Chemo-selective enrichment method to achieve in-depth coverage of methyllysine proteome

Abstract

The present disclosure relates to an aryl diazonium compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof, and use thereof in conjugating monomethyllysine (Kme1) peptide, an aryl diazonium resin of Formula (II) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof, and use thereof in enriching and isolating monomethyllysine (Kme1) peptide.

Description

CHEMO-SELECTIVE ENRICHMENT METHOD TO ACHIEVE IN-DEPTH COVERAGE OF METHYLLYSINE PROTEOMEFIELD OF INVENTION

[0001] The present disclosure relates to an aryl diazonium compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof, and use thereof in conjugating monomethyllysine (Kme1) peptide, an aryl diazonium resin of Formula (II) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof, and use thereof in enriching and isolating monomethyllysine (Kme1) peptide.BACKGROUND

[0002] Posttranslational modifications (PTMs) , including phosphorylation, acetylation, and ubiquitination, play significant roles in regulating cellular processes1-3. Proteomic analysis is powerful to identify modification sites and study dynamic changes by qualitative and quantitative mass spectrometry4-6. However, low abundant PTM containing tryptic peptides cannot be effectively identified by mass spectrometry, due to suppression of detection by large amounts of unmodified peptides from proteome. Therefore, development of enrichment methods is essential to amplify coverage of identification. One great success is phosphopeptide enrichment by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and metal oxide affinity chromatography (MOAC) 7, 8. In addition, pan antibody-mediated enrichment is well established to study tyrosine phosphorylation, lysine acetylation and lysine ubiquitination9-11. These methods enable routine identification of over tens of thousands of PTM sites from cell line and clinical samples. Such proteomic analysis offers valuable insight into biological roles of the modifications.

[0003] Lysine methylation is an important PTM that is often studied for chromatin regulation12-14 (Fig. 1a) . For example, histone H3K27me3 is associated with gene repression and H3K4me3 is correlated with gene activation15, 16 (Fig. 1b) . Due to hypermethylation of H3K27 and H3K4 in some cancer cells, the corresponding methyltransferases, EZH2 and KMT2, are potential drug targets for cancer therapy including one FDA approved drug (tazemetostat) and many pipelines17-19. Lysine methylation also plays significant roles in nonhistone proteins but there are only limited examples20. p53K370 dimethylation enhances p53 stability while p53K382 monomethylation suppresses p53dependent transcription activation21, 22. HSP70K561 dimethylation translocate HSP70 into nucleus and promotes cell cycle progression via activation of Aurora kinase B in cancer cells23 (Fig. 1b) .

[0004] Despite the significant biological roles, progress of lysine methylation research is rather slow, probably due to a lack of robust proteomic method. There were some reported pan-methyllysine antibodies that lead to identification of hundreds of methyllysine peptides from a large amount of cell samples, but the overall efficiency was low due to insufficient affinity24-26 (Fig. 1c) . Another strategy was employment of engineered methyllysine reader proteins, but the affinity of reader 3×MBT could not achieve better coverage of methyllysine sites27, 28 (Fig. 1c) . Instead of affinity-based methods, strong cation-exchange (SCX) chromatography was developed to enrich tryptic methyllysine peptides that contain more positive charges than unmodified ones29-31. But the number of reported methyllysine peptides was still limited (Fig. 1c) due to inadequate separation. Consequently, a novel strategy of methyllysine peptide enrichment is highly desired to drive the field of lysine methylation.

[0005] In the present disclosure, the inventors developed a new enrichment strategy by covalent linkage between aryl diazonium and Kme1 peptide to overcome the limitations of the affinity and SCX based methods (Fig. 1d) . Since methyllysine peptides are chemo-selectively conjugated to resin, background tryptic peptides could be washed out thoroughly. As a result, low abundant methyllysine peptides could be detected effectively by mass spectrometry to achieve in-depth coverage of cellular methyllysine samples.SUMMARY OF THE INVENTION

[0006] In one aspect, the present disclosure is directed to an aryl diazonium compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof:

[0007] wherein Ra and Rb are each independently C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH, and Ra and Rb are each independently substituted on ortho-or para-position to diazonium;

[0008] each Rc is independently selected from the group consisting of C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH,

[0009] each X is independently absent or selected from -CO-NH-and -NH-CO-,

[0010] p = 0, 1, 2, or 3, and

[0011] A is an inorganic or organic acid anion.

[0012] In some embodiments, the aryl diazonium compound is not any one of the following compounds:

[0013] In some embodiments, Ra and Rb are the same or different.

[0014] In some embodiments, the aryl diazonium compound is of Formula (Ia) , or (Ib) :

[0015] wherein Ra, Rb, Rc, X, p and A are defined as described herein.

[0016] In some embodiments, the aryl diazonium compound is selected from the group consisting of following compounds:

[0017] In one aspect, the present disclosure is directed to use of an aryl diazonium compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof in conjugating monomethyllysine (Kme1) peptide:

[0018] wherein Ra and Rb are each independently C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH, and Ra and Rb are each independently substituted on ortho-or para-position to diazonium;

[0019] each Rc is independently selected from the group consisting of C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH,

[0020] each X is independently absent or selected from -CO-NH-and -NH-CO-,

[0021] p = 0, 1, 2, or 3, and

[0022] A is an inorganic or organic acid anion.

[0023] In some embodiments, Ra and Rb are the same or different.

[0024] In some embodiments, the aryl diazonium compound is of Formula (Ia) , or (Ib) :

[0025] wherein Ra, Rb, Rc, X, p and A are defined as described herein.

[0026] In some embodiments, the aryl diazonium compound is selected from the group consisting of following compounds:

[0027] In another aspect, the present disclosure is directed to an aryl diazonium resin of Formula (II) :

[0028] or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof,

[0029] wherein Z is a moiety derived from aryl diazonium compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof;

[0030] L is a linker having a structure of Y-L’, where Y is selected from -CO-NH-or -NH-CO-, L’ is selected from C2-20 alkylene, 4-to 40 membered heteroalkylene, which alkylene and heteroalkylene are optionally substituted with one or more halo, or -OH.

[0031] Resin can be any suitable resin known in the art.

[0032] In some embodiments, the moiety Z is mono-valence moiety obtained by removing any one of Ra, Rb, and Rc.

[0033] In some embodiments, L’ is selected from optionally substituted straight chain C2-20 alkylene, C2-15 alkylene, C2-12 alkylene, C2-10 alkylene, C2-8 alkylene, C2-6 alkylene or C2-4 alkylene, specifically C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, or C12 alkylene, which is optionally substituted with one or more halo, -OH.

[0034] In some embodiments, L’ is selected from optionally substituted straight chain 4-to 40-membered, for example, 4-to 35-membered, 4-to 30-membered, 4-to 25-membered, 4-to 20-membered, 4-to 15-membered, 4-to 10-membered heteroalkylene containing 1-12, for example, 1-10, 1-8, 1-6, or 1-4, specifically 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 heteroatoms selected from N, O, S, which is optionally substituted with one or more halo, -OH. In some embodiments, L’ is a straight chain 4-to 40-membered heteroalkylene comprising 1 to 10 O atoms, preferably a polyethylenen glycol group.

[0035] In some embodiments, L is attached to Z by L’.

[0036] In some embodiments, the aryl diazonium resin is of Formula (IIa) , (IIb) , (IIc) , (IId) , or (IIe) :

[0037] wherein L, Ra, Rb, Rc, X, p and A are defined as described herein.

[0038] In some embodiments, the aryl diazonium resin is selected from the group consisting of following compounds:

[0039] In another aspect, the present disclosure is directed to a method for preparing an aryl diazonium resin of Formula (II) :

[0040] or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof, wherein L and Z are defined as described herein.

[0041] In some embodiments, the method comprises following steps:

[0042] I) reacting a compound of Za with a compound of La to obtain a compound of La’-Za’, the compound of Za has a structure of Formula (III) or Formula (III’) :

[0043] wherein Ra and Rb are each independently H, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH, and Ra and Rb are each independently substituted on ortho-or para-position to amine;

[0044] each Rc is independently selected from the group consisting of C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH,

[0045] each X is independently absent or selected from -CO-NH-and -NH-CO-,

[0046] p = 0, 1, 2, or 3, and

[0047] provided that one of Ra and Rb is hydrogen and the other is not,

[0048] wherein Ra and Rb are each independently C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH, and Ra and Rb are each independently substituted on ortho-or para-position to amine;

[0049] each Rc is independently selected from the group consisting of C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH,

[0050] each X is independently absent or selected from -CO-NH-and -NH-CO-,

[0051] p’= 0, 1, or 2, and

[0052] X’ selected from -COOH, and -NH2,

[0053] the compound of La has a structure of Formula (IV) :

[0054] Y’-L’-W

[0055] wherein Y’ is selected from -NH2 or -COOH,

[0056] L’ is selected from C2-20 alkylene, 4-to 40 membered heteroalkylene, which alkylene and heteroalkylene are optionally substituted with one or more halo, or -OH, and

[0057] W is selected from halogen, -COOH, and -NH2,

[0058] the compound of compound of La’-Za’ has a structure of Formula (V) or Formula (V’) :

[0059] ii) attaching the compound of La’-Za’ to a resin;

[0060] and

[0061] iii) treating the resin attached compound with acid and nitrite compound to obtain the compound of Formula (II) .

[0062] In another aspect, the present disclosure is directed to a method for enriching monomethyllysine (Kme1) peptide, comprising following steps:

[0063] a) mixing and incubating an aryl diazonium resin of Formula (II) of the present disclosure with a sample containing Kme1 peptide:

[0064] b) separating the aryl diazonium resin from the mixture; and

[0065] c) removing and collecting Kme1 peptide from the aryl diazonium resin.

[0066] In some embodiments, the Kme1 peptide is enriched from a biologic sample.

[0067] In some embodiments, the Kme1 peptide is enriched for proteomics study.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0068] FIG. 1 illustrates lysine methylation and the enrichment methods for proteomic studies. a) Lysine methylation is regulated by lysine methyltransferases (KMTs) and lysine demethylases (KDMs) . b) Biological roles of lysine methylation on histone and nonhistone proteins. Histone H3K27 trimethylation is a repressive chromatin mark while H3K4 trimethylation promotes gene transcription from transcription factors (TF) and RNA polymerase II (RNAPII) . Lysine methylation translocate HSP70 into nucleus to interact and activate Aurora kinase B for cancer cell proliferation. c) Current methods of methyllysine enrichment for proteomic studies. d) Covalent linkage-based enrichment method in this study has several advantages over previous methods.

[0069] FIG. 2 illustrates screening of aryl diazonium for robust and selective conjugation to Kme1 peptide. a, Scheme of the conjugation reaction between diazonium and peptide p1. b, Characterization of diazonium d1-d5 for peptide p1 conjugation. c, HPLC analysis of stability and conjugation activity of diazonium d2 and d5. The detail of peaks between 1 min and 3 min are zoomed in as shown in an additional small window at top-right corner. d, Mass spectrometry analysis of the conjugation products from d2 and d5. e, Characterization of diazonium d6-d9 for peptide p1 conjugation. f, HPLC analysis of stability, conjugation activity and tyrosine-selectivity of diazonium d8 and d9.

[0070] FIG. 3 illustrates synthesis and characterization of diazonium resins. a, Synthetic route from aniline s1 to diazonium resin r1. b, Structure of diazonium resin r2-r4. c, General scheme of Kme1 peptide enrichment by diazonium resin. d, Characterization of resin r1-r4 for conjugation and elution activities. e, A mixture of peptide p2-p6 was loaded to resin r1 for enrichment and HPLC analysis of the eluent demonstrated high Kme1selectivity. f, Trace amount of Kme1 peptide p1 and p2 were effectively enriched from tryptic BSA peptides by resin r1.

[0071] FIG. 4 illustrates Kme1 proteomics using diazonium resin r1. a, General scheme of Kme1 proteomics by resin r1-mediated enrichment. Cellular proteins were extracted from HeLa cells followed by IAA (iodoacetamide) alkylation. After trypsin digestion, the peptides were treated with resin r1 for two rounds of enrichment. The eluted peptides were next analyzed by LC-MS / MS. b, Resin r1 exhibited superior enrichment result to resin r4. c, Identification of Kme1 peptides by isotope labeling via reductive methylation that leads to unique one light monomethylation plus one heavy monomethylation on Kme1 sites. d, Venn diagram of Kme1 sites and Kme1 proteins of HeLa cells from triplicate. e, h, Gene ontology analysis of biological processes of HeLa Kme1 proteins (e) or mouse tissue-specific Kme1 proteins (h) . f, g, Venn diagram of Kme1 sites and Kme1 proteins of different cell lines (f) or different mouse tissues (g) .

[0072] FIG. 5 illustrates discovery and validation of SAM-independent Kme1. a, Workflow of cell passages using Met (CD3) and Met (CH3) from batch H0 to L4. b, S-CD3 group is expected to be transferred from methionine to lysine via SAM in batch H1-H6. c, CD3 / CH3 ratio of methionine and SAM from cell batch H1 to L4 were analyzed by LCMS / MS. d, Relative abundance of K-CD3 peptides among total Kme1 peptides from batch H0, H1, H2, H6, L1 and L2. The abundance in batch H0 indicates a false positive background by software analysis since no heavy methionine in batch H0. e, Statistic analysis of Kme1 peptides dependent on ratio of K-CD3 / K-CH3. Significant K-CD3 or KCH3 peptides with high confidence were shown in volcano plot. f, Enriched Kme1 peptides were hydrolyzed by acid to compare the isotope ratio between K-CD3 and KCH3. g, Summary of SAM-dependent and independent histone methylation sites verified by the ratio of K-CD3 / K-CH3 from batch H0, H1, H2, H6, L1 and to L2. h, Scheme of direct Kme1 isotope analysis of histone that were extracted from cell nuclei of batch H6. i, Mass spectrometry analysis of histone H3K79me1 and H4K31me1 peptides as two representative examples of K-CD3 and K-CH3 methylation sites.

[0073] FIG. 6 illustrates screening of 4-substituted aryl diazonium for robust and selective crosslinking to Kme1 peptide p1. a, HPLC analysis of stability and conjugation activity of diazonium d1, d3, d4 and d5 for peptide p1. b, Mass spectrometry analysis of the conjugation products from d3 and d4 for peptide p1.

[0074] FIG. 7 illustrates screening of dimethoxy-substituted aryl diazonium for robust and selective crosslinking to Kme1 peptide. a, HPLC analysis of stability and conjugation activity of diazonium d6 and d7 for peptide p1. b, Mass spectrometry analysis of the conjugation products from d6, d7 and d8 for peptide p1. c, HPLC analysis of stability and conjugation activity of diazonium d8 and d9 for peptide p3, p4, p6 and p7. d, Mass spectrometry analysis of the conjugation products from d8 and d9 for peptide p3, p4, p6 and p7.

[0075] FIG. 8 illustrates characterization of diazonium resins. a-d, Characterization of resin r1-r4 for conjugation and elution activities on peptide p3, p4, p6 and p7. e, HPLC analysis of comparing the conjugation rate of diazonium d8 and d9 for peptide p1. f, A mixture of peptide p1 and p7-p10 was loaded to resin r1 for enrichment and HPLC analysis of the eluent demonstrated high Kme1-selectivity.

[0076] FIG. 9 illustrates Kme1 proteomics using diazonium resin r1. a, Twice enrichment exhibited superior result to once enrichment by resin r1. b, Isotope labeling via reductive methylation could distinguish false positive lysine methylation. c, Enriched Kme1 peptides were divided into two parts. The first part was directly analyzed by LC-MS / MS and the other one was treated for heavy reductive methylation followd by LC-MS / MS. The data was in main Fig. 4c.

[0077] FIG. 10 illustrates Kme1 proteomics analysis of HeLa cells. KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) analysis, GO (Gene ontology) analysis of CC (cellular component) and MF (molecular function) for Kme1 proteins from HeLa cells.

[0078] FIG. 11 illustrates Kme1 proteomics analysis of A375 and HEK293T cells. a, b, Venn diagram of Kme1 sites and Kme1 proteins of A375 (a) and HEK293T (b) cells from triplicate. c, KEGG analysis, GO analysis of BP, GO analysis of CC and GO analysis of MF for common Kme1 proteins from HeLa, A375 and HEK293T cell lines.

[0079] FIG. 12 illustrates Kme1 proteomics analysis of mouse heart. a, Venn diagram of Kme1 sites and Kme1 proteins of mouse heart from triplicate. b, c, KEGG analysis, GO analysis of BP, GO analysis of CC and GO analysis of MF for Kme1 proteins from mouse heart (b) and mouse heart-specific Kme1 proteins (c) .

[0080] FIG. 13 illustrates Kme1 proteomics analysis of Mouse thymus. a, Venn diagram of Kme1 sites and Kme1 proteins of mouse thymus from triplicate. b, c, KEGG analysis, GO analysis of BP, GO analysis of CC and GO analysis of MF for Kme1 proteins from mouse thymus (b) and mouse thymus-specific Kme1 proteins (c) .

[0081] FIG. 14 illustrates investigation of SAM-independent Kme1. a, Composition of K-CH3 and K-CD 3 peptides among total Kme1 peptides from batch H6-1. b, Statistic analysis of Kme1 peptides dependent on ratio of K-CD3  / K-CH 3 for batch H0, H1, H2, L1 and L2. Significant K-CD 3 or K-CH 3 peptides with high confidence were shown in volcano plots.

[0082] FIG. 15 illustrates mass spectrometry analysis of histone lysine methylation sites. a, Peptide containing H3K27me1, H3K36me1 and H3K37me1 as representative example of K-CD3 methylation sites. b-e, H3K79me1, H2AK95me1, H2BK85me1 and H2BK108me1 peptides as representative examples of K-CH 3 methylation sites.DETAILED DESCRIPTION

[0083] Reference will now be made in detail to certain embodiments, examples of which are illustrated in the accompanying detailed description. While enumerated embodiments will be described, it shall be understood that they are not intended to limit the present disclosure to those embodiments. On the contrary, the present disclosure is intended to cover all alternatives, modifications, and equivalents, which may be included within the scope of the present disclosure as defined by the claims. Those skilled in the art will recognize many methods and materials similar or equivalent to those described herein, which could be used in the practice of the present disclosure. The present disclosure is in no way limited to the methods and materials as described. In the event that one or more of the incorporated literatures and similar materials differs from or contradicts this disclosure, including  but not limited to defined terms, term usage, described techniques, or the like, this disclosure controls.

[0084] It is appreciated that certain features of the present disclosure, which are, for clarity, described in the context of separate embodiments, can also be provided in combination in a single embodiment. Conversely, various features of the present disclosure, which are, for brevity, described in the context of a single embodiment, can also be provided separately or in any suitable sub-combination.

[0085] DEFINITIONS

[0086] The terms used but not defined herein have their ordinary meaning and the meaning of such terms is independent at each occurrence thereof. Nevertheless, unless otherwise stated, the following definitions apply throughout the specification and claims.

[0087] As used herein, the singular forms “a” , “an” , and “the” include plural referents unless expressly stated to the contrary.

[0088] As used herein, the terms “comprise” and “include” are intended to specify the presence of stated features, integers, components, or steps, but they do not preclude the presence or addition of one or more other features, integers, components, steps, or groups thereof.

[0089] Definitions of specific functional groups and chemical terms are described in more detail below. For purpose of this disclosure, the chemical elements are identified in accordance with the Periodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Edition, inside cover, and specific functional groups are generally defined as described therein. Additionally, general principles of organic chemistry, as well as specific functional moieties and reactivity, are described in Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March’s Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; Carruthers, Some Modem Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987.

[0090] All ranges cited herein are inclusive, unless expressly stated to the contrary.

[0091] When a range of values is listed, it is intended to encompass each value and sub-range within the range. For example, “C1-6” is intended to encompass, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5, and C5-6. For example, a heteroaromatic ring described as containing from “1 to 4 heteroatoms” means that the ring can contain 1, 2, 3 or 4 heteroatoms. It is also to be understood that any range cited herein includes within its scope all of the sub-ranges within that range. Thus, for example, a heterocyclic ring described as containing from “1 to 4 heteroatoms” is intended to include as aspects thereof, heterocyclic rings containing 2 to 4 heteroatoms, 3 or 4 heteroatoms, 1 to 3 heteroatoms, 2 or 3 heteroatoms, 1 or 2 heteroatoms, 1 heteroatom, 2 heteroatoms, 3 heteroatoms, or 4 heteroatoms.

[0092] When any variable occurs more than one time in any constituent or in Formula (I) or in any other formula depicting and describing the compounds of the present disclosure, its definition at each occurrence is independent of its definition at every other occurrence. Also, combinations of substituents and / or variables are permissible only if such combinations result in stable compounds.

[0093] As used herein, the term “alkyl” refers to a linear or branched chain saturated hydrocarbon group. The term “Ci-j alkyl” refers to an alkyl having i to j carbon atoms. Alkyl groups may contain 1 to 10 carbon atoms, unless otherwise stated. In certain embodiments, alkyl groups contain 1 to 6 carbon atoms (C1-6) , such as, 1 to 5 carbon atoms (C1-5) , 1 to 4 carbon atoms (C1-4) , 1 to 3 carbon atoms (C1-3) , or 1 to 2 carbon atoms (C1-2) . Non-limiting examples of alkyl groups include methyl, ethyl, n-and iso-propyl, n-, sec-, iso-, and tert-butyl, neopentyl, and the like. Alkyl groups may be optionally substituted (i.e., unsubstituted or substituted) , as valency permits, with one, two, three, or, in the case of alkyl groups of two carbons or more, four or more substituents independently selected from the group consisting of: amino; alkoxy; aryl; aryloxy; azido; cycloalkyl; cycloalkyloxy; cycloalkenyl; cycloalkynyl; halogen; heterocyclyl; (heterocyclyl) oxy; heteroaryl; hydroxy; nitro; thiol; silyl; cyano; alkylmercapto; alkylsulfonyl; alkylsulfinyl; alkylsulfenyl; =O; =S; -C (O) R or -SO2R, in which R is  amino; and =NR’, in which R’ is H, alkyl, aryl, or heterocyclyl. Each of the substituents may itself be unsubstituted or, as valency permits, substituted with unsubstituted substituent (s) defined herein for each respective group. In certain embodiments, alkyl groups may be optionally substituted with one or more substitutes selected from halogen, C1-4 alkyloxy, C1-4 haloalkyloxy, and C1-4 haloalkylmercapto.

[0094] As used herein, the term “alkylene” refers to a divalent substituent that is a monovalent alkyl having one hydrogen atom replaced with a valency. Alkylene groups may be unsubstituted or substituted. An optionally substituted alkylene is an alkylene that is optionally substituted as described herein for alkyl.

[0095] As used herein, the term “heteroalkyl” refers to an alkyl group where one or more carbon atoms are replaced with a heteroatom, such as, N, O, or S. In some embodiments, the heteroatoms comprised therein can constitute the backbone of heteroalkyl along with the carbon atom, such as, but not limited to, a structure such as -C-N-C-, -C-O-C-, -C-O-O-C, -C-S-C-, -C-S-S-C, or any combination thereof.

[0096] As used herein, the term “heteroalkylene” refers to a divalent substituent that is a monovalent heteroalkyl having one hydrogen atom replaced with a valency. Heteroalkylene groups may be unsubstituted or substituted. An optionally substituted heteroalkylene is an alkylene that is optionally substituted as described herein for alkyl.

[0097] As used herein, the term “alkenyl” refers to a linear or branched-chain hydrocarbon radical having at least one (such as one, two, or three) carbon-carbon double bond, which may be optionally substituted (i.e., unsubstituted or substituted) independently with one or more substituents described herein, and includes radicals having “cis” and “trans” orientations, or alternatively, “E” and “Z” orientations. Alkenyl groups may contain 2 to 10 carbon atoms, unless otherwise stated. In certain embodiments, alkenyl groups may contain 2 to 6 carbon atoms, such as 2 to 5 carbon atoms, 2 to 4 carbon atoms, 2 to 3 carbon atoms. In certain embodiments, alkenyl groups contain 2 carbon atoms. Non-limiting examples of alkenyl groups include ethylenyl (vinyl) , propenyl, butenyl, pentenyl, 1-methyl-2-buten-1-yl, 5-hexenyl, etc. An optionally substituted alkenyl is an alkenyl that is optionally substituted as described herein for alkyl.

[0098] As used herein, the term “alkynyl” refers to a linear or branched hydrocarbon radical having at least one (such as one, two, or three) carbon-carbon triple bond, which may be optionally substituted (i.e., unsubstituted or substituted) independently with one or more substituents described herein. Alkynyl groups may contain 2 to 10 carbon atoms, unless otherwise stated. In certain embodiments, alkynyl groups may contain 2 to 6 carbon atoms, such as 2 to 5 carbon atoms, 2 to 4 carbon atoms, 2 to 3 carbon atoms. In certain embodiments, alkynyl groups contain 2 carbon atoms. Non-limiting examples of alkynyl groups include ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, etc. An optionally substituted alkynyl is an alkynyl that is optionally substituted as described herein for alkyl.

[0099] As used herein, the term “heteroaryl” refers to a monocyclic ring system, or a fused or bridged bicyclic ring system, in which the ring system contains one, two, three, or four heteroatoms independently selected from the group consisting of nitrogen, oxygen, and sulfur; and at least one of the rings is an aromatic ring. Heteroaryl groups may be 5-to 10-membered, unless otherwise stated. In certain embodiments, heteroaryl groups may be a 5-to 6-membered heteroaryl ring having 1 to 3 heteroatoms independently selected from nitrogen, oxygen, and sulfur; or an 8-to 10-membered bicyclic heteroaryl ring having 1 to 4 heteroatoms independently selected from nitrogen, oxygen, and sulfur. In certain embodiments, heteroaryl groups may contain one, two, or three heteroatoms. In certain embodiments, heteroaryl groups may contain one or two heteroatoms. Non-limiting examples of heteroaryl groups include benzimidazolyl, benzofuryl, benzothiazolyl, benzothienyl, benzoxazolyl, furyl, imidazolyl, indolyl, isoindazolyl, isoquinolinyl, isothiazolyl, isothiazolyl, isoxazolyl, oxadiazolyl, oxazolyl, purinyl, pyrrolyl, pyridinyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, qunazolinyl, quinolinyl, thiadiazolyl, thiazolyl, thienyl, triazolyl, tetrazolyl, dihydroindolyl, tetrahydroquinolyl, tetrahydroisoquinolyl, etc. Heteroaryl groups include at least one ring having at least one heteroatom  as described above and at least one aromatic ring. For example, a ring having at least one heteroatom may be fused to one, two, or three carbocyclic rings, e.g., an aryl ring, a cyclohexane ring, a cyclohexene ring, a cyclopentane ring, a cyclopentene ring, or another monocyclic heterocyclic ring. Non-limiting examples of fused heteroaryl groups include 1, 2, 3, 5, 8, 8a-hexahydroindolizine, 2, 3-dihydrobenzofuran, 2, 3-dihydroindole, 2, 3-dihydrobenzothiophene, etc. In the context of the present disclosure, the terms “heteroaryl” and “heteroaromatic ring” may be used interchangeably. Heteroaryl groups may be unsubstituted or substituted. An optionally substituted heteroaryl group may be a heteroaryl optionally substituted with one, two, three, four, or five substituents independently selected from the group consisting of: alkyl; alkenyl; alkynyl; alkoxy; alkylsulfinyl; alkylsulfenyl; alkylsulfonyl; amino; aryl; aryloxy; azido; cycloalkyl; cycloalkoxy; cycloalkenyl; cycloalkynyl; halogen; heteroalkyl; heteroalkenyl; heteroalkynyl; heterocyclyl; (heterocyclyl) oxy; heteroaryl; hydroxy; nitro; thiol; silyl; - (CH2) n-C (O) OR’; -C (O) R; and -SO2R, in which R is amino or alkyl, R’ is H or alkyl, and n is 0 or 1. Each of the substituents may itself be unsubstituted or substituted with unsubstituted substituent (s) defined herein for each respective group. In certain embodiments, heteroaryl groups may be optionally substituted with one or more substitutes selected from 4-to 10-membered heterocyclyl, C6-10 aryl, and 5-to 10-membered heteroaryl.

[0100] As used herein, the term “heteroatom” refers to nitrogen, oxygen, or sulfur, and may include any oxidized form of nitrogen or sulfur, and any quaternized form of a basic nitrogen.

[0101] As used herein, the term “oxo” refers to a divalent oxygen atom and the structure of oxo may be shown as =O.

[0102] As used herein, the term “halogen” (or “halo” ) refers to fluoride, chloride, bromide, and iodide. In certain embodiments, non-limiting examples of halogen include fluoride, chloride, and bromide. In certain embodiments, halogen is chloride or bromide. In certain embodiments, halogen is fluoride.

[0103] As used herein, the term “haloalkyl” refers to an alkyl group as described herein in which one or more of hydrogen atoms have been replaced with one or more halogen atoms independently selected from the group consisting of fluoride, chloride, bromide, and iodide. When a haloalkyl contains more than one halogen atom, the halogen atoms can be the same or be different from each other. Non-limiting examples of haloalkyl groups include -CH2F, -CHF2, -CF3, -CF2Cl, -CH2CF3, -CF2CF3, etc. In certain embodiments, haloalkyl groups may be perhaloalkyl groups, such as perfluoroalkyl.

[0104] As used herein, the term “substituted” , when refers to a chemical group, means that the chemical group has one or more hydrogen atoms that is / are removed and replaced by substituents. The term “substituent” as used herein has the ordinary meaning known in the art and refers to a chemical moiety that is covalently attached to, or if appropriate, fused to, a parent group. It is to be understood that substitution at a given atom is limited by valency. It is understood that the substituent can be further substituted.

[0105] As used herein, the term “optionally substituted” means that the chemical group may have no substituents (i.e., unsubstituted) or may have one or more substituents (i.e., substituted) . It is to be understood that substitution at a given atom is limited by valency.

[0106] As used herein, the wavy line,  denotes a point of attachment of a substituent to another group.

[0107] ARYL DIAZONIUM COMPOUND

[0108] In one aspect, the present disclosure is directed to an aryl diazonium compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof:

[0109] wherein Ra and Rb are each independently C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH, and Ra and Rb are each independently substituted on ortho-or para-position to diazonium;

[0110] each Rc is independently selected from the group consisting of C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH,

[0111] each X is independently absent or selected from -CO-NH-and -NH-CO-,

[0112] p = 0, 1, 2, or 3, and

[0113] A is an inorganic or organic acid anion.

[0114] In some embodiment, Ra is C1-6 alkyl, for example C1-4 alkyl, specifically, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl; C2-6 alkenyl, for example C2-4 alkenyl, specifically allyl; C2-6 alkynyl, for example C2-4 alkynyl.

[0115] In some embodiment, Rb is C1-6 alkyl, for example C1-4 alkyl, specifically, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl; C2-6 alkenyl, for example C2-4 alkenyl, specifically allyl; C2-6 alkynyl, for example C2-4 alkynyl.

[0116] In some embodiments, Ra and Rb are the same or different.

[0117] In some embodiments, Rc is C1-6 alkyl optionally substituted with one or more halo, -OH, for example optionally substituted C1-4 alkyl, specifically, methyl, ethyl, n-propyl, -CH3OH, -CH2CH3OH.

[0118] In some embodiments, when two or more Rc are present, they can be the same or different.

[0119] In some embodiments, when two or more X are present, they can be the same or different.

[0120] In some embodiments, the group -X-Rc is selected from the group consisting of methyl, ethyl, -CO-NH-CH2CH3, -NH-CO-CH2CH3, -CO-NH-CH2CH2OH.

[0121] In some embodiments, p = 0, 1, 2, or 3, preferably p is 0 or 1. In some embodiments, p is 0, the group -X-Rc is absent. In some embodiments, p is 1, preferably the group -X-Rc is substituted on ortho-or para-position to diazonium.

[0122] The inorganic or organic acid anion A can be any suitable anion known in the art. Examples may include, but not limited to inorganic acid anion, for example, hydrochloride, hydrobromide, hydriodate, sulphate, bisulphate, nitrate, phosphate, acid phosphate, bicarbonate and carbonate; organic acid anion, for example, acetate, adipate, aspartate, benzoate, besylate, bicarbonate / carbonate, bisulfate / sulfate, borate, camsylate, citrate, cyclamate, edisylate, esylate, formate, fumarate, gluceptate, gluconate, glucuronate, hexafluorophosphate, hibenzate, hydrochloride / chloride, hydrobromide / bromide, hydroiodide / iodide, isethionate, lactate, malate, maleate, malonate, mesylate, methylsulfate, naphthylate, 2-napsylate, nicotinate, nitrate, orotate, oxalate, palmitate, pamoate, phosphate / hydrogen phosphate / dihydrogen phosphate, pyroglutamate, saccharate, stearate, succinate, tannate, tartrate, tosylate, trifluoroacetate, 1, 5-naphathalenedisulfonic acid and xinafoate anions. In some embodiment, the anion A is selected from the group consisting of BF4-, PF6-, SO42-, PO43-, CH3COO-, CF3COO-, NO3-, Cl-, Br-, and I-. In some embodiment, the anion A is Cl-.

[0123] In some embodiments, the aryl diazonium compound is not any one of the following compounds:

[0124] In some embodiments, the aryl diazonium compound is of Formula (Ia) , or (Ib) :

[0125] wherein Ra, Rb, Rc, X, p and A are defined as described herein.

[0126] In some embodimetns, the aryl diazonium compound is of (Ia1) , (Ia2) , (Ib1) , or (Ib2) :

[0127] In some embodiments, the aryl diazonium compound is selected from the group consisting of following compounds:

[0128] Compounds provided herein are described with reference to both generic formulae and specific compounds. In addition, compounds of the present invention may exist in a number of different forms or derivatives, all within the scope of the present invention. These include, for example, pharmaceutically acceptable salts, tautomers, stereoisomers, racemic mixtures, regioisomers, prodrugs, solvated forms, different crystal forms or polymorphs, and active metabolites, etc.

[0129] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable” indicates that the substance or composition is compatible chemically and / or toxicologically, with the other ingredients comprising a formulation, and / or the subjects being treated therewith.

[0130] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable salt” , unless otherwise indicated, includes salts that retain the biological effectiveness of the free acid / base form of the specified compound and that are not biologically or otherwise undesirable. Contemplated pharmaceutically acceptable salt  forms include, but are not limited to, mono, bis, tris, tetrakis, and so on. Pharmaceutically acceptable salts are non-toxic in the amounts and concentrations at which they are administered. The preparation of such salts can facilitate the pharmacological use by altering the physical characteristics of a compound without preventing it from exerting its physiological effect. Useful alterations in physical properties may include, for example, increasing the solubility to facilitate administering higher concentrations of the drug.

[0131] The compounds of the present disclosure may have one or more chiral (asymmetric) centers. The present disclosure encompasses all stereoisomeric forms of the compounds of the present disclosure. Centers of asymmetry that are present in the compounds of the present disclosure can all independently of one another have (R) or (S) configuration. When bonds to a chiral carbon are depicted as straight lines in the structural formulas of the present disclosure, or when a compound name is recited without an (R) or (S) chiral designation for a chiral carbon, it is understood that both the (R) and (S) configurations of each such chiral carbon and hence each enantiomer or diastereomer and mixtures thereof are embraced within the formula or by the name. The production of specific stereoisomers or mixtures thereof may be identified in the Examples where such stereoisomers or mixtures were obtained, but this in no way limits the inclusion of all stereoisomers and mixtures thereof from being within the scope of the disclosure.

[0132] The present disclosure includes all possible enantiomers and diastereomers and mixtures of two or more stereoisomers, for example mixtures of enantiomers and / or diastereomers, in all ratios. Thus, enantiomers are a subject of the present disclosure in enantiomerically pure form, both as levorotatory and as dextrorotatory antipodes, in the form of racemates and in the form of mixtures of the two enantiomers in all ratios.

[0133] Unless otherwise stated, the structures depicted herein are also meant to include the compounds that differ only in the presence of one or more isotopically enriched atoms, in other words, the compounds wherein one or more atoms are replaced by atoms having the same atomic number, but an atomic mass or mass number different from the atomic mass or mass number which predominates in nature. Such compounds are referred to as a “isotopic variant” . The present disclosure is intended to include all pharmaceutically acceptable isotopic variants of the compounds of the present disclosure. Examples of isotopes suitable for inclusion in the compounds of the present disclosure include, but not limited to, isotopes of hydrogen, such as 2H and 3H; carbon, such as 11C, 13C and 14C; chlorine, such as 36Cl; fluorine, such as 18F; iodine, such as 123I and 125I; nitrogen, such as 13N and 15N; oxygen, such as 15O, 17O and 18O; phosphorus, such as 32P; and sulfur, such as 35S. Certain isotopic variants of the compounds of the present disclosure, for example those incorporating a radioactive isotope, may be useful in drug and / or substrate tissue distribution studies. Particularly, compounds having the depicted structures that differ only in the replacement with heavier isotopes, such as the replacement of hydrogen by deuterium (2H) , can afford certain therapeutic advantages, for example, resulting from greater metabolic stability, increased in vivo half-life, or reduced dosage requirements and, hence, may be utilized in some particular circumstances. Isotopic variants of compounds of the present disclosure can generally be prepared by conventional techniques known to one skilled in the art or by processes analogous to those described in the accompanying examples and synthesis using an appropriate isotopically-labeled reagent in place of the non-labeled reagent previously employed. In certain embodiments, isotopic variants of compounds of the present disclosure are deuterated variants.

[0134] USE OF AN ARYL DIAZONIUM COMPOUND IN CONJUGATING KME1 PEPTIDE

[0135] In one aspect, the present disclosure is directed to use of an aryl diazonium compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof in conjugating monomethyllysine (Kme1) peptide.

[0136] As used herein, the term "Kme1 peptide" refers to a peptide that includes at least one lysine residue that has been monomethylated. Specifically, this modification involves the addition of a single methyl group to the ε-amino group of the lysine side chain, resulting in a monomethyl lysine (Kme1) residue. The Kme1 modification is a post-translational modification that can occur on various proteins, including histones and non-histones, and plays a crucial role in regulating protein function, gene expression, and chromatin structure. Kme1 peptides are often utilized in research and development to study protein-protein interactions, develop targeted antibodies, and investigate the biological significance of lysine methylation in cellular processes. These peptides can be synthetically produced or isolated from biological samples, and are valuable tools in the fields of epigenetics, molecular biology, and biochemistry.

[0137] As used herein, the term “conjugate” , “conjugating” and “conjugation” refer to the attachment of a molecule (e.g., a drug, protein, peptide, or antibody) to another molecule (e.g., a small molecule, a polymer, an enzyme, or a fluorescent dye) via a chemical bond to change its physical property or enhance its function or stability. Such bonding can serve various purposes, for example,

[0138] 1. Enhancing Functionality: Conjugation can enhance the biological activity or stability of a molecule. For example, conjugating drugs to antibodies can create antibody-drug conjugates (ADCs) , which allow for targeted drug delivery to specific cells, such as cancer cells;

[0139] 2. Creating Prodrugs: Conjugating a drug to a carrier molecule can create a prodrug, which is inactive until it is metabolized in the body to release the active drug;

[0140] 3. Labeling and Detection: Conjugation is often used to attach labels (like fluorescent dyes, radioactive isotopes, or enzymes) to biomolecules (such as proteins or nucleic acids) to facilitate their detection and study in various assays.

[0141] In the present disclosure, upon conjugation of the aryl diazonium compound of the present disclosure to Kme1 peptide, these compounds label Kme1 and are useful for detection, isolation, enrichment, collection, identification of Kme1 peptides and further use in proteomics studies. In some embodiments, the aryl diazonium compound is selected from the group consisting of following compounds:

[0142] ARYL DIAZONIUM RESIN AND PREPARATION METHOD THEREOF

[0143] In another aspect, the present disclosure is directed to an aryl diazonium resin of Formula (II) :

[0144] or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof,

[0145] wherein Z is a moiety derived from aryl diazonium compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof, where the Formula (I) is defined as described herein;

[0146] L is a linker having a structure of Y-L’, where Y is selected from -CO-NH-or -NH-CO-, L’ is selected from C2-20 alkylene, 4-to 40 membered heteroalkylene, which alkylene and heteroalkylene are optionally substituted with one or more halo, or -OH

[0147] In some embodiments, the moiety Z is mono-valence moiety obtained by removing any one of Ra, Rb, and Rc. For example, the moiety Z is of the following structure:

[0148] In some embodiments, the moiety Z is of the following structure:

[0149] In some embodiments, L’ is selected from optionally substituted straight chain C2-20 alkylene, C2-15 alkylene, C2-12 alkylene, C2-10 alkylene, C2-8 alkylene, C2-6 alkylene or C2-4 alkylene, specifically C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, or C12 alkylene, which is optionally substituted with one or more halo, -OH.

[0150] In some embodiments, L’ is selected from optionally substituted straight chain 4-to 40-membered, for example, 4-to 35-membered, 4-to 30-membered, 4-to 25-membered, 4-to 20-membered, 4-to 15-membered, 4-to 10-membered heteroalkylene containing 1-12, for example, 1-10, 1-8, 1-6, or 1-4, specifically 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 heteroatoms selected from N, O, S, which is optionally substituted with one or more halo, -OH. In some embodiments, L’ is a straight chain 4-to 40-membered heteroalylene comprising 1 to 10 O atoms. In some embodiments, L’ is a straight chain polyethylene glycol group having a structure formula of -CH2CH2O- (CH2CH2O) m-CH2CH2-, m = 0 to 11.

[0151] In some embodiments, L’ is selected from the group consisting of C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12 alkylene, -CH2CH2O-CH2CH2-, -CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-, -CH2CH2O- (CH2CH2O) 2-CH2CH2-, -CH2CH2O- (CH2CH2O) 3-CH2CH2-, -CH2CH2O- (CH2CH2O) 4-CH2CH2-, and -CH2CH2O- (CH2CH2O) 5-CH2CH2-.

[0152] In some embodiments, the linker L is selected from but not limited to the group consiting of followings:

[0153] m = 0 to 11;

[0154] m = 0 to 11;

[0155] n = 2 to 6; and

[0156] n = 2 to 6;

[0157] In some embodiment, the moiety -L-Z is selected from but limited to the group consisting of following:

[0158] m = 0 to 11;

[0159] m = 0 to 11;

[0160] m = 0 to 11;

[0161] m = 0 to 11;

[0162] m = 0 to 11;

[0163] m = 0 to 11;

[0164] n = 2 to 6, preferably 4 to 6;

[0165] n = 2 to 6, preferably 3 to 5;

[0166] n = 2 to 6, preferably 3 to 5;

[0167] n = 2 to 6, preferably 2 to 4;

[0168] wherein Ra, Rb, Rc, X, p and A are defined as described herein.

[0169] Resin can be any suitable resin known in the art. In some embodiments, the term “resin” can be used interchangeably with the terms “bead” , “gel” . In some embodiments, the resin can be optionally added with magnetic material. In some embodiments, the resin is hydrophilic resin, for example Agarose resin. Specific examples of the resin are Sepharose resins from Amersham.

[0170] In some embodiments, the resin comprises -NH2 and / or -COOH group (s) for attachment of the linker L.

[0171] In some embodiment, the resin is a hydrophilic agarose resin comprising -NH2 and / or -COOH with or without pre-activation.

[0172] It should be noted that upon attachment of the linker L to the resin, an amid bond (-CO-NH-, or -NH-CO-) is formed. Although a portion of the amide bond (-CO-or -NH) forming the amide bond is derived from the resin, from the point of view of facilitating the description of the structure of the compounds of the present application, the applicant considers the whole amide bond as a part of the linker L.

[0173] In some embodiments, the aryl diazonium resin is of Formula (IIa) , (IIb) , (IIc) , (IId) , or (IIe) :

[0174] wherein L, Ra, Rb, Rc, X, p and A are defined as described herein.

[0175] In some embodiments, the aryl diazonium resin is of Formula (IIa) , (IIb) , (IIc) , (IId) , or (IIe) :

[0176] In some embodiments, the aryl diazonium resin is selected from but not limited to the group consisting of following compounds:

[0177] In a further aspect, the present disclosure is directed to a method for preparing aryl diazonium resin of Formula (II) :

[0178] or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof, wherein L and Z are defined as described herein.

[0179] In some embodiments, the method comprises following steps:

[0180] I) reacting a compound of Za with a compound of La to obtain a compound of La’-Za’, the compound of Za has a structure of Formula (III) or Formula (III’) :

[0181] wherein Ra and Rb are each independently H, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH, and Ra and Rb are each independently substituted on ortho-or para-position to amine;

[0182] each Rc is independently selected from the group consisting of C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH,

[0183] each X is independently absent or selected from -CO-NH-and -NH-CO-,

[0184] p = 0, 1, 2, or 3, and

[0185] provided that one of Ra and Rb is hydrogen and the other is not,

[0186] wherein Ra and Rb are each independently C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH, and Ra and Rb are each independently substituted on ortho-or para-position to amine;

[0187] each Rc is independently selected from the group consisting of C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH,

[0188] each X is independently absent or selected from -CO-NH-and -NH-CO-,

[0189] p’= 0, 1, or 2, and

[0190] X’ selected from -COOH, and -NH2,

[0191] the compound of La has a structure of Formula (IV) :

[0192] Y’-L’-W

[0193] wherein Y’ is selected from -NH2 or -COOH,

[0194] L’ is selected from C2-20 alkylene, 4-to 40 membered heteroalkylene, which alkylene and heteroalkylene are optionally substituted with one or more halo, or -OH, and

[0195] W is selected from halogen, -COOH, and -NH2,

[0196] the compound of compound of La’-Za’ has a structure of Formula (V) or Formula (V’) :

[0197] II) attaching the compound of La’-Za’ to a resin;

[0198] and

[0199] III) treating the resin-attached compound with acid and nitrite compound to obtain the compound of Formula (II) .

[0200] In some embodiments, L’, Ra, Rb, Rc, X, and p are defined as described herein.

[0201] In some embodiments, in the preparation method of the present application, the groups -NH2 and / or -COOH is protected by a protection group (PG) during the reactions. Therefore, the preparation method of the present application comprises the steps of protecting and deprotecting the amino and / or carboxyl groups. The protection group can be any suitable protection groups known in the art to protect -NH2 and / or -COOH. In some embodiments, the protection group for -NH2 is selected from but not limited to the group consisting of Boc, Fmoc, Cbz, Moc, Alloc, and Tfa. In some embodiments, the protection group for -NH2 is Boc. In some embodiments, the protection group for -COOH is selected from but not limited to the group consisting of methy ester, ethyl ester, tert-butyl ester, benzyl ester, methoxymethyl ester, trifluoroethyl ester, and trimethylsilyl ester.

[0202] Methods, steps, and experimental conditions for protecting and deprotecting amino and / or carboxyl groups using protecting groups are well known to those skilled in the art.

[0203] In some embodiment, in step (II) , upon attachment of the compound of La’-Za’ to the resin, an amid bond (-CO-NH-, or -NH-CO-) is formed.

[0204] In some embodiments, in step (III) , the acid is selected from but not limited to the group consisting of HBF4, HPF6, H2SO4, H3PO4, CH3COOH, CF3COOH, HNO3, HCl, HBr, and HI.

[0205] In some embodiments, in step (III) , the nitrite compound is an inorganic nitrite salt, for example sodium nitrite, or an organic nitrite, for example, tert-butyl nitrite.

[0206] Upon treatment of the resin-attached compound with acid and nitrite compound, the -NH2 attatch to phenyl group is converted into diazonium.

[0207] Kme1 PEPTIDE ENRICHMENT METHOD

[0208] In another aspect, the present disclosure is directed to a method for enriching monomethyllysine (Kme1) peptide, comprising following steps:

[0209] a) incubating an aryl diazonium resin of Formula (II) of the present disclosure with a sample containing Kme1 peptide;

[0210] b) washing the aryl diazonium resin; and

[0211] c) removing and collecting Kme1 peptide from the aryl diazonium resin.

[0212] In some embodiments, the sample containing Kme1 peptide is a biological sample obtain from a subject, for example, a human being, an animal, a microorganism, where the animal comprises mammals, birds, reptiles, amphibians, fish, insets and other arthropods, and other invertebrates. Mammals include but are not limited to primate, monkey, horse, cow, sheep, goat, pig, dog, cat, rabbit, rodent, hamster, rat, or mouse. In some embodiments, the subject is a human being, or a mammal.

[0213] In some embodiment, before step a) , the sample is obtained from the subject, and then it is pre-treated with enzyme, for example, trypsin, Lys-C, rLys-C, Arg-C, Asp-N, Glu-C, to digest the proteins contained in the sample into peptides.

[0214] In some embodiment, in step a) , the sample is dissolved / diluted with a buffer of pH 7.0-10.0, and then incubating with the aryl diazonium resin of Formula (II) for a period of about 0.5 to 2.0 hrs, such as about 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, or 2.0 hrs. The type of buffer is not specifically limited and buffers known to those skilled in the art to be suitable for protein solutions may be used. In some embodiments, the buffer is selected from but not limited to Tris-HCl, NaH2PO4-Na2HPO4, K2CO3-HCl with or without guanidine hydrochloride, and the like.

[0215] In some embodiment, a buffer of pH 7.0-10.0 is used to wash the aryl diazonium resin to remove peptides that do not contain Kme1 modification. In some embodiments, the washing is repeatedly conducted for 1 to 8 times, for example, 3 to 8 times, 4 to 6 times.

[0216] In some embodiment, the buffer for dissolving the sample in step a) and the buffer for washing the aryl diazonium resin in step b) is the same or different, preferably the same.

[0217] In some embodiment, the Kmel peptide is removed from the aryl diazonium resin by an acid. The type of acid is not specifically limited and acids known to those skilled in the art to be suitable for cleave peptides from the resin may be used. In some embodiments, the acid is selected from but not limited to TFA (CF3COOH) , CH3COOH, HCl, HBr, H2SO4, H3PO4. The experimental conditions of the acid treatment, including but not limited to the concentration of the acid, are not particularly limited, and may be adjusted by a person skilled in the art according to practical needs, for example, the concentration of the acid can be 100 mM. In some specific embodiments, the acid is TFA, for example a 1%TFA solution.

[0218] In some embodiment, after removal from the aryl diazonium resin, the Kme1 peptide is collected, and optionally lyophilized for storage and later use.

[0219] In some embodiment, steps a) to c) are repeated for 1 to 2 more times for enriching the Kme1 peptide.

[0220] In some embodiments, the Kme1 peptide is enriched from a biologic sample.

[0221] In some embodiments, the Kme1 peptide is enriched for proteomics study.

[0222] EXAMPLES

[0223] In order that the disclosure may be more fully understood, the following examples are set forth. The examples described herein are offered to illustrate the compounds, methods and compositions provided herein and are not to be construed in any way as limiting the scope of the disclosure.

[0224] During synthetic procedures, it may be necessary and / or desirable to protect sensitive or reactive groups on any of the molecules concerned. This may be achieved by means of conventional protecting groups, such as those described in T. W. Greene and P. G. M. Wutts, Protective Groups in Organic  Synthesis, 4th Edition, John Wiley and Sons. The protective groups are optionally removed at a convenient subsequent stage using methods well known in the art.

[0225] The compounds of the present disclosure can be readily prepared according to the following reaction schemes and examples, or modifications thereof, using readily available starting materials, reagents, and conventional synthesis procedures. In these reactions, it is also possible to make use of variants which are themselves known to those skilled in the art, but are not mentioned in greater detail. Furthermore, other methods for preparing the compounds of the disclosure will be readily apparent to those skilled in the art in light of the reaction schemes and examples as described herein. Unless otherwise indicated, all variables are as defined above.

[0226] In general, chemical procedures, all reagents and materials may be purchased from commercial vendors or may be readily prepared by those skilled in the art. A list of abbreviations for reagents used and organic moieties may be found in Table 1, below.

[0227] General information

[0228] 1. Chemical reagents

[0229] Chemical reagents including N, N-dimethyl-formamide (DMF) , dichloromethane (DCM) , methanol (MeOH) , ethyl acetate (EA) , petroleum ether (PE) , N, N-diisopropyl-carbodiimide (DIC) , ethyl cyanoglyoxylate-2-oxime (Oxyma) and ethanolamine were purchased from Titan Scientific (China) . Acetonitrile (ACN, HPLC grade) , trifluoroacetic acid (TFA, HPLC grade) , triisopropylsilane (TIPS) and formic acid (FA, LC-MS grade) were purchased from J&K Scientific (China) . All Fmoc-AA-OH and Rink amide resin were purchased from GL Biochem (China) . Chemical reagents including d1 (4-nitrobenzenediazonium tetrafluoroborate, CAS: 45627-9) , d5 (4-methoxybenzenediazonium tetrafluoroborate, CAS: 459-64-3) , 4-aminobenzoic acid (CAS: 150-13-0) , 4-amino-N-methylbenzamide (CAS: 6274-22-2) , 4'-aminoacetanilide (CAS: 122-80-5) , 3, 5-dimethoxyaniline (CAS: 10272-07-8) , 2, 5-dimethoxyaniline (CAS: 102-56-7) , 2, 5-dimethoxyaniline (CAS: 2735-04-8) , 2, 6-dimethoxyaniline (CAS: 2734-70-5) , s1 (2-amino3-methoxyphenol, CAS: 40925-69-7) , s6 (4-amino-3-methoxyphenol, CAS: 61638-01-5) , s10 (2amino-5-methoxyphenol, CAS: 40925-70-0) , s14 (tert-butyl 4-hydroxyphenylcarbamate, CAS: 54840-15-2) , tert-butoxycarbonyl anhydride ( (Boc) 2O, CAS: 24424-99-5) and s4 (tert-butyl N [2- [2- [2- (2-bromoethoxy) ethoxy] ethoxy] ethyl] carbamate, CAS: 1076199-21-7) were purchased from Bidepharm (Shanghai, China) . Chemical reagents including dithiothreitol (DTT, CAS: 3483-12-3) , iodoacetamide (IAA, CAS: 144-48-9) , formaldehyde-d 2 solution (～20 wt. %in D2O, 98 atom %D, CAS: 1664-98-8) and sodium cyanoborodeuteride (97 atom %D, CSA: 25895-62-9) were purchased from Sigma-Aldrich (Germany) . All other chemical reagents were analytical grade and used as received without any further purification.

[0230] 2. HPLC, NMR and mass spectrometry

[0231] Peptides and several chemical compounds (including s2, s9, s13 and s16) were analyzed and purified by reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC) (Waters, 1525 binary pump and 2489 UV / visible detector) . Peptides were analyzed with C18 column (XBridge Peptide BEH C18 column,  5 μm, 4.6 mm × 150 mm) at a flow rate of 1.0 mL / min with UV absorption at 220 nm and 254 nm. Chemical compounds s2, s9, s13 and s16 were analyzed with C18 column (XBridge Peptide BEH C18 column,  5 μm, 4.6 mm × 150 mm) at a flow rate of 1.0 mL / min with UV absorption at 220 nm and 238 nm. Peptides were purified with C18 column (XBridge Peptide BEH C18 column,  10 μm, 19 mm × 150 mm) at a flow rate of 10 mL / min. Chemical compounds s2, s9, s13 and s16 were purified with C18 column (XBridge Prep C18 5 μm OBD column) at a flow rate of 10 mL / min. A binary 2 mixture of solvent A (0.1%TFA in H2O) and solvent B (0.1%TFA in ACN) were used as mobile phase for the analysis and purification of peptides as well as chemical compounds s2, s9, s13 and s16. Chemical compounds were characterized by 1H and 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectra with 600 MHz solution NMR spectrometer (Cryo Probe, Bruker, AVANCE NEO) . Chemical compounds, peptides and peptide conjugate products were characterized by high resolution mass spectra (HR-MS) (Waters / Synapt XS HDMS) or matrix-assisted laser desorption / ionization-time of flight (MALDI-TOF) (Bruker, Rapiflex) matrixed with α-cyano-4-hydroxycinnamic acid.

[0232] Example 1 Peptide synthesis

[0233] 1. Fmoc solid-phase peptide synthesis

[0234] Peptides were synthesized for 0.2 mmol scale using Rink amide resin (loading: 0.657 mmol / g) on a Liberty Blue 2.0 automated microwave peptide synthesizer (CEM, U.S.A. ) . Resin was swollen with N2 in DMF at room temperature for 10 min. Before coupling amino acid, the Fmoc was deprotected twice with a solution of 4-methylpiperidine (20%in DMF) at 30℃ for 6 min. For coupling amino acid, 5 equivalents of Fmoc-AA-OH was added to the reaction vessel to couple on the resin at 80℃ for 4 min in the presence of 5 equivalents of DIC and 10 equivalents of Oxyma. The amino acids were coupled to the resin according to the sequence by repeating the deprotection and coupling cycles. And the resin was washed by DMF for three times after each Fmoc deprotection and amino acid coupling cycle. After finishing the synthesis, the resin was washed with DMF, DCM and MeOH in sequence and air-dried under room temperature.

[0235] Peptides were cleaved from the resin by using a cocktail of 88: 2: 5: 5, TFA: TIPS: phenol: H2O for rotating at room temperature 3 hrs. The resin was removed by filtration and the peptides were precipitated by cold diethyl ether with centrifugation. The precipitate was washed with cold diethyl ether again and air-dried under room temperature to obtain the crude. The crude was dissolved in an ACN / H2O mixture for analysis and purification by HPLC. HPLC condition: solvent A (0.1%TFA in H2O) and solvent B (0.1%TFA in ACN) ; 5%of B from 0-4 min, 5%-50 %linear gradient of B from 4-22 min, 50%-95%linear gradient of B from 22-24 min, 95%of B from 24-30 min; flow rate 1 mL / min for analysis and 10 mL / min for purification; detection wavelength 220 nm and 254 nm.

[0236] 2. Characterization of the synthetic peptides The purified peptides were dissolved in H2O and then characterized by MALDI-TOF.

[0237] C*= IAA alkylated cysteine

[0238] Example 2 Diazonium resin preparation

[0239] 1. Synthesis of 2, 6-dimethoxyaniline derivative s2

[0240] s1 (1.39 g, 10 mmol) was dissolved in 10 mL DCM, and then (Boc) 2O (3.49 g, 16 mmol) was added while stirring at room temperature (RT) . After several hours, when s1 was almost consumed as detected by thin layer chromatography (TLC, silica gel, PE / EA, 9 / 1) , the reaction mixture was evaporated in vacuum. The crude was purified with flash column chromatography (silica gel, PE / EA, 9 / 1) to afford the target product s3 as oily liquid (2.15 g, 90%) .

[0241] 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 9.14 (s, 1H) , 7.66 (s, 1H) , 6.98 (t, J = 8.3 Hz, 1H) , 6.45 (d, J = 8.2 Hz, 2H) , 3.70 (s, 3H) , 1.40 (s, 9H) .

[0242] 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 156.2, 154.1, 126.7, 113.9, 108.6, 102.2, 77.8, 55.4, 28.1.

[0243] s3 (1.20 g, 5 mmol) and (Boc) 2O (1.09 g, 5 mmol) were dissolved in 10 mL DMF, and then K2 CO 3 (2.07 g, 15 mmol) was added while stirring at RT. After 1 hr, s4 (2.14 g, 6 mmol) was added and the reaction mixture was heated up to 110℃ for stirring overnight. When s3 was almost consumed as detected by TLC (silica gel, PE / EA, 1 / 1) , the reaction mixture was quenched by saturated NH4Cl aqueous solution, and extracted with EA for 3 times and washed with saturated brine. The combined organic layer was dried with anhydrous Na2SO4 and evaporated in vacuum. The crude was purified  with flash column chromatography (silica gel, PE / EA, 1 / 1) to afford the target product s5 as oily liquid (1.69 g, 55%) .

[0244] 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.22 (t, J = 8.3 Hz, 1H) , 6.74 (t, J = 5.8 Hz, 1H) , 6.68 (t, J = 8.4 Hz, 2H) , 4.08 (t, J = 4.6 Hz, 2H) , 3.75 (s, 3H) , 3.69 (t, J = 4.9 Hz, 2H) , 3.59-3.55 (m, 2H) , 3.52-3.47 (m, 6H) , 3.36 (t, J = 6.2 Hz, 2H) , 3.05 (q, J = 6.0 Hz, 2H) , 1.37 (s, 9H) , 1.34 (s, 18H) .

[0245] 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 155.5, 155.1, 154.3, 150.8, 128.5, 117.1, 105.3, 104.3, 81.0, 77.5, 70.0, 69.7, 69.6, 69.4, 69.0, 68.8, 68.3, 55.6, 28.1, 27.4.

[0246] HR-MS (ESI-TOF) : [M+Na] + m / z 637.3314 (Calculated: 637.3307) .

[0247] s5 (1.03 g, 2 mmol) was dissolved in 8 mL DCM in ice-batch and followed by slowly adding 2 mL TFA with stirring. When s5 was all consumed as detected by TLC (silica gel, DCM / MeOH, 9 / 1) , the reaction mixture was evaporated in vacuum. The crude was purified with preparative HPLC to afford the target product s2 as oily liquid (0.92 g, 90%) . HPLC condition: solvent A (0.1%TFA in H2O) and solvent B (0.1%TFA in ACN) ; 5%of B from 0-4 min, 5%-50 %linear gradient of B from 4-22 min, 50%-95%linear gradient of B from 22-24 min, 95%of B from 24-30 min; flow rate 10 mL / min; detection wavelength 220 nm and 238 nm.

[0248] 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 7.37 (t, J = 8.5 Hz, 1H) , 6.83 (d, J = 8.5 Hz, 2H) , 4.29 (t, J = 4.6 Hz, 2H) , 3.96 (s, 3H) , 3.90 (t, J = 4.6 Hz, 2H) , 3.74-3.71 (m, 2H) , 3.71-3.65 (m, 8H) , 3.11 (t, J = 5.3 Hz, 2H) .

[0249] 13C NMR (151 MHz, CD3OD) δ 153.4, 152.4, 129.6, 108.4, 105.4, 104.5, 70.1, 70.0, 69.8, 69.0, 68.4, 66.5, 55.6, 39.2.

[0250] HR-MS (ESI-TOF) : C15H26N2O5 [M+H] + m / z 315.1917 (Calculated: 315.1914) .

[0251] 2. Synthesis of 2, 4-dimethoxyaniline derivative s9

[0252] s6 (1.39 g, 10 mmol) was dissolved in 10 mL DCM, and then (Boc) 2O (3.49 g, 16 mmol) was added while stirring at RT. After several hours, when s6 was almost consumed as detected by TLC (silica gel, PE / EA, 9 / 1) , the reaction mixture was evaporated in vacuum. The crude was purified with flash column chromatography (silica gel, PE / EA, 9 / 1) to afford the target product s7 as white powder (2.06 g, 86%) .

[0253] 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 9.24 (s, 1H) , 7.67 (s, 1H) , 7.24 (s, 1H) , 6.40 (d, J = 2.5 Hz, 1H) , 6.28 (dd, J 1 = 8.5 Hz, J 2 = 2.5 Hz, 1H) , 3.71 (s, 3H) , 1.42 (s, 9H) .

[0254] 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 154.7, 153.4, 118.5, 106.0, 99.2, 78.3, 55.2, 28.0.

[0255] s7 (1.20 g, 5 mmol) was dissolved in 10 mL DMF, and then K2 CO 3 (2.07 g, 15 mmol) was added while stirring at RT. After 1 h, s4 (2.14 g, 6 mmol) was added and the reaction mixture was heat up to 110℃ for stirring overnight. When s7 was almost consumed as detected by TLC (silica gel,  PE / EA, 1 / 1) , the reaction mixture was quenched by saturated NH4 Cl aqueous solution, and extracted with EA for 3 times and washed with saturated brine. The combined organic layer was dried with anhydrous Na2 SO 4 and evaporated in vacuum. The crude was purified with flash column chromatography (silica gel, PE / EA, 1 / 1) to afford the target product s8 as oily liquid (0.98 g, 38%) .

[0256] 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.78 (s, 1H) , 7.39 (s, 1H) , 6.75 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 6.59 (d, J = 2.7 Hz, 1H) , 6.46 (dd, J1 = 8.7 Hz, J2 = 2.7 Hz, 1H) , 4.06 (t, J = 4.7 Hz, 2H) , 3.77 (s, 3H) , 3.72 (t, J = 4.7 Hz, 2H) , 3.60-3.56 (m, 2H) , 3.56-3.53 (m, 2H) , 3.53-3.47 (m, 4H) , 3.37 (t, J = 6.1 Hz, 2H) , 3.05 (q, J = 6.0 Hz, 2H) , 1.43 (s, 9H) , 1.37 (s, 9H) .

[0257] 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 155.6, 155.5, 153.2, 120.3, 104.5, 99.2, 78.5, 77.5, 69.8, 69.7, 69.6, 69.4, 69.0, 68.9, 67.2, 55.5, 28.1, 28.0.

[0258] HR-MS (ESI-TOF) : [M+Na] + m / z 537.2786 (Calculated: 537.2783) .

[0259] s8 (0.77 g, 1.5 mmol) was dissolved in 8 mL DCM in ice-batch and followed by slowly adding 2 mL TFA with stirring. When s8 was all consumed as detected by TLC (silica gel, DCM / MeOH, 9 / 1) , the reaction mixture was evaporated in vacuum. The crude was purified with preparative HPLC like for s2 to afford the target product s9 as oily liquid (0.62 g, 76%) .

[0260] 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 7.27 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 6.77 (d, J = 2.7 Hz, 1H) , 6.62 (dd, J1 = 8.8 Hz, J2 = 2.8 Hz, 1H) , 4.17 (t, J = 4.5 Hz, 2H) , 3.95 (s, 3H) , 3.86 (t, J = 4.7 Hz, 2H) , 3.74-3.66 (m, 10H) , 3.11 (t, J = 5.1 Hz, 2H) .

[0261] 13C NMR (151 MHz, CD3OD) δ160.6, 153.7, 124.0, 112.2, 105.5, 99.7, 70.2, 70.1, 70.0, 69.8, 69.2, 67.7, 66.4, 55.4, 39.2.

[0262] HR-MS (ESI-TOF) : C15H26N2O5 [M+H] + m / z 315.1920 (Calculated: 315.1914) .

[0263] 3. Synthesis of 2, 4-dimethoxyaniline derivative s13

[0264] s10 (1.39 g, 10 mmol) was dissolved in 10 mL DCM, and then (Boc) 2O (3.49 g, 16 mmol) was added while stirring at RT. After several hours, when s10 was almost consumed as detected by TLC (silica gel, PE / EA, 9 / 1) , the reaction mixture was evaporated in vacuum. The crude was purified with flash column chromatography (silica gel, PE / EA, 9 / 1) to afford the target product s11 as oily liquid (1.56 g, 65%) .

[0265] 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 9.63 (s, 1H) , 7.75 (s, 1H) , 7.31 (s, 1H) , 6.40 (d, J = 2.9 Hz, 1H) , 6.33 (dd, J 1= 8.9 Hz, J 2= 2.9 Hz, 1H) , 3.66 (s, 3H) , 1.44 (s, 9H)

[0266] 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 156.2, 153.4, 119.2, 103.7, 101.5, 78.6, 55.3, 28.1.

[0267] s11 (1.20 g, 5 mmol) was dissolved in 10 mL DMF, and then K2 CO 3 (2.07 g, 15 mmol) was added while stirring at RT. After 1 h, s4 (2.14 g, 6 mmol) was added and the reaction mixture was  heat up to 110℃ for stirring overnight. When s11 was almost consumed as detected by TLC (silica gel, PE / EA, 1 / 1) , the reaction mixture was quenched by saturated NH4 HCl aqueous solution, and extracted with EA for 3 times and washed with saturated brine. The combined organic layer was dried with anhydrous Na2 SO 4 and evaporated in vacuum. The crude was purified with flash column chromatography (silica gel, PE / EA, 1 / 1) to afford the target product s12 as oily liquid (1.29 g, 50%) .

[0268] 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.69 (s, 1H) , 7.48 (s, 1H) , 6.74 (t, J = 5.8 Hz, 1H) , 6.63 (d, J = 2.9 Hz, 1H) , 6.48 (dd, J 1 = 8.8 Hz, J 2 = 2.8 Hz, 1H) , 4.11 (t, J = 4.7 Hz, 2H) , 3.74 (t, J = 4.7 Hz, 2H) , 3.72 (s, 3H) , 3.62-3.58 (m, 2H) , 3.57-3.53 (m, 2H) , 3.53-3.46 (m, 4H) , 3.36 (t, J = 6.2 Hz, 2H) , 3.05 (q, J = 6.1 Hz, 2H) , 1.44 (s, 9H) , 1.36 (s, 9H) .

[0269] 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 156.1, 155.5, 152.9, 121.0, 104.9, 100.6, 78.7, 77.5, 78.7, 77.5, 69.8, 69.7, 69.6, 69.4, 69.0, 68.7, 68.5, 55.1, 28.1, 28.0.

[0270] HR-MS (ESI-TOF) : [M+Na] + m / z 537.2781 (Calculated: 537.2783) .

[0271] s12 (1.03 g, 2 mmol) was dissolved in 8 mL DCM in ice-batch and followed by slowly adding 2 mL TFA with stirring. When s12 was all consumed as detected by TLC (silica gel, DCM / MeOH, 9 / 1) , the reaction mixture was evaporated in vacuum. The crude was purified with preparative HPLC like for s2 to afford the target product s13 as oily liquid (1.03 g, 95%) .

[0272] 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 7.29 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 6.77 (d, J = 2.7 Hz, 1H) , 6.62 (dd, J1 =8.8 Hz, J2 = 2.8 Hz, 1H) , 4.28 (t, J = 4.7 Hz, 2H) , 3.90 (t, J = 4.7 Hz, 2H) , 3.82 (s, 3H) , 3.75-3.71 (m, 2H) , 3.70-3.65 (m, 8H) , 3.11 (t, J = 5.1 Hz, 2H) .

[0273] 13C NMR (151 MHz, CD3OD) δ 161.4, 152.8, 124.0, 112.3, 105.2, 100.3, 70.1, 70.1, 70.0, 69.8, 69.0, 68.3, 66.5, 54.9, 39.2.

[0274] HR-MS (ESI-TOF) : C15H26N2O5 [M+H] + m / z 315.1920 (Calculated: 315.1914) .

[0275] 4. Synthesis of 4-methoxyaniline derivative s9

[0276] s14 (1.05 g, 5 mmol) was dissolved in 10 mL DMF, and then K2 CO 3 (2.07 g, 15 mmol) was added while stirring at RT. After 1 h, s4 (2.14 g, 6 mmol) was added and the reaction mixture was heat up to 100℃ for stirring overnight. When s14 was almost consumed as detected by TLC (silica gel, PE / EA, 1 / 1) , the reaction mixture was quenched by saturated NH4 Cl aqueous solution, and extracted with EA for 3 times and washed with saturated brine. The combined organic layer was dried with anhydrous Na2 SO 4 and evaporated in vacuum. The crude was purified with flash column chromatography (silica gel, PE / EA, 1 / 1) to afford the target product s15 as oily liquid (1.57 g, 65%) .

[0277] 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 9.12 (s, 1H) , 7.34 (d, J = 8.7 Hz, 2H) , 6.83 (d, J = 9.1 Hz, 2H) , 6.75 (t, J = 5.8 Hz, 1H) , 4.01 (t, J = 4.5 Hz, 2H) , 3.71 (t, J = 4.7 Hz, 2H) , 3.59-3.55 (m, 2H) , 3.55-3.47 (m, 6H) , 3.37 (t, J = 6.2 Hz, 2H) , 3.06 (q, J = 4.2 Hz, 2H) , 1.46 (s, 9H) , 1.37 (s, 9H) .

[0278] 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 155.5, 153.5, 152.8, 132.6, 119.4, 114.3, 78.5, 77.5, 69.8, 69.7, 69.6, 69.4, 69.0, 68.9, 67.1, 28.1, 28.1.

[0279] HR-MS (ESI-TOF) : [M+Na] + m / z 507.2688 (Calculated: 507.2677) .

[0280] s15 (1.45 g, 3 mmol) was dissolved in 8 mL DCM in ice-batch and followed by slowly adding 2 mL TFA with stirring. When s15 was all consumed as detected by TLC (silica gel, DCM / MeOH, 9 / 1) , the reaction mixture was evaporated in vacuum. The crude was purified with preparative HPLC like for s2 to afford the target product s16 as oily liquid (1.38 g, 90%) .

[0281] 1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 7.32 (d, J = 9.1 Hz, 2H) , 7.08 (d, J = 9.1 Hz, 2H) , 4.16 (t, J = 4.6 Hz, 2H) , 3.86 (t, J = 4.7 Hz, 2H) , 3.73-3.66 (m, 10H) , 3.11 (t, J = 4.9 Hz, 2H) .

[0282] 13C NMR (151 MHz, CD3OD) δ 159.1, 123.9, 123.3, 115.5, 70.2, 70.1, 70.0, 69.8, 69.2, 67.6, 66.4, 39.2.

[0283] HR-MS (ESI-TOF) : C14H24N2O4 [M+H] + m / z 285.1809 (Calculated: 285.1819) .

[0284] Example 3

[0285] 1. Preparation of resin conjugated with methoxyaniline derivatives

[0286] NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow (ligand concentration: 16-23 μmmol NHS / mL resin) was purchased from Cytiva (U.S.A. ) . 25 mL blank resin was washed by pre-cold 1 mM HCl to remove the packed isopropanol adequately. Meanwhile, s2 (400 mg, 0.76 mmol) was dissolved in 12 mL of 0.2 M NaHCO 3 with 0.5 M NaCl. Next, the filtered resin was added to the buffer containing s2, and the pH was adjusted to about 8.3 for incubating 4 hrs at RT with mild shaking. After the incubation, the buffer was removed by filtration and the resin was incubated with 0.5 M ethanolamine containing 0.5 M NaCl (pH8.5) to block the rest NHS-activated sites for another 4 hrs at RT with mild shaking. After filtration, resin r1-0 was washed by 10 mM CH3COOH with 0.5 M NaCl for several times, and stored in 20%ethanol. The unconjugated s2 left in the buffer was quantified by HPLC profile to calculate the ligand concentration of s2 on resin r1-0, which is about 18 μmol / mL resin. HPLC condition: solvent A (0.1%TFA in H2O) and solvent B (0.1%TFA in ACN) ; 5%of B from 0-4 min, 5%-50 %linear gradient of B from 4-22 min, 50%-95%linear gradient of B from 22-24 min, 95%of B from 24-30 min; flow rate 1 mL / min; detection wavelength 220 nm and 238 nm. In the same way, methoxyaniline derivatives s9, s13 and s16 were conjugated for resin r2-0, r3-0 and r4-0, respectively. And the ligand concentration of s9, s13 and s16 on the corresponding resin were all around 18 μmol / mL resin.

[0287] 2. Activation of the resin

[0288] 100 μL resin r1-0 was washed by H2O for several times from 20%ethanol storage. Next, resin r1-0 was mixed with 200 μL H2O and kept on ice-batch for several minutes. Then, 3 μL 6 M HCl and 4.28 μL 4.2 M NaNO2 were added to the pre-cold resin r1-0 slurry step by step with shaking. After the diazotization of the conjugated 2, 6-methoxyaniline derivative, resin r1-0 was activated to form resin r1, and ready for enriching Kme1 peptides. Resin r2-0, r3-0 and r4-0 were activated to form resin r2, r3 and r4 in the same way.

[0289] Example 4 Investigation of aryl diazonium reactivities using Kme1 peptides

[0290] 1. Characterization of Kme1 peptide conjugation by arene diazonium salts

[0291] Aryl diazonium d2, d3, d4, d6, d7, d8 and d9 were in situ prepared from the corresponding arylamine. 20 mM arylamine was dissolved in 40 mM HCl on ice-bath. Next, NaNO2 was added into the acidic arylamine solution at a final concentration of 40 mM to generate the diazotization. The in situ prepared aryl diazonium stock was kept on ice-bath for further use. The commercial aryl diazonium d1 and d5 were directly dissolved in H2O to make a stock of 20 mM before use and kept on ice-bath.

[0292] The pH7.0 labeling buffer was prepared by 6 M guanidine hydrochloride (Gdn) and 100 mM NaH2PO3 -Na2HPO3. The pH8.0 labeling buffer was prepared by 6 M Gdn and 100 mM Tris-HCl. The pH9.0 labeling buffer was prepared by 6 M Gdn and 100 mM K2CO3-HCl. The pH10.0 labeling buffer was prepared by 6 M Gdn and 100 mM K2CO3-HCl. Kme1 peptides were dissolved in H2O to make a 10 mM stock. 90 μL labeling buffer was added 5 μL 10 mM peptide stock and 5 μL 20 mM arly diazonium stock, and then incubated at RT for 30-120 min with shaking at 1000 rpm. After that, 20 μL reaction mixture was injected into neutral HPLC for determining %conversion of the Kme1 peptide as well as analyzing %side reaction etc. Neutral HPLC condition: solvent A (10 mM NH4HCO3 in H2O) and solvent B (10 mM NH4HCO3 in 10%H2O and 90%ACN) ; 5%of B from 0-4 min, 5%-50 %linear gradient of B from 4-22 min, 50%-95%linear gradient of B from 22-24 min, 95%of B from 24-30 min; flow rate 1.0 mL / min; detection wavelength 220 nm and 254 nm.

[0293] 2. Enrichment of Kme1 peptides by resin

[0294] According to the optimized labeling pH for each aryl diazonium, the pH10.0 labeling buffer was used for resin r1-r3 and the pH9.0 labeling buffer was used for resin r4 during enriching standard Kme1 peptides as well as in the following studies. 100 μL activated resin r1, r2, r3 or r4 was washed by labeling buffer for several times before incubating with Kme1 peptide. Next, 10 μL 10 mM Kme1 peptide p1, p3, p4, p6 or p7 stock was diluted by 190 μL labeling buffer and mixed with the resin for incubating over different times (10 min, 20 min, 30 min and 60 min) with shaking at 1000 rpm. After the incubation, the resin was filtered and washed with 200 μL labeling buffer for two times. The flow through and wash parts were combined for profiling by HPLC to calculate the %retain of the Kme1 peptide on resin. Meanwhile, 200 μL 100 mM CH3COOH was added to the resin for eluting the peptides with shaking at 1000 rpm for 30 min at RT. After the elution, the resin was washed by 200 μL H2O for two times. The elution and wash parts were combined for profiling by HPLC to calculate the %elution of the Kme1 peptide. Time studies were done on different resins to plot their time-retain and time-elution curves for comparison.

[0295] 3. Selectivity test of resin r1

[0296] 100 μL activated resin r1 was washed by labeling buffer for several times and mixed with 150 μL labeling buffer and a mixture of Kme1 peptides and unmodified peptides (i.e. 10 μL 10 mM peptide p2, p3, p4, p5 and p6 stock each) . The mixture was incubated at RT with shaking at 1000 rpm for 1 h. After that, the resin was filtered and washed by 200 μL labeling buffer for two times. Next, 200 μL 100 mM CH3COOH was used to elute peptides with shaking at 1000 rpm for 30 min at RT. After the elution, the resin was washed by 200 μL H2O for two times. The elution and wash parts were combined for analysis by HPLC to profile the selectivity of resin r1 on enriching Kme1 peptides.

[0297] 4. Sensitivity test of resin r1

[0298] 100 μL activated resin r1 was washed by labeling buffer for several times and mixed with 200 μL labeling buffer containing 10 ng peptide p1, 10 ng peptide p6 and 10 μg tryptic BSA for incubating at RT with shaking at 1000 rpm for 1 h. After the incubation, the resin was filtered and washed with 200 μL labeling buffer for two times. Next, 200 μL 100 mM CH3COOH was used to elute peptides  with shaking at 1000 rpm for 30 min at RT. After the elution, the resin was washed by 200 μL H2O for two times. The elution and wash parts were combined for analysis by MALDI-TOF to profile the sensitivity of resin r1 on enriching Kme1 peptides.

[0299] Example 5 Sample preparation and analysis of Kme1 proteomics

[0300] 1. Cell culture and cell lysis

[0301] Human cervical carcinoma cell line HeLa, human embryo kidney cell line HEK293T and human malignant melanoma cell line A375 were all cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media (Gibco, U.S.A. ) with 10%fetal bovine serum (Gibco, U.S.A. ) , 1%penicillin and streptomycin (Gibco, U.S.A. ) . The cells were grown at 37 ℃ in a humidified atmosphere with 5%CO2 . When cells grew to ～90%on the surface of dish, they were harvested by scraper and centrifuged at 500 g for 5 min to move the supernatant and washed by 1 × PBS (Gibco, U.S.A. ) for three times. Next, the cell pellet (～3 × 107 cells) was dissolved in 2 mL strong RIPA lysis buffer (Solarbio, China) with 20 μL 100 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF, Solarbio, China) . The cell lysate was taken ultrasonic crushing treatment (Branson, U.S.A. ) under 35%of total power for 2 min of working time (by 5 s power on and 5 s power off) under ice-bath.

[0302] 2. Mouse tissues acquisition and lysis

[0303] C57BL / 6 male mice, 6-8 weeks old, were obtained from Westlake University Animal Center and maintained in sterile conditions. Animal experiments were approved by the Animal Care and Use Committee of Westlake University and conducted in accordance with the institutional guidelines (License number: IACUC-21-060-WMX) . After euthanizing the mouse, thymus and heart were obtained and washed by 1 × PBS to remove the blood. Each individual tissue was put into a lysing matrix A tube (MP Biomedicals, U.S.A. ) containing 1 mL strong RIPA lysis buffer and 10 μL 100 mM PMSF. The tissues were simultaneous homogenization on a fast sample preparation apparatus and cracking system (FastPrep-24, MP Biomedicals, U.S.A. ) for two cycles (20 s for one cycle) . Each tissue lysate was transferred out and taken ultrasonic crushing treatment under ice-bath as described above.

[0304] 3. Protein extraction and digestion

[0305] Cell lysate and mouse tissue lysate were measured its protein concentration by BCA kit (Novozymes, Denmark) according to its protocol. For each sample, 3 mg protein of cell lysate was incubated with DTT at a final concentration of 10 mM for 45 min at 50℃ water-bath. After that, the cell lysate was cold down to RT and then added IAA at a final concentration of 50 mM for 20 min at RT in dark. Next, more than 4-fold volume of -20℃ pre-cold acetone was poured into the lysate to precipitate protein by keeping on ice-bath at least 2 h. The protein was precipitated by centrifugation at 4℃, 4000 rpm for 10 min and then washed by 90%acetone. Next, the precipitated protein was added 3 mL H2O with ultrasonic treatment to promote its dissolution, followed by adding NH4HCO3 to a final concentration of 50 mM. Finally, 30 μg trypsin (Progema, U.S.A. ) was added to the protein solution for digestion at 37℃ overnight. After the digestion, these peptides were freeze-dried for at least two days under 0.3 Pa vacuum degree to remove the NH4HCO3 as much as possible.

[0306] 4. Kme1 peptides enrichment for proteomics

[0307] Each group of freeze-dried peptides from 3 mg protein was dissolved in 150 μL enriching buffer (4 M Gdn, 750 mM K2CO3-HCl, pH10.0) . 160 μL activated resin r1 was washed by the pH10.0 labeling buffer for several times and transferred into the peptides solution for incubating 1 hr at RT with shaking at 1000 rpm. After that, the resin was filtered and washed by the pH10.0 labeling buffer for several times. Subsequently, another pH10.0 buffer containing 100 mM K2CO3-HCl was used to  wash the resin for several times. Next, the Kme1 peptides were eluted by 300 μL 100 mM CH3COOH for incubating 1 hr at RT with shaking at 1000 rpm and washed by 300 μL H2O for two times. The elution and wash parts were combined and freeze-dried, and then dissolved in 70 μL enriching buffer for the second enrichment by 60 μL resin r1 according to the same operations as described above. Finally, the eluted Kme1 peptides was desalted by C18 tips (Thermo fisher, U.S.A) according to the protocol and ready for the mass spectrometry data acquisition after evaporating the solvent.

[0308] 5. Kme1 proteomics by LC-MS / MS and data analysis

[0309] Kme1 peptides enriched from 3 mg protein were adequately dissolved in 15 μL 0.1%FA. After centrifugation at 13,000 rpm for 10 min, the supernatant was transferred and a volume of 6.5 μL was injected for liquid chromatography-mass spectrometry / mass spectrometry (LC-MS / MS) data acquisition. Those peptides were separated by a 135-min gradient elution at a flow rate of 300 nL / min using a Thermo Vanquish Neo integrated nano-HPLC system directly interfaced with a Thermo Exploris 480 mass spectrometer equipped with FAIMS Pro. The analytical column was a home-made fused silica capillary column (75 μm ID, 150 mm length; Upchurch, Oak Harbor, WA, U.S.A. ) packed with C18 resin ( 2 μm, Varian, Lexington, MA, U.S.A. ) . Solvent A consisted of 0.1%FA in H2O, and solvent B consisted of 80%ACN and 0.1%FA. The mass spectrometer was operated in data-dependent acquisition (DDA) mode using Xcalibur 4.1 software, and the -45 V and -65 V CV values of FAIMS Pro were set as the two independent acquisition events. Under one event, a single full-scan mass spectrum in the Orbitrap (350-1800 m / z, 60,000 resolution) was followed by several data-dependent MS / MS scans (110-1500 m / z, 15,000 resolution) at 30%normalized collision energy, with a total cycle time of 1 s per event. The AGC target was set as 5e4, and the maximum injection time was 50 ms. Each mass spectrum was analyzed using the Thermo Xcalibur Qual Browser and Proteome Discoverer 2.5 for the database searching against the Homo sapiens proteome database downloaded from UniProtKB (UP000005640) containing 80, 581 proteins and the Mus musculus proteome database downloaded from UniProtKB (UP000000589) containing 55, 311 proteins. The sequest search parameters included a 10 ppm precursor mass tolerance, 0.02 Da fragment ion tolerance, and up to 2 internal cleavage sites. Fixed modifications included cysteine alkylation, and lysine monomethylation (+CH2) and methionine oxidation were variable modifications. Peptides were filtered with 1%false discovery rate (FDR) .

[0310] 6. KEGG and GO analysis of Kme1 proteins

[0311] KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) analysis, GO (Gene ontology) analysis of BP (biological process) , CC (cellular component) and MF (molecular function) for Kme1 proteins were processed by metascape, a gene annotation & analysis resource57.

[0312] 7. Heavy isotope dimethyl labeling and proteomics data analysis

[0313] Heavy isotope dimethyl labeling on peptides were according to a standard protocol58. For the labeling on standard peptide, 2 μL 10 mM Kme1 peptide p1 was added to 98 μL 100 mM NaH2 PO3 -Na2 HPO 3 (pH7.0) , followed by adding 0.8 μL formaldehyde-d 2 solution (～20 wt. %in D2 O) and 4 μL 0.6 M sodium cyanoborodeuteride. The reaction mixture was incubated at RT for 1 hr with shaking at 1000 rpm. After that, the reaction was quenched by 16 μL 1% (vol / vol) ammonia solution and acidified by 8 μL FA. Peptide p1 before and after heavy dimethyl labeling was analyzed by MALDI-TOF. For the labeling on enriched Kme1 peptides, those enriched peptides from 6 mg HeLa cell protein were divided into halves. One half was acquired for LC-MS / MS and analyzed data as described above. Another half was dissolved in 100 μL 100 mM NaH2 PO3 -Na2 HPO 3 (pH7.0) and made the heavy isotope dimethyl labeling by the same way on Kme1 peptide p1. The data acquired from the labeled half was analyzed in the same way but considered variable modifications of heavy  dimethylation (+C2 D6 -2H) on N-terminal and one light monomethylation plus one heavy monomethylation (+C2 D3 H) on lysine.

[0314] Example 6 Discovery and validation of SAM-independent Kme1

[0315] HeLa cell gradually labeled by HM-SILAC

[0316] The HM-SILAC (heavy methyl-stable isotope labeling by amino acid in cell culture) labeling media was prepared by adding L-methionine-d3 (Met (CD3) , MCE, U.S.A. ) at a final concentration of 15 mg / L to the Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media (Gibco, U.S.A) lacking L-methionine supplemented with 10%dialyzed fetal bovine serum (VivaCell, China) , 1%penicillin and streptomycin. HeLa cells were first resuscitated in DMEM complete media as described above. When cells were amplified to several dishes, they were washed by warmed 1 × PBS for three times and then cultured in HM-SILAC labeling media after being divided in triplicate. When cells grew to ～90%on the surface of dish, a part of cells were harvested for analyzing Kme1 proteomics and the ratio of heavy / light methyl (CD3 / CH3) on methionine (Met) and S-adenosyl methionine (SAM) . The left cells were cultured in HM-SILAC labeling media again before passage in triplicate. After repeating this six times, the cells were subcultured again in DMEM complete media for four times passage and sampling for analysis at the same time. Every batch of HeLa cells was repeated in triplicate for Kme1 proteomics, Met and SAM analysis.

[0317] HM-SILAC data analysis

[0318] Different batches of HeLa cells cultured in HM-SILAC were lysed and extracted protein followed by tryptic digestion and enrichment of Kme1 peptides as described above. Next, enriched Kme1 peptides were adequately dissolved in 10 μL 0.1%FA and a volume of 7.0 μL was injected for LC-MS / MS data acquisition. Those peptides were separated by a 255-min gradient elution for a better separation. The acquired LC-MS / MS data was analyzed in the same way but considered variable modifications of heavy monomethylation (+CD3-H) or light monomethylation (+CH2) on lysine and heavy methyl (+D3-H3) on methionine. Every monomethylation peptide was quantified the ratio of its heavy methyl form (+CD3-H) and light methyl form (+CH2) by their mass spectra abundance. A comprehensive abundance ratio (heavy / light) was obtained by triplicate data searching on Proteome Discoverer 2.5, and the significant test (p-value) was based on each monomethylation peptide’s abundance by Student t-test.

[0319] Isolation of endogenous Met and SAM

[0320] After discarding the media, HeLa cells on the dishes were washed by warmed 1 × PBS for three times to remove the exogenous methionine. A mixture of 40: 40: 20: 0.5, MeOH: ACN: H2O: FA was pre-cold on ice and added equably to HeLa cells for 1 mL per dish. The dish was kept on the ice for 5 min and then quenched by 50 μL 15%NH4HCO3. After that, the cell mixture was transferred into a tube and centrifuged at 15,000 g for 10 min. After discarding the precipitate, the supernatant was evaporated and resuspended in 100 μL MeOH for detecting the ratio of heavy / light methyl on Met and SAM by LC-MS / MS.

[0321] Acid hydrolysis of enriched Kme1 peptides

[0322] Kme1 peptides obtained from HeLa cell batch H6 (adequately labeled by HM-SILAC) were hydrolyzed in 6 M HCl at 110 ℃ for 24 h in an ampoule3. After that, 6 M HCl was vapored, and the amino acid monomers were resuspended in 100 μL MeOH for detecting the ratio of heavy / light methyl on Kme1 monomer by LC-MS / MS.

[0323] LC-MS / MS analysis of Met, SAM and Kme1 monomer

[0324] LC-MS / MS analysis of endogenous methionine, SAM and Kme1 monomer was conducted using LC-MS system comprising an Agilent 1290 Infinity II UHPLC system tandem with Agilent 6495 mass spectrometer. Chromatographic separation was achieved on ACQUITY UPLC BEH Amide column (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) at 40 ℃. The solvent consisted of 10 mM ammonium acetate, 0.2%FA in water (A) and acetonitrile (B) at a flow rate of 0.3 mL / min. The column was eluted with 90%solvent B for 1 minute, followed by a linear gradient to 50%solvent B over 4 min, held at 50%for 3 min, a linear gradient to 90%solvent B over 0.1 min, then 3.9 min at 90%solvent B. The volume for sample injection was 1 μL. Mass spectrometer operating in positive ion mode using the following settings: sheath gas temperature 250 ℃, sheath gas flow 11 L / min, capillary 3000 V, nozzle voltage 1500 V, gas temperature 200℃, gas flow 14 L / min, nebulizer 20 psi. Compounds were measured by multiple reaction monitoring (MRM) with optimized collision energy are shown in following table.

[0325] Histones extraction, gel digestion and LC-MS / MS analysis

[0326] Histones were extracted from batch H6 cells according to a standard protocol4. Then 9 μL of the 3 μg / μL extracted histones were mixed with 3 μL 4 × SDS loading buffer for heating 5 min at 95℃. 10 μL sample was loaded and run in a 15%SDS-PAGE gel.

[0327] The gel bands of interest were carefully excised and subjected to in-gel digestion. The proteins were enzymatically digested with trypsin (enzyme: substrate = 1: 50) at 37℃ overnight. The resulting digested products were extracted twice using 1%FA in a 50%ACN aqueous solution and subsequently lyophilized via SpeedVac (Thermo Scientific, U.S.A. ) .

[0328] For LC-MS / MS analysis, peptides were reconstituted in 0.1%FA and automatically injected using Bruker’s nanoElute UHPLC System onto a 25 cm column equipped with an emitter (Aurora series, CSI, 25 cm × 75 μm ID, 1.6 μm C18, IonOpticks) . Peptides were eluted over 60 minutes at a constant flow rate of 300 nL / min with a gradient of H2O / 0.1%FA (solvent A) and ACN / 0.1%FA (solvent B) . The gradient started at 2%B, increased to 22%B over 45 minutes, further increased to 35%B over 50 minutes, and held at 80%B from 55 to 60 minutes. Eluted peptides were ionized using a nano-electrospray source (CaptiveSpray source, Bruker Daltonics) and analyzed on a tims quadrupole time-of-flight instrument (timsTOF Pro 2, Bruker Daltonics) in DDA-PASEF mode. The DDA-PASEF windows scheme ranged in dimension m / z from 300 to 1500 and in dimension 1 / K0 from 0.75 to 1.3, with a Ramp Time of 166 ms.

[0329] Data files generated from the LC-MS / MS analysis were processed using both Data Analysis 4.3 (Bruker Daltonics) and Proteome Discoverer 2.5 software. For details, the database and parameters were same to the described above, including variable modifications of heavy monomethylation (+CD3-H) or light monomethylation (+CH2) on lysine and heavy methyl (+D3-H3) on methionine.

[0330] Reference Cited

[0331] [1] P. Cohen, D. Cross, P.A.  Nat. Rev. Drug Discov. 2021, 20, 551-569.

[0332] [2] S.M. Zhao, W. Xu, W.Q. Jiang, W. Yu, Y. Lin, T.F. Zhang, J. Yao, L. Zhou, Y.X. Zeng, H. Li, Y.X. Li, J. Shi, W.L. An, S.M. Hancock, F.C. He, L.X. Qin, J. Chin, P.Y. Yang, X. Chen, Q.Y. Lei, Y. Xiong, K.L. Guan, Science 2010, 327, 1000-1004.

[0333] [3] R. Yau, M. Rape, Nat. Cell Biol. 2016, 18, 579-586.

[0334] [4] R. Aebersold, M. Mann, Nature 2016, 537, 347–355.

[0335] [5] B.T. Weinert, T. Narita, S. Satpathy, B. Srinivasan, B.K. Hansen, C.  W.B. Hamilton, B.E. Zucconi, W.W. Wang, W.S.R. Liu, J.M. Brickman, E.A. Kesicki, A. Lai, K.D.Bromberg, P.A. Cole, C. Choudhary, Cell 2018, 174, 231–244.

[0336] [6] K. Krug, E.J. Jaehnig, S. Satpathy, L. Blumenberg, A. Karpova, M. Anurag, G. Miles, P. Mertins, Y. Geffen, L.C. Tang, D.I. Heiman, S. Cao, Y.E. Maruvka, J.T. Lei, C. Huang, R.B. Kothadia, A. Colaprico, C. Birger, J. Wang, Y.C. Dou, B. Wen, Z. Shi, Y.X. Liao, M. Wiznerowicz, M.A. Wyczalkowski, X.S. Chen, J.J. Kennedy, A.G. Paulovich, M. Thiagarajan, C.R. Kinsinger, T. Hiltke, E.S. Boja, M. Mesri, A.I. Robles, H. Rodriguez, T.F. Westbrook, L. Ding, G. Getz, K.R. Clauser, D.  K.V. Ruggles, B. Zhang, D.R. Mani, S.A. Carr, M.J. Ellis, M.A. Gillette, C.P.T.A. Cons, Cell 2020, 183, 1436–1456.

[0337] [7] C.M. Potel, M.H. Lin, A.J.R. Heck, S. Lemeer, Mol. Cell Proteomics 2018, 17, 1028-1034.

[0338] [8] F. Wolschin, S. Wienkoop, W. Weckwerth, Proteomics 2005, 5, 4389-4397.

[0339] [9] Y.Y. Bian, L. Li, M.M. Dong, X.G. Liu, T. Kaneko, K. Cheng, H.D. Liu, C. Voss, X. Cao, Y. Wang, D. Litchfield, M.L. Ye, S.S.C. Li, H.F. Zou, Nat. Chem. Biol. 2016, 12, 959-966.

[0340]

[0010] K.L. Guan, W. Yu, Y. Lin, Y. Xiong, S.M. Zhao, Nat. Protoc. 2010, 5, 1583-1595.

[0341]

[0011] C.W. Davies, S.E. Vidal, L.L. Phu, J. Sudhamsu, T.B. Hinkle, S.C. Rosenberg, F.R. Schumacher, Y.J. Zeng, C. Schwerdtfeger, A.S. Peterson, J.R. Lill, C.M. Rose, A.S. Shaw, I.E. Wertz, D.S. Kirkpatrick, J.T. Koerber, Nat. Commun. 2021, 12, 4608.

[0342]

[0012] M.K. Luo, Chem. Rev. 2018, 118, 6656-6705.

[0343]

[0013] J.C. Black, C. Van Rechem, J.R. Whetstine, Mol. Cell 2012, 48, 491-507.

[0344]

[0014] C. Martin, Y. Zhang, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005, 6, 838-849.

[0345]

[0015] Y.C. Cai, Y. Zhang, Y.P. Loh, J.Q. Tng, M.C. Lim, Z.D. Cao, A. Raju, E.L. Aiden, S. Li, L. Manikandan, V. Tergaonkar, G. Tucker-Kellogg, M.J. Fullwood, Nat. Commun. 2021, 12, 719.

[0346]

[0016] Q.L. Wan, X. Meng, C.Y. Wang, W.Y. Dai, Z.H. Luo, Z.N. Yin, Z.Y. Ju, X.D. Fu, J. Yang, Q.S. Ye, Z.H. Zhang, Q.H. Zhou, Nat. Commun. 2022, 13, 768.

[0347]

[0017] K. Garber, Nat. Biotechnol. 2020, 38, 909-912.

[0348]

[0018] R.C. Rao, Y.L. Dou, Nat. Rev. Cancer 2015, 15, 334-346.

[0349]

[0019] R. Duan, W.F. Du, W.J. Guo, J. Hematol. Oncol. 2020, 13, 104.

[0350]

[0020] R. Hamamoto, V. Saloura, Y. Nakamura, Nat. Rev. Cancer 2015, 15, 110-124.

[0351]

[0021] G.F. Cui, S. Park, A.I. Badeaux, D. Kim, J. Lee, J.R. Thompson, F. Yan, S. Kaneko, Z.Q. Yuan, M.V. Botuyan, M.T. Bedford, J.Q. Cheng, G. Mer, Nat. Struct. Mol. Biol. 2012, 19, 916-924.

[0352]

[0022] X.B. Shi, L. Kachirskaia, H. Yamaguchi, L.E. West, H. Wen, E.W. Wang, S. Dutta, E. Appella, O. Gozani, Mol. Cell 2007, 27, 636-646.

[0353]

[0023] H.S. Cho, T. Shimazu, G. Toyokawa, Y. Daigo, Y. Maehara, S. Hayami, A. Ito, K. Masuda, N. Ikawa, H.I. Field, E. Tsuchiya, S. Ohnuma, B.A.J. Ponder, M. Yoshida, Y. Nakamura, R. Hamamoto, Nat. Commun. 2012, 3, 1072.

[0354]

[0024] J.B. Olsen, X.J. Cao, B.M. Han, L.H. Chen, A. Horvath, T.I. Richardson, R.M. Campbell, B.A. Garcia, H. Nguyen, Mol. Cell Proteomics 2016, 15, 892-905.

[0355]

[0025] A.L. Guo, H.B. Gu, J. Zhou, D. Mulhern, Y. Wang, K.A. Lee, V. Yang, M. Aguiar, J. Kornhauser, X.Y. Jia, J.M. Ren, S.A. Beausoleil, J.C. Silva, V. Vemulapalli, M.T. Bedford, M.J. Comb, Mol. Cell Proteomics 2014, 13, 372-387.

[0356]

[0026] X.J. Cao, A.M. Arnaudo, B.A. Garcia, Epigenetics 2013, 8, 477-485.

[0357]

[0027] S.M. Carlson, K.E. Moore, E.M. Green, G.M. Martin, O. Gozani, Nat. Protoc. 2014, 9, 37-50.

[0358]

[0028] K.E. Moore, S.M. Carlson, N.D. Camp, P. Cheung, R.G. James, K.F. Chua, A. Wolf-Yadlin, O. Gozani, Mol. Cell 2013, 50, 444-456.

[0359]

[0029] Z.X. Li, Q. Wang, Y. Wang, K.Y. Wang, Z. Liu, W.B. Zhang, M.L. Ye, Anal. Chim. Acta. 2021, 1161, 338467.

[0360]

[0030] Q. Wang, Z. Liu, K.Y. Wang, Y. Wang, M.L. Ye, Anal. Chim. Acta. 2019, 1068, 111-119.

[0361]

[0031] K.Y. Wang, M.M. Dong, J.W. Mao, Y. Wang, Y. Jin, M.L. Ye, H.F. Zou, Anal. Chem. 2016, 88, 11319-11327.

[0362]

[0032] O. Nwajiobi, A.K. Verma, M. Raj, J. Am. Chem. Soc. 2022, 144, 4633-4641.

[0363]

[0033] O. Nwajiobi, S. Mahesh, X. Streety, M. Raj, Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 7344–7352.

[0364]

[0034] A. Sonousi, D. Crich, Org. Lett. 2015, 17, 4006-4009.

[0365]

[0035] F.X. Sun, S. Suttapitugsakul, R.H. Wu, Anal. Chem. 2021, 93, 10334-10342.

[0366]

[0036] T.L. Schlick, Z.B. Ding, E.W. Kovacs, M.B. Francis, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 3718-3723.

[0367]

[0037] S. Sengupta, S. Chandrasekaran, Org. Biomol. Chem. 2019, 17, 8308-8329.

[0368]

[0038] I.R. León, V.  O.N. Jensen, R.R. Sprenger, Mol. Cell Proteomics 2013, 12, 2992-3005.

[0369]

[0039] G. Hart-Smith, D. Yagoub, A.P. Tay, R. Pickford, M.R. Wilkins, Mol. Cell Proteomics 2016, 15, 989-1006.

[0370]

[0040] Q. Wang, K.Y. Wang, M.L. Ye, Analyst 2017, 142, 3536–3548.

[0371]

[0041] P.J. Boersema, R. Raijmakers, S. Lemeer, S. Mohammed, A.J.R. Heck, Nat. Protoc. 2009, 4, 484–494.

[0372]

[0042] M. Ashburner, C.A. Ball, J.A. Blake, D. Botstein, H. Butler, J.M. Cherry, A.P. Davis, K. Dolinski, S.S. Dwight, J.T. Eppig, M.A. Harris, D.P. Hill, L. Issel-Tarver, A. Kasarskis, S. Lewis, J.C. Matese, J.E. Richardson, M. Ringwald, G.M. Rubin, G. Sherlock, G.O. Consortium, Nat. Genet. 2000, 25, 25-29.

[0373]

[0043] M. Kanehisa, S. Goto, Nucleic Acids Res. 2000, 28, 27-30.

[0374]

[0044] J.W. Locasale, Nat. Rev. Cancer 2013, 13, 572-583.

[0375]

[0045] S.E. Ong, G. Mittler, M. Mann, Nat. Methods 2004, 1, 119-126.

[0376]

[0046] Z.X. Wu, Z.Y. Cheng, M.W. Sun, X.L. Wan, P. Liu, T.M. He, M.J. Tan, Y.M. Zhao, Mol. Cell Proteomics 2015, 14, 329-339.

[0377]

[0047] S.E. Ong, M. Mann, Nat. Protoc. 2006, 1, 2650-2660.

[0378]

[0048] S.E. Ong, B. Blagoev, I. Kratchmarova, D.B. Kristensen, H. Steen, A. Pandey, M. Mann, Mol. Cell Proteomics 2002, 1, 376-386.

[0379]

[0049] A. Tsugita, J.J. Scheffler, Eur. J. Biochem. 1982, 124, 585-588.

[0380]

[0050] X.H. Shen, Y.C. Liu, Y.J. Hsu, Y. Fujiwara, J. Kim, X.H. Mao, G.C. Yuan, S.H. Orkin, Mol. Cell 2008, 32, 491–502.

[0381]

[0051] E.J. Wagner, P.B. Carpenter, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2012, 13, 115-126.

[0382]

[0052] M.I. Valencia-Sánchez, P. De Ioannes, M. Wang, D.M. Truong, R. Lee, J.P. Armache, J.D. Boeke, K.J. Armache, Science 2021, 371, eabc6663.

[0383]

[0053] H. Huang, S. Lin, B.A. Garcia, Y.M. Zhao, Chem. Rev. 2015, 115, 2376-2418.

[0384]

[0054] F. Sindikubwabo, S. Ding, M.M, P. Ortet, M. Barakat, S. Baumgarten, D. Cannella, A. Palencia, A. Bougdour, L. Belmudes, Y. Couté, I. Tardieux, C.Y. Botte, A. Scherf, M.A. Hakimi, eLife 2017, 6, e29391.

[0385]

[0055] K.W. Anderson, I.V. Turko, Clin. Proteomics 2015, 12, 26.

[0386]

[0056] D. Shechter, H.L. Dormann, C.D. Allis, S.B. Hake, Nat. Protoc. 2007, 2, 1445-1457.

[0387]

[0057] Y.Y. Zhou, B. Zhou, L. Pache, M. Chang, A.H. Khodabakhshi, O. Tanaseichuk, C. Benner, S.K. Chanda, Nat. Commun. 2019, 10, 1523.

[0388]

[0058] P.J. Boersema, R. Raijmakers, S. Lemeer, S. Mohammed, A.J.R. Heck, Nat. Protoc. 2009, 4, 484–494.

[0389]

[0059] A. Tsugita, J.J. Scheffler, Eur. J. Biochem. 1982, 124, 585-588.

[0390]

[0060] D. Shechter, H.L. Dormann, C.D. Allis, S.B. Hake, Nat. Protoc. 2007, 2, 1445-1457.

Claims

1.An aryl diazonium compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof: wherein Ra and Rb are each independently C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH, and Ra and Rb are each independently substituted on ortho-or para-position to diazonium;each Rc is independently selected from the group consisting of C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH,each X is independently absent or selected from -CO-NH-and -NH-CO-,p = 0, 1, 2, or 3, andA is an inorganic or organic acid anion.2.The aryl diazonium compound of Formula (I) according to claim 1, wherein Ra and Rb are the same or different.3.The aryl diazonium compound of Formula (I) according to claim 1 or 2, wherein the group -X-Rc is selected from the group consisting of methyl, ethyl, -CO-NH-CH2CH3, -NH-CO-CH2CH3, -CO-NH-CH2CH2OH.4.The aryl diazonium compound of Formula (I) according to any of claims 1 to 3, wherein p is 0 or 1, when p is 0, the group -X-Rc is absent, when p is 1, the group -X-Rc is substituted on ortho-or para-position to diazonium.5.The aryl diazonium compound of Formula (I) according to any of claims 1 to 4, wherein the anion A is selected from the group consisting of BF4-, PF6-, SO42-, PO43-, CH3COO-, CF3COO-, NO3-, Cl-, Br-, and I-, preferably, the anion A is Cl-.6.The aryl diazonium compound of Formula (I) according to any of claims 1 to 5, wherein the aryl diazonium compound is of Formula (Ia) , or (Ib) : 7.The aryl diazonium compound of Formula (I) according to any of claims 1 to 6, wherein the aryl diazonium compound is of (Ia1) , (Ia2) , (Ib1) , or (Ib2) : 8.The aryl diazonium compound of Formula (I) according to any of claims 1 to 7, wherein the aryl diazonium compound is selected from the group consisting of following compounds: 9.Use of an aryl diazonium compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof according to any of claims 1 to 8 in conjugating monomethyllysine (Kme1) peptide.10.The use according to claim 9, wherein the aryl diazonium compound is selected from the group consisting of following compounds: 11.An aryl diazonium resin of Formula (II) : or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof,wherein Z is a moiety derived from aryl diazonium compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof according to claims 1 to 8;L is a linker having a structure of Y-L’, where Y is selected from -CO-NH-or -NH-CO-, L’ is selected from C2-20 alkylene, 4-to 40 membered heteroalkylene, which alkylene and heteroalkylene are optionally substituted with one or more halo, or -OH.12.The aryl diazonium resin of Formula (II) according to claim 11, wherein the moiety Z is mono-valence moiety obtained by removing any one of Ra, Rb, and Rc, for example, the moiety Z is of the following structure: Preferably, the moiety Z is of the following structure:13.The aryl diazonium resin of Formula (II) according to claim 11 or 12, wherein L’ is selected from optionally substituted straight chain C2-20 alkylene, which is optionally substituted with one or more halo, -OH; or L’ is selected from optionally substituted straight chain 4-to 40-membered heteroalkylene containing 1-12 heteroatoms selected from N, O, S, which is optionally substituted with one or more halo, -OH, for example, L’ is a straight chain 4-to 40-membered heteroalylene comprising 1 to 10 O atoms, preferably, L’ is a straight chain polyethylene glycol group having a structure formula of -CH2CH2O- (CH2CH2O) m-CH2CH2-, m = 0 to 11.14.The aryl diazonium resin of Formula (II) according to any of claims 11 to 13, wherein L’ is selected from the group consisting of C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12 alkylene, -CH2CH2O-CH2CH2-, -CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-, -CH2CH2O- (CH2CH2O) 2-CH2CH2-, -CH2CH2O- (CH2CH2O) 3-CH2CH2-, -CH2CH2O- (CH2CH2O) 4-CH2CH2-, and -CH2CH2O- (CH2CH2O) 5-CH2CH2-.15.The aryl diazonium resin of Formula (II) according to any of claims 11 to 14, wherein the linker L is selected from but not limited to the group consiting of followings: m = 0 to 11; m = 0 to 11; n = 2 to 6; and n = 2 to 6;16.The aryl diazonium resin of Formula (II) according to any of claims 11 to 15, wherein the moiety -L-Z is selected from but limited to the group consisting of following: m = 0 to 11; m = 0 to 11; m = 0 to 11; m = 0 to 11; m = 0 to 11; m = 0 to 11; n = 2 to 6, preferably 4 to 6; n = 2 to 6, preferably 3 to 5; n = 2 to 6, preferably 3 to 5; n = 2 to 6, preferably 2 to 4.17.The aryl diazonium resin of Formula (II) according to any of claims 11 to 16, wherein the aryl diazonium resin is of Formula (IIa) , (IIb) , (IIc) , (IId) , or (IIe) : preferably, the aryl diazonium resin is of Formula (IIa1) , (IIa2) , (IIb1) , (IIb2) , (IIc1) , (IIc2) , (IId1) , or (IIe1) :18.The aryl diazonium resin of Formula (II) according to any of claims 11 to 17, wherein the aryl diazonium resin is selected from the group consisting of following compounds: 19.A method for preparing aryl diazonium resin of Formula (II) : or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof according to any of claims 11 to 18.20.The method according to claim 19 comprises following steps:I) reacting a compound of Za with a compound of La to obtain a compound of La’-Za’, the compound of Za has a structure of Formula (III) or Formula (III’) :wherein Ra and Rb are each independently H, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH, and Ra and Rb are each independently substituted on ortho-or para-position to amine;each Rc is independently selected from the group consisting of C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH,each X is independently absent or selected from -CO-NH-and -NH-CO-,p = 0, 1, 2, or 3, andprovided that one of Ra and Rb is hydrogen and the other is not,wherein Ra and Rb are each independently C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH, and Ra and Rb are each independently substituted on ortho-or para-position to amine;each Rc is independently selected from the group consisting of C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, and C2-6 alkynyl, which alkyl, alkenyl, and alkynyl is optionally substituted with one or more halo, -OH,each X is independently absent or selected from -CO-NH-and -NH-CO-,p’ = 0, 1, or 2, andX’ selected from -COOH, and -NH2,the compound of La has a structure of Formula (IV) :Y’-L’-Wwherein Y’ is selected from -NH2 or -COOH,L’ is selected from C2-20 alkylene, 4-to 40 membered heteroalkylene, which alkylene and heteroalkylene are optionally substituted with one or more halo, or -OH, andW is selected from halogen, -COOH, and -NH2,the compound of compound of La’-Za’ has a structure of Formula (V) or Formula (V’) :II) attaching the compound of La’-Za’ to a resin;andIII) treating the resin-attached compound with acid and nitrite compound to obtain the compound of Formula (II) .21.The method according to claim 19 or 20, wherein the method comprises the steps of protecting and deprotecting amino and / or carboxyl groups.22.The method according to any of claim 19 to 21, wherein in step (II) , upon attachment of the compound of La’-Za’ to the resin, an amid bond (-CO-NH-, or -NH-CO-) is formed.23.The method according to any of claim 19 to 22, wherein in step (III) , the acid is selected from but not limited to the group consisting of HBF4, HPF6, H2SO4, H3PO4, CH3COOH, CF3COOH, HNO3, HCl, HBr, and HI.24.The method according to any of claim 19 to 23, wherein in step (III) , the nitrite compound is an inorganic nitrite salt, for example sodium nitrite, or an organic nitrite, for example, tert-butyl nitrite.25.A method for enriching monomethyllysine (Kme1) peptide, comprising following steps:a) incubating an aryl diazonium resin of Formula (II) or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof according to any of claims 11 to 18 with a sample containing Kme1 peptide;b) washing the aryl diazonium resin; andc) removing and collecting Kme1 peptide from the aryl diazonium resin.26.The method according to claim 25, wherein the sample containing Kme1 peptide is a biological sample obtain from a subject, for example, a human being, an animal, a microorganism.27.The method according to claim 25 or 26, wherein before step a) , the sample is obtained from the subject, and then it is pre-treated with enzyme, for example, trypsin, Lys-C, rLys-C, Arg-C, Asp-N, Glu-C, to digest the proteins contained in the sample into peptides.28.The method according to any of claim 25 to 27, wherein in step a) , the sample is dissolved / diluted with a buffer of pH 7.0-10.0, and then incubating with the aryl diazonium resin of Formula (II) for a period of about 0.5 to 2.0 hrs.29.The method according to any of claim 25 to 28, wherein a buffer of pH 7.0-10.0 is used to wash the aryl diazonium resin to remove peptides that do not contain Kme1 modification.30.The method according to any of claim 25 to 29, wherein the Kme1 peptide is removed from the aryl diazonium resin by an acid, for example, TFA, CH3COOH, HCl, HBr, H2SO4, H3PO4.31.The method according to any of claim 25 to 30, wherein after removal from the aryl diazonium resin, the Kme1 peptide is collected, and optionally lyophilized for storage and later use.32.The method according to any of claim 25 to 31, wherein steps a) to c) are repeated for 1 to 2 more times for enriching the Kme1 peptide.33.The method according to any of claim 25 to 32, wherein the Kme1 peptide is enriched from a biologic sample.34.The method according to any of claim 25 to 33, wherein the Kme1 peptide is enriched for proteomics study.

Images