Sirna, conjugate which contain sirna, pharmaceutical composition and uses thereof

Abstract

It relates to siRNA, e.g., double stranded ribonucleic acid (dsRNA), that interfere with target gene expression or inhibit its expression. It also relates to a conjugate or a pharmaceutical composition containing the siRNA. And the use of the siRNA, the conjugate and the pharmaceutical composition thereof in preparing a drug used for treating and / or preventing the disease or disorder.

Description

SIRNA, CONJUGATE WHICH CONTAIN SIRNA, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USES THEREOFFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present disclosure relates to a nucleic acid capable of inhibiting complement component C3 gene expression, a pharmaceutical composition and a siRNA conjugate containing the nucleic acid, and belongs to the field of nucleic acid pharmaceuticals. The present disclosure also relates to a preparation method and the use of the nucleic acid, the pharmaceutical composition and the siRNA conjugate.BACKGROUND

[0002] The complement pathway is part of the innate immune system of host defense mounted against invading pathogens. It mainly consists of an array of proteins that circulate in the bloodstream in the form of precursors or present on the cell membrane. Activation of complement leads to a cascade of enzymatic reactions, resulting in the formation of potent anaphylatoxins that elicit a plethora of physiological responses, including chemoattraction and cell death. Complement protein C3 is at the nexus of the complement cascade. C3 is hydrolyzed to form the highly reactive C3b that binds to cell surface. This binding leads to the sequential formation of several complexes that trigger the auto amplification of the so called “alternative pathway (AP) ” , which ultimately leads to inflammatory responses resulting in phagocyte attraction, opsonization and consequently the clearance of pathogens, immune complexes and cellular debris. The inappropriate -activation of complement is involved in the propagating and / or the initiation of many diseases, including C3 associated diseases (e.g. C3 Glomerulopathy) , Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) , atypical Hemolytic Uremic Syndrome (aHUS) , rheumatoid arthritis, ischemia-reperfusion injuries and neurodegenerative diseases. Therefore, therapeutic agents that can inhibit the complement system, including those that inhibit the activity of C3, may prove beneficial. Currently, there are limited therapies available for the treatment of complement component C3-associated diseases which require time-consuming and invasive administration at a high cost. Accordingly, there is a need in the art for alternative therapies for subjects having a complement component C3-associated disease.

[0003] Small interfering RNA (siRNA) , based on the mechanism of RNA interference (RNAi) , can inhibit or block the expression of target genes of interest in a sequence-specific manner, thus achieving the specificity of target inhibition for the purpose of treating diseases. Apparently, reducing the expression of C3 gene by modulating the mRNA level of C3 can be an effective way to block the production of complement proteins, maintain the normal immune functions and prevent the abnormal immune response.

[0004] The key to develop siRNA drugs for inhibiting the expression of C3 gene lies in finding a suitable target selective siRNA sequence, the proper modifications for chemical stability and the effective delivery system thereof. Given that C3 expression is largely restricted in liver hepatocytes before the secretion into the bloodstream, it is an ideal target for siRNA therapies.SUMMARY OF THE INVENTION

[0005] The object of the present invention is to provide a siRNA for inhibiting the expression of C3 gene, a pharmaceutical composition and a siRNA conjugate containing the siRNA as a pharmaceutically active ingredient, a method for inhibiting the expression of C3 gene using the siRNA, the pharmaceutical composition or the siRNA conjugate, and use of the siRNA, the pharmaceutical composition or the siRNA conjugate in treatment and / or prevention C3-associated diseases.

[0006] That is, the present invention achieves the foregoing object by providing the following technical solutions.

[0007] In one aspect, the present invention provides a siRNA agent with double stranded ribonucleic acid (dsRNA) for inhibiting expression of complement component C3 (C3) , wherein the dsRNA comprises a first strand and a second strand, wherein the first strand sequence comprises at least 15 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides from any one of the nucleotide sequence of nucleotides 3123-3141, 5019-5037, 2304-2322, 494-512, 2643-2661, 2244-2262, 589-607, 2482-2500, or 4698-4716 of SEQ ID NO: 1; and the second strand comprising a nucleotide sequence that is at least partially complementary to the first strand.

[0008] In one aspect, the first strand sequence comprises at least 16, preferably at least 17, more preferably at least 18 and most preferably all 19 contiguous nucleotides differing by no more than 2 nucleotides, preferably by no more than 1 nucleotide, and more preferably not differing by any nucleotide from any one of the nucleotide sequence of nucleotides 3123-3141, 5019-5037, 2304-2322, 494-512, 2643-2661, 2244-2262, 589-607, 2482-2500, or 4698-4716 of SEQ ID NO: 1.

[0009] In one aspect, the present invention provides a siRNA agent with double stranded ribonucleic acid (dsRNA) for inhibiting expression of complement component C3 (C3) , wherein the nucleic acid comprises a first strand and a second strand, wherein the first strand sequence comprises a sequence of at least 15 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides from any one of the sequences SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188.

[0010] In one aspect, the siRNA agent is a nucleic acid wherein: the first strand sequence comprises the sequence of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, respectively; and optionally wherein the second strand sequence comprises the sequence of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, respectively.

[0011] One aspect of the present invention relates to a siRNA agent, wherein the first strand and the second strand are present on a single strand of a nucleic acid, and the first strand and the second strand are able to hybridize to each other and to thereby form a double-stranded nucleic acid with a  duplex region.

[0012] In one aspect, the first strand and the second strand form a duplex region of 15-25 nucleotides in length; preferably 15-23 nucleotides in length; more preferably 15-19 nucleotides in length; further preferably 17-19 nucleotides in length; most preferably 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 nucleotides in length.

[0013] In one aspect, the first strand and the second strand of the nucleic acid are separate strands. The two separate strands are preferably each 15-25 nucleotides in length, more preferably 17-25 nucleotides in length. The two strands may be of the same or different lengths. The first strand may be 17-25 nucleotides in length, preferably it may be 18-24 nucleotides in length, it may be 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides in length. Most preferably, the first strand is 19 nucleotides in length. The second strand may independently be 17-25 nucleotides in length, preferably it may be 18-24 nucleotides in length, it may be 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides in length. More preferably, the second strand is 18 or 19 or 20 nucleotides in length, and most preferably it is 19 nucleotides in length.

[0014] In one aspect, the siRNA agent is a nucleic acid wherein: the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, respectively; and optionally wherein the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, respectively.

[0015] In one aspect, the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20, 96, 16, 150, 32, 100, 110, 134, 136, respectively.

[0016] In one aspect, the second strand complementary to the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21, 97, 17, 151, 33, 101, 111, 135, 137, respectively.

[0017] In one aspect, the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 96 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 97; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 16 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 17; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 150 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 151; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 32 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 33; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 100 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 101; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 110 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 111; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 134 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 135; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 136 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs:  137.

[0018] In one aspect, the siRNA agent comprises at least one modified nucleotide, preferably wherein substantially all of the nucleotides of the first strand are modified nucleotides, substantially all of the nucleotides of the second strand are modified nucleotides; more preferably wherein all of the nucleotides of the first strand are modified nucleotides, all of the nucleotides of the second strand are modified nucleotides.

[0019] As used herein, “substantially all of the nucleotides are modified” are largely but not wholly modified and include not more than 5, 4, 3, 2, or 1 unmodified nucleotide.

[0020] In one aspect, the modified nucleotides are selected from the group consisting of a 3'-terminal deoxy-thymine (dT) nucleotide, a 2'-OCF2H modified nucleotide, a 2′-methoxy modified nucleotide, a 2'-fluoro modified nucleotide, a nucleotide comprising a 5'-phosphorothioate group and a nucleotide comprising a 5'- (E) -vinylphosphonate.

[0021] In one aspect, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 7th, 9th, 10th and 11th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution, the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 4th, 6th, 8th, 12th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification, the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 13th, 15th, 17th, and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of either 2′-methoxy modification or 2′-fluoro substitution. All of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 6th, 8th, 14th, and 16th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution, the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 7th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification. The 4th, 9th, 10th and 18th position counting from the 5’ end was modified by means of either 2′-methoxy modification or 2′-fluoro substitution.

[0022] In one aspect, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th and 9th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 4th, 6th, 10th, 12th, 13th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; the pentose of the nucleotide residue at 3rd, 11th, and 14th positions counting from the 5’ end were modified by means of either 2′-methoxy modification or 2′-fluoro substitution. All of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 6th, 7th, 9th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th, and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; the pentose of the nucleotide residue at the 4th, 8th and 10th positions counting from the 5’ end were modified by means of either 2′-methoxy modification or 2′-fluoro substitution.

[0023] In certain embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 7th, 9th, 10th and 11th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 8th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification. All of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 6th, 8th, 9th, 14th and 16th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the  pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 7th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0024] In certain embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 3rd, 5th, 7th, 8th and 9th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification. All of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 4th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0025] In certain embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 11th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification. All of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 8th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0026] In certain embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 11th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification. All of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 4th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0027] In certain embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 14th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification. All of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 8th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0028] In certain embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 14th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification. All of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 4th, 14th,  16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0029] In certain embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 3rd, 5th, 7th, 8th and 9th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification. All of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 10th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0030] In certain embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 3rd, 5th, 7th, 8th and 9th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’end were modified by means of 2′-methoxy modification. All of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 8th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0031] In certain embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 11th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification. All of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 10th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0032] In certain embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 14th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification. All of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 10th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0033] In one aspect, the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and / or at the 3'-terminus; and / or the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and / or at the 3'-terminus.

[0034] In certain embodiments, the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus; and / or the second strand comprises two phosphorothioate  internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus.

[0035] In certain embodiments, the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus; and / or the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus.

[0036] In certain embodiments, the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus and / or the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus.

[0037] In one aspect, the second strand comprises a terminal 5’ (E) -vinylphosphonate nucleotide at the 5’ end.

[0038] Throughout the description of the invention, “same or common modification” means the same modification to any nucleotide, be that A, G, C or U modified with a group such as a methyl group (2'-OMe) or a fluoro group (2’ -F) . For example, 2'-F-dU, 2'-F-dA, 2'-F-dC, 2'-F-dG are all considered to be the same or common modification, as are 2'-OMe-rU, 2'-OMe-rA; 2'-OMe-rC; 2'-OMe-rG. In contrast, a 2’ -F modification is a different modification compared to a 2’ -OMe modification.

[0039] Preferably, at least one nucleotide of the first and / or second strand of the nucleic acid is a modified nucleotide, preferably a non-naturally occurring nucleotide such as preferably a 2’ -F or 2’-OMe modified nucleotide.

[0040] In certain embodiments, the siRNA agent further comprises a targeting ligand that targets a liver tissue.

[0041] In one aspect, the targeting ligand is the GalNAc derivatives.

[0042] In one aspect, the targeting ligand is the GalNAc conjugates.

[0043] In one aspect, the targeting ligand is conjugated to the 3'-terminus or 5'-terminus of the first strand of the siRNA agent.

[0044] In certain embodiments, the targeting ligand is conjugated to the 3'-terminus of the first strand of the siRNA agent. In certain embodiments, the targeting ligand is conjugated to the 5'-terminus of the first strand of the siRNA agent.

[0045] In one aspect, the siRNA agent:

[0046] (i) comprises a targeting ligand which is conjugated to the 3'-terminus nucleotide or 5'-terminus nucleotide of the first strand;

[0047] (ii) has a phosphorothioate linkage between the terminal three nucleotides of the first strand at the end opposite to the one conjugated to the targeting ligand;

[0048] (iii) has a phosphorothioate linkage between the terminal three 3’ nucleotides and the terminal three 5’ nucleotides of the second strand; and

[0049] (iv) optionally all remaining linkages between nucleotides of the first and / or of the second strand are phosphodiester linkages.

[0050] In certain embodiments, the targeting ligand is conjugated to the 3'-terminus of the first strand; the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus, the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus, optionally all remaining linkages between nucleotides of the first and / or of the second strand are phosphodiester linkages.

[0051] In certain embodiments, the targeting ligand is conjugated to the 5'-terminus of the first strand; the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus, the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus, optionally all remaining linkages between nucleotides of the first and / or of the second strand are phosphodiester linkages.

[0052] In one aspect, the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*fGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUmGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 208) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NOs: 209) ; or

[0053] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 210) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 211) ; or

[0054] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 210) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; or

[0055] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 212) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 211) ; or

[0056] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 212) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; or

[0057] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGfGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 213) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; or

[0058] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 214) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 211) ; or

[0059] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 214) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; or

[0060] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 215) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 211) ; or

[0061] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 215) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP- mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; or the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*fGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUmUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 216) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; or the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 218) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 219) ; or the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 218) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; or the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 220) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 219) ; or the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 220) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; or the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCfGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 221) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; or the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 222) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 219) ; or the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 222) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; or the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 223) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 219) ; or the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 223) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ;

[0062] wherein mA, mC, mG and mU represent 2'-O-methyl adenosine, cytidine, guanosine and uridine respectively; fA, fC, gG and fU represent 2'-fluoro adenosine, cytidine, guanosine or uridine, respectively; “*” is a phosphorothioate internucleotide linkage, “ (E) -VP” is (E) -vinylphosphonate  moiety at the 5′end, “GN” is the targeting ligand.

[0063] In one aspect, the siRNA agent is conjugated to the ligand as shown in the following schematic: the ligand comprises (i) one or more N-acetyl galactosamine (GalNAc) moieties or derivatives thereof, and (ii) a linker, wherein the linker conjugates the at least one GalNAc moiety or derivative thereof to the nucleic acid, and (iii) a bicyclic group tethers GalNAc and siRNA, or (iv) a terta-functional group, wherein the GalNAc moieties tethers, wherein the X is O or S.

[0064] In one aspect, each linker in the schematic is optionally the same or different.

[0065] In one aspect, the linker the linker in the schematic is independently selected from:

[0066] (1) - (CH2) x-C (O) NH- (CH2) y-C (O) -; (2) - (CH2) x-C (O) NH- (CH2) y-NHC (O) - (CH2) z-C (O) -; (3) -NH- (CH2) y-C (O) -; (4) –C (O) - (CH2) z-C (O) -; the x, y and z is independently selected from 1-10; preferably the x and y is independently selected from 2-8, z is selected from 1-6; more preferably the x and y is independently selected from 3-6, z is selected from 1-4.

[0067] In one aspect, the siRNA agent is conjugated to the ligand as shown in the following schematic:

[0068] Wherein X is O or S,

[0069] the is:

[0070] the is:

[0071] In one aspect, the siRNA agent is conjugated to the ligand as shown in the following schematic:

[0072] Wherein the X is O or S,

[0073] the is:

[0074] In one aspect, the siRNA agent is conjugated to the ligand as shown in the following schematic:

[0075] The tetra functional group is selected from:

[0076] In certain embodiments, the GalNAc conjugate is one or more GalNAc derivatives, optionally conjugated to the double stranded RNA agent via a linker or carrier, one or more GalNAc derivatives, optionally conjugated to the double stranded RNAi agent via a linker or carrier.

[0077] In certain embodiments, the siRNA agent is conjugated to the ligand as shown in the following schematic:

[0078] wherein the X is O or S.

[0079] In certain embodiments, the siRNA agent is conjugated to the ligand as shown in the following schematic:

[0080] In preferred embodiments, the siRNA agent is conjugated to the ligand as shown in the following schematic:

[0081] In one aspect, the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*fGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUmGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 224) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; or

[0082] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 226) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 227) ; or

[0083] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 226)  and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; or

[0084] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID N: 228) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 227) ; or

[0085] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 228) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; or

[0086] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGfGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 229) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; or

[0087] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 230) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 227) ; or

[0088] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 230) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; or

[0089] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 231) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 227) ; or

[0090] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 231) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; or

[0091] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*fGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUmUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 232) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; or

[0092] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 234) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 235) ; or

[0093] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 234) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; or

[0094] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 236)  and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 235) ; or

[0095] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 236) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; or

[0096] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCfGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 237) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; or

[0097] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 238) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 235) ; or

[0098] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 238) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; or

[0099] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 239) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 235) ; or

[0100] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 239) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ;

[0101] wherein mA, mC, mG and mU represent 2'-O-methyl adenosine, cytidine, guanosine and uridine respectively; fA, fC, gG and fU represent 2'-fluoro adenosine, cytidine, guanosine or uridine, respectively; “*” is a phosphorothioate internucleotide linkage; “ (E) -VP” is (E) -vinylphosphonate moiety at the 5′end.

[0102] In one aspect, the pharmaceutical composition comprises a siRNA agent disclosed herein, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, and a solvent (preferably water) and / or a delivery vehicle and / or a physiologically acceptable excipient and / or a pharmaceutically acceptable carrier and / or a salt and / or a diluent and / or a buffer and / or a preservative.

[0103] In one aspect, the pharmaceutical composition comprises a siRNA agent disclosed herein and a further therapeutic agent selected from the group comprising an oligonucleotide, a small molecule, a monoclonal antibody, a polyclonal antibody and a peptide.

[0104] In one aspect, the pharmaceutical composition comprises an agent disclosed herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0105] An additional aspect of the disclosure provides a method of inhibiting expression of a C3 gene in a cell, such as a neural cell or an ocular cell, the method involving: (a) contacting the cell with a double stranded RNAi agent of the instant disclosure or a pharmaceutical composition of the instant disclosure; and (b) maintaining the cell produced in step (a) for a time sufficient to obtain degradation of the mRNA transcript of a C3 gene, thereby inhibiting expression of the C3 gene in  the cell.

[0106] An additional aspect of the disclosure provides a method of treating a subject having a disease or disorder that would benefit from a reduction in complement component C3 expression, the method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the siRNA agent mentioned above, or the pharmaceutical composition mentioned above, thereby treating said subject.

[0107] The disease or disorder to be treated with a nucleic acid or composition disclosed herein is a complement-mediated disease, disorder or syndrome, preferably the disease or disorder is C3-associated disease or disorder.

[0108] The disease or disorder to be treated with a nucleic acid or composition disclosed herein is preferably selected from the group comprising IgA Nephropathy (IgAN) , C3 Glomerulopathy (C3G) , Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH) , atypical Hemolytic Uremic Syndrome (aHUS) , Neuro-Myelitis Optica (NMO) , Multifocal Motor Neuropathy (MMN) , Myasthenia Gravis (MG) .

[0109] The siRNA provided by the present invention can sequence-specifically mediate inhibition of the expression of C3 gene. The gene may be within a cell, e.g., a cell within a subject, such as a human. Without intending to be limited by theory, it is believed that a combination or sub-combination of the foregoing properties and the specific target sites or the specific modifications in these iRNAs confer to the iRNAs of the invention improved efficacy, stability, potency, durability, and safety.

[0110] BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0111] Figure 1. shows the detection result of the inhibitory effect of the siRNA in Table 2A on the expression level of C3 mRNA.

[0112] Figure 2A. shows the dose-response-curve of C3 mRNA knockdown efficacy of the nine selected siRNAs in HepG2 cells.

[0113] Figure 2B. shows the detection result of C3 mRNA knockdown efficacy of the nine selected siRNAs in HepG2 cells at a concentration of 100 and 0.16nM.

[0114] Figure 3A. shows the detection result of C3 mRNA knockdown efficacy of the nine selected GalNAc-conjugated siRNAs in PHH cells at a concentration of 1000 and 1nM.

[0115] Figure 3B. shows the dose-response-curve of C3 mRNA knockdown efficacy of the four selected GalNAc-conjugated siRNAs in PHH cells.

[0116] Figure 4A. shows the dose-response-curve of C3 mRNA knockdown efficacy of the twenty selected GalNAc-conjugated siRNAs in PHH cells.

[0117] Figure 4B. shows the dose-response-curve of C3 mRNA knockdown efficacy of the twenty selected GalNAc-conjugated siRNAs in PHH cells.

[0118] Figure 4C. shows the dose-response-curve of C3 mRNA knockdown efficacy of the twenty selected GalNAc-conjugated siRNAs in PHH cells.

[0119] Figure 4D. shows the dose-response-curve of C3 mRNA knockdown efficacy of the twenty selected GalNAc-conjugated siRNAs in PHH cells.

[0120] Figure 5A. shows the detection result of serum human C3 protein reduction efficacy of the two selected GalNAc-conjugated siRNAs in human C3 transgenic mice (male) .

[0121] Figure 5B. shows the detection result of serum human C3 protein reduction efficacy of the two  selected GalNAc-conjugated siRNAs in human C3 transgenic mice (female) .

[0122] Figure 6. shows the detection result of human C3 protein reduction efficacy of tested conjugated siRNAs.

[0123] Figure 7. shows the detection result of human C3 protein reduction efficacy of tested GalNAc-conjugated siRNAs with different doses.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0124] The present invention is further illustrated by the following detailed description.

[0125] The present invention provides siRNA agent which effect the RNA-induced silencing complex (RISC) -mediated cleavage of RNA transcripts of a complement component C3 (C3) gene. The gene may be within a cell, e.g., a cell within a subject, such as a human. The use of these iRNAs enables the targeted degradation of mRNAs of the corresponding gene (C3) in mammals.

[0126] The siRNA agent of the invention have been designed to target the huma complement component C3 (C3) gene, including portions of the gene that are conserved in the C3 orthologs of other mammalian species. The siRNA agent of the invention have improved efficacy, stability, potency, durability, and safety.

[0127] I. NUCLEIC ACID SEQUENCE

[0128] A first aspect of the invention is siRNA agent with double stranded ribonucleic acid (dsRNA) for inhibiting expression of complement component C3 (C3) , wherein the nucleic acid comprises a first strand and a second strand, wherein the first strand sequence comprises at least 15 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides from any one of the nucleotide sequences of the first strands in any one of Table 1, Table 2A, Table 3A, Table 3B, Table 3C, Table 3D, Table 3E, Table 3F.

[0129] Preferably, the first strand sequence comprises at least 16, more preferably at least 17, yet more preferably at least 18 and most preferably all 19 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides, preferably by no more than 2 nucleotides, more preferably by no more than 1 nucleotide, and most preferably not differing by any nucleotide from any one of the first strand sequences shown in any one of Table 1, Table 2A, Table 3A, Table 3B, Table 3C, Table 3D, Table 3E, Table 3F.

[0130] Also, the present invention provides a siRNA agent with double stranded ribonucleic acid (dsRNA) for inhibiting expression of complement component C3 (C3) , wherein the nucleic acid comprises a first strand and a second strand, wherein the first strand sequence comprises at least 15 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides from any one of the nucleotide sequences of the first strands in any one of Table 1, Table 2A, Table 3A, Table 3B, Table 3C, Table 3D, Table 3E, Table 3F; and the second strand sequence comprises at least 15 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides from any one of the nucleotide sequences of the second strands in any one of Table 1, Table 2A, Table 3A, Table 3B, Table 3C, Table 3D, Table 3E, Table 3F.

[0131] Preferably, the first strand sequence comprises at least 16, more preferably at least 17, yet more preferably at least 18 and most preferably all 19 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides, preferably by no more than 2 nucleotides, more preferably by no more than 1 nucleotide, and most preferably not differing by any nucleotide from any one of the first strand  sequences shown in any one of Table 1, Table 2A, Table 3A, Table 3B, Table 3C, Table 3D, Table 3E, Table 3F; the second strand sequence comprises at least 16, more preferably at least 17, yet more preferably at least 18 and most preferably all 19 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides, preferably by no more than 2 nucleotides, more preferably by no more than 1 nucleotide, and most preferably not differing by any nucleotide from any one of the second strand sequences shown in any one of Table 1, Table 2A, Table 3A, Table 3B, Table 3C, Table 3D, Table 3E, Table 3F.

[0132] Also, the present invention provides a siRNA agent with double stranded ribonucleic acid (dsRNA) for inhibiting expression of complement component C3 (C3) , wherein the nucleic acid comprises a first strand and a second strand, wherein the first strand sequence comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of any one of the nucleotide sequences of the first strands in any one of Table 1, Table 2A, Table 3A, Table 3B, Table 3C, Table 3D, Table 3E, Table 3F; and the second strand comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of any one of the nucleotide sequences of the second strands in any one of Table 1, Table 2A, Table 3A, Table 3B, Table 3C, Table 3D, Table 3E, Table 3F.

[0133] It will be understood that, although the sequences in, for example, Table 1, are not described as modified or conjugated sequences, the dsRNA of the siRNA agent of the invention e.g., a dsRNA of the invention, may comprise any one of the sequences set forth in any one of Table 1, Table 2A, Table 3A, Table 3B, Table 3C, Table 3D, Table 3E, Table 3F that is unmodified, un-conjugated, or modified or conjugated differently than described therein. In other words, the invention encompasses dsRNA of Tables 2-7 which are un-modified, un-conjugated, modified, or conjugated, as described herein.

[0134] Also, the present invention provides a siRNA agent with double stranded ribonucleic acid (dsRNA) for inhibiting expression of complement component C3 (C3) , wherein the first strand sequence comprises a sequence of at least 15 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides from any one of the sequences SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188; and optionally wherein the second strand sequence comprises a sequence of at least 15 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides from any one of the sequences SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189.

[0135] In some embodiments, the first strand sequence comprises at least 16, more preferably at least 17, yet more preferably at least 18 and most preferably all 19 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides, preferably by no more than 2 nucleotides, more preferably by no more than 1 nucleotide, and most preferably not differing by any nucleotide from any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186,  188; and the second strand sequence comprises at least 16, more preferably at least 17, yet more preferably at least 18 and most preferably all 19 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides, preferably by no more than 2 nucleotides, more preferably by no more than 1 nucleotide, and most preferably not differing by any nucleotide from any one of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189.

[0136] In some embodiments, the siRNA agent is a nucleic acid wherein: the first strand sequence comprises the sequence of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, respectively; and optionally wherein the second strand sequence comprises the sequence of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, respectively.

[0137] II. MODIFIED SIRNA AGENT

[0138] A second aspect of the invention is the specific modification patern for the polynucleic acid molecule which is a double-stranded RNA (dsRNA) comprising a first strand and a second strand.

[0139] In one aspect, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand and the second strand comprises at least one modified nucleotide, preferably wherein substantially all of the nucleotides of the first strand are modified nucleotides, substantially all of the nucleotides of the second strand are modified nucleotides; more preferably wherein all of the nucleotides of the first strand are modified nucleotides, all of the nucleotides of the second strand are modified nucleotides.

[0140] As used herein, “substantially all of the nucleotides are modified” are largely but not wholly modified and include not more than 5, 4, 3, 2, or 1 unmodified nucleotide.

[0141] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 7th, 9th, 10th and 11th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution, the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 4th, 6th, 8th, 12th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification, the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 13th, 15th, 17th, and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of either 2′-methoxy modification or 2′-fluoro substitution; all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as:the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 6th, 8th, 14th, and 16th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution, the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 7th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified  by means of 2′-methoxy modification. The 4th, 9th, 10th and 18th position counting from the 5’ end was modified by means of either 2′-methoxy modification or 2′-fluoro substitution.

[0142] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th and 9th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 4th, 6th, 10th, 12th, 13th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; the pentose of the nucleotide residue at 3rd, 11th, and 14th positions counting from the 5’ end were modified by means of either 2′-methoxy modification or 2′-fluoro substitution; all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 6th, 7th, 9th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th, and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; the pentose of the nucleotide residue at the 4th, 8th and 10th positions counting from the 5’ end were modified by means of either 2′-methoxy modification or 2′-fluoro substitution.

[0143] In certain embodiments, the target gene the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) , complement component C5 (C5) , Complement factor B (CFB) , PCSK9, TTR, AGT, LPA, Agtr1, ALK, VEGF, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL8, APOA, APOC3, ASGR1, CIDEB, COL1A1, COL3A1, CTGF, DGAT2, DMPK, DNAJC15 / MCJ, DPP4, Factor VIII, Factor X, Factor IX, Factor XI, Factor XII, GPR146, GPR75, GRB10 / 14, TLR7 / 8 / RIG-1, HSD17B13, INHBE, ITGV6, KHK, KLK1, MASP2, MTARC1, MUC5B, NPC1L1, PNPLA3, ASGR1, SCAP, SERPINA1, SERPINF2, SREBF2, HMGCR, TGFB1, COX-2, TP53, CD4, CD8, CD40, CD71, DUX4, XDH, LDHA, ALDH2, DMD, EPHA2, KIF11, BCL2L12, APOA1, TRPV1, CASP2, KRAS, TMPRSS6, STAT3, PRDM14, PTGS2, CTGF, or DDIT4..

[0144] In certain embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th and 9th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 4th, 6th, 10th, 12th, 13th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; the pentose of the nucleotide residue at 3rd, 11th, and 14th positions counting from the 5’ end were modified by means of either 2′-methoxy modification or 2′-fluoro substitution; all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 6th, 7th, 9th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th, and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; the pentose of the nucleotide residue at the 4th, 8th and 10th positions counting from the 5’ end were modified by means of either 2′-methoxy modification or 2′-fluoro substitution; wherein, the target gene the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) ; preferrably, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 96 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs:  97; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 16 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 17; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 150 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 151; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 32 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 33; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 100 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 101; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 110 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 111; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 134 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 135; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 136 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 137.

[0145] In some embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 7th, 9th, 10th and 11th positions counting from the 5’end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 8th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 6th, 8th, 9th, 14th and 16th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 7th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0146] In some embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 3rd, 5th, 7th, 8th and 9th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’end were modified by means of 2′-methoxy modification; all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 4th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0147] In some embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 11th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 8th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0148] In some embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 11th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; all of the nucleotides of the second  strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 4th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0149] In some embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 14th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 8th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0150] In some embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 14th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 4th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0151] In some embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 3rd, 5th, 7th, 8th and 9th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 10th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0152] In some embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 3rd, 5th, 7th, 8th and 9th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 8th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0153] In some embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 11th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the  5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 10th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0154] In some embodiments, all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 14th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 10th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0155] In certain embodiments, all of the nucleotides of the first strand of a double-stranded RNA (dsRNA) agent comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 11th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 8th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; wherein, the target gene the double-stranded RNA (dsRNA) agent is selected from is complement component C3 (C3) , complement component C5 (C5) , Complement factor B (CFB) , PCSK9, TTR, AGT, LPA, Agtr1, ALK, VEGF, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL8, APOA, APOC3, ASGR1, CIDEB, COL1A1, COL3A1, CTGF, DGAT2, DMPK, DNAJC15 / MCJ, DPP4, Factor VIII, Factor X, Factor IX, Factor XI, Factor XII, GPR146, GPR75, GRB10 / 14, TLR7 / 8 / RIG-1, HSD17B13, INHBE, ITGV6, KHK, KLK1, MASP2, MTARC1, MUC5B, NPC1L1, PNPLA3, ASGR1, SCAP, SERPINA1, SERPINF2, SREBF2, HMGCR, TGFB1, COX-2, TP53, CD4, CD8, CD40, CD71, DUX4, XDH, LDHA, ALDH2, DMD, EPHA2, KIF11, BCL2L12, APOA1, TRPV1, CASP2, KRAS, TMPRSS6, STAT3, PRDM14, PTGS2, CTGF, or DDIT4; preferably, complement component C3 (C3) . In preferred embodiments, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 96 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 97; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 16 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 17; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 150 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 151; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 32 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 33; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 100 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 101; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 110  and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 111; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 134 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 135; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 136 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 137.

[0156] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -nnxnNfnNfNfNfnxnnxnnnnn-3’ ; the second strand comprises 5’-nNfnxnnnxnxnnnNfnNfnNfn-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide, and “x” stand for 2’ -fluoro or 2’ -O-methyl modified nucleotide.

[0157] In certain embodiments, the target gene the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) , complement component C5 (C5) , Complement factor B (CFB) , PCSK9, TTR, AGT, LPA, Agtr1, ALK, VEGF, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL8, APOA, APOC3, ASGR1, CIDEB, COL1A1, COL3A1, CTGF, DGAT2, DMPK, DNAJC15 / MCJ, DPP4, Factor VIII, Factor X, Factor IX, Factor XI, Factor XII, GPR146, GPR75, GRB10 / 14, TLR7 / 8 / RIG-1, HSD17B13, INHBE, ITGV6, KHK, KLK1, MASP2, MTARC1, MUC5B, NPC1L1, PNPLA3, ASGR1, SCAP, SERPINA1, SERPINF2, SREBF2, HMGCR, TGFB1, COX-2, TP53, CD4, CD8, CD40, CD71, DUX4, XDH, LDHA, ALDH2, DMD, EPHA2, KIF11, BCL2L12, APOA1, TRPV1, CASP2, KRAS, TMPRSS6, STAT3, PRDM14, PTGS2, CTGF, or DDIT4..

[0158] In certain embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -nnxnNfnNfNfNfnxnnxnnnnn-3’ ; the second strand comprises 5’-nNfnxnnnxnxnnnNfnNfnNfn-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide, and “x” stand for 2’ -fluoro or 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein the target gene the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) ; preferrably, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 96 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 97; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 16 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 17; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 150 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 151; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 32 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 33; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 100 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 101; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 110 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 111; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 134 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 135; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 136 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 137.

[0159] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand,  wherein the first strand comprises 5’ -nnNfnNfnNfNfNfnnnnnnnnnn-3’ ; the second strand comprises 5’ -nNfnnnnnnnNfnnnNfnNfnNfn-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide.

[0160] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -nnNfnNfnNfNfNfnnnnnnnnnn-3’ ; the second strand comprises 5’ -nNfnnnnnNfnnnnnNfnNfnNfn-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide.

[0161] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -nnNfnNfnNfNfNfnnnnnnnnnn-3’ ; the second strand comprises 5’ -nNfnNfnnnnnnnnnNfnNfnNfn-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide.

[0162] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -nnnnNfnNfNfNfnNfnnnnnnnn-3’ ; the second strand comprises 5’ -nNfnnnnnnnNfnnnNfnNfnNfn-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide.

[0163] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -nnnnNfnNfNfNfnNfnnnnnnnn-3’ ; the second strand comprises 5’ -nNfnnnnnNfnnnnnNfnNfnNfn-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide.

[0164] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -nnnnNfnNfNfNfnNfnnnnnnnn-3’ ; the second strand comprises 5’ -nNfnNfnnnnnnnnnNfnNfnNfn-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide.

[0165] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -nnnnNfnNfNfNfnnnnNfnnnnn-3’ ; the second strand comprises 5’ -nNfnnnnnnnNfnnnNfnNfnNfn-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide.

[0166] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -nnnnNfnNfNfNfnnnnNfnnnnn-3’ ; the second strand comprises 5’ -nNfnnnnnNfnnnnnNfnNfnNfn-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide.

[0167] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -nnnnNfnNfNfNfnnnnNfnnnnn-3’ ; the second strand comprises 5’ -nNfnNfnnnnnnnnnNfnNfnNfn-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide.

[0168] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent  capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -nnnnnnNfnNfNfNfnnnnnnnn-3’ ; the second strand comprises 5’-nNfnnnNfnNfNfnnnnNfnNfnnn-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide.

[0169] In certain embodiments, the target gene the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) , complement component C5 (C5) , Complement factor B (CFB) , PCSK9, TTR, AGT, LPA, Agtr1, ALK, VEGF, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL8, APOA, APOC3, ASGR1, CIDEB, COL1A1, COL3A1, CTGF, DGAT2, DMPK, DNAJC15 / MCJ, DPP4, Factor VIII, Factor X, Factor IX, Factor XI, Factor XII, GPR146, GPR75, GRB10 / 14, TLR7 / 8 / RIG-1, HSD17B13, INHBE, ITGV6, KHK, KLK1, MASP2, MTARC1, MUC5B, NPC1L1, PNPLA3, ASGR1, SCAP, SERPINA1, SERPINF2, SREBF2, HMGCR, TGFB1, COX-2, TP53, CD4, CD8, CD40, CD71, DUX4, XDH, LDHA, ALDH2, DMD, EPHA2, KIF11, BCL2L12, APOA1, TRPV1, CASP2, KRAS, TMPRSS6, STAT3, PRDM14, PTGS2, CTGF, or DDIT4.

[0170] In certain embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -nnnnNfnNfNfNfnNfnnnnnnnn-3’ ; the second strand comprises 5’ -nNfnnnnnNfnnnnnNfnNfnNfn-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein the target gene the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) ; preferrably, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 96 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 97; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 16 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 17; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 150 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 151; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 32 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 33; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 100 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 101; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 110 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 111; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 134 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 135; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 136 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 137.

[0171] In some embodiments, the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and / or at the 3'-terminus; and / or the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and / or at the 3'-terminus.

[0172] In certain embodiments, the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus; and / or the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus.

[0173] In certain embodiments, the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus; and / or the second strand comprises two phosphorothioate  internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus.

[0174] In certain embodiments, the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus and / or the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus.

[0175] In some embodiments, the siRNA agent further comprises a targeting ligand that targets a liver tissue.

[0176] In some embodiments, the targeting ligand is the GalNAc derivatives. In one aspect, the targeting ligand is the GalNAc conjugates.

[0177] In some embodiments, the targeting ligand is conjugated to the 3'-terminus or 5'-terminus of the first strand of the siRNA agent.

[0178] In certain embodiments, the targeting ligand is conjugated to the 3'-terminus of the first strand; the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus, the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus, optionally all remaining linkages between nucleotides of the first and / or of the second strand are phosphodiester linkages.

[0179] In certain embodiments, the targeting ligand is conjugated to the 5'-terminus of the first strand; the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus, the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus, optionally all remaining linkages between nucleotides of the first and / or of the second strand are phosphodiester linkages.

[0180] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -n*n*xnNfnNfNfNfnxnnxnnnnn (GN) -3’ ; the second strand comprises 5’ -n*Nf*nxnnnxnxnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide, and “x” stand for 2’ -fluoro or 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand.

[0181] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ - (GN) nnxnNfnNfNfNfnxnnxnnn*n*n-3’ ; the second strand comprises 5’ -n*Nf*nxnnnxnxnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide, and “x” stand for 2’ -fluoro or 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand.

[0182] In certain embodiments, the target gene of the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) , complement component C5 (C5) , Complement factor B (CFB) , PCSK9, TTR, AGT, LPA, Agtr1, ALK, VEGF, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL8, APOA, APOC3, ASGR1, CIDEB, COL1A1, COL3A1, CTGF, DGAT2, DMPK, DNAJC15 / MCJ, DPP4, Factor VIII, Factor X, Factor IX, Factor XI, Factor XII, GPR146, GPR75, GRB10 / 14, TLR7 / 8 / RIG-1, HSD17B13, INHBE, ITGV6, KHK, KLK1, MASP2, MTARC1, MUC5B, NPC1L1, PNPLA3, ASGR1, SCAP, SERPINA1, SERPINF2, SREBF2, HMGCR, TGFB1, COX-2, TP53, CD4, CD8, CD40, CD71, DUX4, XDH, LDHA, ALDH2, DMD, EPHA2, KIF11, BCL2L12, APOA1, TRPV1,  CASP2, KRAS, TMPRSS6, STAT3, PRDM14, PTGS2, CTGF, or DDIT4.

[0183] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -n*n*NfnNfnNfNfNfnnnnnnnnnn (GN) -3’ ; the second strand comprises 5’ -n*Nf*nNfnnnnnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand.

[0184] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -n*n*nnNfnNfNfNfnNfnnnnnnnn (GN) -3’ ; the second strand comprises 5’ -n*Nf*nnnnnNfnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand.

[0185] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -n*n*nnNfnNfNfNfnNfnnnnnnnn (GN) -3’ ; the second strand comprises 5’ -n*Nf*nNfnnnnnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand.

[0186] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -n*n*nnNfnNfNfNfnnnnNfnnnnn (GN) -3’ ; the second strand comprises 5’ -n*Nf*nnnnnNfnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand.

[0187] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -n*n*nnNfnNfNfNfnnnnNfnnnnn (GN) -3’ ; the second strand comprises 5’ -n*Nf*nNfnnnnnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand.

[0188] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ - (GN) nnNfnNfnNfNfNfnnnnnnnn*n*n-3’ ; the second strand comprises 5’ -n*Nf*nNfnnnnnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand.

[0189] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ - (GN) nnnnNfnNfNfNfnNfnnnnnn*n*n-3’ ; the second strand comprises 5’ -n*Nf*nnnnnNfnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand.

[0190] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent  capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ - (GN) nnnnNfnNfNfNfnNfnnnnnn*n*n-3’ ; the second strand comprises 5’ -n*Nf*nNfnnnnnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand.

[0191] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ - (GN) nnnnNfnNfNfNfnnnnNfnnn*n*n-3’ ; the second strand comprises 5’ -n*Nf*nnnnnNfnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand.

[0192] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ - (GN) nnnnNfnNfNfNfnnnnNfnnn*n*n-3’ ; the second strand comprises 5’ -n*Nf*nNfnnnnnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand.

[0193] In certain embodiments, the target gene of the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) , complement component C5 (C5) , Complement factor B (CFB) , PCSK9, TTR, AGT, LPA, Agtr1, ALK, VEGF, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL8, APOA, APOC3, ASGR1, CIDEB, COL1A1, COL3A1, CTGF, DGAT2, DMPK, DNAJC15 / MCJ, DPP4, Factor VIII, Factor X, Factor IX, Factor XI, Factor XII, GPR146, GPR75, GRB10 / 14, TLR7 / 8 / RIG-1, HSD17B13, INHBE, ITGV6, KHK, KLK1, MASP2, MTARC1, MUC5B, NPC1L1, PNPLA3, ASGR1, SCAP, SERPINA1, SERPINF2, SREBF2, HMGCR, TGFB1, COX-2, TP53, CD4, CD8, CD40, CD71, DUX4, XDH, LDHA, ALDH2, DMD, EPHA2, KIF11, BCL2L12, APOA1, TRPV1, CASP2, KRAS, TMPRSS6, STAT3, PRDM14, PTGS2, CTGF, or DDIT4.

[0194] In certain embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -n*n*nnNfnNfNfNfnNfnnnnnnnn (GN) -3’ ; the second strand comprises 5’ -n*Nf*nnnnnNfnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand; wherein the target gene the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) ; preferrably, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 96 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 97; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 16 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 17; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 150 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 151; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 32 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 33; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 100 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 101; or the first strand has a nucleotide sequence represented  by SEQ ID NOs: 110 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 111; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 134 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 135; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 136 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 137.

[0195] In certain embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ - (GN) nnnnNfnNfNfNfnNfnnnnnn*n*n-3’ ; the second strand comprises 5’ -n*Nf*nnnnnNfnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand; wherein the target gene the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) ; preferrably, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 96 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 97; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 16 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 17; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 150 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 151; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 32 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 33; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 100 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 101; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 110 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 111; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 134 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 135; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 136 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 137.

[0196] In some embodiments, the second strand comprises a terminal 5’ (E) -vinylphosphonate nucleotide at the 5’ end.

[0197] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -n*n*xnNfnNfNfNfnxnnxnnnnn (GN) -3’ ; the second strand comprises 5’ - (E-VP) n*Nf*nxnnnxnxnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide, and “x” stand for 2’ -fluoro or 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand; wherein “E-VP” stand for (E) -vinylphosphonate nucleotide.

[0198] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ - (GN) nnxnNfnNfNfNfnxnnxnnn*n*n-3’ ; the second strand comprises 5’ - (E-VP) n*Nf*nxnnnxnxnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide, and “x” stand for 2’ -fluoro or 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide  linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand; wherein “E-VP” stand for (E) -vinylphosphonate nucleotide.

[0199] In certain embodiments, the target gene of the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) , complement component C5 (C5) , Complement factor B (CFB) , PCSK9, TTR, AGT, LPA, Agtr1, ALK, VEGF, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL8, APOA, APOC3, ASGR1, CIDEB, COL1A1, COL3A1, CTGF, DGAT2, DMPK, DNAJC15 / MCJ, DPP4, Factor VIII, Factor X, Factor IX, Factor XI, Factor XII, GPR146, GPR75, GRB10 / 14, TLR7 / 8 / RIG-1, HSD17B13, INHBE, ITGV6, KHK, KLK1, MASP2, MTARC1, MUC5B, NPC1L1, PNPLA3, ASGR1, SCAP, SERPINA1, SERPINF2, SREBF2, HMGCR, TGFB1, COX-2, TP53, CD4, CD8, CD40, CD71, DUX4, XDH, LDHA, ALDH2, DMD, EPHA2, KIF11, BCL2L12, APOA1, TRPV1, CASP2, KRAS, TMPRSS6, STAT3, PRDM14, PTGS2, CTGF, or DDIT4.

[0200] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -n*n*NfnNfnNfNfNfnnnnnnnnnn (GN) -3’ ; the second strand comprises 5’ - (E-VP) n*Nf*nNfnnnnnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand, wherein “E-VP” stand for (E) -vinylphosphonate nucleotide.

[0201] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -n*n*nnNfnNfNfNfnNfnnnnnnnn (GN) -3’ ; the second strand comprises 5’ - (E-VP) n*Nf*nnnnnNfnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand, wherein “E-VP” stand for (E) -vinylphosphonate nucleotide.

[0202] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -n*n*nnNfnNfNfNfnNfnnnnnnnn (GN) -3’ ; the second strand comprises 5’ - (E-VP) n*Nf*nNfnnnnnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand, wherein “E-VP” stand for (E) -vinylphosphonate nucleotide.

[0203] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -n*n*nnNfnNfNfNfnnnnNfnnnnn (GN) -3’ ; the second strand comprises 5’ - (E-VP) n*Nf*nnnnnNfnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand, wherein “E-VP” stand for (E) -vinylphosphonate nucleotide.

[0204] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -n*n*nnNfnNfNfNfnnnnNfnnnnn (GN) -3’ ; the second strand comprises 5’ - (E-VP) n*Nf*nNfnnnnnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*”  stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand, wherein “E-VP” stand for (E) -vinylphosphonate nucleotide.

[0205] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ - (GN) nnNfnNfnNfNfNfnnnnnnnn*n*n-3’ ; the second strand comprises 5’ - (E-VP) n*Nf*nNfnnnnnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand, wherein “E-VP” stand for (E) -vinylphosphonate nucleotide.

[0206] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ - (GN) nnnnNfnNfNfNfnNfnnnnnn*n*n-3’ ; the second strand comprises 5’ - (E-VP) n*Nf*nnnnnNfnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand, wherein “E-VP” stand for (E) -vinylphosphonate nucleotide.

[0207] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ - (GN) nnnnNfnNfNfNfnNfnnnnnn*n*n-3’ ; the second strand comprises 5’ - (E-VP) n*Nf*nNfnnnnnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand, wherein “E-VP” stand for (E) -vinylphosphonate nucleotide.

[0208] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ - (GN) nnnnNfnNfNfNfnnnnNfnnn*n*n-3’ ; the second strand comprises 5’ - (E-VP) n*Nf*nnnnnNfnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand, wherein “E-VP” stand for (E) -vinylphosphonate nucleotide.

[0209] In some embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ - (GN) nnnnNfnNfNfNfnnnnNfnnn*n*n-3’ ; the second strand comprises 5’ - (E-VP) n*Nf*nNfnnnnnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand, wherein “E-VP” stand for (E) -vinylphosphonate nucleotide.

[0210] In certain embodiments, the target gene of the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) , complement component C5 (C5) , Complement factor B (CFB) , PCSK9, TTR, AGT, LPA, Agtr1, ALK, VEGF, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL8, APOA, APOC3, ASGR1, CIDEB, COL1A1, COL3A1, CTGF, DGAT2, DMPK, DNAJC15 / MCJ, DPP4, Factor VIII, Factor X, Factor IX, Factor XI, Factor XII, GPR146, GPR75, GRB10 / 14, TLR7 / 8 / RIG-1, HSD17B13, INHBE, ITGV6, KHK, KLK1, MASP2, MTARC1, MUC5B, NPC1L1, PNPLA3, ASGR1, SCAP, SERPINA1, SERPINF2, SREBF2, HMGCR, TGFB1, COX-2, TP53, CD4, CD8,  CD40, CD71, DUX4, XDH, LDHA, ALDH2, DMD, EPHA2, KIF11, BCL2L12, APOA1, TRPV1, CASP2, KRAS, TMPRSS6, STAT3, PRDM14, PTGS2, CTGF, or DDIT4.

[0211] In certain embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ -n*n*nnNfnNfNfNfnNfnnnnnnnn (GN) -3’ ; the second strand comprises 5’ - (E-VP) n*Nf*nnnnnNfnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand, wherein “E-VP” stand for (E) -vinylphosphonate nucleotide; wherein the target gene the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) ; preferrably, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 96 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 97; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 16 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 17; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 150 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 151; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 32 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 33; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 100 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 101; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 110 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 111; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 134 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 135; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 136 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 137.

[0212] In certain embodiments, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, comprising a first strand and a second strand, wherein the first strand comprises 5’ - (GN) nnnnNfnNfNfNfnNfnnnnnn*n*n-3’ ; the second strand comprises 5’ - (E-VP) n*Nf*nnnnnNfnnnnnNfnNfn*Nf*n-3’ ; wherein “Nf” stands for a 2’ -fluoro modified nucleotide, and wherein “n” stands for a 2’ -O-methyl modified nucleotide; wherein “*” stands for phosphorothioate internucleotide linkage, wherein “GN” stand for the targeting ligand, wherein “E-VP” stand for (E) -vinylphosphonate nucleotide; wherein the target gene the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) ; preferrably, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 96 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 97; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 16 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 17; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 150 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 151; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 32 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 33; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 100 and the second strand has a nucleotide sequence represented by  SEQ ID NOs: 101; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 110 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 111; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 134 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 135; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 136 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 137.

[0213] In certain embodiments, the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*fGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUmGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 208) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NOs: 209) ; or

[0214] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 210) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 211) ; or

[0215] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 210) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; or

[0216] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 212) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 211) ; or

[0217] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 212) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; or

[0218] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGfGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 213) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; or

[0219] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 214) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 211) ; or

[0220] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 214) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; or

[0221] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 215) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 211) ; or

[0222] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 215) and the  second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; or

[0223] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*fGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUmUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 216) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; or

[0224] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 218) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 219) ; or

[0225] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 218) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; or

[0226] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 220) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 219) ; or

[0227] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 220) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; or

[0228] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCfGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 221) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; or

[0229] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 222) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 219) ; or

[0230] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 222) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; or

[0231] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 223) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 219) ; or

[0232] the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 223) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ;

[0233] wherein mA, mC, mG and mU represent 2'-O-methyl adenosine, cytidine, guanosine and uridine respectively; fA, fC, gG and fU represent 2'-fluoro adenosine, cytidine, guanosine or uridine,  respectively; “*” is a phosphorothioate internucleotide linkage, “ (E) -VP” is (E) -vinylphosphonate moiety at the 5′end, “GN” is the targeting ligand.

[0234] III. SIRNA CONJUGATES

[0235] A third aspect of the invention, the siRNA agent is coupled or conjugated with one or more targeting moieties In some instances, a targeting moiety is selected based on its ability to target the conjugate molecule described herein to a desired cel population, tissue, or an organ selectively or preferably. In some instances, the targeting moiety targets the cel, tissue, or an organ that expresses the coresponding binding partner (e.g., either the coresponding receptor or ligand) of the targeting moiety. For example, the polynucleotide molecule conjugated with N-acetyl galactosamine (GalNAc) can target hepatocytes expressing asialoglycoprotein (ASGP-R) . Any suitable GalNAc molecules that are known in the art to be used as a targeting moiety are contemplated. Exemplary GalNAc molecule includes a triantennary GalNAc (e.g., L96) .

[0236] In one aspect, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, wherein the siRNA agent is conjugated to the ligand.

[0237] In one aspect, the present invention provides a double-stranded RNA (dsRNA) agent capable of inhibiting the expression of a target gene, wherein the siRNA agent is conjugated to the ligand as shown in the following schematic: the ligand comprises (i) one or more N-acetyl galactosamine (GalNAc) moieties or derivatives thereof, and (ii) a linker, wherein the linker conjugates the at least one GalNAc moiety or derivative thereof to the nucleic acid, and (iii) a bicyclic group tethers GalNAc and siRNA, or (iv) a terta-functional group, wherein the GalNAc moieties tethers,

[0238] wherein X is O, S.

[0239] In one aspect, the is:

[0240] the is:

[0241] In one aspect, the siRNA agent is conjugated to the ligand as shown in the following schematic:

[0242] The tetra functional group is selected from:

[0243] In one aspect, the linker in the schematic is independently selected from:

[0244] (1) - (CH2) x-C (O) NH- (CH2) y-C (O) -;

[0245] (2) - (CH2) x-C (O) NH- (CH2) y-NHC (O) - (CH2) z-C (O) -;

[0246] (3) -NH- (CH2) y-C (O) -;

[0247] (4) –C (O) - (CH2) y-C (O) -;

[0248] wherein each linker in the schematic is optionally the same or different; the x, y and z are independently selected from 1-10; preferably the x and y are independently selected from 2-8, z is selected from 1-6; more preferably the x and y are independently selected from 3-6, z is selected from 1-4.

[0249] In one aspect, the siRNA agent is conjugated to the ligand as shown in the following schematic:

[0250] wherein: X is O or S.

[0251] In some embodiments, the target gene of the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) , complement component C5 (C5) , Complement factor B (CFB) , PCSK9, TTR, AGT, LPA, Agtr1, ALK, VEGF, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL8, APOA, APOC3, ASGR1, CIDEB, COL1A1, COL3A1, CTGF, DGAT2, DMPK, DNAJC15 / MCJ, DPP4, Factor VIII, Factor X, Factor IX, Factor XI, Factor XII, GPR146, GPR75, GRB10 / 14, TLR7 / 8 / RIG-1, HSD17B13, INHBE, ITGV6, KHK, KLK1, MASP2, MTARC1, MUC5B, NPC1L1, PNPLA3, ASGR1, SCAP, SERPINA1, SERPINF2, SREBF2, HMGCR, TGFB1, COX-2, TP53, CD4, CD8, CD40, CD71, DUX4, XDH, LDHA, ALDH2, DMD, EPHA2, KIF11, BCL2L12, APOA1, TRPV1, CASP2, KRAS, TMPRSS6, STAT3, PRDM14, PTGS2, CTGF, or DDIT4.

[0252] In certain embodiments, the target gene the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) .

[0253] In certain embodiments, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has sequence comprises at least 15 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides from any one of the nucleotide sequence of nucleotides 3123-3141, 5019-5037, 2304-2322, 494-512, 2643-2661, 2244-2262, 589-607, 2482-2500, or 4698-4716 of SEQ ID NO: 1; and the second strand comprising a nucleotide sequence that is at least partially complementary to the first strand.

[0254] In some embodiments, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20, 96, 16, 150, 32, 100, 110, 134, 136, respectively. In some embodiments, the second strand complementary to the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21, 97, 17, 151, 33, 101, 111, 135, 137, respectively.

[0255] In some embodiments, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 96 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 97; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 16 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 17; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 150 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 151; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 32 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 33; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 100 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 101; or the first strand has a nucleotide  sequence represented by SEQ ID NOs: 110 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 111; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 134 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 135; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 136 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 137.

[0256] In some embodiments, the double-stranded RNA (dsRNA) agent is as shown in the following schematic:

[0257] wherein the target gene the above-mentioned double-stranded RNA (dsRNA) agent is complement component C3 (C3) .

[0258] In some embodiments, the double-stranded RNA (dsRNA) agent is as shown in the following schematic:

[0259] wherein the first strand has sequence comprises at least 15 contiguous nucleotides differing by  no more than 3 nucleotides from any one of the nucleotide sequence of nucleotides 3123-3141, 5019-5037, 2304-2322, 494-512, 2643-2661, 2244-2262, 589-607, 2482-2500, or 4698-4716 of SEQ ID NO: 1; and the second strand comprising a nucleotide sequence that is at least partially complementary to the first strand. In some embodiments, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20, 96, 16, 150, 32, 100, 110, 134, 136, respectively. In some embodiments, the second strand complementary to the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21, 97, 17, 151, 33, 101, 111, 135, and 137, respectively. In preferred embodiments, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 96 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 97; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 16 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 17; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 150 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 151; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 32 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 33; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 100 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 101; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 110 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 111; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 134 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 135; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 136 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 137.

[0260] In some embodiments, the double-stranded RNA (dsRNA) agent is as shown in the following schematic:

[0261] wherein the first strand has sequence comprises at least 15 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides from any one of the nucleotide sequence of nucleotides 3123-3141, 5019-5037, 2304-2322, 494-512, 2643-2661, 2244-2262, 589-607, 2482-2500, or 4698-4716 of SEQ ID NO: 1; and the second strand comprising a nucleotide sequence that is at least partially complementary to the first strand. In some embodiments, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20, 96, 16, 150, 32, 100, 110, 134, 136, respectively. In some embodiments, the second strand complementary to the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21, 97, 17, 151, 33, 101, 111, 135, and 137, respectively. In preferred embodiments, the first strand of the double-stranded RNA (dsRNA) agent has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 96 and the second strand has a nucleotide sequence  represented by SEQ ID NOs: 97; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 16 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 17; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 150 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 151; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 32 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 33; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 100 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 101; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 110 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 111; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 134 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 135; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 136 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 137.

[0262] In certain embodiments, the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*fGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUmGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 224) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; or

[0263] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 226) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 227) ; or

[0264] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 226) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; or

[0265] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID N: 228) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 227) ; or

[0266] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 228) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; or

[0267] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGfGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 229) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; or

[0268] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 230) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 227) ; or

[0269] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 230) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; or

[0270] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 231) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 227) ; or

[0271] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 231) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; or

[0272] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*fGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUmUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 232) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; or

[0273] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 234) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 235) ; or

[0274] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 234) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; or

[0275] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 236) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 235) ; or

[0276] the first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 236) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; or

[0277] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCfGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 237) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; or

[0278] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 238) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 235) ; or

[0279] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 238) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; or

[0280] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 239) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 235) ; or

[0281] the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 239) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ;

[0282] wherein mA, mC, mG and mU represent 2'-O-methyl adenosine, cytidine, guanosine and uridine respectively; fA, fC, gG and fU represent 2'-fluoro adenosine, cytidine, guanosine or uridine, respectively; “*” is a phosphorothioate internucleotide linkage; “ (E) -VP” is (E) -vinylphosphonate moiety at the 5′end.

[0283] DEFINITIONS

[0284] Before the present invention is detailed below, it is to be understood that the present invention is not limited to the particular methodologies, protocols and reagents described herein, as those may vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing the particular embodiments only, and is not intended to limit the scope of the invention, which will be limited only by the appended claims. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the invention pertains.

[0285] For interpretation of the specification, the following definitions will be applied and wherever appropriate, terms used in the singular may also include the plural and vice versa. It is to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing specific embodiments only and is not intended to be limiting.

[0286] As used herein, the term “Complement Component 3, ” used interchangeably with the term “C3, ” refers to the well-known gene and polypeptide, also known in the art as ARMD9, C3a Anaphylatoxin, ASP, Complement Component C3a, C3a, Complement Component C3b, C3b, prepro-C3, Acylation-Stimulating Protein Cleavage Product, CPAMD1, Complement C3, C3 And PZP-Like Alpha-2-Macroglobulin Domain-Containing Protein 1, Complement Component C3, and AHUS5.

[0287] As used herein, “target sequence” refers to a contiguous portion of the nucleotide sequence of an mRNA molecule formed during the transcription of a complement component C3 gene, including mRNA that is a product of RNA processing of a primary transcription product. The target portion of the sequence will be at least long enough to serve as a substrate for iRNA-directed cleavage at or near that portion of the nucleotide sequence of an mRNA molecule formed during the transcription of a complement component C3 gene.

[0288] The terms "iRNA, " "RNAi agent, " "iRNA agent, " "RNA interference agent" as used interchangeably herein, refer to an agent that contains RNA as that term is defined herein, and which mediates the targeted cleavage of an RNA transcript via an RNA-induced silencing complex (RISC) pathway. iRNA directs the sequence-specific degradation of mRNA through a process known as RNA interference (RNAi) . The iRNA modulates, e.g., inhibits, the expression of a C3 gene in a cell, e.g., a cell within a subject, such as a mammalian subject.

[0289] The term “mRNA (messenger RNA) ” refers to an RNA molecule which acts as a template for in vivo protein translation transferring gene encoding information from DNA to protein product. The terms “RNA interference” or “RNAi” refer to a phenomenon of post-transcriptional regulation of gene expression in organisms. This phenomenon is induced by specific degradation of target mRNA mediated by single-stranded or double-stranded RNA. For details of RNAi regulation  mechanism, please refer to the descriptions in Biotech. Adv. 2008, 26 (3) : 202-and other literatures.

[0290] In the present invention, unless otherwise specified, the terms “small interference / small interfering RNA” or “siRNA” refer to an RNA molecule which can sequence-specifically induce RNAi phenomenon, consists of two single-stranded RNAs with a length of 15-27 nucleotides, and has a partially or completely complementary double-stranded structure. In the siRNA according to the present invention, the length of the complementary double-stranded structure may be 16-25, 17-22 or 18-21 base pairs. The siRNA according to the present invention may be a blunt ended double-stranded RNA structure consisting of two single-stranded RNAs with a length of 15-27 nucleotides, or may also be a structure which has 3′protruding end (s) consisting of 1-3 consecutive nucleotides at at least one end of the double-stranded structure.

[0291] In the present invention, unless otherwise specified, the terms “first single strand” or “sense strand” refer to one of the two single strands of the siRNA, which has a nucleotide sequence partially or completely the same as the nucleotide sequence of the action site of the siRNA in the target mRNA; while the terms “second single strand” or “antisense strand” refer to the other single strand of the two single strands of the siRNA, which has a nucleotide sequence partially or completely complementary to the nucleotide sequence of the action site of the siRNA in the target mRNA. The first single strand (or sense strand) and the corresponding second single strand (or antisense strand) of the siRNA mentioned in the present invention may form a partially or completely complementary double-stranded structure.

[0292] “Complementary” sequences, as used herein, can also include, or be formed entirely from, non-Watson-Crick base pairs and / or base pairs formed from non-natural and modified nucleotides, in so far as the above requirements with respect to their ability to hybridize are fulfilled. Such non-Watson-Crick base pairs include, but are not limited to, G: U Wobble or Hoogsteen base pairing.

[0293] In the present invention, unless otherwise specified, the terms “suppress / suppressing, inhibit / inhibiting” refer to the circumstance that mRNA degradation mediated by siRNA or other small-interfering nucleic acid (siNA) inhibitors results in significant down-regulation of target gene expression. The “significant down-regulation” refers to the circumstance that target gene expression reduces by 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%or 99%or more, or 100%compared with normal level or the level before treatment.

[0294] The phrase “contacting a cell with an RNAi agent, ” such as a dsRNA, as used herein, includes contacting a cell by any possible means. Contacting a cell with an RNAi agent includes contacting a cell in vitro with the RNAi agent or contacting a cell in vivo with the RNAi agent. The contacting may be done directly or indirectly. Thus, for example, the RNAi agent may be put into physical contact with the cell by the individual performing the method, or alternatively, the RNAi agent may be put into a situation that will permit or cause it to subsequently come into contact with the cell. Contacting a cell in vitro may be done, for example, by incubating the cell with the RNAi agent. Contacting a cell in vivo may be done, for example, by injecting the RNAi agent into or near the tissue where the cell is located, or by injecting the RNAi agent into another area, e.g., the central nervous system (CNS) , optionally via intrathecal, intravitreal or other injection, or to the bloodstream or the subcutaneous space, such that the agent will subsequently reach the tissue where the cell to be contacted is located.

[0295] “G” , “C” , “A” and “U” each generally stand for a nucleotide that contains guanine, cytosine, adenine, and uracil as a base, respectively. However, it will be understood that the term  “ribonucleotide” or “nucleotide” can also refer to a modified nucleotide, as further detailed below, or a surrogate replacement moiety. The skilled person is well aware that guanine, cytosine, adenine, and uracil may be replaced by other moieties without substantially altering the base pairing properties of an oligonucleotide comprising a nucleotide bearing such replacement moiety.

[0296] The chemical modification of the siRNA conducted by the present invention may be one chemical modification or a combination of more than one chemical modification selected from the following:

[0297] 1) modification of phosphodiester bond connecting nucleotide residues in the backbone structure of the RNA strands;

[0298] 2) modification of ribose in the backbone structure of the RNA strands;

[0299] 3) modification of base in the nucleotide residue of the RNA.

[0300] The naturally occurring internucleoside linkage of siRNA is a 3′to 5′phosphodiester linkage. RNA strands having one or more modified, i.e. non-naturally occurring, internucleoside linkages are often selected over RNA strands having naturally occurring internucleoside linkages because of desirable properties such as, for example, enhanced cellular uptake, enhanced affinity for target nucleic acids, and increased stability in the presence of nucleases.

[0301] Oligonucleotides having modified internucleoside linkages include internucleoside linkages that retain a phosphorus atom as well as internucleoside linkages that do not have a phosphorus atom. Representative phosphorus containing internucleoside linkages include, but are not limited to, phosphodiesters, phosphotriesters, methylphosphonates, phosphoramidate, and phosphorothioates.

[0302] The RNAi agent can comprise a phosphorus-containing group at the 5’ -end of the sense strand or antisense strand. The 5’ -end phosphorus-containing group can be 5’ -end phosphate (5’ -P) , 5’ -end phosphorothioate (5’ -PS) , 5’ -end phosphorodithioate (5’ -PS2) , 5’ -end vinylphosphonate (5’ -VP) , 5’ -end methylphosphonate (MePhos) , or 5’ -deoxy-5’ -C-malonyl) . When the 5’ -end phosphorus-containing group is 5’ -end vinylphosphonate (5’ -VP) , the 5’ -VP can be either 5’ -E-VP isomer sphate, isomer (i.e., cis-vinylphosphate) , or mixtures thereof.

[0303] In the present invention, RNAi agent comprise one or more modified internucleoside linkages. In certain embodiments, the modified internucleoside linkages are phosphorothioate linkages. In certain embodiments, RNAi agent comprise a 5’ -E-VP in the second strand.

[0304] In the present invention, the modification of ribose group refers to modification of 2′-hydroxy (2′-OH) in the ribose group. Upon introducing certain substituents such as methoxy or fluoro at 2′-hydroxy position of the ribose group, ribonuclease in serum cannot easily digest nucleic acid, thereby improving the stability of the nucleic acid and allowing the nucleic acid to have stronger resistance against nuclease hydrolysis. The modification of 2′-hydroxy in the pentose of the nucleotide includes 2′-fluoro modification, 2′-methoxy modification, 2′-methoxyethoxy modification, 2′-2, 4-dinitrophenol modification (2′-DNP modification) , locked nucleic acid modification (LNA modification) , 2′-amino modification, 2′-deoxy modification, etc.

[0305] In the present invention, the modification of base refers to modification of the base in the nucleotide group. For example, 5′-bromo-uracil modification and 5′-iodo-uracil modification with bromine or iodine being introduced at 5-position of uracil are common modification methods for base. Modifications such as N3-methyl-uracil modification, 2, 6-diaminopurine modification are also available.

[0306] In certain embodiments, the double stranded RNAi agent further comprises a targeting ligand that targets a liver tissue. In certain embodiments, the targeting ligand is a GalNAc conjugate. In  certain embodiments, the GalNAc conjugate is one or more GalNAc derivatives, optionally conjugated to the double stranded RNAi agent via a linker or carrier, one or more GalNAc derivatives, optionally conjugated to the double stranded RNAi agent via a linker or carrier.

[0307] In some embodiments, the conjugate comprises one or more GalNAc derivatives. The GalNAc derivatives may be attached via a linker, e.g., a bivalent or trivalent branched linker. In some embodiments the GalNAc conjugate is conjugated to the 3’ end of the sense strand. In some embodiments, the GalNAc conjugate is conjugated to the iRNA agent (e.g., to the 3’ end of the sense strand) via a linker, e.g., a linker as described herein. In some embodiments the GalNAc conjugate is conjugated to the 5’ end of the sense strand. In some embodiments, the GalNAc conjugate is conjugated to the iRNA agent (e.g., to the 5’ end of the sense strand) via a linker, e.g., a linker as described herein.

[0308] In certain embodiments of the invention, the GalNAc or GalNAc derivative is attached to an iRNA agent of the invention via a monovalent linker. In some embodiments, the GalNAc or GalNAc derivative is attached to an iRNA agent of the invention via a bivalent linker. In yet other embodiments of the invention, the GalNAc or GalNAc derivative is attached to an iRNA agent of the invention via a trivalent linker. In other embodiments of the invention, the GalNAc or GalNAc derivative is attached to an iRNA agent of the invention via a tetravalent linker.

[0309] One RNA single strand of the siRNA of the present invention may be synthesized by solid-phase or liquid-phase nucleic acid synthesis method. These methods comprise four process steps: 1) oligonucleotide synthesis; 2) deprotection; 3) purification and separation; and 4) desalination. The technical details of the four steps are well known to those skilled in the art, and thus will not be described in detail herein.

[0310] In addition to chemical synthesis, the siRNA of the present invention may also be obtained from expression of plasmid and / or virus vector. For example, design a DNA sequence with a length of 50-90 nucleotides, and add two different restriction enzyme cutting sites at its two ends, BamHI and EcoRI restriction sites for instance. The middle-segment sequence of the RNA transcript encoded by the designed DNA may form a loop structure, and the sequences at the two ends of the loop after the U-turn may form a complementarily paired double-stranded structure. By cloning technology, the designed DNA is inserted into an expression vector digested by the corresponding restriction enzyme. The expression vector is introduced into cells, and the RNA transcript generated from the designed DNA sequence may be processed into mature siRNA by cell's inherent siRNA processing mechanism. Thereby, siRNA may be expressed temporarily or stably in cells.

[0311] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the RNAi agents and methods featured in the invention, suitable methods and materials are described below. All publications, patent applications, patents, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. In addition, the materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting.

[0312] EXAMPLES

[0313] The present invention will be illustrated in conjunction with the Examples hereinafter. Where  the source of a reagent and other experimental materials is not specifically given herein, such reagent and other experimental materials can be obtained from any supplier of reagents for molecular biology at a quality / purity standard for application in molecular biology.

[0314] Example 1. Design of small interfering nucleotide of human derived C3 gene

[0315] The nucleotide sequences of 19 bp are selected from the mRNA sequence of human derived C3 gene in the range of 1-5231 bp, whose sequence is relatively conservative (the accession number in Genbank is NM_000064, SEQ ID NO: 1) .

[0316] In Table 1, the sequences of the sense strand and the complementary antisense strand of each siRNA are listed, respectively. To be specific, for example, the first strand (sense strand) of siRNA C3-1 has a sequence represented by SEQ ID NO: 2 which is the same as the corresponding target site sequence in the C3 mRNA sequence; and the second strand (antisense strand) has a sequence represented by SEQ ID NO: 3 which is complementary to the corresponding target site sequence in the C3 mRNA sequence. The sequences of the two single strands of each of the other siRNAs are numbered successively in the same way as applied to siRNA C3-1.

[0317] TABLE 1

[0318] Example 2 Verification of the inhibitory effect of the siRNAs on the expression of C3 gene

[0319] The designed siRNA in Table 2A were chemically synthesized by Thermo Fisher Scientific Inc. or GenScript. Complementary oligoribonucleotides may be annealed following the method  described in “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” to form a double-stranded RNA.

[0320] TABLE 2A

[0321] (1) HepG2 Cell Culture

[0322] HepG2 cells were transfected using the custom designed silencer siRNA library (C3) . RQ values were normalized to an empty RNAiMAX transfected HepG2 cells. The assay was run in triplicates of each sample and / or probe. (n=3)

[0323] (2) Methods for HepG2 cell transfection

[0324] A day prior to transfection, 17, 000 cells / well of HepG2 parental cells were plated in a 96-well tissue culture treated plate. siRNA transfections were prepared using 20 nM of siRNA with 0.3 RNAiMAX reagent per well using the LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Kit (Catalog #13778030) . Cells were harvested and analyzed via RT-qPCR 72 hours post transfection. RNA was isolated from the siRNA treated and untreated cells. RNA was extracted using the  Gene Expression Cells-to-Ct Kit (#4399002) . The generated cDNA was used as template for qPCR reaction using  Gene Expression Master Mix and Custom  gene expression assay probes specific for the target genes, Beta-Actin (Hs01060665_g1) , Human C3  (Hs00163811_m1) . Beta-Actin was used as endogenous control. Samples were run on Quant StudioTM 12K Flex real-time PCR system. Data was analyzed using the comparative CT method as shown in the Table 2B and Figure 1.

[0325] Relative C3 mRNA (%) = 2 - (sample ΔCt (Ct of C3-Ct of house keeping gene) -Mock ΔCt (Ct of C3-Ct of house keeping gene) ) X 100%

[0326] The results demonstrate that the exemplary siRNA agents tested effectively reduce the level of the human C3 messenger RNA.

[0327] Table 2B

[0328] Example 3. C3 mRNA knockdown efficacy in HepG2 cells transfected with 0.128 pM -100 nM selected siRNA (dose-response-curve experiment) .

[0329] C3 knockdown efficacy of selected siRNAs, C3-8-dTdT, C3-10-dTdT, C3-16-dTdT, C3-48-dTdT, C3-50-dTdT, C3-55-dTdT, C3-67-dTdT, C3-68-dTdT, and C3-75-dTdT was determined after transfection of 0.128 pM–100 nM siRNA in HepG2 cells. The siRNA sequence information is shown in Table 2A. Results are presented in Figure 2A. All siRNAs showed a dose-dependent knockdown of C3 mRNA after transfection. The most potent siRNAs were C3-48-dTdT, C3-16-dTdT, C3-8-dTdT at 100 nM as shown in Figure 2B.

[0330] Methods for HepG2 cell transfection

[0331] Cells were seeded at a density of 13, 300 cells  / well in 96 well clear F-bottom TC-treated plates (VWR #734-2327) . Transfection of siRNAs was performed with LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagent (Invitrogen life technology) according to the manufacturer’s protocol. Dose-response experiments were done with C3 siRNAs in 8 concentrations starting at 100 nM in 5-fold dilution to 0.128 pM. Mock is no-siRNA treated cells.

[0332] After 72 hours post transfection, RNA was extracted with DynabeadsTM mRNA DIRECTTMPurification Kit (Invitrogen life technology) , according to the manufacturer’s protocol. Briefly, 100 uL of lysis buffer was added to cells after removing the media from the cells. Put the cell culture plate in a shaker with a 300 rpm for 30 mins at room temperature. Dynabeads were added then to purify mRNA in the lysate. Following RNA extraction, reverse transcription was done immediately by SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen life technology) . C3 and TBP mRNAs were determined by a Quantstudio 5 real time PCR system (Invitrogen life technology) , with TaqMan  qPCR primers, C3-FAM (Assay ID: Hs00163811_m1) and TBP-VIC (Assay ID: Hs00427620_m1) . The activity of a given C3 siRNA was presented as percent remaining C3 mRNA normalized to TBP mRNA in the treated cells, related to the C3 mRNA normalized to TBP mRNA in the no-siRNA treated cells (mock) . Dose-response curves were made with GraphPad Prism version 9 using a four-parameter logistic model. The data shown in Figures 2A and 2B is from three biological replicates. Data from Figure 2B is from 0.16 nM and 100 nM data in Figure 2A.

[0333] Example 4. Chemical modification of siRNA

[0334] In order to reinforce the stability of small interfering nucleotide and improve the hepatic targeting of pharmaceutical administration, chemical modification design is carried out for the small interfering nucleotide C3-8, C3-10, C3-16, C3-48, C3-50, C3-55, C3-67, C3-68, and C3-75 of human derived C3 gene and the principles for design are as followed, the nucleotides being numbered consecutively starting with nucleotide number 1 at the 5’ end of the first single strand or second single strand.

[0335] Modification patterns for the first single strand (Sense Strand) :

[0336] SS7: The pentose of the nucleotide residue at 7th, 9th, 10th and 11th positions were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 8th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0337] SS1: The pentose of the nucleotide residue at 3rd, 5th, 7th, 8th and 9th positions were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0338] SS2: The pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 11th positions were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0339] SS3: The pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 14th positions were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0340] Modification patterns for the second single strand (Antisense Strand) :

[0341] AS8: The pentose of the nucleotide residue at 2nd, 6th, 8th, 9th, 14th and 16th positions were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 7th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th, 18th and 19th positions were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0342] AS4: The pentose of the nucleotide residue at 2nd, 10th, 14th, 16th and 18th positions were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0343] AS5: The pentose of the nucleotide residue at 2nd, 8th, 14th, 16th and 18th positions were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions were modified by means of 2′-methoxy  modification.

[0344] AS6: The pentose of the nucleotide residue at 2nd, 4th, 14th, 16th and 18th positions were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions were modified by means of 2′-methoxy modification.

[0345] The siRNA comprises the modification patterns with SS7 / AS8, SS1 / AS4, SS1 / AS5, SS1 / AS6, SS2 / AS4, SS2 / AS5, SS2 / AS6, SS3 / AS4, SS3 / AS5, or SS3 / AS6.

[0346] Phosphorothioates (*indicates phosphorothioate in Table 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F) were introduced between the last 3 nucleotides at the 5'-ends and 3'-ends of the second single strand (antisense strand) . Phosphorothioates were also introduced between the last 3 nucleotides at the 5'-end or 3'-end of the first single strand (sense strand) . (E) -vinylphosphonate ( “ (E) -VP” indicates the (E)-vinylphosphonate in Table 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F) was used at the 5’ end of the second single strand (antisense strand) .

[0347] “GN” in Table 3A, 3B and 3C is the targeting ligand comprised of N-acetyl-galactosamine (GalNAc) .

[0348] The modified siRNA C3-144 to C3-152 comprise the modification patterns SS7 / AS8. The information for the sequences of the modified siRNA C3-144 to C3-152 are shown in Table 3A. The modified siRNA C3-104 to C3-113 comprise the modification patterns SS1 / AS6, SS2 / AS5, SS2 / AS6, SS3 / AS5, SS3 / AS6. The information for the sequences of the modified siRNA C3-104 to C3-113 are shown in Table 3B. The modified siRNA C3-114 to C3-123 comprise the modification patterns SS1 / AS6, SS2 / AS5, SS2 / AS6, SS3 / AS5, SS3 / AS6. The information for the sequences of the modified siRNA C3-114 to C3-123 are shown in Table 3C.

[0349] TABLE 3A

[0350] TABLE 3B

[0351] TABLE 3C

[0352] Specifically, GalNAc-1, GalNAc-3 and GalNAc-7 are conjugated to dsRNA for in vitro and in vivo screening. The siRNA agent is conjugated to GalNAc-1, GalNAc-3 and GalNAc-7 as shown in the following schematic:

[0353] The modified siRNA C3-95 to C3-103 comprise the modification patterns SS7 / AS8. The information for the sequences of the modified siRNA C3-95 to C3-103 are shown in Table 3D. The modified siRNA C3-124 to C3-133 comprise the modification patterns SS1 / AS6, SS2 / AS5,  SS2 / AS6, SS3 / AS5, SS3 / AS6. The information for the sequences of the modified siRNA C3-124 to C3-133 are shown in Table 3E. The modified siRNA C3-134 to C3-143 comprise the modification patterns SS1 / AS6, SS2 / AS5, SS2 / AS6, SS3 / AS5, SS3 / AS6. The information for the sequences of the modified siRNA C3-134 to C3-143 are shown in Table 3F.

[0354] TABLE 3D

[0355] TABLE 3E

[0356] TABLE 3F

[0357] The small interfering nucleotides with chemical modification are synthesized by Wuxi AppTec. The targeting ligand (GalNAc) could be conjugated to the 3’ end or the 5’ end of oligonucleotide as a single piece (triantennary) or step by step in the form of 1+1+1 trivalent. To realize triantennary GalNAc conjugation or the 1+1+1 assembly, GalNAc amidite and / or GalNAc solid support should be synthesized, respectively. The GalNAc amidite and / or GalNAc solid support then were used in  the solid phase oligonucleotide synthesis as building blocks.

[0358] GalNAc-conjugated phosphoramidites:

[0359] The synthesis of all GalNAc-conjugated phosphoramidites followed the procedures described in Example 5.

[0360] GalNAc-conjugated succinate and loading to solid support:

[0361] The synthesis of GalNAc-conjugated succinate and loading to solid support was following the procedures described in Example 5.

[0362] General procedure for siRNA preparation:

[0363] 1. Loading: GalNAc-or nucleoside-preloaded CPG (0.19 g, 500A, ～10 μmol) in 5 mL syringe.

[0364] 2. Washing: acetonitrile (2.0 mL, 0.3 min, repeated two times, at room temperature) .

[0365] 3. Detritylation: 3%trichloroacetic acid in dichloromethane (2.0 mL, 0.7 min, repeated four times, at room temperature) .

[0366] 4. Washing: acetonitrile (2.0 mL, 0.3 min, repeated two times, at room temperature) .

[0367] 5. Coupling: 0.067 M reactant monomer in acetonitrile (1.0 mL) and 0.30 M 5- (Benzylthio) -1H-tetrazole (BTT) in acetonitrile (1.0 mL) as activator (7.0 min, repeated three times, at room temperature)

[0368] 6. Sulfurization or oxidation: N, N-Dimethyl-N'- (3-thioxo-3H-1, 2, 4-dithiazol-5-yl) methanimidamide (DDTT, 4.80 M, in pyridine / acetonitrile = 2 / 1, 2.0 mL, 1 min, two times, at room temperature) or 0.05 M I2 in pyridine / H2O = 80 / 20 (v / v) (2.0 mL, 1 min, two time, at room temperature) .

[0369] 7. Capping: 1-Methylimidazole (NMI)  / acetonitrile = 15 / 85 (v / v) (2.0 mL) and acetic anhydride  / acetonitrile = 20 / 80 (v / v) (0.9 mL, 1 min, one time, at room temperature) .

[0370] 8. Washing: acetonitrile (2.6 mL, 0.3 min, repeated two times, at room temperature) .

[0371] 9. The synthesis program was automatically circulated 19 times.

[0372] 10. The solid support was immersed in 10%DEA for 20 min. The solid support was suspended in NH3·H2O (5 mL) and stirred at 40 ℃ for 16 h in a 48 mL sealed tube. The reaction mixture was allowed to cool to 25 ℃. Then the solid support was filtered and the aqueous phase was concentrated in vacuum to give a yellow solution.

[0373] 11. 40 mL ethanol was added to the filtrate (10 mL) , then followed by adding 0.3 mL NaCl (3M) . The centrifuge tube was standing for 20 mins at -20 ℃. Then the tube was centrifuged. The supernatant liquid was discarded and the remaining solid was collected.

[0374] 12. The white solid was purified by prep-HPLC (column: O-C18 150*40 mm *10 μm; mobile phase: [0.1 M TEAB-ACN] ; B%: 14%-24%, 30 min) .

[0375] 13. The desired compound was obtained as a white solid after lyophilization.

[0376] Annealing steps:

[0377] 1. Calculate the mole value of duplex (for example, 2 mg of duplex, the mole value = 2 mg / duplex M.W., free acid) , which is the single strand mole value.

[0378] 2. Dissolve the sense strand and antisense strand in ultrapure water (DNase / RNase-free, sterile) at 25 ℃, respectively. The concentration of oligos was quantified by UV-vis.

[0379] 3. Mix the two solutions with molar ratio of 1: 1.

[0380] 4. Placed the mixed samples at room temperature for 10 min. Test by HPLC to monitor whether the ratio was appropriate.

[0381] 5. Aliquot the solution into tubes and lyophilize to give the siRNA samples.

[0382] Example 5. Chemical synthesis of GalNAc ligands.

[0383] Compound 1-2:

[0384] Compound 1-1 (5 g, 12.84 mmol) in anhydrous 1, 2-dichloroethane (30 mL) was stirred at 0 ℃, TMSOTf (3.43 g, 15.41 mmol, 2.78 mL) was added dropwise under constant stirring over 10 min, and the stirring was continued overnight at room temperature. The reaction mixture was quenched with cold saturated NaHCO3 solution (200 mL) , and the organic layer was separated. The product was extracted with dichloromethane (60mLx2) ; the combined organic layers were washed with water and brine, dried over anhydrous Na2SO4, and evaporated to dryness under reduced pressure to obtain compound 1-2 (4.23 g, 99%yield) as a yellow oil, which was used without further purification.

[0385] Mass calc. for C14H19NO8: 329.1; found: 330.1 [M+H] +, ESI.

[0386] Compound 1-3:

[0387] Compound 1-2 (4.23 g, 12.85 mmol) in anhydrous 1, 2-dichloroethane (20 mL) was stirred with  molecular sieves (4.7 g) for 5 min at room temperature. 5-Hexen-1-ol (1.42 g, 14.13 mmol) was added and stirring was continued for 30 min. TMSOTf (1.43 g, 6.42 mmol, 1.16 mL) was added dropwise at 0 ℃ and the stirring was continued for 2 h at room temperature. The reaction mixture was quenched with cold saturated NaHCO3 solution (100 mL) , and the organic layer was separated. The product was extracted with dichloromethane (60mLx2) ; the combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous Na2SO4, and evaporated to dryness under reduced pressure to obtain compound 1-3 (5.5 g, 99%yield) as a yellow oil, which was used without further purification.

[0388] Mass calc. for C20H31NO9: 429.2; found: 430.2 [M+H] +, ESI.

[0389] Compound 1-4:

[0390] To a solution of compound 1-3 (5.5 g, 12.81 mmol) in DCM (35 mL) and MeCN (35 mL) was added 4.0 mol equiv. of sodium (meta) periodate (10.96 g, 51.24 mmol) in water (45.5 mL) . The mixture was cooled to 0 ℃ in an ice bath and stirred for 15 min. Ruthenium chloride trihydrate (110.5 mg, 423 μmol) was added to the cold reaction mixture. The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 h. The reaction mixture was diluted with water (90mL) , and the pH was adjusted to 7.5 by adding solid NaHCO3. The DCM layer was removed, the aqueous layer was washed with DCM (30mLx2) , and organic extracts were discarded. pH of the aqueous layer was adjusted to 3 by addition of citric acid, and the carboxylic acid 1-4 was extracted into DCM (50mLx3) . The organic  layer was stirred with saturated brine (50mLx1) followed by drop-wise addition of Na2S2O3 solution (50mLx1) until the dark green organic phase turned to a pale-yellow color. The layers were separated, and the organic layer was dried over anhydrous Na2SO4 and evaporated under reduced pressure to afford compound 1-4 as a white solid (2.3 g, 40%yield) . which was used without further purification.

[0391] Mass calc. for C19H29NO11: 447.2; found: 448.2 [M+H] +, ESI.

[0392] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.81 (d, J = 9.2Hz, 1H) , 5.84-5.73 (m, 1H) , 5.21 (d, J = 3.3 Hz, 1H) , 4.98-4.93 (m, 3H) , 4.48 (d, J = 8.5 Hz, 1H) , 4.04-4.00 (m, 3H) , 3.88-3.83 (m, 1H) , 3.73-3.68 (m, 1H) , 3.40-3.36 (m, 1H) , 2.10 (s, 3H) , 2.03-2.02 (m, 2H) , 2.00 (s, 3H) , 1.89 (s, 3H) , 1.76 (s, 3H) , 1.43-1.32 (m, 4H) .

[0393] Compound 1-6:

[0394] To a solution of compound 1-5 (1.16 g, 6.17 mmol) and the acid 1-4 (2.3 g, 5.14 mmol) in DMF (30 mL) were added HBTU (2.92 g, 7.71 mmol) and DIPEA (1.99 g, 15.42 mmol, 2.69 mL) . The reaction was stirred for 43 h at room temperature and diluted with water (150mL) . The mixture was extracted with ethyl acetate (60mLx3) . The combined organic layers were washed consecutively with water (100mLx3) and brine (100 mL) . After drying over anhydrous Na2SO4, the solvent was evaporated under reduced pressure to obtain the compound 1-6 as a yellow oil (4.3 g, crude) , which was used without further purification.

[0395] Mass calc. for C29H48N2O12: 616.3; found: 617.4 [M+H] +, ESI.

[0396] Compound 1-7:

[0397] Compound 1-6 (4.23 g, assuming 6.86 mmol) was added to formic acid (30 mL) , the mixture was stirred at room temperature overnight. The reaction was completed by LC-MS monitoring. The mixture was then evaporated under reduced pressure and purified by silica gel chromatography (DCM: MeOH = 10: 1) to obtain the compound 1-7 as a yellow oil (2.88 g, 75%yield over 2 steps) . Mass calc. for C25H40N2O12: 560.3; found: 561.3 [M+H] +, ESI.

[0398] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ12.02 (s, 1H) , 7.83 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 7.25 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 5.21 (d, J = 3.2 Hz, 1H) , 4.96 (dd, J = 11.2, 3.6 Hz, 1H) , 4.47 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 4.04-4.00 (m, 3H) , 3.90-3.83 (m, 1H) , 3.73-3.68 (m, 1H) , 3.42-3.36 (m, 1H) , 3.02-2.97 (m, 1H) , 2.18 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.10 (s, 3H) , 2.02 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.99 (s, 3H) , 1.89 (s, 3H) , 1.77 (s, 3H) , 1.54-1.41 (m, 7H) , 1.27-1.21 (m, 3H) .

[0399] Compound 2-1:

[0400] A mixture of 2, 2-bis (bromomethyl) propane-1, 3-diol (270 g, 1.03 mol) , benzaldehyde (114.86 g, 1.08 mol) , TsOH (17.74 g, 340.55 mmol) in toluene (1 L) was refluxed for 6 h. The mixture was cooled and extracted with EA (1 L) , washed with NaHCO3 solution, then washed with brine, dried over Na2SO4. The solvent was removed under reduced pressure, and the residue was recrystallized by MeOH to give desired product 2-1 (247 g, 68%yield) .

[0401] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.47-7.41 (m, 2H) , 7.40-7.36 (m, 3H) , 5.48 (s, 1H) , 4.09-3.93 (m, 6H) , 3.46 (s, 2H) .

[0402] Compound 2-2:

[0403] To a suspension of t-BuOK (137.27 g, 1.43 mol) in dry DMF (700 mL) , diisopropyl malonate (268.85 g, 1.43 mol) was added dropwise (the temperature being maintained below 70℃) followed by adding compound 2-1 (250 g, 714.19 mmol) . The resulting reaction mixture was heated at 140℃ for 6 h. After cooled, saturated NH4Cl solution (1.5 L) was added, and the mixture was extracted with hexanes (500 mLx3) . The combined organic extracts were dried over sodium sulfate and concentrated in vacuo. A solid product was separated from the liquid residue by filtration, washed with hexane (100 mLx2) and dried to yield pure product 2-2 as a white solid (194 g, 68%yield) . Mass calc. for C21H28O6: 376.2; found: 377.2 [M+H] +, ESI.

[0404] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.45-7.31 (m, 5H) , 5.45 (s, 1H) , 5.02-4.93 (m, 2H) , 3.96 (d, J =11.2 Hz, 2H) , 3.77 (d, J = 11.1 Hz, 2H) , 2.55 (s, 2H) , 2.13 (s, 2H) , 1.23-1.15 (m, 12H) .

[0405] Compound 2-3:

[0406] To a solution of compound 2-2 (155 g, 411.7 mmol) in MeOH (750 mL) , 10%Pd / C (31 g) was added, and the resulting suspension was hydrogenated under 5 atm H2 at ambient temperature upon stirring for 48 h. Filtration of the catalyst and removal of the solvent in vacuo was to yield compound 2-3 as a colorless oil (118 g, 99%yield) , which was used in the next step without further purification. Mass calc. for C21H28O6: 288.2; found: 289.4 [M+H] +, ESI.

[0407] Compound 2-4:

[0408] To a solution of compound 2-3 (140 g, 485.5 mmol) in dichloromethane (840 mL) , mesyl chloride (155.7 g, 1.36 mol) was added. The resulting mixture was cooled to -30 ℃, then triethylamine (323.9 g, 3.2 mol) was added dropwise. After the addition was complete, the reaction mixture was warmed to ambient temperature and stirred for 12 h, then washed with water (1000 mL) , 10%aqueous citric acid (1000 mL) and brine (1000 mL) . The organic phase was dried over sodium sulfate and evaporated at reduced pressure to give compound 2-4 (125 g, 58%yield) .

[0409] Mass calc. for C21H28O6: 444.1; found: 445.2 [M+H] +, ESI.

[0410] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 5.02-4.93 (m, 2H) , 4.20 (s, 4H) , 3.23 (s, 6H) , 2.45 (s, 4H) , 1.22-1.14 (m, 12H) .

[0411] Compound 2-5:

[0412] A solution of compound 2-4 (63 g, 141.73 mmol) , potassium carbonate (100.88 g, 729.89 mmol) , and p-toluenesulfonamide (25.48 g, 148.81 mmol) in DMSO (300 mL) was heated at 85℃ for 12 h. After cooled, water (300 mL) was added, and the mixture was extracted with EtOAc (600 mL) . The combined organic phases were washed with 10%aqueous citric acid (600 mL) and brine (600 mL) , dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo, then recrystallization with isopropyl ether to yield compound 2-5 (48 g, 80%yield) .

[0413] Mass calc. for C21H28O6 423.2; found: 424.2 [M+H] +, ESI.

[0414] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.67 (d, J = 8.2 Hz, 2H) , 7.45 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 4.45 (t, J = 5.4 Hz, 2H ) , 3.60 (s, 4H) , 3.14 (d, J = 5.7 Hz, 4H) , 2.43 (s, 3H) , 1.67 (s, 4H) .

[0415] Compound 2-6:

[0416] To a solution of compound 2-5 (58.7 g, 138.60 mmol) in THF (100 mL) , a solution of lithium borohydride (2 M) in THF (263.82 mL) was added at -20 ℃. The resulting mixture was stirred at room temperature for 16 h. The mixture was slowly added to ice water (1 L) . pH was adjusted to 7 with citric acid aqueous solution. The mixture was extracted with EA (500 mL) , dried with anhydrous sodium sulfate and evaporated at reduced pressure to give compound 2-6 (40 g, 93%yield) .

[0417] Mass calc. for C21H28O6: 311.1; found: 312.1 [M+H] +, ESI.

[0418] 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 7.67 (d, J = 8.2 Hz, 2H) , 7.45 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 4.45 (t, J =5.4 Hz, 2H ) , 3.60 (s, 4H) , 3.14 (d, J = 5.7 Hz, 4H) , 2.43 (s, 3H) , 1.67 (s, 4H) .

[0419] Compound 2-7:

[0420] Compound 2-6 (5g, 16.1 mmol) and Mg (powder, 3.47g, 144.6mmol) were mixed in MeOH (anhydrous, 60 mL) and stirred overnight at rt. LC-MS suggested full conversion, and water (30 mL) was added. A white precipitate formed. The mixture was filtered, and the filtrate was adjusted to pH 6 by HCl (aq. 4M) , and concentrated to dryness to give compound 2-7 (2.55 g crude) as a yellow solid. The crude product was used without further purification.

[0421] Mass calc. for C8H15NO2: 157.1; found: 158.1 [M+H] +, ESI.

[0422] Compound 2-8:

[0423] Compound 2-7 (2.55 g, assuming 16.2 mmol) was dissolved in dioxane (20 mL) , and FmocCl (4.60 g, 17.8 mmol) was added slowly at 0℃, followed by Na2CO3 (saturated, 20 mL) . The reaction was stirred at 30℃ for 3 h. LC-MS suggested full conversion. The reaction mixture was extracted by  EA (20 mLx3) . The organic phase was concentrated and purified by flash column chromatography on silica gel (DCM: MeOH =97: 3) to give a white solid 2-8 (2.75 g, 44.7%yield over 2 steps) . Mass calc. for C23H25NO4: 379.2; found: 380.2 [M+H] +, ESI.

[0424] Compound 2-9:

[0425] Compound 2-8 (2.7 g, 7.1 mmol) and pyridine (20 mL) were mixed in a flask and DMTr-Cl (2.4g, 7.1 mmol) was added batch-wise. The reaction was stirred at rt for 4 h. LC-MS suggested full conversion. The reaction mixture was extracted by EA (20 mLx3) . The organic phase was concentrated and purified by flash column chromatography on silica gel (DCM: MeOH=97: 3) to give a yellow solid 2-9 (2.8 g, 58%yield) .

[0426] Mass calc. for C44H43NO6: 681.3; found: 682.3 [M+H] +, ESI.

[0427] Compound 2-10:

[0428] Compound 2-9 (2.3g, 6.8 mmol) , piperidine (5 mL) and MeOH (anhydrous, 45 mL) were mixed in a flask and stirred at 30 ℃ for 3 h. LC-MS suggested full conversion. The reaction mixture was concentrated and purified by flash column chromatography on silica gel (DCM: MeOH=95: 5) to give a yellow solid 2-10 (0.5 g, 33%yield) .

[0429] Mass calc. for C29H33NO4: 459.2; found: 460.2 [M+H] +, ESI.

[0430] Compound 2-11:

[0431] Compound 1-7 (325 mg, 0.58 mmol) , HOBT (105 mg, 0.77 mmol) and EDCI (150 mg, 0.78 mmol) were dissolved in DCM (6 mL) and stirred at rt for 15min, then cooled to 0 ℃. DIPEA (211 mg, 1.6 mmol) was added followed by compound 2-9 (300 mg, 0.65 mmol) , and stirred at rt for 4 h. LC-MS suggested full conversion. NaHCO3 (saturated, 10 mL) was added. The reaction mixture was extracted by DCM (5 mLx3) . The organic phase was concentrated and purified by flash column chromatograph on silica gel (DCM: MeOH=95: 5) to give crude compound 2-11 as a white solid (350 mg, 88%purity at 210 nm, 46%yield) . Purification by prep-HPLC: crude compound 2-7 (1.8 g, 88%purity at 210 nm) was purified by prep-HPLC (C-18 column, water / ACN, 10%-80%ACN) to give compound 2-11 (650 mg, 42%recovery yield) . Mass calc. for C54H71N3O15: 1001.5; found: 1024.5 [M+Na] +, ESI.

[0432] 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.82 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 7.75-7.69 (br, 1H) , 7.40-7.35 (m, 2H) , 7.37-7.21 (m, 7H) , 6.95-6.88 (m, 4H) , 5.21 (d, J = 3.3 Hz, 1H) , 5.00-4.90 (m, 1H) , 4.66-4.63 (m, 1H) , 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 4.08-4.00 (br, 4H) , 3.91-3.83 (m, 1H) , 3.73 (s, 6H) , 3.72-3.66 (m, 3H) , 3.51 (s, 1H) , 3.43-3.37 (m, 3H) , 3.03-2.96 (m, 2H) , 2.91 (s, 2H) , 2.10 (s, 3H) , 2.00-1.76 (m, 17H) , 1.49-1.30 (m, 8H) , 1.23-1.19 (m, 2H) .

[0433] Compound 2-12:

[0434] To a solution of compound 2-11 (300.0 mg, 0.30 mmol) in anhydrous DCM (3.0 mL) was added 4, 5-dicyanoimidazole (32.0 mg, 0.27 mmol) and 2-Cyanoethyl N, N, N′, N′-tetraisopropylphosphorodiamidite (108 mg, 0.36 mmol) at rt and stirred for 1 h. LCMS showed the starting material was consumed completely. The solution was quenched by water (100 mL) , washed with brine (300 mLx3) and dried over by Na2SO4. Then the solution was concentrated under reduced pressure and the residue was purified by Flash-Prep-HPLC with the following conditions (Column: C18 silica gel; mobile phase: CH3CN / H2O = 1 / 1 increasing to CH3CN / H2O = 1 / 0 within 20 min; Detector: UV 254 nm) . This resulted in giving compound 2-12 as a white solid (177 mg, 49%yield) . Mass calc. for C63H88N5O16P: 1201.60; found: 1202.6 [M+H] +, ESI.

[0435] 1HNMR (600 MHz, CD3CN) δ 7.37-7.34 (m, 2H) , 7.24-7.20 (m, 6H) , 7.14-7.12 (m, 1H) , 6.79-6.77 (m, 4H) , 6.57-6.54 (m, 1H) , 6.44-6.43 (m, 1H) , 5.20 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.93-4.91 (m, 1H) , 4.44 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.04-3.83 (m, 5H) , 3.73-3.39 (m, 16H) , 3.04-2.91 (m, 4H) , 2.52-2.50 (m, 2H) , 2.03-1.75 (m, 24H) , 1.53-1.33 (m, 9H) , 1.21-1.04 (m, 15H) .

[0436] 31PNMR (242 MHz, CD3CN) δ 147.37, 147.30.

[0437] Compound 2-13:

[0438] To a solution of compound 2-11 (80 mg, 0.080 mmol) in anhydrous DCM (1.0 mL) , DMAP (5 mg, 0.04 mmol) and TEA (24 mg, 0.24 mmol) were added, followed by adding succinic anhydride (20 mg, 0.2 mmol) . The reaction mixture was stirred at rt for 3 h, LCMS showed the starting material was consumed completely. The reaction mixture was diluted with DCM (10 mL) and washed with H2O (3 mLx4) , then washed with brine (3 mLx4) , the organic layer was concentrated to give compound 2-13 as a white solid (85 mg, 97%yield) .

[0439] Mass calc. for C58H75N3O18: 1101.50; found: 1100.4 [M-H] -, ESI.

[0440] 1HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.22 (s, 1H) , 7.84-7.81 (m, 1H) , 7.71-7.69 (m, 1H) , 7.37-7.16 (m, 9H) , 6.92-6.89 (m, 4H) , 5.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.97-4.95 (m, 1H) , 4.48 (d, J = 12.0 Hz, 1H) , 4.07-4.01 (m, 6H) , 3.89-3.84 (m, 1H) , 3.73-3.65 (m, 9H) , 3.49 (s, 1H) , 3.41-3.38 (m, 1H) , 3.01-2.95 (m, 4H) , 2.45-2.44 (m, 4H) , 2.09-1.76 (m, 20H) , 1.48-1.19 (m, 10H) .

[0441] Solid support 2-14:

[0442] Native amino-LCAA-CPG (loading value: 75 μmol / g,  ) was washed with ACN (100 mLx2) , DMF (100 mLx2) and DCM (100 mLx2) , then dried under high vacuum overnight. To a solution of succinate 2-13 (85 mg, 0.077 mmol) and HBTU (53 mg, 0.14 mmol) in anhydrous DMF(1.5 mL) , DIPEA (30 mg, 0.23 mmol) was added, the reaction mixture was shaken at RT for 10 min, then native amino-LCAA-CPG (250 mg, loading 75 μmol / g) was added, the suspension was shaken at rt for 20 h, then filtered, washed with DMF (20 mLx5) , ACN (20 mLx5) , DCM (20 mLx5) until TLC showed no spot at 254 nm in eluent. The solid support was dried under vacuum for 2 h to give solid support (260 mg) . The unreacted amines on the solid support were capped by stirring with Ac2O / pyridine / N-methyl imidazole (90 μL / 1.0 mL / 80 μL) at RT for 1 h, washed with DMF (20 mLx5) , CAN (20 mLx5) , DCM (20 mLx5) until TLC showed no spot at 254 nm in eluent. The solid support was dried under vacuum for 15 h to give solid support 2-14 (260 mg) . For loading calculation, take 6.5 mg of the dried loaded CPG and add 25 mL of 3%DCA in DCM. Shake the solution and measure UV absorbance at 500 nm. Make sure the absorbance value is below 1.0 unit to ensure no signal saturation. Then apply the following equation: Loading in μmol / g = (total  volume of DCA added in mL) * (Abs value at 500 nm) *1000)  /  (76* (mg of CPG taken) ) Total volume of DCA added in mL = 25 mL

[0443] Abs value at 500 nm = 0.7721 mg of CPG taken = 6.5 mg

[0444] Loading in μmol / g = ( (25) * (0.7721) *1000)  /  (76* (6.5) ) = 39 μmol / g.

[0445] Method 2:

[0446] Compound 2-2:

[0447] Compound 2-1 (11 g, 26.0 mmol) was dissolved in THF (anhydrous, 100 mL) in 250 mL flask. LiAlH4 (1.97 g, 52 mmol) was added batch-wise under 0 ℃ over 15 min. The reaction was then stirred at rt for 4 h. LC-MS suggested full conversion. The reaction was cooled to 0 ℃, and water (2 mL) was added slowly, followed by NaOH (10%, 2 mL) , then water (6 mL) . The mixture was filtered, and the filtrate was concentrated to dryness to give compound 2-2 (6.5 g, 80%yield) as a white solid. The crude product was used without further purification.

[0448] C15H21NO4S for: 311.1; found: 312.1 [M+H] +, ESI.

[0449] 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.67 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 7.48 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 4.46 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 3.60 (s, 4H) , 3.31 (d, J = 5.6 Hz, 4H) , 2.43 (s, 3H) , 1.67 (s, 4H) .

[0450] Compound 2-3:

[0451] Compound 2-2 (5g, 16.1 mmol) and Mg (powder, 3.47g, 144.6mmol) were mixed in MeOH (anhydrous, 60 mL) and stirred overnight at rt. LC-MS suggested full conversion, and water (30 mL) was added. A white precipitate formed. The mixture was filtered, and the filtrate was adjusted to pH 6 by HCl (aq. 4M) , and concentrated to dryness to give compound 2-3 (2.55 g crude) as a yellow solid. The crude product was used without further purification.

[0452] Mass calc. C8H15NO2 for: 157.1; found: 158.1 [M+H] +, ESI.

[0453] Compound 2-4:

[0454] Compound 2-3 (2.55 g, assuming 16.2 mmol) was dissolved in dioxane (20 mL) , and FmocCl (4.60 g, 17.8 mmol) was added slowly at 0℃, followed by Na2CO3 (saturated, 20 mL) . The reaction was stirred at 30℃ for 3 h. LC-MS suggested full conversion. The reaction mixture was extracted by  EA (20 mLx3) . The organic phase was concentrated and purified by flash column chromatography on silica gel (DCM: MeOH =97: 3) to give a white solid 2-4 (2.75 g, 44.7%yield, 2 steps) .

[0455] Mass calc. for C23H25NO4: 379.2; found: 380.2 [M+H] +, ESI.

[0456] Compound 2-5:

[0457] Compound 2-4 (2.7 g, 7.1 mmol) and pyridine (20 mL) were mixed in a flask and DMTr-Cl (2.4g, 7.1 mmol) was added batch-wise. The reaction was stirred at rt for 4 h. LC-MS suggested full conversion. The reaction mixture was extracted by EA (20 mLx3) . The organic phase was concentrated and purified by flash column chromatography on silica gel (DCM: MeOH=97: 3) to give a yellow solid 2-5 (2.8 g, 58%yield) .

[0458] Mass calc. for C44H43NO6: 681.3; found: 682.3 [M+H] +, ESI.

[0459] Compound 2-6:

[0460] Compound 2-5 (2.3g, 6.8 mmol) , piperidine (5 mL) and MeOH (anhydrous, 45 mL) were mixed in a flask and stirred at 30 ℃ for 3 h. LC-MS suggested full conversion. The reaction mixture was concentrated and purified by flash column chromatography on silica gel (DCM: MeOH=95: 5) to give a yellow solid 2-6 (0.5 g, 33%yield) .

[0461] Mass calc. for C29H33NO4: 459.2; found: 460.2 [M+H] +, ESI.

[0462] Compound 2-7:

[0463] Compound 1-7 (325 mg, 0.58 mmol) , HOBT (105 mg, 0.77 mmol) and EDCI (150 mg, 0.78 mmol) were dissolved in DCM (6 mL) and stirred at rt for 15min, then cooled to 0 ℃. DIPEA (211 mg, 1.6 mmol) was added followed by compound 2-6 (300 mg, 0.65 mmol) , and stirred at rt for 4 h. LC-MS suggested full conversion. NaHCO3 (saturated, 10 mL) was added. The reaction mixture was extracted by DCM (5 mLx3) . The organic phase was concentrated and purified by flash column chromatograph on silica gel (DCM: MeOH=95: 5) to give crude compound 2-7 as a white solid (350 mg, 88%purity at 210 nm, 46%yield) . Purification by prep-HPLC: crude compound 2-7 (1.8 g, 88%purity at 210 nm) was purified by prep-HPLC (C-18 column, water / ACN, 10%-80%ACN) to give compound 2-7 (650 mg, 96%purity at 210 nm, 42%recovery yield) . Mass calc. for C54H71N3O15: 1001.5; found: 1024.5 [M+Na] +, ESI.

[0464] 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.82 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 7.75-7.69 (br, 1H) , 7.40-7.35 (m, 2H) , 7.37-7.21 (m, 7H) , 6.95-6.88 (m, 4H) , 5.21 (d, J = 3.3 Hz, 1H) , 5.00-4.90 (m, 1H) , 4.66-4.63 (m, 1H) , 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 4.08-4.00 (br, 4H) , 3.91-3.83 (m, 1H) , 3.73 (s, 6H) , 3.72-3.66 (m, 3H) , 3.51 (s, 1H) , 3.43-3.37 (m, 3H) , 3.03-2.96 (m, 2H) , 2.91 (s, 2H) , 2.10 (s, 3H) , 2.00-1.76 (m, 17H) , 1.49-1.30 (m, 8H) , 1.23-1.19 (m, 2H) .

[0465] Compound 2-8:

[0466] To a solution of compound 2-7 (300.0 mg, 0.30 mmol) in anhydrous DCM (3.0 mL) was added DCI (32.0 mg, 0.27 mmol) and CEP [N (iPr) 2] 2 (108 mg, 0.36 mmol) at rt and stirred for 1 h, LCMS showed SM was consumed completely. The solution was quenched by water (100 mL) washed with brine (300 mLx3) and dry over by Na2SO4. Then the solution was concentrated under reduced pressure and the residue was purified by MPLC with the following conditions (Column: C18 silica gel; mobile phase: CH3CN / H2O = 1 / 1 increasing to CH3CN / H2O = 1 / 0 within 20 min, the eluted product was collected at CH3CN / H2O = 3 / 2; Detector: UV 254 nm) . This resulted in giving compound 2-8 as a white solid (177 mg, 0.15 mmol, 97.0%purity, 49%yield) .

[0467] Mass calc. for C63H88N5O16P: 1201.60; found: 1202.6 [M+H] +, ESI.

[0468] 1H-NMR (600 MHz, CD3CN) : δ = 7.37-7.34 (m, 2H) , 7.24-7.20 (m, 6H) , 7.14-7.12 (m, 1H) , 6.79-6.77 (m, 4H) , 6.57-6.54 (m, 1H) , 6.44-6.43 (m, 1H) , 5.20-5.19 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.93-4.91 (m, 1H) , 4.44-4.43 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.04-3.83 (m, 5H) , 3.73-3.39 (m, 16H) , 3.04-2.91 (m, 4H) , 2.52-2.50 (m, 2H) , 2.03-1.75 (m, 24H) , 1.53-1.33 (m, 9H) , 1.21-1.04 (m, 15H) ;

[0469] 31PNMR (242 MHz, CD3CN) δ 147.37, 147.29.

[0470] Compound 2-9:

[0471] To a solution of Compound 2-7 (80 mg, 0.080 mmol) in anhydrous DCM (1.0 mL) , DMAP (5 mg, 0.04 mmol) and TEA (24 mg, 0.24 mmol) were added, followed by adding succinic anhydride (20 mg, 0.2 mmol) . The reaction mixture was stirred at rt for 3 h, LCMS showed SM was consumed completely. The reaction mixture was diluted with DCM (10 mL) and washed with H2O (3 mLx4) , then washed with brine (3 mLx4) , the organic layer was concentrated to give compound 2-9 as a white solid (85 mg, 0.077 mmol, 97%purity, 97%yield) Mass calc. for C58H75N3O18: 1101.50; found: 1100.4 [M-H] -, ESI.

[0472] 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) : δ = 12.22 (s, 1H) , 7.84-7.81 (m, 1H) , 7.71-7.69 (m, 1H) , 7.37-7.16 (m, 9H) , 6.92-6.89 (m, 4H) , 5.21-5.20 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.97-4.95 (m, 1H) , 4.49-4.47 (d, J = 12.0 Hz, 1H) , 4.07-4.01 (m, 6H) , 3.89-3.84 (m, 1H) , 3.73-3.65 (m, 9H) , 3.49 (s, 1H) , 3.41-3.38 (m, 1H) , 3.01-2.95 (m, 4H) , 2.45-2.44 (m, 4H) , 2.09-1.76 (m, 20H) , 1.48-1.19 (m, 10H) .

[0473] Solid support 2-10:

[0474] Native amino-LCAA-CPG (Loading value: 75 umol / g,  ) was washed with ACN (100 mLx2) , DMF(100 mLx2) and DCM (100 mLx2) , then dried under high vacuum overnight.

[0475] To a solution of succinate 2-9 (85 mg, 0.077 mmol) and HBTU (53 mg, 0.14 mmol) in anhydrous DMF(1.5 mL) , DIPEA (30 mg, 0.23 mmol) was added, the reaction mixture was shook at RT for 10 min, then native amino-LCAA-CPG (250 mg, loading 75 umol / g) was added, the suspension was shook at RT for 20 h, then filtered, washed with DMF (20 mLx5) , ACN (20 mLx5) , DCM (20 mLx5) until TLC showed no spot at 254 nm in eluent. The solid support was dried under vacuum for 2 h to give solid support (260 mg) . The unreacted amines on the solid support were capped by stirring with Ac2O / pyridine / N-methyl imidazole (90 μL / 1.0 mL / 80 μL) at RT for 1 h, washed with DMF (20 mLx5) , CAN (20 mLx5) , DCM (20 mLx5) until TLC showed no spot at 254 nm in eluent. The solid support was dried under vacuum for 15 h to give solid support 2-10 (260 mg) . For loading calculation, take 6.5 mg of the dried loaded CPG and add 25 mL of 3%DCA in DCM. Shake the solution and measure UV absorbance at 500 nm. Make sure the absorbance value is below 1.0 unit to ensure no signal saturation. Then apply the following equation: Loading in μmol / g = (total volume of DCA added in mL) * (Abs value at 500 nm) *1000)  /  (76* (mg of CPG taken) ) Total volume of DCA added in mL = 25 mL

[0476] Abs value at 500 nm = 0.7721 mg of CPG taken = 6.5 mg

[0477] Loading in μmol / g = ( (25) * (0.7721) *1000)  /  (76* (6.5) ) = 39 μmol / g.

[0478] Compound 3-2:

[0479] To a solution of Compound 3-1 (40 g, 211.36 mmol) in NH3 / MeOH (7 M, 192 mL) was added ethyl 2-cyanoacetate (47.82 g, 422.71 mmol) dropwise, and the mixture was stirred overnight. LC-MS showed full conversion, and the reaction was filtered. The fliter cake was triturated in PE (100 mL) , and filtered. The filter cake was dried to afford compound 3-2 as a solide (41 g, 44%yield) . Mass calc. for C18H18N4O2: 322.1; found: 323.1 [M+H] +, ESI.

[0480] Compound 3-3:

[0481] Compound 3-2 (80 g, 248.17 mmol) was dissolved in sulfuric acid solution (conc. H2SO4 / water =1: 1, v / v, 160 mL) , and stirred at 120 ℃ for 5 h. LC-MS showed full conversion, and the reaction mixture was adjusted to pH 9-10 by addion of NaOH (30%aq. ) , and re-adjusted to pH 4-5 by adding 1 M HCl solution. The reaction was then filtered and the filtrate was concentrated to dryness to afford crude compound 3-3 (72g, 95%yield) . The crude product was used directly without further purification.

[0482] Mass calc. For C16H21NO4: 291.2; found: 292.3 [M+H] +, ESI.

[0483] Compound 3-4:

[0484] Compound 3-3 (72.3 g crude) in MeOH (1600 mL) and H2SO4 (160 mL, conc. H2SO4 / water = 1: 1, v / v) was stirred at 85 ℃ for 4h. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was filtered and concentrated to dryness, and purified by silica gel column (0-25%EA in PE) to afford compound 3-4 (62.5 g, 78%yield over 2 steps) .

[0485] Mass calc. for C18H25NO4: 319.2; found: 320.3 [M+H] +, ESI.

[0486] Compound 3-5:

[0487] To a solution of compound 3-4 (40 g, 125.2 mmol) in THF (295 mL) was added LiAlH4 (14.3 g,  375.1 mmol) at 0 ℃ portion-wise and stirred for 1 h. LC-MS showed full conversion, and ethyl acetate (100 mL) was added to the reaction mixture, and adjusted to pH 9-10 by adding 10%NaOH (aq) . The mixture was then filtered and washed by ethyl acetate (50 mL X 2) . The combined filtrate was concentrated to dryness to afford crude compound 3-5 (23 g, 83%yield) . The crude product was used in the next step without further purification.

[0488] Mass calc. C16H25NO2 for 263.2; found: 264.3 [M+H] +, ESI.

[0489] Compound 3-6:

[0490] Compound 3-5 (20 g, 75.94 mmol) , Boc2O (16.57 g, 75.94 mmol) and Pd / C (10%Pd on carbon, wet, ～55%water) in MeOH (150 mL) was stirred at room temperature under 1atm H2 overnight. LC-MS showed full conversion, and the reaction mixture was filtered and concentrated to afford Compound 3-6 as an oil (20 g, 96%yield) , which was used without further purification.

[0491] Mass calc. C14H27NO4 for 273.2; found: 274.1 [M+H] +, ESI.

[0492] Compound 3-7:

[0493] To a solution of compound 3-6 (58 g, 212.17 mmol) in triethylamine (85.88 g, 848.67 mmol, 118.37 mL) and DCM (1.16 L) was added MsCl (72.91 g, 636.51 mmol) . The reaction was stirred at r. t. overnight. LC-MS showed full conversion (by EtOH quenching, and detection of diether) . The reaction mixture was diluted by DCM (1L) and washed by 10%citric acid and then NaHCO3 (sat. aq. ) , and dried to afford compound 3-7 as an oil (87 g, 95%yield) , which was used directly for the next step without further purification.

[0494] Mass calc. for C16H31NO8S2: 429.2; found: 430.3 [M+H] +, ESI.

[0495] Compound 3-8:

[0496] NaH (60%in miniral oil, 3.72 g, 93.12 mmol) was suspended in anhydrous DMF (60 mL) under nitrogen, diisopropyl malonate (8.76 g, 46.56 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at r. t for 30 min, and a clear solution was formed. KI (1.55 g, 9.31 mmol) was added, followed by compound 3-7 (20 g, 46.56 mmol) . The reaction mixture was stirred at 70 ℃ for 30min and 140 ℃ for another 30 min. Full conversion showed by LC-MS. The reaction was cooled to r. t., and diluted by ethyl acetate (300 mL) and washed by citric acid (10%aq., 200 mL x 2) and NaHCO3 (sat. aq., 200 mL) . The organic phase was concentrated and purified by silica gel column (0-10%EA in PE) to afford compound 3-8 as a colorless oil (3.55 g, 18%yield) .

[0497] Mass calc. for C23H39NO6: 425.3; found: 426.2 [M+H] +, ESI.

[0498] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.96-4.90 (m, 2H) , 3.27 (br, 4H) , 1.86 (t, J = 10.8 Hz, 4H) , 1.38 (br, 13H) , 1.28 (s, 4H) , 1.17-1.16 (m, 12H) .

[0499] Compound 3-9:

[0500] To compound 3-8 (7.5 g, 17.62 mmol) was added LiBH4 (172 mL, 1 M, in THF) at 0 ℃, and the mixture was stirred overnight. LC-MS showed full conversion. To the reaction mixture was added ethyl acetate (10 mL) , then NaOH (10%aq., 20 mL) and filtered. The filtrate was diluted by water (200 mL) and extracted by ethyl acetate (50 mL X3) , and concentrated to afford compound 3-9 (6.35 g, 98%yield) as a colorless oil, which was used directly for the next step without further purification. Mass calc. for C17H31NO4: 313.2; found: 314.2 [M+H] +, ESI.

[0501] Compound 3-10:

[0502] Compound 3-9 (6.35 g, 20.26 mmol) was mixed with HCl (63.5 mL, 4M in dioxane) and the mixture was stirred at r. t. for 3 h. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was concentrated to dryness and azeotropically dired with toluene to affored compound 3-10 (7 g, 99%yield) , which was used directly for the next step without further purification.

[0503] Mass calc for C12H23NO2 (free base) : 213.2; found: 214.2 [M+H] +, ESI.

[0504] 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 3.39 (br, 4H) , 3.18 (t, J = 11.6 Hz, 4H) , 1.59 (t, J = 12.0 Hz, 4H) , 1.36-1.33 (m, 4H) , 1.25 (t, J = 12.4 Hz, 4H) .

[0505] Compound 3-11:

[0506] A solution of compound 3-10 (5 g, 20.02 mmol) , DIEA (6.47 g, 50.04 mmol, 8.72 mL) , HOBT (3.25 g, 24.02 mmol) , EDCI (4.60 g, 24.02 mmol) in DCM (150 mL) was stirred at 0 ℃ for 30 min, then Fmoc-6-aminohexanoic acid (5.66 g, 16.01 mmol) was added, and the mixture was stirred at r. t. for 1h. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was diluted by additional DCM (100 mL) , washed by citric acid (10%aq., 200 mL) , NaHCO3 (sat. aq., 200 mL) , and water (200 mL) , dried over Na2SO4, and concentrated to afford crude product, which was purified by silica gel column (0-10%EA in PE) to afford compound 3-11 as a gum (3.65 g, LC-MS purity 92%, 33%yield) . Mass calc. for C33H44N2O5: 548.3; found: 549.3 [M+H] +, ESI.

[0507] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.88 (d, J = 7.5 Hz, 2H) , 7.84 (d, J = 7.5 Hz, 2H) , 7.41 (t, J = 7.3 Hz, 2H) , 7.34 (t, J = 7.3 Hz, 2H) , 6.65 (t, J = 5.3 Hz, 1H) , 6.28 (s, 2H) , 4.36-4.18 (m, 3H) , 3.36 (dt, J = 19.9, 5.2 Hz, 4H) , 3.24 (s, 4H) , 2.92-2.87 (m, 2H) , 2.24 (t, J = 7.4 Hz, 2H) , 1.49-1.26 (m, 18H) .

[0508] Compound 3-12:

[0509] A solution of compound 3-11 (2.55 g, 4.65 mmol) , 4, 4'- (chloro (phenyl) methylene) bis (methoxybenzene) (1.57 g, 4.65 mmol) , DIEA (600.6 mg, 4.65 mmol) , DMAP (56.8 mg, 0.47 mmol) in DCM (51 mL) was stirred at r. t. overnight. LC-MS showed partial conversion. Then reaction mixture was concentrated and purified by silica gel column (10-40%EA in PE to elude impurities and then 5-10%MeOH with 0.1%NH3·H2O in DCM) to afford compound 3-12 (2.75 g, 69%yield) .

[0510] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.88-7.87 (m, 2H) , 7.69-7.68 (m, 2H) , 7.41-7.37 (m, 4H) , 7.33-7.25 (m, 9H) , 6.89-6.80 (m, 5H) , 4.41 (t, J = 5.0 Hz, 1H) , 4.28 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 4.20 (t, J = 6.8 Hz, 1H) , 3.72 (s, 8H) , 3.40-3.39 (m, 2H) , 3.32-3.27 (m, 4H) , 2.96 (q, J = 6.3 Hz, 2H) , 2.22 (t, J = 7.9 Hz, 2H) , 1.48-0.86 (m, 18H) .

[0511] Compound 3-13:

[0512] To a solution of compound 3-12 (1.7 g, 2.00 mmol) in MeOH (51 mL) was added piperidine (5.1 mL) and the mixture was stirred at r. t. for 3h. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was concentrated, and azeotropically dried with xylene. The residue was purified by silica gel column (0-10%MeOH with 0.1%NH3·H2O in DCM) to afford compound 3-13 as a gum (1.1 g, 87%yield) .

[0513] Mass calc. for C39H52N2O5: 628.4; found: 629.4 [M+H] +, ESI.

[0514] Compound 3-14:

[0515] A solution of compound 3-13 (0.94 g, 1.49 mmol) , DIEA (482.98 mg, 3.74 mmol) , HOBT (242.38  mg, 1.79 mmol) , EDCI (343.87 mg, 1.79 mmol) in DCM (29 mL) was stirred at 0 ℃, then compound 1-4 (936.36 mg, 2.09 mmol) was added, and the mixture was stirred at r. t. for 1h. LC-MS showed full conversion. The reactiom mixture was diluted by addtional DCM (20 mL) , and washed by NaHCO3 (sat. Aq., 50 mL) , and water (50 mL) , concentrated and purified by prep-HPLC (C18 column, ACN / water) to afford compound 3-14 (700 mg, 44%yield) .

[0516] Mass calc for C58H79N3O15: 1057.6; found: 1080.5 [M+Na] +, ESI.

[0517] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.82 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 7.69 (t, J = 5.5 Hz, 1H) , 7.40-7.38 (m, 2H) , 7.32-7.19 (m, 7H) , 6.89-6.87 (m, 4H) , 5.21 (d, J = 3.3 Hz, 1H) , 4.97 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 1H) , 4.48 (d, J = 8.5 Hz, 1H) , 4.40 (t, J = 5.0 Hz, 1H) , 4.02 (s, 3H) , 3.91-3.83 (m, 1H) , 3.73-3.68 (m, 7 H) , 3.43-3.39 (m, 3H) , 3.32-3.27 (m, 2H) , 2.99 (q, J = 6.6 Hz, 2H) , 2.87 (s, 2H) , 2.22 (t, J = 7.3 Hz, 2H) , 2.10 (s, 3H) , 2.03 (t, J = 7.0 Hz, 2H) , 1.99 (s, 3H) , 1.89 (s, 3H) , 1.77 (s, 3H) , 1.53-1.03 (m, 20H) , 0.90-0.83 (m, 2H) .

[0518] Compound 3-15:

[0519] To a solution of compound 3-14 (670.0 mg, 0.61 mmol) in anhydrous DCM (3.0 mL) was added 4, 5-dicyanoimidazole (96.0 mg, 0.81 mmol) and 2-Cyanoethyl N, N, N′, N′-tetraisopropylphosphorodiamidite (324 mg, 1.08 mmol) at rt and stirred for 1 h. LCMS showed the starting material was consumed completely. The solution was quenched by water (100 mL) , washed with brine (300 mLx3) and dried over by Na2SO4. Then the solution was concentrated under reduced pressure and the residue was purified by Flash-Prep-HPLC with the following conditions (Column: C18 silica gel; mobile phase: CH3CN / H2O = 1 / 1 increasing to CH3CN / H2O = 1 / 0 within 20 min; Detector: UV 254 nm) . This resulted in giving compound 3-15 as a white solid (600 mg, 83%yield) . Mass calc. for C67H96N5O16P: 1257.66; found: 1204.5 [M-CH2CH2CN] -, ESI.

[0520] 1HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.81-7.67 (m, 2H) , 7.40-7.19 (m, 9H) , 6.88-6.86 (m, 4H) , 5.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.98-4.94 (m, 1H) , 4.49 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.04-3.83 (m, 4H) , 3.73-3.32 (m, 15H) , 3.01-2.89 (m, 4H) , 2.73-2.70 (m, 2H) , 2.24-2.20 (m, 2H) , 2.11-1.76 (m, 15H) , 1.49-0.91 (m, 34H) . 31PNMR (242 MHz, DMSO-d6) δ 146.21, 146.19.

[0521] Compound 4-2:

[0522] Potassium carbonate (8.10 g, 58.61 mmol) was added to a solution of MeOH (80 mL) , H2O (60 mL) , formaldehyde (3.52 g, 117.22 mmol) and compound 4-1 (25 g, 117.22 mmol) at 0 ℃. The reaction  mixture was stirred at 0 ℃ overnight. The reaction mixture was concentrated to 70%of its volume, and the residue was extracted three times with ethyl acetate. The organic phase was washed with water, brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and then concentrated to give crude product 4-2 (27g, 95%yield) , which was used for the next step without further purification.

[0523] Mass calc. for C12H21NO4: 243.2; found: 244.1 [M+H] +, ESI.

[0524] Compound 4-3:

[0525] To a solution of compound 4-2 (35 g, 143.86 mmol) in methanol (28 ml) was added sodium borohydride (11.97 g, 316.48 mmol) at 0 ℃ in about five minutes. The reaction mixture was stirred at 0 ℃, then warmed to room temperature and stirred for 5h. The reaction was quenched with saturated ammonium chloride solution, then concentrated, extracted with ethyl acetate (EA) for three times and washed with brine, then recrystallized with EA: PE=1: 3 to give compound 4-3 (19.6g, 54%yield) .

[0526] Mass calc. C12H23NO4 for: 245.2; found: 146.1 [M+H-Boc] +, ESI.

[0527] Compound 4-4:

[0528] Compound 4-3 (30 g, 122.29 mmol) , triethylamine (30.94 g, 305.73 mmol, 42.64 mL) and DCM (300 mL) were mixed, then the mixture was cooled to -30 ℃, then MsCl (35.02 g, 305.73 mmol) was added slowly. After stirring at room temperature for 1.5h, the reaction mixture was extracted with 400 mL of water, washed with 100 mL of 10%citric acid aqueous solution, dried over anhydrous sodium sulfate. After concentration, the residue was purified by silica gel column to afford compound 4-4 as a light-yellow oily liquid (40g, 81%yield) .

[0529] Mass calc. for C14H27NO8S2: 401.1; found: 302.1 [M+H-Boc] +, ESI.

[0530] Compound 4-5:

[0531] To a mixture of t-BuONa (9.57 g, 99.63 mmol) in DMA (50 mL) under nitrogen was added slowly diisopropyl malonate (14.06 g, 74.72 mmol) . After stirring for 20 mins, compound 4-4 (20 g, 49.81 mmol) , KI (4.13 g, 24.91 mmol) were added. The reaction mixture was warmed to 140 ℃ and stirred overnight. The reaction was quenched by adding saturated ammonium chloride and extracted with ethyl acetate. After concentration, the residue was purified by silica gel column (PE: EA) to afford compound 4-5 (6g, 30%yield) .

[0532] Mass calc. for C21H35NO6: 397.3; found: 398.2 [M+H] +, ESI.

[0533] 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 4.98-4.90 (m, 2H) , 3.22-3.20 (m, 4H) , 2.25 (s, 4H) , 1.42 (t, J = 5.6 Hz, 4H) , 1.38 (s, 9H) , 1.17 (d, J = 6.0 Hz, 12H) .

[0534] Compound 4-6:

[0535] To a solution of compound 4-5 (9.75 g, 24.53 mmol) in anhydrous THF (200 mL) was added lithium borohydride (10.69 g, 490.56 mmol) at 0℃. The reaction mixture was warmed slowly to room temperature and stirred overnight. Then ethyl acetate (200 mL) was added to the reaction mixture, and it was extracted by water (150mL x3) , then washed with saturated sodium chloride, dried over anhydrous sodium sulfate, concentrated to obtain crude product 4-6 (6.52 g, 93%yield) , which was used for the next step without further purification.

[0536] Mass calc. for C15H27NO4: 285.2; found: 186.2 [M+H-Boc] +, ESI.

[0537] Compound 4-7:

[0538] To a solution of product 4-6 (7.52 g, 26.35 mmol) in DCM (100 mL) at 0 ℃ was added HCl (4M in 1, 4-dioxane, 21.52 mL) in 15 min. The reaction mixture was warmed to room temperature and stirred for 3 h. The reaction mixture was filtered, and the filter cake was washed with dichloromethane (x3) to give the crude product 4-7 (3.7g, 76%yield) .

[0539] Mass calc. for C10H19NO2 (free base) : 185.1 m / z; found: 186.2 [M+H] +, ESI.

[0540] Compound 4-8:

[0541] A mixture of Fmoc-6-aminohexanoic acid (1.91 g, 5.41 mmol) , 1-hydroxybenzotriazole (HOBT, 609.41 mg, 4.51 mmol) , EDCI (864.59 mg, 4.51 mmol) , DIEA (582.89 mg, 4.51 mmol, 785.56 μL) in DCM (10mL) was stirred at room temperature for 30min, then it was added to the solution of compound 4-7 (1 g, 4.51 mmol) in DCM and the mixture was stirred for 4 hours. The reaction mixture was washed with saturated sodium bicarbonate solution, brine and dried over anhydrous sodium sulfate. After concentration, the residue was purified by silica gel column to afford compound 4-8 (1.35 g, 58%yield) .

[0542] Mass calc. for C31H40N2O5: 520.3; found: 521.2 [M+H] +, ESI.

[0543] 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.88 (d, J = 7.5 Hz, 2H) , 7.68 (d, J = 7.4 Hz, 2H) , 7.39 (d, J = 7.5 Hz, 4H) , 7.34-7.18 (m, 10H) , 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 4H) , 4.64 (t, J = 4.7 Hz, 1H) , 4.28 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 4.20 (t, J = 6.8 Hz, 1H) , 3.73 (s, 6H) , 3.44 (d, J = 5.0 Hz, 2H) , 3.30-3.10 (m, 4H) , 3.01 (s, 2H) , 3.00-2.90 (m, 2H) , 2.21 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.56 (d, J = 11.9 Hz, 2H) , 1.46-1.30 (m, 8H) , 1.21-1.00 (m, 4H) .

[0544] Compound 4-9:

[0545] The mixture of DMTr-Cl (488.07 mg, 1.44 mmol) and compound 4-8 (0.75 g, 1.44 mmol) in pyridine (6 ml) was stirred at room temperature overnight. The reaction mixture was concentrated under vacuum. The residue was re-dissolved in ethyl acetate with 1%pyridine and dried together with alumina for column chromatography purification (0-10%MeOH, 0.1%TEA in DCM) on alumina to afford compound 4-9 (0.39 g, 32.9%yield) .

[0546] 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.39 (d, J = 7.3 Hz, 2H) , 7.34-7.18 (m, 7H) , 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 4H) , 4.63 (s, 1H) , 3.73 (s, 6H) , 3.43 (s, 2H) , 3.30-3.18 (m, 6H) , 3.05 (s, 2H) , 2.22 (t, J = 7.4 Hz, 2H) , 1.57 (d, J = 12.1 Hz, 2H) , 1.47-1.08 (m, 12H) .

[0547] Compound 4-10:

[0548] Compound 4-9 (1.4 g, 1.70 mmol) was dissolved in MeOH (40 mL) , then piperidine (4 ml) was added. The mixture was stirred at room temperature overnight. The reaction mixture was concentrated under vacuum. The piperidine residue was further removed by azeotropic drying with xylene. Then the residue was purified by silica gel column (DCM: MeOH=10: 1, methanol contains 10%ammonia) to afford compound 4-10 (1 g, 97%yield) .

[0549] Mass calc. for C37H48N2O5: 600.4; found: 601.4 [M+H] +, ESI.

[0550] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.40-7.39 (m, 2H) , 7.33-7.21 (m, 7H) , 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 4H) , 4.63 (s, 1H) , 3.73 (s, 6H) , 3.44-3.16 (m, 8H) , 3.01-3.00 (m, 2H) , 2.24-2.21 (m, 2H) , 1.57 (d, J =12.2 Hz, 2H) , 1.45-1.33 (m, 7H) , 1.27-1.21 (m, 4H) , 1.09 (s, 1H) .

[0551] Compound 4-11:

[0552] The mixture of compound 1-4 (959.23 mg, 2.14 mmol) , HOBt (289.68 mg, 2.14 mmol) , EDCI (410.98 mg, 2.14 mmol) , DIEA (395.82 mg, 3.06 mmol, 533.45 μL) in DCM (10 mL) was stirred for 20min, then it was added to the solution of compound 4-10 (920 mg, 1.53 mmol) in DCM (5 mL) and stirred at room temperature overnight. Water was added to quench the reaction and the organic layer was separated and concentrated. The residue was purified by prep-HPLC to give compound 4-11 (1g, 63%yield) .

[0553] Mass calc. for C56H75N3O15: 1029.5; found: 1052.3 [M+Na] +, ESI.

[0554] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.82 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 7.79 (t, J = 5.0 Hz, 1H) , 7.40-7.19 (m, 9H) , 6.90-6.88 (m, 2H) , 5.21 (d, J = 3.2 Hz, 1H) , 4.97 (dd, J = 11.2, 3.3 Hz, 1H) , 4.62 (t, J = 4.9 Hz, 1H) , 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 4.02 (s, 3H) , 3.87 (dd, J = 20.4, 9.6Hz, 1H) , 3.97-3.67 (m, 7H) , 3.45-3.38 (m, 3H) , 3.30-3.13 (m, 4H) , 3.05-2.96 (m, 4H) , 2.22 (t, J = 7.3 Hz, 2H) , 2.10 (s, 3H) , 2.04-1.99 (m, 5H) , 1.89 (s, 3H) , 1.77 (s, 3H) , 1.59-1.21 (m, 18H) .

[0555] Compound 4-12:

[0556] To a solution of compound 4-11 (750.0 mg, 0.75 mmol) in anhydrous DCM (7.0 mL) was added 4, 5-dicyanoimidazole (80.0 mg, 0.67 mmol) and 2-Cyanoethyl N, N, N′, N′-tetraisopropylphosphorodiamidite (270 mg, 0.90 mmol) at rt and stirred for 1 h, LCMS showed the starting material was consumed completely. The solution was quenched by water (100 mL) , washed with brine (300 mLx3) and dried over by Na2SO4. Then the solution was concentrated under reduced pressure and the residue was purified by Flash-Prep-HPLC with the following conditions (Column, C18 silica gel; mobile phase, CH3CN / H2O = 1 / 1 increasing to CH3CN / H2O = 1 / 0 within 20 min; Detector, UV 254 nm) . This resulted in giving 4-12 as a white solid (500 mg, 53%yield) .

[0557] Mass calc. for C65H92N5O16P: 1229.63; found: 1129.0 [M-N (CH (CH3) 2) 2] +, ESI.

[0558] 1HNMR (600 MHz, DMSO-d6) : δ 7.44-7.18 (m, 9H) , 6.85-6.83 (m, 4H) , 6.52-6.44 (m, 2H) , 5.26 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.99-4.96 (m, 1H) , 4.49 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.13-3.89 (m, 4H) , 3.79-3.55 (m, 13H) , 3.44-3.48 (m, 1H) , 3.35-3.07 (m, 8H) , 2.58-2.56 (m, 2H) , 2.24-1.89 (m, 16H) , 1.62-1.11 (m, 31H) .

[0559] 31PNMR (242 MHz, DMSO-d6) δ 147.17, 147.16.

[0560] Compound 4-13:

[0561] To a solution of compound 4-11 (80 mg, 0.080 mmol) in anhydrous DCM (1.0 mL) , DMAP (5 mg, 0.04 mmol) and TEA (24 mg, 0.24 mmol) were added, followed by adding succinic anhydride (20 mg, 0.2 mmol) , the reaction mixture was stirred at rt for 3 h, LCMS showed the starting material was consumed completely, then the reaction mixture was diluted with DCM and washed with water (3 mLx4) , then washed with brine (3 mLx4) , the organic layer was concentrated to give compound 4-13 as a white solid (85 mg, 97%yield) .

[0562] Mass calc. for C60H79N3O18: 1129.54; found: 1128.6 [M-H] -, ESI.

[0563] 1HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.22 (s, 1H) , 7.84-7.81 (m, 1H) , 7.71-7.69 (m, 1H) , 7.37-7.16 (m, 9H) , 6.92-6.89 (m, 4H) , 5.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.97-4.95 (m, 1H) , 4.48 (d, J = 12.0 Hz, 1H) , 4.12-4.01 (m, 3H) , 3.89-3.84 (m, 1H) , 3.73-3.65 (m, 7H) , 3.41-3.38 (m, 2H) , 3.28-3.15 (m, 4H) , 3.15-2.98 (m, 4H) , 2.46-2.44 (m, 4H) , 2.22-2.20 (m, 2H) , 2.09-1.76 (m, 14H) , 1.65-1.60 (m, 2H) , 1.48-1.06 (m, 19H) .

[0564] Compound 4-14:

[0565] To a solution of compound 4-13 (85 mg, 0.077 mmol) and HBTU (53 mg, 0.14 mmol) in anhydrous DMF (1.5 mL) , DIPEA (30 mg, 0.23 mmol) was added. The reaction mixture was shaken at rt for 10 min, then native amino-lcaa-CPG (250 mg, loading 75 μmol / g) was added, the suspension was shaken at r. t. for 20 h, then filtered, washed with DMF (20 mLx5) , ACN (20 mL x5) , DCM (20 mLx5) until TLC showed no spot at 254 nm in eluent. The solid support was dried under vacuum for 2 h to give solid support (260 mg) . The unreacted amines on the support were capped by stirring with Ac2O / pyridine / N-methyl imidazole (90 μL / 1.0 mL / 80 μL) at rt for 1 h, washed with DMF (20 mLx5) , ACN (20 mLx5) and DCM (20 mLx5) until TLC showed no spot at 254nm in eluent. The solid support was dried under vacuum for 15 h to give solid support 4-14 (260 mg) . For loading calculation, take 5.97 mg of the dried loaded CPG and add 25 mL of 3%DCA on DCM. Shake the solution and measure UV absorbance at 500 nm. Make sure the absorbance value is below 1.0 units to ensure no signal saturation. Then apply the following equation:

[0566] Loading in μmol / g = (total volume of DCA added in mL) * (Abs value at 500 nm) *1000)  / 76* (mg of CPG taken)

[0567] Total volume of DCA added in mL = 25 mL

[0568] Abs value at 500 nm = 0.6689

[0569] Mg of CPG taken = 5.97 mg

[0570] Loading in μmol / g = ( (25) * (0.6689) *1000)  / 76* (5.97) = 36.85 μmol / g.

[0571] Compound 5-2:

[0572] To a solution of methoxymethyl (triphenyl) phosphonium chloride (12.89 g, 37.61 mmol) , KOtBu (4.69 g, 41.79 mmol) in THF (150 mL) under nitrogen at 0 ℃ was added compound 5-1 (10 g, 41.78 mmol) . The reaction mixture was stirred at 25 ℃ overnight. TLC showed full conversion. The reaction was then adjusted to pH 6 by adding citric acid (10%aq. ) and extracted by ethyl acetate (EA) . The organic phase was concentrated and purified by flash column chromatography (0-10%EA in PE) to afford compound 5-2 as an oil (2.92g, 37%yield) .

[0573] Mass calc. for C15H25NO3: 267.2; found: 268.2 [M+H] +, ESI.

[0574] Compound 5-3:

[0575] To a mixture of compound 5-2 (8.2 g, 30.67 mmol) in MeCN (220 mL) was added 2, 2, 2-trichloroacetic acid (6.31 g, 38.64 mmol) in water (70 mL) and the mixture was stirred overnight. Full conversion by TLC. The reaction was then quenched by adjusting pH to 7-8 by NaHCO3 (aq., sat. ) and extracted by ethyl acetate. The organic phase was concentrated to afford compound 5-3 as an oil (7.8 g) . The crude product was used directly for the next step without purification.

[0576] Mass calc. for C14H23NO3: 253.2; found: 154.2 [M+H-Boc] +, ESI.

[0577] Compound 5-4:

[0578] To a mixture of compound 5-3 (1.35 g, 5.33 mmol) and NaOH (21.32 mg, 532.89 μmol, 29.38 μL) in MeOH (30mL) was added formaldehyde solution (454.47 mg, 15.13 mmol, 37%aq., 0.91 g) . The reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 36 h. The reaction mixture was concentrated to remove most of methanol, extracted by ethyl acetate. The organic phase was concentrated and purified by column (0-5%MeOH in DCM) to afford compound 5-4 as a solid (1.5 g, 96%yield over 2 steps) . Mass calc. for C15H25NO4: 283.2; found: 184.2 [M+H-Boc] +, ESI.

[0579] Compound 5-5:

[0580] To a solution of compound 5-4 (2.95 g, 10.41 mmol) in MeOH (90 mL) was added sodium borohydride (866.50 mg, 22.90 mmol) . The reaction mixture was stirred for 1h. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was adjusted to pH6 by citric acid (10%aq. ) , then it was concentrated to dryness and the residue was extracted by DCM and filtered. The filtrate was concentrated to afford compound 5-5 (2.95 g, 73%yield) , which was used directly for the next step without purification.

[0581] Mass calc. for C15H27NO4: 285.2; found: 271.2 [M+ACN+H-tBu] +, ESI.

[0582] Compound 5-6:

[0583] To compound 5-5 (4 g, 14.02 mmol) was added HCl (4M in dioxane, 63.5 mL) . The reaction mixture was stirred for 3h. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was concentrated to afford compound 5-6 (3.5 g) , which was used directly for the next step without purification.

[0584] Mass calc. for C10H19NO2 (free base) : 185.1; found: 186.1 [M+H] +, ESI.

[0585] Compound 5-7:

[0586] A solution of Fmoc-6-aminohexanoic acid (3.19 g, 9.02 mmol) , DIEA (2.91 g, 22.55 mmol, 3.93 mL) , HOBT (1.46 g, 10.82 mmol) , EDCI (2.08 g, 10.82 mmol) in DCM (12 mL) was stirred for 30  min at 0 ℃, then compound 5-6 (2 g, 9.02 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at rt overnight. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was diluted by DCM (12 mL) and washed with citric acid (10%aq., 20 mL) and water. The organic phase was concentrated and purified by silica gel column (0-5%MeOH in DCM) to afford compound 5-7 (3.5 g, 34%yield) . Mass calc. for C31H40N2O5: 520.3; found: 521.2 [M+H] +, ESI.

[0587] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.91-7.68 (m, 4H) , 7.44-7.28 (m, 5H) , 4.32-4.28 (m, 4H) , 4.20 (t, J = 6.6 Hz, 1H) , 3.69 (s, 2H) , 3.43 (s, 2H) , 3.22 (t, J = 5.6 Hz, 4H) , 2.02-1.98 (m, 3H) , 1.55-1.52 (t, J = 6.6 Hz, 4H) , 2.26-2.23 (m, 4H) , 1.24-1.16 (m, 8H) .

[0588] Compound 5-8:

[0589] To a solution of compound 5-7 (2.2 g, 4.23 mmol) , DMAP (51.6 mg, 0.423 mmol) and DIEA (1.09g, 8.46 mmol) in DCM (66 mL) was added DMTrCl (1.43 g, 4.23 mmol) . The reaction mixture was stirred overnight at room temperature. LC-MS showed partial conversion. The reaction mixture was filtered through a pad of alumina and washed with DCM (50 mL) . The filtrate was concentrated and purified by silica gel column (10-40%EA with 0.1%ammonia in PE, then 0-10%MeOH with 0.1%ammonia in DCM) to afford compound 5-8 (3.0 g, 86%yield) .

[0590] Mass for calc. C52H58N2O7: 822.4; found: 845.3 [M+Na] +, ESI.

[0591] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.90-7.67 (m, 4H) , 7.42-7.39 (m, 4H) , 7.41-7.24 (m, 14H) , 6.89-6.87 (m, 4H) , 4.44 (t, J = 7.6 Hz, 1H) , 4.24-4.19 (m, 1H) , 4.06-4.01 (m, 1H) , 3.74-3.73 (m, 6H) , 3.65-3.59 (m, 2H) , 3.42-3.39 (m, 3H) , 3.32 (br, 1H) , 3.00-2.83 (m, 4H) , 1.99-1.96 (m, 4H) , 1.45-1.16 (m, 16H) .

[0592] Compound 5-9:

[0593] To a solution of compound 5-8 (3 g, 3.65 mmol) in MeOH (90 mL) was added piperidine (9mL) . The reaction mixture was stirred at rt overnight. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was concentrated and then further azeotropically distilled with xylene. The residue was purified by silica gel column chromatographic (0-10%MeOH with 1%TEA in DCM) to afford compound 5-9 (1.1 g, 91%yield) .

[0594] Mass calc. for C37H48N2O5: 600.4; found: 601.3 [M+H] +, ESI.

[0595] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.40-7.21 (m, 9H) , 6.89 (d, J = 7.2 Hz, 4H) , 3.74 (s, 6H) , 3.67-3.61 (m, 2H) , 3.39-3.33 (m, 2H) , 2.86-2.62 (m, 4H) , 1.99 (t, J = 7.4 Hz, 2H) , 1.51-1.21 (m, 16H) .

[0596] Compound 5-10:

[0597] A solution of compound 1-4 (2.09 g, 4.66 mmol) , DIEA (1.08 g, 8.32 mmol, 1.45 mL) , HOBT (539.77 mg, 3.99 mmol) and EDCI (765.80 mg, 3.99 mmol) in DCM (60 mL) was stirred at 0 ℃for 30 min, then compound 5-9 (2 g, 3.33 mmol) was added. The reaction mixture was stirred overnight. The reaction mixture was concentrated and the residue was purified by prep-HPLC (C18, water / ACN) to afford compound 5-10 (1.0 g, 15%yield) .

[0598] Mass calc. for C56H75N3O15: 1029.5; found: 1052.3 [M+Na] +, ESI.

[0599] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.83 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 7.71 (t, J = 5.2 Hz, 1H) , 7.40-7.38 (m, 2H) , 7.32-7.19 (m, 5H) , 6.90-9.87 (m, 2H) , 5.22 (d, J = 3.4 Hz, 1H) , 4.97 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 1H) , 4.49 (d, J = 8.5 Hz, 1H) , 4.42 (t, J = 5.0 Hz, 1H) , 4.03 (s, 2H) , 3.91-3.84 (m, 2H) , 3.74 (s, 6H) , 3.67-3.61 (m, 1H) , 3.44-3.37 (m, 4H) , 3.00 (dd, J = 12.7, 6.6 Hz, 2H) , 2.85 (d, J = 9.6 Hz, 2H) , 2.11 (s, 3H) , 2.05-1.96 (m, 7H) , 1.90 (s, 3H) , 1.78 (s, 3H) , 1.52-1.18 (m, 18H) .

[0600] Compound 5-11:

[0601] To a solution of compound 5-10 (690.0 mg, 0.66 mmol) in anhydrous DCM (3.0 mL) was added 4, 5-dicyanoimidazole (96.0 mg, 0.81 mmol) and 2-Cyanoethyl N, N, N′, N′-tetraisopropylphosphorodiamidite (324 mg, 1.08 mmol) at rt and stirred for 1 h, LCMS showed the starting material was consumed completely. The solution was quenched by water (100 mL) , washed with brine (300 mLx3) and dried over by Na2SO4. Then the solution was concentrated under reduced pressure and the residue was purified by Flash-Prep-HPLC with the following conditions (Column, C18 silica gel; mobile phase, CH3CN / H2O = 1 / 1 increasing to CH3CN / H2O = 1 / 0 within 20 min; Detector, UV 254 nm) . This resulted in giving 5-11 as a white solid (460 mg, 56%yield) .

[0602] Mass calc. for C65H92N5O16P: 1229.63; found: 1230.3 [M+H] +, ESI.

[0603] 1HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.81-7.67 (m, 2H) , 7.40-7.19 (m, 9H) , 6.88-6.86 (m, 4H) , 5.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.98-4.94 (m, 1H) , 4.49 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.04-3.83 (m, 4H) , 3.73-3.32 (m, 18H) , 3.01-2.83 (m, 4H) , 2.72-2.69 (m, 2H) , 2.10-1.76 (m, 16H) , 1.52-1.04 (m, 30H) .

[0604] 31PNMR (242 MHz, DMSO-d6) δ 146.33, 146.26.

[0605] Compound 6-2:

[0606] Compound 6-1 (20 g, 99.88 mmol) was dissolved in THF (200 mL) . NaH (4.79 g, 119.86 mmol, 60%purity) was added to the reaction mixture and stirred 30 min at 0 ℃. 2, 3-Dibromopropylene (20.96 g, 104.88 mmol) was slowly added to the reaction mixture. And the reaction was stirred at rt for 2h. The reaction mixture was quenched with saturated NH4Cl solution (100 mL) , extracted with EA (200 mLX3) , washed with brine (100 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography on silica gel to give compound 6-2 as a colorless oil (31 g, 97%yield) .

[0607] Mass calc. for C13H19BrO4: 318.0; found: 319.0 [M+H] +, ESI.

[0608] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.71-5.58 (m, 3H) , 5.14-5.10 (m, 2H) , 4.25-4.13 (m, 4H) , 3.14 (s, 2H) , 2.7 (d, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.26 (t, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0609] Compound 6-3:

[0610] Compound 6-2 (31 g, 97.12 mmol) , Pd (OAc) 2 (2.18 g, 9.71 mmol) , PPh3 (5.09 g, 19.42 mmol) and AgOAc (19.45 g, 116.54 mmol) were dissolved in CAN (600 mL) . The reaction mixture was stirred at 85 ℃ under N2 atmosphere for 3h. The reaction was cooled down to rt and filtered, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography on silica gel to give compound 6-3 as a colorless oil (21 g, 91%yield) . Mass calc. for C13H18O4: 238.1; found: 239.2 [M+H] +, ESI. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.39 (t, J = 2 Hz, 2H) , 4.95 (t, J = 1.6 Hz, 2H) , 4.18 (q, J = 7.2 Hz, 4H) , 3.03 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 1.24 (t, J = 7.2 Hz, 6H) .

[0611] Compound 6-4:

[0612] Compound 6-3 (21 g, 88.13 mmol) was dissolved in DCM (300 mL) and cooled down to -78 ℃. Br2 (14.08 g, 88.13 mmol, 4.51 mL) was dissolved in DCM (100 mL) and added to the reaction mixture over 1h. The mixture was stirred at -78 ℃ for 1h. The reaction mixture was quenched with saturated Na2SO3 solution (100 mL) , extracted with DCM (200 mLX3) , washed with brine (100 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography on silica gel to give compound 6-4 as a pale-yellow oil (28 g, 80%yield) .

[0613] Mass calc. for C13H18Br2O4: 396.0; found: 397.0 [M+H] +, ESI.

[0614] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4.21 (q, J = 7.2 Hz, 4H) , 4.00 (s, 4H) , 3.19 (s, 4H) , 1.26 (t, J = 7.2 Hz, 6H) .

[0615] Compound 6-5:

[0616] 4-methylbenzenesulfonamide (12.05 g, 70.35 mmol) was dissolved in DMF (260 mL) . NaH (6.19 g, 154.77 mmol) was added to the reaction mixture at 0 ℃. And the reaction mixture was stirred at 0 ℃ for 30 min. Compound 6-4 (28 g, 70.35 mmol) in DMF (50 mL) was added to the reaction mixture slowly. The mixture was stirred at rt for 1h. The reaction mixture was quenched with saturated NH4Cl solution (500 mL) , extracted with EA (200 mLx3) , washed with water (500 mLx3) , brine (300 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography on silica gel to give compound 6-5 as a colorless solid (22 g, 76%yield) .

[0617] Mass calc. for C20H25NO6S: 407.1; found: 408.2 [M+H] +, ESI.

[0618] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.70-7.68 (m, 2H) , 7.32-7.30 (m, 2H) , 4.17 (q, J = 7.2 Hz, 4H) , 3.96 (s, 4H) , 2.89 (s, 4H) , 2.42 (s, 3H) , 1.22 (t, J = 7.2 Hz, 6H) .

[0619] Compound 6-6:

[0620] Compound 6-5 (22 g, 54.05 mmol) was dissolved in THF (300 mL) . LiBH4 (11.8 g, 540.5 mmol) was added to the reaction mixture at 0 ℃. The reaction was stirred at rt for 1h. The reaction mixture was quenched with water (100 mL) , extracted with EA (200 mLx3) , washed with brine (100 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography on silica gel to give compound 6-6 as a white solid (14.8 g, 89%yield) .

[0621] Mass calc. for C16H21NO4S: 323.1; found: 324.1 [M+H] +, ESI.

[0622] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.70-7.68 (m, 2H) , 7.43-7.41 (m, 2H) , 4.56 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 3.26 (d, J = 4.8 Hz, 4H) , 2.84 (s, 4H) , 2.39 (s, 3H) , 1.95 (s, 4H) .

[0623] Compound 6-7:

[0624] Compound 6-6 (4.1 g, 12.68 mmol) and DIEA (4.92 g, 3.83 mmol) were dissolved in DCM (20 mL) . DMTrCl (4.30 g, 12.68 mmol) in DCM (80 mL) was slowly added to the reaction mixture at 0 ℃. The reaction was stirred at rt for 1h. The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (20 mL) , extracted with DCM (50 mLx2) , washed with brine (50 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-3%MeOH) on Al2O3 to give compound 6-7 as a white foam solid (6.39 g, 80%yield) .

[0625] Mass calc. for C37H39NO6S: 625.25; found: 648.25 [M+Na] +, ESI.

[0626] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.68 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 7.41 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 7.33 (d, J = 4.0 Hz, 2H) , 7.31-7.18 (m, 7H) , 6.85 (d, J = 8.0 Hz, 4H) , 4.68 (t, J = 4.8 Hz, 1H) , 3.83 (s, 4H) , 3.72 (s, 6H) , 3.37 (d, J = 2.0 Hz, 2H) , 2.94 (s, 2H) , 2.39 (s, 3H) , 2.07-2.03 (m, 2H) , 1.92-1.89 (m, 2H) .

[0627] Compound 6-8:

[0628] Compound 6-7 (6.0 g, 9.59 mmol) was dissolved in MeOH (300 mL) , then Mg (18 g) was added to the reaction mixture at 0 ℃. The mixture was stirred at rt overnight. The reaction mixture was quenched with H2O, extracted with DCM, washed with brine (50 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-15%MeOH) on Al2O3 to give compound 6-8 as a white foam solid (1.2 g, 26.6%yield) .

[0629] Mass calc. for C30H33NO4: 471.24; found: 472.20 [M+H] +, ESI.

[0630] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.37 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 7.32-7.28 (m, 2H) , 7.25-7.19 (m, 5H) , 6.89-6.87 (m, 4H) , 4.76 (s, 1H) , 3.83 (s, 1H) , 3.73 (s, 6H) , 3.47 (s, 3H) , 3.45 (s, 3H) , 3.00 (s, 2H) , 2.13-2.09 (m, 2H) , 1.97-1.93 (m, 2H) .

[0631] Compound 6-9:

[0632] Compound 6-8 (2.4 g. 5.09 mmol) and Fmoc-6-aminohexanoic acid (1.80g, 5.09 mmol) were dissolved in DCM (60 mL) , then DIEA (1.97g, 15.27 mmol) , EDCI (1.95g, 10.18 mmol) and HOBT (1.38g, 10.18mmol) were added to the mixture. The reaction was stirred at rt for 2h. The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (200 mL) , extracted with DCM (60 mLx3) , washed with brine (60 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-10%MeOH) on Al2O3 to give compound 6-9 as a white foam solid (3.1g, 75%yield) .

[0633] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.88 (d, J = 7.4 Hz, 2H) , 7.68 (d, J = 7.4 Hz, 2H) , 7.43-7.37 (m, 4H) , 7.34-7.28 (m, 5H) , 7.26-7.21 (m, 5H) , 6.88 (d, J = 8.9 Hz, 4H) , 4.75 (t, J = 4.8 Hz, 1H) , 4.30-4.28 (m, 2H) , 4.22-4.19 (m, 1H) , 4.11-3.91 (m, 2H) , 3.91-3.85 (m, 2H) , 3.73 (s, 6H) , 3.49-3.48 (d, J = 4.6 Hz, 2H) , 3.02-2.95 (m, 4H) , 2.20-2.14 (m, 4H) , 2.00-1.97 (m, 2H) , 1.52-1.46 (m, 2H) , 1.44- 1.36 (m, 2H) , 1.24-1.29 (m, 2H) .

[0634] Compound 6-10:

[0635] Compound 6-9 (3.1 g, 3.84 mmol) was dissolved in MeOH (60 mL) , then piperidine (6 mL) was added to the mixture. The reaction was stirred at rt for 8h. The reaction mixture was quenched with water and extracted with DCM (100 mLx3) , washed with brine (60 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-20%MeOH) on Al2O3 to give compound 6-10 as a white foam solid (1.45 g, 64%yield) .

[0636] Mass calc. for C36H44N2O5: 584.33; found: 585.4 [M+H] +, ESI.

[0637] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.39-7.39 (m, 2H) , 7.37-7.28 (m, 2H) , 7.25-7.19 (m, 5H) , 6.88 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 4.76 (s, 1H) , 4.04 (m, 2H) , 3.86 (m, 2H) , 3.78 (s, 6H) , 3.49 (s, 2H) , 3.02 (s, 2H) , 2.55 (m, 2H) , 2.22-2.14 (m, 4H) , 2.01-1.97 (m, 2H) , 1.53-1.46 (m, 2H) , 1.37-1.25 (m, 5H) .

[0638] Compound 6-11:

[0639] Compound 6-10 (1.5 g, 2.57 mmol) and compound 1-4 (1.15 g, 2.57 mmol) were dissolved in DCM (60 mL) , then DIEA (1.66 g, 12.83 mmol) , EDCI (1.10 g, 6.41 mmol) , and HOBT (519.92 mg, 3.85 mmol) were added to the mixture. The reaction was stirred at rt for 2h. The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (200 mL) , extracted with DCM (60 mLx3) , washed with brine (60 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-10%MeOH) on Al2O3 to give compound 6-11 as a white foam solid (2 g, 76%yield) .

[0640] Mass calc. for C55H71N3O15: 1013.49; found: 1014.4 [M+H] +, ESI.

[0641] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.82 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 7.72 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 7.39-7.37 (m, 2H) , 7.32-7.28 (m, 2H) , 7.26-7.19 (m, 5H) , 6.90-6.87 (m, 4H) , 5.22 (d, J = 3.4 Hz, 1H) , 4.97 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 1H) , 4.50-4.48 (m, 1H) , 4.03-4.00 (m, 5H) , 3.91-3.84 (m, 3H) , 3.74 (s, 7H) , 3.49 (d, J = 4.6 Hz, 1H) , 3.43-3.38 (m, 1H) , 3.02-2.98 (m, 4H) , 2.21-2.15 (m, 4H) , 2.10-2.08 (m, 3H) , 2.05-2.00 (m, 7H) , 1.89 (s, 3H) , 1.78 (s, 3H) , 1.52-1.35 (m, 9H) , 1.27-1.24 (m, 3H) .

[0642] Compound 6-12:

[0643] To a solution of compound 6-11 (790.0 mg, 0.78 mmol) in anhydrous DCM (3.0 mL) was added 4, 5-dicyanoimidazole (96.0 mg, 0.81 mmol) and 2-Cyanoethyl N, N, N′, N′-tetraisopropylphosphorodiamidite (324 mg, 1.08 mmol) at rt and stirred for 1 h, LCMS showed the starting material was consumed completely. The solution was quenched by water (100 mL) , washed with brine (300 mLx3) and dried over by Na2SO4. Then the solution was concentrated under reduced pressure and the residue was purified by Flash-Prep-HPLC with the following conditions (Column, C18 silica gel; mobile phase, CH3CN / H2O = 1 / 1 increasing to CH3CN / H2O = 1 / 0 within 20 min; Detector, UV 254 nm) . This resulted in giving 6-12 as a white solid (680 mg, 71%yield) .

[0644] Mass calc. for C64H88N5O16P: 1213.60; found: 1159.5 [M-CH2CH2CN] -, ESI.

[0645] 1HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.82-7.68 (m, 2H) , 7.38-7.19 (m, 9H) , 6.90-6.86 (m, 4H) , 5.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.98-4.94 (m, 1H) , 4.48 (d, J = 12.0 Hz, 1H) , 4.04-3.99 (m, 4H) , 3.90-3.37 (m, 16H) , 3.09-2.87 (m, 4H) , 2.71-2.68 (m, 2H) , 2.19-1.76 (m, 20H) , 1.52-1.05 (m, 22H) . 31PNMR (242 MHz, DMSO-d6) δ 146.51, 146.47.

[0646] Compound 7-2:

[0647] To a solution of methoxymethyl (triphenyl) phosphonium chloride (54.78 g, 159.80 mmol) in THF (600 mL) was added KOtBu (19.92 g, 177.55 mmol) at 0 ℃ and stirred for 0.5 h. Compound 7-1 (20 g, 88.78 mmol) was then added at 0 ℃ and stirred overnight, allowing the reaction to warm to rt. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was adjusted to pH6 by citric acid (10%aq. ) , filtered and concentrated to dryness. The residue was purified by silica gel column (0-5%EA in PE) , to afford compound 7-2 as an oil (15.5 g, 68%yield) .

[0648] Mass calc. for C14H23NO3: 253.2; found: 239.1 [M-tBu+ACN+H] +, ESI.

[0649] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 5.99 (pent, J = 2.1 Hz, 1H) , 3.48 (s, 3H) , 3.44-3.36 (m, 2H) , 2.99-2.91 (m, 2H) , 2.59 (br, 2H) , 2.44-2.36 (m, 2H) , 2.04-1.97 (m, 2H) , 1.38 (s, 9H) .

[0650] Compound 7-3:

[0651] To a solution of compound 7-2 (5 g, 19.74 mmol) in MeCN (150 mL) was added 2, 2, 2-trichloroacetic acid (4.06 g, 24.87 mmol, in 50 mL of water) . The reaction mixture was stirred at rt overnight. TLC showed full conversion. The reaction mixture was adjusted to pH7 by NaHCO3 (aq, sat) , and extracted by EA. The organic phase was concentrated to afford crude compound 7-3 as an oil (4.7 g 99%yield) , which is used directly in the next step without further purification.

[0652] Mass calc. for C13H21NO3: 239.2; found: 225.1 [M-tBu+ACN+H] +, ESI.

[0653] Compound 7-4:

[0654] To a mixture of compound 7-3 (4.7 g, 19.64 mmol) and K2CO3 (542.87 mg, 3.93 mmol) in MeOH (150 mL) was added formalin (15.9 g 37%aq. formaldehyde, 55.78 mmol) . The reaction mixture was stirred at rt overnight. TLC showed full conversion. The reaction mixture was adjusted to pH6 by citric acid (10%aq. ) , and extracted by EA. The organic phase was concentrated and purified by silica gel column (0-3%MeOH in DCM) to afford compound 7-4 as an oil (5.2 g, 98%yield) . Mass calc. for C14H23NO4: 269.2; found: 170.1 [M-Boc+H] +, ESI.

[0655] Compound 7-5:

[0656] To a solution of compound 7-4 (17 g, 63.12 mmol) in MeOH (190 mL) was added NaBH4 (5.25 g, 138.86 mmol) . The reaction mixture was stirred at r. t. for 1h. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was adjusted to pH6 by citric acid (10%aq) , filtered and extracted by DCM. The organic phase was concentrated and purified by silica gel column (0-5%MeOH in DCM) to afford compound 7-5 (14.5 g, 84%yield) .

[0657] Mass calc. for C14H25NO4: 271.2; found: 172.1 [M-Boc+H] +, ESI.

[0658] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.53 (t, J = 5.3 Hz) , 3.37-3.32 (m, 2H) , 3.27 (d, J = 5.3 Hz, 2H) ,  3.19 (d, J = 5.3 Hz, 2H) , 3.07 (dd, J = 10.78, 3.5 Hz, 2H) , 1.60 (dd, J = 13.4, 7.9 Hz, 2H) 1.39 (s, 9H) , 1.27 (dd, J = 13.5, 6.3 Hz, 2H) .

[0659] Compound 7-6:

[0660] To a reaction vial charged with compound 7-5 (14.5 g, 53.44 mmol) was added HCl in dioxane (4 M, 140 mL) . The reaction mixture was stirred at r. t. for 1.5h. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was concentrated to afford crude compound 7-6 (11 g) , which was used directly for the next step without further purification.

[0661] Mass calc. for C9H17NO2 (free base) : 171.1; found: 172.1 [M-Boc+H] +, ESI.

[0662] Compound 7-7:

[0663] A mixture of Fmoc-6-aminohexanoic acid (18.38 g, 52.00 mmol) , DIEA (16.80 g, 130.00 mmol, 22.64 mL) , HOBT (8.43 g, 62.40 mmol) and EDCI (11.96 g, 62.40 mmol) in DCM (300 mL) was stirred at 0 ℃ for 30 min, then compound 7-6 (10.8 g, 52.00 mmol) was added. The reaction mixture was stirred overnight, allowing it to warm to r. t. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was diluted with DCM (300 mL) and washed with NaHCO3 (aq, sat) and water. The organic phase was concentrated and purified by silica gel column (0-10%MeOH in DCM) to afford compound 7-7 as a gum (19.6 g, 74%yield) .

[0664] Mass calc. for C30H38N2O5: 506.3; found: 507.3 [M+H] +, ESI.

[0665] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.90-7.68 (m, 4H) , 7.44-7.33 (m, 5H) , 4.55 (s, 2H) , 4.29 (d, J =6.8 Hz, 2H) , 4.23-4.18 (m, 1H) , 3.28-3.21 (m, 6H) , 2.97-2.96 (m, 2H) , 2.61-2.53 (m, 2H) , 2.17 (t, J =7.6 Hz, 2H) , 1.63-1.23 (m, 12H) .

[0666] Compound 7-8:

[0667] To a solution of compound 7-7 (19 g, 37.50 mmol) , N, N-dimethylpyridin-4-amine (458.17 mg, 3.75 mmol) and DIEA (7.27 g, 56.25 mmol, 9.80 mL) in DCM (590 mL) was added DMTrCl (13.98 g, 41.25 mmol) portion-wise at 0 ℃. The reaction mixture was stirred overnight. LC-MS showed partial conversion, formation of 2 isomers and di-DMTr by-product. The reaction mixture was concentrated and purified by silica gel column (20-100%EA with 0.2%TEA in PE) to afford compound 7-8a and 7-8b as a mixture of endo-and exo-isomers (17.9 g, 47%yield) . Isomers were separated by prep-HPLC (C18 column, water / ACN) to afford compound 7-8a (exo-, 7.5 g) and compound 7-8b (endo-, 5.7 g) .

[0668] 7-8a:

[0669] Mass calc. for C51H56N2O7: 808.4; found: 832.3 [M+Na] +, ESI.

[0670] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.90-7.88 (m, 2H) , 7.69-7.67 (m, 2H) , 7.43-8.18 (m, 13H) , 6.88-6.85 (m, 4H) , 4.62 (br, 1H) , 4.37-4.28 (m, 2H) , 4.20 (t, J = 6.7 Hz, 1H) , 3.73 (s, 6H) , 3.47 (dd, J =9.9, 8.2 Hz, 1H) , 3.28 (br, 2H) , 3.11 (td, J = 12.0, 4.3 Hz, 2H) , 2.99-2.91 (m, 4H) , 2.66-2.54 (m, 2H) , 2.19-2.06 (m, 2H) , 1.67 (pent, J = 6.8 Hz, 2H) , 1.51-1.17 (m, 10H) .

[0671] 7-8b:

[0672] Mass calc. for C51H56N2O7: 808.4; found: 832.3 [M+Na] +, ESI.

[0673] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.90-7.84 (m, 4H) , 7.44-7.20 (m, 13H) , 6.91-6.89 (m, 4H) , 6.66 (br, 1H) , 6.29 (s, 2H) , 3.74 (s, 6H) , 3.36-3.31 (m, 3H) , 3.22-3.12 (m, 3H) , 2.90 (dd, J = 12.7, 6.5 Hz, 2 H) , 2.86 (s, 2H) , 2.44-2.29 (m, 2H) , 2.15 (t, J = 7.1 Hz, 2H) , 1.64-1.18 (m, 12H) .

[0674] Compound 7-9a:

[0675] A solution of compound 7-8a (6.5 g, 8.03 mmol) in MeOH (200 mL) and piperidine (20 mL) was stirred at r. t. overnight, LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was concentrated, and the residue was purified by silica gel column (20-30%MeOH with 1%TEA in DCM) to afford compound 7-9a (4.4 g, 94%yield) .

[0676] Mass calc. for C36H46N2O5: 586.3; found: 587.3 [M+H] +, ESI.

[0677] Compound 7-10a:

[0678] A solution of compound 1-4 (4.70 g, 10.50 mmol) , DIEA (2.42 g, 18.75 mmol, 3.27 mL) , HOBT (1.22 g, 9.00 mmol) and EDCI (1.73 g, 9.00 mmol) in DCM (132 mL) was stirred at 0 ℃ for 30 min, then compound 7-9a (4.4 g, 7.50 mmol) was added. The reaction mixture was stirred overnight. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was diluted with DCM (150 mL) , washed with water. The organic phase was concentrated and purified by silica gel column (0-10%MeOH with 1%TEA in DCM) to afford compound 7-10a (3.8 g, 51%yield) .

[0679] Mass calc. for C55H73N3O15: 1015.5; found: 1039.1 [M+Na] +, ESI.

[0680] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.85 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 7.74 (t, J = 5.3 Hz, 1H) , 7.38-7.36 (m, 2H) , 7.31-7.27 (m, 2H) , 7.24-7.19 (m, 5H) , 6.88-6.86 (m, 4H) , 5.22 (d, J = 2.8 Hz, 1H) , 4.97 (dd, J = 11.2, 2.8 Hz, 1H) , 4.65 (t, J = 4.8 Hz, 1H) , 4.49 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 4.03 (s, 3H) , 3.88 (dd, J =19.5, 9.1 Hz, 1H) , 3.73-3.70 (m, 7H) , 3.50-3.39 (m, 2H) , 3.34-3.31 (m, 1H) , 3.27 (d, J = 4.5 Hz, 2H) , 3.17 (d, J = 5.2 Hz, 1H) , 3.15-3.09 (m, 2H) , 3.00 (dd, J = 12.4, 6.3 Hz, 2H) , 2.94 (br, 1H) , 2.67-2.53 (m, 2H) , 2.19-2.08 (m, 5H) , 2.04 (t, J = 6.9 Hz, 2H) , 2.00 (s, 3H) , 1.89 (s, 3H) , 1.78 (s, 3H) , 1.70-1.63 (m, 2H) , 1.53-1.16 (m, 14H) .

[0681] Compound 7-11a:

[0682] To a solution of compound 7-10a (680.0 mg, 0.67 mmol) in anhydrous DCM (3.0 mL) was added 4, 5-dicyanoimidazole (96.0 mg, 0.81 mmol) and 2-Cyanoethyl N, N, N′, N′-tetraisopropylphosphorodiamidite (324 mg, 1.08 mmol) at rt and stirred for 1 h, LCMS showed the starting material was consumed completely. The solution was quenched by water (100 mL) , washed with brine (300 mLx3) and dried over by Na2SO4. Then the solution was concentrated under reduced pressure and the residue was purified by Flash-Prep-HPLC with the following conditions (Column, C18 silica gel; mobile phase, CH3CN / H2O = 1 / 1 increasing to CH3CN / H2O = 1 / 0 within 20 min; Detector, UV 254 nm) . This resulted in giving 7-11a as a white solid (390 mg, 47%yield) .

[0683] Mass calc. for C64H90N5O16P: 1215.61; found: 1161.3 [M-CH2CH2CN] -, ESI.

[0684] 1HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.81-7.69 (m, 2H) , 7.40-7.19 (m, 9H) , 6.88-6.86 (m, 4H) , 5.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.98-4.94 (m, 1H) , 4.49 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.02-3.83 (m, 4H) , 3.73-3.32 (m, 18H) ,  3.01-2.97 (m, 6H) , 2.71-2.68 (m, 4H) , 2.12-1.99 (m, 18H) , 1.49-1.04 (m, 24H) .

[0685] 31PNMR (242 MHz, DMSO-d6) δ 146.70.

[0686] Compound 7-9b:

[0687] A solution of compound 7-8b (5.70 g, 7.05 mmol) in MeOH (200 mL) and piperidine (20 mL) was stirred at r. t. overnight. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was concentrated and purified by silica gel column (10-20%MeOH with 1%TEA in DCM) to afford compound 7-9b (4.1 g, 99%yield) .

[0688] Mass calc. for C36H46N2O5: 586.3; found: 587.3 [M+H] +, ESI.

[0689] Compound 7-10b:

[0690] A solution of compound 1-4 (4.38 g, 9.78 mmol) , DIEA (2.26 g, 17.47 mmol, 3.04 mL) , HOBT (1.13 g, 8.39 mmol) , EDCI (1.61 g, 8.39 mmol) in DCM (120 ml) was stirred at 0 ℃ for 30 min, then compound 7-9b (4.10 g, 6.99 mmol) was added. The reaction mixture was stirred overnight. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was diluted with DCM (150 mL) , washed by water. The organic phase was concentrated and purified by silica gel column (0-10%MeOH with 1%TEA in DCM) to give crude product 4.4 g, which is further purified by prep-HPLC (C18, water / ACN) to afford compound 7-10b (2.0 g, 28%yield) .

[0691] Mass calc. for C55H73N3O15: 1015.5; found: 1039.1 [M+Na] +, ESI.

[0692] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.84 (d, J = 9.2 Hz, 1H) , 7.72 (t, J = 5.5 Hz, 1H) , 7.40-7.38 (m, 2H) , 7.33-7.29 (m, 2H) , 7.28-7.20 (m, 5H) , 6.91-6.88 (m, 4H) , 5.22 (d, J = 3.3 Hz, 1H) , 4.97 (dd, J = 11.2, 3.3 Hz, 1H) , 4.66 (t, J = 4.9 Hz, 1H) , 4.49 (d, J = 8.5 Hz, 1H) , 4.03 (s, 3H) , 3.88 (dd, J =20.2, 8.8 Hz, 1H) , 3.74-3.69 (m, 7H) , 3.48-3.38 (m, 4H) , 3.34-3.31 (m, 1H) , 3.21 (dd, J = 10.4, 4.2 Hz, 1H) , 3.14 (dd, J = 12.0, 4.6 Hz, 1H) , 3.00 (dd, J = 12.7, 6.6 Hz, 2H) , 2.86 (s, 2H) , 2.46-2.27 (m, 2H) , 2.16 (t, J = 6.7 Hz, 2H) , 2.11 (s, 3H) , 2.04 (t, J = 7.0 Hz, 2H) , 2.00 (s, 3H) , 1.89 (s, 3H) , 1.78 (s, 3H) , 1.63-1.12 (m, 14H) .

[0693] Compound 7-11b:

[0694] To a solution of compound 7-10b (680.0 mg, 0.67 mmol) in anhydrous DCM (3.0 mL) was added 4, 5-dicyanoimidazole (96.0 mg, 0.81 mmol) and 2-Cyanoethyl N, N, N′, N′-tetraisopropylphosphorodiamidite (324 mg, 1.08 mmol) at rt and stirred for 1 h, LCMS showed the starting material was consumed completely. The solution was quenched by water (100 mL) , washed with brine (300 mLx3) and dried over by Na2SO4. Then the solution was concentrated under reduced pressure and the residue was purified by Flash-Prep-HPLC with the following conditions (Column, C18 silica gel; mobile phase, CH3CN / H2O = 1 / 1 increasing to CH3CN / H2O = 1 / 0 within 20 min;  Detector: UV 254 nm) . This resulted in giving compound 7-11b as a white solid (390 mg, 47%yield) .

[0695] Mass calc. for C64H90N5O16P: 1215.61; found: 1161.6 [M-CH2CH2CN] -, ESI.

[0696] 1HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.81-7.69 (m, 2H) , 7.40-7.19 (m, 9H) , 6.88-6.86 (m, 4H) , 5.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.98-4.94 (m, 1H) , 4.49 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.02-3.83 (m, 4H) , 3.73-3.32 (m, 18H) , 3.01-2.97 (m, 6H) , 2.71-2.68 (m, 4H) , 2.12-1.99 (m, 18H) , 1.49-1.04 (m, 24H) .

[0697] 31PNMR (242 MHz, DMSO-d6) δ 146.22.

[0698] Compound 8-2:

[0699] To a solution of methoxymethyl (triphenyl) phosphonium chloride (17.71 g, 51.67 mmol) in THF (120 mL) was added KOtBu (9.66 g, 86.12 mmol) at 0 ℃ and stirred for 0.5 h. Compound 8-1 (9.7 g, 43.06 mmol) was then added at 0 ℃ and stirred overnight, allowing the reaction to warm to rt. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was adjusted to pH6 by adding citric acid (10%aq. ) , filtered and concentrated to dryness. The residue was purified by silica gel column (0-5%EA in PE) to afford compound 8-2 as an oil (6.0 g, 55%yield) .

[0700] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 6.01 (s, 1H) , 3.48 (s, 3H) , 3.43-3.33 (m, 2H) , 2.82-2.74 (m, 2H) , 2.35-2.26 (m, 2H) , 1.90-1.79 (m, 4H) , 1.38 (s, 9H) .

[0701] Compound 8-3:

[0702] To a solution of compound 8-2 (5.85 g, 23.09 mmol) in THF (50 mL) was added hydrochloric acid (3.28 g, 90.00 mmol, 2N, 45 mL) . The reaction mixture was stirred at rt for 3h. TLC showed full conversion. The reaction mixture was adjusted to pH7 by adding NaHCO3 (aq., sat. ) , and extracted by EA. The organic phase was concentrated to afford crude compound 8-3 as an oil (5.5 g) , which is used directly in the next step without further purification.

[0703] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.62 (pent, J = 1.2 Hz, 1H) , 3.42-3.33 (m, 3H) , 2.82-2.72 (m, 2H) , 2.03-1.93 (m, 1H) , 1.92-1.87 (m, 2H) , 1.75-1.62 (m, 1H) , 1.51-1.44 (m, 1H) , 1.38 (s, 9H) .

[0704] Compound 8-4:

[0705] To a mixture of compound 8-3 (5.25 g, 21.94 mmol) and K2CO3 (660.39 mg, 4.39 mmol) in MeOH (30 mL) was added formalin (6.59 g, 37%aq., 219.38 mmol) . The reaction mixture was stirred at rt overnight. TLC showed full conversion. The reaction mixture was adjusted to pH6 by adding citric acid (10%aq. ) and extracted by EA. The organic phase was concentrated to afford compound 8-4 (6.7 g) , which was used directly in the next step without further purification.

[0706] Compound 8-5:

[0707] To a solution of compound 8-4 (6.3 g, 23.39 mmol) in MeOH (50 mL) was added NaBH4 (2.65 g, 70.17 mmol) . The reaction mixture was stirred at rt for 1h. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was adjusted to pH6 by adding citric acid (10%aq. ) , filtered and extracted by DCM. The organic phase was concentrated and purified by silica gel column (0-5%MeOH in DCM) to afford compound 8-5 (1.4 g, 22%yield) .

[0708] Mass calc. for C14H25NO4: 271.18; found: 257.24 [M-tBu+CH3CN+H] +, ESI.

[0709] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.16-7.55 (m, 1H) , 4.52-4.48 (m, 2H) , 3.36-3.27 (m, 5H) , 2.74-2.50 (m, 2H) , 1.98-1.84 (m 2H) , 1.54-1.50 (m 2H) , 1.49 (s, 9H) , 1.05-0.97 (m, 2H) .

[0710] Compound 8-6:

[0711] Compound 8-5 (1.35 g, 4.97 mmol) was dissolved in DCM (5 mL) , HCl / Dioxane (4M, 10 mL) was added to the mixture at rt and then stirred at rt for 2 h. The reaction mixture concentrated under vacuum to give crude product 8-6 (1.3 g) as an oil, which was used in the next step without further purification.

[0712] Mass calc. for C9H17NO2: 171.1; found: 172.2 [M+H] +, ESI.

[0713] Compound 8-7:

[0714] Z-6-aminohexanoic acid (1.99 g, 7.51 mmol) , HATU (4.72 g, 12.52 mmol) and DIPEA (2.43 g, 18.78 mmol, 3.27 mL) were dissolved in DCM (20 mL) . The reaction was stirred for 20 min, then compound 8-6 (1.3 g, 6.26 mmol) was added and stirred for another 2 hours. The reaction mixture was quenched with H2O (20 mL) , washed with saturated NaHCO3 aq. (30 mL) , washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (DCM: MeOH = 20: 1) on silica gel to give compound 8-7 as a white foam solid (1.5 g, 3.58 mmol, 57%yield) . Mass calc. for C23H34N2O5: 418.3; found: 419.3 [M+H] +, ESI.

[0715] Compound 8-8:

[0716] Compound 8-7 (1.2 g, 2.87 mmol) was dissolved in DCM (20 mL) . DMTrCl (971.49 mg, 2.87 mmol) and DIPEA (741.12 mg, 5.73 mmol, 998.81 μL) were added. The reaction mixture was stirred at rt for 2 hours. Then the reaction was quenched with water, extracted with DCM (50 mLx2) , washed with brine (50 mL) . The organic phase was collected, dried, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (DCM: MeOH: TEA = 20: 1: 0.5%) on Al2O3 to give compound 8-8 as a white foam solid (850 mg, 41%yield) .

[0717] Mass calc. for C44H52N2O7: 720.4; found: 721.4 [M+H] +, ESI.

[0718] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.41-7.36 (m, 3H) , 7.35-7.29 (m, 6H) , 7.27-7.20 (m, 5H) , 6.89 (d, J = 8.9 Hz, 4H) , 5.00 (s, 2H) , 4.67 (t, J = 4.9 Hz, 1H) , 3.75 (s, 6H) , 3.55-3.47 (m, 2H) , 3.39 (d, J = 4.5 Hz, 2H) , 3.00-2.95 (m, 4H) , 2.92-2.84 (m, 1H) , 2.62 (q, J = 11 Hz, 1H) , 2.16-2.10 (m, 2H) , 1.95-1.70 (m, 2H) , 1.62-1.58 (m, 1H) , 1.51-1.35 (m, 5H) , 1.27-1.23 (m, 3H) , 1.12-1.00 (m, 2H) .

[0719] Compound 8-9:

[0720] Compound 8-8 (0.8 g, 1.11 mmol) was dissolved in MeOH (10mL) . Pd / C (80 mg) was added. The reaction mixture was stirred at rt for 3 h under hydrogen atmosphere. The reaction mixture was filtered and concentrated under vacuum to give crude product 8-9 as a white foam solid (550 mg,  84%yield) , which was used in the next step without further purification.

[0721] Mass calc. for C36H46N2O5: 586.3; found: 587.3 [M+H] +, ESI.

[0722] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.40-7.38 (m, 2H) , 7.31 (t, J = 7.7 Hz, 2H) , 7.29-7.18 (m, 5H) , 6.89 (d, J = 8.9 Hz, 4H) , 3.74 (s, 6H) , 3.54-3.43 (m, 2H) , 3.34-3.21 (m, 2H) , 2.96 (s, 2H) , 2.94-2.85 (m, 2H) , 2.67-2.55 (m, 1H) , 2.17-2.10 (m, 2H) , 1.99-1.74 (m, 2H) , 1.63-1.58 (m, 1H) , 1.53-1.42 (m, 3H) , 1.36-1.24 (m, 5H) , 1.16-1.10 (m, 1H) , 1.05-0.98 (m, 1H) .

[0723] Compound 9-2:

[0724] Methoxymethyl (triphenyl) phosphonium chloride (116.8 g, 340.72 mmol) was dissolved in THF (1200 mL) . KOtBu (46.74 g, 416.56 mmol) was added to the mixture at 0 ℃. The reaction mixture was stirred at 0 ° for another 30 min. Compound 9-1 (40g, 189.34 mmol) was added to the mixture. The mixture was warmed to rt and stirred at rt overnight. The reaction was quenched with saturated citric acid and pH was adjusted to 6-7. The reaction mixture was extracted with EA (500 mL x3) , washed with brine (200 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (10-30%EA in PE) on silica gel to get compound 9-2 as an oil (24 g, 52%yield) .

[0725] Mass calc. for C13H21NO3: 239.3; found: 225.1 [M-tBu+ACN+H] +, ESI.

[0726] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 5.88 (t, J = 2.4 Hz, 1H) , 3.83 (s, 4H) , 3.47 (s, 3H) , 2.79-2.74 (m, 4H) , 1.41 (s, 9H) .

[0727] Compound 9-3:

[0728] Compound 9-2 (15 g, 62.68 mmol) was dissolved in ACN (450 mL) . 2, 2, 2-trichloroacetic acid (12.90 g, 78.98 mmol) in water (150 mL) was added to the reaction mixture. The reaction was stirred at rt overnight, then it was quenched with saturated NaHCO3 and PH was adjusted to 7-8. The mixture was extracted with EA (200 mLx3) , washed with brine (100 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum TO give crude product 9-3 as an oil (13 g, 92%yield) , which was used in the next step without further purification.

[0729] Mass calc. for C12H19NO3: 225.3; found: 211.1 [M-tBu+ACN+H] +, ESI.

[0730] Compound 9-4:

[0731] Compound 9-3 (13 g, 57.71 mmol) was dissolved in MeOH (400 mL) . K2CO3 (1.60 g, 11.54 mmol) and formaldehyde (4.92 g, 163.88 mmol, in water) was added to the mixture. The reaction was stirred at rt overnight, then it was quenched with saturated citric acid and PH was adjusted to 6-7. The mixture was concentrated under vacuum to remove MeOH. The residue was extracted with EA (200 mLx3) , washed with brine (100 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum to give crude product 9-4 (14 g, 95%yield) .

[0732] Mass calc. for C13H21NO4: 255.3; found: 241.1 [M-tBu+ACN+H] +, ESI.

[0733] Compound 9-5:

[0734] Compound 9-4 (14 g, 54.84 mmol) was dissolved in MeOH (420 mL) . NaBH4 (4.56 g, 120.64 mmol) was added portion-wise. The reaction was stirred at rt for 1 h, then it was quenched with water. PH was adjusted to 6-7 with saturated citric acid. The mixture was concentrated under vacuum to remove MeOH, then the residue was extracted with DCM (200 mLx3) , washed with brine (100 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-5%MeOH) on silica gel to give compound 9-5 (7.05 g, 50%yield) .

[0735] Mass calc. for C13H23NO4: 257.3; found: 243.1 [M-tBu+ACN+H] +, ESI.

[0736] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.51-4.11 (m, 2H) , 3.83-3.75 (m, 4H) , 3.25-3.17 (m, 4H) , 2.01-1.91 (m, 4H) , 1.36 (s, 9H) .

[0737] Compound 9-6:

[0738] Compound 9-5 (13.1 g, 50.91 mmol) was dissolved in HCl in 1, 4-Dioxane (4 M, 131 mL) . The reaction mixture was stirred at rt for 1h, then it was concentrated under vacuum to give crude product 9-6 (9.8 g) , which was used in the next step without further purification.

[0739] Mass calc. for C8H13NO2Cl: 157.2; found: 158.2 [M+H] +, ESI.

[0740] Compound 9-7:

[0741] Compound 9-6 (9.8 g, 50.60 mmol) was dissolved in DCM (300 mL) . DIEA (22.89 g, 177.10 mmol, 30.85 mL) , HOBT (8.20 g, 60.72 mmol) , EDCI (11.64 g, 60.72 mmol) and Fmoc-6-hexanoic acid (17.88 g, 50.60 mmol) were added to the reaction mixture. And the reaction was stirred at rt overnight, then it was quenched with water, washed with 10%citric acid (50 mL) , saturated NaHCO3 solution (50 mL) , brine (50 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-10%MeOH) on silica gel to give compound 9-7 (6.7 g, 25%yield over two steps) .

[0742] Mass calc. for C30H36N2O5: 492.3; found: 493.3 [M+H] +, ESI.

[0743] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.91-7.68 (m, 4H) , 7.44-7.28 (m, 4H) , 6.76 (s, 1H) , 6.68-6.66 (m, 1H) , 6.29 (s, 2H) , 4.01 (s, 2H) , 3.74 (s, 2H) , 3.69 (s, 2H) , 3.27 (s, 4H) , 2.92-2.87 (m, 2H) , 1.98-1.91 (m, 4H) , 1.46-1.18 (m, 6H) .

[0744] Compound 9-8:

[0745] Compound 9-7 (6.7 g, 13.60 mmol) , DMAP (166.15 mg, 1.36 mmol) and DIEA (2.64 g, 20.40 mmol, 3.18 mL) were dissolved in DCM (180 mL) . DMTrCl (5.52 g, 14.96 mmol) was added to the  reaction mixture portion-wise at 0℃. The reaction was stirred at rt overnight, then it was quenched with water. The mixture was extracted with DCM (50 mLx2) , washed with brine (50 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (50-100%EA) on Al2O3 to give compound 9-8 (4.3 g, 40%yield) .

[0746] Mass calc. for C51H56N2O8: 824.4; found: 848.3 [M+Na] +, ESI.

[0747] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.91-7.68 (m, 4H) , 7.44-7.28 (m, 4H) , 7.75-7.71 (m, 6H) , 6.90-6.88 (m, 6H) , 6.67-6.65 (m, 1H) , 6.29 (s, 2H) , 3.96 (s, 1H) , 3.74 (s, 9H) , 3.69-3.67 (m, 2H) , 3.53 (s, 1H) , 3.39-3.37 (m, 2H) , 2.92-2.89 (m, 4H) , 2.03-1.79 (m, 8H) , 1.46-1.18 (m, 6H) .

[0748] Compound 9-9:

[0749] Compound 9-8 (4.2 g, 5.09 mmol) was dissolved in MeOH (126 mL) , then piperidine (12.6 mL) was added to the mixture. The reaction mixture was stirred at rt overnight, then it was concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-10%MeOH) on Al2O3 to give compound 9-9 as a white foam (3 g, 97%yield) .

[0750] Mass calc. for C36H46N2O6: 602.3; found: 603.4 [M+H] +, ESI.

[0751] Compound 9-10:

[0752] Compound 1-4 (3.2 g, 7.16 mmol) and compound 9-9 (3 g, 5.11 mmol) were dissolved in DCM (130 mL) . DIEA (1.65 g, 12.78 mmol, 2.17 mL) , HOBT (807.01 mg, 6.13 mmol) and EDCI (1.18 g, 6.13 mmol) were added to the mixture. The reaction was stirred at rt overnight, then it was quenched with water (40 mL) , extracted with DCM (50 mLx2) , washed with brine (50 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by HPLC to give compound 9-10 (610 mg, 12%yield) .

[0753] Mass calc. for C55H73N3O16: 1031.5; found: 1054.5 [M+Na] +, ESI.

[0754] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.82-7.73 (m, 2H) , 7.24-6.88 (m, 12H) , 5.22 (s, 1H) , 4.97 (d, J = 10.8 Hz, 1H) , 4.64-4.48 (m, 2H) , 4.05-3.85 (m, 4H) , 3.71-3.69 (m, 12H) , 3.52 (s, 1H) , 3.39-3.38 (m, 1H) , 3.04-2.91 (m, 4H) , 2.11-1.78 (m, 19H) , 1.46-1.18 (m, 14H) .

[0755] Compound 9-11:

[0756] To a solution of compound 9-10 (1.0 g, 0.97 mmol) in anhydrous DCM (3.0 mL) was added 4, 5-dicyanoimidazole (32.0 mg, 0.27 mmol) and 2-Cyanoethyl N, N, N′, N′-tetraisopropylphosphorodiamidite (108 mg, 0.36 mmol) at rt and stirred for 1 h. LCMS showed the starting material was consumed completely. The solution was quenched by water (100 mL) , washed  with brine (300 mLx3) and dried over by Na2SO4. Then the solution was concentrated under reduced pressure and the residue was purified by Flash-Prep-HPLC with the following conditions (Column: C18 silica gel; mobile phase: CH3CN / H2O = 1 / 1 increasing to CH3CN / H2O = 1 / 0 within 20 min; Detector: UV 254 nm) . This resulted in giving compound 9-11 as a white solid (680 mg, 56%yield) . Mass calc. for C64H90N5O17P: 1231.61; found: 1177.1 [M-CH2CH2CN] -, ESI.

[0757] 1HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.81-7.67 (m, 2H) , 7.26-7.23 (m, 6H) , 6.88-6.86 (m, 6H) , 5.22 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.98-4.95 (m, 1H) , 4.48 (d, J = 12.0 Hz, 1H) , 4.04-3.96 (m, 4H) , 3.89-3.84 (m, 1H) , 3.73-3.38 (m, 20H) , 3.01-2.93 (m, 4H) , 2.73-2.71 (m, 2H) , 2.10-1.75 (m, 20H) , 1.51-1.07 (m, 22H) . 31PNMR (242 MHz, DMSO-d6) δ 146.82, 146.70.

[0758] Compound 9-12:

[0759] To a solution of compound 9-10 (100 mg, 0.097 mmol) in anhydrous DCM (1.0 mL) , DMAP (5 mg, 0.04 mmol) and TEA (24 mg, 0.24 mmol) were added, followed by adding succinic anhydride (20 mg, 0.2 mmol) . The reaction mixture was stirred at rt for 3 h, LCMS showed the starting material was consumed completely. The reaction mixture was diluted with DCM (10 mL) and washed with H2O (3 mLx4) , then washed with brine (3 mLx4) , the organic layer was concentrated to give compound 9-12 as a white solid (85 mg, 90%yield) .

[0760] Mass calc. for C59H77N3O19: 1131.52; found: 1130.2 [M-H] -, ESI.

[0761] 1HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.87-7.72 (m, 2H) , 7.24-7.21 (m, 6H) , 6.90-6.87 (m, 6H) , 5.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.98-4.95 (m, 1H) , 4.49 (d, J = 12.0 Hz, 1H) , 4.06-3.98 (m, 6H) , 3.90-3.83 (m, 1H) , 3.73-3.50 (m, 13H) , 3.02-2.94 (m, 4H) , 2.45-2.44 (m, 4H) , 2.11-1.76 (m, 20H) , 1.48-1.18 (m, 12H) .

[0762] Solid support 9-13:

[0763] Native amino-LCAA-CPG (loading value: 75 μmol / g,  ) was washed with ACN (100 mLx2) , DMF (100 mLx2) and DCM (100 mLx2) , then dried under high vacuum overnight.

[0764] To a solution of succinate 9-12 (85 mg, 0.075 mmol) and HBTU (53 mg, 0.14 mmol) in anhydrous DMF(1.5 mL) , DIPEA (30 mg, 0.23 mmol) was added, the reaction mixture was shaken at rt for 10 min, then native amino-LCAA-CPG (300 mg, loading 75 μmol / g) was added, the suspension was shaken at rt for 20 h, then filtered, washed with DMF (20 mLx5) , ACN (20 mLx5) , DCM (20 mLx5) until TLC showed no spot at 254 nm in eluent. The solid support was dried under vacuum for 2 h to give solid support (300 mg) . The unreacted amines on the solid support were capped by stirring with Ac2O / pyridine / N-methyl imidazole (90 μL / 1.0 mL / 80 μL) at RT for 1 h, washed with DMF (20 mLx5) , CAN (20 mLx5) , DCM (20 mLx5) until TLC showed no spot at 254 nm in eluent. The solid support was dried under vacuum for 15 h to give solid support 9-13 (300 mg) . For loading calculation, take 5.00 mg of the dried loaded CPG and add 25 mL of 3%DCA on DCM. Shake the solution and measure UV absorbance at 482 nm. Make sure the absorbance value is below 1.0 units to ensure no signal saturation. Then apply the following equation:

[0765] Loading in μmol / g = (total volume of DCA added in mL) * (Abs value at 482 nm) *1000)  / 78.3* (mg of CPG taken)

[0766] Total volume of DCA added in mL = 25 mL

[0767] Abs value at 482 nm = 0.577

[0768] Mg of CPG taken = 5.00 mg

[0769] Loading in μmol / g = ( (25) * (0.577) *1000)  / 78.3* (5.00) = 36.8 μmol / g.

[0770] Compound 10-2:

[0771] Compound 10-1 (0.6 g, 0.299 mmol) , DIEA (96.63 mg, 0.748 mmol, 130.23 μL) , HOBT (48.49 mg, 0.359 mmol) and EDCI (68.80 mg, 0.359 mmol) were mixed in DCM (18 mL) and stirred at rt for 30 min, then compound 2-10 (412.34 mg, 0.897 mmol) was added and stirred at rt for 1h. LC-MS showed full conversion. The reaction mixture was concentrated and purified by prep-HPLC (C18 column, eluent A: water, eluent B: ACN) to afford compound 10-2 as a white solid (580 mg, 79%yield) .

[0772] Mass calc. for C120H179N11O42: 2446.22; found: 1247.61 [M+2Na] 2+, ESI.

[0773] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.86-7.82 (m, 6H) , 7.75 (t, J = 5.5 Hz, 3H) , 7.39-7.29 (m, 4H) ,  7.26-7.19 (m, 5H) , 7.00 (br, 1H) , 6.89 (dd, J = 8.9, 3.7 Hz, 4H) , 5.21 (d, J = 3.4 Hz, 3H) , 4.96 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 3H) , 4.66-4.64 (m, 1H) , 4.78 (d, J = 8.4 Hz, 3H) , 4.04-3.96 (m, 10H) , 3.90-3.83 (m, 3H) , 3.73-3.67 (m, 11H) , 3.55-3.50 (m, 13H) , 3.43-3.37 (m, 5H) , 3.02 (pent, J = 5.8 Hz, 12H) , 2.90 (s, 2H) , 2.27 (t, J = 6.2 Hz, 6H) , 2.10 (s, 9H) 2.07-2.00 (m, 10H) , 1.99 (s, 9H) , 1.96-1.92 (m, 2H) , 1.89 (s, 9H) , 1.85-1.80 (m, 2H) , 1.77 (s, 9H) , 1.54-1.37 (m, 22H) , 1.22-1.20 (m, 12H) .

[0774] Compound 10-3:

[0775] To a solution of compound 10-2 (150 mg, 0.06 mmol) in anhydrous DCM (1.0 mL) , DMAP (14 mg, 0.12 mmol) and TEA (24 mg, 0.24 mmol) were added, followed by succinic anhydride (20 mg, 0.2 mmol) , the reaction mixture was stirred at rt for 3 h, LCMS showed the starting material was consumed completely, the reaction mixture was diluted with DCM and washed with water (3 mL x4) , then washed with brine (3 mLx4) , the organic layer was concentrated to give compound 10-3 (130 mg, 97%yield) as a white solid.

[0776] Mass calc. for C124H183N11O45: 2546.24; found: 1273.5 [M+2H] 2+, ESI.

[0777] 1HNMR (600 MHz, DMSO-d6) : 7.84-7.73 (m, 9H) , 7.37-7.21 (m, 9H) , 6.98-6.89 (m, 5H) , 5.21 (d, J = 6.0 Hz, 3H) , 4.97-4.94 (m, 3H) , 4.48 (d, J = 12.0 Hz, 3H) , 4.07-3.66 (m, 26H) , 3.55-3.37 (m, 17H) , 3.04-2.95 (m, 14H) , 2.45 (d, J = 6.0 Hz, 4H) , 2.29-2.25 (m, 6H) , 2.11-1.72 (m, 50H) , 1.51-1.12 (m, 38H) .

[0778] Compound 10-4:

[0779] To a solution of compound 10-3 (130 mg, 0.05 mmol) and HBTU (53 mg, 0.14 mmol) in anhydrous DMF (1.5 mL) , DIPEA (30 mg, 0.23 mmol) was added. The reaction mixture was shaken at rt for 10 min, then native amino-lcaa-CPG (300 mg, loading 75 μmol / g) was added, the suspension was shaken at rt for 20 h, then filtered, washed with DMF (20 mLx5) , ACN (20 mLx5) , DCM (20 mLx5) until TLC showed no spot at 254 nm in eluent. The solid support was dried under vacuum for 2 h to give solid support (300 mg) . The unreacted amines on the support were capped by stirring with Ac2O / pyridine / N-methyl imidazole (90 μL / 1.0 mL / 80 μL) at rt for 1 h, washed with DMF (20 mLx5) , ACN (20 mLx5) , DCM (20 mLx5) until TLC showed no spot at 254 nm in eluent. The solid support was dried under vacuum for 15 h to give solid support 10-4 (300 mg) . For loading calculation, take 5.19 mg of the dried loaded CPG and add 20 mL of 3%DCA on DCM. Shake the solution and measure UV absorbance at 500 nm. Make sure the absorbance value is below 1.0 units to ensure no signal saturation. Then apply the following equation:

[0780] Loading in μmol / g = (total volume of DCA added in mL) * (Abs value at 500 nm) *1000)  / 76* (mg of CPG taken)

[0781] Total volume of DCA added in mL = 20 mL

[0782] Abs value at 500 nm = 0.335

[0783] Mg of CPG taken = 5.19 mg

[0784] Loading in μmol / g = ( (20) * (0.335) *1000)  / 76* (5.19) = 17 μmol / g.

[0785] Compound 11-1:

[0786] To a solution of compound 2-10 (1.27 g, 3.59 mmol) in DCM (15 mL) were added TEA (495.41 mg, 4.90 mmol) and HATU (1.35 g, 3.59 mmol) . After stirred for 15 min, Fmoc-6-hexanoic acid (1.5 g, 3.26 mmol) was added to the reaction mixture and stirring was continued for 4h. The mixture was partitioned between DCM (50 mL) and water (35 mL) and the DCM extract was washed with brine (100 mL) , dried over sodium sulfate and concentrated in vacuo. The residue was purified by column chromatography eluting with DCM / MeOH = 20 / 1 to give 600 mg of compound 11-1 in 23.2%yield.

[0787] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.87 (d, J = 7.6 Hz, 2H) , 7.68 (d, J = 7.4 Hz, 2H) , 7.44-7.35 (m, 4H) , 7.35-7.28 (m, 4H) , 7.27-7.17 (m, 6H) , 6.88 (d, J = 7.6 Hz, 4H) , 4.64 (td, J = 5.04, 1.6 Hz, 1H) , 4.28 (d, J = 6.9 Hz, 2H) , 4.20 (t, J = 6.8 Hz, 1H) , 3.96 (s, 1H) , 3.73 (d, J = 3.8 Hz, 6H) , 3.66 (d, J =10.4 Hz, 2H) , 3.50 (s, 1H) , 3.39 (t, J = 5.9 Hz, 2H) , 2.96 (t, J = 6.6 Hz, 2H) , 2.91 (s, 2H) , 2.06-1.74 (m, 6H) , 1.47-1.31 (m, 4H) , 1.26-1.13 (m, 2H) .

[0788] Compound 11-2:

[0789] Piperidine (0.4 mL) was added to a solution of compound 11-1 (600 mg, 0.75 mmol) in MeOH (4 mL) . After stirred overnight, the mixture was concentrated in vacuo. The residue was purified by column chromatography eluting with DCM / MeOH / NH3OH = 100 / 10 / 1 to give 360 mg of compound 11-2 in 82%yield.

[0790] Mass calc. for C35H44N2O5: 572.3; found: 573.4 [M+H] +, ESI.

[0791] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.27-7.21 (m, 4H) , 6.91-6.85 (m, 9H) , 3.97 (s, 1H) , 3.73 (s, 6H) , 3.68 (s, 2H) , 3.47 (d, J = 6.5 Hz, 2H) , 3.16 (s, 2H) , 2.90 (s, 2H) , 2.66-2.62 (m, 2H) , 2.54-2.51 (m, 2H) , 1.49-1.17 (m, 12H) .

[0792] Compound 11-4:

[0793] A mixture of compound 11-3 (10 g, 84.65 mmol) , 4-bromopyridine (14.71 g, 93.11 mmol) , Pd (PPh3) 2Cl2 (4 g, 5.70 mmol) and t-BuOK (19.00 g, 169.30 mmol) in 1, 4-dioxane (200 mL) was degassed by purging with nitrogen. The mixture was then heated at 60 ℃ for 6 hours. The mixture was concentrated. The residue was then purified by column chromatography eluting with DCM / MeOH / NH4OH = 95 / 5 / 1 to give 8 g of compound 11-4 as a yellow solid in 48%yield. Mass calc. for C12H9N3: 195.1; found: 196.2 [M+H] +, ESI.

[0794] Compound 11-5:

[0795] Compound 11-4 (10 g, 51.22 mmol) was dissolved in tert-butanol and warmed to 50℃, then KOH (574.84 mg, 10.24 mmol and MeOH (5 mL) were added. tert-butyl acrylate (7.22 g, 56.35 mmol) was then slowly added to the reaction mixture and allowed to stir for 5 h. The mixture was concentrated in vacuo. The residue was partitioned between ethyl acetate (250 mL) and water (150 mL) and the ethyl acetate extract was washed with brine (100 ml) , dried over sodium sulfate and concentrated in vacuo. The residue was purified by column chromatography eluting with PE / EA =1 / 2 to give 11 g of compound 11-5 in 66%yield.

[0796] Mass calc. for C19H21N3O2: 323.2; found: 324.2 [M+H] +, ESI.

[0797] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.65 (d, J = 5.6 Hz, 4H) , 7.50 (d, J = 6.0 Hz, 4H) , 2.82 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 2.23 (t, J = 7.8 Hz, 2H) , 1.35 (s, 9H) .

[0798] Compound 11-6:

[0799] Cobalt chloride hexahydrate (1.47 g, 6.18 mmol) was added to a solution of compound 11-5 (1 g, 3.09 mmol) in MeOH (20 mL) . Sodium borohydride (1.17 g, 30.92 mmol) then was slowly added to the reaction mixture at -6 ℃. The mixture was allowed to warm to room temperature and stirred for 5h. The mixture was concentrated in vacuo. The residue was dissolved in EA and filtered through a bed of celite diatomaceous earth and washed with MeOH. The filtrate was concentrated to give 0.7 g of compound 11-6 in 69%yield.

[0800] Mass calc. for C19H25N3O2: 327.2; found: 328.3 [M+H] +, ESI.

[0801] Compound 11-7:

[0802] Compound 11-6 (2.12 g, 9.16 mmol) was dissolved in DCM (40 mL) . Then TEA (925.42 mg, 9.16 mmol) and HATU (3.46 g, 9.16 mmol) were added to this solution. After stirred for 20 min, Boc-6-aminohexanoic acid (3 g, 9.16 mmol) was added to the reaction mixture and the mixture was stirred for 5h. The mixture was partitioned between DCM (50 mL) and water (35 mL) and the DCM extract was washed with brine (100 mL) , dried over sodium sulfate and concentrated in vacuo. The residue was purified by column chromatography eluting with DCM / MeOH = 9 / 1 to give 2.5 g of compound 11-7 as a yellow oil in 71%yield.

[0803] Mass calc. for C30H44N4O5: 540.3; found: 541.4 [M+H] +, ESI.

[0804] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.48 (d, J = 5.9 Hz, 4H) , 7.45 (t, J = 6.6 Hz, 1H) , 7.14 (d, J = 6.1 Hz, 4H) , 6.73 (t, J = 5.4 Hz, 1H) , 3.88 (d, J = 6.1 Hz, 2H) , 2.85 (q, J = 6.6 Hz, 2H) , 2.31 (t, J = 8.0 Hz, 2H) , 1.94 (q, J = 8.0 Hz, 4H) , 1.36 (s, 9H) , 1.32 (s, 9H) , 1.31-1.23 (m, 4H) , 1.1-0.9 (m, 2H) .

[0805] Compound 11-8:

[0806] Platinum oxide (2.2 g, 9.69 mmol) was added to a solution of compound 11-7 (4.5 g, 8.32 mmol) in AcOH (15 ml) . The mixture was hydrogenated under ～0.4 MPa for 56 hours. The catalyst was  filtered through a bed of celite diatomaceous earth and washed with MeOH. The mixture was concentrated in vacuo. pH was adjusted to 7 by addition of conc. NaHCO3 aqueous solution and then dried in vacuo. The residue was dissolved in THF, then the mixture was filtered, and the filtrate was evaporated under reduced pressure to give 4 g of compound 11-8 as a colorless oil in 87%yield. Mass calc. for C30H56N4O5: 552.4; found: 553.4 [M+H] +, ESI.

[0807] Compound 11-9:

[0808] TEA (402.72 mg, 3.98 mmol) and HATU (1.50 g, 3.98 mmol) were added to a solution of Boc-6-aminohexanoic acid (920.49 mg, 3.98 mmol) in DCM (10 mL) . After stirring the solution for 20 min, compound 11-8 (1 g, 1.18 mmol) was added to the reaction mixture and stirring was continued for 5h. The mixture was partitioned between DCM (50 mL) and water (35 mL) and the DCM extract was washed with brine (100 mL) , dried over sodium sulfate and concentrated in vacuo. The residue was purified by column chromatography eluting with DCM / MeOH =15 / 1 to give 0.4 g of compound 11-9 as a white solid in 22%yield.

[0809] Mass calc. for C52H94N6O11: 978.7; found: 979.8 [M+H] +, ESI.

[0810] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.41 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 6.78-6.70 (m, 3H) , 3.88 (d, J = 11.4 Hz, 2H) , 3.02 (d, J = 6.5 Hz, 6H) , 2.92-2.82 (m, 8H) , 2.25 (t, J = 7.4 Hz, 4H) , 2.15 (t, J = 8.1 Hz, 2H) , 2.16 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.70-1.50 (m, 6H) , 1.49-1.38 (m, 10H) , 1.38 (s, 9H) , 1.36 (s, 27H) , 1.34-1.15 (m, 14H) .

[0811] Compound 11-10:

[0812] TFA (2 mL) was added to a solution of compound 11-9 (1.4 g, 1.43 mmol) in DCM (6 mL) , then the mixture was stirred for 4h at rt. The mixture was concentrated in vacuo to give 850 mg of compound 11-10 as a colorless oil in 95%yield.

[0813] Mass calc. for C33H62N6O5: 622.5; found: 623.6 [M+H] +, ESI.

[0814] Compound 11-11:

[0815] TEA (584.84 mg, 5.78 mmol) and HATU (1.64 g, 4.33 mmol) were added to a solution of compound 1-4 (2.13 g, 4.77 mmol) in DMF (10 mL) . After stirred for 20 min, compound 11-10 (0.9 g, 1.44 mmol) was added to the reaction mixture and stirring was continued for 5h. The mixture was purified by reverse phase column (C18 column) to provide 1.3 g of compound 11-11 as a white solid in 47%yield.

[0816] Mass calc. for C90H143N9O35: 1909.9; found: 956.0 [M+2H] 2+, ESI.

[0817] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.0 (br, 1H) , 7.83 (d, J = 9.2 Hz, 3H) , 7.70 (t, J = 5.5 Hz, 3H) , 7.50-7.40 (m, 1H) , 5.20 (d, J = 3.4 Hz, 3H) , 4.96 (dd, J = 11.24, 3.4 Hz, 3H) , 4.50-4.40 (m, 5H) , 4.08-3.96 (m, 9H) , 3.92-3.82 (m, 5H) , 3.76-3.66 (m, 3H) , 3.46-3.36 (m, 4H) , 3.15-2.75 (m, 11H) , 2.40-2.30 (m, 2H) , 2.25 (t, J = 7.3 Hz, 4H) , 2.10 (s, 9H) , 2.08-2.00 (m, 8H) , 1.99 (s, 9H) , 1.98 (s, 9H) , 1.77 (s, 9H) , 1.60-1.08 (m, 42H) .

[0818] Compound 11-12:

[0819] Compound 11-11 (1.4 g, 0.73 mmol) was dissolved in DCM (15 mL) , then HOBT (148.47 mg, 1.10 mmol) , EDCI (210.10 mg, 1.10 mmol) and DIEA (236.69 mg, 1.83 mmol) were added to this solution. After stirred for 15 min, compound 11-2 (503.47 mg, 0.88 mmol) was added to the reaction mixture and stirring was continued for 4h. The mixture was partitioned between DCM (50 mL) and  water (35 mL) and the DCM extract was washed with brine (100 mL) , dried over sodium sulfate and concentrated in vacuo. The residue was purified by reverse phase column (C18 column) to provide 0.8 g of compound 11-12 as a white powder in 44%yield.

[0820] Mass calc. for C125H185N11O39: 2464.3; found: 1255.6 [M+2Na] 2+, ESI.

[0821] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.86-7.76 (m, 4H) , 7.71 (t, J = 5.3 Hz, 3H) , 7.45 (s, 1H) , 7.41-7.35 (m, 2H) , 7.34-7.28 (m, 2H) , 7.27-7.18 (m, 5H) , 6.93-6.86 (m, 4H) , 5.27-5.15 (d, J = 3.3 Hz, 3H) , 5.02-4.90 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 3H) , 4.69-4.60 (m, 1H) , 4.57-4.33 (m, 5H) , 4.11-3.98 (m, 9H) , 3.97 (s, 1H) , 3.93-3.81 (m, 5H) , 3.73 (s, 6H) , 3.72-3.62 (m, 5H) , 3.51 (s, 1H) , 3.46-3.36 (m, 5H) , 3.14-2.73 (m, 14H) , 2.43-2.29 (m, 2H) , 2.29-2.19 (m, 4H) , 2.01 (s, 9H) , 2.06-1.97 (m, 19H) , 1.96-1.91 (m, 3H) , 1.87 (s, 9H) , 1.86-1.80 (m, 2H) , 1.77 (s, 9H) , 1.70-1.55 (m, 5H) , 1.54-1.13 (m, 44H) .

[0822] Compound 11-13:

[0823] To a solution of compound 11-12 (2.0 g, 0.8 mmol) in anhydrous DCM (7.0 mL) was added 4, 5-dicyanoimidazole (80.0 mg, 0.67 mmol) and 2-Cyanoethyl N, N, N′, N′-tetraisopropylphosphorodiamidite (270 mg, 0.90 mmol) at rt and stirred for 1 h, LCMS showed the starting material was consumed completely. The solution was quenched by water (100 mL) , washed with brine (300 mLx3) and dry over by Na2SO4. Then the solution was concentrated under reduced pressure and the residue was purified by Flash-Prep-HPLC with the following conditions (Column, C18 silica gel; mobile phase, CH3CN / H2O = 1 / 1 increasing to CH3CN / H2O = 1 / 0 within 20 min; Detector, UV 254 nm) . This resulted in giving compound 11-13 as a white solid (1.0 g, 45%yield) . Mass calc. for C134H202N13O40P: 2664.39; found: 1132.5 [M-DMTr-N (CH (CH3) 2) 2+4H] 2+, ESI.

[0824] 1HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.82-7.69 (m, 6H) , 7.44-7.19 (m, 9H) , 6.90-6.87 (m, 4H) , 5.21 (d, J = 6.0 Hz, 3H) , 4.98-4.94 (m, 3H) , 4.49-4.44 (m, 5H) , 4.04-3.37 (m, 35H) , 3.02-2.71 (m, 15H) , 2.33-1.75 (m, 56H) , 1.64-1.07 (m, 57H) .

[0825] 31PNMR (242 MHz, DMSO-d6) δ 146.79, 146.67.

[0826] Compound 11-14:

[0827] To a solution of compound 11-12 (150 mg, 0.06 mmol) in anhydrous DCM (1.0 mL) , DMAP (5 mg, 0.04 mmol) and TEA (24 mg, 0.24 mmol) were added, followed by succinic anhydride (20 mg, 0.2 mmol) was added, the reaction mixture was stirred at rt for 3 h, LCMS showed the starting material was consumed completely, the reaction mixture was diluted with DCM and washed with water (3 mL x4) , then washed with brine (3 mLx4) , the organic layer was concentrated to give compound 11-14 (135 mg, 97%yield) as a white solid.

[0828] Mass calc. for C129H189N11O42: 2564.30; found: 1132.5 [M-DMTr+2H] 2+, ESI.

[0829] 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) : 7.84-7.71 (m, 6H) , 7.45-7.21 (m, 10H) , 6.92-6.89 (m, 4H) , 5.21 (d, J = 6.0 Hz, 3H) , 4.98-4.94 (m, 3H) , 4.49-4.44 (m, 5H) , 4.07-3.37 (m, 36H) , 3.16-2.84 (m, 14H) , 2.44-1.77 (m, 62H) , 1.45-1.21 (m, 50H) .

[0830] Compound 11-15:

[0831] To a solution of compound 11-14 (135 mg, 0.05 mmol) and HBTU (53 mg, 0.14 mmol) in anhydrous DMF (1.5 mL) , DIPEA (30 mg, 0.23 mmol) was added. The reaction mixture was shaken at rt for 10 min, then native amino-lcaa-CPG (300 mg, loading 75 μmol / g) was added, the suspension was shaken at rt for 20 h, then filtered, washed with DMF (20 mLx5) , ACN (20 mLx5) , DCM (20 mLx5) until TLC showed no spot at 254 nm in eluent. The solid support was dried under vacuum for 2 h to give solid support (300 mg) . The unreacted amines on the support were capped by stirring with  Ac2O / pyridine / N-methyl imidazole (90 μL / 1.0 mL / 80 μL) at rt for 1 h, washed with DMF (20 mLx5) , ACN (20 mLx5) , DCM (20 mLx5) until TLC showed no spot at 254 nm in eluent. The solid support was dried under vacuum for 15 h to give solid support 11-15 (300 mg) . For loading calculation, take 5.00 mg of the dried loaded CPG and add 20 mL of 3%DCA on DCM. Shake the solution and measure UV absorbance at 500 nm. Make sure the absorbance value is below 1.0 units to ensure no signal saturation. Then apply the following equation:

[0832] Loading in μmol / g = (total volume of DCA added in mL) * (Abs value at 500 nm) *1000)  / 76* (mg of CPG taken)

[0833] Total volume of DCA added in mL = 20 mL

[0834] Abs value at 500 nm = 0.464

[0835] Mg of CPG taken = 5.0 mg

[0836] Loading in μmol / g = ( (20) * (0.464) *1000)  / 76* (5.0) = 24 μmol / g.

[0837] Compound 12-1:

[0838] Compound 3-4 (1.1 g, 5.16 mmol) was dissolved in H2O (10 mL) and THF (20 mL) . K2CO3 (1.43 g, 10.31 mmol) and benzyl chloroformate (967 mg, 5.67 mmol) were added. The reaction mixture was stirred at rt for 3 h. Then it was concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (PE / EA = 5 / 1) on silica gel to get compound 12-1 as a white foam solid (1.5 g, 84%yield) .

[0839] Mass calc. for C20H29NO4: 347.2; found: 348.3 [M+H] +, ESI.

[0840] Compound 12-2:

[0841] Compound 12-1 (1.52 g, 4.37 mmol) , DMAP (147.10 mg, 1.20 mmol) and DIEA (3.11 g, 24.08 mmol, 4.19 mL) were dissolved in DCM (20 mL) . DMTrCl (1.48 g, 4.37 mmol) in DCM (20 mL) was slowly added to the reaction mixture at 0℃. The reaction was stirred at rt for 2h. The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (40 mL) , extracted with DCM (50 mLx2) , washed with brine (50 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-3%MeOH) on Al2O3 to give compound 12-4 as a white foam solid (1.9 g, 67%yield) .

[0842] Mass calc. for C41H47NO6: 649.34; found: 650.34 [M+H] +, ESI.

[0843] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.41-7.19 (m, 15H) , 6.90-6.87 (m, 3H) , 5.06-5.05 (m, 2H) , 4.42-4.40 (m, 1H) , 3.76 (s, 6H) , 3.40-3.38 (m, 6H) , 2.88 (s, 2H) , 1.39-1.11 (m, 12H) .

[0844] Compound 12-3:

[0845] Compound 12-2 (0.7 g, 1.08 mmol) was dissolved in MeOH (30 mL) , then Pd / C (140 mg) was added to the solution. The reaction mixture was stirred at rt for 3h under hydrogen atmosphere. The reaction mixture was filtered and concentrated under vacuum to give crude compound 12-3 as a white foam solid (520 mg) , which was used in the next step without further purification.

[0846] Mass calc. for C33H41NO4: 515.30; found: 516.30 [M+H] +, ESI.

[0847] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.38 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 7.32-7.20 (m, 7H) , 6.89-6.87 (m, 4H) , 4.51-4.49 (m, 1H) , 3.73 (s, 6H) , 2.89-2.86 (m, 8H) , 1.52-1.51 (m, 2H) , 1.19-1.12 (m, 7H) , 0.91-0.88 (m, 2H) .

[0848] Compound 12-4:

[0849] Compound 10-1 (1.56g. 0.756 mmol) was dissolved in DCM (20 mL) . DIEA (300.74 mg, 2.33 mmol) , EDCI (297.39 mg, 1.55 mmol) and HOBT (209.62mg, 1.55mmol) were added to the mixture at 0 ℃. The reaction was stirred at 0 ℃ for 30 min. Compound 12-3 (400 mg, 0.756 mmol) was added to the reaction mixture. The reaction mixture was stirred at rt for 2h. The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (40 mL) , extracted with DCM (30 mLx2) , washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-8%MeOH) on Al2O3 to give compound 12-4 as a white foam solid (1 g, 51%yield) .

[0850] Mass calc. for C124H187N11O42: 2503.28; found: 1101.6 [M-DMTr+2H+] 2+, ESI.

[0851] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.85-7.81 (m, 6H) , 7.73 (t, J = 5.6 Hz, 3H) , 7.39 (d, J = 7.32 Hz, 2H) , 7.32-7.19 (m, 8H) , 6.99 (s, 1H) , 6.88 (d, J = 8.9 Hz, 4H) , 5.21-5.20 (m, 3H) , 4.98-4.94 (m, 3H) , 4.48 (d, J = 8.44 Hz, 3H) , 4.42 (t, J = 5.0 Hz, 1H) , 4.05-4.00 (m, 9H) , 3.90-3.83 (m, 3H) , 3.73-3.67 (m, 9H) , 3.55-3.52 (m, 11H) , 3.43-3.38 (m, 6H) , 3.22-3.21 (m, 6H) , 3.06-3.00 (m, 11H) , 2.29-2.24 (m, 5H) , 2.22 (t, J = 7.4 Hz, 2H) , 2.10 (s, 8H) , 2.05 (t, J = 6.96 Hz, 8H) , 1.99-1.98 (m, 9H) , 1.89 (s, 8H) , 1.77 (s, 8H) , 1.52-1.44 (m, 22H) , 1.30-1.22 (m, 24H) .

[0852] Compound 13-1:

[0853] Compound 4-7 (1.3 g, 7.01 mmol) was dissolved in THF (30 mL) and H2O (15 mL) . K2CO3 (2.91  g, 21.05 mmol) was added to the solution. And benzyl chloroformate (1.32 g, 7.72 mmol) was added to the reaction mixture at 0 ℃. The mixture was stirred at rt for 3h. The reaction mixture was extracted with EA (50 mLX2) , washed with brine (50 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-5%MeOH) on silica gel to get compound 13-1 as a white foam solid (1.95 g, 87%yield) .

[0854] Mass calc. for C18H25NO4: 319.2; found: 320.2 [M+H] +, ESI.

[0855] Compound 13-2:

[0856] Compound 13-1 (2 g, 6.26 mmol) and DIEA (2.43 g, 18.79 mmol, 4.19 mL) were dissolved in DCM (60 mL) . DMTrCl (2.02 g, 5.95 mmol) was added to the reaction mixture at 0 ℃. The reaction was stirred at 0℃ for 1h. The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (40 mL) , extracted with DCM (50 mLX2) , washed with brine (50 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (PE / EA = 0-40%) on Al2O3 to give compound 13-2 as a white foam solid (2.6 g, 66%yield) .

[0857] Compound 13-3:

[0858] Compound 13-2 (600 mg, 0.96 mmol) was dissolved in MeOH (20 mL) , then Pd / C was added to the reaction mixture. The reaction mixture was stirred at rt for 3h under hydrogen atmosphere. The reaction mixture was filtered and concentrated under vacuum to give crude product 13-3 as a white foam solid (470 mg, crude) , which was used in the next step without further purification.

[0859] Mass calc. for C31H37NO4: 487.3; found: 488.3 [M+H] +, ESI.

[0860] Compound 13-4:

[0861] Compound 10-1 (1.23 g, 0.61 mmol) was dissolved in DCM (20 mL) . DIEA (239 mg, 1.85 mmol, 0.32 mL) , EDCI (236 mg, 1.23 mmol) and HOBT (166 mg, 1.23 mmol) were added to the mixture at 0 ℃. The reaction was stirred at 0 ℃ for 30 min. Compound 13-3 (300 mg, 0.61 mmol) was added to the reaction mixture. The reaction mixture was stirred at rt for 2h. The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (40 mL) , extracted with DCM (30 mLx2) , washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-8%MeOH) on Al2O3 to get compound 13-4 as a white foam solid (1 g, 66%yield) .

[0862] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.85-7.82 (m, 6H) , 7.75-7.73 (m, 3H) , 7.40-7.38 (m, 2H) , 733-7.29 (m, 2H) , 7.27-7.25 (m, 4H) , 7.23-7.19 (m, 1H) , 6.98 (s, 1H) , 6.90-6.88 (m, 4H) , 5.21 (d, J =3.2 Hz, 3H) , 4.97 (dd, J = 3.2, 11.2 Hz, 3H) , 4.63-4.61 (m, 1H) , 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 3H) , 4.04-4.00 (m, 9H) , 3.91-3.83 (m, 3H) , 3.73 (s, 6H) , 3.71-3.67 (m, 3H) , 3.55-3.52 (m, 12H) , 3.44-3.37 (m, 5H) , 3.27-3.15 (m, 5H) , 3.06-3.01 (m, 14H) , 2.27 (t, J = 12.8 Hz, 6H) , 2.21 (d, J = 14.8 Hz, 2H) , 2.10 (s, 9H) , 2.04 (t, J = 6.8 Hz, 8H) , 1.99 (s, 9H) , 1.89 (s, 9H) , 1.77 (s, 9H) , 1.58-1.33 (m, 30H) , 1.29-1.23 (m, 12H) .

[0863] Compound 14-1:

[0864] Compound 5-6 (3.6 g, 19.27 mmol) was dissolved in THF (30 mL) and H2O (15 mL) . K2CO3 (5.33 g, 38.54 mmol) was added to the solution. And benzyl chloroformate (3.62 g, 21.20 mmol) was added to the reaction mixture at 0 ℃. The mixture was stirred at rt for 2h. The reaction mixture was extracted with EA (50 mLx2) , washed with brine (50 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-2%MeOH) on silica gel to get compound 14-1 as white foam solid (5 g, 81%yield) .

[0865] Mass calc. for C18H25NO4: 319.2; found: 320.2 [M+H] +, ESI.

[0866] 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.39-7.28 (m, 5H) , 5.01 (s, 2H) , 4.27 (t, J = 5.4 Hz, 2H) , 3.61-3.50 (m, 4H) , 3.22 (d, J = 5.3 Hz, 4H) , 1.55 (t, J = 6.1 Hz, 4H) , 1.25-1.22 (m, 8H) .

[0867] Compound 14-2:

[0868] Compound 14-1 (3.5 g, 10.96 mmol) and DIEA (2.12 g, 16.44 mmol) were dissolved in DCM (60 mL) . DMTrCl (3.34 g, 9.86 mmol) was added to the reaction mixture at 0 ℃. The reaction was stirred at 0 ℃ for 3h. The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (40 mL) , extracted with DCM (50 mLX2) , washed with brine (50 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (PE / EA = 0-60%) on Al2O3 to get compound 14-2 as a white foam solid (5.5 g, 81%yield) .

[0869] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.39-7.18 (m, 14H) , 6.88 (d, J = 8.8 Hz, 4H) , 5.00 (s, 2H) , 4.39 (t, J = 4.9 Hz, 1H) , 3.73 (s, 6H) , 3.58-3.35 (m, 6H) , 2.83 (s, 2H) , 1.29-1.15 (m, 8H) .

[0870] Compound 14-3:

[0871] Compound 14-2 (254 mg, 408.52 μmol) was dissolved in MeOH (10 mL) , then Pd / C was added to the reaction mixture. The reaction mixture was stirred at rt for 2h under hydrogen atmosphere. The reaction mixture was filtered and concentrated under vacuum to give crude product 14-3 as a white foam solid (199 mg, crude) , which was used in the next step without further purification.

[0872] Mass calc. for C31H37NO4: 487.3; found: 488.3 [M+H] +, ESI.

[0873] Compound 14-4:

[0874] Compound 10-1 (820 mg, 408.51 μmol) was dissolved in DCM (20 mL) . DIEA (158 mg, 1.23 mmol) , EDCI (157 mg, 817 μmol) and HOBT (110 mg, 817 μmol) were added to the mixture at 0 ℃. The reaction was stirred at 0 ℃ for 30 min. Compound 14-3 (199 mg, 408.51 μmol) was added to the reaction mixture. The reaction mixture was stirred at rt for 2h. The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (40 mL) , extracted with DCM (30 mLx2) , washed with  brine (30 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-6%MeOH) on Al2O3 to get compound 14-4 as a white foam solid (540 mg, 53%yield) .

[0875] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.89-7.80 (m, 6H) , 7.75 (t, J = 5.5 Hz, 3H) , 7.37 (d, J = 7.3 Hz, 2H) , 7.30 (t, J = 7.7 Hz, 2H) , 7.23-7.17 (m, 5H) , 6.99 (s, 1H) , 6.87 (d, J = 8.4 Hz, 4H) , 5.21 (d, J =3.4 Hz, 3H) , 4.96 (dd, J = 10.8, 3.4 Hz, 3H) , 4.47 (d, J = 8.5 Hz, 3H) , 4.41 (t, J = 4.9Hz, 1H) , 4.04-3.98 (m, 9H) , 3.91-3.82 (m, 3H) , 3.74-3.48 (m, 23H) , 3.43-3.36 (m, 6H) , 3.06-2.98 (m, 12H) , 2.83 (d, J = 9.4 Hz, 2H) , 2.27 (t, J = 6.3Hz, 6H) , 2.09 (s, 9H) , 2.03 (t, J = 7.0 Hz, 8H) , 2.00-1.95 (m, 12H) , 2.01 (s, 9H) , 1.89 (s, 9H) , 1.77 (s, 9H) , 1.54-1.37 (m, 22H) , 1.31-1.14 (m, 20H) .

[0876] Compound 15-1:

[0877] Compound 7-6 (3.8 g, 18.30 mmol) was dissolved in THF (30 mL) and H2O (15 mL) . K2CO3 (5.06 g, 36.59 mmol) was added to the reaction mixture. And benzyl chloroformate (3.43 g, 20.13 mmol) was added to the reaction mixture at 0 ℃. The mixture was stirred at rt for 2h. The reaction mixture was extracted with EA (50 mL x2) , washed with brine (50 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum to give the crude product 15-1 as a white foam (3.46 g, crude) .

[0878] Mass calc. for C17H23NO4: 305.2; found: 306.2 [M+H] +, ESI.

[0879] Compound 15-2:

[0880] Compound 15-1 (3.07 g, 10.06 mmol) and DIEA (1.95 g, 15.09 mmol) were dissolved in DCM (60 mL) . DMTrCl (3.41 g, 10.06 mmol) was added to the reaction mixture at 0 ℃. The reaction was stirred at 0 ℃ for 3h. The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (40 mL) , extracted with DCM (50 mLx2) , washed with brine (50 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (PE / EA = 0-60%) on Al2O3 and prep-HPLC to give compound 15-2a as a white foam solid (1.04 g, 34%yield) and compound 15-2b (1.78 g, 58%yield) .

[0881] 15-2a:

[0882] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.38-7.36 (m, 1H) , 7.36-7.31 (m, 5H) , 7.31-7.20 (m, 7H) , 7.20-7.15 (m, 1H) , 6.85 (d, J = 8.9 Hz, 4H) , 5.02 (d, J = 6.1 Hz, 2H) , 6.98 (s, 1H) , 4.61 (t, J = 5.0 Hz, 1H) , 3.71 (s, 6H) , 3.46-3.35 (m, 2H) , 3.27 (d, J = 5.0 Hz, 2H) , 3.13-3.05 (m, 2H) , 2.93 (s, 2H) , 2.64-2.55 (m, 2H) , 1.72-1.62 (m, 2H) , 1.30-1.21 (m, 2H) .

[0883] 15-2b:

[0884] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.40-7.27 (m, 9H) , 7.27-7.22 (m, 4H) , 7.22-7.16 (m, 1H) , 6.89 (d, J = 8.9 Hz, 4H) , 5.03 (s, 2H) , 6.98 (s, 1H) , 4.64 (t, J = 5.1 Hz, 1H) , 3.73 (s, 6H) , 3.43-3.34 (m, 4H) , 3.19-3.09 (m, 2H) , 3.13-3.05 (m, 2H) , 2.84 (s, 2H) , 2.41-2.31 (m, 2H) , 1.62-1.54 (m, 2H) , 1.38-1.30 (m, 2H) .

[0885] Compound 15-3:

[0886] Compound 15-2a (210 mg, 350.48 μmol) was dissolved in MeOH (10 mL) , then Pd / C was added to the solution. The reaction mixture was stirred at rt for 2h under hydrogen atmosphere. The reaction mixture was filtered and concentrated under vacuum to give crude product 15-3a as a white foam solid (166 mg, crude) , which was used in the next step without further purification.

[0887] Mass calc. for C30H35NO4: 473.3; found: 474.3 [M+H] +, ESI.

[0888] Compound 15-2b (610 mg, 1.00 mmol) was dissolved in MeOH (10 mL) , then Pd / C was added to the solution. The reaction mixture was stirred at rt for 2h under hydrogen atmosphere. The reaction mixture was filtered and concentrated under vacuum to give crude product 15-3b as a white foam solid (475 mg, crude) , which was used in the next step without further purification.

[0889] Compound 15-4:

[0890] Compound 10-1 (700 mg, 348.92 μmol) was dissolved in DCM (20 mL) . DIEA (135 mg, 1.05 mmol) , EDCI (134 mg, 698 μmol) and HOBT (94 mg, 698 μmol) were added to the mixture at 0 ℃. The reaction was stirred at 0 ℃ for 30 min. Compound 15-3a (199 mg, 408.51 μmol) was added to the reaction mixture. The reaction mixture was stirred at rt for 2h. The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (40 mL) , extracted with DCM (30 mLx2) , washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-6%MeOH) on Al2O3 to get compound 15-4a as a white foam solid (550 mg, 64%yield) .

[0891] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.88-7.80 (m, 6H) , 7.75 (t, J = 5.4 Hz, 3H) , 7.38-7.34 (m, 2H) , 7.28 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 7.24-7.17 (m, 5H) , 7.00 (s, 1H) , 6.87 (d, J = 8.9 Hz, 4H) , 5.21 (d, J = 3.4 Hz, 3H) , 4.96 (dd, J = 11.3, 3.4 Hz, 3H) , 4.64-4.60 (m, 1H) , 4.47 (d, J = 8.5 Hz, 3H) , 4.05-3.98 (m, 9H) , 3.92-3.83 (m, 3H) , 3.76-3.65 (m, 9H) , 3.62-3.45 (m, 13H) , 3.45-3.37 (m, 6H) , 3.28-3.23 (m, 2H) , 3.17-3.09 (m, 2H) , 3.07-2.98 (m, 12H) , 2.97-2.89 (m, 2H) , 2.69-2.53 (m, 2H) , 2.27 (t, J = 6.2 Hz, 6H) , 2.16-2.07 (m, 11H) , 2.06-1.96 (m, 17H) , 1.88 (s, 9H) , 1.78 (s, 9H) , 1.57-1.36 (m, 22H) , 1.26-1.15 (m, 14H) .

[0892] Compound 10-1 (1 g, 500.29 μmol) was dissolved in DCM (20 mL) . DIEA (194 mg, 1.50 mmol) , EDCI (192 mg, 1.00 mmol) and HOBT (135 mg, 1.00 mmol) were added to the mixture at 0 ℃. The reaction was stirred at 0 ℃ for 30 min. Compound 15-3b (238 mg, 502.53 μmol) was added to the reaction mixture. The reaction mixture was stirred at rt for 2h. The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (40 mL) , extracted with DCM (30 mLx2) , washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-6%MeOH) on Al2O3 to get compound 15-4b as a white foam solid (550 mg, 44%yield) .

[0893] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.87-7.80 (m, 4H) , 7.74 (t, J = 5.6 Hz, 3H) , 7.40-7.36 (m, 2H) , 7.31 (t, J = 7.7 Hz, 2H) , 7.27-7.18 (m, 5H) , 6.99 (s, 1H) , 6.91-6.87 (m, 4H) , 5.22 (d, J = 3.4 Hz,  3H) , 4.96 (dd, J = 11.3, 3.4 Hz, 3H) , 4.66-4.62 (m, 1H) , 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 3H) , 4.05-3.98 (m, 9H) , 3.92-3.83 (m, 3H) , 3.75-3.67 (m, 9H) , 3.57-3.47 (m, 11H) , 3.46-3.36 (m, 6H) , 3.34-3.27 (m, 4H) , 3.23-3.09 (m, 2H) , 3.07-2.98 (m, 12H) , 2.85 (s, 2H) , 2.46-2.31 (m, 2H) , 2.30-2.24 (m, 6H) , 2.18-2.12 (m, 2H) , 2.09 (s, 9H) , 2.06-2.01 (m, 8H) , 1.99 (s, 9H) , 1.88 (s, 9H) , 1.77 (s, 9H) , 1.55-1.37 (m, 22H) , 1.33-1.14 (m, 14H) .

[0894] Compound 16-1:

[0895] Compound 6-8 (190 mg, 0.403 mmol) and compound 10-1 (809 mg, 0.403 mmol) were dissolved in DCM (10 mL) , then DIEA (156.35 mg, 1.21 mmol) , EDCI (154.61mg, 0.81mmol) and HOBT (108.97 mg, 0.81mmol) were added to the mixture. The reaction was stirred at rt for 2h. The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (40 mL) , extracted with DCM (30 mLx2) , washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-10%MeOH) on Al2O3 to obtain compound 16-1 as a white foam solid (772 mg, 77%yield) .

[0896] Mass calc. for C121H179N11O42: 2458.22; found: 1079.2 [M-DMTr+2H] 2+, ESI.

[0897] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.85-7.82 (m, 6H) , 7.75-7.72 (m, 3H) , 7.38-7.36 (m, 2H) , 7.29-7.27 (m, 2H) , 7.25-7.22 (m, 5H) , 6.98 (s, 1H) , 6.87 (d, J = 8.0 Hz, 4H) , 5.21 (d, J = 4.0 Hz, 3H) , 4.97 (dd, J = 3.2, 8.0 Hz, 3H) , 4.80-4.70 (m, 1H) , 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 3H) , 4.02-4.01 (m, 11H) , 3.88-3.86 (m, 5H) , 3.73-3.69 (m, 9H) , 3.55-3.52 (m, 12H) , 3.46-3.36 (m, 5H) , 3.17 (d, J = 5.2 Hz, 1H) , 3.04-3.00 (m, 14H) , 2.29-2.26 (m, 10H) , 2.10-2.07 (m, 8H) , 2.06-2.02 (m, 19H) , 1.99 (s, 9H) , 1.77 (s, 9H) , 1.52-1.46 (m, 22H) , 1.45-1.22 (m, 12H) .

[0898] Compound 17-1:

[0899] Compound 11-11 (1.5 g, 0.78 mmol) , DIEA (302.32 mg, 2.35 mmol) , HOBT (212.11 mg, 1.57 mmol) and EDCI (300.92 mg, 1.57 mmol) was dissolved in DCM (15 mL) at 0 ℃, then compound 3-12 (493.56 mg, 0.78 mmol) was added, and the mixture was stirred at rt for 1h. LC-MS showed full conversion. The reactiom mixture was diluted by adding DCM (20 mL) , and washed by NaHCO3 (sat. Aq., 50 mL) , and water (50 mL) , concentrated and purified by prep-HPLC (C18 column, ACN / water) to afford compound 17-1 (1.14 g, 58%yield) .

[0900] Mass calc for C129H193N11O39 2520.35, found 1109.35 (M-DMTr+2H) 2+, ESI.

[0901] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.83 (d, J = 9.2 Hz, 4H) , 7.73 (t, J = 9.2 Hz, 3H) , 7.47-7.39 (m, 3H) , 7.33-7.19 (m, 7H) , 6.88 (d, J = 8.92 Hz, 4H) , 5.21 (d, J = 3.3 Hz, 3H) , 4.98-4.94 (m, 3H) , 4.49-4.42 (m, 5H) , 4.02 (s, 9H) , 3.91-3.86 (m, 5H) , 3.73-3.68 (m, 9H) , 3.43-3.39 (m, 5H) , 3.34-3.30 (m, 3H) , 3.02-2.99 (m, 10H) , 2.87 (s, 4H) , 2.34-2.33 (m, 2H) , 2.25-2.21 (m, 6H) , 2.10 (s, 9H) , 2.10-2.08 (m, 8H) , 2.0 (s, 9H) , 1.99 (s, 3H) , 1.89 (s, 9H) , 1.77 (s, 9H) , 1.45-1.24 (m, 64H) .

[0902] Compound 18-1:

[0903] To a solution of compound 11-11 (1.01 g, 0.45 mmol) in DCM (20 mL) were added DIEA (193.61 mg, 1.85 mmol, 0.32 mL) , EDCI (191.45 mg, 0.99 mmol) and HOBT (134.95 mg, 0.99 mmol) at 0 ℃. The reaction was stirred at 0 ℃ for 30 min. Compound 4-10 (300 mg, 0.49 mmol) was added to the reaction mixture. The reaction mixture was stirred at rt for 2h. The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (40 mL) , extracted with DCM (30 mLx2) , washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-8%MeOH) on Al2O3 to give compound 18-1 as a white foam solid (500 mg, 46%yield) .

[0904] Mass calc. for C127H189N11O39: 2493.31; found: 1096.7 [M-DMTr+2H] 2+, ESI.

[0905] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.84-7.78 (m, 2H) , 7.72 (t, J = 5.4 Hz, 3H) , 7.45 (br, 1H) , 7.40-7.39 (m, 2H) , 7.33-7.30 (m, 2H) , 7.28-7.20 (m, 5H) , 5.22 (d, J = 3.4 Hz, 3H) , 4.99-4.95 (m, 3H) , 4.64-4.62 (m, 3H) , 4.49 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 4.03 (s, 9H) , 3.91-3.84 (m, 5H) , 3.74 (s, 6H) , 3.72-3.68 (m, 3H) , 3.45-3.41 (m, 2H) , 3.40-3.34 (m, 4H) , 3.28-3.16 (m, 4H) , 3.01-2.99 (m, 11H) , 2.85-2.67  (m, 4H) , 2.34-2.32 (m, 2H) , 2.27-2.22 (m, 6H) , 2.07-2.00 (m, 17H) , 1.89 (s, 9H) , 1.78 (s, 9H) , 1.64-1.56 (m, 4H) , 1.55-1.34 (m, 36H) , 1.28-1.21 (m, 16H) .

[0906] Compound 19-1:

[0907] Compound 11-11 (1.59 g, 832.24 μmol) (3.2 g, 7.16 mmol) and compound 5-9 (500 mg, 832.24 μmol) were dissolved in DCM (50 mL) . DIEA (215.12 mg, 1.66 mmol, 289.92 μL) , EDCI (239.31 mg, 1.25 mmol) and HOBT (112.45 mg, 832.24 μmol) were added to the mixture. The reaction was stirred at rt overnight. The reaction mixture was quenched with water (40 mL) , extracted with DCM (50 mLx2) , washed with brine (50 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by HPLC to give compound 19-1 (840 mg, 36%yield) .

[0908] Mass calc. for C127H189N11O39: 2492.3; found: 1258.4 [M+2Na] 2+, ESI.

[0909] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.85-7.71 (m, 7H) , 7.49 (s, 1H) , 7.37-7.20 (m, 9H) , 6.82-6.87 (m, J = 8.8 Hz, 4H) , 5.22 (d, J = 3.2 Hz, 3H) , 4.97 (d, J = 11.6 Hz, 3H) , 4.49-4.46 (m, 6H) , 4.05 (s, 9H) , 3.91-3.85 (m, 5H) , 3.77-3.62 (m, 11H) , 3.41 (s, 6H) , 3.01-2.71 (m, 14H) , 2.32-2.25 (m, 6H) , 2.11-1.78 (m, 48H) , 1.62-1.34 (m, 37H) , 1.26-1.21 (m, 20H) .

[0910] Compound 20-1a:

[0911] Compound 11-11 (554 mg, 289.73 μmol) was dissolved in DCM (20 mL) . DIEA (112 mg, 869.18 μmol) , EDCI (222 mg, 1.16 mmol) and HOBT (157 mg, 1.16 mmol) were added to the mixture at 0 ℃. The reaction was stirred at 0 ℃ for 30 min. Compound 7-9a (170 mg, 289.73 μmol) was added to the reaction mixture and the mixture was stirred at rt for 2h. The reaction was quenched with saturated NaHCO3 solution (40 mL) , extracted with DCM (30 mLx2) , washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, concentrated and purified by prep-HPLC (C18 column, ACN / water) to afford compound 20-1a as a white foam solid (640 mg, 89%yield) .

[0912] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.86-7.76 (m, 4H) , 7.72 (t, J = 5.4 Hz, 3H) , 7.49-7.42 (m, 1H) , 7.38 (d, J = 8.6 Hz, 2H) , 7.31 (t, J = 7.7 Hz, 2H) , 7.27-7.19 (m, 5H) , 6.88 (d, J = 8.9 Hz, 4H) , 5.21 (d, J = 3.4 Hz, 3H) , 4.96 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 3H) , 4.65 (t, J = 5.0 Hz, 1H) , 4.50-4.41 (m, 5H) , 4.05-3.99 (m, 9H) , 3.91-3.82 (m, 5H) , 3.76-3.66 (m, 9H) , 3.49-3.36 (m, 6H) , 3.32-3.28 (m, 1H) , 3.23-3.09 (m, 2H) , 3.08-2.91 (m, 10H) , 2.84 (s, 2H) , 2.44-2.21 (m, 8H) , 2.20-1.92 (m, 30H) , 1.88 (s, 9H) , 1.77 (s, 9H) , 1.70-1.08 (m, 54H) .

[0913] Compound 20-1b:

[0914] Compound 11-11 (1.3 g, 681.71 μmol) was dissolved in DCM (20 mL) . DIEA (176 mg, 1.36 mmol) , EDCI (261 mg, 1.36 mmol) and HOBT (138 mg, 1.02 mmol) were added to the mixture at 0 ℃. The reaction was stirred at 0 ℃ for 30 min. Compound 7-9b (400 mg, 681.71 μmol) was added to the reaction mixture. The reaction mixture was stirred at rt for 2h.

[0915] The reaction mixture was quenched with saturated NaHCO3 solution (40 mL) , extracted with DCM (30 mLx2) , washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, concentrated and purified by prep-HPLC (C18 column, ACN / water) to afford compound 20-1b as a white foam solid (610 mg, 36%yield) .

[0916] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.87-7.76 (m, 4H) , 7.72 (t, J = 5.3 Hz, 3H) , 7.46 (s, 1H) , 7.35 (d, J = 7.4 Hz, 2H) , 7.28 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 7.25-7.18 (m, 5H) , 6.86 (d, J = 8.9 Hz, 4H) , 5.21 (d, J =3.4 Hz, 3H) , 4.96 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 3H) , 4.62 (t, J = 5.0 Hz, 1H) , 4.50-4.38 (m, 5H) , 4.07-3.98 (m, 9H) , 3.92-3.82 (m, 5H) , 3.75-3.66 (m, 9H) , 3.51-3.36 (m, 6H) , 3.29-3.23 (m, 2H) , 3.15-3.07 (m, 2H) , 3.01-2.94 (m, 10H) , 2.93-2.88 (m, 2H) , 2.87-2.78 (m, 2H) , 2.68-2.60 (m, 1H) , 2.37-2.23 (m, 2H) , 2.29-2.19 (m, 4H) , 2.13-2.08 (m, 10H) , 2.07-1.98 (m, 18H) , 1.88 (s, 9H) , 1.77 (s, 9H) , 1.71-1.58 (m, 6H) , 1.53-1.13 (m, 48H) .

[0917] Compound 21-1:

[0918] Compound 11-11 (1.76 g, 920.31 μmol) , HOBt (248.70 mg, 1.84 mmol) , EDCI (529.27 mg, 2.76 mmol) were dissolved in DCM (20 mL) . The mixture was stirred for 30 min, then compound 8-9 (540 mg, 920.31 μmol) was added. The reaction mixture was stirred for another 2 hours, then it was concentrated and purified by prep-HPLC to give compound 21-1 (1.2 g, 53%yield) .

[0919] Mass calc. for C126H187N11O39: 2478.3; found: 1089.6 [M-DMTr+2H] 2+, ESI.

[0920] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.84-7.80 (m, 4H) , 7.72 (t, J = 5.4 Hz, 3H) , 7.39 (s, 1H) , 7.40-7.37 (m, 2H) , 7.31 (t, J = 7.7 Hz , 2H) , 7.27-7.20 (m, 5H) , 6.98 (d, J = 8.9 Hz, 4H) , 5.22 (d, J = 3.4 Hz, 3H) , 4.97 (dd, J = 3.4, 7.8 Hz, 3H) , 4.67 (t, J = 4.8 Hz, 1H) , 4.48 (d, J = 8.5 Hz, 3H) , 4.47-4.42 (m, 2H) , 4.05-3.98 (m, 9H) , 3.92-3.83 (m, 5H) , 3.73 (s, 6H) , 3.72-3.67 (m, 3H) , 3.55-3.45 (m, 2H) , 3.44-3.35 (m, 5H) , 3.05-2.93 (m, 11H) , 2.91-2.80 (m, 3H) , 2.65-2.55 (m, 2H) , 2.38-2.20 (m, 9H) , 2.10 (s, 9H) , 2.08-2.01 (m, 9H) , 2.00 (s, 9H) , 1.89 (s, 9H) , 1.78 (s, 9H) , 1.69-1.52 (m, 6H) , 1.47-0.98 (m, 48H) .

[0921] Compound 22-1:

[0922] Compound 6-10 (410 mg. 0.71mmol) and compound 11-11 (1.34 g, 0.71mmol) were dissolved in DCM (60 mL) , then DIEA (453.09 mg, 3.51 mmol) , EDCI (299.57 mg, 1.75 mmol) and HOBT (236.85 mg, 1.75 mmol) were added to the solution. The reaction mixture was stirred at rt for 2h. The reaction was quenched with saturated NaHCO3 solution (100 mL) , extracted with DCM (60 mLx3) , washed with brine (60 mL) , dried over Na2SO4, concentrated under vacuum and purified by flash column chromatography (0-20%MeOH) on Al2O3 to give compound 22-1 as s white foam solid (1.2 g, 69%yield) .

[0923] Mass calc. C126H185N11O39 for: 2476.28; found: 1088.2 [M-DMTr+2H] 2+, ESI.

[0924] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.85-7.81 (m, 3H) , 7.75-7.72 (m, 3H) , 7.47 (s, H) , 7.39-7.37 (m, 2H) , 7.32-7.25 (m, 2H) , 7.24-7.19 (m, 5H) , 6.88 (d, J = 8.84 Hz, 4H) , 5.22 (d, J = 3.4 Hz, 2H) , 4.97 (d, J = 11.2 Hz, 3H) , 4.75 (t, J = 4.4 Hz, 1H) , 4.50-4.48 (m, 5H) , 4.03 (s, 11H) , 3.94-3.80 (m, 7H) , 3.77-3.66 (m, 9H) , 3.50-3.41 (m, 6H) , 3.02-3.00 (m, 12H) , 2.92-2.79 (m, 2H) , 2.43-2.30 (m, 2H) , 2.29-2.22 (m, 2H) , 2.21-2.19 (m, 3H) , 2.11-2.08 (m, 11H) , 2.05-2.02 (m, 8H) , 2.00 (s, 9H) , 1.90 (s, 9H) , 1.78 (s, 9H) , 1.62-1.23 (m, 48H) .

[0925] Compound 23-1:

[0926] A solution of N-Boc-4-piperidone (5 g, 25.09 mmol) , malononitrile (2.49 g, 37.64 mmol) , AcNH2 (3.87 g, 50.19 mmol) and AcOH (4.52 g, 75.28 mmol) in toluene (50 mL) was stirred at 110 ℃ for 2h. LC-MS showed full conversion . The reaction mixture was washed by water (50 mL) , dried over  Na2SO4, concentrated and purified by silica gel column (0-10%EA in PE) to afford compound 23-1 as a gum (6.18 g, 98%yield) .

[0927] Mass calc. for C13H17O2N3: 247.1; found: 246.2 [M-H] -, ESI.

[0928] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.53 (t, J = 11.6 Hz, 4H) , 2.69 (d, J = 11.6 Hz, 4H) , 7.41 (t, J =7.3 Hz, 2H) , 1.427 (s, 9H) .

[0929] Compound 23-2:

[0930] A solution of compound 23-1 (7.6 g, 30.73 mmol) in MeOH (76 mL) was stirred at 0 ℃ . NaBH4 (1.16 g, 30.73 mmol) was added in portions to the stirred solution and stirred for 20 min. The mixture was concentrated in vacuo. The residue was partitioned between ethyl acetate (250 mL) and water (150 mL) and the ethyl acetate extract was washed with brine (100 mL) , dried over sodium sulfate and concentrated in vacuo. The residue was purified by column chromatography eluting with PE / EA = 1 / 5 to afford compound 23-2 as a gum (4.6 g, 60%yield) .

[0931] Mass calc. for C13H19O2N3: 249.2; found: 248.3 [M-H] -, ESI.

[0932] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.04-4.01 (m, 2H) , 2.75 (s, 2H) , 2.31-2.27 (m, 1H) , 1.82-1.78 (m, 2H) , 1.04 (s, 9H) , 1.27-1.16 (m, 3H) .

[0933] Compound 23-3:

[0934] A mixture of compound 23-2 (25 g, 100.28 mmol) , tert-butyl 3-bromopropanoate (41.93 g, 200.56 mmol) , t-BuOK (22.50 g, 200.56 mmol) and KI (33.29 g, 200.56 mmol) in DMSO (250 mL) was stirred at 60 ℃ overnight. LC-MS showed full conversion. The mixture was concentrated in vacuo. The residue was partitioned between ethyl acetate (100 mL×3) and water (150 mL×3) and the ethyl acetate extract was washed with brine (100 mL) , dried over sodium sulfate and concentrated in vacuo. The residue was purified by column chromatography eluting with PE / EA = 10 / 1 to afford compound 23-3 as a gum (32.87 g, 87%yield) .

[0935] Mass calc. for C20H31O4N3: 377.2; found: 319.4 [M-Boc+MeCN+H] +, ESI.

[0936] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.06 (d, J = 11.2 Hz, 2H) , 2.75 (s, 2H) , 2.55-2.53 (m, 1H) , 2.35-2.31 (m, 3H) , 1.89 (d, J = 12.4 Hz , 2H) , 1.43 (s, 9H) , 1.41 (s, 9H) , 1.27-1.19 (m, 3H) .

[0937] Compound 23-4:

[0938] Cobalt chloride hexahydrate (40.34 g, 169.55 mmol) was added to a solution of compound 23-3 (16 g, 42.39 mmol) in MeOH (400 mL) , then sodium borohydride (32.07 g, 847.73 mmol) was slowly added to the reaction mixture at -20 ℃ and stirred for 1h. Then the mixture was stirred for 1h at room temperature. The reaction mixture was concentrated to dryness and azeotropically dired with DMF to give the crude compound 23-4, which was directly used for the next step without further purification.

[0939] Mass calc. for C20H39O4N3: 385.5; found: 386.5 [M+H] +, ESI.

[0940] Compound 23-5:

[0941] A solution of Z-6-Aminohexanoic acid (27.53 g, 103.75 mmol) , TEA (12.6 g, 124.50 mmol) , HATU (46.97 g, 124.50 mmol) in DMF (240 mL) was stirred at room temperature for 30 min, compound 23-4 (16 g, 41.50 mmol) was added and stirred at rt overnight. LC-MS showed full conversion. Water (50 mL) and EA (50 mL) were added to the reaction mixture. The mixture was filtered and the filtrate was partitioned between ethyl acetate (100 mL×3) and water (150 mL×3) and the ethyl  acetate extract was washed with brine (100 mL) , dried over sodium sulfate and concentrated in vacuo. The residue was purified by prep-HPLC (C18 column, ACN / water) to afford compound 23-5 as a gum (8.3 g, 23%yield) .

[0942] Mass calc. for C48H72O11N4: 879.5; found: 880.1 [M+H] +, ESI.

[0943] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.73 (t, J = 12.4 Hz, 2H) , 7.38-7.30 (m, 10H) , 7.23 (t, J = 10.8 Hz, 2H) , 5.00 (s, 4H) , 4.06-3.60 (m, 4H) , 3.00-2.97 (m, 8H) , 2.23-2.19 (m, 4H) , 1.99 (s, 2H) , 1.58-1.48 (m, 6H) , 1.42-1.38 (m, 25H) , 1.25-1.23 (m, 4H) .

[0944] Compound 23-6:

[0945] A mixture of compound 23-5 (3.8 g, 4.31 mmol) , NH3. H2O (3.5 mL) and Pd / C (760 mg) in MeOH (38 mL) was stirred at room temperature for 2h under hydrogen atmosphere. LC-MS showed full conversion. The mixture was filtered and the filtrate was concentrated in vacuo to give the crude compound 23-6, which was used directly for the next step without further purification.

[0946] Mass calc. for C32H60N4O7: 611.8; found: 612.8 [M+H] +, ESI.

[0947] Compound 23-7:

[0948] A mixture of compound 1-4 (2.46 g, 5.49 mmol) , TEA (757.89 mg, 7.49 mmol) and HATU (2.35 mg, 6.24 mmol) in DCM (15 mL) was stirred for 30 min at room temperature. Compound 23-6 (1.53g, 2.5 mmol) was added and the mixture was stirred at rt overni...

Claims

1.A siRNA agent with double stranded ribonucleic acid (dsRNA) for inhibiting expression of complement component C3 (C3) , wherein the dsRNA comprises a first strand and a second strand, wherein the first strand sequence comprises at least 15 contiguous nucleotides differing by no more than 3 nucleotides from any one of the nucleotide sequence of nucleotides 3123-3141, 5019-5037, 2304-2322, 494-512, 2643-2661, 2244-2262, 589-607, 2482-2500, or 4698-4716 of SEQ ID NO: 1; and the second strand comprising a nucleotide sequence that is at least partially complementary to the first strand.2.The siRNA agent of claim 1, wherein the first strand sequence comprises at least 16, preferably at least 17, more preferably at least 18 and most preferably all 19 contiguous nucleotides differing by no more than 2 nucleotides, preferably by no more than 1 nucleotide, and more preferably not differing by any nucleotide from any one of the nucleotide sequence of nucleotides 3123-3141, 5019-5037, 2304-2322, 494-512, 2643-2661, 2244-2262, 589-607, 2482-2500, or 4698-4716 of SEQ ID NO: 1.3.The siRNA agent of claim 1 or 2, wherein the first strand and the second strand form a duplex region of 15-25 nucleotides in length; preferably 15-23 nucleotides in length; more preferably 15-19 nucleotides in length; further preferably 17-19 nucleotides in length; most preferably 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 nucleotides in length.4.The siRNA agent of any one of claims 1-3, wherein the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 20, 96, 16, 150, 32, 100, 110, 134, 136, respectively; and / or the second strand complementary to the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21, 97, 17, 151, 33, 101, 111, 135, 137, respectively.5.The siRNA agent of any one of claim 1-4, wherein the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 96 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 97; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 150 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 151; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 32 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 33; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 100 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 101; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 110 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 111; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 134 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 135; or the first strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 136 and the second strand has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 137.6.The siRNA agent of any one of claims 1-5, wherein the siRNA agent comprises at least one modified nucleotide; preferably wherein not wholly modified and include not more than 5, 4, 3, 2, or 1 unmodified nucleotide; more preferably wherein all of the nucleotides of the first strand are modified nucleotides, all of the nucleotides of the second strand are modified nucleotides.7.The siRNA agent of claim 6, wherein at least one of modified nucleotides is selected from the group consisting of a 3'-terminal deoxy-thymine (dT) nucleotide, a 2′-methoxy modified nucleotide, a 2'-fluoro modified nucleotide, a 2'-OCF2H modified nucleotide, a nucleotide comprising a 5'-phosphorothioate group and a nucleotide comprising a 5'- (E) -vinylphosphonate.8.The siRNA agent of claim 6 or 7, wherein:(i) all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as:the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th and 9th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution;the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 4th, 6th, 10th, 12th, 13th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification;the pentose of the nucleotide residue at 3rd, 11th, and 14th positions counting from the 5’ end were modified by means of either 2′-methoxy modification or 2′-fluoro substitution;all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as:the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution;the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 6th, 7th, 9th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th, and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification;the pentose of the nucleotide residue at 4th, 8th and 10th position counting from the 5’ end were modified by means of either 2′-methoxy modification or 2′-fluoro substitution;or(ii) all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as:the pentose of the nucleotide residue at 7th, 9th, 10th and 11th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution;the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 4th, 6th, 8th, 12th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification;the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 13th, 15th, 17th, and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of either 2′-methoxy modification or 2′-fluoro substitution; all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as:the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 6th, 8th, 14th and 16th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution;the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 7th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification;the 4th, 9th, 10th and 18th position counting from the 5’ end was modified by means of either 2′-methoxy modification or 2′-fluoro substitution.9.The siRNA agent of claim 8, wherein:(i) all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 11th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification;all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 8th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; or(ii) all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 3rd, 5th, 7th, 8th and 9th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification;all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 4th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; or(iii) all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 11th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification;all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 4th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; or(iv) all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 14th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification;all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 8th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; or(v) all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 5th, 7th, 8th, 9th and 14th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification;all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 4th, 14th, 16th and 18th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification; or(vi) all of the nucleotides of the first strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 7th, 9th, 10th and 11th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 8th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification;all of the nucleotides of the second strand comprise a modification in patterns as: the pentose of the nucleotide residue at 2nd, 6th, 8th, 9th, 14th and 16th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-fluoro substitution; the pentose of the nucleotide residue at 1st, 3rd, 4th, 5th, 7th, 10th, 11th, 12th, 13th, 15th, 17th, 18th and 19th positions counting from the 5’ end were modified by means of 2′-methoxy modification.10.The siRNA agent of any one of claims 1-9, wherein the second strand comprises a terminal 5’ (E) -vinylphosphonate nucleotide at the 5’ end.11.The siRNA agent of any one of claims 1-10, wherein:the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and / or at the 3'-terminus; and / or the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and / or at the 3'-terminus;preferably,(i) the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus; and the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus; or(ii) the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus; and the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus.12.The siRNA agent of any one of claims 1-11, further comprising a targeting ligand; preferably the targeting ligand comprises N-acetylgalactosamine (GalNAc) conjugate or derivatives thereof.13.The siRNA agent of claim 12, wherein the targeting ligand is conjugated to the 3'-terminus or 5'-terminus of the first strand of the siRNA agent.14.The siRNA agent of any one of claims 12 or 13, wherein:the targeting ligand is conjugated to the 5'-terminus of the first strand;the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus;the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus;optionally all remaining linkages between nucleotides of the first and / or of the second strand are phosphodiester linkages;orthe targeting ligand is conjugated to the 3'-terminus of the first strand;the first strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus; the second strand comprises two phosphorothioate internucleotide linkages at the 5'-terminus and two phosphorothioate internucleotide linkages at the 3'-terminus;optionally all remaining linkages between nucleotides of the first and / or of the second strand are phosphodiester linkages.15.The siRNA agent of any one of claim 12-14, wherein:the first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 214) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 211) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*fGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUmGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 208) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NOs: 209) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 210) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 211) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 210) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 212) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 211) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmUmUmA-GN (SEQ ID NO: 212) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGfGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 213) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 214) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 215) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 211) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 215) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 209) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*fGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUmUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 216) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 218) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 219) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 218) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 220) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 219) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmCmUmU-GN (SEQ ID NO: 220) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCfGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 221) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 222) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 219) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 222) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 223) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 219) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by GN-mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 223) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 217) ;wherein mA, mC, mG and mU represent 2'-O-methyl adenosine, cytidine, guanosine and uridine respectively; fA, fC, gG and fU represent 2'-fluoro adenosine, cytidine, guanosine or uridine, respectively; “*” is a phosphorothioate internucleotide linkage, “ (E) -VP” is (E) -vinylphosphonate moiety at the 5′ end, “GN” is the targeting ligand.16.The siRNA agent of any one of claims 12-15, wherein the siRNA agent is conjugated to the ligand as shown in the following schematic: the ligand comprises (i) one or more N-acetyl galactosamine (GalNAc) moieties or derivatives thereof, and (ii) a linker, wherein the linker conjugates the at least one GalNAc moiety or derivative thereof to the nucleic acid, and (iii) a bicyclic group tethers GalNAc and siRNA, or (iv) a terta-functional group, wherein the GalNAc moieties tethers, wherein X is O, S.17.The siRNA agent of claim 16, wherein the siRNA agent is conjugated to the ligand as shown in the following schematic: wherein X is O or S;theis:theis:Wherein the X is O or S;theis:18.The siRNA agent of anyone of claims 16 or 17, wherein the linker in the schematic is independently selected from:(1) - (CH2) x-C (O) NH- (CH2) y-C (O) -;(2) - (CH2) x-C (O) NH- (CH2) y-NHC (O) - (CH2) z-C (O) -;(3) -NH- (CH2) y-C (O) -;(4) –C (O) - (CH2) y-C (O) -;wherein each linker in the schematic is optionally the same or different; the x, y and z are independently selected from 1-10; preferably the x and y are independently selected from 2-8, z is selected from 1-6; more preferably the x and y are independently selected from 3-6, z is selected from 1-4.19.The siRNA agent of anyone of claims 12-18, wherein the siRNA agent is conjugated to the ligand as shown in the following schematic: the X is O or S.20.The siRNA agent of any one of claim 12-19, wherein:the first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 230) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 227) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*fGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUmGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 224) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 226) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 227) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 226) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID N: 228) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 227) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mG*mGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmUmUmA- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 228) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGfGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 229) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCfUmGmUmGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 230) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 231) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAmUmGmCmAfCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 227) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmGmGmUfCmAfUfCfGmCmUmGmUfGmCmAmU*mU*mA (SEQ ID NO: 231) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mU*fA*mAfUmGmCmAmCmAmGmCmGmAfUmGfAmC*fC*mG (SEQ ID NO: 225) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*fGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUmUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 232) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 234) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 235) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 234) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 236) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 235) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by mC*mC*mGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmCmUmU- (GalNAc-7) (SEQ ID NO: 236) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCfGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 237) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 238) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 235) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUfGmGmUmUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 238) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 239) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGmAmCmAmAfCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 235) ; orthe first strand has a nucleotide sequence represented by (GalNAc-3) -mCmCmGmAfGmAfGfCfAmUmGmGmUfUmGmUmC*mU*mU (SEQ ID NO: 239) and the second strand has a nucleotide sequence represented by (E) -VP-mA*fA*mGfAmCmAmAmCmCmAmUmGmCfUmCfUmC*fG*mG (SEQ ID NO: 233) ;wherein mA, mC, mG and mU represent 2'-O-methyl adenosine, cytidine, guanosine and uridine respectively; fA, fC, gG and fU represent 2'-fluoro adenosine, cytidine, guanosine or uridine, respectively; “*” is a phosphorothioate internucleotide linkage; “ (E) -VP” is (E) -vinylphosphonate moiety at the 5′ end.21.A pharmaceutical composition comprising the siRNA agent of any one of claims 1-20, and a pharmaceutically acceptable carrier.22.A method of inhibiting expression of a complement component C3 gene in a cell, the method comprising:(a) contacting the cell with the siRNA agent of any one of claims 1-20, or the pharmaceutical composition of claim 21; and(b) maintaining the cell produced in step (a) for a time sufficient to obtain degradation of the mRNA transcript of the complement component C3 gene, thereby inhibiting expression of the complement component C3 gene in the cell.23.A method of treating a subject having a disease or disorder that would benefit from a reduction in complement component C3 expression, the method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the siRNA agent of any one of claims 1-20, or the pharmaceutical composition of claim 21, thereby treating said subject.24.The method of claim 23, wherein the disease or disorder is a complement-mediated disease, disorder or syndrome, preferably the disease or disorder is C3-associated disease or disorder, more preferably the disease or disorder is selected from the group comprising IgA Nephropathy (IgAN) , C3 Glomerulopathy (C3G) , Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH) , atypical Hemolytic Uremic Syndrome (aHUS) , Neuro-Myelitis Optica (NMO) , Multifocal Motor Neuropathy (MMN) and Myasthenia Gravis (MG) .

Images