Modified dsrna molecules

Abstract

Provided is a dsRNA. The dsRNA comprises a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises a specific modification pattern.

Description

MODIFIED DSRNA MOLECULESFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present invention is directed to the field of dsRNA and RNA interfering.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] It is effective to improve the activity and stability of siRNA by using substantially fully modified or fully modified siRNA molecules.

[0003] Hu et al., Signal Transduction and Targeted Therapy (2020) disclosed a series of known modification patterns, for example Alnylam’s STC modification pattern, in which there are three consecutive nucleotides with the same modification in both sense strand and antisense strand.

[0004] Also, the use of siRNA molecules containing modifications of the phosphate backbone can effectively enhance the activity and stability of siRNA.

[0005] Phosphorothioate (PS) modification is a common type of phosphate backbone modification, which is typically applied to the ends of the sense strand and / or the antisense strand of siRNA molecules. For example, in the marketed drug Inclisiran, there are two PS modifications at the 5' end of the sense strand, the 5' end of the antisense strand, and the 3' end of the antisense strand, respectively.

[0006] Most of the siRNA drugs currently in the clinical stage contain PS modifications at the above-mentioned sites, and it is generally believed that these terminal PS modifications are indispensable for the stability of siRNA drugs. Meanwhile, it is reported that PS modification is associated with increased immune activation.

[0007] The impact of the chirality of PS modifications on oligonucleotide has also been researched in recent years.

[0008] Iwamoto et al., Nature Biotechnology (2017) developed a synthetic method for the scalable production of antisense oligonucleotides (ASOs) with high stereochemical and chemical purity. The study found that the chirality of PS has a significant impact on the pharmacological properties of ASOs: the PS linkages in the Sp configuration are more stable and follow the triplet stereochemical code of 3'-Sp-Sp-Rp, which can promote the cleavage of the target RNA by RNase H1 in vitro and provide a more sustained in vivo response compared to stereorandom ASOs.

[0009] Sakamuri et al., ChemBioChem (2019) systematically evaluated the impact of PS chirality on the activity of double-stranded siRNA. The study found that among the 64 possible stereoisomers, only about 10%of the isomers make a significant contribution to the in vivo activity of siRNA. Specifically, the G1R chirality is crucial for activity, and G2R is also important. G21S is superior to G21R, while G22 and P1 / P2 can tolerate both isomers. This study provides preliminary rules for the design of stereopure siRNA and emphasizes the importance of controlling the chirality of PS for improving the efficacy of siRNA drugs.

[0010] Jahns et al., Nucleic Acids Research (2022) investigated the impact of the chirality of PS at the ends of siRNA on in vivo metabolic stability. The study shows that the PS isomers with the Rp configuration at the 5' end and the Sp configuration at the 3' end of the siRNA antisense strand can improve the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties in a mouse model. Molecular modeling studies indicate that the 5' Rp isomer and the 3' Sp isomer can synergistically enhance the loading efficiency of Ago2 and the metabolic stability of siRNA.

[0011] There is a need in the art to develop more modification patterns to further enhance the activity and stability of siRNA molecules, and to reduce off-target toxicity.SUMMARY OF THE INVENTION

[0012] In one aspect, the present invention provides a dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises a modification pattern as shown in Table 1 of the description.

[0013] In another aspect, the present invention provides a dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description.

[0014] In another aspect, the present invention provides a dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises a modification pattern as shown in Table 1 of the description, wherein the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description.

[0015] In one aspect, the present invention provides a dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (I) : 5'-NxNfNxNxNxNxNfNxNxNxNxNfNxNfNxNfNxNxNx (Nx) n-3'   (I)

[0016] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7.

[0017] In one aspect, the present invention provides a dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (II) : 5'-NxNfNxNxNxNfNxNxNxNxNxNfNxNfNxNfNxNxNx (Nx) n-3'   (II)

[0018] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7.

[0019] In one aspect, the present invention provides a dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (III) : 5'-NxNfNxNxNfNxNfNxNxNxNxNfNxNfNxNxNxNxNx (Nx) n-3'   (III)

[0020] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7.

[0021] In one aspect, the present invention provides a dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (IV) : 5'-NxNdNxNxNdNxNdNxNxNxNxNdNxNfNxNxNxNxNx (Nx) n-3'   (IV)

[0022] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nd independently represents a 2’-deoxy modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7.

[0023] The inventors also unexpectedly discovered that, provided that the first nucleotide at the 5' end of the antisense strand has a phosphonate modification, the phosphate backbone between the first and the second nucleotides at the 5' end of the AS strand can be free of the phosphorothioate (PS) modification, that is, maintaining the natural phosphodiester bond (PO) .

[0024] In one aspect, the present invention provides a dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand optionally comprises an antisense strand phosphonate modification, wherein the first internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a natural phosphodiester linkage.

[0025] In one aspect, the present invention provides a dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a natural phosphodiester linkage.

[0026] BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0027] Fig. 1 shows the results of in-vivo activity evaluation experiment of the siRNAs of the present invention in widetype mice on D14.

[0028] Fig. 2 shows the results of in-vivo activity evaluation experiment of the siRNAs of the present invention in widetype mice on D14.

[0029] Fig. 3 shows the results of in-vivo activity evaluation experiment of the siRNAs of the present invention in APOC3 transgenic mice on D14, D28, D42 and D56.

[0030] Fig. 4 shows the results of in-vivo activity evaluation experiment of the siRNAs of the present invention in TTR transgenic mice on D7 and D14.

[0031] Fig. 5 shows the results of in-vivo activity evaluation experiment of the siRNAs of the present invention in widetype mice.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0032] The following describes the embodiments of the present invention through specific examples. Those skilled in the art can easily understand other advantages and effects of the present invention from the disclosure of the present specification. The present invention can also be implemented or applied through other different specific embodiments. Various details in this specification can also be modified or changed in various ways based on different viewpoints and applications without departing from the spirit of the present invention.

[0033] It should be understood that the protection scope of the present invention is not limited to the following specific embodiments; it should also be understood that the terms used in the embodiments of the present invention are for describing specific embodiments, not for limiting the protection scope of the present invention.

[0034] In the specification and claims of the present invention, the singular forms "a" , "an" , and "the" include plural referents unless the context clearly dictates otherwise.

[0035] When the examples give numerical ranges, it should be understood that, unless otherwise stated in the present invention, both endpoints of each numerical range and any value between the two endpoints can be selected. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. In addition to the specific methods, equipment, and materials used in the embodiments, those skilled in the art can also use methods, equipment, and materials described in the embodiments of the present invention based on their understanding of the prior art and the description of the present invention. Any methods, equipment, and materials that are similar or equivalent to the prior art to implement the present invention shall fall within the protection scope of the present invention. Embodiments of the present invention are described in greater detail below.

[0036] Definitions

[0037] As used herein, the term “duplex region” means a region that contains two nucleic acid strands which are antiparallel and complementary or substantially complementary.

[0038] As used herein, the term “double strand RNA” or “dsRNA” means a ribonucleic acid molecule or a ribonucleic acid molecule complex that contains a duplex region as defined above. The two portions forming the duplex region may be two different portions of a larger RNA molecule, or they may be separate RNA molecules.

[0039] When the two portions are separate RNA molecules, the dsRNA herein is referred to as small interfering RNA or short interfering RNA, abbreviated as siRNA.

[0040] When the two portions are two different portions of a larger molecule, that is, when the 3'-end of one portion and the 5'-end of the other portion form a double-stranded region through one or more uninterrupted nucleotides between them, the uninterrupted nucleotides used for the connection are called a "hairpin loop" . When the two portions are covalently linked by a method other than a hairpin loop to form a double-stranded region, the linking structure is called a "linked body" . After such dsRNA is introduced into a cell, it is cleaved into siRNA by an endoribonuclease called Dicer within the cell.

[0041] The term "siRNA" herein is a class of dsRNA molecules which can mediate the silencing of target RNA (e.g., mRNA, e.g., transcript of a gene encoding a protein) complementary thereto. A siRNA is generally double-stranded, including an antisense strand complementary to the target RNA thereof and a sense strand complementary to this antisense strand. For the sake of convenience, such an mRNA is also referred to herein as mRNA to be silenced, and such a gene is also called target gene. Usually, an RNA to be silenced herein is an endogenous gene or a pathogen gene. In addition, RNAs other than mRNA (e.g., tRNA) as well as viral RNA may also be targeted.

[0042] The term "antisense strand" herein refers to a strand of dsRNA (especially siRNA) , wherein said strand contains a region that is completely, sufficiently or substantially complementary to the target sequence thereof. The term "sense strand" herein refers to a strand of a siRNA, wherein said strand contains a region that completely, sufficiently or substantially complementary to a region of an antisense strand as defined herein.

[0043] The term "complementary region" herein refers to a region on an antisense strand that is completely, sufficiently or substantially complementary to the target mRNA sequence thereof. In cases where a complementary region is incompletely complementary to the target sequence thereof, a mismatch may be located in an internal or terminal region of the molecule. Typically, a mismatch most tolerant is located in a terminal region, e.g., within 5, 4, 3, 2 or 1 nucleotide at the 5' and / or 3' end. A region in an antisense strand, which is most sensitive to mismatch, is called "seed region" . For example, in a siRNA containing a strand of 19 nt, the 19th site (counting from the 5' end to the 3' end) can tolerate some mismatches.

[0044] The term "complementary" refers to the ability of a first polynucleotide to hybridize with a second polynucleotide under certain conditions, such as stringent conditions. For example, stringent conditions may include 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, and 50℃ or 70℃ for 12-16 hours. With respect to fulfilling the above required capabilities related to the hybridization ability thereof, said "complementary" sequences may also include or be entirely composed of non-Watson-Crick base pairs and / or base pairs formed from non-natural as well as modified nucleotides. Such non-Watson-Crick base pairs include, but are not limited to, G: U wobble base pairing or Hoogsteen base pairing.

[0045] A polynucleotide that is "at least partially complementary" , "sufficiently complementary" or "substantially complementary" to a messenger RNA (mRNA) refers to a polynucleotide that is substantially complementary to a continuous portion of the mRNA of interest. For example, a polynucleotide is at least partially complementary to an mRNA encoding LPA, when the sequence thereof is substantially complementary to an uninterrupted portion of said LPA mRNA. The terms "complementary, " "completely complementary, " "sufficiently complementary" and "substantially complementary" as used herein may be applied to base pairing between the sense strand and antisense strand of a siRNA, or between the antisense strand of a siRNA reagent and the target sequence thereof.

[0046] The term "sense strand" herein refers to a strand of a siRNA, wherein said strand contains a region that completely, sufficiently or substantially complementary to a region of an antisense strand as defined herein.

[0047] The term "Nucleoside" herein is a compound comprising two substances: one is a purine base or a pyrimidine base, and the other is a ribose or a deoxyribose. "Nucleotide" is a compound comprising three substances: one is a purine base or a pyrimidine base, another is a ribose or deoxyribose, and the third is a phosphoric acid. "Oligonucleotide" is a nucleic acid molecule (RNA or DNA) having a length of less than 100, 200, 300 or 400 nucleotides.

[0048] The term "base" herein is a fundamental building block of nucleosides, nucleotides and nucleic acids; as always containing nitrogen, said base is also referred to as "nitrogenous base. " Unless otherwise specified, the capital letters herein, i.e., A, U, T, G and C, denote the bases of nucleotides, which is adenine, uracil, thymine, guanine and cytosine, respectively.

[0049] As used herein, the term "nucleotide overhang" or "overhang" refers to at least one unpaired nucleotide that protrudes from the duplex structure of the siRNA. Nucleotide overhangs exist, for example, when the 3'-end of one strand of the siRNA extends beyond the 5'-end of the other strand, or vice versa. The siRNA can comprise an overhang having at least one nucleotide; alternatively, the overhang can comprise at least two nucleotides, at least three nucleotides, at least four nucleotides, at least five nucleotides, or more. A nucleotide overhang may comprise or consist of a nucleotide / nucleoside analog (including a deoxynucleotide / nucleoside) . One or more overhangs can be on the sense strand, the antisense strand, or any combination thereof. Additionally, one or more nucleotides of the overhang may be present at the 5'-end, 3'-end, or both ends of the antisense or sense strand of the siRNA.

[0050] As used herein, the term "blunt end" refers to that there are no unpaired nucleotides at that end of the double-stranded siRNA, i.e., there are no nucleotide overhangs at that end. A "blunt-ended siRNA" is a siRNA that is double-stranded throughout its length, i.e., there are no nucleotide overhangs at either end of the molecule.

[0051] Substantially all nucleotides of the dsRNA (especially siRNA) of the present invention are modified. For example, substantially all nucleotides of the sense strand are modified nucleotides, and / or substantially all nucleotides of the antisense strand are modified nucleic acids, and / or substantially all nucleotides of both the sense and antisense strands are modified nucleotides. In other embodiments of the present invention, all nucleotides of the dsRNA (especially siRNA) of the present invention are modified nucleotides. For example, all nucleotides of the sense strand are modified nucleotides, and / or all nucleotides of the antisense strand are modified nucleic acids, and / or all nucleotides of both the sense and antisense strands are modified nucleotides. The term "substantially all nucleotides are modified" refers to that the dsRNA (especially siRNA) of the present invention is mostly but not entirely modified and may include no more than 5, 4, 3, 2, or 1 unmodified nucleotide.

[0052] The term "modified nucleotide" herein includes, but are not limited to: a 2'-O-alkyl modified nucleotide (e.g. a 2'-O-methyl modified nucleotide or a 2’-methoxyethyl modified nucleotide) , a 2'-fluoro modified nucleotide, a 2'-deoxy modified nucleotide, an inosine ribonucleotide, an abasic nucleotide, an inverted abasic deoxyribonucleotide, a phosphorothioate internucleotide linkage modification, a vinylphosphonate modified nucleotide, a locked nucleotide, a 2'-amino modified nucleotide, a 2'-C-alkyl modified nucleotide, a 2'‐O‐allyl modified nucleotide, a morpholino nucleotide, a phosphoramidate, a non-natural base containing nucleotide, a terminal nucleotide linked to a cholesteryl derivative or a dodecanoic acid bisdecylamide group, deoxyribonucleotide, a 3'‐end deoxythymine (dT) nucleotide, a conformation-restricted nucleotide, a restricted ethyl nucleotide, a 2'-hydroxyl-modified nucleotide, a nucleotide containing methylphosphonic acid groups, a nucleotide containing 5'-phosphate, a nucleotide containing 5'-phosphate mimics, a glycol-modified nucleotide (GNA) , and a 2’-O- (N-methylacetamide) -modified nucleotide.

[0053] For example, “2’-fluoro modified nucleotides” means a nucleotide in which the hydroxyl on 2’ ribose position is substituted with fluoro. “2'-O-methyl modified nucleotide” means a nucleotide in which the hydroxyl on 2’ ribose position is substituted with methoxyl. “2’-deoxy modified nucleotides” means a nucleotide in which the hydroxyl on 2’ ribose position is substituted with hydrogen.

[0054] The term “anucleotide comprising a phosphorothioate group” means a nucleotide in which one or more oxygen atoms on the phosphorate group are substituted with sulphur atoms. “phosphorothioate internucleotide linkage” or “phosphorothioate linkage” means the two adjacent nucleotides, terminal modifications and / or delivery moieties are connected via a phosphorothioate.

[0055] As used herein, the term “modification pattern” means the arrangement of all modifications on one or both of the nucleic acid strands of a dsRNA molecule. One modification pattern could correspond to multiple specific dsRNA sequences.

[0056] The term “modification pattern” may include the arrangement of all modification types such as nucleotide ribose ring modification, base modification, internucleotide linkage modification, or the combination thereof. In case one type of modification is not described in a modification pattern, such modification pattern should be construed as include all kinds of modifications in such type. For example, formula (I) (i.e. 5'-NxNfNxNxNxNxNfNxNxNxNxNfNxNfNxNfNxNxNx (Nx) n-3') does not described the internucleotide linkage, and should be construed as including all kinds of internucleotide linkages (either modified or unmodified) known in the art.

[0057] A person skilled in the art understands that the two nucleic acid strands of a dsRNA can be of different length, e.g., 19 / 21nt mode, 21 / 21nt mode, 21 / 23nt mode, etc. When it is described as "comprising" a certain modification pattern herein, it should cover nucleic acid strands of all lengths. For example, with respect to the SSMP-1 modification pattern, the following description pertains to 19 nucleotides starting from the 3'-end of the sense strand, which, however, should not be construed as being applicable only to a nucleic acid strand with a length of 19 nucleotides, but rather to all nucleic acid strands with a length of more than 19 nucleotides.

[0058] The term “antisense strand phosphonate modification” as used herein means a modification on the 5’ phosphate group of the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand. The modified antisense stand comprises a stable and undegradable 5’ phosphonate group to enhance the stability of the siRNA. The antisense strand phosphonate modification herein includes but not limited to vinylphosphonate modification, cycloalkyl phosphonate modification, 4-methyl phosphonate modification and spiro phosphonate modification.

[0059] Exemplified vinylphosphonate modifications include but not limited to:

[0060] exemplified cycloalkyl phosphonate modifications include but not limited to:

[0061] exemplified 4-methyl phosphonate modifications include but not limited to:

[0062] exemplified spiro phosphonate modifications include but not limited to:

[0063] other exemplified antisense strand phosphonate modifications include but not limited to:

[0064] wherein Base represents a base; R represents a modification to the 2’ position of the ribose, including but not limited to hydroxyl, hydrogen, fluorine and methoxyl.

[0065] As used herein, the term “sense strand terminal modification” means a modification on the 5’ end and / or 3’ end of the sense strand of a dsRNA molecule, for example, a conjugated capping modification or structure. Exemplified sense strand terminal modifications include but not limited to inverted abasic deoxyribonucleotide (IB) and STM.

[0066] IB can be of the following two structures depending on its position / linking method in siRNA (for the 5' end and 3' end of the nucleic acid strand, respectively) :

[0067] IB is well known in the art. See, for example, F. Czauderna, Nucleic Acids Res., 2003, 31 (11) , 2705-16 and PCT Publication Nos. WO2016011123 and WO2019051402.

[0068] The structure of STM is

[0069] As used herein, the term “delivery moiety” means a moiety delivering dsRNA molecules to specific tissues. A common delivery moiety is a GalNAc-containing delivery moiety, usually for delivering dsRNA molecules to liver. Exemplified GalNAc-containing delivery moieties include but not limited to L96, NAG37 and GL6.

[0070] L96 represents a GalNAc delivery moiety of the following structure well known in the art, wherein represents a position linked to siRNA by a phosphate group or a phosphorothioate group. See, for example, PCT Publication Nos. WO2009073809 and WO2009082607.

[0071] NAG37 represents a GalNAc delivery moiety of the following structure well known in the art, wherein represents a position linked to siRNA. See, for example, PCT Publication No. WO2018044350.

[0072] GL6 represents a GalNAc delivery moiety of the following structure, wherein  represents a position linked to siRNA by a phosphate group or a phosphorothioate group.

[0073] As used herein, the terms "inhibit" , "reduce" , "silence" , "down-regulate" , and other similar terms are used interchangeably and include inhibition at any level.

[0074] As used herein, the term "treat" or "treatment" means the administration of an agent or the performance of a procedure in order to obtain an effect. These effects can be prophylactic in terms of completely or partially preventing a disease or its symptoms, and / or can be therapeutic in terms of affecting a partial or complete cure of the disease and / or disease symptoms. As used in the present invention, "treatment" may include treating a disease or disorder in a mammal, particularly a human, and includes: (a) preventing the occurrence of the disease or disease symptoms in a subject who is susceptible to the disease but has not yet been diagnosed with the disease (for example, including diseases that may be related to or caused by the primary disease) ; (b) inhibiting the disease, that is, preventing its progression; (c) alleviating the disease, that is, causing the regression of the disease. Treatment can refer to any indication of success in treating, ameliorating, or preventing cancer, including any objective or subjective parameters, such as elimination; remission; reducing symptoms or making the disease condition more tolerable to the patient; slowing the rate of deterioration or decline; or reducing the debilitation of the end-point of deterioration. The treatment or improvement of symptoms is based on one or more objective or subjective parameters; including the results of a doctor's examination. Therefore, the term "treatment" includes administering the dsRNA, cells, or pharmaceutical compositions disclosed in the present invention to prevent or delay, alleviate, or arrest or inhibit the development of symptoms or disorders associated with a disease. The term "therapeutic effect" refers to the reduction, elimination, or prevention of a disease, disease symptoms, or disease side-effects in a subject.

[0075] As used herein, the term "effective amount" means an amount that, when administered to a subject for the treatment of a disease, is sufficient to achieve the treatment of such disease.

[0076] As used herein, the term "subject" means any mammalian subject for whom diagnosis, medical treatment or therapy is desired. "Mammal" for the purpose of treatment refers to any animal classified as a mammal, including humans, domestic animals, as well as laboratory animals, zoo animals, sport animals or pet animals such as dogs, horses, cats, cattle, sheep, goats, pigs, mice, rats, rabbits, guinea pigs, and monkeys.

[0077] I. Antisense strand modification pattern

[0078] The present invention provides a dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises a modification pattern as shown in Table 1.

[0079] Table 1 Antisense strand modification patterns of the present invention

[0080] In one embodiment, the antisense strand comprises a structure of formula (I) : 5'-NxNfNxNxNxNxNfNxNxNxNxNfNxNfNxNfNxNxNx (Nx) n-3'   (I)

[0081] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7, preferably 2.

[0082] In one embodiment, the antisense strand comprises a structure of formula (II) : 5'-NxNfNxNxNxNfNxNxNxNxNxNfNxNfNxNfNxNxNx (Nx) n-3'    (II)

[0083] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7, preferably 2.

[0084] In one embodiment, the antisense strand comprises a structure of formula (III) : 5'-NxNfNxNxNfNxNfNxNxNxNxNfNxNfNxNxNxNxNx (Nx) n-3'   (III)

[0085] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7.

[0086] In one embodiment, the antisense strand comprises a structure of formula (IV) : 5'-NxNdNxNxNdNxNdNxNxNxNxNdNxNfNxNxNxNxNx (Nx) n-3'   (IV)

[0087] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nd independently represents a 2’-deoxy modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7, preferably 2.

[0088] Each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide, wherein the base thereof could be A, U, T, G, or C, or a modified base.

[0089] In one embodiment, Nx is a 2'‐O‐alkyl modified nucleotide, perferably Nx is a 2’-O-methyl modified nucleotides; In one embodiment, Nx is a 2'‐O‐methoxyethyl modified nucleotide. In one embodiment, Nx is an inosine ribonucleotide. In one embodiment, Nx is an abasic nucleotide. In one embodiment, Nx is an inverted abasic deoxyribonucleotide. In one embodiment, Nx is a vinylphosphonate modified nucleotide. In one embodiment, Nx is a locked nucleotide. In one embodiment, Nx is a 2'-amino modified nucleotide. In one embodiment, Nx is a 2'-C-alkyl modified nucleotide. In one embodiment, Nx is a 2'‐O‐allyl modified nucleotide. In one embodiment, Nx is a morpholino nucleotide. In one embodiment, Nx is a phosphoramidate. In one embodiment, Nx is a non-natural base containing nucleotide. In one embodiment, Nx is a terminal nucleotide linked to a cholesteryl derivative or a dodecanoic acid bisdecylamide group. In one embodiment, Nx is a conformation-restricted nucleotide. In one embodiment, Nx is a restricted ethyl nucleotide. In one embodiment, Nx is a nucleotide containing methylphosphonic acid groups. In one embodiment, Nx is a nucleotide containing 5'-phosphate. In one embodiment, Nx is a nucleotide containing 5'-phosphate mimics. In one embodiment, Nx is a glycol-modified nucleotide (GNA) . In one embodiment, Nx is a 2’-O- (N-methylacetamide) -modified nucleotide.

[0090] A skilled person in the art understands that the modification may exist in various positions of the nucleotide, including but not limited to ribose, base and phosphate backbone. Thus, a Nx may be a combination of multiple non-conflcting modifications. For example, a Nx could comprise both a 2'-O-methyl modification and a vinylphosphonate modification.

[0091] II. Sense strand modification pattern

[0092] The present invention provides a dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2.

[0093] Table 2 Sense strand modification patterns of the present invention

[0094] III. dsRNA modification pattern

[0095] The present invention provides a dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises a modification pattern as shown in Table 1 of the description, wherein the sense strand strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description.

[0096] The present invention provides a dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern as shown in Table 3 of the description.

[0097] Table 3 dsRNA modification patterns of the present invention

[0098] IV. dsRNA

[0099] In one embodiment, the sense stand is 15-27 nucleotides in length. In a preferable embodiment, the sense stand is 17-25 nucleotides in length. In a preferable embodiment, the sense stand is 18-23 nucleotides in length. In a preferable embodiment, the sense stand is 19-21 nucleotides in length. In a preferable embodiment, the sense stand is 19 or 21 nucleotides in length.

[0100] In one embodiment, the antisense stand is 15-27 nucleotides in length. In a preferable embodiment, the antisense stand is 17-25 nucleotides in length. In a preferable embodiment, the antisense stand is 18-23 nucleotides in length. In a preferable embodiment, the antisense stand is 21-23 nucleotides in length. In a preferable embodiment, the antisense stand is 21 or 23 nucleotides in length.

[0101] In one embodiment, one or both of the sense stand and the antisense strand comprise a 3’ overhang and / or a 5’ overhang having at least one nucleotide. In a preferable embodiment, one or both of the sense stand and the antisense strand comprise a 3’ overhang and / or a 5’ overhang having at least two nucleotides. In a preferable embodiment, the dsRNA comprises a two-nucleotide overhang at the 3’ end of the antisense strand and a blunt end at the 5’ end of the antisense strand.

[0102] In one embodiment, the dsRNA is a siRNA. In one embodiment, the dsRNA is a miRNA. In one embodiment, the dsRNA is a shRNA.

[0103] V. Other modifications

[0104] In one embodiment, the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand comprises an antisense strand phosphonate modification. In one embodiment, the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand comprises a vinylphosphonate modification. In one embodiment, the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand comprises a cycloalkyl phosphonate modification. In one embodiment, the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand comprises a 4-methyl phosphonate modification. In one embodiment, the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand comprises a spiro phosphonate modification. In a preferable embodiment, the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand comprises a SCP modification.

[0105] In one embodiment, the sense strand comprises at its 3’ end and / or 5’ end a sense strand terminal modification. In one embodiment, the sense strand comprises at its 3’ end and / or 5’ end an inverted abasic deoxyribonucleotide. In one embodiment, the sense strand comprises at its 3’ end and / or 5’ end a STM modification.

[0106] In one embodiment, the sense strand is conjugated at its 3’ end and / or 5’ end with a delivery moiety. In one embodiment, the sense strand is conjugated at its 3’ end and / or 5’ end with a GalANc-based delivery moiety.

[0107] A skilled person understands that the sense strand terminal modification and the delivery moiety conjugated at the sense stand terminal position are not counted as nucleotides in the sense strand. For example, when the sense strand comprises at the 5’ end a sense strand terminal modification, the first nucleotide counting from the 5’ end of the sense strand is the nucleotide connecting to said sense strand terminal modification, rather than the sense strand terminal modification itself.

[0108] In one embodiment, the sense strand and / or the antisense strand comprise, at their 3’ end and / or 5’ end, 1-5 phosphorothioate internucleotide linkages. In a preferable embodiment, the sense strand and / or the antisense strand comprise, at their 3’ end and / or 5’ end, 2-4 phosphorothioate internucleotide linkages. In a preferable embodiment, each of the sense strand and the antisense strand comprises, at its 3’ end and 5’ end, 2 phosphorothioate internucleotide linkages.

[0109] In one embodiment, the first internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a natural phosphodiester linkage. In one embodiment, the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage. In one embodiment, the first and the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the sense strand is each a phosphorothioate linkage. In one embodiment, the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a phosphorothioate linkage. In one embodiment, the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a phosphorothioate linkage.

[0110] In one embodiment, at least one of the phosphorothioate linkage is a chirally-modified phosphorothioate linkage. In one embodiment, the phosphorothioate linkage in the antisense strand and / or in the sense strand is each a chirally-modified phosphorothioate linkage. In one embodiment, the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage in Rp configuration, and the first and the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is each a phosphorothioate linkage in Sp configuration. In one embodiment, the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand, and the first and the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the sense strand is each a phosphorothioate linkage in Rp configuration; the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand, and the first and the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is each a phosphorothioate linkage in Sp configuration.

[0111] In one embodiment, the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is a phosphorodithioate linkage and optionally the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is a natural phosphodiester linkage.

[0112] A person skilled in the art should understand that, except the nucleotides connected through the phosphorothioate internucleotide linkage above, the remaining nucleotides, terminal modifications and delivery moiety of the dsRNA of the present invention could be connected through natural phosphodiester groups, or through any modified phosphate groups known in the art.

[0113] Exemplified modified phosphate groups include but not limited to:

[0114] wherein each X is independently O or S; each R is independently alkyl, e.g., C1-6 alkyl, including but not limited to methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, pentyl and hexyl.

[0115] VI. Cell

[0116] The present invention provides a cell, comprising the dsRNA as described in the present invention.

[0117] VII. Pharmaceutical composition

[0118] The present invention provides a pharmaceutical composition, comprising the dsRNA or cell as described in the present invention, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0119] As used herein, "pharmaceutically acceptable" refers to those compounds, materials, compositions and / or dosage forms which, within the scope of sound medical judgment, are suitable for contact with the tissues of human subjects and animal subjects without excessive toxicity, irritation, allergic response or other problems or complications, and are commensurate with a reasonable benefit / risk ratio.

[0120] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable carrier” means a pharmaceutical carrier that facilitates the administration of dsRNA or cells containing it to the human body and / or is beneficial for its absorption or exertion of its effect, for example, diluents, excipients such as water, fillers such as starch and sucrose, binders such as cellulose derivatives, alginates, gelatin and polyvinylpyrrolidone, wetting agents such as glycerol, disintegrants such as agar, calcium carbonate and sodium bicarbonate, absorption promoters such as quaternary ammonium compounds, surfactants such as cetyl alcohol, adsorbent carriers such as kaolin and bentonite, lubricants such as talc, calcium / magnesium stearate and polyethylene glycol. In addition, other adjuvants such as flavoring agents and sweeteners can also be added to the composition.

[0121] The pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable diluent or a sustained-release matrix, in which the dsRNA or cells of the present invention are embedded.

[0122] The pharmaceutical composition of the present invention may comprise a drug delivery system for delivering dsRNA. The drug delivery systems of the present invention include, but not limited to, nanoparticles (such as lipid nanoparticles, polymer-based nanoparticles) , polymers, PEG, cationic delivery systems, polylactic acid (PLA) microspheres, poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres, liposomes, micelles, inverse micelles, lipid cochleates, lipid microtubules, cholesterol, PEG-lipids such as PEG-2000-C-DMG, PEG-2000-DMG (Moderna) , ALC-0159, and DSPC.

[0123] In some embodiments, the dsRNA in the pharmaceutical composition of the present invention may be encapsulated in polymers and polymer-based nanoparticles.

[0124] In some specific embodiments, the polymer is a polymer based on poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) . In some specific embodiments, the PLGA-based polymer is modified to contain individual cationic groups.

[0125] In some specific embodiments, the polymer contains amino groups that can be converted into cationic groups, such as polyethyleneimine (PEI) and poly (L-lysine) (PLL) , which can form complexes with dsRNA through electrostatic interactions and deliver the dsRNA into cells. In some embodiments, PEG and PLL are chemically modified to improve in-vivo efficacy and tolerability.

[0126] In some embodiments, the siRNA or cells in the pharmaceutical composition of the present invention can be delivered by the cationic polymer poly (β-amino ester) (PBAE) .

[0127] VIII. Kit

[0128] The present invention provides a kit, comprising the dsRNA or cell as described in the present invention.

[0129] The present invention also provides a kit for using the dsRNA of the present invention and / or for performing the method of the present invention. Such kit includes one or more dsRNAs or cells of the present invention, and may further include instructions for use. Instructions for inhibiting gene expression in a cell by contacting the cell with the dsRNA of the present invention in an amount effective to inhibit gene expression may be recorded in the instructions for use.

[0130] In the case where the dsRNA of the present invention is contacted with a cell in vitro, optionally, the kit of the present invention may further comprise a means for contacting the cell with the dsRNA of the present invention (e.g., an injection device) or a means for measuring gene inhibition (e.g., a device for measuring mRNA or protein inhibition) . Such a means for measuring gene inhibition may comprise a device for obtaining a sample (e.g., a plasma sample) from a subject.

[0131] In the case where the dsRNA, or the cell into which the dsRNA of the present invention has been introduced in vitro is administered into the body, the kit of the present invention may optionally further comprise a means for administering the dsRNA or cell of the present invention to a subject or a means for determining a therapeutically effective amount or a prophylactically effective amount.

[0132] IX. Therapeutic method and medical use

[0133] The present invention provides a method of inhibiting gene expression in a cell, wherein the method comprises contacting the cell with the dsRNA or pharmaceutical composition of the present invention. In some embodiments, the method is carried out in vivo. In some embodiments, the method is carried out in vitro. The present invention provides a dsRNA or pharmaceutical composition for inhibiting gene expression in a cell.

[0134] The present invention provides a method of inhibiting gene expression in a subject, wherein the method comprises administrating to the subject the dsRNA, cell, or pharmaceutical composition of the present invention.

[0135] In some embodiments, the dsRNA, cell, or pharmaceutical composition is administrated subcutaneously.

[0136] In some embodiments, the subject is a mammal. In some embodiments, the subject is a primate mammal. In some embodiments, the subject is a human.

[0137] X. The specific technical solutions of the present invention

[0138] The symbols of compounds and substituents appearing in the following technical solutions A1-A27 are only valid within technical solutions A1-A27. In case of any conflict between these symbols and those in other parts hereof, the latter shall prevail.

[0139] Technical solution A1. A dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises a modification pattern as shown in Table 1 of the description.

[0140] Technical solution A2. A dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description.

[0141] Technical solution A3. A dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises a modification pattern as shown in Table 1 of the description, wherein the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description.

[0142] Technical solution A4. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern as shown in Table 3 of the description.

[0143] Technical solution A5. A dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises 1 or 5 of 2’-fluoro modified nucleotides, and comprises a 2’-fluoro modified nucleotide at positon 14.

[0144] Technical solution A6. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (I) : 5'-NxNfNxNxNxNxNfNxNxNxNxNfNxNfNxNfNxNxNx (Nx) n-3'   (I)

[0145] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,

[0146] preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-4, ASMP-17, or ASMP-42 as shown in Table 1,

[0147] preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-4, DS-52, DS-43, DS-48, DS-85, DS-17, or DS-41 as shown in Table 3.

[0148] Technical solution A7. The dsRNA any one of preceding technical solutions, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (II) :

[0149] 5'-NxNfNxNxNxNfNxNxNxNxNxNfNxNfNxNfNxNxNx (Nx) n-3' (II) wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,

[0150] preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-6 as shown in Table 1,

[0151] preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-6 as shown in Table 3.

[0152] Technical solution A8. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (III) : 5'-NxNfNxNxNfNxNfNxNxNxNxNfNxNfNxNxNxNxNx (Nx) n-3'   (III)

[0153] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,

[0154] preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12 or ASMP-19 as shown in Table 1,

[0155] preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-12, DS-50, DS-51, DS-46, or DS-19 as shown in Table 3.

[0156] Technical solution A9. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (IV) : 5'-NxNdNxNxNdNxNdNxNxNxNxNdNxNfNxNxNxNxNx (Nx) n-3'   (IV)

[0157] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nd independently represents a 2’-deoxy modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,

[0158] preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-38, ASMP-43, ASMP-59, ASMP-62, ASMP-63, ASMP-64, ASMP-65, ASMP-66, ASMP-67, or ASMP-68 as shown in Table 1,

[0159] preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-38, DS-40, DS-49, DS-42, DS-69, DS-72, DS-73, DS-74, DS-75, DS-76, DS-77, or DS-78 as shown in Table 3.

[0160] Technical solution A10. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the sense stand is 15-27 nucleotides in length, preferably 17-25 nucleotides, more perferably 18-23 nucleotides, more perferably 19-21 nucleotides, most perferably 19 or 21 nucleotides.

[0161] Technical solution A11. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense stand is 15-27 nucleotides in length, perferably 17-25 nucleotides, more perferably 18-23 nucleotides, more perferably 21-23 nucleotides, most perferably 21 or 23 nucleotides.

[0162] Technical solution A12. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein one or both of the sense stand and the antisense strand comprise a 3’ overhang and / or a 5’ overhang having at least one nucleotide, perferably wherein one or both of the sense stand and the antisense strand comprise a 3’ overhang and / or a 5’ overhang having at least two nucleotides, more perferably wherein the dsRNA comprises a two-nucleotide overhang at the 3’ end of the antisense strand and a blunt end at the 5’ end of the antisense strand.

[0163] Technical solution A13. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand comprises an antisense strand phosphonate modification, wherein the antisense strand phosphonate modification is preferably a SCP modification.

[0164] Technical solution A14. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the sense strand and / or the antisense strand comprise, at their 3’ end and / or 5’ end, 1-5 phosphorothioate internucleotide linkages, perferably 2-4 phosphorothioate internucleotide linkages, wherein more perferably each of the sense strand and the antisense strand comprises, at its 3’ end and 5’ end, 2 phosphorothioate internucleotide linkages.

[0165] Technical solution A15. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the first internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a natural phosphodiester linkage, and the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand comprises an SCP modifiecation,

[0166] preferably, the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage,

[0167] preferably, the first and the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the sense strand is each a phosphorothioate linkage,

[0168] preferably, the first and the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is each a phosphorothioate linkage.

[0169] Technical solution A16. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a natural phosphodiester linkage,

[0170] preferably, the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a phosphorothioate linkage,

[0171] preferably, the first and the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the sense strand is each a phosphorothioate linkage,

[0172] preferably, the first and the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is each a phosphorothioate linkage.

[0173] Technical solution A17. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein:

[0174] the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage in Rp configuration; the first and the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is each a phosphorothioate linkage in Sp configuration,

[0175] or the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is a phosphorodithioate linkage and optionally the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is a natural phosphodiester linkage.

[0176] Technical solution A18. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the sense strand comprises, at its 3’ end and / or 5’ end, a sense strand terminal modification, wherein preferably the sense strand terminal modification is an inverted abasic deoxyribonucleotide.

[0177] Technical solution A19. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the dsRNA is siRNA.

[0178] Technical solution A20. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense strand targets to the gene of PCSK9, APOC3, ANGPTL3 or TTR.

[0179] Technical solution A21. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, the antisense stand is 21 nucleotides in length and the sense stand is 19 nucleotides in length, wherein:

[0180] (1) the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12, and further comprises the following modification:

[0181] (iii) SCP modified nucleotide at position 1; and

[0182] (iv) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 1 and 2, positions 2 and 3, positions 19 and 20, positions 20 and 21;

[0183] the sense strand comprises the following modification:

[0184] (i) 2’-O-methyl modified nucleotides at positions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 and 19;

[0185] (ii) 2’-fluoro modified nucleotides at positions 7, 8 and 9;

[0186] (iii) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 1 and 2, positions 2 and 3, positions 18 and 19,

[0187] or (2) the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12, and further comprises the following modification:

[0188] (iii) SCP modified nucleotide at position 1; and

[0189] (iv) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 2 and 3, positions 19 and 20, positions 20 and 21;

[0190] the sense strand comprises the following modification:

[0191] (i) 2’-O-methyl modified nucleotides at positions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 and 19;

[0192] (ii) 2’-fluoro modified nucleotides at positions 7, 8 and 9;

[0193] (iii) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 1 and 2, positions 2 and 3, positions 18 and 19,

[0194] or (3) the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12, and further comprises the following modification:

[0195] (iii) SCP modified nucleotide at position 1; and

[0196] (iv) phosphorothioate internucleotide linkage in Rp configuration between positions 2 and 3; and

[0197] (v) phosphorothioate internucleotide linkages in Sp configuration between positions 19 and 20, and between positions 20 and 21;

[0198] the sense strand comprises the following modification:

[0199] (i) 2’-O-methyl modified nucleotides at positions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 and 19;

[0200] (ii) 2’-fluoro modified nucleotides at positions 7, 8 and 9;

[0201] (iii) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 1 and 2, positions 2 and 3, positions 18 and 19; and

[0202] (iv) a nucleotide comprising a phosphorothioate group at position 19.

[0203] Technical solution A22. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the sense strand is conjugated, at its 3’ end and / or 5’ end a delivery moiety, wherein the delivery moiety is preferably a GalNAc-containing delivery moiety.

[0204] Technical solution A23. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the sense strand and the antisense strand comprises the sequences selected from Tables 4, 8, 10, 12-13, and 15.

[0205] Technical solution A24. A cell, comprising the dsRNA of any one of technical solutions A1-A23.

[0206] Technical solution A25. A pharmaceutical composition, comprising the dsRNA of any one of technical solutions A1-A23, or the cell of technical solution A24, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0207] Technical solution A26. A kit, comprising the dsRNA of any one of technical solutions A1-A23, the cell of technical solution A24, or the pharmaceutical composition of technical solution 25.

[0208] Technical solution A27. A method of inhibiting gene expression in a subject, wherein the method comprises administrating to the subject the dsRNA of any one of technical solutions A1-A23, the cell of technical solution A24, or the pharmaceutical composition of technical solution A25, preferably the subject is a human.

[0209] The content of the present invention is further illustrated in combination with examples as follows. It should be understood that the following examples are merely illustrative and should not be regarded as limiting the scope of the present invention.

[0210] The symbols of compounds and substituents appearing in the following technical solutions B1-B44 are only valid within technical solutions B1-B44. In case of any conflict between these symbols and those in other parts hereof, the latter shall prevail.

[0211] Technical solution B1. A dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand optionally comprises an antisense strand phosphonate modification, wherein the first internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a natural phosphodiester linkage.

[0212] Technical solution B2. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage.

[0213] Technical solution B3. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the first and the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the sense strand is each a phosphorothioate linkage.

[0214] Technical solution B4. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the first and the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is each a phosphorothioate linkage.

[0215] Technical solution B5. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a phosphorothioate linkage.

[0216] Technical solution B6. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a natural phosphodiester linkage.

[0217] Technical solution B7. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a phosphorothioate linkage.

[0218] Technical solution B8. A dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a natural phosphodiester linkage.

[0219] Technical solution B9. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a phosphorothioate linkage.

[0220] Technical solution B10. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the first and the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the sense strand is each a phosphorothioate linkage.

[0221] Technical solution B11. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the first and the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is each a phosphorothioate linkage.

[0222] Technical solution B12. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the first internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage.

[0223] Technical solution B13. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the first internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a natural phosphodiester linkage.

[0224] Technical solution B14. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage.

[0225] Technical solution B15. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense strand comprises an antisense strand phosphonate modification, preferably the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand comprises the antisense strand phosphonate modification.

[0226] Technical solution B16. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein at least one of the phosphorothioate linkage is a chirally-modified phosphorothioate linkage.

[0227] Technical solution B17. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the phosphorothioate linkage in the antisense strand and / or in the sense strand is each a chirally-modified phosphorothioate linkage.

[0228] Technical solution B18. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage in Rp configuration.

[0229] Technical solution B19. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein:

[0230] the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage in Rp configuration; the first and the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is each a phosphorothioate linkage in Sp configuration,

[0231] or the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is a phosphorodithioate linkage and optionally the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is a natural phosphodiester linkage.

[0232] Technical solution B20. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense strand phosphonate modification is selected from a vinylphosphonate modification, a cycloalkyl phosphonate modification, a 4-methyl phosphonate modification, or a spiro phosphonate modification, preferably a spiro phosphomate modification, more preferably a SCP modification.

[0233] Technical solution B21. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense strand further comprises a modification pattern as shown in Table 1 of the description.

[0234] Technical solution B22. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the sense strand further comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description.

[0235] Technical solution B23. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense strand comprises a modification pattern as shown in Table 1 of the description, wherein the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description.

[0236] Technical solution B24. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern as shown in Table 3 of the description.

[0237] Technical solution B25. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (I) : 5'-NxNfNxNxNxNxNfNxNxNxNxNfNxNfNxNfNxNxNx (Nx) n-3'   (I)

[0238] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,

[0239] preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-4, ASMP-17, or ASMP-42 as shown in Table 1,

[0240] preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-4, DS-52, DS-43, DS-48, DS-85, DS-17, or DS-41 as shown in Table 3.

[0241] Technical solution B26. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (II) : 5'-NxNfNxNxNxNfNxNxNxNxNxNfNxNfNxNfNxNxNx (Nx) n-3'   (II)

[0242] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,

[0243] preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-6 as shown in Table 1,

[0244] preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-6 as shown in Table 3.

[0245] Technical solution B27. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (III) : 5'-NxNfNxNxNfNxNfNxNxNxNxNfNxNfNxNxNxNxNx (Nx) n-3'   (III)

[0246] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,

[0247] preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12 or ASMP-19 as shown in Table 1,

[0248] preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-12, DS-50, DS-51, DS-46, or DS-19 as shown in Table 3.

[0249] Technical solution B28. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (IV) : 5'-NxNdNxNxNdNxNdNxNxNxNxNdNxNfNxNxNxNxNx (Nx) n-3'   (IV)

[0250] wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nd independently represents a 2’-deoxy modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,

[0251] preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12 or ASMP-19 as shown in Table 1,

[0252] preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-12, DS-50, DS-51, DS-46, or DS-19 as shown in Table 3.

[0253] Technical solution B29. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the sense stand is 15-27 nucleotides in length, preferably 17-25 nucleotides, more perferably 18-23 nucleotides, more perferably 19-21 nucleotides, most perferably 19 or 21 nucleotides.

[0254] Technical solution B30. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense stand is 15-27 nucleotides in length, perferably 17-25 nucleotides, more perferably 18-23 nucleotides, more perferably 21-23 nucleotides, most perferably 21 or 23 nucleotides.

[0255] Technical solution B31. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein one or both of the sense stand and the antisense strand comprise a 3’ overhang and / or a 5’ overhang having at least one nucleotide, perferably wherein one or both of the sense stand and the antisense strand comprise a 3’ overhang and / or a 5’ overhang having at least two nucleotides, more perferably wherein the dsRNA comprises a two-nucleotide overhang at the 3’ end of the antisense strand and a blunt end at the 5’ end of the antisense strand.

[0256] Technical solution B32. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the sense strand comprises, at its 3’ end and / or 5’ end, a sense strand terminal modification, wherein preferably the sense strand terminal modification is an inverted abasic deoxyribonucleotide.

[0257] Technical solution B33. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the dsRNA is siRNA.

[0258] Technical solution B34. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the antisense strand targets to the gene of PCSK9, APOC3, ANGPTL3 or TTR.

[0259] Technical solution B35. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, the antisense stand is 21 nucleotides in length and the sense stand is 19 nucleotides in length, wherein:

[0260] (1) the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12, and further comprises the following modification:

[0261] (iii) SCP modified nucleotide at position 1; and

[0262] (iv) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 1 and 2, positions 2 and 3, positions 19 and 20, positions 20 and 21;

[0263] the sense strand comprises the following modification:

[0264] (i) 2’-O-methyl modified nucleotides at positions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 and 19;

[0265] (ii) 2’-fluoro modified nucleotides at positions 7, 8 and 9;

[0266] (iii) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 1 and 2, positions 2 and 3, positions 18 and 19,

[0267] or (2) the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12, and further comprises the following modification:

[0268] (iii) SCP modified nucleotide at position 1; and

[0269] (iv) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 2 and 3, positions 19 and 20, positions 20 and 21;

[0270] the sense strand comprises the following modification:

[0271] (i) 2’-O-methyl modified nucleotides at positions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 and 19;

[0272] (ii) 2’-fluoro modified nucleotides at positions 7, 8 and 9;

[0273] (iii) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 1 and 2, positions 2 and 3, positions 18 and 19,

[0274] or (3) the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12, and further comprises the following modification:

[0275] (iii) SCP modified nucleotide at position 1; and

[0276] (iv) phosphorothioate internucleotide linkage in Rp configuration between positions 2 and 3; and

[0277] (v) phosphorothioate internucleotide linkages in Sp configuration between positions 19 and 20, and between positions 20 and 21;

[0278] the sense strand comprises the following modification:

[0279] (i) 2’-O-methyl modified nucleotides at positions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 and 19;

[0280] (ii) 2’-fluoro modified nucleotides at positions 7, 8 and 9;

[0281] (iii) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 1 and 2, positions 2 and 3, positions 18 and 19; and

[0282] (iv) a nucleotide comprising a phosphorothioate group at position 19.

[0283] Technical solution B36. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the sense strand is conjugated, at its 3’ end and / or 5’ end a delivery moiety, wherein the delivery moiety is preferably a GalNAc-containing delivery moiety.

[0284] Technical solution B37. The dsRNA of any one of preceding technical solutions, wherein the sense strand and the antisense strand comprises the sequences selected from Tables 4, 8, 10, 12-13, and 15.

[0285] Technical solution B38. A cell, comprising the dsRNA of any one of technical solutions B1-B37.

[0286] Technical solution B39. A pharmaceutical composition, comprising the dsRNA of any one of technical solutions B1-B37, or the cell of technical solution B38, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0287] Technical solution B40. A kit, comprising the dsRNA of any one of technical solutions B1-B37, the cell of technical solution B38, or the pharmaceutical composition of technical solution B39.

[0288] Technical solution B41. A method of inhibiting gene expression in a subject, wherein the method comprises administrating to the subject the dsRNA of any one of technical solutions B1-B37, the cell of technical solution B38, or the pharmaceutical composition of technical solution B39, preferably the subject is a human.

[0289] EXAMPLES

[0290] Example 1 Synthesis of siRNA

[0291] The siRNA of the present invention was prepared using the solid-phase phosphoramidite method well known in the art. The specific methods can be referred to, for example, PCT Publication Nos. WO2016081444 and WO2019105419, and are briefly described below.

[0292] 1.1 Synthesis of Sense Strand (SS)

[0293] Using the solid-phase phosphoramidite method, a blank CPG solid support was used as the starting cycle, and nucleoside monomers or targeting moiety were linked one by one according to the arrangement of sense strand nucleotides from the 3' to 5' direction. Each linkage of a nucleoside monomer involved four steps of deprotection, coupling, capping, and oxidation or thiolation to synthesize 5 μmol oligonucleotide. The synthesis conditions were as follows:

[0294] Nucleoside monomers were provided in a 0.05 mol / L acetonitrile solution. The conditions for each step were identical: 25℃; deprotection for 3 times using a 3%trichloroacetic acid-dichloromethane solution; coupling twice using a 0.25 mol / L 5-(ethylthio) -1H-tetrazole (ETT) -acetonitrile solution as an activator; capping twice using 10%acetic anhydride-acetonitrile and pyridine / N-methylimidazole / acetonitrile (10: 14: 76, v / v / v) ; oxidation twice using 0.05 mol / L of iodine in tetrahydrofuran / pyridine / water (70: 20: 10, v / v / v) ; thiolation twice using 0.2 mol / L phenylacetyl disulfide (PADS) in acetonitrile / 3-methylpyridine (1: 1, v / v) .

[0295] 1.2 Synthesis of Antisense Strand (AS)

[0296] Using the solid-phase phosphoramidite method, a blank CPG solid support was used as the starting cycle, and nucleoside monomers were linked one by one according to the arrangement of antisense strand nucleotides from the 3' to 5' direction. Each linkage of a nucleoside monomer involved four steps of deprotection, coupling, capping, and oxidation or thiolation. The conditions for the synthesis of a 5 μmol oligonucleotide for the antisense strand were identical to those for the sense strand.

[0297] 1.3 Purification and Annealing of Oligonucleotides

[0298] 1.3.1 Ammonolysis

[0299] The synthesized solid support (sense or antisense strand) was transferred to a 5 mL centrifuge tube, followed by the addition of 3%diethylamine / ammonia (v / v) or a mixed solution of ammonia and methylamine (50%-50%, v / v) . The mixture was allowed to react in a thermostatic water bath at 35℃ (or 55℃) for 16 h (or 8 h) , and then filtered. The solid support was washed three times with ethanol / water, 1 mL each time. The filtrate was concentrated by centrifugation, and the crude product was purified.

[0300] 1.3.2 Purification

[0301] The methods for purification and desalting are well known to those skilled in the art. For example, a strong anionic packing column can be used; a sodium chloride-sodium hydroxide system can be used for elution and purification. The product can be collected in tubes and desalted using a gel packing purification column. The elution system can be pure water.

[0302] 1.3.3 Annealing

[0303] The sense strand (SS) was mixed with the antisense strand (AS) at a molar ratio (SS / AS = 1 / 1.05) according to the instructions. The mixture was heated in a water bath to 70-95℃ for 3-5 min, and then allowed to cool naturally to room temperature. The system was freeze-dried to obtain the product.

[0304] A chiral-modified dimer intermediate is required to produce a chirally-modified phosphorothioate internucleotide linkage. Such dimer intermediates are known in the art. See, for example, PCT Publication No. WO2019126651.

[0305] The following siRNA molecules were synthesized according to the method described herein. The specific sequences of the siRNAs are shown in the following Tables 4, 8, 10, 12-13, and 15.

[0306] Table 4. The specific siRNA molecules targeting PCSK9, APOC3, ANGPTL3 or TTR

[0307] The abbreviations used herein have the meaning as follows:

[0308] “A” , “U” , “G” , and “C” represent natural adenine ribonucleotide, uracil ribonucleotide, guanine ribonucleotide, and cytosine ribonucleotide, respectively.

[0309] “d” represents that the righ nucleotide is a deoxyribonucleotide. For example, dA, dT, dG and dC represent adenine deoxyribonucleotide, thymine deoxyribonucleotide, guanine deoxyribonucleotide, and cytosine deoxyribonucleotide, respectively.

[0310] “i” represents inosine ribonucleotide.

[0311] “m” represents that the left nucleotide is a 2'-OCH3 modified nucleotide. For example, Am, Um, Gm, and Cm represent 2'-OCH3 modified A, U, G, and C, respectively.

[0312] “f” represents that the left nucleotide is a 2'-F modified nucleotide. For example, Af, Uf, Gf, and Cf represent 2'-F modified A, U, G, and C, respectively.

[0313] "s" or "-s" represents that the flanking two nucleotides, the delivery moiety, or other structures are connected by a phosphorothioate internucleotide linkage.

[0314] “ss” , “rps” and “sps” represent that the flanking two nucleotides, the delivery moiety, or other structures are connected by a phosphorodithioate internucleotide linkage, a phosphorothioate internucleotide linkage in Rp configuration and Sp configuration, respectively.

[0315] Unless otherwise specified, the flanking two nucleotides, the delivery moiety, or other structures in the sequences above are connected by a phosphodiester internucleotide linkage.

[0316] The structures of phosphodiester internucleotide linkage, phosphorothioate internucleotide linkage (Sp configuration) and phosphorothioate internucleotide linkage (Rp configuration) are shown as below.

[0317] “SCP modified nucleotide” means a modified nucleotide with the following structure:  wherein Base is independely selected from H, modified or unmodified bases or leaving groups. Preferably, Base is an unmodified base, including adenine base, uracil base, guanine base, and cytosine base.

[0318] In some embodiments, Base is a modified base.

[0319] (SCP-Um) represents the above structure with Base being uracil.

[0320] Example 2 Assessment in an In Vivo Mouse Model

[0321] The siRNAs of the present invention were tested on four genes (PCSK9, APOC3, ANGPTL3 and TTR) , using corresponding mice and ELISA kits to evaluate in-vivo activity.

[0322] Table 5

[0323] After the acclimation period, on Day 4 before administration (D-4) , each mouse was bled from the orbital vein. After centrifugation, serum samples were collected. The level of human corresponding protein in the serum of each mouse was detected by ELISA assay as the experimental baseline, and the mice were grouped for administration according to the baseline levels (3-4 mice in each group) . On the day of administration (D0) , mice in each group were subcutaneously injected with saline or the siRNA to be tested. Mouse serum was collected at multiple time points after administration, and the level of the corresponding protein was measured by ELISA assay. The knockdown efficiency of siRNA was calculated by comparing the protein levels in the serum of each mouse before and after administration.

[0324] The results of the in-vivo activity evaluation experiment in PCSK9 transgenic mice on D7 and D14 (administration dose: 1 mg / kg) are shown in Table 4.

[0325] Table 6. Activity evaluation results of hPCSK9 transgenic mice (normalized to pre-dose)

[0326] The results of the in-vivo activity evaluation experiment in ANGPTL3 widetype mice on D14 (administration dose: 2 mg / kg) are shown in Fig. 1 and Fig. 2.

[0327] The results of the in-vivo activity evaluation experiment in APOC3 transgenic mice on D14, D28, D42 and D56 (administration dose: 1 mg / kg) are shown in Fig. 3 and Table 7.

[0328] Table 7

[0329] N.D. = not detected

[0330] The results of the in-vivo activity evaluation experiment in TTR transgenic mice on D7 and D14 (administration dose: 1 mg / kg) are shown in Fig. 4.

[0331] Example 3 Assessment of siRNAs with reduced PS modification at 5’ end of the sense strand in an In Vivo Mouse Model

[0332] According to the method of Example 2, the siRNAs of the present invention was further tested. The results of hPCSK9 level in PCSK9 transgenic mice on D14, D28, D41 and D56 (administration dose: 1 mg / kg) are shown in the table below.

[0333] Table 8

[0334] Table 9

[0335] As shown in the table above, replacing the phosphorothioate linkage with a natural phosphodiester linkage in the first internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand did not reduce the potency of the tested siRNA molecules.

[0336] Example 4 Assessment of siRNAs with reduced PS modification at 5’ end of the antisense strand in an In Vivo Mouse Model

[0337] Table 10

[0338] DL0370 represents the following structure:

[0339] NHC6 represents the following structure:

[0340] (close to the 5’ end side)

[0341] DL0426 represents the following structure:

[0342] See, for example, PCT Application No. PCT / CN2025 / 070456.

[0343] According to the method of Example 2, the siRNAs of the present invention were further tested. The results of mAdipoq level in C57BL / 6 mice on D7, D14, D28, D42, D56 and D70 (administration dose: 2 mg / kg) are shown in the table below.

[0344] Table 11

[0345] As shown in the table above, compared with the phosphorothioate linkage, the tested siRNA molecules using a natural phosphodiester linkage in the first internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand showed significantly higher potency.

[0346] Example 5 Assessment of siRNAs with reduced PS modification at 3’ end of the sense strand and a phosphordithioate modification at 3’ end of the antisense strand in an In vivo Mouse Model

[0347] According to the method of Example 2, the siRNAs of the present invention was further tested. The siRNAs in this example, directed to the ApoB gene and LDL-C level, were used to reflect the knock-down level of ApoB mRNA. The results of the in-vivo activity evaluation experiment in widetype mice on D7, D14, D28, D42 and D56 (administration dose: 3 mg / kg) are shown in Fig. 5.

[0348] Table 12

[0349] As shown in Fig. 5 (298 vs 201, 299 vs 202) , replacing the phosphorothioate linkage with a natural phosphodiester linkage in the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand did not reduce the potency of the tested siRNA molecules.

[0350] In addition, replacing the phosphorothioate linkages with a phosphorodithioate linkage in the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand (DR014322) did not reduce the potency of the tested siRNA molecules (201 vs322) .

[0351] According to the method of Example 2, the siRNAs of the present invention targeting TTR were further tested. The results of the in-vivo activity evaluation experiment in mice on D7, D14, D28 and D42 (administration dose: 0.3 mg / kg) are shown in the table below.

[0352] Table 13

[0353] Table 14

[0354] The results of TTR targeting siRNAs in Table 14 are consistent with those of ApoB targeting siRNAs as set forth above, showing that the modification patterns of the present invention are compatible with various sequences and / or targets.

[0355] Example 6 Assessment of siRNAs with reduced chirally-modified PS modification in an In Vivo Mouse Model

[0356] According to the method of Example 2, the siRNAs of the present invention were further tested. The results of hPCSK9 level in PCSK9 transgenic mice on D14, D28, D42 and D56 (administration dose: 1 mg / kg) are shown in the table below.

[0357] Table 15

[0358] Table 16

[0359] As shown in the table above, compared with phosphorothioate linkages, siRNAs with chirally-modified phosphorothioate linkages have higher potency, especially on D28, D42 and D56, suggesting a long-acting effect.

[0360] Example 7 5′-PDE II Exonuclease Stability Experiment

[0361] Phosphodiesterase exonuclease experiment was conducted to show the stability of the antisense strands of the present invention. The experimental method was known in the art, see, e.g., Nucleic Acids Research, 2022, Vol. 50, No. 3 1221–1240, which was briefly described below.

[0362] Oligonucleotides were added at 0.1 mg / ml to a solution of 50 mM sodium acetate (pH 6.5) and 10 mM MgCl2. Phosphodiesterase II (PDE II) from bovine spleen (Worthington, cat #LS003 602) was added to the mixture at 500 mU / ml.

[0363] Aliquots were analyzed every hour for 24 h by injection onto a Dionex DNAPac PA200 column (4 mm x 250 mm) at 30℃ run at a flow rate of 1ml / min with a gradient of 37-52%Buffer B over 7.5 min.

[0364] Buffer A was 20 mM sodium phosphate, 15%acetonitrile, pH 11; Buffer B was Buffer A containing 1 M sodium bromide (pH 11) .

[0365] The area under the peak corresponding to full-length oligonucleotide was normalized to the area from the 0 h time point to show the remaining antisense strand.

[0366] The tested antisense strands are shown in the following table, where the underlined sequences indicate the variable regions among the strands.

[0367] Table 17

[0368] Table 18

[0369] As shown in Table 16 and known in the art, a phosphorothioate (PS) modification at the first internucleotide linkage of the antisense strand is critical to the resistance against 5’-PDE II exonuclease (SR022285A vs. SR026891A) . It is surprisingly found that the usage of phosphonate modification at the 5’ terminal position of the antisense strand helps to maintain such resistance even without a PS modification at the first internucleotide linkage of the antisense strand.

Claims

A dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises a modification pattern as shown in Table 1 of the description.A dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description.A dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises a modification pattern as shown in Table 1 of the description, wherein the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description.The dsRNA of any one of claims 1-3, wherein the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern as shown in Table 3 of the description.A dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the antisense strand comprises 1 or 5 of 2’-fluoro modified nucleotides, and comprises a 2’-fluoro modified nucleotide at positon 14.The dsRNA of claim 5, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (I) :5'-NxNfNxNxNxNxNfNxNxNxNxNfNxNfNxNfNxNxNx (Nx) n-3'   (I)wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-4, ASMP-17, or ASMP-42 as shown in Table 1,preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-4, DS-52, DS-43, DS-48, DS-85, DS-17, or DS-41 as shown in Table 3.The dsRNA of claim 5, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (II) :5'-NxNfNxNxNxNfNxNxNxNxNxNfNxNfNxNfNxNxNx (Nx) n-3'   (II)wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-6 as shown in Table 1,preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-6 as shown in Table 3.The dsRNA of claim 5, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (III) :5'-NxNfNxNxNfNxNfNxNxNxNxNfNxNfNxNxNxNxNx (Nx) n-3'   (III)wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12 or ASMP-19 as shown in Table 1,preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-12, DS-50, DS-51, DS-46, or DS-19 as shown in Table 3.The dsRNA of claim 5, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (IV) :5'-NxNdNxNxNdNxNdNxNxNxNxNdNxNfNxNxNxNxNx (Nx) n-3'   (IV)wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nd independently represents a 2’-deoxy modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-38, ASMP-43, ASMP-59, ASMP-62, ASMP-63, ASMP-64, ASMP-65, ASMP-66, ASMP-67, or ASMP-68 as shown in Table 1,preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-38, DS-40, DS-49, DS-42, DS-69, DS-72, DS-73, DS-74, DS-75, DS-76, DS-77, or DS-78 as shown in Table 3.The dsRNA of any one of claims 1-9, wherein the sense stand is 15-27 nucleotides in length, preferably 17-25 nucleotides, more perferably 18-23 nucleotides, more perferably 19-21 nucleotides, most perferably 19 or 21 nucleotides.The dsRNA of any one of claims 1-10, wherein the antisense stand is 15-27 nucleotides in length, perferably 17-25 nucleotides, more perferably 18-23 nucleotides, more perferably 21-23 nucleotides, most perferably 21 or 23 nucleotides.The dsRNA of any one of claims 1-11, wherein one or both of the sense stand and the antisense strand comprise a 3’ overhang and / or a 5’ overhang having at least one nucleotide, perferably wherein one or both of the sense stand and the antisense strand comprise a 3’ overhang and / or a 5’ overhang having at least two nucleotides, more perferably wherein the dsRNA comprises a two-nucleotide overhang at the 3’ end of the antisense strand and a blunt end at the 5’ end of the antisense strand.The dsRNA of any one of claims 1-12, wherein the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand comprises an antisense strand phosphonate modification, wherein the antisense strand phosphonate modification is preferably a SCP modification.The dsRNA of any one of claims 1-13, wherein the sense strand and / or the antisense strand comprise, at their 3’ end and / or 5’ end, 1-5 phosphorothioate internucleotide linkages, perferably 2-4 phosphorothioate internucleotide linkages, wherein more perferably each of the sense strand and the antisense strand comprises, at its 3’ end and 5’ end, 2 phosphorothioate internucleotide linkages.The dsRNA of claim 14, wherein the first internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a natural phosphodiester linkage, and the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand comprises an SCP modifiecation,preferably, the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage,preferably, the first and the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the sense strand is each a phosphorothioate linkage,preferably, the first and the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is each a phosphorothioate linkage.The dsRNA of claim 14, wherein the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a natural phosphodiester linkage,preferably, the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a phosphorothioate linkage,preferably, the first and the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the sense strand is each a phosphorothioate linkage,preferably, the first and the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is each a phosphorothioate linkage.The dsRNA of any one of claims 14-15, wherein:the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage in Rp configuration; the first and the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is each a phosphorothioate linkage in Sp configuration,or the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is a phosphorodithioate linkage and optionally the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is a natural phosphodiester linkage.The dsRNA of any one of claims 1-17, wherein the sense strand comprises, at its 3’ end and / or 5’ end, a sense strand terminal modification, wherein preferably the sense strand terminal modification is an inverted abasic deoxyribonucleotide.A dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand optionally comprises an antisense strand phosphonate modification, wherein the first internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a natural phosphodiester linkage.The dsRNA of claim 19, wherein the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage.The dsRNA of claims 19 or 20, wherein the first and the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the sense strand is each a phosphorothioate linkage.The dsRNA of any one of claims 19-21, wherein the first and the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is each a phosphorothioate linkage.The dsRNA of any one of claims 19-22, wherein the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a phosphorothioate linkage.The dsRNA of any one of claims 19-23, wherein the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a natural phosphodiester linkage.The dsRNA of any one of claims 19-24, wherein the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a phosphorothioate linkage.A dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a duplex region, wherein the sense strand and the antisense strand are independently 15-30 nucleotides in length, wherein the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a natural phosphodiester linkage.The dsRNA of claim 26, wherein the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the sense strand is a phosphorothioate linkage.The dsRNA of claims 26 or 27, wherein the first and the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the sense strand is each a phosphorothioate linkage.The dsRNA of any one of claims 26-28, wherein the first and the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is each a phosphorothioate linkage.The dsRNA of any one of claims 26-29, wherein the first internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage.The dsRNA of any one of claims 26-30, wherein the first internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a natural phosphodiester linkage.The dsRNA of any one of claims 26-31, wherein the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage.The dsRNA of any one of claims 26-32, wherein the antisense strand comprises an antisense strand phosphonate modification, preferably the first nucleotide counting from the 5’ end of the antisense strand comprises the antisense strand phosphonate modification.The dsRNA of any one of claims 19-33, wherein at least one of the phosphorothioate linkage is a chirally-modified phosphorothioate linkage.The dsRNA of claim 34, wherein the phosphorothioate linkage in the antisense strand and / or in the sense strand is each a chirally-modified phosphorothioate linkage.The dsRNA of claim 35, wherein the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage in Rp configuration.The dsRNA of claim 36, wherein:the second internucleotide linkage counting from the 5’ end of the antisense strand is a phosphorothioate linkage in Rp configuration; the first and the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is each a phosphorothioate linkage in Sp configuration,or the first internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is a phosphorodithioate linkage and optionally the second internucleotide linkage counting from the 3’ end of the antisense strand is a natural phosphodiester linkage.The dsRNA of any one of claims 19-37, wherein the antisense strand phosphonate modification is selected from a vinylphosphonate modification, a cycloalkyl phosphonate modification, a 4-methyl phosphonate modification, or a spiro phosphonate modification, preferably a spiro phosphomate modification, more preferably a SCP modification.The dsRNA of any one of claims 19-38, wherein the antisense strand further comprises a modification pattern as shown in Table 1 of the description.The dsRNA of any one of claims 19-39, wherein the sense strand further comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description.The dsRNA of any one of claims 19-40, wherein the antisense strand comprises a modification pattern as shown in Table 1 of the description, wherein the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description.The dsRNA of any one of claims 19-41, wherein the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern as shown in Table 3 of the description.The dsRNA of any one of claims 19-38, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (I) :5'-NxNfNxNxNxNxNfNxNxNxNxNfNxNfNxNfNxNxNx (Nx) n-3'   (I)wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-4, ASMP-17, or ASMP-42 as shown in Table 1,preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-4, DS-52, DS-43, DS-48, DS-85, DS-17, or DS-41 as shown in Table 3.The dsRNA of any one of claims 19-38, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (II) :5'-NxNfNxNxNxNfNxNxNxNxNxNfNxNfNxNfNxNxNx (Nx) n-3'   (II)wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-6 as shown in Table 1,preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-6 as shown in Table 3.The dsRNA of any one of claims 19-38, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (III) :5'-NxNfNxNxNfNxNfNxNxNxNxNfNxNfNxNxNxNxNx (Nx) n-3'   (III)wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12 or ASMP-19 as shown in Table 1,preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-12, DS-50, DS-51, DS-46, or DS-19 as shown in Table 3.The dsRNA of any one of claims 19-38, wherein the antisense strand comprises a structure of formula (IV) :5'-NxNdNxNxNdNxNdNxNxNxNxNdNxNfNxNxNxNxNx (Nx) n-3'   (IV)wherein each Nf independently represents a 2’-fluoro modified nucleotide; each Nd independently represents a 2’-deoxy modified nucleotide; each Nx independently represents a modified or unmodified nucleotide; n is an integer of 0-7,preferably, the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12 or ASMP-19 as shown in Table 1,preferably, the sense strand comprises a modification pattern as shown in Table 2 of the description, more preferably, the sense strand and the antisense strand comprise a paired modification pattern of DS-12, DS-50, DS-51, DS-46, or DS-19 as shown in Table 3.The dsRNA of any one of claims 19-46, wherein the sense stand is 15-27 nucleotides in length, preferably 17-25 nucleotides, more perferably 18-23 nucleotides, more perferably 19-21 nucleotides, most perferably 19 or 21 nucleotides.The dsRNA of any one of claims 19-47, wherein the antisense stand is 15-27 nucleotides in length, perferably 17-25 nucleotides, more perferably 18-23 nucleotides, more perferably 21-23 nucleotides, most perferably 21 or 23 nucleotides.The dsRNA of any one of claims 19-48, wherein one or both of the sense stand and the antisense strand comprise a 3’ overhang and / or a 5’ overhang having at least one nucleotide, perferably wherein one or both of the sense stand and the antisense strand comprise a 3’ overhang and / or a 5’ overhang having at least two nucleotides, more perferably wherein the dsRNA comprises a two-nucleotide overhang at the 3’ end of the antisense strand and a blunt end at the 5’ end of the antisense strand.The dsRNA of any one of claims 19-49, wherein the sense strand comprises, at its 3’ end and / or 5’ end, a sense strand terminal modification, wherein preferably the sense strand terminal modification is an inverted abasic deoxyribonucleotide.The dsRNA of any one of claims 1-50, the antisense stand is 21 nucleotides in length and the sense stand is 19 nucleotides in length, counting from 5’ end, wherein:(1) the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12, and further comprises the following modification:(iii) SCP modified nucleotide at position 1; and(iv) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 1 and 2, positions 2 and 3, positions 19 and 20, positions 20 and 21;the sense strand comprises the following modification:(i) 2’-O-methyl modified nucleotides at positions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 and 19;(ii) 2’-fluoro modified nucleotides at positions 7, 8 and 9;(iii) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 1 and 2, positions 2 and 3, positions 18 and 19,or (2) the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12, and further comprises the following modification:(iii) SCP modified nucleotide at position 1; and(iv) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 2 and 3, positions 19 and 20, positions 20 and 21;the sense strand comprises the following modification:(i) 2’-O-methyl modified nucleotides at positions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 and 19;(ii) 2’-fluoro modified nucleotides at positions 7, 8 and 9;(iii) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 1 and 2, positions 2 and 3, positions 18 and 19,or (3) the antisense strand comprises a modification pattern of ASMP-12, and further comprises the following modification:(iii) SCP modified nucleotide at position 1; and(iv) phosphorothioate internucleotide linkage in Rp configuration between positions 2 and 3; and(v) phosphorothioate internucleotide linkages in Sp configuration between positions 19 and 20, and between positions 20 and 21;the sense strand comprises the following modification:(i) 2’-O-methyl modified nucleotides at positions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 and 19;(ii) 2’-fluoro modified nucleotides at positions 7, 8 and 9;(iii) phosphorothioate internucleotide linkage between positions 1 and 2, positions 2 and 3, positions 18 and 19; and(iv) a nucleotide comprising a phosphorothioate group at position 19.The dsRNA of any one of claims 1-51, wherein the sense strand is conjugated, at its 3’ end and / or 5’ end a delivery moiety, wherein the delivery moiety is preferably a GalNAc-containing delivery moiety.The dsRNA of any one of claims 1-51 wherein the sense strand and the antisense strand comprises the sequences selected from Tables 4, 8, 10, and 12-13, and 15.The dsRNA of any one of claims 1-53, wherein the dsRNA is siRNA.A cell, comprising the dsRNA of any one of claims 1-54.A pharmaceutical composition, comprising the dsRNA of any one of claims 1-54, or the cell of claim 55, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.A kit, comprising the dsRNA of any one of claims 1-54, the cell of claim 55, or the pharmaceutical composition of claim 56.A method of inhibiting gene expression in a subject, wherein the method comprises administrating to the subject the dsRNA of any one of claims 1-54, the cell of claim 55, or the pharmaceutical composition of claim 56, preferably the subject is a human.

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