Immunotherapies using engineered cells for enhanced bone marrow homing

Abstract

Provides is engineered cells, including induced pluripotent stem cells (iPSCs) and hematopoietic cells derived therefrom, pharmaceutical compositions comprising said cells, and methods of use of same, wherein one or more genes are transfected into said cells, such that bone marrow homing is enhanced.

Description

IMMUNOTHERAPIES USING ENGINEERED CELLS FOR ENHANCED BONE MARROW HOMINGCROSS REFERENCE TO THE RELATED APPLICATIONS

[0001] This application is based upon and claims priority to International Application No. PCT / CN2024 / 091601, filed on May 08, 2024, the entire contents of which are incorporated herein by reference. SEQUENCE LISTING

[0002] The instant application contains a Sequence Listing which has been submitted in XML format via EFS-Web and is hereby incorporated by reference in its entirety. Said XML copy is named SRP250105 sequence list, created on 05 / 07 / 2025, and is 12, 288 bytes in size.FIELD

[0003] The disclosure relates generally to the field of immunotherapies, and more specifically to engineered hematopoietic cells, e.g., natural killer (NK) cells or T-cells, and uses thereof.BACKGROUND

[0004] The development of engineered immune cells to treat disease has positively impacted clinical outcomes, for example the development of chimeric antigen receptor engineered T (CAR-T) cells for the treatment of cancer. However, immune cell-based therapeutics currently face challenges that limit the efficacy of those therapeutics. For example, the process of preparing CAR-T cells is time-consuming, labor-intensive, and costly, resulting in limited availability of CAR-T-cell therapies. Additionally, the complex manufacturing process of autologous CAR-T-cell therapeutics further limits the accessibility of such treatments. Furthermore, technical challenges limit the efficacy of such treatments in patients able to access engineered immune cell-based therapies, such as heterogeneous tumor antigen profiles, immune suppression within the tumor microenvironment, and limitations to physical accessibility of the engineered cells to the disease site. For example, many solid tumors and their environments are composed of cells with a tight physical barrier between them, which inhibit engineered immune cells from infiltrating into the disease site. Bone marrow is one example of a potential disease site with hindered accessibility to engineered immune cells.

[0005] Acute myeloid leukemia (AML) is one disease which serves as an example of the outstanding challenges facing engineered immune cell-based therapies. AML is caused by genetic mutations during hematopoietic stem cell (HSC) differentiation into blast cells. This yields AML tumor cells that are genetically heterogeneous and often located, and physically protected, within the bone marrow.

[0006] Existing therapies to treat AML using engineered immune cells comprise CAR-T cell-based strategies, such as anti-CD33-CAR-T cells, anti-CLL1-CAR-T-cells, and dual anti-CD33 / anti-CLL1-CAR-T cells. However, CAR-T cells can proliferate and expand within the patient, and persist within the patient’s circulatory system for several months post-infusion, inducing severe side effects to the patient undergoing therapy. For example, anti-CD33-CAR-T cells induce cytotoxicity to HSCs through their mechanism of action, which can delay follow-up transplantation of normal HSCs. Additionally, anti-CLL1-CAR-T cells can cause neutropenia, which subsequently increases the patient’s risk of infection and potentially fatal infection-related complications.

[0007] AML progresses quickly, and the risk of the patient developing life-threatening complications requires that engineered immune cells be available on demand. The extensive manufacturing labor and time necessary to produce autologous engineered cells further increases risk to the patient. Moreover, AML-related abnormal differentiation of HSCs results in lower quality and availability of lymphoid cells including T cells, B cells, and NK cells, which further increases the difficulty of treating AML with engineered immune cells.

[0008] CAR-NK therapies are alternatively available, wherein natural killer (NK) cells are harvested from peripheral blood and engineered with comparable CAR constructs to CAR-T cell therapies. However, NK cells are naturally difficult to engineer with multiple CAR constructs / transgenes. Additionally, the introduction of CAR constructs / transgenes is often unstable and the resultant immunogenicity and function of the CAR-NK cells depends upon the donor NK cells, which adds further difficulty to treating cancers such as AML with autologous engineered CAR-NK cells.

[0009] Thus, an on-demand, off-the-shelf allogeneic cell therapy capable of homing to bone marrow is needed. BRIEF DESCRIPTION OF THE DISCLOSURE

[0010] We have discovered that induced pluripotent stem cell (iPSC) -derived NK cells show very low efficiency in infiltrating bone marrow, and this acts to limit the potential efficacy of CAR-NK cell therapies to disease sites within bone marrow, such as AML. The CXC motif chemokine receptor 4 (CXCR4) can increase cell signaling for enhanced homing to bone marrow. We have further discovered that iPSC-derived NK cells do not express CXCR4. Without wishing to be bound by theory, we expect that the lack of CXCR4 expression in NK cells is responsible, at least in part, with the low efficiency of bone marrow infiltration of said NK cells. Thus, we have discovered that by increasing the expression of CXCR4 in immune cells, e.g., engineered NK(eNK) cells, e.g., CAR-NK cells, enhanced bone marrow homing can be achieved. We have further discovered that immune cells, e.g., eNKs, e.g., CAR-NK cells, expressing CXCR4 demonstrate improved cytotoxicity against tumor cells within bone marrow.

[0011] Additionally, we have surprisingly found that iPSCs constitutively expressing CXCR4 cannot differentiate into immune cells, e.g., NK cells. Thus, we have developed a new platform to engineer an iPSC with conditional expression of CXCR4, i.e., engineered iPSC with an inactive CXCR4 gene wherein the iPSC is capable of successful differentiation into an immune cell, e.g., NK cell, wherein expression of CXCR4 is activated during and / or following differentiation of said iPSC into said immune cell, e.g., NK cell, T cell.

[0012] The present disclosure thus provides engineered cells [e.g., human cells, including (i) engineered stem cells, e.g., iPSCs, and (ii) engineered hematopoietic cells, e.g., NK cells or T-cells (which engineered hematopoietic cells may be the progeny of the engineered stem cells) ] , which have enhanced homing to the bone marrow of a subject, and which have conditional expression of one or more transgenes, such that the expression of the one or more transgenes is dependent upon the phenotype of said engineered cells, wherein iPSCs which are so engineered can differentiate into hematopoietic cells, e.g., NK cells or T-cells. The disclosure also provides pharmaceutical compositions comprising such engineered cells, methods of producing such cells, and methods of treating disease, e.g., cancer or auto-immune disease or conditions, using such cells.

[0013] In certain embodiments, the engineered cells are iPSCs, wherein the conditional expression of one or more transgenes is inactive. In alternative embodiments, the engineered cells are hematopoietic cells, e.g., NK cells or T-cells, and the conditional expression of one or more transgenes is active. In some embodiments, said hematopoietic cells are the progeny of said iPSCs. In certain embodiments, the conditional expression of one or more transgenes activates upon differentiation of iPSCs, e.g., the one or more transgenes begin to express functional protein products upon differentiation of iPSCs, e.g., the one of more transgenes activates upon differentiation of iPSCs into hematopoietic cells, e.g., HSCs, e.g., NK cells or T-cells.

[0014] In certain embodiments, the conditional expression of one or more transgenes comprise a gene encoding the CXC motif chemokine receptor 4 (CXCR4) . In certain embodiments, the conditional expression of one or more transgenes is operably linked to a gene with low or no expression in iPSCs but that is highly expressed in hematopoietic cells, e.g., Granzyme B gene, e.g., wherein the one or more transgenes is inserted adjacent to and / or within the Granzyme B gene.

[0015] In certain embodiments, the engineered cells home to the bone marrow of a subject such that the presence of engineered cells in the bone marrow post-infusion of said engineered cells is increased by at least 10%, e.g., at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%relative to a control, e.g., relative to isogenic cells, e.g., relative to the presence of engineered cells in peripheral blood.

[0016] In certain embodiments, the engineered cells further comprise one or more transgenes comprising one or more coding regions for a chimeric antigen receptor (CAR) construct.

[0017] Further, more specific embodiments are set forth in the detailed description below, and in the Examples.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0018] Figure 1 depicts the experimental design of NK cell modification.

[0019] Figure 2 depicts a schematic drawing of the gene constructs used to modify cells.

[0020] Figure 3 depicts a legend of control and test groups used in subsequent Figs. 4-7.

[0021] Figure 4 depicts enhanced bone marrow (BM) localization over peripheral blood (PB) by eNK cells expressing CXCR4 relative to controls.

[0022] Figure 5 depicts the localization of total CD56+cells sampled, with most NK cells found in peripheral blood (PB) samples relative to bone marrow (BM) .

[0023] Figure 6 depicts that eNK cells expressing CXCR4 construct are more prominent in bone marrow (BM) than peripheral blood (PB) , demonstrating enhanced bone marrow homing of CXCR4+eNK cells.

[0024] Figure 7 depicts that eNK cells expressing CXCR4 construct are more prominent in bone marrow (BM) than peripheral blood (PB) , demonstrating enhanced bone marrow homing of CXCR4+eNK cells.

[0025] Figure 8, left, depicts expression of CXCR4 across a variety of iPSC clones. Figure 8, right, depicts the healthy phenotype of iPSCs engineered to express CXCR4 relative to the non-modified ANB control.

[0026] Figure 9 depicts the inverse relationship between CXCR4 expression and the capability of iPSC differentiation into eNK cells.

[0027] Figure 10 depicts the inverse relationship between CXCR4 expression and iPSC differentiation potential into eNK cells.

[0028] Figure 11 depicts the low expression level of CXCR4 in eNKs differentiated from iPSCs expressing CXCR4.

[0029] Figure 12 depicts a schematic overview of a conditional knock-in strategy, wherein expression of the CXCR4 construct exhibits conditional expression of CXCR4 upon differentiation of engineered iPSCs into eNK cells.

[0030] Figure 13 depicts fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of transgene expression in iPSCs engineered using the conditional knock-in strategy.

[0031] Figure 14 depicts FACS analysis of transgene expression in iNKs at day 18 engineered using the conditional knock-in strategy.

[0032] Figure 15 depicts FACS analysis of transgene expression in iNKs at day 22 engineered using the conditional knock-in strategy.

[0033] Figure 16 depicts FACS analysis of transgene expression in eNKs at day 7 engineered using the conditional knock-in strategy.

[0034] Figure 17 depicts increased expression of CXCR4 in engineered clones.

[0035] Figure 18 depicts CXCR4+eNK cytotoxicity to tumor cells relative to non-engineered cells. DETAILED DESCRIPTION OF THE DISCLOSURE

[0036] The following description of different embodiments is merely exemplary in nature and is in no way intended to limit the invention, its application, or uses. I.Definitions

[0037] As used herein, the following terms have the meanings ascribed to them unless specified otherwise.

[0038] As used herein, “CXCR4” refers to C-X-C chemokine receptor type 4, which is a G-protein-coupled chemokine receptor, normally expressed on white blood cells and hematopoetic stem cells, also known as fusin or CD184, which acts as a receptor for C-X-C chemokine CXCL12 / SDF-1, including functional isoforms of CXCR4, e.g., comprising a C-terminal region of SEQ ID NO: 1 for example any of CXCR4 isoforms a-e: and functional variants of any of these sequences, e.g. having at least 50%, 60%, 70%, 80%,  90%, 95%, 98%or 99%identity thereto (for example variants which can still act as a receptor for CXCL12 / SDF-1) ; for example variants having a truncation (e.g. a C-terminus of N-terminus truncation) and / or one or more mutations or single nucleotide polymorphisms (SNPs) ; for example the protein of SEQ ID NO: 2, having the following mutation (s) : CXCR4 S342X and / or CXCR4 R338X, wherein X is any natural amino acid; or other CXCR4 isoforms having the corresponding mutations. CXCR4 splice variants are discussed in Park HK, et al. “The N-terminus of CXCR4 splice variants determines expression andfunctionalproperties. ” PLoS One. 2023 May 4; 18 (5) : e0283015, the contents of which are incorporated herein by reference.

[0039] As used herein, the term “immune cell” generally refers to a differentiated hematopoietic cell. Non-limiting examples of an immune cell can include an NK cell, a T-cell, a B-cell, amonocyte, an innate lymphocyte, a tumor-infiltrating lymphocyte, a macrophage, a granulocyte, etc. In certain embodiments, an NK cell or T cell may be derived from a stem cell, e.g., an iPSC, e.g., a hematopoietic stem cell (HSC) . In certain embodiments, an NK cell may be isolated from peripheral blood (PBNK) or cord blood (CBNK) , optionally wherein the NK cell may be further modified / engineered. In certain embodiments, a T-cell may be isolated from peripheral blood, optionally wherein the T-cell may be further modified / engineered.

[0040] As used herein, the terms “immune response” and immune cell “activation” generally refer to T-cell mediated, B-cell mediated, and / or NK-cell mediated immune responses from a host’s immune system to an object, e.g., a disease site, e.g., a foreign object, e.g., an exogenous or allogeneic cell. An example of an immune response includes T-cell responses, e.g., cytokine production and cellular cytotoxicity, e.g., antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) . In some cases, an immune response can be indirectly affected by T-cell activation, e.g., antibody production (humoral responses) and activation of cytokine responsive cells, such as macrophages. As used herein, “activation” in the context of NK cells generally refers to the induction of a typical immune response, e.g., degranulation of NK cells.

[0041] The term "gene" generally refers to a nucleic acid (e.g., DNA such as genomic DNA and cDNA) and its corresponding nucleotide sequence that is involved in encoding an RNA transcript. The term as used herein with reference to genomic DNA includes intervening, non-coding regions as well as regulatory regions and can include 5’a nd 3’ ends. In some uses, the term encompasses the transcribed sequences, including 5’a nd 3’ untranslated regions (5’ -UTR and 3’ -UTR) , exons and introns. In some genes, the transcribed region will contain "open reading frames" that encode polypeptides. In some uses of the term, a "gene" comprises only the coding sequences (e.g., an "open reading frame" or "coding region" ) necessary for encoding a polypeptide. In some cases, genes do not encode a polypeptide, for example, ribosomal RNA genes (rRNA) and transfer RNA (tRNA) genes. In some cases, the term "gene" includes not only the transcribed sequences, but in addition, also includes non-transcribed regions including upstream and downstream regulatory regions, enhancers, and promoters. A gene can refer to an "endogenous gene" or a native gene in its natural location in the genome of an organism. A gene can refer to an "exogenous gene" or a non-native gene. A non-native gene can refer to a gene not normally found in the host organism, but which is introduced into the host organism by gene transfer. A non-native gene can also refer to a gene not in its natural location in the genome of an organism. A non-native gene can also refer to a naturally occurring nucleic acid or polypeptide sequence that comprises mutations, insertions and / or deletions (e.g., non-native sequence) .

[0042] The terms “exogenous gene” or “transgene” refer to a gene which has been introduced into the cell or an ancestor thereof by genetic engineering, e.g., comprising a coding sequence for a protein of interest operably linked to a heterologous promoter. The exogenous genes used herein may be transiently expressed by viral vectors, e.g., adeno-associated vectors, but in particular embodiments herein, they are stably incorporated into the genome of the engineered cells. The exogenous genes herein may be associated with a selectable or screenable marker, for example a fluorescent marker such as green fluorescent protein (GFP) and / or blue fluorescent protein (BFP) . In certain embodiments, induced pluripotent stem cells (iPSCs) are stably transformed with the exogenous gene of interest, together with a selectable or screenable marker, and differentiated into hematopoietic cells, e.g., NK cells or T cells, which also express the exogenous gene, and which may be introduced into a patient as an allogeneic cell therapy.

[0043] The term "expression" generally refers to one or more processes by which a polynucleotide is transcribed from a DNA template (such as into an mRNA or other RNA transcript) and / or the process by which a transcribed mRNA is subsequently translated into peptides, polypeptides, or proteins. Transcripts and encoded polypeptides can be collectively referred to as "gene product. " If the polynucleotide is derived from genomic DNA, expression can include splicing of the mRNA in a eukaryotic cell. "Up-regulated, " with reference to expression, or “overexpression” generally refer to an increased expression level of a polynucleotide (e.g., RNA such as mRNA) and / or polypeptide sequence relative to its expression level in a wild-type state while "down-regulated" or “underexpression” generally refer to a decreased expression level of a polynucleotide (e.g., RNA such as mRNA) and / or polypeptide sequence relative to its expression in a wild-type state. Expression of a transfected gene can occur transiently or stably in a cell. During "transient expression" the transfected gene is not stably transferred to the daughter cell during cell division, e.g., the transfected gene is not transferred and replicated within the genome of a daughter cell during cell division. Since its expression is restricted to the transfected cell, expression of the gene is lost over time. In contrast, stable expression of a transfected gene can occur when the gene is co-transfected with another gene that confers a selection advantage to the transfected cell. Such a selection advantage may be a resistance towards a certain toxin that is presented to the cell or the production of a fluorescent gene product amenable to optical detection for cell selection.

[0044] The term “conditional expression, ” as used herein, refers to expression of a gene being conditional on the phenotype of the said cell comprising said gene. For example, a cell with conditional expression of a gene may comprise a transgene wherein said transgene is not expressed when the cell is in one phenotypic state, but said transgene is expressed when the cell is in a different phenotypic state. For example, an iPSC conditionally expressing a transgene will not actively express said transgene while remaining in an iPSC-like state, i.e., while maintaining an iPSC or iPSC-like phenotype; however, the iPSC will actively express said transgene when the phenotype of the cell changes, e.g., upon differentiation of the iPSC into another cell type, e.g., a hematopoietic stem cell (HSC) , e.g., a hematopoietic cell, e.g., NK cell or T-cell.

[0045] The term "peptide, " "polypeptide, " or "protein, " as used interchangeably herein, generally refers to a polymer of at least two amino acid residues joined by peptide bond (s) . This term does not connote a specific length of polymer, nor is it intended to imply or distinguish whether the peptide is produced using recombinant techniques, chemical or enzymatic synthesis, or is naturally occurring. The terms apply to naturally occurring amino acid polymers as well as amino acid polymers comprising at least one modified amino acid. In some cases, the polymer can be interrupted by non-amino acids. The terms include amino acid chains of any length, including full length proteins, and proteins with or without secondary and / or tertiary structure (e.g., domains) . The terms also encompass an amino acid polymer that has been modified, for example, by disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, oxidation, and any other manipulation such as conjugation with a labeling component. The terms "amino acid" and "amino acids, " as used herein, generally refer to natural and non-natural amino acids, including, but not limited to, modified amino acids and amino acid analogues. Modified amino acids can include natural amino acids and non-natural amino acids, which have been chemically modified to include a group or a chemical moiety not naturally present on the amino acid. Amino acid analogues can refer to amino acid derivatives. The term "amino acid" includes both D-amino acids and L-amino acids.

[0046] As used herein, an “engineered” cell is understood to mean a cell wherein the genome of the cell has a heterologous nucleic acid sequence or a nucleic acid sequence altered through the application of genetic engineering techniques to the cell or an ancestor of the cell, such that the genome and gene expression of the engineered cell differs from the genome and gene expression of a normal, nonengineered cell. Genetic engineering techniques include DNA cloning technologies; transfection, transformation, and other gene transfer technologies; homologous recombination; site-directed mutagenesis; gene fusion; gene disruption; gene activation; and gene editing. In particular, an engineered cell includes, for example, a cell wherein (a) the genome of the cell (or an ancestor of the cell) has been genetically engineered to include a transgene (sometimes referred to as a “knock-in” ) and / or a heterologous promoter for an endogenous gene, and / or (b) the genome of the cell (or an ancestor of the cell) has been genetically engineered to have significantly reduced or eliminated expression of the functional protein expressed by the naturally occurring gene (e.g., using Crispr-Cas9, prime editing, base editing, gene disruption, or other gene editing approach, sometimes referred to as a “knock-out” ) .

[0047] As used herein, the term “homing” refers to the directed shuttling or trafficking of a cell to a site of interest, e.g., a disease site, the preferential partitioning of cells between two physical spaces, and / or the increased prevalence of a cell relative to a control, e.g., increasing the ratio of engineered cells partitioned between the bone marrow and in circulation. For example, if 2%of administered control cells are found in the bone marrow at 1 day post-infusion of said control cells, and 10%of administered engineered cells are found in the bone marrow at 1 day post-infusion of said engineered cells, then the engineered cells exhibit enhanced bone marrow homing.

[0048] The disclosure may refer to a coding sequence “operably linked to a heterologous promoter, ” meaning that the promoter is capable of driving expression of the coding sequence (i.e., is “operably linked” to the coding sequence) , but the coding sequence is not naturally associated with (i.e., is “heterologous” to) the promoter. Promoters for use in transgenes as described herein include, for example, constitutive promoters, such as viral promoters and synthetic promoters. For example, the CAG promoter is a strong synthetic promoter frequently used to drive high levels of gene expression in mammalian expression vectors. It is derived from the cytomegalovirus (CMV) early enhancer element [C] ; the promoter, the first exon and the first intron of chicken beta-actin gene [A] ; and the splice acceptor of the rabbit beta-globin gene [G] . Other strong constitutive promoters include the adenovirus major late promoter, the human cytomegalovirus immediate early promoter (hCMV-IE) , the SV40 and Rous Sarcoma virus promoters, the murine 3-phosphoglycerate kinase promoter, the translation elongation factor 1α(EF-1α) promoter, and the human ubiquitin C promoter. In certain embodiments, the coding sequence operably linked to a heterologous promoter is part of a transgene. In certain embodiments, the coding sequence is an endogenous coding region operably linked to a heterologous promoter to provide elevated or different expression relative to expression when under control of the natural promoter for the coding region.

[0049] The term "differentiation" generally refers to a process by which an unspecialized ( "uncommitted" ) or less specialized cell acquires the features of a specialized cell such as, e.g., an immune cell. A differentiated or differentiation-induced cell is one that has taken on a more specialized ( "committed" ) position within the lineage of a cell. The term "committed" generally refers to a cell that has proceeded in the differentiation pathway to a point where, under normal circumstances, it will continue to differentiate into a specific cell type or subset of cell types, and cannot, under normal circumstances, differentiate into a different cell type or revert to a less differentiated cell type.

[0050] The term "pluripotent" generally refers to the ability of a cell to form all lineages of the body or soma (i.e., the embryo proper) . For example, embryonic stem cells are a type of pluripotent stem cells that can form cells from each of the three germs layers, the ectoderm, the mesoderm, and the endoderm. Pluripotency can be a continuum of developmental potencies ranging from the incompletely or partially pluripotent cell (e.g., an epiblast stem cell) , which is unable to give rise to a complete organism to the more primitive, more pluripotent cell, which is able to give rise to a complete organism (e.g., an embryonic stem cell) .

[0051] The term "induced pluripotent stem cells" (iPSCs) generally refers to stem cells that are derived from differentiated cells (e.g., differentiated adult, neonatal, or fetal cells) that have been induced or changed (i.e., reprogrammed) into cells capable of differentiating into tissues of all three germ or dermal layers: mesoderm, endoderm, and ectoderm. The iPSCs produced do not refer to cells as they are found in nature. In some cases, iPSCs can be engineered to differentiation directly into committed cells (e.g., natural killer (NK) cells) . In some cases, iPSCs can be engineered to differentiate first into tissue-specific stem cells (e.g., hematopoietic stem cells (HSCs) ) , which can be further induced to differentiate into committed cells (e.g., NK cells) .

[0052] The term "embryonic stem cell" (ESCs) generally refers to naturally occurring pluripotent stem cells of the inner cell mass of the embryonic blastocyst. Embryonic stem cells are pluripotent and give rise during development to all derivatives of the three primary germ layers: ectoderm, endoderm, and mesoderm. In some cases, ESCs can be engineered to differentiation directly into committed cells (e.g., NK cells) . In some cases, ESCs can be engineered to differentiate first into tissue-specific stem cells (e.g., HSCs) , which can be further induced to differentiate into committed cells (e.g., NK cells) .

[0053] The term "isolated stem cells" generally refers to any type of stem cells disclosed herein (e.g., ESCs, HSCs, mesenchymal stem cells (MSCs) , etc. ) that are isolated from a multicellular organism. For example, HSCs can be isolated from a mammal's body, such as a human body. In another example, an embryonic stem cells can be isolated from an embryo.

[0054] The term "isolated" generally refers to a cell or a population of cells, which has been separated from its original environment. For example, a new environment of the isolated cells is substantially free of at least one component as found in the environment in which the "un-isolated" reference cells exist. An isolated cell can be a cell that is removed from some or all components as it is found in its natural environment, for example, isolated from a tissue or biopsy sample. The term also includes a cell that is removed from at least one, some or all components as the cell is found in non-naturally occurring environments, for example, isolated from a cell culture or cell suspension.

[0055] The term "hematopoietic stem and progenitor cells, " "hematopoietic stem cells, " , "hematopoietic progenitor cells, " or "hematopoietic precursor cells, " as used interchangeably herein, generally refers to cells which are committed to a hematopoietic lineage but are capable of further hematopoietic differentiation (e.g., into NK cells) and include, multipotent hematopoietic stem cells (hematoblasts) , myeloid progenitors, megakaryocyte progenitors, erythrocyte progenitors, and lymphoid progenitors. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSCs) are multipotent stem cells that give rise to all the blood cell types including myeloid (monocytes and macrophages, neutrophils, basophils, eosinophils, erythrocytes, megakaryocytes / platelets, dendritic cells) , and lymphoid lineages (T cells, B cells, NK cells) . In some cases, HSCs can be CD34+hematopoietic cells capable of giving rise to both mature myeloid and lymphoid cell types including T cells, NK cells and B cells.

[0056] As used herein, the terms “Natural Killer cell” or “NK cell” generally refer to a subset of lymphocytes defined by the expression of CD56 or CD16 and the absence of the T cell receptor, i.e., CD3. In some cases, NK cells that are phenotypically CD3-and CD56+, expressing at least one of NKG2C and CD57 (e.g., NKG2C, CD57, or both in same or different degrees) , and optionally, CD16, but lack expression of one or more of the following: PLZF, SYK, FceRγ, and EAT-2. In some cases, isolated subpopulations of CD56+NK cells can exhibit expression of CD16, NKG2C, CD57, NKG2D, NCR ligands, NKp30, NKp40, NKp46, activating and inhibitory KIRs, NKG2A, and / or DNAM-1.

[0057] As used herein, the terms “CAR construct” or “CAR transgene” refer to nucleotide sequences encoding a chimeric antigen receptor (CAR) . Such CAR constructs / transgenes can be engineered to induce activation of an immune cell engineered to express said CAR constructs / transgenes upon binding to a complimentary antibody / antigen.

[0058] As used herein, “treating” or “treatment” encompasses prophylaxis, mitigation, amelioration of symptoms, and / or delaying the progression of a disease, condition, or pathology.

[0059] The present disclosure provides a population of induced pluripotent stem cells (iPSCs) and hematopoietic cells derived therefrom, pharmaceutical compositions comprising said cells, and methods of use of same wherein the cells are transfected with selected transgenes for enhancing homing to bone marrow in a subject.

[0060] For example, the population of hematopoietic cells, pharmaceutical compositions, and methods disclosed are intended to enhance bone marrow homing of immune cells engineered to detect, scavenge, and kill diseased cells within the body of a subject in need thereof, e.g., ahuman, e.g., a human diagnosed with cancer, e.g., AML.

[0061] The present disclosure describes systems and methods for immunotherapies. Immune cells described herein, e.g., NK cells and / or T-cells, can be engineered to exhibit enhanced bone marrow homing as compared to a control cell, e.g., a non-engineered immune cell. Immune cells can be engineered to exhibit enhanced half-life as compared to a control cell. Immune cells can be engineered to exhibit enhanced proliferation as compared to a control cell. Immune cells can be engineered to effectively and specifically target diseased cells, e.g., cancer cells, B cell, that a control cell otherwise is insufficient or unable to target. The engineered immune cells disclosed herein can be engineered ex vivo, in vitro, and in some cases, in vivo. The engineered immune cells that are prepared ex vivo or in vitro can be administered to a subject in need thereof to treat a disease, e.g., cancer, autoimmune disease, e.g., myeloma, lymphoma, solid tumors, systemic lupus erythematosus, lupus nephritis, autoimmune hemolytic anemia, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, systemic sclerosis, neuromyelitis optica spectrum disorder, idiopathic inflammatory myopathies, ANCA-associated vasculitis, autoimmune encephalitis, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. The engineered immune cells can be autologous to the subject. Alternatively, the engineered immune cells can be allogeneic to the subject.

[0062] We have evaluated the efficiency of bone marrow homing of engineered cells, e.g., hematopoietic cells, e.g., NK cells or T-cells, with respect to their expression of CXCR4. We have discovered that iPSC-derived NK cells show very low efficiency in infiltrating bone marrow, which acts to limit the potential efficacy of immunotherapies, particularly efficacy of immunotherapies against disease sites within bone marrow, e.g., in the treatment of cancer, e.g., AML. We have further discovered that iPSC-derived NK cells do not express high levels of CXCR4. Indeed, we observe an inverse correlation between CXCR4 expression and efficient bone marrow homing.

[0063] We have discovered that increasing the expression of CXCR4 in engineered immune cells, e.g., engineered NK (eNK) cells, e.g., CAR-NK cells, enhances bone marrow homing. We have further discovered that immune cells, e.g., eNKs, e.g., CAR-NK cells, expressing CXCR4 demonstrate improved cytotoxicity against tumor cells within bone marrow.

[0064] Additionally, we have surprisingly found that constitutive expression of CXCR4 in iPSCs inhibits differentiation of said iPSCs into immune cells, e.g., NK cells. Thus, we have developed a new platform to engineer an iPSC with conditional expression of CXCR4.

[0065] For example, we have developed an engineered iPSC with an inactive CXCR4 transgene wherein the iPSC is capable of successful differentiation into an immune cell, e.g., NK cell, wherein expression of CXCR4 is activated during and / or following differentiation of said iPSC into said immune cell, e.g., NK cell.

[0066] For example, in certain embodiments, the engineered cells are iPSCs comprising one or more transgenes. In certain embodiments, the engineered cells are iPSCs and the one or more transgenes exhibit conditional expression. In certain embodiments, the engineered cells are iPSCs, wherein the conditional expression of one or more transgenes is inactive, e.g., wherein the one or more transgenes comprise a CXCR4 transgene. In alternative embodiments, the engineered cells are hematopoietic cells, e.g., NK cells or T-cells, and wherein the conditional expression of one or more transgenes is active, e.g., wherein the one or more transgenes comprises a CXCR4 transgene, e.g., wherein the CXCR4 transgene is actively producing a functional gene product. In certain embodiments, the conditional expression of one or more transgenes activates upon differentiation of iPSCs, e.g., the one or more transgenes begin to express a functional protein product upon differentiation of said iPSCs, e.g., the one or more transgenes activate upon differentiation of iPSCs into hematopoietic cells, e.g., HSCs, e.g., NK cells or T-cells. In certain embodiments, the engineered cells are hematopoietic cells that are the progeny of the engineered iPSCs.

[0067] In certain embodiments, the conditional expression of one or more transgenes comprises a gene encoding the CXC motif chemokine receptor 4 (CXCR4) . In certain embodiments, the conditional expression of one or more transgenes is operably linked to a gene with low or no expression in one cell phenotype, but with high expression in a different cell phenotype, e.g., Granzyme B gene, e.g., wherein the one or more transgenes is inserted adjacent to and / or within the Granzyme B gene. In certain embodiments, the one or more transgenes, e.g., the one or more transgenes operably linked to a gene that is inactive while present in an iPSC. In certain embodiments, the one or more transgenes, e.g., the one or more transgenes operably linked to a Granzyme B gene, are active while present in a hematopoietic cell, e.g., NK cell or T-cell. In certain embodiments, the one or more transgenes, e.g., the one or more transgenes operably linked to a Granzyme B gene, is activated upon differentiation of the iPSC, e.g., the one or more transgenes begin to produce functional protein products during and / or following the differentiation of the iPSC, e.g., into a hematopoietic cell, e.g., NK cell or T-cell.

[0068] In certain embodiments, the conditional expression of one or more transgenes comprises wherein said one or more transgenes are operably linked to a gene with a constitutive promoter, wherein conditional expression of said one or more transgenes is accomplished by selective suppression of said constitutive promoter. For example, wherein the one or more transgenes are operably linked to a gene comprising a tetracycline-controlled Tet-Off and / or Tet-On expression system, e.g., as taught in “Tet-On Systems for Doxycycline-inducible Gene Expression” Current Gene Therapy 16 (3) : 156-167 (2016) , the contents of which are incorporated herein by reference.

[0069] In certain embodiments, the engineered cells home to the bone marrow of a subject such that the presence of engineered cells in the bone marrow post-infusion of said engineered cells is increased by at least 10%, e.g., at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%relative to a control, e.g., relative to isogenic cells, e.g., relative to the presence of engineered cells in peripheral blood.

[0070] In addition to comprising modifications enhancing bone marrow homing, the engineered cells can include modifications such as CAR constructs to target diseased cells effectively and specifically (e.g., cancer cells) that a control cell otherwise is insufficient or unable to target. For example, the engineered cells can include exogenous genes expressing CAR constructs or transgenes.

[0071] The disclosure thus provides engineered cells (Cell 1) [e.g., human cells, including (i) engineered stem cells, e.g., induced pluripotent stem cells (iPSCs) , and (ii) engineered hematopoietic cells, e.g., NK cells or T-cells (which engineered hematopoietic cells may be the progeny of the engineered stem cells, primary cells or the progeny of primary cells) ] , which have enhanced homing to the bone marrow of a subject, and which comprise one or more transgenes; optionally, wherein the one or more transgenes have conditional expression, such that the  expression of the one or more transgenes is dependent upon the phenotype of said engineered cells, wherein iPSCs which are so engineered can differentiate into hematopoietic cells, e.g.,  NK cells or T-cells.

[0072] For example, the disclosure provides: 1.1. Cell 1 wherein the engineered cells are induced pluripotent stem cells (iPSCs) . 1.2. Cell 1 wherein the engineered cells are derived from induced pluripotent stem cells  (iPSCs) . 1.3. Cell 1, Wherein the engineered cells are primary cells. 1.4. Cell 1 or 1.2 wherein the engineered cells are hematopoietic cells. 1.5. Cell 1.3 wherein the engineered cells are hematopoietic stem cells (HSCs) . 1.6. Cell 1.3 wherein the engineered cells are natural killer (NK) cells or primary NK  cells. 1.7. Cell 1.3 wherein the engineered cells are T cells or primary T cells. 1.8. Any foregoing engineered cells, wherein the engineered cells are iPSCs and the  conditional expression of one or more transgenes is inactive. 1.9. Any foregoing engineered cells, wherein the engineered cells are hematopoietic cells,  e.g., NK cells orT-cells, and the conditional expression of one or more transgenes is active. 1.10. Any foregoing engineered cells, wherein the conditional expression of one or  more transgenes activates upon differentiation of iPSCs, e.g., differentiation of iPSCs into hematopoietic cells, e.g., hematopoietic stem cells, e.g., NK cells or T-cells.  1.11. Any foregoing engineered cells, wherein the conditional expression of one or  more transgenes is operably linked to a gene inactive in iPSCs and active in differentiated cells, e.g., hematopoietic cells, e.g., HSCs, e.g., NK cells or T-cells. 1.12. Any foregoing engineered cells, wherein the enhanced homing to the bone  marrow of the subject is induced by expression, e.g., conditional expression, of one or more transgenes therein; e. g wherein the engineered cells are NK cells or T cells. 1.13. Any foregoing engineered cells, wherein the one or more transgenes is operably  linked to a heterologous promoter, e.g., wherein the heterologous promoter is a promoter that in a nontransgenic cell is operably linked to NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, DNAM1, CD96, NKG2A, CD56, IFN-γ, perforin, CD34, CD45, DAP12, DAP10, CD3D, CD3E, CD7, IL2Rg, LTB, CD52, TRAC, or Granzyme B. 1.14. Any foregoing engineered cells, wherein the incorporation, e.g., knock-in, of the  one or more transgenes does not interfere with the differentiation of iPSCs comprising the one or more transgenes, e.g., differentiation into selected hematopoietic cells, e.g., NK cells or T-cells. 1.15. Any foregoing engineered cells, wherein the expression of the one or more  transgenes does not interfere with the differentiation of iPSCs comprising the one or more transgenes, e.g., differentiation into selected hematopoietic cells, e.g., NK cells or T-cells. 1.16. Any foregoing engineered cells, wherein the expression of the one or more  transgenes is stable, e.g., constitutive expression, e.g., capable of or exhibiting long-term expression, e.g., capable of or exhibiting expression after one or more rounds of cell division / multiplication. 1.17. Any foregoing engineered cells, wherein the expression of the one or more  transgenes is unstable or transient, e.g., non-constitutive expression, e.g., not exhibiting or incapable of long-term expression, e.g., not exhibiting or incapable of expression after one or more rounds of cell division / multiplication. 1.18. Any foregoing engineered cells, wherein the one or more transgenes comprises  one or more ofCXCR4, CDH1, CXCR6, CCR1, CXCR1, CXCR3, CXCR7, e.g., CXCR4. 1.19. Any foregoing engineered cells, wherein constitutive expression of the one or  more transgenes induces one or more negative impacts on the cells, wherein the one or more negative impacts comprise reduced or atypical iPSC pluripotency, and / or reduced or atypical differentiation, development, and / or function of NK cells or T-cells; and wherein conditional expression of the one or more transgenes effectively reduces, e.g., negates, e.g., eliminates, the one or more negative impacts on the cells. 1.20. Any foregoing engineered cells, wherein the one or more transgenes is operably  linked to a heterologous promoter, wherein the heterologous promoter provides conditional expression of the transgene, such that (i) expression of the one or more transgenes in iPSCs comprising said one or more transgenes is not expressed at a level that interferes with the differentiation of iPSCs, e.g., differentiation into hematopoietic cells, e.g., NK cells or T-cells; and / or (ii) the one or more transgenes is highly expressed in hematopoietic cells, e.g., NK cells or T-cells; 1.21. Any foregoing engineered cells wherein the one or more transgenes comprises  one or more of CXCR4, CDH1, CXCR6, CCR1, CXCR1, CXCR3, or CXCR7. 1.22. Any foregoing engineered cells wherein the heterologous promoter is a promoter  that in non-transgenic cells is operably linked to NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, DNAM1, CD96, NKG2A, CD56, IFN-γ, perforin, CD34, CD45, DAP12, DAP10, CD3D, CD3E, CD7, IL2Rg, LTB, CD52, TRAC, or Granzyme B; e.g., wherein the heterologous promoter is a Granzyme B promoter. 1.23. Any foregoing engineered cells, wherein the expression of one or more transgenes  is operably linked to a promoter for a gene that is highly expressed in NK cells, NK progenitor cells, iPSC-derived NK cells, or progeny thereof, e.g., wherein the expression of one or more transgenes is under control of a promoter that in non-transgenic cells is operably linked to NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, DNAM1, CD96, NKG2A, CD56, interferon-gamma (IFN-γ) , perforin, CD34, CD45, DAP12, DAP10, or Granzyme B; e.g. under control of a Granzyme B promoter. 1.24. Any foregoing engineered cells, wherein the conditional expression of one or  more transgenes is operably linked to a promoter for a gene that is highly expressed in NK cells, NK progenitor cells, iPSC-derived NK cells, or progeny thereof; e.g., wherein the conditional expression of one or more transgenes is under control of a promoter that in non-transgenic cells is operably linked to NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, DNAM1, CD96, NKG2A, CD56, interferon-gamma (IFN-γ) , perforin, CD34, CD45, DAP12, DAP10, or Granzyme B e.g., under control of a Granzyme B promoter. 1.25. Any foregoing engineered cells, wherein the expression of one or more transgenes  is operably linked to a promoter for a gene that is highly expressed in T-cells, including double-negative (CD4-CD8-) T-cells, double-positive (CD4+CD8+) T-cells, single-positive (CD4-CD8+or CD4+CD8-) T-cells, memory T-cells, effector T-cells, iPSC-derived T-cells, or progeny thereof; e.g., wherein the one or more transgenes is operably linked to a promoter that in non-transgenic cells is operably linked to CD34, CD45, CD3D, CD3E, CD7, IL2Rg, LTB, CD52, TRAC, or Granzyme B; e.g., is operably linked to a Granzyme B promoter. 1.26. Any foregoing engineered cells, wherein the conditional expression of one or  more transgenes is: a. more active in differentiated cells, e.g., hematopoietic cells, e.g., hematopoietic  stem cells, NK cells, or T-cells, relative to pluripotent stem cells; b. less active or inactive in pluripotent stem cells, e.g., induced pluripotent stem  cells (iPSCs) , relative to hematopoietic cells; and / or c. activated upon differentiation of iPSCs, e.g., differentiation of iPSCs into  hematopoietic cells, e.g., hematopoietic stem cells, NK cells, or T-cells. 1.27. Any foreign engineered cells, wherein the constitutive expression of one or more  transgenes induces one or more negative impacts on the cells, wherein the one or more negative impacts comprise (i) reduced or atypical iPSC pluripotency, and / or (ii) reduced or atypical differentiation, development, and / or function of NK cells or T-cells, and wherein conditional expression of the one or more transgenes (e.g. significantly higher (e.g., 2x, 5x, or 10x) expression in NK cells or T cells relative to iPSCs) effectively reduces, e.g., negates, e.g., eliminates, the one or more negative impacts on the cells. 1.28. Any foregoing engineered cells, wherein the conditional expression of one or  more transgenes is under control of a promoter that is highly expressed in T-cells, including double-negative (CD4-CD8-) T-cells, double-positive (CD4+CD8+) T-cells, single-positive (CD4-CD8+or CD4+CD8-) T-cells, memory T-cells, effector T-cells, iPSC-derived T-cells, or progeny thereof; e.g., wherein the conditional expression of one or more transgenes is under control of a promoter that in non-transgenic cells is operably linked to CD34, CD45, CD3D, CD3E, CD7, IL2Rg, LTB, CD52, TRAC, or Granzyme B; e.g., under control of a Granzyme B promoter. 1.29. Any foregoing engineered cells, wherein the one or more transgenes is operably  linked to a Granzyme B promoter, e.g., wherein the one or more transgenes is inserted adjacent to and / or within the Granzyme B gene. 1.30. Any foregoing engineered cells, wherein the one or more transgenes conditionally  express one or more chemokine receptors, e.g., one or more of CXCR4, CXCR6, CCR1, CXCR1, CXCR3, CXCR7, e.g., CXCR4. 1.31. Any foregoing engineered cells, wherein the one or more transgenes conditionally  express CXCR4. 1.32. Any foregoing engineered cells, wherein the engineered cells are NK cells  expressing CXCR4, e.g., wherein the NK cells are derived from iPSCs and express CXCR4 at a higher level than the iPSCs from which they were derived. 1.33. Any foregoing engineered cells, wherein the chemokine receptor gene, e.g.,  CXCR4 gene, corresponds to or is derived from a mammal, e.g., a human, mouse, rat, dog, cow, or monkey, e.g., a human or monkey. 1.34. Any foregoing engineered cells, wherein the one or more transgenes comprise a  transgene that expresses a chemokine receptor which is modified, e.g., wherein the one or more transgenes comprise a transgene that expresses a CXCR4 protein that comprises one or more sequence modifications, e.g., a C-terminus truncation and / or one or more single nucleotide polymorphisms (SNPs) , e.g., CXCR4 S342X and / or CXCR4 R338X, wherein X is any amino acid. 1.35. Any foregoing engineered cells, wherein the engineered cells home to the bone  marrow of the subject such that the presence of engineered cells is increased in the bone marrow by at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%relative to a control, e.g., relative to isogenic cells, e.g., relative to the presence of engineered cells in peripheral blood, e.g., in an in vivo assay as described in the Examples below. 1.36. Any foregoing engineered cells, wherein the engineered cells further comprise  one or more transgene encoding one or more chimeric antigen receptor (CAR) construct. 1.37. The engineered cells of Cell 1.30, wherein the CAR construct expresses a CAR  receptor on the surface of the engineered cell. 1.38. The engineered cells of Cell 1.30 or 1.31, wherein the engineered cells expressing  CAR constructs are capable of cell-mediated cytotoxicity through a CAR-dependent pathway. 1.39. Any foregoing engineered cells, comprising two or more transgenes, said  transgenes comprising coding regions for two or more CAR constructs. 1.40. The engineered cells of Cell 1.33, wherein the engineered cells express the two or  more CAR constructs simultaneously, e.g., wherein both CAR construct protein products are present on the cell surface. 1.41. Any foregoing engineered cells, wherein the cells are CAR-NK cells or CAR-T  cells. 1.42. Any foregoing engineered cells, wherein the CAR construct (s) are operably  linked to a heterologous promoter, wherein the heterologous promoter is a constitutive promoter, e.g., selected from the CAG promoter, the adenovirus major late promoter, the human cytomegalovirus immediate early promoter (hCMV-IE) , the SV40 and Rous Sarcoma virus promoters, the murine 3-phosphoglycerate kinase promoter, the translation elongation factor 1α (EF-1α) promoter, and the human ubiquitin C promoter; e.g., the CAG promoter. 1.43. Any foregoing engineered cells, wherein the subject is a mammal, e.g., a human. 1.44. Any foregoing engineered cells, wherein the cells or their progeny, when  engrafted into a subject, remain in circulation for at least 15 days, e.g., at least 30 days, e.g., at least 60 days. 1.45. Any foregoing engineered cells which are iPSCs or NK cells derived from said  iPSCs. 1.46. Any foregoing engineered cells which are iPSCs, NK cells, T-cells, B-cells,  macrophages, monocytes, cardiomyocytes, islet cells, neural cells, or endothelial cells; e.g., iPSCs, NK cells, T-cells, B-cells, macrophages, monocytes, cardiomyocytes, islet cells, neural cells, or endothelial cells derived from said iPSCs; e.g., NK cells derived from said iPSCs. 1.47. Any foregoing engineered cells which express, e.g., conditionally express, one or  more transgenes comprising CXCR4, e.g., wherein the one or more transgenes are operably linked to a Granzyme B promoter; wherein the engineered cells display enhanced bone marrow homing relative to a control, e.g., relative to isogenic cells, e.g., relative to the presence of engineered cells in peripheral blood, e.g., in an in vivo assay as described in the Examples below. 1.48. Any foregoing engineered cells which conditionally express one or more  transgenes comprising CXCR4, wherein the one or more transgene is not expressed in iPSCs, and wherein the one or more transgene is expressed during and / or following differentiation of said iPSCs, e.g., differentiation into hematopoietic cells, e.g., HSCs, e.g., NK cells or T-cells. 1.49. Any foregoing engineered cells for use in treating a disease or condition in a  patient in need thereof. 1.50. The foregoing engineered cells wherein the patient is a human. 1.51. Any foregoing engineered cells wherein the transgenes are derived from  mammalian genes, e.g., human, monkey, cattle, dog, mouse, or rat, preferably human or monkey. 1.52. Any foregoing engineered cells in a pharmaceutical composition comprising the  engineered cells in a pharmaceutically acceptable carrier, suitable for administration by injection, e.g., via intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrathecal, or intraosseous injection. 1.53. Any foregoing engineered cells for use in treating cancer, e.g., comprising  administering a composition comprising any foregoing cells to a patient in need thereof. 1.54. Any foregoing engineered cells for use in treating cancer, e.g., blood cancer, bone  cancer, lung cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, renal cell cancer, or breast cancer, e.g., acute myeloid leukemia (AML) , acute lymphoblastic leukemia, Burkitt lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia. 1.55. Any foregoing engineered cells for use in treating an auto-immune disease or  condition, e.g., systemic lupus erythematosus, lupus nephritis, autoimmune hemolytic anemia, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, systemic sclerosis, neuromyelitis optica spectrum disorder, idiopathic inflammatory myopathies, ANCA-associated vasculitis, autoimmune encephalitis, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, e.g., comprising administering a composition comprising any foregoing cells to a patient in need thereof. 1.56. Any foregoing engineered cells for use in treating a disease or condition, e.g.,  cancer or auto-immune disease, comprising multiple on-demand administrations. 1.57. Any foregoing engineered cells for use in treating blood cancer or a solid tumor,  e.g., myeloma or lymphoma, e.g., comprising administering a composition comprising iPSCs, differentiated immune cells (e.g., NK cells, T-cells, B-cells, NKT-cells, macrophages, or monocytes) , or differentiated immune cells derived from said iPSCs. 1.58. Any foregoing engineered cells for use in treating an autoimmune disease, e.g.,  comprising administering a composition comprising iPSCs, differentiation immune cells (e.g., NK cells, T-cells, B-cells, NKT-cells, macrophages, or monocytes) , or differentiated immune cells derived from said iPSCs. 1.59. Any foregoing engineered cells for use in regenerative medicine treatments, e.g.,  cardiomyocyte transplantation for heart injury or failure, islet cell transplantation for diabetes, neural progenitor cell transplantation for stroke or central nervous system disorders / injury, e.g., comprising administering a composition comprising iPSCs, NK cells, T cells, B cells, macrophages, monocytes, cardiomyocytes, islet cells, neural cells, neural progenitor cells, endothelial cells, mesenchymal cells, or are said cells derived from said iPSCs. 1.60. Any foregoing engineered cells for use in the manufacture of a medicament for  use in treating cancer or an auto-immune disease or condition, e.g., comprising administering a composition comprising any foregoing cell to a patient in need thereof. 1.61. The progeny of any foregoing engineered cells. 1.62. A pharmaceutical composition comprising engineered cells according to any of  the foregoing engineered cells in a pharmaceutically acceptable carrier suitable for injection, e.g., suitable for intravenous infusion, e.g., for use in treating a disease or condition in a human patient, e.g., for use in treating cancer or an auto-immune disease or condition.

[0073] The disclosure further provides a pharmaceutical composition comprising engineered cells according to any of Cell 1, et seq., in a pharmaceutically acceptable carrier suitable for injection, e.g., suitable for intravenous infusion. For example, the pharmaceutically acceptable carrier suitable for intravenous infusion may be an isotonic saline solution, e.g., 0.9%w / v saline solution, lactate Ringer’s solution, or an isotonic solution formulated for cell culture or therapy, e.g., an isotonic solution comprising physiologically acceptable levels of sodium chloride, dextrose, electrolytes, albumin, and optionally a cryopreservative [e.g., comprising 31.25% (v / v) of Plasma-Lyte A, 31.25% (v / v) of 5%Dextrose / 0.45%sodium chloride, 10%Dextran 40 (LMD)  / 5%Dextrose, 20% (v / v) of 25%Human Serum Albumin (HSA) , and 7.5% (v / v)  dimethylsulfoxide (DMSO) ] . In certain embodiments, the pharmaceutical composition is frozen during storage and thawed upon administration to the patient. The engineered cells according to any of Cell 1, et seq., include, for example, engineered cells wherein the cells are allogeneic with respect to the patient and wherein the cells or their progeny, when engrafted into a recipient, remain in circulation for at least 15 days, e.g., for at least 30 days, e.g., for at least 60 days; e.g., wherein the population comprises NK cells or T-cells wherein the one or more genes transfected into the cells comprise CXCR4.

[0074] In a further embodiment, the disclosure provides a method of treating a disease, condition, or pathology, e.g., cancer or an auto-immune disease or condition, comprising administering engineered cells according to any of Cell 1, et seq., or a pharmaceutical composition comprising engineered cells according to any of Cell 1, et seq., to a subject in need thereof, e.g., wherein the cells are allogeneic with respect to the subject and wherein the engineered cells exhibit enhanced homing to bone marrow within the subject; e.g., wherein the cells or their progeny, when engrafted into a recipient, remain in circulation for at least 15 days, e.g., for at least 30 days, e.g., for at least 60 days; e.g., wherein the population comprises NK cells and / or T-cells wherein the one or more genes transfected into the cells comprises CXCR4.

[0075] In a further embodiment, the disclosure provides a method of treating a disease or condition, e.g., characterized by a disease site located within, adjacent to, or peripheral to bone marrow, comprising administering a composition comprising any of Cell 1, et seq., to a patient in need thereof, wherein the disease or condition is: a. cancer, e.g., blood cancer (e.g., myeloma or lymphoma) , bone cancer, lung cancer,  colorectal cancer, pancreatic cancer, renal cell cancer, or breast cancer; e.g., acute myeloid leukemia (AML) , acute lymphoblastic leukemia, Burkitt lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia; b. an auto-immune disease or condition, e.g., an auto-immune disease or condition  mediated by B cells, e.g., B cells in circulation and / or in bone marrow, e.g., systemic lupus erythematosus, lupus nephritis, autoimmune hemolytic anemia, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, systemic sclerosis, neuromyelitis optica spectrum disorder, idiopathic inflammatory myopathies, ANCA-associated vasculitis, autoimmune encephalitis, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy; c. a condition requiring replacement or regeneration of depleted cells, e.g., wherein the  replacement or regeneration requires localization or homing of engineered cells to bone marrow; for example, wherein the cells are selected from iPSCs and hematopoietic cells, e.g., NK  cells; e.g., wherein the cells are autologous or allogeneic with respect to the patient, e.g., wherein the cells are allogeneic NK cells.

[0076] In a further embodiment, the disclosure provides a method of making hematopoietic cells wherein said cells exhibit conditional expression of one or more transgenes such that the engineered cells have enhanced bone marrow homing, comprising culturing a population of engineered induced pluripotent stem cells (iPSCs) , e.g., according to Cell 1.1, under conditions which induce differentiation of the engineered iPSCs into engineered hematopoietic cells, e.g., engineered cells according to any of Cell 1, or Cell 1.2, et seq.; e.g., wherein the one or more transgenes comprise CXCR4; e.g., wherein the hematopoietic cells are NK cells and the conditions which induce differentiation of the iPSCs into hematopoietic cells are conditions which further induce differentiation into NK cells; or wherein the hematopoietic cells are T-cells and the conditions which induce differentiation of the iPSCs into hematopoietic cells are conditions which further induce differentiation into T-cells.

[0077] In a further embodiment, the disclosure provides a means for providing conditional expression of one or more transgenes in an engineered cell, such that the engineered cell exhibits enhanced bone marrow homing. In certain embodiments, the means for providing conditional expression may be through insertion of one or more transgenes into an engineered cell wherein the one or more transgenes is operably linked to a gene with low or no expression when said engineered cell exhibits one phenotype but wherein said gene is highly expressed when the engineered cell exhibits a different phenotype. In certain embodiments, the one or more transgenes comprises CXCR4.EXAMPLESExample 1: Cells expressing CXCR4 home to bone marrow

[0078] Through a virus transduction system, engineered natural killer (eNK) cells are engineered to express an operably linked CXCR4 and green fluorescent protein construct (CXCR4-GFP) , wherein the fluorescent marker is used to identify the successfully modified cells. In parallel, another group of cells is modified with an operably linked luciferase and green fluorescent protein vector (Luc-GFP) to act as a control group. See Figs. 1-3. Both populations of engineered cells are transfused into immunodeficient NOG mice, wherein the homing of said cells to bone marrow is monitored. The eNK cells expressing CXCR4 demonstrate efficient homing to bone marrow, while the control group show limited cells capable of penetrating into the bone marrow, as depicted in Figs. 4-7.

[0079] More specifically, Fig. 4 demonstrates that the CXCR4-GFP eNK cells are significantly more present in the bone marrow (BM) samples relative to the Luc-GFP control cells, which show no significant enhancement of bone marrow homing relative to the unmodified control cells identified by CD56+staining (a canonical marker for NK cells) . This trend holds both at 7 days post-infusion (D7) and 14 days post-infusion (D14) . Fig. 5 shows that of the total CD56+NK cells present in the mice, NK cells are more prominent in peripheral blood (PB) than bone marrow (BM) , and that the presence of CD56+NK cells increases from D7 to D14 post-infusion. Notably, the relative bone marrow homing between the CXCR4-GFP cells and the Luc-GFP cells is maintained, with the CXCR4-GFP eNK cells displaying enhanced bone marrow homing relative to control groups. Fig. 6 demonstrates that eNK cells expressing CXCR4-GFP are more prominent in bone marrow (BM) than peripheral blood (PB) , demonstrating a significant preference in bone marrow homing of CXCR4+eNK cells. We note here that NK cells typically have low-level expression of CXCR4, and thus the Luc-GFP cells may be identified using CXCR4 markers; however, typical NK cells express CXCR4 at levels insufficient to induce effective selective homing to bone marrow and should not be construed as “CXCR4+” as used in the context of the eNK cells expressing the desired CXCR4-GFP construct. Fig. 7 depicts that, among all the engineered cells, the eNK cells expressing CXCR4 demonstrate significant preference for bone marrow homing, while the Luc-GFP control shows no significant difference between peripheral blood (PB) and bone marrow (BM) localization. Example 2: CXCR4 expression inhibits iPSC differentiation

[0080] Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are engineered to express CXCR4. The CXCR4 is observed to yield effective expression levels in iPSCs, yet this modification is found to inhibit the differentiation of the iPSCs into NK cells. iPSCs modified with a control vector exhibit efficient differentiation to NK cells. However, iPSCs displaying low levels of CXCR4 expression display inhibition of differentiation to NK cells, and the CXCR4 expression is disrupted in the NK cells derived from said CXCR4+iPSCs. Without wishing to be bound by theory, these data suggest that iPSCs with low to silent expression of CXCR4 undergo a selection process, wherein the reduced expression of CXCR4 allows for differentiation of iPSCs to NK cells.

[0081] Figs. 8-11 depict the inhibition of CXCR4+iPSC differentiation to NK cells. Fig. 8, left, depicts the expression of CXCR4 in a variety of iPSC clones. Fig. 8, right, depicts the healthy phenotype of iPSCs engineered to express CXCR4. However, as depicted in Fig. 9, the induced differentiation of said iPSCs into NK cells yields varying results, with the success of differentiation inversely correlated with CXCR4 expression. Notably, high expression levels of CXCR4 led to cell death (i.e., H3 D5 and H5 D5) , while low (i.e., L4 and L6) to no (e.g., effectively no, e.g., basal level, i.e., ANB) expression of CXCR4 allowed for a visually healthy cell phenotype. Fig. 10 depicts the inhibition of differentiation of the iPSCs into induced NK (iNK) cells, wherein efficiency of differentiation of iPSCs into iNKs is inhibited from 87.80%in the ANB isotypic control to 64.90%and 46.20%in the iPSCs with low level expression of CXCR4 at day 21 (iNK D21) . Similarly, at day 23 (iNK D23) , the ANB isotypic control exhibits 96.65%differentiation efficiency, while the iPSCs with low level expression of CXCR4 display 83.12%and 69.04%differentiation efficiency. Of those cells capable of differentiation, the resultant iNK cells display very low expression of CXCR4, as depicted in Fig. 11.

[0082] Example 3: Conditional knock-in of CXCR4 allows differentiation of iPSCs into NK cells with CXCR4 expression

[0083] Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are engineered with a targeted knock-in of CXCR4 into an endogenous gene (i.e., Granzyme B) inactive in iPSCs but with expression activated at the NK stage of differentiation, e.g., the expanded NK (eNK) stage of differentiation. This targeted knock-in is also used to introduce blue fluorescent protein (BFP) into the engineered construct as a positive control. The iPSCs engineered with the conditional knock-in can successfully differentiate into NK cells, wherein the expression of CXCR4 is activated upon successful differentiation into the NK stage. More specifically, in this example, the iPSCs engineered with the conditional knock-in can successfully differentiate into NK cells, wherein the iPSCs first differentiate into iNK cells, which are subsequently expanded (i.e., proliferated) to provide eNK cells. The engineered eNK cells derived from said iPSCs show high CXCR4 expression levels compared to various endogenous NK cells found in peripheral blood (PBNK) . Importantly, the eNKs exhibit typical antitumor function relative to mature eNKs absent the CXCR4 transgene.

[0084] Granzyme B sequence (SEQ ID NO: 7) :

[0085]

[0086] Fig. 12 depicts a schematic overview of the conditional knock-in strategy, wherein the CXCR4-GFP vector is inserted within the Granzyme B locus, allowing conditional expression of CXCR4 upon differentiation of engineered iPSCs into eNK cells.

[0087] Fig. 13 demonstrates fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of transgene expression in iPSCs. In these experiments, “AL” clones are cells modified at the iPSC stage with the CXCR4 knock-in using the conditional knock-in strategy at the Granzyme B locus; alternatively, “AM” clones are cells modified at the iPSC stage with BFP (i.e., without CXCR4) knock-in using the conditional knock-in strategy at the Granzyme B locus, which is used as a control, e.g., an engineering control. Notably, the AL clones exhibit effectively no CXCR4 expression at the iPSC stage (i.e., 0.56%, 0.35%, and 0.39%of cells from clones AL-21, AL-43, and AL-59, respectively, are measured to be CXCR4+) . Correspondingly, the AM clones exhibit effectively no BFP expression at the iPSC stage (i.e., 0.26%, 0.35%, 0.10%, and 0.27%of cells from clones AM-8, AM-18, AM-19, and AM-28, respectively, are measured to be BFP+) .

[0088] Fig. 14 demonstrates FACS analysis of gene expression, e.g., transgene expression, in iNKs at day 18, wherein the iPSCs of Fig. 13 have undergone the initial differentiation process into NK cells. Herein, ANB cells are used as a non-modified (i.e., non-engineered) control, wherein expression of any genes represents basal levels of gene expression, e.g., naturally-occurring levels of gene expression. Fig. 14 shows that at day 18 of the iNK stage, the AL clones exhibit moderate Granzyme B expression and low, i.e., basal level, CXCR4 expression (i.e., 41.91% / 0.96%, 8.55% / 1.59%, and 41.99% / 0.58%of cells from clones AL-21, AL-43, and AL-59, respectively, are measured to be Granzyme B+ / CXCR4+) . Correspondingly, at day 18 of the iNK stage, the AM clones exhibit moderate BFP expression (i.e., 24.83%, 32.26%, 6.12%, and 16.52%of cells from clones AM-8, AM-18, AM-19, and AM-28, respectively, are measured to be BFP+) . Additionally, at day 18 of the iNK stage, the ANB clone is observed to have moderate expression of Granzyme B and low, i.e., basal level and / or false positive, expression of CXCR4 and BFP (i.e., 59.08% / 0.75% / 0.75%of ANB cells are measured to be Granzyme B+ / CXCR4+ / BFP+) .

[0089] Fig. 15 demonstrates FACS analysis of gene expression, e.g., transgene expression, in iNKs at day 22. At day 22 of the iNK stage, the AL clones exhibit moderate to high expression of Granzyme B and above-basal level expression of CXCR4 (i.e., 74.19% / 3.11%, 16.80% / 6.33%, and 76.03% / 2.24%of cells from clones AL-21, AL-43, and AL-59, respectively, are measured to be Granzyme B+ / CXCR4+) . Correspondingly, at day 22 of the iNK stage, the AM clones exhibit moderate to high BFP expression (i.e., 53.49%, 53.19%, 31.82%, and 32.31%of cells from clones AM-8, AM-18, AM-19, and AM-28, respectively, are measured to be BFP+) . Additionally, at day 22 of the iNK stage, the ANB clone is observed to have moderate expression of Granzyme B and low, i.e., basal level and / or false positive, expression of CXCR4 and BFP (i.e., 77.19% / 1.51% / 1.51%of ANB cells are measured to be Granzyme B+ / CXCR4+ / BFP+) .

[0090] Fig. 16 demonstrates FACS analysis of gene expression, e.g., transgene expression, in eNKs at day 7, wherein the eNKs are expanded, i.e., matured and / or proliferated and / or progeny, from the iNKs of Fig. 15. At day 7 of the eNK stage, the AL clones exhibit high expression levels of Granzyme B and CXCR4 (i.e., 99.93% / 62.60%, 99.62% / 82.72%, 99.98% / 66.43%of cells from clones AL-21, AL-43, and AL-59, respectively, are measured to be Granzyme B+ / CXCR4+) . Correspondingly, at day 7 of the eNK stage, the AM clones exhibit high BFP expression (i.e., 98.65%, 93.94%, 96.17%, and 97.10%of cells from clones AM-8, AM-18, AM-19,and AM-28, respectively, measured to be BFP+) . Additionally, at day 7 of the eNK stage, the ANB clone is observed to have high expression of Granzyme B and low, i.e., basal level and / or false positive, expression of CXCR4 and BFP (i.e., 99.98% / 1.70% / 1.70%of ANB cells are measured to be Granzyme B+ / CXCR4+ / BFP+) .

[0091] Importantly, Fig. 13-16 demonstrate that engineered cells do not exhibit significant expression of any of Granzyme B, CXCR4, or BFP while at the iPSC stage; however, expression of Granzyme B, and corresponding expression of CXCR4 and BFP in the AL and AM clones, respectively, are activated (i.e., conditionally expressed) upon differentiation of the iPSC cells into iNK cells and subsequent expansion into eNK cells.

[0092] Fig. 17 demonstrates the relative expression levels of CXCR4 as shown via qPCR across a variety of engineered clones. Fig. 18 demonstrates that engineered CXCR4+eNKs exhibit effective cytotoxicity against tumor cells in vitro, namely against cancer cell line THP1, relative to non-engineered eNK cells.

Claims

1.Engineered cellsa. which have enhanced homing to the bone marrow of a subject; andb. which comprise one or more transgenes;c. optionally, wherein the one or more transgenes are conditionally expressed, such that the expression of the one or more transgenes is dependent upon the phenotype of said engineered cells;wherein iPSCs which are so engineered can differentiate into hematopoietic cells.2.The engineered cells of Claim 1, wherein the enhanced homing to the bone marrow of a subject is induced by expression, e.g., conditional expression, of one or more transgenes therein.3.The engineered cells of any of the preceding claims, wherein the conditional expression of one or more transgenes is:a. more active in differentiated cells, e.g., hematopoietic cells, e.g., hematopoietic stem cells, NK cells, or T-cells, relative to pluripotent stem cells;b. less active or inactive in pluripotent stem cells, e.g., induced pluripotent stem cells (iPSCs) , relative to hematopoietic cells; and / orc. activated upon differentiation of iPSCs, e.g., differentiation of iPSCs into hematopoietic cells, e.g., hematopoietic stem cells, NK cells, or T-cells.4.The engineered cells of any of the preceding claims, wherein the constitutive expression of one or more transgenes induces one or more negative impacts on the cells, wherein the one or more negative impacts comprise (i) reduced or atypical iPSC pluripotency, and / or (ii) reduced or atypical differentiation, development, and / or function of NK cells or T-cells, and wherein conditional expression of the one or more transgenes (e.g. significantly higher (e.g., 2x, 5x, or 10x) expression in NK cells or T cells relative to iPSCs) effectively reduces, e.g., negates, e.g., eliminates, the one or more negative impacts on the cells.5.The engineered cells of any of the preceding claims, wherein the one or more transgenes is operably linked to a heterologous promoter, wherein the heterologous promoter provides conditional expression of the transgene, such that (i) expression of the one or more transgenes in iPSCs comprising said one or more transgenes is not expressed at a level that interferes with the differentiation of iPSCs, e.g., differentiation into hematopoietic cells, e.g., NK cells or T-cells; and / or (ii) the one or more transgenes is highly expressed in hematopoietic cells, e.g., NK cells or T-cells; optionally wherein the heterologous promoter is a promoter that in non-transgenic cells is operably linked to NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, DNAM1, CD96, NKG2A, CD56, IFN-γ, perforin, CD34, CD45, DAP12, DAP10, CD3D, CD3E, CD7, IL2Rg, LTB, CD52, TRAC, or Granzyme B, e.g., TRAC or Granzyme B, e.g., Granzyme B.6.The engineered cells of any of the preceding claims, wherein the one or more transgenes are each operably linked to a promoter for a gene that is highly expressed in hematopoietic cells, e.g., NK cells or T-cells, e.g., double-negative (CD4-CD8-) T-cells, double-positive (CD4+CD8+) T-cells, single-positive (CD4-CD8+or CD4+CD8-) T-cells, memory T-cells, effector T-cells, iPSC-derived T-cells, or progeny thereof.7.The engineered cells of any of the preceding claims, wherein the one or more transgenes comprise CDH1, CXCR4, CXCR6, CCR1, CXCR1, CXCR3, CXCR7, or combinations thereof; e.g., CXCR4.8.The one or more transgenes of claim 7, Wherein is expressed in primary immune, e.g., primary T cells, primary NK cells, to enhance the bone marrow homing function of the primary immune cells.9.The engineered cells of claim 7, wherein the one or more transgenes, e.g., the one or more chemokine receptor genes, is derived from a mammal, e.g., a human, mouse, rat, dog, cow or monkey, e.g., a human or monkey, e.g., a human.10.The engineered cells of any of the preceding claims, wherein the one or more transgenes comprise one or more modified transgenes, e.g., wherein the one or more transgenes comprise a modified chemokine receptor gene, e.g., wherein the wherein the one or more transgenes comprise a gene expressing a protein product that has a C-terminus truncation and / or one or more single nucleotide polymorphism (SNP) , e.g., wherein the one or more transgenes comprise a modified chemokine receptor gene expressing CXCR4 S342X and / or CXCR4 R338X.11.The engineered cells of any of the preceding claims, wherein the engineered cells home to the bone marrow of the subject such that the presence of engineered cells is increased in the bone marrow by at least 10%relative to a control.12.The engineered cells of any of the preceding claims, wherein the cells further comprise one or more transgene comprising a coding region for one or more chimeric antigen receptor (CAR) construct; optionally wherein the engineered cells express a CD19-CAR and / or a BCMA-CAR; for example, wherein the engineered cells are CD19-CAR-T cells, BCMA-CAR-T cells, or CD19 / BCMA-CAR-T cells.13.The engineered cells of any of the preceding claims, wherein the cells or their progeny express, e.g., conditionally express, CXCR4, e.g., wherein the cells comprise a transgene comprising a coding region for CXCR4 operably linked to a Granzyme B promoter; wherein the engineered cells display enhanced bone marrow homing relative to a control.14.The engineered cells of any of the preceding claims, wherein the cells or their progeny comprise one or more transgenes that conditionally express CXCR4, wherein the CXCR4 is not expressed (or is only weakly or basally expressed) in iPSCs, and wherein the CXCR4 expression is elevated during and / or following differentiation of said iPSCs, e.g., differentiation into hematopoietic cells, e.g., hematopoietic stem cells, e.g., NK cells or T-cells.15.Use of the engineered cells of any of the preceding claims in treating a disease or condition in a subject in need thereof; e.g., wherein the subject is a human; e.g., wherein the disease or condition is cancer or an auto-immune disease or condition; e.g., comprising administering a composition comprising iPSCs, differentiation immune cells (e.g., NK cells, T-cells, B-cells, macrophages, or monocytes) , or differentiated immune cells derived from said iPSCs.16.A pharmaceutical composition comprising the engineered cells of any of the preceding claims, and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent; e.g., a pharmaceutical composition suitable for administration by injection; e.g., via intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrathecal, or intraosseous injection.17.A method for treating a disease or condition in a subject in need thereof, comprising administering to the patient in need thereof an effective amount of the engineered cells of any of Claims 1-14, or the pharmaceutical composition of Claim 16;wherein the disease or condition is cancer, e.g., blood cancer, bone cancer, lung cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, renal cell cancer, or breast cancer; e.g., acute myeloid leukemia (AML) , acute lymphoblastic leukemia, Burkitt lymphoma, non-Hodgkin’s lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, or chronic myelogenous leukemia; orwherein the disease or condition is an auto-immune disease or condition, e.g., systemic lupus erythematosus, lupus nephritis, autoimmune hemolytic anemia, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, systemic sclerosis, neuromyelitis optica spectrum disorder, idiopathic inflammatory myopathies, ANCA-associated vasculitis, autoimmune encephalitis, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy e.g., wherein the treatment of said auto-immune disease or condition requires enhanced homing to bone marrow; orwherein the disease or condition requires multiple on-demand administrations.18.A method of making the hematopoietic cells according to any of Claims 1-14, comprising culturing the iPSCs according to any of claims 1-14 under conditions which induce differentiation of the iPSCs into hematopoietic cells, e.g., NK cells or T-cells.19.Any foregoing claim, wherein the subject is a human.

Images