Buffalo whole genome 20k liquid-phase SNP chip as well as design method and application thereof

Abstract

The invention belongs to the technical field of animal molecular biology and animal genetic breeding, and particularly relates to a buffalo whole genome 20k liquid-phase SNP chip and a design method and application thereof, and the chip comprises 24893 SNP molecular markers; according to the method, four selection signal analysis (FST, Piratio, XP-CLR and XP-EHH) are jointly applied to screen 11 buffalo group comparison combinations, it is ensured that the sites have high information content and group universality, through multiple rounds of quality control and function annotation, finally 24893 SNP sites are carefully selected, the whole genome is covered in a balanced mode, and the redundancy is remarkably reduced; based on 115 sample data of 11 main Chinese buffalo varieties (including marsh type and river type), the chip is ensured to be suitable for multi-variety buffalo groups, and the application advantages of variety identification, genetic analysis, genetic diversity monitoring and the like are highlighted.

Description

Technical Field

[0001] This invention belongs to the fields of animal molecular biology technology and animal genetics and breeding technology, and specifically relates to a 20k liquid phase SNP chip of the whole genome of buffalo, its design method and application. Background Technology

[0002] Asian buffalo are mainly divided into two types: swamp buffalo and river buffalo. China is a country with very rich buffalo resources, with 27 local buffalo breeds. Except for the Binlangjiang buffalo, which is a river buffalo, the rest are swamp buffalo. Nine local breeds are distributed in Yunnan, Sichuan, Guizhou, and Chongqing in the southwest region: Binlangjiang buffalo, Dehong buffalo, Southeast Yunnan buffalo, Yanjin buffalo, Yibin buffalo, Dechang buffalo, Guizhou buffalo, Guizhou white buffalo, and Fuling buffalo. With the development of agricultural mechanization, the number of buffalo used for labor has declined sharply, and buffalo genetic resources are facing a crisis of loss. To better protect the diversity of buffalo genetic resources and improve breeds, it is urgent to make full use of the advantages of molecular biology technologies such as gene chips to conduct precise breed identification and selection.

[0003] Currently, my country has limited development of chips specifically for buffalo. In 2017, through the introduction and evaluation of the Italian SNP90K buffalo chip technology, and after digestion, absorption, and reinnovation, a high-density, universal dairy buffalo SNP200K chip was successfully developed. A set of genomic selection breeding techniques for dairy buffalo was constructed, and preliminary selection of high-yielding dairy buffalo core herds was conducted in breeding demonstration areas. This is of great significance for addressing the current problems of insufficient breeding stock and low milk production in my country's industry, accelerating the development of the buffalo industry, and increasing farmers' income. However, this chip has not yet achieved commercial application and development, and its applicability to swamp buffalo is limited, failing to meet various breeding requirements.

[0004] The invention patent with publication number CN116386717A discloses a 50K SNP chip for the whole genome of buffalo, its design method, and its application. It is a high-density genotyping chip based on the principle of liquid-phase hybridization, containing 50,000 SNP molecular markers evenly distributed on the buffalo chromosome. Its design method integrates a multi-source functional site screening strategy: the sites are divided into three categories: (1) SNPs directly associated with economic traits reported in literature or patents; (2) sites located in important gene regions (such as exons and promoters); and (3) sites obtained through selection signal analysis (F...). STThe loci selected by Pi and Tajima's D are those enhanced by natural selection and must be supported by at least two signals. Trait coverage encompasses key areas such as disease resistance (e.g., heat stress tolerance, mastitis resistance), growth traits (body weight, body size, lipid metabolism), reproductive performance (sperm quality, conception rate), and economic traits (milk yield, milk protein percentage, meat production performance). This method is costly: 50K chips have high R&D and usage costs; while covering 50,000 loci, many are weakly correlated with basic conservation work such as variety identification and kinship analysis, resulting in resource waste. High-density chips rely on the supporting computing resources and genetic evaluation systems of large breeding companies, making them less suitable for grassroots farms / farmers. In contrast, 20K liquid phase chips, due to their lower cost and lightweight data analysis, are more suitable for daily monitoring in local conservation farms or hybridization improvement projects.

[0005] The invention patent with publication number CN117568486A discloses a liquid phase chip for Xinglong buffalo and its applications. It is the first domestically developed liquid phase chip designed specifically for the genetic characteristics of Xinglong buffalo in tropical regions. Based on targeted sequencing genotyping (GBTS) technology, it integrates 1,208 SNP loci. Its design focuses on tropical environmental adaptability and germplasm resource protection: locus selection centers on disease resistance traits, extending to gene regions related to heat resistance and meat quality traits. It includes genetic markers unique to the Xinglong buffalo population, enabling precise breed differentiation and kinship analysis. Specifically designed for the protection and hybridization improvement of Xinglong buffalo germplasm resources, it is suitable for scenarios such as pedigree purification, dynamic monitoring of genetic diversity, and marker-assisted breeding. However, the chip contains only 1,208 SNP loci, and this low density significantly reduces its accuracy in applications. Locus selection is based on the unique genetic background of the Xinglong buffalo population, and its genotyping effect on other buffalo breeds (such as the Mora buffalo, Nili-Raffi buffalo, and Fuling buffalo) may be poor, limiting its application in cross-population genomic selection. Although both are liquid-phase chips, the extremely low density of the 5K chip makes it difficult to support the construction of detailed genetic maps or the analysis of selection signals.

[0006] Chinese invention patent with publication number CN119464509A discloses the combination and application of SNP molecular markers of the whole genome of Haizi buffalo. This method only obtains a chip composed of 48,887 SNP sites based on the resequencing data of the Haizi buffalo genome, and its applicability to other breeds is poor.

[0007] Therefore, in order to further accelerate the genetic progress of buffalo breed resource protection and genetic improvement in Southwest my country, improve the efficiency of genetic diversity protection and precision breeding, and help the sustainable development of the population, it is urgent to develop a buffalo whole genome SNP breeding chip that is effective for multiple buffalo breeds, covers the entire genome, and has good molecular breeding application. Summary of the Invention

[0008] The purpose of this invention is to further accelerate the genetic progress of buffalo breed resource protection and genetic improvement in southwestern my country, improve the efficiency of genetic diversity protection and precision breeding, and contribute to the sustainable development of the population by providing a 20k liquid phase SNP chip of the whole buffalo genome, its design method and application.

[0009] To achieve the above objectives, the technical solution adopted in this invention is: a 20k liquid-phase SNP chip of the whole buffalo genome. The chip contains 24,893 SNP molecular markers. The site information of the molecular markers is shown in Table 3. In the table, the left side of the site number indicates the chromosome where the site is located, the middle indicates the position of the site on the chromosome, and the right side indicates the polymorphic base of the site. The reference genome is: NDDB_SH_1 / GCF_019923935.1.

[0010] The molecular markers of this invention can be used in the preparation of 20k liquid-phase SNP chips of the whole buffalo genome.

[0011] The 20k liquid phase SNP chip of the whole buffalo genome of this invention can be used for buffalo breed identification, pedigree analysis, kinship identification, or genetic diversity analysis of buffalo populations, as well as the protection and breeding of buffalo breed genetic resources.

[0012] Furthermore, the buffalo breeds include: Fuling buffalo, Fuzhong buffalo, Southeast Yunnan buffalo, Dehong buffalo, Guizhou buffalo, Guizhou white buffalo, Yibin buffalo, Yanjin buffalo, Dechang buffalo, Nilirafi buffalo, Mora buffalo, and Binlangjiang buffalo.

[0013] The present invention provides a method for designing a 20k liquid-phase SNP chip of the whole buffalo genome, comprising the following steps:

[0014] S1: Collect raw sequencing data of buffalo samples, use FASTP software for quality control of raw data, use Sentieon software for mutation site detection, and use GATK software for preliminary filtering of mutation sites, obtaining 27,227,286 high-quality mutation sites.

[0015] S2: Four methods were used in combination to capture selection traces in the genome: interpopulation differentiation index (FST), nucleotide polymorphism ratio (Pi_ratio), cross-population complex likelihood ratio test (XP-CLR), and cross-population extended haplotype homozygosity (XP-EHH). The focus was on selecting loci that differentiate between riverine and swampy morphologies, and these loci were sorted from largest to smallest based on their FST values. Then, the top 5% of loci in each of the 32 comparison groups were selected as candidate loci. At this point, a total of 12,189,219 loci were initially selected. The linkage relationships between loci were calculated using plink software, and the loci with the highest weights in each linkage block were selected as representative loci. After linkage selection, a total of 30,400 high-weight loci were retained. Loci with high coefficients of variation were selected for each population to evaluate their grouping effect. Finally, 24,893 loci with good grouping effects were retained.

[0016] S3: Probe design and synthesis

[0017] For the selected sites, probe design was performed using the software OligoMiner (v 1.7). The probe design requirements included: (1) probe length 120bp; (2) GC content 30% to 70%; (3) probe sequence was back-aligned to the genome via bowtie2 and could only be aligned to a unique position; (4) all 25bp kmers contained in the probe could not be repeated more than 3 times in the whole genome. For sites that did not meet the above design principles, the linkage method was used to select other sites closely linked to them for supplementary design.

[0018] The beneficial technical effects of this invention are: this invention combines the application of four selection signal analysis methods (F... ST The microarray (XP-CLR, XP-EHH) was used to screen 11 buffalo populations for comparative combinations to ensure that the loci have both high information content and population universality. Through multiple rounds of quality control and functional annotation, 24,893 SNP loci were finally selected, which evenly cover the whole genome and significantly reduce redundancy. Based on 115 sample data from 11 major Chinese buffalo breeds (including swamp type and river type), the microarray is made suitable for multiple buffalo populations, highlighting its application advantages in breed identification, kinship analysis, and genetic diversity monitoring. Attached Figure Description

[0019] To more clearly illustrate the technical solutions in the embodiments of the present invention or the prior art, the drawings used in the description of the embodiments or the prior art will be briefly introduced below. Obviously, the drawings described below are only some embodiments of the present invention. For those skilled in the art, other drawings can be obtained based on these drawings without creative effort.

[0020] Figure 1 This is the distribution of buffalo 20K liquid phase gene chip loci on the genome in Embodiment 1 of the present invention.

[0021] Figure 2 This is a graph showing the principal component analysis results of Embodiment 2 of the present invention.

[0022] Figure 3 This is a graph showing the results of population ancestor component analysis in Embodiment 2 of the present invention.

[0023] Figure 4 This is the phylogenetic tree construction result of Embodiment 2 of the present invention. Detailed Implementation

[0024] The technical solutions of the embodiments of the present invention will be clearly and completely described below with reference to the accompanying drawings. Obviously, the described embodiments are only some embodiments of the present invention, and not all embodiments. Based on the embodiments of the present invention, all other embodiments obtained by those skilled in the art without creative effort are within the scope of protection of the present invention.

[0025] Example 1

[0026] A method for designing a 20k liquid-phase SNP microarray of the whole buffalo genome, including the following steps:

[0027] S1: Blood samples were collected from 28 purebred Fuling buffaloes and 1 Fuling buffalo-Mola buffalo crossbred buffalo at the Fuling Buffalo Breeding Farm, totaling 29 samples. After extracting qualified DNA, whole-genome resequencing was performed. Raw sequencing data from 115 buffalo samples (Table 1) were obtained. FastP software was used for quality control of the raw data, Sentieon software was used for variant site detection, and GATK software was used for preliminary filtering of variant sites, resulting in 27,227,286 high-quality variant sites.

[0028] Table 1. 115 sample varieties and quantities

[0029]

[0030] S2: Site selection was performed using selection signal analysis. Eleven different population contrastive combinations were constructed for selection signal analysis to identify sites in significant regions. Specifically:

[0031] S201 Intergroup Differentiation Index (F) ST )

[0032] Calculate the F-value between two populations using the VCFTOOLS software package. ST The values ​​are determined using a sliding window strategy to ensure the reliability of the test results in biological replicates.

[0033] Specific calculation steps: vcf tools--gzvcf--fst-window-size 50000.

[0034] S202 nucleotide polymorphism ratio (Pi)

[0035] Pi_Ratio = Pi {domesticated group} / Pi {control group}, using VCFTOOLS to calculate the Pi_Ratio value between the two groups based on their loci;

[0036] Specific steps: vcf tools—gzvcf--window-pi50000.

[0037] S203 Cross-population composite likelihood ratio test (XP-CLR)

[0038] Calculate the XP-CLR value between the two populations;

[0039] Specific steps: XPCLR -xpclr -w1 0.005 2500 50000 -p0 0.95.

[0040] S204 Cross-population extended haplotype homozygosity (XP-EHH)

[0041] Using the Selscan tool, XP-EHH values ​​between two populations were calculated based on chromosomes and loci. The results were then standardized. The standardized XP-EHH values ​​reflect the proportion of SNPs greater than 2 within a specific interval, specifically through the inter-population differentiation index (F...). ST Four methods were used in combination to screen and capture selection traces in the genome: nucleotide polymorphism ratio (Pi_ratio), cross-population complex likelihood ratio test (XP-CLR), and cross-population extended haplotype homozygosity (XP-EHH). The focus was on selecting loci that distinguish between riverine and swampy morphologies, and these loci were sorted from largest to smallest based on their Fst values. Then, the top 5% of loci in each of the 32 comparison groups were selected as candidate loci. At this initial stage, a total of 12,189,219 loci were initially selected. The linkage relationships between loci were calculated using plink software (v1.9.0, --show-tags all --tag-kb 100 --tag-r2 0.8), and the highest-weighted loci were selected from each linkage block as representative loci. After linkage selection, a total of 30,400 high-weighted loci were retained. Loci with high coefficients of variation were then selected for each population to evaluate their grouping effect. Finally, 24,893 loci with good grouping effect were retained. Loci information is shown in Table 3. The distribution and location of microarray marker sites on chromosomes are shown in the figure. Figure 1 .

[0042] Table 2. Number of genes in significant regions analyzed by four selection signals

[0043] Selective method Population name Includes non-protein-coding genes (top 1%) Genes containing non-protein-coding genes were removed, and the top 1% of genes ultimately used for gene annotation were selected. Includes non-protein coding genes (top 5%) Genes containing non-protein-coding genes were removed, and the top 5% of genes ultimately used for gene annotation were selected. FST DDN_vs_DH 994 746 4183 3026 FST DDN_vs_GZB+GZ+YB+FL+YJ 957 709 4015 2867 FST DH_vs_GZB+GZ+YB+FL+YJ 1049 758 4246 3003 FST DH_vs_GZB 906 643 4082 2903 FST DH_vs_YJ 1014 720 4355 3095 FST FL1_vs_FL2 864 642 3839 2841 FST FL_vs_DDN 937 695 4072 2953 FST FL_vs_DH 994 692 4156 2941 FST FL_vs_GZB+GZ+YB 912 684 3823 2790 FST FL_vs_GZB 837 626 3770 2745 FST GZ_vs_GZB 787 541 3653 2560 Pi DDN_vs_DH 1824 1375 8252 6056 Pi DDN_vs_GZB+GZ+YB+FL+YJ 1806 1334 8327 6115 Pi DH_vs_GZB+GZ+YB+FL+YJ 1829 1364 8103 5893 Pi DH_vs_GZB 1785 1336 7986 5801 Pi DH_vs_YJ 1804 1312 7993 5818 Pi FL1_vs_FL2 1716 1293 7768 5702 Pi FL_vs_DDN 1839 1390 8161 5977 Pi FL_vs_DH 1858 1368 7949 5811 Pi FL_vs_GZB+GZ+YB 1806 1347 7841 5704 Pi FL_vs_GZB 1750 1312 7939 5816 Pi GZ_vs_GZB 1759 1283 7932 5720 XP-CLR DDN_vs_DH 658 481 3339 2455 XP-CLR DDN_vs_GZB+GZ+YB+FL+YJ 608 412 1790 1204 XP-CLR DH_vs_GZB+GZ+YB+FL+YJ 590 384 1904 1294 XP-CLR DH_vs_GZB 614 442 3203 2360 XP-CLR DH_vs_YJ 667 476 3391 2423 XP-CLR FL1_vs_FL2 643 478 3308 2367 XP-CLR FL_vs_DDN 740 526 3543 2560 XP-CLR FL_vs_DH 695 509 3365 2440 XP-CLR FL_vs_GZB+GZ+YB 492 351 1645 1110 XP-CLR FL_vs_GZB 758 569 3516 2621 XP-CLR GZ_vs_GZB 625 434 3241 2315 XP-EHH DDN_vs_DH 777 540 3655 2629 XP-EHH DDN_vs_GZB+GZ+YB+FL+YJ 756 529 3693 2641 XP-EHH DH_vs_GZB+GZ+YB+FL+YJ 797 574 3493 2490 XP-EHH DH_vs_GZB 845 610 3714 2646 XP-EHH DH_vs_YJ 705 492 3487 2454 XP-EHH FL1_vs_FL2 674 503 3501 2504 XP-EHH FL_vs_DDN 676 478 3526 2518 XP-EHH FL_vs_DH 629 440 3440 2412 XP-EHH FL_vs_GZB+GZ+YB 698 512 3562 2541 XP-EHH FL_vs_GZB 735 545 3519 2539 XP-EHH GZ_vs_GZB 782 545 3495 2465

[0044] Table 3 Information on 24,893 SNP sites

[0045] 1_43950C / A;1_63866C / T;1_111485T / C;1_154652A / G;1_228078T / C;1_268188G / A;1_292724G / A;1_303698G / A;1_327265G / C;1_351439C / G;1_381633C / G;1_405016C / G;1_441001T / G;1_575443A / T;1_824606T / C;1_825159C / A;1_866757C / T;1_897875A / C;1_903418C / A;1_934055A / G;1_1023444G / C;1_1047355G / A;1_1190674C / T;1_1426876G / A;1_1566407G / A;1_1581353T / C;1_1710088G / A;1_1760444T / A;1_1780877T / C;1_1820581A / G;1_1839401G / A;1_1860028C / A;1_1891797A / C;1_2039348C / T;1_2215252G / A;1_2229370T / A;1_2459045A / G;1_2816276T / C;1_2835312C / T;1_3093369C / T;1_3217653A / T;1_3235786G / A;1_3292678G / C;1_3912370C / T;1_4514453C / T;1_4529803T / C;1_4605567G / A;1_5421656T / A;1_5992818C / T;1_6171819G / A;1_6198679A / G;1_6202141A / G;1_6237375C / T;1_6856515G / A;1_6878517T / C;1_6906249G / A;1_6926408C / T;1_8380177C / T;1_8412087C / T;1_8434592G / A;1_8850689C / T;1_8936921G / A;1_9168886G / A;1_9183567A / G;1_9203449C / T;1_9463166G / C;1_9481287T / G;1_9562116C / T;1_9577079G / A;1_9614041C / T;1_9772629T / C;1_10439826C / G;1_10828766A / G;1_11073343T / C;1_11093247T / C;1_11186037G / A;1_11901239G / T;1_11928436G / A;1_11989567C / T;1_13829623C / G;1_15517102C / T;1_15525587A / G;1_16703707A / T;1_16735187G / A;1_17063667A / G;1_17503691G / A;1_17541009A / G;1_17681868C / T;1_17819805G / T;1_17840754G / C;1_17936895G / A;1_17957330A / C;1_17995800T / A;1_18206101G / T;1_18227386G / A;1_18447605G / T;1_18502440T / C;1_18573275A / G;1_18626552A / G;1_18945511T / C;1_18965678T / C;1_18980178C / T;1_19056590A / G;1_19099308A / C;1_19205128T / C;1_19244369G / C;1_19422437A / G;1_19430872T / C;1_19668599C / A;1_19916464C / T;1_19968066C / A;1_19980768T / C;1_20726135T / C;1_21166445A / G;1_21183817G / A;1_21954402A / G;1_21983982C / A;1_22135139C / T;1_22806811T / C;1_22911494G / A;1_22953432C / T;1_22990108C / T;1_23200599T / C;1_23252435G / A;1_23293393T / C;1_23659702T / C;1_23922767A / G;1_24335818C / T;1_24355196C / T;1_24419285A / G;1_24539236T / C;1_25165339C / G;1_25179150G / A;1_25225847T / A;1_25268044C / T;1_25293149T / C;1_25306690T / A;1_25393988G / C;1_25401500A / G;1_25463869T / C;1_25494180C / T;1_25519551C / T;1_25526551G / A;1_25654302G / A;1_25920589C / T;1_25941634G / A;1_25953154G / A;1_25976605T / C;1_26001739A / C;1_26042692A / G;1_26055306G / C;1_26159181A / G;1_26182269C / T;1_26273038A / C;1_26279594T / A;1_27057449G / C;1_27078457A / G;1_27617067T / C;1_27769528A / G;1_28403726A / G;1_28518198C / T;1_28545105C / T;1_28768838T / C;1_28870270G / C;1_28894910G / A;1_28912436T / C;1_28944429G / A;1_28968678A / G;1_29023505C / T;1_29307070T / C;1_29329451A / G;1_29361135A / G;1_29392730G / A;1_29607547C / T;1_29637795A / C;1_29785934A / T;1_30072508T / G;1_30075458C / T;1_30261224C / T;1_30744787G / A;1_30816198T / C;1_30828988T / G;1_30977176C / T;1_31113647C / G;1_31128039C / T;1_31212769C / T;1_31867035T / C;1_31883997C / T;1_32554714G / T; 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Claims

1. A 20k whole genome liquid phase SNP chip for water buffalo, characterized in that: The chip comprises 24893 SNP molecular markers, and the site information of the molecular markers is specifically shown in Table 3; wherein the left side of the site number represents the chromosome where the site is located, the middle represents the position of the site on the chromosome, and the right side represents the polymorphic base of the site, and the reference genome is: NDDB_SH_1 / GCF_019923935.

1.

2. The application of the molecular marker in claim 1 in the preparation of a 20k liquid-phase SNP chip of a whole genome of a buffalo.

3. The application of the 20k liquid-phase SNP chip of a whole genome of a buffalo in claim 1 in the identification of a buffalo breed, the analysis of a pedigree component, the identification of a genetic relationship, the structure of a family, the analysis of genetic diversity of a population, the protection and breeding of a genetic resource of a breed.

4. Use according to claim 3, characterized in that, The buffalo breeds include: Fuling buffalo, Fuzhong buffalo, southeast Yunnan buffalo, Dehong buffalo, Guizhou buffalo, Guizhou white buffalo, Yibin buffalo, Yanjin buffalo, Nirilaphi buffalo, Morava buffalo and Binlangjiang buffalo.

5. The method for designing water buffalo whole genome 20k SNP chip by liquid phase according to claim 1, wherein the step of It comprises: S1: determining and collecting raw sequencing data of a buffalo sample, using fastp software to quality control the raw data, using Sentieon software to detect variant sites, using GATK software to preliminarily filter the variant sites, and obtaining 22999614 high-quality variant sites; S2: using plink2 software to jointly screen selection traces in a genome through four methods of an inter-population differentiation index, a nucleotide polymorphism ratio, a cross-population composite likelihood ratio test and a cross-population extended haplotype homozygosity, focusing on selecting interval sites for distinguishing between river type and marsh type and sorting the interval sites according to Fst values from large to small, and then selecting 32 top 5% interval sites in each comparison group as candidate sites, at this time, a total of 12,189,219 sites are preliminarily selected; using plink software to calculate the linkage relationship between the sites, and selecting the highest-weighted site in each linkage block as a representative site, after linkage relationship selection, a total of 30400 high-weighted sites are reserved, selecting sites with high variation coefficients in each population, evaluating the grouping effect of these sites, and finally reserving sites with good grouping effect, a total of 24,893 sites; S3: probe design and synthesis For the selected sites, software OligoMiner (v 1.7) is used for probe design; the probe design requirements include: (1) the length of the probe is 120 bp; (2) the GC content is 30%-70%; (3) the probe sequence is aligned to the genome by bowtie2, and can only be aligned to a unique position; (4) all 25 bp kmers contained in the probe cannot exceed 3 times in the whole genome; for sites that do not meet the above design principles, other sites closely linked to them are selected by linkage method for supplementary design.

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