Isolated akkermansia muciniphila, composition comprising the same, and use thereof

Abstract

The present invention provides an isolated Akkermansia muciniphila strain, composition comprising the same, and use thereof, which can be used for treating, preventing, or alleviating obesity, metabolic disorders induced by obesity, diabetes, inflammation, liver and kidney diseases, liver diseases, cardiovascular and cerebrovascular diseases, brain aging, tumors, etc. Additionally, it can be used for preventing and treating metabolic disorders after discontinuation of GLP-1 receptor agonist drugs, preventing weight rebound and blood glucose rebound, and maintaining glucose homeostasis.

Description

ISOLATED AKKERMANSIA MUCINIPHILA, COMPOSITION COMPRISING THE SAME, AND USE THEREOFTECHNICAL FIELD

[0001] The present invention relates to a novel strain of Akkermansia muciniphila obtained by natural isolation, a composition comprising the same, and use thereof in the prevention and / or treatment of metabolic diseases, the prevention and treatment of brain aging, the treatment of metabolic disorders after discontinuation of GLP-1 receptor agonist drug therapy for metabolic diseases, and the prevention of weight rebound or blood glucose rebound.BACKGROUND

[0002] Akkermansia muciniphila is a mucin-degrading bacterium commonly colonized in the intestines of human and many animals.

[0003] Screening for novel strains of Akkermansia muciniphila faces significant difficulties because Akkermansia muciniphila primarily resides in the intestines of human or animals, is a strictly anaerobic microorganism with extremely high requirements for nutritional and cultural environments, and has a long growth cycle. Furthermore, during efficacy validation, bacteria of this genus are difficult to validate through in vitro cell experiments due to their anaerobic nature; during in vivo animal experiments, bacteria of this genus struggle to maintain stable viable cell counts due to difficulty in cultivation and their highly anaerobic nature, and issue of insufficient reproducibility exists. These technical challenges related to in vitro and in vivo studies limit the discovery and application of novel Akkermansia muciniphila strains.

[0004] Furthermore, Akkermansia muciniphila grows relatively slowly and finds it difficult to compete with other microbial strains, thus posing challenge in acquisition during screening process.

[0005] The AKK PROBIO strain disclosed in CN116925975B exhibits hydrophobicity reaching 31%at 60 minutes, with the auto-aggregation tends to stabilize at around 52%at 20 hours. Some literature suggests that AKK PROBIO has a very weak ability to form biofilms, and in vitro test results indicate that AKK PROBIO has low colonization ability in the intestine (https:  / / doi. org / 10.3390 / foods13030442, Section 3.1) . Weak colonization and adhesion abilities of the AKK strain limits development of its commercial product.

[0006] The prevalence of metabolic diseases such as obesity, diabetes, hypertension, hyperlipidemia, and fatty liver disease is continually increasing. Concurrently, studies have shown that these diseases are associated with dysbiosis of microbiota. In many populations, Akkermansia muciniphila is negatively correlated with obesity, diabetes, cardiovascular diseases, and low-grade inflammation. Akkermansia muciniphila can protect the integrity of intestinal epithelial cells and the mucus layer, thereby exerting metabolic protective effects.

[0007] In the prior art, mixtures of multiple microorganisms are often used for treating metabolic and obesity-related diseases or disorders, such as probiotics or fecal microbiota transplantation (FMT) . However, mixtures of multiple microorganisms make the mechanism more complex, the mutual influences among the microorganisms are not yet maturely studied, and the use of microbial mixtures often disrupts the homeostasis of the gut microbiota. Furthermore, the use of microbial mixtures requires additional consideration of whether the microorganisms affect each other’s viability; meanwhile, it also remains unclear whether the synergistic effect of the microbial mixture or a single bacterium within it, is responsible for the therapeutic or preventive effect in diseases.

[0008] The number of microbial resources is extremely vast, and screening for new species or strains capable of being effectively used to treat or prevent diseases such as obesity, diabetes, hypertension, hyperlipidemia, liver and kidney diseases, tumors, etc., from the microbial resources represents a huge challenge, but also signifies a vast unmet need.

[0009] With improvements in living standards and changes in lifestyle, the incidence of obesity is rising rapidly. GLP-1 agonists such as semaglutide and liraglutide induce four types of gastrointestinal adverse reactions at a higher incidence rate than other weight-loss drugs, including biliary diseases, pancreatitis, intestinal obstruction, and gastrospasm. Existing GLP-1 receptor agonist analogs as weight-loss drugs often lead to “compensatory rebound” in appetite after discontinuation, making weight loss more difficult. Moreover, after discontinuation of GLP-1 agonists, metabolic disorders are prone to occur, particularly potential drug dependence or body damage from medication (e.g., pancreaticβ-cell damage) , leading to phenomena such as blood glucose imbalance, failure to maintain weight-loss effect, and even weight rebound. One clinical trial showed that participants who received semaglutide treatment regained over 50%of the lost weight after drug discontinuation for one-year, with diabetes treatment returned to baseline levels. Addressing body damage after discontinuing GLP drugs and treating metabolic disorders after drug discontinuation, including maintaining healthy weight levels in obesity, maintaining blood glucose balance in diabetes, and managing metabolic-associated fatty liver diseases (MAFLD) and local fat metabolic levels, are currently pressing problems that need to be solved. Active proteins such as Amuc1100 are important active substances in the Akkermansia muciniphila species, playing significant roles in metabolic regulation. Fermentation processes that promote increased Amuc protein content are of great significance in promoting the role of Akkermansia muciniphila in metabolic diseases and metabolic disorders following discontinuation of GLP-1 receptor agonist.

[0010] Aging is a natural phenomenon. Studies have shown that the aging process is also influenced by a combination of factors including mitochondrial function, telomeres, inflammation, genes, metabolic pathways, epigenetics, body clocks, dysregulated nutrient sensing, and microbiota dysbiosis (Campisi, J., Kapahi, P., Lithgow, G. J. et al. From discoveries in ageing research to therapeutics for healthy ageing. Nature 571, 183–192 (2019) . https:  / / doi. org / 10.1038 / s41586-019-1365-2) . Among these, mitochondrial function is closely related to cellular aging and brain aging. The aging of nerve cells and brain is closely related to diseases such as motor impairment, amnesia, Parkinson’s disease (PD) , and Alzheimer’s disease. Mitochondrial dysfunction is an important cause of PD pathogenesis. For example, expression of Sir2.1 and SIRT1 can induce the mitochondrial unfolded protein response (UPRmt) , improve mitochondrial function, and significantly extend the lifespan of nematodes or mammals. Studies have found that overexpression of Sir2 significantly suppressed motor neuron degeneration in transgenic drosophila model of Parkinson’s disease (PD) , markedly improving motor ability of drosophila, and the protective effect of Sir2 was significantly weakened when UPRmt was inhibited.

[0011] CN116925975B used APP / PS1 double transgenic mice. Literature reports that these mice exhibit early AD symptoms such asβ-amyloid plaque deposition, hyperphosphorylated tau protein (but unable to form NFTs) , microglial proliferation, neuronal degeneration, and synaptic damage. APP / PS1 double transgenic mice show decreased SIRT1 expression, and stimulating SIRT1 expression can improve AD symptoms. Abnormal deposition ofβ-amyloid protein into plaques in the brain reduces the number of hippocampal neuronal axons, leading to a decline in neurological function and consequently the onset of AD. Hyperphosphorylation of Tau protein leads to neurofibrillary tangles, which causes decreased physiological activity, pathological changes, or even death of the neurons, resulting in brain parenchymal atrophy and triggering onset of AD. Activation of microglia leading to neuroinflammation is one of the important factor for triggering AD.

[0012] Preventing or treating brain aging, particularly aging diseases associated with aging of brain nerve cells or nervous system, and treating diseases related to brain aging such as Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease by regulating the expression of genes related to aging of brain, brain nerve cells or nervous system, such as sir2.1 or SIRT1 homologous genes, remains an unresolved problem.

[0013] In summary, screening for new species or strains that can be effectively used for treating metabolic diseases, treating metabolic disorders after discontinuation of GLP-1 receptor agonists, repairing body damage after discontinuation of GLP-1 receptor agonists, delaying brain aging, and particularly applying them to the treatment of aging of brain nervous system, represents a huge challenge, but also signifies a vast unmet need.SUMMARY

[0014] The present invention isolates and obtains a novel Akkermansia muciniphila strain, MNH19250, the genomic information of which has been uploaded to NCBI GenBank (website address: https:  / / www. ncbi. nlm. nih. gov / nuccore / JBQKMJ000000000) , with the accession number of: JBQKMJ000000000. The accession number for 16S rRNA of the strain is PX112495.

[0015] In a first aspect, the present invention provides an isolated Akkermansia muciniphila strain having an Average Nucleotide Identity (ANI) value of at least 95%, at least 95.5%, at least 96%, at least 96.5%, at least 97%, at least 97.1%, at least 97.2%, at least 97.3%, at least 97.4%, or at least 97.5%with the Akkermansia muciniphila (GCF_000020225.1) , and / or having a 16S rRNA sequence having at least 98.65%identity to the sequence as set forth in SEQ ID NO: 1.

[0016] In some embodiments, the Akkermansia muciniphila strain has an Alignment Fraction (AF) of at least 90%, at least 90.5%, at least 91.5%, at least 92%, at least 92.5%, at least 93%, at least 93.5%, at least 94%, at least 94.5%, at least 95%, at least 95.5%, at least 96%, at least 96.5%, at least 97%, at least 97.5%, at least 98%, at least 98.5%, at least 99%, at least 99.5%, or 100%with the Akkermansia muciniphila (GCF_000020225.1) .

[0017] In some embodiments, the Akkermansia muciniphila strain has a 16S rRNA sequence having 98%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, at least 98.65%, at least 98.7%, at least 98.8%, at least 98.9%, at least 99.0%, at least 99.1%, at least 99.2%, at least 99.3%, at least 99.4%, at least 99.5%, at least 99.6%, at least 99.7%, at least 99.8%, at least 99.9%, or 100%identity to the sequence as set forth in SEQ ID NO: 1.

[0018] In some embodiments, the Akkermansia muciniphila strain is a novel strain of the Akkermansia muciniphila species, the novel strain has an Average Nucleotide Identity (ANI) value of at least 95%, such as 95.1%, 95.2%, 95.3%, 95.4%, 95.5%, 95.6%, 95.7%, 95.8%, 95.9%, 96%, 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5%, 96.6%, 96.7%, 96.8%, 96.9%, 97%, 97.1%, 97.2%, 97.3%, 97.4%, 97.5%, 97.6%, 97.7%, 97.8%, 97.9%, 98%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, or 100%with the Akkermansia muciniphila (GCF_000020225.1) .

[0019] In some embodiments, a fermentation culture of the Akkermansia muciniphila strain comprises short-chain fatty acids, the short-chain fatty acids comprise at least one of acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, isovaleric acid, hexanoic acid, and decanoic acid.

[0020] In some embodiments, the Akkermansia muciniphila strain is Akkermansia muciniphila strain MNH19250, deposited at the Guangdong Microbial Culture Collection Center (GDMCC) under deposit number GDMCC No: 63782, on June 21, 2024.

[0021] In a second aspect, the present invention provides a composition comprising the Akkermansia muciniphila strain as described in the first aspect, or a fermentation culture thereof, or progeny strains thereof, or proteins secreted thereby.

[0022] In some embodiments, the fermentation culture of the Akkermansia muciniphila strain comprises a solid culture, a fermentation culture, or a supernatant of the fermentation culture of the Akkermansia muciniphila strain.

[0023] In some embodiments, the fermentation culture of the Akkermansia muciniphila strain comprises an inactivated fermentation broth, or a concentrated or dried product of any of the foregoing.

[0024] In some embodiments, the composition is provided in liquid form or solid form.

[0025] In some embodiments, the Akkermansia muciniphila strain in the composition is attenuated strain, inactivated strain, lyophilized strain, or irradiated strain, for example, it may be heat-inactivated strain, preferably pasteurized strain.

[0026] In some embodiments, the composition is in a form of liquid, foam, cream, spray, powder (e.g., lyophilized powder) , or gel.

[0027] In some embodiments, the composition is in a form of powder, microencapsulated powder, capsule, tablet, lozenge, granule, oral liquid, suspension, emulsion, liquid formulation, sustained-release formulation, nano formulation, or microencapsulated capsule.

[0028] In some embodiments, the composition further comprises one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or adjuvants. The pharmaceutically acceptable excipients are well-known to those skilled in the art.

[0029] In some embodiments, the excipient may be at least one selected from the group consisting of carriers, excipients, diluents, lubricants, wetting agents, emulsifiers, suspension stabilizers, preservatives, sweeteners, and flavoring agents.

[0030] In some embodiments, the composition comprises one or more of buffer agents (e.g., sodium bicarbonate, infant formula, or sterile human milk, or other agents that allow bacterial survival and growth (e.g., survival in the acidic environment of the stomach and growth in the intestinal environment) ) , lyoprotectants, preservatives, stabilizers, binders, compaction agents, lubricants, dispersion enhancers, disintegrants, antioxidants, flavoring agents, sweeteners, and coloring agents.

[0031] In some embodiments, the composition further comprises one or more other active agents for preventing or treating metabolic diseases and / or tumors.

[0032] The composition is also for use in at least one of the following purposes: (a) appetite suppression, (b) prevention or treatment of metabolic diseases, (c) prevention or treatment of metabolic disorders, (d) repair or treatment of body damage, and (e) prevention or treatment of brain aging.

[0033] In some embodiments, the appetite suppression comprises reducing food intake and / or reducing appetite.

[0034] In some embodiments, the other active agent is selected from: GLP-1 receptor agonists, GLP-1 receptor and GCG receptor dual agonists, GLP-1 receptor, GIP receptor and GCG receptor triple agonists, AMPK agonists, or active drugs promoting GLP-1 secretion.

[0035] In some embodiments, the other active agent is selected from: metformin, sulfonylureas, meglitinides, thiazolidinediones, DPP-4 inhibitors, GLP-1 receptor agonists, SGLT2 inhibitors, insulin, pioglitazone, rosiglitazone, pentoxifylline, Ω-3-fatty acids, statins, ezetimibe, ursodeoxycholic acid, semaglutide, liraglutide, exenatide, or benaglutide.

[0036] In some embodiments, the other active agent may be an agent for preventing or treating tumors.

[0037] In some embodiments, the other active agent may be one or more of probiotics, prebiotics, or combinations thereof; preferably, the probiotic is selected from one or more of lactic acid bacteria, Lactobacillus sp., Lactococcus sp., butyrate-producing bacteria, Bifidobacterium sp., Streptococcus thermophilus, Enterococcusfaecalis, or Leuconostoc mesenteroides.

[0038] Preferably, the probiotic is selected from at least one of Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiranofaciens, Lacticaseibacillus casei, Lacticaseibacillus paracasei, Lacticaseibacillus rhamnosus, Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Lactiplantibacillus plantarum, Ligilactobacillus salivarius, Latilactobacillus curvatus, Latilactobacillus sakei, Lactococcus lactis, or Lactococcus cremoris;

[0039] Preferably, the prebiotic is selected from the group consisting of inulin, mulberry leaf extract, berberine, Ganoderma lucidum, green coffee bean extract, oats, pectin, potato or extract thereof, citrus polyphenols, Ceylon cinnamon, chromium, ergothioneine, astaxanthin, quercetin, curcumin, proanthocyanidins, resistant dextrin, yeast β-glucan, ginseng or extract thereof, nutritional compounds, biotin, polydextrose, fructooligosaccharides (FOS) , galactooligosaccharides (GOS) , starch, cellulose, β-glucan, hemicellulose, lactulose, mannan oligosaccharides, mannose oligosaccharides (MOS) , fructooligosaccharide-rich inulin, glucose oligosaccharide, tagatose, trans-galactooligosaccharides, pectin, resistant starch, xylooligosaccharides (XOS) , and any combination thereof. In some embodiments, the other active agent may be an antioxidant, for example, Vitamin C, Vitamin E, Vitamin A and precursors thereof (such asβ-carotene) , tea polyphenols, anthocyanins, resveratrol, coenzyme Q10, ergothioneine, lipoic acid, selenium, zinc, and any combination thereof.

[0040] In some embodiments, the other active agent may be an anti-aging drug, such as anti-inflammatory drugs (e.g., NSAIDs, glucocorticoids) ; metabolic regulators (e.g., metformin, rapamycin) ; growth hormone, DHEA; drugs for treating or preventing aging (e.g., Senolytics, NAD+boosters) ; immunomodulators (e.g., immunostimulants, immunosuppressants) ; etc.

[0041] In some embodiments, the composition may be formulated as a frozen composition, for example, a frozen composition prepared by flash freezing and drying, or lyophilization, for storage and / or transportation.

[0042] In some embodiments, the composition may be administered alone or in combination with a carrier such as a pharmaceutically acceptable carrier or a biocompatible scaffold.

[0043] In some embodiments, the composition is formulated for oral administration. In some embodiments, the composition is an enteric formulation. In some embodiments, the enteric formulation is a dosage form with an enteric coating. For example, the enteric formulation may be enteric-coated granules, enteric-coated tablets, or enteric-coated capsules. In some embodiments, the composition is a capsule. In some embodiments, the capsule is a hard capsule or a soft capsule; or the capsule is a sustained-release capsule, controlled-release capsule, or enteric capsule, or the capsule may be a microencapsulated capsule or microcapsule.

[0044] In some embodiments, the composition is a drug, or a health product, or a food.

[0045] In some embodiments, the composition is a dosage form suitable for infants, children, or adults.

[0046] In some embodiments, the composition is a dosage form for enteral administration or parenteral administration.

[0047] The pharmaceutical composition of the present invention may also comprise cellular components metabolized by the Akkermansia muciniphila strain, secreted proteins, secreted molecules and compounds, and the like. These may be obtained, for example, by recovering supernatant of Akkermansia muciniphila culture or by extracting the cellular components or cellular fractions, proteins, or secreted compounds from the Akkermansia muciniphila culture; they may correspond to components in an isolated form from the Akkermansia muciniphila strain, or any mixture of one or more components from the Akkermansia muciniphila strain.

[0048] In a third aspect, use of the Akkermansia muciniphila strain according to the first aspect, or the composition according to the second aspect in the manufacture of a medicament for treating, preventing, or alleviating inflammatory diseases, liver and kidney diseases, cardiovascular and cerebrovascular diseases, metabolic diseases, diseases related to intestinal barrier damage, immune-related diseases, tumors, brain aging, or for maintaining blood glucose balance, a health product, or food is provided.

[0049] In some embodiments, the metabolic diseases comprise metabolic syndrome, metabolic disorders, metabolic dysregulation, or diseases caused by metabolic disorders, including but not limited to: at least one of liver diseases, obesity and obesity-related diseases, cardiovascular diseases, cardiovascular and cerebrovascular diseases, diabetes, dyslipidemia, glucose intolerance, Type I diabetes, Type II diabetes, impaired glucose tolerance, insulin resistance, obesity, hyperglycemia, hyperinsulinemia, fatty liver, alcoholic steatohepatitis, hypercholesterolemia, hypertension, hyperlipoproteinemia, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, uremia, ketoacidosis, hypoglycemia, thrombotic diseases, dyslipidemia, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) , non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , atherosclerosis, and kidney diseases.

[0050] In some embodiments, the liver and kidney diseases comprise liver diseases, diseases related to liver function impairment, kidney injury, kidney diseases such as abnormal kidney function.

[0051] Liver diseases include but are not limited to: at least one of fatty liver, NAFLD / NASH, abnormal liver function, extrahepatic cholestasis, hepatitis, liver injury, intrahepatic cholestasis, liver fibrosis, cirrhosis, and liver cell damage.

[0052] In some embodiments, the Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be used for treating or preventing diseases related to liver function impairment, the diseases related to liver function impairment comprise at least one of the following: fatty liver, non-alcoholic fatty liver disease, non-alcoholic steatohepatitis, liver fibrosis, cirrhosis, liver cancer, or liver cell damage.

[0053] In some embodiments, causes of the liver diseases include but are not limited to at least one of high-fat diet, high-cholesterol diet, high-sugar diet, hyperlipidemia, hyperglycemia, or high cholesterol.

[0054] In some embodiments, the liver diseases include those caused by high-fat diet, high-cholesterol diet, high-sugar diet, high-fat and high-cholesterol, high-fat and high-sugar, and / or high-fat, high-cholesterol, and high-sugar.

[0055] In some embodiments, the Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be used for treating, preventing, or alleviating diseases related to liver function impairment, the diseases related to liver function impairment comprise at least one of the following: fatty liver, non-alcoholic fatty liver disease, non-alcoholic steatohepatitis, liver fibrosis, cirrhosis, or liver cell damage.

[0056] In particular, the Akkermansia muciniphila strain or the composition comprising the same of the present invention can be used for treating or preventing liver injury. The liver injury may be liver injury caused by prolonged strenuous work, liver injury caused by long-term alcohol consumption, fatty liver, drug-induced liver diseases, or liver injury caused by genetic metabolic factors.

[0057] In some embodiments, the Akkermansia muciniphila strain or the composition comprising the same of the present invention can reduce ALT and / or AST levels.

[0058] In some embodiments, the Akkermansia muciniphila strain or the composition comprising the same of the present invention can reduce liver weight.

[0059] In some embodiments, the kidney diseases include but are not limited to kidney injury, abnormal kidney function, etc. The kidney diseases include but are not limited to primary glomerulonephritis, hypertensive arteriolar nephrosclerosis, diabetic nephropathy, secondary glomerulonephritis, tubulointerstitial lesions (e.g., chronic pyelonephritis, chronic uric acid nephropathy, obstructive nephropathy, drug-induced nephropathy, etc. ) , ischemic nephropathy, etc. In some embodiments, causes of the kidney diseases comprise at least one of the following: high-fat diet, high-sugar diet, high-cholesterol diet. In some embodiments, a manifestation of the kidney diseases is elevated serum creatinine.

[0060] In some embodiments, the obesity and obesity-related diseases include but are not limited to: overweight, obesity, metabolic syndrome, cardiovascular diseases, cardiovascular and cerebrovascular diseases, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, hypertension, insulin resistance syndrome, obesity-related gastroesophageal reflux disease, steatohepatitis.

[0061] In some embodiments, the Akkermansia muciniphila strain or the composition comprising the same of the present invention can reduce body fat and / or visceral fat and / or abdominal fat.

[0062] In some embodiments, the diabetes includes but is not limited to: Type I diabetes, Type II diabetes, gestational diabetes, HDAC activity-mediated diabetes, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic eye disease, diabetic retinopathy, diabetic foot, diabetes caused by pancreatic B cell damage, diabetes caused by insulin tolerance, and diabetes caused by obesity.

[0063] In some embodiments, causes of the diabetes include but are not limited to: at least one of pancreatic cell dysfunction, decreased insulin secretion, increased insulin resistance, high-fat diet, high-sugar diet, high cholesterol, hyperlipidemia, hyperglycemia, NAFLD, or NASH.

[0064] In some embodiments, the metabolic disorders include but are not limited to: (1) glucose metabolism disorders, or (2) abnormal glucose tolerance or reduced glucose tolerance, or (3) pancreatic B cell damage, or (4) metabolic disorders caused by insulin resistance, or (5) energy metabolism disorders.

[0065] In some embodiments, the Akkermansia muciniphila strain of the present invention has the effect of increasing secretion level of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) , thereby regulating blood glucose balance of body, improving glucose tolerance of the body, further improving insulin sensitivity and leptin sensitivity of the body, and consequently achieving the prevention and / or treatment of diabetes and / or hyperlipidemia.

[0066] In some embodiments, the cardiovascular diseases or cardiovascular and cerebrovascular diseases include but are not limited to atherosclerosis, coronary heart disease, hypertension, cardiovascular diseases in patients with NAFLD or NASH, cardiovascular and cerebrovascular diseases in patients with NAFLD or NASH, and hypercholesterolemia diseases.

[0067] In some embodiments, causes of the cardiovascular diseases or cardiovascular and cerebrovascular diseases include but are not limited to at least one of atherosclerosis, NAFLD, NASH, hyperlipidemia, hyperglycemia, or high cholesterol.

[0068] Therefore, in some embodiments, the composition can modulate immunity while regulating metabolism.

[0069] In some embodiments, the composition can reduce fat while improving atherosclerosis. The fat reducing refers to reducing fat in abdominal obesity, or reducing visceral fat.

[0070] In a fifth aspect, the novel strain of the present invention exhibits superior epithelial cell adhesion capacity compared to the existing Akkermansia muciniphila strains, enabling it to effectively colonize the intestine of human or animal, thereby prolonging its residence time in the intestine and allowing it to better exert its therapeutic efficacy within the intestine. Regarding metabolic disorders and body damage (e.g., pancreaticβcell damage) caused by discontinuation of GLP-1 receptor agonists and analogs thereof, the Akkermansia muciniphila strain of the present invention has the effect of improving the metabolic disorders associated with the GLP-1 receptor agonists or analog drugs and can repair body damage after discontinuation of the GLP-1 receptor agonists. Both live and pasteurized bacteria can effectively prevent weight rebound after discontinuation of the GLP-1 receptor agonist drugs, maintaining a healthy weight after weight loss. The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can effectively prevent blood glucose rebound after discontinuation of the GLP-1 receptor agonist drugs, maintaining blood glucose balance. The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can effectively prevent local body fat increase after discontinuation of the GLP-1 receptor agonist drugs. The pasteurized bacteria contain large amounts of active substances or proteins, with significant effect in preventing weight rebound. The pasteurized bacteria improve the effectiveness and safety of the application of the Akkermansia muciniphila strain.

[0071] Specifically, the metabolic disorders caused by discontinuation of the GLP-1 receptor agonists and analogs thereof, for which the strain of the present invention is used for treatment, comprise: (1) glucose metabolism disorders, or (2) abnormal glucose tolerance or reduced glucose tolerance, or (3) pancreatic B cell damage, or (4) metabolic disorders caused by insulin resistance, or (5) energy metabolism disorders.

[0072] Furthermore, the strain is used for at least one of the following effects: 1. improving weight rebound after discontinuation of the GLP-1 receptor agonist drugs (hereinafter referred to as GLP-1 drugs) , maintaining body weight after weight loss; 2. improving imbalance in blood glucose homeostasis after discontinuation of the GLP-1 drugs, maintaining blood glucose balance; 3. improving local fat accumulation after discontinuation of the GLP-1 drugs, maintaining local fat reduction effect; 4. mitigating the side effects of the GLP-1 receptor agonist drugs; and 5. repairing body damage after discontinuation of the GLP-1 drugs.

[0073] The body damage, for which a fermentation product of the strain of the present invention is used for treatment, comprises anti-inflammatory effects which are beneficial for the side effects induced by the GLP-1 drugs, such as diarrhea, enteritis, pancreatitis, or digestive tract inflammation, etc.

[0074] In a sixth aspect, the Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be used for applications in preventing, treating, or alleviating aging, including brain aging.

[0075] The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be used for treating, preventing, or alleviating diseases related to nerve cell aging or nervous system aging; the nerve cell aging or nervous system aging comprises brain nerve cell aging or brain nervous system aging.

[0076] The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be used to combat brain aging by regulating expression levels of SIRT1 or SIR2.1; and / or to treat or alleviate the brain nerve cell or brain nervous system aging by regulating the expression levels of SIRT1 or SIR2.1.

[0077] The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be used in at least one of the following applications related to brain aging:

[0078] (1) improving memory; (2) slowing cognitive decline; (3) reducing or alleviating neuroinflammation; (4) alleviating reduction in the number of neuronal cells; (5) alleviating functional decline in nervous system; (6) alleviating reduction in the number of neuronal axons; (7) alleviating or improving brain atrophy; (8) improving or alleviating dementia; and (9) improving or alleviating microglial activation.

[0079] The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be used for preventing, treating, or alleviating Parkinson’s syndrome and / or Alzheimer’s disease.

[0080] The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be used for treating Alzheimer’s disease or Parkinson’s syndrome by regulating the expression levels of SIRT1 or SIR2.1. The Parkinson’s syndrome and / or Alzheimer’s disease are selected from subtypes characterized by an increase in phosphorylated Tau-positive neurons in the brain hippocampus. The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be used for treating or alleviating Parkinson’s syndrome and / or Alzheimer’s disease are selected form at least one of typical AD, limbic-predominant AD, HpSp-hippocampal sparing type, or PCA-posterior cortical atrophy type. The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be used for at least one Parkinson’s syndrome selected from non-α-synuclein subtypes, progressive supranuclear palsy (PSP) , corticobasal degeneration (CBD) , frontotemporal dementia with parkinsonism-17 (FTDP-17) , and argyrophilic grain disease (AGD) .

[0081] The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can effectively delay aging and achieve healthy longevity, including extending lifespan, improving brain aging, improving motor ability and reproductive ability, through anti-inflammatory, antioxidant effects, and by regulating the expression of multiple genes such as genes in the insulin / IGF-1 signaling pathway, antioxidant genes, and regulatory genes for mitochondrial unfolded protein response. The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be used in the preparation or development of anti-aging, antioxidant, and anti-inflammatory products. The present invention provides an efficient and safe solution for anti-aging, antioxidant, and anti-inflammatory purposes.

[0082] Beneficial effects of the present invention

[0083] The Akkermansia muciniphila strain of the present invention exhibits high auto-aggregation capacity and strong surface hydrophobicity, enabling it to effectively adhere to intestinal epithelial cells, thereby prolonging residence time in the intestine and enhancing therapeutic efficacy. This strain demonstrates adaptability to the intestinal environment and excellent stability. The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can significantly inhibit metabolic disorders and body damage after drug discontinuation, reduce visceral fat accumulation, and provide sustained effects without rebound. It offers an efficient and safe microbial therapeutic solution for maintaining body weight after obesity treatment and for preventing obesity development in obesity-prone individuals.

[0084] Both the live and pasteurized forms of the strain of the present invention can be effectively used to treat metabolic disorders, particularly to the treatment or recovery of metabolic diseases associated with metabolic disorders or body damage (e.g., intestinal inflammation, pancreatic B cell damage) caused by discontinuation of the GLP-1 drugs. Specifically, the metabolic disorders treatable by the strain of the present invention comprise: (1) glucose metabolism disorders, or (2) abnormal glucose tolerance or reduced glucose tolerance, or (3) pancreatic B cell damage, or (4) metabolic disorders caused by insulin resistance, or (5) energy metabolism disorders.

[0085] Furthermore, the strain is applicable for at least one of the following: 1. improving weight rebound after discontinuation of the GLP-1 receptor agonist drugs (hereinafter referred to as GLP-1 drugs) , maintaining body weight after weight loss; 2. improving imbalance in blood glucose homeostasis after discontinuation of the GLP-1 drugs, maintaining blood glucose balance; 3. improving local fat accumulation after discontinuation of the GLP-1 drugs, maintaining local fat reduction effect; 4. mitigating the side effects of the GLP-1 receptor agonist drugs; and 5. repairing body damage after discontinuation of the GLP-1 drugs.

[0086] Thereby, prevention of weight regains (weight rebound) , maintenance of healthy body weight, blood glucose, and body fat after weight loss are achieved. The pasteurized bacteria show significant anti-weight-rebound effect, indicating the presence of large amounts of active substances or proteins within the bacterial cells. The pasteurized bacteria enhance the efficacy and safety of applications of the Akkermansia muciniphila strain. The metabolites of the strain of the present invention possess anti-inflammatory properties, and are beneficial for alleviating side effects caused by weight-loss drugs, such as diarrhea, enteritis, pancreatitis, and digestive tract inflammation, etc.

[0087] The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be used in medicaments for preventing, treating, or alleviating aging, including brain aging, brain nerve cell aging, and brain nervous system aging. The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be used for treating, preventing, or alleviating diseases related to nerve cell aging or nervous system aging.

[0088] The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be used to combat brain aging by regulating the expression levels of SIRT1 or SIR2.1; and / or to treat or alleviate the brain nerve cell or brain nervous system aging by regulating the expression levels of SIRT1 or SIR2.1.

[0089] The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can regulate the expression of genes related to aging of brain, brain nerve cells or brain nervous system. The Akkermansia muciniphila strain of the present invention can be effectively used for delaying brain aging, particularly used for treating brain aging related to Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, etc., and is effective in (1) improving memory; (2) slowing cognitive decline; (3) reducing or alleviating neuroinflammation; (4) alleviating reduction in the number of neuronal cells; (5) alleviating functional decline in nervous system; (6) alleviating reduction in the number of neuronal axons; (7) alleviating or improving brain atrophy; (8) improving or alleviating dementia; (9) improving or alleviating microglial activation; thereby treating or improving symptoms of brain aging. The present invention provides an efficient and safe solution for combating brain aging.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0090] The following describes the embodiments in conjunction with the drawings, so that the above-mentioned and other aspects, as well as the advantages of the present invention will become apparent and readily understandable.

[0091] FIG. 1 shows a photograph of the colonial morphology of strain MNH19250.

[0092] FIG. 2 shows a photograph of the Gram staining of strain MNH19250.

[0093] FIG. 3 shows an SEM photo of strain MNH19250.

[0094] FIG. 4 shows the pH tolerance results for strain MNH19250. The x-axis represents pH value, and the y-axis represents survival percentage.

[0095] FIG. 5 shows the tolerance results of strain MNH19250 to different concentrations of NaCl.

[0096] FIG. 6 shows the tolerance results of strain MNH19250 to different concentrations of bile salts.

[0097] FIG. 7 shows the biochemical identification results of strain MNH19250 using API 20A.

[0098] FIG. 8 shows the 6-hour auto-aggregation ability of strain MNH19250.

[0099] FIG. 9 shows the phylogenetic tree of strain MNH19250.

[0100] FIG. 10 shows a bar chart showing the relative fluorescence values of IFN-βexpression levels in the presence of strain MNH19250.

[0101] FIG. 11a-11b show that strain MNH19250 significantly reduces liver function indicators (FIG. 11a: ALT; FIG. 11b: AST) .

[0102] FIG. 12a-12g show that strain MNH19250 significantly improves non-alcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis (NAFLD / NASH) (FIG. 12a: liver weight; FIG. 12b: liver weight as a percentage of body weight; FIG. 12c: hepatic steatosis; FIG. 12d: hepatic lobular inflammation; FIG. 12e: hepatocellular ballooning; FIG. 12f: NAFLD activity scores (NAS) ; FIG. 12g: HE-stained liver tissue sections) .

[0103] FIG. 13 shows that strain MNH19250 improves renal function indicators.

[0104] FIG. 14a-14b shows that strain MNH19250 significantly reduces oral glucose tolerance in high-fat diet-induced type 2 diabetic mice (FIG. 13a: results of oral glucose tolerance test; FIG. 13b: results of area under the curve (AUC) of oral glucose tolerance test; data are presented as mean±SD. Statistical analysis was performed using Student’s t-test; *, p<0.05 compared to the HFD-Control group; **, p<0.01 compared to the HFD-Control group) .

[0105] FIG. 15 shows that strain MNH19250 significantly reduces fasting blood glucose in high-fat diet-induced type 2 diabetic mice (data are presented as mean±SD. Statistical analysis was performed using Student’s t-test; *, p<0.05 compared to the HFD-Control group) .

[0106] FIG. 16a-16b show that strain MNH19250 significantly reduces body weight in high-fat diet-induced obese mice (FIG. 16a: results of body weight; FIG. 16b: results of body weight change percentage; data are presented as mean±SD. Statistical analysis was performed using Student’s t-test; *, p<0.05 compared to the HFD-Control group; **, p<0.01 compared to the HFD-Control group) .

[0107] FIG. 17 shows that strain MNH19250 reduces food intake in high-fat diet-induced obese mice.

[0108] FIG. 18a-18e show that strain MNH19250 significantly reduces blood lipids in high-fat diet-induced obese mice (FIG. 18a: total cholesterol (TCHO) results in serum; FIG. 18b: triglyceride (TG) results in serum; FIG. 18c: high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) results in serum; FIG. 18d: low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) results in serum; FIG. 18e: results of LDL-C / HDL-C ratio; data are presented as mean±SD. Statistical analysis was performed using Student’s t-test; *, p<0.05 compared to the HFD-Control group) .

[0109] FIG. 19a-19f show that strain MNH19250 significantly reduces fat weights and visceral fat ratios in high-fat diet-induced obese mice (FIG. 19a: epididymal fat; FIG. 19b: perirenal fat; FIG. 19c: mesenteric fat; FIG. 19d: visceral fat; FIG. 19e: visceral fat ratios; FIG. 19f: inguinal fat; data are presented as mean±SD. Statistical analysis was performed using Student’s t-test; *, p<0.05 compared to the HFD-Control group) .

[0110] FIG. 20a-20b show that strain MNH19250 significantly increases mucus layer thickness in high-fat diet-induced obese mice (FIG. 20a: Alcian blue staining images of colon; FIG. 20b: colon mucus layer thickness; data are presented as mean±SD. Statistical analysis was performed using Student’s t-test; *, p<0.05 compared to the HFD-Control group) .

[0111] FIG. 21a-21e: MNH19250 ameliorates weight regain after discontinuation of semaglutide treatment. FIG. 21a: body weight line chart; FIG. 21b: body weight at the end of the experiment; FIG. 21c: percentage of weight gain after discontinuation of semaglutide; FIG. 21d: percentage of weight gain after drug discontinuation; FIG. 21e: rate of weight gain after discontinuation of semaglutide. Note: Data are presented as mean±SD. Statistical analysis was performed using Student’s t-test; *, p<0.05 compared to the HFD-Sema group.

[0112] FIG. 22a-22c: MNH19250 ameliorates elevated blood glucose after discontinuation of semaglutide treatment. FIG. 22a: OGTT chart; FIG. 22b: AUC-OGTT chart; FIG. 22c: fasting blood glucose. Note: Data are presented as mean±SD. Statistical analysis was performed using Student’s t-test; *, p<0.05 compared to the HFD-Sema group; ***, p<0.001 compared to the HFD-Sema group.

[0113] FIG. 23a-23g: MNH19250 ameliorates fat accumulation after discontinuation of semaglutide treatment. FIG. 23a: liver weight; FIG. 23b: subcutaneous fat; FIG. 23c: epididymal fat; FIG. 23d: perirenal fat; FIG. 23e: mesenteric fat; FIG. 23f: white adipose tissue; FIG. 23g: visceral fat. Note: Data are presented as mean±SD. Statistical analysis was performed using Student’s t-test; *, p<0.05 compared to the HFD-Sema group.

[0114] FIG. 24: Movement trajectories of mice in the water maze test show that MNH19250 improves cognitive ability in mice.

[0115] FIG. 25A-25C: immunofluorescence staining results of phosphorylated Tau and P53 proteins in mouse hippocampus show that MNH19250 ameliorates brain tissue aging and nerve cell damage in mice. FIG. 25A: representative images of P53 and Tau immunofluorescence staining; FIG. 25B: quantification results of P53-positive accumulated area; FIG. 25C: quantification results of Tau-positive accumulated area.

[0116] FIG. 26A-26C: Immunofluorescence staining results of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and ionized calcium-binding adapter molecule 1 (IBA-1) in mice show that MNH19250 ameliorates brain tissue aging and nerve cell damage in mice. FIG. 26A: representative images of GFAP and IBA-1 immunofluorescence staining; FIG. 26B: quantification results of GFAP-positive accumulated area; FIG. 26C: quantification results of IBA-1-positive accumulated area.

[0117] FIG. 27A-27C: Results of Nissl staining and immunofluorescence staining of myelin basic protein (MBP) in mouse hippocampus show that MNH19250 ameliorates brain aging and nerve cell damage. FIG. 27A: representative images of Nissl staining and MBP immunofluorescence staining; FIG. 27B: quantification results of neuronal cell count in the hippocampus by Nissl staining; FIG. 27C: quantification results of MBP-positive accumulated area.

[0118] FIG. 28: relative expression of the hippocampal Sirtuin1 gene.

[0119] FIG. 29A-29B show the survival curve and mean lifespan of nematodes under different treatment conditions; compared to the control group fed with E. coli OP50, supplementation with either pasteurized or live bacteria MNH19250 significantly extended the maximum lifespan of nematodes, and the pasteurized MNH19250 significantly increased the mean lifespan of nematodes (FIG. 29A: survival curve; FIG. 29B: mean lifespan) .

[0120] FIG. 30A-30D show the effects of different MNH19250 treatments on locomotor activity, movement rate, and physiological function in nematodes; locomotor activity scoring showed that supplementation of MNH19250 significantly reduced the proportion of dead (Class D) and immobile (Class C) nematodes and increased the proportion of normally moving (Class A) nematodes; significantly increased movement rate indicates improved locomotor activity; increased pharyngeal pumping rate indicates that MNH19250 improves feeding function in nematodes (FIG. 30A-30B. locomotor activity scoring; FIG. 30C. movement rate; FIG. 30D. pharyngeal pumping rate) .

[0121] FIG. 31 shows the effects of different MNH19250 treatments on the expression of anti-aging genes in nematodes, including insulin / IGF-1 pathway genes (daf-16, daf-2, age-1) , antioxidant genes (gst-4, sod-3) , and longevity-related genes (sir-2.1) .

[0122] FIG. 32A-32C show the effects of MNH19250 on heat-stress resistance, antioxidant ability, and UV stress resistance in nematodes. FIG. 32A: lifespan curve of nematodes treated with pasteurized MNH19250 under heat shock stress; FIG. 32B: lifespan curve of nematodes treated with live MNH19250 under heat shock stress; FIG. 32C: lifespan curve of nematodes treated with pasteurized and live MNH19250 under UV irradiation.

[0123] FIG. 33A-33E: Water maze test results show that MNH19250 improves learning ability in mice. FIG. 33A: time taken for mice to find the platform for the first time; FIG. 33B: distance traveled by mice to find the platform for the first time; FIG. 33C: number of crossings over the target platform by mice; FIG. 33D: percentage of distance traveled in the target quadrant by mice; FIG. 33E: percentage of time spent in the target quadrant by mice.

[0124] FIG. 34 shows the relationship between the OD600 and bacterial count.

[0125] FIG. 35 shows a linear equation based on the peptide concentration (ng / mL) and the mass spectrometry-detected peptide response.

[0126] FIG. 36A-36J show the quantitative mass spectrometry peak diagrams of the signature peptide for fermentation culture of Akkermansia muciniphila under Different Nitrogen Sources. Figures 35A to 35J correspond to Soy peptone、Tryptone、Wheat peptone、Beef extract powder、Pea peptone、Papaya peptone、Casein peptone、Rise peptone、Yeast peptone、Yeast extract powder as Nitrogen sources respectively.

[0127] FIG. 37 shows the relationship between the total bacterial count in the fermentation broth and the Amuc_1100 protein content in the fermentation broth.DETAILED DESCRIPTION

[0128] Deposition of Strain

[0129] The strain Akkermansia muciniphila MNH19250 has been deposited at the Guangdong Microbial Culture Collection Center (GDMCC) under the deposit number GDMCC No: 63782, and was deposited on June 21, 2024, at Institute of Microbiology, Guangdong Academy of Sciences located at 5th Floor, Building 59, No. 100 Xianlie Central road, Guangzhou, China. The strain is designated as Akkermansia muciniphila MNH19250.

[0130] The present invention has isolated a novel strain of Akkermansia muciniphila, deposited under the deposit number GDMCC No: 63782, which was identified using traditional taxonomic methods and molecular biological techniques. The identification results confirm that this strain belongs to a novel strain of Akkermansia muciniphila. Furthermore, biochemical properties and therapeutic use of this strain have been investigated in the present invention.

[0131] It is known in the art that traditional taxonomic methods and molecular biological methods can be employed for taxonomic identification of bacterial strains. Traditional taxonomic methods include but are not limited to, e.g. cell morphology observation, Gram staining, flagella staining, various metabolic assays, etc. Molecular biological methods include but are not limited to ribosomal RNA sequencing, whole-genome sequencing-based method, etc.

[0132] 16S rRNA is a ribosomal RNA in prokaryotes. 16S rRNA gene consists of variable and conserved regions, wherein the conserved regions are shared among all bacteria, while the variable regions exhibit varying degrees of divergence among different bacteria. By comparing the 16S rRNA gene sequences of bacteria, a phylogenetic tree can be constructed based on the evolutionary distances derived from calculated differences in sequence. When the identity of 16S rRNA gene sequences between two strains is below 98.65%, they can be classified as different species (see Kim, M.,Oh, H. -S., Park, S. -C., &Chun, J. (2014) . Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 64 (Pt 2) , 346–351; and Liu, C., Du, M. -X., Abuduaini, R., Yu, H. -Y., Li, D. -H., Wang, Y. -J., Liu, S. -J. (2021) . Enlightening the taxonomy darkness of human gut microbiomes with a cultured biobank. Microbiome, 9 (1) , Page 23) .

[0133] Known computer algorithms, such as FASTA program, GCG package, BLASTN, or FASTA, can be used to determine the “identity” between two nucleic acid sequences. Commercial or publicly available programs, such as MegAlign program of DNAStar, may also be used.

[0134] Next-generation sequencing technologies, based on whole-genome sequencing, can be used for species identification, which allow the species identification results to be more accurate. The Average Nucleotide Identity (ANI) of bacterial genomes refers to the similarity of homologous genes between the two bacterial genomes. ANI value can be calculated using methods such as BLAST. In bacterial taxonomy, it is generally accepted that an ANI value of at least 95%is required to classify two strains as the same species (Jain C, Rodriguez-R L M, Phillippy A M, et al. High throughput ANI analysis of 90K prokaryotic genomes reveals clear species boundaries [J] . Nature Communications, 2018, 9 (1) : 5114. ) .

[0135] Currently available and well-established ANI calculation tools can be employed, such as locally operated software Jspecies ( / jspecies) and Gegenees ( / documentation. html) , as well as online calculation tools of ANI calculator (http:  / enveomics. gatech. edu / ) , EzGenome ( / ezgenome / ani) , and ANItools.

[0136] Using the above methods, those skilled in the art can determine whether an isolated strain belongs to the Akkermansia muciniphila species as identified by the inventors. For example, when the Average Nucleotide Identity (ANI) value with Akkermansia muciniphila (GCF_000020225.1) is at least 95%, such as 95.1%, 95.2%, 95.3%, 95.4%, 95.5%, 95.6%, 95.7%, 95.8%, 95.9%, 96%, 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5%, 96.6%, 96.7%, 96.8%, 96.9%, 97%, 97.1%, 97.2%, 97.3%, 97.4%, 97.5%, 97.6%, 97.7%, 97.8%, 97.9%, 98%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, or 100%, it can be determined that they belong to the same species.

[0137] As another example, when the 16S rRNA sequence has at least 98.65%, such as at least 98.7%, 98.8%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, or 100%identity to the sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, it can be determined that they belong to the same species.

[0138] The Alignment Fraction (AF) refers to the proportion of orthologous gene regions shared between two genomes (fraction of orthologous genes) . On the basis of ANI>95%, researchers have proposed further use of Alignment Fraction (AF, i.e., the proportion of orthologous regions shared between two genomes) as an additional threshold for delimiting species, so as to ensure that the ANI value is not based on a small set of conserved genes. There is no unified standard for the AF threshold; some literature uses 65% (Parks, D. H., Chuvochina, M., Chaumeil, PA. et al. A complete domain-to-species taxonomy for Bacteria and Archaea. Nat Biotechnol 38, 1079-1086 (2020) . ) , while other literature uses 30% (Zeng, S., Patangia, D., Almeida, A. et al. A compendium of 32, 277 metagenome-assembled genomes and over 80 million genes from the early-life human gut microbiome. Nat Commun 13, 5139 (2022) . ) . In summary, the AF value can serve as an auxiliary additional threshold.

[0139] A “strain” should be understood as a single-cell microorganism capable of reproducing through cell division. Bacteria are classified into families, genera, and species. Each bacterial species comprises multiple bacterial strains. The bacterial strain of the present invention belongs to the species Akkermansia muciniphila. Therefore, “bacterial strain” or “strain” as used herein refers not only to a specific bacterial strain but also to all bacteria derived from this strain, or obtained from this strain, or corresponding to this strain and possessing the same metabolic functions, such as at least one bacterium isolated from a colony derived from this strain.

[0140] “Progeny strain” or “mutant strain” in the present invention refers to a strain that is highly similar to the MNH19250 strain. Preferably, such a strain comprises a nucleotide sequence having at least 99.90%ANI identity, more preferably having at least 99.91%, at least 99.92%, at least 99.93%, at least 99.94%, at least 99.95%, at least 99.96%, at least 99.97%, at least 99.98%, or at least 99.99%ANI identity to the nucleotide sequence of the genome of MNH19250 strain.

[0141] As used herein, “supernatant” or “supernate” refers to the culture supernatant of the bacterial strain according to the present invention, optionally containing compounds and / or cell debris of the strain, and / or metabolites and / or molecules secreted by the strain.

[0142] As used herein, “microbial population” typically refers to a microbial community that substantially consisting of a single strain, species, or genus, as may be the case when culturing an isolated and purified subpopulation derived from such a strain, species, or genus. Thus, for a given microbial population, if cultivated from an isolated microbial species or strain, such a population will be referred to herein as purified or substantially pure. The resulting population may generally be at least 80%pure for the microbial species or strain, relative to other microbial species or strains within that specific population of at least 90%pure, at least 95%pure, at least 98%pure, at least 99%pure, at least 99.5%pure, or at least 99.9%pure. Conversely, the level of undesired strains in any specific desired microbial population will be below 20%, below 10%, below 5%, below 2%, below 1%, below 0.5%, or below 0.1%. For example, the level of impurities in a purified consortium, such as other undesired microbial strains or species, may be proportionally at or below the aforementioned levels for each desired population. In the case where a composition comprises a consortium of multiple microbial populations, each population may possess the aforementioned purity either prior to its incorporation into the composition or when measured collectively for the consortium.

[0143] As used herein, the term “prebiotic” may be a general term referring to chemicals and / or components capable of influencing the growth and / or activity of microorganisms in a host (e.g., allowing specific changes in the composition and / or activity of the microbiome) .

[0144] The terms “subject” , “object” , “individual” , “host” , and “patient” are used interchangeably herein to refer to any animal subject, including human, mammals, laboratory animals, livestock, and domestic pets.

[0145] The compositions or formulations of the present invention may be administered as pharmaceutical preparations, therapeutic compositions, dietary supplements, nutritional supplements, medical probiotics, or medical foods. In some cases, the composition is administered in the form of a pharmaceutical preparation. In some cases, the composition is administered as a nutritional supplement. In some cases, the composition is administered as a dietary supplement. In some cases, the composition is administered as a medical food. In some cases, the composition is administered as a medical probiotic. In some cases, the composition (e.g., dietary supplement, nutritional supplement, medical probiotic, or medical food) may be administered orally, for example, as a capsule, pill, or tablet.

[0146] In the context of the present invention, the term “polypeptide” is equivalent to “protein” . Apolypeptide has a specific amino acid sequence. A “variant” of the polypeptide of the present invention preferably has an amino acid sequence having at least 50%sequence identity to the polypeptide of the present invention.

[0147] The term “homeostasis” refers to mechanisms that contribute to maintaining a balanced internal state in an organism, such as lipid metabolic homeostasis, energy metabolic homeostasis, glucose regulatory homeostasis, triglyceride homeostasis, and cholesterol homeostasis.

[0148] The terms “weight rebound” and “weight regain” both refer to the phenomenon where use of a weight-loss drug causes weight loss, but significant weight increase occurs after discontinuation of the weight-loss drug, even exceeding the pre-intervention baseline weight. Typically, a weight increase of≥5%, 6%, 7%, 8%. . . 10%from the lowest point or an increase of≥1-5 kg is considered as weight regain or significant weight rebound. Maintaining a post-discontinuation weight increase of<5%, 4%, 3%. . . 2%, 1%, etc., relative to the lowest point, is considered as significant control or prevention of “weight rebound” and “weight regain” .

[0149] The term “metabolic disorder” or “metabolic disease” refers to energy metabolism disorders, such as abnormal energy conversion affecting carbohydrates and / or fats. Metabolic disorders include, for example: (1) glucose metabolism disorders, or (2) abnormal glucose tolerance or reduced glucose tolerance, or (3) pancreatic B cell damage, or (4) metabolic disorders caused by insulin resistance, or (5) energy metabolism disorders.

[0150] “Prevention” in the present invention refers to reducing the risk or probability of occurrence of a given phenomenon (i.e., in the context of the present invention, gut dysbiosis and related diseases, such as obesity) to a lesser extent. In the context of the present invention, these terms are also applicable to one or more symptoms of the diseases described herein.

[0151] “Treatment” in the present invention refers to slowing the progression of a disease, stabilizing, reversing, or regressing, or even interrupting or inhibiting the progression of gut microbial dysbiosis and / or diseases (e.g., metabolic diseases such as obesity, inflammatory diseases, or cancers) . In the context of the present invention, these terms are also applicable to one or more symptoms of the diseases described herein.

[0152] In some embodiments, the metabolic diseases, metabolic disorders, or diseases caused by metabolic disorders include, but are not limited to, at least one of liver diseases, obesity and obesity-related diseases, cardiovascular diseases, diabetes, dyslipidemia, cardiovascular and cerebrovascular diseases, glucose intolerance, atherosclerosis, coronary heart disease or hypertension, Type I diabetes, Type II diabetes, impaired glucose tolerance, insulin resistance, obesity, hyperglycemia, hyperinsulinemia, fatty liver, alcoholic steatohepatitis, hypercholesterolemia, hypertension, hyperlipoproteinemia, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, uremia, ketoacidosis, hypoglycemia, thrombotic diseases, dyslipidemia, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) , non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , atherosclerosis, and kidney diseases.

[0153] Diabetes

[0154] Diabetes includes Type I diabetes (T1D) , Type II diabetes (T2D) , and gestational diabetes (GDM) .

[0155] Insulin resistance refers to a condition where various causes lead to decreased efficiency of insulin in promoting glucose uptake and utilization, resulting in compensatory over-secretion of insulin by the organism, which induces hyperinsulinemia to maintain blood glucose stability. Insulin resistance is prone to leading to metabolic syndrome and Type II diabetes.

[0156] Oral glucose tolerance test is used to assess pancreaticβ-cell function and the ability to regulate blood glucose by the body, which is currently a well-recognized diagnostic indicator for diabetes. When glucose metabolism is disordered, blood glucose rises sharply after oral administration of a certain amount of glucose, or does not rise significantly, but fails to return to fasting levels or original levels within a short time. This indicates abnormal glucose tolerance or reduced glucose tolerance. Abnormal glucose tolerance indicates decreased metabolic capacity of the body to process glucose, and is commonly observed in type II diabetes and obesity.

[0157] HOMA-IR is an indicator used to evaluate insulin resistance level of an individual. It has been widely used clinically to assess insulin sensitivity in diabetic patients. HOMA-IR is calculated as: fasting plasma glucose (FPG, mmol / L) ×fasting insulin (FINS, μU / mL)  / 22.5. The HOMA-IR index for normal individuals is 1. As insulin resistance increases, the HOMA-IR index will be higher than 1.

[0158] L cells in the intestine can secrete glucagon-like peptide-1 (GLP-1) , which promotes insulin production by pancreaticβ-cells, inhibits glucagon production by pancreaticα-cells, and thereby regulates blood glucose balance and improves glucose tolerance of the body.

[0159] Functional Diseases of Liver

[0160] Functional diseases of liver refer to abnormal liver function or liver function impairment. Alanine aminotransferase (ALT) and / or aspartate aminotransferase (AST) are sensitive markers of liver function diseases. When liver function of the body is abnormal (e.g., liver injury, NAFLD, or NASH) , blood levels of ALT and / or AST are significantly elevated. Generally, ALT is more sensitive than AST in reflecting acute liver injury. Continuous elevation of ALT suggests chronic liver injury. In the circumstances of chronic hepatitis, cirrhosis, liver cancer, etc., AST elevation is more pronounced and may exceed ALT. AST level indicates the chronicity, extent, and severity of liver lesions and may even predict the prognosis of chronic liver diseases.

[0161] Common liver diseases associated with elevated ALT and / or AST include, but are not limited to: acute viral hepatitis (hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E) , EB virus and cytomegalovirus infections, chronic hepatitis B or chronic hepatitis C, autoimmune liver disease, alcoholic liver disease (ALD) , non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD or NASH) , drug-induced / toxic liver injury, cirrhosis, liver cancer, Wilson’s disease, α1-antitrypsin deficiency, hemochromatosis, etc.

[0162] Additionally, fat accumulation in the liver is an important factor for the occurrence and development of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD or NASH) . Therefore, decrease in ALT and / or AST levels and decrease in liver weight after drug intervention can indicate certain therapeutic improvement and effect of the drug.

[0163] Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) refers to the accumulation of excess fat in the liver in the form of triglycerides (TG) (steatosis) . Some NAFLD patients also demonstrate liver cell damage and inflammation (steatohepatitis) in addition to excess fat, i.e., non-alcoholic steatohepatitis (NASH) . NASH is widely recognized as the hepatic manifestation of metabolic syndromes, such as type II diabetes, insulin resistance, central obesity, hyperlipidemia (low HDL cholesterol, hypertriglyceridemia) , and hypertension.

[0164] Functional Diseases of Liver and Kidney

[0165] Functional diseases of liver and kidney refer to functional acute renal failure that occurs in severe liver diseases or decompensated cirrhosis. Due to the factors such as deficiency of effective circulating blood volume, and reduced prostaglandins, it can lead to hepatorenal syndrome.

[0166] Cardiovascular Diseases

[0167] TG (triglycerides) primarily participate in energy metabolism in the body to produce heat. Excessively high blood TG levels can cause blood thickening, leading to lipid deposition on blood vessel walls and gradual formation of small plaques, i.e., atherosclerosis. Elevated LDL-C is a major independent risk factor for the occurrence and development and progression of atherosclerosis; elevated LDL-C level is also an indicator of coronary heart disease. Since HDL-C can transport cholesterol from blood vessel walls to the liver for catabolism (i.e., reverse cholesterol transport) , cholesterol deposition in the blood vessel walls can be reduced to exert anti-atherosclerotic effects.

[0168] Inflammation

[0169] Lipopolysaccharide (LPS) , also known as endotoxin, is a phospholipid that constitutes the outer cell wall of Gram-negative bacteria. In addition to ensuring integrity of bacterial structure, LPS protects these bacteria from decomposition by bile salts secreted by the gallbladder. Normally, LPS is blocked from entering the bloodstream by tight junctions in the intestinal wall. If LPS enters the bloodstream, it can induce a strong inflammatory response in animals. Therefore, blood LPS level can reflect the inflammation level.

[0170] Obesity

[0171] Obesity refers to a significant degree of overweight and excessive fat layer thickness; it refers to a state resulting from excessive accumulation of body fat, especially triglycerides. It is an abnormal or excessive fat accumulation that poses health risks. Obesity-related diseases include conditions in individuals who wish to lose weight.

[0172] Obesity-related diseases in the present invention comprise at least one of the following: obesity, metabolic syndrome, cardiovascular diseases, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, hypertension, insulin resistance syndrome, obesity-related gastroesophageal reflux disease, and steatohepatitis.

[0173] Brain Aging

[0174] Brain aging refers to a series of physiological degenerative changes in the structure, function, and molecular levels of the brain that occur with increase of age. Manifestations include overall or regional brain volume reduction, decreased cerebral blood flow, reduced synaptic density, altered neuronal excitation-suppression balance, thinning of myelin sheath, and changes in glial cell function, etc.

[0175] Neuronal Senescence: it refers to neurons entering a specific biological state of “cellular senescence” , wherein the cells exhibit DNA damage response, telomere dysfunction, epigenetic reprogramming, lysosome-autophagy system failure, inflammatory senescence-associated secretory phenotype (SASP) , etc.

[0176] Aging of Brain Nerve Cells: decreased metabolic activity of brain neurons and impaired synaptic plasticity, thereby leading to cognitive decline and neurodegenerative diseases.

[0177] Aging of the Brain Nervous System includes structural and functional degeneration of all components, including neurons, glial cells (astrocytes, oligodendrocytes, microglia) , cerebral blood vessels, blood-brain barrier, meninges, and choroid plexus, etc. Manifestations are systemic changes, such as changes in neuronal level, reduced myelin sheath, glial cell activation, etc.

[0178] Alzheimer’s Disease (AD) : a progressive, irreversible neurodegenerative disorder. Its core pathological features include neuritic plaques formed by extracellularβ-amyloid (Aβ) deposition and / or neurofibrillary tangles formed by aggregation of intracellular hyperphosphorylated Tau protein, which leads to massive synaptic and neuronal loss, primarily manifested as episodic memory impairment gradually extending to other cognitive domains, eventually resulting in full-blown dementia.

[0179] Anti-aging, as mentioned in the present invention, includes “treating, preventing, or alleviating aging” , and may also be understood as similar meanings such as “delaying aging” , “preventing or alleviating signs of aging” , “extending lifespan” , etc. The above terms are used interchangeably herein. “Treating, preventing, or alleviating aging-related diseases” also falls within the scope of the present invention. “Aging-related diseases” include, for example, Parkinson’s disease.

[0180] Mood regulation as involved in the present invention, primarily refers to alleviating brain stress, relieving mental fatigue by improving brain attention and cognition. A state of “Mental fatigue” refers to symptoms of exhaustion, burnout, feeling drained, tired, decreased attention, or other similar symptoms. Therefore, if a subject experiences alleviation of any of these symptoms compared to the feeling after exercise without consuming bioactive substances, the subject’s mental fatigue is considered to be reduced. For example, the subject may experience sensations of recovery, rejuvenation, energetic, rebalancing, refreshment, restoration, or being recharged, or other similar sensations.

[0181] The Akkermansia muciniphila strain described herein can be used to prepare a composition, for example, by using pharmaceutically acceptable excipients. The pharmaceutical composition comprises a pharmaceutically effective amount of the Akkermansia muciniphila strain, such as the strain deposited under the deposit number GDMCC No: 63782. Similarly, the Akkermansia muciniphila strain with the deposit number GDMCC No: 63782 can also be used to prepare a pharmaceutical composition, for example, by using pharmaceutically acceptable excipients, which comprises a pharmaceutically effective amount of this Akkermansia muciniphila strain.

[0182] Interferon (IFN) Receptor Protein is a type of cytokine secreted by host cells that can regulate immune responses. Viruses, bacterial endotoxins, synthetic double-stranded RNA, etc., can stimulate interferon production. Macrophages, lymphocytes, somatic cells, etc., in the human body can produce interferon. Wherein, IFN-βbelongs to type I interferon and can promote the activity of NK cells, macrophages, and T lymphocytes, thereby exerting antiviral, antitumor, and immunomodulatory effects.

[0183] The Akkermansia muciniphila strain or products thereof provided by the present invention can significantly promote transcriptional activity of IFN-β. Type I interferon IFN-βhas been confirmed to be capable of regulating immunity and rebuilding the synergistic effect of innate immunity and adaptive immunity in the tumor microenvironment for treating refractory drug-resistant cancers (see “Targeting the tumor Microenvironment with interferon-βBridges innate and adaptive immune responses, Yang X1, cancer cell, 2014, doi: 10.1016 / j. ccr. 2013.12.004” ) . Therefore, these results indicate that strain MNH19250 or the Akkermansia muciniphila strain or products thereof provided by the present invention can regulate immunity and achieve antitumor effects through immune modulation, while exhibiting potential therapeutic effects against viral-associated tumors.

[0184] Short-Chain Fatty Acids are important metabolites of gut microbiota, acting as signaling molecules to influence a series of host activities, primarily acetate, propionate, and butyrate. Short-chain fatty acids can lower intestinal pH value and inhibit pathogen growth. Short-chain fatty acids can activate target pathways such as GPR41, GPR43, GPR109A, and GPCR81, improve the integrity and function of colonic epithelial cells, enhance intestinal barrier function, promote the secretion of hormones, such as GLP-1 and PYY, in the intestinal endocrine cells, increase insulin sensitivity, increase energy expenditure, promote fat decomposition, inhibit the production of pro-inflammatory cytokines, and maintain intestinal immune homeostasis. Short-chain fatty acids have certain beneficial effects on metabolic diseases such as obesity, diabetes, NAFLD, NASH, ulcerative colitis, radiation proctitis, and Crohn’s disease, etc.

[0185] Propionic acid and butyric acid can act as HDAC inhibitors for altering the expression of various functional genes, regulating cell proliferation, apoptosis, and differentiation by inhibiting HDAC, thereby enhancing immunity while preventing the occurrence and development of inflammation.

[0186] Amuc-1100 and Amuc_1631 (P9) Proteins are outer membrane proteins derived from Akkermansia muciniphila. The Amuc-1100 protein can interact with Toll-like receptor 2 (TLR2) of host cells, affecting intestinal health and immune regulation (Wang J, Xu W, Wang R, et al., The outer membrane protein Amuc_1100 of Akkermansia muciniphila promotes intestinal 5-HT biosynthesis and extracellular availability through TLR2 signalling. [J] . Food&function, 2021, 12 (8) : 3597-3610. DOI: 10.1039 / d1fo00115a. ) . Amuc-1100 has the effect of promoting GLP-1 secretion, which helps to improve blood glucose control and metabolic disorders (YOON H S, CHO C H, YUN M S, et al., Akkermansia muciniphila secretes a glucagon-like peptide-1-inducing protein that improves glucose homeostasis and ameliorates metabolic disease in mice [J] . Nature Microbiology, 2021, 6: 563-573) . Amuc-1100 remains stable during pasteurization and can inhibit expression of intestinal CB1 receptor while enhancing expression of tight junction proteins (Ding, G., Yang, X., Li, Y. et al., Gut microbiota regulates gut homeostasis, mucosal immunity and influences immune-related diseases. Mol Cell Biochem (2024) . https:  / / doi. org / 10.1007 / s11010-024-05077-y) .

[0187] The Amuc_1631 (P9) protein can promote GLP-1 secretion by intestinal L cells, showing potential for treating diabetes, obesity, and other metabolic diseases (Wenxuan D, Yuchen Z, Xinyuan Z, et al., Heterologous expression of P9 from Akkermansia muciniphila increases the GLP-1 secretion of intestinal L cells [J] . World Journal of Microbiology&Biotechnology, 2024 (7) : 40.DOI: 10.1007 / s11274-024-04012-z. ) . The P9 protein also exhibits strong anti-inflammatory effects and can regulate intestinal barrier function, thereby playing a role in inflammatory bowel disease. The P9 protein enhances intestinal barrier function by increasing the number of goblet cells, mucus production, and enhancing differentiation of stem cells into secretory cells (Patrice D. Cani, Clara Depommier, Muriel Derrien, et al., Akkermansia muciniphila: paradigm for next-generation beneficial microorganisms. Nature Reviews Gastroenterology&Hepatology volume 19, pages 625–637 (2022) ) .

[0188] Long-term use of GLP-1 receptor agonists can cause multifaceted damage and effects on the body, including severe damages to pancreaticβ-cells, central nervous system, hormonal balance, etc. (Abdullah Bin Ahmed I. A Comprehensive Review on Weight Gain following Discontinuation of Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Agonists for Obesity. J Obes. 2024 May 10; 2024: 8056440, https:  / / doi. org / 10.1155 / 2024 / 8056440) , which makes it more difficult to control indicators such as weight, blood glucose, blood lipids, etc. after discontinuation of GLP-1 receptor agonists (GLP-1RAs) .

[0189] After discontinuation of GLP-1RAs, the following side effects may occur in the body:

[0190] (a) Hormonal imbalance after discontinuation of GLP-1RA: GLP-1RAs control energy intake by suppressing appetite. Caloric restriction can trigger compensatory responses in the body, such as significant reduction in energy expenditure, as well as changes in levels of cholecystokinin hormones and leptin. Decreased leptin concentrations stimulate foraging behavior of animals while reducing their energy expenditure. Sudden discontinuation of GLP-1RAs can significantly increase body appetite, even surpassing the appetite before use of GLP-1RAs, thereby leading to rapid weight rebound.

[0191] (b) Dysregulated pathways in obese individuals and inability of cells of central nervous system to regulate food intake. Even if other drugs could promote endogenous GLP-1 secretion, or could regulate food intake for weight loss, after long-term use of GLP-1RAs and subsequent discontinuation of the drugs, due to dysregulation of related pathways and weakened regulatory function of the central nervous system, it would be difficult to achieve effects such as preventing weight rebound by controlling appetite.

[0192] (c) Continued use of GLP-1RAs leads toβ-cell dysfunction. After discontinuation of GLP-1RAs, the ability to produce insulin is reduced, which results in diabetes and weight gain. Prolonged exposure to GLP-1RAs may cause pancreaticβ-cell damage, thereby impairing insulin secretion function.

[0193] (d) Gut microbiota dysbiosis.

[0194] In summary, discontinuation of GLP-1RAs can cause multifaceted damage and metabolic disorders in the body, making it more difficult to control indicators such as weight, blood glucose, blood lipids, etc. after long-term use of GLP-1RAs and subsequent discontinuation of the drugs. The Akkermansia muciniphila strain involved in the present invention can address the side effects such as damage reduction after GLP-1 discontinuation, while also preventing and treating diseases such as metabolic disorders after GLP-1 discontinuation, which shows significant effects in preventing weight rebound, preventing blood glucose rebound and / or maintaining blood glucose balance, or preventing fat accumulation.

[0195] Therefore, the Akkermansia muciniphila strain involved in the present invention can influence or regulate immune signaling transduction and / or affect intestinal barrier function and / or influence energy metabolic homeostasis and / or glucose metabolic homeostasis and / or cholesterol homeostasis and / or triglyceride homeostasis. The Akkermansia muciniphila strain involved in the present invention can be used for the treatment or recovery of metabolic disorders or body damage (e.g., intestinal inflammation, pancreaticβ-cell damage) caused by discontinuation of GLP-1 receptor agonist drugs; specifically, for use in maintaining energy metabolic homeostasis, and / or glucose metabolic homeostasis, and / or cholesterol homeostasis, and / or triglyceride homeostasis after discontinuation of GLP-1 receptor agonists. The metabolic disorders treatable by the strain of the present invention comprise: (1) glucose metabolism disorders, or (2) abnormal glucose tolerance or reduced glucose tolerance, or (3) pancreatic B-cell damage, or (4) metabolic disorders caused by insulin resistance, or (5) energy metabolism disorders.

[0196] Furthermore, the strain is applicable for at least one of the following: 1. improving weight rebound after discontinuation of the GLP-1 receptor agonist drugs (hereinafter referred to as GLP-1 drugs) , maintaining body weight after weight loss; 2. improving imbalance in blood glucose homeostasis after discontinuation of the GLP-1 drugs, maintaining blood glucose balance; 3. improving local fat accumulation after discontinuation of the GLP-1 drugs, maintaining local fat reduction effect; 4. mitigating the side effects of the GLP-1 receptor agonist drugs; and 5. repairing body damage after discontinuation of the GLP-1 drugs.

[0197] Use of the strain, bacterial agent, or fermentation products thereof or extracts of the fermentation products in the aforementioned aspects also falls within the scope of protection of the present invention.

[0198] The solutions of the present invention will be explained below in conjunction with examples. Those skilled in the art will understand that the following examples are only used to illustrate the present invention and should not be construed as limiting the scope of the invention. Specific techniques or conditions not indicated in the examples are performed according to the techniques or conditions described in the literature in the field or according to instructions of the product or instrument. All reagents or instruments not specified by the manufacturer are commercially available.

[0199] EXAMPLE

[0200] In the examples, the composition of the MM01 liquid medium was as follows: 5 g / L of peptone, 5 g / L of tryptone, 10 g / L of yeast powder, 5 g / L of beef extract, 5 g / L of glucose, 2 g / L of K2HPO4, 2 g / L of sodium acetate, 1 mL / L of Tween 80, 5 mg / L of hemin, 0.5 g / L of L-cysteine hydrochloride, 1μL / L of vitamin K1, 8 mL / L of inorganic salt solution (each 1 L of the inorganic salt solution contained 0.25 g of calcium chloride, 1 g of K2HPO4, 1 g of KH2PO4, 0.5 g of magnesium sulfate, 10 g of sodium bicarbonate, and 2 g of sodium chloride) .

[0201] In the examples, the composition of the MM01 solid medium was as follow: 5 g / L of peptone, 5 g / L of tryptone, 10 g / L of yeast powder, 5 g / L of beef extract, 5 g / L of glucose, 2 g / L of K2HPO4, 2 g / L of sodium acetate, 1 mL / L of Tween 80, 5 mg / L of hemin, 0.5 g / L of L-cysteine hydrochloride, 1 L / L of vitamin K1, 8 mL / L of inorganic salt solution (each 1 L of the inorganic salt solution contained 0.25 g of calcium chloride, 1 g of K2HPO4, 1 g of KH2PO4, 0.5 g of magnesium sulfate, 10 g of sodium bicarbonate, and 2 g of sodium chloride) , and agar 15 g / L.

[0202] The anaerobic blood agar plate was purchased from Huankai Microorganism, with the formula as follows: 10 g / L of tryptic digest of casein, 3 g / L of tryptic digest of heart, 1 g / L of corn starch, 5 g / L of gastric digest of meat, 5 g / L ofyeast extract powder, 5 g / L of sodium chloride, 15 g / L of agar, 50-100 mL / L of sterile defibrinated sheep blood, and a pH of 7.3±0.2.

[0203] The above-mentioned media could be prepared by conventional preparation methods and sterilization methods.

[0204] Example 1. Isolation and Identification of Strain MNH19250

[0205] 1.1 Isolation and Purification of Strain MNH19250

[0206] A gut bacterial strain designated MNH19250 was isolated from a healthy male volunteer in Guangzhou, Guangdong Province, China. The strain was isolated using a conventional method involving gradient dilution followed by isolation, cultivation and single colony selection. The obtained colonies were purified and cultured anaerobically at 37℃. The pure cultures were formulated into a 20%glycerol-water bacterial suspension and preserved at-80℃under cryogenic conditions.

[0207] Specifically, the method for isolating the bacterial strain is as follows:

[0208] 5 g of sample was self-collected by the donor and placed into a collection tube. After homogenization by shaking, the processed sample was stored in an ice box and delivered to the laboratory for strain isolation within 24 hours for strain isolation.

[0209] Sterile saline was dispensed at 9 mL per tube in a biosafety cabinet. Anaerobic blood agar plates, serving as the culture medium for strain isolation, were prepared and transferred into an anaerobic workstation 24 hours in advance, and labeled with sample information, medium type, and isolation date.

[0210] Fresh sample was vortexed for 1 min inside the anaerobic workstation, and 1 mL of the suspension was transferred into 9 mL of saline to obtain a 10-1 dilution, followed by serial gradient dilution to obtain a 10-6 dilution, which was set aside for subsequent use.

[0211] 100μL of the 10-6 dilution was pipetted onto the anaerobic blood agar plate and spread evenly, after drying, the plates were incubated in an inverted position at 37℃for 3-5 days.

[0212] The growth status of strains on the isolation medium (anaerobic blood agar plates) was observed, and single colonies were picked using sterile toothpicks for strain purification. The purified strains were anaerobically cultured at 37℃. The pure cultured strains were prepared into a 20%glycerol / water bacterial suspension and preserved at-80℃under cryogenic conditions.

[0213] 1.2 Cultivation of Morphological features and Morphological Characteristics of Strain MNH19250

[0214] Cultivation and morphological characteristics

[0215] Strain MNH19250 was inoculated into MM01 medium and incubated anaerobically at 37℃for 72 h. On MM01 agar plates, visible colonies were formed. The colonies were circular, with regular and smooth edges, approximately 0.5 mm in diameter, pale yellow, and semi-transparent; The strain is Gram-negative. Microscopic observation shows that it is non-flagellated, non-motile, and rod-shaped, with a size of approximately 0.5-1μm×1.5-3μm. Colony morphology of strain MNH19250 after 72 h incubation on MM01 plates was shown in Figure 1. Gram staining of strain MNH19250 was shown in Figure 2, and electron microscopy images were shown in Figure 3.

[0216] 1.3 Physiological Characteristics of Strain MNH19250

[0217] Strain MNH19250 did not grow under aerobic conditions but grew under anaerobic conditions. Growth occurred within a pH range of 6.0-9.0, with an optimal pH of approximately 8.0 (results of the strain's tolerance to different pH values are shown in Figure 4) . Growth was significantly inhibited when NaCl concentration exceeded 2% (w / v) (results of the strain's tolerance to different NaCl concentration are shown in Figure 5) . Strain MNH19250 is capable of surviving and growing in a bile salt concentration range of 0%to 0.25% (w / v) , but the growth was significantly inhibited when bile salt concentration was≥0.3% (results of the strain's tolerance to different NaCl concentration are shown in Figure 6) .

[0218] 1.4 Biochemical Identification by API 20A

[0219] Biochemical characterization of strain MNH19250 was performed using the API 20A system (bioMérieux, CN2030025) according to the manufacturer’s instructions. The strain was cultured at 37℃under anaerobic conditions. The test results are summarized in Table 1 and Figure 7.

[0220] Table 1. MNH 19250 API 20A test result of strain MH192550

[0221] Strain MNH19250 could ferment glucose, lactose, and mannose to produce acid. Therefore, glucose, lactose, mannose, and their derivatives were suitable as carbon sources during fermentation or cultivation.

[0222] Strain MNH19250 could hydrolyze esculin (ESC) , indicatingβ-glucosidase production. β-glucosidase is a cellulase enzyme capable of hydrolyzing cellobiose and short-chain cello-oligosaccharides into glucose.

[0223] Strain MNH19250 hydrolyzed gelatin, indicating protease production. The function of protease is to convert unabsorbable proteins into polypeptides or amino acids that can penetrate into bacterial cells. This enzyme is mainly an extracellular enzyme, which can first hydrolyze gelatin into polypeptides and then further hydrolyze them into amino acids, causing the loss of gel properties and liquefaction, and making the black substance in the reaction hole diffuse, thus showing a positive reaction.

[0224] 1.5 Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of Antibiotics

[0225] The MICs of antibiotics against strain MNH19250 were determined using E-test strips (Liofilchem) . Test results are shown in Table 2.

[0226] Table 2. Minimum Inhibitory Concentration values of strain MNH19250

[0227] The results indicated that MNH19250 is sensitive to ampicillin, chloramphenicol, clindamycin, amoxicillin, rifampicin, imipenem, penicillin, and cefquinome. It can be seen that MNH19250 is sensitive to most types of antibiotics, suggesting a low risk of antibiotic resistance development after long-term administration.

[0228] 1.6 Determination of the auto-aggregation ability of strain MNH19250

[0229] Strain MNH19250 was cultured in MM01 liquid medium under anaerobic conditions at 37℃for 48 h. 20 mL of the bacterial fermentation broth was taken, and the bacterial cells were collected by centrifugation (4500 rpm, 4℃, 10 min) and washed twice with sterile PBS (pH 7.2) , resuspended in PBS buffer, and the OD600 value was adjusted to 0.5, which was recorded as A0.

[0230] The bacterial solution was statically incubated at 37℃ (directly standing in cuvettes) . Its OD600 value was measured every 30 minutes, recorded as At, and the measurement was conducted for 6 hours with three replicates.

[0231] Auto-aggregation ability was calculated according to the following formula: Auto-aggregation ability of the strain (%) = [1- (At / A0) ] ×100%.

[0232] After 6 h, strain MNH19250 exhibited an auto-aggregation ability of 54.21% (as shown in Figure 8) , which was over 20%higher than other strains reported in the literaturethe (Strain A. muciniphila PROBIO with an auto-aggregation ability about 30% (8 h) , Figure 1d; Xin Ma 1, Meng Tian 2, Xueping Yu, et al., Foods. 2024, Jan 30; 13 (3) : 442. Characterization and Preliminary Safety Evaluation of Akkermansia muciniphila PROBIO, https:  / / doi. org / 10.3390 / foods13030442) . Strains with strong auto-aggregation were considered to have stronger epithelial adhesion and colonize the human intestine better, thereby exerting probiotic effects.

[0233] 1.7 Determination of the surface hydrophobicity of strain MNH19250

[0234] Strain MNH19250 was cultured in MM01 liquid medium under anaerobic conditions at 37℃for 48 h. 20 mL of the bacterial fermentation broth was taken, and the bacterial cells were collected by centrifugation (4500 rpm, 4℃, 10 min) and washed twice with sterile PBS (pH 7.2) , resuspended in PBS buffer, and the OD600 value was adjusted to 0.5, which was recorded as A0.

[0235] 4 mL of xylene was added to 4 mL of the resuspension solution, the two-phase system was vortexed for 5 minutes and incubated at room temperature for 1 h to remove the xylene phase, the absorbance value (A) of the aqueous phase was measured at 600 nm with three replicates. The surface hydrophobicity of the test strain was calculated according to the following formula: H%= [ (A0-A)  / A0] ×100, wherein A0 and A represent the absorbance values before and after organic solvent extraction, respectively.

[0236] The surface hydrophobicity of strain MNH19250 was determined as 57.06%, which was over 25%higher than other strains reported in the literature (The surface hydrophobicity of A. muciniphila PROBIO is 31% (1 h) , Figure 1c, Xin Ma 1, Meng Tian 2, Xueping Yu, et al., Foods. 2024, Jan 30; 13 (3) : 442. Characterization and Preliminary Safety Evaluation of Akkermansia muciniphila PROBIO, https:  / / doi. org / 10.3390 / foods13030442) . Strains with High hydrophobicity were considered to have stronger epithelial adhesion and colonize the human intestine better, thereby exerting probiotic effects.

[0237] 1.8 16S rRNA Gene Amplification of strain MNH19250

[0238] Genomic DNA was extracted from freshly cultured strain MNH19250 and used as template for PCR amplification of the 16S rRNA gene.

[0239] The primer pair used for PCR amplification of the 16S rRNA gene is:

[0240] 27F: 5’ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ (SEQ ID NO: 2) ,

[0241] 1492R: 5’ -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’ (SEQ ID NO: 3) .

[0242] PCR conditions were: initial denaturation at 94℃for 4 min; denaturation at 94℃for 50 s, annealing at 52℃for 40 s, extension at 72℃for 70 s, repeated for 36 cycles; and final extension at 72℃for 10 min.

[0243] 1.9 16S rRNA Gene Sequencing

[0244] The PCR product was purified and subjected to 16S rRNA gene sequencing by Sangon Biotech Co., Ltd., yielding a 16S rRNA gene sequence (1355 bp) as shown in SEQ ID NO: 1.

[0245] 1.10 Identification of Strain MNH19250

[0246] The sequenced 16S rRNA gene sequence, as shown in SEQ ID NO: 1, was analyzed using the NCBI Basic Local Alignment Search Tool for strain 16S rRNA gene analysis, and the strain classification information was confirmed.

[0247] The sequenced sequence was compared with the data in GenBank through BLAST analysis. The comparison results revealed that the strain most similar to MNH19250 was Akkermansia muciniphila, with a similarity of 100%, thus it was determined that strain MNH19250 belongs to the species Akkermansia muciniphila.

[0248] The 16S rRNA gene sequence of strain MNH19250 was compared with those of related strains of the genus Akkermansia sp. retrieved from databases such as GenBank, and a phylogenetic tree was constructed.

[0249] The 16S rRNA gene sequence of strain MNH19250 was compared with 16S rRNA gene sequences of type strains exhibiting high similarity in the NCBI database through multiple sequence alignment. A phylogenetic tree was then constructed using the software MEGA 5 (the phylogenetic tree was constructed using the maximum likelihood method) (see Figure 9) , wherein only nodes with Bootstrap values greater than 50%are displayed.

[0250] It can be seen from the phylogenetic tree that strain MNH19250 clustered together with Akkermansia sp. and Akkermansia muciniphila Muc AY271254. Therefore, strain MNH19250 was identified as a novel strain of Akkermansia muciniphila.

[0251] 1.11 Genome Analysis of Strain MNH19250

[0252] Genome Analysis of Strain MNH19250

[0253] The genome of strain MNH19250 was fragmented by ultrasonication, and an Illumina sequencing library was constructed using a standard DNA library preparation kit (NEB UltraTM) . The constructed sequencing library was subjected to paired-end 150 bp sequencing using NovaSeq (Illumina) . A total of 3.01 Gbp of data was obtained, with a Q20 percentage of 97.42%.

[0254] The raw genomic sequencing data was filtered using fastp (version: 0.20.0) . The filtered raw data was genome assembled using SPAdes (version: v3.14.0) . A total genome length of 2.82 Mbp was obtained from the genome assembly, with an N50 length of 378.4 kbp and a GC content of 55.19%.

[0255] Genome gene prediction and analysis were performed using the prokaryotic analysis software genome annotation pipeline Prokka (version: 1.14.5) . A total of 2, 376 CDS sequences were predicted, with an average CDS sequence length of 1, 039 bp.

[0256] Potential antibiotic resistance genes in the genome were analyzed using RGI (version: 4.2.2) , wherein the antibiotic resistance gene database is CARD (version: 3.0.0, https:  / / card. mcmaster. ca / analyze / rgi) . Detailed comparison information is shown in Table 3.

[0257] Table 3. List of Antibiotic Resistance Gene Information

[0258] Analysis of potential virulence factors and related genes in the genome was performed using NCBI blastp (version: 2.7.1+) by aligning against the Virulence Factor Database (VFDB, http:  / / www. mgc. ac. cn / cgi-bin / VFs / v5 / main. cgi, updated on September 19, 2019) . Detailed alignment results are shown in Table 4.

[0259] Table 4. List of Potential Toxic Genes of MNH-19250

[0260] Analysis of potential secondary metabolic gene clusters in the genome was performed using antiSMASH 6 (version: 6.0.1) . Detailed alignment results are shown in Table 5.

[0261] Table 5. List of Potential Secondary Metabolic Gene Clusters of Strain MNH-19250

[0262] Analysis of potential Primary metabolic gene cluster in the genome was performed using antiSMASH 6 (version: 1.0.0) . Detailed alignment results are shown in Table 6.

[0263] Table 6. List of Potential Primary Metabolite Gene Clusters of Strain MNH19250

[0264] Analysis of the genes encoding Amuc_1100 protein and P9 protein in strain MNH19250. BLAST was used to align the Amuc_1100 protein sequence (WP_197738471) and the Amuc_1631 (P9) protein sequence (ACD05451) . The analysis results of the Amuc_1100 protein sequence and its gene are shown in the following table.

[0265] Table 7. Analysis of the Gene Encoding Amuc_1100 Protein in MNH19250

[0266] Sequence:

[0267] >MNH19250_01469 hypothetical protein

[0268] The analysis results of the Amuc_1631 (P9) protein sequence and its gene are shown in the following table.

[0269] Table 8. Analysis of the Gene Encoding Amuc_1631 (P9) Protein in MNH19250

[0270] Sequence:

[0271] >MNH19250_00667 Tail-specific protease

[0272] Example 2. Fatty Acid Composition Analysis of Strain MNH19250

[0273] 2.1Analysis of Fatty Acid Composition

[0274] Strain MNH19250 was inoculated onto MM01 agar plates and cultured anaerobically at 37℃for 72 hours, the bacterial was collected, followed by cellular fatty acid extraction and methylation treatment. The analysis of fatty acid composition of strain MNH19250 was performed using the automated bacterial identification system from MIDI (Microbial ID, Inc., Newark, DE, USA) .

[0275] The major fatty acid (>10%) of strain MNH19250 was C15: 0 anteiso (48.73%) ..

[0276] 2.2 Analysis of Short-Chain Fatty Acids (SCFAs)

[0277] Preparation of Bacterial Cells

[0278] Strain MNH19250 was cultured in MM01 liquid medium anaerobically at 37℃for 48 h. Cells and culture supernatants were collected by centrifugation and stored at-80℃until use.

[0279] Pretreatment of Culture Supernatant Samples

[0280] (1) Samples were thawed and vortexed for 3 min;

[0281] (2) 50μL of sample was transferred into a 1.5 mL centrifuge tube, followed by the addition of 100μL of 0.5% (v / v) phosphoric acid solution, and the mixture was vortexed at 2500 r / min for 3min;

[0282] (3) 750μL of Methyl-tert-butyl ether (MTBE) extraction solution containing an internal standard was added, followed by vortexing at 2, 500 rpm for 3 minutes, ultrasonication at 4℃for 5 min, and centrifugation at 4℃ and 12, 000 rpm for 10 minutes;

[0283] (4) 200μL of supernatant was transferred into the insert of the sample vial, stored in a-20℃refrigerator for GC–MS / MS analysis.

[0284] Pretreatment of Bacterial Cell Samples

[0285] (1) After the sample was thawed, 100μL of ultrapure water as extract solution was added to resuspend it evenly;

[0286] (2) 50μL of the suspension solution was transferred into a 1.5 mL centrifuge tube, followed by the addition of 100μL of 0.5% (v / v) phosphoric acid solution. The mixture was vortexed for 3 min;

[0287] (3) The suspension solution was immersed in liquid nitrogen for 2 minutes, then taken out and completely thawed on ice, vortexed at 2500 r / min for 3 minutes, and this process was repeated 3 times;

[0288] (4) 150μL of MTBE extraction solution containing an internal standard was added, the mixture was vortexed at 2, 500 rpm for 3 min, ultrasonication at 4℃for 5 min, and centrifugation at 4℃ and 12, 000 rpm for 10 min;

[0289] (5) 90μL of supernatant solution was transferred to the insert of a sample vial for GC-MS / MS analysis;

[0290] (6) The remaining 50μL of bacterial suspension solution was subjected to three repeated freeze-thaw cycles in liquid nitrogen, centrifuged at 12, 000 rpm for 10 min, and the supernatant was analyzed for protein concentration using the BCA method.

[0291] Preparation of Standards: Standard solutions of acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid, and isovaleric acid were prepared at concentrations of 0.005, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1, 2, 5, 8, 10, and 20μg / mL. Chromatographic and mass spectrometric conditions used for GC-MS / MS analysis are summarized in Table 9.

[0292] The chromatographic peak intensity data corresponding to the quantitative signals of standard samples with various concentrations were obtained. The standard curves for different substances were plotted with the concentration ratio of external standard to internal standard (Concentration Ratio) as the abscissa and the peak area ratio of external standard to internal standard (Area Ratio) as the ordinate.

[0293] Table 9. GC-MS / MS Operating Conditions

[0294] The detected integrated peak area ratios of all samples were substituted into the linear equation of the standard curve for calculation. After calculation using the sample calculation formula, the content data of the substance in the actual samples were finally obtained. The results showed that both the bacterial supernatant and bacterial cells contained short-chain fatty acids such as acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid, and isovaleric acid, among which the contents of acetic acid and propionic acid are shown in Table 10.

[0295] Table 10. Short-Chain Fatty Acids and Medium-Chain Fatty Acids concentrations in culture supernatant and bacterial cells of strain MNH19250

[0296] The results demonstrated that strain MNH19250 produced substantial amounts of acetic acid and propionic acid during growth.

[0297] Example 3. Effect of Strain MNH19250 on IFNβExpression

[0298] Although the weight-loss effects of GLP-1 agonists such as liraglutide and semaglutide are indeed significant in the short term, studies have found that the incidence rates of four gastrointestinal adverse reactions induced by GLP-1 agonists semaglutide and liraglutide are higher than those of other weight-loss drugs, including biliary tract diseases, pancreatitis, intestinal obstruction, and gastric spasms. Reactions such as diarrhea and digestive tract inflammation are common side effects of GLP-1 agonists.

[0299] Currently, inflammation is recognized as one of the biomarkers of accelerated aging and one of the characteristics of aging biology. The extension of lifespan and health-span might be achieved through a favorable balance between pro-inflammatory and anti-inflammatory processes. Studies have indicated that although centenarians exhibited increased levels of inflammatory molecules (e.g., interleukin-6) , the adverse consequences caused by these pro-inflammatory molecules are counteracted by high levels of anti-inflammatory molecules (Campisi, J., Kapahi, P., Lithgow, G. J. et al. From discoveries in ageing research to therapeutics for healthy ageing. Nature 571, 183–192 (2019) . https:  / / doi. org / 10.1038 / s41586-019-1365-2) .

[0300] Type I interferonβ (IFN-β) had been confirmed to possess anti-inflammatory effects, being capable of promoting the reprogramming of macrophages into an anti-inflammatory phenotype, thereby facilitating the resolution of inflammation (Kumaran Satyanarayanan, S., El Kebir, D., Soboh, S.et al. IFN-βis a macrophage-derived effector cytokine facilitating the resolution of bacterial inflammation. Nat Commun 10, 3471 (2019) . https:  / / doi. org / 10.1038 / s41467-019-10903-9) . IFN-βwas also able to regulate immunity and achieve antiviral and antitumor effects through such immune regulation.

[0301] To verify whether MNH19250 can promote expression of IFN-β, the present invention utilized constructed THP-1 cells carrying an IFN-βgene promoter reporter gene (THP-1-IFNβ-promoter reporter cells, an in-house established cell line from Moon Company) to evaluate the effect of MNH19250 on IFN transcriptional activity.

[0302] The construction of THP-1-IFNβ-promoter reporter cells comprised the following steps: the reporter gene was inserted into a vector, cells were infected with the vector, and a cell line expressing the reporter gene was screened and obtained. For details, reference was made to the following literatures: Huashan Du, Tianmin Xu, Manhua Cui, “cGAS-STING signaling in cancer immunity and immunotherapy” Biomedicine&Pharmacotherapy 133 (2021) 110972; Jiang et al., “cGAS-STING, an important pathway in cancer immunotherapy” Journal of Hematology&Oncology (2020) 13: 81, Khiem C. Lam et al., “Microbiota triggers STING-type I IFN-dependent monocyte reprogramming of the tumor microenvironment” Cell 184, 5338-5356.

[0303] Preparation of the culture supernatant of strain MNH19250 comprised the following steps: Strain MNH19250 was inoculated into MM01 liquid medium and cultured anaerobically at 37℃for 48 hours, bacterial cells were removed by centrifugation, and the culture supernatant was filtered through a 0.22μm filter, aliquoted, and the collected material was stored at-80℃for subsequent use.

[0304] Control Group (Control) : DMEM complete medium (Gibco, 10%FBS) with 10%by volume of the MM01 liquid medium;

[0305] MSA-2 group (positive control group) : DMEM complete medium containing 10μM MSA-2 (purchased from Topscience) ;

[0306] Strain MNH19250 group: DMEM complete medium containing 10%by volume of the culture supernatant of strain MNH19250.

[0307] THP-1-IFN-promoter reporter cells were inoculated into a 96-well plate at a density of 1×105 cells per well. Cells were treated according to the set groups. After further culturing for 24 hours, the cells were centrifuged at 300 g for 5 minutes, the culture supernatant was removed, and 50μL of 1×Luminescence (Promega) was added to normalize the Control group (Control) for evaluation of the effect of strain MNH19250 on the transcription activity of IFN-β.

[0308] The experimental results are shown in Figure 10. Strain MNH19250 significantly enhanced the transcriptional activity of IFN-β. Therefore, these results indicated that MNH19250 and its metabolites possessed anti-inflammatory and immune-regulating functions, thereby being capable of reducing the side effects of GLP-1 agonist drugs such as liraglutide and semaglutide. The metabolites of strain MNH19250 could significantly enhanced the transcriptional activity of IFN-β. Thus, these results suggested that MNH19250 and its metabolites had anti-inflammatory and immune-regulating functions, thereby delaying body aging.

[0309] Type I interferon IFN-βhas been demonstrated to modulate immunity and achieve antitumor effects through immunomodulation, while having a potential functional role in antiviral tumors. Thus, these results indicate that MNH19250 and its metabolites are able to modulate body immunity and achieve antitumor effects by modulating immunity, while having potential prophylactic and inhibitory effects on viral tumors.

[0310] Example 4: Improvement of Liver and Kidney Functions and Related Diseases by the Strain in a Mouse Model of Liver and Kidney Injury Induced by a High-fat diet

[0311] A mouse model of liver and kidney injury induced by a high-fat diet was used to study the improvement of liver and kidney functions and related diseases by strain MNH19250. This experimental protocol had been reviewed and approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Moon Biotechnology.

[0312] 4.1 Experimental Methods

[0313] 1) Experimental animals: The mice used in the experiment were C57BL / 6J mice, aged 5-6 weeks, which were purchased from Jiangsu GemPharmatech Co., Ltd.

[0314] 2) Preparation of the test substance of strain MNH19250: The glycerol stock tube of strain MNH19250 was thawed at 37℃, and then inoculated onto MM01 plates in an anaerobic workstation for activation. The activated strain was inoculated into MM01 liquid medium and cultured anaerobically to obtain a sufficient quantity of culture. The cultured bacterial suspension was concentrated by centrifugation, after which the resulting bacterial pellets were resuspended in PBS containing 0.05%L-cysteine hydrochloride (L-Cys·HCl) to obtain a test substance with purity and viable count (2×109 CFU / mL) meeting the requirements of animal experiments.

[0315] 3) Negative control: PBS containing 0.05%L-Cys HCl was used as the negative control.

[0316] 4) Experimental procedure: After the quarantine period, 5-6-week-old male C57BL / 6J mice were fed a high-fat diet for 10 weeks. Twelve mice with body weights ranging from 35.50 g to 44.49 g were selected and randomly assigned into two groups (experimental group and control group) based on body weight stratification, with 6 mice per group. Administration began on the first day of grouping (D1) . The experimental group was given the above-mentioned test substance, while the control group received the negative control. Dosing was performed twice daily for 28 consecutive days. Throughout the experiment, the mice had free access to water and food and were maintained under a 12h / 12h light / dark cycle. General clinical observations were conducted once after each administration. The experimental endpoint was set as the day after the final administration (D29) . At the endpoint, dissection and sample collection were performed according to the protocol. Data from anatomical results and serum test results were summarized and analyzed. All data were expressed as Mean±SD, and GraphPad Prism software was used for graphing and statistical analysis. For pairwise comparisons, the t-test (Student’s t-test) analysis method was adopted. The significance of differences was indicated by*, with*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, and****p<0.0001.

[0317] As shown in Figure 11, liver function indicators were significantly reduced by strain MNH19250. Specifically, Figure 11 demonstrates that serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) levels were significantly decreased by strain MNH19250. Therefore, it is suggested that strain MNH19250 can ameliorate high-fat diet-induced liver dysfunction and possesses therapeutic or preventive activity against liver function impairment.

[0318] As shown in Figure 12, based on the NAS scoring system (2005) proposed by the American Association for the Study of Liver Diseases, it is demonstrated that strain MNH19250 possesses therapeutic or preventive activity against liver function impairment and fatty liver diseases (NAFLD / NASH) . Specifically, Figure 12 shows that strain MNH19250 could significantly improve NAFLD / NASH: liver weight was significantly reduced, the liver-to-body weight ratio was significantly decreased, hepatic steatosis and lobular inflammation were significantly alleviated, hepatocellular ballooning was markedly attenuated, and the NAFLD Activity Score (NAS) was significantly lowered by strain MNH19250. Therefore, strain MNH19250 can obviously improve the nonalcoholic fatty liver and the nonalcoholic fatty hepatitis, obviously improve the liver cell injury, and has the activity of treating or preventing the liver cell injury and NAFLD / NASH.

[0319] As shown in Figure 13, it was revealed that serum urea nitrogen (BUN) and creatinine (CRE) levels were significantly reduced by strain MNH19250. Therefore, strain MNH19250 could significantly improve renal function abnormalities and had the activity of treating or preventing kidney injury and renal function abnormalities.

[0320] Example 5 Use of Strain MNH19250 for Preventing or Treating diabetes

[0321] 5.1 Experimental Methods

[0322] 1) Experimental animals: The mice used in the experiment were C57BL / 6J mice, aged 5-6 weeks, which were purchased from Jiangsu GemPharmatech Co., Ltd.

[0323] 2) Preparation of the test substance of strain MNH19250: The glycerol stock tube of strain MNH19250 was thawed at 37℃, and then inoculated onto MM01 plates in an anaerobic workstation for activation. The activated strain was inoculated into MM01 liquid medium and cultured anaerobically to obtain a sufficient quantity of culture. The cultured bacterial suspension was concentrated by centrifugation, after which the resulting bacterial pellets were resuspended in PBS containing 0.05%L-cysteine hydrochloride (L-Cys·HCl) to obtain a test substance with purity and viable count (2×109 CFU / mL) meeting the requirements of animal experiments.

[0324] 3) Negative control: PBS containing 0.05%L-Cys HCl was used as the negative control.

[0325] 4) Experimental procedure: After the quarantine period, 5-6-week-old male C57BL / 6J mice were fed a high-fat diet for 10 weeks. Twelve mice with body weights ranging from 35.50 g to 44.49 g were selected and randomly assigned into two groups (experimental group and control group) based on body weight stratification, with 6 mice per group. Administration began on the first day of grouping (D1) . The experimental group was given the above-mentioned test substance, while the control group received the negative control. Dosing was performed twice daily for 28 consecutive days. The experimental endpoint was set as the day after the final administration (D29) . Throughout the experiment, the mice had free access to water and food and were maintained under a 12h / 12h light / dark cycle. General clinical observations were conducted once after each administration. An oral glucose tolerance test (OGTT) was performed once within the last week of administration, and fasting blood glucose was determined at the end point of the test (D29) . All data were expressed as Mean±SD, and GraphPad Prism software was used for graphing and statistical analysis. For pairwise comparisons, the t-test (Student’s t-test) analysis method was adopted. The significance of differences was indicated by*, with*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, and****p <0.0001.

[0326] 5.2 Experiment on the Effect of Strain MNH19250 on Oral Glucose Tolerance in Type 2 diabetic mice induced by High-fat diet:

[0327] Oral glucose tolerance test (OGTT) : As described above, during the last week of administration, the OGTT was performed after a 12-hour fasting period (from 20: 30: 00 in the evening to 08: 30: 00 the next day) . The fasting body weight of the mice was measured, and glucose was administered by gavage at a dose of 2 g / kg (glucose in grams per fasting body weight in kilograms) . Blood glucose levels were measured at fasting and at 15, 30, 60, 90, and 120 minutes after glucose administration. For each mouse, the timing was strictly controlled, and blood glucose was accurately measured at the six specified time points.

[0328] 5.3 Experimental Results on the Effect of the Strain on Oral Glucose Tolerance in Type 2 diabetic mice induced by High-fat diet:

[0329] As shown in Figure 14, it could be seen that strain MNH19250 could significantly reduce the oral glucose tolerance in high-fat diet-induced type 2 diabetic mice induced by high-fat diet. Specifically, the results in Figure 14 showed that strain MNH19250 could significantly inhibit the increase in blood glucose in type 2 diabetic mice after glucose administration, significantly improve oral glucose tolerance, and significantly reduce the area under the oral glucose tolerance curve in type 2 diabetic mice, indicating that strain MNH19250 could significantly control blood glucose and significantly improve glucose homeostasis in type 2 diabetic mice.

[0330] 5.4 Experimental Results on the Effect of Strain MNH19250 on Fasting Blood Glucose in Type 2 Diabetic Mice Induced by High-fat Diet:

[0331] As shown in Figure 15, it could be seen that strain MNH19250 could significantly reduce the fasting blood glucose in type 2 diabetic mice induced by high-fat diet. Therefore, strain MNH19250 had the activity of preventing or treating diabetes.

[0332] Example 6 Use of Strain MNH19250 for the treatment and prevention of obesity and related diseases

[0333] 6.1 Experimental Method:

[0334] 1) Experimental animals: The mice used in the experiment were C57BL / 6J mice, aged 5-6 weeks, which were purchased from Jiangsu GemPharmatech Co., Ltd.

[0335] 2) Preparation of the test substance of strain MNH19250: The glycerol stock tube of strain MNH19250 was thawed at 37℃, and then inoculated onto MM01 plates in an anaerobic workstation for activation. The activated strain was inoculated into MM01 liquid medium and cultured anaerobically to obtain a sufficient quantity of culture. The cultured bacterial suspension was concentrated by centrifugation, after which the resulting bacterial pellets were resuspended in PBS containing 0.05%L-cysteine hydrochloride (L-Cys·HCl) to obtain a test substance with purity and viable count (2×109 CFU / mL) meeting the requirements of animal experiments.

[0336] 3) Negative control: PBS containing 0.05%L-Cys HCl was used as the negative control.

[0337] 4) Experimental procedure: After the quarantine period, 5-6-week-old male C57BL / 6J mice were fed a high-fat diet for 10 weeks. Twelve mice with body weights ranging from 35.50 g to 44.49 g were selected and randomly assigned into two groups (experimental group and control group) based on body weight stratification, with 6 mice per group. Administration began on the first day of grouping (D1) . The experimental group was given the above-mentioned test substance, while the control group received the negative control. Dosing was performed twice daily for 28 consecutive days. Throughout the experiment, the mice had free access to water and food and were maintained under a 12h / 12h light / dark cycle. General clinical observations were conducted once after each administration. Animal weights were measured twice weekly during the dosing period and were measured prior to the end of the test dissection.

[0338] Measurement of mouse food intake: On Day n, the amount of feed provided was weighed, and on Day n+1, the amount of remaining feed was weighed to obtain the 24-hour food intake before administration. During the dosing period, the amount of feed provided and the remaining feed after 24-hour consumption by the mice were weighed once per week. The experimental endpoint was set as the day after the final administration (D29) . At the endpoint, dissection and sample collection were performed according to the protocol. Data on body weight, percentage change in body weight, anatomical results, and serum test results were summarized and analyzed. All data are expressed as Mean±SD. Graphs were plotted and statistical analyses were conducted using GraphPad Prism software. For pairwise comparisons, the t-test (Student’s t-test) analysis method was adopted. The significance of differences was indicated by*, with*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, and****p <0.0001.

[0339] 6.2 Influence of Strain MNH19250 on Body Weight of Obese Model Mice:

[0340] As shown in Figure 16, it can be seen that strain MNH19250 significantly reduced the weight and weight gain of high fat diet induced obese mice and reduced the weight by about 10%after four weeks of intragastric intervention compared to before intervention, indicating that strain MNH19250 had significant weight loss effects.

[0341] 6.3 Effect of Strain MNH19250 on Food Intake in Obese Model Mice:

[0342] As shown in Figure 17, the results demonstrated that strain MNH19250 could significantly reduce the food intake of obese mice induced by a high-fat diet, indicating that strain MNH19250 exerted an appetite-suppressing effect.

[0343] 6.4 Effect of Strain MNH19250 on Blood Lipids in Obese Model Mice Induced by High-Fat Diet:

[0344] As shown in Figure 18, the results revealed that strain MNH19250 could significantly decrease the concentrations of total cholesterol (TCHO) , triglycerides (TG) , and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) in the serum of obese mice induced by high-fat diet, and significantly reduce the ratio of low-density lipoprotein cholesterol to high-density lipoprotein cholesterol, while exerting little effect on high-density lipoprotein cholesterol. The above data indicated that strain MNH19250 had the effect of treating / preventing hypercholesterolemia, hyperlipidemia, and cardiovascular and cerebrovascular diseases.

[0345] 6.5 Effect of Strain MNH19250 on Body Fat in Obese Model Mice Induced by High-Fat Diet:

[0346] As shown in Figure 19, the results showed that strain MNH19250 could significantly reduce the weights of epididymal fat, perirenal fat, visceral fat, and inguinal fat in obese mice induced by high-fat diet, and significantly decrease the ratio of visceral fat to body weight. This indicated that strain MNH19250 had the effect of treating / preventing abnormally high visceral fat ratio and treating / preventing obesity.

[0347] Example 7: Effect of the Strain on Colonic Tissue Mucosa Repair in Mice with Intestinal Barrier Dysfunction Induced by High-Fat Diet

[0348] 7.1 Experimental Methods:

[0349] 1) Experimental animals: The mice used in the experiment were C57BL / 6J mice, aged 5-6 weeks, which were purchased from Jiangsu GemPharmatech Co., Ltd.

[0350] 2) Preparation of the test substance of strain MNH19250: The glycerol stock tube of strain MNH19250 was thawed at 37℃, and then inoculated onto MM01 plates in an anaerobic workstation for activation. The activated strain was inoculated into MM01 liquid medium and cultured anaerobically to obtain a sufficient quantity of culture. The cultured bacterial suspension was concentrated by centrifugation, after which the resulting bacterial pellets were resuspended in PBS containing 0.05%L-cysteine hydrochloride (L-Cys·HCl) to obtain a test substance with purity and viable count (2×109 CFU / mL) meeting the requirements of animal experiments.

[0351] 3) Negative control: PBS containing 0.05%L-Cys HCl was used as the negative control.

[0352] 4) Experimental procedure: After the quarantine period, 5-6-week-old male C57BL / 6J mice were fed a high-fat diet for 10 weeks. Twelve mice with body weights ranging from 35.50 g to 44.49 g were selected and randomly assigned into two groups (experimental group and control group) based on body weight stratification, with 6 mice per group. Administration began on the first day of grouping (D1) . The experimental group was given the above-mentioned test substance, while the control group received the negative control. Dosing was performed twice daily for 28 consecutive days. Throughout the experiment, the mice had free access to water and food and were maintained under a 12h / 12h light / dark cycle. General clinical observations were conducted once after each administration. The experimental endpoint was set as the day after the final administration (D29) . At the test end point, the colon was collected through dissection, and fixed with paraformaldehyde fixative. Sections were stained with AB-PAS staining solution Alcian blue to visualize the mucus layer, and the mucus layer thickness was measured. . All data were expressed as Mean±SD, and GraphPad Prism software was used for graphing and statistical analysis. For pairwise comparisons, the t-test (Student’s t-test) was employed. The significance of differences was indicated by*, with*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, and****p<0.0001.

[0353] 7.2 Effect of Strain MNH19250 on Colonic Tissue Mucosa Repair in Mice with Intestinal Barrier Dysfunction Induced by High-Fat Diet

[0354] As shown in Figure 20, the results demonstrated that strain MNH19250 could significantly increase the thickness of the colonic mucus layer in mice with intestinal barrier dysfunction induced by high-fat diet, indicating that strain MNH19250 had the effect of treating / preventing intestinal barrier damage.

[0355] Example 8: Strain for use in Treatment of Metabolic Disorders to Prevent Weight Rebound and Glycemic Rebound after Discontinuation of a GLP-1 Receptor Agonist

[0356] 8.1 In Vivo Experiment in Obese Mice after Discontinuation of Semaglutide Treatment

[0357] After being fed a high-fat diet for 10 weeks and obesity was induced, the mice were treated with semaglutide for 4 weeks followed by withdrawal. After semaglutide treatment was discontinued, interventions with live MNH19250 (MNH19250-L) and pasteurized MNH19250 cells (MNH19250-P) were administered to evaluate the effect of MNH19250 on preventing weight rebound after semaglutide withdrawal. This study has been approved by the Animal Ethics Committee of Moon Biotechnology.

[0358] 8.1.1 Experimental Methods

[0359] 1) Experimental animals: The mice used in the experiment were C57BL / 6J mice, aged 5-6 weeks, which were purchased from Jiangsu GemPharmatech Co., Ltd.

[0360] 2) Test strain: The glycerol stock tube of MNH19250 strain was thawed at 37℃, and then inoculated onto MM01 plates in an anaerobic workstation for activation. The activated strain was inoculated into MM01 liquid medium and cultured anaerobically to obtain a sufficient quantity of culture. The cultured bacterial suspension was concentrated by centrifugation, after which the resulting bacterial pellets were resuspended in PBS containing 25%glycerol and 0.05%L-cysteine hydrochloride (L-Cys·HCl) to obtain a test substance with purity and viable count (2×109 CFU / mL) meeting the requirements of animal experiments. Wherein a portion of the viable MNH19250 cells was incubated at 70℃for 30 minutes to obtain pasteurized MNH19250 cells (MNH19250-P) .

[0361] 3) Negative control: PBS containing 25%glycerol and 0.05%L-Cys HCl was used as the negative control.

[0362] 4) Experimental procedure: 5–6-week-old male C57BL / 6J mice were used in the experiment. After the quarantine period, eight mice were randomly selected and fed a standard diet, while the remaining mice were all fed a high-fat diet for 10 weeks. After 10 weeks, all mice fed the standard diet were assigned to the NCD group. Among the mice fed the high-fat diet, 32 mice with body weights ranging from 36 g to 44 g were selected and randomly divided into groups based on body weight stratification, with 8 mice per group. A total of five groups were established: NCD group, HFD group, HFD+Sema group, MNH19250-L group, and MNH19250-P group. The NCD group continued to receive the standard diet, while the other four groups continued to be fed the high-fat diet. Administration began on the first day of grouping (D1) . The NCD group and HFD group were given the negative control. The remaining three groups were administered Semaglutide (30 nmol / kg, once every three days) . After 4 weeks of Semaglutide treatment, administration was discontinued. The HFD+Sema group then started receiving the negative control, while the MNH19250-L group and MNH19250-P group began receiving MNH19250-L and MNH19250-P, respectively. The NCD group and HFD group continued to receive the negative control. Dosing was performed once daily for a total of 28 days. Throughout the experiment, the mice had free access to water and food and were maintained under a 12h / 12h light / dark cycle. General clinical observations were conducted once after each administration. The experimental endpoint was set as the day after the final administration (D57) . At the endpoint, dissection and sample collection were performed according to the protocol. Data from anatomical results and serum test results were summarized and analyzed. Fasting blood glucose levels were measured, along with blood glucose levels at 15, 30, 60, 90, and 120 minutes after glucose administration. For each mouse, the timing was strictly controlled, and blood glucose was accurately measured at the six specified time points to obtain glycemic indicators. Subcutaneous fat, epididymal fat, perirenal fat, and mesenteric fat were directly dissected and weighed. Visceral fat was defined as the sum of epididymal, perirenal, and mesenteric fat. White adipose was calculated as the total of all fat deposits.

[0363] 5) All data were expressed as Mean±SD, and GraphPad Prism software was used for graphing and statistical analysis. For pairwise comparisons, the t-test (Student’s t test) was adopted. No significance was indicated by no mark; the significance of differences was indicated by*, with*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, and****p<0.0001.

[0364] 8.2 Experiment on Oral Glucose Tolerance in High-Fat Diet-Induced Type 2 Diabetic Mice:

[0365] Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) : During the last week of administration, the OGTT was performed after a 12-hour fasting period (from 20: 30: 00 in the evening to 08: 30: 00 the next day) . The fasting body weight of the mice was measured, and glucose was administered by gavage at a dose of 2 g / kg (glucose in grams per fasting body weight in kilograms) . Blood glucose levels were measured at fasting and at 15, 30, 60, 90, and 120 minutes after glucose administration. For each mouse, the timing was strictly controlled, and blood glucose was accurately measured at the six specified time points.

[0366] 8.3 Results

[0367] 1) As shown in Figure 21, it demonstrated that the weight gain and weight gain rate after semaglutide treatment discontinuation were reduced by MNH19250. Compared to the lowest point, the weight increase was less than 7.09%, with the pasteurized MNH19250 group showing an increase of less than 5%, specifically 2.09%. These findings indicate that MNH19250 ameliorates weight rebound after semaglutide discontinuation and can be used to maintain body weight, thereby enabling sustained metabolic disease treatment effects.

[0368] 2) As shown in Figure 22, strain MNH19250 could significantly reduce the area under the OGTT curve (AUC-OGTT) , 2-hour postprandial blood glucose, and fasting blood glucose after discontinuation of semaglutide treatment. This indicated that MNH19250 could improve the imbalance of glucose homeostasis and the elevation of blood glucose after discontinuation of semaglutide treatment, and had the application of preventing blood glucose rebound and maintaining blood glucose balance, thereby enabling the therapeutic effect on metabolic diseases to be sustained at a healthy level after drug discontinuation.

[0369] 3) As shown in Figure 23, strain MNH19250 could significantlyreduce liver weight, local fat weights, e.g., subcutaneous fat, epididymal fat, perirenal fat, mesenteric fat, and white adipose, the ratio of white adipose to body weight, visceral fat, and the ratio of visceral fat to body weight after discontinuation of semaglutide treatment. This indicated that MNH19250 could improve fat accumulation after discontinuation of semaglutide treatment and had the application of preventing body fat accumulation and local fat rebound.

[0370] Example 9: Live bacteria and pasteurized inactivated Akkermansia muciniphila improve Alzheimer's disease

[0371] 9.1. Experimental Model and Detection Methods

[0372] 48 male C57BL / 6J mice were ordered. After the quarantine period, they were randomly stratified into 6 groups based on body weight, with 8 mice per group and 4 mice per cage. Negative control group was administrated negative control. The D-galactose-induced aged model mice were divided into 5 groups: the model group (Group B: Model group) , Probiotic1 (Group C: MNH19250-L) , Probiotic2 (Group D: MNH19250-P) , Probiotic3 (Group E: MNH19631-L) , and Probiotic4 (Group F: MNH19631-P) . . Administration was initiated on Day 1 (model establishment) , once daily, for at least 42 days. Starting from Day 1, except for the negative control group (Control group) , the remaining model groups (Groups B to F) were subcutaneously injected with 800 mg / kg / day D-gal to establish the aging model. This was performed once daily.

[0373] In the prior art, aged models are usually established by administering D-galactose alone or in combination with sodium nitrite. Administration methods and dosages have been studied in the literature (Sun Ronghua, Li Shuang, Shao Ying, Li Wei, Ding Chuanbo, Zhang Jing, Zheng Yinan, Ren Xiaoli. Optimization of D-galactose-induced subacute aged model in mice [J] . Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica, 2015, 31 (4) : 293-297) . It has been found that the levels of malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH) in mouse brain tissues can be significantly altered by subcutaneous injection of 0.5 g / kg D-galactose, whereas the levels of MDA and GSH in mouse brain tissues have not been significantly changed by subcutaneous injection of a combination of 0.125 g / kg D-galactose and 0.08 g / kg sodium nitrite. Compared with the subcutaneous combination group (0.125 g / kg D-galactose+0.08 g / kg sodium nitrite) , mice in the 0.5 g / kg subcutaneous D-galactose group exhibit more obvious aging symptoms, including changes in mental state, physiological parts, fur color, and excretion. This indicates that the method of subcutaneous injection of high-dose D-galactose is more capable of simulating brain aging in animals. Therefore, the modeling method adopted in the present application was subcutaneous injection of high-dose D-galactose.

[0374] After 42 days of administration, behavioral tests were performed to validate the successful establishment of the Alzheimer’s disease model. Upon completion of the tests, mouse brain tissues preserved in formalin fixative were collected, and paraffin sections were prepared.

[0375] Nissl staining was used to observe the distribution, morphology, and pathological changes (such as neuronal degeneration, necrosis, or atrophy) of neurons in the hippocampus and other brain regions. Nissl staining is a classic neural tissue staining method. It uses basic dyes (such as cresyl violet, toluidine blue, or crystal violet) to specifically bind to Nissl bodies (rough endoplasmic reticulum and free ribosomes) in the cytoplasm of neurons, and is used to observe the distribution, morphology, and pathological changes (such as neuronal degeneration, necrosis, or atrophy) of neurons in the hippocampus and other brain regions.

[0376] Fluorescent double-labeled immunofluorescence staining method was used to detect the expression of amyloid protein (Aβ) , phosphorylated Tau (p-Tau) , P53 protein, GFAP (glial fibrillary acidic protein) , IBA-1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1) , and myelin basic protein (MBP) molecules in hippocampal tissues.

[0377] Detection of Sirtuin1 gene expression levels: a10-50mg of mouse brain samples were taken. The tissue RNA were extracted using an RNA extraction kit (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, Code No. 9767) , followed by reverse transcription using a reverse transcription kit (TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser, Code No. RR047A) . The expression of the target functional gene Sirtuin1 and housekeeping genes was detected using a gene expression detection kit (TaKaRa TB Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus) , TaKaRa) . The relative expression level of Sirtuin1 in the mouse brain tissue samples was calculated.

[0378] Morris Water Maze Test Procedure

[0379] 1 Acquisition phase: Learning to find the resting platform in water

[0380] The pool was divided into 4 quadrants (Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ) according to the four directions of east, south, west, and north, and the platform placed in the center of quadrantⅢ (southeast direction) .

[0381] Steps as following:

[0382] 1) The mice were placed into the water with their heads facing the pool wall, and the placement position was randomly selected from one of the four starting positions in quadrantsⅠ, Ⅱ, Ⅲ, andⅣ. The time (s) taken for the animals to locate the underwater platform was recorded.

[0383] 2) Training was initiated for each animal following its initial placement into each of the four quadrants, with a total of four training sessions conducted per day for five consecutive days. During the initial training sessions, if the time taken to locate the platform exceeded 60 s, the animal was guided to the platform. The animal was allowed to remain on the platform for 10 s.

[0384] 2 Probe trial: Remove the platform to assess animal's learning and memory abilities as well as spatial memory capabilities.

[0385] On the day following the final acquisition training phase, the platform was removed, and a 60-second probe trial was initiated. The animal was placed into the water from the quadrant opposite to the platform quadrant (QuadrantⅠ) . The time spent in the target quadrant (the quadrant where the platform was originally located) and the number of platform crossings, among other indicators, were recorded and served as indicators for assessing learning, memory, and spatial memory capabilities.

[0386] In the experimental results, statistical analyses were performed on key indicators, including Escape latency (time taken to locate the platform) , Distance in escape latency (distance traveled to locate the platform) , Platform-crossing times (number of platform crossings) , Distance in target quadrant (distance traveled in the target quadrant) , and Time in target quadrant (time spent in the target quadrant) . These analyses were then used to evaluate the improvement in learning, memory, and spatial perception abilities of the brain in aged model mice after drug administration.

[0387] 9.2. Result:

[0388] 9.2.1 Morris Water Maze Test

[0389] As shown in Figures 24 and 33, compared to normal mice (control group) , for aged model mice, the time and distance spent searching for the target platform significantly increased, while the number of crossings at the target platform, as well as the time and distance in the target quadrant, significantly decreased. Compared to aged model mice, the group administrated with MNH19250 live bacteria (MNH19250-L) , pasteurized inactivated MNH19250 (MNH19250-P) , MNH19631 live bacteria (MNH19631-L) , pasteurized inactivated MNH19631 (MNH19631-P) , the time and distance spent searching for the target platform significantly decreased significantly, while the number of crossings at the target platform, as well as the time and distance in the target quadrant, significantly increased. The above results can also be intuitively observed from the mice's movement trajectory graphs.

[0390] MNH19250 live bacteria (MNH19250-L) , pasteurized inactivated MNH19250 (MNH19250-P) , MNH19631 live bacteria (MNH19631-L) and pasteurized inactivated MNH19631 (MNH19631-P) could significantly improve learning, memory and spatial perception abilities of aged model mice.

[0391] 9.2.2 Brain Tissue Aging and Nerve Cell Damage of the Aged Mice

[0392] Alzheimer's disease (AD) is a common single type of senile dementia. It is an irreversible neurodegenerative disease caused by abnormal deposition ofβ-amyloid (Aβ) and tau protein tangles in the brain, which lead to neuronal damage. Unlike other types of dementia such as vascular dementia and Lewy body dementia, the core cause of AD is the accumulation ofβ-amyloid plaques and neurofibrillary tangles in the brain, resulting in neuronal death and brain atrophy.

[0393] Aβand tau proteins are biomarkers for the clinical diagnosis of Alzheimer's disease. In patients with Alzheimer's disease, abnormal phosphorylation of tau protein leads to the formation of neurofibrillary tangles, which is one of the pathological features of the disease.

[0394] As shown in Figure 25, the significant increase in phosphorylated tau-positive neurons in the hippocampus of model mice suggests abnormal phosphorylation of tau protein in the hippocampus of model mice, indicating the successful modeling of Alzheimer's disease in mice.

[0395] In a published study (Stanga, S. et al., 2010. Unfolded p53 in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: Is HIPK2 the link? Aging, 2 (9) , pp. 545‐554. ) , it has been demonstrated that the presence of a large number of conformationally altered p53 isoforms is identified as an early risk factor for Alzheimer’s disease (AD for short) . Higher levels of unfolded p53 have also been confirmed in the blood of AD patients and in mild cognitive impairment (MCI) that progresses to AD, compared with healthy non-demented subjects or patients affected by other types of dementia and Parkinson’s disease (PD) .

[0396] As shown in Figure 25, we verified that the activation of P53 and the significantly increase of P53+ cells were related to neuronal functional decline, neuroinflammation and cognitive impairment.

[0397] Devastating neuronal loss and glial cell proliferation in the hippocampus are also recognized as hallmarks of Alzheimer’s disease (Rao, Y. L., Ganaraja, B., Murlimanju, B.V. et al. Hippocampus and its involvement in Alzheimer’s disease: a review. 3 Biotech 12, 55 (2022) . https:  / / doi. org / 10.1007 / s13205-022-03123-4) . GFAP (glial fibrillary acidic protein) and IBA-1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1) are two key glial cell markers, which are used to assess the activation status of astrocytes and microglia, respectively, in mouse brain tissues.

[0398] As shown in Figure 26, for model mice, astrocytic hyperplasia (upregulated expression of GFAP, leading to neuroinflammation) and microglial activation (upregulated expression of IBA-1, resulting in synaptic phagocytosis) in the hippocampus are observed, indicating abnormal activation of glial cells in the model mice. This suggests the presence of neuroinflammation in the hippocampus of the mice, and both factors collectively drive the "neuroinflammation-synaptic damage-cognitive decline" axis, ultimately leading to brain degenerative aging and neurodegenerative diseases.

[0399] As shown in Figure 27, decrease of hippocampal neurons (Nissl staining) and damage to the myelin sheath of neural synapses were observed, indicating abnormal apoptosis of horse somatic neurons and myelin sheath damage in brain tissue.

[0400] Based on the experimental results of the aforementioned biological markers (abnormal phosphorylation of tau protein) , key pathological features (neuronal loss and gliosis) , and behavioral characteristics in the model mice, the model group was successfully validated as an Alzheimer's disease model.

[0401] 9.2.3 MNH19250 improve Brain aging and Nerve Cell Damage

[0402] As shown in Figure 25-26, decrease of phosphorylated tau-positive neurons in the hippocampal region of mice in the mice administrated with MNH19250-P was associated with a significant reduction in glial cell activation (GFAP / IBA-1) , indicating administration of MNH19250-P could decrease abnormal phosphorylation of tau protein, mitigate neuroinflammation and reduce neurofibrillary tangles, thereby improving cognitive function and neuronal function, and ameliorating neurodegenerative diseases.

[0403] Based on the differences in the primary locations of tau neurofibrillary tangles (NFTs) , Alzheimer's disease (AD) can be classified into three subtypes: typical AD, limbic-predominant AD, and hippocampal-sparing AD (Ferreira, Daniel et al. “The hippocampal sparing subtype of Alzheimer's disease assessed in neuropathology and in vivo tau positron emission tomography: asystematic review. ” Acta neuropathologica communications vol. 10, 1 166.14 Nov. 2022, doi: 10.1186 / s40478-022-01471-z) . In limbic-predominant AD, NFTs are mainly concentrated in the hippocampus and limbic structures. In hippocampal-sparing AD, NFTs are primarily distributed in the association cortex regions, including the medial frontal gyrus, superior temporal gyrus, and inferior parietal gyrus, with mild NFT involvement in the hippocampus. In contrast, NFTs in typical AD are widely distributed in the entorhinal cortex and association cortex.

[0404] Therefore, we verified that MNH19250 could alleviate typical AD and limbic-predominant AD by reducing abnormal phosphorylation of tau protein in the hippocampal region.

[0405] Meanwhile, administration of MNH19250-P could regulate the abnormal increase of P53-positive neurons in mice and improve neuronal function.

[0406] As shown in Figure 27, the number of neurons and the myelin basic protein (MBP) in the mouse hippocampus of mice administrated MNH19250-P increased significantly, indicating that administration of MNH19250-P could reduce neuronal damage in the brain and myelin sheath damage in brain tissues, thereby improving spatial memory deficits and learning and memory abilities.

[0407] 9.2.4 Pasteurized Inactivated MNH19250 increases Expression of Sirtuin1 in Mouse Brain Tissue

[0408] Silent information regulator 1 (SIRT1) is one of the seven proteins in the sirtuin family of mammalian NAD+-dependent deacetylases. Current studies have found that SIRT1 has neuroprotective effects and regulates many pathological processes related to Alzheimer's disease (AD) , including the cleavage of amyloid-β precursor protein (APP) , neuroinflammation, neurodegeneration, and mitochondrial dysfunction.

[0409] The results are shown in Figure 28. Compared with the model group (Model control) , the relative expression level of Sirtuin1 in the brain tissue of mice was significantly increased after intervention with live MNH19250 (MNH19250-L) and pasteurized MNH19250 (MNH19250-P) . This indicates that both live and pasteurized MNH19250 were able to activate the expression of Sirtuin1, which regulates multiple downstream pathways through deacetylation, thereby achieving effects such as antioxidation, reduction of paired helical filament tau accumulation, reduction of Aβaccumulation, and alleviation of neuroinflammation.

[0410] Studies have shown that SIRT1 is significantly reduced in the parietal cortex of AD patients (mRNA: -29%; protein: -45%) . SIRT1 mRNA and its translated protein are negatively correlated with the accumulation of paired helical filament tau (PHF-Tau) . PHF-Tau is the main component of neurofibrillary tangles (NFTs) , which is closely associated with neuronal necrosis and programmed cell death. Overall, the deficiency of SIRT1 is closely linked to the accumulation of Aβand tau in the cerebral cortex of AD patients. (Julien C, Tremblay C, Emond V, Lebbadi M, Salem N Jr, Bennett DA, Calon F. Sirtuin 1 reduction parallels the accumulation of tau in Alzheimer disease. J Neuropathol Exp Neurol. 2009 Jan; 68 (1) : 48-58. doi: 10.1097 / NEN. 0b013e3181922348. PMID: 19104446; PMCID: PMC2813570) .

[0411] Using a nematode model, it was validated that sir-2.1 (a homolog of SIRT1) deletion mutants exhibited more severe tau-induced locomotion deficits, accompanied by elevated oxidative stress and neuronal axon degeneration (Nicolas Bizat, Jean-Michel Peyrin, Stephane  et al. Neuron Dysfunction Is Induced by Prion Protein with an Insertional Mutation via a Fyn Kinase and Reversed by Sirtuin Activation in Caenorhabditis elegans. ) .

[0412] Overexpression of Sirtuin1 / Sir2.1 can significantly reduce tau aggregation and regulate neuronal energy metabolism by activating the DAF-16 / FOXO and inhibiting the NF-κB inflammatory pathways. In addition, activation of the SIRT1 / AMPK pathway was demonstrated to be associated with cholesterol synthesis and the pathogenic effects of APOE4 on APP and tau aggregation. Activation of SIRT1 was also shown to enhance blood-brain barrier integrity and elicit adaptive immune responses, which may modulate the inflammatory components of degenerative processes and improve brain resilience (Justyna Anna Bizoń, Marta  et al. Role of Sirtuins in Physiology and Diseases of the Central Nervous System. Biomedicines 2022, 10 (10) , 2434; https:  / / doi. org / 10.3390 / biomedicines10102434) .

[0413] Sirt1, known as a "longevity protein" , is one of the most critical regulatory factors in the process of cellular senescence. Sirt1 participates in regulating multiple core signaling pathways of aging.

[0414] The Sirt1 / P53 / P21 cellular senescence pathway, which is the most classical pathway through which Sirt1 inhibits cellular senescence. Sirt1 directly deacetylates the p53 protein, inhibiting its transcriptional activity. This reduces the expression of p21, thereby alleviating cellular senescence and buying time for cellular repair. After intervention with live MNH19250 and its postbiotics, Sirtuin1 was significantly activated in the hippocampus, with increased expression levels, and p53-positive proteins were markedly reduced.

[0415] Additionally, mouse brain tissues preserved in formalin fixative were used to prepare paraffin sections. Immunofluorescence staining was performed using a p21 antibody.

[0416] The results showed that, following intervention with live MNH19250 and its postbiotics, p21-positive proteins were significantly reduced, indicating that live MNH19250 and its postbiotics slow neuronal senescence in the brain by activating Sirtuin1 and the Sirt1 / P53 / P21 cellular senescence pathway..

[0417] The Sirt1 / NF-κB pathway (anti-inflammatory pathway) , in which Sirt1 deacetylates and inhibits the NF-κB signaling pathway. NF-κB is the master switch of inflammatory responses. By suppressing it, Sirt1 effectively calms overactive glial cells and reduces the release of pro-inflammatory factors.

[0418] Detection of inflammatory factors TNF-α, IL-1β, and IL-6 in serum and hippocampal: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used for detection, with mouse ELISA kits purchased from Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd. Hippocampal and other tissue samples were homogenized in normal saline at a ratio of 1: 9, and the supernatant was collected after centrifugation. ELISA was performed using mouse ELISA kits purchased from Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.

[0419] Detection of NF-κB in the hippocampus: Mouse brain tissues preserved in formalin fixative were used to prepare paraffin sections. Immunofluorescence staining was performed using an NF-κB antibody.

[0420] The results showed that NF-κB was significantly reduced in hippocampal tissues.

[0421] MNH19250 itself, or in conjunction with other gut microorganisms after entering the intestine, produces activators that activate Sirtuin1, such as NMN (nicotinamide mononucleotide) , NR (nicotinamide riboside) , L-arginine, polyamines (e.g., spermidine, spermine) , or tryptophan metabolites like Indole-3-lactic acid, among other similar substances.

[0422] Example10: Anti-aging Experiment of Wild-type Caenorhabditis elegans N2 with Supplementary Feeding of MNH19250

[0423] 10.1 Culture of Strain MNH19250

[0424] The glycerol stock tube of strain MNH19250 was thawed at 37℃, then inoculated into MM01 medium for activation in a biological safety cabinet. Then, the activated strain was inoculated into MM01 liquid medium for cultivation to obtain a sufficient quantity of culture.

[0425] 10.2 Culture of E. coli OP50

[0426] The cryopreserved OP50 strain (the E. coli OP50 strain used in this experiment was kindly provided by the Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences) was taken out from the-80℃ freezer, inoculated into LB medium, and cultured with shaking at 225 rpm at 37℃ for approximately 16 hours. The bacterial culture was aliquoted and stored in a 2-8℃refrigerator for future use.

[0427] 10.3 Preparation of Bacterial Culture Dish for Nematode Feeding

[0428] The Caenorhabditis elegans N2 (hereinafter referred to as nematodes) used in this experiment was kindly provided by the Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences.

[0429] 100μL of the overnight-cultured OP50 bacterial solution was spread on NGM plate medium (Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd., M2328B) , which served as the OP50 nematode feeding plate (labeled OP50) .

[0430] Akkermansia muciniphila MNH19250 was washed 3 times with M9 buffer (3 g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5 g NaCl and 1 mL 1 M MgSO4, added with water to 1 L, autoclaved at high temperature) and resuspended in E. coli OP50 to different concentration gradients, 100μL of each gradient was spread on NGM plate medium, which served as the nematode feeding plates for OP50 and MNH19250 live bacterial (labeled OP50+AKK) ;

[0431] Prior to resuspension in E. coli OP50, Akkermansia muciniphila MNH19250 of different concentration gradients were heated at 70℃for 30 min, and then resuspended in E. coli OP50 to different concentration gradients. 100μL of each gradient was spread on NGM plate medium, which served as OP50 and pasteurized MNH19250 nematode feeding plates (labeled OP50+pas-AKK) .

[0432] 10.4 Synchronization of Nematodes

[0433] The nematode culture plates with a high number of nematode eggs were washed several times with sterile water, and the wash solution was collected into a 15 mL centrifuge tube. After natural sedimentation of nematodes and eggs, the supernatant was removed, leaving 3.5 mL of suspension containing egg in sterile water. Then, 1.5 mL of lysate (prepared by mixing 5 mol / L sodium hydroxide solution and 5%sodium hypochlorite solution at a volume ratio of 1: 2) was added. The centrifuge tube was shaken using a vortex mixer at 200 rpm, with the process repeated every 2 minutes for a total duration of 10 minutes. Subsequently, the mixture was centrifuged at 1, 300 g for 30 seconds to precipitate the eggs. The supernatant was removed, and the eggs were washed once with sterile water. The eggs were then transferred to a new NGM plate and incubated at 20℃ in a biochemical incubator. After approximately 48 hours, the eggs developed into L4-stage larvae, which were used for subsequent experiments.

[0434] 10.5 Detection Method

[0435] 10.5.1 Determination of lifespan of nematodes

[0436] L4-stage larvae were transferred to NGM plates seeded with OP50, OP50+Pas-AKK, or OP50+AKK bacteria for nematode maintenance. All lifespan assays were conducted at 20℃. Synchronized L4 larvae were designated as t=0 for lifespan determination and were transferred to fresh plates every two days until all nematodes had died. Each experiment tested 90 nematodes across three plates (30 nematodes per plate) . Survival rates were assessed every 1-2 days. Nematodes that did not respond to mechanical stimulation were considered dead. The maximum lifespan, mean lifespan, and survival curves were statistically analyzed under different treatment conditions.

[0437] 10.5.2 Locomotor Ability

[0438] Locomotor ability was one of the key indicators for evaluating the healthy lifespan of nematodes. Locomotor status and ability were gradually impaired and weakened with the aging of the organism. During the lifespan assays, the locomotor ability of nematodes was scored to evaluate their locomotor ability, and further to assess the impact of MNH19250 on the healthy lifespan of nematodes.

[0439] Synchronized L4-stage larvae were transferred to NGM plates seeded with OP50, OP50+Pas-AKK, or OP50+AKK bacteria for nematode maintenance. locomotor ability scoring was measured on days 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, and 17. During observation, nematodes were transferred to food-free NGM plates, and a minimum of90 nematodes were randomly scored per experiment.

[0440] Locomotor Ability Scoring Rules:

[0441] 10.5.3 Movement Rate

[0442] The movement rate is one of the key indicators for assessing the motor vitality of nematodes. Nematodes move by bending their bodies, so the body bending frequency is used to represent the movement rate. 30 synchronized L4-stage larvae were randomly selected and transferred to NGM plates seeded with OP50, OP50+Pas-AKK, or OP50+AKK bacteria for nematode maintenance. The movement rate was measured on days 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, and 17. During observation, the nematodes were transferred to food-free NGM plates and allowed to move freely for 2 minutes. Under a microscope, the number of body bends within 1 minute was observed and recorded as an indicator of body bending frequency. One bend was defined as the movement of one wavelength relative to the body's longitudinal axis.

[0443] 10.5.4 Determination of Pharyngeal Pump Frequency

[0444] Nematode food intake is primarily accomplished through the pharyngeal pump. 30 synchronized L4-stage larvae were randomly selected and transferred to NGM plates seeded with OP50, OP50+Pas-AKK, or OP50+AKK bacteria for nematode maintenance. Their swallowing frequency was measured on days 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, and 17. The pharyngeal pump rate was observed and measured using a stereomicroscope. The number of pharyngeal contractions in the terminal bulb of the pharynx was counted at 30-second intervals.

[0445] 10.5.5 Anti-aging Associated Gene Pathway in Nematodes

[0446] Insulin / insulin-like growth factor 1 (IGF-1) signaling pathway is one of the most important signaling pathways regulating aging in biological individuals. The daf-16 gene belongs to a key gene in an insulin signal path in nematodes, and can find a homologous gene of the signal path in human beings. There are a number of reports in the literature that the daf-16 gene can be regulated by providing specific nutrients to delay life. The higher the activity of daf-16, the longer the life of the nematode and the better the immunity against infection. Inhibition of the DAF-2 and age-1 genes activates DAF-16, and promotes entry of DAF-16 from the cytoplasm into the nucleus, thereby widely regulating the expression level of downstream genes associated with anti-stress, detoxification and metabolism.

[0447] Sir-2.1 is a member of the sirtuin protein family and plays an important role in DNA damage repair, cell cycle control, inhibition of apoptosis, resistance to oxidative stress, energy metabolism, mitochondrial function protection, and the like. Recent studies have shown that Sir2 can increase the ratio between mitochondrially encoded MTCO1 (mitochondrial oxidative respiratory chain complex IV subunit) and nuclear encoded ATP5A (mitochondrial oxidative respiratory chain complex IV subunit) , disrupt mitochondrial nucleoprotein imbalance, induce mitochondrial unfolded protein responses (mito-chondrial unfolded protein response, UPRmt) , improve mitochondrial function and significantly extend nematode longevity (Qi Xinxin et al, mitochondrial unfolded protein responses act in Sir2 to inhibit parkinsonism transgenic drosophila, university of medical science, 2016) . The study proves that the overexpression of Sir2 obviously inhibits the degeneration of motor neurons of transgenic Drosophila in Parkinson's Disease (PD) , obviously improves the motor capacity of the Drosophila, and obviously reduces the protective effect of Sir2 after UPRmt is inhibited. Conclusion Sir2 has neuroprotective effects on PD transgenic drosophila, which are associated with UPRmt.

[0448] Meanwhile, research results show that the exosomes derived from the mesenchymal stem cells can remarkably increase the expression of SIRT1 genes (homologous genes of Sir2.1) in the aging mice, resist apoptosis and reduce the effect of oxidative stress in the brains of the aging mice. SIRT1 is a viable therapeutic target and plays an important role in anti-aging processes, particularly in resisting brain aging (Zhang, Xiaowen et al. "Exosomes secreted by mesenchymal stem cells delay brain aging by upregulating SIRT1 expression. " Scientific reports vol. 13, 113213.14 Aug. 2023, doi: 10.1038 / s41598-023-40543-5) .

[0449] The antioxidant genes include glutathione S-transferase 4 (gst-4) , superoxide dismutase 3 (superoxide dismutase, sod-3) .

[0450] Synchronized L4-stage larvae were randomly selected and transferred to NGM plates seeded with OP50, OP50+Pas-AKK, or OP50+AKK bacteria for nematode maintenance. To ensure sufficient bacterial food supply, no more than 150 nematodes were placed per plate. After culturing at 20℃ for 4 days, a minimum of 500 nematodes were collected from each treatment group and washed 5 times with M9 buffer to remove residual bacteria. Total RNA was extracted from the nematodes using the MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (Takara, CAT. No. 9767) . Following the protocol described in the PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara, catalog number RR047A) , 1μg of total RNA was reverse-transcribed into cDNA. Real-time quantitative PCR was performed using the PrimeScript RT Enzyme Mix reagent (Takara, CAT. No. RR037Q) reaction system on an Applied Biosystems QuantStudio 3 real-time PCR system. Relative gene expression levels were calculated using the 2-ΔΔCt method. Primer sequences are listed in the table below.

[0451] 10.5.6 Influence of MNH19250 Supplementation on Heat Shock Stress and UV Stress Resistance

[0452] Heat stress resistance assay: 30 synchronized L4-stage larvae were randomly selected and transferred to NGM plates seeded with OP50, OP50+Pas-AKK, or OP50+AKK bacteria for nematode maintenance. After culturing at 20℃ for 4 days, the treated nematodes were transferred to a constant-temperature incubator set at 35℃. The number of dead nematodes was recorded every hour or every 30 minutes. Nematode that did not respond to mechanical stimulation were considered dead. The maximum lifespan, mean lifespan, and survival curves were statistically analyzed under different treatment conditions.

[0453] UV aging resistance assay: L4 larvae were washed off from NGM plates using sterile water. The nematode suspension solution was centrifuged at 156 g for 1 minute, and the supernatant was removed. The pellet was resuspended in M9 buffer to a volume of 50μL, containing approximately 30 nematodes per aliquot. Each aliquot was transferred to a well of a 6-well plate pre-seeded with OP50 or a mixture of OP50 and differently treated Akkermansia muciniphila MNH19250, and allowed to adapt overnight. Each sample was replicated in three wells. The following day, the plate was exposed to 254 nm UV radiation at a dose of 1000 J / m2 for 8 min and 40 s, and then immediately transferred to a 20℃ incubator. The animals were counted every 24 hours until all nematodes in the assay had died.

[0454] 10.6 Result

[0455] Graphs and statistical analyses were performed using GraphPad Prism 9.3.1 software. Survival curves were analyzed using simple survival analysis (Kaplan-Meier) . For pairwise comparisons, an unpaired t-test was applied. For comparisons among three or more groups, one-way ANOVA was used. Significance was denoted as follows: *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001, ****: p<0.0001. No significance was indicated ifnot marked.

[0456] 10.6.1 Lifespan

[0457] As shown in Figure 29, Compared with the average lifespan and maximum lifespan of nematodes fed with E. coli OP50, pasteurized MNH19250 and live MNH19250 significantly prolonged the maximum lifespan of nematodes (Figure 29A) . Pasteurized MNH19250 significantly prolonged the mean life of the nematodes, and live MNH19250 prolonged the mean life of the nematodes (Figure 29B) . MNH19250 was shown to delay nematode senescence.

[0458] 10.6.2 Locomotor Ability

[0459] As shown in Figure 30, as nematodes aged, the locomotor ability of those fed with E. coli OP50 gradually deteriorated and weakened, with a gradual increase in the number of nematodes classified as dead (Category D) and unable to move the body (Category C) in locomotor ability scoring. Compared with the locomotor ability scores of nematodes fed with E. coli OP50, supplemental feeding with pasteurized MNH19250 and live MNH19250 significantly improved the healthy survival and locomotor ability of nematodes. The number of dead (Category D) and body-immobile (Category C) nematodes was significantly fewer than that of OP50-fed nematodes, while the number of nematodes exhibiting normal sinusoidal movement (Category A) was more numerous.

[0460] Supplemental feeding with pasteurized MNH19250 and MNH19250 live bacteria significantly increased the sinusoidal movement frequency of nematodes and improved their healthy Locomotor Ability (Panel C of Figure 30) . Supplemental feeding with pasteurized MNH19250 and MNH19250 live bacteria significantly increased the significantly increased the Swallowing Pump frequency of nematodes (Panel D of Figure 30) .

[0461] It could be seen that MNH19250 significantly improved locomotor activity and physiology of nematodes and improved the decline in locomotor activity and physiology caused by aging

[0462] 10.6.3 Anti-aging Associated Gene Pathway in Nematodes

[0463] As shown in Figure 31, compared to the number of nematode progeny fed E. coli OP 50, pasteurized MNH19250 supplementation significantly increased the relative expression of C. elegans insulin / IGF-1 growth factor life signaling pathway related gene (daf-16) , significantly increased the relative expression of antioxidant pathway critical genes (gst-4 and sod-3) , and significantly increased the relative expression of regulator Sir-2.1 protein of glial cell signaling mitochondrial unfolded protein response.

[0464] Therefore, the delay in aging rate by MNH19250 was achieved by upregulating the expression of genes associated with the insulin / IGF-1 signaling pathway (daf-16) , key antioxidant pathway genes (gst-4 and sod-3) , and the mitochondrial unfolded protein response regulator Sir-2.1 in glial cell signaling in C. elegans.

[0465] 10.6.4 Influence of MNH19250 Supplementation on Heat Shock Stress and UV Stress Resistance

[0466] As shown in Figure 32A and 32 B, compared with the life span of nematode fed E. coli OP 50, both pasteurized and live Akkermansia muciniphila MNH19250 (Pas-AKK and AKK) at concentrations of 1010CFU / mL, 109CFU / mL, and 108CFU / mL were able to significantly prolong the lifespan of nematodes under heat stress and improve their survival rate against thermal stress.

[0467] As shown in Figure 32C, compared with nematodes fed E. coli OP50, pasteurized Akkermansia muciniphila MNH19250 (Pas-AKK) at concentrations of 1011CFU / mL, 1010CFU / mL, as well as live Akkermansia muciniphila MNH19250 at 1011CFU / mL were able to significantly prolong the lifespan of nematodes under UV irradiation stress and improve their survival rate against UV-induced aging.

[0468] Example 11 Method for increasing the production of Amuc_1100 protein in Akkermansia muciniphila

[0469] 11. Material and Method

[0470] 11.1 Material

[0471] 11.1.1 Strain

[0472] Akkermansia muciniphila MNH19250

[0473] 11.1.2 Medium

[0474] Liquid seed medium: 15.0 g / L of yeast peptone, 15.0 g / L yeast extract powder, 5.0 g / L of food-grade glucose monohydrate, 10 g / L of N-acetyl-D-glucosamine, 1.0 g / L of L-cysteine hydrochloride monohydrate, 2.0 g / L of L-threonine, 0.1 g / L of magnesium sulfate heptahydrate, 0.05 g / L of ferrous sulfate heptahydrate, 0.05 g / L of manganese sulfate, 1.0 g / L of Tween 80, 2.0 g / L of dipotassium hydrogen phosphate anhydrous, 4.0 g / L of potassium citrate, 5.0 g / L of Sodium acetate anhydrous.

[0475] Basic culture medium: 5.0 g / L of food-grade glucose monohydrate, 10 g / L of N-acetyl-D-glucosamine, 1.0 g / L of L-cysteine hydrochloride monohydrate, 2.0 g / L of L-threonine, 0.1 g / L of magnesium sulfate heptahydrate, 0.05 g / L of ferrous sulfate heptahydrate, 0.05 g / L of manganese sulfate, 1.0 g / L of Tween 80, 2.0 g / L of dipotassium hydrogen phosphate anhydrous, 4.0 g / L of potassium citrate, 5.0 g / L of Sodium acetate anhydrous.

[0476] Complete medium: Based on the aforementioned basic culture medium, different types of peptone (refer to Table 11) were added at a concentration of 30 g / L each, and the complete medium containing different types of peptone was prepared.

[0477] Table 11 Complete Medium Supplemented with Different Candidate Nitrogen Sources

[0478] 11.1.3 Activation and Cultivation of Strains

[0479] The glycerol stock tube of MNH19250 was taken and activated in an anaerobic workstation using liquid seed medium for 24-28 hours. Subsequently, a2%inoculation volume was transferred to fresh liquid seed medium and cultured for 24 hours to prepare the seed culture. The seed culture was then inoculated at 2.5%into complete media containing different nitrogen sources and anaerobically cultured at 37℃ for 48 hours. After cultivation, the bacterial suspension was collected for subsequent detection.

[0480] 11.1.4 Reagent

[0481] The reagents used in the following Example are listed in Table 12 below.

[0482] Table 12

[0483] 11.1.5 Instrument / equipment

[0484] The instruments and equipment used in the following Example are listed in Table 13 below.

[0485] Table 13

[0486] 11.2 Detection and Analysis Methods

[0487] 11.2.1 Methods for Detecting Bacterial Growth

[0488] 1)OD600 measurement: The bacterial fermentation broth was appropriately diluted to ensure the absorbance fell within the range of 0.2-0.8. The absorbance was measured at a wavelength of 600 nm using a spectrophotometer.

[0489] The turbidity OD600nm=OD600 after dilution×dilution factor.

[0490] Each sample was measured three times, and the average value was taken.

[0491] 2) Counting chamber enumeration: Hemocytometer counting was performed. A clean hemocytometer was used, and the appropriately diluted bacterial suspension was introduced into the counting chamber grid. After allowing it to stand for approximately 5 minutes, counting was conducted. The calculation formula was as follows:

[0492] Bacterial count (TFU / mL) =average number of bacteria per grid×20, 000×1, 000×dilution factor.

[0493] Each sample was counted three times, and the average value was taken.

[0494] 11.2.2 Quantitative Detection Method of Amuc_1100 Protein

[0495] Principle of quantitative detection: The quantitative detection of Amuc_1100 protein in Akkermansia muciniphila was performed using mass spectrometry, based on an established protein quantification method employing external standard calibration with the signature peptide of Amuc_1100 protein (Table 14) . Specifically, the signature peptide AINSLVNK (SEQ ID NO: 16) of Amuc_1100 protein, with a purity exceeding 98%, was chemically synthesized as a standard (molecular weight: 858.50434) . A standard curve for quantifying the signature peptide was constructed by measuring peptide signals via mass spectrometry. Finally, the content of Amuc_1100 protein in Akkermansia muciniphila samples was detected via the standard curve.

[0496] Table 14. Signature peptide of Recombinant Amuc_1100 Protein

[0497] The specific experimental steps were as follows:

[0498] (1) Preparation of Polypeptide Standard Stock Solution

[0499] 5.00 mg of the synthetic polypeptide (AINSLVNK standard) was precisely weighed and placed in a 5 mL volumetric flask. A0.1%formic acid aqueous solution was added to dissolve and dilute the peptide to the mark. The solution was thoroughly mixed to prepare a stock solution with a concentration of 1 mg / mL.

[0500] (2) Construction of Standard Curve

[0501] The aforementioned polypeptide standard stock solution was diluted to a standard working solution of 10 mg / L, which was further diluted to obtain standard curve working solutions at concentrations of 500, 100, 50, 10, 5, and 1μg / L. The content of the signature peptide in the linearly diluted standard working solutions was detected using a triple quadrupole liquid chromatography-mass spectrometry system. A standard curve was plotted to subsequently quantify the signature peptide content in actual samples based on this curve, ultimately converting the results to determine the Amuc_1100 protein content.

[0502] (3) Preparation of Bacterial Sample Protein Peptides

[0503] An appropriate amount of sample (3.5-4 mL) was centrifuged, and the supernatant was discarded. The pellet was resuspended in 8 M urea and subjected to ultrasonic disruption for extraction. The mixture was centrifuged at 12, 000 r / min for 20 minutes at low temperature, and the supernatant was collected. The volume of the supernatant was adjusted to 500μL, and a small aliquot was taken for protein concentration detection. The remaining supernatant was precipitated with acetone, redissolved in 8 M urea solution, and reduced with DTT (10 mM) at 37℃ for 60 minutes. Subsequently, IAA (50 mM) was added, and the mixture was incubated at room temperature in the dark for 45 minutes for alkylation. Finally, the urea concentration of the sample was diluted to below 1 M, and trypsin was added at a mass ratio of 1: 50 (trypsin: protein) for enzymatic digestion overnight at 37℃. The peptide samples were desalted using Waters SEP-PAK C18 columns and finally dissolved in 100μL of 0.1%formic acid for subsequent mass spectrometry detection.

[0504] (4) Quantitative Detection of Amuc_1100 Protein

[0505] The standard curve was constructed using the signature peptide standard. The content of the signature peptide in the samples was detected using a triple quadrupole liquid chromatography-mass spectrometry system. The Amuc_1100 protein content in the samples was calculated via the external standard method.

[0506] Table 15

[0507] Calculation formula for the content of Amuc_1100 protein in the sample:

[0508] 1) Content of Amuc_1100 protein in the sample (ng / mL) = (CX-C0) ×M1×V / m / M2 / 1000 (Formula 1)

[0509] wherein, m: liquid (volume of the sample, with the unit being liter (L) ) ; M1: protein molecular mass (molecular weight of the target protein) , molecular weight of Amuc_1100 proptein is 34213 Da; M2: molecular mass of the polypeptide standard (molecular weight of the signature peptide) , molecular weight of the polypeptide is 858.50434 Da; V: Final volumetric volume of the sample solution, with the unit being milliliter (mL) , referring to the final volume for dissolving the desalted and lyophilized peptide fragments, i.e., 0.1 mL; C0: Mass concentration of the blank, with the unit being microgram per liter (μg / L) ; CX: Mass concentration of polypeptide in the test sample, with the unit being microgram per liter (μg / L) .

[0510] 11.3 Shake flask fermentation culture of Akkermansia muciniphila

[0511] The prepared complete media containing different nitrogen sources were utilized to culture Akkermansia muciniphila for 48 hours, aiming to investigate the effects of different nitrogen sources on its growth, including bacterial concentration (OD value) and bacterial count.

[0512] The results are shown in Table 16. According to the OD600 measurements, after 48 hours of cultivation, the OD600 values of the tryptone and Papaya peptone groups exceeded 3, while the OD600 values of the other peptone groups ranged between 2 and 3. Although OD600 typically reflects bacterial concentration and is used to assess bacterial growth, metabolites secreted by Akkermansia muciniphila can interfere with absorbance measurements, meaning the recorded OD values may not accurately represent the actual bacterial count. This could subsequently affect the precise evaluation of Amuc_1100 protein content in the bacteria. Therefore, this study further employed counting chamber enumeration to directly determine the bacterial count in the culture under a microscope. The total bacterial counts are presented in Table 16.

[0513] Analysis of the relationship between OD600 and the corresponding bacterial count (Figure 34) revealed a fitted curve with R2=0.0924, indicating no linear correlation between the two parameters. Thus, for subsequent evaluation of Amuc_1100 content in the bacteria, the bacterial count was adopted as a more accurate metric than OD600.

[0514] According to Table 16, the median total bacterial count in the fermentation broth was 6.835×109 CFU / mL. Tryptone, pea peptone, casein peptone, yeast peptone, and yeast extract powder significantly promoted the increase in the total bacterial count of Akkermansia muciniphila in the fermentation broth.

[0515] Table16 Concentration and Bacterial Count of MNH19250 under Different Nitrogen Sources

[0516] 11.4 Quantitative Detection of Amuc_1100 Protein

[0517] To quantify the Amuc_1100 protein content in the samples, a quantitative standard curve was first established via the external standard method using the signature peptide standard of Amuc_1100. The results in Table 17 and Figure 35 show that a linear equation was fitted based on the peptide concentration (ng / mL) and the mass spectrometry-detected peptide response, with the formula: y=389.827848×x-234.964403, R2=0.99811738. The established quantitative standard curve was then used to detect the Amuc_1100 protein content in different samples.

[0518] Table 17 Detection Results of the Quantitative Standard Curve for Amuc_1100 Protein

[0519] For the bacterial suspension samples of Akkermansia muciniphila cultured with 10 different nitrogen sources, bacterial proteins were extracted and enzymatically digested to obtain peptides. The signature peptide of Amuc_1100 was then detected and analyzed using high-performance liquid chromatography coupled with high-resolution mass spectrometry (HPLC-HRMS) . The quantitative mass spectrometry peak diagrams of the signature peptide for each sample are shown in Figure 36. Based on the established formula for the quantitative standard curve of Amuc_1100 protein signature peptide (y=389.827848×x-234.964403) and the calculation formula for Amuc_1100 protein content in the samples (Amuc_1100 content in test sample (ng / mL) = (CX-C0) ×M1×V / m / M2 / 1000; for specific details, refer to Formula 1 above) , the Amuc_1100 protein content in the samples was calculated. By combining the bacterial count in the samples, the impact of different nitrogen sources on the Amuc_1100 content in the bacteria was evaluated.

[0520] The detection results are shown in Table 18. The median Amuc_1100 content per milliliter of sample was 2.395 ng. The top four nitrogen sources with the highest Amuc_1100 content were soybean peptone (4.474 ng) , tryptone (3.898 ng) , wheat peptone (3.235 ng) , and yeast extract powder (2.828 ng) . This indicates that the addition of soybean peptone, tryptone, wheat peptone, and yeast extract powder significantly promoted the increase in the level of the functional protein Amuc_1100 per unit volume of fermentation broth compared to other nitrogen source peptones. The fermentation broth of Akkermansia muciniphila cultured with media containing these nitrogen sources exhibited higher Amuc_1100 protein concentrations.

[0521] Per 1010 bacteria, the median Amuc_1100 content was 3.61835 ng. The top four nitrogen sources with the highest Amuc_1100 content were soybean peptone (9.8109 ng) , wheat peptone (6.1857 ng) , rice peptone (6.4008 ng) , and tryptone (4.8539 ng) , all exceeding 4 ng. Soybean peptone had the highest content, approaching 10 ng, indicating that plant-derived nitrogen sources, particularly cereal-type plant peptones such as soybean peptone, wheat peptone, and rice peptone, significantly promoted the increase in functional protein Amuc_1100 levels per individual cell compared to animal-derived nitrogen source peptones. Akkermansia muciniphila cultured in media containing these cereal-type plant peptones, such as soybean peptone, wheat peptone, and rice peptone, may possess greater advantages in terms of probiotic efficacy.

[0522] Table18 Quantification of Amuc_1100 Protein

[0523] Based on the bacterial counts after 48 h of cultivation shown in Table 16 and the Amuc_1100 contents of fermentation broth samples shown in Table 18, a correlation between the total bacterial count in the fermentation broth and the Amuc_1100 content was plotted. Figure 37 displays the relationship between the total bacterial count in the fermentation broth and the Amuc_1100 protein content in the fermentation broth. As can be seen from Figure 37, after 48 hours of fermentation, acertain negative correlation was observed between the total bacterial count and the Amuc_1100 protein content in the fermentation broth. It is speculated that a higher bacterial count of Akkermansia muciniphila may lead to the consumption of Amuc_1100 protein or a reduction in its synthesis, thereby decreasing the Amuc_1100 protein content. Therefore, controlling the total bacterial count in the fermentation broth could be considered as a strategy to enhance Amuc_1100 protein production.

[0524] Example12 Promotion of Different Extract on Akkermansia muciniphila’s Growth

[0525] MM01 medium supplemented with different nutrients / components at concentrations ranging from 0 mg / L to 10, 000 mg / L was prepared. The bacterial strain MNH19250 was inoculated and activated in MM01 medium within an anaerobic workstation, followed by anaerobic cultivation at 37℃ for 48 hours. The activated strain was then inoculated into MM01 medium containing different nutrients / components at concentrations of 0 mg / L to 10, 000 mg / L and anaerobically cultured at 37℃ for 48 hours. The OD600 absorbance value or viable bacterial count at the end of cultivation was detected, and the experimental results are shown in Table 19 below.

[0526] Table 19. Results of MNH19250 Co-fermentation Experiments

[0527] In Table 19, Astaxanthin from Haematococcus pluvialis, medium-chain triglycerides, conjugated linoleic acid glycerides, and diglyceride were purchased from INNOBIO Corporation Limited. Dendrobium officinale extract, Ganoderma lucidum extract, mulberry leaf extract, Turmeric were purchased from Guangdong Qingyunshan Pharmaceutical Co., Ltd. Garcinia cambogia extract, green coffee bean extract were purchased from Changsha Huir Biological-Tech Co., Ltd. Opuntiaficus-indica fruit extract was purchased from Guangzhou Zhaokang Trading Co., Ltd. Antarctic krill oil P45 and Antarctic krill oil P40 were purchased from Jiangsu Sunline Biomarine Technology Co., Ltd. Natto extract was purchased from Sungen Bioscience Co., Ltd. Fructooligosaccharides was purchased from Henan Keshuo Food Additives Co., Ltd. EGCG was purchased from Ningbo Time Trading Co., Ltd. Ergothioneine was purchased from Shenzhen Siyomicro Bio-tech Co., Ltd. Berberine and black pepper extract were purchased from Sabinsa Nanjing Biotech Co., Ltd. Coenzyme Q10 was purchased from Inner Mongolia Kingdomway Pharamaceutical Co., Ltd. Panax ginseng extract and grape seed extract were purchased from Nanjing Zhenweikang Biotechnology Co., Ltd. Citrus extract and quercetin were purchased from Guangdong Golden Health Biotech., Co Ltd. Fish oil was purchased from Novosana (Taicang) Biotechnology Co., Ltd. PQQ was purchased from Weifang Shengyu Pharamaceutical Co., Ltd.

[0528] The data indicated that Haematococcus pluvialis astaxanthin, Dendrobium officinale extract, Garcinia cambogia extract, Opuntia ficus-indica extract, Antarctic krill oil P45, Antarctic krill oil P40, natto extract, diacylglycerol, medium-chain triglycerides, conjugated linoleic acid glycerides, fructooligosaccharides, EGCG, ergothioneine, berberine, Ganoderma lucidum extract, coenzyme Q10, ginseng extract, citrus extract, fish oil, black pepper extract, mulberry leaf extract, green coffee bean extract, pyrroloquinoline quinone (PQQ) , grape seed extract, quercetin, and turmeric, among others, were demonstrated to promote the growth of Akkermansia muciniphila.

[0529] Although the present invention has been disclosed with reference to certain embodiments, it will be apparent that modifications and variations can be made without departing from the spirit and scope of the invention as disclosed herein and as set forth in the appended claims. Furthermore, it should be understood that while all examples in the disclosure illustrate embodiments of the invention, they are provided merely as non-limiting examples and, therefore, should not be construed as limiting the various aspects of the invention illustrated thereby. The present invention is intended to encompass the full scope defined by the invention, the language of the following claims, and any equivalents thereof. Accordingly, the drawings and detailed description are to be regarded as illustrative rather than restrictive.

Claims

1.An isolated Akkermansia muciniphila strain, wherein the Akkermansia muciniphila strain has an Average Nucleotide Identity (ANI) value of at least 95%with Akkermansia muciniphila strain MNH19250; and / orhas a 16S rRNA sequence having at least 98.65%identity to the sequence as set forth in SEQ ID NO: 1.2.The Akkermansia muciniphila strain according to claim 1, comprising an Amuc-1100 protein having at least 95%identity to the sequence as set forth in SEQ ID NO: 4; and / orcomprising an Amuc_1631 protein having at least 95%identity to the sequence as set forth in SEQ ID NO: 5.3.The Akkermansia muciniphila strain according to claim 1 or 2, wherein the Average Nucleotide Identity (ANI) value with the Akkermansia muciniphila strain MNH19250 is 95.1%, 95.2%, 95.3%, 95.4%, 95.5%, 95.6%, 95.7%, 95.8%, 95.9%, 96%, 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5%, 96.6%, 96.7%, 96.8%, 96.9%, 97%, 97.1%, 97.2%, 97.3%, 97.4%, 97.5%, 97.6%, 97.7%, 97.8%, 97.9%, 98%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, or 100%; and / orwherein the 16S rRNA sequence of the Akkermansia muciniphila strain has at least 98%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.65%, at least 98.7%, at least 98.8%, at least 98.9%, at least 99.0%, at least 99.1%, at least 99.2%, at least 99.3%, at least 99.4%, at least 99.5%, at least 99.6%, at least 99.7%, at least 99.8%, at least 99.9%, or 100%identity to the sequence as set forth in SEQ ID NO: 1; and / orwherein the Akkermansia muciniphila strain comprises an Amuc-1100 protein having at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to the sequence as set forth in SEQ ID NO: 4; and / orwherein the Akkermansia muciniphila strain comprises an Amuc_1631 protein having at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to the sequence as set forth in SEQ ID NO: 5.4.The Akkermansia muciniphila strain according to any one of claims 1-3, wherein the Akkermansia muciniphila strain is the Akkermansia muciniphila strain MNH19250 or a progeny strain thereof,wherein the strain MNH19250 is deposited at the Guangdong Microbial Culture Collection Center (GDMCC) under the deposit number GDMCC No: 63782 on June 21, 2024.5.An isolated Akkermansia muciniphila strain, wherein the Akkermansia muciniphila strain has an Average Nucleotide Identity (ANI) value of at least 95.1%, 95.2%, 95.3%, 95.4%, 95.5%, 95.6%, 95.7%, 95.8%, 95.9%, 96%, 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5%, 96.6%, 96.7%, 96.8%, 96.9%, 97%, 97.1%, 97.2%, 97.3%, 97.4%, 97.5%, 97.6%, 97.7%, 97.8%, 97.9%, 98%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, or 100%with the strain deposited under deposit number GDMCC No: 63782.6.A composition comprising the Akkermansia muciniphila strain according to any one of claims 1-5, a culture thereof, and / or a protein isolated from the Akkermansia muciniphila strain;wherein the Akkermansia muciniphila strain or culture thereof is selected from any one of the following:(1) a live strain, an attenuated strain, an inactivated strain, or a lyophilized strain;(2) a strain obtained by heat inactivation, preferably, a strain obtained by pasteurization;wherein the composition comprises the Akkermansia muciniphila strain as an active substance at a concentration of 107 to 1012 CFU / g;(3) a fermentation broth of the Akkermansia muciniphila strain;(4) a supernatant of the fermentation broth of the Akkermansia muciniphila strain;(5) an inactivated product of the fermentation broth of the Akkermansia muciniphila strain;(6) a concentrated or dried product of the fermentation broth, the supernatant of the fermentation broth, and / or the inactivated product of the fermentation broth, of the Akkermansia muciniphila strain; and(7) the culture comprises a product obtained by pasteurizing the fermentation broth of the Akkermansia muciniphila strain; wherein the inactivated product comprises a protein secreted by the Akkermansia muciniphila strain, wherein the protein is the Amuc-1100 protein; and / or the Amuc_1631 protein.7.The composition according to claim 6, further comprising one or more pharmaceutically acceptable carriers, food-grade carriers, excipients, and / or adjuvants.8.The composition according to claim 6 or 7, further comprising one or more other active agents for preventing or treating metabolic diseases or metabolic disorders, cardiovascular diseases, functional diseases of liver, inflammatory diseases, neurodegenerative diseases, brain aging, mood regulation, and / or enhancing immunity;preferably, the other active agent is one or more selected from probiotics, prebiotics, plant extracts, polyphenol extracts, and GLP-1 receptor agonists.9.The composition according to any one of claims 6-8, wherein the composition is any one of a drug, a health product, or a food;preferably, the health product or food is any one of a nutritional composition, a food product, a candy, a food bar, a food additive, a beverage additive, or a dietary supplement.10.The composition according to any one of claims 6-9, wherein the plant extract is selected from at least one of the following: (1) berberine, (2) black ginger extract, (3) cinnamon extract, (4) mulberry leaf extract, (5) dihydroberberine, (6) dihydromyricetin, (7) silymarin, (8) fisetin, (9) turmeric, (10) red yeast rice extract, (11) nattokinase, (12) coenzyme Q10, (13) hesperidin, (14) naringin, (15) urolithin A, (16) apigenin, (17) prickly pear extract, (18) black ginseng extract, (19) Phyllanthus emblica extract, (20) broccoli seed aqueous extract, (21) blueberry anthocyanin, (22) ginger extract, (23) pomegranate extract, (24) elderberry, (25) quercetin, (26) silymarin, (27) cranberry extract, (28) capsaicin extract, (29) grape extract, (30) soybean isoflavone, (31) inulin, (32) perilla oil / perilla extract, and (33) resveratrol.11.Use of the Akkermansia muciniphila strain according to any one of claims 1-5, or the composition according to any one of claims 6-10, in the manufacture of a medicament for preventing, treating, or alleviating at least one of the following conditions: (1) metabolic diseases or metabolic disorders, (2) cardiovascular diseases, (3) inflammatory diseases, (4) neurodegenerative diseases, (6) brain aging, (7) side effects resulting from discontinuation of GLP-1 receptor agonists, (8) weight rebound after discontinuation of GLP-1 receptor agonist drugs, (9) blood glucose rebound after discontinuation of GLP-1 receptor agonist drugs, (10) local fat rebound after discontinuation of GLP-1 receptor agonist drugs, (11) metabolic disorders after discontinuation of GLP-1 receptor agonist drugs, (12) diseases related to intestinal barrier damage, (13) immune-related diseases, (14) tumors, and (15) neuronal cell damage.12.A method for preventing, treating, or alleviating at least one of the following conditions in a subject: (1) metabolic diseases or metabolic disorders, (2) cardiovascular diseases, (3) inflammatory diseases, (4) neurodegenerative diseases, (6) brain aging, (7) side effects resulting from discontinuation of GLP-1 receptor agonists, (8) weight rebound after discontinuation of GLP-1 receptor agonist drugs, (9) blood glucose rebound after discontinuation of GLP-1 receptor agonist drugs, (10) local fat rebound after discontinuation of GLP-1 receptor agonist drugs, (11) metabolic disorders after discontinuation of GLP-1 receptor agonist drugs, (12) diseases related to intestinal barrier damage, (13) immune-related diseases, (14) tumors, and (15) neuronal cell damage,wherein the method comprises a step of administering an effective amount of the Akkermansia muciniphila strain according to any one of claims 1-5 or the composition according to any one of claims 6-10 to a subject in need thereof.13.The use according to claim 11 or the method according to claim 12, wherein the inflammatory disease is selected from: arthritis, bronchial inflammation, cervical inflammation, conjunctival inflammation, esophageal inflammation, myocardial inflammation, rectal inflammation, scleral inflammation, gingival inflammation, bone inflammation, lung inflammation, respiratory tract inflammation, inflammatory skin diseases, and fibrotic diseases, encephalitis;wherein the liver and kidney disease is selected from non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) , liver fibrosis, cirrhosis, alcoholic liver disease, and drug-induced liver injury, kidney injury, and abnormal kidney function; preferably, the Akkermansia muciniphila strain or the composition reduces serum aspartate aminotransferase and / or alanine aminotransferase (ALT) and / or liver weight in the subject; and / or reduces the level of blood urea nitrogen and / or creatinine in the subject;wherein the metabolic disease is selected from obesity, metabolic syndrome, metabolic disorders, insulin deficiency or insulin resistance-related disorders, diabetes, glucose intolerance, abnormal lipid metabolism, hyperglycemia, dyslipidemia, irritable bowel syndrome, intestinal motility disorders, hypercholesterolemia, and hyperlipidemia;wherein the cardiovascular and cerebrovascular disease is selected from hypertension, atherosclerosis, and coronary heart disease;wherein the disease related to intestinal barrier damage is selected from inflammatory bowel disease, Crohn’s disease, and ulcerative colitis; preferably, the Akkermansia muciniphila strain or the composition increases colon mucus layer thickness;wherein the fat reducing is selected from reducing visceral fat and / or local fat.14.The use according to claim 11 or the method according to claim 12, wherein the Akkermansia muciniphila strain or the composition is capable of treating, preventing, alleviating, or improving at least one ofthe following:(1) weight loss or weight control;(2) preventing, treating, improving, or alleviating liver injury, NAFLD, or NASH;(3) preventing, treating, improving, or alleviating kidney injury or abnormal kidney function;(4) enhancing immunity;(5) preventing, treating, improving, or alleviating cancer;(6) preventing, treating, improving, or alleviating diabetes;(7) reducing blood lipid and / or cholesterol levels in the subject;(8) reducing body fat and / or visceral fat in the subject;(9) repairing intestinal tissue mucosa ofthe subject; and(10) preventing weight rebound or blood glucose rebound.15.A Akkermansia muciniphila strain or a composition comprising the Akkermansia muciniphila strain for use in maintaining energy metabolism balance, fat metabolism balance, and / or maintaining blood glucose homeostasis in a subject after discontinuation of a GLP-1 receptor agonist.16.A Akkermansia muciniphila strain or a composition comprising the Akkermansia muciniphila strain for use in preventing or treating metabolic disorders, metabolic diseases, and / or body damage after discontinuation of a GLP-1 receptor agonist.17.The Akkermansia muciniphila strain or the composition comprising the Akkermansia muciniphila strain for use according to claim 15 or 16, wherein the composition further comprises one or more other active agents; andwherein the active agent is the Akkermansia muciniphila strain’s growth promoter.18.The Akkermansia muciniphila strain or the composition comprising the Akkermansia muciniphila strain for use according to claim 17, wherein the active agent is selected from at least one of the following: (1) berberine, (2) black ginger extract, (3) cinnamon extract, (4) mulberry leaf extract, (5) dihydroberberine, (6) dihydromyricetin, (7) silymarin, (8) fisetin, (9) turmeric, (10) red yeast rice extract, (11) nattokinase, (12) coenzyme Q10, (13) hesperidin, (14) naringin, (15) urolithin A, (16) apigenin, (17) prickly pear extract, (18) black ginseng extract, (19) Phyllanthus emblica extract, (20) broccoli seed aqueous extract, (21) blueberry anthocyanin, (22) ginger extract, (23) pomegranate extract, (24) elderberry, (25) quercetin, (26) silymarin, (27) cranberry extract, (28) capsaicin extract, (29) grape extract, (30) soybean isoflavone, (31) inulin, (32) perilla oil / perilla extract, (33) resveratrol, and (34) one or more ofprobiotics and prebiotics.19.The Akkermansia muciniphila strain or the composition comprising the Akkermansia muciniphila strain for use according to claim 15 or 16, wherein the Akkermansia muciniphila strain or the composition comprising the Akkermansia muciniphila strain prevents at least one of local fat rebound, weight rebound, and blood glucose rebound after discontinuation of the GLP-1 receptor agonist.20.The use according to claim 11, the Akkermansia muciniphila strain or the composition comprising the Akkermansia muciniphila strain for use according to claim 15, or 16, or the method according to claim 12, wherein the GLP-1 receptor agonist comprises liraglutide, semaglutide, or tirzepatide.21.Use of a Akkermansia muciniphila strain or a composition comprising the Akkermansia muciniphila strain in treating, preventing, or alleviating at least one of neuronal cell aging, nervous system aging, neurodegenerative diseases, neuronal cell damage, brain aging, and / or mood regulation.22.The use according to claim 21, wherein by regulating an expression level of SIRT1 or SIR2.1 to combat brain aging; and / or by regulating the expression level of SIRT1 or SIR2.1 to treat or alleviate brain nerve cell aging or brain nervous system aging.23.The use according to claim 21 or 22, further comprising at least one ofthe following uses:(1) preventing, treating, or improving memory decline;(2) preventing, treating, or improving cognitive decline;(3) preventing, treating, or improving neuroinflammation;(4) preventing, treating, or improving reduction or damage ofneuronal cell number;(5) preventing, treating, or improving functional decline in nervous system;(6) preventing, treating, or improving reduction in number ofneuronal axons;(7) preventing, treating, or improving brain atrophy, brain injury, myelin damage of brain tissue;(8) preventing, treating, or improving dementia;(9) preventing, treating, or improving microglial activation;(10) extending lifespan of a subject;(11) improving decline in motor ability, swallowing function, and / or reproductive ability due to aging;(12) regulating expression of genes in insulin / IGF-1 signaling pathway, antioxidant genes, and regulatory genes for mitochondrial unfolded protein response;(13) alleviating damage or aging caused by heat stress, oxidative stress, or ultraviolet stress; and(14) regulating mental fatigue.24.The use according to any one of claims 21-23, further comprising at least one of the following uses:(1) treating Alzheimer’s disease or Parkinson’s syndrome; and(2) treating a subtype of Alzheimer’s disease or Parkinson’s syndrome characterized by an increase in phosphorylated Tau-positive neurons in the brain hippocampus; wherein the Parkinson’s syndrome and / or Alzheimer’s disease is selected from at least one of typical AD, limbic-predominant AD, HpSp-hippocampal sparing type, or PCA-posterior cortical atrophy type;wherein the Parkinson’s syndrome is selected from non-α-synuclein subtypes, progressive supranuclear palsy (PSP) , corticobasal degeneration (CBD) , frontotemporal dementia with parkinsonism-17 (FTDP-17) , argyrophilic grain disease (AGD) .25.Use of peptone or yeast extract powder in increasing a yield of Amuc_1100 protein, wherein the peptone comprises at least one of cereal plant-derived peptones, and the Amuc_1100 protein is derived from Akkermansia muciniphila strain.26.The use according to claim 25, wherein the cereal plant-derived peptone comprises at least one of soybean peptone, wheat peptone, or rice peptone.27.A method for increasing a yield ofAmuc_1100 protein in a fermentation broth, wherein the method comprises culturing a Akkermansia muciniphila strain using a medium containing peptone or yeast extract powder,wherein the peptone comprises a cereal plant-derived peptone,wherein the medium further comprises at least one of glucose, N-Acetyl-D-glucosamine, L-Cysteine hydrochloride, L-Threonine, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, dipotassium hydrogen phosphate, potassium citrate, and sodium acetate.28.The method according to claim 27, wherein the cereal plant-derived peptone comprises at least one of soybean peptone,wheat peptone,or rice peptone.

Images