Compounds for treating metabolic disorders

Abstract

Compounds are provided that have activity at each of the GIP receptor, GLP-1 receptor, glucagon receptor and pcsk9. Methods also are provided for treating diseases such as diabetes mellitus, type 2 diabetes, obesity, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), dyslipidemia, cardiovascular disease, and metabolic syndrome.

Description

COMPOUNDS FOR TREATING METABOLIC DISORDERSFIELD

[0001] The present disclosure in some aspects relates generally to conjugates comprising an anti-PCSK9 antibody and a GLP-1 / GIP / Glucagon (GCG) receptor triagonist, compositions comprising such conjugates, methods of preparing them, and methods of their use for treating diseases and disorders.BACKGROUND

[0002] Over the past several decades, the prevalence of diabetes has continued to rise. The current standard of care for diabetes such as type 2 diabetes mellitus (T2DM) or other metabolic diseases includes diet and exercise, as well as treatment with oral medications and injectable glucose-lowering drugs including incretin-based therapies, such as GLP-1 receptor agonists. A variety of GLP-1 analogs are currently available for treating metabolic disorders such as T2DM, including dulaglutide, exenatide and liraglutide. Many currently marketed GLP-1 receptor agonists, however, are dose-limited by gastrointestinal side effects, such as nausea and vomiting. Despite the treatment options available, significant numbers of individuals receiving approved therapies are not reaching glycemic control goals (see, e.g., Casagrande et al. (2013) Diabetes Care 36: 2271-2279) . Therefore, therapies effective in glucose control and weight reduction are needed for better disease management.

[0003] PCSK9 is a nonenzymatic target for LDL cholesterol reduction and PCSK9 mutations correlate with reductions in LDL cholesterol and coronary heart disease. Cohen JC, N Engl J Med, 354: 1264 (2006) . PCSK9 antibodies have been shown to reduce LDL cholesterol in statin-treated patients and multiple candidates are undergoing clinical review.

[0004] While there are a plurality of individual treatments for diabetes and cardiovascular diseases, there is a need for a single pharmaceutical composition to address both disease states (and the relationship between diabetes and cardiovascular disease) . Providing a single pharmaceutical compound that has dual activities will reduce side effects, difficulties with patient compliance, and will increase beneficial outcomes to individual patients and will decrease costs incurred by the health care system. The present application addresses these and other needs.SUMMARY

[0005] In one aspect, provided herein is a conjugate of Formula (O) : or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein: Ab is an anti-PCSK9 antibody or an antigen-binding fragment thereof; Lk is a linking moiety or a bond; Pp is a GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist; n is an integer ranging from 1 to 20; and wherein Pp is connected to Lk via a covalent bond, and each of Pp-Lk is independently connected to Ab via a covalent bond.

[0006] In some embodiments, the GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist Pp is a peptide. In some embodiments, the peptide is selected from the group consisting of retatrutide, HM15211, HM15275, MWN101, and UBT251, or the peptide comprises Formula (I) , or a pharmaceutically acceptable salt thereof, Y-X2-Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-I-X13-L-D-K-X17-A-X19-X20-A-F-I-E-Y-L-L-X28-X29-X30-X31 (SEQ ID NO: 65) (I) wherein: X2 is Aib; X13 is L, or αMeL, X17 is K, C, E, or D, X19 is Q or A, X20 is Aib, αMeK, Q or H, X28 is E or A, X29 is G or Aib, X30 is G or Aib, and X31 is G or absent, wherein the C-terminal amino acid of the peptide is connected to Lk via a covalent bond.

[0007] In some embodiments, the peptide is of Formula (I) . In some embodiments, X13 is αMeL. In some embodiments, X17 is K. In some embodiments, X19 is Q. In some embodiments, X20 is Aib. In some embodiments, X28 is E. In some embodiments, X29 is G. In some embodiments, X30 is G. In some embodiments, X31 is G. In some embodiments, the peptide is: Y- (Aib) -Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-I- (αMeL) -L-D-K-K-A-Q- (Aib) -A-F-I-E-Y-L-L-E-G-G (SEQ ID NO: 66) or Y- (Aib) -Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-I- (αMeL) -L-D-K-K-A-Q- (Aib) -A-F-I-E-Y-L-L-E-G-G-G (SEQ ID NO: 67) .

[0008] In some embodiments, the linking moiety Lk comprises a peptide. In some embodiments, the linking moiety Lk comprises formula L1-L2-L3-L4-, wherein each of L1, L2, L3, and L4 is independent a bond, V-A, V-C, V-K-G, G-G-F-G (SEQ ID NO: 68) , or G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , provided that at least one of L1, L2, L3, and L4 is G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , and wherein Pp is connected to Lk via a peptide bond between the C-terminal amino acid of Pp and the N-terminal amino acid of Lk.

[0009] In some embodiments, the linking moiety Lk has a Formula of L1-L2-L3-L4-XL, wherein each of L1, L2, L3, and L4 is independently a bond, V-A, V-C, V-K-G, G-G-F-G (SEQ ID NO: 68) , or G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , provided that at least one of L1, L2, L3, and L4 is G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , Pp is connected to Lk via a peptide bond between the C-terminal amino acid of Pp and the N-terminal amino acid of Lk;and XL is a bond, K,  or wherein *indicates the point of connection to L4 and **indicates the point of connection to Ab.

[0010] In some embodiments, L1 is G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , L2 is G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , L3 is a bond, and L4 is a bond. In some embodiments, L1 is G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , L2 is G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , L3 is G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , and L4 is a bond. In some embodiments, XL is a bond. In some embodiments, XL is K. In some embodiments, XL is In some embodiments, XL is

[0011] In some embodiments, the linking moiety is selected from the group consisting of: #-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-** (SEQ ID NO: 70) ; #-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-** (SEQ ID NO: 71) ; wherein #indicates the point of connection to Pp and **indicates the point of connection to Ab.

[0012] In some embodiments, each Pp-Lk is independently selected from the group consisting of: wherein **indicates the point of connection to Ab.

[0013] In some embodiments, the linking moiety Lk is a bond.

[0014] In some embodiments, Pp is a compound with a molecule weight less than 5 kD. In some embodiments, Pp is a compound with a molecule weight less than 1 kD .

[0015] In some embodiments, Ab comprises a cysteine or non-canonical amino acid substitution at one or more conjugation site (s) .

[0016] In some embodiments, the Pp-Lk is conjugated to Ab through the side chain of the cysteine residue or non-canonical amino acid residue substituted at the one or more conjugation site (s) . In some embodiments, the Pp-Lk is conjugated to Ab through the -SH group in the cysteine residue of Ab. In some embodiments, the Pp-Lk is conjugated to Ab through a thioether bond.

[0017] In some embodiments, Ab comprises a heavy chain variable (VH) region and a light chain variable (VL) region, wherein: 1) the VH region comprises a heavy chain complementarity determining region 1 (CDR-H1) , a heavy chain complementarity determining region 2 (CDR-H2) , and a heavy chain complementarity determining region 3 (CDR-H3) contained within SEQ ID NO: 25, and the VL region comprises a light chain complementarity determining region 1 (CDR-L1) , a light chain complementarity determining region 2 (CDR-L2) and a light chain complementarity determining region 3 (CDR-L3) contained within SEQ ID NO: 26; 2) the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 contained within SEQ ID NO: 27, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2 and a CDR-L3 contained within SEQ ID NO: 28; 3) the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 contained within SEQ ID NO: 29, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2 and a CDR-L3 contained within SEQ ID NO: 30; or 4) the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 contained within SEQ ID NO: 31, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2 and a CDR-L3 contained within SEQ ID NO: 32.

[0018] In some embodiments, 1) the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 1, 2, and 3, respectively, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2, and a CDR-L3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 4, 5, and 6, respectively; 2) the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 7, 8, and 9, respectively, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2, and a CDR-L3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 10, 11, and 12, respectively; 3) the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 13, 14, and 15, respectively, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2, and a CDR-L3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 16, 17, and 18, respectively; or 4) the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 19, 20, and 21, respectively, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2, and a CDR-L3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 22, 23, and 24, respectively.

[0019] In some embodiments, 1) the VH region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 25, and the VL region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 26; 2) the VH region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 27, and the VL region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 28; 3) the VH region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 29, and the VL region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 30; or 4) the VH region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 31, and the VL region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 32.

[0020] In some embodiments, the VH region and the VL region are or comprise: the sequence set forth in SEQ ID NO: 25 and 26, respectively; the sequence set forth in SEQ ID NO: 27 and 28, respectively; the sequence set forth in SEQ ID NO: 29 and 30, respectively; or the sequence set forth in SEQ ID NO: 31 and 32, respectively.

[0021] In some embodiments, Ab comprises a heavy chain constant region (or Fc) from an IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, or IgM. In some embodiments, Ab comprises a heavy chain constant region from an IgG1 or a variant thereof. In some embodiments, Ab comprises a heavy chain constant region from human IgG (such as IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4) or a variant thereof. In some embodiments, the heavy chain constant region from an IgG1 (human IgG1) comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 33 or a variant thereof. In some embodiments, Ab comprises a cysteine or non-canonical amino acid substitution at one or more conjugation site (s) . In some embodiments, Ab comprises a cysteine at position 272 based on EU numbering relative to reference sequence SEQ ID NO: 33 or a variant thereof. In some embodiments, Ab comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 34. In some embodiments, Ab comprises LALA, M252Y, S254T, and / or T256E mutation. In some embodiments, Ab comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 35.

[0022] In some embodiments, Ab comprises an alanine at position 297 relative to reference sequence SEQ ID NO: 33 based on EU numbering, and / or post modifications.

[0023] In some embodiments, Ab comprises a heavy chain constant region from an IgG2 (human IgG2) or a variant thereof. In some embodiments, the heavy chain constant region from an IgG2 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 37.

[0024] In some embodiments, Ab comprises a light chain constant region from kappa (κ) or lambda (λ) chain of an immunoglobulin. In some embodiments, Ab comprises a light chain constant region from human κ or λ chain. In some embodiments, the light chain constant region comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 91 or 92.

[0025] In some embodiments, (1) Pp-Lk is and (2) Ab comprises a heavy chain constant (CH) region, wherein the CH region are or comprise the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-36.

[0026] In some embodiments, (1) Pp-Lk is and (2) Ab comprises a heavy chain constant (CH) region, wherein the CH region are or comprise the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 33-35.

[0027] In some embodiments, (1) Pp-Lk is and (2) Ab comprises a heavy chain constant (CH) region, wherein the CH region are or comprise the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 33-35.

[0028] In some embodiments, n is an integer ranging from 1 to 12. In some embodiments, n is an integer ranging from 1 to 8.

[0029] In some embodiments, an average DAR value of the conjugate is an integer or decimal from 1 to 12, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 4, 1 to 3, 1.5 to 2.5, 2 to 8, 2 to 6, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3.

[0030] In one aspect, provided herein is a pharmaceutical composition, comprising a conjugate provided herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a pharmaceutical excipient.

[0031] In one aspect, provided herein is a method of treating a disease mediated by glucagon receptor, GLP-1 receptor, or GIP receptor, or any combination thereof, in a subject in need thereof, comprising administering a conjugate provided herein, or the pharmaceutical composition provided herein, to the subject. In some embodiments, the conjugate or the pharmaceutical composition is administered in a therapeutically effective amount to the subject. In some embodiments, the disease is selected from the group consisting of diabetes mellitus, type 2 diabetes, obesity, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) , non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , dyslipidemia, cardiovascular disease, and metabolic syndrome. In some embodiments, the subject is a mammal. In some embodiments, the subject is a primate (such as human, chimpanzee, rhesus, cynomolgus) , mouse, rat, pig, sheep, goat, horse, cat, or dog. In some embodiments, the subject is human.

[0032] In one aspect, provided herein is use of the conjugate or the pharmaceutical composition herein in preparing a medicament for treating a disease mediated by glucagon receptor, GLP-1 receptor, or GIP receptor, or any combination thereof in a subject in need thereof. In some embodiments, the disease is selected from the group consisting of diabetes mellitus, type 2 diabetes, obesity, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) , non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , dyslipidemia, cardiovascular disease, and metabolic syndrome. In some embodiments, the subject is a mammal. In some embodiments, the subject is a primate (such as human, chimpanzee, rhesus monkey, cynomolgus monkey) , mouse, rat, pig, sheep, goat, horse, cat, or dog. In some embodiments, the subject is human.

[0033] In one aspect, provided herein is use of the conjugate or the pharmaceutical composition herein for treating a disease mediated by glucagon receptor, GLP-1 receptor, or GIP receptor, or any combination thereof in a subject in need thereof. In some embodiments, the disease is selected from the group consisting of diabetes mellitus, type 2 diabetes, obesity, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) , non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , dyslipidemia, cardiovascular disease, and metabolic syndrome. In some embodiments, the subject is a mammal. In some embodiments, the subject is a primate (such as human, chimpanzee, rhesus, cynomolgus) , mouse, rat, pig, sheep, goat, horse, cat, or dog. In some embodiments, the subject is human.

[0034] In one aspect, provided herein is a conjugate or a pharmaceutical composition herein for use in the treatment of a disease mediated by glucagon receptor, GLP-1 receptor, or GIP receptor, or any combination thereof in a subject in need thereof. In some embodiments, the disease is selected from the group consisting of diabetes mellitus, type 2 diabetes, obesity, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) , non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , dyslipidemia, cardiovascular disease, and metabolic syndrome. In some embodiments, the subject is a mammal. In some embodiments, the subject is a primate (such as human, chimpanzee, rhesus, cynomolgus) , mouse, rat, pig, sheep, goat, horse, cat, or dog. In some embodiments, the subject is human.

[0035] In one aspect, provided herein is a method for preparing a conjugate having a structure of Formula (O) : or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein: Ab is an anti-PCSK9 antibody or antigen-binding fragment thereof; Lk is a linking moiety or a bond; Pp is a peptide that is a GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist, wherein the peptide comprises an activated chemical moiety; the method comprising a) contacting the antibody or antigen-binding fragment with a cysteine blocking agent, wherein the cysteine blocking agent forms a stable mixed disulfide with at least one cysteine residue of the antibody or antigen-binding fragment; b) contacting the antibody or antigen-binding fragment with a reducing agent to form a reduced antibody or antigen-binding fragment; and c) contacting the reduced antibody or antigen-binding fragment with a precursor peptide-linker compound Pp-Lk1 comprising an activated chemical moiety to form the conjugate; wherein the method does not use an oxidizing agent.

[0036] In some embodiments, the mixed disulfide is an antibody or antigen-binding fragment with a capped free cysteine. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment with a capped free cysteine comprises a cap selected from the group consisting of cysteine, cysteamine, cystamine, and glutathione. In some embodiments, the method further comprises removing excess cysteine blocking agent. In some embodiments, the excess cysteine blocking agent is removed by ultrafiltration or cation exchange chromatography. In some embodiments, the reducing agent is selected from the group consisting of triphenylphosphine-3, 3', 3"-trisulfonate ( “TPPTS” ) , tris (2-carboxyethyl) phosphine ( “TCEP” ) , and triphenylphosphine-3, 3'-disulfonate ( “TPPDS” ) . In some embodiments, the molar ratio of reducing agent to antibody or antigen-binding fragment is 2 to 4: 1.

[0037] In some embodiments, the method further comprises removing excess reducing agent. In some embodiments, the excess reducing agent is removed by buffer exchange. In some embodiments, the buffer exchange step is ultrafiltration / diafiltration.

[0038] In some embodiments, the activated chemical moiety comprises a halogen, wherein the halogen is selected from the group consisting of Br, I, and Cl. In some embodiments, the molar ratio of the peptide having an activated chemical moiety to the antibody or antigen-binding fragment is 2 to 6: 1.

[0039] In some embodiments, the method further comprises purification step d) removing the excess precursor peptide-linker compound Pp-Lk1. In some embodiments, the purification step comprises size exclusion chromatographic, hydrophobic interaction chromatography ( “HIC” ) , or ultrafiltration / diafiltration, or any combination thereof.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0040] The drawings illustrate certain embodiments of the features and advantages of this disclosure. These embodiments are not intended to limit the scope of the appended claims in any manner.

[0041] FIG. 1 shows illustrations of the antibody peptide conjugate (APC) prepared in Example 3.

[0042] FIG. 2 shows hydrophobicity measurement results of selected APCs.

[0043] FIG. 3 shows huPCKS9 protein binding activities of APC001 and control antibody tafolecimab.

[0044] FIG. 4A and FIG. 4B show PCSK9 / LDLR interaction blocking activities of various APC samples and control antibodies or drugs.

[0045] FIG. 5A and FIG. 5B show PCSK9 / LDLR interaction blocking and LDL-c update promotion activities of various APC samples and control antibodies or drugs.

[0046] FIG. 6A and FIG. 6B show the induction of cAMP generation from CHO-K1 GLP-1R cells by various tested samples. FIG. 6C shows the induction of cAMP generation from CHO-K1 GCGR cells by various tested samples. FIG. 6D shows the induction of cAMP generation from CHO-K1 GIPR cells by various tested samples.

[0047] FIG. 7 shows the induction of insulin secretion in Ins-1e cell line by various tested samples.

[0048] FIG. 8A and FIG. 8B show the changes in body weight and blood glucose in huPCSK9 mice (i.e., iniv-1750-huPCSK9 KI mice or huPCSK9 KI mice) , respectively. FIG. 8C shows the AUC during OGTT. FIG. 8D shows the change of LDL-c in huPCSK9 mice over test period.

[0049] FIG. 9A to FIG. 9N show physiological parameters or the change thereof in huPCSK9 transgenic mice treated with various test samples .

[0050] FIG. 10A shows the change in body weight in huPCSK9 mice dosed with various samples. FIG. 10B to FIG. 10F show the results of OGTT tests.

[0051] FIG. 11A shows the change in body weight in ob / ob mice dosed with various samples. FIG. 11B to FIG. 11E show the results of OGTT tests. FIG. 11F and FIG. 11G show changes of LDL-c levels in ob / ob mice dosed with various samples.

[0052] FIG. 12A and FIG. 12B show the results of OGTT experiments in GLP-1R KO mice dosed with various test samples.

[0053] FIG. 13A shows the change in body weight in rats dosed with various samples. FIG. 13B to FIG. 13E show the results of OGTT tests in rats. FIG. 13F shows changes of LDL-c levels in rats dosed with various samples.

[0054] FIG. 14 shows an exemplary method for preparing the antibody-peptide conjugates provided herein.

[0055] FIG. 15A to FIG. 15H shows the changes in cardiovascular risk indicators such as uric acid (UA) , creatine kinase (CK) , and circulating immune complex (CIC) , LDL-c and total cholesterol, body weight, food consumption and serum insulin level in cynomolgus monkeys after being administered the exemplary APC at different doses.DETAILED DESCRIPTION

[0056] The following description is presented to enable a person of ordinary skill in the art to make and use the various embodiments. Descriptions of specific devices, techniques, and applications are provided only as examples. Various modifications to the examples described herein will be readily apparent to those of ordinary skill in the art, and the general principles defined herein may be applied to other examples and applications without departing from the spirit and scope of the various embodiments. Thus, the various embodiments are not intended to be limited to the examples described herein and shown, but are to be accorded the scope consistent with the claims.

[0057] In one aspect, provided herein are conjugates comprising a drug moiety that has agonistic activities at each of the GIP, GLP-1 and glucagon receptors and an anti-PCSK9 antibody. Advantageously, the conjugates described herein have (1) longer half-life and stability compared to the isolated drug moiety, (2) extended duration of action at each of the GIP, GLP-1 and glucagon receptors, (3) satisfying activity at any one receptor without overwhelming activity at the other two receptors, thereby resulting in less side effects, and (4) can target at PCSK9 and control cholesterol profile. All of these features allow for longer dosing intervals (e.g., once-a-day, thrice-weekly, twice-weekly or once-a-week) with satisfying dual efficacy for both glucose control and cholesterol control. In this manner, the conjugates described herein could result in enhanced glucose control, metabolic benefits such as body weight lowering and / or improved body composition, lipid benefits such as proprotein convertase subtilisin / kexin type 9 (PCSK9) lowering, and / or other benefits such as an increase in bone mass or bone formation or a decrease in bone resorption. I. Definition

[0058] As used in the present specification, the following words and phrases are generally intended to have the meanings as set forth below, except to the extent that the context in which they are used indicates otherwise.

[0059] Unless otherwise specified, the term “bond” means a single bond.

[0060] The singular forms “a” and “the” include plural references unless the context clearly dictates otherwise. Thus, e.g., reference to “the compound” includes a plurality of such compounds and reference to “the compound” includes reference to one or more compounds and equivalents thereof known to those skilled in the art.

[0061] As used herein, “about” means within a statistically meaningful range of a value or values such as, for example, a stated concentration, length, molecular weight, pH, sequence identity, time frame, temperature or volume. Such a value or range can be within an order of magnitude typically within 20%, more typically within 10%, and even more typically within 5%of a given value or range. The allowable variation encompassed by “about” will depend upon the particular system under study, and can be readily appreciated by one of skill in the art. “About” a parameter or value includes and describes that parameter or value per se. For example, “about X” includes and describes X per se.

[0062] The term “antibody” includes monoclonal antibodies (including full length antibodies which have an immunoglobulin Fc region) , antibody compositions with polyepitopic specificity, multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies, diabodies, and single-chain molecules) , as well as antibody fragments (e.g., Fab, F (ab') 2, and Fv) . The term “immunoglobulin” (Ig) is used interchangeably with “antibody” herein.

[0063] The basic 4-chain antibody unit is a heterotetrameric glycoprotein composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. An IgM antibody consists of 5 of the basic heterotetramer units along with an additional polypeptide called a J chain, and contains 10 antigen binding sites, while IgA antibodies comprise from 2-5 of the basic 4-chain units which can polymerize to form polyvalent assemblages in combination with the J chain. In the case of IgGs, the 4-chain unit is generally about 150,000 daltons. Each L chain is linked to an H chain by one covalent disulfide bond, while the two H chains are linked to each other by one or more disulfide bonds depending on the H chain isotype. Each H and L chain also has regularly spaced intrachain disulfide bridges. Each H chain has at the N-terminus, a variable domain (VH) followed by three constant domains (CH) for each of the α and γ chains and four CH domains for μ and ε isotypes. Each L chain has at the N-terminus, a variable domain (VL) followed by a constant domain at its other end. The VL is aligned with the VH and the CL is aligned with the first constant domain of the heavy chain (CH1) . Particular amino acid residues are believed to form an interface between the light chain and heavy chain variable domains. The pairing of a VH and VL together forms a single antigen-binding site. For the structure and properties of the different classes of antibodies, see e.g., Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds) , Appleton &Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6. The L chain from any vertebrate species can be assigned to one of two clearly distinct types, called kappa and lambda, based on the amino acid sequences of their constant domains. Depending on the amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains (CH) , immunoglobulins can be assigned to different classes or isotypes. There are five classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, having heavy chains designated α, δ, ε, γ and μ, respectively. The γ and α classes are further divided into subclasses on the basis of relatively minor differences in the CH sequence and function, e.g., humans express the following subclasses: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2.

[0064] As used herein, the term “CDR” or “complementarity determining region” is intended to mean the non-contiguous antigen combining sites found within the variable region of both heavy and light chain polypeptides. These particular regions have been described by Kabat et al., J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977) ; Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991) ; Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) ; Al-Lazikani B. et al., J. Mol. Biol., 273: 927-948 (1997) ; MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996) ; Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008) ; Lefranc M. P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77 (2003) ; and Honegger and Plückthun, J. Mol. Biol., 309: 657-670 (2001) , where the definitions include overlapping or subsets of amino acid residues when compared against each other. Nevertheless, application of either definition to refer to a CDR of an antibody or grafted antibodies or variants thereof is intended to be within the scope of the term as defined and used herein. The amino acid residues which encompass the CDRs as defined by each of the above-cited references are set forth below in Table 1 as a comparison. CDR prediction algorithms and interfaces are known in the art, including, for example, Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008) ; Ehrenmann F. et al., Nucleic Acids Res., 38: D301-D307 (2010) ; and Adolf-Bryfogle J. et al., Nucleic Acids Res., 43: D432-D438 (2015) . The contents of the references cited in this paragraph are incorporated herein by reference in their entireties for use in the present application and for possible inclusion in one or more claims herein. In some embodiments, the CDR sequences provided herein are based on IMGT definition. For example, the CDR sequences may be determined by the VBASE2 tool (http:  / / www. vbase2. org / vbase2. php, see also Retter I, Althaus HH, Münch R, Müller W: VBASE2, an integrative V gene database. Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1; 33 (Database issue) : D671-4, which is incorporated herein by reference in its entirety) . 1Residue numbering follows the nomenclature of Kabat et al., supra2Residue numbering follows the nomenclature of Chothia et al., supra3Residue numbering follows the nomenclature of MacCallum et al., supra4Residue numbering follows the nomenclature of Lefranc et al., supra5Residue numbering follows the nomenclature of Honegger and Plückthun, supra

[0065] The “variable region” or “variable domain” of an antibody refers to the amino-terminal domains of the heavy or light chain of the antibody. The variable domain of the heavy chain may be referred to as “VH. ” The variable domain of the light chain may be referred to as “VL. ” These domains are generally the most variable parts of an antibody and contain the antigen-binding sites.

[0066] As used herein, an "Fc" region contains two heavy chain fragments comprising the CH2 and CH3 domains of an antibody. The two heavy chain fragments are held together by two or more disulfide bonds and by hydrophobic interactions of the CH3 domains.

[0067] As used herein, “percent (%) amino acid sequence identity” or “homology” with respect to the polypeptide and antibody sequences identified herein is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical with the amino acid residues in the polypeptide being compared, after aligning the sequences considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved in various ways that are within the skill in the art, for instance, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign (DNASTAR) , or MUSCLE software. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full-length of the sequences being compared. For purposes herein, however, %amino acid sequence identity values are generated using the sequence comparison computer program MUSCLE (Edgar, R. C., Nucleic Acids Research 32 (5) : 1792-1797, 2004; Edgar, R. C., BMC Bioinformatics 5 (1) : 113, 2004) .

[0068] An amino acid substitution may include but are not limited to the replacement of one amino acid in a polypeptide with another amino acid. Exemplary substitutions are shown in Table 2. Amino acid substitutions may be introduced into an antibody of interest and the products screened for a desired activity, for example, retained / improved antigen binding, decreased immunogenicity, or improved ADCC or CDC. Amino acids may be grouped according to common side-chain properties: (1) hydrophobic: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) neutral hydrophilic: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acidic: Asp, Glu; (4) basic: His, Lys, Arg; (5) residues that influence chain orientation: Gly, Pro; (6) aromatic: Trp, Tyr, Phe.

[0069] Non-conservative substitutions will entail exchanging a member of one of these classes for another class.

[0070] The term “conservative amino acid substitution” as used herein means an amino acid substitution in which an amino acid residue is substituted by another amino acid residue having a side chain R group with similar chemical properties (e.g., charge or hydrophobicity) . Examples of groups of amino acids that have side chains with similar chemical properties include 1) aliphatic side chains: glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine; 2) aliphatic-hydroxyl side chains: serine and threonine; 3) amide-containing side chains: asparagine and glutamine; 4) aromatic side chains: phenylalanine, tyrosine, and tryptophan; 5) basic side chains: lysine, arginine, and histidine; 6) acidic side chains: aspartic acid and glutamic acid; and 7) sulfur-containing side chains: cysteine and methionine. Conservative amino acids substitution groups are: valine-leucine-isoleucine, phenylalanine-tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, glutamate-aspartate, and asparagine-glutamine.

[0071] As used herein, “treatment” or “treating” is an approach for obtaining a beneficial or desired result, such as a clinical result. For purposes of this disclosure, beneficial or desired results include, but are not limited to, alleviation of a symptom and / or diminishment of the extent of a symptom and / or preventing a worsening of a symptom associated with a disease or condition. In one variation, beneficial or desired clinical results include, but are not limited to, alleviation of a symptom and / or diminishment of the extent of a symptom and / or preventing a worsening of a symptom associated with a disease provided herein, such as a metabolic disorder. Preferably, treatment of a disease or condition with a compound of the disclosure, or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, or tautomer thereof, is accompanied by no or fewer side effects than are associated with currently available therapies for the disease or condition and / or improves the quality of life of the individual.

[0072] As used herein, “effective amount” means an amount, concentration or dose of one or more incretin analogs described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof which, upon single or multiple dose administration to an individual in need thereof, provides a desired effect in such an individual under diagnosis or treatment. An effective amount can be readily determined by one of skill in the art through the use of known techniques and by observing results obtained under analogous circumstances. In determining the effective amount for an individual, a number of factors are considered including, but not limited to, the species of mammal; its size, age and general health; the specific disease or disorder involved; the degree of or involvement of or the severity of the disease or disorder; the response of the individual patient; the particular incretin analog administered; the mode of administration; the bioavailability characteristics of the preparation administered; the dose regimen selected; the use of concomitant medication; and other relevant circumstances. In certain instances, an “effective amount” is considered in the context of therapeutical uses and may be optionally referred to as “therapeutically effective amount” . A “therapeutically effective amount” refers to an amount of the compound or the composition comprising a compound or salt thereof as set forth herein sufficient to produce a desired therapeutic outcome and / or required to provide a clinically significant decrease in a disease.

[0073] In some embodiments, “an individual” or “asubject” as used herein intends a mammal, including but not limited to a primate, human, bovine, horse, feline, canine, or rodent. In one variation, the individual or subject is a human.

[0074] As used herein, by “pharmaceutically acceptable” or “pharmacologically acceptable” is meant a material that is not biologically or otherwise undesirable, e.g., the material may be incorporated into a pharmaceutical composition administered to a patient without causing any significant undesirable biological effects or interacting in a deleterious manner with any of the other components of the composition in which it is contained. Pharmaceutically acceptable carriers or excipients have preferably met the required standards of toxicological and manufacturing testing and / or are included on the Inactive Ingredient Guide prepared by the U.S. Food and Drug administration.

[0075] “Pharmaceutically acceptable salts” are those salts which retain at least some of the biological activity of the free (non-salt) compound and which can be administered as drugs or pharmaceuticals to an individual. Such salts, for example, include: (1) acid addition salts, formed with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, and the like; or formed with organic acids such as acetic acid, oxalic acid, propionic acid, succinic acid, maleic acid, tartaric acid and the like; (2) salts formed when an acidic proton present in the parent compound either is replaced by a metal ion, e.g., an alkali metal ion, an alkaline earth ion, or an aluminum ion; or coordinates with an organic base. Acceptable organic bases include ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine and the like. Acceptable inorganic bases include aluminum hydroxide, calcium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydroxide, and the like. Further examples of pharmaceutically acceptable salts include those listed in Berge et al., Pharmaceutical Salts, J. Pharm. Sci. 1977 Jan; 66 (1) : 1-19. Pharmaceutically acceptable salts can be prepared in situ in the manufacturing process, or by separately reacting a purified compound of the disclosure in its free acid or base form with a suitable organic or inorganic base or acid, respectively, and isolating the salt thus formed during subsequent purification.

[0076] The term “excipient” as used herein means an inert or inactive substance that may be used in the production of a drug or pharmaceutical, such as a tablet containing a compound of the disclosure as an active ingredient. Various substances may be embraced by the term excipient, including without limitation any substance used as a binder, disintegrant, coating, compression / encapsulation aid, cream or lotion, lubricant, solutions for parenteral administration, materials for chewable tablets, sweetener or flavoring, suspending / gelling agent, or wet granulation agent. Binders include, e.g., carbomers, povidone, xanthan gum, etc. ; coatings include, e.g., cellulose acetate phthalate, ethylcellulose, gellan gum, maltodextrin, enteric coatings, etc. ; compression / encapsulation aids include, e.g., calcium carbonate, dextrose, fructose dc (directly compressible) , honey dc, lactose (anhydrate or monohydrate; optionally in combination with aspartame, cellulose, or microcrystalline cellulose) , starch dc, sucrose, etc. ; disintegrants include, e.g., croscarmellose sodium, gellan gum, sodium starch glycolate, etc. ; creams or lotions include, e.g., maltodextrin, carrageenans, etc. ; lubricants include, e.g., magnesium stearate, stearic acid, sodium stearyl fumarate, etc. ; materials for chewable tablets include, e.g., dextrose, fructose dc, lactose (monohydrate, optionally in combination with aspartame or cellulose) , etc. ; suspending / gelling agents include, e.g., carrageenan, sodium starch glycolate, xanthan gum, etc. ; sweeteners include, e.g., aspartame, dextrose, fructose dc, sorbitol, sucrose dc, etc. ; and wet granulation agents include, e.g., calcium carbonate, maltodextrin, microcrystalline cellulose, etc.

[0077] The amino acid sequences described herein incorporate naturally occurring amino acids, typically depicted herein using standard one letter codes (e.g., L = leucine) , as well as alpha-methyl substituted residues of natural amino acids (e.g., α-methyl leucine (αMeL) and α-methyl lysine (αMeK) ) , and certain other unnatural amino acids, such as alpha amino isobutyric acid (Aib) . The structures of these amino acids are depicted below:

[0078] Unless specified otherwise, the left-hand end of the amino acid sequences discussed herein is the N-terminus, and the right-hand end of the amino acid sequences described herein corresponds to the C-terminus, which in some variations may be further chemically modified. When describing the peptides or other amino acid sequences herein, several nomenclatures have been used, following the convention known in the art, unless otherwise noted. In some variations, the amino acids are represented by three-letter code and the amino acid sequences are represented by connecting the three-letter codes. For example, (Gly) 3Lys (Gly) 4 means Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. In some variations, the amino acids are represented by one-letter code and the amino acid sequences are represented by connecting the one-letter codes. For example, GGGS, which is interchangeable with G-G-G-Sunless otherwise noted, means Gly-Gly-Gly-Ser, or (Gly) 3Ser.

[0079] In some embodiments, unless otherwise noted, the linkage between the amino acids in the peptides or conjugates provided herein is a typical peptide bond, which is also known as eupeptide bond, and is formed between the α-carboxyl group of one amino acid and the α-amino group of the second amino acid. Such peptide bond or eupeptide bond may be represented as a hyphen “-” between two amino acids, or by directly linking the three-letter code or one-letter code of two amino acids together. For example, G-S, Gly-Ser, GlySer, and GS all represent a glycine binding to a serine through a typical peptide bond (i.e., eupeptide bond) . In some embodiments, two amino acids provided herein may also be linked through an isopeptide bond, which is the linkage between the side chain amino or carboxyl group of one amino acid to the α-carboxyl, α-amino group, or the side chain of another amino acid. In some embodiments, the peptides provided herein does not comprise an isopeptide bond. In some embodiments, the conjugates provided herein does not comprise an isopeptide bond.

[0080] It is understood that aspects and embodiments described herein as “comprising” , which is an open-ended mode expression, include “consisting of” and “consisting essentially of” embodiments.

[0081] It is understood that when letters A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, Y, and V are used in the context of a peptide, such letters mean amino acids as set forth in the table below: II. Conjugate

[0082] In one aspect, provided herein is a conjugate that is capable of targeting at each of GLP-1 receptor, GIP receptor, and Glucagon (GCG) receptor, and in the meanwhile, capable of targeting at PCSK9. In one aspect, provided herein is a conjugate that is capable of treating a metabolic disorder by targeting at each of GLP-1 receptor, GIP receptor, and Glucagon receptor, and capable of treating a cholesterol-related disorder by targeting at PCSK9. In some embodiments, the conjugate comprises a GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist and an anti-PCSK9 antibody or an antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the binding activity to each of the receptors or PCSK9 may be measured using techniques known in the art for measuring receptor binding levels, including, for example, those described in the examples below, and is commonly expressed as an inhibitory constant (Ki) or as an effective concentration 50 (EC50) value.

[0083] In some embodiments, the conjugate is capable of activating GLP-1 receptor, GCG receptor, or GIP receptor. In some embodiments, advantageously, the conjugate has a stronger activity in activating GLP-1 receptor, GCG receptor, or GIP receptor compared to isolated peptide GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist, such as retatrutide.

[0084] In some embodiments, the conjugate provided herein, by combining GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist and an anti-PCSK9 antibody or an antigen-binding fragment thereof, can achieve one or more of the following technical benefits: (1) inducing cAMP production; (2) inducing insulin secretion in response to high glucose stimulation; (3) reducing insulin resistance; (4) reducing or managing body weight; (5) reducing LDL-c level; (6) controlling glucose level for a period of time; (7) reducing fat mass while maintaining lean mass; (8) reducing total cholesterol level; (9) reducing cardiovascular risk indicators such as uric acid (UA) , creatine kinase (CK) , and circulating immune complex (CIC) ; and / or (10) enhancing insulin sensitivity in a subject. In some embodiments, the therapeutic effects or activities of the conjugates provided herein are stronger than isolated peptide GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist, such as retatrutide, which can be measured by techniques used in the art.

[0085] In some embodiments, the GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist can comprise or be a peptide. In some embodiments, the GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist can comprise or be a small molecule drug. In some embodiments, the GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist can be connected to the antibody or the antigen-binding fragment thereof via a bond. In some embodiments, the GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist can be connected to the antibody or the antigen-binding fragment thereof via a linking moiety. In some embodiments, the molar ratio of GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist to antibody (i.e., drug-antibody-ratio, “DAR” ) is any integer from 1 to 20, such as any of 1 to 18, 1 to 16, 1 to 14, 1 to 12, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, or 2, or 1. In some embodiments, when the DAR is more than 1, each GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist and linking moiety (if any) is independently selected. In some embodiments, the specific DAR is achieved via site specific conjugation techniques (e.g., engineered cysteines introduced to the antibody including at position 272 at IgG1 Fc, according to the EU Index numbering system) . It is understood that a common approach to site-specific conjugation is the use of a cysteine mutant antibody (e.g., Cys-mAb or Thiomab) , in which a new cysteine amino acid is introduced into the antibody primary structure. This engineered cysteine can be used as a site for conjugating a synthetic molecule. The average DAR value means the average number of GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist bound onto each antibody molecule in resultant conjugate products. The average DAR value can be any integer or decimal from 1 to 20, such as any of 1 to 18, 1 to 16, 1 to 14, 1 to 12, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 2 to 8, 3 to 8, 4 to 8, 5 to 8, 6 to 8, 7 to 8, 1 to 3, 2 to 3, 2 to 4, 2 to 5, 2 to 6, or 2 to 7.

[0086] In some embodiments, provided herein is a conjugate of Formula (O) : or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein: Ab is an anti-PCSK9 antibody or an antigen-binding fragment thereof; Lk is a linking moiety or a bond; Pp is a GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist; n is an integer ranging from 1 to 20; and wherein Pp is connected to Lk via a covalent bond, and each of Pp-Lk is independently connected to Ab via a covalent bond. GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonists

[0087] In some embodiments, the GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist can be any GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist known in the art. In some embodiments, the GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist having activity at each of the glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) receptor, glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor and glucagon (GCG) receptor. In some embodiments, the GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist comprises or is a peptide. In some embodiments, the peptide is selected from the group consisting of retatrutide, HM15211, HM15275, MWN101, and UBT251, or the peptide comprises Formula (I) , or a pharmaceutically acceptable salt thereof, Y-X2-Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-I-X13-L-D-K-X17-A-X19-X20-A-F-I-E-Y-L-L-X28-X29-X30-X31 (SEQ ID NO: 65) (I) wherein: X2 is Aib; X13 is L, or αMeL, X17 is K, C, E, or D, X19 is Q or A, X20 is Aib, αMeK, Q or H, X28 is E or A, X29 is G or Aib, X30 is G or Aib, and X31 is G or absent, wherein the C-terminal amino acid of the peptide is connected to Lk via a covalent bond.

[0088] In some embodiments, the peptide comprises Formula (I) . In some embodiments, the peptide has a length of less than 38 amino acids, such as less than any of 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, or 30 amino acids. In some embodiments, the peptide has a length of less than 32 amino acids. In some embodiments, the peptide does not comprise proline. In some embodiments, the peptide is of Formula (I) .

[0089] In some embodiments, X13 is αMeL. In some embodiments, X13 is L.

[0090] In some embodiments, X17 is K. In some embodiments, X17 is C. In some embodiments, X17 is E. In some embodiments, X17 is D.

[0091] In some embodiments, X19 is Q. In some embodiments, X19 is A.

[0092] In some embodiments, X20 is Aib. In some embodiments, X20 is αMeK. In some embodiments, X20 is Q. In some embodiments, X20 is H (i.e., histidine) .

[0093] In some embodiments, X28 is E. In some embodiments, X28 is A.

[0094] In some embodiments, X29 is G. In some embodiments, X29 is Aib.

[0095] In some embodiments, X30 is G. In some embodiments, X30 is Aib.

[0096] In some embodiments, X31 is G. In some embodiments, X31 is absent.

[0097] In some embodiments, X19 is Q and X20 is Aib. In some embodiments, X13 is αMeL and X17 is K. In some embodiments, -X28-X29-X30-X31 is -E-G-G. In some embodiments, -X28-X29-X30-X31 is -E-G-G-G.

[0098] In some embodiments, the peptide is: Y- (Aib) -Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-I- (αMeL) -L-D-K-K-A-Q- (Aib) -A-F-I-E-Y-L-L-E-G-G (SEQ ID NO: 66) ; or Y- (Aib) -Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-I- (αMeL) -L-D-K-K-A-Q- (Aib) -A-F-I-E-Y-L-L-E-G-G-G (SEQ ID NO: 67) .

[0099] In some embodiments, the amino acids in the peptide Pp are bound with each other through a peptide bond. In some embodiments, the peptide Pp does not comprise an isopeptide bond.

[0100] In some embodiments, the C-terminal amino acid of the peptide Pp is connected to Lk via a covalent bond. In some embodiments, the C-terminal amino acid of the peptide Pp is connected to Lk via a typical peptide bond (i.e., eupeptide bond: -CO-NH-) .

[0101] In some embodiments, Pp does not comprise a peptide.

[0102] In some embodiments, Pp is a compound with a molecule weight less than 5 kD, such as less than about any of 4.5 kD, 4 kD, 3.5 kD, 3 kD, 2.5 kD, 2 kD, 1.5 kD, 1 kD, or 0.5 kD. In some embodiments, Pp is a compound with a molecule weight less than 1 kD (e.g., a small molecule drug moiety) . Linking Moiety

[0103] In some embodiments, the linking moiety Lk can be any chemical moiety that is capable of covalently joining or conjugating the GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist to the anti-PCSK9 antibody. In some embodiments, the linking moiety is a bond. In some embodiments, the linking moiety serves primarily as a spacer to position, join, connect, or optimize presentation or position of the peptide in relation to one or more other functional moieties of a molecule of the inventive conjugates, such as Fc or antibody, and therefore can be any chemical group that could serve this function. In some embodiments, the linking moiety is specifically designed for the GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist and / or for the connection mode to the anti-PCSK9 antibody.

[0104] In some embodiments, the linking moiety Lk comprises a peptide. In some embodiments, the linking moiety Lk comprises a peptide made up in length of from 1 up to about 40 amino acid residues, of from 1 up to about 20 amino acid residues, or of from 1 to about 10 amino acid residues. In some embodiments, the amino acid residues in the linking moiety Lk are from among the twenty canonical amino acids, more preferably, cysteine, glycine, alanine, proline, asparagine, glutamine, serine, or any combination thereof. In some embodiments, the linking moiety Lk comprises a peptide made up of a majority of amino acids that are sterically unhindered, such as glycine, serine, and alanine linked by a peptide bond. In some embodiments, the linking moiety Lk comprises a glycine or glycine / serine linking peptide. In some embodiments, the peptide in the linking moiety Lk can be selected to avoid rapid proteolytic turnover in circulation in vivo. Some of these amino acids may be glycosylated, as is well understood by those in the art.

[0105] In some embodiments, the linking moiety Lk comprises or is a peptide made up in length of from 1 up to about 40 amino acid residues, wherein the 1 to 40 amino acids are selected from glycine, alanine, proline, asparagine, glutamine, and lysine. In some embodiments, the linking moiety Lk comprises or is a peptide made up of a majority of amino acids that are sterically unhindered, such as glycine and alanine. In some embodiments, the linking moiety Lk comprises polyglycines, polyserines, and polyalanines, or combinations of any of these. Exemplary peptides in linking moiety Lk include, but are not limited to poly (Gly) 1-8, particularly (Gly) 3, (Gly) 4, (Gly) 5, and (Gly) 7, as well as, GlySer and poly (Gly) 4Ser, such as GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 70) , poly (Gly-Ala) 2-4 and poly (Ala) 1-8. Other examples of peptides in linking moiety Lk include (Gly) 5Lys, and (Gly) 5LysArg. Other examples of peptides in linking moiety Lk include, but are not limited to (Gly) 3Lys (Gly) 4, (Gly) 3AsnGlySer (Gly) 2, (Gly) 3Cys (Gly) 4, GlyProAsnGlyGly, (Gly) 4Ser (i.e., G-G-G-G-S, SEQ ID NO: 69) , (Gly) 4Ser (Gly) 4Ser (i.e., G-G-G-G-S-G-G-G-G-S, SEQ ID NO: 71) , (Gly) 4Ser (Gly) 4Ser (Gly) 4Ser (i.e., G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S, SEQ ID NO: 70) , (Gly) 4Ser (Gly) 4Ser (Gly) 4Ser (Gly) 4Ser (i.e., G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S, SEQ ID NO: 72) , ValAla (i.e., V-A) , ValCys (i.e., V-C) , ValLysGly (i.e., V-K-G) , GlyGlyPheGly (i.e., G-G-F-G, SEQ ID NO: 68) , and any linking moiety Lk used in the working examples hereinafter.

[0106] In some embodiments, the linking moiety Lk may comprise one or more acidic residues, for example, glutamate or aspartate residues placed in the amino acid sequences described above. For example, exemplary sequences of linking moiety Lk include, but are not limited to, GGEGGG (SEQ ID NO: 73) , GGEEEGGG (SEQ ID NO: 74) , GEEEG (SEQ ID NO: 75) , GEEE (SEQ ID NO: 76) , GGDGGG (SEQ ID NO: 77) , GGDDDGG (SEQ ID NO: 78) , GDDDG (SEQ ID NO: 79) , GDDD (SEQ ID NO: 80) , GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS (SEQ ID NO: 81) , WEWEW (SEQ ID NO: 82) , FEFEF (SEQ ID NO: 83) , EEEWWW (SEQ ID NO: 84) , EEEFFF (SEQ ID NO: 85) , WWEEEWW (SEQ ID NO: 86) , or FFEEEFF (SEQ ID NO: 87) .

[0107] In some embodiments, the linking moiety Lk may comprise a formula M1M2YM4M5G, wherein M1, M2, M4, and M5 are each independently any amino acid residue; or M1M2SM4 M5G, wherein M1, M2, M4 and M5 are each independently any amino acid residue; or M1M2TM4M5G, wherein M1, M2, M4 and M5 are each independently any amino acid residue.

[0108] In some embodiments, the peptide in the linking moiety Lk is a large, flexible linker comprising a random Gly / Ser / Thr sequence, for example: GSGSATGGSGSTASSGSGSATH (SEQ ID NO: 88) or HGSGSATGGSGSTASSGSGSAT (SEQ ID NO: 89) , that is estimated to be about the size of a 1 kDa PEG molecule. In some embodiments, the peptide in the linking moiety Lk may comprise amino acid sequences known in the art to form rigid helical structures (e.g., Rigid linker: -AEAAAKEAAAKEAAAKAGG- / / , SEQ ID NO: 90) . In some embodiments, the peptide in the linking moiety Lk may also comprise a non-peptidyl segment such as a 6 carbon aliphatic molecule of the formula -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-. The peptidyl linkers can be altered to form derivatives as described herein.

[0109] In some embodiments, the linking moiety Lk comprise a non-peptidyl linker moiety. For example, in some embodiments, the non-peptidyl linker can be alkyl linkers such as -NH- (CH2) S-C (O) -, wherein s is from 2 to 20. These alkyl linkers may further be substituted by any non-sterically hindering group such as lower alkyl (e.g., C1-C6) lower acyl, halogen (e.g., Cl, Br) , CN, NH2, phenyl, etc. Exemplary non-peptidyl linkers are PEG linkers (e.g., shown below) : wherein n is such that the linker has a molecular weight of about 100 to about 5000 Daltons (Da) , preferably about 100 to about 500 Da.

[0110] In one embodiment, the non-peptidyl linking moiety is aryl. The linkers may be altered to form derivatives in the same manner as described herein. “Aryl” is phenyl or phenyl vicinally-fused with a saturated, partially-saturated, or unsaturated 3-, 4-, or 5 membered carbon bridge, the phenyl or bridge being substituted by 0, 1, 2 or 3 substituents selected from C1-8 alkyl, C1-4 haloalkyl or halo. “Heteroaryl” is an unsaturated 5, 6 or 7 membered monocyclic or partially-saturated or unsaturated 6-, 7-, 8-, 9-, 10-or 11 membered bicyclic ring, wherein at least one ring is unsaturated, the monocyclic and the bicyclic rings containing 1, 2, 3 or 4 atoms selected from N, O and S, wherein the ring is substituted by 0, 1, 2 or 3 substituents selected from C1-8 alkyl, C1-4 haloalkyl, and halo.

[0111] In one embodiment, the non-peptidyl linking moiety comprises a rigid polyheterocyclic core of controlled length. The linkers are chemically differentiated on either end to accommodate orthogonal coupling chemistries (i.e. azide “click” , amide coupling, thioether formation by alkylation with maleimide or haloacetamide, oxime formation, reductive amination, etc. ) .

[0112] In some embodiments, Lk represents the chemical moiety after a precursor peptide-linker compound Pp-Lk1 binds to the antibody or antigen-binding fragment thereof. For example, when Lk1 is a peptide, such as -G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , then Lk is -G-G-G-S-** (SEQ ID NO: 69) , wherein **indicates the point of connection to the antibody or antigen-binding fragment thereof. In some variations, chemical reactions may occur between Lk1 and the antibody or antigen-binding fragment thereof, thereby new chemical bonds are formed. For example, when Lk1 is of Formula Lm-Br and the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a -SH group, the -SH group can replace the -Br group and thereby form a Lm-S-Fc conjugate, and Lk represents the chemical moiety Lm-S.

[0113] In some embodiments, the linking moiety Lk further comprises XL which is a residue formed by covalently binding a precursor peptide-linker compound Pp-Lk1 to the antibody or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the precursor peptide-linker compound Pp-Lk1 can react with an amino acid residue of the antibody or antigen-binding fragment thereof, and the reaction is a substitution reaction (e.g., substitution reaction between halogen (Cl, Br, I) and -SH) , an addition reaction (e.g., a Michael addition) , a peptide formation reaction (e.g., forming a peptide bond or isopeptide bond) , or a click reaction (e.g., reaction between a C≡C and an azide) . Hence in some embodiments, the residue XL is a residue of a substitution reaction (e.g., substitution reaction between halogen (Cl, Br, I) and -SH) , an addition reaction (e.g., a Michael addition) , a peptide formation reaction (e.g., forming a peptide bond or isopeptide bond) , or a click reaction (e.g., reaction between a C≡C and an azide) .

[0114] In some embodiments, the linking moiety Lk comprises a peptide. In some embodiments, comprises formula L1-L2-L3-L4, wherein each of L1, L2, L3, and L4 is independent a bond, V-A, V-C, V-K-G, G-G-F-G (SEQ ID NO: 68) , or G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , provided that at least one of L1, L2, L3, and L4 is G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) ; and wherein Pp is connected to Lk via a peptide bond between the C-terminal amino acid of Pp and the N-terminal amino acid of Lk.

[0115] In some embodiments, the linking moiety Lk has a Formula of L1-L2-L3-L4-XL, wherein each of L1, L2, L3, and L4 is independently a bond, V-A, V-C, V-K-G, G-G-F-G (SEQ ID NO: 68) , or G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , provided that at least one of L1, L2, L3, and L4 is G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) ; Pp is connected to Lk via a peptide bond between the C-terminal amino acid of Pp and the N-terminal amino acid of Lk; and XL is a bond, K,  wherein *indicates the point of connection to L4 and **indicates the point of connection to Ab.

[0116] In some embodiments, L1 is G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , L2 is G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , L3 is a bond, and L4 is a bond. In some embodiments, L1 is G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , L2 is G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , L3 is G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , and L4 is a bond.

[0117] In some embodiments, XL is a bond. In some embodiments, XL is K. In some embodiments, XL is K and binds to the second peptide through the backbone. In some embodiments, XL is K and binds to the second peptide through the side chain.

[0118] In some embodiments, XL is a residue formed by a substitution reaction (e.g., a substitution reaction between a -SH in the antibody or antigen-binding fragment thereof and a -Br in a precursor peptide-linker compound Pp-Lk1) . In some embodiments, the precursor peptide-linker compound Pp-Lk1 comprises a Lys (Ac-Br) group, which reacts with a -SH provided by the antibody or antigen-binding fragment thereof to form XL. Hence in some embodiments, XL is

[0119] In some embodiments, XL is a residue formed by a click reaction (e.g., reaction between a C≡C in a precursor peptide-linker compound Pp-Lk1 and an azide provided by the antibody or antigen-binding fragment thereof) . In some embodiments, the precursor peptide-linker compound Pp-Lk1 comprises a Lys-DBCO group, which reacts with an azide group provided by the antibody or antigen-binding fragment thereof to form XL. Hence in some embodiments, XL is

[0120] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is modified with an azide-tagged disaccharide. In some embodiments, the modified antibody (i.e., an azido-tagged antibody) or antigen-binding fragment thereof is conjugated with the peptide-linker comprising a DBCO moiety as described herein via DBCO azide click reaction. Exemplary modifications of antibody or antigen-binding fragment thereof with an azide-tagged disaccharide are described in WO2022226420A9, e.g. as described in Example 1 of WO2022226420A9. The disclosure of WO2022226420A9 is incorporated herein by reference in its entirety. In some embodiments, the modified antibody comprises a modified disaccharide core, and wherein the modified disaccharide core is composed of : (1) a mannose-β1, 4-N-acetylglucosamine conjugated to the asparagine (Asn) -linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) on the antibody; (2) a glucose-β1, 4-N-acetylglucosamine conjugated to the asparagine (Asn) -linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) on the antibody; or (3) a galactose-β1, 4-N-acetylglucosamine conjugated to the asparagine (Asn) -linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) on the antibody.

[0121] In some embodiments, the azido-tagged antibody can have the following structure: wherein n is as defined herein.

[0122] In some embodiments, the linking moiety is selected from the group consisting of: #-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-** (SEQ ID NO: 70) ; #-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-** (SEQ ID NO: 71) ; wherein #indicates the point of connection to Pp and **indicates the point of connection to Ab.

[0123] In some embodiments, when is part of the linker, the **indicates the point of connection to Ab, and the connection mode may be any mode known in the art. In some embodiments, the connection is formed by a click reaction between azide linked to the Ab and the DBCO in peptide-linker precursor. In some embodiments,  may refer to structure of wherein ***indicates the point of connection to Ab.

[0124] In some embodiments, the conjugate is selected from a conjugate represented by formula (I) , (II) , (III) or (IV) : wherein, X2, X13, X17, X19, X20, X28, X29, X30, X31, n and Ab are as defined herein.

[0125] In some embodiments, the conjugate is selected from a conjugate represented by formula (I-1) , (I-2) , (II-1) , (II-2) , (III-1) , (III-2) or (IV) : wherein, n and Ab are as defined hereinafter.

[0126] In some embodiments, in the conjugate represented by formula (I) , (II) , (III) , (IV) , (I-1) , (I-2) , (II-1) , (II-2) , (III-1) , (III-2) or (IV) , the Ab is Evolocumab, or Alirocumab, or the Ab comprising: a VH region and a VL region which are or comprise: the sequence set forth in SEQ ID NO: 25 and 26, respectively; the sequence set forth in SEQ ID NO: 27 and 28, respectively; the sequence set forth in SEQ ID NO: 29 and 30, respectively; or the sequence set forth in SEQ ID NO: 31 and 32, respectively. In some embodiments, in the conjugate represented by formula (I) , (III) , (I-1) , (I-2) , (III-1) or (III-2) , the Ab is the Ab comprising a VH region and a VL region which are or comprise: the sequence set forth in SEQ ID NO: 25 and 26, respectively.

[0127] In some embodiments, in the conjugate represented by formula (I) , (II) , (IV) , (I-1) , (I-2) , (II-1) , (II-2) or (IV) , the Ab further comprises a heavy chain constant region comprising the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 34 to 36. In some embodiments, in the conjugate represented by formula (I) , (I-1) or (I-2) , the Ab further comprises a heavy chain constant region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 36 or 35. In some embodiments, in the conjugate represented by formula (III) , (III-1) , or (III-2) , the Ab further comprises a heavy chain constant region comprising the sequence set forth in any one of SEQ ID NO: 33-35 and 37. In some embodiments, in the conjugate represented by formula (III) , (III-1) , or (III-2) , the Ab further comprises a heavy chain constant region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 33. In some embodiments, in the conjugate represented by formula (I) , (II) , (III) , (IV) , (I-1) , (I-2) , (II-1) , (II-2) , (III-1) , (III-2) or (IV) , the Ab further comprises a light chain constant region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 91 or 92. In some embodiments, the Ab further comprises a light chain constant region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 91. In some embodiments, the average DAR value of the conjugate represented by formula (I) , (II) , (III) , (IV) , (I-1) , (I-2) , (II-1) , (II-2) , (III-1) , (III-2) or (IV) can be any integer or decimal from 1 to 20, such as any of 1 to 18, 1 to 16, 1 to 14, 1 to 12, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 1 to 3, 1.5 to 2.5, 2 to 8, 3 to 8, 4 to 8, 5 to 8, 6 to 8, 7 to 8, or 2 to 3, 2 to 4, 2 to 5, 2 to 6, or 2 to 7.

[0128] In some embodiments, the conjugate is selected from: wherein, n and Ab are as defined hereinafter. In some embodiments, in the conjugate represented by formula (I) , (I-1) or (I-2) , the Ab further comprises a heavy chain constant region comprising the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 34 to 36; in the conjugate represented by formula (II) , (II-1) , (II-2) , (III) , (III-1) , or (III-2) , the Ab further comprises a heavy chain constant region comprising the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 33 to 35 and 37; and / or the Ab further comprises a light chain constant region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 91 or 92.

[0129] In some embodiments, in the conjugate represented by formula (I) , (I-1) or (I-2) , the Ab comprises: the VH region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 25, the heavy chain constant region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 36 or 35, the VL region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 26, and the light chain constant region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 91; in the conjugate represented by formula (III) , (III-1) , or (III-2) , the Ab comprises: the VH region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 25, a heavy chain constant region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 33, the VL region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 26, and the light chain constant region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 91.

[0130] In some embodiments, in the conjugate represented by formula (I-1) , the Ab comprises a heavy chain comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 39 and a light chain comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 40; in the conjugate represented by formula (III-1) , the Ab comprises a heavy chain comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 63 and a light chain comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 42. Anti-PCSK9 Antibody

[0131] Unless otherwise stated, the term “proprotein convertase subtilisin / kexin type 9 (PCSK9) ” , “PCSK9” or “NARC-1” as used herein refers to from any natural PCSK9 of vertebrate origin, including mammals such as primates (e.g., humans) and rodents (e.g., mice and rats) . The term encompasses “full length” unprocessed PCSK9 as well as any form of PCSK9 produced by intracellular processing or any fragment thereof. The term also encompasses variants of naturally occurring PCSK9, for example, splice variants or allelic variants.

[0132] The term “anti-PCSK9 antibody” , “anti-PCSK9” , “PCSK9 antibody” or “antibody that binds to PCSK9” refers to an antibody which is capable of binding a PCSK9 protein or a fragment thereof with sufficient affinity such that the antibody can be used as a diagnostic agent and / or therapeutic agent. In one embodiment, the anti-PCSK9 antibody binds to an unrelated, non-PCSK9 protein to a lesser extent than about 10%of the binding of the antibody to PCSK9, as measured, for example, by radioimmunoassay (RIA) . In some embodiments, the antibody against PCSK9 has an equilibrium dissociation constant (KD) ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, or ≤ 0.001 nM (e.g., 10-8 M or less, such as 10-8 M to 10-13 M, or 10-9 M to 10-13 M) .

[0133] A "variant" of a polypeptide (e.g., an antibody) comprises an amino acid sequence wherein one or more amino acid residues are inserted into, deleted from and / or substituted into the amino acid sequence relative to another polypeptide sequence. Variants include fusion proteins.

[0134] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody is a commercially available anti-PCSK9 antibody, including but not limited to: Evolocumab, Alirocumab, Tafolecimab, Ongericimab, Ebronucimab, and Recaticimab.

[0135] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a heavy chain variable (VH) region and a light chain variable (VL) region, wherein the VH region comprises a heavy chain complementarity determining region 1 (CDR-H1) , a heavy chain complementarity determining region 2 (CDR-H2) , and a heavy chain complementarity determining region 3 (CDR-H3) contained within SEQ ID NO: 25, and the VL region comprises a light chain complementarity determining region 1 (CDR-L1) , a light chain complementarity determining region 2 (CDR-L2) and a light chain complementarity determining region 3 (CDR-L3) contained within SEQ ID NO: 26.

[0136] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a VH region and a VL region, wherein the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 contained within SEQ ID NO: 27, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2 and a CDR-L3 contained within SEQ ID NO: 28.

[0137] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a VH region and a VL region, wherein the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 contained within SEQ ID NO: 29, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2 and a CDR-L3 contained within SEQ ID NO: 30.

[0138] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a VH region and a VL region, wherein the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 contained within SEQ ID NO: 31, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2 and a CDR-L3 contained within SEQ ID NO: 32.

[0139] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a VH region and a VL region, wherein the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 1, 2, and 3, respectively, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2, and a CDR-L3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 4, 5, and 6, respectively.

[0140] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a VH region and a VL region, wherein the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 7, 8, and 9, respectively, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2, and a CDR-L3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 10, 11, and 12, respectively.

[0141] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a VH region and a VL region, wherein the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 13, 14, and 15, respectively, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2, and a CDR-L3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 16, 17, and 18, respectively.

[0142] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a VH region and a VL region, wherein the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 19, 20, and 21, respectively, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2, and a CDR-L3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 22, 23, and 24, respectively.

[0143] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a VH region and a VL region, wherein the VH region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 25, and the VL region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the VH region and the VL region are or comprise: the sequence set forth in SEQ ID NO: 25 and 26, respectively.

[0144] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a VH region and a VL region, wherein the VH region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 27, and the VL region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 28. In some embodiments, the VH region and the VL region are or comprise: the sequence set forth in SEQ ID NO: 27 and 28, respectively.

[0145] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a VH region and a VL region, wherein the VH region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 29, and the VL region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 30. In some embodiments, the VH region and the VL region are or comprise: the sequence set forth in SEQ ID NO: 29 and 30, respectively.

[0146] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a VH region and a VL region, wherein the VH region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 31, and the VL region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 32. In some embodiments, the VH region and the VL region are or comprise: the sequence set forth in SEQ ID NO: 31 and 32, respectively.

[0147] In some embodiments, compared with SEQ ID NO: 25, 27, 29 or 31, different amino acids in the amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity are located in FR (framework region) . In some embodiments, compared with SEQ ID NO: 26, 28, 30 or 32, different amino acids in the amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity are located in FR (framework region) .

[0148] Table 3 lists sequence identifiers (SEQ ID NO: ) corresponding to amino acid (aa) sequences of the variable heavy (VH) chain and variable light (VL) chain of the anti-PCSK9 antibodies, including complementarity determining regions (CDRs) of each chain. Note: “Antibody 10087” herein covers the antibodies “10087 IgG1 N297A” , “10087 IgG1 LALA” and “10087 IgG1” , and these three specific antibodies have different heavy chain constant regions.

[0149] Complementarity determining regions (CDRs) and framework regions (FR) of a given antibody may be identified using the system described by Kabat et al. in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991. Certain antibodies that are disclosed herein comprise one or more amino acid sequences that are identical or have substantial sequence identity to the amino acid sequences of one or more of the CDRs presented in Table 3.

[0150] The structure and properties of CDRs within a naturally occurring antibody has been described, supra. Briefly, in a traditional antibody, the CDRs are embedded within a framework in the heavy and light chain variable region where they constitute the regions responsible for antigen binding and recognition. A variable region comprises at least three heavy or light chain CDRs, see, supra (Kabat et al, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N. I. H., Bethesda, MD; see also Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al, 1989, Nature 342: 877-883) , within a framework region (designated framework regions 1-4, FR1, FR2, FR3, and FR4, by Kabat et al, 1991, supra; see also Chothia and Lesk, 1987, supra) .

[0151] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a constant region (Fc) selected from the group consisting of IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, and combinations and hybrids thereof.

[0152] The term “Fc region, ” “Fc domain, ” “Fc fragment” or “Fc” refers to a C-terminal non-antigen binding region of an immunoglobulin heavy chain that contains at least a portion of the constant region. The term includes native Fc regions and variant Fc regions. In some embodiments, a human IgG heavy chain Fc region extends from Cys226 to the carboxyl-terminus of the heavy chain. However, the C-terminal lysine (Lys447) of the Fc region may or may not be present, without affecting the structure or stability of the Fc region. Unless otherwise specified herein, numbering of amino acid residues in the IgG or Fc region is according to the EU numbering system for antibodies, also called the EU index, as described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

[0153] In some embodiments, the Fc fragment is an IgG1 Fc fragment or a variant thereof. In some embodiments, the IgG1 heavy chain constant region comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 33 or a variant thereof.

[0154] In some embodiments, one or more amino acid modifications may be introduced into the Fc fragment, thereby generating an Fc fragment variant. The Fc fragment variant may comprise a human Fc sequence (e.g., a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 Fc fragment) comprising an amino acid modification (e.g. a substitution) at one or more amino acid positions. In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a cysteine or non-canonical amino acid substitution at one or more conjugation site (s) . For instance, in some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a cysteine at position 272, an alanine at position 297, and / or L234A / L235A (LALA) mutation, based on EU numbering relative to reference sequence SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises post modifications. The Fc region of the antibodies (e.g., anti-PCSK9 antibody) described herein may be a glycoengineered Fc. For example, the Fc may include one or more site-specific modifications at the glycan site through deglycosylation and / or transglycosylation. The Fc may be an azido-tagged Fc at the glycan site.

[0155] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a cysteine at position 272 based on EU numbering relative to reference sequence SEQ ID NO: 33 or a variant thereof. In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 34.

[0156] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises L234A / L235A (LALA) mutation. In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises L234A / L235A (LALA) mutation and a cysteine at position 272 based on EU numbering relative to reference sequence SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 35.

[0157] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises an alanine at position 297 based on EU numbering relative to reference sequence SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises an alanine at position 297 and a cysteine at position 272 based on EU numbering relative to reference sequence SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 36.

[0158] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a heavy chain constant region from an IgG2 or a variant thereof. In some embodiments, the heavy chain constant region from an IgG2 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 37.

[0159] In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a light chain constant region from kappa (κ) or lambda (λ) chain of an immunoglobulin or a variant thereof. In some embodiments, the anti-PCSK9 antibody comprises a light chain constant region from human κ or λ chain or a variant thereof. In some embodiments, the light chain constant region comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 91 or 92.

[0160] The antibodies provided herein include monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies may be produced using any technique known in the art, e.g., by immortalizing spleen cells harvested from the transgenic animal after completion of the immunization schedule. The spleen cells can be immortalized using any technique known in the art, e.g., by fusing them with myeloma cells to produce hybridomas. Myeloma cells for use in hybridoma-producing fusion procedures preferably are non-antibody-producing, have high fusion efficiency, and enzyme deficiencies that render them incapable of growing in certain selective media which support the growth of only the desired fused cells (hybridomas) . Examples of suitable cell lines for use in mouse fusions include Sp-20, P3-X63 / Ag8, P3-X63-Ag8.653, NSl / 1-Ag4-1, Sp210-Ag14, FO, NSO / U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 and S194 / 5XXO Bul; examples of cell lines used in rat fusions include R210. RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F and 4B210. Other cell lines useful for cell fusions are U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 and UC729-6.

[0161] In some instances, a hybridoma cell line is produced by immunizing an animal (e.g., a transgenic animal having human immunoglobulin sequences) with an immunogen; harvesting spleen cells from the immunized animal; fusing the harvested spleen cells to a myeloma cell line, thereby generating hybridoma cells; establishing hybridoma cell lines from the hybridoma cells, and identifying a hybridoma cell line that produces an antibody that binds a target polypeptide. Such hybridoma cell lines, and monoclonal antibodies produced by them, are aspects of the present application.

[0162] Monoclonal antibodies secreted by a hybridoma cell line can be purified using any technique known in the art. Hybridomas or mAbs may be further screened to identify mAbs with particular properties. Subscript “n” –Drug to Antibody Ratio (DAR)

[0163] In some embodiments, subscript n represents the number of Drug Linker moieties Pp-Lk on an antibody or antigen binding fragment thereof in an individual conjugate.

[0164] In some embodiments, a conjugate or antibody-peptide conjugate (APC) describes a population of individual conjugates or APC compounds substantially identical except for the number of Drug Linker moieties Pp-Lk bound to each antibody or antigen binding fragment thereof, and in this variation, the subscript n (DAR) represents the average number of Pp-Lk bound to the antibody or antigen binding fragment thereof of in the conjugate composition.

[0165] In some embodiments, n is an integer from 1 to 20, such as any of 1 to 18, 1 to 16, 1 to 14, 1 to 12, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, or 2, or 1. In some embodiments, n is 8. In some embodiments, n is 6. In some embodiments, n is 4. In some embodiments, n is 2.

[0166] In some embodiments, the value of subscript n refers to the average Pp-Lk loading as well as the drug loading of the predominate conjugate in a composition. In some embodiments, the value of subscript n refers to the predominate drug loading of the conjugate in a composition. In some embodiments, at least about 60%, such as at least about any of 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, or 100%of the conjugates in the composition has the value of subscript p (i.e., DAR) as the Pp-Lk loading. For example, in some embodiments, conjugates with a DAR of 8 may refer to a composition wherein the predominate conjugate has a DAR of 8 (e.g., at least about any of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, or 100%of the conjugates has a DAR of 8) and wherein there may be small amount (e.g., no more than about any of 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, or 0.1%) of conjugates with other DARs (e.g., a DAR of 8, 7, 6, 5, or 4) .

[0167] In some embodiments, when the DAR is more than 1, each GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist and linking moiety (if any) is independently selected.

[0168] In some embodiments, provided herein is a conjugate, wherein: (1) Pp-Lk is and (2) Ab comprises a heavy chain constant (CH) region, wherein the CH region are or comprise the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-36.

[0169] In some embodiments, provided herein is a conjugate, wherein: (1) Pp-Lk is and (2) Ab comprises a heavy chain constant (CH) region, wherein the CH region are or comprise the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 33-35.

[0170] In some embodiments, provided herein is a conjugate, wherein: (1) Pp-Lk is and (2) Ab comprises a heavy chain constant (CH) region, wherein the CH region are or comprise the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 33-35.

[0171] In some embodiments, n is an integer ranging from 1 to 20, such as any of 1 to 18, 1 to 16, 1 to 14, 1 to 12, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, or 2, or 1. In some embodiments, n is 8. In some embodiments, n is 6. In some embodiments, n is 4. In some embodiments, n is 2.

[0172] In some embodiments, the average DAR value of the conjugate can be any integer or decimal from 1 to 20, such as any of 1 to 18, 1 to 16, 1 to 14, 1 to 12, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 1 to 3, 1.5 to 2.5, 2 to 8, 3 to 8, 4 to 8, 5 to 8, 6 to 8, 7 to 8, or 2 to 3, 2 to 4, 2 to 5, 2 to 6, or 2 to 7.

[0173] Also provided are stereoisomers, mixture of stereoisomers, tautomers, isotopically enriched analogs, and pharmaceutically acceptable salts of the compounds described herein, such as the conjugate of Formula (O) , or any variation thereof described herein.

[0174] In the descriptions herein (e.g., conjugate of Formula (O) , or any variation thereof described herein) , it is understood that every description, variation, embodiment or aspect of a moiety may be combined with every description, variation, embodiment or aspect of other moieties the same as if each and every combination of descriptions is specifically and individually listed. For example, every description, variation, embodiment or aspect provided herein with respect to Pp of Formula (O) may be combined with every description, variation, embodiment or aspect of Lk of Formula (O) the same as if each and every combination were specifically and individually listed and such combinations are equally applicable to other formulae where permitted by the chemical structure.

[0175] The compounds disclosed herein, or their pharmaceutically acceptable salts, may include an asymmetric center and may thus give rise to enantiomers, diastereomers, and other stereoisomeric forms that may be defined, in terms of absolute stereochemistry, as (R) -or (S) -. The present disclosure is meant to include all such possible isomers, as well as their racemic and optically pure forms. Optically active (+) and (-) , or (R) -and (S) -isomers may be prepared using chiral synthons or chiral reagents, or resolved using conventional techniques, for example, chromatography and fractional crystallization. Conventional techniques for the preparation / isolation of individual enantiomers include chiral synthesis from a suitable optically pure precursor or resolution of the racemate (or the racemate of a salt or derivative) using, for example, chiral high pressure liquid chromatography (HPLC) . When the compounds described herein contain olefinic double bonds or other centers of geometric asymmetry, and unless specified otherwise, it is intended that the compounds include both E and Z geometric isomers. In some embodiments, the compound of Formula (O) provided herein also encompasses stereoisomers of the conjugate of Formula (O) , or any variation thereof described herein.

[0176] Any compound or structure given herein, is also intended to represent unlabeled forms as well as isotopically labeled forms of the compounds. These forms of compounds may also be referred to as an “isotopically enriched analog. ” Isotopically labeled compounds have structures depicted herein, except that one or more atoms are replaced by an atom having a selected atomic mass or mass number. Examples of isotopes that can be incorporated into the disclosed compounds include isotopes of hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, phosphorous, fluorine, chlorine and iodine, such as 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F, 36Cl, 123I, and 125I, respectively. Various isotopically labeled compounds of the present disclosure, for example those into which radioactive isotopes such as 3H, 13C and 14C are incorporated. Such isotopically labelled compounds may be useful in metabolic studies, reaction kinetic studies, detection or imaging techniques, such as positron emission tomography (PET) or single-photon emission computed tomography (SPECT) including drug or substrate tissue distribution assays or in radioactive treatment of patients. Such compounds may exhibit increased resistance to metabolism and are thus useful for increasing the half-life of any compound when administered to a mammal, particularly a human. Such compounds are synthesized by means well known in the art, for example by employing starting materials in which one or more hydrogens have been replaced by deuterium.

[0177] Certain compounds disclosed herein (e.g., the conjugate of Formula (O) , or any variation thereof described herein) contain one or more ionizable groups (groups from which a proton can be removed (e.g., -COOH) or added (e.g., amines) or which can be quaternized (e.g., amines) ) . All possible ionic forms of such molecules and salts thereof are intended to be included individually in the disclosure herein. With regard to salts of the compounds described herein, one of ordinary skill in the art can select from among a wide variety of available counterions those that are appropriate. In specific applications, the selection of a given anion or cation for preparation of a salt may result in increased or decreased solubility of that salt. III. Pharmaceutical composition

[0178] In some embodiments, the compounds provided herein (e.g., the conjugate of Formula (O) , or any variation thereof described herein) can be formulated in a composition, such as a pharmaceutical composition. In some embodiments, the composition further comprises one or more additional medicinal agents, pharmaceutical agents, adjuvants, carriers, excipients, and the like. Suitable medicinal and pharmaceutical agents include those described herein and any other conventional medicinal and pharmaceutical agents known in the art. In some embodiments, the pharmaceutical composition includes a pharmaceutically acceptable excipient or adjuvant and at least one chemical entity as described herein. In some embodiments, provided are compositions, such as pharmaceutical compositions that contain one or more compounds described herein (e.g., the conjugate of Formula (O) , or any variation thereof described herein) , or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, or tautomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[0179] Also provided are packaged pharmaceutical compositions, comprising a pharmaceutical composition as described herein and instructions for using the composition to treat a patient suffering from a disease or condition described herein. IV. Method of use

[0180] In one aspect, provided herein is a method of treating a disease mediated by glucagon receptor, GLP-1 receptor, or GIP receptor, or any combination thereof, in a subject in need thereof, comprising administering a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof, described herein. In some embodiments, the subject in need thereof have a disease mediated by glucagon receptor, GLP-1 receptor, or GIP receptor, or any combination thereof, or a symptom associated with such a disease. In some embodiments, the subject has been diagnosed with the disease. In some embodiments, the subject has shown early sign of the disease. In some embodiments, the subject has an elevated risk for having the disease.

[0181] In some embodiments, the disease mediated by glucagon receptor, GLP-1 receptor, or GIP receptor, or any combination thereof is a metabolic disorder. Hence in some embodiments, provided herein is a method of treating a metabolic disorder in a subject in need thereof (e.g., a subject who has been diagnosed with a metabolic disorder) , comprising administering a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof, described herein. In some embodiments, the metabolic disorder includes, not is not limited to, a disorder of glucose metabolism (e.g., Type 2 diabetes, elevated glucose levels, elevated insulin levels, dyslipidemia, metabolic syndrome (Syndrome X or insulin resistance syndrome) , glucosuria, metabolic acidosis, diabetic neuropathy, diabetes mellitus, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, diabetic cardiomyopathy, Type 1 diabetes, obesity and conditions exacerbated by obesity) , non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) , non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , metabolic syndrome, or any combination thereof.

[0182] In some embodiments, the metabolic disorder is diabetes, e.g., type 2 diabetes. In some embodiments, the metabolic disorder is obesity. In some embodiments, the metabolic disorder is dyslipidemia, elevated glucose levels, elevated insulin levels or diabetic nephropathy. For example, in some embodiments, the subject (e.g., human subject) has a fasting blood glucose level of 125 mg / dL or greater, for example, 130 mg / dL, 135 mg / dL, 140 mg / dL, 145 mg / dL, 150 mg / dL, 155 mg / dL, 160 mg / dL, 165 mg / dL, 170 mg / dL, 175 mg / dL, 180 mg / dL, 185 mg / dL, 190 mg / dL, 195 mg / dL, 200 mg / dL, or greater than 200 mg / dL. Blood glucose levels can be determined in the fed or fasted state, or at random. In some embodiments, the metabolic disorder can also comprise a condition in which a subject is at increased risk of developing a metabolic condition. For a human subject, such conditions may include a fasting blood glucose level of 100 mg / dL. Conditions that can be treated using a pharmaceutical composition comprising a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof, described herein can also be found in the American Diabetes Association Standards of Medical Care in Diabetes Care-2011, American Diabetes Association, Diabetes Care Vol. 34, No. Supplement 1, S11-S61, 2010, incorporated herein by reference. In some embodiments, the disease is diabetes mellitus, type 2 diabetes, obesity, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) , non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , dyslipidemia, cardiovascular disease, or metabolic syndrome.

[0183] In some embodiments, provided herein is a method of treating obesity in a subject in need thereof (e.g., a subject who has been diagnosed with obesity) , comprising administering a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof described herein.

[0184] In some embodiments, provided herein is a method of inducing a weight loss in a subject in need thereof, comprising administering a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof described herein. In some embodiments, the subject has been diagnosed with overweight. In some embodiments, the subject has a body mass index (BMI) of at least 24, such as at least about any of 25, 26, 27, 28, 29, 30, or above.

[0185] In some embodiments, provided herein is a method of treating metabolic syndrome in a subject in need thereof (e.g., a subject who has been diagnosed with a metabolic syndrome) , comprising administering a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof described herein.

[0186] In some embodiments, provided herein is a method of treating NASH in a subject in need thereof (e.g., a subject who has been diagnosed with NASH) , comprising administering a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof described herein.

[0187] In some embodiments, provided herein is a method of treating NAFLD in a subject in need thereof (e.g., a subject who has been diagnosed with NAFLD) , comprising administering a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof described herein.

[0188] In some embodiments, effectiveness of the peptide of Formula (I) , the conjugate of Formula (O) , or any composition thereof can be assessed by, for example, observing a significant reduction in blood glucose, observing a significant increase in insulin, observing a significant reduction in HbA1c and / or observing a significant reduction in body weight.

[0189] In some embodiments, provided herein is a method of treating any disease or condition that can be ameliorated, slowed, inhibited or prevented by eliminating, inhibiting or reducing PCSK9 activity, the method comprising administering to the subject a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof, described herein. In some embodiments, a disease or condition that can be treated or prevented by the use of a statin can also be treated with any of the conjugate of Formula (O) , or any composition thereof described herein. In some embodiments, a disease or condition that can benefit from preventing cholesterol synthesis or increased expression of LDLR can also be treated using any of the conjugate of Formula (O) , or any composition thereof described herein. Preferably, the subject is a human.

[0190] In one aspect, provided herein is a method of treating a cholesterol-related disease in a subject in need thereof, comprising administering a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof, described herein. In some embodiments, the subject in need thereof have a cholesterol-related disease, or a symptom associated with such a disease. In some embodiments, the subject has been diagnosed with a cholesterol-related disease. In some embodiments, the subject has shown early sign of a cholesterol-related disease. In some embodiments, the subject has an elevated risk for having a cholesterol-related disease.

[0191] In some embodiments, cholesterol-related disease includes, but is not limited to hypercholesterolemia, hyperlipidemia, heart disease, metabolic syndrome, diabetes, coronary heart disease, Stroke, cardiovascular diseases, and general dyslipidemia (shown as, for example, increased total serum cholesterol, elevated LDL, increased Triglycerides, increased VLDL and / or low HDL) , or any combination thereof. Some non-limiting examples of primary and secondary dyslipidemia that can be treated with the conjugate of Formula (O) described herein include metabolic syndrome, diabetes mellitus, Familial combined hyperlipidemia, familial hypertriglyceridemia, familial hypercholesterolemia, including heterozygous hypercholesterolemia , homozygous hypercholesterolemia, familial defective apoplipoprotein B-100; polygenic hypercholesterolemia; remnant removal disorder (remnant removal) Disease) , hepatic lipase deficiency; secondary to any of the following dyslipidemia: dietary indiscretion, hypothyroidism, drugs (including estrogen and progesterone therapy, beta Blockers and thiazide diuretics Nephrotic syndrome, chronic renal failure, Cushing's syndrome, primary biliary cirrhosis, glycogen storage diseases ) , hepatoma, cholestasis, acromegaly, insulinoma, isolated growth hormone deficiency, and alcohol-induced hypertriglyceridemia.

[0192] In some embodiments, provided herein is a method of inhibiting binding of PCSK9 to LDL-receptor (LDLR) in a subject, the method comprising administering to the subject a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof, described herein.

[0193] In some embodiments, provided herein is a method of lowering cholesterol levels in a subject, the method comprising administering to the subject a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof, described herein. In some embodiments, the cholesterol is LDL-cholesterol. Hence in some embodiments, provided herein is a method of lowering LDL-cholesterol levels in a subject, the method comprising administering to the subject a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof, described herein. In some embodiments, provided herein is a method of reducing serum LDL-cholesterol levels in a subject, the method comprising administering to the subject a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof, described herein. In some embodiments, the subject has been diagnosed with higher-than-normal LDL level. In some embodiments, the subject has an LDL level of at least 120, such as at least about any of 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, or above.

[0194] In some embodiments, provided herein is a method of treating a condition associated with elevated LDL-cholesterol levels in a subject in need thereof, the method comprising administering to the subject a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof, described herein.

[0195] In some embodiments, provided herein is a method of treating a cholesterol-related disease in a subject in need thereof (e.g., a subject who has been diagnosed with a cholesterol-related disease) , the method comprising administering to the subject a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof, described herein.

[0196] In some embodiments, provided herein is a method of treating hypercholesterolemia and / or hyperlipidemia in a subject in need thereof (e.g., a subject who has been diagnosed with hypercholesterolemia and / or hyperlipidemia) , the method comprising administering to the subject a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof, described herein.

[0197] In some embodiments, provided herein is a method of (1) treating a disease mediated by glucagon receptor, GLP-1 receptor, or GIP receptor, or any combination thereof (e.g., a metabolic disorder, such as diabetes mellitus, type 2 diabetes, obesity, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) , non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , dyslipidemia, cardiovascular disease, and metabolic syndrome) ; and (2) treating a disease that can be ameliorated, slowed, inhibited or prevented by eliminating, inhibiting or reducing PCSK9 activity (e.g., cholesterol-related disease such as hypercholesterolemia) in a subject thereof, the method comprising administering to the subject a conjugate of Formula (O) , or any composition thereof, described herein.

[0198] In some embodiments, disease mediated by glucagon receptor, GLP-1 receptor, or GIP receptor, or any combination thereof can be the same or have similar symptoms as the disease that can be ameliorated, slowed, inhibited or prevented by eliminating, inhibiting or reducing PCSK9 activity. In some embodiments, the method provided herein provides a stronger therapeutic effects in treating such a disease or symptom. In some embodiments, the subject has been diagnosed with both diseases. In some embodiments, the subject has an elevated risk for having both diseases.

[0199] In some embodiments, disease mediated by glucagon receptor, GLP-1 receptor, or GIP receptor, or any combination thereof can be different from or have different symptoms from the disease that can be ameliorated, slowed, inhibited or prevented by eliminating, inhibiting or reducing PCSK9 activity. In some embodiments, the method provided herein provides therapeutics in both the disease mediated by glucagon receptor, GLP-1 receptor, or GIP receptor, or any combination thereof and the disease that can be ameliorated, slowed, inhibited or prevented by eliminating, inhibiting or reducing PCSK9 activity. In some embodiments, the subject has been diagnosed with both diseases. In some embodiments, the subject has an elevated risk for having both diseases.

[0200] In some embodiments, the method can induce cAMP production, such as increase the cAMP production by at least about 5%, or at least about any of 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, or 200%. In some embodiments, the method can induce insulin secretion in response to high glucose stimulation, such as increase insulin secretion by at least about 5%, or at least about any of 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, or 200%. In some embodiments, the method can reduce insulin resistance. In some embodiments, the method can reduce or manage body weight, such as reduce the body weight by at least about 5%, or at least about any of 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, or 50%. In some embodiments, the method can reduce LDL-c level, such as reduce the LDL-c level by at least about 5%, or at least about any of 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, or 50%.

[0201] In some variations, the compounds (e.g., the conjugate of Formula (O) , or any variation thereof described herein) and compositions described herein are administered at a therapeutically effective dosage, e.g., a dosage sufficient to provide treatment for the disease state. The amount of the chemical entity administered will be dependent, for example, on the subject (e.g., human) and disease state being treated, the severity of the affliction, the manner and schedule of administration and the judgment of the prescribing physician.

[0202] Administration of the compounds (e.g., the conjugate of Formula (O) , or any variation thereof described herein) and compositions described herein can be via any accepted mode of administration for therapeutic agents including, but not limited to, oral, sublingual, subcutaneous, parenteral, intravenous, intranasal, topical, transdermal, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonary, vaginal, rectal, or intraocular administration. In some embodiments, the compound (e.g., the conjugate of Formula (O) , or any variation thereof described herein) or composition is administered subcutaneously. In some embodiments, the compound (e.g., the conjugate of Formula (O) , or any variation thereof described herein) or composition is administered orally. In some embodiments, the compound (e.g., the conjugate of Formula (O) , or any variation thereof described herein) or composition is administered intravenously.

[0203] In some embodiments, the compound (e.g., the conjugate of Formula (O) , or any variation thereof described herein) or composition described herein have an extended duration of action, e.g., the binding affinity and activity for a compound provided herein continues for a period of time greater than native human GIP, GLP-1 and glucagon peptides. The time action profile of the compound provided herein may be measured using known pharmacokinetic test methods such as those utilized in the examples below.

[0204] Also provided herein is the use of the compound (e.g., the conjugate of Formula (O) , or any variation thereof described herein) or composition described herein for the manufacture of preparation of a medicament for the treatment of a disease or disorder mentioned herein. V. Kits

[0205] Also provided herein are kits for carrying out the methods described herein, which comprises one or more compounds (e.g., the conjugate of Formula (O) , or any variation thereof described herein) described herein, or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, or tautomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmacological composition comprising a compound described herein. The kits may employ any of the compounds disclosed herein. In one variation, the kit employs a compound described herein or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The kits may be used for any one or more of the uses described herein, and, accordingly, may contain instructions for use in the treatment of a disease provided herein, such as a metabolic disorder.

[0206] Kits generally comprise suitable packaging. The kits may comprise one or more containers comprising any compound described herein. Each component (if there is more than one component) can be packaged in separate containers or some components can be combined in one container where cross-reactivity and shelf life permit. One or more components of a kit may be sterile and / or may be contained within sterile packaging.

[0207] The kits may be in unit dosage forms, bulk packages (e.g., multi-dose packages) or sub-unit doses. For example, kits may be provided that contain sufficient dosages of a compound as disclosed herein (e.g., a therapeutically effective amount) and / or a second pharmaceutically active compound useful for a disease detailed herein (e.g., metabolic disorder) to provide effective treatment of an individual for an extended period. Kits may also include multiple unit doses of the compounds and instructions for use and be packaged in quantities sufficient for storage and use in pharmacies (e.g., hospital pharmacies and compounding pharmacies) .

[0208] The kits may optionally include a set of instructions, generally written instructions, although electronic storage media (e.g., magnetic diskette or optical disk) containing instructions are also acceptable, relating to the use of component (s) of the methods described herein. The instructions included with the kit generally include information as to the components and their administration to an individual. VI. Method of Preparation Conjugation Method 1

[0209] In one aspect, provided herein is a method of preparing a conjugate having a structure of Formula (O) : or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein: Ab is an anti-PCSK9 antibody or antigen-binding fragment thereof; Lk is a linking moiety or a bond; Pp is a peptide that is a GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist, wherein the peptide comprises an activated chemical moiety; the method comprising a) contacting the antibody or antigen-binding fragment with a cysteine blocking agent, wherein the cysteine blocking agent forms a stable mixed disulfide with at least one cysteine residue of the antibody or antigen-binding fragment; b) contacting the antibody or antigen-binding fragment with a reducing agent to form a reduced antibody or antigen-binding fragment; and c) contacting the reduced antibody or antigen-binding fragment with a precursor peptide-linker compound Pp-Lk1 comprising an activated chemical moiety to form the conjugate; wherein the method does not use an oxidizing agent.

[0210] Without being bound to any theory, in order to be an effective target of a conjugation reaction, the anti-PCSK9 antibody or antigen-binding fragment should comprise a free cysteine in the reduced form (e.g., -SH) . However, a protein with a free cysteine may, for the high conjugation activity, be difficult to produce or isolate, and is thus frequently obtained as a mixed disulfide including a small organic moiety. Hence the method provided herein comprises a) contacting the antibody or antigen-binding fragment with a cysteine blocking agent, wherein the cysteine blocking agent forms a stable mixed disulfide with at least one cysteine residue of the antibody or antigen-binding fragment. In some embodiments, mixed disulfides are molecules comprising a disulfide bond linking two different entities which are not both polypeptides, such as an “antibody-S-S-Cap” moiety (e.g., a capped cysteine) . It should be understood that in mixed disulfides, there could still exist “ordinary” disulfide bonds between two cysteine amino acid residues in the antibody or antigen-binding fragment. In some embodiments, an exemplary method is illustrated in FIG. 14.

[0211] In some embodiments, the mixed disulfide is an antibody or antigen-binding fragment with a capped cysteine “antibody-S-S-Cap” . In some embodiments, the Cap may be derived from a small organic moiety, including at least one sulfur atom that is part of the disulfide bond of the mixed di-sulfide. In some embodiments, the -S-Cap is derived from cysteine / cystine, cysteamine / cystamine (which is a decarboxylated cystine) or glutathione (G-SH) / glutathione disulfide (GS-SG) , and the mixed disulfide is thus in an embodiment selected from antibody-S-S-Cys, antibody-S-S-Cyst, or antibody-S-S-G, wherein the Cys refers to half of a cystine, Cyst refers to half of cystamine, and G refers to half of glutathione disulfide. In other words, in one embodiment, the Cap of antibody-S-S-Cap is derived from cysteine, cysteamine or glutathione.

[0212] In some embodiments, the method further comprises removing excess cysteine blocking agent. The excess cysteine blocking agent can be removed by for example, cation exchange chromatography, or ultrafiltration. In some embodiments, the excess cysteine blocking agent is removed by ultrafiltration or cation exchange chromatography. In some embodiments, the excess cysteine blocking agent can be removed between steps a) and b) . In some embodiments, the excess cysteine blocking agent can be removed between steps b) and c) . In some embodiments, the cysteine blocking agent is removed by cation exchange chromatography. In some embodiments, the cysteine blocking agent is removed by ultrafiltration.

[0213] In some embodiments, the method comprises b) contacting the antibody or antigen-binding fragment with a reducing agent to form a reduced antibody or antigen-binding fragment. In some embodiments, the reducing step reduces the “antibody-S-S-blocking agent” moiety to an “antibody-SH” moiety, wherein the -SH can be further used for conjugation. In some embodiments, the reducing agent is selected from the group consisting of triphenylphosphine-3, 3', 3"-trisulfonate ( “TPPTS” ) , tris (2-carboxyethyl) phosphine ( “TCEP” ) , and triphenylphosphine-3, 3'-disulfonate ( “TPPDS” ) . In some embodiments, the molar ratio of reducing agent to antibody or antigen-binding fragment is 2 to 4: 1. In some embodiments, the molar ratio of reducing agent to antibody or antigen-binding fragment is 2 to 4: 1. In some embodiments, the molar ratio of reducing agent to antibody or antigen-binding fragment is 3 to 4: 1. In some embodiments, the molar ratio of reducing agent to antibody or antigen-binding fragment is 2: 1. In some embodiments, the molar ratio of reducing agent to antibody or antigen-binding fragment is 3: 1. In some embodiments, the molar ratio of reducing agent to antibody or antigen-binding fragment is 4: 1.

[0214] In some embodiments, the method further comprises removing excess reducing agent. In some embodiments, the excess reducing agent is removed by buffer exchange. In some embodiments, the reducing agent is removed between steps b) and c) to remove the reducing agent. In some embodiments, the buffer exchange step is ultrafiltration or diafiltration.

[0215] In some embodiments, the method comprises c) contacting the reduced antibody or antigen-binding fragment with a precursor peptide-linker compound Pp-Lk1 comprising an activated chemical moiety to form the conjugate. In some embodiments, the activated chemical moiety can comprise or be any chemical group that can be replaced by a sulfur. In some embodiments, after reacting with the antibody or antigen-binding fragment, the activated chemical moiety is replaced by a group (e.g., a sulfur) in the antibody or antigen-binding fragment, and the precursor peptide-linker compound Pp-Lk1 becomes Pp-Lk, wherein Pp and Lk are each independently as defined herein. In some embodiments, the activated chemical moiety comprises a halogen, wherein the halogen is selected from the group consisting of Br, I, and Cl.

[0216] In some embodiments, methods provided herein further comprise providing a precursor peptide-linker compound Pp-Lk1 comprising an activated chemical moiety. In some embodiments, this step comprises synthesizing a peptide moiety in the precursor peptide-linker compound Pp-Lk1 and then coupling the active moiety to the peptide moiety. In some embodiments, the peptide moiety can by synthesized by chemical synthesis or recombinant production. In some embodiments, the peptide moiety can by synthesized by Fmoc chemical synthesis. In some embodiments, this step further comprises purifying the peptide moiety. In some embodiments, the peptide is purified by, e.g., HPLC. An exemplary procedure for preparing the peptide having an activated chemical moiety is described in Examples provided herein. In some embodiments, activated chemical moiety is bromoacetic acid.

[0217] In some embodiments, the molar ratio of the peptide having an activated chemical moiety to the antibody or antigen-binding fragment is 1 to 6: 1. In some embodiments, the molar ratio of the peptide having an activated chemical moiety to the antibody or antigen-binding fragment is 2 to 6: 1. In some embodiments, the molar ratio of the peptide having an activated chemical moiety to the antibody or antigen-binding fragment is 3 to 6: 1. In some embodiments, the molar ratio of the peptide having an activated chemical moiety to the antibody or antigen-binding fragment is 4 to 6: 1.

[0218] In some embodiments, the method further comprises purification step d) removing the excess precursor peptide-linker compound Pp-Lk1. In some embodiments, the purification step comprises size exclusion chromatographic, hydrophobic interaction chromatography ( “HIC” ) , or ultrafiltration / diafiltration, or any combination thereof.

[0219] In some embodiments, the method does not use an oxidizing agent. In some embodiments, after step b) , the antibody or antigen-binding fragment thereof is not further oxidized. In some embodiments, the oxidizing agent comprises dehydroascorbic acid ( “DHAA” ) and the method does not comprise the use of DHAA. Conjugation Method 2

[0220] In some embodiments, the APC conjugate described herein may be a glycosite-specific conjugate. In some embodiments, the glycosite-specific APC conjugate is prepared by glycosite-specific coupling technology, and the cytotoxin is site-specifically modified at the N297 glycosylation site of the Fc domain of the antibody, wherein the amino acid position is based on EU numbering.

[0221] Currently, in vivo anitbody glycosite-specific modification methods mainly include glycosyltransferase technology and endoglycosidase technology. In the glycosyltransferase technology, galactose or sialic acid with reactive functional groups is transferred to the glycosylation site of the antibody by using galactosyltransferase or sialyltransferase, which is further coupled to cytotoxins to prepare glycosite-specific ADC compounds. For example. Zhu et al. firstly used β1, 4-galactosidase to hydrolyze the galactose at the end of the N-glycan at the glycosylation site of antibody and then used galactosyltransferase to transfer the ketocarbonyl-containing GalNAc to the end of the N-glycan and further coupled the toxin containing hydroxylanine functional group to obtain the glycosite-specific ADC compounds. Qun Zhou et al. used galactosyltransferase and sialyltransferase to transfer galactose and sialic acid to the antibody glycosylation site sequentially, and then used sodium periodate to oxidize the terminal sialic acid so as to introduce an aldehyde group at the glycosylation site, providing a reactive site for toxin coupling. Floris L. van Delft et al firstly used the endoglycosidase Endo-Sto hydrolyze the heterogeneous N-glycan of the antibody, then used galactosyltransferase to transfer the azide-containing GalNAz to the glycosylation site of the antibody, and finally used the click chemical reactions to achieve the modification of toxins at the glycosylation site.

[0222] Also provided is a method of preparing an APC conjugate described herein, wherein the method comprises contacting the antibody with an azide-modified disasccharide oxazoline in the presence of a single enzyme. Also provided is a method of preparing an APC conjugate described herein, wherein the method comprises a conjugation technique, wherein said conjugation technique is glycosylation site-specific conjugation technique. In some embodiments, the glycosylation site-specific conjugation technique comprises one pot Fc glycan remodeling method, said one pot Fc glycan remodeling method using a single enzyme for both deglycosylation and transglycoslation. In some embodiments, the one pot Fc glycan remodeling method includes a modified disaccharide core composed of a mannose-β1, 4-N-acetylglucosamine conjugated to the asparagine (Asn) -linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) on the antibody. In some embodiments, the one pot Fc glycan remodeling method includes a modified disaccharide core composed of a glucose-β1, 4-N-acetylglucosamine conjugated to the asparagine (Asn) -linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) on the antibody. In some embodiments, the one pot Fc glycan remodeling method includes a modified disaccharide core composed of a galactose-β1, 4-N-acetylglucosamine conjugated to the asparagine (Asn) -linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) on the antibody. In some embodiments, the enzyme is selected from the group consisting of wild-type Endo S, wild-type Endo S2, wild-type Endo F3 and mutants thereof. In some embodiments, the enzyme is wild-type Endo S2 and mutants thereof.

[0223] In some embodiments, the antibody is glycoengineered, comprising one or more modifications at the glycan site, For example, the antibody may undergo deglycosylation and / or transglycosylation to provide an azido-tagged antibody. In some embodiments, the azido-tagged antibody is conjugated with the peptide-linker comprising a DBCO moiety as described herein via DBCO / azide click reaction. In some embodiments, the glycoengineered antibody is modified at position 297, wherein the amino acid position is based on EU numbering. Exemplary methods of preparing glycoengineered Fc are described in CN117580586 and WO2022226420, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entireties.

[0224] In some embodiments, the azido-tagged antibody prepared by the glycosylation site-specific conjugation technique has the following structure:

[0225] In some embodiments, the peptide-linker-antibody conjugate, which is prepared by conjugating the azido-tagged antibody with one or more peptide-linkers comprising a DBCO moiety, has the following structure: EXAMPLES Example 1. Anti-PCSK9 antibody production, purification, and capping

[0226] The sequence encoding anti-PCSK9 antibody of the IgG1 isoform modified with E272C (EU) and N297A mutations (named as “10087 IgG1 N297A” or “10087-IgG1-N297A” ) was cloned into pcDNA3.1 (Invitrogen) , and the protein was produced by the ExpiCHOTM Expression system (Gibco, A29133) expression system according to the following procedures.

[0227] ExpiCHO-STM cells (Gibco) were passaged according to the desired transfection volume and the cell density was adjusted to 3.5×106 cells / ml the day before transfection. On the day of transfection, the cell density was adjusted to 6×106 cells / ml. In a 50 ml centrifuge tube, transfection buffer reagent OptiPROTM SFM (Gibco, 12309019) was added in volume as 8%of the total volume, and total amount of plasmid was added at 0.8 μg / ml transfected cells (light chain: heavy chain plasmid mass ratio is 1: 1) ; the transfection buffer containing the DNA plasmid was filtered into a new 50 ml centrifuge tube using a 0.22 μm filter and ExpiFectamineTM CHO reagent (Gibco, 100033022) was added to the filtered mixture at a DNA: Reagent=1: 4 ratio. Immediately after mixing the transfection reagent with plasmid DNA, the mixture was added slowly to the cells while gently shaking the flask, and the incubation time of the transfection reagent and plasmid was less than 5 minutes. For transfection, the cells were incubated at 37 ℃ while shaking with 8%CO2. After 18-22 h, Enhancer (Gibco, 100033019) was added at a 6 μl / ml cell volume, and Feed (Gibco, A29101-01) was added at a 300 μl / ml cell volume. The cell were incubated at 37℃ at 120 rpm with 8%CO2, and continuously being incubated until day 7 or when cell viability is ≤ 60%. Cell supernatants were collected for purification.

[0228] The cell culture was centrifuged at 4000 rpm for 50 minutes, and the supernatant was collected, and purified with a Hitrap Mabselect Sure prepacked column (GE, 11-0034-95) . Specifically, before purification, the prepacked column was equilibrated using 5 times the column volume of PBS; the collected supernatant was passed through the column; and the packed column was then washed with 10 times column volumes of PBS to remove non-specific binding proteins; afterwards, the column was washed with 5 times column volumes of elution buffer (100 mM sodium citrate, pH 3.5) to collect the eluate. The pH was adjusted to 6.5 with 2 M Tris per 1 ml of eluate and the concentration was measured.

[0229] The affinity-purified antibody was capped by adding the antibody to 40 mM HEPES buffer (pH 8) containing 2.5 mM cystamine and 2.5 mM cysteine to a final concentration of approximately 2.5 mg / mL and incubating for 15–20 hours at room temperature. The reaction mixture was then filtered through a sterile filter and diluted 3-fold with 100 mM sodium acetate buffer at pH 5.0. The reaction mixture was then purified by cation-exchange chromatography (Thermo Scientific POROSTM 50 HS; Equilibrated solution: 20 mM phosphate, pH 6.0; eluent: balanced solution + 1.0 M NaCl, 0-40%10 CV) , and the main peak was the target protein containing bicysteine cap, and the buffer was replaced with 10 mM sodium acetate (pH 5.0) , filtered and sterilized, and the protein concentration was determined. Example 2. Preparation of Peptide-Linker Compound p005 and p016 Preparation of Peptide-Linker Compound p005

[0230] The sequence of Peptide-Linker Compound p005 (SEQ ID NO: 62) is: Y- (Aib) -Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-I- (αMeL) -L-D-K-K-A-Q- (Aib) -A-F-I-E-Y-L-L-E-G-G-G-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S- [Lys (Ac-Br) ] .

[0231] Peptide-Linker Compound p005 was synthesized following the standard Fmoc synthetic method, which included the following steps: 1. Pre-treatment of Rink Amide MBHA resin: Rink Amide MBHA resin (0.30 mmol, 1.00 eq, Sub 0.33 mmol / g) was weighed, to which 10 mL of N, N-Dimethylformamide (DMF) was added under nitrogen bubbling, such that the resin was swelled. The swelled resin was incubated at 25℃ for 2 hours. Then the solvent was removed. 2. Deprotection: After resin pre-treatment, the protecting groups on the resin were removed by incubating 10 mL DMF containing 20%piperidine with the resin under nitrogen bubbling for 30 minutes. Then the solvent was removed and the resin was washed with 10 mL DMF for six times. Once the washing was done, the solvent was then removed. 3. Coupling reaction: Fmoc-Lys (Dde) -OH (0.9 mmol, 3.00 eq) , DIEA (1.8 mmol, 6.00 eq) , and HBTU (0.85 mmol, 2.85 eq) were dissolved in 5.0 mL DMF, and added to the resin under nitrogen bubbling at 20℃ for 30 minutes. Then the resin was washed with 10 mL DMF for six times. Once the washing was done, the solvent was then removed. 4. Steps 2 and 3 were repeated, sequentially adding to the mixture the amino acids and coupling reagents listed in Table 4-1. 5. For the last amino acid (N-terminus of the peptide) , Boc-Tyr (tBu) -OH was used for coupling. After the reaction was completed, 3%NH2NH2·H2O was used to remove the Dde protection group in DMF. 2-bromoacetic acid was then coupled to the peptide. Table 4-1

[0232] The synthesized Peptide-Linker Compound p005 was then purified following steps below: 1. After the coupling was completed, the resin was washed with 30 mL DMF for five times, then washed with 30 mL MeOH for three times. The mixture was vacuum dried to obtain 2.8 g resin with Peptide-Linker Compound, which was then added into 25 mL cleavage reagent (92.5%TFA / 2.5%Mpr / 2.5%TIS / 2.5%H2O) and reacted at 20℃ for 2 hours. 2. The cleavage solution was then filtered, and 250 mL of ice-cold isopropyl ether was added to the filtrate. The mixture was then centrifuged at 5000 rpm for 2 minutes, and washed twice with isopropyl ether. 3. The mixture of step 2 was vacuum dried to obtain crude product of the target Peptide-Linker Compound, which was confirmed by LCMS. 4. The crude product was purified by HPLC under the conditions listed in Table 4-2. The target peptide fraction was collected, and its composition was confirm by LCMS (EW50679-1-P3C, retention time 0.963 minutes) and HPLC (EW50679-1-P3B, retention time 9.855 minutes) . The resulting product, Peptide-Linker Compound p005 (MW: 4606.13) , had a purity of no less than 95%. Table 4-2 Preparation of Peptide-Linker Compound p016

[0233] The sequence of Peptide-Linker Compound p016 (SEQ ID NO: 64) is: Y- (Aib) -Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-I- (αMeL) -L-D-K-K-A-Q- (Aib) -A-F-I-E-Y-L-L-E-G-G-G-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S- (Lys-DBCO) .

[0234] Peptide-Linker Compound p016 was synthesized following the standard Fmoc synthetic method, which included the following steps: 1. Pre-treatment of Rink Amide MBHA resin: Rink Amide MBHA resin (0.30 mmol, 1.00 eq, Sub 0.33 mmol / g) was weighed, to which 10 mL of N,N-Dimethylformamide (DMF) was added under nitrogen bubbling, such that the resin was swelled. The swelled resin was incubated at 25℃ for 2 hours. Then the solvent was removed. 2. Deprotection: After resin pretreatment, the protecting groups on the resin were removed by incubating 10 mL DMF containing 20%piperidine with the resin under nitrogen bubbling for 30 minutes. Then the solvent was removed and the resin was washed with 10 mL DMF for six times. Once the washing was done, the solvent was then removed. 3. Coupling reaction: Fmoc-Lys (Boc) -OH (0.9 mmol, 3.00 eq) , DIEA (1.8 mmol, 6.00 eq) , and HBTU (0.85 mmol, 2.85 eq) were dissolved in 5.0 mL DMF, and added to the resin under nitrogen bubbling at 20℃ for 30 minutes. Then the resin was washed with 10 mL DMF for six times. 4. Steps 2 and 3 were repeated, sequentially adding to the mixture the amino acids and coupling reagents listed in Table 4-3. 5. For the last amino acid (N-terminus of the peptide) , Boc-Tyr (tBu) -OH was used for coupling. After the reaction was completed, 3%NH2NH2·H2O was used to remove the Dde protection group in DMF. Fmoc N-hydroxysuccinimide ester (Fmoc-Osu) was then coupled to the peptide to protect the side chain -NH2 in Lys. Table 4-3

[0235] The synthesized Peptide-Linker Compound p016 was then purified following steps below: 1. Once the coupling was completed, the resin was washed with 30 mL DMF for five times, then washed with 30 mL MeOH for three times. The mixture was vacuum dried to obtain 2.3 g resin with Peptide-Linker Compound, which was then added into 25 mL cleavage reagent (92.5%TFA / 2.5%Mpr / 2.5%TIS / 2.5%H2O) and reacted at 20℃ for 2 hours. 2. The cleavage solution was then filtered, and 250 mL of ice-cold isopropyl ether was added to the filtrate. The mixture was then centrifuged at 5000 rpm for 2 minutes, and washed twice with isopropyl ether. 3. The mixture of step 2 was vacuum dried to obtain crude product of the target Peptide-Linker Compound p016, which was confirmed by LCMS. 4. The crude product was purified by HPLC under the conditions listed in Table 4-4. 5. The Peptide-Linker Compound of Step 4 was dissolved in DMSO, to which DBCO-NHS ESTER (0.95 eq) / DIEA (1.9 eq) was added. LCMS was used to monitor the progress of the reaction. After the reaction was completed, DBU (0.15mL) was added to the mixture to remove the Fmoc groups. 6. The mixture was further purified by HPLC following conditions in Table 4-5. The target peptide fraction was collected, and its composition was confirm by LCMS (EW53145-2-P4C, retention time 1.069 minutes) and HPLC (EW53145-2-P4B, retention time 14.614 minutes) . The resulting product, Peptide-Linker Compound p016 (MW: 4772.30 ) , had a purity of no less than 95%. Table 4-4 Table 4-5 Example 3. Preparation of Antibody Peptide Conjugates (APCs)

[0236] The anti-PCSK9 antibody prepared in Example 1 (10087 IgG1 N297A) and the Peptide-Linker Compound p005 or p016 prepared in Example 2 were conjugated to form the target APC following the method detailed below, wherein the antibody “10087 IgG1” was obtained by replacing the heavy chain constant region in Tafolecimab with human IgG1 heavy chain constant region (SEQ ID NO: 33) ; and the antibody “10087 IgG1 LALA” was obtained by further introducing the L234A / L235A (LALA) mutation into the antibody “10087 IgG1” . Other APCs were also prepared following similar method. The composition and conjugation position for each prepared APC were summarized in Table 4-6.

[0237] MEDI4166 is a fusion protein wherein the peptide is fused to the light chain via a linker. Methods for producing fusion protein are known in the art. For instance, WO2015127273A1 describes Anti-PCSK9～glp-1 fusion proteins, which is incorporated herein by reference in its entirety. Table 4-6 Conjugation Method 1

[0238] Step 1: Reduction of anti-PCSK9 antibody. The reduction of anti-PCSK9 antibody capped with cysteamine was carried out using 2-3 equivalents of sodium triphenylphosphine trisulfonate (TPPTS) at room temperature. The reaction lasted for 1-2 hours and cation exchange chromatography (column: YMC-BioPro SP-F; mobile phases A: 20mM sodium acetate buffer (pH 5.0) ; mobile phase B: 1M sodium chloride, 20mM sodium acetate (pH 5.0) ) was used to monitor the progress of anti-PCSK9 antibody reduction. After the reduction was complete, free cysteamine was removed from the anti-PCSK9 antibody using a 30kDa ultrafiltration tube, and the anti-PCSK9 antibody was stored in a 20mM sodium acetate buffer (pH 5.0) . Reverse-phase chromatography (column: BioResolve RP mAb Polyphenyl Column; mobile phase A: 0.1%trifluoroacetic acid in water; mobile phase B: 0.1%trifluoroacetic acid in acetonitrile) was used to monitor the percentage of completely reduced disulfide bonds in the anti-PCSK9 antibody hinge region (0.97%) .

[0239] Step 2: conjugation. The pH of the solution containing the reduced anti-PCSK9 antibody was adjusted to between 7.0 and 7.5 using a 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) . Subsequently, 4-6 equivalents of Peptide-Linker Compound p005 (or Sema for 10087-Sema) were added to the pH-adjusted anti-PCSK9 antibody, and the mixture was reacted at 4 ℃ for 16-20 hours. Hydrophobic chromatography (Column: TSKgel Butyl-NPR; mobile phase A: 1.5M ammonium sulfate, and 25mM sodium phosphate (pH 7.0) ; mobile phase B: 25%isopropanol (v / v) , 25mM sodium phosphate (pH 7.0) ) was utilized to monitor the Drug-to-Antibody Ratio (DAR) of the conjugation reaction. Quantitative analysis was conducted using the area normalization method. The peak area percentage of APCs containing 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ····and n (which is an integer greater than 8) peptide-linker compounds (P-Ls) were calculated, respectively. The average DAR value of the APCs was calculated according to the following formula: average DAR value= (APC containing 0 P-L×0 + APC containing 1 P-L×1 + APC containing 2 P-Ls×2 + APC containing 3 P-Ls×3 + APC containing 4 P-Ls×4 + APC containing 5 P-Ls×5 + APC containing 6 P-Ls×6 + APC containing 7 P-Ls×7 + APC containing 8 P-Ls×8 ····APC containing n P-Ls×n)  / 100%.

[0240] Step 3: purification. Size exclusion chromatography (column: HiLoad 16 / 600 Superdex 200pg; mobile phase: 50mM Tris (pH 10) ) was used to remove un-conjugated peptides, peptide-linker compounds, or aggregates thereof.

[0241] Structure of the prepared APC is illustrated in FIG. 1. The average DAR values of the prepared 10087-N297A-p005, 10087-p005, 10087-Sema, Alirocumab-p005, and Evolocumab-p005 are 1.5-2.5, respectively. Conjugation Method 2

[0242] Step 1: Glycosylation and Modification of anti-PCSK9 antibody. To the histidine solution of anti-PCSK9 antibody (220 mg anti-PCSK9 antibody in 20 mM, 2 mL, pH 6.5 histidine solution) , Endo-S2 (2.9 mg) and azide-GlcGLcNAc-oxazoline (20.3 mg, 30 equivalents) were sequentially added. The pH of the reaction mixture was adjusted to 6.5, and was incubated at 30℃ for 2 hours. After confirming the completion of the reaction via LC-MS, the azide-modified G1AA-PCSK9 was purified using a protein A column.

[0243] Step 2: Conjugation. The azide-modified G1AA-PCSK9 (196 mg) was mixed with p016 (32 mg, 5 equivalents) . DMSO was added to a final concentration of 15% (v / v) , and the mixture was reacted on a shaker at room temperature for 20 hours. Hydrophobic chromatography was carried out under the same conditions as “Conjugation Method 1” , and average DAR value of the APCs was calculated.

[0244] Step 3: Purification. Size exclusion chromatography (column: HiLoad 16 / 600 Superdex 200pg; mobile phase a: 50mM Tris (pH 10) ) to remove un-conjugated peptides, peptide-linker compounds, or aggregates thereof. The average DAR value of the prepared APC006 is 1.5 to 2.5. Example 4. Affinity of APCs to various animals’ PCSK9

[0245] The equilibrium dissociation constant (KD) for the binding of the APC provided herein to human, cynomolgus monkey, rat, and mouse PCSK9 was determined using Bio-Layer Interferometry (BLI) . The affinity determination was conducted according to existing methods (Estep, P., et al., High throughput solution Based measurement of antibody antigen affinity and epitope binning, MAbs, 2013, 5 (2) : 270-278) .

[0246] Half an hour before the experiment, an appropriate number of AHC sensors (18-5060, Sartorius) were soaked in SD buffer (PBS 1×, BSA 0.1%, Tween 20 0.05%) based on the quantity of samples to be measured.

[0247] 100μL of SD buffer, APC sample, and antigens were added to a 96-well black polystyrene half-area microplate (Greiner, 675076) . The sensor positions were selected based on the sample layout. The instrument parameters were set with a baseline of 120 seconds, loading approximately 1nm, followed by another baseline of 120 seconds, association for 100 seconds, and dissociation for 120 seconds, at a speed of 1000rpm and a temperature of 30℃. The KD values were analyzed using ForteBio analysis software. The results are shown in Table 4-7. As shown in Table 4-7, 10087-N297A-p005 have high affinity to PCSK9 from different species (human, cyno, Rat and mice) . Table 4-7

[0248] The hydrophobicity of the APCs was assessed by recording their retention time on an HIC-HPLC column. The samples were diluted to 1mg / mL, and 10μL sample was injected into a MAbPac HIC-10 chromatography column. The chromatographic conditions included a detection wavelength of 280nm, column temperature of 25℃, and a flow rate of 1 ml / min. The mobile phase gradient was: 0-20 min 100%A –100%B; 20-25min 100%B; 25-30 min 100%A. The mobile phases used were A: 1.8 M (NH4) 2SO4, 100 mM NaH2PO4, pH 6.5 and B: 100 mM NaH2PO4, 10%IPA, pH 6.5. The results are shown in FIG. 2. Example 5. PCSK9 binding activity of prepared APC

[0249] The prepared APCs, 10087-N297A-p005 and 10087-Glyco-p016, and the control sample tafolecimab, were tested for their binding activities with huPCSK9 protein in an experimental system.

[0250] Human PCSK9 protein (ACRO, PCY-H5225) was diluted to a final concentration of 5 ug / mL and 100μL was added to a new ELISA plate, which was then incubated overnight in a refrigerator at 4℃. The ELISA plate was washed three times with a plate washer and residual liquid was removed by shaking. Then, 200μL of 5%milk was added as a blocking solution and the plate was sealed at room temperature for 2 hours. After sealing, the plate was washed three times with the plate washer and residual liquid was removed by shaking.

[0251] 10087-N297A-p005 or 10087-Glyco-p016 was diluted to a final concentration of 50nM using assay buffer (1%BSA + PBST) , and serially diluted threefold. 100μL of the diluted solution was added to each well of the ELISA plate and incubated at room temperature for 2 hours. The plate was then washed three times with the plate washer and residual liquid was removed by shaking. 100 μL of secondary antibody (BETHYL, A80-104P) solution diluted 1: 10000 was added and incubated at room temperature in the dark for 1 hour. The plate was washed three times with the plate washer and residual liquid was removed by shaking.

[0252] 100 μL of TMB substrate solution was added to each well, and the plate was incubated in the dark for 4-7 minutes for color development. 100 μL of termination solution was added, and the optical density at 450 nm (OD450) was measured using an ELISA reader.

[0253] As shown in FIG. 3, the binding interactions of the control antibody tafolecimab, 10087-N297A-p005 and 10087-Glyco-p016 with huPCSK9 protein were comparable. The curve fitting data is further shown in Table 5. Table 5 Example 6. PCSK9 blocking activities of APC candidates

[0254] The prepared APC candidates and control samples were tested for their binding activities with LDLR on LDLR-CHOS cells.

[0255] Ligand protein HIS-PCSK9 (ACRO, PCY-H5225) stock solution was diluted with PBS to a final concentration of 200nM. This solution was then used to dilute the APC samples to a final concentration of 300nM, followed by serial two-fold dilutions. 50μL of each diluted solution was added to a new 96-well plate and incubated in a refrigerator at 4℃ for 30 minutes. Target cells (LDLR-CHOS) were collected, centrifuged to remove the supernatant, resuspended in PBS, and the cell density was adjusted to 4*10E6 cells / mL. 50μL of target cells were added to the pre-diluted antibodies in the 96-well plate, mixed by pipetting, and incubated in a refrigerator at 4℃ for 30 minutes.

[0256] After treatment, the cells were centrifuged at 400×G for 5 minutes, the supernatant was gently discarded, and 200μL of PBS was added followed by centrifugation at 400×G for 5 minutes. This washing step was repeated three times. 100μL of a 1: 200 diluted HIS-PE secondary antibody (biolegend, 362603) solution was added to resuspend the cells, and they were incubated in a refrigerator at 4℃, protected from light, for 30 minutes. The cells were then centrifuged at 400×G for 5 minutes, the supernatant was gently discarded, and 200μL of PBS was added followed by centrifugation at 400×G for 5 minutes. This washing step was repeated three times. Finally, 80 μL of PBS was added to resuspend the cells. The cell fluorescence signals were detected using a flow cytometer.

[0257] As shown in FIG. 4A and FIG. 4B, the ability of the control antibodies tafolecimab, Evolocumab, MEDI4166, and APC samples (10087-N297A-p005, 10087-p005, Alirocumab-p005, Evolocumab-p005) to block the PCSK9 / LDLR interaction was comparable. The curve fitting data of FIG. 4B is further shown in Table 6. Table 6 Example 7. LDL-c Uptake Experiment

[0258] The APCs provided herein and control samples were tested in an LDL-c uptake analysis experimental system to assess their ability to block the interaction between PCSK9 and LDLR, thereby promoting intracellular LDL-c uptake.

[0259] HepG2 cells were collected, centrifuged to remove the supernatant, and resuspended in Assay buffer (1%NEAA + DMEM) to adjust the cell density to 2*10E5 cells / mL. 100 μL of this cell suspension was seeded into each well of a black-bottomed, clear, poly-D-lysine-coated 96-well plate and incubated overnight in a 37℃ incubator. The test APC candidates were diluted to a final concentration of 1000nM and serially diluted twofold, which were mixed in equal volumes with ligand protein HIS-PCSK9 (ACRO, PCY-H5225) diluted to a final concentration of 1200nM and incubated at room temperature for 1 hour.

[0260] 50 μL of the incubated APC candidates were gently pipetted into the seeded 96-well plate and mixed gently, followed by incubation in a 37℃ incubator for 6 hours. Positive control (PC) wells without PCSK9 protein and APC candidates, and negative control (NC) wells with 1200nM PCSK9 protein without APC candidates were also set up. 25 μL of BODIPY reagent (Gibco, L3483) diluted to 30 μg / mL was added to each well and incubated for an additional 22 hours.

[0261] After treatment, the supernatant was gently discarded from each well, and 200 μL of PBS was added to each well, gently discarded, and this washing step was repeated three times. Then, 100 μL of PBS was added to each well. Fluorescence values were read using a SpectraMAX i3 plate reader with an excitation wavelength of 488nm and an emission wavelength of 540nm.

[0262] As shown in FIG. 5A and FIG. 5B, the ability of the control antibody tafolecimab and APC samples (10087-N297A-p005, Alirocumab-p005, Evolocumab-p005) to block the interaction between PCSK9 and LDLR, thereby promoting intracellular LDL-c uptake, was comparable. The curve fitting data of FIG. 4A and FIG. 4B is further shown in Table 7-1 and Table 7-2, respectively. Table 7-1 Table 7-2 Example 8: Incretin Signal Activation of cAMP

[0263] The APCs provided herein were tested in a cAMP activation experimental system to assess their ability to activate GLP-1 receptor, GCG receptor, or GIP receptor and induce cAMP production.

[0264] CHO-K1 GLP-1R cells, CHO-K1 GCGR cells, or CHO-K1 GIPR cells were cultured separately in F-12 medium (GIBCO, 11765-054) supplemented with 10%FBS (HYCLONE, SH30406.05) . When the overexpressed cell lines reached about 80%confluency in T75 culture flasks, they were digested with trypsin (GIBCO, 25200-072) . After digestion, the cells were centrifuged to remove the supernatant, resuspended in complete medium, and adjusted to a density of 4*105 cells / ml. 100 μL per well of the cell suspension was added to a 96-well clear flat-bottom cell culture plate and incubated overnight in a 37℃ incubator.

[0265] The next day, each test sample was diluted four-fold in a U-bottom plate using PBS, then mixed with an equal volume of 2%HSA (SIGMA, A3782-10G) -PBS buffer and set aside. The prepared cell plate was removed from the incubator, the existing complete medium was discarded, and residual liquid was quickly removed with a pipette. 80 μL per well of the diluted test samples were rapidly added and incubated in a 37℃ incubator for 30 minutes to stimulate the cells.

[0266] After stimulation, the cell lines were processed according to the cAMP ELISA kit (R&D, PKGE002B) instructions by directly adding 80 μL per well of ice-cold 2X lysis buffer to lyse the cells. The cell plate was then frozen at -80℃ for 20 minutes, thawed at room temperature, and subjected to two freeze-thaw cycles. Afterward, the cell lysates were centrifuged to collect the supernatant.

[0267] The cAMP content in the cell lysate supernatant was determined using a cAMP ELISA kit, and the OD450-OD570 values were measured with an ELISA reader. The cAMP levels in the samples were calculated based on a standard curve and analyzed using GraphPad Prism 10.0 software.

[0268] As shown in FIG. 6A to FIG. 6E, 10087-N297A-p005 and 10087-Glyco-p016 was able to activate GLP-1 receptor, GCG receptor, or GIP receptor and induce cAMP production. Additionally, the activity of 10087-N297A-p005 and 10087-Glyco-p016 on GLP-1R was comparable to Alirocumab-p005 and Evolocumab-p005, and AMG133, was weaker than Dulaglutide but stronger than MEDI4166 and Retatrutide. The curve fitting data of FIG. 6A to FIG. 6D is further shown in Table 8-1 to Table 8-4, respectively. Table 8-1. Curve fitting result of FIG. 6A Table 8-2. Curve fitting result of FIG. 6B Table 8-3. Curve fitting result of FIG. 6C Table 8-4. Curve fitting result of FIG. 6D Example 9: Incretin-Induced Insulin Secretion

[0269] The APCs provided herein were tested in a Glucose Stimulates Insulin Secretion (GSIS) experimental system to assess their ability to induce insulin secretion in response to glucose stimulation in Ins-1e cell line.

[0270] Using ice-cold RPMI 1640 medium, a 1%Matrigel basement membrane matrix solution (CORNING, 356231) was prepared. Then, 100 μL per well of the Matrigel matrix was added to a 96-well clear flat-bottom cell culture plate and incubated overnight in a 37℃ incubator. The Ins-1e cell line was cultured in RPMI 1640 medium (GIBCO, 22400-071) supplemented with 10%FBS (HYCLONE, SH30406.05) and 1 mM sodium pyruvate (GIBCO, 11360-070) . The cells were digested with trypsin (GIBCO, 25200-072) when they reached about 80%confluency in T75 culture flasks. After digestion, the cells were centrifuged to remove the supernatant and then resuspended in sugar-free KRBH buffer (135 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 0.5 mM NaH2PO4, 0.5 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2, 5 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.1 %BSA, pH adjusted to 7.4) and adjusted to a cell density of 1*106 cells / mL.

[0271] The cell plate coated with Matrigel matrix was prepared by discarding the original coating solution and adding 100 μL per well of the Ins-1e cell suspension. The cells were then incubated in a 37℃ incubator for 3 hours to starve. Each test molecule was diluted tenfold in sugar-free KRBH buffer and mixed with an equal volume of 33.6 mM D-glucose solution and set aside. The starved cell line was removed from the incubator, the existing sugar-free KRBH buffer was removed, and residual liquid was quickly aspirated. Then, 100 μL per well of the test molecules diluted with 16.8 mM D-glucose was rapidly added and incubated in a 37℃ incubator for 2 hours to stimulate the cells.

[0272] After stimulation, the cell line was centrifuged, and the cell culture supernatant was collected. The insulin content in the cell culture supernatant was measured according to the Mouse insulin ELISA kit (Crystal Chem, 90082) instructions. The OD450-OD630 values were detected using an ELISA reader, and the insulin content in the samples was calculated based on a standard curve. The experimental data were analyzed and graphed using GraphPad Prism 10.0 software.

[0273] As shown in FIG. 7, 10087-N297A-p005 was able to induce insulin secretion in the Ins-1e cell line in response to high glucose stimulation. The curve fitting data of FIG. 7 is further shown in Table 9. Table 9. Curve fitting result of FIG. 7 Example 10-1: Pharmacological Study in huPCSK9 Transgenic Mice

[0274] This study utilized an obesity model of huPCSK9 transgenic mice fed a high-fat diet to evaluate the weight reduction and glucose tolerance effects of APC samples provided herein.

[0275] Male huPCSK9 mice (15-25g) were purchased from Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd., with an SPF grade. After acclimatization and quarantine for 3 days upon arrival, the mice were fed a high-fat diet for 14 days before the study started. The high-fat diet (Dyets, D12079B) was used to feed the huPCSK9 mice.

[0276] The mice were grouped based on their LDL-C levels (6 per group) for dosing. The control group had an initial weight of ～26 g. A single dose was administered. Oral glucose tolerance tests (OGTT) experiments were conducted on days 4 and 8 post-dosing. The dosing for Tafolecimab was 10 mpk, and for APC, it was 10.8 mpk. The dosing groups were as follows: ·Model: NA ·Tafolecimab: Positive control Tafolecimab ·10087-p005 APC: Exemplary APC10087-p005 ·MEDI4166: Positive control MEDI4166 ·10087-Sema APC: Positive control 10087-Sema

[0277] Blood was drawn a day before dosing to check LDL-C levels. The next day, based on the LDL-C values and mouse weights, the mice were divided into 8 groups of 6 each and given subcutaneous injections. An electronic balance was used to measure weight on days D0, D3, D7, D10, and D11. Blood was drawn on days 3, 7, 10, and 11 post-dosing for subsequent LDL-C and huPCSK9 testing. OGTT experiments were conducted on days 4 and 10 post-dosing to assess the glucose control ability of each antibody peptide conjugate. Non-fasting blood glucose levels were monitored using a glucometer on day 10 post-dosing.

[0278] The changes in body weight and blood glucose are shown in FIG. 8A and FIG. 8B, respectively. AUC during OGTT is shown in FIG. 8C. Change of LDL-c over test period is shown in FIG. 8D. As shown in these figures, the exemplary APC 10087-p005 significantly reduced the body weight of huPCSK9 mice. There was no significant change in weight in the Model group, positive control Tafolecimab group, or positive control MEDI-4166 group compared to before dosing. In contrast, the exemplary APC 10087-p005 achieved a 19%weight reduction by day 3 post-dosing. OGTT conducted on day 2 post-dosing showed that all candidate drugs still had glucose control ability two days after dosing, with 10087-p005 being stronger than 10087-Sema. Blood drawn on days 3, 7, 10, and 11 post-dosing was used for subsequent LDL-C and huPCSK9 testing, with 10087-p005 showing stronger LDL-C reduction capabilities than MEDI-4166 and 10087-Sema. On day 10 post-dosing, there was no significant difference in non-fasting blood glucose levels between the dosing groups and the Model group. Example 10-2: Pharmacological Study in huPCSK9 Transgenic Mice

[0279] This study utilized an obesity model of huPCSK9 transgenic mice fed a high-fat diet to evaluate the weight reduction and glucose tolerance effects of the example samples.

[0280] Male huPCSK9 mice (8-9 weeks old) were purchased from Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd., with an SPF grade. After acclimatization and quarantine for 3 days upon arrival, the mice were fed a high-fat diet for 14 days before the study commenced. The high-fat diet (Dyets, D12079B) was used to feed the huPCSK9 mice.

[0281] Dosing: The mice were grouped based on their LDL-C levels (6 per group) for dosing. The control group had an initial weight of ～29 g. A single dose was administered. OGTT experiments were conducted on days 3 and 7 post-dosing. The dosing for Tafolecimab was 10 mpk, and for APC (antibody peptide conjugate) , it was 10.8 mpk. The dosing groups were as follows: ·Model: NA ·Tafolecimab: Positive control Tafolecimab ·10087-N297A-p005: Exemplary APC 10087-N297A-p005

[0282] Blood was drawn a day before dosing to check LDL-C levels. The next day, based on the LDL-C values and mouse weights, the mice were divided into 6 groups of 6 each and given subcutaneous injections. An electronic balance was used to measure weight on days D0, D2, D6, and D8. Blood was drawn on days 2, 6, and 8 post-dosing for subsequent LDL-C and huPCSK9 testing. OGTT experiments were conducted on days 3 and 7 post-dosing to assess the glucose control ability of each antibody peptide conjugate. Non-fasting blood glucose levels were monitored using a glucometer on days 3 and 7 post-dosing.

[0283] The results are shown in FIG. 9A to FIG. 9J. As shown in FIG. 9A to FIG. 9J, the exemplary APC significantly reduced the body weight of huPCSK9 mice. There was no significant change in weight in the Model group and positive control Tafolecimab group compared to before dosing. In contrast, 10087-N297A-p005 showed a certain weight reduction function by day 7 post-dosing. OGTT conducted on days 3 and 7 post-dosing showed that 10087-N297A-p005 still had significant glucose control ability on days 3 and 7 post-dosing. Blood drawn on days 2, 6, and 8 post-dosing was used for subsequent LDL-C testing, showing that both Tafolecimab and 10087-N297A-p005 had LDL-C lowering effects, with 10087-N297A-p005 being stronger than Tafolecimab. On days 2 and 6 post-dosing, the non-fasting blood glucose levels in the 10087-N297A-p005 group showed significant differences compared to the Model group. Example 10-3: Pharmacological Study in huPCSK9 Transgenic Mice

[0284] This study utilized an obesity model of huPCSK9 mice fed a high-fat diet to evaluate the weight reduction and fat reduction effects of the exemplary samples.

[0285] Male huPCSK9 mice (15-25g) were purchased from Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd., with an SPF grade. After acclimatization and quarantine for 3 days upon arrival, the mice were fed a high-fat diet for 14 days before the study started. The high-fat diet (Dyets, D12079B) was used to feed the huPCSK9 mice.

[0286] The mice were grouped based on their LDL-C levels (6 per group) for dosing. The control group had an initial weight of ～28 g. Tafolecimab and 10087-N297A-p005 were administered every 6 days for 3 times; and Retatrutide was administered every 3 days for 6 times. The dosing for Tafolecimab was 10 mpk, the dosing for Retatrutide was 0.6mpk, and the dosing for 10087-N297A-p005 was 10.8 mpk. The dosing groups were as follows: ·Model: NA ·Tafolecimab + Retatrutide: Positive control Tafolecimab and positive control Retatrutide ·10087-N297A-p005: Exemplary APC 10087-N297A-p005

[0287] Body fat, blood pressure, and heart rate were measured 2 days before dosing. Blood was drawn a day before dosing to check LDL-C levels. The next day, based on the LDL-C values and mouse weights, the mice were divided into 3 groups of 6 each and subcutaneous injections were conducted for dosing. An electronic balance was used to measure weight on days D-2, D0, D3, D4, D6, D7, D9, D12, D14, D15 and D19. Blood was drawn on days 2, 6, and 8 post-dosing for subsequent LDL-C and huPCSK9 testing. Body fat was measured on 2 days before dosing and days 7 and 14 post-dosing.

[0288] The results are shown in FIG. 9K to FIG. 9N. As shown in FIG. 9K, the exemplary APC significantly reduced the body weight of huPCSK9 mice; as shown in FIG. 9L to FIG. 9N, in the huPCSK9 KI mouse model, the 10087-N297A-p005 group reduced fat by about 45wt%on day 14 after dosing, and increased muscle mass by about 4wt%compared to before dosing, while the control drug Tafolecimab+Retatrutide reduced muscle mass by about 15wt%; the 10087-N297A-p005 group reduced lean mass by about 1%compared to before dosing, while the control drug Tafolecimab+Retatrutide reduced lean mass by about 26%. Compared to the control drug, 10087-N297A-p005 demonstrated the characteristic of reducing fat mass while maintaining lean mass during the weight reduction process. Example 11-1: Pharmacological Study in AAV-PCSK9 Induced ob / ob Mice

[0289] This study utilized an obesity model of ob / ob mice fed a high-fat diet to evaluate the weight reduction and glucose tolerance effects of the example antibodies.

[0290] Male ob / ob mice (8 weeks old) were purchased from Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd., with an SPF grade. After acclimatization and quarantine for 3 days upon arrival, the mice were fed a high-fat diet (Dyets, D12492) and the study started. Mice were grouped based on their LDL-C levels (6 per group) for dosing. The control group had an initial weight of ～53 g. A single dose was administered. OGTT experiments were conducted on days 4, 8, and 11 post-dosing. The dosing for Tafolecimab was 10 mpk, and for APC, it was 10.8 mpk. The dosing groups were as follows: ·OB / OB Control: NA ·Model: NA ·Tafolecimab: Positive control Tafolecimab ·10087-Sema APC: Exemplary APC 10087-Sema ·10087-p005: Exemplary APC 10087-p005 ·MEDI4166: Positive control MEDI4166

[0291] Except for 3 ob / ob mice as the Control group, the remaining ob / ob mice were injected intravenously with 4E10 μg / mice of AAV8-pcsk9 7 days before dosing. Blood was drawn a day before dosing to check LDL-C levels. The next day, based on the LDL-C values and mouse weights, the mice were divided into 8 groups of 6 each and given subcutaneous injections. An electronic balance was used to measure weight on days D0, D3, D7, D10, D11. Blood was drawn on days 3, 7, 10, 11, 16 post-dosing for subsequent LDL-C and huPCSK9 testing. OGTT experiments were conducted on days 4 and 10 post-dosing to assess the glucose control ability of each sample. Non-fasting blood glucose levels were monitored using a glucometer on day 16 post-dosing.

[0292] The weight change curve and results of OGTT test are shown in FIG. 10A to FIG. 10F. The exemplary antibody peptide conjugate 10087-p005 significantly reduced the weight of ob / ob mice. There was no significant change in weight in the h-IgG group, Tafolecimab group, example multi-antibody peptide conjugate 10087-Sema group, and MEDI4166 group compared to before dosing. In contrast, 10087-p005 achieved a weight reduction of 18%by day 7 post-dosing. OGTT conducted on days 4, 8, and 11 post-dosing showed that, except for the Tafolecimab group, all candidate drugs still had significant glucose control ability on day 4 post-dosing, with 10087-p005 being significantly stronger than other molecules. On days 8 and 11 post-dosing, except for the 10087-p005 group, no dosing groups showed significant glucose control ability. Blood drawn on days 3, 7, 10, 14, and 16 post-dosing was used for subsequent LDL-C and huPCSK9 testing, showing that, except for the Tafolecimab group, all candidate drugs had significant LDL-C lowering capabilities, with 10087-p005 being significantly stronger than other molecules. Example 11-2: Pharmacological Study in AAV-PCSK9 Induced ob / ob Mice

[0293] This study utilized an obesity model of ob / ob mice fed a high-fat diet to evaluate the weight reduction and glucose tolerance effects of the example samples.

[0294] Male ob / ob mice (8 weeks old) were purchased from Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd., with an SPF grade. After acclimatization and quarantine for 3 days upon arrival, the mice were fed a high-fat diet (Dyets, D12492) and the study started. Mice were grouped based on their LDL-C levels (6 per group) for dosing. The control group had an initial weight of ～50 g. A single dose was administered. OGTT experiments were conducted on days 4, 8, and 11 post-dosing. The dosing for tafolecimab was 10 mpk, and for APC, it was 10.8 mpk. The dosing groups were as follows: ·ob / ob Control: NA ·Model: NA ·tafolecimab: Positive control tafolecimab ·10087-N297A-p005: Exemplary APC 10087-N297A-p005

[0295] Except for 4 ob / ob mice as the Control group, the remaining ob / ob mice were injected intravenously with 4E10 μg / mice of AAV8-pcsk9 7 days before dosing. Blood was drawn a day before dosing to check LDL-C levels. On the next day, based on the LDL-C values and mouse weights, the mice were divided into 8 groups of 6 each and given subcutaneous injections. An electronic balance was used to measure weight on days D0, D3, D7, D10, D14. Blood was drawn on days 3, 7, 10, 14 post-dosing for subsequent LDL-C and huPCSK9 testing. OGTT experiments were conducted on days 4, 8, 11 post-dosing to assess the glucose control ability of each antibody peptide conjugate. Non-fasting blood glucose levels were monitored using a glucometer on days 7, 10, 14 post-dosing.

[0296] The weight change curve is shown in FIG. 11A. The exemplary antibody peptide conjugate significantly reduced the weight of ob / ob mice. There was no significant change in weight in the h-IgG group and tafolecimab group compared to before dosing. In contrast, 10087-N297A-p005 achieved weight reduction by day 7 post-dosing. The OGTT test results are shown in FIG. 11B to FIG. 11E. As shown in the results, OGTT conducted on days 4 and 8 post-dosing showed that 10087-N297A-p005 still had significant glucose control ability on days 4 and 8 post-dosing; on day 7 post-dosing, compared to the Model group, the 10087-N297A-p005 group significantly reduced non-fasting blood glucose. The LDL-c level test results are shown in FIG. 11F and FIG. 11G. Blood drawn on days 4, 9, 11, 15 post-dosing was used for subsequent LDL-C testing, showing that 10087-N297A-p005 had a stronger LDL-C lowering effect than tafolecimab. Example 12: Pharmacological Study in GLP-1R KO Mice

[0297] This study utilized an obesity model of GLP-1R KO mice to evaluate the glucose tolerance effects of the example antibodies.

[0298] Male GLP-1R mice (46-48 days old) were purchased from Shanghai Southern Biotechnology Co., Ltd., with an SPF grade. After acclimatization and quarantine for 3 days upon arrival, the study started. Mice were randomly grouped (6 per group) for dosing. The control group had an initial weight of ～24g. A single dose was administered. One day post-dosing, an OGTT experiment was conducted. The dosing for Tafolecimab was 10 mpk, and for APC, it was 10.8 mpk. The dosing groups were as follows: ·Model GLP-1R KO: NA ·10087-N297A-p005: Exemplary APC 10087-N297A-p005 ·MEDI4166: Positive control MEDI4166

[0299] Random grouping was used, and body weight was measured using an electronic scale, followed by subcutaneous injection for dosing. One day post-dosing, an OGTT experiment was conducted to assess the glucose control ability of each antibody peptide conjugate.

[0300] OGTT was conducted one day post-dosing. As shown in FIG. 12A and FIG. 12B, 10087-N297A-p005 demonstrated significant glucose control ability and had the best effect in reducing insulin resistance. Example 13: Pharmacological Study in Rats

[0301] This study utilized an SD rat model to evaluate the weight reduction and glucose tolerance effects of the APCs provided herein.

[0302] Male SD rats (330-360g) and female SD rats (270-300g) were purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., with an SPF grade. After acclimatization and quarantine for 3 days upon arrival, the study started. Dosing was based on the LDL-C levels and body weight of the SD rats (6 per group, 3 males and 3 females) . The control group had an initial weight of 303 g. A single dose was administered. OGTT experiments were conducted on days 2 and 6 post-dosing. The dosing for Tafolecimab was 10 mpk, and for APC, it was 10.8 mpk. The dosing groups were as follows: ·Model: NA ·Tafolecimab: Positive control Tafolecimab ·Retatrutide: Positive control Retatrutide ·10087-N297A-p005: Exemplary APC 10087-N297A-p005

[0303] Blood was drawn a day before dosing to check LDL-C levels. The next day, based on the LDL-C values and rat weights, the rats were divided into 6 groups of 6 each (3 males and 3 females) and given subcutaneous injections. An electronic balance was used to measure weight on days D1, D5, D8, D10, D14. Blood was drawn on days 4, 5, 8, 10, 14 post-dosing for subsequent LDL-C and huPCSK9 testing. OGTT experiments were conducted on days 2 and 6 post-dosing to assess the glucose control ability of each antibody peptide conjugate.

[0304] The weight change curve is shown in FIG. 13A. The exemplary antibody peptide conjugate 10087-N297A-p005 demonstrated weight reduction function. The results of the OGTT experiments are shown in FIG. 13B to FIG. 13E. As shown in these results, OGTT conducted on days 4 and 8 post-dosing showed that, except for tafolecimab, all candidate drugs still had significant glucose control ability from days 3 to 10 post-dosing in SD rats, with 10087-N297A-p005 showing a stronger trend than other groups. The LDL-c level test results are shown in FIG. 13F. Blood drawn on days 4, 5, 8, 10, 14 post-dosing was used for LDL-C testing, showing that 10087-N297A-p005 had LDL-C lowering capabilities. Example 14: Pharmacological Study in Cynomolgus Monkeys

[0305] This study utilized cynomolgus monkey to observe the changes in blood biochemical indicators after subcutaneous injection of different doses of the exemplary APC10087-N297A-p005.

[0306] The cynomolgus monkeys (8 males and 4 females, conventional animal, 3-5 years old, 2.65-3.50 kg) were purchased from Suzhou Xishanzhongke Laboratory Animal Co., Ltd. (SCXK (SU) 2023-0001) . The monkeys were randomly divided into 4 groups based on the body weight thereof using Provantis 10.5.0.4 system, with 2 males per group and 1 female per group (3 each group) . The specific grouping and dosing information were shown in Table 10.

[0307] Table 10

[0308] Body weight and food intake were observed throughout the study. Blood samples for biochemical analysis were collected at the following time points: before administration, and on days 4, 18, and 32 after formal administration. Additionally, blood samples for insulin testing were collected before administration, and on days 8, 15, 22, and 29 after formal administration.

[0309] As shown in FIG. 15A to FIG. 15H, all dose groups of 10087-N297A-p005 significantly reduced LDL-c and total cholesterol level by up to 76%and 44%, respectively. In addition, 10087-N297A-p005 significantly reduced cardiovascular risk indicators, including uric acid (UA) , creatine kinase (CK) , and circulating immune complex (CIC) , with a reduction rate up to 93%for UA, up to 86%for CK, and up to 71%for CIC. No significant dose-dependent effects were observed among these groups. Furthermore, treatment with 10087-N297A-p005 led to a significantly reduction in animal appetite, which recovered to normal levels within a short period of time. In addition, 10087-N297A-p005 also reduced animal body weight, with a decrease of 7.9%to 10.9%for the three groups compared to pre-dosing baselines. Finally, serum insulin levels were significantly decreased in all groups with administration of 10087-N297A-p005, indicating that the drug enhanced insulin sensitivity in the animals. SEQUENCES

Claims

1.A conjugate of Formula (O) : or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein:Ab is an anti-PCSK9 antibody or an antigen-binding fragment thereof;Lk is a linking moiety or a bond;Pp is a GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist;n is an integer ranging from 1 to 20; andwherein Pp is connected to Lk via a covalent bond, and each of Pp-Lk is independently connected to Ab via a covalent bond.2.The conjugate of claim 1, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist Pp is a peptide.3.The conjugate of claim 1 or 2, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the peptide is selected from the group consisting of retatrutide, HM15211, HM15275, MWN101, and UBT251, or the peptide comprises Formula (I) , or a pharmaceutically acceptable salt thereof,Y-X2-Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-I-X13-L-D-K-X17-A-X19-X20-A-F-I-E-Y-L-L-X28-X29-X30-X31 (SEQ ID NO: 65)(I)wherein:X2 is Aib;X13 is L, or αMeL,X17 is K, C, E, or D,X19 is Q or A,X20 is Aib, αMeK, Q or H,X28 is E or A,X29 is G or Aib,X30 is G or Aib, andX31 is G or absent,wherein the C-terminal amino acid of the peptide is connected to Lk via a covalent bond.4.The conjugate of claim 3, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the peptide is of Formula (I) .5.The conjugate of claim 3 or 4, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein X13 is αMeL.6.The conjugate of any one of claims 3-5, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein X17 is K.7.The conjugate of any one of claims 3-6, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein X19 is Q.8.The conjugate of any one of claims 3-7, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein X20 is Aib.9.The conjugate of any one of claims 3-8, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein X28 is E.10.The conjugate of any one of claims 3-9, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein X29 is G.11.The conjugate of any one of claims 3-10, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein X30 is G.12.The conjugate of any one of claims 3-11, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein X31 is G.13.The conjugate of any one of claims 3-12, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the peptide is:Y- (Aib) -Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-I- (αMeL) -L-D-K-K-A-Q- (Aib) -A-F-I-E-Y-L-L-E-G-G (SEQ ID NO: 66) orY- (Aib) -Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-I- (αMeL) -L-D-K-K-A-Q- (Aib) -A-F-I-E-Y-L-L-E-G-G-G (SEQ ID NO: 67) .14.The conjugate of any one of claims 1-13, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the linking moiety Lk comprises a peptide.15.The conjugate of any one of claims 1-14, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the linking moiety Lk comprises formula L1-L2-L3-L4-, wherein each of L1, L2, L3, and L4 is independent a bond, peptide V-A, peptide V-C, peptide V-K-G, peptide G-G-F-G (SEQ ID NO: 68) , or peptide G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , provided that at least one of L1, L2, L3, and L4 is peptide G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , andwherein Pp is connected to Lk via a peptide bond between the C-terminal amino acid of Pp and the N-terminal amino acid of Lk.16.The conjugate of any one of claims 1-15, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the linking moiety Lk has a Formula of L1-L2-L3-L4-XL, wherein each of L1, L2, L3, and L4 is independently a bond, peptide V-A, peptide V-C, peptide V-K-G, peptide G-G-F-G (SEQ ID NO: 68) , or peptide G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , provided that at least one of L1, L2, L3, and L4 is peptide G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , Pp is connected to Lk via a peptide bond between the C-terminal amino acid of Pp and the N-terminal amino acid of Lk; andXL is a bond, K, wherein *indicates the point of connection to L4 and **indicates the point of connection to Ab.17.The conjugate of claim 16, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein L1 is peptide G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , L2 is peptide G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , L3 is a bond, and L4 is a bond.18.The conjugate of claim 16, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein L1 is peptide G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , L2 is peptide G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , L3 is peptide G-G-G-G-S (SEQ ID NO: 69) , and L4 is a bond.19.The conjugate of any one of claims 16-18, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein XL is a bond.20.The conjugate of any one of claims 16-18, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein XL is K.21.The conjugate of any one of claims 16-18, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein XL is 22.The conjugate of any one of claims 16-18, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein XL is 23.The conjugate of any one of claims 16-18 and 20-22, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the linking moiety is selected from the group consisting of:#-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-** (SEQ ID NO: 70) ;#-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-** (SEQ ID NO: 71) ;wherein #indicates the point of connection to Pp and **indicates the point of connection to Ab.24.The conjugate of any one of claims 1-23, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein each Pp-Lk is independently selected from the group consisting of: wherein **indicates the point of connection to Ab.25.The conjugate of any one of claims 1-24, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the linking moiety Lk is a bond.26.The conjugate of any one of claims 1-25, wherein Pp is a compound with a molecule weight less than 5 kD.27.The conjugate of claim 26, wherein Pp is a compound with a molecule weight less than 1 kD.28.The conjugate of any one of claims 1-27, wherein Ab comprises a cysteine or non-canonical amino acid substitution at one or more conjugation site (s) .29.The conjugate of any one of claims 1-28, wherein the Pp-Lk is conjugated to Ab through the side chain of the cysteine residue or non-canonical amino acid residue substituted at the one or more conjugation site (s) .30.The conjugate of any one of claims 1-29, wherein Ab comprises a heavy chain variable (VH) region and a light chain variable (VL) region, wherein:1) the VH region comprises a heavy chain complementarity determining region 1 (CDR-H1) , a heavy chain complementarity determining region 2 (CDR-H2) , and a heavy chain complementarity determining region 3 (CDR-H3) contained within SEQ ID NOs: 25, and the VL region comprises a light chain complementarity determining region 1 (CDR-L1) , a light chain complementarity determining region 2 (CDR-L2) and a light chain complementarity determining region 3 (CDR-L3) contained within SEQ ID NOs: 26;2) the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 contained within SEQ ID NOs: 27, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2 and a CDR-L3 contained within SEQ ID NOs: 28;3) the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 contained within SEQ ID NOs: 29, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2 and a CDR-L3 contained within SEQ ID NOs: 30; or4) the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 contained within SEQ ID NOs: 31, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2 and a CDR-L3 contained within SEQ ID NOs: 32.31.The conjugate of any one of claims 1-30, wherein:1) the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 1, 2, and 3, respectively, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2, and a CDR-L3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 4, 5, and 6, respectively;2) the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 7, 8, and 9, respectively, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2, and a CDR-L3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 10, 11, and 12, respectively;3) the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 13, 14, and 15, respectively, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2, and a CDR-L3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 16, 17, and 18, respectively; or4) the VH region comprises a CDR-H1, a CDR-H2, and a CDR-H3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 19, 20, and 21, respectively, and the VL region comprises a CDR-L1, a CDR-L2, and a CDR-L3 comprising the sequence set forth in SEQ ID NOS: 22, 23, and 24, respectively.32.The conjugate of claim 30 or 31, wherein:1) the VH region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 25, and the VL region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 26;2) the VH region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 27, and the VL region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 28;3) the VH region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 29, and the VL region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 30; or4) the VH region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 31, and the VL region is or comprises an amino acid sequence having at least at or about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to SEQ ID NO: 32.33.The conjugate of any one of claims 30-32, wherein the VH region and the VL region are or comprise: the sequence set forth in SEQ ID NO: 25 and 26, respectively; the sequence set forth in SEQ ID NO: 27 and 28, respectively; the sequence set forth in SEQ ID NO: 29 and 30, respectively; or the sequence set forth in SEQ ID NO: 31 and 32, respectively.34.The conjugate of any one of claims 1-33, wherein Ab comprises an Fc from an IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, or IgM.35.The conjugate of any one of claims 1-34, wherein Ab comprises a heavy chain constant region from an IgG1 or a variant thereof.36.The conjugate of claim 35, wherein the heavy chain constant region from an IgG1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 33 or a variant thereof.37.The conjugate of claim 35, wherein Ab comprises a cysteine or non-canonical amino acid substitution at one or more conjugation site (s) .38.The conjugate of claim 37, wherein Ab comprises a cysteine at position 272 based on EU numbering relative to reference sequence SEQ ID NO: 33 or a variant thereof.39.The conjugate of claim 38, wherein Ab comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 34.40.The conjugate of any one of claims 35-39, wherein Ab comprises L234A / L235A (LALA) , M252Y, S254T, and / or T256E mutation.41.The conjugate of any one of claims 35-40, wherein Ab comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 35.42.The conjugate of any one of claims 35-41, wherein Ab comprises an alanine at position 297 relative to reference sequence SEQ ID NO: 33 based on EU numbering, and / or post modifications.43.The conjugate of claim 42, wherein Ab comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 36.44.The conjugate of any one of claims 1-34, wherein Ab comprises a heavy chain constant region from an IgG2 or a variant thereof.45.The conjugate of claim 44, wherein the heavy chain constant region from an IgG2 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 37.46.The conjugate of any one of claims 1-45, wherein Ab comprises a light chain constant region from human κ or λ chain.47.The conjugate of claim 46, wherein the light chain constant region comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 91 or 92.48.The conjugate of any one of claims 1-47, wherein Ab is an azido-tagged antibody with the following structure: 49.The conjugate of any one of claims 1-29, wherein Ab is Evolocumab, or Alirocumab.50.The conjugate of any one of claims 1-47, wherein(1) Pp-Lk isand(2) Ab comprises a heavy chain constant (CH) region, wherein the CH region are or comprise the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-36.51.The conjugate of any one of claims 1-48, wherein(1) Pp-Lk isand(2) Ab comprises a heavy chain constant (CH) region, wherein the CH region are or comprise the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 33-35.52.The conjugate of any one of claims 1-48, wherein(1) Pp-Lk isand(2) Ab comprises a heavy chain constant (CH) region, wherein the CH region are or comprise the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 33-35.53.The conjugate of any one of claims 1-52, wherein n is an integer ranging from 1 to 12.54.The conjugate of any one of claims 1-53, wherein n is an integer ranging from 1 to 8.55.The conjugate of any one of claims 1-54, wherein the conjugate is selected from a conjugate represented by formula (I) , (II) , or (III) : 56.The conjugate of claim 55, wherein the conjugate is selected from a conjugate represented by formula (I-1) , (I-2) , (II-1) , (II-2) , (III-1) or (III-2) : 57.The conjugate of claim 56, wherein the conjugate is selected from: 58.The conjugate of any one of claims 55-57, wherein, in the conjugate represented by formula (I) , (I-1) or (I-2) , the Ab further comprises a heavy chain constant region comprising the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 34 to 36; in the conjugate represented by formula (II) , (II-1) , (II-2) , (III) , (III-1) , or (III-2) , the Ab further comprises a heavy chain constant region comprising the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 33 to 35 and 37; and / orthe Ab further comprises a light chain constant region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 91 or 92.59.The conjugate of claim 58, wherein, in the conjugate represented by formula (I) , (I-1) or (I-2) , the Ab comprises: the VH region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 25, the heavy chain constant region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 36 or 35, the VL region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 26, and the light chain constant region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 91;in the conjugate represented by formula (III) , (III-1) , or (III-2) , the Ab comprises: the VH region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 25, a heavy chain constant region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 33, the VL region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 26, and the light chain constant region comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 91.60.The conjugate of any one of claims 57-59, wherein, in the conjugate represented by formula (I-1) , the Ab comprises a heavy chain comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 39 and a light chain comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 40;in the conjugate represented by formula (III-1) , the Ab comprises a heavy chain comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 63 and a light chain comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 42.61.The conjugate of any one of claims 1-60, wherein the conjugate has an average DAR value, which is an integer or decimal, from 1 to 20, 1 to 18, 1 to 16, 1 to 14, 1 to 12, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 1 to 3, 1.5 to 2.5, 2 to 8, 3 to 8, 4 to 8, 5 to 8, 6 to 8, 7 to 8, 2 to 3, 2 to 4, 2 to 5, 2 to 6, or 2 to 7.62.The conjugate of any one of claim 61, wherein the conjugate has an average DAR value of 2.63.A pharmaceutical composition, comprising a conjugate of any one of claims 1-62, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, anda pharmaceutical excipient.64.A method of treating a disease mediated by glucagon receptor, GLP-1 receptor, or GIP receptor, or any combination thereof, in a subject in need thereof, comprising administering a conjugate of any one of claims 1-62, or the pharmaceutical composition of claim 63, to the subject.65.The method of claim 64, wherein the disease is selected from the group consisting of diabetes mellitus, type 2 diabetes, obesity, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) , non-alcoholic steatohepatitis (NASH) , dyslipidemia, cardiovascular disease, and metabolic syndrome.66.A method for preparing a conjugate having a structure of Formula (O) : or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein:Ab is an anti-PCSK9 antibody or antigen-binding fragment thereof;Lk is a linking moiety or a bond;Pp is a peptide that is a GLP-1 / GIP / Glucagon receptor triagonist, wherein the peptide comprises an activated chemical moiety;the method comprisinga) contacting the antibody or antigen-binding fragment with a cysteine blocking agent, wherein the cysteine blocking agent forms a stable mixed disulfide with at least one cysteine residue of the antibody or antigen-binding fragment;b) contacting the antibody or antigen-binding fragment with a reducing agent to form a reduced antibody or antigen-binding fragment; andc) contacting the reduced antibody or antigen-binding fragment with a precursor peptide-linker compound Pp-Lk1 comprising an activated chemical moiety to form the conjugate; wherein the method does not use an oxidizing agent.67.The method of claim 66, wherein the mixed disulfide is an antibody or antigen-binding fragment with a capped free cysteine.68.The method of claim 67, wherein the antibody or antigen-binding fragment with a capped free cysteine comprises a cap selected from the group consisting of cysteine, cysteamine, cystamine, and glutathione.69.The method of claim 66, further comprising removing excess cysteine blocking agent.70.The method of claim 69, wherein the excess cysteine blocking agent is removed by ultrafiltration or cation exchange chromatography.71.The method of any one of claims 66-70, wherein the reducing agent is selected from the group consisting of triphenylphosphine-3, 3', 3"-trisulfonate ( “TPPTS” ) , tris (2-carboxyethyl) phosphine ( “TCEP” ) , and triphenylphosphine-3, 3'-disulfonate ( “TPPDS” ) .72.The method of claim 71, wherein the molar ratio of reducing agent to antibody or antigen-binding fragment is 2 to 4: 1.73.The method of any one of claims 66-72, comprising removing excess reducing agent.74.The method of claim 73, wherein the excess reducing agent is removed by buffer exchange.75.The method of claim 74, wherein the buffer exchange step is ultrafiltration / diafiltration.76.The method of any one of claims 66-75, wherein the activated chemical moiety comprises a halogen, wherein the halogen is selected from the group consisting of Br, I, and Cl.77.The method of claim 76, wherein the molar ratio of the peptide having an activated chemical moiety to the antibody or antigen-binding fragment is 2 to 6: 1.78.The method of any one of claims 66-77, further comprising purification step d) removing the excess precursor peptide-linker compound Pp-Lk1.79.The method according to claim 78, wherein the purification step comprises size exclusion chromatographic, hydrophobic interaction chromatography ( “HIC” ) , or ultrafiltration / diafiltration, or any combination thereof.80.A method of preparing the conjugate of claim 51 or 52, wherein the method comprises contacting the antibody with an azide-modified disasccharide oxazoline in the presence of a single enzyme.81.The method of claim 80, wherein the antibody comprises a modified disaccharide core, and wherein the modified disaccharide core is composed of a mannose-β1, 4-N-acetylglucosamine conjugated to the asparagine (Asn) -linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) on the antibody.82.The method of claim 80, wherein the antibody comprises a modified disaccharide core, and wherein the modified disaccharide core is composed of a glucose-β1, 4-N-acetylglucosamine conjugated to the asparagine (Asn) -linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) on the antibody.83.The method according to claim 80, wherein the antibody comprises a modified disaccharide core, and wherein the modified disaccharide core is composed of a galactose-β1, 4-N-acetylglucosamine conjugated to the asparagine (Asn) -linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) on the antibody.84.The method of any one of claims 80-83, wherein the enzyme is selected from the group consisting of wild-type Endo S, wild-type Endo S2, wild-type Endo F3 and mutants thereof.85.The method according to claim 84, wherein said enzyme is wild-type Endo S2 and mutants thereof.86.The method of claim 80, wherein the azide-modified disasccharide oxazoline is azid-GlcGlcNAc-oxazoline.87.The method claim 86, wherein the method comprises contacting the antibody with azid-GlcGlcNAc-oxazoline in the presence of Endo S2 or mutants thereof to generate an azido-tagged antibody with the following structure: 88.The method of claim 87, further comprising reacting the azido-tagged antibodywith a peptide-linker having a DBCO moiety to generate the conjugate of claim 51:or the conjugate of claim 52:wherein Pp is peptide Y- (Aib) -Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-I- (αMeL) -L-D-K-K-A-Q- (Aib) -A-F-I-E-Y-L-L-E-G-G-G (SEQ ID NO: 67) .

Images