Engineered reprogramming factors and uses thereof

Abstract

The present application provides methods of rejuvenating a population of cells (e.g., skin cells), comprising introducing into the population of cells (e.g., skin cells) an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in liquid-liquid phase separation (LLPS). Also provided are methods of delaying or preventing the progression of aging of a tissue (e.g., skin tissue) in an individual (e.g., human), and methods of treating and / or preventing aging, damage, or disease or condition in a tissue (e.g., skin tissue) of an individual, using any of the tissue (e.g., skin) rejuvenation methods and / or LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein.

Description

ENGINEERED REPROGRAMMING FACTORS AND USES THEREOF

[0001] CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This patent application claims priority benefits of Chinese Patent Application No. CN202310793813. X filed on June 30, 2023, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0003] REFERENCE TO AN ELECTRONIC SEQUENCE LISTING

[0004] The contents of the electronic sequence listing (313682000140SEQLIST. xml; Size: 365, 362 bytes; and Date of Creation: June 30, 2024) is herein incorporated by reference in its entirety.FIELD OF THE INVENTION

[0005] The present application relates to methods of rejuvenating a population of cells (such as skin cells) , comprising introducing into the population of cells (such as skin cells) an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in liquid-liquid phase separation (LLPS) . Also provided are methods of delaying or preventing the progression of aging of a tissue (such as skin) tissue in an individual (e.g., human) , and methods of treating and / or preventing aging, damage, or disease or condition in a tissue (such as skin tissue) of an individual, using any of the skin rejuvenation methods and / or LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0006] An important approach for induced pluripotent stem cell (iPSC) reprogramming is using transcription factors such as OCT4, SOX2, KLF4, and MYC (referred to as “OSKM” or “4-Factor” ) to reprogram somatic cells into pluripotent status, the process of which is called complete reprogramming, and can be divided into initiation phase, maturation phase, and stabilization phase (K.Tanabe et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013; 110 (30) : 12172-12179; N. Olova et al., Aging Cell. 2019; 18 (1) : e12877) . During the reprogramming process, cells undergo drastic changes in transcription levels and epigenetic modifications, resulting in dramatic changes in cell identity and state. During the initiation phase, the expression levels of early-stage pluripotent genes, such as TRA-1-60, NANOG, SSEA4 and SALL4, increase rapidly, while the expression levels of somatic identity genes do not change much. Then, during the maturation phase, in addition to the above- mentioned early-stage pluripotent genes, the late-stage pluripotent genes, such as DPPA5 and LIN28, are highly expressed, while the the expression levels of somatic identity genes decrease rapidly (K. Tanabe et al., 2013; N. Olova et al., 2019) . Finally, during the stabilization phase, the cells have fully established the pluripotency gene expression network and become iPSCs, which express the above pluripotent genes and also other classical core pluripotency transcription factors, such as OCT4, SOX2 and KLF4, at high levels, while somatic identity marker genes are basically not expressed. This reprogramming process can lead to cell rejuvenation, which can be detected by changes in the transcription level of certain marker genes, cellular senescence markers, and especially epigenetic age (EpiAge) based on DNA methylation (N. Olova et al., 2019; A. Daunay, et al., Aging (Albany NY) . 2022; 14 (19) : 7718-7733; D. Gill et al., eLife, 2022; 11: e71624) .

[0007] Partial reprogramming refers to the cessation of complete reprogramming in the middle of the process mentioned above. Since cell rejuvenation occurs in the early-stage of the reprogramming process, and the loss of somatic identity occurs in the middle-and late-stages of the reprogramming process, there is a time window to rejuvenate the cells without altering the original identity of the cells, which is the technical principle of partial reprogramming to rejuvenate cells (A. Ocampo et al., Cell. 2016; 167 (7) : 1719-1733. e12; N. Olova et al., Aging Cell. 2019; 18 (1) : e12877) . The methods of using transcription factors to rejuvenate cells via partial reprogramming are mainly reported as follows: 1) In vitro induction of time-restricted partial reprogramming, also known as transient reprogramming. For example, transient induction of the 4-Factor expression by an inducible transgene expression system in human fibroblast was found to reverse the EpiAge of cells while maintaining the fibroblast identity (N. Olova et al., 2019; D. Gill et al., 2022) . 2) In vivo induction of transient-pulse partial reprogramming. For example, transient-pulse induction of the 4-Factor expression in transgenic mice with an inducible expression system was found to make the organs (e.g., skin, spleen, liver, kidney, stomach and aorta) of Progeria mice younger, and also make the organs (e.g., pancreas and muscle) of wild-type old mice younger to a certain extent (A. Ocampo et al., 2016; K. Browder et al., Nat Aging. 2022; 2 (3) : 243-253) . 3) Partial reprogramming by a reduced number of transcription factors (referred to 3-Factor reprogramming) . For example, delivery of AAV vectors expressing 3 transcription factors (OSK) into the eyes of a mouse glaucoma model exhibited remarkable therapeutic efficacy (Lu et al., Nature. 2020; 588 (7836) : 124-129) .

[0008] Some protein and / or nucleic acid molecules in the cell can interact with each other to produce a phase with different physical and chemical properties in the surrounding homogeneous environment, usually showing droplet-like characteristics, and the result is the formation of membrane-free organelles or sub-cellular structures, namely, biomolecular condensates. This process is referred to as phase separation or liquid-liquid phase separation (LLPS) (C. Brangwynne et al., Science. 2009; 324 (5935) : 1729-1732; P. Li et al. Nature. 2012; 483 (7389) : 336-340) . Biomolecular condenesates are in size at the micron level, which create a relatively independent spatial region that selectively enriches molecules. Biomolecular condenesates formed by phase separation typically have higher protein densities and reduced molecular micromotility compared to the surrounding environment, which can facilitate certain biochemical reactions more efficiently. The structural characteristics of proteins that can form condensates are still being studied.

[0009] In 2021, Wang et al. (Cell Stem Cell. 2021; 28 (10) : 1868-1883. e11) discovered that OCT4 undergoes phase separation to regulate topological-associated domain (TAD) reorganization, and TAD reorganization contributes to cell fate transition.

[0010] The disclosures of all publications, patents, patent applications and published patent applications referred to herein are hereby incorporated herein by reference in their entirety.

[0011] BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION

[0012] One aspect of the present application provides a method of rejuvenating a population of cells (such as skin cells) , comprising introducing into the population of cells (such as skin cells) an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS.

[0013] In some embodiments, the methods are for rejuventation of skin or skin cells. In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination thereof.

[0014] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, the population of skin cells are from a skin tissue that is: (i) an aged skin tissue; (ii) a damaged skin tissue; (iii) a skin tissue with skin disease or condition; and / or (iv) a skin tissue after cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue.

[0015] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, the method does not reprogram the population of skin cells into a reprogrammed stem cell.

[0016] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, compared to a reference skin cell not introduced with the engineered reprogramming factor, the rejuvenated population of skin cells: (i) have reduced proportion of cell senescence biomarker-positive cells; (ii) have reduced expression and / or function of a biomarker of cell senescence; (iii) have reduced epigenetic age (EpiAge) ; (iv) have increased expression and / or function of a biomarker related to healthy skin cell function; (v) have increased expression and / or function of a biomarker of skin cell identity; (vi) have reduced expression and / or function of a biomarker of apoptosis; (vii) have reduced expression and / or function of a biomarker of ferroptosis; (viii) have reduced expression and / or function of a biomarker of inflammation; (ix) have reduced expression and / or function of a biomarker of endoplasmic reticulum stress; and / or (x) have reduced expression and / or function of a biomarker related to unhealthy skin cell function. In some embodiments, (i) the biomarker of cell senescence is selected from the group consisting of senescence-associated-β-galactosidase (SA-β-gal) , p16, and p21, or a combination thereof; (ii) the EpiAge is measured using Horvath’s clock, Levine’s clock, Hannum’s clock, and / or AltumAge; (iii) the biomarker related to healthy skin cell function is selected from the group consisting of COL1A1, COL3A1, COL4A1, ELN, FN1, and LAMA5, or a combination thereof; (iv) the biomarker of skin cell identity is selected from the group consisting of THY1, P4HB, S100A4, and SERPINH1, or a combination thereof; (v) the biomarker of apoptosis is selected from the group consisting of loss of membrane asymmetry, cleavage of a Bcl-2 family protein, caspase activation, caspase substrate cleavage, non-caspase protease activation, mitochondrial transmembrane potential (Δ ψm) decrease, cytochrome C release, increase of sub G1 population, nuclear condensation, DNA fragmentation, and membrane blebbing, or a combination thereof; (vi) the biomarker of ferroptosis is HMOX1, SAT1, or a combination thereof; (vii) the biomarker of inflammation is IL6, CCL3, CXCL2, CXCL8, CSF2, or a combination thereof; (viii) the biomarker of endoplasmic reticulum stress comprises Hsp70 heat shock proteins, Hsp40 heat shock proteins, DDIT3, and HERPUD1, or a combination thereof; and / or (ix) the biomarker related to unhealthy skin cell function is selected from the group consisting of IL6, CXCL8, IL1A, IL1B, IGFBP3, CDKN1A, TGFB3, MMP1, MMP2, and SOD2, or a combination thereof.

[0017] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, compared to a reference skin cell introduced with an effective amount of a reference reprogramming factor that is not deficient in LLPS, the rejuvenated population of skin cells: (i) have increased expression and / or function of a biomarker of initiation phase reprogramming (IPR) ; (ii) have reduced expression and / or function of a biomarker of maturation phase reprogramming; and / or (iii) have reduced expression and / or function of a biomarker of stabilization phase reprogramming. In some embodiments, (i) the biomarker of IPR is NANOG and / or SALL4; (ii) the biomarker of maturation phase reprogramming is DPPA5 and / or LIN28A; and / or (iii) the biomarker of stabilization phase reprogramming is OCT4 and / or XACT.

[0018] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, compared to a reference skin tissue not comprising skin cells introduced with the effective amount of the engineered reprogramming factor, a skin tissue comprising the population of skin cells introduced with the effective amount of the engineered reprogramming factors has increased expression of one or more selected from the group consisting of elastin, collagen I, collagen III, and collagen IV. In some embodiments, compared to a reference skin tissue comprising skin cells introduced with an effective amount of a reference reprogramming factor that is not deficient in LLPS, a skin tissue comprising the population of skin cells introduced with the effective amount of the engineered reprogramming factors has increased expression of one or more selected from the group consisting of elastin, collagen I, collagen III, and collagen IV. In some embodiments, the reference skin tissue and the skin tissue are from a same individual. In some embodiments, the reference skin tissue and the skin tissue are from different individuals.

[0019] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, the engineered reprogramming factor comprises a mutation in an LLPS-related domain in reference to a corresponding wild-type reprogramming factor. In some embodiments, the LLPS-related domain is selected from the group consisting of an intrinsically disordered region (IDR) , a region outside of DNA-binding domain (DBD) , a ubiquitination site, or any combination thereof. In some embodiments, the mutation comprises: (i) substituting an acidic amino acid within the IDR with a neutral amino acid; (ii) substituting an amino acid that can be ubiquitinated with an amino acid that cannot be ubiquitinated; (iii) deleting an amino acid that can be ubiquitinated; (iv) deleting an amino acid within the IDR; and / or (v) deleting an amino acid within a region outside of DBD. In some embodiments, (i) the amino acid that can be ubiquitinated is K; and / or (ii) the  amino acid to be deleted comprises an acidic amino acid. In some embodiments, the wild-type reprogramming factor is from a family selected from the group consisting of OCT family, SOX family, KLF family, MYC family, LIN28 family, NANOG family, and GLIS family. In some embodiments, the wild-type reprogramming factor is selected from the group consisting of OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, L-MYC, LIN28, NANOG, and GLIS1.

[0020] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, the engineered reprogramming factor is an engineered OCT4. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises a mutation at amino acid positions 1-140 and / or 288-360, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises a substitution at an amino acid position selected from the group consisting of 8, 20, 26, 31, 56, 68, 91, 96, 98, 104, 108, 113, 125, 127, 130, 134, 135, 138, 291, 296, 297, 299, 341, and 343, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises a substitution at an amino acid position selected from the group consisting of D8, D20, E26, D31, E56, E68, E91, E96, E98, E104, D108, E113, E125, E127, E130, E134, E135, D138, D291, E296, D297, E299, E341, and E343. In some embodiments, the substitution comprises substituting an acidic amino acid with a neutral amino acid, such as substituting a D or E with an A. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises a substitution selected from the group consisting of D8A, D20A, D31A, D108A, E134A, D138A, D291A, or any combination thereof. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises a substitution selected from the group consisting of: (i) D8A, D20A, E26A, D31A, E56A, E68A, E91A, E96A, E98A, E104A, D108A, E113A, E125A, E127A, E130A, E134A, E135A, D138A, D291A, E296A, D297A, E299A, E341A, and E343A; (ii) D8A, D20A, E26A, D31A, E56A, E68A, E91A, E96A, E98A, E104A, D108A, E113A, E125A, E127A, E130A, E134A, E135A, and D138A; (iii) D291A, E296A, D297A, E299A, E341A, and E343A; (iv) D8A, D20A, E26A, D31A, E56A, E68A, E91A, E96A, E98A, E104A, D108A, E113A, E125A, E127A, E130A, E134A, D138A, D291A, E296A, E299A, E341A, and E343A; (v) E134A, E135A, E296A, and D297A; (vi) D8A, D20A, D31A, D108A, D138A, D291A, and D297A; and (vii) E26A, E56A, E68A, E91A, E96A, E98A, E104A, E113A, E125A, E127A, E130A, E134A, E135A, E296A, E299A, E341A, and E343A. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 4-10, or a variant thereof having at least about 85%sequence identity to any of SEQ ID NOs: 4-10. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises a  deletion at amino acid positions 2-140 and / or 288-360, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises a deletion selected from the group consisting of: (i) a deletion at amino acid positions 2-140 and 301-360; (ii) a deletion at amino acid positions 301-360; and (iii) a deletion at amino acid positions 2-140. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 44-46, or a variant thereof having at least about 85%sequence identity to any of SEQ ID NOs: 44-46.

[0021] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, the engineered reprogramming factor is an engineered c-MYC. In some embodiments, the engineered c-MYC comprises a substitution of an amino acid that can be ubiquitinated with an amino acid that cannot be ubiquitinated, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 12 or 85. In some embodiments, the substitution comprises substituting a K with an R. In some embodiments, the engineered c-MYC comprises a substitution at an amino acid position selected from the group consisting of 51, 52, 126, 143, 148, 157, 206, 269, 275, 289, 298, 317, 323, 326, 341, 355, 371, 389, 392, 397, 398, 412, 422, 428, and 430, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 12 or 85. In some embodiments, the engineered c-MYC comprises a substitution selected from the group consisting of K51R, K52R, K148R, K275R, K289R, and K389R, or any combination thereof. In some embodiments, the engineered c-MYC comprises a substitution selected from the group consisting of: (i) K51R, K52R, K126R, K143R, K148R, K157R, K206R, K269R, K275R, K289R, K298R, K317R, K323R, K326R, K341R, K355R, K371R, K389R, K392R, K397R, K398R, K412R, K422R, K428R, and K430R; (ii) K148R; (iii) K389R; (iv) K148R and K389R; (v) K51R and K52R; (vi) K275R and K289R; and (vii) K51R, K52R, K275R, and K289R. In some embodiments, the engineered c-MYC comprises an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14-20, or a variant thereof having at least about 85%sequence identity to any of SEQ ID NOs: 14-20. In some embodiments, the engineered c-MYC comprises a deletion at amino acid positions 2-360 (e.g., a deletion at amino acid positions 2-140) , wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 12 or 85. In some embodiments, the engineered c-MYC comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 or 48, or a variant thereof having at least about 85%sequence identity to SEQ ID NO: 47 or 48.

[0022] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, the engineered reprogramming factor is an engineered KLF4. In some embodiments, the  engineered KLF4 comprises a deletion at amino acid positions 2-374, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the engineered KLF4 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, or a variant thereof having at least about 85%sequence identity to SEQ ID NO: 40.

[0023] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, the engineered reprogramming factor is an engineered SOX2. In some embodiments, the engineered SOX2 comprises a deletion at amino acid positions 2-40 and / or 201-317, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the engineered SOX2 comprises an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 41-43, or a variant thereof having at least about 85%sequence identity to any of SEQ ID NOs: 41-43.

[0024] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, the engineered reprogramming factor is encoded by a nucleic acid. In some embodiments, the nucleic acid comprises a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 13. In some embodiments, the nucleic acid is an RNA, e.g., a circular RNA (circRNA) , self-amplifying mRNA, or linear mRNA. In some embodiments, the nucleic acid is a DNA. In some embodiments, the nucleic acid is comprised within a vector, e.g., a viral vector, such as a lentiviral vector or an adeno-associated virus (AAV) vector. In some embodiments, the nucleic acid is delivered by an exosome, a liposome, a lipid nanoparticle (LNP) , or a virus.

[0025] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, the population of skin cells is present in an individual in need of treatment, wherein the method comprises administering the effective amount of the engineered reprogramming factor to the individual in vivo. In some embodiments, the method comprises administering an RNA (e.g., circRNA, or linear mRNA) encoding the engineered reprogramming factor, wherein the RNA is encapsulated within an exosome or an LNP. In some embodiments, the exosome or LNP is delivered by a microneedle. In some embodiments, the population of skin cells is obtained from a donor individual and cultured ex vivo. In some embodiments, the method comprises implanting the rejuvenated population of skin cells into an individual in need of treatment. In some embodiments, the donor individual and the individual in need of treatment are the same. In some embodiments, the donor individual and the individual in need of treatment are different. In some embodiments, the method comprises ex vivo administering to the population of skin cells an RNA  encoding the engineered reprogramming factor, wherein the RNA is encapsulated within an exosome or an LNP.

[0026] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, the method comprises introducing a plurality of reprogramming factors into the population of skin cells, wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise two or more reprogramming factors from two or more families selected from the group consisting of OCT family, SOX family, KLF family, MYC family, LIN28 family, NANOG family, and GLIS family. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise two or more reprogramming factors selected from the group consisting of OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, L-MYC, LIN28, NANOG, GLIS1, and variant thereof. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise OCT4 and KLF4, wherein at least one of OCT4 and KLF4 is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise three or all of OCT4, KLF4, c-MYC, and SOX2, wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS. In some embodiments, the OCT4 is an engineered OCT4 that is deficient in LLPS. In some embodiments, the KLF4 is an engineered KLF4 that is deficient in LLPS. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise a wild-type reprogramming factor. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise any of: (i) an engineered OCT4 that is deficient in LLPS, SOX2, and KLF4; (ii) an engineered OCT4 that is deficient in LLPS, KLF4, and an engineered c-MYC that is deficient in LLPS; or (iii) an engineered OCT4 that is deficient in LLPS, KLF4, an engineered c-MYC that is deficient in LLPS, and SOX2. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors are encoded by a plurality of nucleic acids. In some embodiments, the plurality of nucleic acids are on separate nucleic acid constructs. In some embodiments, at least two of the plurality of nucleic acids are on a single nucleic acid construct. In some embodiments, the at least two of the plurality of nucleic acids are under the control of different promoters. In some embodiments, the at least two of the plurality of nucleic acids are under the control of the same promoter. In some embodiments, the at least two of the plurality of nucleic acids are connected by one or more linking nucleic acids. In some embodiments, the one or more linking nucleic acids comprise IRES or a linking sequence encoding a self-cleaving peptide. In some embodiments, the one or more linking nucleic acids  comprise a linking sequence encoding a self-cleaving peptide, and wherein the self-cleaving peptide is P2A, T2A, or E2A. In some embodiments, the nucleic acid construct comprises from 5’ to 3’ : (i) a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS–a first linking sequence encoding P2A–a second nucleic acid encoding SOX2–a second linking sequence encoding T2A–a third nucleic acid encoding KLF4; (ii) a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS–a first linking sequence encoding P2A–a second nucleic acid encoding KLF4–a second linking sequence encoding T2A–a third nucleic acid encoding an engineered c-MYC that is deficient in LLPS; (iii) a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS–a first linking sequence encoding P2A–a second nucleic acid encoding KLF4–a second linking sequence encoding T2A–a third nucleic acid encoding an engineered c-MYC that is deficient in LLPS–a third linking sequence encoding E2A –a fourth nucleic acid encoding SOX2; or (iv) a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS–a first linking sequence encoding P2A–a second nucleic acid encoding KLF4–a second linking sequence encoding T2A–a third nucleic acid encoding SOX2. In some embodiments, (i) the engineered OCT4 that is deficient in LLPS comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; and / or (ii) the engineered c-MYC that is deficient in LLPS comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the nucleic acid construct comprises a nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 28, 30, 32, 35, 37, 39, 57, 59, 61, 94, 98, and 102.

[0027] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, the method further comprises introducing into the population of skin cells an effective amount of a therapeutic agent, such as B18R, Vitamin C, Vitamin E, or any combination thereof.

[0028] In some embodiments according to any of the skin rejuvenation methods described above, the individual is a human (e.g., of any age) , such as a human of 10 years or older (e.g., 22 years or older, 30 years or older) .

[0029] Another aspect of the present application provides a method of delaying or preventing the progression of aging of a skin tissue in an individual (e.g., human, such as a human of 22 years or older) , comprising introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the engineered reprogramming factors described herein) . In some embodiments, the method of  delaying or preventing the progression of aging of the skin tissue in the individual comprises rejuvenating a population of skin cells of the skin tissue using any of the skin rejuvenation methods described above.

[0030] Another aspect of the present application provides a method of treating aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , comprising introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the engineered reprogramming factors described herein) . In some embodiments, the method of treating aging, damage, or disease or condition in the skin tissue of the individual comprises rejuvenating a population of skin cells of the skin tissue using any of the skin rejuvenation methods described above.

[0031] Another aspect of the present application provides a method of preserving or improving the state and / or appearance of a skin tissue of an individual (e.g., human, such as a human of 22 years or older) , comprising introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the engineered reprogramming factors described herein) . In some embodiments, the method of preserving or improving the state and / or appearance of the skin tissue of the individual comprises rejuvenating a population of skin cells of the skin tissue using any of the skin rejuvenation methods described above.

[0032] Another aspect of the present application provides a method of enhancing the restoration of a skin tissue in an individual (e.g., human, such as a human of 10 years or older, or 22 years or older) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, comprising introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the engineered reprogramming factors described herein) . In some embodiments, the method of enhancing the restoration of the skin tissue in the individual after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure comprises rejuvenating a population of skin cells of the skin tissue using any of the skin rejuvenation methods described above.

[0033] Another aspect of the present application provides a method of preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , comprising introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of an engineered reprogramming  factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the engineered reprogramming factors described herein) . In some embodiments, the method of preventing aging, damage, or disease or condition in the skin tissue of the individual comprises rejuvenating a population of skin cells of the skin tissue using any of the skin rejuvenation methods described above. In some embodiments, the skin tissue is: (i) susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) susceptible of being damaged or with predisposition toward skin damage; (iii) susceptible of or with predisposition toward developing a skin disease or condition; and / or (iv) to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0034] FIGs. 1A-1B show verification of GFP-OCT4 and GFP-OCT4mutant (GFP-OCT4’ ) expression and distribution pattern in DAPI-stained 293T cells. FIG. 1A shows distribution pattern of GFP-OCT4 and GFP-OCT4’ in 293T cells, including after treatment with 1, 6-hexanediol. FIG. 1B shows fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of GFP-Oct4 and GFP-Oct4’ droplets.

[0035] FIGs. 2A-2D show schematic diagrams of AnaPIE circular RNA (circRNA) vector structures containing one or two nucleic acids encoding different reprogramming factors. FIG. 2A shows the vector structure of AnaPIE-OS (encoding OCT4 and SOX2) . FIG. 2B shows the vector structure of AnaPIE-M (encoding c-MYC) . FIG. 2C shows the vector structure of AnaPIE-K (encoding KLF4) . FIG. 2D shows the vector structure of AnaPIE-LN (encoding LIN28 and NANOG) .

[0036] FIG. 3 shows results of 1%agarose gel electrophoresis following digestion with RNase R enzyme to verify formation of AnaPIE-OS, AnaPIE-M, AnaPIE-K and AnaPIE-LN circRNAs.

[0037] FIG. 4 shows results of 2%agarose gel electrophoresis of test circRNAs AnaPIE-OS, AnaPIE-M, AnaPIE-K and AnaPIE-LN compared to control circRNA AnaPIE-GFP.

[0038] FIG. 5 shows Western blot analysis of protein expression from AnaPIE-OS, AnaPIE-M, AnaPIE-K and AnaPIE-LN circRNAs following transfection into HEK 293T cells.

[0039] FIGs. 6A-6F show schematic diagrams of AzoPIE circRNA plasmid structures containing three or four nucleic acids encoding different reprogramming factors. FIG. 6A shows the vector structure of AzoPIE-OSK (encoding OCT4, SOX2, and KLF4) . FIG. 6B shows the  vector structure of AzoPIE-O’SK (encoding OCT4’ , SOX2, and KLF4) . FIG. 6C shows the vector structure of AzoPIE-OKM (encoding OCT4, KLF4, and c-MYC) . FIG. 6D shows the vector structure of AzoPIE-O’KM’ (encoding OCT4’ , KLF4, and c-MYC’ ) . FIG. 6E shows the vector structure of AzoPIE-OKMS (encoding OCT4, KLF4, c-MYC, and SOX2) . FIG. 6F shows the vector structure of AzoPIE-O’KM’S (encoding OCT4’ , KLF4, c-MYC’ , and SOX2) .

[0040] FIG. 7 shows results of 1%agarose gel electrophoresis of AzoPIE-OSK, AzoPIE-O’SK, AzoPIE-O’KM’ , and AzoPIE-OKM circRNAs.

[0041] FIG. 8 shows results of 1%agarose gel electrophoresis of AzoPIE-OKMS and AzoPIE-O’KM’S circRNAs.

[0042] FIG. 9 shows Western blot analysis of protein expression from AzoPIE-OKM, AzoPIE-O’KM’ , and AzoPIE-OKMS circRNAs following transfection into HEK 293T cells.

[0043] FIGs. 10A-10C show schematic diagrams of AzoPIE circRNA vector structures containing nucleic acids encoding mouse OCT4 (wild-type (MsO) or mutant (MsOmut) ) , mouse KLF4 (MsKLF4) and mouse SOX2 (MsSOX2) . FIG. 10A shows the vector structure of AzoPIE-MsOKS. FIGs. 10B-10C show the vector structure of AzoPIE-MsOmutKS encoding two different mouse OCT4 mutants. FIG. 10B shows the vector structure of AzoPIE-MsOmut1KS. FIG. 10C shows the vector structure of AzoPIE-MsOmut2KS.

[0044] FIG. 11 shows Western blot analysis of protein expression from the AzoPIE-MsOmut1KS circRNA following transfection into HEK 293T cells.

[0045] FIGs. 12A-12B show characterization of HEK cell exosomes. FIG. 12A shows a transmission electron microscope (TEM) image of exosome samples showing typical cup-shaped morphology. FIG. 12B shows nano flow cytometry results showing that the size of the exosomes is generally between 60-80 nm.

[0046] FIG. 13 shows nano flow cytometry results measuring concentration and size of HEK cell exosome (HEK-exo) and human MSC exosome (huMSC-exo) with and without the loading of circular RNA.

[0047] FIG. 14 shows RT-qPCR results indicating the copy number of circRNAs in HEK-exo, huMSC-exo, and control samples.

[0048] FIGs. 15A-15B show verification of circRNA delivery by exosomes using fluorescent reporters eGFP. FIG. 15A shows microscopy images showing eGFP expression 24 hours after incubating HEK-exo with circRNA-eGFP. FIG. 15B shows microscopy images showing eGFP expression 24 hours after incubating huMSC-exo with circRNA-eGFP.

[0049] FIG. 16 shows nano flow cytometry results showing no significant difference in loading efficiency of OSK-circRNA and O’SK circRNA in HEK-exo.

[0050] FIG. 17 shows immunofluorescence verification of expression of human KLF4, OCT4, and SOX4 proteins from OSK-circRNA-loaded HEK-exosome following transfection into human skin fibroblast cells. DAPI staining shows nuclei.

[0051] FIGs. 18A-18B show lentiviral vector construction. FIG. 18A shows a schematic diagram of four lentiviral vector structures: LV-TRE3G-OKM, LV-TRE3G-O’KM’ , LV-TRE3G-OKMS, and LV-TRE3G-O’KM’S . FIG. 18B shows results of enzyme digestion of the four lentiviral vector plasmids.

[0052] FIGs. 19A-19B show the lentiviral vector quality control assay. FIG. 19A shows lentiviral titer and sterility test results of LV-TRE3G-OKM, LV-TRE3G-O’KM’ , LV-TRE3G-OKMS, and LV-TRE3G-O’KM’S . FIG. 19B shows detection of KLF4 RNA expression levels of the four lentiviral vector plasmids following transduction into HEK 293T cells.

[0053] FIG. 20 shows a schematic diagram of the AAV-TRE3G-OKS vector structure.

[0054] FIG. 21 shows results of enzyme digestion of the AAV-TRE3G-OKS vector plasmid.

[0055] FIG. 22 shows a schematic diagram of the AAV-TRE3G-O’KS vector structure.

[0056] FIG. 23 shows results of enzyme digestion of the AAV-TRE3G-O’KS vector plasmid.

[0057] FIGs. 24A-24C show RT-qPCR results for the AAV-TRE3G vectors. FIG. 24A shows the original amplification curve set. FIG. 24B shows the standard curve. FIG. 24C shows the titer measurement of AAV-TRE3G-OKS and AAV-TRE3G-O’KS using RT-qPCR.

[0058] FIG. 25 shows immunostaining of KLF4 in mouse retinal ganglion cells two weeks after intravitreal injection with AAV-TRE3G-eGFP, AAV-TRE3G-OKS, or AAV-TRE3G-O’KS, together with co-injection of AAV-CMV-TET3G and followed by doxicyclin induction.

[0059] FIG. 26 shows Western blot analysis of KLF4 expression from AAV-TRE3G-OKS and AAV-TRE3G-O’KS treated groups.

[0060] FIG. 27 shows a schematic diagram of mouse AAV-CMV-OKS (AAV-CMV-MsOKS) vector structure.

[0061] FIG. 28 shows results of enzyme digestion of the AAV-CMV-MsOKS vector plasmid.

[0062] FIG. 29 shows a schematic diagram of AAV-CMV-MsOmut1KS vector encoding mouse Oct4 mutant 1.

[0063] FIG. 30 show results of enzyme digestion of the AAV-CMV-MsOmut1KS vector plasmid.

[0064] FIG. 31 shows a schematic diagram of AAV-CMV-MsOmut2KS vector encoding OCT4 mutant 2.

[0065] FIG. 32 shows results of enzyme digestion of AAV-CMV-MsOmut2KS vector plasmid.

[0066] FIGs. 33A-33C show RT-qPCR results for the AAV2-CMV vectors. FIG. 33A shows the original amplification curve set. FIG. 33B shows the standard curve. FIG. 33C shows viral particle titer measurement of AAV2-CMV-MsOKS, AAV2-CMV-MsOmut1KS, and AAV2-CMV-MsOmut2KS using RT-qPCR.

[0067] FIGs. 34A-34C show RT-qPCR results for the AAV9-CMV vectors. FIG. 34A shows the original amplification curve set. FIG. 34B shows the standard curve. FIG. 34C shows viral particle titer measurement of AAV9-CMV-MsOKS and AAV9-CMV-MsOmut1KS using RT-qPCR.

[0068] FIG. 35 shows a schematic diagram of the structure of the Tet-On lentiviral vectors LV-TRE3G-O’KM’S , LV-TRE3G-OKMS, and LV-EFS-Tet3G.

[0069] FIGs. 36A-36D show a senescence-associated galactosidase (SA-β-Gal) staining experiment of skin cells FY-009 transfected with lentiviral particle LV-TRE3G-O'KM'S or LV-TRE3G-OKMS, and the TET3G (Tet-On 3G) -expressing lentiviral particle LV-EFS-Tet3G. FIG. 36A shows a representative image of SA-β-Gal staining results for the blank control group (no virus added) . FIG. 36B shows a representative image of SA-β-Gal staining results for the OKMS reprogramming group. FIG. 36C shows a representative image of SA-β-Gal staining results for the  O’KM’S reprogramming group. FIG. 36D shows statistics on the proportion of SA-β-Gal staining positive cells in each group.

[0070] FIGs. 37A-37E show detection of gene expression levels related to skin fibroblast rejuvenation function or healthy skin cell function. Significance was determined via t-test. **: P <0.01, ***: P < 0.001.

[0071] FIGs. 38A-38D show detection of gene expression levels of skin fibroblast identity markers. Significance was determined via t-test. *: P < 0.05, ***: P < 0.001.

[0072] FIGs. 39A-39B show detection of marker gene expression levels at the initiation phase reprogramming (IPR) . Significance was determined via t-test. **: P < 0.01.

[0073] FIGs. 40A-40B show detection of gene expression levels at the maturation phase reprogramming. Significance was determined via t-test. **: P < 0.01, ***: P < 0.001.

[0074] FIG. 41 shows an epigenetic age (EpiAge) analysis of cellular DNA methylation.

[0075] FIG. 42 shows a schematic diagram of the structure of the Tet-On lentiviral vectors LV-TRE3G-O’KM’ , LV-TRE3G-OKM, and LV-EFS-Tet3G.

[0076] FIGs. 43A-43D show results of SA-β-GAL staining for skin cells FY-009 transfected with lentiviral particle LV-TRE3G-OKM or LV-TRE3G-O’KM’ , and TET3G (Tet-On 3G) -expressing lentiviral particle LV-EFS-Tet3G. FIG. 43A shows a representative image of SA-β-Gal staining results for the blank control group (no virus added) . FIG. 43B shows a representative image of the SA-β-Gal staining results of the OKM reprogramming group. FIG. 43C shows a representative image of SA-β-Gal staining results of the O’KM’ reprogramming group. FIG. 43D shows statistics on the proportion of SA-β-GAL stain-positive cells in each group.

[0077] FIGs. 44A-44E show detection of gene expression levels related to skin cell rejuvenation function or healthy skin cell function. Significance was determined via t-test. **: P < 0.01, ***: P < 0.001.

[0078] FIGs. 45A-45D show detection of gene expression levels of skin fibroblast identity markers. Significance was determined via t-test. ***: P < 0.001.

[0079] FIGs. 46A-46B show detection of gene expression levels at the initiation phase reprogramming (IPR) . Significance was determined via t-test. ***: P < 0.001.

[0080] FIGs. 47A-47B show detection of gene expression levels at the maturation phase reprogramming. Significance was determined via t-test. ***: P < 0.001.

[0081] FIGs. 48A-48B show results of SA-β-GAL staining for SBK-M57 skin cells treated with OSK-LNP or O’SK-LNP. No treatment served as blank control. FIG. 48A shows representative SA-β-GAL staining images from the OSK-LNP reprogramming group, O’SK LNP reprogramming group, and blank control at four time points. FIG. 48B shows statistics of the proportion of SA-β-GAL staining-positive cells in each group at different time points.

[0082] FIG. 49 shows an epigenetic age analysis of cellular DNA methylation in SBK-M57 skin fibroblasts treated with OSK-LNP and O’SK-LNP. No treatment served as control.

[0083] FIG. 50 shows single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) results of up-regulated genes in OSK-LNP reprogramming group and O’SK-LNP reprogramming group.

[0084] FIG. 51 shows scRNA-seq results of down-regulated genes in the OSK-LNP reprogramming group and O’SK-LNP reprogramming group.

[0085] FIGs. 52A-52D show scRNA-seq cell cluster analysis for the OSK-LNP reprogramming group, O’SK-LNP reprogramming group, and blank control. FIG. 52A shows the cluster pattern for each group. FIG. 52B shows statistics of cell number proportional changes for each cluster across samples. FIG. 52C shows top gene ontology-biological process (GO-BP) and KEGG pathway analysis for Cluster 1. FIG. 52D shows top GO-BP and KEGG pathway analysis for Cluster 6.

[0086] FIGs. 53A-53C show immunohistochemistry analysis of elastin content in isolated skin tissues treated with OSK-LNP or O’SK-LNP compared to controls. FIG. 53A shows representative images of staining results for the OSK-LNP reprogramming group, O’SK-LNP reprogramming group, and three control groups. FIGs. 53B-53C show summary statistics of the relative integral optical density (IOD) mean of each group. ##: P < 0.01 compared to Blank Control (BC) , *: P <0.05 compared to Negative Control (NC) , **: P < 0.01 compared to Negative Control.

[0087] FIGs. 54A-54C show immunohistochemistry analysis of Collagen I content in isolated skin tissues treated with OSK-LNP or O’SK-LNP compared to controls. FIG. 54A shows representative images of staining results for the OSK-LNP reprogramming group, O’SK-LNP reprogramming group, and three control groups. FIGs. 54B-54C show summary statistics of the  relative IOD mean of each group. ##: P < 0.01 compared to Blank Control, **: P < 0.01 compared to Negative Control.

[0088] FIGs. 55A-55C show immunohistochemistry analysis of Collagen III content in isolated skin tissues treated with OSK-LNP or O’SK-LNP compared to controls. FIG. 55A shows representative images of staining results for the OSK-LNP reprogramming group, O’SK-LNP reprogramming group, and three control groups. FIGs. 55B-55C show summary statistics of the relative IOD mean of each group. ##: P < 0.01 compared to Blank Control, **: P < 0.01 compared to Negative Control.

[0089] FIGs. 56A-56C show immunohistochemistry analysis of Collagen IV content in isolated skin tissues treated with OSK-LNP or O’SK-LNP compared to controls. FIG. 56A shows representative images of staining results for the OSK-LNP reprogramming group, O’SK-LNP reprogramming group, and three control groups. FIGs. 56B-56C show summary statistics of the relative IOD mean of each group. ##: P < 0.01 compared to Blank Control, *: P < 0.05 compared to Negative Control, **: P < 0.01 compared to Negative Control.

[0090] FIG. 57 shows representative images of skin fibroblast cells transfected with circRNA-OSKMLN LNP at day 1 and day 7 post-transfection compared to a negative control. The transfected skin fibroblast cells dispay iPSC-like clones on day 7.

[0091] FIGs. 58A-58B show a protocol for assessing the effects of AAV-TRE3G-OKS and AAV-TRE3G-O’KS on optic nerve regeneration and retinal ganglion cell (RGC) function following damage via laser coagulation. FIG. 58A shows the experimental timeline for assessing regenerative effects following retinal damage induced by laser coagulation. FIG. 58B shows a summary of the experimental groups. AAV-Luciferace served as negative control.

[0092] FIGs. 59A-59B show effects of AAV-TRE3G-OKS and AAV-TRE3G-O’KS on laser-induced retina lesion. FIG. 59A shows representative Optical Coherence Tomography (OCT) images. FIG. 59B shows a statistical analysis of laser-induced retina lesion area of each experimental group. AAV-Luciferace served as negative control.

[0093] FIGs. 60A-60B show effects of AAV-TRE3G-OKS and AAV-TRE3G-O’KS on ERG after laser coagulation. FIG. 60A shows representative full field ERG images. FIG. 60B shows a statistical analysis of photopic negative response (PhNR) amplitude by experimental group. PhNR  is a measurement of the electrophysiological function of RGCs. AAV-Luciferace served as negative control.

[0094] FIGs. 61A-61B show effects of AAV-TRE3G-OKS and AAV-TRE3G-O’KS on optic nerve regeneration. FIG. 61A shows representative immunofluorescent images of nervous marker βIII-tubulin in optic nerves. FIG. 61B shows a statistical analysis of βIII-tubulin density. AAV-Luciferace served as negative control.

[0095] FIGs. 62A-62B show effects of AAV-TRE3G-OKS and AAV-TRE3G-O’KS on RGC survival. FIG. 62A shows representative immunofluorescent images of RGC marker BRN3A in retina. FIG. 62B shows quantification of RGC number per mm2 area. AAV-Luciferace served as negative control.

[0096] FIGs. 63A-63B show a protocol for assessing the effects of AAV9-CMV-MsOKS and AAV9-CMV-MsOmut1KS on optic nerve regeneration and RGC function following damage via optic nerve crush. FIG. 63A shows the experimental timeline for assessing regenerative effects following optic nerve crush damage. FIG. 63B shows a summary of the experimental groups.

[0097] FIGs. 64A-64B show effects of AAV9-CMV-MsOKS and AAV9-CMV-MsOmut1KS on RGC electrophysiological function in response to optical nerve crush. FIG. 64A shows representative waveform graphs of pERG results. FIG. 64B shows a statistical analysis of P50-N95 amplitude of the pERG. AAV-EGFP (no crush) and AAV-EGFR (crush) served as negative control.

[0098] FIG. 65 shows P1-N2 waveform graphs of fVEP for groups treated with AAV9-CMV-MsOKS and AAV9-CMV-MsOmut1KS. AAV-EGFR (crush) served as negative control.

[0099] FIGs. 66A-66B show a protocol for assessing the effects of AAV2-CMV-MsOKS, AAV2-CMV-MsOmut1KS, and AAV2-CMV-MsOmut2KS on optic nerve regeneration and RGC survival following damage via optic nerve crush. FIG. 66A shows the experimental timeline for assessing regenerative effects following optic nerve crush damage. FIG. 66B shows a summary of the experimental groups.

[0100] FIGs. 67A-67B show effects of AAV2-CMV-MsOKS, AAV2-CMV-MsOmut1KS, and AAV2-CMV-MsOmut2KS on optic nerve regeneration. FIG. 67A shows representative images of  CTB555-labeled axons regenerated in optic nerves following crush. FIG. 67B shows quantification of CTB intensity at different distances from the crush site.

[0101] FIGs. 68A-68B show effects of AAV2-CMV-MsOKS, AAV2-CMV-MsOmut1KS, and AAV2-CMV-MsOmut2KS on RGC survival. FIG. 68A shows representative wholemount retina images showing RGC marker RBPMS staining. FIG. 68B shows quantification of RGC number per 0.04 mm2 area.

[0102] FIGs. 69A-69B show assessment of the anti-senescence effect of OSK-LNP and O'SK-LNP administration on HepG2 cells via senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal) staining.

[0103] FIGs. 70A-70B show assessment of the anti-senescence effect of O'SK-LNP on three different lots of primary human livers (PHH) . FIG. 70A shows SA-β-gal staining. FIG. 70B shows quantification of senescent marker p16 via Western blot.

[0104] FIGs. 71A-71C show assessment of the anti-fibrosis effect of OSK-LNP and O'SK-LNP administration on TGFβ-induced LX-2. FIG. 71A shows a cell morphology assessment. FIG. 71B shows immunostaining results for Collagen I. FIG. 71C shows quantification of Collagen I via Western blot.

[0105] FIGs. 72A-72E show effects of O'SK-LNP on liver regeneration in C57 / B6J mice subjected to 70%partial hepatectomy (PHx) . FIG. 72A shows a schematic of the 5-day experimental protocol. FIG. 72B shows changes in body weight observed on Day 5. FIG. 72C shows changes in liver anatomy observed on Day 5. FIG. 72D shows changes in liver weight on Day 5. FIG. 72E shows changes in liver-to-body weight ratio on Day 5.

[0106] FIGs. 73A-73D show effects of O'SK-LNP on serum markers relative to PBS control in C57 / B6J mice subjected to 70%PHx. FIG. 73A shows ALT levels. FIG. 73B shows AST levels. FIG. 73C shows total bilirubin levels. FIG. 73D shows albumin levels.

[0107] FIGs. 74A-74B show expression of exogenous human OCT4mut in mouse liver sections.

[0108] FIG. 74A shows expression of OCT4mut on Day 2. FIG. 74B shows expression of OCT4mut on Day 5.

[0109] FIG. 75 shows mouse liver histology results of O'SK-LNP versus PBS control for sections obtained on Day 2 and Day 5.

[0110] FIGs. 76A-76C show effects of O'SK-LNP on Ki67+ liver cell count levels. FIG. 76A shows liver histology results of O'SK-LNP versus PBS control for sections obtained on Day 2 and Day 5. FIG. 76B shows Ki67+ liver levels on Day 2. FIG. 76C shows Ki67+ liver levels on Day 5.

[0111] FIGs. 77A-77D show immunostaining to assess effects of OSK-LNP and O'SK-LNP treatment on TGFβ-induced epithelial-mesenchymal transition. FIG. 77A shows representative immunostaining images for N-cadherin. FIG. 77B shows quantification of immunofluorescence for N-cadherin. FIG. 77C shows representative immunostaining images for E-cadherin. FIG. 77D shows quantification of immunofluorescence for E-cadherin.

[0112] FIG. 78 shows a Western blot analysis of N-cadherin and E-cadherin levels to assess effects of OSK-LNP and O'SK-LNP treatment on TGFβ-induced epithelial-mesenchymal transition.

[0113] FIGs. 79A-79B show results of a wound healing assay following treatment with OSK-LNP, O'SK-LNP, and Pirfinidone to measure cell migration. FIG. 79A shows quantification of the cell-free area at 0 hours, 48 hours, and 72 hours following introduction of a wound. FIG. 79B shows normalization of the wound healing data to the cell-free area at 0 hours and to effects from the untreated group. *: p<0.05, **: p<0.01 indicates statistical difference at 48 hours compared to untreated group, while #: p<0.05, ##: p<0.01 denotes statistical difference at 72 hours compared to untreated group.

[0114] FIGs. 80A-80C show Collagen I and / or α-SMA immunostaining and Western Blot. OSK-LNP and O’SK-LNP ameliorated TGFβ-induced fibrogenesis in HFL-1 cells.

[0115] FIG. 81 shows a schematic for treatment with AAV-OSK and AAV-O'SK in a mouse model of bleomycin-induced idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) .

[0116] FIG. 82 shows immunostaining showing colocalization of GFP from AAV and AAV-specific antibody in alveolae.

[0117] FIGs. 83A-83B show results for αSMA immunostaining of lung tissue. FIG. 83A shows representative immunostaining images. FIG. 83B shows quantification of αSMA staining.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0118] Inventors of the present application discovered that engineered reprogramming factor (s) that is deficient in liquid-liquid phase separation (LLPS) (hereinafter also referred to as “LLPS-deficient reprogramming factor” ) could mediate initiation phase reprogramming (IPR) . Because of the deficiency in LLPS (or forming condensates) , cellular reprogramming retains at the initiation phase. The benefits of the methods described herein include but are not limited to: i) cells and tissues (e.g., skin cell / tissue) can be effectively rejuvenated, including effective reversion of EpiAge, reducing biomarkers of cell senescence, apoptosis, ferroptosis, inflammation, endoplasmic reticulum stress, and unhealthy cell function, increasing biomarkers of healthy cell function, and effectively repairing injured or damaged cells and tissues (e.g., photoaged skin cell / tissue) , etc.; ii) rejuvenated cells retain their cell identities (e.g., skin fibroblasts) instead of becoming iPSCs; iii) the efficiency of cell rejuvenation is greatly improved while the risk of iPSC induction is greatly reduced, compared to that achieved by the traditional 4-Factor (non-engineered OSKM) or 3-Factor reprogramming methods; iv) various delivery methods are compatible with the LLPS-deficient reprogramming factors and rejuvenation methods described herein, such as DNA or RNA (e.g., circRNA) delivery, viral vector delivery, or delivery by exosomes or lipid nanoparticles (LNPs) , hence suitable for feasible applications to various organ and tissue types (e.g., skin, such as using microneedles) . These findings demonstrate promising applications in various clinical settings, such as skin rejuvenation, preventing or delaying the progression of skin aging, and treating aged or damaged skin tissue.

[0119] Hence in one aspect, the present application provides a method of rejuvenating a population of skin cells (herein after also referred to as “skin rejuvenation method” ) , comprising introducing into the population of skin cells an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS. Also provided are methods of delaying or preventing the progression of aging of a skin tissue in an individual (e.g., human, such as 22 years or older) , and methods of treating aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual, comprising (i) rejuvenating a population of skin cells of the skin tissue according to any of the skin rejuvenation methods described herein, and / or (ii) introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein.

[0120] In another aspect, the present application provides engineered reprogramming factors that are deficient in LLPS, such as for use in any of the skin rejuvenation methods, or treatment or prevention methods described herein. Also provided are methods of preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual, comprising introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the engineered reprogramming factors described herein) , such as before the individual reaches certain age (e.g., before 22 years or older) , or before the skin tissue is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation, or cosmetic, dermatological, or surgical procedure) .

[0121] In a further aspect, the present application provides a method of rejuvenating a population of cells (e.g., cells of skin, eye, liver, lung, heart, muscle, brain, spleen, stomach, bone, blood, pancreas, bladder, intestine, kidney, gallbladder, etc. ) (herein after also referred to as “rejuvenation method” in general) , comprising introducing into the population of cells an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein) . Also provided are methods of delaying or preventing the progression of aging of a cell (or related tissue or organ) in an individual (e.g., human, such as 22 years or older) , methods of treating aging, damage, or disease or condition in a tissue or organ of an individual, methods of preserving or improving the viability, histology, and / or function of a cell (or related tissue or organ) in an individual, methods of enhancing the restoration of a cell (or related tissue or organ) in an individual after damage or procedure (e.g., cosmetic or surgical) , methods of promoting regeneration of a cell (or related tissue or organ) in an individual, and methods of preventing aging, damage, or disease or condition in a tissue or organ of an individual, comprising (i) rejuvenating a population of cells (e.g., of the tissue or organ) according to any of the rejuvenation methods described herein, and / or (ii) introducing into a population of cells (e.g., of the tissue or organ) an effective amount of any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein.

[0122] I. Definitions

[0123] As used herein, “condensate” means a non-membrane-encapsulated compartment formed by phase separation of one or more proteins and / or other macromolecules such as nucleic acids (including all stages of phase separation) .

[0124] The term “liquid-liquid phase separation” (LLPS) or “phase separation” refers to a process by which macromolecules (e.g., protein, nucleic acid) condense into a liquid-like dense phase, demixing from a diluted surrounding environment. LLPS underlies the formation of biomolecular condensates. It allows for the enrichment of specific factors while excluding others from the condensates, thereby creating a unique environment that either favours or restricts certain biochemical reactions.

[0125] As used herein, “stem cell” refers to those cells which retain the ability to renew themselves through mitotic cell division and which can differentiate into a diverse range of specialized cell types. It includes both embryonic stem cells (ESCs) that are found in blastocysts, and adult stem cells that are found in adult tissues. “Totipotent cells” refers to cells that have the ability to develop into cells derived from all three embryonic germ layers (mesoderm, endoderm and ectoderm) and an entire organism (e.g., human being if placed in a woman's uterus in the case of humans) . Totipotent stem cells are produced by the fusion of an egg and a sperm. The cells produced by the first few divisions of a fertilized egg are also totipotent. Totipotent cells may give rise to an embryo, the extra embryonic membranes and all post-embryonic tissues and organs. ESCs are the offspring of totipotent cells. ESCs are pluripotent and can differentiate into cell types from any of the three germ layers.

[0126] As used herein, the term “pluripotent” refers to cells with the ability to give rise to progeny that can undergo differentiation, under appropriate conditions, into cell types that collectively exhibit characteristics associated with cell lineages from the three germ layers (endoderm, mesoderm, and ectoderm) . Pluripotent stem cells (PSC) can contribute to tissues of a prenatal, postnatal or adult organism. A standard art-accepted test, such as the ability to form a teratoma in 8-12 week old SCID mice, can be used to establish the pluripotency of a cell population. However, identification of various pluripotent stem cell characteristics can also be used to identify pluripotent cells. Human pluripotent stem cells may express at least some, and optionally all, of the markers from the following non-limiting list: SSEA-3, SSEA-4, TRA-I-60, TRA-I-81, TRA-2-49 / 6E, ALP, Sox2, E-cadherin, UTF-I, Oct4, Lin28, REX-1, and Nanog.

[0127] As used herein, the term “induced pluripotent stem cell” (iPSC) refers to a pluripotent stem cell artificially derived from a non-pluripotent cell. A non-pluripotent cell can be a cell of lesser potency to self-renew and differentiate than a pluripotent stem cell. Cells of lesser potency  can be, but are not limited to, somatic stem cells, tissue specific progenitor cells, primary or secondary cells. iPSCs can derive from adult cells that are induced into ESC-like pluripotency by cell reprogramming factors. iPSCs can be derived from adult somatic cells such as skin or blood cells. iPSCs have the potential to differentiate into any of the three germ layer cell types.

[0128] The term “cellular reprogramming” refers to the process of altering the epigenome of a cell using reprogramming factors (e.g., reversing or preventing epigenetic changes in cells that are causes of dysfunction, deterioration, cell death, senescence or aging) . Cellular reprogramming may be complete reprogramming, such that a differentiated cell (e.g., somatic cell) is reprogrammed to a PSC. Cellular reprogramming may be incomplete, such that a differentiated cell (e.g., somatic cell) retains its cellular identity (e.g., lineage-specific stem cell) . Cellular reprogramming may be incomplete, e.g., a stem cell is not created, such that a cell is rejuvenated, or takes on more youthful attributes (e.g., increased survival, reduced inflammation, or ability to divide) . Cellular reprogramming may provide additional cellular functions, or prevent cellular aging (e.g., transdifferentiation, or transition into cellular senescence) . Cellular reprogramming may induce temporary or permanent gene expression changes. In some embodiments, cellular reprogramming prevents senescence from occurring.

[0129] As used herein, the term “complete reprogramming” refers to the use of cell reprogramming factors to induce somatic cell conversion to iPSCs. The complete reprogramming process can be divided into three phases: the initiation phase, the maturation phase, and the stabilization phase. In the initiation phase, the cells still maintain their original somatic identity, but the expression of early pluripotency-related genes such as NANOG and SALL4 increases rapidly; in the maturation phase, the somatic identity characteristics are rapidly lost, and the expression of late pluripotency-related genes such as DPPA5 and LIN28 increases; and in the stabilization phase, the cells completely lose their cell identity and become iPSCs.

[0130] As used herein, the term “loss of cell identity” refers to the reprogramming of somatic cells to lose the morphology, function, epigenetic patterns, gene expression profiles, and other characteristics of the original somatic cells (i.e., “cell identity” ) , and to obtain various characteristics of PSCs and become iPSCs. The cellular identity of somatic cells is gradually lost in the process of reprogramming. In the initiation phase, the cells still maintains their original cell  identity; and in the maturation phase, the cells have lost most of their cell identity characteristics and obtained a higher degree of PSC characteristics.

[0131] The term “partial reprogramming” refers to the treatment or reprogramming of an aged or damaged cell using one or more cell reprogramming factors to restore some viability to the cells, but not enough to dedifferentiate into iPSCs and thus retain their original somatic identity. Transient reprogramming is an implementation of partial reprogramming, in which cells are exposed to cellular reprogramming factors for a sufficient period of time to rejuvenate the cells, but not enough to cause dedifferentiation into iPSCs. Due to the very short exposure time, the degree of rejuvenation of this instantaneous reprogramming is low.

[0132] “Initiation phase reprogramming” or “IPR” refers to reprogramming an aged or damaged cell in the initiation phase, so as to have a longer safety time window to rejuvenate the cells while greatly reduce the risk of becoming an iPSC.

[0133] A “reprogramming factor” is a factor, for example, it may be a transcription factor, which can be used to reprogram a target cell. The term “reprogramming factor” further includes any analogue molecule that mimics the function of the factor with respect to reprogramming capacity.

[0134] The term “rejuvenating” or “rejuvenation” as used herein is meant to include preventing or reversing the cellular causes of aging or damages without inducing a pluripotent state.

[0135] As used herein, the term “rejuvenated cell (s) ” refers to aged or damaged cells that have been treated or reprogrammed with one or more cellular reprogramming factors such that the cells have a transcriptomic profile of a younger or healthier cell while still retaining one or more cell identity markers.

[0136] “Regeneration” refers to the capability of contributing to the repair or de novo construction of a cell, tissue or organ. In some embodiments, cell rejuvenation comprises cell regeneration.

[0137] The term “tissue regeneration” refers to restoration of existing tissue or cells (e.g., aged, damaged, or diseased) and / or production of new tissue or cells within a tissue that are the same type as the tissue of interest (e.g., same type as the damaged tissue or cell) .

[0138] The term “tissue repair” in the context of damaged tissue refers to restoration of tissue architecture, function following tissue damage, or a combination thereof. Tissue repair includes  tissue regeneration, cell growth, tissue replacement, and / or rewiring of existing tissue (reprogramming) .

[0139] As used herein, the terms “treatment, ” “treat, ” and “treating” refer to reversing, alleviating, delaying the onset of, or inhibiting the progress of a disease or disorder, or one or more symptoms thereof, as described herein. In certain embodiments, treatment may be administered after one or more symptoms have developed. In other embodiments, treatment may be administered in the absence of symptoms. For example, treatment may be administered to a susceptible individual prior to the onset of symptoms, not yet been diagnosed with a disease or condition, or may be treated with another damaging agent (e.g., in light of a history of symptoms, in light of genetic or other susceptibility factors, a disease therapy, or any combination thereof) . Treatment may also be continued after symptoms have resolved, for example, to prevent or delay their recurrence. Desirable effects of treatment include decreasing the rate of disease or condition progression, ameliorating or palliating the disease state or symptoms, achieving desired pharmacological and / or physiological effect, and remission or improved prognosis. Said effects may be prophylactic in terms of complete or partial prevention of the disease or its symptoms, and / or therapeutic in terms of partial or complete cure of the disease and / or adverse effects resulting from the disease. For example, an individual is successfully “treated” if one or more symptoms associated with the disease or condition are mitigated or eliminated, including, but not limited to, delaying or preventing the progression of the disease or condition, decreasing symptoms resulting from the disease or condition, increasing the quality of life of those suffering from the disease or condition, decreasing the dose of other medications required to treat the disease or condition, and / or prolonging survival of individuals.

[0140] “Prevention” as used herein refers to all acts of avoiding symptoms or delaying the tension of a particular symptom by administering an agent before or after the onset of the development of the disease or condition.

[0141] As used herein, an “effective amount” refers to an amount of an agent effective to provide the desired treatment or prevention after being administered in single or multiple doses. As is understood in the clinical context, an effective amount of an agent or pharmaceutical composition may or may not be achieved in conjunction with another agent or pharmaceutical composition. Thus, an “effective amount” may be considered in the context of administering one or more agents,  and a single agent may be considered to be given in an effective amount if, in conjunction with one or more other agents, a desirable result may be or is achieved.

[0142] As used herein, an “individual” or a “subject” refers to a mammal, including, but not limited to, human, bovine, horse, sheep, goat, pig, deer, donkey, feline, canine, rodent (e.g., rat, mouse, rabbit, hamster) , or non-human primate (e.g., monkey, chimpanzee) . In some embodiments, the individual is a human. In some embodiments, the individual is a pet, e.g., horse, dog, cat, rabbit, guinea pig, hamster, rat, mouse, ferret, chinchilla, etc. In some embodiments, the individual is a farm animal, e.g., horse, cattle, cow, goat, sheep, pig, donkey, etc.

[0143] “Tissue” refers to an ensemble of cells (identical or not) and an extracellular matrix (ECM) that together carry out a specific function or set of functions.

[0144] The term “variant” refers to a sequence that comprises a modification relative to a wild-type sequence. Non-limiting modifications in an amino acid sequence include insertions, deletions, and point mutations. Non-limiting modifications to nucleic acid (e.g., engineered nucleic acid) sequences include frameshift mutations, nucleotide insertions, and nucleotide deletions.

[0145] As used herein, “percent (%) amino acid sequence identity” and “homology” with respect to a peptide or polypeptide sequence are defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical with the amino acid residues in the specific peptide or polypeptide sequence, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved in various ways that are within the skill in the art, for instance, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or MEGALIGNTM (DNASTAR) software. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared.

[0146] An amino acid substitution may include but is not limited to the replacement of one amino acid in a polypeptide with another amino acid. Exemplary substitutions are shown in Table A.

[0147] Table A. Exemplary amino acid substitutions.

[0148] Amino acids may be grouped according to common side-chain properties: (1) hydrophobic: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) neutral hydrophilic: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acidic: Asp, Glu; (4) basic: His, Lys, Arg; (5) residues that influence chain orientation: Gly, Pro; (6) aromatic: Trp, Tyr, Phe. Non-conservative substitutions will entail exchanging a member of one of these classes for another class.

[0149] As used herein, the term “transfection” refers to the uptake of exogenous DNA or RNA by a cell. A cell has been “transfected” when exogenous DNA or RNA has been introduced inside the cell membrane. A number of transfection techniques are generally known in the art. See, e.g., Graham et al. (1973) Virology, 52: 456, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning, a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1995) Basic Methods in Molecular Biology, 2nd edition, McGraw-Hill, and Chu et al. (1981) Gene 13: 197. Such techniques can be used to introduce one or more exogenous DNA or RNA molecules into cells. The term refers to both stable and transient uptake of the DNA or RNA molecules. For example, transfection can be used for transient uptake of mRNAs encoding cellular reprogramming factors into cells in need of rejuvenation.

[0150] The terms “host cell, ” “host cell line, ” and “host cell culture” are used interchangeably and refer to cells into which exogenous nucleic acid has been introduced, including the progeny of  such cells. Host cells include “transformants” and “transformed cells, ” which include the primary transformed cell and progeny derived therefrom without regard to the number of passages. Progeny may not be completely identical in nucleic acid content to a parent cell, and may contain mutations. Mutant progenies that have the same function or biological activity as screened or selected for in the originally transformed cell are included herein.

[0151] The term “pharmaceutical formulation” of “pharmaceutical composition” refers to a preparation that is in such form as to permit the biological activity of the active ingredient to be effective, and that contains no additional components that are unacceptably toxic to a subject to which the formulation would be administered. Such formulations are sterile. A “sterile” formulation is aseptic or free from all living microorganisms and their spores.

[0152] It will be understood by one of ordinary skill in the art that uracil and thymine can both be represented by ‘t’ , instead of ‘u’ for uracil and ‘t’ for thymine; in the context of a ribonucleic acid, it will be understood that ‘t’ is used to represent uracil unless otherwise indicated.

[0153] It is understood that embodiments of the invention described herein include “consisting” and / or “consisting essentially of” embodiments.

[0154] Reference to “about” a value or parameter herein includes (and describes) variations that are directed to that value or parameter per se. For example, description referring to “about X” includes description of “X” .

[0155] As used herein, reference to “not” a value or parameter generally means and describes “other than” a value or parameter. For example, the method is not used to treat cancer of type X means the method is used to treat cancer of types other than X.

[0156] The term “about X-Y” used herein has the same meaning as “about X to about Y. ”

[0157] As used herein and in the appended claims, the singular forms “a, ” “or, ” and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise.

[0158] II. Methods of of rejuvenating a population of skin cells

[0159] In some embodiments, there is provided a method of rejuvenating a population of cells (e.g., skin cells) , comprising introducing into the population of cells (e.g., skin cells) an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein) , or a nucleic acid (DNA or RNA) ,  a nucleic acid construct (e.g., circRNA or plasmid) , or a virus encoding thereof, or a composition (e.g., pharmaceutical composition) comprising thereof. In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a tissue (e.g., skin tissue) in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving (e.g., improving at least about any of 10%, 30%, 50%, 70%, 90%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, or more) the state and / or appearance of a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a tissue (e.g., skin tissue) in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human) , comprising: (a) introducing into a population of cells of the tissue (e.g., skin cells of the skin tissue) an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein) , or a nucleic acid (DNA or RNA) , a nucleic acid construct (e.g., circRNA or plasmid) , or a virus encoding thereof, or a composition (e.g., pharmaceutical composition) comprising thereof; or (b) introducing into a population of cells (e.g., skin cells) (e.g., from the same individual or different individuals) an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein) , or a nucleic acid (DNA or RNA) , a nucleic acid construct (e.g., circRNA or plasmid) , or a virus encoding thereof, or a composition (e.g., pharmaceutical composition) comprising thereof, and implanting the rejuvenated population of cells (e.g., skin cells) into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a tissue (e.g., skin tissue) in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a tissue (e.g., skin tissue) in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human) , comprising: (a) rejuvenating a population of cells of the tissue (e.g., skin cells of the skin tissue) using any of the rejuvenation methods (e.g., skin rejuvenation methods) described herein; or (b) rejuvenating a population of cells (e.g., skin cells)  (e.g., from the same individual or different individuals) using any of the rejuvenation methods (e.g., skin rejuvenation methods) described herein, and implanting the rejuvenated population of cells (e.g., skin cells) into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) . In some embodiments, the population of cells is a population of skin cells. In some embodiments, the tissue is a skin tissue. In some embodiments, the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination thereof. In some embodiments, the population of cells (e.g., skin cells) are from a tissue (e.g., skin tissue) that is: (i) an aged tissue (e.g., skin tissue) ; (ii) a damaged tissue (e.g., skin tissue) ; (iii) a tissue (e.g., skin tissue) with disease or condition (e.g., skin disease or condition) ; and / or (iv) a tissue (e.g., skin tissue) after cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the tissue (e.g., skin tissue) is: (i) susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) susceptible of being damaged or with predisposition toward damage (e.g., skin damage) ; (iii) susceptible of or with predisposition toward developing a disease or condition (e.g., skin disease or condition) ; and / or (iv) to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue. In some embodiments, the method does not reprogram the population of cells (e.g., skin cells) into a reprogrammed stem cell. In some embodiments, the engineered reprogramming factor comprises a mutation in an LLPS-related domain in reference to a corresponding wild-type reprogramming factor. In some embodiments, the LLPS-related domain is selected from the group consisting of an intrinsically disordered region (IDR) , a region outside of DNA-binding domain (DBD) , a ubiquitination site, or any combination thereof. In some embodiments, the mutation comprises: (i) substituting an acidic amino acid (e.g., D or E) within the IDR with a neutral amino acid (e.g., A) ; (ii) substituting an amino acid that can be ubiquitinated (e.g., K) with an amino acid that cannot be ubiquitinated (e.g., R) ; (iii) deleting an amino acid that can be ubiquitinated (e.g., K) ; (iv) deleting an amino acid (e.g., acidic amino acid) within the IDR; and / or (v) deleting an amino acid (e.g., acidic amino acid) within a region outside of DBD. In some embodiments, the wild-type reprogramming factor is from a family selected from the group consisting of OCT family, SOX family, KLF family, MYC family, LIN28 family, NANOG family, and GLIS family. In some embodiments, the wild-type reprogramming factor is selected from the group consisting of OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, L-MYC, LIN28, NANOG, and GLIS1. In some embodiments, the engineered reprogramming factor is an engineered OCT4, e.g., comprising an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4. In some  embodiments, the engineered reprogramming factor is an engineered c-MYC, e.g., comprising an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the engineered reprogramming factor is an engineered SOX2, e.g., comprising an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 41-43. In some embodiments, the engineered reprogramming factor is an engineered KLF4, e.g., comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO:40. In some embodiments, the engineered reprogramming factor is encoded by a nucleic acid, e.g., RNA such as circRNA, or DNA. In some embodiments, the nucleic acid is comprised within a vector, e.g., a viral vector, such as lentiviral vector or AAV vector. In some embodiments, the nucleic acid is delivered by an exosome, a liposome, an LNP, or a virus. In some embodiments, the population of cells (e.g., skin cells) is present in an individual in need of treatment or prevention, wherein the method comprises administering the effective amount of the engineered reprogramming factor to the individual (e.g., to the skin tissue) in vivo. In some embodiments, the method comprises administering an RNA (e.g., circRNA) encoding the engineered reprogramming factor, wherein the RNA is encapsulated within an exosome or an LNP. In some embodiments, the exosome or LNP is delivered by a microneedle. In some embodiments, the population of cells (e.g., skin cells) is obtained from a donor individual and cultured ex vivo. In some embodiments, the method comprises implanting the rejuvenated population of cells (e.g., skin cells) into an individual (e.g., to the skin tissue) in need of treatment or prevention. The donor individual and the individual in need of treatment or prevention can be the same or different. In some embodiments, the method comprises ex vivo administering to the population of cells (e.g., skin cells) an RNA (e.g., circRNA) encoding the engineered reprogramming factor, wherein the RNA is encapsulated within an exosome or an LNP. In some embodiments, the method further comprises introducing into the population of skin cells an effective amount of a therapeutic agent, e.g., B18R, Vitamin C, Vitamin E, or any combination thereof. In some embodiments, the individual is a human (e.g., of any age) , such as a human that is 10 years or older (e.g., at least about any of 15, 22, 30, 40, 50, 60, 70 years old, or older) . In some embodiments, for preventing aging, damage, or disease or condition in a tissue / cell (e.g., skin tissue / cell) , the method is performed before the tissue / cell (e.g., skin tissue / cell) is aging, is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation, or cosmetic, dermatological, or surgical procedure) , or has (e.g., diagnosed with) a disease or condition. In some embodiments, the method is performed at least about 12 hours (e.g.,  at least about any of 24 hours, 48 hours, or more) before the tissue / cell (e.g., skin tissue / cell) is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation) .

[0160] The invidiaul that can be treated here, either prophylacticaly or therapeutically, can be any mammal, including, but not limited to, human, bovine, horse, sheep, goat, pig, deer, donkey, feline, canine, rodent (e.g., rat, mouse, rabbit, hamster) , or non-human primate (e.g., monkey, chimpanzee) . In some embodiments, the individual is a human. In some embodiments, the individual is a non-human mammal (e.g., pet or farm animal) . The human to be treated can be of any age, such as any of 10, 15, 20, 22, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 years old, or older. In some embodiments, the human is 22 years or older, such as 30 years or older, 50 years or older, or 60 years or older. When the individual is a non-human mammal, the human ages described herein can be converted to equivalent non-human ages of the corresponding non-human mammal.

[0161] The engineered reprogramming factor (s) can be introduced into the population of cells (e.g., skin cells) as protein, nucleic acid (DNA or RNA, such as circRNA) , nucleic acid construct (e.g., plasmid) , virus (e.g., lentivus or AAV) , or a composition (e.g., pharmaceutical composition) comprising thereof. Hence, when referring to introducing into the population of cells (e.g., skin cells) an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS, it is not limited to introducing protein. Any introduction or administration methods that can result in the engineered reprogramming factor (s) being introduced into the cells (e.g., skin cells) , or can result in the engineered reprogramming factor (s) being expressed in the cells (e.g., skin cells) , are contemplated by the methods described herein.

[0162] In some embodiments, the method comprises introducing a plurality of reprogramming factors into the population of cells (e.g., skin cells) , wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein) . Hence in some embodiments, there is provided a method of rejuvenating a population of cells (e.g., skin cells) , comprising introducing into the population of cells (e.g., skin cells) an effective amount of a plurality of reprogramming factors (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the  progression of aging of a tissue (e.g., skin tissue) in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a tissue (e.g., skin tissue) in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human) , comprising: (a) introducing into a population of cells of the tissue (e.g., skin cells of the skin tissue) an effective amount of a plurality of reprogramming factors (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein) ; or (b) introducing into a population of cells (e.g., skin cells) (e.g., from the same individual or different individuals) an effective amount of a plurality of reprogramming factors (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein) , and implanting the rejuvenated population of cells (e.g., skin cells) into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a tissue (e.g., skin tissue) in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a tissue (e.g., skin tissue) in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human) , comprising: (a) rejuvenating a population of cells of the tissue (e.g., skin cells of the skin tissue) using any of the rejuvenation methods (e.g., skin rejuvenation methods) described herein; or (b) rejuvenating a population of cells (e.g., skin cells) (e.g., from the same individual or different individuals) using any of the rejuvenation methods (e.g., skin rejuvenation methods) described herein, and implanting the rejuvenated population of cells (e.g., skin cells) into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) . In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise two or more reprogramming factors from two or more families  selected from the group consisting of OCT family, SOX family, KLF family, MYC family, LIN28 family, NANOG family, and GLIS family. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise two or more reprogramming factors selected from the group consisting of OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, L-MYC, LIN28, NANOG, GLIS1, and variant thereof. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise three or all reprogramming factors selected from the group consisting of OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC, wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise OCT4 and KLF4, wherein at least one of OCT4 and KLF4 is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS. In some embodiments, all of the plurality of reprogramming factors are engineered reprogramming factors that are deficient in LLPS. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise a wild-type reprogramming factor. In some embodiments, the OCT4 is an engineered OCT4 that is deficient in LLPS, e.g., comprising an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4. In some embodiments, c-MYC is an engineered c-MYC that is deficient in LLPS, e.g., comprising an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the population of cells is a population of skin cells. In some embodiments, the tissue is a skin tissue. In some embodiments, the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination thereof. In some embodiments, the population of cells (e.g., skin cells) are from a tissue (e.g., skin tissue) that is: (i) an aged tissue (e.g., skin tissue) ; (ii) a damaged tissue (e.g., skin tissue) ; (iii) a tissue (e.g., skin tissue) with disease or condition (e.g., skin disease or condition) ; and / or (iv) a tissue (e.g., skin tissue) after cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the tissue (e.g., skin tissue) is: (i) susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) susceptible of being damaged or with predisposition toward damage (e.g., skin damage) ; (iii) susceptible of or with predisposition toward developing a disease or condition (e.g., skin disease or condition) ; and / or (iv) to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue. In some embodiments, the method does not reprogram the population of cells (e.g., skin cells) into a reprogrammed stem cell. In some embodiments, the population of cells (e.g., skin cells) is present in an individual in need of treatment or prevention, wherein the method comprises administering the effective amount of the plurality of  reprogramming factors to the individual (e.g., to the skin tissue) in vivo. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors are encapsulated within an exosome, a liposome, or an LNP. In some embodiments, the exosome, liposome, or LNP is delivered by a microneedle. In some embodiments, the population of cells (e.g., skin cells) is obtained from a donor individual and cultured ex vivo. In some embodiments, the method comprises implanting the rejuvenated population of cells (e.g., skin cells) into an individual (e.g., to the skin tissue) in need of treatment or prevention. The donor individual and the individual in need of treatment or prevention can be the same or different. In some embodiments, the method comprises ex vivo administering to the population of cells (e.g., skin cells) the effective amount of the plurality of reprogramming factors. In some embodiments, the method further comprises introducing into the population of skin cells an effective amount of a therapeutic agent, e.g., B18R, Vitamin C, Vitamin E, or any combination thereof. In some embodiments, the individual is a human (e.g., of any age) , such as a human that is 10 years or older (e.g., at least about any of 15, 22, 30, 40, 50, 60, 70 years old, or older) . In some embodiments, for preventing aging, damage, or disease or condition in a tissue / cell (e.g., skin tissue / cell) , the method is performed before the tissue / cell (e.g., skin tissue / cell) is aging, is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation, or cosmetic, dermatological, or surgical procedure) , or has (e.g., diagnosed with) a disease or condition. In some embodiments, the method is performed at least about 12 hours (e.g., at least about any of 24 hours, 48 hours, or more) before the tissue / cell (e.g., skin tissue / cell) is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation) .

[0163] In some embodiments, there is provided a method of rejuvenating a population of skin cells, comprising introducing into the population of skin cells an effective amount of a plurality of reprogramming factors (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) , and KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a skin tissue in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a skin tissue of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a skin tissue in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) ,  comprising: (a) introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of a plurality of reprogramming factors (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) , and KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) ; or (b) introducing into a population of skin cells (e.g., from the same individual or different individuals) an effective amount of a plurality of reprogramming factors (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , and implanting the rejuvenated population of skin cells into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) , wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) , and KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) . In some embodiments, the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination thereof. In some embodiments, the population of skin cells are from a skin tissue that is:(i) an aged skin tissue; (ii) a damaged skin tissue; (iii) a skin tissue with skin disease or condition; and / or (iv) a skin tissue after cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is: (i) susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) susceptible of being damaged or with predisposition toward skin damage; (iii) susceptible of or with predisposition toward developing a skin disease or condition; and / or (iv) to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue. In some embodiments, the method does not reprogram the population of skin cells into a reprogrammed stem cell. In some embodiments, the population of skin cells is present in an individual in need of treatment or prevention, wherein the method comprises administering the effective amount of the plurality of reprogramming factors to the individual (e.g., to the skin tissue) in vivo. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors are encapsulated within an exosome, a liposome, or an LNP. In some embodiments, the exosome, liposome, or LNP is delivered by a microneedle. In some embodiments, the population of skin cells is obtained from a donor individual and cultured ex vivo. In some embodiments, the method comprises implanting the rejuvenated population of skin cells into an individual (e.g., to the skin tissue) in need of treatment or prevention. The donor individual and the individual in need of treatment or prevention can be the same or different. In some embodiments, the method comprises ex vivo administering to the population of skin cells the effective amount of the plurality of  reprogramming factors. In some embodiments, the method further comprises introducing into the population of skin cells an effective amount of a therapeutic agent, e.g., B18R, Vitamin C, Vitamin E, or any combination thereof. In some embodiments, the individual is a human (e.g., of any age) , such as a human that is 10 years or older (e.g., at least about any of 15, 22, 30, 40, 50, 60, 70 years old, or older) . In some embodiments, for preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue / cell, the method is performed before the skin tissue / cell is aging, is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation, or cosmetic, dermatological, or surgical procedure) , or has (e.g., diagnosed with) a disease or condition. In some embodiments, the method is performed at least about 12 hours (e.g., at least about any of 24 hours, 48 hours, or more) before the skin tissue / cell is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation) .

[0164] In some embodiments, there is provided a method of rejuvenating a population of skin cells, comprising introducing into the population of skin cells an effective amount of a plurality of reprogramming factors (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , and an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a skin tissue in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a skin tissue of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a skin tissue in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , comprising: (a) introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of a plurality of reprogramming factors (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , and an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) ; or (b) introducing into a population of skin cells (e.g., from the same individual or different individuals) an effective amount of a plurality of reprogramming factors (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , and implanting the rejuvenated  population of skin cells into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) , wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , and an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) . In some embodiments, the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination thereof. In some embodiments, the population of skin cells are from a skin tissue that is: (i) an aged skin tissue; (ii) a damaged skin tissue; (iii) a skin tissue with skin disease or condition; and / or (iv) a skin tissue after cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is: (i) susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) susceptible of being damaged or with predisposition toward skin damage; (iii) susceptible of or with predisposition toward developing a skin disease or condition; and / or (iv) to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue. In some embodiments, the method does not reprogram the population of skin cells into a reprogrammed stem cell. In some embodiments, the population of skin cells is present in an individual in need of treatment or prevention, wherein the method comprises administering the effective amount of the plurality of reprogramming factors to the individual (e.g., to the skin tissue) in vivo. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors are encapsulated within an exosome, a liposome, or an LNP. In some embodiments, the exosome, liposome, or LNP is delivered by a microneedle. In some embodiments, the population of skin cells is obtained from a donor individual and cultured ex vivo. In some embodiments, the method comprises implanting the rejuvenated population of skin cells into an individual (e.g., to the skin tissue) in need of treatment or prevention. The donor individual and the individual in need of treatment or prevention can be the same or different. In some embodiments, the method comprises ex vivo administering to the population of skin cells the effective amount of the plurality of reprogramming factors. In some embodiments, the method further comprises introducing into the population of skin cells an effective amount of a therapeutic agent, e.g., B18R, Vitamin C, Vitamin E, or any combination thereof. In some embodiments, the individual is a human (e.g., of any age) , such as a human that is 10 years or older (e.g., at least about any of 15, 22, 30, 40, 50, 60, 70 years old, or older) . In some embodiments, for preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue / cell, the method is performed before the skin tissue / cell is aging, is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation, or cosmetic,  dermatological, or surgical procedure) , or has (e.g., diagnosed with) a disease or condition. In some embodiments, the method is performed at least about 12 hours (e.g., at least about any of 24 hours, 48 hours, or more) before the skin tissue / cell is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation) .

[0165] In some embodiments, there is provided a method of rejuvenating a population of skin cells, comprising introducing into the population of skin cells an effective amount of a plurality of reprogramming factors (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) , and SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a skin tissue in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a skin tissue of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a skin tissue in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , comprising: (a) introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of a plurality of reprogramming factors (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) , and SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) ; or (b) introducing into a population of skin cells (e.g., from the same individual or different individuals) an effective amount of a plurality of reprogramming factors (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , and implanting the rejuvenated population of skin cells into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) , wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) , and SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) . In some embodiments, the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination  thereof. In some embodiments, the population of skin cells are from a skin tissue that is: (i) an aged skin tissue; (ii) a damaged skin tissue; (iii) a skin tissue with skin disease or condition; and / or (iv) a skin tissue after cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is: (i) susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) susceptible of being damaged or with predisposition toward skin damage; (iii) susceptible of or with predisposition toward developing a skin disease or condition; and / or (iv) to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue. In some embodiments, the method does not reprogram the population of skin cells into a reprogrammed stem cell. In some embodiments, the population of skin cells is present in an individual in need of treatment or prevention, wherein the method comprises administering the effective amount of the plurality of reprogramming factors to the individual (e.g., to the skin tissue) in vivo. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors are encapsulated within an exosome, a liposome, or an LNP. In some embodiments, the exosome, liposome, or LNP is delivered by a microneedle. In some embodiments, the population of skin cells is obtained from a donor individual and cultured ex vivo. In some embodiments, the method comprises implanting the rejuvenated population of skin cells into an individual (e.g., to the skin tissue) in need of treatment or prevention. The donor individual and the individual in need of treatment or prevention can be the same or different. In some embodiments, the method comprises ex vivo administering to the population of skin cells the effective amount of the plurality of reprogramming factors. In some embodiments, the method further comprises introducing into the population of skin cells an effective amount of a therapeutic agent, e.g., B18R, Vitamin C, Vitamin E, or any combination thereof. In some embodiments, the individual is a human (e.g., of any age) , such as a human that is 10 years or older (e.g., at least about any of 15, 22, 30, 40, 50, 60, 70 years old, or older) . In some embodiments, for preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue / cell, the method is performed before the skin tissue / cell is aging, is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation, or cosmetic, dermatological, or surgical procedure) , or has (e.g., diagnosed with) a disease or condition. In some embodiments, the method is performed at least about 12 hours (e.g., at least about any of 24 hours, 48 hours, or more) before the skin tissue / cell is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation) .

[0166] In some embodiments, the method comprises introducing a plurality of nucleic acids (e.g., RNA (e.g., circRNA) or DNA) encoding a plurality of reprogramming factors into the population  of cells (e.g., skin cells) , wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein) . Hence in some embodiments, there is provided a method of rejuvenating a population of cells (e.g., skin cells) , comprising introducing into the population of cells (e.g., skin cells) an effective amount of a plurality of nucleic acids (RNA (e.g., circRNA) or DNA, such as any of the nucleic acids described herein) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) encoding a plurality of reprogramming factors, wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a tissue (e.g., skin tissue) in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a tissue (e.g., skin tissue) in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human) , comprising: (a) introducing into a population of cells of the tissue (e.g., skin cells of the skin tissue) an effective amount of a plurality of nucleic acids (RNA (e.g., circRNA) or DNA, such as any of the nucleic acids described herein) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) encoding a plurality of reprogramming factors, wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein) ; or (b) introducing into a population of cells (e.g., skin cells) (e.g., from the same individual or different individuals) an effective amount of a plurality of nucleic acids (RNA (e.g., circRNA) or DNA, such as any of the nucleic acids described herein) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) encoding a plurality of reprogramming factors, wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein) , and implanting the rejuvenated population of cells (e.g., skin cells) into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a tissue (e.g., skin tissue) in an individual (e.g., human,  e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a tissue (e.g., skin tissue) in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a tissue (e.g., skin tissue) of an individual (e.g., human) , comprising: (a) rejuvenating a population of cells of the tissue (e.g., skin cells of the skin tissue) using any of the rejuvenation methods (e.g., skin rejuvenation) methods described herein; or (b) rejuvenating a population of skin cells (e.g., from the same individual or different individuals) using any of the rejuvenation methods (e.g., skin rejuvenation methods) described herein, and implanting the rejuvenated population of cells (e.g., skin cells) into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) . In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise two or more reprogramming factors from two or more families selected from the group consisting of OCT family, SOX family, KLF family, MYC family, LIN28 family, NANOG family, and GLIS family. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise two or more reprogramming factors selected from the group consisting of OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, L-MYC, LIN28, NANOG, GLIS1, and variant thereof. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise three or all reprogramming factors selected from the group consisting of OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC, wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise OCT4 and KLF4, wherein at least one of OCT4 and KLF4 is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS. In some embodiments, all of the plurality of reprogramming factors are engineered reprogramming factors that are deficient in LLPS. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise a wild-type reprogramming factor. In some embodiments, the OCT4 is an engineered OCT4 that is deficient in LLPS, e.g., comprising an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4. In some embodiments, c-MYC is an engineered c-MYC that is deficient in LLPS, e.g., comprising an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the population of cells is a population of skin cells. In some embodiments, the tissue is a skin tissue. In some embodiments, the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any  combination thereof. In some embodiments, the population of cells (e.g., skin cells) are from a tissue (e.g., skin tissue) that is: (i) an aged tissue (e.g., skin tissue) ; (ii) a damaged tissue (e.g., skin tissue) ; (iii) a tissue (e.g., skin tissue) with disease or condition (e.g., skin disease or condition) ; and / or (iv) a tissue (e.g., skin tissue) after cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the tissue (e.g., skin tissue) is: (i) susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) susceptible of being damaged or with predisposition toward damage (e.g., skin damage) ; (iii) susceptible of or with predisposition toward developing a disease or condition (e.g., skin disease or condition) ; and / or (iv) to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue. In some embodiments, the method does not reprogram the population of cells (e.g., skin cells) into a reprogrammed stem cell. The plurality of nucleic acids can be on separate nucleic acid constructs (e.g., circRNA, plasmid, or recombinant viral genome) , or on a single nucleic acid construct. The plurality of nucleic acids can be delivered using an exosome, a liposome, an LNP, or a virus (e.g., LV or AAV) . In some embodiments, at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are on a single nucleic acid construct. In some embodiments, the at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are under the control of different promoters. In some embodiments, the at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are under the control of the same promoter. In some embodiments, the at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are connected by one or more linking nucleic acids. In some embodiments, the one or more linking nucleic acids comprise IRES or a linking sequence encoding a self-cleaving peptide, e.g., P2A, T2A, or E2A. In some embodiments, the nucleic acid construct comprises a nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 28, 30, 32, 35, 37, 39, 57, 59, 61, 94, 98, and 102. In some embodiments, the population of cells (e.g., skin cells) is present in an individual in need of treatment or prevention, wherein the method comprises administering the effective amount of the plurality of nucleic acids (or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) to the individual (e.g., to the skin tissue) in vivo. In some embodiments, the plurality of nucleic acids are one or more RNAs (e.g., one circRNA) . In some embodiments, the one or more RNAs (e.g., one circRNA) are encapsulated within an exosome, a liposome, or an LNP. In some embodiments, the exosome, liposome, or LNP is delivered by a microneedle. In some embodiments, the population of cells (e.g., skin cells) is obtained from a donor individual and cultured ex vivo. In some embodiments, the method comprises implanting the rejuvenated population of cells (e.g., skin cells) into an individual (e.g., to the skin tissue) in  need of treatment or prevention. The donor individual and the individual in need of treatment or prevention can be the same or different. In some embodiments, the method comprises ex vivo administering to the population of cells (e.g., skin cells) the effective amount of the plurality of nucleic acids (or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) . In some embodiments, the plurality of nucleic acids are one or more RNAs (e.g., one circRNA) . In some embodiments, the one or more RNAs (e.g., one circRNA) are encapsulated within an exosome, a liposome, or an LNP. In some embodiments, the method further comprises introducing into the population of skin cells an effective amount of a therapeutic agent, e.g., B18R, Vitamin C, Vitamin E, or any combination thereof. In some embodiments, the individual is a human (e.g., of any age) , such as a human that is 10 years or older (e.g., at least about any of 15, 22, 30, 40, 50, 60, 70 years old, or older) . In some embodiments, for preventing aging, damage, or disease or condition in a tissue / cell (e.g., skin tissue / cell) , the method is performed before the tissue / cell (e.g., skin tissue / cell) is aging, is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation, or cosmetic, dermatological, or surgical procedure) , or has (e.g., diagnosed with) a disease or condition. In some embodiments, the method is performed at least about 12 hours (e.g., at least about any of 24 hours, 48 hours, or more) before the tissue / cell (e.g., skin tissue / cell) is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation) . In some embodiments, the plurality of nucleic acids encoding the plurality of reprogramming factors are on a single nucleic acid construct (e.g., RNA (e.g., circRNA) or DNA) . In some embodiments, the plurality of nucleic acids are under the control of the same promoter. In some embodiments, the plurality of nucleic acids are connected by one or more linking nucleic acids. In some embodiments, the one or more linking nucleic acids comprise IRES or a linking sequence encoding a self-cleaving peptide, e.g., P2A, T2A, or E2A.

[0167] In some embodiments, there is provided a method of rejuvenating a population of skin cells, comprising introducing into the population of skin cells an effective amount of a plurality of nucleic acids (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) encoding a plurality of reprogramming factors, wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) , and KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a skin tissue in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition  in a skin tissue of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a skin tissue of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a skin tissue in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , comprising: (a) introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of a plurality of nucleic acids (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) encoding a plurality of reprogramming factors, wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) , and KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) ; or (b) introducing into a population of skin cells (e.g., from the same individual or different individuals) an effective amount of a plurality of nucleic acids (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) encoding a plurality of reprogramming factors, and implanting the rejuvenated population of skin cells into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) , wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) , and KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) . In some embodiments, the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination thereof. In some embodiments, the population of skin cells are from a skin tissue that is: (i) an aged skin tissue; (ii) a damaged skin tissue; (iii) a skin tissue with skin disease or condition; and / or (iv) a skin tissue after cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is: (i) susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) susceptible of being damaged or with predisposition toward skin damage; (iii) susceptible of or with predisposition toward developing a skin disease or condition; and / or (iv) to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue. In some embodiments, the method does not reprogram the population of skin cells into a reprogrammed stem cell. The plurality of nucleic acids can be on separate nucleic acid constructs (e.g., circRNA, plasmid, or recombinant viral genome) , or on a single nucleic acid construct. The plurality of nucleic acids can be delivered using an exosome, a liposome, an LNP, or a virus (e.g., LV or AAV) . In some embodiments, at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are  on a single nucleic acid construct. In some embodiments, the at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are under the control of different promoters. In some embodiments, the at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are under the control of the same promoter. In some embodiments, the at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are connected by one or more linking nucleic acids. In some embodiments, the one or more linking nucleic acids comprise IRES or a linking sequence encoding a self-cleaving peptide, e.g., P2A, T2A, or E2A. In some embodiments, the population of skin cells is present in an individual in need of treatment or prevention, wherein the method comprises administering the effective amount of the plurality of nucleic acids (or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) to the individual (e.g., to the skin tissue) in vivo. In some embodiments, the plurality of nucleic acids are one or more RNAs (e.g., one circRNA) . In some embodiments, the one or more RNAs (e.g., one circRNA) are encapsulated within an exosome, a liposome, or an LNP. In some embodiments, the exosome, liposome, or LNP is delivered by a microneedle. In some embodiments, the population of skin cells is obtained from a donor individual and cultured ex vivo. In some embodiments, the method comprises implanting the rejuvenated population of skin cells into an individual (e.g., to the skin tissue) in need of treatment or prevention. The donor individual and the individual in need of treatment or prevention can be the same or different. In some embodiments, the method comprises ex vivo administering to the population of skin cells the effective amount of the plurality of nucleic acids (or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) . In some embodiments, the plurality of nucleic acids are one or more RNAs (e.g., one circRNA) . In some embodiments, the one or more RNAs (e.g., one circRNA) are encapsulated within an exosome, a liposome, or an LNP. In some embodiments, the method further comprises introducing into the population of skin cells an effective amount of a therapeutic agent, e.g., B18R, Vitamin C, Vitamin E, or any combination thereof. In some embodiments, the individual is a human (e.g., of any age) , such as a human that is 10 years or older (e.g., at least about any of 15, 22, 30, 40, 50, 60, 70 years old, or older) . In some embodiments, for preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue / cell, the method is performed before the skin tissue / cell is aging, is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation, or cosmetic, dermatological, or surgical procedure) , or has (e.g., diagnosed with) a disease or condition. In some embodiments, the method is performed at least about 12 hours (e.g., at least about any of 24 hours, 48 hours, or more) before the skin tissue / cell is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation) .

[0168] In some embodiments, there is provided a method of rejuvenating a population of skin cells, comprising introducing into the population of skin cells an effective amount of a nucleic acid construct (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or a virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein the nucleic acid construct comprises from 5’ to 3’ : a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) –a first linking sequence (e.g., encoding P2A) –a second nucleic acid encoding SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) –a second linking sequence (e.g., encoding T2A) –a third nucleic acid encoding KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a skin tissue in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a skin tissue of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a skin tissue in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , comprising: (a) introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of a nucleic acid construct (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or a virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein the nucleic acid construct comprises from 5’ to 3’ : a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) –a first linking sequence (e.g., encoding P2A) –a second nucleic acid encoding SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) –a second linking sequence (e.g., encoding T2A) –a third nucleic acid encoding KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) ; or (b) introducing into a population of skin cells (e.g., from the same individual or different individuals) an effective amount of a nucleic acid construct (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or a virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , and implanting the rejuvenated population of skin cells into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) , wherein the nucleic acid construct comprises from 5’ to 3’ : a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) –a first linking sequence (e.g., encoding P2A) –a second nucleic acid encoding SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) –a second linking sequence (e.g., encoding T2A) –a third nucleic acid encoding KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) . In some embodiments, the nucleic acid construct encodes a protein sequence of SEQ ID NO: 93. In some embodiments,  the nucleic acid construct further comprises an IRES at 5’ of the first nucleic acid. In some embodiments, the nucleic acid construct is a circRNA. In some embodiments, the nucleic acid construct is a DNA vector (e.g., lentival vector, AAV vector, or plasmid) . In some embodiments, the nucleic acid construct comprises a nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 39, 57, and 94.In some embodiments, the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination thereof. In some embodiments, the population of skin cells are from a skin tissue that is: (i) an aged skin tissue; (ii) a damaged skin tissue; (iii) a skin tissue with skin disease or condition; and / or (iv) a skin tissue after cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is: (i) susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) susceptible of being damaged or with predisposition toward skin damage; (iii) susceptible of or with predisposition toward developing a skin disease or condition; and / or (iv) to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue. In some embodiments, the method does not reprogram the population of skin cells into a reprogrammed stem cell. The nucleic acid construct can be delivered using an exosome, a liposome, an LNP, or a virus (e.g., LV or AAV) . In some embodiments, the exosome, liposome, or LNP is delivered by a microneedle. In some embodiments, the population of skin cells is present in an individual in need of treatment or prevention, wherein the method comprises administering the effective amount of the nucleic acid construct (or a virus comprising thereof) to the individual (e.g., to the skin tissue) in vivo. In some embodiments, the population of skin cells is obtained from a donor individual and cultured ex vivo. In some embodiments, the method comprises implanting the rejuvenated population of skin cells into an individual (e.g., to the skin tissue) in need of treatment or prevention. The donor individual and the individual in need of treatment or prevention can be the same or different. In some embodiments, the method comprises ex vivo administering to the population of skin cells the effective amount of the nucleic acid construct (or a virus comprising thereof) . In some embodiments, the method further comprises introducing into the population of skin cells an effective amount of a therapeutic agent, e.g., B18R, Vitamin C, Vitamin E, or any combination thereof. In some embodiments, the individual is a human (e.g., of any age) , such as a human that is 10 years or older (e.g., at least about any of 15, 22, 30, 40, 50, 60, 70 years old, or older) . In some embodiments, for preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue / cell, the method is performed before the skin tissue / cell is aging, is exposed to a damage factor (e.g., UV  irradiation, or cosmetic, dermatological, or surgical procedure) , or has (e.g., diagnosed with) a disease or condition. In some embodiments, the method is performed at least about 12 hours (e.g., at least about any of 24 hours, 48 hours, or more) before the skin tissue / cell is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation) .

[0169] In some embodiments, there is provided a method of rejuvenating a population of skin cells, comprising introducing into the population of skin cells an effective amount of a nucleic acid construct (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or a virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein the nucleic acid construct comprises from 5’ to 3’ : a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) –a first linking sequence (e.g., encoding P2A) –a second nucleic acid encoding KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) –a second linking sequence (e.g., encoding T2A) –a third nucleic acid encoding SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a skin tissue in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a skin tissue of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a skin tissue in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , comprising: (a) introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of a nucleic acid construct (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or a virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein the nucleic acid construct comprises from 5’ to 3’ : a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) –a first linking sequence (e.g., encoding P2A) –a second nucleic acid encoding KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) –a second linking sequence (e.g., encoding T2A) –a third nucleic acid encoding SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) ; or (b) introducing into a population of skin cells (e.g., from the same individual or different individuals) an effective amount of a nucleic acid construct (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or a virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , and implanting the rejuvenated population of skin cells into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) , wherein the nucleic acid construct comprises from 5’ to 3’ : a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID  NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) –a first linking sequence (e.g., encoding P2A) –a second nucleic acid encoding KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) –a second linking sequence (e.g., encoding T2A) –a third nucleic acid encoding SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) . In some embodiments, the nucleic acid construct further comprises an IRES at 5’ of the first nucleic acid. In some embodiments, the nucleic acid construct is a circRNA. In some embodiments, the nucleic acid construct is a DNA vector (e.g., lentival vector, AAV vector, or plasmid) . In some embodiments, the nucleic acid construct comprises a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 32 or 39. In some embodiments, the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination thereof. In some embodiments, the population of skin cells are from a skin tissue that is: (i) an aged skin tissue; (ii) a damaged skin tissue; (iii) a skin tissue with skin disease or condition; and / or (iv) a skin tissue after cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is: (i) susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) susceptible of being damaged or with predisposition toward skin damage; (iii) susceptible of or with predisposition toward developing a skin disease or condition; and / or (iv) to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue. In some embodiments, the method does not reprogram the population of skin cells into a reprogrammed stem cell. The nucleic acid construct can be delivered using an exosome, a liposome, an LNP, or a virus (e.g., LV or AAV) . In some embodiments, the exosome, liposome, or LNP is delivered by a microneedle. In some embodiments, the population of skin cells is present in an individual in need of treatment or prevention, wherein the method comprises administering the effective amount of the nucleic acid construct (or a virus comprising thereof) to the individual (e.g., to the skin tissue) in vivo. In some embodiments, the population of skin cells is obtained from a donor individual and cultured ex vivo. In some embodiments, the method comprises implanting the rejuvenated population of skin cells into an individual (e.g., to the skin tissue) in need of treatment or prevention. The donor individual and the individual in need of treatment or prevention can be the same or different. In some embodiments, the method comprises ex vivo administering to the population of skin cells the effective amount of the nucleic acid construct (or a virus comprising thereof) . In some embodiments, the method further comprises introducing into the population of skin cells an effective amount of a therapeutic agent, e.g., B18R, Vitamin C, Vitamin E, or any combination thereof. In some embodiments, the individual is a human (e.g., of any age) , such as a human that  is 10 years or older (e.g., at least about any of 15, 22, 30, 40, 50, 60, 70 years old, or older) . In some embodiments, for preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue / cell, the method is performed before the skin tissue / cell is aging, is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation, or cosmetic, dermatological, or surgical procedure) , or has (e.g., diagnosed with) a disease or condition. In some embodiments, the method is performed at least about 12 hours (e.g., at least about any of 24 hours, 48 hours, or more) before the skin tissue / cell is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation) .

[0170] In some embodiments, there is provided a method of rejuvenating a population of skin cells, comprising introducing into the population of skin cells an effective amount of a plurality of nucleic acids (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) encoding a plurality of reprogramming factors, wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , and an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a skin tissue in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a skin tissue of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a skin tissue in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , comprising: (a) introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of a plurality of nucleic acids (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) encoding a plurality of reprogramming factors, wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , and an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) ; or (b) introducing into a population of skin cells (e.g., from the same individual or different individuals) an effective amount of a plurality of nucleic acids (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof)  encoding a plurality of reprogramming factors, and implanting the rejuvenated population of skin cells into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) , wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , and an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO:14) . In some embodiments, the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination thereof. In some embodiments, the population of skin cells are from a skin tissue that is: (i) an aged skin tissue; (ii) a damaged skin tissue; (iii) a skin tissue with skin disease or condition; and / or (iv) a skin tissue after cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is: (i) susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) susceptible of being damaged or with predisposition toward skin damage; (iii) susceptible of or with predisposition toward developing a skin disease or condition; and / or (iv) to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue. In some embodiments, the method does not reprogram the population of skin cells into a reprogrammed stem cell. The plurality of nucleic acids can be on separate nucleic acid constructs (e.g., circRNA, plasmid, or recombinant viral genome) , or on a single nucleic acid construct. The plurality of nucleic acids can be delivered using an exosome, a liposome, an LNP, or a virus (e.g., LV or AAV) . In some embodiments, at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are on a single nucleic acid construct. In some embodiments, the at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are under the control of different promoters. In some embodiments, the at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are under the control of the same promoter. In some embodiments, the at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are connected by one or more linking nucleic acids. In some embodiments, the one or more linking nucleic acids comprise IRES or a linking sequence encoding a self-cleaving peptide, e.g., P2A, T2A, or E2A. In some embodiments, the population of skin cells is present in an individual in need of treatment or prevention, wherein the method comprises administering the effective amount of the plurality of nucleic acids (or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) to the individual (e.g., to the skin tissue) in vivo. In some embodiments, the plurality of nucleic acids are one or more RNAs (e.g., one circRNA) . In some embodiments, the one or more RNAs (e.g., one circRNA) are encapsulated within an exosome, a liposome, or an LNP. In some embodiments, the exosome, liposome, or LNP is delivered by a  microneedle. In some embodiments, the population of skin cells is obtained from a donor individual and cultured ex vivo. In some embodiments, the method comprises implanting the rejuvenated population of skin cells into an individual (e.g., to the skin tissue) in need of treatment or prevention. The donor individual and the individual in need of treatment or prevention can be the same or different. In some embodiments, the method comprises ex vivo administering to the population of skin cells the effective amount of the plurality of nucleic acids (or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) . In some embodiments, the plurality of nucleic acids are one or more RNAs (e.g., one circRNA) . In some embodiments, the one or more RNAs (e.g., one circRNA) are encapsulated within an exosome, a liposome, or an LNP. In some embodiments, the method further comprises introducing into the population of skin cells an effective amount of a therapeutic agent, e.g., B18R, Vitamin C, Vitamin E, or any combination thereof. In some embodiments, the individual is a human (e.g., of any age) , such as a human that is 10 years or older (e.g., at least about any of 15, 22, 30, 40, 50, 60, 70 years old, or older) . In some embodiments, for preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue / cell, the method is performed before the skin tissue / cell is aging, is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation, or cosmetic, dermatological, or surgical procedure) , or has (e.g., diagnosed with) a disease or condition. In some embodiments, the method is performed at least about 12 hours (e.g., at least about any of 24 hours, 48 hours, or more) before the skin tissue / cell is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation) .

[0171] In some embodiments, there is provided a method of rejuvenating a population of skin cells, comprising introducing into the population of skin cells an effective amount of a nucleic acid construct (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or a virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein the nucleic acid construct comprises from 5’ to 3’ : a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) –a first linking sequence (e.g., encoding P2A) –a second nucleic acid encoding KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) –a second linking sequence (e.g., encoding T2A) –a third nucleic acid encoding an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a skin tissue in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a skin tissue of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv)  enhancing the restoration of a skin tissue in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , comprising: (a) introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of a nucleic acid construct (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or a virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein the nucleic acid construct comprises from 5’ to 3’ : a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) –a first linking sequence (e.g., encoding P2A) –a second nucleic acid encoding KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) –a second linking sequence (e.g., encoding T2A) –a third nucleic acid encoding an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) ; or (b) introducing into a population of skin cells (e.g., from the same individual or different individuals) an effective amount of a nucleic acid construct (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or a virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , and implanting the rejuvenated population of skin cells into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) , wherein the nucleic acid construct comprises from 5’ to 3’ : a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) –a first linking sequence (e.g., encoding P2A) –a second nucleic acid encoding KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) –a second linking sequence (e.g., encoding T2A) –a third nucleic acid encoding an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) . In some embodiments, the nucleic acid construct encodes a protein sequence of SEQ ID NO: 97. In some embodiments, the nucleic acid construct further comprises an IRES at 5’ of the first nucleic acid. In some embodiments, the nucleic acid construct is a circRNA. In some embodiments, the nucleic acid construct is a DNA vector (e.g., lentival vector, AAV vector, or plasmid) . In some embodiments, the nucleic acid construct comprises a nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 30, 35, 59, and 98. In some embodiments, the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination thereof. In some embodiments, the population of skin cells are from a skin tissue that is: (i) an aged skin tissue; (ii) a damaged skin tissue; (iii) a skin tissue with skin disease or condition; and / or (iv) a skin tissue after cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is: (i) susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) susceptible of being damaged or with predisposition  toward skin damage; (iii) susceptible of or with predisposition toward developing a skin disease or condition; and / or (iv) to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue. In some embodiments, the method does not reprogram the population of skin cells into a reprogrammed stem cell. The nucleic acid construct can be delivered using an exosome, a liposome, an LNP, or a virus (e.g., LV or AAV) . In some embodiments, the exosome, liposome, or LNP is delivered by a microneedle. In some embodiments, the population of skin cells is present in an individual in need of treatment or prevention, wherein the method comprises administering the effective amount of the nucleic acid construct (or a virus comprising thereof) to the individual (e.g., to the skin tissue) in vivo. In some embodiments, the population of skin cells is obtained from a donor individual and cultured ex vivo. In some embodiments, the method comprises implanting the rejuvenated population of skin cells into an individual (e.g., to the skin tissue) in need of treatment or prevention. The donor individual and the individual in need of treatment or prevention can be the same or different. In some embodiments, the method comprises ex vivo administering to the population of skin cells the effective amount of the nucleic acid construct (or a virus comprising thereof) . In some embodiments, the method further comprises introducing into the population of skin cells an effective amount of a therapeutic agent, e.g., B18R, Vitamin C, Vitamin E, or any combination thereof. In some embodiments, the individual is a human (e.g., of any age) , such as a human that is 10 years or older (e.g., at least about any of 15, 22, 30, 40, 50, 60, 70 years old, or older) . In some embodiments, for preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue / cell, the method is performed before the skin tissue / cell is aging, is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation, or cosmetic, dermatological, or surgical procedure) , or has (e.g., diagnosed with) a disease or condition. In some embodiments, the method is performed at least about 12 hours (e.g., at least about any of 24 hours, 48 hours, or more) before the skin tissue / cell is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation) .

[0172] In some embodiments, there is provided a method of rejuvenating a population of skin cells, comprising introducing into the population of skin cells an effective amount of a plurality of nucleic acids (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) encoding a plurality of reprogramming factors, wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO:  4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) , and SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a skin tissue in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a skin tissue of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a skin tissue in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , comprising: (a) introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of a plurality of nucleic acids (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) encoding a plurality of reprogramming factors, wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) , and SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) ; or (b) introducing into a population of skin cells (e.g., from the same individual or different individuals) an effective amount of a plurality of nucleic acids (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) encoding a plurality of reprogramming factors, and implanting the rejuvenated population of skin cells into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) , wherein the plurality of reprogramming factors comprise an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) , and SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) . In some embodiments, the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination thereof. In some embodiments, the population of skin cells are from a skin tissue that is: (i) an aged skin tissue; (ii) a damaged skin tissue; (iii) a skin tissue with skin disease or condition; and / or (iv) a skin tissue after cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is: (i) susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) susceptible of being damaged or with predisposition toward skin damage; (iii) susceptible of or with predisposition  toward developing a skin disease or condition; and / or (iv) to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue. In some embodiments, the method does not reprogram the population of skin cells into a reprogrammed stem cell. The plurality of nucleic acids can be on separate nucleic acid constructs (e.g., circRNA, plasmid, or recombinant viral genome) , or on a single nucleic acid construct. The plurality of nucleic acids can be delivered using an exosome, a liposome, an LNP, or a virus (e.g., LV or AAV) . In some embodiments, at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are on a single nucleic acid construct. In some embodiments, the at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are under the control of different promoters. In some embodiments, the at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are under the control of the same promoter. In some embodiments, the at least two of (e.g., all of) the plurality of nucleic acids are connected by one or more linking nucleic acids. In some embodiments, the one or more linking nucleic acids comprise IRES or a linking sequence encoding a self-cleaving peptide, e.g., P2A, T2A, or E2A. In some embodiments, the population of skin cells is present in an individual in need of treatment or prevention, wherein the method comprises administering the effective amount of the plurality of nucleic acids (or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) to the individual (e.g., to the skin tissue) in vivo. In some embodiments, the plurality of nucleic acids are one or more RNAs (e.g., one circRNA) . In some embodiments, the one or more RNAs (e.g., one circRNA) are encapsulated within an exosome, a liposome, or an LNP. In some embodiments, the exosome, liposome, or LNP is delivered by a microneedle. In some embodiments, the population of skin cells is obtained from a donor individual and cultured ex vivo. In some embodiments, the method comprises implanting the rejuvenated population of skin cells into an individual (e.g., to the skin tissue) in need of treatment or prevention. The donor individual and the individual in need of treatment or prevention can be the same or different. In some embodiments, the method comprises ex vivo administering to the population of skin cells the effective amount of the plurality of nucleic acids (or nucleic acid construct (s) or virus comprising thereof) . In some embodiments, the plurality of nucleic acids are one or more RNAs (e.g., one circRNA) . In some embodiments, the one or more RNAs (e.g., one circRNA) are encapsulated within an exosome, a liposome, or an LNP. In some embodiments, the method further comprises introducing into the population of skin cells an effective amount of a therapeutic agent, e.g., B18R, Vitamin C, Vitamin E, or any combination thereof. In some embodiments, the individual is a human (e.g., of any age) , such as a human that  is 10 years or older (e.g., at least about any of 15, 22, 30, 40, 50, 60, 70 years old, or older) . In some embodiments, for preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue / cell, the method is performed before the skin tissue / cell is aging, is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation, or cosmetic, dermatological, or surgical procedure) , or has (e.g., diagnosed with) a disease or condition. In some embodiments, the method is performed at least about 12 hours (e.g., at least about any of 24 hours, 48 hours, or more) before the skin tissue / cell is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation) .

[0173] In some embodiments, there is provided a method of rejuvenating a population of skin cells, comprising introducing into the population of skin cells an effective amount of a nucleic acid construct (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or a virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein the nucleic acid construct comprises from 5’ to 3’ : a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) –a first linking sequence (e.g., encoding P2A) –a second nucleic acid encoding KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) –a second linking sequence (e.g., encoding T2A) –a third nucleic acid encoding an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) –a third linking sequence (e.g., encoding E2A) –a fourth nucleic acid encoding SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) . In some embodiments, there is provided a method of: (i) delaying or preventing the progression of aging of a skin tissue in an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (ii) treating aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , (iii) preserving or improving the state and / or appearance of a skin tissue of an individual (e.g., human, e.g., 22 years or older) , (iv) enhancing the restoration of a skin tissue in an individual (e.g., human) after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, and / or (v) preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual (e.g., human) , comprising: (a) introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of a nucleic acid construct (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or a virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , wherein the nucleic acid construct comprises from 5’ to 3’ : a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) –a first linking sequence (e.g., encoding P2A) –a second nucleic acid encoding KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) –a second linking sequence (e.g., encoding T2A) –a third nucleic acid encoding an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs:  14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) –a third linking sequence (e.g., encoding E2A) –a fourth nucleic acid encoding SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) ; or (b) introducing into a population of skin cells (e.g., from the same individual or different individuals) an effective amount of a nucleic acid construct (RNA (e.g., circRNA) or DNA; or a virus comprising thereof) (or a pharmaceutical composition comprising thereof) , and implanting the rejuvenated population of skin cells into the individual (e.g., the skin tissue of the individual) , wherein the nucleic acid construct comprises from 5’ to 3’ : a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) –a first linking sequence (e.g., encoding P2A) –a second nucleic acid encoding KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) –a second linking sequence (e.g., encoding T2A) –a third nucleic acid encoding an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) –a third linking sequence (e.g., encoding E2A) –a fourth nucleic acid encoding SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) . In some embodiments, the nucleic acid construct encodes a protein sequence of SEQ ID NO: 101. In some embodiments, the nucleic acid construct further comprises an IRES at 5’ of the first nucleic acid. In some embodiments, the nucleic acid construct is a circRNA. In some embodiments, the nucleic acid construct is a DNA vector (e.g., lentival vector, AAV vector, or plasmid) . In some embodiments, the nucleic acid construct comprises a nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 28, 37, 61, and 102. In some embodiments, the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination thereof. In some embodiments, the population of skin cells are from a skin tissue that is: (i) an aged skin tissue; (ii) a damaged skin tissue; (iii) a skin tissue with skin disease or condition; and / or (iv) a skin tissue after cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is: (i) susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) susceptible of being damaged or with predisposition toward skin damage; (iii) susceptible of or with predisposition toward developing a skin disease or condition; and / or (iv) to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue. In some embodiments, the method does not reprogram the population of skin cells into a reprogrammed stem cell. The nucleic acid construct can be delivered using an exosome, a liposome, an LNP, or a virus (e.g., LV or AAV) . In some embodiments, the exosome, liposome, or LNP is delivered by a microneedle. In some embodiments, the population of skin cells is present in an individual in need of treatment or prevention, wherein the method comprises administering the effective amount of the nucleic  acid construct (or a virus comprising thereof) to the individual (e.g., to the skin tissue) in vivo. In some embodiments, the population of skin cells is obtained from a donor individual and cultured ex vivo. In some embodiments, the method comprises implanting the rejuvenated population of skin cells into an individual (e.g., to the skin tissue) in need of treatment or prevention. The donor individual and the individual in need of treatment or prevention can be the same or different. In some embodiments, the method comprises ex vivo administering to the population of skin cells the effective amount of the nucleic acid construct (or a virus comprising thereof) . In some embodiments, the method further comprises introducing into the population of skin cells an effective amount of a therapeutic agent, e.g., B18R, Vitamin C, Vitamin E, or any combination thereof. In some embodiments, the individual is a human (e.g., of any age) , such as a human that is 10 years or older (e.g., at least about any of 15, 22, 30, 40, 50, 60, 70 years old, or older) . In some embodiments, for preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue / cell, the method is performed before the skin tissue / cell is aging, is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation, or cosmetic, dermatological, or surgical procedure) , or has (e.g., diagnosed with) a disease or condition. In some embodiments, the method is performed at least about 12 hours (e.g., at least about any of 24 hours, 48 hours, or more) before the skin tissue / cell is exposed to a damage factor (e.g., UV irradiation) .

[0174] Skin cells and tissues and associated conditions

[0175] Skin is usually composed of two main layers of tissue. The outermost layer is epidermis, which is composed of several layers. The dermis is composed of a papillary layer above and a reticular layer below.

[0176] Human epidermis is mainly composed of keratinocytes. It also contains other types of cells including the melanocytes and the Langerhans cells.

[0177] The dermis provides a solid support for the epidermis and also serves as its feeder layer. The dermis consists mainly of fibroblasts. Leukocytes, mast cells or tissue macrophages are also present. The dermis further contains blood vessels and nerve fibers. The acellular part (i.e., the area in between the cells) of the dermis is called extracellular matrix (ECM) . The skin ECM is composed of various extracellular components including proteins, particularly collagen fibers and elastin. Other skin ECM components include glycosaminoglycans (e.g., hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, heparan sulfate, etc. ) , proteoglycans (e.g.,  fibromodulin, decorin, biglycan, perlecan, heparan sulfate proteoglycan 2, agrin, versican, aggrecan, lumican, collagen type IX, collagen type XII, collagen type XIV, testican 1, testican 2, etc. ) and various glycoproteins (e.g., fibrillin 1, thrombospondin-1 and -2, tenascin-C and -X, osteopontin, fibronectin, laminin-5 and -6, vitronectin, etc. ) . These extracellular components are synthesized by dermal fibroblasts, which make dermal fibroblasts the primary constituent in the structural assembly of the dermis.

[0178] The ECM is a highly heterogeneous amalgam of morphologically diverse architectural entities. It organizes and imparts structural integrity to individual tissues, in addition to modulating cell behavior by interacting with cell surface receptors and soluble growth factors. Dysfunctions and changes in components of the ECM can interfere with both tissue integrity and cell performance. Dysfunctions and changes in components of the ECM of skin and mucosa in humans can lead to skin aging, skin atrophy, damaged skin, wounded skin, atrophy of vulva and vagina (vulvovaginal atrophy) , or to any other conditions, disorders and diseases of skin and mucosa associated with changes in ECM components.

[0179] The five most common types of collagen in human body are collagen I, II, III, IV and V. However, over 90%of the collagen in the body is of type I.

[0180] In human skin, collagen types I and III are the predominant types of collagen. They are present as fibrils and are responsible for the solidity and the strength of the dermis. Since type I collagen is the predominant collagen in adult human skin, comprising about 80%of the total bulk of collagen, it plays a major role in providing tensile strength to the skin. It is clear, however, that type III collagen, which comprises some 10%of the total dermal collagen, also plays a critical role in providing additional tensile properties to the skin and other tissues. See Journal of Dermatological Science, 24, Suppl. 1, 2000, S60-S69.

[0181] Chronologically aged skin manifests in a reduced synthesis of both collagen types I and III. With respect to photoaging, Schwarz et al. (Photochem Photobiol 1993, 58, 841-844) demonstrated that the loss in collagen in sun-damaged human skin is due to increased degradation of both types I and III collagens. Additionally, it was shown that fibroblasts derived from sun-exposed skin synthesize a lower proportion of collagen III than cells from sun-protected skin. See J Photochem Photobiol B. 1995, 27: 33-38.

[0182] The production of collagen in vivo requires activation of the collagen biosynthesis pathway by which transcription in the cell nucleus promotes polypeptide synthesis via translation from mRNA, organization of the polypeptides into a pro-collagen triple helix in the cytoplasm, secretion of pro-collagen from the cell, and then cleavage reactions, fibril assembly, and cross-linking extracellularly. Unlike many proteins that are stored in secretory granules and then secreted from the cell upon demand, collagen is secreted continuously.

[0183] Alterations in content and structure of collagen and other components of the ECM, including but not limited to, elastin and hyaluronic acid are characteristic of aged human skin.

[0184] Elastin is a vital component of the ECM of vertebrates, and provides exceptional properties including elasticity and tensile strength to many tissues and organs including the skin. Mature elastin is an insoluble and extremely durable protein that undergoes little turnover, but sustained exposure to proteases may lead to irreversible and severe damage, and thus to functional loss of the elastic fiber network. In general, elastin content decreased with age in sun unexposed skin (i.e., buttock) (i.e., elastin content decreased by about 44%between 50 and 70 years of age) . A similar decrease was seen in severe sun-exposed skin (i.e., face) (i.e., elastin content decreased by about 31%between 50 and 70 years of age) . Interestingly, the elastin content in moderately sun-exposed areas (i.e., forearm) did not significantly change during aging. This phenomenon might be explained by a combination of age-induced reduction and sun-dependent increase in elastin, what appears to be at least partially regulated by UV-induced deposition of lysozyme in elastin fibers. See JEADV 2006, 20, 980-987.

[0185] Other than in skin aging, collagens I and III are also major ECM components involved in scar formation. Scarring occurs after trauma, injury or surgery to any tissue or organ in the body. Such scars are a consequence of a repair mechanism that replaces the missing normal tissue with an ECM consisting predominantly of collagen types I and III as well as fibronectin and some other ECM components. Scarring represents imperfect tissue regeneration. Whereas skin wounds on early mammalian embryos (e.g., up to about 24 weeks of gestation in humans) heal perfectly with no signs of scarring and complete restitution of the normal skin architecture, postnatal wounds heal with scars. See Dang C et al., Clin Plast Surg 2003: 30, 13-23. Of the many different types of collagen identified, fetal skin is known to contain a greater proportion of type III collagen, whereas adult skin consists predominantly of type I collagen.

[0186] Inflammation has an important function during scar formation. As the immune system develops and its resultant inflammatory response increases, scar formation occurs at the repair site. Synthesis and remodeling of the ECM by wound fibroblasts is likely the major determinant of dermal architecture after repair. Differences between scarring and scarless collagen architecture may be partly explained by phenotypic differences between adult and fetal fibroblasts.

[0187] Fetal and adult fibroblasts display differences in synthetic rates of collagen, hyaluronic acid (HA) , and other ECM components. In vitro, fetal fibroblasts synthesize more type III and IV collagen than their adult counterparts. Fetal fibroblasts can simultaneously proliferate and synthesize collagen. Fetal fibroblasts have a greater ability to migrate into collagen gels than do adult fibroblasts. Increasing cell density diminishes HA production in the adult but has no effect on fetal fibroblast HA synthesis.

[0188] Skin aging is classified into intrinsic aging and extrinsic aging depending on its cause. Intrinsic aging is a process by which the skin structure and the physiological functions of the skin deteriorate regardless of environmental changes as a human gets older. Extrinsic aging is caused by continuous exposure to external environment such as sunlight and air pollutants. Especially, skin aging caused by sun light is called photoaging. Ultraviolet (UV) light from the sun is the main cause of the physiological and morphological changes in aged skin.

[0189] As intrinsic skin aging proceeds, the skin becomes dry, and fine lines and wrinkles form which become more visible and deepen with age. Further, because of structural and functional changes of the epidermis and the dermis, the skin loses its elasticity and looks drooping. The dermis becomes thinner and well visible skin folds (e.g., nasolabial fold) form with age. It is estimated that the total quantity of collagen lost each year for adults is about 1%. In addition, the remaining collagen fibers gradually become thicker, while the cross-linking of the collagen fibers increases, so that the solubility, elasticity and like thereof decrease. Furthermore, elastin fibers become thicker and the cross-linking thereof also increases. Moreover, the proliferative activity of fibroblasts in the dermis decreases with time, and the ability of the aging fibroblasts to form (i.e., synthesize) new collagen, elastin, hyaluronic acid and other components of the ECM also decreases.

[0190] Continuous exposure to the sun is the main cause of extrinsic aging of skin. The UV component of sunlight, particularly UVA and UVB, is generally believed to be the principal  causative agent in this process called photoaging. The extent of UV exposure required to cause “photoaging” is not currently known, although the amount sufficient to cause erythema (reddening, commonly described as sunburn) in human skin is quantified as the “minimal erythema dose” (MED) from a given UV light source. Repeated exposure to sunlight UV at levels that cause erythema and tanning are, nevertheless, commonly associated with photoaging.

[0191] There is a difference between the physiology of intrinsically-aged (i.e., chronologically-aged) skin in comparison with that of photoaged skin. Chronologically-aged skin typically maintains a smooth and unblemished appearance, in comparison with the leathery, blotchy, and often deep wrinkling of photoaged skin. Photoaging is characterized clinically by coarseness, wrinkles, mottled pigmentation, sallowness, laxity, telangiectasia, lentigines, purpura and relative ease of bruising, atrophy, depigmented areas, eventually premalignant, and ultimately malignant neoplasm (i.e., abnormal mass of tissue as a result of neoplasia, which is the abnormal proliferation of cells) . Photoaging commonly occurs in skin that is generally exposed to sunlight such as the face, ears, bald areas of the scalp, neck, décolleté, forearms, and hands.

[0192] Nevertheless, chronologically aged and UV-irradiated skin were found to share important molecular features including altered signal transduction pathways that promote matrix-metalloproteinase expression (e.g., collagenase, gelatinase) causing ECM degradation, decreased collagen formation, and alteration or damage to ECM of skin such as the accumulation of amorphous elastin-containing material residing beneath the epidermal dermal junction.

[0193] Wrinkles are generally a result of the natural aging process of the skin and of exposure to the sun’s ultraviolet rays. A wrinkle is a configuration change in the surface of the skin, without specific structural alterations at the histological level. Generally, wrinkles are classified as described in Ligman et al. (1985) Br. J. Derm. 113: 37-42, incorporated herein by reference. Kligman classifies wrinkles into three classes: linear wrinkles, glyphic wrinkles, and crinkles. Linear wrinkles are straight, found generally in the facial skin, and are caused by natural aging or exposure to ultraviolet light. Glyphic wrinkles are shaped as apparent triangles or rectangles of wrinkles, are found on the face, hands, and neck exposed to sunlight, and are aggravated by exposure to ultraviolet light or dermatoheliosis. Crinkles, are thin, crinkled wrinkles on flabby skin, found anywhere on the skin, but typically on the backs of hands and around the eyelids.

[0194] A skin tissue described herein may be an abnormal, damaged, or unhealthy skin tissue, which may need to be treated. A skin tissue may also be a normal or healthy skin tissue that is under a higher than normal risk of becoming abnormal or unhealthy (e.g., to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, or to be exposed to UV irradiation) , which may need to be prevented. In certain embodiments, the skin tissue is considered healthy but suboptimal for performance or survival in current or future conditions.

[0195] A skin tissue can be from any of face, neck, neckline, décolleté, scalp, hand, palm, arm, leg, foot, sole, chest, breast, back, abdomen, buttock, vulva, penis, scrotum, anus, and / or any other skin areas of the human body. In some embodiments, the skin tissue is the face skin tissue.

[0196] In some embodiments, the population of skin cells to be administered with the LLPS-deficient engineered reprogramming factor (s) described herein comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination thereof. In some embodiments, the population of skin cells comprise (or consist essentially of, or consist of) fibroblasts. In some embodiments, the population of skin cells are from a skin tissue that is (i) an aged skin tissue, or a skin tissue susceptible of aging or with predisposition toward aging; (ii) a damaged skin tissue, or a skin tissue susceptible of being damaged or with predisposition toward skin damage; (iii) a skin tissue with skin disease or condition, or susceptible of or with predisposition toward developing a skin disease or condition; and / or (iv) a skin tissue to be administered or after cosmetic, dermatological, or surgical procedure.

[0197] In some embodiments, the population of skin cells are from an aged skin tissue, or a skin tissue susceptible of aging or with predisposition toward aging. Skin aging can be intrinsic aging (i.e., chronological aging) or extrinsic aging (e.g., due to extrinsic damage factor such as UV irradiation or air pollutants) . In some embodiments, the aged skin tissue is from a human who is 22 years or older (e.g., at least about any of 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 years old, or older) , such as 24 years or older, 30 years or older, 50 years or older, 55 years or older, or 60 years or older. In some embodiments, the skin tissue is a photoaged skin tissue, or susceptible of or with predisposition toward being photo-damaged. The photoaged skin tissue, or a skin tissue susceptible of aging or with predisposition toward aging, can be from an individual (e.g., human) of any age.

[0198] Extrinsic skin aging can be due to skin damage factors, include but are not limited to, air pollution, sun radiation (e.g., UV) , tabacco, alcohol, climate (e.g., high temperature, high altitudes, or desert environment) , nutrition (e.g., fats, refined flour, highly processed foods) , stress, lack of sleep, lack of exercise, or a combination thereof.

[0199] In some embodiments, the population of skin cells are from a a damaged skin tissue, or a skin tissue susceptible of being damaged or with predisposition toward skin damage. In some embodiments, the damage is ultraviolet (e.g., UVA or UVB) -induced, such as causing wrinkles. In some embodiments, the damage is due to invasive cut, abrasion, or wound, such as knife cut or physical stretch. In some embodiments, the damage is due to fire or chemical burns. In some embodiments, the damage is due to cosmetic, dermatological, or surgical procedures. Skin injuries or damages include but are not limited to, cuts, lacerations, gashes, tears, scrapes, abrasions, scratches, floor burns, and bruises. Damaged skin is typically characterized by one or more of inflammation, epidermal hyperplasia, dermal elastosis and matrix protein degradation, and the presence of perivenular lymphohistiocytic dermal infiltrates.

[0200] In some embodiments, the population of skin cells are from a skin tissue with skin disease or condition, or susceptible of or with predisposition toward developing a skin disease or condition. Any skin diseases or conditions that are assocociated with skin cell / tissue aging or damage, or associated with changes in ECM components (e.g., not related to aging) , can be treated or prevented herein, include but are not limited to, inflammatory skin condition, neurogenic or neuroinflammatory skin condition, acute or chronic wounds, acute or chronic ulcers or burns. In some embodiments, the skin disease or condition is in need of scarless healing and / or a balanced response to skin inflammation. In some embodiments, the skin tissue has a scar, or is susceptible of or with predisposition toward developing a scar. In some embodiments, the skin disease or condiditon is hereditary. In some embodiments, the skin disease or condition is an skin-aging related disease or condition, such as dry skin, itchy skin, age spot, skin tag, chronic wound, etc.. In some embodiments, the skin disease or condition is dermatoporosis. Also see Blume-Peytavi et al., Gerontologist. 2016: 56 Suppl 2: S230-42 for exemplary age-associated skin conditions and diseases.

[0201] The inflammatory skin condition can be vulvar vestibulitis syndrome, dysesthetic vulvodynia, vulvodynia, psoriasis, dermatitis, atopic dermatitis, eczema, contact dermatitis,  allergic contact dermatitis, dermatitis herpetiformis, generalized exfoliative dermatitis, vulvar lichen sclerosus, sebaceous cysts, seborrheic dermatitis, rosacea, acne, keloids, pruritus, atrophie blanche, dandruff, diaper rash, photo-dermatoses, peri-ulcers, scars or xerosis.

[0202] Wounds can happen during and / or after skin allograft, skin autograft, or three-dimensional skin construct. Wounds after surgery can also be treated, include but are not limited to, non-cosmetic, cosmetic, plastic and / or reconstructive surgery procedures. Acute and chronic wounds can comprise minor burns, minor wounds, crevices, cracks, scratches, accidental wounds, ulcers, peri-ulcer skin, skin after wound closure and / or healing.

[0203] Cosmetic, plastic and reconstructive surgery procedures include, but are not limited to breast lift, breast augmentation or reduction, facelift, forehead lift, surgery of the nose, surgery of the ear, surgery of the eye lid, surgery of the abdomen, liposculpturing, liposuction, scar revision, fat transfer, soft-tissue augmentation, cryosurgery or cryotherapy, hair transplantation, nail surgery, sclerotherapy, laser surgery, tattoo removal and / or vein surgery.

[0204] In some embodiments, the population of skin cells are from a skin tissue to be administered or after cosmetic, dermatological, or surgical procedure.

[0205] Cosmetic and / or dermatological procedures include, but are not limited to, light chemical peels, medium chemical peels, deep chemical peels, physical peels, waxing, microdermabrasion, dermabrasion, light treatments (intense pulse light, photomodulation, treatments with visible, non-visible, infrared and / or ultraviolet light) , laser treatments, radiofrequency treatments, thermal treatments (heat, cold, cycles of heat and cold) , electrical treatments, sonnication treatments, mechanical treatments (massage, pressure, suction, vibration, friction, abrasion) , oxygen and / or ozone treatments, injections and / or any combinations thereof.

[0206] Skin surgical procedures include but are not limited to, skin biopsy (e.g., punch biopsy, shave biopsy, incisional biopsy, and excision biopsy) , electrosurgery, curettage and cautery, wound closure, flaps, skin grafting, mohs excision, cryotherapy, subcision, excision of skin lesions, etc.

[0207] The skin rejuvenation methods, treatment or prevention methods, or LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein can be used in combination with said cosmetic  and / or dermatological procedures, or said cosmetic, plastic and / or reconstructive surgery procedures; either before, after and / or during (in parallel) the procedures.

[0208] Therapeutic and / or prophylactic effects of skin rejuvenation

[0209] The skin rejuvenation methods described herein can be therapeutic or prophylactic (i.e., preventive) , herein also referred to as “therapeutic skin rejuvenation method” or “treatment method” , and “prophylactic skin rejuvenation method” or “prevention method, ” respectively. The methods or the LLPS-deficient engineered reprogramming factors (or compositions thereof) described herein can be used prophylactically, or they can be used to reduce, treat, and / or prevent further skin aging or damage (e.g., wrinkles) , or to reduce the appearance of skin aging or damage in an individual with predisposition toward skin damage, or has been exposed to an agent likely to cause skin damage (e.g., UV radiation such as UVB radiation) , with the purpose to reduce, improve, alleviate, alter, remedy, ameliorate, or affect the appearance of skin damage. Without being bound by theory, the treatment and prevention methods described herein comprising introducing an LLPS-deficient engineered reprogramming factor (or composition thereof) can function by any mechanisms, include but are not limited to skin rejuvenation.

[0210] For therapeutic skin rejuvenation methods, the skin tissue to be treated can be (or the population of skin cells to be treated are from) : (i) an aged skin tissue; (ii) a damaged skin tissue; (iii) a skin tissue with skin disease or condition; and / or (iv) a skin tissue after cosmetic, dermatological, or surgical procedure.

[0211] For prophylactic skin rejuvenation methods, the skin tissue to be treated can be (or the population of skin cells to be treated are from) : (i) a skin tissue susceptible of aging or with predisposition toward aging (e.g., before skin intrinsic aging starts) ; (ii) a skin tissue susceptible of being damaged or with predisposition toward skin damage (e.g., before exposure to skin damage factors such as UV irradiation, or has been exposed to an agent likely to cause skin damage) ; (iii) a skin tissue susceptible of or with predisposition toward developing a skin disease or condition (e.g., before a skin disease or condition is diagnosed) ; and / or (iv) a skin tissue to be administered a cosmetic, dermatological, or surgical procedure (e.g., before laser treatment or skin grafting) .

[0212] The therapeutic skin rejuvenation methods described herein may achieve one or more of: i) improving the state of aged skin and / or visible signs or of skin aging (including, for example, fine lines, wrinkles, skin folds, enlarged pores, roughness, dryness, loss of elasticity, loss of  volume) ; ii) improving other skin texture defects such as stretch marks (as caused by pregnancy, trauma or other influences) ; iii) reducing bags under the eyes (or “puffy eyes” ) ; iv) reducing dark (under eye) circles (both caused by thinning of the skin, insufficient blood circulation and slack tissue) ; v) reducing the severity of atrophic skin (e.g., atrophic vulva, atrophic vagina) ; vi) reducing scarring of damaged skin; vii) restoring damaged skin; viii) enhancing the restoration of skin after damage (s) or cosmetic, dermatological, and / or surgical procedure (s) , e.g., enhancing scar or wound healing, enhancing skin regeneration, or reducing inflammation; ix) preventing or delaying the progression of skin aging; x) reducing the severity of a skin disease or condition; xi) preventing or delaying the progression of a skin disease or condition (e.g., inflammation) ; xii) treating, alleviating, or ameliorating a symptom associated with a skin disease or condition; xiii) improving the life quality (e.g., self-confidence, or satisfaction) of an individual; and / or xiv) preserving or improving the state (e.g., texture, moisture, elasticity, volume, or biomarkers) and / or appearance of a skin tissue (including ECM) . In some embodiments, compared to a reference, skin aging, damage, or disease or condition (or associated symptom) treated by the skin rejuvenation methods described herein is reduced by at least about 5%, such as at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 100%. In some embodiments, compared to a reference, the progression of skin aging, damage, or disease or condition (or associated symptom) treated by the skin rejuvenation methods described herein is delayed by at least about 1 week, such as at least about any of 2 weeks, 1 month, 3 months, 6 months, 1 year, 2 years, 5 years, or longer. In some embodiments, compared to a reference, the skin appearance, state, condition, and / or function (e.g., protection against microorganisms, dehydration, ultraviolet light, and mechanical damage, sensation of pain, temperature, touch, and deep pressure, etc. ) , and / or the life quality of the individual, is improved by at least about 5%, such as at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 2-fold, 5-fold, 10-fold, or more. In some embodiments, the skin appearance, state, condition, and / or function is restored to at least about 20% (e.g., at least about any of 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 100%) of a healthy skin and / or a younger skin. The reference can be: i) a reference skin cell or tissue not introduced with the LLPS-deficient engineered reprogramming factor; and / or ii) a reference skin cell or tissue introduced with a reference reprogramming factor that is not deficient in LLPS. The reference skin tissue / cell and the skin tissue / cell can be from a same individual or from different individuals.

[0213] The prophylactic skin rejuvenation methods described herein may achieve one or more of: i) maintaining healthy skin; and / or ii) preventing or delaying the onset of skin aging, damage (e.g., scar, sunspot) , or disease or condition (or associated symptom) . In some embodiments, compared to a reference, the onset of skin aging, damage, or disease or condition (or associated symptom) treated by the skin rejuvenation methods (or LLPS-deficient engineered reprogramming factors) described herein is delayed by at least about 1 week, such as at least about any of 2 weeks, 1 month, 3 months, 6 months, 1 year, 2 years, 5 years, or longer. In some embodiments, compared to a reference, the healthy skin is maintained at least about 1 week longer, such as at least about any of 2 weeks, 1 month, 3 months, 6 months, 1 year, 2 years, 5 years, or more, longer. The reference can be: i) a reference skin cell or tissue not introduced with the LLPS-deficient engineered reprogramming factor; and / or ii) a reference skin cell or tissue introduced with a reference reprogramming factor that is not deficient in LLPS. The reference skin tissue / cell and the skin tissue / cell can be from a same individual or from different individuals.

[0214] In some embodiments, the therapeutic or prophylactic effects of the skin rejuvenation methods (or treatment or prevention methods) or LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein can be determined or quantified using one or more biomarkers.

[0215] In some embodiments, the skin rejuvenation method (or treatment or prevention method) does not reprogram the population of skin cells into a reprogrammed stem cell (i.e., iPSC) . A reprogrammed stem cell or iPSC may express at least some, and optionally all, of the markers from the following non-limiting list: SSEA-3, SSEA-4, TRA-I-60, TRA-I-81, TRA-2-49 / 6E, ALP, Sox2, E-cadherin, UTF-I, Oct4, Lin28, Klf4, REX-1, and Nanog. OCT4, LIN28, and / or KLF4 can be expressed at high levels in iPSCs, while skin identity marker genes are not expressed or barely expressed. In some embodiments, compared to a reference skin cell introduced with an effective amount of a reference reprogramming factor that is not deficient in LLPS, the rejuvenated population of skin cells: (i) have increased (e.g., increasing at least about 5%, such as at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 2-fold, 3-fold, 5-fold, 10-fold, or more) expression and / or function of a biomarker of initiation phase reprogramming (IPR) ; (ii) have reduced (e.g., reducing at least about 5%, such as at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 100%) expression and / or function of a biomarker of maturation phase reprogramming; and / or (iii) have reduced (e.g., reducing at least about 5%, such as at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 100%)  expression and / or function of a biomarker of stabilization phase reprogramming. In some embodiments, compared to a reference skin cell not introduced with the engineered reprogramming factor, the rejuvenated population of skin cells have increased (e.g., increasing at least about 5%, such as at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 2-fold, 3-fold, 5-fold, 10-fold, or more) expression and / or function of a biomarker of IPR. In some embodiments, (i) the biomarker of IPR is NANOG and / or SALL4; (ii) the biomarker of maturation phase reprogramming is DPPA5 and / or LIN28A; and / or (iii) the biomarker of stabilization phase reprogramming is OCT4 and / or XACT. The reference skin tissue / cell and the skin tissue / cell can be from a same individual or from different individuals.

[0216] In some embodiments, compared to a reference skin cell not introduced with the engineered reprogramming factor, and / or compared to a reference skin cell introduced with an effective amount of a reference reprogramming factor that is not deficient in LLPS, the rejuvenated population of skin cells: (i) have reduced proportion of cell senescence biomarker-positive cells; (ii) have reduced expression and / or function of a biomarker of cell senescence; (iii) have reduced epigenetic age (EpiAge) ; (iv) have increased expression and / or function of a biomarker related to healthy skin cell function; (v) have increased expression and / or function of a biomarker of skin cell identity; (vi) have reduced expression and / or function of a biomarker of apoptosis; (vii) have reduced expression and / or function of a biomarker of ferroptosis; (viii) have reduced expression and / or function of a biomarker of inflammation; (ix) have reduced expression and / or function of a biomarker of endoplasmic reticulum (ER) stress; and / or (x) have reduced expression and / or function of a biomarker related to unhealthy skin cell function. The reduction of the expression and / or function of the biomarker can be a reduction of at least about 5% (e.g., at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 100%) of the expression and / or function of the biomarker in the reference skin cell. The increase of the expression and / or function of the biomarker can be an increase of at least about 5% (e.g., at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 2-fold, 3-fold, 5-fold, 10-fold, or more) of the expression and / or function of the biomarker in the reference skin cell. In some embodiments, (i) the biomarker of cell senescence is selected from the group consisting of senescence-associated-β-galactosidase (SA-β-gal) , p16, and p21, or a combination thereof; (ii) the EpiAge is measured using Horvath’s clock, Levine’s clock, Hannum’s clock, and / or AltumAge; (iii) the biomarker related to healthy skin cell function is selected from the group consisting of COL1A1, COL3A1,  COL4A1, ELN, FN1, and LAMA5, or a combination thereof; (iv) the biomarker of skin cell identity is selected from the group consisting of THY1, P4HB, S100A4, and SERPINH1, or a combination thereof; (v) the biomarker of apoptosis is selected from the group consisting of loss of membrane asymmetry, cleavage of a Bcl-2 family protein, caspase activation, caspase substrate cleavage, non-caspase protease activation, mitochondrial transmembrane potential (Δ ψm) decrease, cytochrome C release, increase of sub G1 population, nuclear condensation, DNA fragmentation, and membrane blebbing, or a combination thereof; (vi) the biomarker of ferroptosis is HMOX1, SAT1, or a combination thereof; (vii) the biomarker of inflammation is IL6, CCL3, CXCL2, CXCL8, CSF2, or a combination thereof; (viii) the biomarker of endoplasmic reticulum stress comprises Hsp70 heat shock proteins, Hsp40 heat shock proteins, DDIT3, and HERPUD1, or a combination thereof; and / or (ix) the biomarker related to unhealthy skin cell function is selected from the group consisting of IL6, CXCL8, IL1A, IL1B, IGFBP3, CDKN1A, TGFB3, MMP1, MMP2, and SOD2, or a combination thereof. The reference skin tissue / cell and the skin tissue / cell can be from a same individual or from different individuals.

[0217] In some embodiments, compared to a reference skin tissue not comprising skin cells introduced with the effective amount of the engineered reprogramming factor, and / or compared to a reference skin cell introduced with an effective amount of a reference reprogramming factor that is not deficient in LLPS, a skin tissue comprising the population of skin cells introduced with the effective amount of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors has increased expression of one or more selected from the group consisting of elastin, collagen I, collagen III, and collagen IV. The reference skin tissue and the skin tissue can be from a same individual or from different individuals.

[0218] Methods of measurement of elastin and / or collagen are well-known. For example, elastin can be measured by immunoassay for desmosine. Collagen can be measured by hydroxyproline measurement (hydroxyproline is a signature amino acid for fibrillar collagens and comprises approximately 13.5%of the protein) . Total protein is a useful denominator to normalize elastin or collagen levels in tissues or in cells. Protein levels can be rapidly measured with high throughput from an amino acid hydrolysate using a simple colorimetric assay in a convenient 96-well plate format (Starcher, 2001) . Also see, e.g., Stoilov et al., “Chapter 7 -Measurement of elastin, collagen, and total protein levels in tissues, ” Methods in Cell Biology. Volume 143, 2018, Pages 133-146; the content of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0219] The biomarkers described herein can be detected and / or measured using any methods known in the art, such as RNA and / or protein expression tests, DNA methylation assays, and functional assays. Such methods include but are not limited to, northern blot, RNA sequencing (RNA-Seq) , RT-qPCR, RNA-fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) , western blot, mass spectrometry (MS) , immunofluorescence (IF) , reporter assay (in vitro or in cell) , signal transduction assay, etc.

[0220] Any cellular senescence assay can be used herein, such as colorimetric assay (e.g., SA-β-gal assay) , fluorescent assay (e.g., C12FDG or CellEvent Senescence Green Reagent, which function as fluorescent β-gal substrate) , or flow cytometry (e.g., using a combination of antibody markers such as p16ARF and p21) .

[0221] Any apoptosis assay can be used herein, includes but is not limited to, Annexin V assays, DNA condensation and fragmentation (TUNEL) assays, Caspase activation and detection assays, mitochondrial membrane potential-dependent dyes, Cytochrome C release assays, glutathione assays, etc. See, e.g., “Apoptosis assays and markers guide, ” abcam, at abcam. com / kits / apoptosis-assays, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0222] Any ferroptosis assay can be used herein, includes but is not limited to, measuring ferroptotic response related to iron and / or lipid metabolism (e.g., lipid ROS) , such as Prussian blue staining, Mito-FerroGreen, fluorescent probes Ferrum 430, Ferrum 560, and Ursa 520-R, green fluorescent heavy metal indicator Phen Green SK, FIP-1 (an endoperoxide reactivity-based fluorescence resonance energy transfer probe) , staining TFRC with antibodies (e.g., 3F3-FMA) , fluorometric probes C11-BODIPY, Click-It LAA and LiperFluo, fluorescent probes MitoPerOx, MitoPeDPP and MitoCLox, monoclonal antibodies specific for HMOX1, SAT1, MDA, or 4HNE. See, e.g., Chen et al., Front Cell Dev Biol. 2021: 9: 637162; Tang et al., Cell Res. 2021; 31 (2) : 107-125; the contents of each of which are incorporated herein by reference in entire entirety.

[0223] Any ER stress assay can be used herein, includes but is not limited to, electron microscopy (e.g., detecting ER lumen dilation) , real-time redox measurements during ER stress (e.g., using eroGFP (ER-targeted redox-sensitive GFP) ) , detection of accumulation of misfolded and unfolded proteins in the ER, etc. ER stress can be detected using Thioflavin T (ThT) , which is a tiny molecule that exhibits enhanced fluorescence on binding to protein aggregates. The enhanced ThT-fluorescence correlates directly with proven indicators of UPR (unfolded protein response)  activation. ER stress can also be detected indirectly by measuring the levels of specific UPR factors. Commonly measured indicators of UPR activation include: phosphorylated PERK, phosphorylated eIF2α, Gadd153 / CHOP, ATF4, Grp78 / BiP, Grp94, calreticulin, and protein disulphide isomerase (PDI) . These are usually detected by immunoblot or immunohistochemistry. See, e.g., Oslowski and Urano, Methods Enzymol. 2011; 490: 71–92, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0224] EpiAge is measured by age-associated changes of a collection of DNA methylation sites (e.g., clock CpGs, or age-associated CpG sites) whose aggregate methylation status (e.g., weighted methylation average) measures biological age. Different EpiAge models use different sets of methylation sites and different weighting algorithms. While Horvath’s clock is the most popular model, any EpiAge model can be used herein, such as Levine’s clock, Hannum’s clock, or AltumAge (see, e.g., Lucas Paulo de Lima Camillo et al., NPJ Aging. 2022; 8 (1) : 4; Horvath and Raj, Nat Rev Genet. 2018; 19 (6) : 371-384; the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety) . Methods of detecting and / or measuring DNA methylation are well-known, include but are not limited to, methylation microarray, Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) , Tagmentation-based Indexing for Methylation Sequencing (TIME-Seq; Griffin et al., bioRxiv. 2021) , bisulfite barcoded amplicon sequencing (BBA-seq) , pyrosequencing, droplet digital PCR (ddPCR) , etc. Also see methods described in Han et al., BMC Biol. 2020; 18: 71; Kurdyukov and Bullock, Biology (Basel) . 2016; 5 (1) : 3; the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[0225] In some embodiments, morphological characteristic (s) and / or histology of the skin cell and / or skin tissue is used to assess the therapeutic or prophylactic effects of the skin rejuvenation methods (or treatment or prevention methods) or LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein. Such methods include but are not limited to, tissue biopsy, immunohistochemical staining, immunofluorescence, light microscopy, transmission electron microscopy, etc. For example, fibroblasts have an elongated spindle or stellate shape with a multitude of cytoplasmic projections. Skin fibroblasts have very distinct phenotypes compared to iPSCs (see FIG. 57) . See Agarwal and Krishnamurthy. “Histology, Skin, ” StatPearls. 2023 May; Dick et al., “Histology, Fibroblast, ” StatPearls. 2023 May; Moroki, J Toxicol Pathol. 2023 Apr.; 36 (2) : 85-94; the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[0226] Depending on therapeutic or prophylactic use, an effective amount of the LLPS-deficient engineered reprogramming factor described herein (or a composition thereof) is an amount which, upon administration to a population of skin cells, a skin tissue, or an individual, achieves one or more of the therapeutic or prophylactic effects, biomarkers, and / or morphological characteristics described above. For example, the effective amount can prevent or reduce one or more signs of skin aging or damage, e.g., inflammation, epidermal hyperplasia, dermal elastosis and matrix protein degradation, perivenular lymphohistiocytic dermal infiltrates, and the formation of wrinkles (e.g., fine wrinkles) . The effective amount to be administered to a skin tissue or an individual is typically based on a variety of factors including age, sex, surface area, weight, and conditions of the skin. Body surface area may be approximately determined from height and weight of the individual. See, e.g., Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, N. Y., 1970, 537. Effective doses will vary, as recognized by those skilled in the art, dependent on route for administration, excipient usage, and the possibility of co-usage with other treatments such as usage of other wrinkle or scar reducing agents, wound healing agents, or cosmetic or dermatological procedure. An experimental animal can be used in a method of determining an effective amount of the LLPS-deficient engineered reprogramming factor (or a composition thereof) .

[0227] Engineered reprogramming factors that are deficient in LLPS

[0228] The present application in one aspect provides engineered reprogramming factors that are deficient in LLPS (also referred to herein as “engineered reprogramming factor” or “LLPS-deficient engineered reprogramming factor” ) . Any of the engineered reprogramming factors provided herein can be used in the rejuvenation methods (or treatment or prevention methods) described herein.

[0229] Any engineered reprogramming factors that are deficient in LLPS (e.g., reducing at least about 50%LLPS, such as reducing at least about any of 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%LLPS) are encompassed and can be used herein. Deficiency in LLPS in some embodiments comprises deficieny in forming a condensate, such as deficieny in forming any condensate. Deficiency in LLPS in some embodiments comprises deficiency in forming a condensate comprising the same condensate components compared to that formed by a corresponding wilde-type reprogramming factor. For example, a wild-type OCT4 may form a condensate with both wild-type SOX2 and wild-type KLF4; while an LLPS-deficient engineered  OCT4 may form a condensate with only wild-type SOX2, but wild-type KLF4 is not within the condensate. In some embodiments, the LLPS-deficient engineered reprogramming factor does not reprogram a population of skin cells into reprogrammed stem cells (or iPSCs) , such as by retaining the reprogramming of the population of skin cells at the initiation phase (IPR) .

[0230] Any methods known in the art that can detect LLPS or condensate formation can be used herein to determine whether an engineered reprogramming factor is LLPS-deficient, or whether a mutation to a reprogramming factor causes LLPS-deficiency. See, e.g., Basturea, G.N. ( “Biological Condensates, ” MATER METHODS 2019; 9: 2794) and Alberti et al. (J Mol Biol. 2018; 430 (23) : 4806–4820) for exemplary methods (the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety) , such as imagining technique, such as microscopy (e.g., fluorescent microscopy) . LLPS or condensate formation of an engineered reprogramming factor can be detected in vitro or in cells. For example, the engineered reprogramming factor can comprise a detectable characteristic, such as fluorescent characteristic. In some embodiments, the engineered reprogramming factor comprises a label, such as a fluorescent label. In some embodiments, the engineered reprogramming factor is further labeled with a detection tag, such as a fluorescein, a fluorescent polypeptide (e.g., GFP) , or a radioisotope label. In some embodiments, the label or tag does not affect the engineered reprogramming factor’s action and / or activity in association / dissociation with one or more biomolecules (e.g., DNA, other condensate protein component, or other protein to form a condensate) or a condensate. In some embodiments, the engineered reprogramming factor or a condensate comprising thereof is detected using an antibody that specifically recognizes the engineered reprogramming factor, or a label / tag of the engineered reprogramming factor. The antibody can have a fluorescent label, or can be detected using a secondary antibody that has a fluorescent label. In some embodiments, the deficiency in LLPS of the engineered reprogramming factor with another condensate component (e.g., DNA or another protein) is examined by detecting whether there is co-localization of the engineered reprogramming factor and the other condensate component, such as using fluorescent imaging technique. The dynamic nature of LLPS or condensates can be examined via FRAP.

[0231] In some embodiments, the imaging technique comprises any one or more of immunofluorescence (IF) , in situ hybridization (ISH, such as FISH) , gene fusion (e.g., GFP labeling) , or a dye that is specific for the engineered reprogramming factor. In some embodiments, the imaging technique comprises use of an agent to visualize a cellular feature, such as a cell  membrane or an organelle, such as nucleus (e.g., by DAPI staining) . In some embodiments, the imaging technique further comprise measuring (such as quantifying) a signal of the detectable reagent. The microscopy technique can be one or more of: confocal microscopy, fluorescence microscopy, high-resolution microscopy, stimulated emission depletion (STED) microscopy, SoRa super-resolution spinning-disk microscopy, electron microscopy (such as cryo-EM or cryo-ET) , and / or a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.

[0232] In some embodiments, there is provided an engineered reprogramming factor, which comprises a mutation (e.g., one or more mutations, such as insertion, deletion, and / or substitution) in an LLPS-related domain in reference to a corresponding wild-type reprogramming factor. The mutation can be in any LLPS-related domain, such as selected from the group consisting of an intrinsically disordered region (IDR) , an activation domain (AD) , a region outside of DNA-binding domain (DBD) , an ubiquitination site, or any combination thereof. Mutations in other domains are also comtemplated by the subject application, as long as such mutations can reduce (e.g., reducing at least about 50%LLPS, such as reducing at least about any of 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or more LLPS) or abolish LLPS of the reprogramming factor. The mutation can comprises one or more of: (i) substituting a charged amino acid (e.g., an acidic amino acid such as D or E, or a basic amino aicd such as K, R, or H) within the IDR or AD with a neutral amino acid (e.g., Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Pro, Met, Trp, Tyr, Ser, Thr, Cys, Gln, or Asn, such as A) ; (ii) substituting an amino acid that can be ubiquitinated (e.g., S, T, or K, such as K) with an amino acid that cannot be ubiquitinated (e.g., R) ; (iii) deleting an amino acid that can be ubiquitinated (e.g., S, T, or K, such as K) ; (iv) deleting an amino acid (e.g., a charged amino acid, such as an acidic amino acid (e.g., D or E) or a basic amino aicd (e.g., K, R, or H) ) within the IDR or AD; and / or (v) deleting an amino acid (e.g., a charged amino acid, such as an acidic amino acid (e.g., D or E) or a basic amino aicd (e.g., K, R, or H) ) within a region outside of DBD. In some embodiments, the amino acid to be deleted comprises an acidic amino acid (e.g., D or E) . In some embodiments, substituting a charged amino acid within the IDR or AD with a neutral amino acid comprises substituting an acidic amino acid (e.g., D or E) within the IDR or AD with a neutral amino acid (e.g., A) . In some embodiments, the amino acid that can be ubiquitinated is K. In some embodiments, the engineered reprogramming factor does not comprise a mutation in IDR. In some embodiments, the engineered reprogramming factor does not comprise a mutation in DBD.

[0233] In some embodiments, the mutation that causes LLPS-deficiency of the engineered reprogramming factor comprises a partial or full deletion, such as partial or full deletion of an LLPS-related domain. In some embodiments, the mutation is a partial or full deletion of an IDR and / or AD, such as partial deletion of charged amino acids in the IDR. In some embodiments, the mutation is a terminal deletion, such as partial or full deletion of the N-terminal domain and / or C-terminal domain of a wild-type reprogramming factor. In some embodiments, the N-terminal domain and / or C-terminal domain of the wild-type reprogramming factor comprises an IDR and / or an AD. In some embodiments, the mutation is a partial or full deletion of the middle part of the wild-type reprogramming factor. In some embodiments, the middle part of the wild-type reprogramming factor comprises an IDR and / or an AD. In some embodiments, the mutation is a partial or full deletion of regulatory region (s) of a wild-type reprogramming factor, such as partial or full deletion of lysine (s) , which can undergo ubiquitination modification, or partial or full deletion of other amino acid (s) that contribute to LLPS.

[0234] In some embodiments, the engineered reprogramming factor comprises (or further comprises) a mutation (e.g., insertion, deletion, and / or substitution) in the DBD. In some embodiments, the mutation in the DBD doest not affect, or affects at most about 10% (e.g., at most about any of 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 2%, 1%, or less) of, the DNA-binding activity (e.g., affinity and / or specificity) of the engineered reprogramming factor.

[0235] In some embodiments, the DBD is in the middle of a wild-type reprogramming factor, hence the region outside of DBD can be at N-terminus and / or C-terminus of the wild-type reprogramming factor. In some embodiments, the DBD is at the N-terminus of a wild-type reprogramming factor, hence the region outside of DBD is C-terminal to the DBD or at the C-terminus of the wild-type reprogramming factor. In some embodiments, the DBD is at the C-terminus of a wild-type reprogramming factor, hence the region outside of DBD is N-terminal to the DBD or at the N-terminus of the wild-type reprogramming factor. In some embodiments, the the DBDs are at both the N-terminus and C-terminus of a wild-type reprogramming factor, hence the region outside of DBD (s) is C-terminal to the N-terminal DBD and N-terminal to the the C-terminal DBD, such as in the middle of a wild-type reprogramming factor.

[0236] DBDs can be identified by many methods known in the art. Experimental approaches include but are not limited to, electrophoretic mobility-shift assay (EMSA) , DNase I footprinting,  exonuclease III footprinting, southwestern blotting, DNA pull-down assay, reporter assay, microplate capture and detection assay, X-ray crystallography, and nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) . Computational or database methods can also be used, such as DP-Bind, DeepDISE, DNAbinder, DNABIND, DRNApred, GraphSite, DBS-pred, DBS-PSSM, BindN, DNABindR, DISIS, BindN-RF, DBindR, DBD-Threader, ProteDNA, BindN+, NAPS, MetaDBSite, DNABR, TargetS, SNBRFinder, DisoRDPbind, DQPred-DBR, TargetDNA, PRODNA, DRNApred, PDRLGB, ENSEMBLE-CNN, NucBind, hybridNAP, DNAPred, ProNA2020, NCBRPred, MTDsite, DNAgenie, DeepDISOBind, HybridDBRpred, PDNAsite, RANSFAC, JASPAR, PROSITE, Pfam, and SMART.

[0237] Activation domain (AD) or transactivation domain (TAD) is a transcription factor scaffold domain which contains binding sites for other proteins such as transcription coregulators. There are usually 4 clases of TADs: acidic domains, glutamine-rich domains, proline-rich domains, and isoleucine-rich domains. AD can be identified by many methods known in the art. Experimental approaches include but are not limited to, reporter assay, co-IP, tAD‐seq (Arnold et al., EMBO J. 2018; 37 (16) : e98896) , etc. Computational or database methods can also be used, such as ADpred, PADDLE, 9aaTAD Prediction Tool, etc.

[0238] Protein regions which lack stable three-dimensional structures are referred to as IDRs. IDRs can be inferred from sequence features (see, e.g., Lu et al., PLoS Comput Biol. 2022; 18 (6) : e1010238; Trivedi and Nagarajaram, Int J Mol Sci. 2022; 23 (22) : 14050; R. van der Lee et al., Chem Rev. 2014; 114 (13) : 6589–6631; the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety) . IDRs are usually enriched with charged and polar amino acids and depleted in bulky hydrophobic residues, leading to a weakened hydrophobic effect, which is usually the main drive for the folding of polypeptides into their compact tertiary structure (natively folded state) . Methods to identify IDRs are well-known and can all be used herein. Computational methods for identifying IDRs can be divided into three categories: (1) Physicochemical-based methods, such as FoldIndex, GlobPlot, IUPred, FoldUnfold, and IsUnstruct, which rely on the amino acid physiochemical properties for identifying disorder. (2) Machine learning-based methods-for instance, DISvgg, RFPR-IDP, IDP-Seq2Seq, SPOT-Disorder, SPOT-Disorder2, DISOPRED3, SPINE-D, ESpritz, BVDEA, POODLE-S, RONN, and PONDRs-which treat the identification of IDRs as labeling each amino acid of a protein sequence or as a classification problem. (3) Meta methods, including MFDp, MetaPrDOS, and Meta-Disorder predictor, which  fuse multiple predictors to yield the final prediction for IDRs. Other computing techniques can also be used, e.g., VSL2, VSL2B, IUPred2, ANCHOR2, DisEMBL, DISOPRED, and IUPred. Experimental methods used to detect IDRs include X-ray crystallography, NMR, small-angle X-ray scattering, circular dichroism and  resonance energy transfer.

[0239] Negatively charged IDRs of reprogramming factors may contribute to LLPS. IDR region within a reprogramming factor can be predicted by an algorithm that provides a Disorder Score. A region with a Disorder Score greater than a certain value has a high probability of being IDR. Using human OCT4 as an example, VSL2 was used as an algorithm to predict the IDR. A continuous region with a Disorder Score greater than a certain value has a high probability of being IDR -the value is not particularly limited, but can be in the range of 0.4-0.6, preferably 0.5. The exemplary prediction results of OCT4 showed that the IDR of OCT4 distributed in the activation domain (AD) at both ends of the protein, and more specifically, at amino acid residues 1-140 and 288-360; while the intermediate DBD did not belong to IDR. Alternative scoring criteria may also be used, such as IUPred2 and ANCHOR2. All scoring algorithm and criteria can be used herein, as long as they can be used for predictive scoring of the IDR. For example, as inventors predicted, the IDR prediction obtained by a variety of scoring criteria was the same (within an error range) .

[0240] Ubiquitination site identification methods are well-known in the art. Biochemical approaches can be used, such as immunoblotting using anti-Ub antibodies. If the immunoblotting result suggests ubiquitination on the substrates, the putative ubiquitinated lysine is further mutated and analyzed by immunoblotting to evaluate whether the mutated lysine is ubiquitinated or not. Ubiquitination sites can also be identified by MS through the detection of peptide adducts derived from ubiquitin. Other methods of profiling ubiquitination sites include but are not limited to, Ub tagging-based approach, anti-diGly antibody-based approach, UbiSite antibody-based approach, antibody-free approach (e.g., Ub COmbined FRActional DIagonal Chromatography (COFRADIC) , StUbEx PLUS) , etc. Computational methods can also be used, e.g., ESA-UbiSite, HUbipPred. Also see exemplary methods in, e.g., M. Pourmirzaei et al., BMC Bioinformatics. 2023 Nov; 24 (1) : 449; Sun and Zhang, Cell Biosci. 2022; 12: 126; the contens of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[0241] When amino acids are modified by polyubiquitin, the polyubiquitin chains may mediate LLPS. Substituting an amino acid that can be ubiquitinated (e.g., K) with an amino acid that cannot  be ubiquitinated (e.g., R) shall not produce polyubiquitin modification, hence avoiding LLPS. Any other mutations that can reduce or abolish ubiquitination modification of the reprogramming factors can also be used herein.

[0242] Any transcription factor that can reprogram (partial or complete) a cell can be used herein as the wild-type or reference reprogramming factor. The wild-type reprogramming factor can be from a family selected from the group consisting of OCT family, SOX family, KLF family, MYC family, LIN28 family, NANOG family, and GLIS family. In some embodiments, the wild-type reprogramming factor is selected from the group consisting of OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, L-MYC, LIN28, NANOG, and GLIS1. Other exemplary reprogramming factors that can be used herein or as reference reprogramming factors include DPPA2, DPPA4, ESRRB, GDF3, KLF2, KLF5, LMYC, NMYC, NR5A1, NR5A2, RCOR2, SALL1, SALL4, SOX1, SOX3, TDRD12, TET1, TH2A, TH2B, UTF1, ZFP42, MDM2, CyclinD1, SV40 large T antigen, SIRT6, TCL1A, and RARγ.

[0243] The engineered reprogramming factor can be from any source, include but are not limited to, human, bovine, horse, sheep, feline, canine, rodent (e.g., rat, mouse, rabbit) , avian (e.g., chicken) , and non-human primate (e.g., monkey) . In some embodiments, the engineered reprogramming factor is a human engineered reprogramming factor. In some embodiments, the engineered reprogramming factor is a mouse engineered reprogramming factor.

[0244] OCT

[0245] Oct family is a family of octamer ( “Oct” ) transcription factors which play a crucial role in maintaining pluripotency. Oct reprogramming factor herein refers to any naturally occurring member of the Oct family, or a functional variant thereof which maintains at least about 50% (e.g., at least about any of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 100%) reprogramming activity of the corresponding wild-type Oct reprogramming factor. In some embodiments, an Oct reprogramming factor variant contains at least the DBD of the corresponding wild-type Oct reprogramming factor, and can further contain an AD. Exemplary Oct reprogramming factors include Oct-1, Oct-2, Oct-3 / 4, Oct-6, Oct-7, Oct-8, Oct-9, and Oct-11.

[0246] POU5F1 (POU domain, class 5, transcription factor 1) also known as Oct3 / 4 is one representative of Oct family. The absence of Oct3 / 4 in Oct-3 / 4+ cells, such as blastomeres and embryonic stem cells, leads to spontaneous trophoblast differentiation, and presence of Oct-3 / 4  thus gives rise to the pluripotency and differentiation potential of embryonic stem cells. Exemplary Oct3 / 4 proteins are the proteins encoded by the murine Oct3 / 4 gene (Genbank accession number NM_013633) and the human Oct3 / 4 gene (Genbank accession number NM_002701) .

[0247] The terms “Oct3 / 4” , “Oct4, ” “OCT4, ” “Oct4 protein, ” “OCT4 protein” and the like refer to any of the naturally-occurring forms of the Octomer 4 transcription factor, or variants thereof that maintain Oct4 transcription factor activity (e.g. at least about any of 50%, 80%, 90%, or 100%activity compared to wildtype Oct4 as measured by methods known in the art) . In some embodiments, an OCT4 variant has at least about 85% (e.g., at least about any of 90%, 95%, 99%, or more) amino acid sequence identity across the whole sequence compared to the naturally occurring Oct4 polypeptide. In some embodiments, the Oct4 protein is the protein as identified by the Genbank reference ADW77327.1.

[0248] In some embodiments, the LLPS-deficient engineered reprogramming factor is an engineered OCT4, such as engineered human OCT4 or engineered mouse OCT4.

[0249] In some embodiments, the human wild-type OCT4 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, there is provided an engineered OCT4 that comprises a mutation (e.g., one or more mutations, such as deletion, insertion, and / or substitution) in the IDR (s) in reference to SEQ ID NO: 2. The IDR of OCT4 can be identified using any methods known in the art or described herein, such as VSL2. The IDR of wild-type OCT4 can account for about 38%to about 40%of the total sequence of SEQ ID NO: 2 at the N-terminus, and / or account for about 19%to about 24%of the total sequence of SEQ ID NO: 2 at the C-terminus. In some embodiments, the IDR of OCT4 is at amino acid positions 1-140 and 288-360 (can have a margin of error of about 10 to about 20 amino acids) in reference to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the DBD of OCT4 is at amino acid positions 141-287 (can have a margin of error of about 10 to about 20 amino acids) in reference to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, there is provided an engineered OCT4 that comprises a mutation (e.g., deletion, insertion, and / or substitution) at amino acid positions 1-140 and / or 288-360, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the human wild-type OCT4 is GFP-tagged, e.g., encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO:109.

[0250] In some embodiments, there is provided an engineered OCT4 that comprises a substitution in reference to SEQ ID NO: 2, wherein the substitution comprises substituting a polar amino acid (charged or uncharged, e.g., D, E, R, K, H, S, T, N, Q, C, Y) with a neutral amino acid (e.g., Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Pro, Met, Trp, Tyr, Ser, Thr, Cys, Gln, or Asn, such as A) . In some embodiments, there is provided an engineered OCT4 that comprises a substitution in reference to SEQ ID NO: 2, wherein the substitution comprises substituting a charged amino acid (e.g., an acidic amino acid, such as D or E, or a basic amino acid, such as R, K, or H) with a neutral amino acid (e.g., A) . In some embodiments, the substitution comprises substituting an acidic amino acid (e.g., D or E) in reference to SEQ ID NO: 2 to a neutral amino acid (e.g., A) . In some embodiments, the substitution comprises substituting an acidic amino acid (e.g., D or E) in the IDR(s) in reference to SEQ ID NO: 2 to a neutral amino acid (e.g., A) . In some embodiments, there is provided an engineered OCT4 that comprises a substitution (e.g., substituting to a neutral amino acid, such as A) at an amino acid position selected from the group consisting of 8, 20, 26, 31, 56, 68, 91, 96, 98, 104, 108, 113, 125, 127, 130, 134, 135, 138, 145, 147, 166, 188, 209, 210, 215, 224, 238, 246, 270, 272, 291, 296, 297, 299, 341, and 343, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises a substitution (e.g., substituting to a neutral amino acid, such as A) at an amino acid position selected from the group consisting of 8, 20, 26, 31, 56, 68, 91, 96, 98, 104, 108, 113, 125, 127, 130, 134, 135, 138, 291, 296, 297, 299, 341, and 343, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises a substitution (e.g., substituting to a neutral amino acid, such as A) at an amino acid position selected from the group consisting of D8, D20, E26, D31, E56, E68, E91, E96, E98, E104, D108, E113, E125, E127, E130, E134, E135, D138, D291, E296, D297, E299, E341, and E343, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the substitution comprises substituting a D or E with an A. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises a substitution selected from the group consisting of D8A, D20A, D31A, D108A, E134A, D138A, D291A, or any combination thereof, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, there is provided an engineered OCT4 that comprises a substitution in reference to SEQ ID NO: 2, wherein the substitution is selected from the group consisting of: (i) D8A, D20A, E26A, D31A, E56A, E68A, E91A, E96A, E98A, E104A, D108A, E113A, E125A, E127A, E130A, E134A, E135A, D138A, D291A, E296A, D297A, E299A, E341A, and E343A; (ii) D8A, D20A,  E26A, D31A, E56A, E68A, E91A, E96A, E98A, E104A, D108A, E113A, E125A, E127A, E130A, E134A, E135A, and D138A; (iii) D291A, E296A, D297A, E299A, E341A, and E343A; (iv) D8A, D20A, E26A, D31A, E56A, E68A, E91A, E96A, E98A, E104A, D108A, E113A, E125A, E127A, E130A, E134A, D138A, D291A, E296A, E299A, E341A, and E343A; (v) E134A, E135A, E296A, and D297A; (vi) D8A, D20A, D31A, D108A, D138A, D291A, and D297A; and (vii) E26A, E56A, E68A, E91A, E96A, E98A, E104A, E113A, E125A, E127A, E130A, E134A, E135A, E296A, E299A, E341A, and E343A. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 4-10, or a variant thereof having at least about 85% (e.g., at least about any of 90%, 95%, 99%, or more) sequence identity to any of SEQ ID NOs: 4-10. In some embodiments, the engineered OCT4 is encoded by a nucleic acid seuqnece of SEQ ID NO: 3.

[0251] In some embodiments, there is provided an engineered OCT4 that comprises a deletion (partial or complete) of the IDR (s) in reference to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises a deletion at amino acid positions 2-140 and / or 288-360, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises a deletion selected from the group consisting of: (i) a deletion at amino acid positions 2-140 and 301-360; (ii) a deletion at amino acid positions 301-360; and (iii) a deletion at amino acid positions 2-140. In some embodiments, the engineered OCT4 comprises an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 44-46, or a variant thereof having at least about 85% (e.g., at least about any of 90%, 95%, 99%, or more) sequence identity to any of SEQ ID NOs: 44-46. In some embodiments, the engineered OCT4 is GFP-tagged, e.g., encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 110.

[0252] In some embodiments, the mouse wild-type OCT4 (MsOCT4) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66, or is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 67. In some embodiments, there is provided an engineered mouse OCT4 (MsOCT4mut) that comprises a mutation (e.g., one or more mutations, such as deletion, insertion, and / or substitution) in the IDR (s) in reference to SEQ ID NO: 66. The IDR of MsOCT4 can be identified using any methods known in the art or described herein, such as VSL2. In some embodiments, the IDR of MsOCT4 is at amino acid positions 1-140 and 280-352 (can have a margin of error of about 10 to about 20 amino acids) in reference to SEQ ID NO: 66. In some embodiments, the DBD of MsOCT4 is at amino acid positions 141-279 (can have a margin of error of about 10 to about 20 amino acids) in  reference to SEQ ID NO: 66. In some embodiments, there is provided an engineered MsOCT4 that comprises a mutation (e.g., deletion, insertion, and / or substitution) at amino acid positions 1-140 and / or 280-352, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 66.

[0253] In some embodiments, there is provided an engineered MsOCT4 that comprises a substitution in reference to SEQ ID NO: 66, wherein the substitution comprises substituting a polar amino acid (charged or uncharged, e.g., D, E, R, K, H, S, T, N, Q, C, Y) with a neutral amino acid (e.g., Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Pro, Met, Trp, Tyr, Ser, Thr, Cys, Gln, or Asn, such as A) . In some embodiments, there is provided an engineered MsOCT4 that comprises a substitution in reference to SEQ ID NO: 66, wherein the substitution comprises substituting a charged amino acid (e.g., an acidic amino acid, such as D or E, or a basic amino acid, such as R, K, or H) with a neutral amino acid (e.g., A) . In some embodiments, the substitution comprises substituting an acidic amino acid (e.g., D or E) in reference to SEQ ID NO: 66 to a neutral amino acid (e.g., A) . In some embodiments, the substitution comprises substituting an acidic amino acid (e.g., D or E) in the IDR(s) in reference to SEQ ID NO: 66 to a neutral amino acid (e.g., A) . In some embodiments, there is provided an engineered MsOCT4 that comprises a substitution (e.g., substituting to a neutral amino acid, such as A) at an amino acid position selected from the group consisting of D8, D19, E25, D30, E51, E63, E86, E91, E99, E103, E108, D112, E120, E123, E127, E128, D131, E284, E289, E290, E292, E333, and E335, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 66. In some embodiments, the engineered MsOCT4 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68, or a variant thereof having at least about 85% (e.g., at least about any of 90%, 95%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 68. In some embodiments, the engineered MsOCT4 is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 69.

[0254] In some embodiments, there is provided an engineered MsOCT4 that comprises a deletion (partial or complete) of the IDR (s) in reference to SEQ ID NO: 66. In some embodiments, the engineered MsOCT4 comprises a deletion at amino acid positions 2-140 and / or 280-352, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 66. In some embodiments, the engineered MsOCT4 comprises a deletion at amino acid positions 324-326 in reference to SEQ ID NO:66. In some embodiments, the engineered MsOCT4 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70, or a variant thereof having at least about 85% (e.g., at least about any of 90%, 95%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 70. In some embodiments, the engineered MsOCT4 is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 71.

[0255] MYC

[0256] Factors of the Myc family are factors encoded by myc proto-oncogenes implicated in cancer. c-Myc was shown to be a factor implicated in the generation of mouse iPSCs and of human iPSCs. Exemplary c-Myc proteins are the proteins encoded by the murine c-myc gene (Genbank accession number NM_010849) and the human c-myc gene (Genbank accession number NM_002467) . N-Myc or L-myc was also used as possible reprogramming factor replacing c-Myc. N-Myc or L-myc can also been used as a possible reprogramming factor to replace c-Myc. Myc reprogramming factor herein refers to any naturally occurring member of the Myc family, or a functional variant thereof which maintains at least about 50% (e.g., at least about any of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 100%) reprogramming activity of the corresponding wild-type Myc reprogramming factor.

[0257] The terms “c-Myc, ” C-MYC, ” “c-Myc protein” , “C-MYC protein” and the like as referred to herein includes any of the naturally-occurring forms of the cMyc transcription factor, or variants thereof that maintain cMyc transcription factor activity (e.g. within at least about any of 50%, 80%, 90%or 100%activity compared to wildtype cMyc as measured by methods known in the art) . In some embodiments, a c-Myc variant has at least about 85% (e.g., at least about any of 90%, 95%, 99%, or more) amino acid sequence identity across the whole sequence compared to the naturally occurring c-Myc polypeptide. In some embodiments, the c-Myc protein is the protein as identified by the NCBI reference NP 002458.2.

[0258] In some embodiments, the LLPS-deficient engineered reprogramming factor is an engineered c-MYC, such as engineered human c-MYC or engineered mouse c-MYC.

[0259] In some embodiments, the human wild-type c-MYC comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, or is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, or 53. In some embodiments, the human wild-type c-MYC comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, or is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 86. In some embodiments, there is provided an engineered c-MYC that comprises a mutation (e.g., one or more mutations, such as deletion, insertion, and / or substitution) at a ubiquitination site (e.g., S, T, or K, such as K) in reference to SEQ ID NO: 12 or 85. The ubiquitination site (s) of c-MYC can be identified using any methods known in the art or described herein. In some embodiments, there is provided an engineered c-MYC that comprises a mutation (e.g., one or more mutations, such as deletion,  insertion, and / or substitution) in the IDR in reference to SEQ ID NO: 12 or 85. The IDR of c-MYC can be identified using any methods known in the art or described herein, such as VSL2. In some embodiments, the IDR of c-MYC is at amino acid positions 1-360 (can have a margin of error of about 10 to about 20 amino acids) in reference to SEQ ID NO: 12 or 85. In some embodiments, the DBD of c-MYC (bHLH-LZ domain) is at amino acid positions 361-439 (can have a margin of error of about 10 to about 20 amino acids) in reference to SEQ ID NO: 12 or 85. In some embodiments, the engineered c-MYC comprises a deletion at amino acid positions 2-360, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 12 or 85.

[0260] In some embodiments, there is provided an engineered c-MYC that comprises a substitution of an amino acid that can be ubiquitinated (e.g., S, T, or K, such as K) with an amino acid that cannot be ubiquitinated (e.g., R) , wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 12 or 85. In some embodiments, the substitution comprises substituting a K with an R.In some embodiments, the engineered c-MYC comprises a (e.g., one or more) substitution at an amino acid position selected from the group consisting of 51, 52, 126, 143, 148, 157, 206, 269, 275, 289, 298, 317, 323, 326, 341, 355, 371, 389, 392, 397, 398, 412, 422, 428, and 430, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 12 or 85. In some embodiments, 20 to 25 amino acid positions at any of 51, 52, 126, 143, 148, 157, 206, 269, 275, 289, 298, 317, 323, 326, 341, 355, 371, 389, 392, 397, 398, 412, 422, 428, and 430 in reference to SEQ ID NO: 12 or 85 are substituted. In some embodiments, the engineered c-MYC comprises a substitution selected from the group consisting of K51R, K52R, K148R, K275R, K289R, and K389R, or any combination thereof, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 12 or 85. In some embodiments, the engineered c-MYC comprises a substitution selected from the group consisting of: (i) K51R, K52R, K126R, K143R, K148R, K157R, K206R, K269R, K275R, K289R, K298R, K317R, K323R, K326R, K341R, K355R, K371R, K389R, K392R, K397R, K398R, K412R, K422R, K428R, and K430R; (ii) K148R; (iii) K389R; (iv) K148R and K389R; (v) K51R and K52R; (vi) K275R and K289R; and (vii) K51R, K52R, K275R, and K289R; wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 12 or 85. In some embodiments, the engineered c-MYC comprises an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14-20, or a variant thereof having at least about 85% (e.g., at least about any of 90%, 95%, 99%, or more) sequence identity to any of SEQ ID NOs: 14-20. In some embodiments, the engineered c-MYC is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13.

[0261] In some embodiments, there is provided an engineered c-MYC that comprises a deletion (partial or complete) of the IDR in reference to SEQ ID NO: 12 or 85. In some embodiments, the engineered c-MYC comprises a deletion at amino acid positions 2-360, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 12 or 85. In some embodiments, the engineered c-MYC comprises a deletion at amino acid positions 2-140 in reference to SEQ ID NO: 12 or 85. In some embodiments, the engineered c-MYC comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 or 48, or a variant thereof having at least about 85% (e.g., at least about any of 90%, 95%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 47 or 48.

[0262] In some embodiments, the engineered c-MYC comprises a substitution in the IDR in reference to SEQ ID NO: 12 or 85, wherein the substitution comprises substituting a polar amino acid (charged or uncharged, e.g., D, E, R, K, H, S, T, N, Q, C, Y) with a neutral amino acid (e.g., Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Pro, Met, Trp, Tyr, Ser, Thr, Cys, Gln, or Asn, such as A) . In some embodiments, the engineered c-MYC comprises a substitution in the IDR in reference to SEQ ID NO:12 or 85, wherein the substitution comprises substituting a charged amino acid (e.g., an acidic amino acid, such as D or E, or a basic amino acid, such as R, K, or H) with a neutral amino acid (e.g., A) . In some embodiments, the substitution comprises substituting an acidic amino acid (e.g., D or E) in the IDR in reference to SEQ ID NO: 12 or 85 to a neutral amino acid (e.g., A) . In some embodiments, the IDR in reference to SEQ ID NO: 12 or 85 is at amino acid positions 2-360.

[0263] In some embodiments, the mouse wild-type c-MYC (Ms c-MYC) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111. In some embodiments, the mouse wild-type c-MYC (Ms c-MYC) is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 112. In some embodiments, there is provided an engineered mouse c-MYC (Ms c-MYCmut) that comprises a mutation (e.g., one or more mutations, such as deletion, insertion, and / or substitution) in the IDR in reference to SEQ ID NO:111. The IDR of Ms c-MYC can be identified using any methods known in the art or described herein, such as VSL2. In some embodiments, the IDR of Ms c-MYC is at amino acid positions 1-360 (can have a margin of error of about 10 to about 20 amino acids) in reference to SEQ ID NO: 111. In some embodiments, there is provided an engineered Ms c-MYC that comprises a mutation (e.g., deletion, insertion, and / or substitution) at amino acid positions 2-360, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 111. In some embodiments, there is provided an engineered Ms c-MYC that comprises a mutation (e.g., one or more mutations, such as deletion, insertion, and / or substitution) at a ubiquitination site (e.g., S, T, or K, such as K) in reference to  SEQ ID NO: 111. The ubiquitination site (s) of Ms c-MYC can be identified using any methods known in the art or described herein. In some embodiments, the substitution comprises substituting a K with an R.

[0264] KLF

[0265] Klf family (or Krüppel-like family of transcription factors) refers to Klf genes initially identified as a factor for the generation of mouse iPSCs and also demonstrated to be a factor for generation of human iPSCs. Exemplary Klf4 proteins are the proteins encoded by the murine klf4 gene (Genbank accession number NM_010637) and the human klf4 gene (Genbank accession number NM_004235) . Exemplary Klf family members include Klf1, Klf2, Klf3, Klf-4, Klf5, Klf6, Klf7, Klf8, Klf9, Klf10, Klf11, Klf12, Klf13, Klf14, Klf15, Klf16, and Klf17. KLF reprogramming factor herein refers to any naturally occurring member of the Klf family, or a functional variant thereof which maintains at least about 50% (e.g., at least about any of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 100%) reprogramming activity of the corresponding wild-type Klf reprogramming factor.

[0266] The terms “KLF4, ” “KLF4 protein” and the like as referred to herein includes any of the naturally-occurring forms of the KLF4 transcription factor, or variants thereof that maintain KLF4 transcription factor activity (e.g. within at least about any of 50%, 80%, 90%or 100%activity compared to wildtype KLF4 as measured by methods known in the art) . In some embodiments, a KLF4 variant has at least about 85% (e.g., at least about any of 90%, 95%, 99%, or more) amino acid sequence identity across the whole sequence compared to the naturally occurring KLF4 polypeptide. In other embodiments, the KLF4 protein is the protein as identified by the NCBI reference NP 004226.3.

[0267] In some embodiments, the LLPS-deficient engineered reprogramming factor is an engineered KLF4, such as engineered human KLF4 or engineered mouse KLF4.

[0268] In some embodiments, the human wild-type KLF4 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or 87, or is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 21, 54, or 88. In some embodiments, there is provided an engineered KLF4 that comprises a mutation (e.g., one or more mutations, such as deletion, insertion, and / or substitution) in the IDR in reference to SEQ ID NO: 22. The IDR of KLF4 can be identified using any methods known in the art or described herein, such as VSL2. In some embodiments, the IDR of KLF4 is at amino acid positions 1-374 (can have a margin of error of about 10 to about 20 amino acids) in reference to SEQ ID NO: 22.  In some embodiments, the DBD of KLF4 is at amino acid positions 375-470 (can have a margin of error of about 10 to about 20 amino acids) in reference to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, there is provided an engineered KLF4 that comprises a mutation (e.g., deletion, insertion, and / or substitution) at amino acid positions 2-374, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the engineered KLF4 comprises a deletion at amino acid positions 2-374, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the engineered KLF4 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, or a variant thereof having at least about 85% (e.g., at least about any of 90%, 95%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 40.

[0269] In some embodiments, the engineered KLF4 comprises a substitution in the IDR in reference to SEQ ID NO: 22, wherein the substitution comprises substituting a polar amino acid (charged or uncharged, e.g., D, E, R, K, H, S, T, N, Q, C, Y) with a neutral amino acid (e.g., Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Pro, Met, Trp, Tyr, Ser, Thr, Cys, Gln, or Asn, such as A) . In some embodiments, the engineered KLF4 comprises a substitution in the IDR in reference to SEQ ID NO: 22, wherein the substitution comprises substituting a charged amino acid (e.g., an acidic amino acid, such as D or E, or a basic amino acid, such as R, K, or H) with a neutral amino acid (e.g., A) . In some embodiments, the substitution comprises substituting an acidic amino acid (e.g., D or E) in the IDR in reference to SEQ ID NO: 22 to a neutral amino acid (e.g., A) . In some embodiments, the IDR in reference to SEQ ID NO: 22 is at amino acid positions 2-374.

[0270] In some embodiments, the mouse wild-type KLF4 (MsKLF4) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72, or is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 73. In some embodiments, there is provided an engineered mouse KLF4 (MsKLF4mut) that comprises a mutation (e.g., one or more mutations, such as deletion, insertion, and / or substitution) in the IDR in reference to SEQ ID NO: 73. The IDR of MsKLF4 can be identified using any methods known in the art or described herein, such as VSL2. In some embodiments, the IDR of MsKLF4 is at amino acid positions 1-374 (can have a margin of error of about 10 to about 20 amino acids) in reference to SEQ ID NO: 73. In some embodiments, there is provided an engineered MsKLF4 that comprises a mutation (e.g., deletion, insertion, and / or substitution) at amino acid positions 2-374, such as partial or complete deletion of amino acids 2-374, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 73.

[0271] SOX

[0272] Sox family refers to Sox genes associated with maintaining pluripotency similar to Oct-3 / 4, although it is associated with multipotent and unipotent stem cells in contrast with Oct-3 / 4, which is exclusively expressed in pluripotent stem cells. SOX genes (SRY-related HMG-box genes) encode a family of transcription factors that bind to the minor groove in DNA, and belong to a super-family of genes characterized by a homologous sequence called the HMG-box (for high mobility group) . This HMG box is a DNA binding domain that is highly conserved throughout eukaryotic species. Homologues have been identified in insects, nematodes, amphibians, reptiles, birds and a range of mammals. Sox proteins (e.g., Sox1, Sox2, Sox3, Sox15, or Sox18) can be derived from human, mouse, rat, bovine, porcine, or other animals. SOX reprogramming factor herein refers to any naturally occurring member of the Sox family, or a functional variant thereof which maintains at least about 50% (e.g., at least about any of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 100%) reprogramming activity of the corresponding wild-type Sox reprogramming factor.

[0273] Exemplary Sox2 proteins are the proteins encoded by the murine Sox2 gene (Genbank accession number NM_011443) and the human Sox2 gene (Genbank accession number NM_003106) .

[0274] The terms “Sox2, ” “SOX2, ” “Sox2 protein, ” “SOX2 protein” and the like as referred to herein thus includes any of the naturally-occurring forms of the Sox2 transcription factor, or variants thereof that maintain Sox2 transcription factor activity (e.g. within at least about any of 50%, 80%, 90%or 100%activity compared to wildtype Sox2 as measured by methods known in the art) . In some embodiments, a SOX2 variant has at least about 85% (e.g., at least about any of 90%, 95%, 99%, or more) amino acid sequence identity across the whole sequence compared to the naturally occurring Sox2 polypeptide. In some embodiments, the Sox2 protein is the protein as identified by the NCBI reference NP 003097.1.

[0275] In some embodiments, the LLPS-deficient engineered reprogramming factor is an engineered SOX2, such as engineered human SOX2 or engineered mouse SOX2.

[0276] In some embodiments, the human wild-type SOX2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, or is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 23. In some embodiments, there is provided an engineered SOX2 that comprises a mutation (e.g., one or more mutations, such as deletion, insertion, and / or substitution) in the IDR (s) in reference to SEQ ID  NO: 24. The IDR (s) of SOX2 can be identified using any methods known in the art or described herein, such as VSL2. In some embodiments, the IDR of SOX2 is at amino acid positions 1-40 and 201-317 (can have a margin of error of about 10 to about 20 amino acids) in reference to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the DBD of SOX2 is at amino acid positions 41-200 (can have a margin of error of about 10 to about 20 amino acids) in reference to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, there is provided an engineered SOX2 that comprises a mutation (e.g., deletion, insertion, and / or substitution) at amino acid positions 2-40 and / or 201-317, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, there is provided an engineered SOX2 that comprises a deletion at: (i) amino acid positions 2-40, (ii) amino acid positions 201-317; or (iii) 2-40 and 201-317; wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the engineered SOX2 comprises an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 41-43, or a variant thereof having at least about 85% (e.g., at least about any of 90%, 95%, 99%, or more) sequence identity to any of SEQ ID NOs: 41-43.

[0277] In some embodiments, the engineered SOX2 comprises a substitution in the IDR (s) in reference to SEQ ID NO: 24, wherein the substitution comprises substituting a polar amino acid (charged or uncharged, e.g., D, E, R, K, H, S, T, N, Q, C, Y) with a neutral amino acid (e.g., Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Pro, Met, Trp, Tyr, Ser, Thr, Cys, Gln, or Asn, such as A) . In some embodiments, the engineered SOX2 comprises a substitution in the IDR (s) in reference to SEQ ID NO: 24, wherein the substitution comprises substituting a charged amino acid (e.g., an acidic amino acid, such as D or E, or a basic amino acid, such as R, K, or H) with a neutral amino acid (e.g., A) . In some embodiments, the substitution comprises substituting an acidic amino acid (e.g., D or E) in the IDR (s) in reference to SEQ ID NO: 24 to a neutral amino acid (e.g., A) . In some embodiments, the IDR (s) in reference to SEQ ID NO: 24 is at amino acid positions 1-40 and 201-317.

[0278] In some embodiments, the mouse wild-type SOX2 (MsSOX2) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74, or is encoded by a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 75. In some embodiments, there is provided an engineered mouse SOX2 (MsSOX2mut) that comprises a mutation (e.g., one or more mutations, such as deletion, insertion, and / or substitution) in the IDR (s) in reference to SEQ ID NO: 74. The IDR (s) of MsSOX2 can be identified using any methods known in the art or described herein, such as VSL2. In some embodiments, the IDR of MsSOX2 is at amino acid positions 1-40 and 203-319 (can have a margin of error of about 10 to about 20  amino acids) in reference to SEQ ID NO: 74. In some embodiments, the DBD of MsSOX2 is at amino acid positions 41-202 (can have a margin of error of about 10 to about 20 amino acids) in reference to SEQ ID NO: 74. In some embodiments, there is provided an engineered MsSOX2 that comprises a mutation (e.g., deletion, insertion, and / or substitution) at amino acid positions 2-40 and / or 203-319 such as partial or complete deletion of amino acids 2-40 and / or 203-319, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 74.

[0279] NANOG

[0280] Nanog is a transcription factor critically involved with self-renewal of undifferentiated embryonic stem cells. It helps embryonic stem cells (ESCs) maintain pluripotency by suppressing cell determination factors. In humans, this protein is encoded by the NANOG gene. Exemplary nanog is the protein encoded by murine gene (Genbank accession number XM_132755) and human Nanog gene (Genbank accession number NM_024865) . The human hNanog protein coded by the NANOG gene, consists of 305 amino acids and possesses 3 functional domains: the N-terminal domain, the C-terminal domain, and the conserved homeodomain motif (for DNA binding) . The homeodomain in hNANOG ranges from residues 95 to 155. There are also additional NANOG genes (NANOG2, NANOG p8) . Nanog reprogramming factor herein refers to any naturally occurring member of the Nanog family, or a functional variant thereof which maintains at least about 50% (e.g., at least about any of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 100%) reprogramming activity of the corresponding wild-type Nanog reprogramming factor.

[0281] The term “Nanog” or “nanog” and the like as referred to herein thus includes any of the naturally-occurring forms of the Nanog transcription factor, or variants thereof that maintain Nanog transcription factor activity (e.g. within at least about any of 50%, 80%, 90%or 100%activity compared to wildtype Nanog as measured by methods known in the art) . In some embodiments, a Nanog variant has at least about 85% (e.g., at least about any of 90%, 95%, 99%, or more) amino acid sequence identity across the whole sequence compared to the naturally occurring Nanog polypeptide. In some embodiments, the Nanog protein is the protein as identified by the NCBI reference NP_079141.

[0282] An LLPS-deficient engineered NANOG can comprise any of the mutations described herein that lead to LLPS deficiency. For example, partial or complete deletion of the N-terminal domain and / or the C-terminal domain outside of the DBD, substitution of a charged amino acid  (e.g., an acidic amino acid, such as D or E, or a basic amino acid, such as R, K, or H) with a neutral amino acid (e.g., A) , or a combination thereof.

[0283] LIN28

[0284] The LIN28 family of RNA-binding proteins promoting pluripotency has two members-LIN28A and LIN28B. Lin28 reprogramming factor herein refers to any naturally occurring member of the Lin28 family, or a functional variant thereof which maintains at least about 50%(e.g., at least about any of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 100%) reprogramming activity of the corresponding wild-type Lin28 reprogramming factor.

[0285] Lin28 or Lin-28 homolog A is a protein that is encoded by the LIN28 gene in humans. It is a marker of undifferentiated human embryonic stem cells and encodes a cytoplasmic mRNA-binding protein that binds to and enhances the translation of the IGF-2 (Insulin-like growth factor 2) mRNA. Lin28 has also been shown to bind to the let-7 pre-miRNA and block production of the mature let-7 microRNA in mouse embryonic stem cells. It is a factor in iPSCs generation, although it is not mandatory. Exemplary Lin28 is the protein encoded by murine gene (Genbank accession number NM_145833) and human Lin28 gene (Genbank accession number NM_024674) .

[0286] The term “Lin28” or “Lin28 homolog A” and the like as referred to herein thus includes any of the naturally-occurring forms of the Lin28 transcription factor, or variants thereof that maintain Lin28 transcription factor activity (e.g. within at least about any of 50%, 80%, 90%or 100%activity compared to wildtype Lin28 as measured by methods known in the art) . In some embodiments, a LIN28 variant has at least about 85% (e.g., at least about any of 90%, 95%, 99%, or more) amino acid sequence identity across the whole sequence compared to the naturally occurring Lin28 polypeptide. In other embodiments, the Lin28 protein is the protein as identified by the NCBI reference NP_078950.

[0287] Human LIN28 has an IDR at amino acid positions 1-31 and 178-209. An LLPS-deficient engineered LIN28 can comprise any of the mutations described herein that lead to LLPS deficiency. For example, partial or complete deletion of the IDR (s) , substitution of a charged amino acid (e.g., an acidic amino acid, such as D or E, or a basic amino acid, such as R, K, or H) with a neutral amino acid (e.g., A) , such as within the IDR (s) , or a combination thereof.

[0288] Nucleic acids, constructs, and carriers

[0289] In some embodiments, the engineered reprogramming factor is encoded by a nucleic acid (e.g., RNA or DNA) or a nucleic acid construct (e.g., RNA construct, such as circRNA, or DNA construct, such as viral or bacterial vector) . Hence also provided are nucleic acids (e.g., codon-optimized nucleic acids) and nucleic acid constructs that encode any of the LLPS-deficient engineered reprogramming factors described herein. In some embodiments, the nucleic acid comprises a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 13. In some embodiments, the nucleic acid comprises a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 69 or 71. The step of introducing into a population of cells (e.g., skin cells) an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS in the rejuvenation methods (or treatment or prevention methods) described herein also encompass introducing into a population of cells (e.g., skin cells) a nucleic acid that encodes an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS.

[0290] Any carriers or methods that can introduce the nucleic acids described herein into skin cells can be used herein. In some embodiments, the delivery of the nucleic acid (s) is viral delivery (e.g., AAV or lentivirus) . In some embodiments, the delivery of the nucleic acid (s) is non-viral delivery, such as lipofection, nucleofection, microinjection, biolistics, virosomes, liposomes, immunoliposomes, polycation or lipid: nucleic acid conjugates, electroporation, nanoparticles, exosomes, microvesicles, gene-gun, naked DNA, and artificial virions. Delivery using GalNAc conjugated linked delivery system, protamine, polymer, inorganic nanoparticle, or polymer matrix are also contemplated.

[0291] In some embodiments, the nucleic acid is an RNA (e.g., mRNA) , such as a circular RNA (circRNA) or a linear RNA (e.g., linear mRNA) . Circular mRNA has lower immunogenicity and higher stability than linear mRNA, and is suitable for long-term expression of encoded proteins in vivo. In some embodiments, the nucleic acid is comprised within a vector. In some embodiments, the nucleic acid (e.g., circRNA) is delivered by an exosome, a liposome, or a lipid nanoparticle (LNP) . In some embodiments, the nucleic acid is delivered by electroporation. In some embodiments, the mRNA comprises IRES. In some embodiments, the RNA may contain a sequence bound to L7Ae, TAT, etc., for enrichment of the RNA. In some embodiments, the RNA contains modification (s) . In some embodiments, the RNA is a self-amplifying mRNA.

[0292] In some embodiments, the nucleic acid is a DNA. In some embodiments, the nucleic acid is comprised within a vector, such as a viral vector. In some embodiments, the viral vector is selected from the group consisting of adeno-associated virus (AAV) vector, adenovirus vector, retrovirus vector, herpes simplex virus (HSV) vector, murine stem cell virus (MSCV) vector, Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) vector, human immunodeficiency virus (HIV) vector, bovine papilloma virus vector, lentiviral vector, vaccinia virus vector, and polyoma virus vector. In some embodiments, the viral vector is a lentiviral vector or an AAV vector. In some embodiments, the nucleic acid is delivered by a virus, e.g., lentivirus or AAV. In some embodiments, the nucleic acid is delivered by electroporation.

[0293] The term “vector” or “nucleic acid construct” as used herein refers to DNA or RNA molecules that comprise a coding nucleotide sequence that can be transcribed into RNAs or expressed into proteins. The present application also provides vectors or nucleic acid constructs in which a nucleic acid of the present application is inserted. The nucleic acid can be cloned into a number of types of vectors. For example, the nucleic acid can be cloned into a vector including, but not limited to a plasmid, a phagemid, a phage derivative, an animal virus, and a cosmid. Vectors of particular interest include expression vectors, replication vectors, probe generation vectors, and sequencing vectors.

[0294] In some embodiments, the vector comprises a promoter that is operably linked to the coding nucleotide sequence, such that the promoter controls the transcription or expression of the coding nucleotide sequence. A promoter may be positioned 5’ (upstream) of a coding nucleotide sequence under its control. The distance between the promoter and the coding sequence may be approximately the same as the distance between that promoter and the gene it controls in the gene from which the promoter is derived. As is known in the art, variation in this distance may be accommodated without loss of promoter function. In some embodiments, the vector comprises a 5’ UTR and / or a 3’ UTR that regulates the transcription or expression of the coding nucleotide sequence. In some embodiments, a suitable vector contains an origin of replication functional in at least one organism, a promoter sequence, convenient restriction endonuclease sites, and one or more selectable markers. (See, e.g., WO 01 / 96584; WO 01 / 29058; and U.S. Pat. No. 6,326,193) . Exemplary selectable markers can include, but are not limited to, peptide protein tags (e.g., FLAG-tag) , fluorescent tags, and antibiotic resistance cassettes. Both selectable markers and reporter genes may be flanked by appropriate regulatory sequences to enable expression in the target cells.  In some embodiments, the vector also comprises or encodes a Kozak sequence, a terminator sequence, a 5’ cap, a poly (A) tail, or WPRE.

[0295] Suitable vectors include, but are not limited to, nucleic acid molecules that are single-stranded, double-stranded, or partially double-stranded; nucleic acid molecules that comprise one or more free ends, no free ends (e.g., circular) ; nucleic acid molecules that comprise DNA, RNA, or both; and other varieties of polynucleotides known in the art. One type of vector is a “plasmid, ” which refers to a circular double stranded DNA loop into which additional DNA segments can be inserted, such as by standard molecular cloning techniques. Certain vectors are capable of autonomous replication in a host cell into which they are introduced (e.g., bacterial vectors having a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors) . Other vectors (e.g., non-episomal mammalian vectors) are integrated into the genome of a host cell upon introduction into the host cell, and thereby are replicated along with the host genome. Moreover, certain vectors are capable of directing the transcription or expression of coding nucleotide sequences to which they are operatively linked. Such vectors are referred to herein as “expression vectors” .

[0296] Recombinant expression vectors can comprise a nucleic acid of the invention in a form suitable for transcription or expression of the nucleic acid in a host cell (e.g., skin cell) . In some embodiments, the recombinant expression vector includes one or more regulatory elements, which may be selected on the basis of the host cells to be used for transcription or expression, which is operatively linked to the nucleic acid sequence to be transcribed or expressed. Within a recombinant expression vector, “operably linked” is intended to mean that the nucleotide sequence of interest is linked to the regulatory element (s) in a manner that allows for expression of the nucleotide sequence (e.g., in an in vitro transcription / translation system or in a host cell when the vector is introduced into the host cell) .

[0297] The expression vectors may contain a variety of elements for controlling expression, including without limitation, promoter sequences, transcription initiation sequences, enhancer sequences, selectable markers, and signal sequences. These elements may be selected as appropriate by a person of ordinary skill in the art. For example, the promoter sequences may be selected to promote the transcription of the polynucleotide in the vector. Suitable promoter sequences include, without limitation, T7 promoter, T3 promoter, SP6 promoter, beta-actin promoter, EF1a promoter, CMV promoter, CAG promoter, PGK promoter, and SV40 promoter.  Enhancer sequences may be selected to enhance the transcription of the nucleic acids. Selectable markers may be selected to allow selection of the host cells inserted with the vector from those not, for example, the selectable markers may be genes that confer antibiotic resistance. Signal sequences may be selected to allow the expressed polypeptide to be transported outside of the host cell.

[0298] The expression vector may be in the form of a viral vector. Viral vector technology is well known in the art and is described, for example, in Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) , and in other virology and molecular biology manuals. Viruses which are useful as vectors include, but are not limited to, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, and lentiviruses. In some embodiments, a murine stem cell virus (MSCV) vector is used to express a desired nucleic acid. MSCV vectors have been demonstrated to efficiently express desired nucleic acids in cells. Other examples of viral vectors are those based upon Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) and human immunodeficiency virus (HIV) . The use of RNA or DNA viral based systems for the delivery of nucleic acids has high efficiency in targeting a virus to specific cells and trafficking the viral payload to the cellular nuclei.

[0299] In some embodiments, the viral vector is a recombinant AAV (rAAV) vector. In some embodiments, the rAAV vector is a vector derived from an AAV serotype, including without limitation, AAV ITRs are AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, a goat AAV, bovine AAV, or mouse AAV capsid serotype or the like. In some embodiments, the nucleic acid in the AAV comprises an ITR of AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, a goat AAV, bovine AAV, or mouse AAV capsid serotype or the like. In some embodiments, the nucleic acid in the AAV further encodes an engineered reprogramming factor as described herein. Use of any AAV serotype is considered within the scope of the present disclosure. In some embodiments, the vector is encapsidated in a rAAV particle. In some embodiments, the AAV viral particle comprises an AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2 / 2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8,  AAVPHP. B, AAVPHP. eB, AAVBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, goat AAV, AAV1 / AAV2 chimeric, bovine AAV, mouse AAV, or raAV2 / HboV1 serotype capsid.

[0300] In some embodiments, the viral vector is a lentiviral vector. In some embodiments, the lentiviral vector is pseudotyped. In some embodiments, the lentiviral vector comprises a G glycoprotein. In some embodiments, the G glycoprotein is selected from the group consisting of vesicular stomatitis virus (VSV) , Piry virus, Chandipura virus, Spring viremia of carp virus and Mokola virus G glycoproteins. In some embodiments, the lentiviral vector comprises long terminal repeats (LTRs) selected from the group consisting of HIV and equine infectious anemia long terminal repeats.

[0301] The viral vector (e.g., transfer vector) comprising the nucleic acid (s) encoding the reprogramming factor (s) can be introduced into a producer cell. In some embodiments, the nucleic acid (s) encoding the reprogramming factor (s) comprises long terminal repeat (LTR) sequences flanking the transgene to enable integration into the target cell genome. In some embodiments, the LTR (5’ LTR and / or 3’ LTR) is mutated (e.g., truncated, such as truncating U3) to generate self-inactivating viral vector. One or more packaging vectors can be introduced into the producer cell simultaneously or sequentially (in any order) to produce a recombinant virus. A recombinant virus can be produced by, for example, culturing the producer cell under conditions sufficient to make the recombinant virus. In some embodiments, the producer cell already comprises one or more nucleic acids that encode the components to produce the recombinant virus. These can be structural or non-structural viral components or proteins. Producer cell lines are known in the art and can be modified with the molecules of interest to produce the recombinant virus of interest. Any suitable producer cell line known in the art can be used, such as HEK293, 293T, HeLa, D-17, MDCK, BHK and Cf2Th cells. In some embodiments, the producer cell line is 293T.

[0302] In some embodiments, the viral vector promoter is selected from the group consisting of a Rous Sarcoma Virus (RSV) promoter, a Simian Virus 40 (SV40) promoter, a cytomegalovirus immediate early gene promoter (CMV IE) , a murine stem cell virus promoter (MCSV) , an elongation factor 1 alpha promoter (EF1-α) , a phosphoglycerate kinase-1 (PGK) promoter, a ubiquitin-C (UBQ-C) promoter, a cytomegalovirus enhancer / chicken beta-actin (CAG) promoter, a polyoma enhancer / herpes simplex thymidine kinase (MC1) promoter, a beta actin (β-ACT) promoter, a “myeloproliferative sarcoma virus enhancer, negative control region deleted, d1587rev  primer-binding site substituted (MND) ” promoter, an NFAT promoter, a  promoter, and an NFκB promoter. The transfer vector (e.g., carrying the transgene) can employ a promoter same as or different from the envelope vector and / or packaging vector (s) .

[0303] Genes necessary to produce a recombinant virus can be split across two or more vectors to increase recombinant virus safety. Recombinant virus is typically produced using an envelope vector encoding a viral glycoprotein, packaging vector (s) encoding viral structural proteins, and a transfer vector encoding the transgene of interest. The genes required produce a recombinant virus include gag, pol, rev and optionally tat (depending on the vectors used) . Gag encodes for viral structural proteins, pol encodes for enzymes involved in reverse transcription and genome integration, while rev and tat encode for gene regulatory proteins. Wherein the transfer plasmid comprises a 5’ LTR fused to a heterologous promoter, Tat is no longer required, as expression of the transgene is Tat-independent. Promoters may be chosen for each vector based on the desired application, such as depending on the cell type to be transduced (e.g., primary cells vs. cell lines) , or the gene to be expressed (e.g., a dual promoter for co-expressing two transgenes) .

[0304] In some embodiments, the rejuvenation method (or treatment or prevention method) described herein comprises introducing a plurality of reprogramming factors (e.g., a plurality of nucleic acids encoding the plurality of reprogramming factors) into the population of cells (e.g., skin cells) , wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS (e.g., any of the engineered reprogramming factors described herein) . In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise two or more reprogramming factors from two or more families selected from the group consisting of OCT family, SOX family, KLF family, MYC family, LIN28 family, NANOG family, and GLIS family. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise two or more reprogramming factors selected from the group consisting of OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, L-MYC, LIN28, NANOG, GLIS1, and variant thereof, wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise three or all of OCT4, KLF4, SOX2, and c-MYC, wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS. In some embodiments, the SOX2 is an engineered SOX2 that is deficient in LLPS, such as any of the engineered SOX2 described herein, e.g., any of SEQ ID NOs: 41-43. In some embodiments, the c-MYC is an engineered c-MYC that is  deficient in LLPS, such as any of the engineered c-MYC described herein, e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise OCT4 and KLF4, wherein at least one of OCT4 and KLF4 is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS. In some embodiments, the OCT4 is an engineered OCT4 that is deficient in LLPS, such as any of the engineered OCT4 described herein, e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the KLF4 is an engineered KLF4 that is deficient in LLPS, such as any of the engineered KLF4 described herein, e.g., SEQ ID NO: 40. In some embodiments, all of the plurality of reprogramming factors are engineered reprogramming factors that are deficient in LLPS. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise a (e.g., one or more) wild-type reprogramming factor. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise any of: (i) an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) , and KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) ; (ii) an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , and an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) ; (iii) an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , an engineered c-MYC that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 14-20, 47, and 48, such as SEQ ID NO: 14) , and SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) ; or (iv) an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., any of SEQ ID NOs: 4-10 and 44-46, such as SEQ ID NO: 4) , KLF4 (e.g., SEQ ID NO: 22) , and SOX2 (e.g., SEQ ID NO: 24) .

[0305] In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise three or all of mouse OCT4 (MsOCT4) , mouse KLF4 (MsKLF4) , mouse SOX2 (MsSOX2) , and mouse c-MYC (Ms c-MYC) , wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS. In some embodiments, the MsSOX2 is an engineered MsSOX2 that is deficient in LLPS, such as any of the engineered MsSOX2 described herein. In some embodiments, the Ms c-MYC is an engineered Ms c-MYC that is deficient in LLPS, such as any of the engineered Ms c-MYC described herein. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise MsOCT4 and MsKLF4, wherein the at least one of MsOCT4 and MsKLF4 is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS. In some embodiments, the MsOCT4 is an engineered MsOCT4 that is deficient in LLPS, such as any of  the engineered MsOCT4 described herein, e.g., SEQ ID NO: 68 or 70. In some embodiments, the MsKLF4 is an engineered MsKLF4 that is deficient in LLPS, such as any of the engineered MsKLF4 described herein. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise a (e.g., one or more) wild-type reprogramming factor. In some embodiments, the plurality of reprogramming factors comprise: an engineered OCT4 that is deficient in LLPS (e.g., SEQ ID NO: 68 or 70) , MsKLF4 (e.g., SEQ ID NO: 72) , and MsSOX2 (e.g., SEQ ID NO: 74) .

[0306] In some embodiments, the plurality of reprogramming factors are encoded by a plurality of nucleic acids, e.g., RNA (e.g., linear mRNA or circRNA) or DNA. The expression of the nucleic acid (s) can be constitutive or induced (e.g., using Tet-On system) .

[0307] In some embodiments, the plurality of nucleic acids are on separate nucleic acid constructs. The nucleic acid construct can be an RNA construct (e.g., linear RNA or circRNA) or a DNA construct (e.g., lentival vector, AAV vector, or plasmid) .

[0308] In some embodiments, at least two of the plurality of nucleic acids are on a single nucleic acid construct. The nucleic acid construct can be an RNA construct (e.g., linear RNA or circRNA) or a DNA construct (e.g., lentival vector, AAV vector, or plasmid) . In some embodiments, at least two of the plurality of nucleic acids are on a single DNA construct (e.g., viral or bacterial vector) . In some embodiments, the at least two of the plurality of nucleic acids are under the control of different promoters. In some embodiments, the at least two of the plurality of nucleic acids are under the control of the same promoter. The promoter can be a constitutive promoter (e.g., CMV) or an inducible promoter (e.g., Tet-On promoter, such as TRE3G (e.g., SEQ ID NO: 63) , TRE, TRE3GS, TRE3GV, etc. ) . In some embodiments, the at least two of the plurality of nucleic acids are connected by one or more linking nucleic acids, such as IRES, or a linking sequence encoding a self-cleaving peptide (e.g., 2A peptide, such as P2A, T2A, E2A, F2A) . In some embodiments, the one or more linking nucleic acids comprise a linking sequence encoding a self-cleaving peptide, wherein the self-cleaving peptide is P2A, T2A, or E2A. In some embodiments, the nucleic acid encoding P2A comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the nucleic acid encoding T2A comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the nucleic acid encoding E2A comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 27.

[0309] Circular RNA (circRNA)

[0310] In some embodiments, the nucleic acid or the nucleic acid construct is a circRNA. circRNA refers to a polyribonucleotide that forms a circular structure through covalent bonds. circRNA can be produced by any methods known in the art, include but are not limited to, back-splicing, in vitro synthesis of a linear RNA precursor followed by ligation of its ends to produce a covalently-closed loop (can be chemical or enzymatic approach) , or generation in living cells by the overexpression of a plasmid harboring a minigene sequence that is naturally circularized following transcription, etc. During back-splicing, a 5′splice site attaches to an upstream 3′splice site on the same pre-mRNA, circularizing the intervening exon (s) . In vitro or in cell circRNA synthesis can use the PIE (permuted intron exon) system, e.g., Anabaena permuted group I intron-exon system (Ana PIE) , or Azoarcus sp. BH permuted group I intron circular system (AzoPIE) , or the Twister-optimized RNA for durable overexpression system (Tornado system) . For example, a nucleic acid sequence encoding one or more reprogramming factors can be recombined into the PIE system, and constructed within a plasmid (e.g., pBluescript II SK (+) ) , following in vitro transcription, the linear RNA is circularized to obtain the circRNA. See exemplary methods in Obi and Chen, Methods. 2021: 196: 85-103, WO2023115732, WO2023024500, US20230346921, US11679120, US11981909, US20240078661, and US20240042015, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety. For example, a nucleic aicd sequence encoding one or more reprogramming factors can be recombined into the Tornado system, and constructed within a plamid (e.g., pcDNA3.1 (+) , Piggybac) , following the plasmid transfected into cells such 293T, the circRNA can be produced and also exosome which containing circRNA can be collected. See exemplary methods in US20210340542, US011756183, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[0311] In the PIE method, circularly permuted group I intron precursor RNAs (e.g., derived from Tetrahymena or Anabena) have end-to-end fused exons that interrupt half intron sequences. Circularly permuted group I intron precursor RNAs can self-splice to generate a circular RNA exon in vitro. Foreign sequences (e.g., encoding reprogramming factor (s) ) can be placed in the exon of a permuted group I intron self-splicing system and made circular. This is because the exon sequence does not participate in the self-splicing reaction.

[0312] Methods of making any of the circRNAs described herein are provided. In some embodiments, the method comprises synthesizing a precursor RNA (linear RNA) by transcription (e.g., run-off transcription) using a DNA vector (e.g., a DNA vector comprising, in the following  order, a 5′ homology arm, a 3′ group I intron fragment, a 5’ spacer, an IRES, an expression sequence (e.g., encoding the plurality of reprogramming factors described herein) , a 3’ spacer, a 5′ group I intron fragment, and a 3′ homology arm) as a template, and circularizing the precursor RNA to form circRNA (e.g., incubating the precursor RNA under suitable conditions for circularization, such as in the presence of divalent cations (e.g., magnesium ions) and GTP) . In some embodiments, the method further comprises constructing the DNA vector for transcription (e.g., in vitro) of the precursor RNA. DNA vector construction can be performed using any molecular cloning methods. Exemplary DNA vectors are shown in FIGs. 2A-2D, 6A-6F, 10A-10B. In some embodiments, the DNA vector is linearized (e.g., via enzyme digestion) to provide a transcription template. In some embodiments, the transcription template is digested (e.g., using DNaseI) after transcription of the precursor RNA is completed. In some embodiments, the method further comprises purifying the circRNA (e.g., via RNA precipitation and ethanol washing) . In some embodiments, the method further comprises verification of the circRNA (e.g., Rnase R digestion analysis, or E-Gel electrophoresis) . Successfully generated circRNA shall stay intact and not digested by exonuclease-like Rnase R, as circRNAs lack free ends. Also see exemplary circRNA making methods in Examples 2-4.

[0313] The present application hence also provides DNA vectors and linear precursor RNAs for making any of the circRNAs described herein.

[0314] In some embodiments, the DNA vector comprises, in the following order, an optional 5′homology arm, a 3′ group I intron fragment, an optional 5’ internal spacer, an IRES (e.g., CVB3 IRES) , an expression sequence (e.g., encoding the plurality of reprogramming factors) , an optional 3’ internal spacer, a 5′ group I intron fragment, and an optional 3′ homology arm. In some embodiments, the 5’ homology arm and the 3’ homology arms are reverse complementary sequences which could help the two ends of linear precursor RNA get closer and improve circularization efficiency. In some embodiments, the 5’ internal spacer and the 3’ internal spacer are non-structural sequences (e.g., CAAA, or CAAAAA) for separating the ribozyme element (group I intron RNA) and the IRES element or the coding element. In some embodiments, the DNA vector comprises, in the following order, a 5′ homology arm, a 3′ group I intron fragment, a 5’ internal spacer, an IRES (e.g., CVB3 IRES) , an expression sequence (e.g., encoding the engineered reprogramming factor or the plurality of reprogramming factors described herein) , a 3’ internal spacer, a 5′ group I intron fragment, and a 3′ homology arm. In some embodiments, at  least one of the 3′ or 5′ internal spacers has a length of about 3 to about 60 nucleotides. In some embodiments, the 3′ and / or 5′ homology arms has a length of about 10 to about 100 nucleotides, such as any of about 10 to about 80 nt, about 10 to about 60 nt, about 10 to about 50 nt, about 10 to about 30 nt, about 20 to about 80 nt, about 40 to about 60 nt, or about 10 to about 20 nt. In some embodiments, the 3′ and 5′ internal spacers each comprises a duplex forming region capable of forming a duplex. In some embodiments, the duplex forming regions of the 3’ and 5’ spacers each has a length of about 5 to about 100 nucleotides, such as any of about 10 to about 50 nt, about 20 to about 40 nt, or about about 8 to about 20 nt. The homology arms or the duplex forming regions may form perfect or imperfect duplexes. For example, at least about any of 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%of the homology arms or duplex forming regions may be base paired with one another. In some embodiments, the DNA vector further comprises a transcription regulatory sequence. In some embodiments, the transcription regulatory sequence comprises a promoter and / or an enhancer. In some embodiments, the promoter comprises a T7 promoter. The DNA vector can be a circular DNA or a linear DNA. In some embodiments, the T7 promoter is at the 5’ end of 5′ homology arm.

[0315] In some embodiments, the 5’ elements of the DNA vector (contain 5’ homology arm, 3’ group I intron fragment, 5’ internal spacer) upstream of IRES comprise the sequence of SEQ ID NO:49. In some embodiments, the 3’ elements of the DNA vector (contain 3’ internal spacer, 5’ group I intron fragment, 3’ homology arm) downstream of the protein-coding sequence comprise the sequence of SEQ ID NO: 50.

[0316] In some embodiments, the 5’ elements (contain 5’ homology arm, 3’ group I intron fragment, 5’ internal spacer) upstream of IRES comprise the sequence of SEQ ID NO: 51. In some embodiments, the 3’ elements (contain 3’ internal spacer, 5’ group I intron fragment, 3’ homology arm) downstream of the protein-coding sequence comprise the sequence of SEQ ID NO: 52.

[0317] The term “3′ group I intron fragment” refers to a sequence with 75%or higher similarity to the 3′-proximal end of a natural group I intron including the splice site dinucleotide and optionally a stretch of natural exon sequence. In some embodiments, the term “5′ group I intron fragment” refers to a sequence with 75%or higher similarity to the 5′-proximal end of a natural group I intron including the splice site dinucleotide and optionally a stretch of natural exon sequence. The term “permutation site” refers to the site in a group I intron where a cut is made  prior to permutation of the intron. This cut generates 3′ and 5′ group I intron fragments that are permuted to be on either side of a stretch of precursor RNA to be circularized. The term “splice site” refers to a dinucleotide that is partially or fully included in a group I intron and between which a phosphodiester bond is cleaved during RNA circularization. Two “duplex forming regions, ” “homology arms, ” or “homology regions, ” may be any two regions that are thermodynamically favored to cross-pair in a sequence specific interaction. In some embodiments, two duplex forming regions, homology arms, or homology regions, share a sufficient level of sequence identity to one another's reverse complement to act as substrates for a hybridization reaction. As used herein polynucleotide sequences have “homology” when they are either identical or share sequence identity to a reverse complement or “complementary” sequence. The percent sequence identity between a homology region and a counterpart homology region's reverse complement can be any percent of sequence identity that allows for hybridization to occur. In some embodiments, an internal duplex forming region of an inventive polynucleotide is capable of forming a duplex with another internal duplex forming region and does not form a duplex with an external duplex forming region.

[0318] Two types of spacers can improve precursor RNA circularization and / or gene expression from circRNA. The first type of spacer is external spacer, i.e., present in a precursor RNA but removed upon circularization. While not wishing to be bound by theory, it is contemplated that an external spacer may improve ribozyme-mediated circularization by maintaining the structure of the ribozyme itself and preventing other neighboring sequence elements from interfering with its folding and function. The second type of spacer is internal spacer, i.e., present in a precursor RNA and retained in a resulting circular RNA. While not wishing to be bound by theory, it is contemplated that an internal spacer may improve ribozyme-mediated circularization by maintaining the structure of the ribozyme itself and preventing other neighboring sequence elements, particularly the neighboring IRES and coding region, from interfering with its folding and function. It is also contemplated that an internal spacer may improve protein expression from the IRES by preventing neighboring sequence elements, particularly the intron elements, from hybridizing with sequences within the IRES and inhibiting its ability to fold into its most preferred and active conformation.

[0319] Any IRES can be used herein. In some embodiments, the IRES is CVB3 IRES. Modifications of IRES and accessory sequences can increase or reduce IRES activities, for  example, by truncating the 5′ and / or 3′ ends of the IRES, adding a spacer 5′ to the IRES, modifying the 6 nucleotides 5′ to the translation initiation site (Kozak sequence) , modification of alternative translation initiation sites, and creating chimeric / hybrid IRES sequences.

[0320] In certain embodiments, the vectors, precursor RNA and circular RNA provided herein comprise a first (5′ ) and / or a second (3′ ) spacer. In some embodiments, including a spacer between the 3′ group I intron fragment and the IRES may conserve secondary structures in those regions by preventing them from interacting, thus increasing splicing efficiency. In some embodiments, the first (between 3′ group I intron fragment and IRES) and second (between the expression sequence and 5′ group I intron fragment) spacers comprise additional base pairing regions that are predicted to base pair with each other and not to the first and second duplex forming regions. In some embodiments, such spacer base pairing brings the group I intron fragments in close proximity to each other, further increasing splicing efficiency. Additionally, in some embodiments, the combination of base pairing between the first and second duplex forming regions, and separately, base pairing between the first and second spacers, promotes the formation of a splicing bubble containing the group I intron fragments flanked by adjacent regions of base pairing. Typical spacers are contiguous sequences with one or more of the following qualities: 1) predicted to avoid interfering with proximal structures, for example, the IRES, expression sequence, or intron; 2) is at least 7 nt long and no longer than 100 nt; 3) is located after and adjacent to the 3′ intron fragment and / or before and adjacent to the 5′ intron fragment; and 4) contains one or more of the following: a) an unstructured region at least 5 nt long, b) a region of base pairing at least 5 nt long to a distal sequence, including another spacer, and c) a structured region at least 7 nt long limited in scope to the sequence of the spacer. Spacers may have several regions, including an unstructured region, a base pairing region, a hairpin / structured region, and combinations thereof. In an embodiment, the spacer has a structured region with high GC content. In an embodiment, a region within a spacer base pairs with another region within the same spacer. In an embodiment, a region within a spacer base pairs with a region within another spacer. In an embodiment, a spacer comprises one or more hairpin structures. In an embodiment, a spacer comprises one or more hairpin structures with a stem of 4 to 12 nucleotides and a loop of 2 to 10 nucleotides. In an embodiment, there is an additional spacer (internal spacer) between the 3′ group I intron fragment and the IRES. In an embodiment, this additional spacer prevents the structured regions of the IRES from interfering with the folding of the 3′ group I intron fragment or reduces the extent to which this occurs. In  some embodiments, the 5′spacer sequence is at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 nucleotides in length. In some embodiments, the 5′spacer sequence is no more than 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, or 30 nucleotides in length. In some embodiments the 5′spacer sequence is between 3 and 50, 5 and 10, 10 and 50, 20 and 50, 20 and 40, and / or 25 and 35 nucleotides in length. In certain embodiments, the 5′spacer sequence is 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 or 50 nucleotides in length. In one embodiment, the 5′spacer sequence is a polyA sequence. In another embodiment, the 5′spacer sequence is a polyAC sequence. In one embodiment, a spacer comprises about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 100%polyAC content. In one embodiment, a spacer comprises about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 100%polypyrimidine (C / T or C / U) content.

[0321] In some embodiments, the method comprises incubating the DNA vector under a suitable condition for transcription. In some embodiments, the DNA vector is transcribed in vitro. In some embodiments, the suitable condition comprises ATP, GTP, CTP, UTP, and an RNA polymerase (e.g., T7 RNA polymerase) . In some embodiments, the suitable condition further comprise an RNase inhibitor.

[0322] It has been discovered that circRNA has reduced immunogenicity relative to a corresponding mRNA, at least partially because the mRNA contains an immunogenic 5′cap. When transcribing a DNA vector from certain promoters (e.g., a T7 promoter) to produce a precursor RNA, it is understood that the 5′ end of the precursor RNA is G. To reduce the immunogenicity of a circular RNA composition that contains a low level of contaminant linear mRNA, an excess of GMP relative to GTP can be provided during transcription such that most transcripts contain a 5′ GMP, which cannot be capped.

[0323] In some embodiments, the linear precursor RNA can be circularized by autocatalysis of a Group I intron. Any Group I intron known in the art could be used to generate circRNA via self-splicing. Examples of Group I introns useful for the methods of this application are described in Puttaraju, M. &Been, M., Nucleic Acids Res. 20, 5357–5364 (1992) ; Ford, E. &Ares, M., Proc. Natl Acad. Sci. 91, 3117–3121 (1994) ; Vicens, Q., Paukstelis, P. J., Westhof, E., Lambowitz, A.M. &Cech, T. R., RNA 14, 2013–2029 (2008) , which are incorporated herein by reference. The Group I intron can be derieved from bacterial phage Group I intron or a bacterial Group I intron. In some  embodiments, the group I intron is derived from a cyanobacteria Group I intron. In some embodiments, the group I intron is derived from an Anabaena Group I intron. In some embodiments, the linear RNA polynucleotide comprises a 3′ Anabaena group I intron fragment and a 5′ Anabaena group I intron fragment. In some embodiments, the reference 3′ Anabaena group I intron fragment and reference 5′ Anabaena group I intron fragment were generated using the L6-5 permutation site. In some embodiments, the linear RNA polynucleotide comprises a 3′ Azoarcus sp. BH group I intron fragment and a 5′ Azoarcus sp. BH group I intron fragment.

[0324] In some embodiments, the circRNA comprises an IRES followed by an expression sequence (e.g., encoding engineered reprogramming factor or the plurality of reprogramming factors) . In some embodiments, the circRNA comprises, in the following order: a) a post-splicing intron fragment of a 3′ group I intron fragment, b) an IRES, c) an expression sequence, and d) a post-splicing intron fragment of a 5′ group I intron fragment. In some embodiments, the circRNA does not comprise the 5’ homology arm and the 3’ homology arm. In some embodiments, the...

Claims

1.A method of rejuvenating a population of skin cells, comprising introducing into the population of skin cells an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in liquid-liquid phase separation (LLPS) .2.The method of claim 1, wherein the population of skin cells comprise fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, or any combination thereof.3.The method of claim 1 or 2, wherein the population of skin cells are from a skin tissue that is:(i) an aged skin tissue;(ii) a damaged skin tissue;(iii) a skin tissue with skin disease or condition; and / or(iv) a skin tissue after cosmetic, dermatological, or surgical procedure.4.The method of claim 3, wherein the skin tissue is a photoaged skin tissue.5.The method of any one of claims 1-4, wherein the method does not reprogram the population of skin cells into a reprogrammed stem cell.6.The method of any one of claims 1-5, wherein the engineered reprogramming factor comprises a mutation in an LLPS-related domain in reference to a corresponding wild-type reprogramming factor.7.The method of claim 6, wherein the LLPS-related domain is selected from the group consisting of an intrinsically disordered region (IDR) , a region outside of DNA-binding domain (DBD) , an ubiquitination site, or any combination thereof.8.The method of claim 7, wherein the mutation comprises:(i) substituting an acidic amino acid within the IDR with a neutral amino acid;(ii) substituting an amino acid that can be ubiquitinated with an amino acid that cannot be ubiquitinated;(iii) deleting an amino acid that can be ubiquitinated;(iv) deleting an amino acid within the IDR; and / or(v) deleting an amino acid within a region outside of DBD.9.The method of claim 8, wherein:(i) the amino acid that can be ubiquitinated is K; and / or(ii) the amino acid to be deleted comprises an acidic amino acid.10.The method of any one of claims 6-9, wherein the engineered reprogramming factor is an engineered OCT4.11.The method of claim 10, wherein the engineered OCT4 comprises a mutation at amino acid positions 1-140 and / or 288-360, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 2.12.The method of claim 11, wherein the engineered OCT4 comprises a substitution at an amino acid position selected from the group consisting of 8, 20, 26, 31, 56, 68, 91, 96, 98, 104, 108, 113, 125, 127, 130, 134, 135, 138, 291, 296, 297, 299, 341, and 343, and wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 2.13.The method of claim 12, wherein the substitution comprises substituting an acidic amino acid with a neutral amino acid.14.The method of claim 12 or 13, wherein the engineered OCT4 comprises a substitution selected from the group consisting of:(i) D8A, D20A, E26A, D31A, E56A, E68A, E91A, E96A, E98A, E104A, D108A, E113A, E125A, E127A, E130A, E134A, E135A, D138A, D291A, E296A, D297A, E299A, E341A, and E343A;(ii) D8A, D20A, E26A, D31A, E56A, E68A, E91A, E96A, E98A, E104A, D108A, E113A, E125A, E127A, E130A, E134A, E135A, and D138A;(iii) D291A, E296A, D297A, E299A, E341A, and E343A;(iv) D8A, D20A, E26A, D31A, E56A, E68A, E91A, E96A, E98A, E104A, D108A, E113A, E125A, E127A, E130A, E134A, D138A, D291A, E296A, E299A, E341A, and E343A;(v) E134A, E135A, E296A, and D297A;(vi) D8A, D20A, D31A, D108A, D138A, D291A, and D297A; and(vii) E26A, E56A, E68A, E91A, E96A, E98A, E104A, E113A, E125A, E127A, E130A, E134A, E135A, E296A, E299A, E341A, and E343A.15.The method of claim 14, wherein the engineered OCT4 comprises an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 4-10, or a variant thereof having at least about 85%sequence identity to any of SEQ ID NOs: 4-10.16.The method of claim 11, wherein the engineered OCT4 comprises a deletion at amino acid positions 2-140 and / or 288-360, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 2.17.The method of claim 16, wherein the engineered OCT4 comprises an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 44-46, or a variant thereof having at least about 85%sequence identity to any of SEQ ID NOs: 44-46.18.The method of any one of claims 6-9, wherein the engineered reprogramming factor is an engineered c-MYC.19.The method of claim 18, wherein the engineered c-MYC comprises a substitution of an amino acid that can be ubiquitinated with an amino acid that cannot be ubiquitinated, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 12 or 85.20.The method of claim 19, wherein the substitution comprises substituting a K with an R.21.The method of claim 19 or 20, wherein the engineered c-MYC comprises a substitution at an amino acid position selected from the group consisting of 51, 52, 126, 143, 148, 157, 206, 269, 275, 289, 298, 317, 323, 326, 341, 355, 371, 389, 392, 397, 398, 412, 422, 428, and 430, and wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 12 or 85.22.The method of claim 21, wherein the engineered c-MYC comprises a substitution selected from the group consisting of:(i) K51R, K52R, K126R, K143R, K148R, K157R, K206R, K269R, K275R, K289R, K298R, K317R, K323R, K326R, K341R, K355R, K371R, K389R, K392R, K397R, K398R, K412R, K422R, K428R, and K430R;(ii) K148R;(iii) K389R;(iv) K148R and K389R;(v) K51R and K52R;(vi) K275R and K289R; and(vii) K51R, K52R, K275R, and K289R.23.The method of any one of claims 19-22, wherein the engineered c-MYC comprises an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14-20, or a variant thereof having at least about 85%sequence identity to any of SEQ ID NOs: 14-20.24.The method of claim 18, wherein the engineered c-MYC comprises a deletion at amino acid positions 2-360, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 12 or 85.25.The method of claim 24, wherein the engineered c-MYC comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 or 48, or a variant thereof having at least about 85%sequence identity to SEQ ID NO: 47 or 48.26.The method of any one of claims 6-9, wherein the engineered reprogramming factor is an engineered KLF4.27.The method of claim 26, wherein the engineered KLF4 comprises a deletion at amino acid positions 2-374, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 22.28.The method of claim 27, wherein the engineered KLF4 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, or a variant thereof having at least about 85%sequence identity to SEQ ID NO: 40.29.The method of any one of claims 6-9, wherein the engineered reprogramming factor is an engineered SOX2.30.The method of claim 29, wherein the engineered SOX2 comprises a deletion at amino acid positions 2-40 and / or 201-317, wherein the amino acid positions are in reference to SEQ ID NO: 24.31.The method of claim 30, wherein the engineered SOX2 comprises an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 41-43, or a variant thereof having at least about 85%sequence identity to any of SEQ ID NOs: 41-43.32.The method of any one of claims 1-31, wherein the engineered reprogramming factor is encoded by a nucleic acid.33.The method of claim 32, wherein the nucleic acid is an RNA.34.The method of claim 33, wherein the RNA is a circular RNA (circRNA) .35.The method of claim 32, wherein the nucleic acid is a DNA.36.The method of any one of claims 32-35, wherein the nucleic acid is delivered by an exosome, a lipid nanoparticle (LNP) , or a virus.37.The method of any one of claims 1-36, wherein the population of skin cells is present in an individual in need of treatment, and wherein the method comprises administering the effective amount of the engineered reprogramming factor to the individual in vivo.38.The method of claim 37, wherein the method comprises administering an RNA encoding the engineered reprogramming factor, and wherein the RNA is encapsulated within an exosome or an LNP.39.The method of claim 38, wherein the exosome or LNP is delivered by a microneedle.40.The method of any of claims 1-36, wherein the population of skin cells is obtained from a donor individual and cultured ex vivo.41.The method of claim 40, wherein the method comprises implanting the rejuvenated population of skin cells into an individual in need of treatment.42.The method of any one of claims 1-41, wherein the method comprises introducing a plurality of reprogramming factors into the population of skin cells, wherein at least one of the plurality of reprogramming factors is an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS.43.The method of claim 42, wherein the plurality of reprogramming factors comprise two or more reprogramming factors selected from the group consisting of OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, L-MYC, LIN28, NANOG, GLIS1, and variant thereof.44.The method of claim 42 or 43, wherein the plurality of reprogramming factors comprise a wild-type reprogramming factor.45.The method of any one of claims 42-44, wherein the plurality of reprogramming factors comprise any of:(i) an engineered OCT4 that is deficient in LLPS, SOX2, and KLF4;(ii) an engineered OCT4 that is deficient in LLPS, KLF4, and an engineered c-MYC that is deficient in LLPS; or(iii) an engineered OCT4 that is deficient in LLPS, KLF4, an engineered c-MYC that is deficient in LLPS, and SOX2.46.The method of any one of claims 42-45, wherein the plurality of reprogramming factors are encoded by a plurality of nucleic acids.47.The method of claim 46, wherein at least two of the plurality of nucleic acids are on a single nucleic acid construct.48.The method of claim 47, wherein the at least two of the plurality of nucleic acids are under the control of the same promoter.49.The method of claim 48, wherein the at least two of the plurality of nucleic acids are connected by one or more linking nucleic acids.50.The method of claim 49, wherein the one or more linking nucleic acids comprise IRES or a linking sequence encoding a self-cleaving peptide.51.The method of claim 50, wherein the nucleic acid construct comprises from 5’ to 3’:(i) a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS –a first linking sequence encoding P2A –a second nucleic acid encoding SOX2 –a second linking sequence encoding T2A –a third nucleic acid encoding KLF4;(ii) a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS –a first linking sequence encoding P2A –a second nucleic acid encoding KLF4 –a second linking sequence encoding T2A –a third nucleic acid encoding an engineered c-MYC that is deficient in LLPS;(iii) a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS –a first linking sequence encoding P2A –a second nucleic acid encoding KLF4 –a second linking sequence encoding T2A –a third nucleic acid encoding an engineered c-MYC that is deficient in LLPS –a third linking sequence encoding E2A –a fourth nucleic acid encoding SOX2; or(iv) a first nucleic acid encoding an engineered OCT4 that is deficient in LLPS –a first linking sequence encoding P2A –a second nucleic acid encoding KLF4 –a second linking sequence encoding T2A –a third nucleic acid encoding SOX2.52.The method of claim 51, wherein the nucleic acid construct comprises a nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 28, 30, 32, 35, 37, 39, 57, 59, 61, 94, 98, and 102.53.A method of delaying or preventing the progression of aging of a skin tissue in an individual, comprising introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS.54.A method of treating aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual, comprising introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS.55.A method of preserving or improving the state and / or appearance of a skin tissue of an individual, comprising introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS.56.A method of enhancing the restoration of a skin tissue in an individual after damage or a cosmetic, dermatological, or surgical procedure, comprising introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS.57.A method of preventing aging, damage, or disease or condition in a skin tissue of an individual, comprising introducing into a population of skin cells of the skin tissue an effective amount of an engineered reprogramming factor that is deficient in LLPS.58.The method of any one of claims 37-57, wherein the individual is a human.

Images