Engineered cells and uses thereof

Abstract

An engineered cell comprising a nucleic acid encoding an agent which binds to Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 (LAIR-1) and an engineered immune cell, wherein the engineered immune cell has reduced expression and / or function of LAIR-1 compared to a reference immune cell that is not engineered to have reduce expression level and / or function of LAIR-1. The agents comprised in such engineered cells, methods of making, and methods of using the engineered cells for treatment of diseases such as cancer.

Description

ENGINEERED CELLS AND USES THEREOFCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0001] This application claims benefit of priority of International Patent Application No. PCT / CN2024 / 122474 filed on September 29, 2024, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety. SUBMISSION OF SEQUENCE LISTING ON XML FILE

[0002] The content of the following submission on XML file is incorporated herein by reference in its entirety: a computer readable form (CRF) of the Sequence Listing (file name: IEC250446PCT SEQUENCE LISTING. XML, date recorded: September 24, 2025, size: 70,297 bytes) . FIELD OF THE PRESENT APPLICATION

[0003] The present application generally relates to engineered cells useful for immunotherapy, and more specifically to compositions and methods for adoptive cell therapy and methods of reducing undesired immune response in such therapy. BACKGROUND OF THE PRESENT APPLICATION

[0004] Adoptive cell therapy or adoptive cell transfer (ACT) is becoming an ever more important treatment paradigm, particularly in the treatment of cancer. ACT refers to the transfer of therapeutic cells, most typically immune cells, into a patient. These cells may have originated from the patient (i.e., autologous therapy) or from another individual of the same species (i.e., allogeneic therapy) . The goal of ACT is to improve functions and characteristics of the immune system in the patient. Specially, in cancer immunotherapy, the goal of ACT is to trigger an immune response against the cancer. Although T cells are most often used in ACT, other immune cell types such as natural killer (NK) cells, lymphocytes (e.g., tumor-infiltrating lymphocytes or TILs) , dendritic cells and myeloid cells have also been applied.

[0005] Ideally, the therapeutic cells that are infused to a patient receiving an ACT (or reinfused in case of autologous therapy) will expand and persist in the patient. To improve ACT efficacy, lymphodepletion is often used as neoadjuvant therapy, which ablates competing immune cells that may repopulate the immune cell space. This is especially important for allogeneic therapy because an immune response may be raised against infused non-self cells, both by the adaptive and the innate immune systems. Sometimes, myeloablation, which applies high-dose chemotherapy to kill cells in the bone marrow, is also used. However, lymphodepletion or myeloablation are quite drastic measures that often result in severe side effects because of their effects on the immune system. Accordingly, it would be advantageous to prevent or reduce undesired immune response against infused ACT cells, which may increase the persistence of the ACT cells in vivo and enhance the benefits of the therapy. Ideally, such strategy would lead to reduced need for lymphodepletion or myeloablation and the associated side effects.

[0006] The immune system has developed elaborate and effective mechanisms against foreign agents. Undesired immune response presents the most formidable barriers against successful ACT, especially allogeneic ACT, including allogeneic Chimeric Antigen Receptor (CAR) T cells. One barrier is graft-versus-host disease (GvHD) , in which the donor T cells recognize the patient’s cells as foreign, resulting in attack of the patient’s healthy tissues. Another barrier is Host-versus-graft disease (HvGD) , in which T cells in the patient (i.e., host) recognize the donor cells as foreign, resulting in attack of the donor cells and graft rejection. GvHD is mediated by T cell receptors (TCR) on the surface of donor T cells, which recognize human leukocyte antigen (HLA) on the host cells as foreign and initiate the attack by the donor T cells. HvGD is mediated by TCRs on the surface of host T cells, which recognize HLA on the donor cells as foreign and initiate the attack by the host T cells.

[0007] To mitigate GvHD, genome-editing technologies have been used to knockout TCR genes from the genome of donor CAR-T cells. Many companies also knockout beta-2 microglobulin (B2M) in donor CAR-T cells to reduce graft rejection caused by host T cells. Recently developed genome-editing tools such as transcription activator-like effector nucleases (TALENs) , zinc finger nucleases and CRISPR–Cas9 systems are effective and easy to easy. However, genome editing in clinically relevant human somatic cells remains a challenge because of immunogenicity of the genome-edited cells. For example, B2M knockout increases the risk of graft rejection mediated by Natural Killer (NK) cells. To date, allogeneic T cell therapy products have yet to achieve promising clinical results (Sommer C et al., Mol Ther. (2019) 27 (6) : 1126-1138; MacLeod DT et al., Mol Ther. (2017) 25 (4) : 949-96; Sheridan C et al., Nat Biotechnol (2018) 36, 375–377; Qasim W. Am J Hematol. 2019; 94: S50–S54) . Accordingly, there exists a need for therapeutic cells suitable for allogeneic transplantation with reduced risk of undesired immune response.

[0008] The disclosures of all publications, patents, patent applications and published patent applications referred to herein are hereby incorporated herein by reference in their entirety. BRIEF SUMMARY OF THE DISCLOSURE

[0009] The present application in one aspect provides engineered cells comprising a nucleic acid encoding an agent that binds to Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 (LAIR-1) . In some embodiments, the agent activates LAIR-1.

[0010] In some embodiments according to any of the engineered cells described above, the agent is bound to the membrane of the engineered cell. In some embodiments, the agent is bound to the membrane of the engineered cell by a transmembrane domain or via an anchor.

[0011] In some embodiments according to any of the engineered cells described above, the agent is derived from an RIFIN molecule. In some embodiments, the RIFIN molecule is RIFIN2, RIFIN6, RIFIN7, or RIFIN8.

[0012] In some embodiments according to any of the engineered cells described above, the agent comprises a variable region of the RIFIN molecule.

[0013] In some embodiments according to any of the engineered cells described above, the agent can comprise a transmembrane domain of a RIFIN molecule.

[0014] In some embodiments according to any of the engineered cells described above, the agent can comprise a full length RIFIN molecule.

[0015] In some embodiments according to any of the engineered cells described above, the agent does not comprise an intracellular domain.

[0016] In some embodiments according to any of the engineered cells described above, the agent comprises an anti-LAIR-1 antibody or an antigen binding fragment thereof. In some embodiments, the agent comprises a CD28 transmembrane domain. In some embodiments, the agent comprises a CD28 hinge domain.

[0017] In some embodiments according to any of the engineered cells described above, the agent comprises an amino acid sequence having at least 80%sequence identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-16, and 54-57.

[0018] In some embodiments according to any of the engineered cells described above, the LAIR-1 is expressed on an effector immune cell. In some embodiments, the effector immune cell is a natural killer (NK) cell, a T cell, a B cell, a macrophage, or a dendritic cell.

[0019] In some embodiments according to any of the engineered cells described above, the engineered cell is an immune cell, or a stem cell or a cell differentiated therefrom. In some embodiments, the engineered cell is an immune cell selected from the group consisting of: T cell, NK cell, B cell, macrophage and CIK cell.

[0020] In some embodiments according to any of the engineered cells described above, the engineered cell further comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor targets a tumor antigen selected from the group consisting of CD19, BCMA, Claudin 18.2, NY-ESO-1, VEGFR2, MAGE-A3, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA, EGFR, GD2, HER2, IGF1R, mesothelin, PSMA, ROR1, GPC3, DLL3, GPRC5D, CLL1, WT1 and combinations thereof. In some embodiments, the engineered receptor is selected from the group consisting of: a chimeric antigen receptor (CAR) , an engineered TCR, a chimeric T cell receptor (cTCR) , a T-cell antigen coupler (TAC) receptor, and a TAC-like engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR.

[0021] In some embodiments according to any of the engineered cells described above, the engineered cell is further modified to have a reduced expression and / or function of LAIR-1 compared to an engineered cell that is not modified to have a reduced expression and / or function of LAIR-1. In some embodiments, the engineered cell is genetically modified. In some embodiments, the engineered cell comprises a LAIR-1 knockdown or knockout mutation.

[0022] The present application in another aspect provides a pharmaceutical composition comprising of any of the engineered cells described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0023] The present application in another aspect provides a method of inhibiting effector immune cells that express LAIR-1, comprising contacting the effector immune cells with any of the engineered cells described herein, or any of the pharmaceutical compositions described herein.

[0024] The present application in another aspect provides a method of treating a disease or condition in an individual in need thereof, comprising administering to the individual an effective amount of any of the pharmaceutical compositions described herein. In some embodiments, the engineered cell is allogeneic. In some embodiments, the individual is human.

[0025] In some embodiments according to any of the methods described above, the method can reduce undesired immune response against the engineered cell in the individual compared to a method using a reference cell that does not comprise the nucleic acid encoding the agent. In some embodiments, the undesired immune response comprises Host-versus-Graft (HvG) response. In some embodiments, the HvG response is mediated by T cells of the individual. In some embodiments, the HvG response is mediated by NK cells of the individual. In some embodiments, the method (i) increases immune tolerance towards the engineered cell in the individual and / or (ii) increases persistence of the engineered cell in the individual compared to a method using a reference cell that does not comprise the nucleic acid encoding the agent. In some embodiments, the disease or condition is a cancer, an autoimmune disease, or an infectious disease.

[0026] The present application in another aspect provides a method of (i) reducing graft rejection and / or (ii) increasing persistence of allogeneic cells in an individual in need thereof, comprising administering to the individual an effective amount of any of the engineered cells described herein, or any of the pharmaceutical compositions described herein.

[0027] The present application in another aspect provides a method of (i) reducing graft rejection and / or (ii) increasing persistence of allogeneic cells in an individual in need thereof, comprising introducing into the allogeneic cells a nucleic acid encoding an agent which activates LAIR-1 on an effector immune cell.

[0028] The present application in another aspect provides an engineered immune cell, wherein the engineered immune cell has reduced expression and / or function of LAIR-1 compared to a reference immune cell that is not engineered to have reduced expression and / or function of LAIR-1. In some embodiments, the engineered immune cell is genetically modified. In some embodiments, the engineered immune cell comprises a LAIR-1 knockdown or knockout mutation. In some embodiments, the engineered immune cell has stronger proliferation activity compared to a reference immune cell that is not engineered to have reduced expression and / or function of LAIR-1.

[0029] In some embodiments according to any of the engineered immune cells described above, the engineered immune cell further comprises reduced expression and / or function of B2M compared to a reference immune cell that is not engineered to have reduced expression and / or function of B2M. In some embodiments, the engineered immune cell comprises a B2M knockdown or knockout mutation. In some embodiments, the LAIR-1 and / or B2M knockdown or knockout mutation is introduced into the engineered immune cell using CRISPR / Cas, base editors, TALENs, or ZFNs. In some embodiments, the LAIR-1 and / or B2M knockdown or knockout mutation is introduced into the engineered immune cell using CRISPR / Cas9.

[0030] In some embodiments according to any of the engineered immune cells described above, the engineered immune cell further comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR.

[0031] In some embodiments according to any of the engineered immune cells described above, the engineered immune cell is a T cell.

[0032] The present application in another aspect provides a method of producing any of the engineered immune cells described herein, comprising introducing a CRISPR / Cas9 system into a precursor immune cell, wherein the CRISPR / Cas9 system comprises a gRNA comprising the sequence of SEQ ID NO: 51.

[0033] The present application in another aspect provides a method of treating a disease or condition in an individual in need thereof, comprising administering to the individual an effective amount of any of the engineered immune cells described herein. In some embodiments, the engineered immune cell is allogeneic. In some embodiments, the individual is a human.

[0034] The present application in another aspect provides an agent that binds to LAIR-1 on an effector immune cell, wherein the agent activates LAIR-1. In some embodiments, the agent comprises a transmembrane domain. In some embodiments, the agent is a truncate of a RIFIN molecule. In some embodiments, the RIFIN molecule is RIFIN6 or RIFIN8. In some embodiments, the agent lacks the intracellular domain compared to the RIFIN molecule. In some embodiments, the agent comprises a variable region and a transmembrane domain of the RIFIN molecule. In some embodiments, the agent comprises an anti-LAIR-1 antibody or an antigen binding fragment thereof. In some embodiments, the agent comprises a CD28 transmembrane domain and a CD28 hinge domain. In some embodiments, the agent comprises an amino acid sequence having at least about 80%sequence identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-16, and 54-57.

[0035] The present application in another aspect provides a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding any of the agents described herein. In some embodiments, the nucleic acid further comprising a nucleic acid sequence encoding an engineered receptor.

[0036] The present application in another aspect provides a method of treating or preventing a disease or condition in an individual in need thereof, comprising administering to the individual an effective amount of any of the agents described herein. In some embodiments, the disease or condition is HvG response. The present application in another aspect provides a method of treating or preventing a disease or condition in an individual in need thereof, comprising administering to the individual an effective amount of any of the agents described herein and an engineered immune cell. In some embodiments, the disease or condition is cancer or autoimmune disease. In some embodiments, the engineered immune cell has reduced expression and / or function of LAIR-1 compared to a reference immune cell that is not engineered to have reduce expression level and / or function of LAIR-1, and / or the engineered immune cell comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an engineered receptor.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0037] FIGs. 1A-1B show the expression level of LAIR-1 in immune cells. FIG. 1A is a flow cytometry result chart, and FIG. 1B is a column analysis chart based on the flow cytometry results.

[0038] FIGs. 2A-2B show the expression levels of LAIR-1 and NKG2A in NK cells. FIG. 2A is a flow cytometry result diagram, and FIG. 2B is a dot plot based on the flow cytometry results.

[0039] FIG. 3 shows the expression levels of vectors carrying anti-HvG molecules and CAR in K562 cells.

[0040] FIGs. 4A-4B show the expression levels of vectors carrying anti-HvG molecules and CAR in T cells (FIG. 4A) , and the knockout efficiency of LAIR-1 and B2M (FIG. 4B) .

[0041] FIG. 5 shows the expression levels of LAIR-1 and NKG2A on primed NK obtained from 2 healthy donor-derived PBMC (No. 20063494, SHZX158) using K562-IL15 trophoblast cells for NK cell expansion in vitro.

[0042] FIGs. 6A-6B show the killing of K562 cells expressing anti-HvG molecules and CAR by NK cells derived from two donors respectively.

[0043] FIGs. 7A-7B show the survival results of CAR-T cells co-cultured with NK cells and allogeneic T cells expressing anti-HvG molecules and CAR. FIG. 7A is the flow cytometry result of detecting LAIR-1 negative and B2M positive in T cells (CD5-positive) , and FIG. 7B is a histogram based on the flow cytometry results.

[0044] FIGs. 8A-8B show the effect of knocking out LAIR-1 in T cells to promote CAR-T proliferation. DETAILED DESCRIPTION OF THE DISCLOSURE

[0045] The present application in one aspect provides an engineered cell comprising a nucleic acid encoding an agent (e.g., an agent derived from an RIFIN molecule, an anti-LAIR-1 antibody, or a fragment thereof) which binds to (e.g., activates) Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 (LAIR-1) . The application is in part based on inventors’ insight and observation that such LAIR-1 binding agent expressed on the surface of an engineered cells can effectively reduce graft rejection and increase persistence when the engineered cells are introduced to an individual. Without being bound by theory, it is believed that certain LAIR-1 binding agents are capable of activating LAIR-1 receptors expressed on the surface of effector immune cells (such as NK cells) within the individual, thereby reducing the killing effect of the host effector immune cells on the engineered cells introduced into the individual.

[0046] In another aspect, there is provided an engineered immune cell having reduced expression and / or function of LAIR-1 compared to a reference cell which is not engineered, and the engineered immune cell may optionally further comprise a nucleic acid encoding an agent which binds to (e.g., activates) LAIR-1. The disclosure is based on the surprising finding that, when the expression and / or function of LAIR-1 is reduced, the engineered immune cells proliferate better and have reduced risk of being attacked by agents expressed thereon that activate LAIR-1. LAIR-1 reduction or knockout can therefore be used as an armor strategy for the engineered immune cells to enhance the efficacy and durability of the engineered immune cells in clinical treatment.

[0047] The present application also provides the nucleic acids encoding the LAIR-1 binding agents described herein, methods of treating diseases by administering any of the engineered cells described herein, as well as methods of reducing graft rejection and / or increasing persistence of engineered cells in an individual administered with the engineered cells described herein. I. Definitions

[0048] The term “antibody” includes monoclonal antibodies as well as antibody fragments (e.g., Fab, F (ab′) 2, and Fv) . The term “immunoglobulin” (Ig) is used interchangeably with “antibody” herein. The term antibody includes conventional four-chain antibodies, and single-domain antibodies, such as heavy-chain only antibodies or fragments thereof, e.g., VHH.

[0049] The term “heavy chain-only antibody” or “HCAb” refers to a functional antibody, which comprises heavy chains, but lacks the light chains usually found in 4-chain antibodies. Camelid animals (such as camels, llamas, or alpacas) are known to produce HCAbs.

[0050] The term “single-domain antibody” or “sdAb” refers to a single antigen-binding polypeptide having three complementary determining regions (CDRs) . The sdAb alone is capable of binding to the antigen without pairing with a corresponding CDR-containing polypeptide. In some cases, single-domain antibodies are engineered from camelid HCAbs, and their heavy chain variable domains are referred herein as “VHHs” (Variable domain of the heavy chain of the Heavy chain antibody) . Camelid sdAb is one of the smallest known antigen-binding antibody fragments (see, e.g., Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-8 (1993) ; Greenberg et al., Nature 374: 168-73 (1995) ; Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomedicine (Lond) , 8: 1013-26 (2013) ) . A basic VHH has the following structure from the N-terminus to the C-terminus: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, in which FR1 to FR4 refer to framework regions 1 to 4, respectively, and in which CDR1 to CDR3 refer to the complementarity determining regions 1 to 3.

[0051] The term “constant domain” refers to the portion of an immunoglobulin molecule having a more conserved amino acid sequence relative to the other portion of the immunoglobulin, the variable domain, which contains the antigen-binding site. The constant domain contains the CH1, CH2 and CH3 domains (collectively, CH) of the heavy chain and the CHL (or CL) domain of the light chain.

[0052] The “variable region” or “variable domain” of an antibody refers to the amino-terminal domains of the heavy or light chain of the antibody. The variable domains of the heavy chain and light chain may be referred to as “VH” and “VL” , respectively. These domains are generally the most variable parts of the antibody (relative to other antibodies of the same class) and contain the antigen binding sites. Heavy-chain only antibodies from the Camelid species have a single heavy chain variable region, which is referred to as “VHH” . VHH is thus a special type of VH.

[0053] The “light chains” of antibodies (immunoglobulins) from any mammalian species can be assigned to one of two clearly distinct types, called kappa ( “κ” ) and lambda ( “λ” ) , based on the amino acid sequences of their constant domains.

[0054] “Antibody fragments” comprise a portion of an intact antibody, preferably comprising the antigen-binding region thereof. In some embodiments, the antibody fragment described herein is an antigen-binding fragment. Examples of antibody fragments include, but are not limited to Fab, Fab′, F (ab′) 2 and Fv fragments; diabodies; linear antibodies (see U.S. Pat. No. 5,641,870, Example 2; Zapata et al., Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 (1995) ) ; single-chain antibody (scFv) molecules; single-domain antibodies (such as VHH) , and multispecific antibodies formed from antibody fragments. Papain digestion of antibodies produced two identical antigen-binding fragments, called “Fab” fragments, and a residual “Fc” fragment, a designation reflecting the ability to crystallize readily. The Fab fragment consists of an entire L chain along with the variable domain of the H chain (VH) , and the first constant domain of one heavy chain (CH1) . Each Fab fragment is monovalent with respect to antigen binding, i.e., it has a single antigen-binding site. Pepsin treatment of an antibody yields a single large F (ab′) 2 fragment that roughly corresponds to two disulfide linked Fab fragments having different antigen-binding activity and is still capable of cross-linking antigen. Fab′fragments differ from Fab fragments by having a few additional residues at the carboxy-terminus of the CH1 domain including one or more cysteines from the antibody hinge region. Fab′-SH is the designation herein for Fab′in which the cysteine residue (s) of the constant domains bear a free thiol group. F (ab′) 2 antibody fragments originally were produced as pairs of Fab′fragments, which have hinge cysteines between them. Other chemical couplings of antibody fragments are also known.

[0055] “Single-chain Fv” or “scFv” antibody fragments comprise the VH and VL domains of antibody, wherein these domains are present in a single polypeptide chain. Generally, the scFv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains, which enables the scFv to form the desired structure for antigen binding. For a review of scFv, see, e.g., Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. Springer Berlin Heidelberg, 1994.269-315.

[0056] The term “hypervariable region, ” “HVR, ” or “HV, ” when used herein refers to the regions of an antibody variable domain, which are hypervariable in sequence, and / or form structurally defined loops. Generally, single-domain antibodies comprise three HVRs (or CDRs) : HVR1 (or CDR1) , HVR2 (or CDR2) , and HVR3 (or CDR3) . HVR3 (or CDR3) displays the most diversity of the three HVRs, and is believed to play a unique role in conferring fine specificity to antibodies. See, e.g., Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993) ; Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996) .

[0057] The term “Complementarity Determining Region” or “CDR” are used to refer to hypervariable regions as defined by the Kabat system. See Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)

[0058] A number of HVR delineations are in use and are encompassed herein. The Kabat Complementarity Determining Regions (CDRs) are based on sequence variability and are the most commonly used (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . Chothia refers instead to the location of the structural loops (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) ) . The AbM HVRs represent a compromise between the Kabat HVRs and Chothia structural loops, and are used by Oxford Molecular's AbM antibody modeling software. The “contact” HVRs are based on an analysis of the available complex crystal structures. The residues from each of these HVRs are noted below in Table 1. Table 1. HVR delineations.

[0059] HVRs may comprise “extended HVRs” as follows: 24-36 or 24-34 (L1) , 46-56 or 50-56 (L2) and 89-97 or 89-96 (L3) in the VL and 26-35 (H1) , 50-65 or 49-65 (H2) and 93-102, 94-102, or 95-102 (H3) in the VH. The variable domain residues are numbered according to Kabat et al., supra, for each of these definitions.

[0060] The expression “variable-domain residue-numbering as in Kabat” or “amino-acid-position numbering as in Kabat, ” and variations thereof, refers to the numbering system used for heavy-chain variable domains or light-chain variable domains of the compilation of antibodies in Kabat et al., supra. Using this numbering system, the actual linear amino acid sequence may contain fewer or additional amino acids corresponding to a shortening of, or insertion into, a FR or HVR of the variable domain. For example, a heavy-chain variable domain may include a single amino acid insert (residue 52a according to Kabat) after residue 52 of H2 and inserted residues (e.g. residues 82a, 82b, and 82c, etc. according to Kabat) after heavy-chain FR residue 82. The Kabat numbering of residues may be determined for a given antibody by alignment at regions of homology of the sequence of the antibody with a “standard” Kabat numbered sequence.

[0061] Unless indicated otherwise herein, the numbering of the residues in an immunoglobulin heavy chain is that of the EU index as in Kabat et al., supra. The “EU index as in Kabat” refers to the residue numbering of the human IgG1 EU antibody.

[0062] “Framework” or “FR” residues are those variable-domain residues other than the HVR residues as herein defined.

[0063] The term “Fc region” or “fragment crystallizable region” herein is used to define a C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, including native-sequence Fc regions and variant Fc regions. Although the boundaries of the Fc region of an immunoglobulin heavy chain might vary, the human IgG heavy-chain Fc region is usually defined to stretch from an amino acid residue at position Cys226, or from Pro230, to the carboxyl-terminus thereof. The C-terminal lysine (residue 447 according to the EU numbering system) of the Fc region may be removed, for example, during production or purification of the antibody, or by recombinantly engineering the nucleic acid encoding a heavy chain of the antibody. Accordingly, a composition of intact antibodies may comprise antibody populations with all K447 residues removed, antibody populations with no K447 residues removed, and antibody populations having a mixture of antibodies with and without the K447 residue. Suitable native-sequence Fc regions for use in the antibodies described herein include human IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B) , IgG3 and IgG4.

[0064] As use herein, the term “binds” , “specifically binds to” or is “specific for” refers to measurable and reproducible interactions such as binding between a target and a ligand, which is determinative of the presence of the target in the presence of a heterogeneous population of molecules including biological molecules. For example, a ligand that binds to or specifically binds to a target is a ligand that binds this target with greater affinity, avidity, more readily, and / or with greater duration than it binds to other targets. The extent of binding of a ligand to an unrelated target may be less than about 10%of the binding of the ligand to the target as measured, e.g., by a radioimmunoassay (RIA) . In certain embodiments, a ligand that specifically binds to a target has a dissociation constant (Kd) of ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, or ≤ 0.1 nM. In certain embodiments, a ligand specifically binds to a region on a protein that is conserved among the proteins from different species. In another embodiment, specific binding can include, but does not require exclusive binding.

[0065] “Percent (%) amino acid sequence identity” and “homology” with respect to a polypeptide sequence are defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical with the amino acid residues in the specific polypeptide sequence, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved in various ways that are within the skill in the art, for instance, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or MEGALIGNTM(DNASTAR) software. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared. For example, polypeptides having at least 70%, 85%, 90%, 95%, 98%or 99%identity to specific polypeptides described herein and preferably exhibiting substantially the same functions, as well as polynucleotide encoding such polypeptides, are contemplated.

[0066] As used herein, the term “express” refers to transcription of a DNA to an RNA (e.g., mRNA) , or translation of a nucleic acid into a protein. Proteins may be expressed and remain intracellular, become a component of the cell surface membrane, or be secreted into extracellular matrix or medium.

[0067] As used herein, the term “overexpress” generally refers to any amount greater than an expression level exhibited by a reference standard. The terms “overexpress, ” “overexpressing, ” “overexpressed” and “overexpression” in the present disclosure refer an expression of a gene product or a polypeptide at a level greater than the expression of the same gene product or polypeptide prior to a genetic alteration of the host cell or in a comparable host which has not been genetically altered at defined conditions. If a host cell does not comprise a given gene product, it is possible to introduce the gene product into the host cell for expression; in this case, any detectable expression is encompassed by the term “overexpression. ”

[0068] Nucleic acid is “operably linked” when it is placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, DNA for a presequence or secretory leader is operably linked to DNA for a polypeptide if it is expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; or a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it is positioned so as to facilitate translation. Generally, “operably linked” means that the DNA sequences being linked are contiguous, and, in the case of a secretory leader, contiguous and in reading phase. However, enhancers do not have to be contiguous. Linking is accomplished by ligation at convenient restriction sites. If such sites do not exist, the synthetic oligonucleotide adaptors or linkers are used in accordance with conventional practice.

[0069] The term “vector, ” as used herein, refers to a nucleic acid molecule capable of propagating another nucleic acid to which it is linked. The term includes the vector as a self-replicating nucleic acid structure as well as the vector incorporated into the genome of a host cell into which it has been introduced. Certain vectors are capable of directing the expression of nucleic acids to which they are operatively linked. Such vectors are referred to herein as “expression vectors. ”

[0070] The term “transfected” or “transformed” or “transduced” as used herein refers to a process by which exogenous nucleic acid is transferred or introduced into the host cell. A “transfected” or “transformed” or “transduced” cell is a cell, which has been transfected, transformed or transduced with exogenous nucleic acid.

[0071] As used herein, the expressions “cell” , “cell line” , and “cell culture” are used interchangeably and all such designations include progeny. Thus, the words “transfectants” and “transfected cells” include the primary subject cell and cultures derived there from without regard for the number of transfers. It is also understood that not all progeny may be precisely identical in DNA content, due to deliberate or inadvertent mutations. Variant progeny that has the same function or biological activity as screened for in the originally transformed cell are included.

[0072] “Primary cells" refer to cells taken directly from living tissue (i.e. biopsy material) and established for growth in vitro, which have undergone very few population doublings and are therefore more representative of the main functional components and characteristics of tissues from which they are derived from, in comparison to continuous tumorigenic or artificially immortalized cell lines.

[0073] The term “in vivo” refers to inside the body of the organism from which the cell is obtained. “Ex vivo” or “in vitro” means outside the body of the organism from which the cell is obtained.

[0074] As used herein, the term “autologous” refers to any material derived from the same individual to whom it is later to be re-introduced into the individual.

[0075] “Allogeneic” refers to a graft derived from a different individual of the same species.

[0076] The term “recombinant” refers to a biomolecule, e.g., a gene or protein, that (1) has been removed from its naturally occurring environment, (2) is not associated with all or a portion of a polynucleotide in which the gene is found in nature, (3) is operatively linked to a polynucleotide which it is not linked to in nature, or (4) does not occur in nature. The term “recombinant” can be used in reference to cloned DNA isolates, chemically synthesized polynucleotide analogs, or polynucleotide analogs that are biologically synthesized by heterologous systems, as well as proteins and / or mRNAs encoded by such nucleic acids.

[0077] As used herein, “treatment” or “treating” is an approach for obtaining beneficial or desired results including clinical results. For purposes of this disclosure, beneficial or desired clinical results include, but are not limited to, one or more of the following: alleviating one or more symptoms resulting from the disease, diminishing the extent of the disease, stabilizing the disease (e.g., preventing or delaying the worsening of the disease) , preventing or delaying the spread (e.g., metastasis) of the disease, preventing or delaying the recurrence of the disease, delay or slowing the progression of the disease, ameliorating the disease state, providing a remission (partial or total) of the disease, decreasing the dose of one or more other medications required to treat the disease, delaying the progression of the disease, increasing the quality of life, and / or prolonging survival. Also encompassed by “treatment” is a reduction of pathological consequence of the disease. The methods of the present application contemplate any one or more of these aspects of treatment.

[0078] The term “prevent, ” and similar words such as “prevented, ” “preventing” etc., indicate an approach for preventing, inhibiting, or reducing the likelihood of the recurrence of, a disease or condition, e.g., cancer. It also refers to delaying the recurrence of a disease or condition or delaying the recurrence of the symptoms of a disease or condition. As used herein, “prevention” and similar words also includes reducing the intensity, effect, symptoms and / or burden of a disease or condition prior to recurrence of the disease or condition.

[0079] As used herein, “delaying” the development of a disease means to defer, hinder, slow, retard, stabilize, and / or postpone development of the disease. This delay can be of varying lengths of time, depending on the history of the disease and / or individual being treated. A method that “delays” development of a disease is a method that reduces probability of disease development in a given time frame and / or reduces the extent of the disease in a given time frame, when compared to not using the method. Such comparisons are typically based on clinical studies, using a statistically significant number of individuals. Disease development can be detectable using standard methods, including, but not limited to, computerized axial tomography (CAT Scan) , Magnetic Resonance Imaging (MRI) , abdominal ultrasound, clotting tests, arteriography, or biopsy. Development may also refer to disease progression that may be initially undetectable and includes occurrence, recurrence, and onset.

[0080] The term “effective amount” used herein refers to an amount of an agent sufficient to treat a specified disorder, condition or disease such as ameliorate, palliate, lessen, and / or delay one or more of its symptoms. In reference to cancer, an effective amount comprises an amount sufficient to cause a tumor to shrink and / or to decrease the growth rate of the tumor (such as to suppress tumor growth) or to prevent or delay other unwanted cell proliferation. In some embodiments, an effective amount is an amount sufficient to delay development. In some embodiments, an effective amount is an amount sufficient to prevent or delay recurrence. An effective amount can be administered in one or more administrations. The effective amount of the drug or composition may: (i) reduce the number of cancer cells; (ii) reduce tumor size; (iii) inhibit, retard, slow to some extent and preferably stop cancer cell infiltration into peripheral organs; (iv) inhibit (i.e., slow to some extent and preferably stop) tumor metastasis; (v) inhibit tumor growth; (vi) prevent or delay occurrence and / or recurrence of tumor; and / or (vii) relieve to some extent one or more of the symptoms associated with the cancer.

[0081] As used herein, an “individual” or a “subject” refers to a mammal, including, but not limited to, human, bovine, horse, feline, canine, rodent, or primate. In some embodiments, the individual is a human.

[0082] It is understood that embodiments of the present application described herein include “consisting” and / or “consisting essentially of” embodiments.

[0083] Reference to “about” a value or parameter herein includes (and describes) variations that are directed to that value or parameter per se. For example, description referring to “about X” includes description of “X” .

[0084] As used herein, reference to “not” a value or parameter generally means and describes “other than” a value or parameter. For example, the method is not used to treat cancer of type X means the method is used to treat cancer of types other than X.

[0085] The term “about X-Y” used herein has the same meaning as “about X to about Y. ”

[0086] As used herein and in the appended claims, the singular forms “a” , “an” , and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise.

[0087] The term “and / or” as used herein a phrase such as “Aand / or B” is intended to include both A and B; A or B; A (alone) ; and B (alone) . Likewise, the term “and / or” as used herein a phrase such as “A, B, and / or C” is intended to encompass each of the following embodiments: A, B, and C; A, B, or C; A or C; A or B; B or C; A and C; A and B; B and C; A (alone) ; B (alone) ; and C (alone) .

[0088] It will be understood by one of ordinary skill in the art that uracil and thymine can both be represented by ‘t’ , instead of ‘u’ for uracil and ‘t’ for thymine; in the context of a ribonucleic acid, it will be understood that ‘t’ is used to represent uracil unless otherwise indicated. II. Engineered Cells Expressing a LAIR-1 Binding Agent

[0089] In one aspect, the present application provides an engineered cell comprising a nucleic acid encoding an agent which binds to (e.g., activates) LAIR-1. LAIR-1 is an inhibitory receptor found on the peripheral mononuclear cells, including NK cells, T cells, B cells, macrophages, and dendritic cells. The LAIR-1 gene is a member of both the immunoglobulin superfamily and the leukocyte-associated inhibitory receptor family. The gene maps to a region of 19q13.4 called the leukocyte receptor cluster, which contains at least 29 genes encoding leukocyte-expressed receptors of the immunoglobulin superfamily.

[0090] In some embodiments, the engineered cell is an immune cell, such as an immune cell selected from the group of T cell, NK cell, B cell, macrophage, and cytokine-induced killer (CIK) cell. In some embodiments, the engineered cell is a stem cell (such as embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells (iPSCs) , or hematopoietic stems cells (HSCs)) or a cell differentiated therefrom.

[0091] In some embodiments, the agent is bound to the cell membrane of the engineered cell, for example via a transmembrane domain or a membrane anchor.

[0092] In some embodiments, the engineered cell further comprises a second nucleic acid encoding an engineered receptor (such as CAR, for example an anti-GPRC5D CAR) . In some embodiments, the engineered cell is further modified to have a reduced expression and / or function of LAIR-1 (e.g., a LAIR-1 knockout) as compared to an engineered cell that is not modified.

[0093] In some embodiments, the agent that binds to (e.g., activates) LAIR-1 is derived from a RIFIN molecule. For example, in some embodiments, there is provided an engineered cell comprising a nucleic acid encoding an agent which binds to LAIR-1, wherein the agent that binds to LAIR-1 is derived from a RIFIN molecule. In some embodiments, the RIFIN molecule is selected from the group consisting of RIFIN2, RIFIN6, RIFIN7, and RIFIN8. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN molecule comprises one or more variable regions of the RIFIN molecule. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN molecule further comprises a membrane anchoring sequence, such as a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchoring sequence. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN molecule comprises a transmembrane domain, such as the transmembrane domain of the RIFIN molecule. In some embodiment, the agent derived from the RIFIN molecule comprise (e.g., is) a full length RIFIN protein. In an alternative embodiment, the agent derived from the RIFIN molecule comprises a truncated RIFIN molecule. For example, the agent in some embodiments does not comprise an intracellular domain, such as the intracellular domain of RIFIN. In some embodiments, the nucleic acid further encodes a signaling peptide. In some embodiments, the engineered cell is an immune cell, such as an immune cell selected from the group of T cell, NK cell, B cell, macrophage, and CIK cell. In some embodiments, the engineered cell further comprises a second nucleic acid encoding an engineered receptor (such as CAR, for example an anti-GPRC5D CAR) . In some embodiments, the engineered cell is further modified to have a reduced expression and / or function of LAIR-1 (e.g., a LAIR-1 knockout) as compared to an engineered cell that is not modified.

[0094] In some embodiments, there is provided an engineered cell comprising a nucleic acid encoding an agent which binds to LAIR-1, wherein the agent that binds to LAIR-1 is derived from a RIFIN2 molecule. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN2 molecule comprises one or more variable regions of the RIFIN2 molecule. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN2 molecule further comprises a membrane anchoring sequence, such as a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchoring sequence. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN2 molecule comprises a transmembrane domain, such as the transmembrane domain of the RIFIN2 molecule. In some embodiment, the agent derived from the RIFIN2 molecule comprise (e.g., is) a full length RIFIN2 protein. In an alternative embodiment, the agent derived from the RIFIN2 molecule does not comprise an intracellular domain, such as the intracellular domain of RIFIN2. In some embodiments, the nucleic acid further encodes a signaling peptide (e.g., a signal peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27) . In some embodiments, the nucleic acid encodes an agent having the amino acid sequence having at least 80% (such as at least any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 54 or 56. In some embodiments, the engineered cell is an immune cell, such as an immune cell selected from the group of T cell, NK cell, B cell, macrophage, and CIK cell. In some embodiments, the engineered cell further comprises a second nucleic acid encoding an engineered receptor (such as CAR, for example an anti-GPRC5D CAR) . In some embodiments, the engineered cell is further modified to have a reduced expression and / or function of LAIR-1 (e.g., a LAIR-1 knockout) as compared to an engineered cell that is not modified.

[0095] In some embodiments, there is provided an engineered cell comprising a nucleic acid encoding an agent which binds to LAIR-1, wherein the agent that binds to LAIR-1 is derived from a RIFIN6 molecule. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN6 molecule comprises one or more variable regions of the RIFIN6 molecule. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN6 molecule further comprises a membrane anchoring sequence, such as a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor sequence. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN6 molecule comprises a transmembrane domain, such as the transmembrane domain of the RIFIN6 molecule. In some embodiment, the agent derived from the RIFIN6 molecule comprise (e.g., is) a full length RIFIN6 protein. In an alternative embodiment, the agent derived from the RIFIN6 molecule does not comprise an intracellular domain, such as the intracellular domain of RIFIN6. In some embodiments, the nucleic acid further encodes a signaling peptide (e.g., a signal peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27) . In some embodiments, the nucleic acid encodes an agent having the amino acid sequence having at least 80% (such as at least any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 9, 11, and 13. In some embodiments, the engineered cell is an immune cell, such as an immune cell selected from the group of T cell, NK cell, B cell, macrophage, and CIK cell. In some embodiments, the engineered cell further comprises a second nucleic acid encoding an engineered receptor (such as CAR, for example an anti-GPRC5D CAR) . In some embodiments, the engineered cell is further modified to have a reduced expression and / or function of LAIR-1 (e.g., a LAIR-1 knockout) as compared to an engineered cell that is not modified.

[0096] In some embodiments, there is provided an engineered cell comprising a nucleic acid encoding an agent which binds to LAIR-1, wherein the agent that binds to LAIR-1 is derived from a RIFIN7 molecule. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN7 molecule comprises one or more variable regions of the RIFIN7 molecule. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN7 molecule further comprises a membrane anchoring sequence, such as a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchoring sequence. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN7 molecule comprises a transmembrane domain, such as the transmembrane domain of the RIFIN7 molecule. In some embodiment, the agent derived from the RIFIN7 molecule comprise (e.g., is) a full length RIFIN7 protein. In an alternative embodiment, the agent derived from the RIFIN7 molecule does not comprise an intracellular domain, such as the intracellular domain of RIFIN7. In some embodiments, the nucleic acid further encodes a signaling peptide (e.g., a signal peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58) . In some embodiments, the nucleic acid encodes an agent having the amino acid sequence having at least 80% (such as at least any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 55 or 57. In some embodiments, the engineered cell is an immune cell, such as an immune cell selected from the group of T cell, NK cell, B cell, macrophage, and CIK cell. In some embodiments, the engineered cell further comprises a second nucleic acid encoding an engineered receptor (such as CAR, for example an anti-GPRC5D CAR) . In some embodiments, the engineered cell is further modified to have a reduced expression and / or function of LAIR-1 (e.g., a LAIR-1 knockout) as compared to an engineered cell that is not modified.

[0097] In some embodiments, there is provided an engineered cell comprising a nucleic acid encoding an agent which binds to LAIR-1, wherein the agent that binds to LAIR-1 is derived from a RIFIN8 molecule. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN8 molecule comprises one or more variable regions of the RIFIN8 molecule. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN8 molecule further comprises a membrane anchoring sequence, such as a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchoring sequence. In some embodiments, the agent derived from the RIFIN8 molecule comprises a transmembrane domain, such as the transmembrane domain of the RIFIN8 molecule. In some embodiment, the agent derived from the RIFIN8 molecule comprise (e.g., is) a full length RIFIN8 protein. In an alternative embodiment, the agent derived from the RIFIN8 molecule does not comprise an intracellular domain, such as the intracellular domain of RIFIN8. In some embodiments, the nucleic acid further encodes a signaling peptide. In some embodiments, the nucleic acid further encodes a signaling peptide (e.g., a signal peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28) . In some embodiments, the nucleic acid encodes an agent having the amino acid sequence having at least 80% (such as at least any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 10, 12, and 14. In some embodiments, the engineered cell is an immune cell, such as an immune cell selected from the group of T cell, NK cell, B cell, macrophage, and CIK cell. In some embodiments, the engineered cell further comprises a second nucleic acid encoding an engineered receptor (such as CAR, for example an anti-GPRC5D CAR) . In some embodiments, the engineered cell is further modified to have a reduced expression and / or function of LAIR-1 (e.g., a LAIR-1 knockout) as compared to an engineered cell that is not modified.

[0098] In some embodiments, there is provided an engineered cell comprising a nucleic acid encoding an agent which binds to LAIR-1, wherein the agent that binds to LAIR-1 is derived from a RIFIN1 molecule. In some embodiment, the agent derived from the RIFIN1 molecule comprise (e.g., is) a full length RIFIN1 protein. In some embodiments, the nucleic acid further encodes a signaling peptide. In some embodiments, the nucleic acid further encodes a signaling peptide (e.g., a signal peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO:26) . In some embodiments, the nucleic acid encodes an agent having the amino acid sequence having at least 80% (such as at least any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 1 or 8. In some embodiments, the engineered cell is an immune cell, such as an immune cell selected from the group of T cell, NK cell, B cell, macrophage, and CIK cell. In some embodiments, the engineered cell further comprises a second nucleic acid encoding an engineered receptor (such as CAR, for example an anti-GPRC5D CAR) . In some embodiments, the engineered cell is further modified to have a reduced expression and / or function of LAIR-1 (e.g., a LAIR-1 knockout) as compared to an engineered cell that is not modified.

[0099] In some embodiments, the agent that binds to LAIR-1 comprises an anti-LAIR-1 antibody or an antigen binding fragment thereof. For example, in some embodiments, there is provided an engineered cell comprising a nucleic acid encoding an agent that binds to LAIR-1 comprises an anti-LAIR-1 antibody or an antigen binding fragment thereof. In some embodiments, the agent that binds to LAIR-1 comprises an anti-LAIR-1 agonist antibody or an antigen binding fragment thereof. In some embodiment, the anti-LAIR-1 antibody or antigen binding fragment thereof is a scFv, a Fab, a sdAb, or a full-length antibody. In some embodiments, the agent comprising the anti-LAIR-1 antibody or antigen binding fragment thereof further comprises a membrane anchoring sequence, such as a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchoring sequence. In some embodiments, the agent comprising the anti-LAIR-1 antibody or antigen binding fragment thereof comprises a transmembrane domain, such as a CD28 transmembrane domain. In some embodiments, the agent comprising the anti-LAIR-1 antibody or antigen binding fragment thereof further comprises a hinge domain, such as a CD28 hinge domain. In some embodiments, the agent comprising an anti-LAIR-1 antibody or antigen binding fragment thereof does not comprise an intracellular domain. In some embodiments, the nucleic acid further encodes a signaling peptide. In some embodiments, the nucleic acid further encodes a signaling peptide (e.g., a signal peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29) . In some embodiments, the nucleic acid encodes an agent having the amino acid sequence having at least 80% (such as at least any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 15 or 16. In some embodiments, the engineered cell is an immune cell, such as an immune cell selected from the group of T cell, NK cell, B cell, macrophage, and CIK cell. In some embodiments, the engineered cell further comprises a second nucleic acid encoding an engineered receptor (such as CAR, for example an anti-GPRC5D CAR) . In some embodiments, the engineered cell is further modified to have a reduced expression and / or function of LAIR-1 (e.g., a LAIR-1 knockout) as compared to an engineered cell that is not modified. A. Agents that bind to LAIR-1

[0100] The engineered cells described herein comprise a nucleic acid encoding an agent that binds to LAIR-1. The agent in some embodiments activates LAIR-1. The present application in one aspect provides any of the agents described herein. For example, in some embodiments, there is provided an agent that binds to LAIR-1 on an effector immune cell, wherein the agent activates LAIR-1.

[0101] Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 (LAIR-1) is an inhibitory receptor on immune cells. The binding of the agent to LAIR-1 can be determined, for example, by affinity measurement, co-immunoprecipitation, FACS, and EM analysis. The effect of the agents on LAIR-1 can be analyzed, for example, by incubating the engineered cells with target cells (e.g., effector cells) expressing LAIR-1. The activity of LAIR-1 can be assessed by methods known in the art, including for example phosphatase inhibition assay, cell proliferation assay, and cytokine release assay. Agent derived from a RIFIN molecule

[0102] In some embodiments, the agent that binds to LAIR-1 is derived from a RIFIN molecule. RIFINs, or Repetitive Interspersed Family of Polypeptides, are a group of Plasmodium variant surface antigens which play a crucial role in malaria pathogenesis by mediating immune suppression through activation of inhibitory receptors such as LAIR-1 (Xu et al., Nature Communications 12, 4226 (2021) , which is hereby incorporated herein by reference in its entirety) . In addition to proteins, which are classified as RIFINs, the skilled person may easily determine whether any (unknown) protein is a RIFIN by use of appropriate computer programs, for example “RSpred” , which is freely accessible under http:  / / www. bioinfo. ifm. liu. se / and described by Joannin N. et al., 2011: RSpred, a set of Hidden Markov Models to detect and classify the RIFIN and STEVOR proteins of Plasmodium falciparum. BMC genomics 12: 119, which are hereby incorporated herein by reference in their entirety. RIFINs carry a semi-conserved domain and cysteine-rich regions at the N-terminus, while the C-terminal half is highly polymorphic. RIFINs are described as small polypeptides comprising (in the direction from N-to C-terminus) : (1) a putative signal peptide (SP) , (2) a first variable domain (V1) , (3) a plasmodium export element (PEXEL) , (4) an N-terminal semi-conserved domain (C1, also referred to as “constant region 1” ) , (5) a hydrophobic patch, (6) a second variable domain, also known as hypervariable domain (V2) , (7) a transmembrane domain, and (8) a C-terminal conserved domain (C2) as described for example by Joannin N. et al., 2008, BMC genomics 9: 19 (FIG. 1 and corresponding description) , by Templeton T. J., 2009, Molecular &Biochemical Parasitology 166: 109-116 and by Xu et al., Nature Communications 12, 4226 (2021) , each of which is hereby incorporated herein by reference in their entirety. By using this literature, the skilled person can easily assign the above protein domains (1) - (8) to any RIFIN. Moreover, the skilled person is also aware of databases for protein domain prediction, for example “NCBI conserved domain search” (www. ncbi. nlm. nih. gov / Structure / cdd / wrpsb. cgi) , “SMART” (smartembl-heidelberg. de / ) , InterPro protein (www. ebi. ac. uk / interpro / ) , “PredictProtein” (https:  / / www. predictprotein. org / ) , and the like, each of which is hereby incorporated herein by reference in their entirety. The second variable domain (V2) comprises approximately 170 polymorphic residues and is predicted to be exposed on the cell surface (i.e. extracellular localization) . V2 is responsible for the binding of RIFIN to LAIR-1. The skilled person can easily recognize RIFIN molecules that bind LAIR-1, e.g., according to the method disclosed by Xu et al., Nature Communications 12, 4226 (2021) , which is hereby incorporated herein by reference in their entirety. Residues on RIFIN involved in binding LAIR-1 included, for example, C254, S255, A256, T257 on loop α4-α5, C265, V266, R268 on α5, and P275, M281 on loop α5-α6 (Xu et al., Nature Communications 12, 4226 (2021)) .

[0103] In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule comprises variable domain 2 of the RIFIN molecule. In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule comprises a variant of a RIFIN molecule, for example comprising a variant of variable domain 2 of the RIFIN molecule. Variant of variable domain 2 of a RIFIN molecule can contain no more than any of 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1 amino acid variations relative to a corresponding wildtype RIFIN variable domain 2. In some embodiments, the variant of variable domain 2 of a RIFIN molecule has an amino acid sequence that is at least about 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to the corresponding wild type RIFIN molecule. In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule comprises one or more amino acid residues selected from the group consisting of: D247, C254, S255, A256, T257, C265, V266, R268, P275, and M281, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 57. In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule comprises C254 and C265, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 57. In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule comprises one, two, three, or four residues selected from the group consisting of D247, C254, C265, and R268. In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule comprises one, two, or three residues selected from the group consisting of C254, C265, and R268. RIFIN molecules shown to interact with LAIR-1 are reported in Xu et al., which is specifically incorporated by reference herein in its entirety, and can be used for making the agents described herein.

[0104] In some embodiments, the agent is derived from a RIFIN molecule selected from the group consisting of RIFIN2 (SEQ ID NO: 54 or 56) , RIFIN6 (SEQ ID NO: 2 or 9) , RIFIN7 (SEQ ID NO: 55 or 57) , and RIFIN8 (SEQ ID NO: 3 or 10) .

[0105] In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule described herein can further comprises one or more other domains of a RIFIN molecule, including, but not limited to, variable domain 1, PEXEL motif, Conserved domain 1, Indel motif, transmembrane domain, and conserved domain 2.

[0106] In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule is secreted. In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule is bound to the cell membrane of the engineered cell by a transmembrane domain or a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchoring sequence. For example, in some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule comprises a transmembrane domain of the RIFIN molecule. In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule comprises a transmembrane domain that is not derived from a RIFIN molecule. In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule comprises a transmembrane domain that is derived from OX40, NKG2D, DAP12, CD40, CD55, or CD8. In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule comprises a membrane anchoring sequence, for example for attaching to a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor.

[0107] In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule comprises an intracellular domain (e.g., conserved domain 2 of RIFIN) . In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule does not comprise a functional intracellular domain (e.g., is completely devoid of an intracellular domain) .

[0108] In some embodiments, the agent derived from a RIFIN molecule comprises a signal peptide at the N-terminus. Suitable signal peptides include, for example, the signal peptide of RIFIN1 (SEQ ID NO: 26) , signal peptide of RIFIN6 (SEQ ID NO: 27) , signal peptide of RIFIN8 (SEQ ID NO: 28) , or signal peptide of RIFIN7 (SEQ ID NO: 58) . In some embodiments, the signal peptide is derived from CD8α (e.g., SEQ ID NO: 29) .

[0109] In some embodiments, the agent derived from an RIFIN molecule comprises an amino acid sequence having at least about 80% (such as at least about any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 1-14 and 54-57. In some embodiments, the agent that binds to LAIR-1 comprises any of the RIFIN molecules described herein. The agent described herein may further comprise an HLA-E (e.g., an HLA-E single chain trimer) . Anti-LAIR-1 agonist antibody and antigen binding fragment thereof

[0110] In some embodiments, the agent that binds to LAIR-1 comprises an anti-LAIR-1 agonist antibody or an antigen binding fragment thereof, such as an scFv, a Fv, a Fab, a (Fab’ ) 2, a single domain antibody (sdAb) , or a VHH domain. In some embodiments, the anti-LAIR-1 agonist antibody or antigen binding fragment thereof is a full length antibody. In some embodiments, the anti-LAIR-1 agonist antibody or antigen binding fragment thereof is an scFv. In some embodiments, the anti-LAIR-1 agonist antibody or antigen binding fragment thereof is a Fab. In some embodiments, the anti-LAIR-1 agonist antibody or antigen binding fragment thereof is a sdAb.

[0111] Anti-LAIR-1 agonist antibodies are known in the art and have been disclosed in, for example, WO2018 / 126259, which is incorporated by reference herein specifically. In some embodiments, the anti-LAIR-1 agonist antibody or antigen binding fragment thereof comprises (a) a heavy chain variable domain comprising an HCDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, an HCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and an HCDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; and (b) a light chain variable domain comprising a LCDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, a LCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and a LCDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the anti-LAIR-1 agonist antibody or antigen binding fragment thereof comprises a VH domain having the amino acid sequence having at least 80% (such as at least any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 23 and a VL domain having the amino acid sequence having at least 80% (such as at least any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the anti-LAIR-1 agonist antibody comprises an scFv having the amino acid sequence having at least 80% (such as at least any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO:25.

[0112] In some embodiments, the agent comprising an anti-LAIR-1 agonist antibody or an antigen binding fragment thereof is secreted. In some embodiments, the agent comprising an anti-LAIR-1 agonist antibody or an antigen binding fragment thereof is bound to the cell membrane of the engineered cell by a transmembrane domain or a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. In some embodiments, the agent comprising an anti-LAIR-1 agonist antibody or an antigen binding fragment thereof comprises a transmembrane domain that is derived from OX40, NKG2D, DAP12, CD40, CD55, or CD8. In some embodiments, the agent comprising an anti-LAIR-1 agonist antibody or an antigen binding fragment thereof comprises a transmembrane domain of CD28 (e.g., SEQ ID NO: 31) . In some embodiments, the agent comprising an anti-LAIR-1 agonist antibody or an antigen binding fragment thereof comprises a membrane anchoring sequence, for example for attaching to a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. In some embodiments, the agent comprising an anti-LAIR-1 agonist antibody or an antigen binding fragment thereof further comprises a hinge domain between anti-LAIR-1 agonist antibody or an antigen binding fragment thereof and the transmembrane domain or membrane anchoring domain. In some embodiments, the hinge domain is derived from CD28 (e.g., SEQ ID NO: 30) .

[0113] In some embodiments, the agent comprising an anti-LAIR-1 agonist antibody or an antigen binding fragment thereof comprises an intracellular domain. In some embodiments, the agent comprising an anti-LAIR-1 agonist antibody or an antigen binding fragment thereof does not comprise a functional intracellular domain (e.g., is completely devoid of an intracellular domain) .

[0114] In some embodiments, the agent comprising an anti-LAIR-1 agonist antibody or an antigen binding fragment thereof comprises a signal peptide at the N-terminus. In some embodiments, the signal peptide is derived from CD8α (e.g., SEQ ID NO: 29) .

[0115] In some embodiments, the agent comprising an anti-LAIR-1 agonist antibody or an antigen binding fragment thereof comprises an amino acid sequence of any having at least about 80% (such as at least about any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO. 16. B. Engineered receptors

[0116] The engineered cells described herein may further express one or more engineered receptors. In some embodiments, the engineered receptor comprises i) an extracellular antigen binding domain specifically recognizing a target antigen, and ii) a transmembrane domain. In some embodiments, the engineered receptor is a chimeric antigen receptor (CAR) , an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric TCR (cTCR) , a T cell antigen coupler (TAC) , or a TAC-like engineered receptor.

[0117] In some embodiments, the engineered receptor is encoded by a heterologous nucleic acid operably linked to a promoter (such as a constitutive promoter or an inducible promoter) . The engineered cells thus in some embodiments comprise a second nucleic acid encoding an engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is introduced to the engineered immune cell by inserting proteins into the cell membrane while passing cells through a microfluidic system, such as CELL  (see, for example, U.S. Patent Application Publication No. 20140287509) . The engineered receptor may enhance the function of the engineered cells, such as by targeting the engineered cells (e.g., engineered immune cells) , by transducing signals, and / or by enhancing cytotoxicity of the engineered cells (e.g., engineered immune cells) .

[0118] In some embodiment, the engineered receptor comprises a binding domain that specifically binds to a tumor antigen. In some embodiments, the tumor antigen is selected from the group consisting of CD19, BCMA, Claudin 18.2, NY-ESO-1, VEGFR2, MAGE-A3, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA, EGFR, GD2, HER2, IGF1R, mesothelin, PSMA, ROR1, GPC3, DLL3, GPRC5D, CLL1, WT1 and combinations thereof.

[0119] In some embodiments, the engineered receptor comprises a binding domain that specifically binds to GPRC5D. In some embodiments, the engineered receptor comprises an antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds to GPRC5D. In some embodiments, the anti-GPRC5D antibody or antigen binding fragment thereof comprises (a) a heavy chain variable domain comprising an HCDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, an HCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and an HCDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; and (b) a light chain variable domain comprising a LCDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, a LCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a LCDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37. In some embodiments, the anti-GPRC5D antibody or antigen binding fragment thereof comprises a VH domain having the amino acid sequence having at least 80% (such as at least any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 38 and a VL domain having the amino acid sequence having at least 80%(such as at least any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 39. In some embodiments, the anti-GPRC5D antibody comprises an scFv having the amino acid sequence having at least 80% (such as at least any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 40.Chimeric Antigen Receptor (CAR)

[0120] In some embodiments, the engineered receptor is a CAR, such as any CAR known in the art or described herein. In some embodiments, the CAR comprises i) an extracellular antigen binding domain specifically recognizing a target antigen, ii) a transmembrane domain, and iii) an intracellular signaling domain (e.g., derived from CD3ζ) . In some embodiments, the CAR comprises from N-terminus to C-terminus: (a) an extracellular antigen binding domain; (b) an optional hinge domain; (c) a transmembrane domain; (d) an optional intracellular co-stimulatory signaling domain; and (e) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the CAR comprises from N-terminus to C-terminus: (a) an extracellular antigen binding domain; (b) an optional hinge domain; (c) a transmembrane domain; (d) an intracellular signaling domain; and (e) an optional intracellular co-stimulatory signaling domain. The extracellular antigen binding domain of the CAR may be selected from the group consisting of a Fab, a Fab’ , a (Fab’ ) 2, an Fv, an scFv, an sdAb, and a peptide ligand specifically binding to the target antigen, or a combination thereof. The extracellular antigen binding domain can be monospecific or multispecific.

[0121] In some embodiments, the engineered cell comprises a second nucleic acid encoding a CAR. Many CARs targeting different tumor antigens known in the field can be used herein, such as CAR targeting GPRC5D. CARs that can be used herein include, but are not limited to, those described in WO2013123061, WO2016100232, WO2019028051, and WO2019126724, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety. Extracellular antigen binding domain

[0122] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain of the CAR comprises an antibody moiety specifically recognizing a target epitope or antigen. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain recognizes a tumor associated antigen, including but not limited to GPRC5D, GPC2, CD7, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD70, CD123, CD228, CD138, BCMA, AFP, GPC3, CEA, Claudin 18.2, CLL1, CD33, folate receptor (FRα) , mesothelin (MSLN) , DLL3, CD276, gp100, 5T4, GD2, EGFR, MUC-1, PSMA, EpCAM, MCSP, SM5-1, MICA, MICB, NKG2D ligand, ULBP, and HER-2. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain specifically recognizes GPRC5D. Transmembrane domain

[0123] The transmembrane domain can be directly or indirectly fused to the extracellular antigen binding domain. Any protein structure that is thermodynamically stable in a cell membrane, such as a eukaryotic cell membrane, can be used as the transmembrane domain herein. The transmembrane domain may be derived either from a natural or from a synthetic source. In some embodiments, the transmembrane domain of the CAR is derived from a molecule selected from the group consisting of: an α, β or ζ chain of a TCR, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, 4-1BB (CD137) , CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18) , ICOS (CD278) , 4-1BB (CD137) , GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , CD160, Claudin-6, IL-2Rβ, IL-2Rγ, IL-7Ra, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CDIOO (SEMA4D) , SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, and NKG2C. In some embodiments, the transmembrane domain of the CAR is derived from CD8α or CD28. Hinge

[0124] The CAR of the present disclosure may comprise a hinge domain that is located between the extracellular antigen binding domain and the transmembrane domain. A hinge domain is an amino acid segment that is generally found between two domains of a protein and may allow for flexibility of the protein and movement of one or both of the domains relative to one another. Any amino acid sequence that provides such flexibility and movement of the extracellular antigen binding domain relative to the transmembrane domain of the effector molecule can be used. The hinge domain can be a peptide linker, or a hinge domain of antibodies, such as an IgG, IgA, IgM, IgE, or IgD. The hinge domain can be a hinge domain of a naturally occurring protein (e.g., derived from CD8α) , or a non-naturally occurring peptide. In some embodiments, the hinge domain between the C-terminus of the extracellular antigen binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain is derived from CD8α. Intracellular signaling domain

[0125] In some embodiments, the CAR comprises an intracellular signaling domain consisting essentially of (or consisting of) a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell. “Primary intracellular signaling domain” refers to intracellular signaling sequence that acts in a stimulatory manner to induce immune effector functions. In some embodiments, the primary intracellular signaling domain contains a signaling motif known as immunoreceptor tyrosine-based activation motif, or ITAM. An “ITAM, ” as used herein, is a conserved protein motif that is generally present in the tail portion of signaling molecules expressed in many immune cells. ITAMs within signaling molecules are important for signal transduction within the cell, which is mediated at least in part by phosphorylation of tyrosine residues in the ITAM following activation of the signaling molecule. ITAMs may also function as docking sites for other proteins involved in signaling pathways. Exemplary ITAM-containing primary intracellular signaling sequences include those derived from CD3ζ, FcεRIβ, FcεRIγ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, DAP12, CNAIP / NFAM1, STAM-1, STAM-2, Moesin, CD5, CD22, CD79a, CD79b, and CD66d (CEACAM3) . In some embodiments, the intracellular signaling domain of the CAR comprises (or consists essentially of, or consists of) an CD3ζ intracellular signaling domain. Intracellular co-stimulatory signaling domain

[0126] Many immune effector cells require co-stimulation, in addition to stimulation of an antigen-specific signal (e.g., the primary signal) , to promote cell proliferation, differentiation and survival, as well as to activate effector functions of the cell. In some embodiments, the CAR comprises at least one intracellular co-stimulatory signaling domain. The term “intracellular co-stimulatory signaling domain, ” as used herein, refers to at least a portion of a protein that mediates a secondary or co-stimulatory signal transduction within a cell to induce an immune response such as an effector function. The intracellular co-stimulatory signaling domain can act in an antigen-independent manner to provide a secondary or co-stimulatory signal to immune cells. The intracellular co-stimulatory signaling domain of the CAR can be an intracellular signaling domain from a co-stimulatory protein, which transduces a secondary or co-stimulatory signal and modulates responses mediated by immune cells, such as T cells, NK cells, macrophages, neutrophils, or eosinophils. The term "co-stimulatory molecule" refers to a cognate binding partner on an immune cell (such as T cell) that specifically binds with a co-stimulatory ligand, thereby mediating a co-stimulatory response by the immune cell, such as, but not limited to, proliferation and survival. Activation of an intracellular co-stimulatory signaling domain in a host cell (e.g., an immune cell) may induce the cell to increase or decrease the production and secretion of cytokines, phagocytic properties, proliferation, differentiation, survival, and / or cytotoxicity. The intracellular co-stimulatory signaling domain of any co-stimulatory molecule may be compatible for use in the CAR described herein. The type (s) of intracellular co-stimulatory signaling domain is selected based on factors such as the type of the immune effector cells in which the CAR would be expressed (e.g., T cells, NK cells, macrophages, neutrophils, or eosinophils) and the desired immune effector function (e.g., ADCC effect) . In some embodiments, the co-stimulatory molecule is selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137, OX40, CD40, PD-1, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, TNFRSF9, TNFRSF4, TNFRSF8, CD40LG, ITGB2, KLRC2, TNFRSF18, TNFRSF14, HAVCR1, LGALS9, DAP10, DAP12, CD83, and ligands of CD83. In some embodiments, the CAR comprises an intracellular co-stimulatory signaling domain derived from 4-1BB. Signal peptide

[0127] The CAR of the present disclosure may further comprise a signal peptide (also known as a signal sequence) at the N-terminus of the polypeptide. In general, signal peptides are peptide sequences that target a polypeptide to the desired site in a cell. In some embodiments, the signal peptide targets the engineered receptor to the secretory pathway of the cell and will allow for integration and anchoring of the CAR into the lipid bilayer. During or following translocation of the polypeptide to the cell membrane, the signal peptide may be cleaved. Signal peptides including signal sequences of naturally occurring proteins or synthetic, non-naturally occurring signal sequences, which are compatible for use in the engineered receptors described herein, will be evident to one of skill in the art. In some embodiments, the signal peptide is derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, GM-CSF receptor α, and IgG1 heavy chain. In some embodiments, the signal peptide is derived from a CD8α propeptide, e.g., human CD8α. Peptide linker

[0128] The CAR may comprise one or more peptide linkers, such as between different components of the engineered receptor (e.g., between two or more intracellular co-stimulatory signaling domains, between intracellular co-stimulatory signaling domain and primary intracellular signaling domain, or between the extracellular antigen binding domain and the transmembrane domain) , and / or within one engineered receptor component (e.g., extracellular antigen binding domain, such as within an scFv, or for connecting two or more antibody moieties in tandem) .

[0129] Each peptide linker in a CAR may have the same or different length and / or sequence depending on the structural and / or functional features of the antibody moieties and / or the various domains. Each peptide linker may be selected and optimized independently. The length, the degree of flexibility and / or other properties of the peptide linker (s) used in the engineered receptors may have some influence on properties, including but not limited to the affinity, specificity or avidity for one or more particular antigens or epitopes. The peptide linker may have a naturally occurring sequence, or a non-naturally occurring sequence. For example, a sequence derived from the hinge region of heavy chain only antibodies may be used as the linker. See, for example, WO1996 / 34103. In some embodiments, the peptide linker is a flexible linker. Exemplary flexible linkers include but not limited to glycine polymers (G) n, glycine-serine polymers, glycine-alanine polymers, alanine-serine polymers, threonine-serine, and other flexible linkers known in the art. Other linkers known in the art, for example, as described in WO2016014789, WO2015158671, WO2016102965, US20150299317, WO2018067992, US7741465, Colcher et al., J. Nat. Cancer Inst. 82: 1191-1197 (1990) , and Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) may also be included in the chimeric receptors provided herein, the disclosure of each of which is incorporated herein by reference in their entirety.

[0130] In some embodiments, the peptide linker is (GxS) n, wherein x and n independently can be an integer of at least 1, such as between 3 and 12 (e.g., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) . In some embodiments, the (GxS) n linker comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53.

[0131] In some embodiments, the CAR is an anti-GPRC5D CAR. In some embodiments, the CAR comprises an anti-GPRC5D scFv. In some embodiments, the CAR is an anit-GPRC5D CAR comprising the amino acid sequence having at least 80% (such as at least any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 46.Engineered T cell receptor (TCR)

[0132] In some embodiments, the engineered receptor is an engineered TCR. The engineered TCR may comprise i) an extracellular antigen binding domain that comprises a Vα and a Vβ (or a Vδ and a Vγ) derived from a wildtype TCR together specifically recognizing a target antigen, wherein the Vα, the Vβ, or both (or the Vδ, the Vγ, or both) , comprise one or more mutations (e.g., insertions, deletions, or substitutions, such as conservative substitutions) in one or more CDRs relative to the wild type TCR; and ii) a transmembrane domain derived from a TCR molecule (e.g., TCRα / TCRβ, or TCRδ / TCRγ) . The engineered TCR can be a single chain TCR (scTCR) or a dimeric TCR (dTCR) . The engineered TCR may bind to the same cognate peptide-MHC bound by the wildtype TCR. The engineered TCR may bind to the same cognate peptide-MHC with higher affinity compared to that bound by the wildtype TCR. The engineered TCR may bind to the same cognate peptide-MHC with lower affinity compared to that bound by the wildtype TCR. The engineered TCR may bind to a non-cognate peptide-MHC not bound by the wildtype TCR. The engineered TCR may not comprise an intracellular signaling domain (e.g., the cytoplasmic domain of TCRα, TCRβ, TCRδ, or TCRγ) . The engineered TCR may further comprise a hinge domain (or a connecting domain) between the TCR Ig-like constant domain and the TCR transmembrane domain, such as a hinge domain derived from TCRα / TCRβ or TCRδ / TCRγ.Chimeric TCR (cTCR)

[0133] In some embodiments, the engineered receptor is a chimeric T cell receptor (cTCR) . The cTCR may comprise: i) an extracellular antigen binding domain comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof (e.g., scFv, Fab, or sdAb) that specifically recognizes a target antigen, and ii) a full-length TCR subunit, wherein the TCR subunit is selected from the group consisting of TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3ε, and CD3δ; wherein the extracellular antigen binding domain is fused (directly or indirectly) to the N-terminus of the full-length TCR subunit. The cTCR may comprise an optional extracellular domain (ECD) or portion thereof derived from a TCR subunit. The cTCR can be incorporated into a functional TCR complex along with other endogenous TCR subunits and confer antigen specificity to the TCR complex. The extracellular antigen binding domain of the cTCR may be selected from the group consisting of a Fab, a Fab’ , a (Fab’ ) 2, an Fv, an scFv, and an sdAb. The cTCR extracellular antigen binding domain may be fused to the N-terminus of the full-length or a portion thereof of CD3ε, CD3γ, or CD3δ. The cTCR extracellular antigen binding domain may be fused to the N-terminus of a TCRα molecule (with or without the Vα domain) , and / or the N-terminus of a TCRβ molecule (with or without the Vβ domain) . The cTCR extracellular antigen binding domain may be fused to the N-terminus of a TCRγ molecule (with or without the Vγ domain) , and / or the N-terminus of a TCRδ molecule (with or without the Vδ domain) . The cTCR may or may not comprise an intracellular signaling domain. The cTCR may comprise an intracellular signaling domain, such as the intracellular signaling domain of CD3γ, CD3ε, or CD3δ. The cTCR intracellular signaling domain and the cTCR transmembrane domain can be derived from the same TCR subunit, e.g., both from CD3ε, both from CD3ε, or both from CD3δ. The cTCR extracellular antigen binding domain and the TCR subunit (full-length or an ECD portion thereof) can be fused via a linker (such as a GS linker) . In some embodiments, the extracellular antigen binding domain is fused to the N-terminus of the transmembrane domain via an optional linker or hinge domain. The cTCR may further comprise a hinge domain between the ECD portion derived from a first TCR subunit and a transmembrane domain derived from a second TCR subunit. In some embodiments, the cTCR comprises from N-terminus to C-terminus: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof (e.g., scFv, Fab, or sdAb) that specifically recognizes a target antigen; (b) an optional linker, (c) an optional extracellular domain of a first TCR subunit or a portion thereof, (d) an optional hinge domain, (e) a transmembrane domain derived from a second TCR subunit, and (f) an optional cytoplasmic domain (e.g., optional intracellular signaling domain) ; wherein the first and second TCR subunits are independently selected from the group consisting of TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, and CD3δ. The first and second TCR subunits can be the same or different.T cell antigen coupler (TAC)

[0134] In some embodiments, the engineered receptor is a T cell antigen coupler (TAC) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., scFv, sdAb) that specifically recognizes a target antigen; (b) an optional first linker; (c) an extracellular TCR binding domain that specifically recognizes the extracellular domain of a TCR subunit (e.g., CD3ε) ; (d) an optional second linker; (e) an optional extracellular domain derived from a first TCR co-receptor (such as CD4, CD28, or CD8) ; (f) a transmembrane comprising a transmembrane derived from a second TCR co-receptor (such as CD4, CD28, or CD8) ; and (g) an optional intracellular signaling domain comprising an intracellular signaling domain derived from a third TCR co-receptor (such as CD4, CD28, or CD8) . In some embodiments, the first, second, and third TCR co-receptors are the same (e.g., all CD4) . In some embodiments, the first, second, and third TCR co-receptors are different. For example, in some embodiments, the TAC comprises: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., scFv, sdAb) that specifically recognizes one or more epitopes of a tumor antigen; (b) an optional first linker; (c) an extracellular TCR binding domain that specifically recognizes the extracellular domain of a TCR subunit (e.g., CD3ε) ; (d) an optional second linker; and (e) a full length TCR co-receptor (e.g., CD4, CD8, or CD28) .TAC-like engineered receptor

[0135] In some embodiments, the engineered receptor is a TAC-like engineered receptor comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., scFv, sdAb) that specifically recognizes one or more epitopes of a target antigen; (b) an optional first linker; (c) an extracellular TCR binding domain that specifically recognizes the extracellular domain of a first TCR subunit; (d) an optional second linker; (e) an optional extracellular domain derived from a second TCR subunit or a portion thereof; (f) a transmembrane domain comprising a transmembrane domain derived from a third TCR subunit; and (g) an optional intracellular signaling domain comprising an intracellular signaling domain derived from a fourth TCR subunit; wherein the first, second, third, and fourth TCR subunits are all selected from the group consisting of TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, and CD3δ. In some embodiments, the first, second, third, and fourth TCR subunits are the same. In some embodiments, the second, third, and fourth TCR subunits are the same. In some embodiments, the first, second, third, and fourth TCR subunits are different. In some embodiments, the second, third, and fourth TCR subunits are the same but different from the first TCR subunit. In some embodiments, the TAC-like chimeric receptor comprises: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., scFv, sdAb) that specifically recognizes one or more epitopes of a target antigen; (b) an optional first linker; (c) an extracellular TCR binding domain that specifically recognizes the extracellular domain of a first TCR subunit; (d) an optional second linker; and (e) a full length second TCR subunit; wherein the first and second TCR subunits are both selected from the group consisting of TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, and CD3δ. In some embodiments, the first and second TCR subunits are the same. In some embodiments, the first and second TCR subunits are different.

[0136] These examples are merely illustrative in nature and are not limiting to the present embodiments, as any engineered receptors can be present in the engineered cells. These are non-limiting examples of engineered receptors (e.g., CAR, TCR, cTCR, TAC, and TAC-like engineered receptors) and any other engineered receptor construct could be encoded for by the second nucleic acid disclosed herein. C. Additional agonist agents

[0137] In some embodiments, the engineered cell further comprises a third nucleic acid encoding an additional agonist agent of an inhibitory receptor on the surface of an effector immune cell. In some embodiments, the agonist agent is an agonist antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds to the inhibitory receptor. Inhibitory receptors in the surface of an effector immune cell include, but is not limited to, NKG2A. In some embodiments, the inhibitory receptor is an NKG2A receptor. In some embodiments, the agonist agent that specifically binds to NKG2A receptor is HLA-E or a functional variant thereof. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding the LAIR-1 binding agent described herein is fused to the third nucleic acid sequence encoding HLA-E or a functional variant thereof via another nucleic acid sequence encoding a self-cleavable linker, such as P2A, T2A, E2A, or F2A peptide. In some embodiments, the agonist agent that specifically binds to NKG2A has an amino acid sequence that is at least 80% (such as at least any of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100) identical to SEQ ID NO: 48. D. Nucleic Acids

[0138] The engineered cells described herein comprise one or more nucleic acids comprising heterologous nucleic acid sequence (s) encoding any one of the agents for binding to LAIR-1 and / or engineered receptors and / or additional agonist agents described herein. In some embodiments, the nucleic acid is a DNA. In some embodiments, the nucleic acid is an RNA. In some embodiments, the nucleic acid is linear. In some embodiments, the nucleic acid is circular.

[0139] The heterologous nucleic acid sequence (s) may be operably linked to one or more regulatory sequences. Exemplary regulatory sequences that control the transcription and / or translation of a coding sequence are known in the art and may include, but not limited to, a promoter, additional elements for proper initiation, regulation and / or termination of transcription (e.g. polyA transcription termination sequences) , mRNA transport (e.g. nuclear localization signal sequences) , processing (e.g. splicing signals) , stability (e.g. introns and non-coding 5’ and 3’ sequences) , translation (e.g. an initiator Met, tripartite leader sequences, IRES ribosome binding sites, signal peptides, etc. ) , and insertion site for introducing an insert into the viral vector. In some embodiments, the regulatory sequence is a promoter, a transcriptional enhancer and / or a sequence that allows for proper expression of the agent and / or the engineered receptor.

[0140] The term “regulatory sequence” or “control sequence” refers to a DNA sequence that affects the expression of a coding sequence to which it is operably linked. The nature of such regulatory sequences differs depending upon the host organism. In prokaryotes, regulatory sequences generally include promoters, ribosomal binding sites, and terminators. In eukaryotes, regulatory sequences include promoters, terminators and, in some instances, enhancers, transactivators or transcription factors.

[0141] The term “operably linked” refers to a juxtaposition wherein the components so described are in a relationship permitting them to function in their intended manner. A regulatory sequence “operably linked” to a coding sequence is ligated in such a way that expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the regulatory sequences.

[0142] As used herein, a “promoter” or a “promoter region” refers to a segment of DNA or RNA that controls transcription of the DNA or RNA to which it is operatively linked. The promoter region includes specific sequences that are involved in RNA polymerase recognition, binding and transcription initiation. In addition, the promoter includes sequences that modulate recognition, binding and transcription initiation activity of RNA polymerase (i.e., binding of one or more transcription factors) . These sequences can be cis acting or can be responsive to trans acting factors. Promoters, depending upon the nature of the regulation, can be constitutive or regulated. Regulated promoters can be inducible or environmentally responsive (e.g. respond to cues such as pH, anaerobic conditions, osmoticum, temperature, light, or cell density) . Many such promoter sequences are known in the art. See, for example, U.S. Pat. Nos. 4,980,285; 5,631,150; 5,707,928; 5,759,828; 5,888,783; 5,919,670, and Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (1989) .

[0143] In some embodiments, the promoter is an endogenous promoter. For example, a nucleic acid sequencing encoding the LAIR-1 binding agent or engineered receptor may be knocked-in to the genome of an engineered immune cell downstream of an endogenous promoter using any methods known in the art, such as CRISPR / Cas9 method. In some embodiments, the endogenous promoter is a promoter for an abundant protein, such as beta-actin. In some embodiments, the endogenous promoter is an inducible promoter, for example, inducible by an endogenous activation signal of the engineered cell (e.g., engineered immune cell) . In some embodiments, wherein the engineered cell is a T cell, the promoter is a T cell activation-dependent promoter (such as an IL-2 promoter, an NFAT promoter, or an NFκB promoter) . In some embodiments, the promoter is a heterologous promoter.

[0144] Varieties of promoters have been explored for gene expression in mammalian cells, and any of the promoters known in the art may be used in the present disclosure. Promoters may be roughly categorized as constitutive promoters or regulated promoters, such as inducible promoters. In some embodiments, the heterologous nucleic acid sequence encoding the LAIR-1 binding agent or engineered receptor is operably linked to a constitutive promoter. In some embodiments, the heterologous nucleic acid sequence encoding the LAIR-1 binding agent or engineered receptor is operably linked to an inducible promoter.

[0145] Constitutive promoters allow heterologous genes (also referred to as transgenes) to be expressed constitutively in the host cells. Exemplary constitutive promoters contemplated herein include, but are not limited to, Cytomegalovirus (CMV) promoters, human elongation factors-1alpha (hEF1α) , ubiquitin C promoter (UbiC) , phosphoglycerokinase promoter (PGK) , simian virus 40 early promoter (SV40) , and chicken β-Actin promoter coupled with CMV early enhancer (CAGG) . The efficiencies of such constitutive promoters on driving transgene expression have been widely compared in a huge number of studies. In some embodiments, the promoter is a hEF1α promoter.

[0146] In some embodiments, the promoter is an inducible promoter. Inducible promoters belong to the category of regulated promoters. The inducible promoter can be induced by one or more conditions, such as a physical condition, microenvironment of the engineered cell (e.g., engineered immune cell) , or the physiological state of the engineered cell (e.g., engineered immune cell) , an inducer (i.e., an inducing agent) , or a combination thereof. In some embodiments, the inducing condition does not induce the expression of endogenous genes in the engineered cell (e.g., engineered immune cell) , and / or in the subject that receives the pharmaceutical composition. In some embodiments, the inducing condition is selected from the group consisting of: inducer, irradiation (such as ionizing radiation, light) , temperature (such as heat) , redox state, tumor environment, and the activation state of the engineered cell (e.g., engineered immune cell) .

[0147] The heterologous nucleic acid sequences (s) described herein can be present in a heterologous gene expression cassette, which comprises one or more protein-coding sequences and optionally one or more promoters. In some embodiments, the heterologous gene expression cassette comprises a single protein-coding sequence. In some embodiments, the heterologous gene expression cassette comprises two or more protein-coding sequences driven by a single promoter (i.e., polycistronic) . In some embodiments, the heterologous gene expression cassette further comprises one or more regulatory sequences (such as 5’ UTR, 3’ UTR, enhancer sequence, IRES, transcription termination sequence) , recombination sites, one or more selection markers (such as antibiotic resistance gene, reporter gene, etc. ) , signal sequence, or combinations thereof. In some embodiments, a first heterologous nucleic acid sequence encoding the LAIR-1 binding agent is fused to a second heterologous nucleic acid sequence encoding an engineered receptor or an additional agonist agent via another nucleic acid sequence encoding a self-cleavable linker, such as P2A, T2A, E2A, or F2A peptide.

[0148] In some embodiments, the heterologous nucleic acid sequence (s) are present in a vector. In some embodiments, the engineered cell comprises a vector comprising a first heterologous nucleic acid sequence encoding a LAIR-1 binding agent. In some embodiments, the engineered cell comprises a vector comprising a first heterologous nucleic acid sequence encoding a LAIR-1 binding agent and a second heterologous nucleic acid sequence encoding an engineered receptor (e.g., CAR) . In some embodiments, the engineered cell comprises a vector comprising a first heterologous nucleic acid sequence encoding a LAIR-1 binding agent and a second heterologous nucleic acid sequence encoding an additional agonist agent of an inhibitory receptor. In some embodiments, the engineered cell comprises a vector comprising a first heterologous nucleic acid sequence encoding a LAIR-1 binding agent, a second heterologous nucleic acid sequence encoding an engineered receptor (e.g., CAR) , and a third heterologous nucleic acid sequence encoding an additional agonist agent of an inhibitory receptor.

[0149] In some embodiments, the vector is a viral vector. Examples of viral vectors include, but are not limited to, adenoviral vectors, adeno-associated virus vectors, lentiviral vector, retroviral vectors, vaccinia vector, herpes simplex viral vector, and derivatives thereof. Viral vector technology is well known in the art and is described, for example, in Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) , and in other virology and molecular biology manuals.

[0150] A number of viral based systems have been developed for gene transfer into mammalian cells. For example, retroviruses provide a convenient platform for gene delivery systems. The heterologous nucleic acid can be inserted into a vector and packaged in retroviral particles using techniques known in the art. The recombinant virus can then be isolated and delivered to the therapeutic cell (e.g., engineered immune cell) in vitro or ex vivo. A number of retroviral systems are known in the art. In some embodiments, adenovirus vectors are used. In some embodiments, lentivirus vectors are used. In some embodiments, self-inactivating lentiviral vectors are used. For example, self-inactivating lentiviral vectors can be packaged with protocols known in the art. The resulting lentiviral vectors can be used to transduce a mammalian cell (such as human T cells) using methods known in the art.

[0151] In some embodiments, the vector is a non-viral vector, such as a plasmid, or an episomal expression vector.

[0152] In some embodiments, the vector is an expression vector. “Expression vector” is a construct that can be used to transform a selected host and provides for expression of a coding sequence in the selected host. Expression vectors can for instance be cloning vectors, binary vectors or integrating vectors. Expression comprises transcription of the nucleic acid molecule preferably into a translatable mRNA. Regulatory elements ensuring expression in eukaryotic cells are well known to those skilled in the art. In the case of eukaryotic cells they comprise normally promoters ensuring initiation of transcription and optionally poly-Asignals ensuring termination of transcription and stabilization of the transcript. Examples of regulatory elements permitting expression in eukaryotic host cells are AOX1 or GAL1 promoter in yeast or the CMV-, SV40-, RSV-promoter (Rous sarcoma virus) , CMV-enhancer, SV40-enhancer or a globin intron in mammalian and other animal cells. Furthermore, depending on the expression system used leader sequences capable of directing the polypeptide to a cellular compartment or secreting it into the medium may be added to the coding sequence of the recited nucleic acid sequence and are well known in the art. The leader sequence (s) is (are) assembled in appropriate phase with translation, initiation and termination sequences, and preferably, a leader sequence capable of directing secretion of translated protein, or a portion thereof, into the periplasmic space or extracellular medium. Optionally, the nucleic acid sequence can encode a fusion protein including an N-terminal identification peptide imparting desired characteristics, e.g., stabilization or simplified purification of expressed recombinant product. Suitable expression vectors are known in the art such as Okayama-Berg cDNA expression vector pcDV1 (Pharmacia) , pEF-Neo, pCDM8, pRc / CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) , pEF-DHFR and pEF-ADA, (Raum et al., Cancer Immunol Immunother (2001) 50 (3) , 141-150) or pSPORT1 (GIBCO BRL) .

[0153] The engineered cells described herein can further comprise one or more genetic modifications. For example, in some embodiments there is provided an engineered immune cell comprising a nucleic acid encoding an agent which binds to LAIR-1, wherein the engineered immune cell has reduced expression and / or function of LAIR-1. In some embodiments, the engineered immune cell further has reduced expression or function of LAIR-1. In some embodiments there is provided an engineered immune cell comprising a nucleic acid encoding an agent which binds to LAIR-1, wherein the engineered immune cell further comprises a LAIR-1 knockdown or knockout mutation. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises a B2M knockdown or knockout mutation. Engineered immune cells and methods of making thereof are further discussed in section III below. III. Engineered Immune Cells Having Reduced Expression and / or Function of LAIR-1

[0154] In some aspects, there is provided an engineered immune cell having reduced expression and / or function of LAIR-1. The engineered immune cells in some embodiments show stronger proliferation activity compared to a reference immune cell that is not engineered to have reduced expression and / or function of LAIR-1. The engineered immune cell in some embodiments further comprises an agent that binds to (and e.g. activates) LAIR-1 as described in Section II above. In addition to or independent of the agent that binds to LAIR-1, the engineered cell in some embodiments further comprises a nucleic acid encoding an engineered receptor as described in Section II above. In addition to or independent of the agent that binds to LAIR-1 and / or engineered receptor, the engineered cell in some embodiments further comprises a nucleic acid encoding an additional agonist agent of an inhibitory receptor as described in Section II above. In some embodiments, the engineered immune cells are further modified to have reduced expression and / or function of a second molecule (such as B2M) .

[0155] In some embodiments, the expression of LAIR-1 (RNA and / or protein expression) and / or function of the LAIR-1 protein is reduced (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or inhibited by a small molecule compound, a nucleic acid (or vector comprising thereof) , a lipid, and / or a protein molecule. In some embodiments, the expression of LAIR-1 is reduced (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or inhibited by an antisense RNA, an siRNA, or an shRNA specifically recognizing an RNA encoding LAIR-1 protein.

[0156] In some embodiments, the function of the LAIR-1 protein is reduced (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or inhibited by a chemically modified mRNA, such as a chemically modified mRNA encoding a dominant negative inhibitor (e.g., dominant negative variant or fragment thereof, or dominant negative binding partner) of the LAIR-1 protein. In some embodiments, the engineered immune cell expresses a dominant negative LAIR-1 protein variant or dominant negative fragment thereof. In some embodiments, the engineered immune cell expresses a dominant negative binding partner of LAIR-1 protein.

[0157] In some embodiments, the engineered immune cell is genetically modified at the DNA locus encoding the LAIR-1 protein. In some embodiments, the DNA locus (i.e., LAIR-1 locus) is modified by a mutagenic agent. Mutagenic agents can be classified into three categories: physical (e.g., gamma rays, ultraviolet (UV) radiations) , chemical (e.g., ethyl methane sulphonate (EMS) ) and transposable elements (such as transposons, retrotransposons, T-DNA, retroviruses) . In some embodiments, the mutagenic agent or condition is any of ionizing radiation (IR) , UV radiation, an alkylating agent (e.g., nitrogen mustard gas, methyl methanesulfonate (MMS) , EMS, N-ethyl-N-nitrosourea (ENU)) , an aromatic amine (e.g., 2-aminofluorene) , an polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH; e.g., dibenzo [a, l] pyrene, naphthalene, anthracene, pyrene) , crosslinking, insertional mutagenesis (e.g., mediated by transposons or viruses) , or other toxins (e.g., aflatoxin, N-nitrosamines) .

[0158] In some embodiments, the DNA locus (i.e., LAIR-1 locus) is modified by gene editing. Any known gene editing methods can be used herein, including but not limited to, non-homologous end-joining (NHEJ) -mediated, homology directed repair (HDR) -mediated, zinc-finger nuclease (ZFN) -mediated, transcription activator-like effector nuclease (TALEN) -mediated, or CRISPR / Cas mediated gene editing. Gene editing can introduce one or more mutations in the DNA locus encoding the LAIR-1 protein, including but not limited to, insertion, deletion, substitution (e.g., nonsynonymous substitution) , truncation, translocation, point mutation, etc. In some embodiments, the mutation is a frameshift mutation, a loss-of-function (LOF) mutation, a dominant negative mutation, a missense mutation, or a nonsense mutation. In some embodiments, the gene editing comprises gene knockout (KO) . In some embodiments, the gene editing comprises base editing (e.g., introducing nonsynonymous substitution) . In some embodiments, base editing introduces a stop codon which may reduce the expression of functional RNA and / or protein. In some embodiments, base editing introduces a mutation that affects the function of the RNA and / or protein. In some embodiments, the gene editing is mediated by CRISPR / Cas. In some embodiments, the Cas protein has endonuclease activity. In some embodiments, the Cas protein is fusion protein comprising i) a dead Cas protein (dCas) and ii) an adenine base editor (ABE) or adenine deaminase (ADA) , or a cytidine base editor (CBE) or cytidine deaminase (CDA) , or functional fragment thereof. Cytidine base editors can convert target C: G base pairs to T: Abase pairs, and adenine base editors can convert A: T base pairs to G: C base pairs, collectively, these two classes of base editors enable the targeted installation of all possible transition mutations (C-to-T, G-to-A, A-to-G, T-to-C, C-to-U, and A-to-U) .

[0159] In some embodiments, the engineered immune cell is genetically modified at LAIR-1 RNA. In some embodiments, the RNA encoding the LAIR-1 protein is modified by RNA editing. RNA editing can introduce one or more mutations in the RNA encoding the LAIR-1 protein, including but not limited to, insertion, deletion, substitution (e.g., nonsynonymous substitution) , truncation, point mutation, etc. In some embodiments, the mutation is a frameshift mutation, an LOF mutation, a dominant negative mutation, a missense mutation, or a nonsense mutation. In some embodiments, the RNA editing comprises base editing (e.g., introducing nonsynonymous substitution, such as C to U, A to I) . Any known RNA editing methods can be used herein (see, e.g., Guillermo Aquino-Jarquin, “Novel Engineered Programmable Systems for ADAR-Mediated RNA Editing, ” Mol Ther Nucleic Acids. 2020; 19: 1065-1072; the content of which is incorporated herein by reference in its entirety) , including but not limited to, leveraging endogenous ADAR for programmable editing of RNA ( “LEAPER” ; see, e.g., WO2020074001 and Qu et al. (Nat Biotechnol. 2019; 37 (9) : 1059-1069) , or RNA Editing for Programmable A to I Replacement ( “REPAIR” ; see, e.g., Cox et al., “RNA editing with CRISPR-Cas13, ” Science. 2017; 358 (6366) : 1019-1027) , recruiting endogenous ADAR to specific transcripts for oligonucleotide-mediated RNA editing ( “RESTORE” ; see, e.g., Merkle et al., “Precise RNA editing by recruiting endogenous ADARs with antisense oligonucleotides, ” Methods Mol Biol. 2021; 2181: 331-349) , CRISPR-Cas-Inspired RNA Targeting System ( “CIRTS” ; see, e.g., Rauch et al., “Programmable RNA-Guided RNA Effector Proteins Built from Human Parts, ” Cell. 2019; 178 (1) : 122-134. e12) , RNA Editing for Specific C to U Exchange ( “RESCUE” ; see, e.g., Abudayyeh et al., “A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing, ” Science. 2019; 365 (6451) : 382-386) , or CLUSTER (see, e.g., P. Reautschnig et al., “CLUSTER guide RNAs enable precise and efficient RNA editing with endogenous ADAR enzymes in vivo, ” Nat Biotechnol. 2022 May; 40 (5) : 759-768) , the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety. In some embodiments, the RNA editing is mediated by LEAPER. In some embodiments, the RNA editing is mediated by CRISPR / Cas, such as by fusing an adenine base editor (ABE) or adenine deaminase (ADA) , or a cytidine base editor (CBE) or cytidine deaminase (CDA) , or functional fragment thereof to a dead Cas (dCas, e.g., dCas13) protein.

[0160] Methods for making CRISPRs that recognize pre-determined DNA or RNA sites are known in the art. Any known CRISPR / Cas systems suitable for gene editing or RNA editing can be used herein. See, e.g., Nidhi et el., “Novel CRISPR–Cas Systems: An Updated Review of the Current Achievements, Applications, and Future Research Perspectives, ” Int J Mol Sci. 2021; 22 (7) : 3327, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety. Among class 2 CRISPR-Cas systems, the type II Cas9 system and the type V-A / B / E / J Cas12a / Cas12b / Cas12e / Cas12j systems have been utilized for genome editing and provided broad prospects for biomedical research. Cas13a (C2c2) is a type VI-ARNA-guided RNA-targeting CRISPR effector, which can be used in RNA editing described herein. The CRISPR / Cas system used herein can create double-strand break (DSB) or single-strand break at the pre-determined nucleic acid site. In some embodiments, CRISPR / Cas system used herein is a CRISPR / Cas9 system. In some embodiments, the CRISPR / Cas system comprises a gRNA having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 51.

[0161] In some embodiments, the expression of LAIR-1 is reduced by an agent. In some embodiments, the agent is an RNAi molecule. Exemplary RNAi molecules include, but are not limited to, short-hairpin RNA (shRNA) , small interfering RNA (siRNA) , and microRNA (miRNA) , including siRNA or shRNA comprising a target sequence embedded in a naturally-occurring miRNA scaffold. In some embodiments, the agent is a CRISPR interference (CRISPRi) agent. The modified therapeutic cell may express any one of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or more shRNAs, which may have a single target or multiple targets.

[0162] RNAi molecules such as shRNA, siRNA and miRNA can be designed using known methods in the art based on the mRNA sequence of the target molecule.

[0163] shRNAs can be used to knockdown the expression level of a target to different levels. The desirable level of expression of LAIR-1 can be achieved by screening for an shRNA or a pool of shRNAs having a suitable knockdown efficiency, and / or by adjusting the expression level of the shRNA using a suitable promoter (e.g., U6 promoter) or expression vector (e.g., viral vector) . shRNAs targeting different sequences in an mRNA may have different knockdown efficiency.

[0164] In some embodiments, the engineered immune cell is selected from the group consisting of a monocyte, a dendritic cell, a macrophage, a B cell, a T cell, a natural killer (NK) cell, or a combination thereof. In some embodiments, the engineered immune cell is a T cell. In some embodiments, the T cell is selected from the group consisting of a helper CD4+T cell, a cytotoxic CD8+ T cell, a memory T cell, a regulatory CD4+ T cell, a natural killer T (NKT) cell, a mucosal associated invariant T (MAIT) cell, a double negative T (DNT) cell, and a γδ T cell. In some embodiments, the T cell is a γδ T cell. In some embodiments, the γδT cell is selected from the group consisting of Vδ1 T cell, Vδ2 T cell, Vδ3 T cell, Vδ4 T cell, Vδ5 T cell, Vδ6 T cell, Vδ7 T cell, γδT1 cell, γδT2 cell, γδT17 cell, γδTreg cell, and γδTAPC cell. In some embodiments, the γδ T cell is Vγ9Vδ2 T cell.

[0165] The present application also provides a method of producing any of the engineered immune cells described above, comprising modifying a precursor cell (e.g., a precursor immune cell) to reduce or eliminate expression and / or function of a LAIR-1 protein. In some embodiments, there is provided a method of enhancing proliferation of an engineered immune cell, comprising modifying a precursor cell (e.g., a precursor immune cell) to reduce or eliminate expression and / or function of a LAIR-1 protein. In some embodiments, the precursor cell from which the engineered immune cells are derived is selected from the group consisting of a monocyte, a dendritic cell, a macrophage, a B cell, a T cell, a natural killer (NK) cell, an induced pluripotent stem cell (iPSC) , an embryonic stem cell (ESC) , a hematopoietic stem cell (HSC) , or a combination thereof.

[0166] In some embodiments, the engineered immune cells are further modified to have reduced expression and / or function of a second molecule (such as B2M) . The expression and / or function of the second molecule can also be reduced by using any of the methods described above. IV. Methods of treatment

[0167] One aspect of the present application relates to methods of treating a disease or condition (such as cancer) in an individual (such as a human individual) , comprising administering to the individual an effective amount of any one of the engineered cells (such as engineered immune cells) comprising a LAIR-1 binding agent, such as any of the engineered cells described herein. In some embodiments, the treatment is allogenic.

[0168] In some embodiments, there is provided a method of (i) reducing graft rejection and / or (ii) increasing persistence of allogeneic cells in an individual (such as a human individual) in need thereof, comprising introducing into the allogeneic cells a nucleic acid encoding an agent which activates LAIR-1 on an effector immune cell. In some embodiments, the method (i) increases immune tolerance towards the engineered cell (such as any of the engineered cells described herein) in the individual and / or increases persistence of the engineered cell in the individual comprising to a method using a reference cell that does not comprise the nucleic acid encoding a LAIR-1binding agent.

[0169] In some embodiments, there are provided methods of inhibiting effector immune cells that express LAIR-1, comprising contacting the effector immune cells with any of the engineered cells (such as engineered immune cells) comprising a LAIR-1 binding agent, such as any of the engineered cells described herein.

[0170] In some embodiments, there are provided methods of treating a disease or condition (such as cancer) in an individual (such as a human individual) , comprising administering to the individual an effective amount of any one of the engineered immune cells having reduced expression and / or function of LAIR-1 compared to a reference immune cell, such as any of the engineered cells described herein. In some embodiments, the treatment is allogenic.

[0171] The present application contemplates engineered cells that can be administered either alone or in any combination with another therapy, and in at least some aspects, together with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. In some embodiments, prior to administration, the engineered cells may be combined with suitable pharmaceutical carriers and excipients that are well known in the art.

[0172] The present application provides methods of treating cancer in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of the engineered cells (or pharmaceutical composition comprising such engineered cells) disclosed herein. In some embodiments, the individual, to whom the engineered immune cells or compositions thereof are administered is a primate, such as a human, monkey, gorilla, chimpanzee, etc. In some embodiments, the individual is a human. The individual can be male or female and can be any suitable age, including infant, juvenile, adolescent, adult, and geriatric individuals. In some embodiments, the individual is a mammal, including but are not limited to, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, chinchillas, cats, dogs, horses, donkeys, cows, goats, sheep, deer, monkeys, apes, etc. In some embodiments, the individual is a livestock. In some embodiments, the individual is a companion animal. In some examples, the individual is a validated animal model for disease, adoptive cell therapy, and / or for assessing toxic outcomes. In some embodiments, the cancer is a solid tumor. In some embodiments, the treatment method of allogenic. In some embodiments, the treatment method of autologous.

[0173] The methods are applicable to cancers of all stages, including early stage, advanced stage and metastatic cancer. The methods described herein may be used as a first therapy, second therapy, third therapy, or combination therapy with other types of cancer therapies known in the art, such as chemotherapy, surgery, radiation, gene therapy, immunotherapy, bone marrow transplantation, stem cell transplantation, targeted therapy, cryotherapy, ultrasound therapy, photodynamic therapy, radio-frequency ablation or the like, in an adjuvant setting or a neoadjuvant setting.

[0174] In some embodiments, the solid cancer is selected from the group consisting of colon cancer, rectal cancer, renal-cell carcinoma, liver cancer, non-small cell carcinoma of the lung, cancer of the small intestine, cancer of the esophagus, melanoma, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, cancer of the head or neck, cutaneous or intraocular malignant melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, cancer of the anal region, stomach cancer, testicular cancer, uterine cancer, carcinoma of the fallopian tubes, carcinoma of the endometrium, carcinoma of the cervix, carcinoma of the vagina, carcinoma of the vulva, Hodgkin's Disease, non-Hodgkin's lymphoma, cancer of the endocrine system, cancer of the thyroid gland, cancer of the parathyroid gland, cancer of the adrenal gland, sarcoma of soft tissue, cancer of the urethra, cancer of the penis, solid tumors of childhood, cancer of the bladder, cancer of the kidney or ureter, carcinoma of the renal pelvis, neoplasm of the central nervous system (CNS) , primary CNS lymphoma, tumor angiogenesis, spinal axis tumor, brain stem glioma, pituitary adenoma, Kaposi's sarcoma, epidermoid cancer, squamous cell cancer, T-cell lymphoma, environmentally induced cancers, combinations of said cancers, and metastatic lesions of said cancers.

[0175] Any suitable methods for the administration of an engineered cell can be used herein. The route of administration is in accordance with any known and accepted methods, such as by single or multiple bolus or infusion over a long period of time in a suitable manner, e.g., injection or infusion by subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intraarterial, or intralesional routes, or by sustained release or extended-release means. In some embodiments, the engineered immune cell is administered intravenously, such as by infusion. In some embodiments, the engineered immune cell is administered intratumorally.

[0176] In some embodiments, the pharmaceutical composition provided herein contains the engineered cells in amounts effective to treat or prevent the disease or disorder, such as a therapeutically effective or prophylactically effective amount. Therapeutic or prophylactic efficacy in some embodiments is monitored by periodic assessment of treated subjects. For repeated administrations over several days or longer, depending on the condition, the treatment is repeated until a desired suppression of disease symptoms occurs. However, other dosage regimens may be useful and can be determined.

[0177] Dosages and desired drug concentration of engineered cells of the present invention may vary depending on the particular use envisioned. The determination of the appropriate dosage or route of administration is well within the skill of an ordinary artisan. Animal experiments provide reliable guidance for the determination of effective doses for human therapy. Interspecies scaling of effective doses can be performed following the principles laid down by Mordenti, J. and Chappell, W. “The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics, ” In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46. Different formulations will be effective for different treatments and different disorders, and that administration intended to treat a specific organ or tissue may necessitate delivery in a manner different from that to another organ or tissue.

[0178] In some embodiments, a subject may be administered the range of about ten thousand to about 100 billion cells and / or that amount of cells per kilogram of body weight. In some embodiments, the engineered cell or pharmaceutical composition thereof is administered at a dosage of at least about any of 104, 105, 106, 107, 108, or 109 cells / kg of body weight of the individual. Dosages may vary depending on attributes particular to the disease or disorder and / or patient and / or other treatments. The method may occur without or with the administration of one or more cytokines. The cytokine may be IL2, IL7, IL12, IL21, and / or IL15. The method may occur without or with one or more chemokines. The chemokine may be CCL19 and / or CCL21.

[0179] In some embodiments, the engineered or pharmaceutical composition thereof is administered for a single time. In some embodiments, the engineered cell or pharmaceutical composition thereof is administered for multiple times (such as any of 2, 3, 4, 5, 6, or more times) . In some embodiments, the engineered cell or pharmaceutical composition thereof is administered once or multiple times during a dosing cycle. A dosing cycle can be, e.g., 1, 2, 3, 4, 5 or more week (s) , or 1, 2, 3, 4, 5, or more month (s) . The administration frequency and duration of the engineered cell can be the same or different. The optimal dosage and treatment regime for a particular patient can be determined by one skilled in the art of medicine by monitoring the patient for signs of disease and adjusting the treatment accordingly. In certain embodiments, once the engineered cells are administered to a mammal (e.g., a human) , the biological activity of the engineered cell populations is measured by any of a number of known methods. Parameters to assess include specific binding of an engineered cell or non-engineered cell (e.g., bystanders) to antigen, in vivo, e.g., by imaging, or ex vivo, e.g., by ELISA or flow cytometry. In certain embodiments, the ability of the engineered cells or non-engineered cells (e.g., bystanders) to destroy target cells can be measured using any suitable method known in the art, such as cytotoxicity assays described in, for example, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7) : 689-702 (2009) , and Herman et al. J. Immunological Methods, 285 (1) : 25-40 (2004) . In certain embodiments, the biological activity of the engineered cells or non-engineered cells (e.g., bystanders) also can be measured by assaying expression and / or secretion of certain cytokines, such as CD107a, IFNγ, IL-2, and TNF. In some embodiments, the biological activity is measured by assessing clinical outcome, such as reduction in tumor burden or load.

[0180] Thus, in some embodiments, there is provided a method of treating a cancer in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an engineered cell, wherein the engineered cell comprises a nucleic acid encoding an agent which binds to LAIR-1. In some embodiments, there is provided a method of treating a cancer in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an engineered immune cell, wherein the engineered immune cell has reduced expression and / or function of LAIR-1 compared to a reference immune cell that is not engineered to have reduced expression and / or function of LAIR-1. Engineered cells and engineered immune cells are discussed in detail in the sections above. V. Pharmaceutical Compositions

[0181] In some embodiments, there is provided a composition comprising any one of the engineered cells described herein. The composition may comprise any number of the engineered cell. In some embodiments, the composition comprises a single copy of the engineered cell. In some embodiments, the composition comprises at least about any of 1, 10, 100, 1000, 104, 105, 106, 107, 108 or more copies of the engineered cells. In some embodiments, there is provided a pharmaceutical composition comprising an effective amount of engineered cell (such as allogeneic CAR-T cell) , and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0182] Also provided are the compositions for use in any one of the methods described herein, and use of the compositions in preparation of a medicament for any one of the methods described herein.

[0183] “Carriers” as used herein include pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or stabilizers which are nontoxic to the cells or individual being exposed thereto at the dosages and concentrations employed. Often the physiologically acceptable carrier is an aqueous pH buffered solution. Examples of suitable pharmaceutical carriers are well known in the art and include phosphate buffered saline solutions, water, emulsions, such as oil / water emulsions, various types of wetting agents, sterile solutions, etc. Acceptable carriers, excipients, or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed.

[0184] Pharmaceutical compositions comprising such carriers can be formulated by well-known conventional methods. The solvent or diluent is preferably isotonic, hypotonic or weakly hypertonic and has a relatively low ionic strength. Representative examples include sterile water, physiological saline (e.g., sodium chloride) , Ringer's solution, glucose, trehalose or saccharose solutions, Hank's solution, and other aqueous physiologically balanced salt solutions (see, for example, the most current edition of Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins) .

[0185] The pharmaceutical compositions described herein may be administered via any suitable routes. In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered parenterally, transdermally (into the dermis) , intraluminally, intra-arterially (into an artery) , intramuscularly (into muscle) , intrathecally or intravenously. In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered subcutaneously (under the skin) . In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered intravenously. In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered to the individual via infusion or injection. In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered directly to the target site, e.g., by biolistic delivery to an internal or external target site or by catheter to a site in an artery. In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered locally, e.g., intratumorally. Administrations may use conventional syringes and needles or any compound or device available in the art capable of facilitating or improving delivery of the active agent (s) in the subject.

[0186] Preparations for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions. Examples of non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate. Aqueous carriers include water, alcoholic / aqueous solutions, emulsions or suspensions, including saline and buffered media. Parenteral vehicles include sodium chloride solution, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, lactated Ringer's , or fixed oils. Intravenous vehicles include fluid and nutrient replenishers, electrolyte replenishers (such as those based on Ringer's dextrose) , and the like. Preservatives and other additives may also be present such as, for example, antimicrobials, anti-oxidants, chelating agents, and inert gases and the like. In addition, the pharmaceutical composition of the present disclosure might comprise proteinaceous carriers, like, e.g., serum albumin or immunoglobulin, preferably of human origin.

[0187] In some embodiments, the pharmaceutical composition is suitably buffered for human use. Suitable buffers include without limitation phosphate buffer (e.g. PBS) , bicarbonate buffer and / or Tris buffer capable of maintaining a physiological or slightly basic pH (e.g., from approximately pH 7 to approximately pH 9) . In some embodiments, the pharmaceutical composition can also be made to be isotonic with blood by the addition of a suitable tonicity modifier, such as glycerol.

[0188] In some embodiments, the pharmaceutical composition is contained in a single-use vial, such as a single-use sealed vial. In some embodiments, the pharmaceutical composition is contained in a multi-use vial. In some embodiments, the pharmaceutical composition is contained in bulk in a container.

[0189] In some embodiments, the pharmaceutical composition must meet certain standards for administration to an individual. For example, the United States Food and Drug Administration has issued regulatory guidelines setting standards for cell-based immunotherapeutic products, including 21 CFR 610 and 21 CFR 610.13. Methods are known in the art to assess the appearance, identity, purity, safety, and / or potency of pharmaceutical compositions. In some embodiments, the pharmaceutical composition is substantially free of extraneous protein capable of producing allergenic effects, such as proteins of an animal source used in cell culture other than the therapeutic cells. In some embodiments, “substantially free” is less than about any of 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 1ppm or less of total volume or weight of the pharmaceutical composition. In some embodiments, the pharmaceutical composition is prepared in a GMP-level workshop. In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises less than about 5 EU / kg body weight / hr of endotoxin for parenteral administration. In some embodiments, at least about 70%of the therapeutic cells in the pharmaceutical composition are alive for intravenous administration. In some embodiments, the pharmaceutical composition has a “no growth” result when assessed using a 14-day direct inoculation test method as described in the United States Pharmacopoeia (USP) . In some embodiments, prior to administration of the pharmaceutical composition, a sample including both the therapeutic cells and the pharmaceutically acceptable excipient should be taken for sterility testing approximately about 48-72 hours prior to the final harvest (or coincident with the last re-feeding of the culture) . In some embodiments, the pharmaceutical composition is free of mycoplasma contamination. In some embodiments, the pharmaceutical composition is free of detectable microbial agents. In some embodiments, the pharmaceutical composition is free of communicable disease agents, such as HIV type I, HIV type II, HBV, HCV, Human T-lymphotropic virus, type I; and Human T-lymphotropic virus, type II.

[0190] Also provided are kits, unit dosages, and articles of manufacture comprising any one of the engineered cells described herein.

[0191] In some embodiments, a kit is provided which contains any one of the pharmaceutical compositions described herein and preferably provides instructions for its use. In some embodiments, there is provided a kit comprising: (a) any one of the engineered cells described herein; and (b) instructions for use in any one of the methods described herein. In some embodiments, the engineered cells are allogeneic therapeutic cells. In some embodiments, the engineered cells are engineered immune cells. VI. Methods of making engineered cells

[0192] Also provided are methods of making any of the engineered cells (e.g., engineered immune cells) described herein. Also provided are methods of making any of the agents described herein. Methods of cloning vector construction, protein expression and purification, cell preparation (e.g., enrichment and / or activation) and transfection, etc., are well-known in the art. Any of the isolated nucleic acids and vectors described under Section II “D. Nucleic acids and vectors can be used herein to make the engineered immune cells and / or agents. Also see Examples 2 and 3 for exemplary making methods.

[0193] In some embodiments, there is provided a method of making an engineered cell (e.g., an engineered immune cell) comprising a nucleic acid encoding an agent that binds (e.g., activates) LAIR-1, wherein the method comprises: introducing into a population of precursor cells the nucleic acid encoding the agent. In some embodiments, the method further comprises providing the population of precursor cells before introducing the nucleic acid. In some embodiments, the method further comprises isolating and / or enriching a plurality of engineered immune cells that express the agent.

[0194] In some embodiments, there is provided a method of making an engineered immune cell (e.g., an engineered T cell) , wherein the engineered immune cell comprises: (1) a first nucleic acid encoding an agent that binds (e.g., activates) LAIR-1; and (2) a second nucleic acid encoding an engineered receptor; wherein the method comprises: introducing into a population of precursor immune cells the first nucleic acid and the second nucleic acid. In some embodiments, the method further comprises providing the population of precursor immune cells before introducing the first nucleic acid and / or the second nucleic acid. Hence in some embodiments, the engineered immune cell is made from a method comprising providing a population of precursor immune cells, and introducing into the population of immune cells a first nucleic acid encoding the LAIR-1 binding agent and a second nucleic acid encoding the engineered receptor. In some embodiments, the first nucleic acid and the second nucleic acid are on different vectors. In some embodiments, the first nucleic acid and the second nucleic acid are introduced into the population of precursor immune cells simultaneously. In some embodiments, the first nucleic acid is introduced into the population of precursor immune cells before introducing the second nucleic acid. In some embodiments, the method further comprises isolating and / or enriching a plurality of engineered immune cells expressing the LAIR-1 binding agent, then introducing into the plurality of engineered immune cells the second nucleic acid encoding the engineered receptor. In some embodiments, the second nucleic acid is introduced into the population of immune cells before introducing the first nucleic acid. In some embodiments, the method further comprises isolating and / or enriching a plurality of engineered immune cells expressing the engineered receptor, then introducing into the plurality of engineered immune cells the first nucleic acid encoding the LAIR-1 binding agent. In some embodiments, the first nucleic acid and the second nucleic acid are on the same vector (e.g., under the control of the same promoter or different promoters) . In some embodiments, the method further comprises isolating and / or enriching a plurality of engineered immune cells that express both the LAIR-1 binding agent and the engineered receptor.

[0195] In some embodiments, the first nucleic acid and the second nucleic acid are introduced into the population of precursor cells (such as precursor immune cells) simultaneously. In some embodiments, the first nucleic acid and the second nucleic acid are on the same vector. In some embodiments, the first nucleic acid and the second nucleic acid are on the same vector and under the control of separate promoters (can be the same or different) . In some embodiments, the first nucleic acid and the second nucleic acid are on the same vector and under the control of the same promoter, wherein the first nucleic acid and the second nucleic acid are connected via a linking nucleic acid encoding a cleavable linker, such as a self-cleaving peptide. In some embodiments, the self-cleaving peptide is selected from the group consisting of T2A, P2A, E2A, and F2A. In some embodiments, the cleavable linker is a T2A peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.

[0196] In some embodiments, the first nucleic acid and / or the second nucleic acid are introduced into the population of immune cells via a viral vector. Examples of viral vectors include, but are not limited to, adenoviral vectors, adeno-associated virus (AVV) vectors, lentiviral vector, retroviral vectors, herpes simplex viral vector, and derivatives thereof.

[0197] In some embodiments, the first nucleic acid and / or the second nucleic acid are under the control of a promoter. In some embodiments, the promoter is selected from the group consisting of a phosphoglycerate kinase (PGK) promoter (e.g., PGK-1 promoter) , a Rous Sarcoma Virus (RSV) promoter, an Simian Virus 40 (SV40) promoter, a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter, an elongation factor 1 alpha (EF1-α) promoter, a ubiquitin-C (UBQ-C) promoter, a cytomegalovirus CMV) enhancer / chicken beta-actin (CAG) promoter, polyoma enhancer / herpes simplex thymidine kinase (MC1) promoter, a beta actin (β-ACT) promoter, a myeloproliferative sarcoma virus enhancer, negative control region deleted, d1587rev primer-binding site substituted (MND) promoter, an NFAT promoter, a promoter, and an NFκB promoter. In some embodiments, the promoter is an hEF1α promoter.

[0198] In some embodiments, the nucleic acids are introduced to the precursor cells by transfecting any one of the nucleic acids or vectors described herein.

[0199] Methods of introducing vectors or nucleic acids into a mammalian cell are known in the art. The vectors described can be transferred into an immune effector cell by physical, chemical, or biological methods.

[0200] Physical methods for introducing a nucleic acid or vector into a precursor cell include calcium phosphate precipitation, lipofection, particle bombardment, microinjection, electroporation, and the like. Methods for producing cells comprising vectors and / or exogenous nucleic acids are well-known in the art. See, e.g., Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. In some embodiments, the vector is introduced into the cell by electroporation.

[0201] Biological methods for introducing a nucleic acid or vector into a precursor cell include the use of DNA and RNA vectors. Viral vectors have become the most widely used method for inserting genes into mammalian, e.g., human cells.

[0202] Chemical means for introducing a nucleic acid or vector into a precursor cell include colloidal dispersion systems, such as macromolecule complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipid-based systems including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes. An exemplary colloidal system for use as a delivery vehicle in vitro is a liposome (e.g., an artificial membrane vesicle) .

[0203] RNA molecules encoding any of the agents and / or engineered receptors described herein may be prepared by a conventional method (e.g., in vitro transcription) and then introduced into the precursor cells via known methods such as mRNA electroporation. See, e.g., Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17: 1027-1035 (2006) .

[0204] The transduced or transfected precursor cell can be propagated ex vivo after introduction of the vector or nucleic acid. For example, the transduced or transfected immune cell can be cultured to propagate for at least about any of 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 9 days, 10 days, 12 days, or 14 days. The transduced or transfected immune cells may be further evaluated or screened to select the engineered mammalian cell, e.g., expressing the agent and / or engineered receptor.

[0205] Reporter genes may be used for identifying potentially transfected cells and for evaluating the functionality of regulatory sequences. In general, a reporter gene is a gene that is not present in or expressed by the recipient organism or tissue and that encodes a polypeptide whose expression is manifested by some easily detectable property, e.g., enzymatic activity. Expression of the reporter gene is assayed at a suitable time after the DNA has been introduced into the recipient cells. Suitable reporter genes may include genes encoding luciferase, beta-galactosidase, chloramphenicol acetyl transferase, secreted alkaline phosphatase, or the green fluorescent protein gene (e.g., Ui-Tei et al. FEBS Letters 479: 79-82 (2000) ) . Suitable expression systems are well known and may be prepared using known techniques or obtained commercially.

[0206] Other methods to confirm the presence of the nucleic acid, include, for example, molecular biological assays well known to those of skill in the art, such as Southern and Northern blotting, RT-PCR and PCR; biochemical assays, such as detecting the presence or absence of a particular peptide, e.g., by immunological methods (such as ELISAs and Western blots) .

[0207] In some embodiments, the engineered cell is a T cell. T cells for use in expansion and genetic modification can be obtained from a number of sources, including peripheral blood mononuclear cells, bone marrow, lymph node tissue, cord blood, thymus tissue, tissue from a site of infection, ascites, pleural effusion, spleen tissue, and tumors. In some embodiments, any number of T cell lines available in the art, may be used. For example, T cells can be obtained from a unit of blood collected from a subject using any number of techniques known to the skilled artisan, such as FicollTM separation. In some embodiments, cells from the circulating blood of an individual are obtained by apheresis. The apheresis product typically contains lymphocytes, including T cells, monocytes, granulocytes, B cells, other nucleated white blood cells, red blood cells, and platelets. The cells collected by apheresis may be washed to remove the plasma fraction and to place the cells in an appropriate buffer or media for subsequent processing steps. In some embodiments, the cells are washed with phosphate buffered saline (PBS) . In some embodiments, the wash solution lacks calcium and may lack magnesium or may lack many if not all divalent cations. Initial activation steps in the absence of calcium may lead to magnified activation. As those of ordinary skill in the art would readily appreciate a washing step may be accomplished by methods known to those in the art, such as by using a semi-automated “flow-through” centrifuge (for example, the Cobe 2991 cell processor, the Baxter CytoMate, or the Haemonetics Cell Saver 5) according to the manufacturer's instructions. After washing, the cells may be resuspended in a variety of biocompatible buffers, such as, for example, Ca2+-free, Mg2+-free PBS, PlasmaLyte A, or other saline solution with or without buffer. Alternatively, the undesirable components of the apheresis sample may be removed and the cells directly resuspended in culture media.

[0208] T cells can be isolated from peripheral blood lymphocytes by lysing the red blood cells and depleting the monocytes, for example, by centrifugation through a PERCOLLTM gradient or by counterflow centrifugal elutriation. A specific subpopulation of T cells, such as CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, and CD45RO+ T cells, can be further isolated by positive or negative selection techniques. For example, in some embodiments, T cells are isolated by incubation with anti-CD3 / anti-CD28 (i.e., 3×28) -conjugated beads, such as  M-450 CD3 / CD28 T, for a time period sufficient for positive selection of the desired T cells. In some embodiments, the time period is about 30 minutes. In a further embodiment, the time period ranges from about 30 minutes to about 36 hours or longer and all integer values there between, such as about 10 to about 24 hours. In a further embodiment, the time period is at least about 1, 2, 3, 4, 5, or 6 hours. For isolation of T cells from patients with leukemia, use of longer incubation times, such as 24 hours, can increase cell yield. Longer incubation times may be used to isolate T cells in any situation where there are few T cells as compared to other cell types, such in isolating T cells from tumor tissue or from immune-compromised individuals. Further, use of longer incubation times can increase the efficiency of capture of CD8+ T cells. For example, by simply shortening or lengthening the time T cells are allowed to bind to the CD3 / CD28 beads and / or by increasing or decreasing the ratio of beads to T cells, subpopulations of T cells can be preferentially selected for or against at culture initiation or at other time points during the process. Additionally, by increasing or decreasing the ratio of anti-CD3 and / or anti-CD28 antibodies on the beads or other surface, subpopulations of T cells can be preferentially selected for or against at culture initiation or at other desired time points. The skilled artisan would recognize that multiple rounds of selection can also be used. It may be desirable to perform the selection procedure and use the “unselected” cells in the activation and expansion process. “Unselected” cells can also be subjected to further rounds of selection.

[0209] Enrichment of a T cell population by negative selection can be accomplished with a combination of antibodies directed to surface markers unique to the negatively selected cells. One method is cell sorting and / or selection via negative magnetic immunoadherence or flow cytometry that uses a cocktail of monoclonal antibodies directed to cell surface markers present on the cells negatively selected. For example, to enrich for CD4+ cells by negative selection, a monoclonal antibody cocktail typically includes antibodies to CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, and CD8. It may be desirable to enrich for or positively select for regulatory T cells which typically express CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, and FoxP3+. Alternatively, in certain embodiments, T regulatory cells are depleted by anti-C25 conjugated beads or other similar method of selection.

[0210] For isolation of a desired population of cells by positive or negative selection, the concentration of cells and surface (e.g., particles such as beads) can be varied. It may be desirable to significantly decrease the volume in which beads and cells are mixed together (i.e., increase the concentration of cells) , to ensure maximum contact of cells and beads. For example, a concentration of 1 billion cells / ml or 2 billion cells / ml may be used. In a further embodiment, greater than 100 million cells / ml is used. In a further embodiment, a concentration of cells of 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, or 150 million cells / ml is used. Using high concentrations may result in increased cell yield, cell activation, and cell expansion. Further, use of high cell concentrations may allow more efficient capture of cells that may weakly express target antigens of interest, such as CD28-negative T cells, or from samples where there are many tumor cells present (i.e., leukemic blood, tumor tissue, etc. ) . Such populations of cells may have therapeutic value and would be desirable to obtain. In some embodiments, using high concentration of cells allows more efficient selection of CD8+ T cells that normally have weaker CD28 expression.EXAMPLES

[0211] The examples and exemplary embodiments below are intended to be purely exemplary of the disclosure and should therefore not be considered to limit the disclosure in any way. The following examples and detailed description are offered by way of illustration and not by way of limitation. Example 1: Detection of expression levels of Lair-1 and NKG2A in immune cells

[0212] Multicolor flow cytometry was used on PBMCs from healthy donors (No. 19058258) to analyze Lair-1 expression level in T cells (hCD5 positive) , B cells (hCD19 positive) , NK cells (hCD56 positive) and Monocyte cells (hCD14 positive) . As shown in FIGs. 1A-1B, the expression levels of Lair-1 are 84.26%in T cells, 92.68%in B cells, 94.34%in NK cells, and 99.96%in monocytes.

[0213] NK cells from three healthy volunteers (numbered SHZX158, 20063494, and SHZX162) were activated and expanded in vitro, and then the expression levels of NKG2A and Lair-1 were detected by flow cytometry. As shown in FIGs. 2A-2B, in NK cells from healthy volunteers SHZX158, 20063494, and SHZX162, the NKG2A positive rates were 60.09%, 77.38%, and 33.27%respectively, and the Lair-1 positive rates were 81.85%, 44.90%, and 80.70%respectively. The results show that like NKG2A, LAIR-1 is also highly expressed on NK cells. Example 2: Vector construction and lentivirus preparation

[0214] First, different anti-HvG molecules, such as HLA-E, CD47 and different structures of Rifins were fused with Flag and GPRC5D CAR. The structure of GPRC5D CAR is GPRC5D scFv-CD8hinge-CD8TM-41BB-CD3z (SEQ ID NO: 46) . The pLVX-Puro vector purchased from Clontech was digested with ClaI and EcoRI restriction enzymes to remove the CMV promoter, and the human EF1α promoter (GenBank: J04617.1) was cloned into the digested vector. Thus, the pLVX-hEF1α vector was obtained. The above fusion structure was cloned into the expression plasmid pLVX-hEF1α to form a recombinant anti-HvG molecule and CAR expression plasmid. The expression structure is shown in Table 2. Membrane-bound Lair-1 antibody structures were also constructed and co-expressed with CAR: HILB2 and HILB4 are Lair-1 antibodies, which were fused with CD28hinge and CD28TM to form a membrane-bound antibody structure. Exemplary RIFIN proteins include RIFIN1 (PF3D7_1254800) , RIFIN2 (PF3D7_0223100) , RIFIN3 (PF3D7_0500400) , RIFIN4 (PF3D7_1000500) , RIFIN5 (PF3D7_1254200) , RIFIN6 (PF3D7_1400600) , RI FIN7 (PF3D7_1040300) , RIFIN8 (PF3D7_1101100) . RIFIN proteins were modified to better co-express with CAR, such as replacing the original signal peptide, intercepting the variable region (VR) and transmembrane domains (TM) , intercepting fragments except the intracellular domain, etc. Table 2. CAR expression structures. "FL" represents full length; "VRTM" represents variable region + transmembrane domain; "FLWOI" represents full length without intracellular domain; "R6" represents RIFIN6; "R8" represents RIFIN8; "SP" represents signal peptide, such as CD8a SP.

[0215] The amino acid sequences of RIFIN1-FL, RIFIN8-FL, SP-R8VRTM, SP-R6VRTM, R8FLWOI, and HILB4-CD28hinge-CD28TM are shown in SEQ ID NO: 8, 10, 14, 13, 12, and 15, respectively.

[0216] Anti-HvG molecules and CAR expression plasmids were mixed with psPAX2 and pMD2. G helper plasmids in a certain proportion and co-transfected into HEK 293T cells. 60h after transfection, the cell culture supernatant containing the virus was collected and centrifuged at 4℃ and 3000 rpm for 5 min. After the supernatant was filtered through a 0.45 μm filter, the lentivirus concentrate was further concentrated using ultracentrifugation and stored at -80℃ for later use. Example 3: Preparation of anti-HvG molecules and CAR overexpression cells

[0217] Luciferase stably transfected K562 cells (K562. luc) were centrifuged and counted, and the cell density was adjusted to 2.5M / ml, and the lentivirus carrying different anti-HvG molecules and CAR genes prepared in Example 2 were added to K562. luc cells according to MOI (Multiplicity Of Infection) =5. After mixing thoroughly, the cells were cultured in the cell culture dish for seven days, and the positively transduced K562. luc cells were enriched using anti-flag magnetic beads. After enrichment, the expression levels of anti-HvG molecules and CAR in K562. luc cells were above 90% (FIG. 3) .

[0218] PBMC (20063494) from healthy donors were used to prepare unT (untransfected T cells) , CAR-T-M2676 (Mock) , CAR-T-M2814 (HLA-E) , and CAR-T-M2938 (R6VRTM) cells. The above cells were also modified to knock out B2M and LAIR1, using CRISPR / Cas9 on the 7th day of culture. B2M gRNA sequence is set forth in SEQ ID NO: 50, and LAIR1 gRNA sequence is set forth in SEQ ID NO: 51. Flow cytometry was performed after cell preparation was completed (Day 14) . As shown in FIG. 4A, the positive rates of lentiviral transduction of CAR-T-M2676 (Mock) , CAR-T-M2814 (HLA-E) , and CAR-T-M2938 (R6VRTM) were 96.79%, 51.65%, and 7.37%respectively. As shown in FIG. 4B, after gene knockout editing of unT, CAR-T-M2676 (Mock) , CAR-T-M2814 (HLA-E) , CAR-T-M2938 (R6VRTM) cells, Lair-1 and B2M The double negative rates were 66.53%, 80.32%, 87.02%and 88.62%, respectively.

[0219] The preparation process of CAR-T cells is as follows: cell culture medium was prepared with TexMACS medium supplemented with 300IU / ml IL2. PBMCs were resuscitated according to conventional methods, and transferred to a 50ml centrifuge tube. The cryopreservation solution was diluted to more than 5 times by adding culture medium, mixed by pipetting, and centrifuged at 400g for 10 minutes. After centrifugation, the supernatant was discarded, and fresh culture medium was added to resuspend the cells and adjust the cell density to 1*106 cells / ml. T cell transAct was added according to a certain proportion to activate T cells. The next day, the cells were counted, and the density was adjusted to 2.5M / ml. A certain volume of the lentivirus described in Example 2 was added according to MOI=5. After culturing for seven days, the B2M gene and Lair-1 gene on the cells were double-knocked out using CRISPR / Cas9, which was detected by flow cytometry. All cells were harvested then. Example 4: Evaluation of NK cell killing of K562. luc cells expressing anti-HvG molecule

[0220] PBMC (No. 20063494, SHZX158) from two healthy donors were used to expand NK cells using K562-IL15 feeder cells (K562 engineered to express IL-15) in vitro to obtain primed NK or activated primary NK. After cell harvest, flow cytometry was used to detect expression levels of the inhibitory molecules Lair-1 and NKG2A. As shown in FIG. 5, the NKG2A positive rate on 20063494-derived NK cells was 75%, and the Lair-1 positive rate was 42%; the NKG2A positive rate on SHZX158-derived NK cells was 60%, and the Lair-1 positive rate was 80%.

[0221] Evaluation of killing of K562. luc cells expressing anti-HvG molecule by NK effector cells: NK cells expanded in vitro using K562-IL15 feeder cells from PBMC (No. 20063494, SHZX158) were tested with the K562. luc cells expressing the anti-HvG molecules prepared in Example-3. Cells were incubated in Corning 384 white well plates for 12 h according to the ET (effect-target ratio) of 4: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2, or 1: 4 (NK as effector cells) . After the above cell incubation was completed, 25 μL One-Glo (TAKARA, Cat. No. B6120) was added to each well of the 384-well plate, and a microplate reader (TECAN, spark 10M) was used to detect the Luciferase fluorescence value and calculate the killing efficiency (or specific lysis rate) of each group of cells against the target cells.

[0222] FIG. 6A and FIG. 6B show the data of NK cells killing anti-HvG and CAR overexpressed K562. luc, in which CD47 and HLA-E are the control groups, and the Mock group is not transduced with anti-HvG molecules. The results show that compared to the HLA-E, CD47, and mock groups, R8VRTM, R8FL, HILB2, and R6VRTM all show better NK cell tolerance. As shown in FIG. 6A, when the ET ratio is 2: 1, the cell lysis rates of the M2939 (R8FLWOI) , M2935 (R8FL) , M2945 (HILB2) , and M2937 (R8VRTM) groups are lower than those of HLA-E, CD47, and mock groups; the cell lysis rates of the M2938 (R6VRTM) and M2940 (R6FLWOI) groups are lower than those of CD47 and Mock groups. As shown in FIG. 6B, when the ET ratio is 1: 1, the cell lysis rates of M2939 (R8FLWOI) , M2935 (R8FL) , M2945 (HILB2) , M2937 (R8VRTM) , M2938 (R6VRTM) and M2947 (HILB4) groups are lower than the CD47 and mock groups, lower than or similar to the HLA-E group; the cell lysis rate of the M2940 (R6FLWOI) group is lower than those of the CD47 and Mock groups. The cell lysis rate of the M2742 (RIFIN-1 -FL) group is lower than that of the CD47 group. Example 5: Evaluation of NK cell killing of CAR-T cells expressing anti-HvG molecules

[0223] The NK cells expanded from PBMC (No. 20063494) using K562-IL15 feeder cells in vitro were co-cultured with the anti-HvG molecule overexpressed CAR-T cells prepared in Example 3 according to the ET ratio of 4: 1. Cells were incubated in Corning 96-well plates for 24 h and 96 h. Multicolor flow cytometry was used to detect CD5, Lair-1 and B2M, analyze the proportion of Lair-1 and B2M double-negative cells in the CD5-positive gate, and evaluate the tolerance ability of the anti-HvG molecules overexpressed and B2M-negative CAR-T cells against NK cells. As shown in FIGs. 7A-7B, compared with the groups of control mock and HLA-E, B2M and Lair-1 double-negative CAR-T cells expressing R6VRTM have more cell survival in the NK co-culture system, suggesting that R6VRTM has better resistance to NK cell killing compared to HLA-E. Example 6: LAIR-1 gene knockout enhances CAR-T expansion

[0224] In Example 3, during the preparation process of CAR-T cells expressing anti-HvG molecules (HLA-E or R6VRTM) , double knockout of B2M and LAIR-1 genes was performed on Day 7, and cells with only B2M knocked out were used as controls. At different time points cell counts were performed, the proliferation fold (relative to the proliferation fold on day 2) was calculated, and the in vitro proliferation ability was evaluated. As shown in FIGs. 8A-8B, B2M knockout CAR-T cells starting from PBMC proliferate slowly or not at all. B2M knockout and continued LAIR -1 knockout can enhance the expansion of CAR-T cells. The results suggest that in LAIR-1 knockout CAR-T cells, the release of self-inhibitory signals can enhance cell proliferation. LAIR-1 gene knockout can be used as an armor strategy for CAR-T to enhance the efficacy and durability of CAR-T in clinical treatment.

Claims

1.An engineered cell comprising a nucleic acid encoding an agent that binds to Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 (LAIR-1) .2.The engineered cell of claim 1, wherein the agent activates LAIR-1.3.The engineered cell of claim 1 or 2, wherein the agent is bound to the membrane of the engineered cell.4.The engineered cell of claim 3, wherein the agent is bound to the membrane of the engineered cell by a transmembrane domain or via an anchor.5.The engineered cell of any one of claims 1-4, wherein the agent is derived from an RIFIN molecule.6.The engineered cell of claim 5, wherein the RIFIN molecule is RIFIN2, RIFIN6, RIFIN7, or RIFIN8.7.The engineered cell of claim 5 or 6, wherein the agent comprises a variable region of the RIFIN molecule.8.The engineered cell of any one of claims 5-7, wherein the agent comprises a transmembrane domain of a RIFIN molecule.9.The engineered cell of any one of claims 5-8, wherein the agent comprises a full length RIFIN molecule.10.The engineered cell of any one of claims 5-8, wherein the agent does not comprise an intracellular domain.11.The engineered cell of any one of claims 1-4, wherein the agent comprises an anti-LAIR-1 antibody or an antigen binding fragment thereof.12.The engineered cell of any one of claim 1-4 and 11, wherein the agent comprises a CD28 transmembrane domain.13.The engineered cell of any one of claims 1-4 and 11-12, wherein the agent comprises a CD28 hinge domain.14.The engineered cell of any one of claims 1-13, wherein the agent comprises an amino acid sequence having at least 80%sequence identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-16, and 54-57.15.The engineered cell of any one of claims 1-14, wherein said LAIR-1 is expressed on an effector immune cell.16.The engineered cell of claim 15, wherein the effector immune cell is a natural killer (NK) cell, a T cell, a B cell, a macrophage, or a dendritic cell.17.The engineered cell of any one of claims 1-16, wherein the engineered cell is an immune cell, or a stem cell or a cell differentiated therefrom.18.The engineered cell of claim 17, wherein the engineered cell is an immune cell selected from the group consisting of: T cell, NK cell, B cell, macrophage and CIK cell.19.The engineered cell of claim 17 or 18, wherein the engineered cell further comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an engineered receptor.20.The engineered cell of claim 19, wherein the engineered receptor targets a tumor antigen selected from the group consisting of CD19, BCMA, Claudin 18.2, NY-ESO-1, VEGFR2, MAGE-A3, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA, EGFR, GD2, HER2, IGF1R, mesothelin, PSMA, ROR1, GPC3, DLL3, GPRC5D, CLL1, WT1 and combinations thereof.21.The engineered cell of claim 19 or 20, wherein the engineered receptor is selected from the group consisting of: a chimeric antigen receptor (CAR) , an engineered TCR, a chimeric T cell receptor (cTCR) , a T-cell antigen coupler (TAC) receptor, and a TAC-like engineered receptor.22.The engineered cell of claim 21, wherein the engineered receptor is a CAR.23.The engineered cell of any one of claims 1-22, wherein the engineered cell is further modified to have a reduced expression and / or function of LAIR-1 compared to an engineered cell that is not modified to have a reduced expression and / or function of LAIR-1.24.The engineered cell of claim 23, wherein the engineered cell is genetically modified.25.The engineered cell of claim 24, wherein the engineered cell comprises a LAIR-1 knockdown or knockout mutation.26.A pharmaceutical composition comprising the engineered cell of any one of claims 1-25, and a pharmaceutically acceptable carrier.27.A method of inhibiting effector immune cells that express LAIR-1, comprising contacting the effector immune cells with the engineered cell of any one of claims 1-25, or the pharmaceutical composition of claim 26.28.A method of treating a disease or condition in an individual in need thereof, comprising administering to the individual an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 26.29.The method of claim 28, wherein the engineered cell is allogeneic.30.The method of claim 28 or 29, wherein the individual is human.31.The method of any one of claims 28-30, wherein the method reduces undesired immune response against the engineered cell in the individual compared to a method using a reference cell that does not comprise the nucleic acid encoding the agent.32.The method of claim 31, wherein the undesired immune response comprises Host-versus-Graft (HvG) response.33.The method of claim 32, wherein the HvG response is mediated by T cells of the individual.34.The method of claim 32 or 33, wherein the HvG response is mediated by NK cells of the individual.35.The method of any one of claims 28-34, wherein the method (i) increases immune tolerance towards the engineered cell in the individual and / or (ii) increases persistence of the engineered cell in the individual compared to a method using a reference cell that does not comprise the nucleic acid encoding the agent.36.The method of any one of claims 28-35, wherein the disease or condition is a cancer, an autoimmune disease, or an infectious disease.37.A method of (i) reducing graft rejection and / or (ii) increasing persistence of allogeneic cells in an individual in need thereof, comprising administering to the individual an effective amount of the engineered cell of any one of claims 1-25, or the pharmaceutical composition of claim 26.38.A method of (i) reducing graft rejection and / or (ii) increasing persistence of allogeneic cells in an individual in need thereof, comprising introducing into the allogeneic cells a nucleic acid encoding an agent which activates LAIR-1 on an effector immune cell.39.An engineered immune cell, wherein the engineered immune cell has reduced expression and / or function of LAIR-1 compared to a reference immune cell that is not engineered to have reduced expression and / or function of LAIR-1.40.The engineered immune cell of claim 39, wherein the engineered immune cell is genetically modified.41.The engineered immune cell of claim 40, wherein the engineered immune cell comprises a LAIR-1 knockdown or knockout mutation.42.The engineered immune cell of any one of claims 39-41, wherein the engineered immune cell has stronger proliferation activity compared to a reference immune cell that is not engineered to have reduced expression and / or function of LAIR-1.43.The engineered immune cell of any one of claims 39-42, further comprising reduced expression and / or function of B2M compared to a reference immune cell that is not engineered to have reduced expression and / or function of B2M.44.The engineered immune cell of claim 43, wherein the engineered immune cell comprises a B2M knockdown or knockout mutation.45.The engineered immune cell of claim 41 or 44, wherein the LAIR-1 and / or B2M knockdown or knockout mutation is introduced into the engineered immune cell using CRISPR / Cas, base editors, TALENs, or ZFNs.46.The engineered immune cell of claim 45, wherein the LAIR-1 and / or B2M knockdown or knockout mutation is introduced into the engineered immune cell using CRISPR / Cas9.47.The engineered immune cell of any one of claims 39-46, further comprising a heterologous nucleic acid sequence encoding an engineered receptor.48.The engineered immune cell of claim 47, wherein the engineered receptor is a CAR.49.The engineered immune cell of any one of claims 39-48, wherein the engineered immune cell is a T cell.50.A method of producing the engineered immune cell of any one of claims 39-49, comprising introducing a CRISPR / Cas9 system into a precursor immune cell, wherein the CRISPR / Cas9 system comprises a gRNA comprising the sequence of SEQ ID NO: 51.51.A method of treating a disease or condition in an individual in need thereof, comprising administering to the individual an effective amount of the engineered immune cell of any one of claims 39-49.52.The method of claim 51, wherein the engineered immune cell is allogeneic.53.The method of claim 51 or 52, wherein the individual is a human.54.An agent that binds to LAIR-1 on an effector immune cell, wherein the agent activates LAIR-1.55.The agent of claim 54, wherein the agent comprises a transmembrane domain.56.The agent of claim 54 or 55, wherein the agent is a truncate of a RIFIN molecule; optionally wherein the RIFIN molecule is RIFIN6 or RIFIN8.57.The agent of claim 56, wherein the agent lacks the intracellular domain compared to the RIFIN molecule.58.The agent of claim 56 or 57, wherein the agent comprises a variable region and a transmembrane domain of the RIFIN molecule.59.The agent of claim 54 or 55, wherein the agent comprises an anti-LAIR-1 antibody or an antigen binding fragment thereof.60.The agent of claim 59, wherein the agent comprises a CD28 transmembrane domain and a CD28 hinge domain.61.The agent of any one of claims 54-60, wherein the agent comprises an amino acid sequence having at least about 80%sequence identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-16 and 54-57.62.A nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding the agent of any one of claims 54-61.63.The nucleic acid of claim 62, further comprising a nucleic acid sequence encoding an engineered receptor.64.A method of treating or preventing a disease or condition in an individual in need thereof, comprising administering to the individual an effective amount of the agent of any one of claims 54-61, optionally wherein the disease or condition is HvG response.65.A method of treating or preventing a disease or condition in an individual in need thereof, comprising administering to the individual the agent of any one of claims 54-61 and an engineered immune cell, optionally wherein the disease or condition is cancer or autoimmune disease.66.The method of claim 65, wherein the engineered immune cell has reduced expression and / or function of LAIR-1 compared to a reference immune cell that is not engineered to have reduce expression level and / or function of LAIR-1, and / or the engineered immune cell comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding an engineered receptor.

Images