obtaining a material comprising corn protein and having a DS content of 1-25% (w / w) , preferably a DS content of 10-20% (w / w) ;

[0120] ii. optionally treating the material of step i. with one or more hydrolyzing enzymes, preferably at least an alpha-amylase, to obtain a hydrolysed material;

[0121] iii. treating the material of step i. or the hydrolysed material of step ii. with a protein deamidase to obtain a material comprising deamidated corn protein;

[0122] iv. heat treating the material comprising deamidated corn protein to obtain a heat-treated material comprising deamidated corn protein; and

[0123] v. optionally drying the heat-treated material comprising deamidated corn protein.

[0124] An embodiment relates to a method for improving water holding capacity, protein solubility and / or emulsifying capacity of a material comprising corn protein, which method comprises the steps of:

[0125] i. obtaining a material comprising corn protein and having a DS content of 1-25% (w / w) , preferably a DS content of 10-20% (w / w) ;

[0126] ii. treating the material of step i. with one or more hydrolyzing enzymes, preferably at least an alpha-amylase, to obtain a hydrolysed material;

[0127] iii. separating the hydrolysed material of step ii. by centrifugation, decanting and / or filtration to obtain a concentrated material;

[0128] iv. rehydrating the concentrated material of step iii. to a DS content of 1-25% (w / w) , preferably a DS content of 10-20% (w / w) to obtain a rehydrated material;

[0129] iii. treating the rehydrated material of step iv. with a protein deamidase to obtain a material comprising deamidated corn protein;

[0130] iv. heat treating the material comprising deamidated corn protein to obtain a heat-treated material comprising deamidated corn protein; and

[0131] v. optionally drying the heat-treated material comprising deamidated corn protein, preferably wherein the material comprising corn protein further comprises starch, such as corn starch, and / or fiber, such as corn fiber.

[0132] An embodiment relates to a method for improving water holding capacity, protein solubility and / or emulsifying capacity of a material comprising corn protein, which method comprises the steps of:

[0133] i. obtaining a material comprising corn protein and having a DS content of 1-25% (w / w) , preferably a DS content of 10-20% (w / w) ;

[0134] ii. washing the material of step i. with a washing solution at a pH in the range of 3.0-8.0, a temperature in the range of 20-99℃, for a duration of 10 minutes to 5 hours;

[0135] iii. removing the washing solution by centrifugation, decanting and / or filtration to obtain a pre-washed material;

[0136] iv. rehydrating the pre-washed material of step iii. to a DS content of 1-25% (w / w) , preferably a DS content of 10-20% (w / w) ;

[0137] v. treating the re-hydrated material of step iv. with a protein deamidase to obtain a material comprising deamidated corn protein;

[0138] vii. heat treating the material comprising deamidated corn protein to obtain a heat-treated material comprising deamidated corn protein; and

[0139] viii. optionally drying the heat-treated material comprising deamidated corn protein,

[0140] optionally wherein a step of treating the material comprising corn protein with one or more hydrolyzing enzymes, preferably at least an alpha-amylase, is performed before step v., such as during step ii. or between step iv. and step v.

[0141] Without wishing to be bound by any particular theory, it is believed that the combination of a washing step and use of one or more hydrolyzing enzymes, such as amylases, pullulanases, xylanases, cellulases, hemicellulases, before the protein deamidase treatment can result a further increase in protein purity of the thus obtained final material comprising corn protein.

[0142] Protein deamidase

[0143] In the methods of the invention, a material comprising corn protein is treated with a protein deamidase to obtain a material comprsing enzymatically deamidated corn protein having improved protein solubility, and / or improved water holiding capacity and / or improved emulsification capacity.

[0144] In the present invention, a protein deamidase refers to an enzyme having an effect of directly acting on an amide group of a side chain of an amino acid that constitutes a protein to cause deamidation and release ammonia without cleaving a peptide bond of the protein and without crosslinking the protein.

[0145] The term “deamidase” means a protein-glutamine glutaminase (also known as glutaminylpeptide glutaminase) activity, as described in EC 3.5.1.44, which catalyzes the hydrolysis of the gamma-amide of glutamine substituted at the carboxyl position or both the alpha-amino and carboxyl positions, e.g., L-glutaminylglycine and L-phenylalanyl-L-glutaminylglycine. Thus, deamidases can deamidate glutamine residues in proteins to glutamate residues and are also referred to as protein glutamine deamidase. Deamidases comprise a Cys-His-Asp catalytic triad (e.g., Cys-156, His-197, and Asp-217, as shown in Hashizume et al. “Crystal structures of protein glutaminase and its pro forms converted into enzyme-substrate complex” , Journal of Biological Chemistry, vol. 286, no. 44, pp. 38691–38702) and belong to the InterPro entry IPR041325.

[0146] Deamidase may also include a protein asparaginase that directly acts on an amide group of a side chain of an asparagine residue contained in a protein to release ammonia and thus converts the asparagine residue into an aspartate residue. In the present invention, as a protein deamidase, any one of the protein glutaminase and the protein asparaginase can be used, or both can be used in combination. One example of the protein deamidase used in the present invention is a protein glutaminase.

[0147] A protein deamidase to be used in a method of the present invention may be obtained from microorganisms of any genus. For purposes of the present invention, the term “obtained from” as used herein in connection with a given source shall mean that the polypeptide encoded by a polynucleotide is produced by the source or by a strain in which the polynucleotide from the source has been inserted. In one embodiment, the polypeptide obtained from a given source is secreted extracellularly.

[0148] The protein deamidase may be obtained from a microorganism by use of any suitable technique. For instance, an enzyme preparation may be obtained by fermentation of a suitable microorganism and subsequent isolation of a protein deamidase preparation from the resulting fermented broth or microorganism by methods known in the art. The protein deamidase may also be obtained by use of recombinant DNA techniques. Such method normally comprises cultivation of a host cell transformed with a recombinant DNA vector comprising a DNA sequence encoding the protein deamidase and the DNA sequence being operationally linked with an appropriate expression signal such that it is capable of expressing the enzyme in a culture medium under conditions permitting the expression of the enzyme and recovering the enzyme from the culture. The DNA sequence may also be incorporated into the genome of the host cell. The DNA sequence may be of genomic, cDNA or synthetic origin or any combinations of these, and may be isolated or synthesized in accordance with methods known in the art.

[0149] The protein deamidase may be purified. The term "purified" as used herein covers protein deamidase enzyme protein essentially free from insoluble components from the production organism. The term "purified" also covers protein deamidase enzyme protein essentially free from insoluble components from the native organism from which it is obtained. Preferably, it is also separated from some of the soluble components of the organism and culture medium from which it is derived. More preferably, it is separated by one or more of the unit operations: filtration, precipitation, or chromatography.

[0150] The types or origins of the protein deamidase used in the present invention are not particularly limited. Examples of the protein deamidase includes protein deamidases derived from Chryseobacterium genus, Flavobacterium genus, Empedobacter genus, Sphingobacterium genus, Aureobacterium genus, or Myroides genus.

[0151] The protein deamidase may be derived from any of the sources mentioned herein. The term “derived” means in this context that the enzyme may have been isolated from an organism where it is present natively, i.e. the amino acid sequence of the protein deamidase is identical to a native polypeptide. The term “derived” also means that the enzyme may have been produced recombinantly in a host organism, the recombinantly produced enzyme having either an amino acid sequence which is identical to a native enzyme or having a modified amino acid sequence, e.g. having one or more amino acids which are deleted, inserted and / or substituted, i.e. a recombinantly produced enzyme which is a mutant of a native amino acid sequence. Within the meaning of a native enzyme are included natural variants. Furthermore, the term “derived” includes enzymes produced synthetically by, e.g., peptide synthesis. The term “derived” also encompasses enzymes which have been modified e.g. by glycosylation, phosphorylation etc., whether in vivo or in vitro. With respect to recombinantly produced enzymes the term “derived from” refers to the identity of the enzyme and not the identity of the host organism in which it is produced recombinantly.

[0152] In some embodiments, the protein deamidase may be derived from Chryseobacterium genus, such as Chryseobacterium viscerum, C. gambrini, C. culicis, C. defluvii, or C. proteolyticum. In some embodiments, the deamidase in the methods of the invention is derived from or obtained from Chryseobacterium viscerum.

[0153] EP1839491 discloses cloning of a protein glutaminase from Chryseobacterium proteolyticum expressed in Corynebacterium glutamicum. Deamidases are also commercially available, e.g., protein glutaminases derived from Chryseobacterium genus, for example, "Amano PG500” (manufactured by Amano Enzyme Inc. ) .

[0154] For example, protein deamidases can be obtained from a culture broth of the above-described microorganisms.

[0155] Protein deamidases are produced by microbial cells in an inactive proform, which comprises a propeptide domain tightly bound to a deamidase domain. The proform is expressed as a fusion protein, which has reduced deamidase activity to protect the viability of the host cell. In nature, the fusion protein is post-processed to remove the propeptide and release the active deamidase outside of the host cell. However, in recombinant expression systems, the fusion protein is secreted outside of the host cell as an inactive proform comprising the propeptide. The propeptide may then be enzymatically cleaved off to separate it from the mature deamidase. The protein deamidases of the methods and compositions of the present invention are mature deamidases where the propeptide has been removed. In some embodiments, the propeptide was cleaved enzymatically by an endopeptidase. In some embodiments, the propeptide may still be present in the composition comprising the mature deamidase.

[0156] The recombinant, mature protein deamidases used in the methods of the invention comprises the polypeptide of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, and 10. Each mature protein deamidase is derived from a deamidase proform polypeptide, which comprises the polypeptide of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, and 9, respectively. The proform polypeptide comprises a propeptide at the N-terminal end, fused to a deamidase which is the same as that of the polypeptide of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, or 10. The propeptide may be enzymatically cleaved from the proform polypeptide to release the mature deamidase. Naturally occurring propeptide sequences are provided in the proform polypeptide.

[0157] The methods and compositions of the invention include a mature deamidase and optionally a second polypeptide which is derived from the propeptide of a deamidase. The second polypeptides described herein are mutated variants of the naturally occurring propeptides. These variant propeptide sequences have been found to bind less strongly to their corresponding deamidase, so that they are more easily enzymatically cleaved off after recombinant expression and secretion from of the host cell. The polypeptides of SEQ ID NOs: 1 to 10 are derived from Chryseobacterium spp. and are described in PCT application PCT / EP2023 / 055936; filed March 8, 2023, herein incorporated by reference.

[0158] After expression of the proform polypeptide in a recombinant expression system, a site-specific endopeptidase is used to cleave off the propeptide, leaving an active, mature deamidase. In some embodiments, the cleaved propeptide is not purified away from the mature deamidase. Therefore, the propeptide may be present in the composition with the mature deamidase.

[0159] According to a preferred embodiment the protein deamidase applied in the process of the invention is derived from or obtained from a Chryseobacterium species, e.g., Chryseobacterium proteolyticum or Chryseobacterium viscerum.

[0160] In the context of the present invention, the term “mature polypeptide” means a polypeptide in its mature form following N terminal processing (e.g., removal of signal peptide) . A "signal peptide" is a sequence of amino acids attached to the N-terminal portion of a protein, which facilitates the secretion of the protein outside the cell. The mature form of an extracellular protein lacks the signal peptide, which is cleaved off during the secretion process.

[0161] In one embodiment the deamidase is selected from a polypeptide having at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 2.

[0162] In one embodiment the deamidase is selected from a polypeptide having at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 4.

[0163] In one embodiment the deamidase is selected from a polypeptide having at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 6.

[0164] In one embodiment the deamidase is selected from a polypeptide having at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 8.

[0165] In one embodiment the deamidase is selected from a polypeptide having at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 10.

[0166] In one embodiment the deamidase is selected from a polypeptide having at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%sequence identity to a mature polypeptide of SEQ ID NO: 1.

[0167] In one embodiment the deamidase is selected from a polypeptide having at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%sequence identity to a mature polypeptide of SEQ ID NO: 3.

[0168] In one embodiment the deamidase is selected from a polypeptide having at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%sequence identity to a mature polypeptide of SEQ ID NO: 5.

[0169] In one embodiment the deamidase is selected from a polypeptide having at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%sequence identity to a mature polypeptide of SEQ ID NO: 7.

[0170] In one embodiment the deamidase is selected from a polypeptide having at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%sequence identity to a mature polypeptide of SEQ ID NO: 9.

[0171] For purposes of the present invention, the sequence identity between two amino acid sequences is determined as the output of “longest identity” using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) as implemented in the Needle program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) , preferably version 6.6.0 or later. The parameters used are a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 (EMBOSS version of BLOSUM62) substitution matrix. In order for the Needle program to report the longest identity, the -nobrief option must be specified in the command line. The output of Needle labelled “longest identity” is calculated as follows:

[0172] (Identical Residues x 100)  /  (Length of Alignment –Total Number of Gaps in Alignment)

[0173] In the context of the present invention, the term “variant” means a polypeptide having enzymatic activity comprising an alteration, i.e., a substitution, insertion, and / or deletion, at one or more (e.g., several) positions. A substitution means replacement of the amino acid occupying a position with a different amino acid; a deletion means removal of the amino acid occupying a position; and an insertion means adding one or more (e.g., several) amino acids, e.g., 1-5 amino acids, adjacent to and immediately following the amino acid occupying a position.

[0174] The amino acid changes may be of a minor nature, that is conservative amino acid substitutions or insertions that do not significantly affect the folding and / or activity of the protein; small deletions, typically of 1-30 amino acids; small amino-or carboxyl-terminal extensions, such as an amino-terminal methionine residue; a small linker peptide of up to 20-25 residues; or a small extension that facilitates purification by changing net charge or another function, such as a poly-histidine tract, an antigenic epitope or a binding domain.

[0175] Examples of conservative substitutions are within the groups of basic amino acids (arginine, lysine and histidine) , acidic amino acids (glutamic acid and aspartic acid) , polar amino acids (glutamine and asparagine) , hydrophobic amino acids (leucine, isoleucine and valine) , aromatic amino acids (phenylalanine, tryptophan and tyrosine) , and small amino acids (glycine, alanine, serine, threonine and methionine) . Amino acid substitutions that do not generally alter specific activity are known in the art and are described, for example, by H. Neurath and R. L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Common substitutions are Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Tyr / Phe, Ala / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, and Asp / Gly.

[0176] Alternatively, the amino acid changes are of such a nature that the physico-chemical properties of the polypeptides are altered. For example, amino acid changes may affect the thermal stability of the polypeptide, alter the substrate specificity, change the pH optimum, and the like.

[0177] Essential amino acids in a polypeptide can be identified according to procedures known in the art, such as site-directed mutagenesis or alanine-scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085) . In the latter technique, single alanine mutations are intr0oduced at every residue in the molecule, and the resultant mutant molecules are tested for enzymatic activity to identify amino acid residues that are critical to the activity of the molecule. See also, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. The active site of the enzyme or other biological interaction can also be determined by physical analysis of structure, as determined by such techniques as nuclear magnetic resonance, crystallography, electron diffraction, or photoaffinity labelling, in conjunction with mutation of putative contact site amino acids. See, for example, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. The identity of essential amino acids can also be inferred from an alignment with a related polypeptide.

[0178] Single or multiple amino acid substitutions, deletions, and / or insertions can be made and tested using known methods of mutagenesis, recombination, and / or shuffling, followed by a relevant screening procedure, such as those disclosed by Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95 / 17413; or WO 95 / 22625. Other methods that can be used include error-prone PCR, phage display (e.g., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; U.S. Patent No. 5,223,409; WO 92 / 06204) , and region-directed mutagenesis (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127) .

[0179] Mutagenesis / shuffling methods can be combined with high-throughput, automated screening methods to detect activity of cloned, mutagenized polypeptides expressed by host cells (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896) . Mutagenized DNA molecules that encode active polypeptides can be recovered from the host cells and rapidly sequenced using standard methods in the art. These methods allow the rapid determination of the importance of individual amino acid residues in a polypeptide.

[0180] A protein deamidase to be used in the methods of the invention may be added in a concentration of 0.01-100 IPA (U)  / g substrate protein, such as 0.1-70 IPA (U)  / g substrate protein, 0.5-50 IPA (U)  / g substrate protein. In some embodiments, the protein deamidase to be used in the methods of the invention is added in a concentration in the range of 1-25 IPA (U)  / g substrate protein, such as 2-15 IPA (U)  / g substrate protein.

[0181] Deamidase (protein glutaminase) activity was measured using the assay described in Example 1. The activity assay consists of two separate de-coupled parts: (1) an enzymatic step wherein ammonia is formed by the catalytic action of the protein deamidase; and (2) a non-enzymatic detection step, wherein the ammonia formed in step (1) is derivatized to a blue indophenol compound with an absorption maximum at 630 nm. The amount of enzyme producing 1 μmol ammonia per minute at 37℃ is defined as 1 unit (given in Indophenol Assay Unit: IPA (U) ) . The activity may be determined relative to a standard of declared strength.

[0182] The enzymes dosage will depend on parameters such as the temperature and the incubation time. The skilled person will know how to determine the optimal enzyme dosage.

[0183] The conditions of treatment with a protein deamidase are not particularly limited as long as the treatment is efficient for the effect of the present invention, that is, increase and / or improvement in physical properties of the obtained material comprising corn protein.

[0184] Use of the material comprising enzymatically deamidated corn protein

[0185] Without wishing to be bound by any particular theory, the inventors believe that use of protein deamidase to yield a material comprising enzymatically deamidated corn protein contribute to the superior benefits reported herein, including, but not limited to, an improved protein solubility, emulsifying capacity, and / or water holiding capacity, which enable incorporation of the treated materials comprising deamidated corn protein in a wide variety of food materials to form superior protein fortified foods.

[0186] Improving the protein solubility, emulsifying capacity, and water holding capacity of corn protein offers numerous benefits, including enhanced nutritional value, improved texture and mouthfeel, extended shelf life, cost savings, product development versatility, and sustainability. These enhancements contribute to the production of higher quality, more functional, and nutritionally superior products, benefiting both consumers and manufacturers.

[0187] Enhancing the emulsifying capacity of a corn protein through protein deamidase treatment offers a multitude of benefits across various industries. By increasing the protein's ability to form stable emulsions, the functionality and versatility of the corn protein are significantly augmented, leading to improved texture, mouthfeel, and stability of the food product comprising the corn protein. This enhancement can also result in cost savings by reducing the need for additional stabilizers or emulsifiers. Furthermore, the modified plant protein's emulsifying properties can facilitate the development of healthier, plant-based alternatives in the food industry, meeting the growing consumer demand for clean label products with improved nutritional profiles.

[0188] Improving protein solubility may for example improve the nutritional value of food or feed products containing the corn protein, improve their sensory qualities, and allow for the creation of clearer beverages and smoother textures in food formulations. Improving protein solubility may also provide property of better dispersion stability of a beverage or liquid format products and even has stabilizer replacement benefit.

[0189] Improving water holding capacity offers several key benefits across various industries. In the food sector, enhanced water holding capacity leads to improved moisture retention in products, resulting in extended shelf life, better texture, and reduced syneresis. This improvement also contributes to improved stability and mouthfeel of various food products. Overall, this enhancement provides opportunities for creating high-quality, longer-lasting products with improved sensory attributes and consumer appeal.

[0190] In some embodiments of the present invention, the enzymatically treated material comprising corn protein of the present invention can be used as food raw materials in food, beverages, fermented beverages, alcoholic beverages, condiments, baked foods, dairy products, health products, dietary supplements and other products. In some embodiments, the base food can be pasta (e.g., spaghetti) , a baked product (e.g., bread, cake, cookies, or biscuits) , or a snack food (e.g., chips, crackers, or trail mix) , In other embodiments, the base food is meat (e.g., chicken, pork, beef, or fish) , the materials comprising corn protein treated by the invention is incorporated thereon in a batter or breading. In some other embodiments, the base food is a fruit or vegetable and the materials comprising corn protein treated by the invention is incorporated therein.

[0191] The enzymatically treated material can also be applied to animal feed and pet food, for example, as corn gluten feed. The feed product as disclosed herein can be for a companion animal that includes, without limitation, dog, cat, bird, fish, potbelly pig, reptile, amphibian, and rodent. For example, a feed product as disclosed herein can include a pet food and / or pet treats (e.g., a biscuit, bar, chew, cookies, kibble, or toy) . In some embodiments, the feed product is a nutritional supplement such as a biscuit, a bar, a chew, cookies, biscuits, kibble, an energy bar, an energy sauce or an energy drink.

[0192] In some embodiments, the corn protein obtained according to the herein disclosed and claimed methods is used as a milk replacer, preferably as a calf milk replacer. For example, the calf milk replacer may be used as feed for ruminants and suidae. For example, the calf milk replacer comprising corn protein obtained according to the present invention may be used as feed for bovine, cattle, goat, sheep, pigs, hogs, and swine.

[0193] The material comprising corn protein treated by the invention may be used in various forms including but not limited to powder, granules, stick, baked biscuit or other products, pressed candy, soft capsule or hard capsule, soft candy or hard candy, gum or gel, paste, ice cream, jam, sauce, dried meat, alternative meat or vegetables, dairy or fermented dairy products.

[0194] Thus, in other aspects, the present invention also relates to a food or a beverage or a feed comprising the material obtained by the method according to the present invention.

[0195] The invention is further defined by the following numbered embodiments:

[0196] Embodiment 1. A method of improving emulsifying capacity, water holding capacity and / or protein solubility of a material comprising corn protein, which comprises treating the material with a protein deamidase.

[0197] Embodiment 2. The method according to embodiment 1, wherein the protein deamidase is a protein glutaminase.

[0198] Embodiment 3. The method according to embodiment 1 or 2, wherein the material further comprises starch and / or fiber.

[0199] Embodiment 4. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the material further preferably corn starch and / or corn fiber.

[0200] Embodiment 5. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the material is selected from corn gluten meal, corn protein concentrate, corn protein isolate or dried distillers grains with solubles (DDGS) .

[0201] Embodiment 6. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the material is selected from corn gluten meal, corn protein concentrates and corn protein isolates.

[0202] Embodiment 7. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the material is selected from corn gluten meal and corn protein concentrates.

[0203] Embodiment 8. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the material is a byproduct from starch production.

[0204] Embodiment 9. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the material is a byproduct from corn wet milling.

[0205] Embodiment 10. The method according to embodiment 8 or 9, wherein the material is corn gluten meal produced by wet milling and is not dried prior to the enzymatic treatment with the protein deamidase.

[0206] Embodiment 11. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the material has a starch content in the range of 5-25% (w / w, dry basis) , such as in the range of 10-20% (w / w, dry basis) .

[0207] Embodiment 12. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the material is a corn gluten meal having a starch content in the range of 10-25% (w / w, dry basis) .

[0208] Embodiment 13. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the material has a corn protein content of at least 10% (w / w, dry basis, corn protein / dry substance) , such as at least 30% (w / w) , at least 40% (w / w) , at least 50% (w / w) , at least 60% (w / w) , at least 70% (w / w) , at least 80% (w / w) , or at least 90% (w / w) .

[0209] Embodiment 14. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the material has a corn protein content of at least 25% (w / w) .

[0210] Embodiment 15. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the material has a corn protein content in the range of 10-99% (w / w) , 30-95% (w / w) , 40-90% (w / w) , or 50-80% (w / w) .

[0211] Embodiment 16. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the material is a corn gluten meal having a protein content of at least 25% (w / w) , such as at least 55% (w / w) .

[0212] Embodiment 17. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the enzymatic treatment is carried out under a condition with a pH in a range of 3.0-10.0.

[0213] Embodiment 18. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the enzymatic treatment is carried out under a condition with a pH in a range of 4.5-9.0, preferably a pH in a range of 5.0-8.0.

[0214] Embodiment 19. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the treatment with the protein deamidase is carried out at a temperature in the range of 20-70℃, such as at a temperature in the range of 50-60℃.

[0215] Embodiment 20. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the treatment with the protein deamidase lasts for at least 10 minutes, at least 30 minutes or at least 60 minutes.

[0216] Embodiment 21. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the treatment with the protein deamidase is carried out for 30 minutes to 120 minutes, suchas for 30-90 minutes.

[0217] Embodiment 22. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the material is subjected to a washing step before treatment with the protein deamidase.

[0218] Embodiment 23. The method according to embodiment 22, wherein the washing step is performed at:

[0219] a pH in the range of 3.0-10.0;

[0220] a temperature in the range of 15-99℃; and

[0221] for a duration of 10 minutes to 5 hours.

[0222] Embodiment 24. The method according to embodiment 22 or 23, wherein the washing step is performed at:

[0223] a pH in the range of 3.0-8.0; and

[0224] a temperature in the range of 20-90℃; and

[0225] for a duration of 20 minutes to 60 minutes.

[0226] Embodiment 25. The method according to any of embodiments 22-24, wherein the washing step is performed at:

[0227] a pH in the range of 3.0-8.0, such as at a pH of about 7.0;

[0228] a temperature in the range of 20-90℃, such as in the range of about 40-90℃; and

[0229] for a duration of 20 minutes to 60 minutes, such as for a duration of about 30 minutes.

[0230] Embodiment 26. The method according to any of embodiments 22-25, wherein the liquid used for the washing treatment is removed by centrifugation, decanting and / or filtration.

[0231] Embodiment 27. The method according to any of embodiments 22-26, wherein the liquid used for the washing treatment is a water-based solution, a salt solution, an acidic solution, an alkaline solution, an enzyme-based washing solution, an organic solvent solution, or a combination thereof.

[0232] Embodiment 28. The method according to any of embodiments 22-27, wherein the liquid used for the washing treatment is water, a phosphate buffer solution, or an organic solvent.

[0233] Embodiment 29. The method according to any of embodiments 22-28, wherein the enzymatically treated corn protein has improved improved protein solubility compared to a corn protein which has not been subjected to a step of washing treatment prior to the protein deamidase treatment.

[0234] Embodiment 30. The method according to any of embodiments 22-29, wherein a lower dosage of protein deamidase can be used to achieve the improved protein solubility as compared to using the same method without the step of washing the material prior to the protein deamidase treatment.

[0235] Embodiment 31. The method according to any of the preceding embodiments, further comprising treating the material comprising corn protein with one or more hydrolyzing enzymes selected from the group of cellulases, pectinases, hemicellulases, xylanases, beta-glucanases, mannanases, glucanases, glucoamylases, iso-amylases, alpha-amylases, pullulanase, beta-amylases, and mixtures thereof.

[0236] Embodiment 32. The method according to embodiment 31, wherein the one or more hydrolyzing enzymes is selected from a cellulase, a hemicellulase, an alpha-amylase, a pullulanase, a xylanase, or any combination thereof.

[0237] Embodiment 33. The method according to any of embodiments 31-32, wherein the treatment with the one or more hydrolyzing enzymes is carried out before the protein deamidase treatment.

[0238] Embodiment 34. The method according to any of embodiments 22-33, wherein the material comprising corn protein is treated with one or more hydrolyzing enzymes selected from the group of cellulases, pectinases, hemicellulases, xylanases, beta-glucanases, mannanases, glucanases, glucoamylases, iso-amylases, alpha-amylases, pullulanase, beta-amylases, and mixtures thereof, either during the washing step or after the washing step, but before the protein deamidase treatment.

[0239] Embodiment 35. The method according to the preceding embodiment, wherein the one or more hydrolyzing enzymes is selected from the group of a cellulase, a hemicellulase, an alpha-amylase, a pullulanase, a xylanase, or any combination thereof, preferably wherein the one or more hydrolyzing enzymes is an alpha-amylase.

[0240] Embodiment 36. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the protein deamidase is derived from or obtained from a Chryseobacterium species, more preferably from Chryseobacterium proteolyticum or Chryseobacterium viscerum.

[0241] Embodiment 37. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the protein deamidase comprises a polypeptide sequence with at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%sequence identity to SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, or 10.

[0242] Embodiment 38. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the protein deamidase comprises the polypeptide sequence of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, or 10.

[0243] Embodiment 39. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the enzymatically treated material has improved emulsifying capacity, water holding capacity and / or improved corn protein solubility compared to a material obtained using same method but without the use of a protein deamidase.

[0244] Embodiment 40. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the enzymatically treated material has improved emulsifying capacity compared to a material obtained using same method but without the use of a protein deamidase.

[0245] Embodiment 41. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the enzymatically treated material has improved water holding capacity compared to a material obtained using same method but without the use of a protein deamidase.

[0246] Embodiment 42. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the enzymatically treated material has improved corn protein solubility compared to a material obtained using same method but without the use of a protein deamidase.

[0247] Embodiment 43. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the enzymatically treated material is at least partially dried, preferably dried.

[0248] Embodiment 44. The method according to the preceding embodiment, wherein the enzymatically treated material is spray-or freeze-dried.

[0249] Embodiment 45. The method according to any of embodiments 43 or 44, wherein the at least partially dried material has improved emulsifying capacity, water holding capacity and / or improved corn protein solubility compared to a material obtained using same method but without the use of a protein deamidase.

[0250] Embodiment 46. The method according to any of embodiments 43-45, wherein the at least partially dried material has improved water holding capacity and / or improved corn protein solubility compared to a material obtained using same method but without the use of a protein deamidase.

[0251] Embodiment 47. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the enzymatically treated corn protein is subjected to heat treatment after the protein deamidase treatment.

[0252] Embodiment 48. The method accoding to the preceding embodiment, wherein the heat treatment is is carried out at 80-125℃ for 5-30 minutes.

[0253] Embodiment 49. The method according to any of embodiments 47-48, wherein the heat treatment is carried out at 85-121℃ for 10-20 minutes, such as about at 85-90℃ for about 10-15 minutes.

[0254] Embodiment 50. The method according to any of the preceding embodiments, wherein the enzymatically treated corn protein is suitable for use in a food, a beverage, or as a feed.

[0255] Embodiment 51. A method of treating a material comprising corn protein and starch, preferably corn starch, which comprises treating the material with a protein deamidase.

[0256] Embodiment 52. The method according to embodiment 51, wherein the protein deamidase is a protein glutaminase.

[0257] Embodiment 53. The method according to embodiment 51 or 52, wherein the material further comprises fiber, preferably corn fiber.

[0258] Embodiment 54. The method according to any of embodiments 51-53, wherein the material is corn gluten meal, which preferably is a byproduct from starch production which are obtained by corn wet milling.

[0259] Embodiment 55. The method according to any of embodiments 51-54, wherein the material has a starch content in the range of 5-25% (w / w, dry basis) , such as in the range of 10-20% (w / w, dry basis) .

[0260] Embodiment 56. The method according to any of embodiments 51-55, wherein the material has a corn protein content of at least 10% (w / w) , such as at least 30% (w / w) , at least 40% (w / w) , at least 50% (w / w) , at least 60% (w / w) , at least 70% (w / w) , at least 80% (w / w) , or at least 90% (w / w) .

[0261] Embodiment 57. The method according to any of embodiments 51-56, wherein the material has a corn protein content of at least 25% (w / w) .

[0262] Embodiment 58. The method according to any of embodiments 51-57, wherein the material has a corn protein content in the range of 10-99% (w / w) , 30-95% (w / w) , 40-90% (w / w) , or 50-80% (w / w) .

[0263] Embodiment 59. The method according to any of embodiments 51-58, wherein the material is a corn gluten meal having a protein content of at least 55% (w / w) .

[0264] Embodiment 60. The method according to any of embodiments 51-59, wherein the protein deamidase is derived from or obtained from a Chryseobacterium species, more preferably from Chryseobacterium proteolyticum or Chryseobacterium viscerum.

[0265] Embodiment 61. The method according to any of embodiments 51-60, wherein the protein deamidase comprises a polypeptide sequence with at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%sequence identity to SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, or 10.

[0266] Embodiment 62. The method according to any of embodiments 51-61, wherein the protein deamidase comprises the polypeptide sequence of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, or 10.

[0267] Embodiment 63. The method according to any of embodiments 51-62, wherein the enzymatically treated material has improved emulsifying capacity, water holding capacity and / or improved corn protein solubility compared to a material obtained using same method but without the use of a protein deamidase.

[0268] Embodiment 64. The method according to any of embodiments 51-63, wherein the enzymatically treated material has improved water holding capacity and / or improved corn protein solubility compared to a material obtained using same method but without the use of a protein deamidase.

[0269] Embodiment 65. The method according to any of embodiments 51-64, wherein the enzymatic treatment is carried out under a condition with a pH in a range of 3-10.0, such as with a pH in a range of 4.5-9.0, preferably a pH in a range of 5.0-8.0.

[0270] Embodiment 66. The method according to any of embodiments 51-65, further comprising treating the material with one or more hydrolyzing enzymes selected from the group of cellulases, pectinases, hemicellulases, xylanases, beta-glucanases, mannanases, glucanases, glucoamylases, iso-amylases, alpha-amylases, pullulanase, beta-amylases, and mixtures thereof, preferably wherein the one or more hydrolyzing enzymes selected from the group a cellulase, a hemicellulase, an alpha-amylase, a pullulanase, a xylanase, or any combination thereof.

[0271] Embodiment 67. The method according to the preceding embodiment, wherein the treatment with the one or more hydrolyzing enzymes is carried out before treatment with the protein deamidase.

[0272] Embodiment 68. The method according to any of embodiments 51-67, wherein the material is subjected to a washing step before treatment with the protein deamidase.

[0273] Embodiment 69. The method according to the preceding embodiment, wherein the washing step is performed at:

[0274] a pH in the range of 3.0-10.0;

[0275] a temperature in the range of 15-99℃;

[0276] for a duration of 10 minutes to 5 hours, and

[0277] optionally wherein the liquid used for the washing treatment is removed by centrifugation, decanting, and / or filtration.

[0278] Embodiment 70. The method according to any of embodiments 67-69 and dependent on embodiment 66, the treatment with the one or more hydrolyzing enzyme is carried out during or after the washing step.

[0279] Embodiment 71. A food, a beverage, or a feed comprising the material obtained by the method according to any of embodiments 1-70.

[0280] Embodiment 72. Use of a protein deamidase to treat a material comprising corn protein to improve emulsifying capacity, water holding capacity and / or protein solubility.

[0281] Embodiment 73. Use according to embodiment 72, wherein the material has been subjected to a step of washing before the protein deamidase treatment.

[0282] Embodiment 74. Use of a protein deamidase to treat a material comprising corn protein to improve emulsifying capacity.

[0283] Embodiment 75. Use of a protein deamidase to treat a material comprising corn protein to improve water holding capacity.

[0284] Embodiment 76. Use of a protein deamidase to treat a material comprising corn protein to improve protein solubility.

[0285] Embodiment 77. Use according to embodiment 76, wherein the material has been subjected to a step of washing before the protein deamidase treatment.

[0286] Embodiment 78. Use of a protein deamidase to treat a material comprising corn protein and starch to improve emulsifying capacity, water holding capacity and / or protein solubility, preferably wherein the starch is corn starch.

[0287] Embodiment 79. Use according to embodiment 78, wherein the material further comprises fiber, preferably corn fiber.

[0288] Embodiment 80. Use according to any of embodiments 78-79, wherein the material has been subjected to a step of washing before the protein deamidase treatment.

[0289] Embodiment 81. Use according to any of embodiments 78-80, wherein the material has been treated with one or more hydrolyzing enzymes before the protein deamidase treatment, wherein the one or more hydrolyzing enzymes selected from the group of cellulases, pectinases, hemicellulases, xylanases, beta-glucanases, mannanases, glucanases, glucoamylases, iso-amylases, alpha-amylases, pullulanase, beta-amylases, and mixtures thereof, preferably wherein the one or more hydrolyzing enzymes selected from the group a cellulase, a hemicellulase, an alpha-amylase, a pullulanase, a xylanase, or any combination thereof.

[0290] EXAMPLES

[0291] Enzymes

[0292] The following enzymes are used throughout the examples:

[0293] Protein deamidase: Protein glutaminase derived from Chryseobacterium viscerum (the strain has formerly been referred to as Chryseobacterium sp-62563) having the mature polypeptide sequence shown as SEQ ID NO: 2. Cleavage of the propeptide was achieved by treating the deamidase of SEQ ID NO: 1 with a site-specific endopeptidase. The site-specific endopeptidase used was a glutamyl endopeptidase from Bacillus licheniformis. The resulting active deamidase after maturation was the polypeptide shown in SEQ ID NO: 2. The Chryseobacterium strain was isolated from a soil sample collected in Sibhult, Sweden, in September 2013.

[0294] Example 1: Protein deamidase activity assay

[0295] The protein deamidase activity assay consists of two separate de-coupled parts:

[0296] 1) An enzymatic step wherein ammonia is formed by the catalytic action of the protein deamidase; and

[0297] 2) A non-enzymatic detection step wherein the ammonia formed in step (1) is derivatized to a blue indophenol compound with an absorption maximum at 630 nm.

[0298] In step (1) , the ammonia is developed by the deamidating action of the protein deamidase. In step (2) , the generated ammonia reacts with phenol to form dioxyphenylamine under alkaline conditions. The reaction is catalyzed by sodium pentacyanonitrosylferrate (III) (sodium nitroprusside) . “Color Reagent solution A” contains phenol and sodium nitroprusside. “Color Reagent Solution B” provides alkaline reaction conditions. The intermediate is then oxidized by addition of sodium hypochlorite ( “Color Reagent Solution C” ) to form indophenol blue. This compound absorbs visible light at 630 nm. The enzyme activity is then calculated using a standard curve.

[0299] Assay Procedure:

[0300] Step (1) Enzymatic step with ammonia formation

[0301] Reagents:

[0302] Assay dilution solution: 0.2 M Na-phosphate buffer, 0.01%Triton X-100, pH 6.5.

[0303] Assay buffer: Same as above. Used to prepare stock solution and diluted sample of protein deamidase (referred to in the following as “enzyme” ) .

[0304] Substrate solution: 30 mM Z-Gln-Gly (Merck C6154-1G) in assay dilution solution (check pH after dissolution) .

[0305] Stop solution: 0.4M TCA (Trichloroacetic acid) .

[0306] Standard: NH4Cl (Ammonium Standard for IC, Merck 59755-100ML, 1000 mg / L NH4+ in water) diluted in assay dilution solution (see also “Standard curve” section) .

[0307] Dissolve / dilute enzyme product in assay buffer and prepare suitable dilution resulting in a linear assay response.

[0308] Incubation:

[0309] 1. Add 10 μL of diluted enzyme samples in triplicates to the wells of a 96-well microtiter plate (MTP) .

[0310] 2. Add 100 μL of substrate solution to each well.

[0311] 3. For blank samples add 100 μL 0.4M TCA solution.

[0312] 4. Seal the plate using transparent plate sealer.

[0313] 5. Incubate the plate for 10 minutes at 37℃, 500 rpm, on a thermomixer equipped with a lid heating function.

[0314] 6. To stop the reaction, carefully add 100 μL 0.4M TCA solution (except for the blank samples, which already contain TCA) .

[0315] Total reaction volume: 210 μL

[0316] Step (2) Ammonia detection step

[0317] Reagents:

[0318] Color reagent A: 4% (w / v) Phenol, 0.015% (w / v) sodium pentacyanonitrosylferrate (III) dihydrate (sodium nitroprusside) (Na2 [Fe (CN) 5NO] ·2H2O) .

[0319] Color reagent B: 5% (w / v) Potassium hydroxide.

[0320] Color reagent C: 28% (w / v) Potassium carbonate, 6% (v / v) sodium hypochlorite (Sigma-Aldrich 239305-25ml, < 5%available Cl2) .

[0321] Incubation:

[0322] 1. Transfer 15 μL from each well from step (1) into a new 96-well MTP.

[0323] 2. Transfer 45 μL Milli-Q water to each well.

[0324] 3. To each well, add 30μL of color reagent B (on lab table, shake gently by hand to mix) .

[0325] 4. To each well, add 60μL of color reagent A (on lab table, shake gently by hand to mix) .

[0326] 5. To each well, add 60μL of color reagent C (on lab table, shake gently by hand to mix) .

[0327] 6. Color development: Carefully seal the plate and leave it on lab table for 30 minutes.

[0328] 7. Carefully transfer the MTP to a plate reader and measure absorbance at 630 nm.

[0329] Total reaction volume: 210 μL

[0330] Standard curve:

[0331] Standard stock solution: 1000 mg NH4+ / L.

[0332] The standard curve is prepared by adding dilutions of the ammonium standard in the assay dilution buffer in the ammonia detection step. That is, mixing 15 μL diluted ammonia standard with 45 μL water and then adding the color reagents in the order given above; B, A, and C.

[0333] The amount of enzyme producing 1 μmol ammonia per minute at 37℃ is defined as 1 unit (Indophenol Assay Unit; IPA (U) ) :

[0334] where

[0335] which can be shortened to

[0336] where

[0337] · CNH4+ is the ammonia concentration in the reaction solution derived from the ammonium standard curve (i.e., taking into account the dilution of the prediluted ammonium standard solution in the ammonia derivatization step) .

[0338] · 18.04 is the molecular mass of ammonium used for the standard solution.

[0339] · Vreaction is the reaction volume in the well when ammonia is generated (210 μL) .

[0340] · Venzyme is the volume of enzyme solution added to the well when ammonia is generated (10 μL) .

[0341] · VNH3 detection is the reaction volume in the well when ammonia is detected (210 μL) .

[0342] Example 2: Treatment of corn gluten meal using protein deamidase

[0343] Raw Corn gluten meal was obtained from a corn wet milling process as a byproduct from starch production, which contained 54.0% (w / w) water, 27.6% (w / w) corn protein, 13.6 % (w / w) starch and 1.5% (w / w) fiber.

[0344] 50g raw corn gluten meal was diluted into 10%w / w (dry substance weight to total weight) slurry with de-ionic water. The corn gluten meal slurry was homogenized at 8000 rpm blending for 10 minutes with IKA T25 digital ULTRA-TURRAX homogenizer. After homogenization, the pH of the homogenized slurry was adjusted to 7.0 by adding NaOH (6 mol / L) .

[0345] After pH adjustment, 40 g of the homogenized slurry was put into plastic tubes (with 50 mL volume) for three batches. Protein deamidase was added into the two batches of the slurry, which were 6 (Batch 2) and 13.3 (Batch 3) IPA (U) per gram corn protein, respectively. As a control, no protein deamiase was used in Batch 1. Batch 1, Batch 2 and Batch 3 were incubated at 60℃, 150 rpm shaking speed for 60 minutes in Thermo ScientificTM MaxQTM 6000 lab shaker. Afterward, the three batches of slurry were deactivated at 90℃ for 10 minutes by hot water bath. The deactivated slurry was cooled to room temperature and used for analysis of solubility of corn protein and water holding capacity.

[0346] Determination of corn protein content:

[0347] The corn protein content of raw corn gluten meal and supernatants of three batches of deactivated corn gluten meal slurry was determined by LECO FP-528 Nitrogen Analyzer, respectively.

[0348] 0.1 g raw corn gluten meal was weighed and transferred to an empty tin capsule. The capsule was closed carefully with a pincer and ready for protein content determination. The supernatants of three batches of deactivated corn gluten meal slurry were obtained by centrifuging at 15000 g force for 10 minutes. 1 ml supernatant was collected into 1.5 ml Eppendorf tube from each sample, respectively. 100 μL supernatant was pipetted from the Eppendorf tube and transferred to an empty tin capsule. The weight of supernatant was recorded. Then 0.3 g LECO 501-427 aluminum oxide powder (LECO 501-427 aluminum oxide powder was used as adsorbent for samples in liquid form) was added to the capsule then mix well manually. The capsule was closed carefully with a pincer and ready for protein content determination.

[0349] The procedure was to determine the nitrogen content based on combustion of the samples where, mainly CO2, H2O, NOx, N2 are passed through different sorts of “filters” to exclude all but nitrogen. The nitrogen, in a helium carrier, was measured by a thermal conductivity cell. EDTA with nitrogen content of 9.57%was used as calibration standard. 6.25 was used as Nitrogen to protein factor. The protein content was calculated automatically by the computer by using the nitrogen content multiplied by nitrogen to protein factor.

[0350] Determination of relative corn protein solubility:

[0351] Relative Corn protein solubility was calculated by using the protein content of supernatant of the deactivated corn gluten meal slurry divided by the protein content of raw corn gluten meal slurry. The protein content of raw corn gluten meal slurry was calculated by using the protein content of corn gluten meal divided by the dry substance content of corn gluten meal (in Example 2 this value was 46%w / w, which was calculate by using 100%minus the water content, ) and multiplied by the dry substance of raw corn gluten meal slurry (in Example 2 this value was 10%) :

[0352] In the equation:

[0353] PS: relative corn protein solubility.

[0354] Psupernatant: protein content of supernatant of deactivated corn gluten meal slurry.

[0355] PCGM: protein content of corn gluten meal.

[0356] Determination of water holding capacity:

[0357] 5 g deactivated corn gluten meal slurry (with 0.5 g dry substance) of Batch 1, Batch 2 and Batch 3 were diluted to 1.25 % (w / w, dry substance weight to total weight) with de-ionic water using 50 ml plastic tubes. And then such slurries were incubated at 300 rpm for 4 hours at room temperature with a lab shaker. Subsequently, the 3 batches of slurries were centrifuged at 4000 g force for 20 minutes at room temperature. After centrifugation, the supernatant and the wet sediment of the 3 batches were separated, and the wet sediment was left in the bottom of the tube. The sediment is corn gluten residual obtained. The total weights of the wet sediments and tubes were weighed, respectively. After that, the wet sediment together with the tube was dried at 105℃ over night with a hot air oven. After drying, the tubes with dried sediments were weighed.

[0358] The water holding capacity of sediment was calculated by using the difference value of weights between wet sediment and dried sediment divided by dried sediment weight.

[0359] In the equation:

[0360] WHC: water holding capacity.

[0361] Mwet sediment: weight of the wet sediment.

[0362] Mdried sediment: weight of the dried sediment.

[0363] Result and discussion:

[0364] The relative corn protein solubility (%) and water holding capacity (%) of Batch 1, Batch 2 and Batch 3 was determined, see Table 1.

[0365] Table 1 Relative protein solubility and water holding capacity of Batch 1, Batch 2 and Batch 3.

[0366] As can be seen from the results in Table 1, protein glutaminase was amazingly effective in improving the corn protein solubility of the raw corn gluten meal. The relative protein solubility in control batch (Batch 1) was only 7.51%, but when protein glutaminase was used, the relative protein solubility was significantly improved to 42.34%and 68.24%in Batch 2 and Batch 3, respectively. It demonstrated that more soluble corn protein was released from the raw corn gluten compared to the control. With the improved solubility, the corn protein of the supernatants be used alone for a broad applications in food & beverage, for example, production a nutritious beverage with desirable sensory properties. The corn protein of the supernatants can also be used together with the corn gluten residual obtained as corn gluten feed for a better high-protein supplement in feeds for livestock, poultry and pets.

[0367] Besides this, as also can been from the results in Table 1, with the enzymatic treatment in Batch 2 and Batch 3, a higher portion of soluble corn protein was released from the raw corn gluten meal resulted in less corn protein content in the sediment, correspondingly, the weight of the dried sediment in Batch 2 and Batch 3 was less than that of control in Batch 1, but much surprisingly, even with less dry substances (due to less corn protein content) in the dried sediments of Batch 2 and Batch 3, the weight of the wet sediment in Batch 2 and Batch 3 was much higher than that of control in Batch 1. The results in Table 1 demonstrated that the water holding capacity of the corn gluten residual obtained by the treatment of protein glutaminase was significantly improved even if the corn gluten residual contains less corn protein content.

[0368] With the improved water holding capacity, the corn gluten residual obtained can be much suitable for co-formulating with other ingredients for food and / or feed application, for example, the corn gluten residuals obtain can be used alone or together with soluable corn protein for food application, or as a high-quality corn gluten feed for livestock, poultry and pets.

[0369] Also, the results in Table 1 demonstrated that the protein solubility and / or water holding capacity of the enzmaticlly treated corn gluten meal were significantly improved.

[0370] Typically, without the centrifugation process mentioned in the example or other kinds of separation process of corn protein from corn gluten meal, the enzymatically treated slurry obtained from raw corn gluten meal in the example can be further dried or at least partially dried, such enzymatically treated corn gluten meal as a whole can be used as corn gluten feed or for incorporation into food-grade applications.

[0371] Example 3: Treatment of corn gluten meal using protein deamidase with and without washing

[0372] Fresh raw corn gluten meal was obtained from a corn wet milling process as a byproduct from starch production and contained 55.4% (w / w) water, 29.6% (w / w) corn protein, 9.12 % (w / w) starch and approximately 1.5% (w / w) fiber.

[0373] 400g corn gluten meal was diluted with de-ionic water to make a 15%w / w (dry substance weight to total weight) slurry. The slurry was homogenized at speed 8 for 3 minutes using a Thermomix machine (Vorwerk Thermomix TM6) . The homogenized slurry was adjusted to pH 7.0 by adding NaOH (6 mol / L) . Then, the slurry was diluted into two aliquot portions having the same weight. For portion 1, the slurry was hydrated (washing treatment) at ambient temperature with continuous stirring for 30 minutes. Following hydration, portion 1 was centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes using a benchtop centrifuge (Sorvall ST40, Thermo Scientific) . To the recovered pellet, DI water was added to reach a DS of 15%w / w (dry substance to total weight) . No washing treatment was adopted on portion 2.

[0374] For both portion 1 and 2, 1%m / m (enzyme product to total dry matter) BAN 480L was added to the slurry. Then, the two portions were incubated at 90℃ for 30 minutes, followed by cooling to around 60℃ to prepare the portions for the protein deamidase treatment.

[0375] Portion 1 was divided into ten aliquots with numbering 1 to 10. Portion 2 was divided into seven aliquots with numbering 11 to 17. The information of samples is described in Table 2.

[0376] Table 2 Conditions of protein deamidase treatment for Portion 1 and 2. Y, Yes; N, No; PD, protein deamidase

[0377] For the protein deamidase treatment, the samples were incubated at 60℃, 150 rpm shaking speed in Thermo ScientificTM MaxQTM 6000 lab shaker for time given in Table 2. Inactivation of the protein deamidase was carried out using a hot water bath at 90℃ for 10 minutes. The samples were cooled to room temperature and used for the analysis of corn protein solubility, water holding capacity and emulsifying capacity.

[0378] The protein solubility and water holding capacity was determined using the methods described in Example 2 herein. Emulsifying capacity was determined using the method described below.

[0379] Determination of emulsifying capacity

[0380] The emulsifying capacity of corn protein was calculated by measuring the shift of conductivity of the protein solution. Emulsifying capacity was determined at the inversion point where an oil-in-water emulsion turns into a water-in-oil emulsion as indicated by a sudden drop in conductivity. Emulsifying capacity was expressed as g of oil homogenized per g of protein before the inversion was observed.

[0381] 0.25% (w / w) protein solution was prepared by dispersing 0.1 g corn protein into a mixture of 20 g 50mg / L NaCl solution and 20 g rapeseed oil. The mixture was treated with high-performance homogenizer (IKA T25 digital Ultra Turrax) blending for 1 minute at 7 krpm. The conductivity of the resulting emulsion was measured immediately after homogenization using a portable conductivity meter (Mettler Toledo SevenEasy) . Rapeseed oil was dripped into the emulsion with continuous homogenization while monitoring for the conductivity shift. At the point of emulsion, i.e. shift from oil-in-water to water-in-oil emulsion, a sudden drop in conductivity could be observed. The oil consumption amount was recorded.

[0382] The emulsifying capacity can be expressed as:

[0383] wherein in the equation:

[0384] moil: weight of oil consumed, i.e. summation of the initial 20 g plus the oil dripped into the emulsion before emulsion shift was observed,

[0385] Pdried corn protein: protein content of dried corn protein.

[0386] Results and discussion

[0387] The functionality indexes of samples 1-17 are provided in Table 3 below.

[0388] Table 3 Relative protein solubility, water holding capacity and emulsifying capacity of samples 1-17.

[0389] As can be seen from at least the results in Table 3, protein solubility, water holding capacity and emulsifying capacity of corn protein was improved with protein deamidase treatment with and without a washing step. In particular for samples 1-10, in which the corn material was subjected to a washing step before protein deamidase treatment, a significant improvement was observed in protein solubility, at all the tested enzyme incubation times (1h, 2h, and 4h protein deamidase incubation) . The improvement in protein solubility is seen at least from comparing, e.g., sample 10 (washing) with sample 17 (no washing) , wherein a much higher protein solubility was observed for sample 10. The same trend can be confirmed when comparing sample 5 with sample 14 and sample 7 with sample 15.

[0390] Without wishing to be bound by any particular theory, the inventors believe that the by washing the corn protein material prior to protein deamidase treatment an improved enzyme efficiency can be achieved. That is, after pre-washing of the material comprising corn protein, even if there was a loss of soluble protein, the remaining fraction could still achieve the same effect under the action of less protein deamidase as the unwashed raw material under the action of higher enzyme dosage. This is of great relevance to manufacturers of corn protein in that a lower dosing and / or enzyme incubation time can be employed without affecting the functionality of the thus obtained modified corn protein. Thus, a reduction in cost and time of manufacturing corn protein can be achieved. In particular applications, a pre-washing step is suggested to enable better properties of the corn protein, for example, lower background microbial level, more natural pH and general smell.

[0391] Example 4: Effect of lactic acid on enzymatic deamidation of corn protein

[0392] To investigate the factors inhibiting protein deamidase performance in corn, lactic acid was examined due to its high abundance in corn. To maintain a stable pH, the pH drop induced by lactic acid was corrected using a 0.5M phosphate buffer. All tested samples were maintained at a reaction pH of 7.0. The buffer was prepared as follows: the desired amount of lactic acid was added to a 0.5M disodium hydrogen phosphate solution (PBS buffer) , and the pH was adjusted to 7.0 using NaOH.

[0393] Pea protein isolate was selected for this study as it is free of lactic acid. A 10%dry matter (DS) solution of pea protein isolate (Pisane C9, protein content 79%) was prepared in phosphate buffer, with or without lactic acid, and mixed using a magnetic stirrer. Protein deamidase was added at concentrations of 0, 2, and 6 IPA (U)  / g protein. The mixtures were incubated at 60℃ for 1 hour in a FINEPCR combi-D24 Rotisserie with a rotation speed set at 7. Following incubation, the samples were heat treated at 85℃ for 10 minutes.

[0394] Protein Solubility Measurement:

[0395] Protein solubility was measured in the supernatant of each sample after centrifugation at 15,000 g for 10 minutes. Protein content was then determined using a LECO analyzer, which employs the Dumas method (combustion, reduction, and detection of nitrogen as N2 using a conductivity detector) . The protein factor used was 6.25.

[0396] As can be seen from the data shown in Table 4, it was observed that when the concentration of lactic acid reached 5 g / L, the performance of protein deamidase was negatively impacted. The dose-response effect was less pronounced compared to samples with no lactic acid or 1 g / L lactic acid in the solution.

[0397] Without the wish of being bound by any particular theory, it is postulated that the improved protein deamidase efficiency report in at least Example 3 herein, wherein the addition of washing step before the protein deamidase treatment was shown to result in improved enzyme efficiency, may be partially explained by removal of some of the lactic acid present in the raw corn material used. This hypothesis is supported at least by the findings shown in Example 3 and 4 disclosed herein.

[0398] Table 4 Cosucra Pisane C9 solubility improvement with protein deamidase w / w. o lactic acid. CTRL, control; PD, protein deamidase; DS, dry matter; PPI, pea protein isolate.

[0399] Example 5 Effect of washing for removal of organic acids in corn material

[0400] This experiment was performed using fresh corn protein cake to quantify how much organic acids can be removed by washing at certain conditions. The purpose of the experiment was to identify which or which category component can be the inhibitor of protein deamidase in corn protein.

[0401] Washing process and organic acids analysis:

[0402] Corn protein cake was collected from a starch wet milling process. The cake was diluted to 15%DS and adjusted to pH ～7 with 6M NaOH. After 30 minutes hydration at 150rpm shaking at 60℃, the slurry was centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes using a benchtop centrifuge (Sorvall ST40, Thermo Scientific) . The pellet was collected and blended to uniform. The uniform pellet was labeled ‘corn protein with one washing’ and a sample was kept for the organic acid analysis.

[0403] A new sample was prepared using the ‘corn protein with one washing’ , which was washed again as described above. After centrifugation, the pellet of this sample was labeled ‘corn protein with two washings’ .

[0404] The organic acids content in corn protein cake (no washing) , ‘corn protein with one washing’ and ‘corn protein with two washings’ were analyzed using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) . For the analysis, 1.00 gram of each sample was accurately weighed, to which 25mL of distilled water containing 5mmol / L H2SO4 was added and extracted with shaking in a water bath at 25℃ for 10 minutes and then static precipitation at 4℃ overnight. Then, the samples were centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes using a benchtop centrifuge. The supernatants were filtered using a 0.2 μm stream filter membrane and used for HPLC analysis.

[0405] The conditions of the HPLC analysis:

[0406] Equipment type: Agilent HPLC 1200

[0407] Column: Biorad Aminex HPX-87H

[0408] Flow rate: 0.60 mL / min.

[0409] Mobile phase: 5mM H2SO4 (in water) , 0.2μm filtered and degassed

[0410] Column temperature: 65℃

[0411] Injection volume: 10.0 μL

[0412] Run Time: 50 minutes

[0413] Detection: Refractive Index (RI) 50C

[0414] Formic acid, acetic acid and lactic acid in the three samples were identified and quantified. The amount of these three organic acids were convert into gram per kilogram dried corn protein substrate for standardization. The results from the HPLC analysis is shown in Table 5 below.

[0415] Table 5 Amount of organic acids in corn protein cake with or without washing. The amounts of organic acids is given in gram organic acid per dried kg corn protein substrate.

[0416] The findings reported in Example 5 clearly shows that washing treatment can significantly reduce or even remove organic acids present in raw corn material.

[0417] Taken together with the findings reported in Example 4, i.e., that protein deamidase treatment is negatively affected by at least the presence of lactic acid in the corn material, the present inventors believe that by subjecting corn raw material, such as corn gluten cake, to at least one washing step before the protein deamidase treatment, this can lead to a significant boost of the enzyme performance.

Claims

1.A method of improving water holding capacity, protein solubility and / or emulsifying capacity of a material comprising corn protein, which comprises treating the material with a protein deamidase.2.The method according to claim 1, wherein the protein deamidase is a protein glutaminase.3.The method according to claim 1 or 2, wherein the material further comprises starch and / or fiber, preferably corn starch and / or corn fiber.4.The method according to any of the preceding claims, wherein the material is selected from corn gluten meal, corn protein concentrates and corn protein isolates.5.The method according to any of the preceding claims, wherein the material is a byproduct from starch production which are obtained by corn wet milling.6.The method according to claim 5, wherein the material is corn gluten meal produced by wet milling and is not dried prior to the enzymatic treatment with the protein deamidase.7.The method according to any of the preceding claims, wherein the enzymatic treatment is carried out under a condition with a pH in a range of 3.0-10.0, such as with a pH in a range of 4.5-9.0, preferably a pH in a range of 5.0-8.0.8.The method according to any of the preceding claims, wherein the material is subjected to a washing step before treatment with the protein deamidase.9.The method according to claim 8, wherein the washing step is performed at:a pH in the range of 3.0-10.0;a temperature in the range of 15-99℃; andfor a duration of 10 minutes to 5 hours.10.The method according to any of claims 8-9, wherein the liquid used for the washing treatment is removed by centrifugation, decanting, and / or filtration.11.The method according to any of the preceding claims, wherein the enzymatically treated material has improved emulsifying capacity, water holding capacity and / or improved corn protein solubility compared to a material obtained using the same method but without the use of a protein deamidase.12.The method according to any of the preceding claims, wherein the enzymatically treated material is at least partially dried, preferably dried.13.The method according to claim 12, wherein the at least partially dried material has improved emulsifying capacity, water holding capacity and / or improved corn protein solubility compared to a material obtained using the same method but without the use of a protein deamidase.14.A method of treating a material comprising corn protein and starch, preferably corn starch, which comprises treating the material with a protein deamidase.15.The method according to claim 14, wherein the protein deamidase is a protein glutaminase.16.The method according to claim 14 or 15, wherein the material further comprises fiber, preferably corn fiber.17.The method according to any of claims 14-16, wherein the material is corn gluten meal, which preferably is a byproduct from starch production which are obtained by corn wet milling.18.The method according to any of claims 14-17, wherein the enzymatically treated material has improved emulsifying capacity, water holding capacity and / or improved corn protein solubility compared to a material obtained using the same method but without the use of a protein deamidase.19.The method according to any of claims 14-18, wherein the enzymatic treatment is carried out under a condition with a pH in a range of 3-10.0, such as with a pH in a range of 4.5-9.0, preferably a pH in a range of 5.0-8.0.20.The method according to any of claims 14-19, wherein the material is subjected to a washing step before treatment with the protein deamidase, optionally wherein the washing step is performed at:a pH in the range of 3.0-10.0;a temperature in the range of 15-99℃;for a duration of 10 minutes to 5 hours, andoptionally wherein the liquid used for the washing treatment is removed by centrifugation, decanting, and / or filtration.21.The method according to any of claims 14-20, further comprising treating the material with one or more hydrolyzing enzymes selected from the group of cellulases, pectinases, hemicellulases, xylanases, beta-glucanases, mannanases, glucanases, glucoamylases, iso-amylases, alpha-amylases, pullulanase, beta-amylases, and mixtures thereof, preferably wherein the one or more hydrolyzing enzymes selected from the group a cellulase, a hemicellulase, an alpha-amylase, a pullulanase, a xylanase, or any combination thereof.22.The method according to claim 21, wherein the treatment with the one or more hydrolyzing enzyme is carried out before the protein deamidase treatment, and optionally, when dependent on claim 20, wherein the treatment with the one or more hydrolyzing enzyme is carried out during or after the washing step.23.A food or beverage or feed comprising the material obtained by the method according to any of claims 1-22.

Images