Circular RNA-based therapeutic vaccine for treating solid tumor

Abstract

Provided are a method and a composition utilizing circular RNA as a vaccine for cancer treatment, and with a design specifically targeting the MHC presentation pathway.

Description

CIRCULAR RNA-BASED THERAPEUTIC VACCINE FOR TREATING SOLID TUMORTECHNICAL FIELD

[0001] The present invention relates to the technical field of biological medicine, and particularly relates to a therapeutic circular RNA vaccine to treat solid tumor and application thereof.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] The great success of cancer immunotherapy is paving the way for a new era in cancer treatment, and therapeutic cancer vaccine has also garnered significant interest. Cancer vaccines mainly use tumor-associated antigens (TAAs) and tumor-specific antigens (TSAs) to prime the corresponding immune response, activate T cells and eliminate tumor cells in patients. Studies have shown that primary solid tumors can still evoke CD4+ and CD8+ T cell-mediated recognition of tumor antigens, suggesting an autologous anti-tumor T cell response. These findings highlight the potential of activating antigen-specific T cells in solid tumors. The nature of modularity, stability and substantial payload capacity of circular RNAs, makes them desirable tools for cancer immunotherapy. In this context, we introduce a novel method and composition utilizing circular RNA vaccines, rationally designed to elicit durable CD4+ and CD8+ T cell-mediated immune responses in patients with metastatic melanoma. Thus, circular RNA cancer vaccines could expand therapeutic choices and potentially improve clinical outcomes.SUMMARY OF THE INVENTION

[0003] In one aspect, the present disclosure provides a circular RNA for treating solid tumor. The circular RNA comprises a translational initiation element, a first immune enhancer element, an antigen coding element, a second immune enhancer element, and optionally a helper element.

[0004] In one aspect, the present disclosure provides a linear RNA for treating solid tumor. The linear RNA comprises a first immune enhancer element, an antigen coding element, a second immune enhancer element, and optionally a helper element.

[0005] In one aspect, the present disclosure provides a DNA for treating solid tumor. The DNA could be used to prepare the circular RNA or the linear RNA, or could be transcribed to the linear RNA.

[0006] In another aspect, the present disclosure provides a vector comprising the circular RNA, the linear RNA, or the DNA.

[0007] In another aspect, the present disclosure provides a circular RNA combination comprising at least two circular RNAs of the present invention, wherein each circular RNA is expressed separately.

[0008] In one aspect, the present disclosure provides a composition comprising the circular RNA, the linear RNA, the DNA, the vector, or the circular RNA combination, and pharmaceutically acceptable excipients.

[0009] In one aspect, the present disclosure provides use of the circular RNA, the linear RNA, the DNA, the vector, the circular RNA combination, or the composition in the manufacture of a medicament for treating solid tumor.

[0010] In one aspect, the present disclosure provides a method for treating a disease in a subject having solid tumor, comprising administering a therapeutically effective amount of the circular RNA, the linear RNA, the DNA, the vector, the circular RNA combination, or the composition.

[0011] In one aspect, the present disclosure provides a therapeutically effective amount of the circular RNA, the linear RNA, the DNA, the vector, the circular RNA combination, or the composition for use in treating a solid tumor in a subject.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0012] Figure 1 illustrates general structures of the circRNAs of EP-00091. Schematic representative of MHC targeted cancer vaccine design strategies are as follows. Nucleotide sequence of circular RNAs consists of translation regulation element and protein coding sequence where the leading signal peptide, antigen amino acids, immune modulation peptide, sequence to boost HLA presentation (luminal domain and cytoplasmic tail of LAMP proteins) are connected by protein linkers in tandem.

[0013] Figure 2 shows in vitro expression of circular RNAs. Manufactured circular RNAs were transfected into HEK293T cells by Lipofectamine RNAiMAX reagent or encapsulated to lipid nanoparticles. The expression of target immunogens was detected with Western Blot.

[0014] Figure 3 demonstrates the intramuscular administration of a cancer vaccine is capable of inducing antigen specific immune response and increased vaccine schedule can further amplify immune responses. In this study, C57BL / 6 mice (n=3) were immunized intramuscularly with 20 μg circRNA-253-LNP, 7 days after the last immunization, the secretion of IFN-γ as a measure of antigen-specific immune response was evaluated with ELISPOT analysis.

[0015] Figure 4 shows antigen specific immune response can be induced in both C57BL / 6 and BALB / c mice. Mice were immunized with cancer vaccines at Day 0, Day 3, Day 8 and sacrificed at Day 14. Splenocytes were then isolated and stimulated with antigens, IFN-γ secretion was evaluated by ELISPOT.

[0016] Figure 5 shows immune response induced by EP-00091 vaccines. B-HLA-A2.1 humanized mice were immunized at Day 0, Day 3, Day 8 and sacrificed at Day 14. Splenocytes were isolated and stimulated with individual antigen peptide pools. Secretion of IFN-γ as an indicator of antigen-specific immune response was evaluated with ELISPOT.

[0017] Figure 6 shows intracellular cytokine staining analysis of antigen specific CD8+, CD4+ T cells in B-HLA-A2.1 humanized mice. Mice were immunized with different vaccines at Day 0, Day 3, Day 8 and sacrificed at Day 14. Splenocytes were isolated and stimulated with antigens. IFN-γ secretion was evaluated by intracellular cytokine staining.

[0018] Figure 7 shows EP-00091 vaccination inhibited tumor development in C57BL / 6 syngeneic model. C57BL / 6 mice (n = 6 for each group) were immunized with 40 μg EP-00091 circRNA vaccines at Day 0, Day 3, Day 8, followed by NY-ESO-1 overexpressed MC38 tumor cell challenge (2×105 cells / dose) at Day11 (left pannel) . MC38 tumor growth were monitored (right panel) .DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0019] Unless otherwise defined below, all technical and scientific terms used herein have the same meanings as commonly understood by an ordinary skilled person in the art. References to techniques used herein are intended to refer to techniques that are generally understood in the art, including those obvious changes or equivalent replacements of the techniques for those skilled in the art. While it is believed that the following terms are well understood by those skilled in the art, the following definitions are set forth to better explain the invention.

[0020] In one aspect, the present disclosure provides a circular RNA for treating solid tumor.

[0021] In some embodiments, the circular RNA comprises:

[0022] a translational initiation element,

[0023] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0024] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2,

[0025] a second enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein, and

[0026] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0027] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0028] each circular RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens.

[0029] In some embodiments, the circular RNA comprises:

[0030] a translational initiation element,

[0031] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0032] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2,

[0033] a second enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein, and

[0034] a helper element which breaks immunological tolerance,

[0035] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0036] each circular RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens.

[0037] In some embodiments, the arrangement of each element in circular RNA is arbitrary. In some embodiments, the circular RNA comprises elements in order, wherein the arrangement of each element in circular RNA includes but not limits the following embodiments.

[0038] For example, in some embodiments, the circular RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0039] a translational initiation element,

[0040] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0041] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2,

[0042] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein, and

[0043] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0044] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0045] each circular RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens,

[0046] the circular RNA is formed by connecting 5’ and 3’ .

[0047] For example, in some embodiments, the circular RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0048] a translational initiation element,

[0049] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0050] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2,

[0051] optionally a helper element which breaks immunological tolerance, and

[0052] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0053] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0054] each circular RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens,

[0055] the circular RNA is formed by connecting 5’ and 3’ .

[0056] For example, in some embodiments, the circular RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0057] a translational initiation element,

[0058] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0059] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0060] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2, and

[0061] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0062] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0063] each circular RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens,

[0064] the circular RNA is formed by connecting 5’ and 3’ .

[0065] For example, in some embodiments, the circular RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0066] a translational initiation element,

[0067] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0068] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0069] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein, and

[0070] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2,

[0071] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0072] each circular RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens,

[0073] the circular RNA is formed by connecting 5’ and 3’ .

[0074] For example, in some embodiments, the circular RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0075] a translational initiation element,

[0076] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0077] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0078] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2, and

[0079] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0080] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0081] each circular RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens,

[0082] the circular RNA is formed by connecting 5’ and 3’ .

[0083] For example, in some embodiments, the circular RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0084] a translational initiation element,

[0085] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0086] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0087] optionally a helper element which breaks immunological tolerance, and

[0088] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2,

[0089] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0090] each circular RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens,

[0091] the circular RNA is formed by connecting 5’ and 3’ .

[0092] In some embodiments, the circular RNA is formed by the in vitro RNA circularization strategies, including but not limiting chemical method, enzymatic ligation method and ribozyme method.

[0093] In some embodiments, the circling regulatory element is internal ribosomal entry site (IRES) or a fragment thereof,

[0094] preferably, the IRES is selected from the group consisting of Coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, Enterovirus 71 (EV71) IRES, encephalomyocarditis virus (EMCV) IRES, picornavirus (PV) IRES, hepatitis C virus (HCV) IRES, adenovirus (AdV) IRES, human papillomavirus type 31 (HPV31) IRES, human herpesvirus (HHV) IRES, Rous sarcoma virus (RSV) IRES, classical swine fever virus (CSFV) IRES, FGF9 IRES, SLC7A1 IRES, and RUNX1 IRES,

[0095] more preferably the IRES is CVB3 IRES, the most preferably the IRES is SEQ ID NO: 17.

[0096] In some embodiments, the signal peptide targets endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi. In some embodiments, the first immune enhancer element encodes the signal peptide targets endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.

[0097] In some embodiments, the first immune enhancer element encodes the signal peptide of mouse LAMP1, human LAMP1, human dendritic-cell LAMP (human D.C. LAMP) ,

[0098] preferably, the first immune enhancer element encoding leading signal peptide of mouse LAMP1 is SEQ ID NO: 32, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32;

[0099] preferably, the first immune enhancer element encoding leading signal peptide of human LAMP1 is SEQ ID NO: 9, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9;

[0100] preferably, the first immune enhancer element encoding leading signal peptide of human D.C. LAMP is SEQ ID NO: 33, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33.

[0101] In some embodiments, the peptide coded by the second enhancer expression element retains the fusion protein in endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi. In some embodiments, the second immune enhancer element encodes a peptide retaining the fusion protein in endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.

[0102] In some embodiments, the peptide encoded by the second immune enhancer element is the lumen domain and cytoplasmic tail of mouse LAMP1, human LAMP1, human dendritic-cell LAMP (human D.C. LAMP) ,

[0103] preferably, the second immune enhancer element encoding the lumen domain and cytoplasmic tail of mouse LAMP1 is SEQ ID NO: 35, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35;

[0104] preferably, the second immune enhancer element encoding the lumen domain and cytoplasmic tail of human LAMP1 is SEQ ID NO: 10, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10;

[0105] preferably, the second immune enhancer element encoding the lumen domain and cytoplasmic tail of human D.C. LAMP is SEQ ID NO: 37, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37.

[0106] In some embodiments, the antigen coding element comprises a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 13, 14, 15 and 16, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 13, 14, 15 or 16.

[0107] In some embodiments, the helper element breaking immunological tolerance is selected or derived from the tetanus toxoid (TT) of Clostridium tetani; preferably is helper epitope P2, P16, or P2P16,

[0108] more preferably is SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 or, SEQ ID NO: 11.

[0109] In some embodiments, the linker encoding animo acid is selected or derived from GA, GS, GG, GGA, GGS, GGG, GGGA, GGGS, GGGG, GGGGA, GGGGS, GGGGG, GGGGA, GGGGS, GGGGG, GGAG, GGSG, AGGGG, SGGG, GAGA, GSGS, GAGAGA, GSGSGS, GAGAGAGA, GSGSGSGS, GAGAGAGAGA, GSGSGSGSGS, GAGAGAGAGAGA, GAGSGSGSGSGS, GGAGGA, GGSGGS, GGAGGAGGA, GGSGGSGGS, GGAGGAGGAGGA, GGSGGSGGSGGS, GGAGGGAG, GGSGGGSG, GGAGGGAGGGAG, GGSGGGSGGSG, GGGAGGGAGGGA or GGGSGGGSGGGS.

[0110] In some embodiments, the nucleotide sequence of the circular RNA is selected from SEQ ID NOs: 22, 23, 24, and 25, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 22, 23, 24, and 25.

[0111] In one aspect, the present disclosure provides a linear RNA for treating a solid tumor.

[0112] In some embodiments, a linear RNA comprises:

[0113] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0114] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2,

[0115] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein and

[0116] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0117] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0118] each element of the linear RNA has the same definition as any one of preceding claims,

[0119] each linear RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens.

[0120] In some embodiments, a linear RNA comprises:

[0121] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0122] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2,

[0123] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein and

[0124] a helper element which breaks immunological tolerance,

[0125] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0126] each element of the linear RNA has the same definition as any one of preceding claims,

[0127] each linear RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens.

[0128] In some embodiments, the arrangement of each element in linear RNA is arbitrary. In some embodiments, the linear RNA comprises elements in order, wherein the arrangement of each element in linear RNA includes but not limits the following embodiments.

[0129] For example, in some embodiments, the linear RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0130] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0131] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2,

[0132] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein, and

[0133] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0134] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0135] each linear RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens.

[0136] For example, in some embodiments, the linear RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0137] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I andor MHC II,

[0138] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2,

[0139] optionally a helper element which breaks immunological tolerance, and

[0140] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0141] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0142] each linear RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens.

[0143] For example, in some embodiments, the linear RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0144] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0145] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0146] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2, and

[0147] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining a fusion protein,

[0148] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0149] each linear RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens.

[0150] For example, in some embodiments, the linear RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0151] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0152] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0153] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein, and

[0154] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2,

[0155] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0156] each linear RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens.

[0157] For example, in some embodiments, the linear RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0158] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0159] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0160] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2, and

[0161] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0162] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0163] each linear RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens.

[0164] For example, in some embodiments, the linear RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0165] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0166] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0167] optionally a helper element which breaks immunological tolerance, and

[0168] an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2,

[0169] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0170] each linear RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens.

[0171] In some embodiments, the signal peptide targets endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi. In some embodiments, the first immune enhancer element encodes the signal peptide targets proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.

[0172] In some embodiments, the peptide coded by the second enhancer expression element retains the fusion protein in endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi. In some embodiments, the second immune enhancer element encodes a peptide retaining the fusion protein in endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi. In some embodiments, each element of the linear RNA has the same definition as any one of preceding embodiments.

[0173] In one aspect, the present disclosure provides a DNA for treating a solid tumor.

[0174] In some embodiments, the DNA could be used to prepare the circular RNA of any one of the preceding embodiments, or could be transcribed to the linear RNA of any one of the preceding embodiments.

[0175] In another aspect, the present disclosure provides a vector comprising the circular RNA, the linear RNA, or the DNA of preceding embodiments.

[0176] In another aspect, the present disclosure provides a circular RNA combination comprising at least two circular RNAs of any one of preceding embodiments, preferably comprising three circular RNAs of any one of preceding embodiments, more preferably four circular RNAs of any one of preceding embodiments, wherein each circular RNA is expressed separately.

[0177] In one aspect, the present disclosure provides a composition comprising the circular RNA, the linear RNA, the DNA, the vector, or the circular RNA combination of any one of preceding embodiments, and pharmaceutically acceptable excipients.

[0178] In some embodiments, the circular RNA, linear RNA or DNA of any one of preceding embodiment are formulated or is to be formulated as lipoplex particles.

[0179] In some embodiments, the lipoplex particles are obtainable by mixing the RNA with liposomes. In some embodiments, the circular RNA, linear RNA or DNA of any one of preceding embodiment are formulated or is to be formulated as lipid nanoparticles (LNP) .

[0180] In some embodiments, the lipid nanoparticles are obtainable by mixing the RNA with of the organic phase containing LNP lipid components.

[0181] In one aspect, the present disclosure provides use of said circular RNA, said linear RNA, said DNA, said vector, said circular RNA combination, or said composition of preceding embodiments in the manufacture of a medicament for treating solid tumor.

[0182] In one aspect, the present disclosure provides a method for treating a disease in a subject having solid tumor, comprising administering a therapeutically effective amount of said circular RNA, said linear RNA, said DNA, said vector, said circular RNA combination, or said composition of preceding embodiments.

[0183] In one aspect, the present disclosure provides a therapeutically effective amount of said circular RNA, said linear RNA, said DNA, said vector, said circular RNA combination of preceding embodiments for use in treating a solid tumor in a subject.

[0184] In some embodiments, wherein the solid tumor is selected from bladder cancer, breast cancer, colorectal carcinoma, colon cancer, gastric carcinoma, glioma, head and neck cancer, hepatocellular carcinoma, lung cancer, renal cell carcinoma, synovial sarcoma, osteosarcoma, multiple myeloma, prostate cancer, pancreatic cancer, or ovarian cancer.

[0185] General Definition

[0186] As used herein, the terms “including” , “having” , “containing” or “comprising” , and other variants thereof, are inclusive or open, and do not exclude other unlisted elements or method steps.

[0187] As used herein, the terms “embodiment” , “disclosed herein” or “disclosure” are not meant to be limiting, but applies generally to any of the embodiments defined in the claims or described herein. These terms are used interchangeably herein.

[0188] As used herein, the terms “treat” , “treating” , “treatment” and the like refer to eliminating, reducing, or ameliorating a disease or condition, and / or symptoms associated therewith. Although not precluded, treating a disease or condition does not require that the disease, condition, or symptoms associated therewith be completely eliminated. The term “treat” and synonyms contemplate administering a therapeutically effective amount of the circular RNA or the composition disclosed herein to a subject in need of such treatment. The treatment can be orientated symptomatically, for example, to suppress symptoms. It can be effected over a short period, be oriented over a medium term, or can be a long-term treatment, for example within the context of a maintenance therapy.

[0189] Throughout this disclosure, the terms “a” or “an” entity refers to one or more of that entity; for example, “apolynucleotide” is understood to represent one or more polynucleotides. As such, the terms “a” , “an” , “one or more” and “at least one” can be used interchangeably herein.

[0190] The terms “composition” or “pharmaceutical composition” refer to compositions comprising the circular RNA provided herein, along with e.g., pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or diluents for administration to a subject in need of treatment.

[0191] The term “pharmaceutically acceptable” refers to compositions that are, within the scope of sound medical judgment, suitable for contact with the tissues of human beings and animals without excessive toxicity or other complications commensurate with a reasonable benefit / risk ratio.

[0192] An “effective amount” is that amount of a circular RNA provided herein, the administration of which to a subject, either in a single dose or as part of a series, is effective for treatment. For example, with respect to obesity, an amount is effective, for example, when its administration results in one or more of weight loss or weight maintenance (e.g., prevention of weight gain) , loss of body fat, prevention or modulation hypoglycemia, prevention or modulation hyperglycemia, promotion of insulin synthesis, or reduction in food intake. This amount can be a fixed dose for all subjects being treated, or can vary depending upon the weight, health, and physical condition of the subject to be treated, the extent of weight loss or weight maintenance desired, the formulation of the circular RNA or the composition disclosed herein, a professional assessment of the medical situation, and other relevant factors.

[0193] The term “subject” is meant any subject, particularly a mammalian subject, in need of treatment with the circular RNA or the composition provided herein. Mammalian subjects include, but are not limited to, humans, dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, cattle, bears, cows, apes, monkeys, orangutans, and chimpanzees, and so on. In one embodiment, the subject is a human subject.

[0194] The term “about” as used herein, includes the recited number ± 10%. Thus, “about 10” means 9 to 11.

[0195] As used herein, the terms “circRNA” or “circular polyribonucleotide” or “circular RNA” are used interchangeably and can refer to a polyribonucleotide that forms a circular structure through covalent or non-covalent bonds. When it comes to circular RNA, a skilled person would understand that a polynucleotide in an RNA refers to a polyribonucleotide.

[0196] As used herein, the terms “helper element” or “helper epitopes” is a nucleotide or amino acid sequence that has a function of breaking immunological tolerance. In one embodiment, the helper epitopes may be tetanus toxoid-derived, e.g., P2P16 amino acid sequences derived from the tetanus toxoid (TT) of Clostridium tetani. These sequences may support to overcome self-tolerance mechanisms for efficient induction of immune responses to self-antigens by providing tumor-unspecific T-cell help during priming. The tetanus toxoid heavy chain includes epitopes that can bind promiscuously to MHC class II alleles and induce CD4+ memory T cells in almost all tetanus vaccinated individuals. In addition, the combination of TT helper epitopes with tumor-associated antigens is known to improve the immune stimulation compared to the application of tumor-associated antigen alone by providing CD4+ mediated T-cell help during priming. To reduce the risk of stimulating CD8+ T cells, two peptide sequences known to contain promiscuously binding helper epitopes may be used to ensure binding to as many MHC class II alleles as possible, e.g., P2, P16 or P2P16.

[0197] The term “signal peptides” as defined herein preferably allow the transport or targeting of the antigenic peptide or protein as encoded by the RNA into a defined cellular compartment, preferably the cell surface, the endoplasmic reticulum (ER) or the endosomal-lysosomal compartment.

[0198] The term “linker” suitable for use in present disclosure is generally one or more flexible portion (s) that provide flexibility of each element to facilitate their functions independently without interfering. Such flexible portion encodes flexible peptide. Exemplary flexible peptides include, but do not limited to (GS) n, (GSGGS) n, (GGGS) n, GA, GS, GG, GGA, GGS, GGG, GGGA, GGGS, GGGG, GGGGA, GGGGS, GGGGG, GGGGA, GGGGS, GGGGG, GGAG, GGSG, AGGGG, SGGG, GAGA, GSGS, GAGAGA, GSGSGS, GAGAGAGA, GSGSGSGS, GAGAGAGAGA, GSGSGSGSGS, GAGAGAGAGAGA, GAGSGSGSGSGS, GGAGGA, GGSGGS, GGAGGAGGA, GGSGGSGGS, GGAGGAGGAGGA, GGSGGSGGSGGS, GGAGGGAG, GGSGGGSG, GGAGGGAGGGAG, GGSGGGSGGSG, GGGAGGGAGGGA or GGGSGGGSGGGS.

[0199] The term “cancer-associated antigen” is used in its broadest sense to refer to any antigen associated with a disease. A cancer-associated antigen is a molecule which contains epitopes that will stimulate a host’s immune system to make a cellular antigen-specific immune response and / or a humoral antibody response against the disease. The cancer-associated antigen or an epitope thereof may therefore be used for therapeutic purposes.

[0200] The term “tumor antigen” refers to a constituent of cancer cells. In particular, it refers to those antigens which are produced intracellularly or as surface antigens on tumor cells.

[0201] The term “vector” is intended to refer to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it has been linked. The commonly used forms of vector in the art include but not limit plasmid, cell, viral vector, bacterial vector, phage and the like. The most commonly used form of vector is plasmid, a circular double stranded DNA loop into which additional DNA segments may be ligated. In general, expression vectors of utility in recombinant DNA techniques are often in the form of plasmids. In the present application, “plasmid” and “vector” may be used interchangeably.

[0202] Examples

[0203] To make the objects and technical solutions of the present invention clearer, the present invention will be further described below in conjunction with specific examples. It should be understood that the examples are not intended to limit the scope of the invention. Further, specific experimental methods not mentioned in the following examples were carried out in accordance with a conventional experimental method.

[0204] EXAMPLE 1: Synthesis of circular RNA vaccine

[0205] The immunogenic circular RNA consists of several functional domains: a signal peptide at the N-terminus (SEQ ID NO: 1) , followed by tumor associated antigen (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8) to trigger tumor cell specific immune response, a helper peptide (SEQ ID NO: 3) derived from tetanus toxoid in order to enhance resulting immune response, and additional amino acids sequence to increase MHC presentation (SEQ ID NO: 2) . All these functional domains are joined by protein linkers (SEQ ID NO: 4) . Both the signal peptide and C-terminal peptide targeting the antigen to MHC molecules are derived from lysosome-associated membrane protein (LAMP) . Nucleotides encoding this protein are codon optimized with internal algorithms and the translation is initiated through internal ribosome entry sites (IRESs) of coxsackievirus B3 (CVB3) (SEQ ID NO: 17) . The nucleotide sequences of IRES and coding region were synthesized by Azenta Life Sciences (Suzhou, China) .

[0206] EP-00091 vaccine developed as circRNA-based vaccine for cancer treatment, is comprised of a quartet of distinct circular RNAs (Figure 1) : circRNA-0248 (SEQ ID NO: 18) , circRNA-0253 (SEQ ID NO: 19) , circRNA-0254 (SEQ ID NO: 20) and circRNA-0259 (SEQ ID NO: 21) . Each RNA component is engineered to encode one of four cancer-associated antigens: NY-ESO-1 / CTAG1B (SEQ ID NO: 5) , MAGE-A3 (SEQ ID NO: 6) , Tyrosinase (TYR) (SEQ ID NO: 7) and SSX2 (SEQ ID NO: 8) . For therapeutic use, each circRNA is formulated individually and then mixed in a precise cocktail for intramuscular administration.

[0207] EXAMPLE 2: Manufacturing of circular RNA.

[0208] The plasmid was linearized by digestion with BspQ I restriction endonuclease (Vazyme, DD4302-PC-02) . The reaction was incubated at 50 ℃for 3 hours and the linear DNA template was purified using DNA Clean &Concentrator-25 Kit (ZYMO RESEARCH, D4034) . Following the linearization step, an aliquot of the linearized DNA template was added to an IVT reaction to get the precursor RNA. In a traditional IVT reaction system, reaction components were assembled with 400 ng linearized DNA template, 100 U T7 RNA Polymerase (Vazyme, DD4101-PC-03) , a NTP solution mix including 100 μM GTP (Vazyme, DD4108-PA-02) , 600 μM GMP solution, 100 μM ATP (Vazyme, DD4106-PA-02) , 100 μM CTP (Vazyme, DD4107-PA-02) , 100 μM UTP (Vazyme, DD4105-PA-02) , 10×reaction buffer (Vazyme, DD4101R) , 10 U Rnase Inhibitor (Vazyme, DD4102-PA-01) and 0.008 U Pyrophosphatase (Vazyme, DD4103-PC-01) . The IVT reaction was incubated at 37 ℃ for 2 hours. Then the linear products were exposed to DNase I (Vazyme, EN401) digestion to remove the template DNA, and the RNA transcripts were purified by  RNA Cleanup Kit (NEB, T2040L) . To get the circular RNA, T4 Rnl2 (Kactus, TRL-BE103-C1) were used to circularize the RNA transcripts. An enzyme ligation reaction was assembled, where 10 U T4 RNA Ligase II, 10×reaction buffer and 10 μg linear RNA were added to a 40 μL reaction mixture. Afterwards, reaction vessels were incubated at 25 ℃ for 2 hours. Theb RNase R exonuclease (Novoprotein, GMP-E224-M001) was added to degrade the linear RNA and enrich the circular product, where 1 μg column purified RNA product, 1 U Rnase R was assembled to the 6 μl reaction system, and the reactions were incubated at 37 ℃ for 30 minutes. The circular RNA products were then purified using RNA Cleanup Kit (NEB, T2040L) . Purified circRNA were transfected into HEK293T cells by Lipofectamine RNAiMAX reagent or encapsulated to lipid nanoparticles, expression of target immunogens was detected with Western Blot (Figure 2) .

[0209] EXAMPLE 3: Induction of antigen-specific immune responses by sequential intramuscular immunization

[0210] C57BL / 6 mice underwent a series of intramuscular immunizations with circular RNA vaccine. The regimen was initiated on Day 0, and mice were received either single, 2 or 3 dose (s) in total with second administration on Day 3 and third administration on Day 8, each comprising an injection of 20 μg of circRNA-0253-LNP into the tibialis anterior muscle. On Day 14, the mice were euthanized, and spleens were harvested for enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay analysis.

[0211] For single cell suspension preparation, spleens were homogenized by a syringe plunger through a 70 μm cell strainer ( 352350) into RPMI-1640 medium (HyClone, SH30027.01) . Red blood cells were removed by applying ACK lysis buffer (GibcoTM, A1049201) to splenocyte for 4 min at room temperature. Cells were washed with DPBS (GibcoTM, 14040133) twice and resuspended at 1×107 cells / mL. For ELISPOT, 3×105 splenocyte were seeded in 96-plates coated with IFN-γ capture antibody (MABTECH, 3321-4AST) . NY-ESO-1 peptide pool (Miltenyi Biotec, 130-095-381) was then added to a concentration of 0.25 μg / mL and incubated 40 h for in vitro stimulation. IFN-γsecretion was detected by biotinylated anti-IFN-γ antibody. Spots were developed following the manufacturer’s instructions. The final spots were counted using an AID SLISPOT reader (Figure 3) .

[0212] EXAMPLE 4: Intravenous injection of cancer vaccines can induce antigen-specific immune response

[0213] C57BL / 6 or BALB / c mice (n=3) underwent a series of intravenously immunizations with 40 μg circRNA vaccines (40 μg in total, 10 μg for each vaccine) . The regimen was initiated on Day 0, followed by subsequent administrations on Day 3 and Day 8, on Day 14, the mice were euthanized, and spleens were harvested for enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay analysis.

[0214] For single cell suspension preparation, spleens were homogenized by a syringe plunger through a 70 μm cell strainer ( 352350) into RPMI-1640 medium (HyClone, SH30027.01) . Red blood cells were removed by applying ACK lysis buffer (GibcoTM, A1049201) to splenocyte for 4 min at room temperature. Cells were washed with DPBS (GibcoTM, 14040133) twice and resuspended at 3×106 cells / mL. for ELISPOT, 3×105 splenocyte were seeded in 96-plates coated with IFN-γ capture antibody (MABTECH, 3321-4AST) . NY-ESO-1 (Miltenyi Biotec, 130-095-381) , MAGE-A3 (Miltenyi Biotec, 130-095-384) , TYR (Miltenyi Biotec, 130-094-446) and SSX2 (JPT, PM-SSX2) peptide pools was added then to a concentration of 0.25 μg / mL and incubated 40 h for in vitro stimulation. IFN-γ secretion was detected by biotinylated anti-IFN-γantibody. Spots were developed following the manufacturer’s instructions. The final spots were counted using an AID SLISPOT reader (Figure 4) .

[0215] EXAMPLE 5: Induction of antigen-specific immune responses in B-HLA-A2.1 mice

[0216] Transgenic humanized B-HLA-A2.1 mice were immunized intramuscularly with lipid nanoparticles encapsulated circular RNA vaccines at Day 0, Day 3 and Day 8. At Day 14, mice were sacrificed, and spleen were collected for enzyme-linked immune spot (ELISPOT) and intracellular cytokine staining. For single cell suspension preparation, spleens were homogenized by a syringe plunger through a 70 μm cell strainer ( 352350) into RPMI-1640 medium (HyClone, SH30027.01) . Red blood cells were removed by applying ACK lysis buffer (GibcoTM, A1049201) to splenocyte for 4 min at room temperature. Cells were washed with DPBS (GibcoTM, 14040133) twice and resuspended at 1×107 cells / mL. For ELISPOT, 3×105 splenocytes were seeded in 96-plates coated with IFN-γ capture antibody (MABTECH, 3321-4AST) . Individual peptide pools (NY-ESO-1, Miltenyi Biotec, 130-095-381; MAGE-A3, Miltenyi Biotec, 130-095-384; TYR, Miltenyi Biotec, 130-094-446; SSX2, JPT, PM-SSX2) was then added to a final concentration of 0.25 μg / mL and incubated 40 h for in vitro stimulation. IFN-γ secretion was detected by biotinylated anti-IFN-γ antibody. Spots were developed following the manufacturer’s instructions. The final spots were counted using an AID SLISPOT reader (Figure 5) .

[0217] For antigen specific CD4+ and CD8+ T cells response detection, 3 million splenocytes were stimulated with NY-ESO-1 / MAGE-A3 / TYR / SSX2 peptide pools (0.25 μg / mL each) and anti-CD28 monoclonal antibody (1 μg / mL, BioLegend, 102116) in a U-bottom 96-well plate. 4 hours later, BD GolgiStop monensin (1: 1000 dilution, BD Bioscience, 554715) was added to block protein transport for 12 hours. Then, cells were washed with PBS and followed by anti-CD16 / 32 Fc-receptor blockade (BD Pharmingen, 553142) before staining. Cells were stained with PE anti-mouse CD3 Antibody (BioLegend, 100205) , FITC Rat Anti-Mouse CD8a (BD Pharmingen, 553030) , APC Rat Anti-Mouse CD4 (BD Pharmingen, 553051) , and Fixable Viability Stain 510 (BD Pharmingen, 564406) for surface staining at 4 ℃ for 30 minutes. Then cells were washed with stain buffer (BD Pharmingen, 554656) , fixed and permeabilized using the Cytofix / Cytoperm kit (BD Biosciences, 554714) , and stained intracellularly for another 30 minutes with PerCP-CyTM5.5 Rat Anti-Mouse IFN-γ (BD Pharmingen, 560660) . Proportion of IFN-γ producing CD4+ and CD8+ T cells were analyzed by flow cytometry (Figure 6) .

[0218] Example 6: EP-00091 circRNAs vaccination delayed NY-ESO-1 loaded MC38 tumor cell growth

[0219] To evaluatethe prophylactic efficacy of EP-00091 circRNA vaccines, 6-to 8-week-old female mice were intramuscularly (i. m. ) immunized with three doses of circRNA vaccines at Day 0, Day 3, Day 8. These mice were then challenged with 2 x 10^5 NY-ESO-1-expressing MC38 tumor cells via subcutaneous (s. c. ) injection at Day 11. Tumor growth was monitored three times a week. The results showed that EP-00091 immunization significantly inhibited MC38 tumor growth compared to the PBS group (Figure 7) .

Claims

1.A circular RNA, comprising:a translational initiation element,a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2,a second enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein, andoptionally a helper element which breaks immunological tolerance,wherein each element is optionally connected by a linker,each circular RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens.2.The circular RNA of claim 1, wherein the translational initiation element is internal ribosomal entry site (IRES) or a fragment thereof,preferably, the IRES is selected from the group consisting of Coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, Enterovirus 71 (EV71) IRES, encephalomyocarditis virus (EMCV) IRES, picornavirus (PV) IRES, hepatitis C virus (HCV) IRES, adenovirus (AdV) IRES, human papillomavirus type 31 (HPV31) IRES, human herpesvirus (HHV) IRES, Rous sarcoma virus (RSV) IRES, classical swine fever virus (CSFV) IRES, FGF9 IRES, SLC7A1 IRES, and RUNX1 IRES,more preferably the IRES is CVB3 IRES,the most preferably the IRES is SEQ ID NO: 17.3.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein the signal peptide targets endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.4.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein first immune enhancer element encodes the signal peptide of mouse LAMP1, human LAMP1, human dendritic-cell LAMP (human D. C. LAMP) ,preferably, the first immune enhancer element encoding leading signal peptide of mouse LAMP1 is SEQ ID NO: 32, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO:32;preferably, the first immune enhancer element encoding leading signal peptide of human LAMP1 is SEQ ID NO: 9, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9;preferably, the first immune enhancer element encoding leading signal peptide of human D. C. LAMP is SEQ ID NO: 33, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO:33.5.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein the peptide coded by the second enhancer expression element retains the fusion protein in endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.6.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein the peptide encoded by the second immune enhancer element is the lumen domain and cytoplasmic tail of mouse LAMP1, human LAMP1, human dendritic-cell LAMP (human D. C. LAMP) ;preferably, the second immune enhancer element encoding the lumen domain and cytoplasmic tail of mouse LAMP1 is SEQ ID NO: 35, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35;preferably, the second immune enhancer element encoding the lumen domain and cytoplasmic tail of human LAMP1 is SEQ ID NO: 10, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10;preferably, the second immune enhancer element encoding the lumen domain and cytoplasmic tail of human D. C. LAMP is SEQ ID NO: 37, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37.7.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein the antigen coding element comprises a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 13, 14, 15 and 16, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 13, 14, 15 or 16.8.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein the helper element breaking immunological tolerance is selected or derived from the tetanus toxoid (TT) of Clostridium tetani;preferably is helper epitope P2, P16, or P2P16,more preferably is SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 or, SEQ ID NO: 11.9.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein the linker encoding animo acid is selected or derived from GA, GS, GG, GGA, GGS, GGG, GGGA, GGGS, GGGG, GGGGA, GGGGS, GGGGG, GGGGA, GGGGS, GGGGG, GGAG, GGSG, AGGGG, SGGG, GAGA, GSGS, GAGAGA, GSGSGS, GAGAGAGA, GSGSGSGS, GAGAGAGAGA, GSGSGSGSGS, GAGAGAGAGAGA, GAGSGSGSGSGS, GGAGGA, GGSGGS, GGAGGAGGA, GGSGGSGGS, GGAGGAGGAGGA, GGSGGSGGSGGS, GGAGGGAG, GGSGGGSG, GGAGGGAGGGAG, GGSGGGSGGSG, GGGAGGGAGGGA or GGGSGGGSGGGS.10.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein the nucleotide sequence of the circular RNA is selected from SEQ ID NOs: 22, 23, 24, and 25, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 22, 23, 24, or 25.11.A linear RNA, comprisinga first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,an antigen coding element encoding at least one cancer-associated antigen selected from NY-ESO-1 / CTAG1B, MAGE-A3, Tyrosinase and SSX2,a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein andoptionally a helper element which breaks immunological tolerance,wherein each element is optionally connected by a linker,each element of the linear RNA has the same definition as any one of preceding claims,each linear RNA is expressed separately, when the expression element comprises a nucleotide sequence encoding at least two cancer-associated antigens.12.The linear RNA of the claim 11, wherein the signal peptide targets endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.13.The linear RNA of any one of the preceding claims, wherein the peptide coded by the second enhancer expression element retains the fusion protein in endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.14.A DNA, wherein the DNA could be used to prepare the circular RNA of any one of claims 1-10, or could be transcribed to the linear RNA of any one of claims 11-13.15.A vector, comprising the circular RNA of any one of claims 1-10, the linear RNA of any one of claims 11-13, or the DNA of claim 14.16.A circular RNA combination, comprising at least two circular RNAs of any one of claims 1-10, preferably comprising three circular RNAs of any one of claims 1-10, more preferably four circular RNAs of any one of claims 1-10, wherein each circular RNA is expressed separately.17.A composition comprising the circular RNA of any one of claims 1-10, the linear RNA of any one of claims 11-13, the DNA of claim 14, the vector of claim 15, or the circular RNA combination of claim 16, wherein the composition comprises pharmaceutically acceptable excipients.18.Use of the circular RNA of any one of claims 1-10, the linear RNA of any one of claims 11-13, the DNA of claim 14, the vector of claim 15, the circular RNA combination of claim 16, or the composition of claim 17 in the manufacture of a medicament for treating a solid tumor in a subject, ora method for treating a solid tumor in a subject, comprising administering a therapeutically effective amount of the circular RNA of any one of claims 1-10, the linear RNA of any one of claims 11-13, the DNA of claim 14, the vector of claim 15, the circular RNA combination of claim 16, or the composition of claim 17, ora therapeutically effective amount of the circular RNA of any one of claims 1-10, the linear RNA of any one of claims 11-13, the DNA of claim 14, the vector of claim 15, the circular RNA combination of claim 16, or the composition of claim 17 for use in treating a solid tumor in a subject.19.The use or method of claim 18, wherein the solid tumor is selected from bladder cancer, breast cancer, colorectal carcinoma, colon cancer, gastric carcinoma, glioma, head and neck cancer, hepatocellular carcinoma, lung cancer, renal cell carcinoma, synovial sarcoma, osteosarcoma, multiple myeloma, prostate cancer, pancreatic cancer, or ovarian cancer.

Images