Method for enhancing secondary metabolite productivity

Abstract

Provided is a method for increasing the productivity of secondary metabolites such as antibiotics in a microorganism. In particular, provided is a method to improve the productivity of secondary metabolites in a microorganism by inactivating or reducing the expression of FadR transcription regulator and Srb RNA binding protein of said microorganism.

Description

Method for Enhancing Secondary Metabolite ProductivityFIELD

[0001] This invention relates to a method for increasing the productivity of secondary metabolites such as antibiotics in a microorganism. In particular, the invention provides a method to improve the productivity of secondary metabolites in a microorganism by inactivating or reducing the expression of FadR transcription regulator and Srb RNA binding protein of said microorganism.BACKGROUND

[0002] Secondary metabolites, produced by a vast number of organisms, are usually defined as organic compounds that do not directly support the producer’s growth or development but offer advantages under particular environmental conditions. They exhibit diverse biological functions allowing for their application as antifungal, antiviral, antibiotics, as well as anticancer and immunosuppressive compounds1.

[0003] Actinomycetes are high GC Gram-positive bacteria and a rich source of secondary metabolites, from genera such as Streptomyces, Saccharopolyspora and Salinispora2. Streptomyces species are the most abundant source of antibiotics and are responsible for producing more than 50%of our clinically relevant antibiotics, including streptomycin, tetracycline, lincomycin, vancomycin and kanamycin3. The variety of bioactive compounds produced by the genus of Streptomyces also include antivirals (e.g., virantmycin by Streptomyces nitrosporeus) 4, antifungals (e.g., amphotericin B by Streptomyces nodosus) 5, antiparasitic (e.g., avermectins by Streptomyces avermitilis) 6, immunosuppressant (e.g., rapamycin by Streptomyces hygroscopicus) 7 and chemotherapeutics (e.g, daunorubicin by Streptomyces peucetius) 8. Saccharopolyspora species are also characterized by their production of secondary metabolites with medical importance, particularly macrolide antibiotics such as erythromycin, and spinosyn9. Salinispora tropica is a marine actinomycete that produces salinosporamide A and B, potential anticancer agents10.

[0004] Typically, each Streptomyces species produces several antibiotics, with the profile being species specific. The biosynthesis of antibiotics and other classes of biologically active secondary metabolites is generally specified by a large gene cluster  on the chromosome or plasmids, which has been termed as biosynthetic gene clusters (BGCs) 11. With the rapid development of next-generation sequencing technologies in the last two decades, genome information of numerous Streptomyces species is now available. Genome analysis revealed that in addition to the BGCs that are constitutively expressed and whose products can be determined, there are also many BGCs that are ‘cryptic’ or ‘silent’ , for which no end-product can be determined12. For example, Streptomyces coelicolor only produces actinorhodin, undecylprodigiosin, calcium-dependent antibiotic and methylenomycin at laboratory conditions, though its genome contains 30 BGCs11. A single Streptomyces’ genome generally encodes 25-50 BCGs, ～90%of which are silent or cryptic under standard laboratory conditions. Given the large number of Streptomyces species (over 950 species and 50 subspecies) , the potential for new antibiotics reaches tens of thousands3. It has therefore become necessary to devise methods and strategies to identify physiological signals and regulatory mechanisms that can activate these “cryptic” pathways, thus unleashing the full biosynthetic potential of these prodigious producers, or that can increase the productivity of known antibiotics.

[0005] Currently used methods include manipulation of fermentation conditions, the use of ecologically based tricks, genome mining, ribosome engineering, genetic manipulation of the regulators controlling gene clusters, regulation of signaling molecules, and heterologous expression of gene clusters in different host strains12.SUMMARY OF THE INVENTION

[0006] The current invention is based on the inventor’s extensive study and unexpected new findings. That is, the productivity of multiple secondary metabolites including desferrioxamine B and undecylprodigiosin in Streptomyces coelicolor can be improved by deleting two previously uncharacterized genes SCO5169 and SCO5170. The inventor further validated this conclusion in another Streptomyces species -deletion of XNR_1634 and XNR_1633, ortholog of SCO5169 and SCO5170, respectively, in Streptomyces albidoflavus, resulted in upregulation of BGCs of secondary metabolites.

[0007] Rv3208A is an uncharacterized protein in Mycobacterium tuberculosis H37Rv. The inventor’s unpublished work on Rv3208A has identified it as an RNA binding protein  that binds both small RNAs and mRNAs (Fig. 2) . Rv3208A homologs are also present in all other genera within the phylum of Actinomycetes including Streptomyces, Saccharopolyspora, Salinispora, Corynebacterium, Nocardia and Rhodococcus. Rv3208A proteins form the DUF (domain of unknown function) 3107 group in the protein family database Pfam. There are currently 5,034 sequences in 4,146 species in DUF3107 (https: / / www.ebi.ac.uk / interpro / entry / pfam / PF11305 / protein / UniProt / #table) , suggesting that this protein is ubiquitous in Actinomycetes.

[0008] SCO5169, a previously uncharacterized protein, is a homolog of Rv3208A in Streptomyces coelicolor. Initially, the investor hypothesized that SCO5169 could mediate the interactions of small RNAs and mRNAs, thereby playing a role regulating secondary metabolite biosynthesis in Streptomyces. However, deletion of SCO5169 (ΔSCO5169) did not result in the upregulation of BGCs in Streptomyces coelicolor. Interestingly, during the course of constructing the SCO5169 knockout strain (ΔSCO5169) by the CRISPR / Cas9 method13, a double knockout strain of SCO5169 and SCO5170 (ΔSCO5169ΔSCO5170) was inadvertently created (Fig. 3a) . Unexpectedly, RNA-seq analysis showed that individual genes in multiple BGCs were all upregulated in the double knockout strain, including BGCs of desferrioxamine B, undecylprodigiosin, 5-hydroxyectoine, isorenieratene and albaflavenone (Fig. 4) . Liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC / MS) analysis confirmed the increased productions of desferrioxamine B and undecylprodigiosin (Fig. 5) .

[0009] SCO5170 is predicted to be a probable TetR-family transcription regulator but its function has not been characterized previously. TetR-family proteins are one of the most ubiquitous classes of transcription regulators in bacteria and there are approximately 150 members in Streptomyces coelicolor14.

[0010] SCO5169 and SCO5170 are adjacent to each other in the genome but experiments found that they were not co-transcribed. Multiple repeated attempts to delete SCO5170 by the CRISPR / Cas9 method were unsuccessful, and the resulting clones all contained deletion of both SCO5169 and SCO5170 (Fig. 3e) . These results suggest that deletion of SCO5170 is lethal to the cell unless SCO5169 is also deleted.

[0011] RNA-seq analysis revealed that genes involved in fatty acid β-oxidation pathway were drastically increased in their expression in ΔSCO5169ΔSCO5170 of Streptomyces  coelicolor, including fadA (SCO6027, 54-fold increase) , fadB (SCO6026, 44-fold) , fadE (SCO3800, 58-fold) and multiple fadD genes (Table 2, Fig. 6a) . Upregulation of these genes leads to β-oxidative cleavage of long-chain fatty acids into acetyl-CoA and propionyl-CoA, which are then converted to malonyl-CoA and methylmalonyl-CoA by acetyl-CoA carboxylase and propionyl-CoA carboxylase, respectively (Fig. 7) . Consistently, genes encoding acetyl-CoA carboxylase (SCO5535 and SCO5536) and propionyl-CoA carboxylase (SCO4925 and SCO4926) were also upregulated in ΔSCO5169ΔSCO5170.

[0012] The various acyl precursors (acetyl-CoA, propionyl-CoA, malonyl-CoA and methylmalonyl-CoA) are the most commonly used starters or building blocks for the biosynthesis of secondary metabolites (Fig. 7) . For example, the biosynthesis of erythromycin begins with the sequential condensation of one unit of propionyl CoA and six units of methylmalonyl CoA, catalyzed by a polyketide synthase15. Similarly, a polyketide synthase catalyzes the iterative Claisen-like condensation of nine malonyl CoA to initiate the biosynthesis of oxytetracycline16. The increase in precursor supply provides an explanation for the upregulation of multiple and unrelated BGCs, and that individual genes in each BGC were increased in their expression to a similar level, regardless their orientation in the gene cluster (Fig. 4) .

[0013] Notably, upregulation of the fatty acid β-oxidation pathway was not observed in ΔSCO5169 strain, suggesting that deletion of SCO5170 is likely responsible for the phenotype. Taken together, these results suggest that SCO5170 is likely the previously unidentified FadR in Streptomyces coelicolor, which is a global repressor of genes in the fatty acid β-oxidation pathway (Fig. 7) . FadR in other bacteria such as Escherichia coli has been extensively studied but has not been identified previously Streptomyces species17. There is a scarce of studies on fatty acid β-oxidation in Streptomyces18.

[0014] Why is the deletion of SCO5170 lethal to the cell? Experiments found that SCO5170 also represses the expression of SCO5169. Thus, the deletion of SCO5170 will result in the overexpression of SCO5169. Since SCO5169 is an RNA binding protein (by analogous to Rv3208A) , the excessive SCO5169 would bind and sequester mRNAs of BGCs, effectively blocking the biosynthesis of secondary metabolites even though the mRNA transcripts of BGCs were increased in the presence of increased  precursor supply (Fig. 7) . This would lead to excessive accumulation of precursors including acetyl CoA, propionyl CoA, malonyl-CoA and methylmalonyl-CoA. Of which, accumulation of propionyl CoA is known to be toxic to cells including mammalian and microbial cells19, which explains the lethality of SCO5170 deletion. However, deleting both SCO5170 and SCO5169 would eliminate the inhibitory effect of SCO5169, allowing excessive precursors to be fluxed into the biosynthetic pathways of secondary metabolite, leading to their increased productivity (Fig. 7) .

[0015] Like SCO5169, SCO5170 is highly conserved in Streptomyces species and its homologs are present in other actinomycetes including Mycobacterium, Saccharopolyspora and Salinispora. Moreover, the localization of these two gene orthologs in the genome are also conserved, that is, they are adjacent to each other in the genomes of these organisms. These observations suggest that gene orthologs of SCO5169 and SCO5170 in other organisms likely perform similar functions. To confirm this, experiments were performed in yet another Streptomyces species.

[0016] XNR_1634 and XNR_1633 of Streptomyces albidoflavus are the homolog of SCO5169 and SCO5170, respectively. A double knockout (ΔXNR_1633ΔXNR_1644) strain was constructed using the CRISPR / Cas9 method13. Similar to Streptomyces coelicolor, deletion of these two genes in Streptomyces albidoflavus led to a large increase in expression of genes in the fatty acid β-oxidation pathway, including fadA (XNR_0767, 35-fold) , fadB (XNR_0766, 35-fold) , fadD (XNR_4749, 3.7-fold) , and fadE (XNR_3084, 44-fold) (Table 3, Fig. 6b) . As anticipated, BGCs of multiple secondary metabolites were also upregulated in the ΔXNR_1633ΔXNR_1644 strain, including BGCs of hopene, cyclofaulknamycin, minimycin, and candicidin (Fig. 8) .

[0017] The present invention was achieved based on the new findings described above. The term “FadR” is used hereafter to refer SCO5170 and its homologs, and the term “Srb” is used hereafter to refer SCO5169 and its homologs. FadR is a global repressor of genes in the fatty acid β-oxidation pathway and Srb is an RNA binding protein. Thus, the present invention provides:

[0018] (1) A method for increasing a productivity of a secondary metabolite in a microorganism by inactivating the fadR gene, or by inactivating fadR and srb genes, of said microorganism.

[0019] (2) A method for increasing a productivity of a secondary metabolite in a microorganism by reducing the expression of the fadR gene, or by reducing the expression of fadR and srb genes, of said microorganism.

[0020] (3) The method as described in (1) or (2) above, wherein said microorganism is a bacterium.

[0021] (4) The method as described in (1) or (2) above, wherein said microorganism belongs to actinomycetes, including but not limited to the genus selected from the group consisting of genus Streptomyces, genus Saccharopolyspora, genus Salinispora, genus Nocardia, genus Rhodococcus and genus Corynebacterium.

[0022] (5) The method as described in (1) or (2) above, wherein the fadR gene encodes

[0023] (i) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; or

[0024] (ii) a protein with the substitution, addition, or deletion of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

[0025] (6) The method as described in (1) or (2) above, wherein the srb gene encodes

[0026] (i) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; or

[0027] (ii) a protein with the substitution, addition, or deletion of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.

[0028] (7) The method as described in (1) or (2) above, wherein the fadR gene comprises

[0029] (i) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2; or

[0030] (ii) a sequence that hybridizes to the nucleotide sequence of (i) under a stringent hybridization condition; or

[0031] (iii) a sequence having at least 60%sequence identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.

[0032] (8) The method as described in (1) or (2) above, wherein the srb gene comprises

[0033] (i) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4; or

[0034] (ii) a sequence that hybridizes to the nucleotide sequence of (i) under a stringent hybridization condition; or

[0035] (iii) a sequence having at least 60%sequence identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.

[0036] (9) The method as described in (1) above, wherein the fadR gene is inactivated by deleting the fadR gene from the genome, and the srb gene is inactivated by deleting the srb gene from the genome.

[0037] (10) The method as described in (2) above, wherein the expression of fadR is reduced by overexpression of a dominant-negative fadR mutant, expression of antisense fadR transcript, and introducing mutations in the promoter region of fadR. Similarly, the expression of srb is reduced by overexpression of a dominant-negative srb mutant, expression of antisense srb transcript, and introducing mutations in the promoter region of srb.

[0038] (11) The method as described in (1) or (2) above, wherein said secondary metabolite is selected from the group consisting of antibiotics, antiviral agents, antifungal agents, anticancer agents, immunosuppressive agents, enzymes, and other physiological active substance.

[0039] (12) A method for producing a secondary metabolite, which comprises the steps of culturing in a media of a microorganism which is produced in accordance of with the method as described in (1) or (2) above, forming and accumulating a secondary metabolite, and recovering the secondary metabolite therefrom.

[0040] (13) The method as described in (12) above, wherein said microorganism is a bacterium.

[0041] (14) The method as described in (12) above, wherein said microorganism belongs to actinomycetes, including but not limited to the genus selected from the group consisting of genus Streptomyces, genus Saccharopolyspora, genus Salinispora, genus Nocardia, genus Rhodococcus and genus Corynebacterium.

[0042] (15) The method as described in (12) above, wherein said secondary metabolite is selected from the group consisting of antibiotics, antiviral agents, antifungal agents, anticancer agents, immunosuppressive agents, enzymes, and other physiologically active substances.

[0043] (16) A microorganism having increased productivity of the secondary metabolite in comparison to an original strain thereof, which is produced in accordance with the method of (1) or (2) above.

[0044] (17) The microorganism as described in (16) above, wherein said microorganism is a bacterium.

[0045] (18) The microorganism as described in (16) above, wherein said microorganism belongs to actinomycetes, including but not limited to the genus selected from the group consisting of genus Streptomyces, genus Saccharopolyspora, genus Salinispora, genus Nocardia, genus Rhodococcus and genus Corynebacterium.

[0046] (19) As another aspect of the invention, a method is provided for inducing the expression of ‘silent’ or ‘cryptic’ biosynthetic gene clusters in microorganisms by inactivating or reducing expression of fadR, or fadR and srb, and providing a new approach to find new antibiotics and other physiologically active substances.

[0047] BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWING

[0048] Figure 1 shows FadR and Srb sequences. (a) Amino acid sequence of FadR of Streptomyces coelicolor; (b) DNA sequence of fadR of Streptomyces coelicolor; (c) Amino acid sequence of Srb of Streptomyces coelicolor; (d) DNA sequence of srb of Streptomyces coelicolor.

[0049] Figure 2 shows that Rv3208A is an RNA binding protein that binds small RNAs (mcr7, mcr11) and mRNAs (panD, tatC) .

[0050] Figure 3 shows the construction of deletion strains of Streptomyces coelicolor and Streptomyces albidoflavus.

[0051] Figure 4 shows BGCs of five secondary metabolites were upregulated in ΔsrbΔfadR of Streptomyces coelicolor.

[0052] Figure 5 shows the production of secondary metabolites were increased in ΔsrbΔfadR of Streptomyces coelicolor.

[0053] Figure 6 shows DEGs in ΔsrbΔfadR of Streptomyces coelicolor and Streptomyces albidoflavus compared to wild type strains.

[0054] Figure 7 shows the fatty acid β-oxidation pathway and connection to biosynthesis of secondary metabolites.

[0055] Figure 8 shows multiple BGCs of secondary metabolites were upregulated in ΔsrbΔfadR of Streptomyces albidoflavus.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0056] The present invention provides a method to improve the productivity of secondary metabolites in a microorganism by inactivating or reducing expression of fadR, or fadR and srb.

[0057] An exemplary amino acid sequence of FadR is presented in Figure 1a [SEQ ID NO: 1] and an exemplary nucleotide sequence encoding the same is presented in Figure 1b [SEQ ID NO: 2] . An exemplary amino acid sequence of Srb is presented in Figure 1c [SEQ ID NO: 3] and an exemplary nucleotide sequence encoding the same is presented in Figure 1d [SEQ ID NO: 4] . These sequences represent FadR (SCO5170) and Srb (SCO5169) from Streptomyces coelicolor, as presented in the genome sequence available at the StrpDB (https: / / strepdb.streptomyces.org.uk / cgi-bin / dc3.pl?accession=AL645992&start=4291472&end=4302043&iorm=map&width=1200) .

[0058] The proteins, polypeptides or peptides encoded according to the invention include naturally-occurring proteins, polypeptides or peptides, or the homologs thereof which have the same function as naturally-occurring proteins, polypeptides or peptides. Such homologs include proteins, polypeptides or peptides having at least 60%, preferably about 70%or more, 80%or more, and most preferably 90%or more, e.g., 95%, 96%, 97%, 98 or 99%homology to the amino acid sequences of the naturally-occurring proteins, polypeptides or peptides, e.g., to the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3. Such homologs include proteins, polypeptides or peptides with substitution, addition and deletion of one or more (e.g., 1-50, 1-20, 1-10, 1-5) amino acid residues in the amino acid sequences of the naturally-occurring proteins, polypeptides or peptides (e.g., in the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3) . Such homologs include especially proteins, polypeptides or peptides with conserved amino acid substitution (s) .

[0059] The microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as the productivity of thereof can be increased by inactivating or reducing expression of fadR, or fadR and srb in a microorganism. It is preferable to use Actinomycetes. Examples of those belonging to Actinomycetes may be exampled as the genus of Streptomyces, genus Saccharopolyspora, genus Salinispora, genus Nocardia, genus Rhodococcus and genus Corynebacterium.

[0060] The microorganism can be isolated from nature, or available from the culture collections such as ATCC. The microorganism may be wild type or genetically modified strains, and may be those that have already been used in a fermentation industry as producers of medically and / or agriculturally used antibiotics or biologically active substances.

[0061] The secondary metabolite is not particularly limited as long as the productivity of thereof can be increased by inactivating or reducing expression of fadR, or fadR and srb in a microorganism. Preferable secondary metabolites include medically and / or agriculturally useful antibiotics, for example, oxytetracycline from Streptomyces rimosus, lincomycin from Streptomyces lincolnensis, avermectin from Streptomyces avermitilis, erythromycin from Saccharopolyspora erythraea, and spinosad from Saccharopolyspora spinosa.

[0062] The method for inactivating or reducing expression of fadR and srb in a microorganism is not particularly limited. Generally, the method of inactivation will involve assembling sgRNAs and flanking sequences (homologous recombination templates) that exclude the fadR and srb genes into a CRSIPR / Cas9 vector, or flanking an antibiotic resistance gene with nucleic acid sequences encoding parts of the FadR or Srb protein and generate a knock-out construct. The replacement of the chromosomal copy of fadR or srb gene will be achieved by allelic exchange. Those of skill in the art will recognize that many other methods are known and would be suitable for use in the invention. For example, the chromosomal fadR or srb gene may be disrupted by transposon insertion or deletion from the chromosome. The methods of reducing the expression of fadR or srb include but are not limited to: overexpression of a dominant-negative mutant, expression of antisense transcript, and introducing mutations in the promoter regions of fadR or srb. In addition, overexpression of these genetic constructs  may be inducible for example, under the tetracycline inducible promoters. Alternatively, genes that control the expression of fadR or srb may also be targeted by genetic modifications to disrupt or reduce the FadR or Srb protein activity.

[0063] Variations of Nucleic Acid Molecules

[0064] Modifications

[0065] Many modifications may be made to the nucleic acid molecule DNA sequences disclosed in this application and these will be apparent to one skilled in the art. The invention includes nucleotide modifications of the sequences disclosed in this application (or fragments thereof) that encode proteins or peptides in bacterial or mammalian cells which have the same function as the proteins or peptides disclosed in this application. Modifications include substitution, insertion or deletion of one or more (e.g., 1-50, 1-20, 1-10, 1-5) nucleotides or altering the relative positions or order of one or more (e.g., 1-50, 1-20, 1-10, 1-5) nucleotides.

[0066] Nucleic acid molecules may encode conservative amino acid changes in FadR and Srb proteins. The invention includes functionally equivalent nucleic acid molecules that encode conservative amino acid changes and produce silent amino acid changes in FadR and Srb proteins. Methods for identifying empirically conserved amino acid substitution groups are well known in the art (see for example, Wu, Thomas D. "Discovering Empirically Conserved Amino Acid Substitution Groups in Databases of Protein Families" (https:  / / pubmed. ncbi. nlm. nih. gov / 8877523 / ) .

[0067] Nucleic acid molecules may encode non-conservative amino acid substitutions, additions or deletions in fadR and / or srb gene. The invention includes functionally equivalent nucleic acid molecules that make non-conservative amino acid changes within the amino acid sequences in FadR and Srb proteins. Functionally equivalent nucleic acid molecules include DNA and RNA that encode peptides, peptides and proteins having non-conservative amino acid substitutions (preferably substitution of a chemically similar amino acid) , additions, or deletions but which also retain the same or similar function to the FadR and Srb proteins or peptides disclosed in this application. The invention includes the DNAs or RNAs encoding fragments or  variants of FadR and Srb protein.

[0068] Sequence Identity

[0069] The nucleic acid molecules of the invention also include nucleic acid molecules (or a fragment thereof) having at least about: 60%identity, at least 70%identity, at least 80%identity, at least 90%identity, at least 95%identity, at least 96%identity, at least 97%identity, at least 98%identity or, most preferred, at least 99%or 99.5%identity to a nucleic acid molecule of the invention and which are capable of expression of nucleic acid molecules in bacterial or mammalian cells. Identity refers to the similarity of two nucleotide sequences that are aligned so that the highest order match is obtained. Identity is calculated according to methods known in the art. For example, if a nucleotide sequence (called "Sequence A: ') has 90%identity to a portion of SEQ ID NO: 2, then Sequence A will be identical to the referenced portion of SEQ ID NO: 2 except that Sequence A may include up to 10 point mutations (such as substitutions with other nucleotides) per each 100 nucleotides of the referenced portion of SEQ ID NO: 2.

[0070] Sequence identity (each construct preferably without a coding nucleic acid molecule insert) is preferably set at least about: 70%identity, at least 80%identity, at least 90%identity, at least 95%identity, at least 96%identity, at least 97%identity, at least 98%identity or, most preferred, at least 99%or 99.5%identity to the sequences provided in SEQ ID NO: 2 or its complementary sequence) . Sequence identity will preferably be calculated with the GCG program from Bioinformatics (University of Wisconsin) . Other programs are also available to calculate sequence identity, such as the Clustal W program (preferably using default parameters; Thompson, JD et al., Nucleic Acid Res. 22: 4673-4680) , BLAST P, BLAST X algorithms, Streptomyces species BLAST searches at (https: / / strepdb.streptomyces.org.uk / cgi-bin / dc3.pl?accession=AL645882&start=4291472&end=4302043&iorm=map&width=1200) , various BLAST searches at the Nationa Center for Biotechnology Information USA (https: / / blast.ncbi.nlm.nih.gov / Blast.cgi) and various BLAST searches at GenomeNet (https: / / www.genome.jp / ) .

[0071] Since the genetic code is degenerate, the nucleic acid sequences in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 are not the only sequences which may code for a polypeptide having FadR and Srb activities. This invention includes nucleic acid molecules that have the same essential genetic information as the nucleic acid molecules described in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4. Nucleic acid molecules (including RNA) having one or more nucleic acid changes compared to the sequences described in this application and which result in production of the polypeptides shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 are within the scope of the invention.

[0072] Other functional equivalent forms of FadR and Srb proteins-encoding nucleic acids can be isolated using conventional DNA-DNA or DNA-RNA hybridization techniques.

[0073] Hybridization

[0074] The invention includes DNA that has a sequence with sufficient identity to a nucleic acid molecule described in this application to hybridize under stringent hybridization conditions (hybridization techniques are well known in the art) . The present invention also includes nucleic acid molecules that hybridize to one or more of the sequences in [SEQ ID NO: 2] and SEQ ID NO: 4 or their complementary sequences. Such nucleic acid molecules preferably hybridize under high stringency conditions (see Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Most Recent Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. ) . High stringency washes have preferably low salt (preferably about 0.2%SSC) and a temperature of about 50-65℃.

[0075] EXAMPLES

[0076] Example 1. Bacterial strains and culture conditions

[0077] Escherichia coli DH5α was used as a general host strain for routine cloning. E. coli ET12567 (pUZ8002) was used as a host for transferring DNAfrom E. coli to Streptomyces by intergenic conjugation. Streptomyces coelicolor M145 and its derivatives were grown on R5M or MS agar and R5M liquid medium. Streptomyces  albidoflavus J1074 and its derivatives were grown on MS agar and MYM liquid medium. All Streptomyces strains were maintained at 30℃. When necessary, antibiotics were used at the following concentrations: 50 μg / mL apramycin, 50 μg / mL kanamycin, and 25 μg / mL chloramphenicol, and 25 μg / mL nalidixic acid.

[0078] Example 2. Construction of deletion mutants in Streptomyces using CRISPR / Cas9

[0079] Construction of Δsrb and ΔsrbΔfadR strains in Streptomyces coelicolor and ΔsrbΔfadR strain in Streptomyces albidofiavus was done using an Actinomycete-optimized CRISPR-Cas9 system as described previously13. The construction and sequence information of cloning vector pCRISPR-Cas9 was described previously13. Molecular cloning (PCR amplification, agarose gel analysis of PCR fragments, purification of PCR products, restriction enzyme digestion of DNA fragments, DNA ligation) were performed by standard procedures.

[0080] A single guide RNA (sgRNA) comprising 20 nucleotides specific to the locus targeted for deletion was designed using the web resource CRISPy (https: / / crispy.secondarymetabolites.org / # / input) 20. For each target gene, six different sgRNAs were used in parallel to increase the odds of successful deletion (Table 1 listed the sgRNA-containing primers used for each experiment) . Each sgRNA cassette was cloned into the vector pCRISPR-Cas9 and under the control of the constitutive ermE＊promoter13. To supply repair templates for homologous recombination (HR) , ～1.5 kb fragments of the 5' and 3' regions flanking the targeted gene (s) were PCR amplified from genomic DNA of Streptomyces coelicolor or Streptomyces albidoflavus, and ligated into pCRISPR-Cas9. The resulting pCRISPR-Cas9 plasmid carried a sgRNA cassette targeting the deletion locus and homologous recombination templates designed to exclude srb, fadR, or both srb and fadR upon repair. The PCR primers for amplifying the homologous recombination templates are listed in Table 1. All plasmids, once sequenced and verified, were transferred into Streptomyces coelicolor M145 or Streptomyces albidoflavus J1074 by conjugation. Single colonies of exconjugants were picked and streaked on media containing apramycin (to select for pCRISPR-Cas9) and 1 μg / ml thiostrepton (to induce Cas9 expression) . Resulting colonies were grown in  media without drugs to cure pCRISPR-Cas9. Genomic DNA was obtained from putative mutant colonies and the correct deletion was verified by PCR using primers flanking the deleted locus (Table 1) . All mutant clones were verified by DNA sequencing.

[0081] Figure 3 shows the construction of deletion strains of Streptomyces. In the first attempt to delete the srb gene of Streptomyces coelicolor, srbkosgRNA-F1 to F6 primers (Table 1) that targeted srb were employed, and homologous recombination templates of 1.1-and 1.3-kb were amplified by primers dko homo-5’F, -5’R, -3’F, -3’R, (Table 1) and were assembled into the pCRISPR-Cas9 vector (Fig. 3a) . Agarose gel analysis showed that a band size of 635 bp was amplified from the genomic DNA of five randomly picked mutant clones (C4-C8) , using primers srbkodeletioncheck-F and -R (Table 1, Fig. 3b) . This result indicates the deletion of srb (SCO5169) and 3’ portion of fadR (SCO5170) , resulting in ΔsrbΔfadR. DNA sequencing confirmed that the last 237 bp encoding 78 amino acids of the fadR gene was also deleted (Fig. 3a &b) . qPCR analysis showed that the expression of fadR was abolished. Therefore, due to the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) system in Streptomyces, the first attempt to construct a Δsrb strain of Streptomyces coelicolor inadvertently generated a double deletion mutant, ΔsrbΔfadR.

[0082] To make a clean and single deletion of srb in Streptomyces coelicolor, a new 3' homologous recombination template (amplified by primers srbko homo-5’F, -5’R, -3’F, -3’R, Table 1) that includes the entire coding sequence of fadR, together with sgRNA and 5’ homologous arm, were assembled into the pCRISPR-Cas9 vector (Fig. 3c) . Agarose gel showed successful generation of Δsrb of Streptomyces coelicolor. An expected DNA fragment of 1033 bp was amplified from the genomic DNA of three mutant clones (Fig. 3d) . All clones were verified by sequencing. This led to successful generation of single deletion mutant, Δsrb, of Streptomyces coelicolor (Fig. 3c &d) .

[0083] Multiple attempts to delete fadR in Streptomyces coelicolorwere unsuccessful. To make a single fadR deletion mutant, sgRNAs (fadrkosgRNA-1 to -5, Table 1) were designed to target fadR, and a homologous recombination template (amplified by fadrko homo-5’F, -5’R, -3’F, -3’R) that exclude fadR was provided (indicated by blue arrows, Fig. 3e) . However, DNA sequencing analysis revealed that all clones had deletion of  both fadR and srb (indicated by red arrows) , suggesting that fadR is essential in Streptomyces coelicolor and cannot be deleted unless srb is also deleted (Fig. 3e) .

[0084] The ΔsrbΔfadR strain of Streptomyces albidoflavus was successfully constructed (Fig. 3f &g) by using sgRNAs (Albido sgRNA-1 to -6, Table 1) and homologous recombination template (amplified by Albido homo 5’F, -5’R, -3’F, -3’R, Table 1) . Figure 3f shows the CRISPR-Cas9 design to delete both srb (XNR_1634) and fadR (tetR, XNR_1633) in Streptomyces albidoflavus. Agarose gel showed a band size of 425 bp was amplified from the mutant clones (Fig. 3g) , indicating successful construction of the ΔsrbΔfadR double mutant. All clones were verified by sequencing.

[0085] Example 3. RNA-sequencing analysis

[0086] All strains (wild type, Δsrb, and ΔsrbΔfadR of Streptomyces coelicolor, WT and ΔsrbΔfadR of Streptomyces albidoflavus) were cultured in 50 mL media to mid-exponential phases. RNA was extracted using a modified version of the guanidium thiocyanate protocol described previously21. Briefly, cells were lysed by vortexing with glass beads in a guanidium thiocyanate solution (4 M guanidium thiocyanate, 25 mM trisodium citrate dihydrate, 0.5%w / v sodium N-lauroylsarcosine, 0.8%β-mercaptoethanol) . The lysate was subjected to two phenol-chloroform extractions. Total nucleic acids were precipitated overnight at -20℃ in isopropanol and sodium acetate (3.0 M; pH 6.0) , pelleted, washed with 70%ethanol, and resuspended in nuclease-free water. DNA contamination was removed using Turbo DNase (Ambion) . RNA purity and concentration were measured with a Nanodrop spectrophotometer, while RNA quality was evaluated via Agilent 2100 Bioanalyzer and agarose gel electrophoresis. Ribosomal RNAs were removed using MICROBExpressTM Bacterial mRNA Enrichment Kit (AM1905) and cDNA libraries were prepared using Next Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (E7760) . High-throughput sequencing was carried out via Novaseq 6000 SP flow cell with paired-end reads of 100 bp or 150 bp. Raw sequencing reads were trimmed to remove adaptor sequences and low-quality 3' ends using Cutadapt. An average of 22 million raw reads per sample were checked for quality using FastQC and aligned to the Streptomyces coelicolor M145 or Streptomyces albidoflavus  J1074 genome sequence using Rockhopper. Differentially expressed genes (DEGs) were defined as those with a false discovery rate Q ≤ 0.05 and fold-change ≥2.

[0087] Comparing the Δsrb mutant with the wild type strain of Streptomyces coelicolor, 282 DEGs were identified (210 upregulated, 72 downregulated) . GO analysis showed enrichment in phenylacetic acid degradation (SCO7469-SCO7475) and nitrate reductase 2 (Nar2, SCO0217-SCO0219) in downregulated genes, but no significant‘GO term’ was identified in upregulated genes.

[0088] A total of 428 DEGs (283 upregulated, 155 downregulated) was identified between the ΔsrbΔfadR mutant and the wild type strain of Streptomyces coelicolor. Strikingly, BGCs of five different secondary metabolites (prodigiosin, desferrioxamine B, 5-hydroxyectoine, albaflavenone, and isorenieratene) were significantly upregulated in ΔsrbΔfadR (Fig. 4) Importantly, every gene was upregulated and to a similar level in each BGC (Fig. 4) . Prodigiosin is a secondary metabolite with a wide range of biological activities, including activities as antimalarial22, antifungal23, immunosuppressant24, and antibiotic agents25, also known for its capacity to trigger apoptosis of malignant cancer cells26. Desferrioxamine B is a medication under the brand name Desferal and specifically used in treatment of iron overdose due to multiple blood transfusion or an underlying genetic condition. 5-hydroxyectoine is used as an active ingredient in skin care and sun protection products.

[0089] GO analysis also revealed that lipid catabolic pathways were significantly enriched in upregulated genes of ΔsrbΔfadR. Specifically, genes involved in fatty acid β-oxidation including fadA (SCO6027) , fadB (SCO6026) , and fadE (SCO3800) were increased ～50-fold and are among the most highly upregulated genes (Table 2, Fig. 6a, Fig. 7) . A number of FadD and FadE homologs are present in Streptomyces coelicolor. Three FadD encoding genes SCO2131 (6.6-fold) , SCO2051 (7.3-fold) , and SCO2720 (8.0-fold) , were upregulated (Table 2) . Two additional FadE encoding genes, SCO1209 (5.5-fold) and SCO3051 (13.2-fold) , were also upregulated.

[0090] Notably, a lipase (SCO1725, 4.2-fold) that breaks down triacylglycerol into free fatty acids and a cholesterol esterase (SCO5420, 16.9-fold) that hydrolyzes the sterol esters and release free fatty acids were also upregulated (Table 2) . Neutral lipids such as triacylglycerides and cholesterol are excellent storage compounds that can be  accumulated in large amounts in cytoplasm as lipid droplets without affecting cell osmolarity27., and they can be mobilized under certain physiological conditions to provide the acyl moieties, which can be further degraded by the fatty acid β-oxidation pathway (Fig. 7) .

[0091] Four hundred eighty-seven genes were upregulated and 302 genes were downregulated in the ΔsrbΔfadR mutant compared to the wild type strain of Streptomyces albidoflavus. Multiple BGCs were upregulated in ΔsrbΔfadR, including the BGC for hopene, cyclofaulknamycin, minimycin, and candicidin (Fig. 8) . Candicidin is an antifungal compound and is being used to treat infection caused by Candida albicans28. Cyclofaulknamycin is a cyclic-peptide antibiotic29 and minimycin is a C-nucleoside antibiotic structurally related to pseudouridine30. Moreover, similar to ΔsrbΔfadR of Streptomyces coelicolor, genes involved in fatty acid β-oxidation were drastically increased in their expression in ΔsrbΔfadR of Streptomyces albidoflavus (Fig. 6b, Table 3) .

[0092] Example 4. Metabolite extraction and analysis

[0093] Streptomyces coelicolorwild type and ΔsrbΔfadR strains were grown as a lawn on R5M agar over a time course of 36, 54, 96, and 168 hours. At each timepoint, the entirety of each plate was macerated in an equal volume of n-butanol, sonicated, and left overnight. Extracts were filtered through Whatman paper and dried down in a GeneVac. Extracts were resuspended in 100%methanol or acetonitrile and subjected to liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analysis.

[0094] Figure 5a shows the representative LC / MS profile of metabolites extracted from wild type (black line) and ΔsrbΔfadR (red line) of Streptomyces coelicolor. Consistent with the RNA-seq data, the levels of undecylprodigiosin (Fig. 5b) and desferrioxamine B (Fig. 5c) were largely increased in ΔsrbΔfadR (red line) compared to wild type (black line) . Importantly, in addition to the elevated production of known secondary metabolites, new compounds (e.g, the one with the molecular mass of 611.5392, Fig. 5a) appeared in ΔsrbΔfadR and their identities are currently unknown and warrant future studies.

[0095] Reference

[0096] 1 Hug, J.J., Krug, D. &Muller, R. Bacteria as genetically programmable producers of bioactive natural products. Nat Rev Chem 4, 172-193 (2020) . https: / / doi.org / 10.1038 / s41570-020-0176-1

[0097] 2 Ngamcharungchit, C., Chaimusik, N., Panbangred, VV., Euanorasetr, J. &Intra, B. Bioactive Metabolites from Terrestrial and Marine Actinomycetes. Molecules 28 (2023) .https: / / doi.org. / 10.3390 / molecules28155915

[0098] 3 VVatve, M.G., Tickoo, R., Jog, M.M. &Bhole, B.D. How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces? Arch Microbiol176, 386-390 (2001) . https: / / doi.org / 10.1007 / s002030100345

[0099] 4 Nakagawa, A. et al. Virantmycin, a new antiviral antibiotic produced by a strain of Streptomyces. J Antibiot (Tokyo) 34, 1408-1415 (1981 ) .https: / / doi.org / 10.7164 / antibiotics.34.1408

[0100] 5 Caffrey, P., Lynch, S., Flood, E., Finnan, S. &Oliynyk, M. Amphotericin biosynthesis in Streptomyces nodosus: deductions from analysis of polyketide synthase and late genes. Chem Biol 8, 713-723 (2001) .https: / / doi.org / 10.1016 / s1074-5521(01)00046-1

[0101] 6 Ikeda, H., Nonomiya, T., Usami, M., Ohta, T. &Omura, S. Organization of the biosynthetic gene cluster for the polyketide anthelmintic macrolide avermectin in Streptomyces avermitilis. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 9509-9514 (1999) .https: / / doi.org / 10.1073 / pnas.96.17.9509

[0102] 7 Aparicio, J.F. et al. Organization of the biosynthetic gene cluster for rapamycin in Streptomyces hygroscopicus: analysis of the enzymatic domains in the modular polyketide synthase. Gene 169, 9-16 (1996) . https: / / doi.org / 10.1016 / 0378-1119(95)00800-4

[0103] 8 Otten, S.L., Stutzman-Engwall, K.J. &Hutchinson, C.R. Cloning and expression of daunorubicin biosynthesis genes from Streptomyces peucetius and S. peucetius subsp. caesius. J Bacteriol 172, 3427-3434 (1990) .https: / / doi.org / 10.1128 / jb.172.6.3427-3434.1990

[0104] 9 Sayed, A.M., Abdel-Wahab, N.M., Hassan, H.M. &Abdelmohsen, U.R. Saccharopolyspora: an underexplored source for bioactive natural products. J Appl Microbiol 128, 314-329 (2020) . https: / / doi.org / 10.1111 / jam.14360

[0105] 10 Jensen, P.R. Microbe Profile: Salinispora tropica: natural products and the evolution of a unique marine bacterium. Microbiology (Reading) 168 (2022) . https: / / doi.org / 10.1099 / mic.0.001163

[0106] 11 Nett, M., Ikeda, H. &Moore, B.S. Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes. Nat Prod Rep 26, 1362-1384 (2009) . https: / / doi.org / 10.1039 / b817069j

[0107] 12 Liu, G., Chater, K.F., Chandra, G., Niu, G. &Tan, H. Molecular regulation of antibiotic biosynthesis in streptomyces. Microbiol Mol BiolRev 77, 112-143 (2013) . https: / / doi.org / 10.1128 / MMBR.00054-12

[0108] 13 Tong, Y., Charusanti, P., Zhang, L., Weber, T. &Lee, S.Y. CRISPR-Cas9 Based Engineering of Actinomycetal Genomes. ACS Synth Biol 4, 1020-1029 (2015) . https: / / doi.org / 10.1021 / acssynbio.5b00038

[0109] 14 Cuthbertson, L. &Nodwell, J.R. The TetR family of regulators. Microbiol Mol Biol Rev 77, 440-475 (2013) . https: / / doi.org / 10.1128 / MMBR.00018-13

[0110] 15 Staunton, J. &Wilkinson, B. Biosynthesis of Erythromycin and Rapamycin. Chem Rev 97, 2611-2630 (1997) . https: / / doi.org / 10.1021 / cr9600316

[0111] 16 Pickens, L.B. &Tang, Y. Oxytetracycline biosynthesis. J Biol Chem 285, 27509-27515 (2010) . https: / / doi.org / 10.1074 / jbc.R110.130419

[0112] 17 Fujita, Y., Matsuoka, H. &Hirooka, K. Regulation of fatty acid metabolism in bacteria. Mol Microbiol 66, 829-839 (2007) . https: / / doi.org / 10.1111 / j.1365-2958.2007.05947.x

[0113] 18 Menendez-Bravo, S., Paganini, J., Avignone-Rossa, C., Gramajo, H. &Arabolaza, A. Identification of FadAB Complexes Involved in Fatty Acid beta-Oxidation in Streptomyces coelicolor and Construction of a Triacylglycerol Overproducing strain. Front Microbiol 8, 1428 (2017) .https: / / doi.org / 10.3389 / fmicb.2017.01428

[0114] 19 Lee, W., VanderVen, B.C., Fahey, R.J. &Russell, D. G. Intracellular Mycobacterium tuberculosis exploits host-derived fatty acids to limit metabolic stress. J Biol Chem 288, 6788-6800 (2013) .https: / / doi.org / 10.1074 / jbc.M112.445056

[0115] 20 Blin, K., Pedersen, L.E., Weber, T. &Lee, S.Y. CRISPy-web: An online resource to design sgRNAs for CRISPR applications. Synth Syst Biotechnol 1, 118-121 (2016) . https: / / doi.org / 10.1016 / j.synbio.2016.01.003

[0116] 21 Chomczynski, P. &Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162, 156-159 (1987) . https: / / doi.org / 10.1006 / abio.1987.9999

[0117] 22 Castro, A.J. Antimalarial activity of prodigiosin. Nature 213, 903-904 (1967) . https: / / doi.org / 10.1038 / 213903a0

[0118] 23 Berg, G. Diversity of antifungal and plant-associated Serratia plymuthica strains. J Appl Microbiol88, 952-960 (2000) . https: / / doi.org / 10.1046 / j.1365-2672.2000.01064.x

[0119] 24 Magae, J., Miller, M.W., Nagai, K. &Shearer, G.M. Effect of metacycloprodigiosin, an inhibitor of killer T cells on murine skin and heart transplants. J Antibiot (Tokyo) 49, 86-90 (1996) .https: / / doi.org / 10.716 / antibiotics.49.86

[0120] 25 Suryawanshi, R.K., Patil, C.D., Koli, S.H., Hallsworth, J.E. &Patil, S.V. Antimicrobial activity of prodigiosin is attributable to plasma-membrane damage. Nat Prod Res 31, 572-577 (2017) .https: / / doi.org / 10.1080 / 14786419.2016.1195380

[0121] 26 Perez-Tomas, R. &Vinas, M. New insights on the antitumoral properties of prodiginines. CurrMed Chem 17, 2222-2231 (2010) .https: / / doi.org / 10.2174 / 092986710791331103

[0122] 27 Alvarez, H.M. Triacylglycerol and wax ester-accumulating machinery in prokaryotes. Biochimie 120, 28-39 (2016) .https: / / doi.org / 10.1016 / j.biochi.2015.08.016

[0123] 28 Liu, J., Tran, V., Leung, A.S., Alexander, D.C. &Zhu, B. BCG vaccines: their mechanisms of attenuation and impact on safety and protective efficacy. Hum Vaccin 5, 70-78 (2009) . https: / / doi.org / 10.4161 / hv.5.2.7210

[0124] 29 Horbal, L. et al. Cyclofaulknamycin with the Rare Amino Acid D-capreomycidine Isolated from a Well-Characterized Streptomyces albus Strain. Microorganisms 9 (2021) . https: / / doi.org / 10.3390 / microorganisms9081609

[0125] 30 Kong, L. et al. Divergent Biosynthesis of C-Nucleoside Minimycin and Indigoidine in Bacteria. iScience 22, 430-440 (2019) .https: / / doi.org / 10.1016 / j.isci.2019.11.037

[0126] Table 1. Primers used in this study.

[0127] #Restriction enzyme sites are underlined.

[0128] §The 20 nt target sequences are shown in red. The pattern of the sgRNA-F primer is: CATGCCATGGN20GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.

[0129] ＊These primers were originally picked to build homologous recombination templates excluding only srb of Streptomyces coelicolor, but accidentally also excluded the last 237 bp (78 amino acids) of the upstream fadR gene, resulting in a double mutant. Corrected primers for making homologous recombination templates excluding only srb are included above as: srbkohomo-5’F, srbkohomo-5’R, srbkohomo-3’F, and srbkohomo-3’R.

[0130] Table 2. Genes involved in fatty acid β-oxidation were upregulated in ΔsrbΔfadR of Streptomyces coelicolor compared to wide type strain.

[0131] Table 3. Genes involved in fatty acid β-oxidation were upregulated in ΔsrbΔfadR of Streptomyces albidoflavus compared to wide type strain.

Claims

1.A method for increasing a productivity of a secondary metabolite in a microorganism by inactivating the fadR gene, or by inactivating fadR and srb genes, of said microorganism.2.A method for increasing a productivity of a secondary metabolite in a microorganism by reducing the expression of the fadR gene, or by reducing the expression of fadR and srb genes, of said microorganism.3.The method as described in (1) or (2) above, wherein said microorganism is a bacterium.4.The method as described in (1) or (2) above, wherein said microorganism belongs to actinomycetes, including but not limited to the genus selected from the group consisting of genus Streptomyces, genus Saccharopolyspora, genus Salinispora, genus Nocardia, genus Rhodococcus and genus Corynebacterium.5.The method as described in (1) or (2) above, wherein the fadR gene encodes(i) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; or(ii) a protein with the substitution, addition, or deletion of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.6.The method as described in (1) or (2) above, wherein the srb gene encodes(i) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; or(ii) a protein with the substitution, addition, or deletion of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.7.The method as described in (1) or (2) above, wherein the fadR gene comprises(i) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2; or(ii) a sequence that hybridizes to the nucleotide sequence of (i) under a stringent hybridization condition; or(iii) a sequence having at least 60%sequence identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.8.The method as described in (1) or (2) above, wherein the srb gene comprises(i) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4; or(ii) a sequence that hybridizes to the nucleotide sequence of (i) under a stringent hybridization condition; or(iii) a sequence having at least 60%sequence identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.9.The method as described in (1) above, wherein the fadR gene is inactivated by deleting the fadR gene from the genome, and the srb gene is inactivated by deleting the srb gene from the genome.10.The method as described in (2) above, wherein the expression of fadR is reduced by overexpression of a dominant-negative fadR mutant, expression of antisense fadR transcript, and introducing mutations in the promoter region of fadR. Similarly, the expression of srb is reduced by overexpression of a dominant-negative srb mutant, expression of antisense srb transcript, and introducing mutations in the promoter region of srb.11.The method as described in (1) or (2) above, wherein said secondary metabolite is selected from the group consisting of antibiotics, antiviral agents, antifungal agents, anticancer agents, immunosuppressive agents, enzymes, and other physiological active substance.12.A method for producing a secondary metabolite, which comprises the steps of culturing in a media of a microorganism which is produced in accordance of with the method as described in (1) or (2) above, forming and accumulating a secondary metabolite, and recovering the secondary metabolite therefrom.13.The method as described in (12) above, wherein said microorganism is a bacterium.14.The method as described in (12) above, wherein said microorganism belongs to actinomycetes, including but not limited to the genus selected from the group consisting of genus Streptomyces, genus Saccharopolyspora, genus Salinispora, genus Nocardia, genus Rhodococcus and genus Corynebacterium.15.The method as described in (12) above, wherein said secondary metabolite is selected from the group consisting of antibiotics, antiviral agents, antifungal agents, anticancer agents, immunosuppressive agents, enzymes, and other physiologically active substances.16.A microorganism having increased productivity of the secondary metabolite in comparison to an original strain thereof, which is produced in accordance with the method of (1) or (2) above.17.The microorganism as described in (16) above, wherein said microorganism is a bacterium.18.The microorganism as described in (16) above, wherein said microorganism belongs to actinomycetes, including but not limited to the genus selected from the group consisting of genus Streptomyces, genus Saccharopolyspora, genus Salinispora, genus Nocardia, genus Rhodococcus and genus Corynebacterium.19.As another aspect of the invention, a method is provided for inducing the expression of ‘silent’ or ‘cryptic’ biosynthetic gene clusters in microorganisms by inactivating or reducing expression of fadR, or fadR and srb, and providing a new approach to find new antibiotics and other physiologically active substances.

Images