Engineered TRNA molecules and methods

Abstract

The engineered transfer RNA (tRNA) molecules for carrying an arginine (Arg) amino acid (including, for example, a suppressor tRNA), the expression cassettes and vectors comprising nucleic acids encoding an engineered tRNA, pharmaceutical compositions comprising the expression cassettes, vectors, and / or the engineered tRNA, and methods of restoring translation and / or disease treatment involving engineered suppressor tRNA molecules are provided.

Description

ENGINEERED TRNA MOLECULES AND METHODSCROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATION

[0001] This application claims the benefit of PCT International Application No. PCT / CN2024 / 100922, filed June 24, 2024, PCT International Application No. PCT / CN2024 / 110998, filed on August 9, 2024, and PCT International Application No. PCT / CN2025 / 078245, filed on February 20, 2025, each of which is hereby incorporated by reference in its entirety. REFERENCE TO AN ELECTRONIC SEQUENCE LISTING

[0002] The contents of the electronic sequence listing (302442000341SEQLIST. xml; Size: 222, 706 bytes; and Date of Creation: April 25, 2025) is herein incorporated by reference in its entirety.FIELD

[0003] The present disclosure relates in some aspects to engineered transfer RNA (tRNA) molecules for carrying an arginine (Arg) amino acid. The present disclosure further relates to expression cassettes and vectors comprising nucleic acids encoding engineered tRNA, pharmaceutical compositions comprising these expression cassettes, vectors, and / or engineered tRNA, and methods involving engineered tRNA molecules for restoring translation and / or treating diseases.BACKGROUND

[0004] Rare diseases, also known as orphan diseases, are strictly defined based on their prevalence. In the United States, a disease is deemed “rare” when it affects fewer than one person out of 1500; in Europe, fewer than one person out of 2000. To date, 6172 unique rare diseases have been documented. 71.9%of these originate from genetic mutations, with the remainder being triggered by viral or bacterial infections, allergies, or environmental factors (Nguengang Wakap, S., et al. (2020) Estimating cumulative point prevalence of rare diseases: analysis of the Orphanet database. Eur J Hum Genet. Feb; 28 (2) : 165-173. doi: 10 [dot] 1038 / s41431-019-0508-0. Epub 2019 Sep 16. PMID: 31527858; PMCID: PMC6974615) . About 263-446 million people are estimated to suffer from rare diseases globally at any point in time (Nguengang Wakap, S., et al. (2020) Estimating cumulative point prevalence of rare diseases: analysis of the Orphanet database. Eur J Hum Genet. Feb; 28 (2) : 165-173. doi: 10 [dot] 1038 / s41431-019-0508-0. Epub 2019 Sep 16. PMID: 31527858; PMCID: PMC6974615) . Regrettably, 75%of rare disease patients are children, with 30%of them having life expectancies of less than 5 years (Benhabiles, H., et al. (2016) . Pathologies Susceptible to be Targeted for Nonsense Mutation Therapies. 10.1016 / B978-0-12-804468-1.00002-6) . Due to the low prevalence of each rare disease, the market has not been able to support the resources needed to study the pathogenesis of these diseases or discover new drugs or treatments.

[0005] Genetically based rare diseases can arise from the insertion or deletion of one or more nucleotides (such as a frameshift mutation) and / or point mutations (such as nonsense or missense mutations) in a gene, resulting in absent or nonfunctional gene products (Benhabiles, H., et al. (2016) . Pathologies Susceptible to be Targeted for Nonsense Mutation Therapies. 10.1016 / B978-0-12-804468-1.00002-6) . Nonsense mutations are well-studied point mutations that lead to a premature termination codon (PTC) in the messenger RNA (mRNA) , causing reduced mRNA stability and truncated protein products (Khajavi, M., et al. (2006) Nonsense-mediated mRNA decay modulates clinical outcome of genetic disease. Eur J Hum Genet. Oct; 14 (10) : 1074-81. doi: 10.1038 / sj [dot] ejhg [dot] 5201649. Epub 2006 Jun 7. PMID: 16757948) . To date, 410, 743 gene mutations have been found responsible for various human inherited diseases, with approximately 11% (45, 689) being nonsense mutations (data from the Human Gene Mutation Database https:  / / www [dot] hgmd [dot] cf [dot] ac [dot] uk / ac / index [dot] php, accessed July 4, 2023) . These nonsense mutations are present in the mRNAs of various genes and occur at different frequencies depending on the stop codon, including 41.8% (19, 101) TAG, 36.5% (16, 680) TGA, and 21.7%(9,908) TAA PTCs. Remarkably, the codon decoding Arginine (Arg) to TGA nonsense mutation counts for the most frequent transitions (9302) (data from the Human Gene Mutation Database  https:  / / www [dot] hgmd [dot] cf [dot] ac [dot] uk / ac / index [dot] php, accessed July 4, 2023) .

[0006] Human inherited diseases caused by nonsense mutations are mainly associated with truncated protein products and rapid degradation of PTC-containing mRNA. Degradation and elimination of PTC-containing mRNAs are triggered by the evolutionarily conserved RNA surveillance mechanism known as nonsense-mediated mRNA decay (NMD) (Chang, Y.F., et al. (2007) The nonsense-mediated decay RNA surveillance pathway. Annu Rev Biochem. 76: 51-74. doi: 10.1146 / annurev [dot] biochem [dot] 76 [dot] 050106 [dot] 093909. PMID: 17352659) . The NMD pathway relies on the ribosome for scanning stop codons, and the presence of exon-junction complexes (EJCs) , which are deposited approximately 20-24 nt upstream of exon-exon junctions. When a ribosome pauses at a stop codon and an EJC is situated more than 50 nt downstream of it, the SURF complex is recruited to the mRNA. The SURF complex consists of a protein kinase (SMG1) , an RNA helicase (UPF1) , as well as the peptide release factors eRF1 and eRF3. Phosphorylation of UPF1 further leads to the recruitment of SMG5, SMG6 and SMG7, which provide a link to the mRNA decay pathway mediated by exonucleases and endonucleases (Nickless, A, et al. (2017) Control of gene expression through the nonsense-mediated RNA decay pathway. Cell Biosci. May 19; 7: 26. doi: 10 [dot] 1186 / s13578-017-0153-7. PMID: 28533900; PMCID: PMC5437625) .

[0007] In the past two decades, clinical studies of PTC therapeutics have focused on enhancing PTC readthrough by incorporating an amino acid to restore the production and function of faulty proteins (Spelier, S., et al. (2023) Readthrough compounds for nonsense mutations: bridging the translational gap. Trends Mol Med. Apr; 29 (4) : 297-314. doi: 10 [dot] 1016 / j [dot] molmed [dot] 2023 [dot] 01 [dot] 004. Epub 2023 Feb 22. PMID: 36828712) . The dominant strategy in the field has been to apply small molecules to promote PTC readthrough based on their role in inhibiting ribosome proofreading (e.g., aminoglycosides, Ataluren) , the NMD pathway (e.g., amlexanox) , and inducing mRNA-tRNA mispairing (e.g., pseudouridylation) (Spelier, S., et al. (2023) Readthrough compounds for nonsense mutations: bridging the translational gap. Trends Mol Med. Apr; 29 (4) : 297-314. doi: 10.1016 / j [dot] molmed [dot] 2023 [dot] 01 [dot] 004. Epub 2023 Feb 22. PMID: 36828712) . Despite several small molecules demonstrating positive outcomes in clinical trials for treating diseases caused by PTCs, the uncertainty regarding which amino acid is incorporated increases the risk of yielding an inappropriate protein product and / or generating off-target effects. Another approach involves implementing a gene therapy strategy to ensure the correct protein production, for instance, CRISPR-based gene editing of a faulty gene or delivery of a transgene (Porter, J.J., et al. (2021) Therapeutic promise of engineered nonsense suppressor tRNAs. Wiley Interdiscip Rev RNA. Jul; 12 (4) : e1641. doi: 10 [dot] 1002 / wrna [dot] 1641. Epub 2021 Feb 10. PMID: 33567469; PMCID: PMC8244042) . However, the application of this approach is constrained by its single target specificity and the risk of off-target effects.

[0008] Following the development of in vivo delivery systems and genome-wide, transcriptome-wide, and proteome-wide analysis technologies, suppressor tRNAs have drawn attention for their potential to treat diseases caused by PTCs (Wang, J., et al. (2022) AAV-delivered suppressor tRNA overcomes a nonsense mutation in mice. Nature. Apr; 604 (7905) : 343-348. doi: 10 [dot] 1038 / s41586-022-04533-3. Epub 2022 Mar 23. PMID: 35322228; PMCID: PMC9446716) . Suppressor tRNAs are derived from naturally occurring tRNAs, with alterations of the anticodon to target a PTC (e.g., UAA, UAG, UGA) , and they carry a desired amino acid to restore full-length protein products for mRNAs containing PTCs. Compared to other PTC rescue strategies, suppressor tRNAs offer the potential to target various PTC induced genetic diseases with a single component and minimal side effects (Wang, J., et al. (2022) AAV-delivered suppressor tRNA overcomes a nonsense mutation in mice. Nature. Apr; 604 (7905) : 343-348. doi: 10 [dot] 1038 / s41586-022-04533-3. Epub 2022 Mar 23. PMID: 35322228; PMCID: PMC9446716) .

[0009] All publications, comprising patent documents, scientific articles and databases, referenced in this application are incorporated by reference in their entirety for all purposes to the same extent as if each individual publication were individually incorporated by reference.SUMMARY

[0010] Disclosed herein are engineered transfer RNA (tRNA) molecules for carrying an arginine (Arg) amino acid. Also disclosed are expression cassettes and vectors comprising nucleic acids encoding the engineered tRNAs; pharmaceutical compositions comprising the expression cassettes, vectors, and / or engineered tRNA; and methods involving engineered tRNA molecules for restoring translation and / or treating diseases. The engineered tRNAs disclosed herein comprise an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region. The anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anti-codon, which may recognize, e.g., a TGA / UGA stop codon. An engineered tRNA molecule disclosed herein may comprise one or more modifications relative to a corresponding reference tRNA, such as, for example, relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 or relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2. An engineered tRNA molecule disclosed herein may exhibit an increased quality and / or quantity as compared to a corresponding reference tRNA. An engineered tRNA molecule disclosed herein may be used in a method of restoring translation of a coding nucleic acid of interest containing a premature TGA / UGA stop codon in a cell (e.g., increasing readthrough efficiency of the premature TGA / UGA stop codon) , by, for example, introducing to the cell the engineered tRNA (or, for example, introducing to the cell a nucleic acid encoding the engineered tRNA, or a vector comprising the nucleic acid encoding the tRNA) , wherein the engineered tRNA introduced into the cell or produced from the nucleic acid or vector recognizes and reads through the premature TGA / UGA stop codon, thereby stabilizing the PTC containing mRNA and restoring translation of the coding nucleic acid of interest containing the premature TGA / UGA stop codon.

[0011] One aspect of the present application provides an engineered transfer RNA (tRNA) for carrying an arginine, including an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm includes a tri-nucleotide anti-codon, wherein the engineered tRNA includes one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications include: (a) a G to A substitution at position 73; (b) a C to U substitution at position 72; (c) a G to C substitution at position 2 together with a U to G substitution at position 71; (d) a U to C substitution at position 4 together with an A to G substitution at position 69; (e) a C to G substitution at position 5 together with a G to U substitution at position 68; (f) a C to G substitution at position 6 together with a G to C substitution at position 67; or a C to A substitution at position 6 together with a G to U substitution at position 67; (g) an A to G substitution at position 26; (h) an A to G substitution at position 43; (i) an A to C substitution at position 31 together with a U to G substitution at position 39; (j) a U to C substitution at position 40; (k) an A to G substitution at position 44; and / or (l) a C to G substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65; or a C to A substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65; wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the anticodon is 5’ -UCA-3’ and recognizes a TGA / UGA stop codon.

[0012] Another aspect of the present application provides an engineered transfer RNA (tRNA) for carrying an arginine, including an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm includes a tri-nucleotide anti-codon, wherein the engineered tRNA includes one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications include: (a) a G to A substitution at position 73; (b) a C to U substitution at position 72; (c) a G to C substitution at position 2 together with a U to G substitution at position 71; (d) a U to C substitution at position 4 together with an A to G substitution at position 69; (e) a C to G substitution at position 5 together with a G to U substitution at position 68; (f) a C to G substitution at position 6 together with a G to C substitution at position 67; or a C to A substitution at position 6 together with a G to U substitution at position 67; (g) an A to G substitution at position 26; (h) an A to G substitution at position 43; (i) an A to C substitution at position 31 together with a U to G substitution at position 39; (j) a U to C substitution at position 40; (k) an A to G substitution at position 44; (l) a C to G substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65; or a C to A substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65; (m) a G to U substitution at position 2 together with a U to A substitution at position 71; (n) an A to G substitution at position 69 alone; (o) a C to U substitution at position 6 together with a G to A substitution at position 67; (p) a U to A substitution at position 27 together with an A to U substitution at position 43; (q) an A to G substitution at position 37; (r) a G to U substitution at position 12 together with a C to A substitution at position 23; (s) a G to A substitution at position 9; (t) an A to U substitution at position 26; and / or (u) a G to C substitution at position 59; wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the anticodon is 5’ -UCA-3’ and recognizes a TGA / UGA stop codon.

[0013] In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA includes a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to G substitution at position 6, and a G to C substitution at position 67, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA includes a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to A substitution at position 6, and a G to U substitution at position 67, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA includes an A to G substitution at position 26, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA includes an A to G substitution at position 43, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, and a U to C substitution at position 40, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA includes an A to G substitution at position 44, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA includes a C to G substitution at position 49, and a G to U substitution at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.

[0014] In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA further includes an A to G substitution at position 26, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA further includes an A to G substitution at position 43, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, and a U to C substitution at position 40, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA further includes a C to G substitution at position 49 and a G to U substitution at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA further includes an A to G substitution at position 44, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.

[0015] In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA further includes a C to G substitution at position 49 and a G to U substitution at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA further includes an A to G substitution at position 44, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA further includes a G to A substitution at position 73, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA further includes an A to G substitution at position 43, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39 and a U to C substitution at position 40, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA further includes a C to A substitution at position 49 and a G to U substitution at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA includes a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to G substitution at position 5, and a G to U substitution at position 68, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA includes a G to A substitution at position 73, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.

[0016] In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA further includes: (a. ) a C to G substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65, and / or (b. ) an A to G substitution at position 44, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA further includes: (a. ) an A to G substitution at position 26; and / or (b. ) an A to G substitution at position 44; wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position; optionally wherein the engineered tRNA further includes (c. ) a C to G substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA further includes (a. ) a G to A substitution at position 73, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position; optionally wherein the engineered tRNA further includes (b. ) an A to G substitution at position 43, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, and a U to C substitution at position 40, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.

[0017] Another aspect of the present application provides an engineered transfer RNA (tRNA) for carrying an arginine, including an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm includes a tri-nucleotide anti-codon, wherein the engineered tRNA includes one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2 (Arg-CCT-4-1) , and wherein the one or more modifications include: (a) an A to G substitution at position 6 together with a U to C substitution at position 67; or an A to C substitution at position 6 together with a U to G substitution at position 67; (b) a G to A substitution at position 9; (c) a C to U substitution at position 12 together with a G to A substitution at position 23; (d) a U to C substitution at position 13 together with an A to G substitution at position 22; (e) an A to G substitution at position 22 together with an A to G substitution at position 46; (f) an A to G substitution at position 26; (g) a G to A substitution at position 44; and / or (h) a U to C substitution at position 50 together with an A to G substitution at position 64; wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.

[0018] In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA includes a nucleic acid sequence at least 85%identical to a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 124. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA contains no more than about 5 nucleotide differences relative to a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 124.

[0019] Another aspect of the present disclosure provides a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 124. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA exhibits an increased quality and / or quantity as compared to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 101, or SEQ ID NO: 133 or SEQ ID NO: 151. In some embodiments, the quality is determined by a proxy measurement, a half-life measurement, an amino acid charging efficiency measurement, or a measurement of binding to a docking partner elongation factor EF-Tu / EF1A1 or ribosomal machinery. In some embodiments, the quantity is determined by tRNA sequencing, quantitative PCR or fluorescence in situ hybridization. In some embodiments, the engineered tRNA is a suppressor tRNA with the increased quality and / or quantity as compared to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 100, 101, or 151, wherein the increased quality and / or quantity is determined by PTC readthrough efficiency. In some embodiments, the PTC readthrough capability is determined by a NanoLuc luciferase assay, RT-qPCR, Western Blot, Immunoprecipitation, Mass Spectrometry, and / or Immunofluorescence.

[0020] Also provided is nucleic acid encoding the engineered tRNA of any one of the preceding embodiments. Also provided is a vector including the nucleic acid of the preceding embodiments. In some embodiments, the vector is a viral vector or a plasmid. In some embodiments, the vector is a viral vector, and the viral vector is an adenoviral vector, an adeno-associated viral (AAV) vector, or a lentiviral vector. In some embodiments, the vector is an AAV 2 / 2 vector, an AAV 2 / 5 vector, an AAV 2 / 6 vector, an AAV 2 / 7 vector, an AAV2 / 8 vector, an AAV 2 / 9 vector, or a recombinant AAV vector.

[0021] Also provided is a pharmaceutical composition including the engineered tRNA of any one of the preceding embodiments, the nucleic acid of the preceding embodiments, or the vector of any one of the preceding embodiments, further including a pharmaceutically acceptable carrier. In some embodiments, the pharmaceutically acceptable carrier is a liposome or a lipid nanoparticle.

[0022] Also provided herein is a method of restoring translation of a coding nucleic acid of interest containing a premature TGA / UGA stop codon in a cell, including introducing to the cell the engineered tRNA of any one of the preceding embodiments, the nucleic acid of the preceding embodiments, or the vector of any one of the preceding embodiments, wherein the engineered tRNA introduced into the cell or produced from the nucleic acid or vector recognizes and reads through the premature TGA / UGA stop codon, thereby stabilizing the PTC containing mRNA and restoring translation of the coding nucleic acid of interest containing the premature TGA / UGA stop codon. In some embodiments, the engineered tRNA restores at least 5%of the translation of the coding nucleic acid of interest containing a premature TGA / UGA stop codon relative to a corresponding coding nucleic acid not containing the premature TGA / UGA stop codon. In some embodiments, the engineered tRNA restores at least 50%of the coding mRNA of interest containing a premature TGA / UGA stop codon relative to a corresponding coding mRNA not containing the premature TGA / UGA stop codon.

[0023] Also provided is a method of treating a disease associated with a premature TGA / UGA stop codon in an individual, including: administering to the individual an effective amount of the pharmaceutical composition of previous embodiments. In some embodiments, the premature stop-codon-associated disease is cystic fibrosis, muscular dystrophy, Alport syndrome, Stargardt disease, dilated cardiomyopathy, Rett syndrome, Mucopolysaccharidosis type II, Hurler syndrome, Hunter syndrome, β-thalassemia, Leber’s congenital amaurosis (LCA) , or Liddle’s syndrome. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the individual is human. In some embodiments, which may be combined with any preceding embodiment, the engineered tRNA exhibits increased PTC readthrough efficiency in vivo as compared to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, or SEQ ID NO: 151.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0024] The drawings illustrate certain features and advantages of this disclosure. These embodiments are not intended to limit the scope of the appended claims in any manner.

[0025] FIGS. 1A-1PP show schematics of the secondary structures of human native tRNA Arg-TCT-1-1 and engineered suppressor tRNAs provided herein and that were used in the experiments described in the Examples. The schematics depict the relative positions of the bases adenine (A) , guanine (G) , cytosine (C) , and uracil (U) , with dots representing pairing between bases, and numbers indicating Sprinzl position of the sequence. FIG. 1A shows human native tRNA Arg-TCT-1-1 (HGNC: 34695, corresponding to SEQ ID NO: 1) . FIG. 1B shows tRNA 147R3 (corresponding to SEQ ID NO: 100) , which was engineered from intron-spliced (i.e., with intron sequences removed) human tRNA Arg-TCT-1-1 (HGNC: 34695) . tRNA 147R3 has the same sequence as intron-spliced human tRNA Arg-TCT-1-1 (SEQ ID NO: 1) , except that 147R3 has a UCA anticodon instead of the UCU anticodon present in human tRNA Arg-TCT-1-1. FIG. 1C shows the layout of the schematics, as mapped onto tRNA 147R3, such that the T-arm is shown to the right, the D-arm is shown to the left, the anticodon arm is shown at the bottom (with the trinucleotide anticodon comprising the three bases at the bottom of each schematic and underlined) , and the acceptor arm is shown at the top. The discriminator is at the top of the acceptor arm, and the variable region is positioned between the T-arm and the anticodon arm. This layout is consistent for all schematics of FIGS. 1A-1PP. Throughout the following secondary structures, a box with an X on the original nucleotide marks a deletion, and a box without an X on a substituted nucleotide marks a substitution compared to the sequence of tRNA 147R3. FIG. 1D shows tRNA 147R3M17 (corresponding to SEQ ID NO: 17) . FIG. 1E shows tRNA 147R3M18 (corresponding to SEQ ID NO: 18) . FIG. 1F shows tRNA 147R3M19 (corresponding to SEQ ID NO: 19) . FIG. 1G shows tRNA 147R3M20 (corresponding to SEQ ID NO: 20) . FIG. 1H shows tRNA 147R3M21 (corresponding to SEQ ID NO: 21) . FIG. 1I shows tRNA 147R3M22 (corresponding to SEQ ID NO: 22) . FIG. 1J shows tRNA 147R3M23 (corresponding to SEQ ID NO: 23) . FIG. 1K shows tRNA 147R3M24 (corresponding to SEQ ID NO: 24) . FIG. 1L shows tRNA 147R3M25 (corresponding to SEQ ID NO: 25) . FIG. 1M shows tRNA 147R3M26 (corresponding to SEQ ID NO: 26) . FIG. 1N shows tRNA 147R3M27 (corresponding to SEQ ID NO: 27) . FIG. 1O shows tRNA 147R3M41 (corresponding to SEQ ID NO: 41) . FIG. 1P shows tRNA 147R3M42 (corresponding to SEQ ID NO: 42) . FIG. 1Q shows tRNA 147R3M43 (corresponding to SEQ ID NO: 43) . FIG. 1R shows tRNA 147R3M44 (corresponding to SEQ ID NO: 44) . FIG. 1S shows tRNA 147R3M45 (corresponding to SEQ ID NO: 45) . FIG. 1T shows tRNA 147R3M46 (corresponding to SEQ ID NO: 46) . FIG. 1U shows tRNA 147R3M47 (corresponding to SEQ ID NO: 47) . FIG. 1V shows tRNA 147R3M48 (corresponding to SEQ ID NO: 48) . FIG. 1W shows tRNA 147R3M49 (corresponding to SEQ ID NO: 49) . FIG. 1X shows tRNA 147R3M50 (corresponding to SEQ ID NO: 50) . FIG. 1Y shows tRNA 147R3M51 (corresponding to SEQ ID NO: 51) . FIG. 1Z shows tRNA 147R3M52 (corresponding to SEQ ID NO: 52) . FIG. 1AA shows tRNA 147R3M53 (corresponding to SEQ ID NO: 53) . FIG. 1BB shows tRNA 147R3M54 (corresponding to SEQ ID NO: 54) . FIG. 1CC shows tRNA 147R3M55 (corresponding to SEQ ID NO: 55) . FIG. 1DD shows tRNA 147R3M56 (corresponding to SEQ ID NO: 56) . FIG. 1EE shows tRNA 147R3M57 (corresponding to SEQ ID NO: 57) . FIG. 1FF shows tRNA 147R3M58 (corresponding to SEQ ID NO: 58) . FIG. 1GG shows tRNA 147R3M59 (corresponding to SEQ ID NO: 59) . FIG. 1HH shows tRNA 147R3M60 (corresponding to SEQ ID NO: 60) . FIG. 1II shows tRNA 147R3M61 (corresponding to SEQ ID NO: 61) . FIG. 1JJ shows tRNA 147R3M62 (corresponding to SEQ ID NO: 62) . FIG. 1KK shows tRNA 147R3M63 (corresponding to SEQ ID NO: 63) . FIG. 1LL shows tRNA 147R3M64 (corresponding to SEQ ID NO: 64) . FIG. 1MM shows tRNA 147R3M65 (corresponding to SEQ ID NO: 65) . FIG. 1NN shows tRNA 147R3M66 (corresponding to SEQ ID NO: 66) . FIG. 1OO shows tRNA 147R3M67 (corresponding to SEQ ID NO: 67) . FIG. 1PP shows tRNA 147R3M501 (corresponding to SEQ ID NO: 165) .

[0026] FIG. 2A presents a schematic of the NanoLuc luciferase construct used to evaluate the efficiency of engineered suppressor tRNAs in suppressing a premature termination codon (PTC) and the charging amino acid on these tRNAs. The NanoLuc luciferase assay was conducted on cell line stably expressing the construct (Luc_V2_R3) , focusing on the restoration of full-length luciferase production and activity by the engineered suppressor tRNA. The rectangle labeled “NanoLuc” represents a modified Luciferase protein coding gene (Promega, Madison, Wisconsin, USA) containing a TGA stop codon (labeled “PTC (TGA) ” ) after base pair position 195. The rectangles with hatched shading on the ends of the luciferase protein illustrate a GS (Glycine and Serine) linker, while rectangles with circles or plus signs represent 3x Myc or 3x FLAG tags on the N-and C-termini, respectively, for protein pull-down assays and mass spectrometric analyses. The vertical line within the luciferase denotes the position where translation would stop due to a PTC in the mRNA (not shown) if the suppressor tRNA fails to suppress the PTC effectively. FIGS. 2B-2F provide exemplary DNA construct schematics (FIGS. 2B and 2E) and NanoLuc luciferase assay results (FIGS. 2C-2D, and 2F) for engineered suppressor tRNAs using different expression cassettes. FIG. 2B depicts a construct schematic labeled “U6 cassette” , where the engineered tRNA is expressed using a U6 promoter and terminated by a poly-T signal. FIG. 2E shows a construct schematic labeled “SF1C cassette” , where the engineered tRNA is flanked downstream by a 100-basepair (100 bp) sequence and upstream by a 300-basepair (300 bp) sequence, derived from the naturally occurring sequences surrounding the tRNA Arg-TCT-1-1 gene (HGNC: 34695) . FIG. 2C shows NanoLuc luciferase assay results for a selection of engineered suppressor tRNAs (147R3M17-147R3M27) expressed using the U6 cassette schematic shown in FIG. 2B. FIG. 2D continues these results for another selection of engineered suppressor tRNAs (147R3M41-147R3M59) expressed using the U6 cassette schematic shown in FIG. 2B. FIG. 2F presents NanoLuc luciferase assay results for a selection of engineered suppressor tRNAs (147R3, 147R3M19, 147R3M20, 147R3M53, 147R3M54, 147R3M60-147R3M67) expressed using the SF1C cassette schematic shown in FIG. 2E. For the luciferase assay results, the vertical axis indicates the fold change in relative luminescence units in NanoLuc cell lines expressing the engineered suppressor tRNAs (shown on the horizontal axes) compared to a cell line expressing tRNA 147R3 using the U6 cassette. Error bars represent the standard deviation of biological triplicates. The horizontal dotted line indicates a fold change of 1, while the horizontal solid line on each bar shows the applied expression cassette. 147R3 expressed by a U6 cassette serves as a positive control. “Scr” represents a negative control with a scrambled sequence derived from 147R3, expressed by a U6 cassette.

[0027] FIG. 3A shows Western blot results for the full-length modified NanoLuc protein rescued by various engineered suppressor tRNAs. “WCE” represents the whole cell extract, used as a loading control to confirm the presence and enrichment of the targeted protein. “FT” refers to the flow-through sample during immunoprecipitation, used to determine the success of the immunoprecipitation, and “IP” denotes the immunoprecipitated sample. The engineered suppressor tRNAs 8R3 ( “IP_8R3” , distinct from the 147R3 series) and 147R3 (“IP_147R3” ) were expressed in the LUC_V2_R3 cell line using the U6 cassette shown in FIG. 2B. The engineered suppressor tRNAs 147R3M19, 147R3M20, 147R3M54, and 147R3M53 were expressed in the LUC_V2_R3 cell line using the SF1C cassette shown in FIG. 2E. The band indicated by the arrow represents the modified full-length NanoLuc protein. Scr ( “IP_Scr” ) serves as a negative control and is expressed using the U6 cassette shown in FIG. 2B.

[0028] FIGS. 3B-3I present next-generation tRNA sequencing results for engineered suppressor tRNA expression (FIGS. 3B-3D) and endogenous tRNAome homeostasis (FIGS. 3E-3I) . FIGS. 3B-3D display line plots of the detected total reads of selected engineered suppressor tRNAs, with the Sprinzl position from the 5’ to 3’ end of the selected tRNA (s) plotted along the horizontal axes, and normalized total read counts plotted along the vertical axes. The title of each plot indicates the specific reads targeted, and the series of plotted tRNAs represent the transfected cell line where these targeted reads were sought. The Luc_V2_R3 cell line transfected with various engineered suppressor tRNAs-147R3U6, 147R3M20SF1C, 147R3M54SF1C, and 147R3M53SF1C-is represented by the grey dotted line, black dashed line, black solid line, and black dotted line, respectively. Control samples transfected with Scr and H2O are represented by the grey dashed line and grey solid line, respectively. The reference sequence to which the reads are aligned in each sample is indicated at the top of each line plot, including 147R3 (FIG. 3B, left panel) , 147R3M20 (FIG. 3B, right panel) , 147R3M53 (FIG. 3C, left panel) , 147R3M54 (FIG. 3C, right panel) , and the naturally occurring tRNA Arg-TCT-1-1 (FIG. 3D) . FIGS. 3E-3I compare the expression levels of endogenous tRNAs between the Luc_V2_R3 cell lines transfected with Scr (plotted along all y-axes) and various engineered suppressor tRNAs (plotted along all x-axes) , including 147R3U6 (FIG. 3E) , 147R3M20SF1C (FIG. 3F) , 147R3M53SF1C (FIG. 3G) , 147R3M54SF1C (FIG. 3H) , and H2O (FIG. 3I) . Total normalized read counts are indicated on each axis in log10 format. The Pearson correlation coefficient for each comparison is included in the top left of each panel. Each of FIGS. 3E-3I is divided into three panels: the left panel shows the analysis of all cytoplasmic tRNAs, the middle panel shows the analysis of all cytoplasmic tRNAs at the isodecoder level, and the right panel shows the analysis of all cytoplasmic tRNAs at the isoacceptor level.

[0029] FIGS. 4A-4B illustrate the outcomes of PTC readthrough assessments on X-linked Alport syndrome-associated PTC mutants within the gene COL4A5 (Collagen alpha-5 (IV) ) treated with lentivirus (referred to as “LV” in the bar plot) containing various engineered suppressor tRNAs. The PTC mutations were introduced into the A549 cell line, resulting in a conversion from an arginine codon to a stop codon at positions 373 ( “R373*” ) (FIG. 4A, left panel) and 1563 ( “R1563*” ) (FIG. 4A, right panel) within the COL4A5 protein sequence (NCBI Reference Sequence: NP_000486.1) . In FIG. 4A, RT-qPCR results are depicted, revealing the relative level of COL4A5 mRNA in samples treated with various engineered suppressor tRNAs (147R3, 147R3M20, 147R3M53, 147R3M54) using the SF1C cassette schematic shown in FIG. 2E, as indicated on the x-axes. The mRNA levels of COL4A5 in each sample were normalized to the mRNA level of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and plotted as fold changes relative to the WT sample (A549 cell) on the y-axes. “Blank” indicates a negative control where the PTC cells are untreated with the lentivirus. Error bars represent the standard deviation of biological triplicates. FIG. 4B presents the integrated density of the COL4A5 signal normalized to cell counts in immunofluorescence analysis, illustrating the restoration of full-length COL4A5 protein in the COL4A5 R373*PTC cell line treated with lentivirus containing different engineered suppressor tRNAs, as indicated on the x-axes. “Blank” refers to a negative control where PTC cells are untreated with the lentivirus. The inclusion of cells treated solely with the secondary antibody serves to confirm that the observed signal is not attributed to the unspecific binding of the secondary antibody to COL4A5 protein.

[0030] FIG. 5 illustrates the results of PTC readthrough assessments on Stargardt disease-associated PTC mutants within the gene ABCA4 (Retinal-specific phospholipid-transporting ATPase) , treated with lentivirus (referred to as “LV” in the bar plot) containing engineered suppressor tRNA. The PTC mutations were induced in the ARPE-19 cell line, resulting in a conversion from an arginine codon to a stop codon at position 681 ( “R681*” ) within the ABCA4 protein sequence (NCBI Reference Sequence: NP_000341.2) . In FIG. 5, RT-qPCR results are depicted, demonstrating the relative level of ABCA4 mRNA in samples treated with engineered suppressor tRNA 147R3M20 using the SF1C cassette schematic shown in FIG. 2E, as indicated on the x-axes. The mRNA levels of ABCA4 in each sample were normalized to the mRNA level of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and plotted as fold changes relative to the WT sample (ARPE-19 cell) on the y-axes. “Blank” indicates a negative control where PTC cells are untreated with the lentivirus. LV-Scr-U6 represents another negative control with PTC cells treated with lentivirus containing the scramble sequence using the U6 cassette schematic shown in FIG. 2B. Error bars represent the standard deviation of biological triplicates.

[0031] FIGS. 6A-6I illustrate the construct schematic of recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV) and the results of NanoLuc luciferase assays in the Luc-V2-R3 cell line transduced with rAAV carrying engineered suppressor tRNA. FIG. 6A presents the schematic of an ssAAV-2xSF1C vector, which contains, from left to right (5’ to 3’ direction) : an AAV2 inverted terminal repeat (ITR) , two identical copies of a SF1C cassette (including a 300 bp upstream flanking sequence, an engineered tRNA, and a 100 bp downstream flanking sequence, as shown in FIG. 2E) , the human cytomegalovirus (CMV) enhancer, the chicken β-actin promoter, the reporter gene mCherry, a poly A signal, and another AAV2 ITR. FIGS. 6B-6C show NanoLuc luciferase assay results (left panel) and transduction efficiency (right panel, via measurement of proportion of cells showing mCherry expression) for cells transduced with rAAV containing engineered suppressor tRNA genes in the ssAAV-2xSF1C vector, as shown in FIG. 6A. Various gradient MOIs (multiplicity of infection) of the rAAVs were transduced into the Luc-V2-R3 cell line, as indicated on the x-axes, increasing from right to left. The relative luminescence units are shown on the y-axes of the bar plot in the left panel, and the percentage of mCherry positive cells is shown on the y-axes of the bar plot in the right panel. The strand type and serotype of the AAV are indicated at the bottom of the bar plot, including ssAAV2 / 2 (FIG. 6B) and ssAAV2 / 9 (FIG. 6C) . The engineered suppressor tRNA 147R3M20 is used in the assay shown in FIGS. 6B-6C. The cassette for engineered suppressor tRNA expression in the rAAV vector is also indicated. Error bars represent the standard deviation of biological triplicates. In FIG. 6B, a negative control was conducted without the engineered suppressor tRNA and the expression cassette in the rAAV vector, while a blank control involved treating the cells with water ('H2O') . Along the x-axis of FIG. 6B, 'ssAAV2 / 2 147R3M20 SF1C' represents samples transduced with the construct from FIG. 6A, expressing the suppressor tRNA 147R3M20. 'ssAAV2 / 2 mCherry' represents samples transduced with a construct lacking the two identical copies of the SF1C cassette.

[0032] FIG. 6D presents the schematic of an ssAAV-2xU6 vector, which contains, from left to right (5’ to 3’ direction) : an Adeno-associated virus inverted terminal repeat (AAV2 ITR) , two identical copies of a U6 cassette (including the U6 promoter, an engineered tRNA, and a poly-T termination signal, as shown in FIG. 2B) , the human cytomegalovirus (CMV) enhancer, the chicken β-actin promoter, the reporter gene mCherry, a poly A signal, and another AAV2 ITR. FIGS. 6E-6G show NanoLuc luciferase assay results (left panel) and transduction efficiency (right panel, via measurement of proportion of cells showing mCherry expression) for cells transduced with rAAV containing engineered suppressor tRNA genes in the ssAAV-2xU6 vector, as shown in FIG. 6D. Various gradient MOIs (multiplicity of infection) of the rAAVs were transduced into the Luc-V2-R3 cell line, as indicated on the x-axes, increasing from right to left. The relative luminescence units are shown on the y-axes of the bar plot in the left panel, and the percentage of mCherry positive cells is shown on the y-axes of the bar plot in the right panel. The strand type and serotype of the AAV are indicated at the bottom of the bar plot. The specific engineered suppressor tRNA genes used in the assay are indicated at the bottom of the bar plot, including 147R3 (FIG. 6E) , 147R3M53 (FIG. 6F) , and 147R3M54 (FIG. 6G) . The cassette for engineered suppressor tRNA expression in the rAAV vector is also indicated. Error bars represent the standard deviation of biological triplicates.

[0033] FIG. 6H presents the schematic of an scAAV-1xSF1C (self-complementary AAV) vector, which contains, from left to right (5’ to 3’ direction) : an AAV2 ΔITR (deletion of a partial sequence in the ITR) , one copy of an SF1C cassette (including a 300 bp upstream flanking sequence, an engineered tRNA, and a 100 bp downstream flanking sequence, as shown in FIG. 2E) , the human cytomegalovirus (CMV) enhancer, the chicken β-actin promoter, the reporter gene mCherry, a poly (A) signal, and a normal AAV2 ITR. FIG. 6I shows NanoLuc luciferase assay results (left panel) and transduction efficiency (right panel, via measurement of proportion of cells showing mCherry expression) for cells transduced with rAAV containing an engineered suppressor tRNA gene in the scAAV-1xSF1C vector, as shown in FIG. 6H. Various gradient MOIs (multiplicity of infection) of the rAAVs were transduced into the Luc-V2-R3 cell line, as indicated on the x-axes. The relative luminescence units are shown on the y-axes of the bar plot in the left panel, and the percentage of mCherry-positive cells is shown on the y-axes of the bar plot in the right panel. The strand type and serotype of the AAV are indicated at the bottom of the bar plot. The specific engineered suppressor tRNA 147R3M53 is used in the assay shown in FIG. 6I. The cassette for engineered suppressor tRNA expression in the rAAV vector is also indicated at the bottom of the bar plot. Error bars represent the standard deviation of biological triplicates.

[0034] FIGS. 7A-7B depict the relative levels of urinary proteins in male mice with X-linked Alport syndrome, injected with ssAAV2 / 9 containing the construct detailed in FIG. 6A. These mice possess an X-linked COL4A5 premature termination codon (PTC) mutation at position 471 (arginine to PTC) ( “R471*” ) within the COL4A5 protein sequence (NCBI Reference Sequence: NP_000486.1) . The ratio of urine albumin (U-ALB) to urine creatinine (U-CRE) , an indicator of disease progression, is plotted on the y-axis, while the age of the mice in weeks is plotted on the x-axis. In FIG. 7A, the mice are categorized by the genotype of the injected rAAV: mice injected with saline ( “Normal Saline” , n=9) are shown by a black solid line, those injected with rAAV (carrying engineered suppressor tRNA 147R3 in the U6 cassette) at a dose of 5E11 v.g. per mouse ( “ssAAV2 / 9-147R3U6 5E11 v.g. ” , n=9) by a black dashed line, mice injected with rAAV (carrying engineered suppressor tRNA 147R3 in the U6 cassette) at a dose of 1.5E12 v.g. per mouse ( “ssAAV2 / 9-147R3U6 1.5E12 v.g. ” , n=9) by a black dotted line, and control Col4a5 wild-type mice ( “Col4a5 WT / Y mouse” , n=3) by a grey solid line. The intravenous injection occurs at 4 weeks of age, as indicated by the arrow below the line plot. Error bars represent the standard deviation of replicates. In FIG. 7B, the mice are grouped by the genotype of the injected rAAV: mice injected with saline ( “Normal Saline” , n=6) are shown with a grey solid line, those injected with rAAV (carrying engineered suppressor tRNA 147R3M54 in the U6 cassette) at a dose of 1.5E11 v.g. per mouse ( “ssAAV2 / 9-147R3M54U6 1.5E11 v.g. ” , n=6) by a black solid line, mice injected with rAAV (carrying engineered suppressor tRNA 147R3M54 in the U6 cassette) at a dose of 5E11 v.g. per mouse ( “ssAAV2 / 9-147R3M54U6 5E11 v.g. ” , n=6) by a black dashed line, and mice injected with rAAV (carrying engineered suppressor tRNA 147R3M54 in the U6 cassette) at a dose of 1.5E12 v.g. per mouse (“ssAAV2 / 9-147R3M54U6 1.5E12 v.g. ” , n=6) by a black dotted line. The intravenous injection is performed at 4 weeks of age, as indicated by the arrow below the line plot. Error bars represent the standard deviation of replicates

[0035] FIGS. 8A-8LL show schematics of the secondary structures of engineered suppressor tRNAs provided herein and that were used in the experiments described in the Examples. The schematics depict the relative positions of the bases adenine (A) , guanine (G) , cytosine (C) , and uracil (U) , with dots representing pairing between bases, and numbers indicating Sprinzl position of the sequence. FIG. 8A shows tRNA 147R3M71 (corresponding to SEQ ID NO: 71) . FIG. 8B shows tRNA 147R3M72 (corresponding to SEQ ID NO: 72) . FIG. 8C shows tRNA 147R3M73 (corresponding to SEQ ID NO: 73) . FIG. 8D shows tRNA 147R3M74 (corresponding to SEQ ID NO: 74) . FIG. 8E shows tRNA 147R3M75 (corresponding to SEQ ID NO: 75) . FIG. 8F shows tRNA 147R3M76 (corresponding to SEQ ID NO: 76) . FIG. 8G shows tRNA 147R3M77 (corresponding to SEQ ID NO: 77) . FIG. 8H shows tRNA 147R3M78 (corresponding to SEQ ID NO: 78) . FIG. 8I shows tRNA 147R3M79 (corresponding to SEQ ID NO: 79) . FIG. 8J shows tRNA 147R3M80 (corresponding to SEQ ID NO: 80) . FIG. 8K shows tRNA 147R3M81 (corresponding to SEQ ID NO: 81) . FIG. 8L shows tRNA 147R3M82 (corresponding to SEQ ID NO: 82) . FIG. 8M shows tRNA 147R3M83 (corresponding to SEQ ID NO: 83) . FIG. 8N shows tRNA 147R3M84 (corresponding to SEQ ID NO: 84) . FIG. 8O shows tRNA 147R3M85 (corresponding to SEQ ID NO: 85) . FIG. 8P shows tRNA 147R3M86 (corresponding to SEQ ID NO: 86) . FIG. 8Q shows tRNA 147R3M87 (corresponding to SEQ ID NO: 87) . FIG. 8R shows tRNA 147R3M88 (corresponding to SEQ ID NO: 88) . FIG. 8S shows tRNA 147R3M89 (corresponding to SEQ ID NO: 89) . FIG. 8T shows tRNA 147R3M90 (corresponding to SEQ ID NO: 90) . FIG. 8U shows tRNA 147R3M91 (corresponding to SEQ ID NO: 91) . FIG. 8V shows tRNA 147R3M92 (corresponding to SEQ ID NO: 92) . FIG. 8W shows tRNA 147R3M93 (corresponding to SEQ ID NO: 93) . FIG. 8X shows tRNA 147R3M94 (corresponding to SEQ ID NO: 94) . FIG. 8Y shows tRNA 147R3M95 (corresponding to SEQ ID NO: 95) . FIG. 8Z shows tRNA 147R3M96 (corresponding to SEQ ID NO: 96) . FIG. 8AA shows tRNA 147R3M97 (corresponding to SEQ ID NO: 97) . FIG. 8BB shows tRNA 147R3M98 (corresponding to SEQ ID NO: 98) . FIG. 8CC shows tRNA 147R3M99 (corresponding to SEQ ID NO: 99) . FIG. 8DD shows tRNA 147R3M100 (corresponding to SEQ ID NO: 28) . FIG. 8EE shows tRNA 147R3M101 (corresponding to SEQ ID NO: 29) . FIG. 8FF shows tRNA 147R3M102 (corresponding to SEQ ID NO: 30) . FIG. 8GG shows tRNA 147R3M103 (corresponding to SEQ ID NO: 31) . FIG. 8HH shows tRNA 147R3M104 (corresponding to SEQ ID NO: 32) . FIG. 8II shows tRNA 147R3M105 (corresponding to SEQ ID NO: 33) . FIG. 8JJ shows tRNA 147R3M106 (corresponding to SEQ ID NO: 34) . FIG. 8KK shows tRNA 147R3M107 (corresponding to SEQ ID NO: 35) . FIG. 8LL shows tRNA 147R3M108 (corresponding to SEQ ID NO: 36) . Throughout the following secondary structures, a box with an X on a nucleotide marks a deletion at that position compared to the sequence of tRNA 147R3 (corresponding to SEQ ID NO: 100) , and a box without an X on a nucleotide marks a substitution compared to the sequence of tRNA 147R3 (corresponding to SEQ ID NO: 100) .

[0036] FIG. 9 shows NanoLuc luciferase assay results for engineered suppressor tRNAs (147R3M71–147R3M108 and 147R3M501) expressed using the SF1C cassette, as shown in FIG. 2E. The vertical axis represents the fold change in relative luminescence units in NanoLuc cell lines each expressing one of the engineered suppressor tRNAs (shown on the horizontal axis) compared to a control cell line expressing tRNA 147R3 via the SF1C cassette. Error bars indicate the standard deviation of biological triplicates. The horizontal dotted line represents a fold change of 1, while the solid horizontal line on each bar indicates the applied expression cassette. 147R3, expressed via the SF1C cassette, serves as a positive control (labeled “147R3” along the horizontal axis) , while “Scr” represents a negative control. In “Scr” , a scrambled sequence derived from 147R3 was expressed via a U6 cassette.

[0037] FIG. 10A presents NanoLuc luciferase assay results for engineered suppressor tRNAs (1R3, 2R3, 3R3, 4R3, 5R3, 6R3, 7R3, 8R3, 9R3, 10R3, 11R3, 12R3, 13R3, 14R3, 15R3, 147R3, 148R3, 149R3, 150R3, and 151R3) expressed using the U6 cassette, as shown in FIG. 2B. The x-axis denotes the engineered tRNAs tested, while the y-axis represents luciferase activity measured in relative luminescence units. The solid horizontal line on each bar indicates the applied expression cassette. Error bars represent the standard deviation of biological triplicates.

[0038] FIG. 10B presents Western blot analyses of rescued full-length p53 expression (as the row titled “IB: p53” ) , with GAPDH serving as a loading control (as the row titled “IB: GAPDH” ) , in DMS1114 cells transfected with 7R3, 8R3, 13R3, 147R3, 148R3, 149R3, Scr, or treated with water ( “blank” ) , compared to the positive control cell line A549 (displayed in the column titled “blank” with A549 indicated above the column) . A solid horizontal line above the blots denotes the corresponding cell lines.

[0039] FIGS. 11A-11T illustrate schematics of the secondary structures of human native tRNA Arg-CCT-4-1 and its engineered suppressor tRNA derivatives. These schematics display the relative positions of the nucleotide bases adenine (A) , guanine (G) , cytosine (C) , and uracil (U) , with dots representing base pairings and numbers indicating Sprinzl positions within the sequence. FIG. 11A depicts the structure of human native tRNA Arg-CCT-4-1 (HGNC: 34975, corresponding to SEQ ID NO: 2) . FIG. 11B shows tRNA 8R3 (corresponding to SEQ ID NO: 101) , an engineered variant derived from tRNA Arg-CCT-4-1. This modified tRNA retains the same sequence as the native form, except for the replacement of its CCU anticodon with UCA. FIG. 11C shows tRNA 8R3M1 (corresponding to SEQ ID NO: 111) . FIG. 11D shows tRNA 8R3M2 (corresponding to SEQ ID NO: 112) . FIG. 11E shows tRNA 8R3M3 (corresponding to SEQ ID NO: 113) . FIG. 11F shows tRNA 8R3M4 (corresponding to SEQ ID NO: 114) . FIG. 11G shows tRNA 8R3M5 (corresponding to SEQ ID NO: 115) . FIG. 11H shows tRNA 8R3M6 (corresponding to SEQ ID NO: 116) . FIG. 11I shows tRNA 8R3M7 (corresponding to SEQ ID NO: 117) . FIG. 11J shows tRNA 8R3M8 (corresponding to SEQ ID NO: 118) . FIG. 11K shows tRNA 8R3M9 (corresponding to SEQ ID NO: 119) . FIG. 11L shows tRNA 8R3M10 (corresponding to SEQ ID NO: 120) . FIG. 11M shows tRNA 8R3M11 (corresponding to SEQ ID NO: 121) . FIG. 11N shows tRNA 8R3M12 (corresponding to SEQ ID NO: 122) . FIG. 11O shows tRNA 8R3M13 (corresponding to SEQ ID NO: 123) . FIG. 11P shows tRNA 8R3M14 (corresponding to SEQ ID NO: 124) . FIG. 11Q shows tRNA 8R3M15 (corresponding to SEQ ID NO: 125) . FIG. 11R shows tRNA 8R3M16 (corresponding to SEQ ID NO: 126) . FIG. 11S shows tRNA 8R3M17 (corresponding to SEQ ID NO: 127) . FIG. 11T shows tRNA 8R3M18 (corresponding to SEQ ID NO: 128) . Throughout the following secondary structures, a box around a nucleotide indicates a substitution relative to the tRNA 8R3 sequence.

[0040] FIGS. 11U-11V illustrate schematics of the secondary structures of human native tRNA Arg-CCT-1-1 and its engineered suppressor tRNA derivative 5R3. These schematics display the relative positions of the nucleotide bases adenine (A) , guanine (G) , cytosine (C) , and uracil (U) , with dots representing base pairings and numbers indicating Sprinzl positions within the sequence. FIG. 11U depicts the structure of human native tRNA Arg-CCT-1-1 (HGNC: 34638, corresponding to SEQ ID NO: 133) . FIG. 11V shows tRNA 5R3 (corresponding to SEQ ID NO: 151) , an engineered variant derived from tRNA Arg-CCT-1-1. This modified tRNA retains the same sequence as the native form, except for the replacement of its CCU anticodon with UCA.

[0041] FIG. 12 shows NanoLuc luciferase assay results for engineered suppressor tRNAs (8R3M1–8R3M18) expressed using the SF1C cassette, as shown in FIG. 2E. The vertical axis represents the fold change in relative luminescence units in NanoLuc cell lines expressing the engineered suppressor tRNAs (shown on the horizontal axis) compared to a control cell line expressing tRNA 8R3 using the SF1C cassette. Error bars indicate the standard deviation of biological triplicates. The horizontal dotted line represents a fold change of 1, while the solid horizontal line on each bar indicates the applied expression cassette. 8R3 ( “8R3” on the horizontal axis) , expressed via the SF1C cassette, serves as a positive control, while “Scr” represents a negative control with a scrambled sequence expressed using a U6 cassette.

[0042] FIGS. 13A-13B present next-generation tRNA sequencing results, highlighting the expression levels of engineered suppressor tRNA 8R3, its corresponding endogenous tRNA, and the homeostasis of the endogenous tRNAome. FIG. 13A features line plots showing the normalized total reads detected for engineered suppressor tRNA 8R3 (right panel) and its corresponding endogenous tRNA Arg-CCT-4-1 (left panel) across different samples. The horizontal axes represent the Sprinzl positions from the 5’ to 3’ ends of the reference tRNAs, while the vertical axes display the normalized total read counts. Each line type corresponds to a sample: the Luc_V2_R3 cell line transfected with plasmids expressing engineered tRNAs (8R3U6 -black dashed line; 147R3U6 -grey dotted line) , with Scr-U6 (grey dashed line) as a negative control, and cells treated with H2O (grey solid line) as a blank control. The reference sequence for aligning the reads is indicated at the top of each plot, including 8R3 (right panel of FIG. 13A) , and the human native tRNAs Arg-CCT-4-1 (left panel of FIG. 13A) . FIG. 13B compares endogenous tRNA expression levels between Luc_V2_R3 cell lines transfected with Scr-U6 (plotted on all x-axes) and engineered suppressor tRNA 8R3U6 (plotted on all y-axes) . Total normalized read counts are shown on each axis in log10 format. The Pearson correlation coefficient for each comparison is displayed in the top left of each panel. This figure is divided into three panels: the left panel shows the analysis of all cytoplasmic mature tRNAs at the single tRNA level, the middle panel presents isodecoder-level analysis, and the right panel focuses on isoacceptor-level analysis.

[0043] FIGS. 14A-14C present Western blot analyses of rescued full-length ABCA4 expression (upper blot labeled “IB: ABCA4” ) and Actin expression as a loading control (lower blot labeled “IB: Actin” ) in HEK293T cells co-transfected with two plasmids: one encoding either the wild-type (WT) ABCA4 gene or the PTC-containing ABCA4 gene, and the other encoding engineered suppressor tRNAs. PTC mutations were introduced into the ABCA4 gene, converting an arginine codon into a stop codon (TGA / UGA) at positions 681 and 2030 in the ABCA4 protein sequence, resulting in PTC-containing ABCA4 genes R681*and R2030*, respectively. FIG. 14A specifically shows Western blot analyses of HEK293T cells co-transfected with a first plasmid encoding either WT ABCA4 or PTC-containing ABCA4 (R681*in the upper panel, R2030*in the lower panel) , as indicated above the solid line, and a second plasmid encoding engineered suppressor tRNAs (147R3M20, 147R3M53, 147R3M54, and 147R3M64, expressed via the SF1C cassette, as well as 147R3 via the U6 cassette) , as indicated above the blots. The molecular masses are noted to the right of each blot. Controls included a blank control (cells without plasmid transfection) , a positive control (cells transfected only with the WT ABCA4 expression plasmid) , and negative controls (cells transfected with the PTC-containing ABCA4 plasmid alone or co-transfected with a plasmid carrying Scr-U6) . FIGS. 14B-14C present Western blot analyses of HEK293T cells co-transfected with two plasmids. The molecular masses are noted to the right of each blot. The first plasmid encoded either WT ABCA4 or PTC-containing ABCA4 (R681*results shown in the upper panel of FIG. 14B and the left panel of FIG. 14C, and R2030*results shown in the lower panel of FIG. 14B and the right panel of FIG. 14C) , as indicated at the top of each panel. The second plasmid encoded engineered suppressor tRNAs (147R3, expressed via the U6 cassette, as well as 147R3M20, 147R3M53, and 147R3M54 via the SF1C cassette) , as indicated above the blots. Controls included a positive control (cells transfected only with the wild type ABCA4 expression plasmid, labeled above the column displaying its result with “ABCA4 WT” ) and negative controls (cells transfected with the PTC-containing ABCA4 plasmid alone or co-transfected with a plasmid carrying Scr-U6, labeled above the column displaying their results with “blank” or “Scr-U6” ) . FIG. 14B shows results of supplying the suppressor tRNA-containing plasmid ( “plasmid 2: sup-tRNA” ) across a range of plasmid amounts (ng) from 10-1000 ng, with the plasmid amount indicated above each respective column. The suppressor tRNA used was tRNA 147R3. FIG. 14C shows results of supplying the suppressor tRNA-containing plasmid ( “plasmid 2: sup-tRNA” ) across a range of plasmid amounts (ng) from 1-100 ng, with the plasmid amount indicated above each respective column. The suppressor tRNAs used were tRNAs 147R3M20, 147R3M53, and 147R3M54.

[0044] FIG. 15 presents Western blot analyses of rescued full-length MeCP2 expression (upper blot, “IB: Myc” ) and Actin expression as a loading control (lower blot, “IB: Actin” ) in HEK293T cells co-transfected with two plasmids: one encoding either the wild-type (WT) MeCP2 gene or the PTC-containing MeCP2 gene (as indicated above the solid line) and the other encoding engineered suppressor tRNAs (as indicated above the blot with the labels “147R3SF1C” , “147R3M20SF1C” , “147R3M53SF1C” , and “147R3M64SF1C” ) . The MeCP2 expression construct includes a Myc tag fused to the C-terminus of the MeCP2 protein, enabling easy detection of full-length MeCP2 expression using an anti-Myc tag antibody. PTC mutations were introduced into the MeCP2 gene, replacing an arginine codon with a stop codon (TGA / UGA) at positions 168, 255, 270, and 294 in the MeCP2 protein sequence, resulting in PTC-containing MeCP2 genes R168* (shown in upper left panel) , R255* (shown in upper right panel) , R270* (shown in bottom left panel) , and R294* (shown in bottom right panel) , respectively. The second plasmid encoded engineered suppressor tRNAs (147R3, 147R3M20, 147R3M53, and 147R3M64) , all expressed using the SF1C cassette. Controls included a positive control (cells transfected only with the wild type MeCP2 expression plasmid, shown in the column labeled “blank” ) and negative controls (cells co-transfected with the PTC-containing MeCP2 plasmids and a plasmid carrying Scr-U6) .

[0045] FIG. 16A presents Western blot analyses of IDS expression (upper blot, left panel, labeled “IB: IDS” ) and GAPDH expression as a loading control (lower blot, left panel, labeled “IB: GAPDH” ) in HEK293T cells transfected with plasmids encoding either the wild-type (WT) IDS gene or missense-and nonsense-mutated IDS genes, as indicated above the blot. Missense mutations were introduced into the IDS gene, replacing a lysine codon with an arginine codon (AGG) at position 174 and a glutamine codon with an arginine codon (CGG) at position 445, resulting in the missense variants K174R and Q445R, respectively. Additionally, nonsense mutations were introduced, converting lysine and glutamine codons into stop codons (TGA / UGA) at positions 174 and 445, generating the PTC-containing IDS variants K174*and Q445*. Cells without plasmid transfection served as the blank control. The right panel presents the relative IDS enzyme activity from cell extracts following transfection with WT, missense, or nonsense IDS gene expression cassettes. The x-axis denotes the plasmids used for transfection, while the y-axis represents IDS activity levels, normalized as a percentage relative to sample transfected with the WT IDS plasmid. Sample without plasmid transfection served as the blank control. Error bars indicate the standard deviation of biological replicates.

[0046] FIGS. 16B-16C present Western blot analyses of rescued full-length IDS expression and relative IDS enzyme activity in HEK293T cells co-transfected with two plasmids: one encoding the WT IDS or variant IDS genes and the other encoding engineered suppressor tRNAs. The left panel shows Western blot analyses of rescued full-length IDS expression (upper blot) and GAPDH expression as a loading control (lower blot) in co-transfected HEK293T cells. In FIG. 16B, the first plasmid encoded either WT IDS or the IDS variants K174*and K174R, and in FIG. 16C, it encoded either WT IDS or the IDS variants Q445*and Q445R, as indicated above the solid line. The second plasmid encoded engineered suppressor tRNAs (5R3, 8R3, 147R3, and 147R3M53) , all expressed via the U6 cassette, as indicated above the blots. Controls include a positive control (cells co-transfected with either WT IDS or the missense mutated IDS variant expression plasmid and a plasmid carrying Scr-U6) and negative controls (cells co-transfected with the PTC-containing IDS plasmids and a plasmid carrying Scr-U6) . The upper right panel in FIG. 16B presents the quantification of the intensity of the protein bands shown in the left panel of FIG. 16B. The annotation above the bar plots of the right panels indicates the first plasmids containing either the WT IDS or variant IDS genes. The x-axis denotes the second plasmids containing the engineered suppressor tRNAs used for transfection, while the y-axis represents full-length IDS protein levels, normalized to GAPDH levels and plotted as a fraction relative to the sample transfected with the WT IDS plasmid. The lower right panel presents the relative IDS enzyme activity from cell extracts following co-transfection. The annotation above the bar plot indicates the first plasmids containing either the WT IDS or variant IDS genes. The x-axis denotes the second plasmids containing the engineered suppressor tRNAs used for transfection, while the y-axis represents IDS activity levels, normalized as a percentage relative to the sample transfected with the WT IDS plasmid.

[0047] FIG. 16D presents Western blot analyses of HEK293T cells co-transfected with a first plasmid encoding either WT IDS or PTC-containing IDS (K174*in the upper panel, Q445*in the lower panel) , as indicated above the solid line, and a second plasmid encoding engineered suppressor tRNAs (147R3M19, 147R3M20, 147R3M53, 147R3M54, and 147R3M64, expressed using the U6 cassette) , as indicated above the blots. Controls included a positive control (cells co-transfected with the WT IDS expression plasmid and a plasmid carrying Scr-U6) and negative controls (cells transfected with the PTC-containing IDS plasmids alone or co-transfected with a plasmid carrying Scr-U6) .

[0048] FIG. 17 presents the results of NanoLuc luciferase assays (upper panel) and transduction efficiency (lower panel, measured by the percentage of cells expressing GFP) for the Luc-V2-R3 cell line, which was transduced with lentivirus (denoted as “LV” in the bar plot) carrying engineered tRNA genes, including 5R3 (left panel) , 8R3 (middle panel) , and 147R3 (right panel) . Two different multiplicities of infection (MOIs) of the lentivirus were applied, as indicated on the x-axis. The y-axis of the upper panel shows relative luminescence units, while the y-axis of the lower panel shows the percentage of GFP-positive (GFP+) cells. Error bars represent the standard deviation from biological triplicates. A blank control was also included, where no lentivirus was transduced.

[0049] FIGS. 18A-18C present next-generation tRNA sequencing results, highlighting the expression levels of engineered suppressor tRNAs delivered by lentivirus, their corresponding endogenous tRNA, and the homeostasis of the endogenous tRNAome. FIG. 18A features line plots showing the normalized total reads detected for engineered suppressor tRNAs 147R3M20 (upper left panel) , 147R3M53 (upper right panel) , their corresponding endogenous tRNA Arg-TCT-1-1 (lower right panel) , and the negative control scrambled sequence Scr (lower left panel) across different samples. The horizontal axes represent the Sprinzl positions from the 5’ to 3’ ends of the reference tRNAs, while the vertical axes display the normalized total read counts. Each line type corresponds to a sample: the A549 cell line was transduced with lentiviruses expressing engineered tRNAs (147R3M20SF1C –black solid line; 147R3M53SF1C –black dashed line) , or carrying Scr-U6 (grey dotted line) as a negative control. The reference sequence for aligning the reads is indicated at the top of each plot, including 147R3M20 (upper left panel) , 147R3M53 (upper right panel) , the human native tRNA Arg-TCT-1-1 (lower right panel) , and the scrambled sequence Scr (lower left panel) . The horizontal solid line in FIG. 18A (lower right panel) represents the lower limit of detection (LLOD) . FIGS. 18B-18C compare endogenous tRNA expression levels between A549 cell lines transduced with lentiviral vectors LV-Scr-U6 (plotted on all x-axes) and LV-147R3M20SF1C (plotted on all y-axes of FIG. 18B) or LV-147R3M53SF1C (plotted on all y-axes of FIG. 18C) . Total normalized read counts are shown on each axis in log10 format. The Pearson correlation coefficient for each comparison is displayed in the top left of each panel. This figure is divided into three panels: the left panel shows the analysis of all cytoplasmic mature tRNAs at the single tRNA level, the middle panel presents isodecoder-level analysis, and the right panel focuses on isoacceptor-level analysis.

[0050] FIG. 19 illustrates the results of PTC readthrough assessments in Stargardt disease-associated PTC mutant ABCA4 R2030*following transduction with lentivirus (LV) carrying suppressor tRNA. PTC mutations were introduced into the ARPE-19 cell line, replacing an arginine codon with a stop codon (TGA / UGA) at position 2030 ( “R2030*” ) in the ABCA4 protein sequence. RT-qPCR data show the relative ABCA4 mRNA levels in the ABCA4 PTC cell line treated with lentivirus carrying the engineered suppressor tRNA 147R3M53 embedded in the SF1C cassette, as indicated on the x-axis. ABCA4 mRNA levels in each sample were normalized to GAPDH mRNA and presented as fold changes relative to the positive control WT sample (ARPE-19 WT cells without lentivirus transduction) on the y-axis. “Blank” represents a control in which PTC cells were not transduced with lentivirus. The ABCA4 PTC cell line treated with lentivirus containing the Scr-U6 expression cassette (LV-Scr-U6) served as a negative control. Error bars represent the standard deviation from biological triplicates.

[0051] FIG. 20 shows the results of PTC readthrough assessments in a Rett syndrome-associated PTC mutant of the MeCP2 gene following treatment with lentivirus (LV, as indicated in the labels along the horizontal axes) carrying various suppressor tRNAs. A PTC mutation was introduced into the HCT-116 cell line, replacing an arginine codon with a stop codon (TGA / UGA) at position 294 ( “R294*” ) in the MeCP2 protein sequence. In the left panel, Western blot analyses display the restored full-length MeCP2 expression (upper blot, labeled “IB: MeCP2” ) and the loading control GAPDH expression (lower blot, labeled “IB: GAPDH” ) in the MeCP2 PTC cell line treated with lentivirus containing different engineered suppressor tRNAs (147R3, 147R3M19, 147R3M20, 147R3M23, 147R3M53, 147R3M54, 147R3M64, and 147R3M65) embedded in the SF1C cassette. WT cells (HCT-116 WT cells) not transduced with lentivirus served as a positive control (labeled “Blank” ) , while MeCP2 PTC cell lines transduced with lentivirus containing the Scr-U6 expression cassette (labeled “LV-Scr-U6” ) served as a negative control. The right panel of FIG. 20 shows the quantification of the protein band intensities from the left panel. The x-axis represents the lentiviruses containing the engineered suppressor tRNAs used for transduction, while the y-axis depicts full-length MeCP2 protein levels, normalized to GAPDH levels and presented as a fraction relative to the WT sample (HCT-116 WT cells) without lentivirus transduction.

[0052] FIGS. 21A-21D depict the construct schematic of recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV) and the results of NanoLuc luciferase assays in the Luc-V2-R3 cell line transduced with rAAV carrying engineered suppressor tRNAs. FIGS. 21A-21B show the NanoLuc luciferase assay results (left panel) and transduction efficiency (right panel, measured by the proportion of cells expressing mCherry) for cells transduced with rAAV containing an engineered suppressor tRNA gene in the scAAV-1xSF1C vector, as shown in FIG. 6H. Various gradient MOIs of rAAVs were transduced into the Luc-V2-R3 cell line, as indicated on the x-axes. The relative luminescence units are plotted on the y-axis of the left panel's bar graph, while the percentage of mCherry-positive cells is shown on the y-axis of the right panel's bar graph. The strand type and serotype of the AAV are noted at the bottom of each bar plot. The vector used for engineered suppressor tRNA expression is also indicated at the bottom of the bar plot. The assay shown in FIGS. 21A-21B uses the specific engineered suppressor tRNA 147R3M53. Cells treated with water served as a blank control (labeled “H2O” ) , and cells transduced with rAAV containing the scAAV-ctrl vector, which expresses a Scr sequence via the SF1C cassette, served as a negative control in the sample series labeled “scAAV8 ctrl” or “scAAV2.7m8 ctrl” . Error bars represent the standard deviation of biological triplicates.

[0053] FIG. 21C shows the schematic of an scAAV-1xU6 vector, which consists, from left to right (5’ to 3’ direction) , of: a mutated inverted terminal repeat (AAV2 ΔITR) , a U6 cassette (containing the U6 promoter, an engineered tRNA, and a poly-T termination signal) , the human cytomegalovirus (CMV) enhancer, the chicken β-actin promoter, the reporter gene mCherry, and a normal AAV2 ITR. FIG. 21D presents the results of NanoLuc luciferase assays for cells transduced with rAAV carrying engineered suppressor tRNA genes in the scAAV-1xU6 vector, as shown in FIG. 21C. Various gradient MOIs of the rAAVs were transduced into the Luc-V2-R3 cell line, as indicated on the horizontal axes, with concentrations increasing from right to left. The vertical axes of the bar plot show the relative luminescence units. The strand type and serotype of the AAV are noted at the bottom of the bar plot. The specific engineered suppressor tRNA genes used in the assay are also indicated at the bottom of the bar plot, including 5R3 (left panel) , 8R3 (middle panel) , and 147R3 (right panel) . Error bars represent the standard deviation of biological triplicates.

[0054] FIG. 22 presents RT-qPCR results (left panel, measured as relative mRNA level) and transduction efficiency (right panel, measured by the proportion of mCherry-expressing cells) for ARPE-19 cells carrying the ABCA4 PTC R2030*mutation (as indicated in the bar plot) , transduced with AAV containing the ssAAV-2xSF1C vector (FIG. 6A) . The different AAVs used to transduce the ABCA4 PTC cell lines are shown on the horizontal axes, including ssAAV2 / 2-mCherry and ssAAV2 / 2-147R3M20SF1C. The AAV ssAAV2 / 2-ctrl, which lacks the 147R3M20SF1C cassette, served as a negative control. In the left panel, ABCA4 mRNA levels for each sample were normalized to GAPDH mRNA and presented as a fraction relative to the WT sample (ARPE-19 WT cells) on the vertical axis. The right panel shows the percentage of mCherry-positive cells on the y-axis. Error bars represent the standard deviation of biological triplicates.

[0055] FIG. 23 presents next-generation tRNA sequencing results, highlighting the expression levels of the engineered suppressor tRNA and its corresponding endogenous tRNA in the hippocampus of WT mice administered rAAV. The line plots show the normalized total reads detected for the engineered suppressor tRNA 147R3M20 (left panel) and its corresponding endogenous tRNA Arg-TCT-1-1 (right panel) in two mice administered rAAV ssAAV2 / 9-147R3M20SF1C. One of the mice is denoted by the dotted line labeled “Mouse1” , and the other mouse is denoted by the dashed line labeled “Mouse2” . The horizontal axes represent the Sprinzl positions from the 5’ to 3’ ends of the reference tRNAs, while the vertical axes display the normalized total read counts. Each line type represents a sample from a different mouse. The reference sequence for aligning the reads is indicated at the top of each plot, including 147R3M20 (left panel) and the human native tRNA Arg-TCT-1-1 (right panel) .

[0056] FIGS. 24A-24C illustrate significant changes in IDS activity and GAG content in the serum, urine, and various tissues of male mice with X-linked Hunter syndrome following administration of scAAV2 / 9-147R3M53SF1C. These mice harbor an X-linked IDS PTC mutation at position 174 (lysine to stop codon, TGA / UGA, “K174*” ) within the IDS protein sequence. The mouse groups are labeled at the top of each bar plot, and the different rAAVs used for administration are indicated along the x-axis. IDS-K174* / Y mice administered AAV scAAV2 / 9-ctrl served as a negative control, while IDS-WT mice administered AAV scAAV2 / 9-ctrl served as a positive control. Error bars represent the standard deviation of biological replicates. FIG. 24A presents IDS activity levels in the serum of mice at 2 weeks (left panel) and 4 weeks (right panel) post-injection, with IDS activity levels normalized as a percentage relative to IDS-WT mice and displayed on the vertical axis. FIG. 24B depicts changes in GAG content in urine at 2 weeks (left panel) and 4 weeks (right panel) post-injection, with the vertical axis representing GAG content, normalized to creatinine levels and expressed as milligrams of GAG per milligram of creatinine (GAG mg / CR mg) . FIG. 24C shows IDS activity (upper panel) and GAG content (lower panel) in various tissues of PTC mice 4 weeks post-injection. The upper and lower panels, from left to right, shows results for analysis of the hippocampus, kidney, lung, spleen, and heart. In the upper panel, IDS activity levels are normalized as a percentage relative to IDS-WT mice and displayed on the vertical axis, while in the lower panel, tissue GAG content is normalized to total protein content and expressed as micrograms of GAG per milligram of protein (GAG μg / protein mg) on the vertical axis.

[0057] FIG. 24D presents Western blot analyses of rescued full-length IDS expression in IDS-K174* / Y mice administered rAAV scAAV2 / 9-147R3M53SF1C. The upper two panels display Western blot results, showing rescued full-length IDS expression (upper blot, labeled “IB: IDS” ) and GAPDH expression as a loading control (lower blot, labeled “IB: GAPDH” ) in mice. The mouse groups are labeled at the top of the panel, and the different rAAVs used for administration are indicated above the blots. IDS-WT mice administered AAV scAAV2 / 9-ctrl served as a positive control, while IDS-K174* / Y mice administered AAV scAAV2 / 9-ctrl served as a negative control. Protein samples for Western blot detection were extracted from the heart (upper left panel) and spleen (upper right panel) . The lower panel presents the quantification of protein band intensities from the upper panel. Mouse groups are annotated above the bar plot, with the horizontal axis indicating the different rAAVs used for administration and the vertical axis representing full-length IDS protein levels, normalized to GAPDH levels and expressed as a fraction relative to IDS-WT mice administered AAV scAAV2 / 9-ctrl. Error bars represent the standard deviation of biological replicates. The arrow in the top right panel indicates the rescued full-length IDS protein in the measured spleen sample administered scAAV2 / 9-147R3M53SF1C.

[0058] FIGS. 25A-25C illustrate the restoration of full-length ABCA4 protein in mice with Stargardt disease following administration of rAAVs with different AAV serotypes. These mice carry an ABCA4 PTC mutation at position 681 ( “R681*” ) , where an arginine codon is replaced by a stop codon (TGA / UGA) within the ABCA4 protein sequence. FIG. 25A presents Western blot analyses of full-length ABCA4 protein restoration in the eye cup of ABCA4-R681*mice at 8 weeks post-injection with scAAV8-147R3M53SF1C. The upper blot shows the rescued full-length ABCA4 protein (labeled “IB: ABCA4” ) , while the lower blot displays Actin as a loading control (labeled “IB: Actin” ) . The molecular masses are noted to the right of each blot. Mouse groups are labeled at the top, and the different rAAVs used for administration are indicated below the groups. “OD” (oculus dexter) refers to the right eye, and “OS” (oculus sinister) to the left eye, with a line above OS / OD indicating the eyes that belong to the same mouse. Eye samples from one mouse per injection group were analyzed. ABCA4-R681*mice injected with scAAV8-ctrl served as a negative control, while ABCA4-WT mouse injected with scAAV8-ctrl was used as a positive control. FIG. 25B shows Western blot analyses of full-length ABCA4 protein restoration in the eye cup of ABCA4-R681*mice at 4 weeks post-injection with scAAV2.7m8-147R3M53SF1C at doses of 1.1E9 VG / eye and 3.3E9 VG / eye. The upper panel displays the Western blot results, with the rescued ABCA4 protein in the upper blot (labeled “IB: ABCA4” ) and Actin as a loading control in the lower blot (labeled “IB: Actin” ) . The molecular masses are noted to the right of each blot. Mouse groups are labeled at the top, the administered rAAVs are indicated below the groups, and the injection doses are shown above the blot. A line beneath OS / OD indicates whether the eyes belong to the same mouse. Eye samples from two mice per dose group were analyzed. ABCA4-R681*mice injected with scAAV2.7m8-ctrl served as a negative control, while ABCA4-WT mouse was used as a positive control. The lower panel of FIG. 25B presents the quantification of protein band intensities from the upper panel, with mouse groups annotated above the bar plot. The horizontal axis represents the administered rAAVs, while the vertical axis displays ABCA4 protein levels normalized to Actin and expressed as a fraction relative to ABCA4-WT mice without treatment. Error bars represent the standard deviation of biological replicates. FIG. 25C illustrates immunofluorescence results showing the detection of full-length ABCA4 protein in ABCA4-R681*mice 4 weeks post-injection with scAAV2.7m8-147R3M53SF1C at a dose of 5E9 VG / eye. The rescued ABCA4 protein is observed in the outer segments (OS) , marked by white dashed circles and arrows in the lower panel. Retinal layers are labeled as follows: RPE (retinal pigment epithelium) , OS (outer segments) , ONL (outer nuclear layer) , OPL (outer plexiform layer) , and INL (inner nuclear layer) . ABCA4-R681*mice injected with scAAV2.7m8-ctrl served as a negative control (middle panel) , while WT mice (ABCA4-WT) were used as a positive control (upper panel) , with the full-length ABCA4 protein signal similarly highlighted by a white dashed circle and an arrow.

[0059] FIGS. 25D-25E illustrate the evaluation of retinal integrity following AAV-mediated suppressor tRNA delivery in ABCA4-R681*mice. FIG. 25D presents a quantitative analysis of retinal thickness (plotted along the vertical axis) in WT and ABCA4-R681*mice at 4 weeks post-injection with scAAV2.7m8-147R3M53SF1C at doses of 1.1E9, 3.3E9, 5E9, and 8E9 VG / eye. Retinal thickness was measured at varying distances from the optic disc center (plotted along the horizontal axis) using optical coherence tomography (OCT) . Control groups consisted of ABCA4-WT and ABCA4-R681*mice that received scAAV2.7m8-ctrl at the corresponding doses, as indicated at the bottom of the figure. FIG. 25E shows representative hematoxylin and eosin-stained cross-sections of the eye from ABCA4-R681*mice treated with scAAV2.7m8-147R3M53SF1C at doses of 1.1E9, 3.3E9, and 5E9 VG / eye. Histological analysis confirmed the preservation of retinal layers, normal cellular morphology, and the absence of structural abnormalities, inflammation, or degeneration across all tested doses.

[0060] FIGS. 26A-26D demonstrate the restoration of full-length MeCP2 protein in male mice with X-linked Rett syndrome following the administration of rAAVs carrying various engineered suppressor tRNAs. These mice carry X-linked MeCP2 PTC mutations at positions 255 (arginine to stop codon, TGA / UGA, “R255* / Y” ) and 294 (arginine to stop codon, TGA / UGA, “R294* / Y” ) in the MeCP2 protein sequence. FIG. 26A shows Western blot analyses of full-length MeCP2 restoration in the hippocampus (left panel) , cortex (middle panel) , and spinal cord (right panel) of MeCP2-R255* / Y mice, 4 weeks after administration of scAAV2 / 9-147R3M53SF1C at a dose of 6.6E10 VG / mouse. The upper blot indicates the rescued full-length MeCP2 protein (labeled “IB: MeCP2” ) , while the lower blot shows Actin as a loading control (labeled “IB: Actin” ) . Mouse groups are labeled in the top row of text, and the rAAV used for administration is noted in the lower row of text. MeCP2-WT mice served as a positive control in the leftmost lane of each blot, while the remaining lanes represented individual mice. FIG. 26B shows Western blot analyses of full-length MeCP2 restoration in the hippocampus (upper panel) and cortex (lower panel) of MeCP2-R294* / Y mice, 4 weeks after administration of scAAV2 / 9-147R3M53SF1C at doses of 2E11, 6.7E10, and 2E10 VG / mouse, and scAAV2 / 9-147R3M64SF1C at a dose of 6.7E10 VG / mouse. The upper blot displays the rescued full-length MeCP2 protein ( “IB: MeCP2” ) , while the lower blot shows Actin as a loading control ( “IB: Actin” ) . Mouse groups are labeled in the top row of text, and the rAAVs used for administration are labeled in the middle row of text (above the dosages) , with injection doses shown immediately above the blots. MeCP2-R294* / Y mice injected with scAAV2 / 9-ctrl were used as a negative control, and MeCP2-WT mice injected with scAAV2 / 9-ctrl were used as the positive controls. One-tenth of the protein extract from the positive control was loaded onto the gel, with each lane representing an individual mouse. FIG. 26C presents immunofluorescence staining results, showing full-length MeCP2 protein in MeCP2-R294* / Y mice 4 weeks after administration of scAAV2 / 9-147R3M53SF1C at a dose of 2E10 VG / mouse. The rescued full-length MeCP2 protein is seen in the cortex and hippocampus, highlighted by a white dashed circle and an arrow in the lower panel. MeCP2-R294* / Y mice injected with scAAV2 / 9-ctrl at a dose of 2E11 VG / mouse served as a negative control (middle panel) , while WT mice (MeCP2-WT) injected with scAAV2 / 9-ctrl at the same dose were used as a positive control (upper panel) , where the full-length MeCP2 protein was detected throughout the brain. FIG. 26D shows Western blot analyses of full-length MeCP2 restoration in the hippocampus (upper left panel) , cortex (upper right panel) , bulbus oblongata (lower left panel) , and midbrain (lower right panel) of MeCP2-R294* / Y mice, 4 weeks after administration of scAAV2 / 9-147R3M64SF1C at a dose of 2E10 VG / mouse. The upper blot indicates the rescued full-length MeCP2 protein (labeled as “IB: MeCP2” ) , while the lower blot displays Actin as a loading control (labeled as “IB: Actin” ) . Mouse groups are labeled in the top row of text, and the rAAV used for administration is noted in the lower row of text. MeCP2-WT mice served as a positive control in the leftmost two lanes of each blot, with each lane representing an individual mouse.DETAILED DESCRIPTION

[0061] The present application provides novel engineered arginine-carrying tRNAs having one or more sequence modifications relative to the native human arginine-carrying tRNA Arg-TCT-1-1. In some embodiments, the engineered tRNAs are high-potency arginine-carrying tRNAs, such as, recognizing an AGA arginine codon, an AGG arginine codon, a CGT / CGU arginine codon, a CGC arginine codon, a CGA arginine codon, or a CGG arginine codon. In some embodiments, the engineered tRNAs are capable of suppressing a premature stop codon (engineered tRNAs with such capabilities are also referred to herein as “engineered suppressor tRNAs” ) , such as, suppressing a TGA / UGA stop codon, a TAG / UAG stop codon, or a TAA / UAA stop codon. The sequence modifications of the engineered tRNAs may be described by Sprinzl position and / or by reference to the sequence of a comparator tRNA (such as, as one or more substitutions relative to the RNA sequence of human tRNA-Arg-TCT-1-1, provided herein as SEQ ID NO: 1) , and may include, for example, (a) a G to A substitution at position 73; (b) a C to U substitution at position 72; (c) a G to C substitution at position 2 together with a U to G substitution at position 71; (d) a U to C substitution at position 4 together with an A to G substitution at position 69; (e) a C to G substitution at position 5 together with a G to U substitution at position 68; (f) a C to G substitution at position 6 together with a G to C substitution at position 67, or a C to A substitution at position 6 together with a G to U substitution at position 67; (g) an A to G substitution at position 26; (h) an A to G substitution at position 43; (i) an A to C substitution at position 31 together with a U to G substitution at position 39; (j) a U to C substitution at position 40; (k) an A to G substitution at position 44; and / or (l) a C to G substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65, or a C to A substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65. The modifications of the engineered tRNAs may include, for example, in combination with any preceding modification or alone, (m) - (uu) : (m) a C to U substitution at position 3 or a C to G substitution at position 3; (n) a G to A substitution at position 7; (o) a G to A substitution at position 9; (p) an A to G substitution at position 15; (q) a U to G substitution at position 16; (r) a G to C substitution at position 17; (s) an A to G substitution at position 19, an A to C substitution at position 19, an A to U substitution at position 19, or a deletion of the nucleotide at position 19; (t) a U to G substitution at position 20; (u) a C to U substitution at position 32; (v) a U to C substitution at position 33; (w) an A to C substitution at position 38, an A to G substitution at position 38, or an A to U substitution at position 38; (x) a U to C substitution at position 48, (y) a G to U substitution at position 51 or a G to C substitution at position 51; (z) a G to A substitution at position 57; (aa) a C to G substitution at position 63 or a C to A substitution at position 63; (bb) a C to U substitution at position 66; (cc) a G to C substitution at position 70 or a G to A substitution at position 70; (dd) a U to G substitution at position 4; (ee) a C to A substitution at position 5; (ff) a C to U substitution at position 6; (gg) a G to U substitution at position 12; (hh) a C to G substitution at position 13; (ii) a C to A substitution at position 23; (jj) an A to U substitution at position 43; (kk) a C to G substitution at position 50; (ll) a G to C substitution at position 59 or a G to U substitution at position 59; (mm) a G to C substitution at position 64; (nn) a G to A substitution at position 67; (oo) an A to C substitution at position 69 or an A to G substitution at position 69; (pp) a U to A substitution at position 71 or a U to C substitution at position 71; (qq) a G to U substitution at position 2; (rr) a G to U substitution at position 68; (ss) a G to A substitution at position 22; (tt) an A to U substitution at position 26; and / or (uu) a U to A substitution at position 27; wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.

[0062] The sequence modifications of the engineered tRNAs may be described by Sprinzl position and / or by reference to the sequence of a comparator tRNA (such as, as one or more substitutions relative to the RNA sequence of human tRNA-Arg-TCT-1-1, provided herein as SEQ ID NO: 1) , and may include, for example, (a) a G to A substitution at position 73; (b) a C to U substitution at position 72; (c) a G to C substitution at position 2 together with a U to G substitution at position 71; (d) a U to C substitution at position 4 together with an A to G substitution at position 69; (e) a C to G substitution at position 5 together with a G to U substitution at position 68; (f) a C to G substitution at position 6 together with a G to C substitution at position 67; or a C to A substitution at position 6 together with a G to U substitution at position 67; (g) an A to G substitution at position 26; (h) an A to G substitution at position 43; (i) an A to C substitution at position 31 together with a U to G substitution at position 39; (j) a U to C substitution at position 40; (k) an A to G substitution at position 44; (l) a C to G substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65; or a C to A substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65; (m) a G to U substitution at position 2 together with a U to A substitution at position 71; (n) an A to G substitution at position 69 alone; (o) a C to U substitution at position 6 together with a G to A substitution at position 67; (p) a U to A substitution at position 27 together with an A to U substitution at position 43; (q) an A to G substitution at position 37; (r) a G to U substitution at position 12 together with a C to A substitution at position 23; (s) a G to A substitution at position 9; (t) an A to U substitution at position 26; and / or (u) a G to C substitution at position 59; wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. The engineered suppressor tRNAs provided herein may further include a different anticodon than that of Arg-TCT-1-1, such as 5’ -UCA-3’ (recognizing a TGA / UGA stop codon) , 5’ -CUA-3’ (recognizing a TAG / UAG stop codon) , or 5’ -UUA-3’ (recognizing a TAA / UAA stop codon) , 5’ -ACG-3’ (recognizing a CGT / CGU arginine codon) , 5’ -CCG-3’ (recognizing a CGG arginine codon) , 5’ -UCG-3’ (recognizing a CGA arginine codon) , 5’ -GCG-3’ (recognizing a CGC arginine codon) , and 5’ -CCU-3’ (recognizing an AGG arginine codon) at position 34-36 (Sprinzl position) .

[0063] The one or more modifications introduced to the engineered tRNA may result in a further increase in tRNA expression, in arginine decoding efficiency, and / or or in stop codon decoding efficiency (i.e., increased PTC readthrough efficiency) , making the modified tRNAs particularly suitable for suppressing premature stop codons in vivo. The findings that minor changes to the nucleotide sequence of the engineered tRNA can significantly improve the properties of the engineered tRNA are remarkable and unexpected.

[0064] Thus, the present application, in one aspect, provides engineered tRNAs for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the anticodon is optionally 5’ -UCA-3’ which recognizes a TGA / UGA stop codon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1, and wherein the one or more modifications comprise: an A to G substitution at position 26 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, and SEQ ID NO: 90) ; a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to G substitution at position 6, and a G to C substitution at position 67 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 66, and SEQ ID NO: 67) ; a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to A substitution at position 6, and a G to U substitution at position 67 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 71, and SEQ ID NO: 72) ; an A to G substitution at position 43, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, and a U to C substitution at position 40 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 67) ; a G to A substitution at position 73 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 55, and SEQ ID NO: 56) ; a C to G substitution at position 49 and a G to U substitution at position 65 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, and SEQ ID NO: 65) ; a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to G substitution at position 5, and a G to U substitution at position 68 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 48, and SEQ ID NO: 49) ; an A to G substitution at position 44 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, and SEQ ID NO: 65) ; a C to A substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 26) , an A to G substitution at position 26 together with a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to A substitution at position 6, and a G to U substitution at position 67 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 71, and SEQ ID NO: 72) ; an A to G substitution at position 26 together with a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to A substitution at position 6, a G to U substitution at position 67, and an A to G substitution at position 37 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 36) ; an A to G substitution at position 26 together with a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to A substitution at position 6, a G to U substitution at position 67, and a U to C substitution at position 33 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 71) ; an A to G substitution at position 26 together with a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to A substitution at position 6, a G to U substitution at position 67, and an A to G substitution at position 38 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 72) ; a U to A substitution at position 27 and an A to U substitution at position 43 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29) ; a U to A substitution at position 27 together with an A to U substitution at position 43, and a U to C substitution at position 40 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 28) ; a G to U substitution at position 29 together with a U to C substitution at position 40, a C to A substitution at position 41, and an A to G substitution at position 43 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 30) ; a U to C substitution at position 27 together with an A to G substitution at position 43, and a U to C substitution at position 40 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 31) ; a C to U substitution at position 50 and a G to A substitution at position 64 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 73) ; an A to U substitution at position 26 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 35) ; a C to G substitution at position 49 together with a C to G substitution at position 50, a G to U substitution at position 51, a C to A substitution at position 63, a G to C substitution at position 64, and a G to C substitution at position 65 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 74) ; a C to U substitution at position 32 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 32) ; an A to C substitution at position 38 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 33) ; an A to U substitution at position 38 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 34) ; a G to U substitution at position 51 and a C to G substitution at position 63 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 75) ; a G to C substitution at position 51 and a C to G substitution at position 63 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 76) ; a G to C substitution at position 59 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 77) ; a G to U substitution at position 59 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 78) ; a G to A substitution at position 57 and a G to A substitution at position 59 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 79) ; an A to G substitution at position 15, an A to U substitution in position 19; and a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 80) ; an A to G substitution at position 15, a nucleotide deletion at position 19; and a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 81) ; an A to G substitution at position 15, a nucleotide deletion at position 19; a U to G substitution at position 16, and a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 82) ; an A to G substitution at position 15, a G to C substitution at position 17, an A to G substitution at position 19; and a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 83) ; an A to G substitution at position 15 and a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 84 and SEQ ID NO: 85) ; an A to G substitution at position 15, an A to C substitution at position 19; and a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 85) ; an A to G substitution at position 15, an A to U substitution at position 19; a U to G substitution at position 20, and a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 86) ; a G to A substitution at position 9, a G to U substitution at position 12, and a C to A substitution at position 23 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 87) ; a G to U substitution at position 12 and a C to A substitution at position 23 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 88) ; a G to C substitution at position 12, a C to G substitution at position 13, a G to A substitution at position 22, and a C to G substitution at position 23 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 89) ; an A to G substitution at position 26 and an A to G substitution at position 44 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 90) ; an A to G substitution at position 26 and an A to G substitution at position 44 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 90) ; a G to U substitution at position 2, a C to U substitution at position 6, a G to A substitution at position 67, a U to A substitution at position 71, and a C to U substitution at position 72 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 91) ; a C to U substitution at position 6 and a G to A substitution at position 67 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 92) ; a C to G substitution at position 3, a U to C substitution at position 4, a C to A at substitution 6, a G to U substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, and a G to C substitution at substitution 70 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 93) ; a G to A substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 6, a G to U substitution at position 67, and A to G substitution at position 69 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 94) ; a G to A substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 5, a G to U substitution at position 68, an A to G substitution at position 69, and a C to U substitution at position 72 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 95) ; a U to C substitution at position 4, a C to G substitution at position 5, a C to U substitution at position 6, a G to A substitution at position 67, a G to C substitution at position 68, and an A to G substitution at position 69 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 96) ; a C to G substitution at position 3, a U to G substitution at position 4, a C to G substitution at position 5, a C to U substitution at position 6, a G to A substitution at position 7, a C to U substitution at position 66, a G to C substitution at position 68, an A to C substitution at position 69, a G to C substitution at position 70, and a U to C substitution at position 71 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 97) ; a G to U substitution at position 2, a C to U substitution at position 3, a G to A substitution at position 70, and a U to A substitution at position 71 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 98) ; and / or a G to U substitution at position 2, a C to U substitution at position 6, a G to A substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, and a U to A substitution at position 71 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 99) , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.

[0065] The present application provides novel engineered arginine-carrying tRNAs having one or more sequence modifications relative to the native human arginine-carrying tRNA Arg-TCT-1-1. In some embodiments, the engineered tRNAs are high-potency arginine-carrying tRNAs, such as, recognizing an AGA arginine codon, an AGG arginine codon, a CGT / CGU arginine codon, a CGC arginine codon, a CGA arginine codon, or a CGG arginine codon. In some embodiments, the engineered tRNAs are capable of suppressing a premature stop codon (engineered tRNAs with such capabilities are also referred to herein as “engineered suppressor tRNAs” ) , such as, suppressing a TGA / UGA stop codon, a TAG / UAG stop codon, or a TAA / UAA stop codon. The sequence modifications of the engineered tRNAs may be described by Sprinzl position and / or by reference to the sequence of a comparator tRNA (such as, as one or more substitutions relative to the RNA sequence of human tRNA-Arg-TCT-1-1, provided herein as SEQ ID NO: 1) , and may include, for example, (a) a G to A substitution at position 73; (b) a C to U substitution at position 72; (c) a G to C substitution at position 2 together with a U to G substitution at position 71; (d) a U to C substitution at position 4 together with an A to G substitution at position 69; (e) a C to G substitution at position 5 together with a G to U substitution at position 68; (f) a C to G substitution at position 6 together with a G to C substitution at position 67, or a C to A substitution at position 6 together with a G to U substitution at position 67; (g) an A to G substitution at position 26; (h) an A to G substitution at position 43; (i) an A to C substitution at position 31 together with a U to G substitution at position 39; (j) a U to C substitution at position 40; (k) an A to G substitution at position 44; and / or (l) a C to G substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65, or a C to A substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65. The modifications of the engineered tRNAs may include, for example, in combination with any preceding modification or alone, (m) - (u) : (m) a G to U substitution at position 2 together with a U to A substitution at position 71; (n) an A to G substitution at position 69 alone; (o) a C to U substitution at position 6 together with a G to A substitution at position 67; (p) a U to A substitution at position 27 together with an A to U substitution at position 43; (q) an A to G substitution at position 37; (r) a G to U substitution at position 12 together with a C to A substitution at position 23; (s) a G to A substitution at position 9; (t) an A to U substitution at position 26; and / or (u) a G to C substitution at position 59. The engineered suppressor tRNAs provided herein may further include a different anticodon than that of Arg-TCT-1-1, such as 5’ -UCA-3’ (recognizing a TGA / UGA stop codon) , 5’ -CUA-3’ (recognizing a TAG / UAG stop codon) , or 5’ -UUA-3’ (recognizing a TAA / UAA stop codon) , 5’ -ACG-3’ (recognizing a CGT / CGU arginine codon) , 5’ -CCG-3’ (recognizing a CGG arginine codon) , 5’ -UCG-3’ (recognizing a CGA arginine codon) , 5’ -GCG-3’ (recognizing a CGC arginine codon) , and 5’ -CCU-3’ (recognizing an AGG arginine codon) at position 34-36 (Sprinzl position) .

[0066] The one or more modifications introduced to the engineered tRNA may result in a further increase in tRNA expression, in arginine decoding efficiency, and / or or in stop codon decoding efficiency (i.e., increased PTC readthrough efficiency) , making the modified tRNAs particularly suitable for suppressing premature stop codons in vivo. The findings that minor changes to the nucleotide sequence of the engineered tRNA can significantly improve the properties of the engineered tRNA are remarkable and unexpected.

[0067] Thus, the present application, in one aspect, provides engineered tRNAs for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the anticodon is optionally 5’ -UCA-3’ which recognizes a TGA / UGA stop codon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1, and wherein the one or more modifications comprise: an A to G substitution at position 26 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, and SEQ ID NO: 90) ; a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to G substitution at position 6, and a G to C substitution at position 67 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 66, and SEQ ID NO: 67) ; a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to A substitution at position 6, and a G to U substitution at position 67 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 71, and SEQ ID NO: 72) ; an A to G substitution at position 43, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, and a U to C substitution at position 40 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 67) ; a G to A substitution at position 73 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 55, and SEQ ID NO: 56) ; a C to G substitution at position 49 and a G to U substitution at position 65 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, and SEQ ID NO: 65) ; a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to G substitution at position 5, and a G to U substitution at position 68 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 48, and SEQ ID NO: 49) ; an A to G substitution at position 44 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, and SEQ ID NO: 65) ; a C to A substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 26) ; an A to G substitution at position 26 together with a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to A substitution at position 6, a G to U substitution at position 67, and an A to G substitution at position 37 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 36) ; a U to A substitution at position 27 and an A to U substitution at position 43 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29) ; an A to U substitution at position 26 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 35) ; a G to C substitution at position 59 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 77) ; a G to A substitution at position 9, a G to U substitution at position 12, and a C to A substitution at position 23 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 87) ; an A to G substitution at position 26 and an A to G substitution at position 44 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 90) ; a G to U substitution at position 2, a C to U substitution at position 6, a G to A substitution at position 67, a U to A substitution at position 71, and a C to U substitution at position 72 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 91) ; and / or a G to U substitution at position 2, a C to U substitution at position 6, a G to A substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, and a U to A substitution at position 71 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 99) , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.

[0068] The present application also provides novel engineered arginine-carrying tRNAs having one or more sequence modifications relative to the native human arginine-carrying tRNA Arg-CCT-4-1. In some embodiments, the engineered tRNAs are high-potency arginine-carrying tRNAs, such as, recognizing an AGA arginine codon, an AGG arginine codon, a CGT / CGU arginine codon, a CGC arginine codon, a CGA arginine codon, or a CGG arginine codon. In some embodiments, the engineered tRNAs are capable of suppressing a premature stop codon (engineered tRNAs with such capabilities are also referred to herein as “engineered suppressor tRNAs” ) , such as, suppressing a TGA / UGA stop codon, a TAG / UAG stop codon, or a TAA / UAA stop codon. The sequence modifications of the engineered tRNAs may be described by Sprinzl position and / or by reference to the sequence of a comparator tRNA (such as, as one or more substitutions relative to the RNA sequence of human tRNA-Arg-CCT-4-1, provided herein as SEQ ID NO: 2) , and may include, for example, (a) an A to G substitution at position 26; (b) an A to G substitution at position 26 together with a G to A substitution at position 44; (c) a C to U substitution at position 4; (d) a C to U substitution at position 4 together with a G to A substitution at position 69; (e) a G to A substitution at position 73; (f) a C to G substitution at position 5 together with a G to U substitution at position 68; (g) a G to A substitution at position 49; (h) a U to A substitution at position 50 together with an A to U substitution at position 64; (i) an A to G substitution at position 6; (j) an A to G substitution at position 6 together with a U to C substitution at position 67; (k) an A to C substitution at position 6 together with a U to G substitution at position 67; (l) a U to C substitution at position 50 together with an A to G substitution at position 64; (m) an A to G substitution at position 22 together with an A to G substitution at position 46; (n) an A to G substitution at position 22 together with an A to G substitution at position 46 and a G to A substitution at position 44; (o) an A to G substitution at position 15 together with a U to C substitution at position 48; (p) an A to G substitution at position 37; (q) a G to A substitution at position 9 together with a C to U substitution at position 12, a U to C substitution at position 13, an A to G substitution at position 22, and a G to A substitution at position 23; (r) and / or a C to G substitution at position 12 together with a U to C substitution at position 13, an A to G substitution at position 22, and a G to C substitution at position 23; wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.

[0069] The sequence modifications of the engineered tRNAs may be described by Sprinzl position and / or by reference to the sequence of a comparator tRNA (such as, as one or more substitutions relative to the RNA sequence of human tRNA-Arg-CCT-4-1, provided herein as SEQ ID NO: 2) , and may include, for example, the one or more modifications consist of: (a) a G to A substitution at position 73; (b) a C to U substitution at position 4 together with a G to A substitution at position 69; or a C to U substitution at position 4; (c) a C to G substitution at position 5 together with a G to U substitution at position 68; (d) an A to G substitution at position 6; or an A to G substitution at position 6 together with a U to C substitution at position 67; or an A to C substitution at position 6 together with a U to G substitution at position 67; (e) a G to A substitution at position 9; (f) a C to G substitution at position 12 together with a G to C substitution at position 23; or a C to U substitution at position 12 together with a G to A substitution at position 23; (g) a U to C substitution at position 13 together with an A to G substitution at position 22; (h) an A to G substitution at position 15 together with a U to C substitution at position 48; (i) an A to G substitution at position 22 together with an A to G substitution at position 46; (j) an A to G substitution at position 26; (k) an A to G substitution at position 37; (l) a G to A substitution at position 44; (m) a G to A substitution at position 49; and / or (n) a U to C substitution at position 50 together with an A to G substitution at position 64; or a U to A substitution at position 50 together with an A to U substitution at position 64; wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. The engineered suppressor tRNAs provided herein may further include a different anticodon than that of Arg-CCT-4-1, such as 5’ -UCA-3’ (recognizing a TGA / UGA stop codon) , 5’ -CUA-3’ (recognizing a TAG / UAG stop codon) , or 5’ -UUA-3’ (recognizing a TAA / UAA stop codon) , 5’ -ACG-3’ (recognizing a CGT / CGU arginine codon) , 5’ -CCG-3’ (recognizing a CGG arginine codon) , 5’ -UCG-3’ (recognizing a CGA arginine codon) , 5’ -GCG-3’ (recognizing a CGC arginine codon) , and 5’ -UCU-3’ (recognizing an AGA arginine codon) at position 34-36 (Sprinzl position) .

[0070] The sequence modifications of the engineered tRNAs may be described by Sprinzl position and / or by reference to the sequence of a comparator tRNA (such as, as one or more substitutions relative to the RNA sequence of human tRNA-Arg-CCT-4-1, provided herein as SEQ ID NO: 2) , and may include, for example, (a) an A to G substitution at position 6 together with a U to C substitution at position 67; or an A to C substitution at position 6 together with a U to G substitution at position 67; (b) a G to A substitution at position 9; (c) a C to U substitution at position 12 together with a G to A substitution at position 23; (d) a U to C substitution at position 13 together with an A to G substitution at position 22; (e) an A to G substitution at position 22 together with an A to G substitution at position 46; (f) an A to G substitution at position 26; (g) a G to A substitution at position 44; and / or (h) a U to C substitution at position 50 together with an A to G substitution at position 64. The engineered suppressor tRNAs provided herein may further include a different anticodon than that of Arg-CCT-4-1, such as 5’ -UCA-3’ (recognizing a TGA / UGA stop codon) , 5’ -CUA-3’ (recognizing a TAG / UAG stop codon) , or 5’ -UUA-3’ (recognizing a TAA / UAA stop codon) , 5’ -ACG-3’ (recognizing a CGT / CGU arginine codon) , 5’ -CCG-3’ (recognizing a CGG arginine codon) , 5’ -UCG-3’ (recognizing a CGA arginine codon) , 5’ -GCG-3’ (recognizing a CGC arginine codon) , and 5’ -UCU-3’ (recognizing an AGA arginine codon) at position 34-36 (Sprinzl position) .

[0071] The one or more modifications introduced to the engineered tRNA may result in a further increase in tRNA expression, in arginine decoding efficiency, and / or or in stop codon decoding efficiency (i.e., increased PTC readthrough efficiency) , making the modified tRNAs particularly suitable for suppressing premature stop codons in vivo. The findings that minor changes to the nucleotide sequence of the engineered tRNA can significantly improve the properties of the engineered tRNA are remarkable and unexpected.

[0072] Thus, the present application, in one aspect, provides engineered tRNAs for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the anticodon is optionally 5’ -UCA-3’ which recognizes a TGA / UGA stop codon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2, and wherein the one or more modifications comprise: an A to G substitution at position 26 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 116 and SEQ ID NO: 117) ; an A to G substitution at position 26 together with a G to A substitution at position 44 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 117) ; a C to U substitution at position 4 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 125 and SEQ ID NO: 126) ; a C to U substitution at position 4 together with a G to A substitution at position 69 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 125) ; a G to A substitution at position 73 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 118) ; a C to G substitution at position 5 together with a G to U substitution at position 68 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 127) ; a G to A substitution at position 49 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 121) ; a U to A substitution at position 50 together with an A to U substitution at position 64 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 120) ; an A to G substitution at position 6 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 122 and SEQ ID NO: 123) ; an A to G substitution at position 6 together with a U to C substitution at position 67 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 123) ; an A to C substitution at position 6 together with a U to G substitution at position 67 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 124) ; a U to C substitution at position 50 together with an A to G substitution at position 64 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 119) ; an A to G substitution at position 22 together with an A to G substitution at position 46 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 114 and SEQ ID NO: 115) ; an A to G substitution at position 22 together with an A to G substitution at position 46 and a G to A substitution at position 44 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 115) ; an A to G substitution at position 15 together with a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 113) ; an A to G substitution at position 37 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 128) ; a G to A substitution at position 9 together with a C to U substitution at position 12, a U to C substitution at position 13, an A to G substitution at position 22, and a G to A substitution at position 23 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 112) ; and / or a C to G substitution at position 12, a U to C substitution at position 13, an A to G substitution at position 22, and a G to C substitution at position 23 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 111) , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.

[0073] Thus, the present application, in one aspect, provides engineered tRNAs for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the anticodon is optionally 5’ -UCA-3’ which recognizes a TGA / UGA stop codon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2, and wherein the one or more modifications comprise: a G to A substitution at position 73 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 118) ; a C to U substitution at position 4 together with a G to A substitution at position 69 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 125) ; a C to U substitution at position 4 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 126) ; a C to G substitution at position 5 together with a G to U substitution at position 68 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 127) ; an A to G substitution at position 6 (as in, e.g., SEQ ID NO: 122) ; an A to G substitution at position 6 together with a U to C substitution at position 67 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 123) ; an A to C substitution at position 6 together with a U to G substitution at position 67 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 124) ; a G to A substitution at position 9 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 112) ; a C to G substitution at position 12 together with a G to C substitution at position 23 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 111) ; a C to U substitution at position 12 together with a G to A substitution at position 23 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 112) ; a U to C substitution at position 13 together with an A to G substitution at position 22 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 111, and SEQ ID NO: 112) ; an A to G substitution at position 15 together with a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 113) ; an A to G substitution at position 22 together with an A to G substitution at position 46 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 114, and SEQ ID NO: 115) ; an A to G substitution at position 26 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 116, and SEQ ID NO: 117) ; an A to G substitution at position 37 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 128) ; a G to A substitution at position 44 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 115, and SEQ ID NO: 117) ; a G to A substitution at position 49 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 121) ; a U to C substitution at position 50 together with an A to G substitution at position 64 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 119) ; a U to A substitution at position 50 together with an A to U substitution at position 64 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 120) ; wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.

[0074] The present application also provides novel engineered arginine-carrying tRNAs having one or more sequence modifications relative to the native human arginine-carrying tRNA Arg-CCT-1-1. In some embodiments, the engineered tRNAs are high-potency arginine-carrying tRNAs, such as, recognizing an AGA arginine codon, an AGG arginine codon, a CGT / CGU arginine codon, a CGC arginine codon, a CGA arginine codon, or a CGG arginine codon. In some embodiments, the engineered tRNAs are capable of suppressing a premature stop codon (engineered tRNAs with such capabilities are also referred to herein as “engineered suppressor tRNAs” ) , such as, suppressing a TGA / UGA stop codon, a TAG / UAG stop codon, or a TAA / UAA stop codon. The sequence modifications of the engineered tRNAs may be described by Sprinzl position and / or by reference to the sequence of a comparator tRNA (such as, as one or more substitutions relative to the RNA sequence of human tRNA-Arg-CCT-1-1, provided herein as SEQ ID NO: 133) .

[0075] The one or more modifications introduced to the engineered tRNA may result in a further increase in tRNA expression, in arginine decoding efficiency, and / or or in stop codon decoding efficiency (i.e., increased PTC readthrough efficiency) , making the modified tRNAs particularly suitable for suppressing premature stop codons in vivo. The findings that minor changes to the nucleotide sequence of the engineered tRNA can significantly improve the properties of the engineered tRNA are remarkable and unexpected.

[0076] In another aspect, there are provided nucleic acids encoding the engineered tRNA, as well as expression cassettes and vectors comprising such nucleic acids. Also provided are methods of using the engineered tRNAs, nucleic acids encoding the engineered tRNAs, expression cassettes, and vectors. I. DEFINITIONS

[0077] Unless defined otherwise, all terms of art, notations and other technical and scientific terms or terminology used herein are intended to have the same meaning as is commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the claimed subject matter pertains. In some embodiments, terms with commonly understood meanings are defined herein for clarity and / or for ready reference, and the inclusion of such definitions herein should not necessarily be construed to represent a substantial difference from what is generally understood in the art.

[0078] Throughout this disclosure, various aspects of the claimed subject matter are presented in a range format. It should be understood that the description in range format is merely for convenience and brevity and should not be construed as an inflexible limitation on the scope of the claimed subject matter. Accordingly, the description of a range should be considered to have specifically disclosed all the possible sub-ranges as well as individual numerical values within that range. For example, where a range of values is provided, it is understood that each intervening value, between the upper and lower limit of that range and any other stated or intervening value in that stated range is encompassed within the claimed subject matter. The upper and lower limits of these smaller ranges may independently be included in the smaller ranges, and are also encompassed within the claimed subject matter, subject to any specifically excluded limit in the stated range. Where the stated range includes one or both of the limits, ranges excluding either or both of those included limits are also included in the claimed subject matter. This applies regardless of the breadth of the range.

[0079] The term “transfer ribonucleic acid” , “transfer RNA” , or “tRNA” as used herein refers to a nucleic acid molecule that helps translate mRNA to protein. The terms “anti codon” , “anticodon” and “anti-codon” are synonymous and used interchangeably herein. Each tRNA can be “charged with” an amino acid corresponding to the mRNA codon that is recognized by the tRNA’s anticodon. “Charging” can be mediated by aminoacyl tRNA synthetase.

[0080] The terms “premature stop codon” , “premature termination codon” , and “PTC” are used synonymously herein to refer to a stop codon that, when present, results in truncation of a polypeptide relative to a wild-type counterpart.

[0081] The term “engineered tRNA” as used herein can refer to transfer RNAs having at least one difference in the sequence of the engineered tRNA relative to a comparable wild type tRNA, such as, for example, relative to human tRNA Arg-TCT-1-1, relative to human tRNA Arg-CCT-4-1, or relative to human tRNA-Arg-CCT-1-1. The terms “suppressor tRNA” “tRNA suppressor” or “engineered tRNA suppressor” as used herein refer to an engineered tRNA capable of suppressing premature stop codon halt in an mRNA.

[0082] The term “effective amount” as used herein can refer to a quantity sufficient to achieve a desired effect.

[0083] The term “restoring” as used herein in relation to the expression of a protein, can refer to the ability to establish expression of the full-length version of the protein from an mRNA comprising a PTC, where previous protein expression was truncated due to the PTC.

[0084] The term “mutation” as used herein can refer to an alteration to a nucleic acid sequence and / or a polypeptide sequence relative to a reference sequence.

[0085] The terms “disease” , “condition” , “disease state” or “disease phenotype” as used herein refer to one or more characteristics of a mammalian cell that results from a stop codon within the coding region of a gene inside the cell (e.g., that results from a nonsense mutation) .

[0086] The term “transduction of cells” as used herein refers to the process of transferring nucleic acid into a cell using a DNA or RNA virus rather than by transfection. An RNA virus (i.e., a retrovirus) for transferring nucleic acid into a cell is referred to herein as a transducing chimeric retrovirus. Exogenous genetic material contained within a retrovirus is incorporated into the genome of the transduced cell. A cell that has been “transduced” with a chimeric DNA virus does not necessarily incorporate the exogenous genetic material into its genome but can express the exogenous genetic material extra-chromosomally within the cell. A “transduced gene” is a gene that has been introduced into the cell via retroviral or vector infection and provirus integration.

[0087] The term “expression cassette” as used herein refers to a nucleic acid sequence capable of directing the expression of a particular nucleotide sequence in an appropriate host cell.

[0088] The term “operably-linked” as used herein refers to the association of nucleic acid sequences on a single nucleic acid fragment such that the function of one of the sequences is affected by another. For example, a regulatory DNA sequence is considered “operably linked to” or “associated with” a DNA sequence that codes for an RNA or a polypeptide when the two sequences are situated such that the regulatory DNA sequence affects the expression of the coding DNA sequence (i.e., the coding sequence or functional RNA is under the transcriptional control of the promoter) .

[0089] The use of ordinal terms such as “first” , “second” , “third” , etc., in the claims to modify a claim element does not by itself connote any priority, precedence, or order of one claim element over another or the temporal order in which acts of a method are performed, but are used merely as labels to distinguish one claim element having a certain name from another element having the same name (but for the use of the ordinal term) to distinguish the claim elements. Similarly, the use of a) , b) , etc., or i) , ii) , etc., does not by itself connote any priority, precedence, or order of steps in the claims. Similarly, the use of these terms in the specification does not by itself connote any required priority, precedence, or order.

[0090] As used in this specification and the appended claims, the singular forms “a, ” “an” and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “a molecule” includes a plurality of such molecules, and the like.

[0091] The term “about” as used herein refers to the usual error range for the respective value readily known to the skilled person in this technical field. Reference to “about” a value or parameter herein comprises (and describes) embodiments that are directed to that value or parameter per se.

[0092] As used herein, the term “nucleic acid” generally refers to a polymer comprising one or more nucleic acid subunits or nucleotides. A nucleic acid may include one or more subunits selected from adenosine (A) , cytosine (C) , guanine (G) , thymine (T) and uracil (U) , or variants thereof. A nucleotide can include A, C, G, T or U, or variants thereof. A nucleotide can include any subunit that can be incorporated into a growing nucleic acid strand. Such a subunit can be an A, C, G, T, or U, or any other subunit that is specific to one or more complementary A, C, G, T or U, or complementary to a purine (e.g., A or G, or a variant thereof) or a pyrimidine (e.g., C, T or U, or a variant thereof) . A subunit can enable individual nucleic acid bases or groups of bases (e.g., AA, TA, AT, GC, CG, CT, TC, GT, TG, AC, CA, or uracil-counterparts thereof) to be resolved. In some examples, a nucleic acid is deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) , or derivatives thereof. A nucleic acid may be single-stranded or double-stranded. In some examples, a nucleic acid is chemically modified.

[0093] The terms “polynucleotide” , “nucleic acid molecule” , “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence” as used herein generally refer to polymeric forms of nucleotides of any length, either ribonucleotides or deoxyribonucleotides, with a given sequence of nucleotides, of which it may be desired to know the presence or amount. Thus, this term comprises, but is not limited to, single-, double-, or multi-stranded DNA or RNA, genomic DNA, cDNA, DNA-RNA hybrids, or a polymer comprising purine and pyrimidine bases or other natural, chemically or biochemically modified, non-natural, or derivatized nucleotide bases. The backbone of the polynucleotide can comprise sugars and phosphate groups (as may typically be found in RNA or DNA) , or modified or substituted sugar or phosphate groups. The nucleotide sequence can comprise RNA or DNA, or a sequence derived from RNA or DNA. Examples of nucleotide sequences are sequences corresponding to natural or synthetic RNA or DNA including genomic DNA and messenger RNA.

[0094] The term “sequencing, ” as used herein, generally refers to methods and technologies for determining the sequence of nucleotide bases in one or more polynucleotides. The polynucleotides can be, for example, nucleic acid molecules such as DNA or RNA, including variants or derivatives thereof (e.g., single stranded DNA) . Sequencing can be performed by various systems currently available, such as, without limitation, a sequencing system by Sanger sequencing,  Pacific Biosciences Oxford or Life Technologies (Ion ) . Alternatively or in addition, sequencing may be performed using nucleic acid amplification, polymerase chain reaction (PCR) (e.g., digital PCR, quantitative PCR, or real time PCR) , or isothermal amplification. Such systems may provide a plurality of raw genetic data corresponding to the genetic information of a subject (e.g., human) , as generated by the systems from a sample provided by the subject.

[0095] As used herein, the terms “treatment” or “treating” are used in reference to a pharmaceutical or other intervention regimen for obtaining beneficial or desired results in the recipient, including but not limited to one or more therapeutic benefits and / or prophylactic benefits. A “therapeutic benefit” in this sense can refer to the eradication or amelioration of symptoms or of an underlying disorder being treated. A “prophylactic effect” in this sense includes delaying, preventing, or eliminating the appearance of a disease or condition, delaying or eliminating the onset of symptoms of a disease or condition, slowing, halting, or reversing the progression of a disease or condition, or any combination thereof, even though a diagnosis of this disease may not have been made. II. TRANSFER RNA SEQUENCE AND STRUCTURE

[0096] Transfer RNAs (tRNAs) are generally RNA molecules about 70-90 nucleotides in length. They fold into a cloverleaf-like secondary structure that contains three hairpin loop “arms” and an acceptor arm comprising the 5’ and 3’ ends of the tRNA. From 5’ to 3’, a tRNA includes: a D-arm comprising a D-stem with a D-loop at the end of the stem, an anticodon arm comprising an anticodon stem with an anticodon loop at the end of the stem (which further comprises a tri-nucleotide anticodon sequence) , a variable region, and a T-arm comprising a T-stem with a T-loop at the end of the stem. In a naturally occurring process, a CCA tri-nucleotide sequence, which is usually not present in the DNA sequence encoding the tRNA in mammalian cells, is added to the 3’ end of the tRNA post-transcriptionally. The tri-nucleotide anticodon recognizes the corresponding codon on the mRNA being transcribed. The canonical Sprinzl position system assigns numbers to each nucleotide based on the tRNA cloverleaf secondary structure. Nucleotides in positions 1-7 pair with those in positions 72-66 to form the acceptor arm. Positions 8-9 act as spacers between the acceptor arm and the D-arm. Nucleotides in positions 10-13 pair with those in positions 25-22 to form the D-stem, while the D-loop consists of nucleotides from positions 14 to 21 (if a tRNA has more than 8 nucleotides in the D-loop, the positions are listed as 14-17, 17A, 18, 19, 20, 20A, 20B, 21, depending on the tertiary structure) . Position 26 serves as a spacer between the D-arm and the anticodon arm. Nucleotides in positions 27-31 pair with those in positions 43-39 to form the anticodon stem. The anticodon loop includes nucleotides from positions 32 to 38, with the anticodon located at positions 34-36. The variable region consists of nucleotides from positions 44 to 48 (if a tRNA has more than 5 nucleotides in the variable region, the positions are listed as 44, 45, e11-e17, e1-e5, e27-e21, 46, 47, 48) . Nucleotides in positions 49-53 pair with those in positions 65-61 to form the T-stem, while the T-loop consists of nucleotides from positions 54 to 60. Additionally, the nucleotide at position 73 is the discriminator, which is post-transcriptionally attached to the CCA tail.

[0097] tRNAs serve as adaptors to link an mRNA and its protein products by both recognizing the codons on mRNA and carrying the amino acid to append to the peptide chain. Upon recognition of the codon corresponding to its anticodon, a charged tRNA can transfer its amino acid to the growing amino acid chain to form a polypeptide or protein. Endogenous tRNAs can be charged by endogenous aminoacyl tRNA synthetase.

[0098] tRNA biogenesis entails multiple steps, including transcription by RNA polymerase III into a precursor tRNA (pre-tRNA) and subsequent intron splicing by a splicing endonuclease (for tRNAs containing introns; not every tRNA has an intron) , 5’ end and 3’ end cleavage by endo-and / or exonucleases, addition of the CCA tail by nucleotidyltransferase, and modifications on multiple nucleotide residuals (Sekulovski S, Trowitzsch S. Transfer RNA processing -from a structural and disease perspective. Biol Chem. 2022 Jun 21; 403 (8-9) : 749-763. doi: 10 [dot] 1515 / hsz-2021-0406. PMID: 35728022) . Each step requires a series of protein enzymes and energy (Sekulovski S, Trowitzsch S. Transfer RNA processing -from a structural and disease perspective. Biol Chem. 2022 Jun 21; 403 (8-9) : 749-763. doi: 10 [dot] 1515 / hsz-2021-0406. PMID: 35728022) .

[0099] The present invention provides engineered tRNAs for carrying arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (native human Arg-TCT-1-1) . Exemplary anticodon sequences that may be present in the engineered tRNAs provided herein are anticodons recognizing a stop codon or anticodons recognizing an arginine codon, such as, for example, 5’ -UCA-3’ (which recognizes a TGA / UGA stop codon) , 5’ -CUA-3’ (which recognizes a TAG / UAG stop codon) , 5’ -UUA-3’ (which recognizes a TAA / UAA stop codon) , 5’ -ACG-3’ (which recognizes a CGT / CGU arginine codon) , 5’ -CCG-3’ (which recognizes a CGG arginine codon) , 5’ -UCG-3’ (which recognizes a CGA arginine codon) , 5’ -GCG-3’ (recognizing a CGC arginine codon) , 5’ -CCU-3’ (which recognizes an AGG arginine codon) , and 5’ -UCU-3’ (which recognizes an AGA arginine codon) at position 34-36 of the tRNA; wherein the nucleotide positions of the anticodon are numbered by Sprinzl position. The engineered tRNAs provided herein may be engineered suppressor tRNAs, in which case they comprise an anticodon that recognizes a stop codon (such as, e.g., 5’ -UCA-3’ ) , or may alternatively comprise an anticodon that recognizes a non-stop codon (such as, e.g., 5’ -UCU-3’ , which recognizes an AGA arginine codon) . The one or more modifications present in the engineered tRNAs provided herein (whether suppressor tRNAs or not) relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 may include one or more of the following modifications labeled (a) - (u) (in addition to the potential modifications to the anticodon sequence, as discussed above) : (a) a G to A substitution at position 73 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 55, and SEQ ID NO: 56) ; (b) a C to U substitution at position 72 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, and SEQ ID NO: 36) ; (c) a G to C substitution at position 2 together with a U to G substitution at position 71 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, and SEQ ID NO: 36) ; or a G to A substitution at position 2 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 94, and SEQ ID NO: 95) ; (d) a U to C substitution at position 4 together with an A to G substitution at position 69 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, and SEQ ID NO: 36) ; (e) a C to G substitution at position 5 together with a G to U substitution at position 68 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 48 and SEQ ID NO: 49) ; or a C to G substitution at position 5 together with a G to C substitution at position 68 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 96, and SEQ ID NO: 97) ; (f) a C to G substitution at position 6 together with a G to C substitution at position 67 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 66, and SEQ ID NO: 67) , or a C to A substitution at position 6 together with a G to U substitution at position 67 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, and SEQ ID NO: 36) ; (g) a G to C substitution at position 12 together with a C to G substitution at position 23 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, and SEQ ID NO: 89) ; (h) a C to U substitution at position 13 together with a G to A substitution at position 22 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 57, and SEQ ID NO: 58) ; (i) an A to G substitution at position 26 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 90, and SEQ ID NO: 36) ; (j) a U to C substitution at position 27 together with an A to G substitution at position 43 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 46, and SEQ ID NO: 31) ; or an A to G substitution at position 43 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 67) ; (k) a U to C substitution at position 28 together with an A to G substitution at position 42 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 25) ; (l) a G to U substitution at position 29 together with a C to A substitution at position 41 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 30) ; (m) an A to C substitution at position 31 together with a U to G substitution at position 39 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 67) ; (n) an A to G substitution at position 37 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 36, and SEQ ID NO: 56) ; (o) a U to C substitution at position 40 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, and SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 67) ; (p) an A to G substitution at position 44 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 90) ; (q) a G to A substitution at position 46 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 57, and SEQ ID NO: 58) ; (r) a deletion of a U residue at position 47 (as in, e.g., SEQ ID NO: 17) ; (s) a C to G substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, and SEQ ID NO: 65) ; or a C to A substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65 (as in, e.g., SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 26) ; or a C to G substitution at position 49 together with a G to C substitution at position 65 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 45, and SEQ ID NO: 74) ; (t) a C to U substitution at position 50 together with a G to A substitution at position 64 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 58, and SEQ ID NO: 73) ; or a C to A substitution at position 50 together with a G to U substitution at position 64 (as in, e.g., SEQ ID NO: 44) ; (u) a G to A substitution at position 59 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 41, and SEQ ID NO: 79) ; wherein the nucleotide positions in the modifications labeled (a) - (u) are numbered by Sprinzl position.

[0100] The one or more modifications present in the engineered tRNAs provided herein (whether suppressor tRNAs or not) relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 may also include, alone or in combination with (a) - (u) above, one or more of the following modifications labeled (v) - (jjj) : (v) an A to G substitution at position 26 together with a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69 (as in, e.g., SEQ ID NO: 28) , (w) a C to U substitution at position 72 together with a C to A substitution at position 6, and a G to U substitution at position 67 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 71, and SEQ ID NO: 72) ; (x) an A to G substitution at position 26 together with a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to A substitution at position 6, a G to U substitution at position 67, and an A to G substitution at position 37 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 36) ; (y) an A to G substitution at position 26 together with a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to A substitution at position 6, a G to U substitution at position 67, and a U to C substitution at position 33 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 71) ; (z) an A to G substitution at position 26 together with a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to A substitution at position 6, a G to U substitution at position 67, and an A to G substitution at position 38 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 72) ; (aa) a U to A substitution at position 27 and an A to U substitution at position 43 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29) ; (bb) a U to A substitution at position 27 together with an A to U substitution at position 43, and a U to C substitution at position 40 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 28) ; (cc) a G to U substitution at position 29 together with a U to C substitution at position 40, a C to A substitution at position 41, and an A to G substitution at position 43 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 30) ; (dd) a U to C substitution at position 27 together with an A to G substitution at position 43, and a U to C substitution at position 40 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 31) ; (ee) a C to U substitution at position 50 and a G to A substitution at position 64 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 73) ; (ff) an A to U substitution at position 26 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 35) ; (gg) a C to G substitution at position 49 together with a C to G substitution at position 50, a G to U substitution at position 51, a C to A substitution at position 63, a G to C substitution at position 64, and a G to C substitution at position 65 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 74) ; (hh) a C to U substitution at position 32 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 32) ; (ii) an A to C substitution at position 38 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 33) ; (jj) an A to U substitution at position 38 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 34) ; (kk) a G to U substitution at position 51 and a C to G substitution at position 63 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 75) ; (ll) a G to C substitution at position 51 and a C to G substitution at position 63 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 76) ; (mm) a G to C substitution at position 59 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 77) ; (nn) a G to U substitution at position 59 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 78) ; (oo) a G to A substitution at position 57 and a G to A substitution at position 59 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 79) ; (pp) an A to G substitution at position 15 together with an A to U substitution in position 19; and a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 80) ; (qq) an A to G substitution at position 15 together with a nucleotide deletion at position 19; and a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 81) ; (rr) an A to G substitution at position 15 together with a nucleotide deletion at position 19; a U to G substitution at position 16, and a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 82) ; (ss) an A to G substitution at position 15 together with a G to C substitution at position 17, an A to G substitution at position 19; and a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 83) ; (tt) an A to G substitution at position 15 and a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 84 and SEQ ID NO: 85) ; (uu) an A to G substitution at position 15 together with an A to C substitution at position 19; and a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 85) ; (vv) an A to G substitution at position 15 together with an A to U substitution at position 19; a U to G substitution at position 20, and a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 86) ; (ww) a G to A substitution at position 9 together with a G to U substitution at position 12, and a C to A substitution at position 23 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 87) ; (xx) a G to U substitution at position 12 and a C to A substitution at position 23 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 88) ; (yy) a G to C substitution at position 12 together with a C to G substitution at position 13, a G to A substitution at position 22, and a C to G substitution at position 23 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 89) ; (zz) an A to G substitution at position 26 and an A to G substitution at position 44 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 90) ; (aaa) an A to G substitution at position 26 and an A to G substitution at position 44 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 90) ; (bbb) a G to U substitution at position 2 together with a C to U substitution at position 6, a G to A substitution at position 67, a U to A substitution at position 71, and a C to U substitution at position 72 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 91) ; (ccc) a C to U substitution at position 6 and a G to A substitution at position 67 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 92) ; (ddd) a C to G substitution at position 3 together with a U to C substitution at position 4, a C to A at substitution 6, a G to U substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, and a G to C substitution at substitution 70 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 93) ; (eee) a G to A substitution at position 2 together with a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 6, a G to U substitution at position 67, and A to G substitution at position 69 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 94) ; (fff) a G to A substitution at position 2 together with a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 5, a G to U substitution at position 68, an A to G substitution at position 69, and a C to U substitution at position 72 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 95) ; (ggg) a U to C substitution at position 4 together with a C to G substitution at position 5, a C to U substitution at position 6, a G to A substitution at position 67, a G to C substitution at position 68, and an A to G substitution at position 69 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 96) ; (hhh) a C to G substitution at position 3 together with a U to G substitution at position 4, a C to G substitution at position 5, a C to U substitution at position 6, a G to A substitution at position 7, a C to U substitution at position 66, a G to C substitution at position 68, an A to C substitution at position 69, a G to C substitution at position 70, and a U to C substitution at position 71 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 97) ; (iii) a G to U substitution at position 2 together with a C to U substitution at position 3, a G to A substitution at position 70, and a U to A substitution at position 71 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 98) ; and / or (jjj) a G to U substitution at position 2 together with a C to U substitution at position 6, a G to A substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, and a U to A substitution at position 71 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 99.

[0101] The one or more modifications present in the engineered tRNAs provided herein (whether suppressor tRNAs or not) relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 may also include, alone or in combination with (a) - (u) above, one or more of the following modifications labeled (v) - (rr) : (v) a G to U substitution at position 2 together with a U to A substitution at position 71 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 98, and SEQ ID NO: 99) ; or a U to C substitution at position 71 (as in, e.g., SEQ ID NO: 97) ; (w) a C to U substitution at position 3 together with a G to A substitution at position 70 (as in, e.g., SEQ ID NO: 98) ; or a C to G substitution at position 3 together with a G to C substitution at position 70 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 93, and SEQ ID NO: 97) ; (x) a U to G substitution at position 4 together with an A to C substitution at position 69 (as in, e.g., SEQ ID NO: 97) ; or an A to G substitution at position 69 (as in, e.g., SEQ ID NO: 99) ; (y) a C to A substitution at position 5 together with a G to U substitution at position 68 (as in, e.g., SEQ ID NO: 95) ; (z) a C to U substitution at position 6 together with a G to A substitution at position 67 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 96, and SEQ ID NO: 99) ; or a C to U substitution at position 6 (as in, e.g., SEQ ID NO: 97) ; (aa) a G to A substitution at position 7 together with a C to U substitution at position 66 (as in, e.g., SEQ ID NO: 97) ; (bb) a G to A substitution at position 9 (as in, e.g., SEQ ID NO: 87) ; (cc) a G to U substitution at position 12 together with a C to A substitution at position 23 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 87, and SEQ ID NO: 88) ; (dd) a C to G substitution at position 13 together with a G to A substitution at position 22 (as in, e.g., SEQ ID NO: 89) ; (ee) an A to G substitution at position 15 together with a U to C substitution at position 48 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, and SEQ ID NO: 86) ; (ff) a U to G substitution at position 16 (as in, e.g., SEQ ID NO: 82) ; (gg) a G to C substitution at position 17 (as in, e.g., SEQ ID NO: 83) ; (hh) an A to U substitution in position 19 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 80, and SEQ ID NO: 86) ; or an A to G substitution at position 19 (as in, e.g., SEQ ID NO: 83) ; or an A to C substitution at position 19 (as in, e.g., SEQ ID NO: 85) ; or a nucleotide deletion at position 19 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 81, and SEQ ID NO: 82) ; (ii) a U to G substitution at position 20 (as in, e.g., SEQ ID NO: 86) ; (jj) an A to U substitution at position 26 (as in, e.g., SEQ ID NO: 35) ; (kk) a U to A substitution at position 27 together with an A to U substitution at position 43 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 28, and SEQ ID NO: 29) ; (ll) a C to U substitution at position 32 (as in, e.g., SEQ ID NO: 32) ; (mm) a U to C substitution at position 33 (as in, e.g., SEQ ID NO: 71) ; (nn) an A to C substitution at position 38 (as in, e.g., SEQ ID NO: 33) ; or an A to G substitution at position 38 (as in, e.g., SEQ ID NO: 72) ; or an A to U substitution at position 38 (as in, e.g., SEQ ID NO: 34) ; (oo) a C to G substitution at position 50 together with a G to C substitution at position 64 (as in, e.g., SEQ ID NO: 74) ; (pp) a G to U substitution at position 51 together with a C to A substitution at position 63 (as in, e.g., SEQ ID NO: 74) ; or a G to U substitution at position 51 together with a C to G substitution at position 63 (as in, e.g., SEQ ID NO: 75) ; or a G to C substitution at position 51 together with a C to G substitution at position 63 (as in, e.g., SEQ ID NO: 76) ; (qq) a G to A substitution at position 57 (as in, e.g., SEQ ID NO: 79) ; (rr) a G to C substitution at position 59 (as in, e.g., SEQ ID NO: 77) ; or a G to U substitution at position 59 (as in, e.g., SEQ ID NO: 78) ; wherein the nucleotide positions in the modifications labeled (v) - (rr) are numbered by Sprinzl position.

[0102] The present invention further provides engineered tRNAs for carrying arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2 (native human Arg-CCT-4-1) . Exemplary anticodon sequences that may be present in the engineered tRNAs provided herein are anticodons recognizing a stop codon or anticodons recognizing an arginine codon, such as, for example, 5’ -UCA-3’ (which recognizes a TGA / UGA stop codon) , 5’ -CUA-3’ (which recognizes a TAG / UAG stop codon) , 5’ -UUA-3’ (which recognizes a TAA / UAA stop codon) , 5’ -ACG-3’ (which recognizes a CGT / CGU arginine codon) , 5’ -CCG-3’ (which recognizes a CGG arginine codon) , 5’ -UCG-3’ (which recognizes a CGA arginine codon) , 5’ -GCG-3’ (recognizing a CGC arginine codon) , 5’ -CCU-3’ (which recognizes an AGG arginine codon) , and 5’ -UCU-3’ (which recognizes an AGA arginine codon) at position 34-36 of the tRNA; wherein the nucleotide positions of the anticodon are numbered by Sprinzl position. The engineered tRNAs provided herein may be engineered suppressor tRNAs, in which case they comprise an anticodon that recognizes a stop codon (such as, e.g., 5’ -UCA-3’ ) , or may alternatively comprise an anticodon that recognizes a non-stop codon (such as, e.g., 5’ -CCU-3’ , which recognizes an AGG arginine codon) . The one or more modifications present in the engineered tRNAs provided herein (whether suppressor tRNAs or not) relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2 may include one or more of the following modifications labeled (a) - (r) (in addition to the potential modifications to the anticodon sequence, as discussed above) : (a) an A to G substitution at position 26 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 116 and SEQ ID NO: 117) ; (b) an A to G substitution at position 26 together with a G to A substitution at position 44 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 117) ; (c) a C to U substitution at position 4 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 125 and SEQ ID NO: 126) ; (d) a C to U substitution at position 4 together with a G to A substitution at position 69 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 125) ; (e) a G to A substitution at position 73 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 118) ; (f) a C to G substitution at position 5 together with a G to U substitution at position 68 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 127) ; (g) a G to A substitution at position 49 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 121) ; (h) a U to A substitution at position 50 together with an A to U substitution at position 64 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 120) ; (i) an A to G substitution at position 6 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 122 and SEQ ID NO: 123) ; (j) an A to G substitution at position 6 together with a U to C substitution at position 67 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 123) ; (k) an A to C substitution at position 6 together with a U to G substitution at position 67 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 124) ; (l) a U to C substitution at position 50 together with an A to G substitution at position 64 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 119) ; (m) an A to G substitution at position 22 together with an A to G substitution at position 46 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 114 and SEQ ID NO: 115) ; (n) an A to G substitution at position 22 together with an A to G substitution at position 46 and a G to A substitution at position 44 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 115) ; (o) an A to G substitution at position 15 together with a U to C substitution at position 48 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 113) ; (p) an A to G substitution at position 37 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 128) ; (q) a G to A substitution at position 9 together with a C to U substitution at position 12, a U to C substitution at position 13, an A to G substitution at position 22, and a G to A substitution at position 23 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 112) ; and (r) a C to G substitution at position 12 together with a U to C substitution at position 13, an A to G substitution at position 22, and a G to C substitution at position 23 (such as, for example, an engineered tRNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 111) , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.

[0103] The one or more modifications present in the engineered tRNAs provided herein (whether suppressor tRNAs or not) relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2 may include one or more of the following modifications labeled (a) - (n) (in addition to the potential modifications to the anticodon sequence, as discussed above) : (a) a G to A substitution at position 73 (as in, e.g., SEQ ID NO: 118) ; (b) a C to U substitution at position 4 together with a G to A substitution at position 69 (as in, e.g., SEQ ID NO: 125) ; or a C to U substitution at position 4 (as in, e.g., SEQ ID NO: 126) ; (c) a C to G substitution at position 5 together with a G to U substitution at position 68 (as in, e.g., SEQ ID NO: 127) ; (d) an A to G substitution at position 6 (as in, e.g., SEQ ID NO: 122) ; or an A to G substitution at position 6 together with a U to C substitution at position 67 (as in, e.g., SEQ ID NO: 123) ; or an A to C substitution at position 6 together with a U to G substitution at position 67 (as in, e.g., SEQ ID NO: 124) ; (e) a G to A substitution at position 9 (as in, e.g., SEQ ID NO: 112) ; (f) a C to G substitution at position 12 together with a G to C substitution at position 23 (as in, e.g., SEQ ID NO: 111) ; or a C to U substitution at position 12 together with a G to A substitution at position 23 (as in, e.g., SEQ ID NO: 112) ; (g) a U to C substitution at position 13 together with an A to G substitution at position 22 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 111, and SEQ ID NO: 112) ; (h) an A to G substitution at position 15 together with a U to C substitution at position 48 (as in, e.g., SEQ ID NO: 113) ; (i) an A to G substitution at position 22 together with an A to G substitution at position 46 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 114, and SEQ ID NO: 115) ; (j) an A to G substitution at position 26 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 116, and SEQ ID NO: 117) ; (k) an A to G substitution at position 37 (as in, e.g., SEQ ID NO: 128) ; (l) a G to A substitution at position 44 (as in, e.g., any of SEQ ID NO: 115, and SEQ ID NO: 117) ; (m) a G to A substitution at position 49 (as in, e.g., SEQ ID NO: 121) ; and / or (n) a U to C substitution at position 50 together with an A to G substitution at position 64 (as in, e.g., SEQ ID NO: 119) ; or a U to A substitution at position 50 together with an A to U substitution at position 64 (as in, e.g., SEQ ID NO: 120) ; wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.

[0104] In some embodiments, the engineered tRNAs have a CCA sequence attached to the acceptor arm at the 3’ end (e.g., introduced through a nucleic acid encoding the engineered tRNA or in an isolated tRNA, or added post-transcriptionally) .

[0105] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a G residue at position 26, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise an A to G substitution at position 26, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M18” or “147R3M18” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 18, as shown in, for example, FIG. 1E. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 18, as shown in, for example, FIG. 1E. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 18 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0106] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 2, a C residue at position 4, a G residue at position 6, a C residue at position 67, a G residue at position 69, a G residue at position 71, and a U residue at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to G substitution at position 6, a G to C substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, a U to G substitution at position 71, and a C to U substitution at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M19” or “147R3M19” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 19, as shown in, for example, FIG. 1F. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 19, as shown in, for example, FIG. 1F. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 19 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0107] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 2, a C residue at position 4, an A residue at position 6, a U residue at position 67, a G residue at position 69, a G residue at position 71, and a U residue at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 6, a G to U substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, a U to G substitution at position 71, and a C to U substitution at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M20” or “147R3M20” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 20, as shown in, for example, FIG. 1G. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 20, as shown in, for example, FIG. 1G. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 20 and includes a CCA tail at its 3’ end.

[0108] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 4, a G residue at position 5, a C residue at position 68, and a G residue at position 69, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a U to C substitution at position 4, a C to G substitution at position 5, a G to C substitution at position 68, and an A to G substitution at position 69, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M21” or “147R3M21” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85%(e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 21, as shown in, for example, FIG. 1H. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 21, as shown in, for example, FIG. 1H. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 21 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0109] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 28, a U residue at position 29, a C residue at position 40, an A residue at position 41, and a G residue at position 42, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a U to C substitution at position 28, a G to U substitution at position 29, a U to C substitution at position 40, a C to A substitution at position 41, and an A to G substitution at position 42, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M22” or “147R3M22” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 22, as shown in, for example, FIG. 1I. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 22, as shown in, for example, FIG. 1I. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 22 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0110] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 31, a G residue at position 39, a C residue at position 40, and a G residue at position 43, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, a U to C substitution at position 40, and an A to G substitution at position 43, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M23” or “147R3M23” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, an engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85%(e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 23, as shown in, for example, FIG. 1J. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 23, as shown in, for example, FIG. 1J. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 23 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0111] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 28, a U residue at position 29, a C residue at position 40, an A residue at position 41, a G residue at position 42, a G residue at position 49, a U residue at position 50, an A residue at position 64, and a C residue at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a U to C substitution at position 28, a G to U substitution at position 29, a U to C substitution at position 40, a C to A substitution at position 41, an A to G substitution at position 42, a C to G substitution at position 49, a C to U substitution at position 50, a G to A substitution at position 64, and a G to C substitution at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M24” or “147R3M24” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 24, as shown in, for example, FIG. 1K. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 24, as shown in, for example, FIG. 1K. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 24 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0112] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 28, a U residue at position 29, a C residue at position 40, an A residue at position 41, a G residue at position 42, an A residue at position 49, and a U residue at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a U to C substitution at position 28, a G to U substitution at position 29, a U to C substitution at position 40, a C to A substitution at position 41, an A to G substitution at position 42, a C to A substitution at position 49, and a G to U substitution at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M25” or “147R3M25” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 25, as shown in, for example, FIG. 1L. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 25, as shown in, for example, FIG. 1L. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 25 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0113] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 31, a G residue at position 39, a C residue at position 40, a G residue at position 43, an A residue at position 49, and a U residue at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, a U to C substitution at position 40, an A to G substitution at position 43, a C to A substitution at position 49, and a G to U substitution at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M26” or “147R3M26” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, an engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 26, as shown in, for example, FIG. 1M. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 26, as shown in, for example, FIG. 1M. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 26 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0114] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises an A residue at position 73, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to A substitution at position 73, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M27” or “147R3M27” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85%(e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 27, as shown in, for example, FIG. 1N. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 27, as shown in, for example, FIG. 1N. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 27 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0115] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises an A residue at position 59, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to A substitution at position 59, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M41” or “147R3M41” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85%(e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 41, as shown in, for example, FIG. 1O. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 41, as shown in, for example, FIG. 1O. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 41 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0116] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a G residue at position 49 and a U residue at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a C to G substitution at position 49 and a G to U substitution at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M42” or “147R3M42” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 42. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 42. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 42. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 42, as shown in, for example, FIG. 1P. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 42, as shown in, for example, FIG. 1P. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 42 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0117] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a G residue at position 49, a U residue at position 50, an A residue at position 64, and a U residue at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a C to G substitution at position 49, a C to U substitution at position 50, a G to A substitution at position 64, and a G to U substitution at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M43” or “147R3M43” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85%(e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 43. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 43. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 43, as shown in, for example, FIG. 1Q. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 43, as shown in, for example, FIG. 1Q. In some embodiments, the engineered tRNA comprises of the sequence set forth in SEQ ID NO: 43 and a CCA tail at its 3' end.

[0118] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a G residue at position 49, an A residue at position 50, a U residue at position 64, and a U residue at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a C to G substitution at position 49, a C to A substitution at position 50, a G to U substitution at position 64, and a G to U substitution at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M44” or “147R3M44” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85%(e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 44. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 44. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 44. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 44, as shown in, for example, FIG. 1R. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 44, as shown in, for example, FIG. 1R. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 44 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0119] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a G residue at position 49, a U residue at position 50, an A residue at position 64, and a C residue at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a C to G substitution at position 49, a C to U substitution at position 50, a G to A substitution at position 64, and a G to C substitution at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M45” or “147R3M45” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85%(e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 45. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 45. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 45, as shown in, for example, FIG. 1S. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 45, as shown in, for example, FIG. 1S. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 45 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0120] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 27, a C residue at position 31, a G residue at position 39, a C residue at position 40, and a G residue at position 43, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a U to C substitution at position 27, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, a U to C substitution at position 40, and an A to G substitution at position 43, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M46” or “147R3M46” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 46. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 46. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 46. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 46, as shown in, for example, FIG. 1T. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 46, as shown in, for example, FIG. 1T. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 46 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0121] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 12, a U residue at position 13, an A residue at position 22, a G residue at position 23, and an A residue at position 46, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 12, a C to U substitution at position 13, a G to A substitution at position 22, a C to G substitution at position 23, and a G to A substitution at position 46, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M47” or “147R3M47” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 47. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 47. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 47. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 47, as shown in, for example, FIG. 1U. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 47, as shown in, for example, FIG. 1U. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 47 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0122] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 4, a G residue at position 5, a U residue at position 68, and a G residue at position 69, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a U to C substitution at position 4, a C to G substitution at position 5, a G to U substitution at position 68, and an A to G substitution at position 69, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M48” or “147R3M48” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85%(e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 48. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 48. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 48. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 48, as shown in, for example, FIG. 1V. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 48, as shown in, for example, FIG. 1V. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 48 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0123] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises an A residue at position 2, a C residue at position 4, a G residue at position 5, a U residue at position 68, and a G residue at position 69, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to A substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to G substitution at position 5, a G to U substitution at position 68, and an A to G substitution at position 69, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M49” or “147R3M49” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 49. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 49. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 49. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 49, as shown in, for example, FIG. 1W. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 49, as shown in, for example, FIG. 1W. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 49 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0124] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 31, a G residue at position 39, a C residue at position 40, a G residue at position 43, and a G residue at position 44, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, a U to C substitution at position 40, an A to G substitution at position 43, and an A to G substitution at position 44, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M50” or “147R3M50” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 50. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 50. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 50. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 50, as shown in, for example, FIG. 1X. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 50, as shown in, for example, FIG. 1X. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 50 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0125] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 12, a U residue at position 13, an A residue at position 22, a G residue at position 23, an A residue at position 46, a G residue at position 49, a U residue at position 50, an A residue at position 64, and a U residue at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 12, a C to U substitution at position 13, a G to A substitution at position 22, a C to G substitution at position 23, a G to A substitution at position 46, a C to G substitution at position 49, a C to U substitution at position 50, a G to A substitution at position 64, and a G to U substitution at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M51” or “147R3M51” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 51. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 51. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 51. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 51, as shown in, for example, FIG. 1Y. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 51, as shown in, for example, FIG. 1Y. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 51 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0126] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 2, a C residue at position 4, an A residue at position 6, a U residue at position 67, a G residue at position 69, a G residue at position 71, a U residue at position 72, and an A residue at position 73, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 6, a G to U substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, a U to G substitution at position 71, a C to U substitution at position 72, and a G to A substitution at position 73, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M52” or “147R3M52” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 52. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 52. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 52. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 52, as shown in, for example, FIG. 1Z. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 52, as shown in, for example, FIG. 1Z. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 52 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0127] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 2, a C residue at position 4, an A residue at position 6, a G residue at position 26, a U residue at position 67, a G residue at position 69, a G residue at position 71, and a U residue at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 6, an A to G substitution at position 26, a G to U substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, a U to G substitution at position 71, and a C to U substitution at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M53” or “147R3M53” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 53. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 53. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 53. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 53, as shown in, for example, FIG. 1AA. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 53, as shown in, for example, FIG. 1AA. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 53 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0128] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 2, a C residue at position 4, an A residue at position 6, a C residue at position 31, a G residue at position 39, a C residue at position 40, a G residue at position 43, a U residue at position 67, a G residue at position 69, a G residue at position 71, and a U residue at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 6, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, a U to C substitution at position 40, an A to G substitution at position 43, a G to U substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, a U to G substitution at position 71, and a C to U substitution at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M54” or “147R3M54” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85%(e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 54. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 54. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 54. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 54, as shown in, for example, FIG. 1BB. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 54, as shown in, for example, FIG. 1BB. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 54 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0129] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 2, a C residue at position 4, an A residue at position 6, a C residue at position 31, a G residue at position 39, a C residue at position 40, a G residue at position 43, a U residue at position 67, a G residue at position 69, a G residue at position 71, a U residue at position 72, and an A residue at position 73, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 6, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, a U to C substitution at position 40, an A to G substitution at position 43, a G to U substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, a U to G substitution at position 71, a C to U substitution at position 72, and a G to A substitution at position 73, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M55” or “147R3M55” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 55. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 55. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 55. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 55, as shown in, for example, FIG. 1CC. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 55, as shown in, for example, FIG. 1CC. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 55 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0130] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 2, a C residue at position 4, an A residue at position 6, a G residue at position 37, a U residue at position 67, a G residue at position 69, a G residue at position 71, a U residue at position 72, and an A residue at position 73, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 6, an A to G substitution at position 37, a G to U substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, a U to G substitution at position 71, a C to U substitution at position 72, and a G to A substitution at position 73, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M56” or “147R3M56” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 56. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 56. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 56. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 56, as shown in, for example, FIG. 1DD. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 56, as shown in, for example, FIG. 1DD. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 56 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0131] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 12, a U residue at position 13, an A residue at position 22, a G residue at position 23, a C residue at position 31, a G residue at position 39, a C residue at position 40, a G residue at position 43, and an A residue at position 46, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 12, a C to U substitution at position 13, a G to A substitution at position 22, a C to G substitution at position 23, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, a U to C substitution at position 40, an A to G substitution at position 43, and a G to A substitution at position 46, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M57” or “147R3M57” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 57. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 57. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 57. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 57, as shown in, for example, FIG. 1EE. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 57, as shown in, for example, FIG. 1EE. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 57 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0132] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 12, a U residue at position 13, an A residue at position 22, a G residue at position 23, a C residue at position 31, a G residue at position 39, a C residue at position 40, a G residue at position 43, an A residue at position 46, a G residue at position 49, a U residue at position 50, an A residue at position 64, and a U residue at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 12, a C to U substitution at position 13, a G to A substitution at position 22, a C to G substitution at position 23, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, a U to C substitution at position 40, an A to G substitution at position 43, a G to A substitution at position 46, a C to G substitution at position 49, a C to U substitution at position 50, a G to A substitution at position 64, and a G to U substitution at position 65, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M58” or “147R3M58” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 58. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 58. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 58. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 58, as shown in, for example, FIG. 1FF. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 58, as shown in, for example, FIG. 1FF. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 58 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0133] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 2, a C residue at position 4, an A residue at position 6, a G residue at position 26, a C residue at position 31, a G residue at position 39, a C residue at position 40, a G residue at position 43, a U residue at position 67, a G residue at position 69, a G residue at position 71, and a U residue at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 6, an A to G substitution at position 26, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, a U to C substitution at position 40, an A to G substitution at position 43, a G to U substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, a U to G substitution at position 71, and a C to U substitution at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M59” or “147R3M59” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 59. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 59. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 59. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 59, as shown in, for example, FIG. 1GG. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 59, as shown in, for example, FIG. 1GG. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 59 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0134] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 2, a C residue at position 4, an A residue at position 6, a G residue at position 26, a G residue at position 49, a U residue at position 65, a U residue at position 67, a G residue at position 69, a G residue at position 71, and a U residue at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 6, an A to G substitution at position 26, a C to G substitution at position 49, a G to U substitution at position 65, a G to U substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, a U to G substitution at position 71, and a C to U substitution at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M60” or “147R3M60” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85%(e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 60. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 60. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 60. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 60, as shown in, for example, FIG. 1HH. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 60, as shown in, for example, FIG. 1HH. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 60 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0135] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 2, a C residue at position 4, an A residue at position 6, a G residue at position 26, a G residue at position 44, a U residue at position 67, a G residue at position 69, a G residue at position 71, and a U residue at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 6, an A to G substitution at position 26, an A to G substitution at position 44, a G to U substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, a U to G substitution at position 71, and a C to U substitution at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M61” or “147R3M61” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 61. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 61. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 61. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 61, as shown in, for example, FIG. 1II. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 61, as shown in, for example, FIG. 1II. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 61 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0136] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 2, a C residue at position 4, an A residue at position 6, a C residue at position 31, a G residue at position 39, a C residue at position 40, a G residue at position 43, a G residue at position 44, a U residue at position 67, a G residue at position 69, a G residue at position 71, and a U residue at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 6, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, a U to C substitution at position 40, an A to G substitution at position 43, an A to G substitution at position 44, a G to U substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, a U to G substitution at position 71, and a C to U substitution at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M62” or “147R3M62” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85% (e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 62. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 62. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 62. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 62, as shown in, for example, FIG. 1JJ. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 62, as shown in, for example, FIG. 1JJ. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 62 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0137] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 2, a C residue at position 4, an A residue at position 6, a G residue at position 26, a C residue at position 31, a G residue at position 39, a C residue at position 40, a G residue at position 43, a G residue at position 49, a U residue at position 65, a U residue at position 67, a G residue at position 69, a G residue at position 71, and a U residue at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 6, an A to G substitution at position 26, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, a U to C substitution at position 40, an A to G substitution at position 43, a C to G substitution at position 49, a G to U substitution at position 65, a G to U substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, a U to G substitution at position 71, and a C to U substitution at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M63” or “147R3M63” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG-3’ , 5’ -CCG-3’ , 5’ -UCG-3’ , 5’ -GCG-3’ , 5’ -CCU-3’ , or 5’ -UCU-3’ , wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UUA-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -ACG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -GCG-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -CCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA comprises an anticodon having the sequence 5’ -UCU-3’ . In some embodiments, the engineered tRNA has a nucleotide sequence that is at least about 85%(e.g., at least about 87%, at least about 90%, at least about 92%, at least about 95%, at least about 99%, or at least about 100%) identical to SEQ ID NO: 63. In some embodiments, the engineered tRNA contains no more than 5 (such as no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1, or 0) nucleotide substitutions relative to SEQ ID NO: 63. In some embodiments, the engineered tRNA comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 63. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 63, as shown in, for example, FIG. 1KK. In some embodiments, the engineered pre-tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 63, as shown in, for example, FIG. 1KK. In some embodiments, the engineered tRNA consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 63 and includes a CCA tail at its 3' end.

[0138] In some embodiments, there is provided an engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises a C residue at position 2, a C residue at position 4, an A residue at position 6, a G residue at position 26, a G residue at position 44, a G residue at position 49, a U residue at position 65, a U residue at position 67, a G residue at position 69, a G residue at position 71, and a U residue at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. In some embodiments, there is provided engineered tRNA for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region, wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anticodon, wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 (Arg-TCT-1-1) , and wherein the one or more modifications comprise a G to C substitution at position 2, a U to C substitution at position 4, a C to A substitution at position 6, an A to G substitution at position 26, an A to G substitution at position 44, a C to G substitution at position 49, a G to U substitution at position 65, a G to U substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, a U to G substitution at position 71, and a C to U substitution at position 72, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position. Engineered tRNAs including such modifications, and / or constructs comprising / expressing the engineered tRNAs including such modifications, may be referred to as, for example, “M64” or “147R3M64” or the like. In some embodiments, the engineered tRNA further comprises an anticodon substitution at positions 34-36, wherein the anticodon has the sequence 5’ -UCA-3’ , 5’ -CUA-3’ , 5’ -UUA-3’ , 5’ -ACG...

Claims

1. An engineered transfer RNA (tRNA) for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region,wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anti-codon,wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1, andwherein the one or more modifications comprise:(a) a G to A substitution at position 73;(b) a C to U substitution at position 72;(c) a G to C substitution at position 2 together with a U to G substitution at position 71;(d) a U to C substitution at position 4 together with an A to G substitution at position 69;(e) a C to G substitution at position 5 together with a G to U substitution at position 68;(f) a C to G substitution at position 6 together with a G to C substitution at position 67; or a C to A substitution at position 6 together with a G to U substitution at position 67;(g) an A to G substitution at position 26;(h) an A to G substitution at position 43;(i) an A to C substitution at position 31 together with a U to G substitution at position 39;(j) a U to C substitution at position 40;(k) an A to G substitution at position 44;(l) a C to G substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65; or a C to A substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65;(m) a G to U substitution at position 2 together with a U to A substitution at position 71;(n) an A to G substitution at position 69;(o) a C to U substitution at position 6 together with a G to A substitution at position 67;(p) a U to A substitution at position 27 together with an A to U substitution at position 43;(q) an A to G substitution at position 37;(r) a G to U substitution at position 12 together with a C to A substitution at position 23;(s) a G to A substitution at position 9;(t) an A to U substitution at position 26; and / or(u) a G to C substitution at position 59;wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.2.An engineered transfer RNA (tRNA) for carrying an arginine, comprising an acceptor arm, a D-arm, a T-arm, an anticodon arm, and a variable region,wherein the anticodon-arm comprises a tri-nucleotide anti-codon,wherein the engineered tRNA comprises one or more modifications relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2, andwherein the one or more modifications comprise:(a) an A to G substitution at position 6 together with a U to C substitution at position 67; or an A to C substitution at position 6 together with a U to G substitution at position 67;(b) a G to A substitution at position 9;(c) a C to U substitution at position 12 together with a G to A substitution at position 23;(d) a U to C substitution at position 13 together with an A to G substitution at position 22;(e) an A to G substitution at position 22 together with an A to G substitution at position 46;(f) an A to G substitution at position 26;(g) a G to A substitution at position 44; and / or(h) a U to C substitution at position 50 together with an A to G substitution at position 64;wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.3.The engineered tRNA of claim 1 or claim 2, wherein the anticodon is substituted with 5’-UCA-3’ and recognizes a TGA / UGA stop codon.4.The engineered tRNA of claim 1 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to G substitution at position 6, and a G to C substitution at position 67,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.5.The engineered tRNA of claim 1 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises a G to C substitution at position 2, a U to G substitution at position 71, a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to U substitution at position 72, a C to A substitution at position 6, and a G to U substitution at position 67,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.6.The engineered tRNA of claim 1 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises an A to G substitution at position 26,wherein the substitution is relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.7.The engineered tRNA of claim 1 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises an A to G substitution at position 43, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, and a U to C substitution at position 40,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.8.The engineered tRNA of claim 1 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises an A to G substitution at position 44,wherein the substitution is relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.9.The engineered tRNA of claim 1 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises a C to G substitution at position 49, and a G to U substitution at position 65,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.10.The engineered tRNA of claim 4, wherein the engineered tRNA further comprises an A to G substitution at position 26,wherein the substitution is relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.11.The engineered tRNA of claim 5, wherein the engineered tRNA further comprises an A to G substitution at position 26,wherein the substitution is relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.12.The engineered tRNA of claim 4, wherein the engineered tRNA further comprises an A to G substitution at position 43, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, and a U to C substitution at position 40,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.13.The engineered tRNA of claim 5, wherein the engineered tRNA further comprises an A to G substitution at position 43, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, and a U to C substitution at position 40,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.14.The engineered tRNA of claim 11, wherein the engineered tRNA further comprises a C to G substitution at position 49 and a G to U substitution at position 65,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.15.The engineered tRNA of claim 11, wherein the engineered tRNA further comprises an A to G substitution at position 44,wherein the substitution is relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.16.The engineered tRNA of claim 13, wherein the engineered tRNA further comprises an A to G substitution at position 26,wherein the substitution is relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.17.The engineered tRNA of claim 13, wherein the engineered tRNA further comprises an A to G substitution at position 44,wherein the substitution is relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.18.The engineered tRNA of claim 16, wherein the engineered tRNA further comprises a C to G substitution at position 49 and a G to U substitution at position 65,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.19.The engineered tRNA of claim 14, wherein the engineered tRNA further comprises an A to G substitution at position 44,wherein the substitution is relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.20.The engineered tRNA of claim 18, wherein the engineered tRNA further comprises an A to G substitution at position 44,wherein the substitution is relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.21.The engineered tRNA of claim 5, wherein the engineered tRNA further comprises a G to A substitution at position 73,wherein the substitution is relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.22.The engineered tRNA of claim 21, wherein the engineered tRNA further comprises an A to G substitution at position 43, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39 and a U to C substitution at position 40,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.23.The engineered tRNA of claim 7, wherein the engineered tRNA further comprises a C to A substitution at position 49 and a G to U substitution at position 65,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.24.The engineered tRNA of claim 1 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises a U to C substitution at position 4, an A to G substitution at position 69, a C to G substitution at position 5, and a G to U substitution at position 68,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.25.The engineered tRNA of claim 1 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises a G to A substitution at position 73,wherein the substitution is relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.26.The engineered tRNA of claim 10, wherein the engineered tRNA further comprises:a. a C to G substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65, and / orb. an A to G substitution at position 44,wherein the substitution (s) are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.27.The engineered tRNA of claim 12, wherein the engineered tRNA further comprises:a. an A to G substitution at position 26; and / orb. an A to G substitution at position 44;wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position; optionally wherein the engineered tRNA further comprisesc. a C to G substitution at position 49 together with a G to U substitution at position 65,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.28.The engineered tRNA of claim 4, wherein the engineered tRNA further comprisesa. a G to A substitution at position 73, wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position; optionally wherein the engineered tRNA further comprisesb. an A to G substitution at position 43, an A to C substitution at position 31, a U to G substitution at position 39, and a U to C substitution at position 40,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.29.The engineered tRNA of claim 6, wherein the engineered tRNA further comprises an A to G substitution at position 44,wherein the substitution is relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.30.The engineered tRNA of claim 1 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises a G to A substitution at position 9, a G to U substitution at position 12, a C to A substitution at position 23,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.31.The engineered tRNA of claim 1 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises a G to U substitution at position 2, a C to U substitution at position 6, a G to A substitution at position 67, an A to G substitution at position 69, a U to A substitution at position 71,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.32.The engineered tRNA of claim 1 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises a U to A substitution at position 27, an A to U substitution at position 43,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 1,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.33.The engineered tRNA of claim 2 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises a G to A substitution at position 9, a C to U substitution at position 12, a U to C substitution at position 13, an A to G substitution at position 22, a G to A substitution at position 23,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.34.The engineered tRNA of claim 2 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises an A to G substitution at position 22, an A to G substitution at position 46,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position; optionally wherein the engineered tRNA further comprises a G to A substitution at position 44,wherein the substitution is relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.35.The engineered tRNA of claim 2 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises an A to G substitution at position 26,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.36.The engineered tRNA of claim 2 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprises a U to C substitution at position 50, an A to G substitution at position 64,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.37.The engineered tRNA of claim 2 or claim 3, wherein the engineered tRNA comprisesa. an A to G substitution at position 6, a U to C substitution at position 67,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position; optionally wherein the engineered tRNA further comprisesb. an A to C substitution at position 6, a U to G substitution at position 67,wherein the substitutions are relative to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 2,wherein the nucleotide positions are numbered by Sprinzl position.38.The engineered tRNA of any one of claims 1-3, wherein the engineered tRNA comprises a nucleic acid sequence at least 85%identical to a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:

75. SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, and SEQ ID NO: 164 .39.The engineered tRNA of any one of claims 1-3, wherein the engineered tRNA comprises a nucleic acid sequence containing no more than about 5 nucleotide differences relative to a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:

75. SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, and SEQ ID NO: 165.40.An engineered tRNA comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:

75. SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, and SEQ ID NO: 165.41.The engineered tRNA of any one of claims 1-40, wherein the engineered tRNA exhibits an increased quality and / or quantity as compared to a tRNA having the sequence ofSEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 100;SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 101; orSEQ ID NO: 133 or SEQ ID NO: 151.42.The engineered tRNA of claim 41, wherein the quantity is determined by tRNA sequencing, quantitative PCR or fluorescence in situ hybridization.43.The engineered tRNA of claim 41, wherein the engineered tRNA is a suppressor tRNA with the increased quality and / or quantity as compared to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, or SEQ ID NO: 151, wherein the increased quality and / or quantity is determined by PTC readthrough efficiency.44.The engineered tRNA of claim 43, wherein the PTC readthrough capability is determined by a NanoLuc luciferase assay, RT-qPCR, Western Blot, immunoprecipitation, mass spectrometry, and / or immunofluorescence.45.A nucleic acid encoding the engineered tRNA of any one of claims 1-44.46.A vector comprising the nucleic acid of claim 45.47.The vector of claim 46, wherein the vector is a viral vector or a plasmid.48.The vector of claim 47, wherein the vector is a viral vector, and wherein the viral vector is an adenoviral vector, an adeno-associated viral (AAV) vector, or a lentiviral vector.49.The vector of claim 48, wherein the vector is an AAV 2 / 2 vector, an AAV 2 / 5 vector, an AAV 2 / 6 vector, an AAV 2 / 7 vector, an AAV2 / 8 vector, an AAV 2 / 9 vector, or a recombinant AAV (rAAV) vector.50.A pharmaceutical composition comprising the engineered tRNA of any one of claims 1-44, the nucleic acid of claim 45, or the vector of any one of claims 46-49, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.51.The pharmaceutical composition of claim 50, wherein the pharmaceutically acceptable carrier is a liposome or a lipid nanoparticle.52.A method of restoring translation of a coding nucleic acid of interest containing a premature TGA / UGA stop codon in a cell, comprising introducing to the cell the engineered tRNA of any one of claims 1-44, the nucleic acid of claim 45, or the vector of any one of claims 46-49, wherein the engineered tRNA introduced into the cell or produced from the nucleic acid or vector recognizes and reads through the premature TGA / UGA stop codon, thereby stabilizing the PTC containing mRNA and restoring translation of the coding nucleic acid of interest containing the premature TGA / UGA stop codon.53.The method of claim 52, wherein the engineered tRNA restores at least 5%of the translation of the coding nucleic acid of interest containing a premature TGA / UGA stop codon relative to a corresponding coding nucleic acid not containing the premature TGA / UGA stop codon.54.The method of claim 52, wherein the engineered tRNA restores at least 50%of the coding mRNA of interest containing a premature TGA / UGA stop codon relative to a corresponding coding mRNA not containing the premature TGA / UGA stop codon.55.A method of treating a disease associated with a premature TGA / UGA stop codon in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 50 or 51.56.The method of claim 55, wherein the premature stop-codon-associated disease is cystic fibrosis, muscular dystrophy, Alport syndrome, Stargardt disease, dilated cardiomyopathy, Rett syndrome, Mucopolysaccharidosis type II, Hurler syndrome, Hunter syndrome, β-thalassemia, Leber’s congenital amaurosis (LCA) , or Liddle’s syndrome.57.The method of claim 55 or 56, wherein the individual is human.58.The engineered tRNA of any one of claims 1-44, wherein the engineered tRNA exhibits increased PTC readthrough efficiency in vivo as compared to a tRNA having the sequence of SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, or SEQ ID NO: 151.

Images