A fatty acid derivative for delivering nucleic acid substances and its synthesis method

Abstract

Provided a technology platform for the delivery of nucleic acids, centered around a new chemical entity known as Fatty Acid Derivatives (FADS). FADS can covalently or non-covalently bind to nucleic acid substances, thereby enhancing their stability and effectiveness.

Description

A FATTY ACID DERIVATIVE FOR DELIVERING NUCLEIC ACID SUBSTANCES AND ITS SYNTHESIS METHOD

[0001] CROSS REFERENCE

[0002] This disclosure requires the Chinese patent application "A fatty acid derivative for delivering nucleic acid substances and its synthesis method" submitted on January 29, 2024 (Application No. 202410121149.9) , the entire contents of which are incorporated herein by reference.FIELD OF THE INVENTION

[0003] The present invention belongs to the field of medical biotechnology. The present invention provides a novel lipophilic compound and its derivatives for modifying nucleic acid substances such as long-chain nucleic acids, oligonucleotides, or double-stranded small nucleic acids. The lipophilic compound and its derivatives covalently or non-covalently bind to nucleic acid substances, enhancing their efficacy in vivo, reducing side effects, and improving storage stability.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0004] Nucleic acids serve as carriers of genetic information in living organisms. People have discovered that artificially designed nucleotide sequences of nucleic acids can exhibit different functions in vivo: (1) They can express proteins or peptides within the organism, and these proteins and peptides may possess various physiological functions used for disease prevention and treatment. (2) They can directly interact with the corresponding mRNA within the organism, upregulating or downregulating the expression of downstream functional proteins or enzymes, or activating and inhibiting the activity of downstream functional proteins or enzymes. (3) They can act on pre-mRNA within the organism, editing the generation of downstream mRNA, enabling mRNA expression for therapeutic proteins, enzymes, or peptides to treat diseases. In theory, they can regulate the expression of any gene, thus broadening the scope of their therapeutic applications and potentially tackling genetic diseases and other refractory illnesses that lack effective drugs.

[0005] Compared to conventional drugs that act at the protein level, such as small molecules, antibodies, and proteins, drugs composed of nucleic acids offer a simpler, more efficient, and highly biologically specific development process. In contrast to therapies at the DNA genome level, nucleic acid-based drugs mitigate the risks associated with gene integration in the organism. As a result, their therapeutic applications are more extensive, holding the promise of addressing genetic diseases and other refractory illnesses without available treatments.

[0006] However, the structural instability of nucleic acid substances makes them susceptible to degradation by nucleases present in blood and tissues. Additionally, the hydrophilic and negatively charged nature of nucleic acids hinders their cellular uptake through the cell membrane. Exogenous nucleic acid molecules exhibit immunogenicity, leading to immune clearance in the body.

[0007] Despite chemical modifications of individual nucleotides, such as base modification, sugar modification, and phosphate modification, to create various nucleic acid substances and optimization techniques for nucleic acid sequences, which partially improve their stability in the body and reduce their immunogenicity, safely and effectively delivering nucleic acids, such as long-chain nucleic acids, oligonucleotides, or double-stranded small nucleic acids, to the organism remains the most significant challenge in their application.

[0008] Currently, the primary delivery technologies for nucleic acid drugs, both in the market and under research, include viral vectors, non-covalent carriers like lipid nanoparticles (LNPs) , and covalent carriers like GalNAc (N-Acetylgalactosamine) .

[0009] Viral vectors offer high transfection efficiency and are well-established, finding widespread applications in vaccines and cell therapies. Common viral vectors include retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, and herpes simplex viruses. However, viral vectors also have their limitations, including significant cytotoxicity, immunogenicity, and biological safety risks.

[0010] LNP carrier technology involves the non-covalent assembly of lipid molecules into nanosized particles with a structure resembling the cell membrane. LNPs with positively charged amino groups can form nanoparticles by binding to negatively charged nucleic acids, thereby enhancing the stability of mRNA molecules for in vivo nucleic acid delivery. Upon reaching the cell membrane, the cationic lipids trigger membrane fusion with the negatively charged cell membrane, leading to endocytosis and internalization into the cell. Following lysosomal degradation, the slightly acidic environment protonates some lipids, leading to LNP′s disruption and the release of physiologically active mRNA. While LNP′s transfection efficiency is lower than viral vectors, it exhibits good biological safety and is relatively mature technologically. Similar techniques have been widely used in anti-tumor small molecule drugs such as Doxil and Onivyde. Recently, LNP has seen successful application in nucleic acid drugs like COVID-19 vaccines, including Moderna′s mRNA-1273 and Pfizer-BioNTech′s BNT162b2. However, LNP-based nucleic acid drugs suffer from poor storage stability, requiting storage at temperatures below -20 degrees Celsius with a shelf life of only about one year.

[0011] GalNAc carrier technology involves covalent modification of nucleic acid drugs by attaching a sugar compound with three galactose units at the head and linking it to the 3′ end of the nucleic acid chain. GalNac-RNA exhibits high affinity for asialoglycoprotein receptors (ASGPR) in the liver. ASGPR is a multitude of endocytic receptors that exist solely on parenchymal liver cells, specifically recognizing and binding to GalNAc. After binding with ASGPR on the liver cell surface, GalNac enters the cell through endocytosis, forming endosomes, thereby delivering nucleic acid drugs into the cell and releasing them within the liver cells to achieve the therapeutic effect. GalNac has found successful application in multiple marketed and investigational nucleic acid drugs, such as Givlaari, inclisiran, and lumasiran developed by Alnylam Pharmaceuticals, used for treating various diseases. However, GalNac has the drawback of requiring large dosages (250mg per administration) , which may lead to hepatotoxicity and other adverse reactions.

[0012] Overall, these diverse delivery technologies for nucleic acid drugs have their strengths and limitations, necessitating ongoing research and development to enhance their safety, efficacy, and stability for broad clinical applications.SUMMARY OF THE INVENTION

[0013] In order to solve the problems of the prior art, the present invention first provides a FADS derivative as shown in Formula 1:

[0014] wherein:

[0015] R1 is a lipophilic fragment, and m is 1, 2, or 3;

[0016] R2 is any m+1 valent linking group;

[0017] R3 is a hydrophilic fragment;

[0018] H1 is selected from:

[0019] 1) phosphoric acid groups, thiophosphoric acid groups, carboxyl COOH, amino NH2, hydroxyl or thiol groups, or their protected or activated forms;

[0020] 2) phosphoryl groups:

[0021] 3) Cyclic linking group

[0022] wherein Cy is an optionally substituted five-or six membered carbon ring or a five-or six membered heterocyclic ring containing one or two heteroatoms (oxygen or nitrogen) , such as

[0023] 4) Non cyclic linking group

[0024] wherein, G1 or G2 is independently selected from H, hydroxyl protecting groups such as DMTr, phosphonyl groups defined in 2) above,

[0025] where CPG is a solid support, preferably controllable pore size glass beads;

[0026] R1、 R2、 R3, and H1 can be connected to each other via any functional group; Preferably, connected via amide or ether groups.

[0027] In specific embodiments of the present invention, R1 is a substituted or unsubstituted C2-30 alkyl, C2-30 alkene, or C2-30 alkynyl group;

[0028] In the specific embodiments of the present invention, m is 1, and R2 is a substituted or unsubstituted C1-10 alkylene, C2-10 alkynylene, or C2-10 alkynylene group;

[0029] In specific embodiments of the present invention, m is 2, and R2 is a C1-10 alkylidene group, C2-10 alkenylenyl group, C2-10 alkynylidene group, or an amino acid residue derived from a side chain with reactive groups such as lysine, glutamic acid, or aspartic acid. For example:

[0030] In the specific embodiments of the present invention, R3 is a group containing a polyethylene glycol fragment.

[0031] Preferably, R1 is derived from an optionally substituted fatty acid group, R1 is connected to R2 via an amide, and R1 is preferably:

[0032] Wherein, n, n1, n2, n3, n4, and n5 are independently integers from 0 to 100; Preferably, n or the sum of n1-n5 is an integer selected from 4-30, further preferably an integer from 8-22.

[0033] Preferably, R2 is an optionally substituted C2-C6 alkylene group, and the substituent group can be selected from OH, NH2, or C1-C4 alkyl.

[0034] Preferably, R3 contains 2-20 ethoxy units, and further preferably, containing 4-10 ethoxy units; Further preferably, every 2 or 3 ethoxy units in R3 are separated by amide bonds.

[0035] Further preferred, R3 is:

[0036] wherein, n6 is an integer from 1 to 9, preferably an integer from 1 to 4 (specifically 1, 2, 3, or 4) ;

[0037] Preferably, R2 and R3 are connected by an amide bond.

[0038] Preferably, the FADS compound is a FADS monomer:

[0039] Preferably, the FADS compound is a FADS coupled solid-phase carrier (FADS-CPG) :

[0040] The second aspect of the present invention provides a modified nucleotide or nucleic acid molecule (Formula II) , comprising:

[0041] preferably

[0042]

[0043] preferably:

[0044] preferably:

[0045]

[0046] wherein the O in the phosphate group can be optionally replaced by S.

[0047] wherein X3 is a nucleotide or nucleic acid molecule.

[0048] The nucleotide is selected from uracil nucleotides, thymine nucleotides, cytosine nucleotides, 5-methylcytosine nucleotides, adenine nucleotides, or guanine nucleotides.

[0049] The nucleic acid molecule is selected from small interfering RNA, microRNA, alternative splicing body, single stranded RNA, double stranded RNA, antisense nucleic acid, nucleic acid aptamer, mRNA or DNA.

[0050] Preferably, the nucleic acid molecule has 2 or 3 consecutive modifications at the 5 ′or 3′ end, for example:

[0051] Preferably, each nucleic acid molecule binds 1-6 (specifically: 1, 2, 3, 4, 5, or 6) compound (s) of formula I mentioned above.

[0052] In the specific embodiments of the present invention, the nucleic acid molecule further comprises other modifications, including but not limited to the following modifications: locked nucleic acid modification, ring opening or non-locked nucleic acid modification, 2′-methoxyethyl modification, 2′-O-methyl modification, 2′-O-allyl modification, 2′-C-allyl modification, 2′-fluoro modification, 2′-deoxy modification, 2′-hydroxy modification, or thiophosphate backbone modification.

[0053] In a preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid molecule is an siRNA molecule that inhibits the expression of a target gene, comprising a sense chain and an antisense chain that complement each other to form a double stranded region; the sense chain and / or the antisense chain comprises 15-25 nucleotides or is composed of 15-25 nucleotides; the antisense chain is completely or partially complementary to at least 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, or 25 consecutive nucleotides of the target gene; the length of the double stranded region is 15-25 bp, and at least one nucleotide in the siRNA molecule contains the modification of a compound of formula I.

[0054] The target genes include but are not limited to: ANGPTL3, PCSK9, ApoB, ApoC, FVII, AGT, Lp (a) , XDH, HSD17B13, SCD1, PNPLA3, HMGCR, etc.

[0055] The target genes also include genes encoding core proteins, viral polymerases, surface antigens, e-antigens, or functional fragments of X proteins in HAV, HBV, HCV, HDV, and HEV.

[0056] The third aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a nucleotide or nucleic acid molecule modified in the second aspect.

[0057] The fourth aspect of the present invention provides an use of the modified nucleotide or nucleic acid molecule or the aforementioned pharmaceutical composition in the preparation of a drug for preventing and / or treating physiological conditions or diseases caused by the expression of specific genes.

[0058] The specific genes include but are not limited to: ANGPTL3, PCSK9, ApoB, ApoC, FVII, AGT, Lp (a) , XDH, HSD17B13, SCD1, PNPLA3, HMGCR, etc.

[0059] The specific genes further include encoding genes of functional fragments of core proteins, viral polymerases, surface antigens, e-antigens, or of X proteins of HAV, HBV, HCV, HDV, HEV.

[0060] Furthermore, in the use provided by the present invention, the disease is chronic liver disease, hereditary transthyretin (hATTR) amyloidosis, hepatitis, liver fibrosis disease, liver proliferative disease, liver cancer, hypertension, and other dyslipidemia diseases.

[0061] The fifth aspect of the present invention provides a method for preventing and / or treating physiological conditions or diseases caused by the expression of specific genes, comprising administering the modified nucleotide or nucleic acid molecule or drug combination to individuals in need.

[0062] The sixth aspect of the present invention provides a method for preparing 3′ modified FADS siRNA, comprising the following steps: synthesizing nucleic acid molecules using an optional FADS modified solid-phase carrier, and then adding FADS monomers optionally; after the reaction is completed, the synthesized sequence is cleaved from the carrier and optionally annealed to obtain modified nucleic acid molecules.

[0063] The present invention also provides a method for preparing 3′ modified FADS-ASO, which comprising the following steps: synthesizing ASO using a solid-phase carrier, and then adding FADS monomer to connect to the 3′ end of ASO; subsequently, the synthesized FADS-ASO was cleaved from the carrier.

[0064] The present invention also provides a method for preparing FADS-siRNA-FADS with modifications at the 5 ′and 3′ ends, which comprising synthesizing siRNA using a modified solid-phase carrier (FADS-CPG) and then adding FADS monomer; after the reaction is completed, the synthesized sequence is cleaved from the carrier and annealed to obtain double modified FADS siRNA FADS.

[0065] The present invention also provides a method for preparing FADS-ASO with modifications at the 5 ′and 3′ ends, comprising synthesizing ASO using a solid-phase carrier (FADS-CPG) and then adding FADS monomer; cut the synthesized sequence from the carrier to obtain double modified FADS-ASO-FADS.

[0066] The seventh aspect of the present invention provides a composition comprising nucleic acid molecules, wherein the composition comprises the FADS compound as described above, phospholipids, and cholesterol.

[0067] In the specific embodiments of the present invention, the composition is a liposome or LNP.

[0068] The nucleic acid molecule comprises small interfering RNA, microRNA, alternative spliceosome, single stranded RNA, double stranded RNA, antisense nucleic acid, nucleic acid aptamer, mRNA or DNA.Brief Description of the Drawings

[0069] Figure 1 shows the synthesis procedure of FADS-CPG solid-phase support.

[0070] Figure 2 shows the LC-MS spectrum of FADS.

[0071] Figure 3 shows the HPLC chromatogram of FADS.

[0072] Figure 4 shows the HNMR result of FADS

[0073] Figure 5 shows the schematic representation of FADS modification at the 5′ end of nucleic acid.

[0074] Figure 6 shows the LC-MS spectrum of SS

[0075] Figure 7 shows the LC-MS spectrum of AS

[0076] Figure 8 shows the UPLC chromatogram of SS.

[0077] Figure 9 shows the UPLC chromatogram of AS.

[0078] Figure 10 shows the cellular uptake of FADS-siRNA in HepG2 cells.

[0079] Figure 11 shows the interference efficiency of FADS-siRNA on intracellular PCSK9.

[0080] Figure 12 shows the proportion of drug distribution in various tissues.

[0081] Figure 13 shows the synthesis procedure of FADS monomer.

[0082] Figure 14 shows the schematic representation of FADS modification at the 3′ end of nucleic acid.

[0083] Figure 15 shows the schematic representation of FADS modification at the 5′ end of ASO.

[0084] Figure 16 shows the schematic representation of FADS modification at both 5′ and 3' ends of siRNA.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0085] This invention provides a novel technology platform for the delivery of nucleic acids, centered around a new chemical entity known as Fatty Acid Derivatives (FADS) . FADS can covalently or non-covalently bind to nucleic acid substances, thereby enhancing their stability and effectiveness. The nucleic acids included in this context are long-chain nucleic acids, oligonucleotides, or double-stranded small nucleic acids. The patent details the structural features of FADS, its structural confirmation, synthesis methods, and basic approaches for binding with nucleic acids. Additionally, comprehensive comparative experiments with LNP and GalNac systems are presented, including in vitro cell targeting experiments, in vitro nucleic acid efficacy experiments, in vivo tissue distribution experiments, and in vivo target mRNA knockdown experiments.

[0086] The experimental results demonstrate that FADS can improve the stability and effectiveness of nucleic acids both in vitro and in vivo. Under the same dosage, FADS exhibits significantly higher target tissue distribution than LNP and GalNac carriers, and its knockdown effect on target mRNA is notably superior to LNP and GalNac technologies.

[0087] In order to achieve the objectives of this invention, the technical solution is a fatty acid derivative (FADS) for the delivery of nucleic acid substances, along with its synthesis method.

[0088] The fatty acid derivative (FADS) for nucleic acid delivery has a structure of X1:

[0089] wherein,

[0090] R1 is selected form the group consisting of

[0091] R2 is selected from the group consisting of

[0092] R3 is

[0093] wherein n, n1, n2, n3, n4 and n5 are each independently an integer of from 0 to 100.

[0094] The present invention further provides a FADS-linked nucleic acid, wherein the FADS is as described above, and a structure of the FADS-linked nucleic acid is X1-X2-X3 as follows:

[0095] wherein X1 is FADS, X2 is a linking moiety, and X3 is nucleic acid.

[0096] The FADS can be connected to the 5′ and 3′ ends of nucleic acid X3 or simultaneously at both ends.

[0097] The FADS can modify nucleic acids such as oligonucleotides, siRNA, shRNA, mRNA, and DNA.

[0098] The composition of the nucleic acid X3 delivered by the FADS includes ribonucleic acid (RNA) , deoxyribonucleic acid (DNA) , nucleotide analogs, and nucleotides with various modifications.

[0099] In the technical solution of the present invention, the structure of R3 in FADS is represented as follow,

[0100] wherein can be any number from 0 to 100.

[0101] In the technical solution of the present invention, R1 of FADS can be a saturated fatty acid with a structure as follow:

[0102] wherein n is any number from 1 to 100.

[0103] Alternatively, R1 can be a carboxylic acid derivative of a saturated fatty acid with a represented structure as follow:

[0104] wherein can be any number from 1 to 100.

[0105] Another option for R1 is an amino derivative of a saturated fatty acid with a represented structure as follow:

[0106] wherein can be any number from 1 to 100.

[0107] Moreover, R1 can be an unsaturated fatty acid, and its structure is represented as:

[0108] wherein n1 is any number from 1 to 100; n2 is any number from 1 to 100; n3 is any number from 0 to 100; n4 is any number from 0 to 100; n5 is any number from 0 to 100.

[0109] R1 can be a carboxylic acid derivative of unsaturated fatty acids, represented as:

[0110] wherein n1 is any number from 1 to 100; n2 is any number from 1 to 100; n3 is any number from 0 to 100; n4 is any number from 0 to 100; n5 is any number from 0 to 100.

[0111] R1 can be an amino derivative of unsaturated fatty acids, represented as:

[0112] wherein n1 is any number from 1 to 100; n2 is any number from 1 to 100; n3 is any number from 0 to 100; n4 is any number from 0 to 100; n5 is any number from 0 to 100.

[0113] In the technical solution of the present invention, R2 can be a structure represented as:

[0114] In the technical solution of the present invention, the FADS used for delivering nucleic acid substances, as described in this invention, can be modified on nucleic acids through solid-phase synthesis. Specifically, the X1 fatty acid derivative is applied on a solid-phase carrier for nucleic acid synthesis. The structure of the solid-phase carrier is as follows:

[0115] wherein, R1, R2 and R3 are as defined above.

[0116] The synthesis steps of the solid-phase carrier for the fatty acid derivative (FADS) used for delivering nucleic acid substances are provided in the example.

[0117] The FADS, used for delivering nucleic acid substances as described in this invention, can be modified on nucleic acids through solid-phase synthesis. Specifically, the X1 fatty acid derivative is used as the synthetic monomer for the modification. The structure of the FADS monomer is as follows:

[0118] wherein, R1, R2 and R3 are as defined above.

[0119] The present invention further provides a method for synthesizing the FADS, wherein the method comprises the steps as follows:

[0120] step (1) : obtaining an intermediate 1 by reacting fatty acid with 4-aminobutyl methacrylate, step (2) : obtaining an intermediate 2 by hydrolyzing the intermediate 1,

[0121] step (3) : obtaining an intermediate 3 by reacting the intermediate 2 with (3R, 5S) -5- { [Bis (4-methoxyphenyl) (phenyl) methoxy] methyl} pyrrolidine-3-ol) , and step (4) : obtaining the FASD by reacting the intermediate 3 with succinic anhydride.

[0122] The synthesis steps of the monomer for the fatty acid derivative (FADS) used for delivering nucleic acid substances are provided in the example.

[0123] The FADS can be used for both covalent and non-covalent modifications of nucleic acids. That is, the FADS is covalently or non-covalently modifying nucleic acids.

[0124] The nucleic acids delivered by the FADS can be used for the treatment of in vivo diseases, and the administration methods include injection, oral administration, and topical administration.

[0125] The present invention further provides use of the FADS, the FADS-linked nucleic acid, the FADS monomer or the solid phase support in the treatment of in vivo disease, wherein, the disease is a genetic disease.

[0126] In one embodiment, the present invention proposes a synthesis method for preparing a solid-phase carrier of stearic acid derivatives (FADS) . The method includes the following steps: intermediate 1 is obtained from the reaction of stearic acid, intermediate 2 is obtained from hydrolysis and other reactions of intermediate 1, intermediate 3 is generated through continued reactions of intermediate 2, intermediate 4 is obtained by reacting intermediate 3 with succinic anhydride, and intermediate 4 is coupled with aminomodified controlled-pore glass beads to yield a solid-phase support with fatty acid derivative side chains, for subsequent nucleic acid synthesis.

[0127] Intermediate 1: 4-Hydrogenated tallow acylamino butyric acid

[0128] Intermediate 2: 10, 19, 24-Trioxo-3, 6, 12, 15-tetraoxa-9, 18, 23-triazatetracosane acid

[0129] Intermediate 3: N- ( (1- (2S, 4R) -2- (bis (4-methoxyphenyl) methyl) oxymethyl) -4-hydroxypyrrolidin-1-yl) -1, 10, 19-trioxo-3, 6, 12, 15-tetraoxa-9, 18-diazabicyclo [22.2.2] docosan-22-yl) hydrogenated tallow amide

[0130] Intermediate 4: 4- ( ( (3R, 5S) -5- ( (bis (4-methoxyphenyl) methyl) oxymethyl) oxolan-3-yl) methoxy) oxobutanoic acid

[0131] In another embodiment, the present invention further proposes a synthetic method for preparing 5′-modified FADS-siRNA, which comprises the following steps: using the solid-phase support FADS-CPG, synthesize siRNA, and then cleave the synthesized sequence from the support, followed by annealing to obtain FADS-siRNA.

[0132] In a further embodiment, the present invention further proposes a synthetic method for preparing 5′-modified FADS-ASO, which comprises the following steps: using the solid-phase support FADS-CPG, synthesize ASO, and then cleave the synthesized FADS-ASO from the support.

[0133] In still another embodiment, the present invention further proposes a synthetic method for preparing fatty acid derivative (FADS) monomers, which comprises the following steps: Stearic acid undergoes a reaction to yield intermediate 1, which is further subjected to hydrolysis and other reactions to obtain intermediate 2. Intermediate 2 continues to react to generate intermediate 3, which reacts with N, N-diisopropylethylamine to yield monomer 4. The specific synthesis steps are shown in the figure below.

[0134] Intermediate 1: 4-Hydrogenated tallow acylamino butyric acid

[0135] Intermediate 2: 10, 19, 24-Trioxo-3, 6, 12, 15-tetraoxa-9, 18, 23-triazatetracosane acid

[0136] Intermediate 3: N- ( (1- (2S, 4R) -2- (bis (4-methoxyphenyl) methyl) oxymethyl) -4-hydroxypyrrolidin-1-yl) -1, 10, 19-trioxo-3, 6, 12, 15-tetraoxa-9, 18-diazabicyclo [22.2.2] docosan-22-yl) hydrogenated tallow amide

[0137] Monomer 4: (3R, 5S) -5- ( (bis (4-methoxyphenyl) (phenyl) methoxy) methyl) -1- (10, 19, 24-trioxo-3, 6, 12, 15-tetraoxa-9, 18, 23-triazahexacosanoyl) pyrrolidine-3-yl (2-cyanoethyl) diisopropylphosphoramidate

[0138] In a further embodiment, the present invention further provides a method for preparing 3′-modified FADS-siRNA. The method comprises the following steps: using a solid-phase support, synthesizing siRNA, and then adding FADS monomers. After completion of the reaction, the synthesized sequence is cleaved from the carrier, followed by annealing to obtain 3′-modified FADS-siRNA.

[0139] In still a further embodiment, the present invention provides a method for preparing 3′-modified FADS-ASO. The method includes the following steps: using a solid-phase support, synthesizing ASO, and then adding FADS monomers to connect to the 3′ end of ASO. Subsequently, the synthesized FADS-ASO is cleaved from the carrier.

[0140] In one more embodiment, the present invention further provides a method for synthesizing FADS-siRNA-FADS with modifications at both the 5′ and 3′ ends. The method includes using a solid-phase support (FADS-CPG) to synthesize siRNA and then adding FADS monomers. After completion of the reaction, the synthesized sequence is cleaved from the carrier and annealed to obtain double-modified FADS-siRNA-FADS.

[0141] In still another embodiment, the present invention provides a method for synthesizing FADS-ASO with modifications at both the 5′ and 3′ ends. The method includes using a solid-phase support (FADS-CPG) to synthesize ASO and then adding FADS monomers. The synthesized sequence is cleaved from the carrier to obtain double-modified FADS-ASO-FADS.

[0142] Furthermore, the present invention proposes a method for preparing a non-covalent delivery platform of nucleic acids using FADS. The method involves mixing FADS, phospholipids, and cholesterol to prepare liposomes containing nucleic acids.

[0143] Definitons

[0144] is a covalent linking site for the functional group.

[0145] The terms “optional” , “any” , “optionally” or “arbitrarily” refer to events or conditions that may but are not necessarily described subsequently, and the description includes situations where the event or condition occurs and situations where the event or condition does not occur.

[0146] The term “oxo” refers to the substitution of two hydrogen atoms with the same substitution by the same oxygen atom to form a double bond.

[0147] Unless otherwise specified, the term “alkyl” refers to a monovalent saturated aliphatic hydrocarbon group, consisting of straight or branched chain groups containing 1-30 carbon atoms, preferably containing 4-28 carbon atoms (i.e. C6-24 alkyl) , and further preferably containing 10-24 carbon atoms (C10-18 alkyl) .

[0148] Unless otherwise specified, the term “vinyl” refers to an unsaturated aliphatic hydrocarbon group consisting of carbon atoms and hydrogen atoms, either straight or branched, with at least one double bond. The vinyl group can contain 2-30 carbon atoms, preferably 6-24 carbon atoms (i.e. C6-24 vinyl) , and further preferably 10-18 carbon atoms (C10-18 vinyl) .

[0149] Unless otherwise specified, the term “alkynyl” refers to an unsaturated aliphatic hydrocarbon group consisting of a straight or branched chain of carbon and hydrogen atoms, with at least one triple bond. The alkynyl group can contain 2-30 carbon atoms, preferably 6-24 carbon atoms (i.e. C2-10 alkynyl group、 C6-24 alkynyl group) .

[0150] The term “C1-10 alkylene” refers to a divalent group formed by removing another hydrogen from the C1-10 alkyl group, and can be substituted or unsubstituted. In some implementation schemes, C1-4 alkyls, C2-4 alkyls, and C1-3 alkyls are preferred. The unsubstituted alkyls include but are not limited to: methylene (-CH2-) , ethylene (-CH2CH2-) , propylene (-CH2CH2CH2-) , butylene (-CH2CH2 CH2CH2-) , pentene (-CH2CH2CH2CH2CH2-) , hexamethylene (-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-) , and so on. Exemplary substituted alkyls, such as those substituted by one or more alkyl (methyl) groups, including but not limited to: substituted methylene (-CH (CH3) -, -C (CH3) 2-) , substituted ethylene (-CH (CH3) CH2-, -CH2CH (CH3) -, -C (CH3) 2CH2-, -CH2C (CH3) 2-) , substituted propylene (-CH (CH3) CH2CH2-, -CH2CH (CH3) CH2-, -CH2CH2CH (CH3) -, -C (CH3) 2CH2CH2-, -CH2C (CH3) 2CH2-, -CH2CH2C (CH3) 2-) , and so on.

[0151] The term "C2-10 alkenylene" refers to a divalent functional group formed by removing another hydrogen from the C2-10 alkenyl group, and can be substituted or unsubstituted. In some implementation schemes, C2-4 alkenylene is particularly preferred. Exemplary unsubsfituted alkenylene groups include but are not limited to: vinylene (-CH=CH-) and propylene (e.g., -CH=CHCH2-, -CH2-CH=CH-) . Exemplary substituted alkenylenes, such as those substituted by one or more alkyl (methyl) groups, include but are not limited to: substituted ethylene (-C (CH3) =CH-, -CH=C (CH3) -) , substituted propylene (-C (CH3) =CHCH2-, -CH=C (CH3) CH2-, -CH=CHCH (CH3) -, -CH=CHC (CH3) 2-, -CH (CH3) -CH=CH-, -C (CH3) 2-CH=CH-, -CH2-C (CH3) =CH-, -CH2-CH=C (CH3) -, and so on.

[0152] The term “C2-10 alkynylene" refers to a divalent functional group formed by removing another hydrogen from the C2-10 alkynyl group, and can be substituted or unsubstituted. In some implementation schemes, the C2-4 alkynyl group is particularly preferred. Exemplary alkynyl groups include but are not limited to: acetylene (-C≡C-) , substituted or unsubstituted acetylene (-C ≡ CCH2-) , and so on.

[0153] The term “optional substitution” used in the present invention refers to the corresponding group being unsubstituted or substituted with a substituted group, including hydroxyl, carboxyl, C1-4 linear or branched alkyl, amino, cyano, halogen, oxo, nitro, amide, or oxo C1-4 linear or branched alkyl.

[0154] The term “fatty acid” refers to a carboxylic acid with an aliphatic chain, which can be saturated or unsaturated. Fatty acids are composed of hydrocarbon groups linked to carboxyl groups, with a carbon atom count of 4-30, preferably 8-22 (carbon atoms containing carboxyl groups) , and further preferably 14-22. Examples of saturated fatty acids include octanoic acid (C8) , decanoic acid (C10) , lauric acid (C12) , coumaric acid (C14) , palmitic acid (C 16) , stearic acid (C 18) , arachidic acid (C20) , or docosahexaenoic acid, etc. Examples of unsaturated fatty acids include monounsaturated fatty acids such as myristic acid (C14: 1, cis-9) , palmitoleic acid (C16: 1, cis-9) , oleic acid (C18: 1, cis-9) , trans oleic acid (C18: 1, trans-9) , ricinoleic acid (C18: 1, cis-9) , etc., or polyunsaturated fatty acids such as linolenic acid, DHA, and EPA.

[0155] The term “group containing polyethylene glycol fragments” refers to subunits based on polyethylene glycol or functional derivatives of polyethylene glycol, including α-amino-ω-carboxyl-polyethylene glycol, etc; In the present invention, "polyethylene glycol" includes polymers obtained by polymerizing ethylene oxide, or homogeneous compounds containing ethoxy units (such as NH2-CH2CH2-CH2O-CH2-COOH) obtained through chemical reactions, that is, any number of ethoxy units in the "groups containing polyethylene glycol fragments" can be separated or interrupted by optional chemical groups.

[0156] Beneficial technical effects

[0157] The present invention provides a novel nucleic acid delivery technology platform, the core of which is a new chemical entity called fatty acid derivative (FADS) . FADS can covalently or non covalently bind to nucleic acid substances, thereby enhancing their stability and effectiveness.

[0158] Specific Modes for Carrying Out the Embodiments

[0159] The following examples are intended to illustrate the present invention, but are not intended to limit the scope of the present invention.

[0160] Example 1: Synthesis of Solid-Phase Support FADS-CPG

[0161] The synthesis conditions can be applied to all the compounds listed. Taking stearic acid as an example, the synthesis method of FADS-CPG is explained in Fig 1:

[0162] The specific synthesis steps are as follows: Using stearic acid as the starting material, intermediate 1 is obtained through a reaction with 4-aminobutyl methacrylate, followed by hydrolysis. The intermediate then undergoes further reactions to yield intermediate 2. Intermediate 2 reacts with (3R, 5S) -5- { [Bis (4-methoxyphenyl) (phenyl) methoxy] methyl} pyrrolidine-3-ol) to form intermediate 3. Intermediate 3 reacts with succinic anhydride to produce intermediate 4 (FADS) . Coupling of intermediate 4 with amino modified controlled-pore glass beads results in a solid-phase support with fatty acid derivative side chains, in preparation for subsequent nucleic acid synthesis.

[0163] Intermediate 1: 4-Hydrogenated tallow acylamino butyric acid

[0164] Intermediate 2: 10, 19, 24-Trioxo-3, 6, 12, 15-tetraoxa-9, 18, 23-triazatetracosane acid

[0165] Intermediate 3: N- ( (1- (2S, 4R) -2- (bis (4-methoxyphenyl) methyl) oxymethyl) -4-hydroxypyrrolidin-1-yl) -1, 10, 19-trioxo-3, 6, 12, 15-tetraoxa-9, 18-diazabicyclo [22.2.2] docosan-22-yl) hydrogenated tallow amide

[0166] Intermediate 4: 4- ( ( (3R, 5S) -5- ( (bis (4-methoxyphenyl) methyl) oxymethyl) oxolan-3-yl) methoxy) oxobutanoic acid

[0167] LC-MS is used to confirm the molecular weight of the synthesized product 4, with the target molecular weight being 1161.49, and the strongest signal observed at m / z=1159.3 [M-2H] (Fig 2) , confirming the correct molecular weight of the product.

[0168] A preliminary assessment of the purity of the product FADS was performed by high-performance liquid chromatography (HPLC) . The chromatographic column used was XBridge Shield RP 18 (150 mm *4.6 mm, 5 μm) . The mobile phase consisted of solvent A: 0.01M NH4HCO3 aqueous solution and solvent B: acetonitrile. The flow rate was set at 1.5 mL / min, and the column temperature was maintained at 40℃. The HPLC results showed a well-separated peak at 8.898 minutes (Fig 3) , indicating a high purity of the product.

[0169] The structure of FADS was confirmed by 1H-NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy at 400 MHz in CDCl3 as the solvent. The NMR data are as follows (Fig 4) : δ = 8.10-8.09 (multiplet, 1H) , 7.90-7.87 (triplet, J = 12 Hz, 1H) , 7.74-7.71 (multiplet, 2H) , 7.34-7.27 (multiplet, 8H) , 6.84-6.79 (multiplet, 4H) , 6.49-6.41 (multiplet, 1H) , 5.32-5.23 (multiplet, 1H) , 4.44-4.22 (multiplet, 2H) , 4.00-3.97 (multiplet, 3H) , 3.80-3.78 (multiplet, 6H) , 3.67-3.55 (multiplet, 13H) , 3.51-3.43 (multiplet, 5H) , 3.27-3.20 (multiplet, 3H) , 2.67-2.47 (multiplet, 6H) , 2.30-2.23 (multiplet, 4H) , 2.18-2.12 (multiplet, 3H) , 1.82-1.75 (multiplet, 2H) , 1.60-1.56 (multiplet, 2H) , 1.25 (singlet, 28H) , 0.89-0.86 (triplet, J = 6.6 Hz, 3H) . These NMR data confirm that the product obtained by this synthetic method has the correct structure.

[0170] The controlled pore glass beads (CPG) were washed with an appropriate amount of dichloromethane five times, and the solvent was evaporated under reduced pressure. Then, intermediate 4, benzotriazol-1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (HBTU) , 4-dimethylaminopyridine (DMAP) , and N-ethyl-diisopropylamine (DIPEA) were added to a plastic reaction vessel and stirred for 3-5 minutes. Subsequently, the CPG beads were added, and the mixture was sealed and agitated at 45℃ for 6 days. After filtration, the beads were washed sequentially with anhydrous N, N-dimethylformamide and anhydrous dichloromethane until thin-layer chromatography (TLC) showed no residual starting materials. The solid was dried under vacuum to obtain CPG funcfionalized with fatty acid derivatives (FADS-CPG) , which serves as a solid-phase support for subsequent nucleic acid synthesis.

[0171] Example 2: Synthesis of 5′-labeled FADS-siRNA

[0172] The siRNA sequence targeting human PCSK9 with a Cy5 fluorescent label (SS: 5′-Cy5CUAGACCUGUUUUGCUUUUGU-FADS-3′, AS: 5′-ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA-3′) was synthesized on a solid-phase support using FADS-CPG as the backbone, employing a twelve-channel nucleic acid synthesizer (HJ-12-20-0) . The synthesis steps are illustrated in Fig 5.

[0173] The molecular weights of the two single strands were determined by LC-MS, with the theoretical molecular weight of the sense strand (SS) being 8031.7 and the antisense strand (AS) being 7431.6. The actual LC-MS results were found to be 8031.5 (Fig 6) and 7432.7 (Fig 7) for SS and AS, respectively, confirming the accuracy of the molecular weights. The purity of SS and AS was evaluated using UPLC (Fig 8, 9) , and the results showed well-separated strong signal peaks for both strands, with purities of 98.58%for SS and 97.35%for AS.

[0174] Example 3: Flow Cytometry Evaluation of HepG2 Hepatocytes Uptake of FADS-siRNA

[0175] HepG2 hepatocytes were seeded in a 12-well plate and then transfected with Cy5-1abeled FADS-siRNA at a concentration of 500 ng / ml. Untreated cells, cells transfected with siRNA alone, cells transfected with siRNA+Lipofectamine 3000, and cells transfected with GalNac-siRNA were used as controls. After 6 hours of transfecfion, the culture medium was removed, and the cells were collected for flow cytometry analysis to measure cellular fluorescence intensity.

[0176] As shown in Fig 10, the positive transfection rate for the GalNac-siRNA group was 24.2±4.17%, while for the FADS-siRNA group, it was 40.93±5.98%, which is 1.69 times higher than the GalNac-siRNA group (P<0.01) . There were no significant differences observed among the siRNA, siRNA+Lipofectamine 3000, and GalNac-siRNA groups, indicating that FADS-siRNA exhibits better transfection efficiency in HepG2 hepatocytes.

[0177] Example 4: RT-qPCR Evaluation of FADS-siRNA Interference on PCSK9

[0178] HepG2 hepatocytes were seeded in a 12-well plate and then transfected with Cy5-labeled FADS-siRNA at a concentration of 500 ng / ml. Untreated cells, cells transfected with siRNA alone, cells transfected with siRNA+Lipofectamine 3000, and cells transfected with GalNac-siRNA were used as controls. After 24 hours of transfection, the culture medium was removed, and cellular RNA was extracted for RT-qPCR analysis to measure the level of PCSK9 mRNA.

[0179] As shown in the Fig 11, siRNA resulted in a knockdown efficiency of 2.96%for PCSK9, siRNA+Lipofectamine 3000 achieved 15.4%, GalNac-siRNA reached 46.9%, and FADS-siRNA achieved 56.42%. The knockdown efficiency of FADS-siRNA was higher than the other groups, indicating that FADS-siRNA exhibits better interference on PCSK9 mRNA.

[0180] Example 5: Fluorescence Imaging Evaluates FADS-siRNA Distribution in Mouse Tissues

[0181] Cy5-labeled PCSK9 siRNA was synthesized. Nine male C57BL / 6 mice with a body weight of 20g were ordered and divided into 3 groups: siRNA, GalNac-siRNA, and FADS-siRNA, with 3 mice in each group. The mice were subcutaneously injected with the respective siRNA at a dose of 0.01 mol per mouse. After 48 hours post-injection, the mice were euthanized, and the heart, liver, spleen, lung, and kidney tissues were dissected for fluorescence imaging. The fluorescence intensity was then statistically analyzed.

[0182] In the FADS-siRNA group, a higher amount of the drug was found in the liver compared to the other two groups (Fig 12) , indicating that FADS-siRNA exhibits better liver-targeting efficiency.

[0183] Example 6: In Vivo Knockdown Evaluation of FADS-siRNA

[0184] Sixty C57BL / 6 mice (equal number of males and females) with a body weight of 20g were selected for the study. They were divided into four groups: saline control group, siRNA group, GalNac-siRNA group, and FADS-siRNA high-dose group, and FADS-siRNA low-dose group, with 5 mice in each group. The mice were subcutaneously injected with the respective drugs at a dose of 5 mg / kg for FADS-siRNA high-dose group and 2 mg / kg for FADS-siRNA low-dose group. After one week, blood samples were collected from the mice, and the hPCSK9 levels in the mouse serum were evaluated using ELISA.

[0185] Example 7: Synthesis of FADS monomer

[0186] The synthetic conditions can be applied to all the listed compounds. Taking stearic acid as an example, the synthesis steps for FADS monomer are shown in the Fig 13.

[0187] The specific synthesis steps are as follows: Using stearic acid as the starting material, intermediate 1 is obtained through a reaction with 4-aminobutyl methacrylate, followed by hydrolysis. The intermediate then undergoes further reactions to yield intermediate 2. Intermediate 2 reacts with (3R, 5S) -5- { [Bis (4-methoxyphenyl) (phenyl) methoxy] methyl} pyrrolidine-3-ol) to form intermediate 3. Intermediate 3 reacts with with N, N-diisopropylethylamine to produce FADS monomer 4..

[0188] Intermediate 1: 4-Hydrogenated tallow acylamino butyric acid

[0189] Intermediate 2: 10, 19, 24-Trioxo-3, 6, 12, 15-tetraoxa-9, 18, 23 -triazatetracosane acid

[0190] Intermediate 3: N- ( (1- (2S, 4R) -2- (bis (4-methoxyphenyl) methyl) oxymethyl) -4-hydroxypyrrolidin-1-yl) -1, 10, 19-trioxo-3, 6, 12, 15-tetraoxa-9, 18-diazabicyclo [22.2.2] docosan-22-yl) hydrogenated tallow amide

[0191] Monomer 4: (3R, 5S) -5- ( (bis (4-methoxyphenyl) (phenyl) methoxy) methyl) -1- (10, 19, 24-trioxo-3, 6, 12, 15-tetraoxa-9, 18, 23-triazahexacosanoyl) pyrrolidine-3-yl (2-cyanoethyl) diisopropylphosphoramidate.

[0192] Example 8: Synthesis of 3′-modified FADS-siRNA

[0193] Using CPG as the solid support, the siRNA sequence targeting human PCSK9 (SS: 5′-Cy5CUAGACCUGUUUUGCUUUUGU-FADS-3′, AS: 5′-ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA-3′) is synthesized on a 12-channel nucleic acid synthesizer (HJ-12-20-0) . After the RNA synthesis is completed, FADS monomer is introduced for modification, and then the modified FADS-siRNA is cleaved from the solid support. The synthesis steps are shown in Fig 14.

[0194] Example 9: Synthesis of 5′-modified FADS-ASO

[0195] The ASO sequence targeting human AGT (5′-CAAAAAAGTGTTCCCTTTTCAAGTT-3′) was synthesized on a solid support using FADS-CPG as the support, employing the twelve-channel nucleic acid synthesizer (HJ-12-20-0) . Subsequently, the modified FADS-ASO was cleaved from the solid support. The synthetic steps are illustrated in Fig 15.

[0196] Example 10: Synthesis of FADS-siRNA-FADS with Dual-end Modifications.

[0197] Using FADS-CPG as the solid support, the siRNA sequence targeting human PCSK9 with a Cy5 fluorescent label (SS: 5′-Cy5 CUAGACCUGUUUUGCUUUUGU-FADS-3′, AS: 5′-ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA-3′) is synthesized on a 12-channel nucleic acid synthesizer (HJ-12-20-0) . After the completion of RNA synthesis, FADS monomer is added for modification, and then the siRNA is cleaved from the solid support. Following annealing, the dual-end modified FADS-siRNA-FADS is obtained. The synthesis steps are shown in Fig 16.

[0198] Although the present invention has been described in detail by general description and specific embodiments, it is obvious to a person skilled in the art that some modifications or improvements can be made on the basis of the present invention. Therefore, these modifications or improvements made without departing from the spirit of the present invention are within the scope of the present invention.Industrial applicability

[0199] The present invention provides a novel technology platform for the delivery of nucleic acids, centered around a new chemical entity known as Fatty Acid Derivatives (FADS) . FADS can covalently or non-covalently bind to nucleic acid substances, thereby enhancing their stability and effectiveness, and has good economic value and application prospects.

Claims

1.A FADS derivative as shown in Formula 1: wherein:R1 is a lipophilic fragment, and m is 1, 2, or 3;R2 is any m+1 valent linking group;R3 is a hydrophilic fragment;H1 is selected from:1) phosphoric acid groups, phosphorothioate groups, carboxyl COOH, amino NH2, hydroxyl or thiol groups, or their protected or activated forms;2) phosphoryl groups:3) cyclic linking groupwherein Cy is an optionally substituted five-or six membered carbon ring or a five-or six membered heterocyclic ring containing one or two heteroatoms (oxygen or nitrogen) , such as4) non cyclic linking groupwherein, G1 or G2 is independently selected from H, hydroxyl protecting groups such as DMTr, phosphonyl groups defined in 2) above,where CPG is a solid support, preferably controllable pore size glass beads;R1、 R2、 R3, and H1 can be connected to each other via any functional group; preferably, connected via amide or ether groups.2.A FADS derivative as claimed in claim 1, R1 is a substituted or unsubstituted C2-30 alkyl, C2-30 alkene, or C2-30 alkynyl group;preferably, R1 is derived from an optionally substituted fatty acid group, R1 is connected to R2 via an amide, and R1 is preferably:wherein, n, n1, n2, n3, n4, and n5 are independently integers from 0 to 100; preferably, n or the sum of n1-n5 is an integer selected from 4-30, further preferably an integer from 8-22.3.A FADS derivative as claimed in claim 1, m is 1, and R2 is a substituted or unsubstituted C1-10 alkylene, C2-10 alkynylene, or C2-10 alkynylene group; preferably, R2 is an optionally substituted C2-C6 alkylene group, and the substituent group can be selected from OH, NH2, or C1-C4 alkyl.4.A FADS derivative as claimed in claim 1, m is 2, and R2 is a C1-10 alkylidene group, C2-10 alkenylenyl group, C2-10 alkynylidene group, or an amino acid residue derived from a side chain with reactive groups such as lysine, glutamic acid, or aspartic acid, for example: 5.A FADS derivative as claimed in claim 1, R3 is a group containing a polyethylene glycol fragment;preferably, R3 contains 2-20 ethoxy units, and further preferably, containing 4-10 ethoxy units; Further preferably, every 2 or 3 ethoxy units in R3 are separated by amide bonds;further preferred, R3 is:wherein, n6 is an integer from 1 to 9, preferably an integer from 1 to 4;preferably, R2 and R3 are connected by an amide bond.6.A FADS derivative as claimed in claim 1, the FADS compound is a FADS monomer: or, the FADS compound is a FADS coupled solid-phase carrier (FADS-CPG) :7.A modified nucleotide or nucleic acid molecule (Formula II) , comprising: wherein the O in the phosphate group can be optionally replaced by S;X3 is a nucleotide or nucleic acid molecule;R1, R2, R3 or m are as claimed in any one of claims 1-6.8.A modified nucleotide or nucleic acid molecule as claimed in claim 7,the nucleotide is selected from uracil nucleotides, thymine nucleotides, cytosine nucleotides, 5-methylcytosine nucleotides, adenine nucleotides, or guanine nucleotides;the nucleic acid molecule is selected from small interfering RNA, microRNA, alternative splicing body, single stranded RNA, double stranded RNA, antisense nucleic acid, nucleic acid aptamer, mRNA or DNA;preferably, the nucleic acid molecule further comprises other modifications, including but not limited to the following modifications: locked nucleic acid modification, ring opening or non-locked nucleic acid modification, 2′-methoxyethyl modification, 2′-O-methyl modification, 2′-O-allyl modification, 2′-C-allyl modification, 2′-fluoro modification, 2′-deoxy modification, 2′-hydroxy modification, or thiophosphate backbone modification;preferably, the nucleic acid molecule is an siRNA molecule that inhibits the expression of a target gene, comprising a sense chain and an antisense chain that complement each other to form a double stranded region; the sense chain and / or the antisense chain comprises 15-25 nucleotides or is composed of 15-25 nucleotides; the antisense chain is completely or partially complementary to at least 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, or 25 consecutive nucleotides of the target gene; the length of the double stranded region is 15-25 bp, and at least one nucleotide in the siRNA molecule contains the modification of a compound of formula I; the target genes include but are not limited to: ANGPTL3, PCSK9, ApoB, ApoC, FVII, AGT, Lp (a) , XDH, HSD17B13, SCD1, PNPLA3, HMGCR, etc; the target genes also include genes encoding core proteins, viral polymerases, surface antigens, e-antigens, or functional fragments of X proteins in HAV, HBV, HCV, HDV, and HEV.9.A modified nucleotide or nucleic acid molecule as claimed in claim 7,the nucleic acid molecule has 2 or 3 consecutive modifications at the 5′ or 3′ end, for example:preferably, each nucleic acid molecule binds 1-6 (specifically: 1, 2, 3, 4, 5, or 6) compound (s) of formula I mentioned above.10.A pharmaceutical composition comprising a modified nucleotide or nucleic acid molecule as claimed in any one of claims 7-9.11.An use of a modified nucleotide or nucleic acid molecule as claimed in any one of claims 7-9 or a pharmaceutical composition as claimed above for the preparation of a drug for the prevention and / or treatment of physiological conditions or diseases caused by the expression of specific genes;preferably, the specific genes include but are not limited to: ANGPTL3, PCSK9, ApoB, ApoC, FVII, AGT, Lp (a) , XDH, HSD17B13, SCD1, PNPLA3, HMGCR, etc.Preferably, the specific genes further include encoding genes of functional fragments of core proteins, viral polymerases, surface antigens, e-antigens, or of X proteins of HAV, HBV, HCV, HDV, HEV.Preferably, the disease is chronic liver disease, hereditary transthyretin (hATTR) amyloidosis, hepatitis, liver fibrosis disease, liver proliferative disease, liver cancer, hypertension, and other dyslipidemia diseases.12.A method for preventing and / or treating physiological conditions or diseases caused by the expression of specific genes, comprising administering a modified nucleotide or nucleic acid molecule as claimed in any one of claims 7-9 or a pharmaceutical composition as claimed in claim 10 to individuals in need.13.A composition comprising nucleic acid molecules, which comprising FADS derivatives according to any one of claims 1-6, phospholipids, and cholesterol;preferably, the composition is a liposome or LNP;preferably, the nucleic acid molecule comprises small interfering RNA, microRNA, alternative spliceosome, single stranded RNA, double stranded RNA, antisense nucleic acid, nucleic acid aptamer, mRNA or DNA.14.A method for preparing 3′ FADS modified or / and 5′ modified FADS nucleic acid molecules, which comprising the following steps: synthesizing nucleic acid molecules using an optional FADS modified solid-phase carrier, and then adding FADS monomers optionally; after the reaction is completed, the synthesized sequence is cleaved from the carrier and optionally annealed to obtain modified nucleic acid molecules;the condition is that at least one of FADS modified solid-phase carrier or FADS monomer is selected;the FADS modified solid-phase carrier and FADS monomer have the structure as claimed in claim 6;preferably, the method is a method for preparing 3′ modified FADS siRNA, which comprising the following steps: synthesizing siRNA using a solid-phase carrier, and then adding the aforementioned FADS monomer; after the reaction is completed, the synthesized sequence is cleaved from the carrier and then annealed to obtain 3′ modified FADS siRNA;preferably, the method is for preparing 3′ modified FADS-ASO, which comprising the following steps: synthesizing ASO using a solid-phase carrier, and then adding FADS monomer to connect to the 3′ end of ASO; subsequently, the synthesized FADS-ASO was cleaved from the carrier;preferably, the method is for preparing FADS siRNA FADS with modifications at the 5′ and 3′ ends, which comprising synthesizing siRNA using a modified solid-phase carrier (FADS-CPG) and then adding FADS monomer; after the reaction is completed, the synthesized sequence is cleaved from the carrier and annealed to obtain double modified FADS siRNA FADS;preferably, the method is for preparing FADS-ASO with modifications at the 5′ and 3′ ends, comprising synthesizing ASO using a solid-phase carrier (FADS-CPG) and then adding FADS monomer; cut the synthesized sequence from the carrier to obtain double modified FADS-ASO-FADS.

Images