Engineered RNA polynucleotide and preparation method thereof

Abstract

Provided is an engineered RNA polynucleotide and preparation method thereof, wherein the engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity as well as improved stability. Also provided are a precursor and a vector for the preparation of the engineered RNA polynucleotide, and the use thereof.

Description

Engineered RNA polynucleotide and preparation method thereofTechnical field

[0001] The present invention relates to an engineered RNA polynucleotide and preparation method thereof, wherein the engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity as well as improved stability. The present invention also relates to a precursor and a vector for the preparation of the engineered RNA polynucleotide, and the use thereof.Background

[0002] The increasing number of approved RNA-based therapeutics has fueled great hope as an effective treatment for a wide range of incurable diseases, as nucleic acid therapeutics can achieve long-lasting or even curative effects via gene inhibition, addition, replacement or editing.

[0003] In recent years, platform technologies that have enabled the clinical translation of nucleic acid therapeutics, including but not limited to technologies such as mRNA, engineered RNA polynucleotide, small interfering RNA.

[0004] However, several challenges remain unsolved and need to be overcome to enable RNA molecules to be utilized more effectively. For example, RNA molecules can be recognized by the host’s innate immune system and provoke an undesirable inflammatory response. A variety of RNA species or analogs have also been reported to be immunogenic. Previous studies have identified the immunological targets for these special RNA molecules, including cell surface or endosome Toll-like receptors (TLRs; TLR-3, -7, -8, and -9) and cytosolic sensors (protein kinase R, RIG-I, and MDA-5) . Recognition of these specific RNA sequences (SEQs) or structures by their corresponding immune receptors will trigger a series of immune events that are part of the host’s natural defense, including cytokine secretion, immune cell proliferation and survival, or activation of adaptive immunity, and thus limiting the use of RNA therapeutics.Summary of the invention

[0005] In one aspect, the present invention provides an RNA polynucleotide precursor comprising:

[0006] a) a self-cleaving ribozyme I or a fragment thereof,

[0007] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site,

[0008] c) a self-cleaving ribozyme II or a fragment thereof.

[0009] wherein said self-cleaving ribozyme I or fragment thereof and said self-cleaving ribozyme II or a fragment thereof catalyze intramolecular self-cleavage from said RNA polynucleotide precursor and forms an engineered RNA polynucleotide in linear form.

[0010] In another aspect, it is an object of the present invention to provide an RNA polynucleotide precursor comprising:

[0011] (a) a self-cleaving ribozyme I or a fragment thereof,

[0012] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site,

[0013] (c) a self-cleaving ribozyme II or a fragment thereof,

[0014] wherein said self-cleaving ribozyme I or fragment thereof and said self-cleaving ribozyme II or a fragment thereof catalyze intramolecular self-cleavage from said RNA polynucleotide precursor, and forms an engineered RNA polynucleotide in linear form, and

[0015] wherein said ribozyme I and ribozyme II can be the same or different ribozymes,

[0016] for example, said ribozyme I and ribozyme II are selected from the group including but not limited to: naturally-occurring ribozymes and modified ribozymes, e.g., ribozymes containing one or more modifications, which can be addition, deletion, substitution, and / or alteration of at least one nucleotide.

[0017] In another aspect, it is an object of the present invention to provide an RNA polynucleotide precursor comprising:

[0018] (a) a self-cleaving ribozyme I fragment,

[0019] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site,

[0020] (c) a self-cleaving ribozyme II fragment,

[0021] wherein said self-cleaving ribozyme I fragment and said self-cleaving ribozyme II fragment each has a sequence identity of at least 85%to the catalytic domain of said ribozyme I and ribozyme II respectively, and catalyze the intramolecular self-cleavage from said RNA polynucleotide precursor to form an engineered RNA polynucleotide in linear form, and

[0022] wherein said ribozyme I and ribozyme II can be the same or different ribozymes,

[0023] for example, said ribozyme I and ribozyme II are selected from the group including but not limited to: naturally-occurring ribozymes and modified ribozymes, e.g., ribozymes containing one or more modifications, which can be addition, deletion, substitution, and / or alteration of at least one nucleotide.

[0024] In one aspect, the present invention provides an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0025] (a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0026] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0027] (c) a 3’ terminal phosphate-containing group,

[0028] wherein said engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved  stability.

[0029] In one aspect, the present invention provides an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0030] (a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0031] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0032] (c) a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0033] wherein said engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved stability.

[0034] In embodiments, the engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved stability.

[0035] In embodiments, the engineered RNA polynucleotide of the present invention is produced from the RNA polynucleotide precursor.

[0036] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a vector comprising the sequence encoding the RNA polynucleotide precursor as described above.

[0037] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a cell comprising the vector as described above.

[0038] In another aspect, it is an object of the present invention to provide use of the engineered RNA polynucleotide or precursor thereof as described above to express a nucleotide sequence of interest.

[0039] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method of providing a nucleotide sequence of interest with reduced immunogenicity and / or improved stability in a subject, comprising:

[0040] (a) delivering to a subject an engineered RNA polynucleotide as described above, and

[0041] (b) optionally, detecting the immunogenicity of the polynucleotide in the subject.

[0042] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method of providing a polypeptide to a subject, comprising:

[0043] (a) delivering to a subject an engineered RNA polynucleotide comprising

[0044] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0045] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0046] c) a 3’ terminal phosphate-containing group, wherein said 3’ terminal phosphate-containing group is a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0047] wherein the sequence of interest comprises (i) one or more coding sequences of the polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) one or more translation  initiation elements, for example, an IRES, and (iii) one or two stagger elements, for example, 2A sequences, and

[0048] (b) expressing the nucleotide sequence of interest,

[0049] optionally the engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved stability in said subject.

[0050] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method of delivering a nucleotide sequence of interest to a subject, comprising:

[0051] (a) preparing an engineered RNA polynucleotide comprising

[0052] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0053] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0054] c) a 3’ terminal phosphate-containing group, wherein said 3’ terminal phosphate-containing group is a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0055] (b) administering to a subject the engineered RNA polynucleotide prepared in (a) , and

[0056] (c) optionally expressing the nucleotide sequence of interest in vivo.

[0057] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method of diagnosis or treatment of a disease in a subject, comprising:

[0058] (a) delivering to a subject an engineered RNA polynucleotide comprising

[0059] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0060] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0061] c) a 3’ terminal phosphate-containing group, wherein said 3’ terminal phosphate-containing group is a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0062] wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0063] (b) expressing the nucleotide sequence of interest,

[0064] wherein the polynucleotide molecule is expressed with reduced immunogenicity.

[0065] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising the engineered RNA polynucleotide or the precursor as described above and / or the nucleic acid vector as described above, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0066] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition, which comprises:

[0067] (a) an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0068] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0069] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0070] c) a 3’ terminal phosphate-containing group, wherein said 3’ terminal phosphate-containing group is a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0071] and

[0072] (b) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0073] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition, which comprises:

[0074] (a) an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0075] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0076] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0077] c) a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0078] wherein the sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0079] (b) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0080] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition, which comprises:

[0081] (a) an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0082] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0083] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0084] c) a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0085] wherein the sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0086] (b) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, wherein the pharmaceutically acceptable carrier encapsulates or covalently binds to the RNA molecule, for example the pharmaceutical carrier is a lipid nanoparticle.

[0087] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method for preparing a polynucleotide sequence which has reduced immunogenicity and / or improved stability, which comprises:

[0088] (a) providing an RNA polynucleotide precursor as described above, and

[0089] (b) enriching the polynucleotide produced from step (a) .

[0090] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method for preparing a composition for delivering to a subject with reduced immunogenicity and / or improved stability, comprising:

[0091] (a) providing the RNA polynucleotide precursor as described above,

[0092] (b) enriching the polynucleotide sequence produced from step (a) ,

[0093] (c) formulating the enriched polynucleotide.

[0094] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method for preparing a pharmaceutical composition for delivering to a subject with reduced immunogenicity, comprising:

[0095] (a) providing the RNA polynucleotide precursor as described above,

[0096] (b) enriching the polynucleotide sequence produced from step (a) ,

[0097] wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element,

[0098] (c) formulating the enriched polynucleotide with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient,

[0099] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method for preparing a pharmaceutical composition for delivering to a subject with reduced immunogenicity and / or improved stability, comprising:

[0100] (a) providing the RNA polynucleotide precursor as described above,

[0101] (b) enriching the polynucleotide sequence produced from step (a) ,

[0102] wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element,

[0103] (c) formulating the enriched polynucleotide with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, wherein the pharmaceutically acceptable carrier encapsulates or covalently binds to the RNA molecule.

[0104] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a product prepared using the engineered RNA polynucleotide sequence, the RNA polynucleotide precursor, the vector, the cell, or a pharmaceutical composition as described above.

[0105] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method for purifying  the engineered RNA polynucleotide.

[0106] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a product expressed by the engineered RNA polynucleotide as described above, the engineered RNA polynucleotide prepared by the method as described above or the engineered RNA polynucleotide purified by the method as described above.

[0107] In yet another aspect, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising the engineered RNA polynucleotide precursor as described above and / or the nucleic acid vector as described above and / or the engineered RNA polynucleotide as described above and / or the engineered RNA polynucleotide prepared by the method as described above and / or the engineered RNA polynucleotide purified by the method as described above, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0108] In yet another aspect, it is an object of the present invention to provide a method for preventing or treating a disease or condition in a subject, comprising administering to a subject the engineered RNA polynucleotide as described above, the engineered RNA polynucleotide prepared by the method as described above or the engineered RNA polynucleotide purified by the method as described above, or the pharmaceutical composition as described above.

[0109] In another aspect, it is an object of the present invention to provide use of the engineered RNA polynucleotide as described above, the engineered RNA polynucleotide prepared by the method as described above or the engineered RNA polynucleotide purified by the method as described above, or the pharmaceutical composition as described above in the manufacture of a medicament for preventing or treating a disease or condition in a subject.

[0110] It is to be understood that each of the method of prevention or treatment embodiments herein can also be formulated as corresponding use type embodiments.Brief description of the drawings

[0111] Figure 1 is a schematic of the generation of the engineered RNA polynucleotide of the present invention, which is also referred to as Ribozyme Linear RNA (RL RNA) .

[0112] Figure 2 shows the identification of RL RNA (RL POLR2A) generated from the RNA polynucleotide precursor (R1: Ribozyme I, R2: Ribozyme II) .

[0113] Figure 3 shows the identification of RL RNA expressing Nano-Luciferase (RL Nanoluc) generated from the RNA polynucleotide precursor (R1: Ribozyme I, R2: Ribozyme II) .

[0114] Figure 4. Determination of the end group of the RL RNA molecule.

[0115] Figure 5 shows the purity of RL RNA purified by PAGE gel.

[0116] Figure 6 depcits cytokine expression induced by different RNA molecules, and RL RNA of the present invention exhibits no immunogenicity.

[0117] Figure 7 depcits cytokine expression induced by different RNA molecules, and RL RNA expressing Nano-Luciferase exhibits no immunogenicity.

[0118] Figure 8 shows Toll-like receptor signaling pathway acativity induced by different RNA molecules in different cell lines, and RL RNA may evade the surveillance of Toll-like receptors.

[0119] Figure 9 shows the high stability of RL RNA in HEK293 cells.

[0120] Figure 10 shows the high stability of RL Nanoluc in cells.

[0121] Figure 11. RL RNA can be translated within cells driven by IRES.

[0122] Figure 12 lists examplary Ribozymes useful in the present invention and their cleavage efficiency.

[0123] Figure 13 shows the activity of different ribozymes.

[0124] Figure 14 shows the efficiency of different examplary ribozymes in generating RL RNAs.

[0125] Figure 15 shows the efficiency of different examplary ribozymes in generating RL RNAs.

[0126] Figure 16 shows the efficiency of different examplary ribozymes in generating RL RNAs.

[0127] Figure 17 shows the efficacy of different IRES to drive RL RNA translation in varying cells.

[0128] Figure 18 shows in vivo expression of cargo proteins by RL RNA.Detailed description of the invention

[0129] In the present invention, unless indicated otherwise, the scientific and technological terminologies used herein refer to meanings commonly understood by a person skilled in the art. Also, the terminologies and experimental procedures used herein relating to protein and nucleotide chemistry, molecular biology, cell and tissue cultivation, microbiology, immunology, all belong to terminologies and conventional methods generally used in the art. For example, the standard DNA recombination and molecular cloning technology used herein are well known to a person skilled in the art, and are described in details in the following references: Sambrook, J., Fritsch, Efland Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989. In the meantime, in order to better understand the present invention, definitions and explanations for the relevant terminologies are provided below.

[0130] As used herein, the singular forms "a, " "an, " and "the" include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. It is further noted that the claims may be drafted to exclude any optional element. For example, a engineered RNA polynucleotide precursor refers to one or more engineered RNA polynucleotide precursors. As such, the terms "a" , "an" , "one or more" and "at least one" can be used interchangeably. This statement is intended to serve as antecedent basis for use of such exclusive terminology as "solely, " "only" and the like in connection with the recitation of claim elements, or use of a "negative" limitation. Similarly the terms "comprising" , "including" and "having" can be used interchangeably.

[0131] As used herein, the term "and / or" encompasses all combinations of items connected by the term, and each combination should be regarded as individually listed herein. For example, "A and / or B" covers "A" , "A and B" , and "B" . For example, "A, B, and / or C" covers "A" , "B" , "C" , "A and B" , "A and C" , "B and C" , and "A and B and C" .

[0132] As used herein, "about, " "approximately, " "substantially, " and "significantly" will be understood by persons of ordinary skill in the art and will vary to some extent on the context in which they are used. If there are uses of these terms which are not clear to persons of ordinary skill in the art given the context in which they are used, "about" and "approximately" will mean plus or minus <10%of the particular term and "substantially" and "significantly" will mean plus or minus >10%of the particular term.

[0133] In the present application, "optional" or "optionally" means that the subsequently described event or circumstance may or may not occur, and that the description includes instances where sa id event or circumstance occurs and instances in which it does not.

[0134] "Polynucleotide" , "nucleic acid sequence" , "nucleotide sequence" , or "nucleic acid fragment" are used interchangeably to refer to a polymer of RNA or DNA that is single-or double-stranded, optionally containing synthetic, non-natural or altered nucleotide bases. Nucleotides (usually found in their 5'-monophosphate form) are referred to by their single letter designation as follows: "A" for adenylate or deoxyadenylate (for RNA or DNA, respectively) , "C" for cytidylate or deoxycytidylate, "G" for guanylate or deoxyguanylate, "U" for uridylate, "T" for deoxythymidylate, "R" for purines (A or G) , "Y" for pyrimidines (C or T) , "K" for G or T, "H" for A or C or T, "I" for inosine, and "N" for any nucleotide. Although the nucleotide sequences herein may be represented as DNA sequences (comprising T (s) ) , when referring to RNA, one skilled in the art can readily determine the corresponding RNA sequence (i.e., replacing T with U) .

[0135] Sequence "identity" has recognized meaning in the art, and the percentage of sequence identity between two nucleic acids or polypeptide molecules or regions can be calculated using the disclosed techniques. Sequence identity can be measured along the entire length of a polynucleotide or polypeptide or along a region of the molecule. (See, for example, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991) . There are many methods for determining sequence identity. An example of algorithms suitable for determining percent sequence identity is the algorithm used in the Basic Local Alignment Search Tool (hereinafter "BLAST" ) , see e.g., Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410,  1990 and Altschul et al, Nucleic Acids Res., 15: 3389-3402, 1997. Software for performing BLAST analysis is publicly available through the National Center for Biotechnology Information (hereafter "NCBI" ) . Default parameters used to determine sequence identity using software available from NCBI (such as BLASTN for nucleic acid sequences) are described in McGinnis et al. Nucleic Acids Res., 32: W20-W25, 2004.

[0136] "RNA polynucleotide precursor" herein refers to a linear RNA molecule capable of forming an engineered RNA polynucleotide molecule, e.g., by self-cleavage. The engineered RNA polynucleotide precursor may be produced by transcription from a nucleic acid vector comprising a coding sequence of the engineered RNA polynucleotide precursor. Alternatively, the engineered RNA polynucleotide precursor may also be obtained by chemical synthesis.

[0137] Ribozymes are catalytic RNA molecules with endoribonuclease activity. The molecule can be divided into two different domains: the antisense portion, responsible for the recognition of and binding to the target RNA, and the catalytic domain which causes cleavage of the RNA.

[0138] As used herein, the term "self-cleaving ribozyme" refers to catalytic RNA molecules that cleave their own phosphodiester backbone. As used herein, a self-cleaving ribozyme or fragment thereof refers to ribozyme or ribozyme fragments that have self-cleaving ribozyme activity and capable of self-cleavage activities.

[0139] "Self-cleaving ribozyme" includes, but is not limited to the following Table 1:

[0140] Table 1

[0141] As used herein, a self-cleaving ribozyme fragment is a sequence that is at least 75%, e.g., at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%identical to a native self-cleaving ribozyme. Said self-cleaving ribozyme fragment maintains the catalytic activities of the self-cleaving ribozyme. For example, said self-cleaving ribozyme fragment maintains at least 75%, e.g., at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%of the catalytic activities of the self-cleaving ribozyme.

[0142] In some embodiments, the self-cleaving ribozyme fragment is derived from the self-cleaving ribozyme. For example, said self-cleaving ribozyme fragment has a sequence identity of at least 75%, e.g., at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%to the self-cleaving ribozyme.

[0143] In some embodiments, the self-cleaving ribozyme fragment is derived from the catalytic domain of a self-cleaving ribozyme. For example, said self-cleaving ribozyme fragment has a sequence identity of at least 75%, e.g., at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%to the catalytic domain of the self-cleaving ribozyme. In some embodiments,  the self-cleaving ribozyme fragment is the catalytic domain of the self-cleaving ribozyme.

[0144] As used herein, "ribozyme recognition site" refers to a segment of nucleotide sequence which is recognized by the self-cleaving ribozyme or fragment thereof and is retained in the engineered RNA polynucleotide after the ribozyme is self-cleaved from the precursor. The ribozyme recognition site may be a fragment of a naturally occurring ribozyme which can be recognized by the catalytic domain of the ribozyme. In embodiments, the ribozyme recognition site comprises 0 to 50 nucleotides, for example 2 to 40, 2 to 30, 2 to 25, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10 nucleotides, in particular 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 or more nucleotides. In embodiments, the ribozyme recognition site I is comprised of 1 to 10 nucleotides, in particular 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleotides. In embodiments, the ribozyme recognition site II is comprised of 1 to 10 nucleotides, in particular 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleotides.

[0145] “Reduced immunogenicity” as used herein may refer to that the engineered RNA, upon contacted with cells, elicits a reduced immune response, i.e., an immune response at a level lower than a control RNA. For example, reduced immune response refers to reduced expression of cytokines. The cytokines include, but are not limited to, IFNβ, TNFα, IL6 and / or RIG-I. In some embodiments, the immunogenicity of the circular RNA is reduced by at least about 10%, at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, at least about 99%or up to 100%. The reduced immunogenicity can be determined by methods well known in the art, such as those described in Examples of the present application.

[0146] “Improved stability” as used herein may refer to that the engineered RNA, when delivered in vivo, has improved stability than a control RNA. The control RNA for the engineered RNA of the present invention is a linear RNA. For example, the in vivo stability of the engineered RNA is improved by at least about 10%, at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, at least about 99%or up to 100%.

[0147] In one aspect, the present invention provides an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0148] (d) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0149] (e) a nucleotide sequence of interest, and

[0150] (f) a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group.

[0151] Wherein said engineered RNA polynucleotide is in an isolated form.

[0152] In embodiments of the above aspect, said engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved stability. In embodiments of the above aspect, the nucleotide  sequence of interest comprises one or more coding or non-coding sequences. In embodiments of the above aspect, the nucleotide sequence of interest further comprises a translation initiation element (TIE) , or a non-TIE functional element. In embodiments of the above aspect, the engineered RNA polynucleotide is generated via (i) intramolecular self-cleavage of ribozyme, (ii) chemical synthesis, or (iii) in vitro translation from a DNA template followed by terminal modification.

[0153] In one aspect, the present invention provides an RNA polynucleotide precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0154] (a) a self-cleaving ribozyme I or a fragment thereof,

[0155] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site,

[0156] (c) a self-cleaving ribozyme II or a fragment thereof,

[0157] wherein said self-cleaving ribozyme I or fragment thereof and said self-cleaving ribozyme II or a fragment thereof catalyze intramolecular self-cleavage from said RNA polynucleotide precursor and forms an engineered RNA polynucleotide. In embodiments, the engineered RNA polynucleotide is a linear RNA polynucleotide.

[0158] In another aspect, it is an object of the present invention to provide an RNA polynucleotide precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0159] (a) a self-cleaving ribozyme I or a fragment thereof,

[0160] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site,

[0161] (c) a self-cleaving ribozyme II or a fragment thereof,

[0162] wherein said self-cleaving ribozyme I or fragment thereof and said self-cleaving ribozyme II or a fragment thereof catalyze intramolecular self-cleavage from said RNA polynucleotide precursor, and thus forms an engineered RNA polynucleotide in linear form, and

[0163] wherein said ribozyme I and ribozyme II can be the same or different ribozymes,

[0164] for example, the ribozymes are selected from the group including but not limited to: naturally-occurring ribozymes and modified ribozymes, e.g., ribozymes containing one or more modifications, which can be addition, deletion, substitution, and / or alteration of at least one nucleotide. In embodiments, at least one of the first and second ribozymes are selected from Table 1.

[0165] In another aspect, it is an object of the present invention to provide an RNA polynucleotide precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0166] (a) a self-cleaving ribozyme I fragment,

[0167] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition  site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site,

[0168] (c) a self-cleaving ribozyme II fragment,

[0169] wherein said self-cleaving ribozyme I fragment and said self-cleaving ribozyme II fragment has a sequence identity of at least 85%to the catalytic domain of said ribozyme I and ribozyme II respectively, and catalyze the intramolecular self-cleavage from said RNA polynucleotide precursor to form an engineered RNA polynucleotide in linear form, and

[0170] wherein the ribozyme I and ribozyme II can be the same or different ribozymes,

[0171] for example, the ribozyme I and ribozyme II are selected from the group including but not limited to: naturally-occurring ribozymes and modified ribozymes, e.g., ribozymes containing one or more modifications, which can be addition, deletion, substitution, and / or alteration of at least one nucleotide. In embodiments, said ribozyme I and ribozyme II are selected from Table 1.

[0172] In one aspect, the present invention provides an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0173] (a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0174] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0175] (c) a 3’ terminal phosphate-containing group,

[0176] wherein said engineered RNA polynucleotide is in linear form.

[0177] In one aspect, the present invention provides an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0178] (a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0179] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0180] (c) a 3’ terminal phosphate-containing group,

[0181] wherein said engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved stability.

[0182] As used herein, “3’ terminal phosphate-containing group” refers to a phosphate containing group which is at the 3’ end of the engineered RNA polynucleotide. In some embodiments, said 3’ terminal phosphate-containing group is a 2’, 3’-cyclic phosphate group. As used herein, “5’ terminal hydroxyl group” refers to the hydroxyl group which is at the end of the engineered RNA polynucleotide. A skilled person in the art understands that “terminal” , “end” , and “termini” can be used in exchange without altering the meaning thereof.

[0183] In one aspect, the present invention provides an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0184] (a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0185] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0186] (c) a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0187] wherein said engineered RNA polynucleotide is in linear form.

[0188] In one aspect, the present invention provides an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0189] (a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0190] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0191] (c) a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0192] wherein the engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved stability.

[0193] In embodiments, the engineered RNA polynucleotide of the present invention is produced from the RNA polynucleotide precursor.

[0194] “Ribozyme linear RNA” or “RL RNA” refers to the engineered RNA polynucleotide of the present invention, which is produced from the RNA polynucleotide precursor through ribozyme self-cleavage.

[0195] In embodiments, the nucleotide sequence of interest comprises one or more coding or non-coding sequences. In aspects of the present invention, the nucleotide sequence of interest further comprises a translation initiation element (TIE) , or a non-TIE functional element. In embodiments, the nucleotide sequence of interest comprises at least two protein-coding sequences. Such at least two protein-coding sequences are operably linked with each other by spacers, 2A sequence or further translation initiation elements. In embodiments, a further translation initiation element is operably linked between any two adjacent protein-coding sequences. In embodiments, the translation initiation element is selected from an IRES sequence, a 5’ UTR sequence, a Kozak sequence, a sequence containing m6A modification, a sequence complementary to ribosome 18S rRNA, or any combination thereof. In embodiments, the translation initiation element is an IRES sequence. In embodiments, the non-TIE functional element is a stop codon, a 3’ UTR or a target-binding sequence.

[0196] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a vector comprising the sequence encoding the precursor molecule as described above.

[0197] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a cell comprising the vector as described above.

[0198] In another aspect, it is an object of the present invention to provide use of the engineered RNA polynucleotide or precursor thereof as described above to express a nucleotide sequence of interest.

[0199] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method of providing a sequence of interest with reduced immunogenicity and / or improved stability in a subject, comprising:

[0200] (a) delivering to a subject an engineered RNA polynucleotide as described above, and

[0201] (b) optionally, detecting the immunogenicity / stability of the polynucleotide in the subject.

[0202] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method of providing a polypeptide to a subject, comprising:

[0203] (a) delivering to a subject an engineered RNA polynucleotide comprising

[0204] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0205] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0206] c) a 3’ terminal phosphate-containing group, wherein said 3’ terminal phosphate-containing group is a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0207] wherein the sequence of interest comprises (i) one or more coding sequences of the polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) one or more translation initiation elements, for example, an IRES, and

[0208] (b) expressing the nucleotide sequence of interest,

[0209] optionally the engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved stability in said subject.

[0210] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method of delivering a sequence of interest to a subject, comprising:

[0211] (a) preparing an engineered RNA polynucleotide comprising

[0212] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0213] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0214] c) a 3’ terminal phosphate-containing group, wherein said 3’ terminal phosphate-containing group is a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0215] (b) administering to a subject the polynucleotide prepared in (a) , and

[0216] (c) optionally expressing the nucleotide sequence of interest in vivo.

[0217] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method of diagnosis or treatment of a disease in a subject, comprising:

[0218] (a) delivering to a subject an engineered RNA polynucleotide comprising

[0219] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0220] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0221] c) a 3’ terminal phosphate-containing group, wherein said 3’ terminal phosphate-containing group is a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0222] wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0223] (b) expressing the nucleotide sequence of interest,

[0224] wherein the polynucleotide molecule is expressed with reduced immunogenicity.

[0225] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a composition comprising the engineered RNA polynucleotide or the RNA polynucleotide precursor as described above. In some embodiments, said composition is a pharmaceutical composition. In some embodiments, said composition is a non-therapeutic composition, e.g. a cosmetic composition. In some embodiments, said composition further comprises a suitable carrier or excipient.

[0226] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising the engineered RNA polynucleotide or the RNA polynucleotide precursor as described above and / or the nucleic acid vector as described above, and a pharmaceutically acceptable carrier. In another aspect, it is an object of the present invention to provide a cosmetic composition comprising the engineered RNA polynucleotide or the RNA polynucleotide precursor as described above and / or the nucleic acid vector as described above, and a cosmetically acceptable carrier.

[0227] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition, which comprises:

[0228] (a) an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0229] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0230] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0231] c) a 3’ terminal phosphate-containing group, wherein said 3’ terminal phosphate-containing group is a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group, and

[0232] (b) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0233] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition, which comprises:

[0234] (a) an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0235] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0236] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site,  and

[0237] c) a 3’ terminal phosphate-containing group, wherein said 3’ terminal phosphate-containing group is a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0238] wherein the sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0239] (b) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0240] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition, which comprises:

[0241] (a) an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0242] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0243] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0244] c) a 3’ terminal phosphate-containing group, wherein said 3’ terminal phosphate-containing group is a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0245] wherein the sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0246] (b) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, wherein the pharmaceutically acceptable carrier encapsulates or covalently binds to the RNA molecule, for example the pharmaceutical carrier is a lipid nanoparticle.

[0247] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a cosmetic composition, which comprises:

[0248] (b) an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0249] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0250] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0251] c) a 3’ terminal phosphate-containing group, wherein said 3’ terminal phosphate-containing group is a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group, and

[0252] (b) a cosmetically acceptable carrier or excipient.

[0253] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a cosmetic composition, which comprises:

[0254] (b) an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0255] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0256] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0257] c) a 3’ terminal phosphate-containing group, wherein said 3’ terminal phosphate-containing group is a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0258] wherein the sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a protein, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0259] (b) a cosmetically acceptable carrier or excipient.

[0260] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a cosmetic composition, which comprises:

[0261] (b) an engineered RNA polynucleotide comprising:

[0262] a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0263] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0264] c) a 3’ terminal phosphate-containing group, wherein said 3’ terminal phosphate-containing group is a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0265] wherein the sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a protein, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0266] (b) a cosmetically acceptable carrier or excipient, wherein the cosmetically acceptable carrier encapsulates or covalently binds to the RNA molecule, for example the cosmetically acceptable carrier is a lipid nanoparticle.

[0267] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method for preparing a polynucleotide sequence, which comprises:

[0268] (a) providing an RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0269] a) a self-cleaving ribozyme I or a fragment thereof,

[0270] b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0271] c) a self-cleaving ribozyme II or a fragment thereof.

[0272] (b) enriching the polynucleotide produced from step (a) ,

[0273] wherein the self-cleaving ribozyme or fragment thereof catalyzes intramolecular cleavage of  said RNA precursor to form said engineered RNA polynucleotide.

[0274] In one aspect, the present invention provides a method for preparing a composition for delivering to a subject, comprising:

[0275] (a) providing the engineered RNA polynucleotide as described in the above aspects of the present invention,

[0276] (b) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (a) , and

[0277] (c) optionally, formulating the enriched engineered RNA polynucleotide.

[0278] In a further aspect, the present invention provides a method for preparing a composition for delivering to a subject, comprising:

[0279] (a) providing an RNA polynucleotide precursor as described in the above aspects,

[0280] (b) allowing the RNA polynucleotide precursor to undergo intramolecular self-cleavage, thereby producing an engineered RNA polynucleotide in linear form,

[0281] (c) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (b) , and

[0282] (d) optionally formulating the enriched engineered RNA polynucleotide.

[0283] In one aspect, the present invention provides a method for preparing a pharmaceutical or cosmetic composition, comprising:

[0284] (a) providing the engineered RNA polynucleotide as described in the above aspects,

[0285] (b) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (a) , wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a biological active protein, a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0286] (c) optionally formulating the enriched engineered RNA polynucleotide with a pharmaceutically or cosmetically acceptable carrier or excipient.

[0287] In a further aspect, the present invention provides a method for preparing a pharmaceutical or cosmetic composition, comprising:

[0288] (a) providing an RNA polynucleotide precursor of the above aspects,

[0289] (b) allowing the RNA polynucleotide precursor to undergo intramolecular self-cleavage, thereby producing an engineered RNA polynucleotide in linear form,

[0290] (c) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (b) , wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a biological active protein, a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0291] (d) optionally formulating the enriched engineered RNA polynucleotide with a pharmaceutically or cosmetically acceptable carrier or excipient.

[0292] In embodiments of the above aspects, the engineered RNA polynucleotide exhibits reduced  immunogenicity and / or improved stability upon administration to a subject in need thereof.

[0293] In embodiments of the above aspects, the pharmaceutically or cosmetically acceptable carrier encapsulates or covalently binds to the engineered RNA polynucleotide.

[0294] In embodiments of the above aspects, enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form comprises removing the cleaved ribozymes by chromatography. In some embodiments, the chromatography comprises an affinity medium capable of specifically binding to the linker or ligand sequence.

[0295] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method for preparing a composition for delivering to a subject with reduced immunogenicity and / or improved stability, comprising:

[0296] (a) providing the RNA polynucleotide precursor as described above,

[0297] (b) enriching the polynucleotide sequence produced from step (a) ,

[0298] (c) formulating the enriched polynucleotide.

[0299] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method for preparing a pharmaceutical composition for delivering to a subject with reduced immunogenicity, comprising:

[0300] (a) providing the RNA polynucleotide precursor as described above,

[0301] (b) enriching the polynucleotide sequence produced from step (a) , wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element,

[0302] (c) formulating the enriched polynucleotide with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient,

[0303] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a method for preparing a pharmaceutical composition for delivering to a subject with reduced immunogenicity and / or improved stability, comprising:

[0304] (a) providing the RNA polynucleotide precursor as described above,

[0305] (b) enriching the polynucleotide sequence produced from step (a) , wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element,

[0306] (c) formulating the enriched polynucleotide with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, wherein the pharmaceutically acceptable carrier encapsulates or covalently binds to the RNA molecule.

[0307] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a product prepared using the engineered RNA polynucleotide sequence, the RNA polynucleotide precursor, the vector the  cell or a pharmaceutical composition as described above.

[0308] In embodiments, the nucleotide sequence of interest is selected from the group including but not limited to a RNA sequence that binds a protein; an RNA sequence that is complementary to a microRNA or siRNA; an RNA sequence that has partial complementarity to a microRNA or siRNA or piRNA; an RNA sequence that hybridizes completely or partially to a cellularly expressed microRNA, siRNA, piRNA, mRNA, IncRNA, ncRNA, or other cellular RNA; a hairpin structure that is a substrate for DICER or endogenous nucleases; a sequence that binds to viral proteins; an antisense RNA, an antagomir, a microRNA, a siRNA, an anti-miRNA, a ribozyme, a decoy oligonucleotide, an RNA activator, an immunostimulatory oligonucleotide, an aptamer, an RNA device; and an RNA molecule encoding a peptide sequence.

[0309] In some aspects, it is an object of the present invention to further purify the enriched engineered RNA polynucleotide.

[0310] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a product expressed by the engineered RNA polynucleotide as described above, the engineered RNA polynucleotide prepared by the method as described above or the engineered RNA polynucleotide purified by the method as described above.

[0311] In yet another aspect, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising the RNA polynucleotide precursor as described above and / or the nucleic acid vector as described above and / or the engineered RNA polynucleotide as described above and / or the engineered RNA polynucleotide prepared by the method as described above and / or the engineered RNA polynucleotide purified by the method as described above, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0312] In another aspect, it is an object of the present invention to provide product comprising the engineered RNA polynucleotide as described above, the RNA polynucleotide precursor as described above or a composition as described above. In some aspects, the product of the present invention can further comprises a device or an appliance for application. In yet another aspect, it is an object of the present invention to provide a method for preventing or treating a disease or condition in a subject, comprising administering to a subject the engineered RNA polynucleotide as described above, the engineered RNA polynucleotide prepared by the method as described above or the engineered RNA polynucleotide purified by the method as described above, or the pharmaceutical composition as described above.

[0313] In another aspect, it is an object of the present invention to provide use of the engineered RNA polynucleotide as described above, the engineered RNA polynucleotide prepared by the method as described above or the engineered RNA polynucleotide purified by the method as described above, or the pharmaceutical composition as described above in the manufacture of a medicament  for preventing or treating a disease or condition in a subject.

[0314] In another aspect, it is an object of the present invention to provide use of the engineered RNA polynucleotide as described above, the RNA polynucleotide precursor as described above, the vector as described above, the cell as described above or a composition as described above for cosmetic treatment or personal care.

[0315] It is to be understood that each of the method of prevention or treatment embodiments herein can also be formulated as corresponding use type embodiments.

[0316] Additionally, in one aspect, the present invention further provides the following:

[0317] 1. An RNA polynucleotide precursor, comprising from 5’ to 3’ direction:

[0318] (a) a self-cleaving ribozyme I or a fragment thereof,

[0319] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site,

[0320] (c) a self-cleaving ribozyme II or a fragment thereof.

[0321] wherein said self-cleaving ribozyme I or fragment thereof and said self-cleaving ribozyme II or a fragment thereof catalyze intramolecular self-cleavage from said RNA polynucleotide precursor and forms an engineered RNA polynucleotide in linear form.

[0322] 2. An RNA polynucleotide precursor, comprising from 5’ to 3’ direction:

[0323] (a) a self-cleaving ribozyme I fragment,

[0324] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site,

[0325] (c) a self-cleaving ribozyme II fragment,

[0326] wherein said self-cleaving ribozyme I fragment and said self-cleaving ribozyme II fragment has a sequence identity of at least 85%to the catalytic domain of said ribozyme I and ribozyme II respectively and catalyze the intramolecular self-cleavage from said RNA polynucleotide precursor to form an engineered RNA polynucleotide in linear form.

[0327] 3. The RNA polynucleotide precursor of item 1 or 2, wherein the first and second ribozyme can be the same or different ribozymes.

[0328] 4. The RNA polynucleotide precursor of any of items 1-3, wherein the first and second ribozymes are selected from Table 1.

[0329] 5. An engineered RNA polynucleotide comprising:

[0330] (a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0331] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0332] (c) a 3’ terminal phosphate-containing group,

[0333] wherein said engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved stability.

[0334] 6. An engineered RNA polynucleotide comprising:

[0335] (a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0336] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0337] (c) a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group,

[0338] wherein said engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved stability.

[0339] 7. The engineered RNA polynucleotide of items 5 or 6, wherein the nucleotide sequence of interest comprises one or more coding or non-coding sequences.

[0340] 8. The engineered RNA polynucleotide of item 7, wherein the nucleotide sequence of interest comprises a translation initiation element (TIE) , or a non-TIE functional element.

[0341] 9. A vector comprising the sequence encoding the RNA polynucleotide precursor of items 1 to 4.

[0342] 10. A cell comprising the vector of item 9.

[0343] 11. A method of providing a sequence of interest with reduced immunogenicity and / or improved stability in a subject, comprising

[0344] (a) delivering to a subject an engineered RNA polynucleotide of any of items 5 to 8, and

[0345] (b) optionally, detecting the immunogenicity and / or stability of the polynucleotide in the subject.

[0346] 12. A method of providing a polypeptide to a subject, comprising

[0347] (a) delivering to a subject the engineered RNA polynucleotide of any of items 5 to 8, wherein the sequence of interest comprises (i) one or more coding sequences of the polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) one re more translation initiation elements, for example, an IRES, and

[0348] (b) expressing the nucleotide sequence of interest.

[0349] 13. A method of delivering a sequence of interest to a subject, comprising:

[0350] (a) preparing the engineered RNA polynucleotide of any of items 5 to 8,

[0351] (b) administering to a subject the polynucleotide prepared in (a) , and

[0352] (c) optionally expressing the nucleotide sequence of interest in vivo.

[0353] 14. A method of diagnosis or treatment of a disease in a subject, comprising

[0354] (a) delivering to a subject the engineered RNA polynucleotide of any of items 5 to 8, wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES,  and / or a translation regulatory element, and

[0355] (b) expressing the nucleotide sequence of interest.

[0356] 15. A pharmaceutical composition, which comprises:

[0357] (a) the engineered RNA polynucleotide of any of items 5 to 8, and

[0358] (b) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0359] 16. A pharmaceutical composition, which comprises

[0360] (a) the engineered RNA polynucleotide of any of items 5 to 8, wherein the sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0361] (b) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0362] 17. A pharmaceutical composition, which comprises:

[0363] (a) the engineered RNA polynucleotide of any of items 5 to 8, wherein the sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0364] (b) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, wherein the pharmaceutically acceptable carrier encapsulates or covalently binds to the engineered RNA polynucleotide, for example the pharmaceutical carrier is a lipid nanoparticle.

[0365] 18. A method for preparing a polynucleotide sequence which has reduced immunogenicity and / or improved stability, which comprises:

[0366] (a) providing an RNA polynucleotide precursor of any of items 1 to 4,

[0367] (b) enriching the polynucleotide produced from step (a) , wherein the self-cleaving ribozyme or fragment thereof catalyzes intramolecular cleavage of said RNA polynucleotide precursor to form said engineered RNA polynucleotide.

[0368] 19. A method for preparing a composition for delivering to a subject with reduced immunogenicity and / or improved stability, comprising:

[0369] (a) providing the RNA polynucleotide precursor of any of items 1 to 4,

[0370] (b) enriching the polynucleotide sequence produced from step (a) ,

[0371] (c) formulating the enriched polynucleotide.

[0372] 20. A method for preparing a pharmaceutical composition for delivering to a subject with reduced immunogenicity and / or improved stability, comprising:

[0373] (a) providing the RNA polynucleotide precursor of any of items 1 to 4,

[0374] (b) enriching the polynucleotide sequence produced from step (a) , wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic  protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element,

[0375] (c) formulating the enriched polynucleotide with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0376] 21. A method for preparing a pharmaceutical composition for delivering to a subject with reduced immunogenicity and / or improved stability, comprising:

[0377] (a) providing the RNA polynucleotide precursor of any of items 1 to 4,

[0378] (b) enriching the polynucleotide sequence produced from step (a) , wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element,

[0379] (c) formulating the enriched polynucleotide with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, wherein the pharmaceutically acceptable carrier encapsulates or covalently binds to the RNA molecule.

[0380] 22. A product prepared using the engineered RNA polynucleotide sequence of item 5 to 8, the RNA polynucleotide precursor of any of item 1 to 4, the vector of item 9, the cell of item 10 or a pharmaceutical composition of any of items 15 to 17.

[0381] 23. Use of the engineered RNA polynucleotide sequence of item 5 to 8, the RNA polynucleotide precursor of any of item 1 to 4, the vector of item 9, the cell of item 10 or a pharmaceutical composition of any of items 15 to 17 in the manufacture of a medicament for preventing or treating a disease or condition in a subject.

[0382] In another aspect, the present invention further provides the following embodiments:

[0383] 1. An isolated RNA polynucleotide precursor, comprising from 5’ to 3’ direction:

[0384] (a) a self-cleaving ribozyme I or a fragment thereof,

[0385] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, and a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0386] (c) a self-cleaving ribozyme II or a fragment thereof,

[0387] wherein said self-cleaving ribozyme I or fragment thereof and said self-cleaving ribozyme II or fragment thereof are capable of catalyzing intramolecular self-cleavage from said RNA polynucleotide precursor, thereby forming an engineered RNA polynucleotide in linear form.

[0388] 2. An isolated RNA polynucleotide precursor, comprising from 5’ to 3’ direction:

[0389] (a) a self-cleaving ribozyme I fragment,

[0390] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, and a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0391] (c) a self-cleaving ribozyme II fragment,

[0392] wherein said self-cleaving ribozyme I fragment and said self-cleaving ribozyme II fragment have a sequence identity of at least 85%to the catalytic domain of said ribozyme I and ribozyme II respectively and are capable of catalyzing the intramolecular self-cleavage from said RNA polynucleotide precursor, thereby forming an engineered RNA polynucleotide in linear form.

[0393] 3. The RNA polynucleotide precursor of item 1 or 2, wherein the self-cleaving ribozyme I and self-cleaving ribozyme II are the same or different ribozymes.

[0394] 4. The RNA polynucleotide precursor of any one of items 1 to 3, wherein the self-cleaving ribozyme I and self-cleaving ribozyme II are selected from Table 1.

[0395] 5. The RNA polynucleotide precursor of any one of items 1 to 4, wherein the engineered RNA polynucleotide in linear form comprises a 5’ end hydroxyl group, the polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, the 5’ ribozyme I recognition site, the nucleotide sequence of interest, and the 3’ ribozyme II recognition site, and a 3’ end 2’, 3’-cyclic phosphate group.

[0396] 6. The RNA polynucleotide precursor of any one of items 1 to 5, further comprising a first linker at 5' upstream of the 5' ribozyme I and / or a second linker at 3' downstream of the 3' ribozyme II.

[0397] 7. The RNA polynucleotide precursor of item 6, wherein the first linker comprises a first ligand sequence and / or the second linker comprises a second ligand sequence.

[0398] 8. An isolated engineered RNA polynucleotide comprising:

[0399] (a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0400] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, and a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0401] (c) a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group.

[0402] 9. The engineered RNA polynucleotide of item 8, wherein said engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved stability.

[0403] 10. The engineered RNA polynucleotide of item 8 or 9, wherein the nucleotide sequence of interest comprises one or more coding or non-coding sequences.

[0404] 11. The engineered RNA polynucleotide of item 10, wherein the nucleotide sequence of interest further comprises a translation initiation element (TIE) , or a non-TIE functional element.

[0405] 12. The engineered RNA polynucleotide of any one of items 8 to 11, which is generated via intramolecular self-cleavage of the RNA polynucleotide precursor of any one of items 1 to 7.

[0406] 13. A vector comprising a DNA sequence encoding the RNA polynucleotide precursor of any one of items 1 to 7.

[0407] 14. A cell comprising the vector of item 13.

[0408] 15. A method of providing a polypeptide to a subject, comprising

[0409] (a) delivering to the subject the engineered RNA polynucleotide of any one of items 8 to 12, wherein the sequence of interest comprises (i) one or more coding sequences of the polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) one or more translation initiation elements, for example, an IRES, and

[0410] (b) expressing the nucleotide sequence of interest.

[0411] 16. A method of delivering a sequence of interest to a subject, comprising:

[0412] (a) preparing the engineered RNA polynucleotide of any one of items 8 to 12,

[0413] (b) administering to the subject the polynucleotide prepared in (a) , and

[0414] (c) optionally expressing the nucleotide sequence of interest in the subject.

[0415] 17. A method of diagnosing a disease in a subject, comprising

[0416] (a) delivering to a subject the engineered RNA polynucleotide of any one of items 8 to 12, wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a diagnostic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0417] (b) expressing the coding sequence of the polypeptide, and

[0418] (c) detecting the occurrence or level of a signal in a tissue of the subject or in a biological sample obtained from the subject, wherein the signal is associated with the expression or activity of the polypeptide, and wherein the occurrence or level of the signal is indicative the presence or absence of the disease in the subject.

[0419] 18. A composition, which comprises:

[0420] (a) the engineered RNA polynucleotide of any one of items 8 to 12, and

[0421] (b) an acceptable carrier or excipient.

[0422] 19. The composition of item 18, wherein said composition is a pharmaceutical composition.

[0423] 20. The composition of item 18, wherein said composition is a cosmetic composition.

[0424] 21. A pharmaceutical composition, which comprises

[0425] (a) the engineered RNA polynucleotide of any one of items 8 to 12, wherein the sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0426] (b) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0427] 22. The pharmaceutical composition of item 21, wherein the pharmaceutically acceptable carrier encapsulates or covalently binds to the engineered RNA polynucleotide, for example the pharmaceutical carrier is a lipid nanoparticle.

[0428] 23. A method for preparing an engineered RNA polynucleotide, which comprises:

[0429] (a) providing an RNA polynucleotide precursor of any one of items 1 to 7,

[0430] (b) allowing the RNA polynucleotide precursor to undergo intramolecular self-cleavage, thereby producing an engineered RNA polynucleotide in linear form, and

[0431] (c) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (b) .

[0432] 24. A method for preparing a composition for delivering to a subject, comprising:

[0433] (a) providing the RNA polynucleotide precursor of any one of items 1 to 7,

[0434] (b) allowing the RNA polynucleotide precursor to undergo intramolecular self-cleavage, thereby producing an engineered RNA polynucleotide in linear form,

[0435] (c) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (b) , and

[0436] (d) formulating the enriched engineered RNA polynucleotide.

[0437] 25. A method for preparing a pharmaceutical composition, comprising:

[0438] (a) providing the RNA polynucleotide precursor of any one of items 1 to 7,

[0439] (b) allowing the RNA polynucleotide precursor to undergo intramolecular self-cleavage, thereby producing an engineered RNA polynucleotide in linear form,

[0440] (c) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (b) , wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0441] (d) formulating the enriched engineered RNA polynucleotide with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0442] 26. The method of item 25, wherein the engineered RNA polynucleotide exhibits reduced immunogenicity and / or improved stability upon administration to a subject in need thereof.

[0443] 27. The method of item 25 or 26, wherein the pharmaceutically acceptable carrier encapsulates or covalently binds to the engineered RNA polynucleotide.

[0444] 28. The method of any one of items 23 to 25, wherein enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form in step (c) comprises removing the cleaved ribozymes by chromatography.

[0445] 29. The method of item 28, wherein the chromatography comprises an affinity medium capable of specifically binding to the linker or ligand sequence.

[0446] 30. A product prepared using the engineered RNA polynucleotide of any one of items 8 to 12, the RNA polynucleotide precursor of any one of items 1 to 7, the vector of item 13, the cell of item 14 or a pharmaceutical composition of any one of items 18 to 22.

[0447] 31. Use of the engineered RNA polynucleotide of any one items 8 to 12, the RNA polynucleotide precursor of any one of items 1 to 7, the vector of item 13, the cell of item 14 or a pharmaceutical composition of any one of items 18 to 22 in the manufacture of a medicament for  preventing or treating a disease or condition in a subject.

[0448] Additionally, the present invention further provides the following embodiments:

[0449] 1. An isolated engineered RNA polynucleotide comprising:

[0450] (a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0451] (b) a nucleotide sequence of interest, and

[0452] (c) a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group.

[0453] 2. The engineered RNA polynucleotide of item 1, wherein said engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved stability.

[0454] 3. The engineered RNA polynucleotide of item 2 or 3, wherein the nucleotide sequence of interest comprises one or more coding or non-coding sequences.

[0455] 4. The engineered RNA polynucleotide of item 3, wherein the nucleotide sequence of interest further comprises a translation initiation element (TIE) , or a non-TIE functional element.

[0456] 5. The engineered RNA polynucleotide of any one of items 1 to 4, which is generated via (i) intramolecular self-cleavage of ribozyme, (ii) chemical synthesis, or (iii) in vitro translation from a DNA template followed by terminal modification.

[0457] 6. An isolated RNA polynucleotide precursor, comprising:

[0458] (a) a self-cleaving ribozyme I or a fragment thereof,

[0459] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, and a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0460] (c) a self-cleaving ribozyme II or a fragment thereof,

[0461] wherein said self-cleaving ribozyme I or fragment thereof and said self-cleaving ribozyme II or fragment thereof are capable of catalyzing intramolecular self-cleavage from said RNA polynucleotide precursor, thereby forming an engineered RNA polynucleotide in linear form.

[0462] 7. An isolated RNA polynucleotide precursor, comprising:

[0463] (a) a self-cleaving ribozyme I fragment,

[0464] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, and a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0465] (c) a self-cleaving ribozyme II fragment,

[0466] wherein said self-cleaving ribozyme I fragment and said self-cleaving ribozyme II fragment have a sequence identity of at least 85%to the catalytic domain of said ribozyme I and ribozyme II respectively and are capable of catalyzing the intramolecular self-cleavage from said RNA polynucleotide precursor, thereby forming an engineered RNA polynucleotide in linear form.

[0467] 8. The RNA polynucleotide precursor of item 6 or 7, wherein the self-cleaving ribozyme I and self-cleaving ribozyme II are the same or different ribozymes.

[0468] 9. The RNA polynucleotide precursor of any one of items 6 to 8, wherein the self-cleaving ribozyme I and self-cleaving ribozyme II are selected from Table 1.

[0469] 10. The RNA polynucleotide precursor of any one of items 6 to 9, wherein the engineered RNA polynucleotide in linear form comprises a 5’ end hydroxyl group, the polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, the 5’ ribozyme I recognition site, the nucleotide sequence of interest, and the 3’ ribozyme II recognition site, and a 3’ end 2’, 3’-cyclic phosphate group.

[0470] 11. The RNA polynucleotide precursor of any one of items 6 to 10, further comprising a first linker at 5' upstream of the 5' ribozyme I and / or a second linker at 3' downstream of the 3' ribozyme II.

[0471] 12. The RNA polynucleotide precursor of item 11, wherein the first linker comprises a first ligand sequence and / or the second linker comprises a second ligand sequence.

[0472] 13. An isolated engineered RNA polynucleotide comprising:

[0473] (a) a 5’ terminal hydroxyl group,

[0474] (b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, and a 3’ ribozyme II recognition site, and

[0475] (c) a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group.

[0476] 14. The engineered RNA polynucleotide of item 13, wherein said engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved stability.

[0477] 15. The engineered RNA polynucleotide of item 13 or 14, wherein the nucleotide sequence of interest comprises one or more coding or non-coding sequences.

[0478] 16. The engineered RNA polynucleotide of item 15, wherein the nucleotide sequence of interest further comprises a translation initiation element (TIE) , or a non-TIE functional element.

[0479] 17. The engineered RNA polynucleotide of any one of items 13 to 16, which is generated via intramolecular self-cleavage of the RNA polynucleotide precursor of any one of items 6 to 12.

[0480] 18. A vector comprising a DNA sequence encoding the RNA polynucleotide precursor of any one of items 6 to 12.

[0481] 19. A cell comprising the vector of item 18.

[0482] 20. A method of providing a polypeptide to a subject, comprising

[0483] (a) delivering to the subject the engineered RNA polynucleotide of any one of items 1 to 5 and 13 to 17, wherein the sequence of interest comprises (i) one or more coding sequences of the polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) one or more translation initiation elements, for example, an IRES, and

[0484] (b) expressing the nucleotide sequence of interest.

[0485] 21. A method of delivering a nucleotide sequence of interest to a subject, comprising:

[0486] (a) preparing the engineered RNA polynucleotide of any one of items 1 to 5 and 13 to 17,

[0487] (b) administering to the subject the engineered RNA polynucleotide prepared in (a) , and

[0488] (c) optionally expressing the nucleotide sequence of interest in the subject.

[0489] 22. A method of diagnosing a disease in a subject, comprising

[0490] (a) delivering to a subject the engineered RNA polynucleotide of any one of items 1 to 5 and 13 to 17, wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a diagnostic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0491] (b) expressing the coding sequence of the polypeptide, and

[0492] (c) detecting the occurrence or level of a signal in a tissue of the subject or in a biological sample obtained from the subject, wherein the signal is associated with the expression or activity of the polypeptide, and wherein the occurrence or level of the signal is indicative the presence or absence of the disease in the subject.

[0493] 23. A composition, which comprises:

[0494] (a) the engineered RNA polynucleotide of any one of items 1 to 5 and 13 to 17, and

[0495] (b) an acceptable carrier or excipient.

[0496] 24. The composition of item 23, wherein said composition is a pharmaceutical composition.

[0497] 25. The composition of item 23, wherein said composition is a cosmetic composition.

[0498] 26. The composition of item 24, which comprises

[0499] the engineered RNA polynucleotide of any one of items 1 to 5 and 13 to 17, wherein the polynucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0500] a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0501] 27. The composition of item 25, which comprises

[0502] the engineered RNA polynucleotide of any one of items 1 to 5 and 13 to 17, wherein the polynucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0503] a cosmetically acceptable carrier or excipient.

[0504] 28. The composition of item 26 or 27, wherein the pharmaceutically or cosmetically acceptable carrier encapsulates or covalently binds to the engineered RNA polynucleotide, for example the carrier is a lipid nanoparticle.

[0505] 29. A method for preparing an engineered RNA polynucleotide, which comprises:

[0506] providing an RNA polynucleotide precursor of any one of items 6 to 12,

[0507] allowing the RNA polynucleotide precursor to undergo intramolecular self-cleavage, thereby  producing an engineered RNA polynucleotide in linear form, and

[0508] enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (b) .

[0509] 30. A method for preparing a composition for delivering to a subject, comprising:

[0510] (a) providing the engineered RNA polynucleotide of any one of items 1 to 5 and 13 to 17,

[0511] (b) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (a) , and

[0512] (c) optionally, formulating the enriched engineered RNA polynucleotide.

[0513] 31. A method for preparing a composition for delivering to a subject, comprising:

[0514] (a) providing an RNA polynucleotide precursor of any one of items 6 to 12,

[0515] (b) allowing the RNA polynucleotide precursor to undergo intramolecular self-cleavage, thereby producing an engineered RNA polynucleotide in linear form,

[0516] (c) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (b) , and

[0517] (d) optionally formulating the enriched engineered RNA polynucleotide.

[0518] 32. A method for preparing a pharmaceutical or cosmetic composition, comprising:

[0519] (a) providing the engineered RNA polynucleotide of any one of items 1 to 5 and 13 to 17,

[0520] (b) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (a) , wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a biological active protein, a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0521] (c) optionally formulating the enriched engineered RNA polynucleotide with a pharmaceutically or cosmetically acceptable carrier or excipient.

[0522] 33. A method for preparing a pharmaceutical or cosmetic composition, comprising:

[0523] (a) providing an RNA polynucleotide precursor of any one of items 6 to 12,

[0524] (b) allowing the RNA polynucleotide precursor to undergo intramolecular self-cleavage, thereby producing an engineered RNA polynucleotide in linear form,

[0525] (c) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (b) , wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a biological active protein, a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and

[0526] (d) optionally formulating the enriched engineered RNA polynucleotide with a pharmaceutically or cosmetically acceptable carrier or excipient.

[0527] 34. The method of any one of items 29 to 33, wherein the engineered RNA polynucleotide exhibits reduced immunogenicity and / or improved stability upon administration to a subject in need thereof.

[0528] 35. The method of any one of items 29 to 34, wherein the pharmaceutically or cosmetically acceptable carrier encapsulates or covalently binds to the engineered RNA polynucleotide.

[0529] 36. The method of any one of items 29 to 33, wherein enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form comprises removing the cleaved ribozymes by chromatography.

[0530] 37. The method of item 36, wherein the chromatography comprises an affinity medium capable of specifically binding to the linker or ligand sequence.

[0531] 38. A product prepared using the engineered RNA polynucleotide of any one of items 1 to 5 and 13 to 17, the RNA polynucleotide precursor of any one of items 6 to 12, the vector of item 18, the cell of item 19 or a composition of any one of items 23 to 28.

[0532] 39. A product comprising the engineered RNA polynucleotide of any one of items 1 to 5 and 13 to 17, the RNA polynucleotide precursor of any one of items 6 to 12 or a composition of any one of items 23 to 28.

[0533] 40. The product of item 39, which further comprises a device or an appliance for application.

[0534] 41. Use of the engineered RNA polynucleotide of any one items 1 to 5 and 13 to 17, the RNA polynucleotide precursor of any one of items 6 to 12, the vector of item 18, the cell of item 19 or a composition of any one of items 23 to 28 in the manufacture of a medicament for preventing or treating a disease or condition in a subject.

[0535] 42. Use of the engineered RNA polynucleotide of any one items 1 to 5 and 13 to 17, the RNA polynucleotide precursor of any one of items 6 to 12, the vector of item 18, the cell of item 19 or a composition of any one of items 23 to 28 for cosmetic treatment or personal care.

[0536] Examples

[0537] The following examples have been included to provide guidance to one of ordinary skill in the art for practicing representative embodiments of the presently disclosed subject matter. In light of the present disclosure and the general level of skill in the art, those of skill can appreciate that the following examples are intended to be exemplary only and that numerous changes, modifications, and alterations can be employed without departing from the scope of the presently disclosed subject matter. The synthetic descriptions and specific examples that follow are only intended for the purposes of illustration and are not to be construed as limiting in any manner the present invention.

[0538] Example 1. Generation of RL RNA by ribozyme autocatalyzation

[0539] The linear RNA generated by ribozyme autocatalyzation is named RL RNA (Ribozyme Linear RNA) , which is different from the conventional linear RNA produced by transcription in that it contains 5’ end hydroxyl and 3’ end 2’, 3’-cyclic phosphate (Figure 1) . To produce the RL RNA, the POLR2A and IRES-Nano-Luciferase (SEQ ID NOs: 142 and 141) sequences were used  as example cargos to construct an RNA polynucleotide precursor, respectively. In brief, a plasmid template containing POLR2A inserted between the Sm and P1 Twister ribozymes (SEQ ID NOs: 3 and 2) and a plasmid template containing IRES-Nano-Luciferase inserted between the Cb and P1 Twister ribozymes (SEQ ID NOs: 6 and 2) were constructed, respectively. In addition, two linkers of different lengths containing ligand for purification were inserted in the plasmid templates, at the 5' terminal (upstream) of the 5' ribozyme and the 3' terminal (downstream) of the 3' ribozyme, respectively, to facilitate RL RNA analysis, identification, and purification. Precursors of RL RNA (SEQ ID NOs: 48 and 49) were prepared by in vitro transcription from the linearized plasmid templates using T7 RNA polymerase according to the manufacturer's instructions (TINZYME) , and RL RNAs (SEQ ID NOs: 90 and 91) were generated through a further step of ribozyme self-cleavage of the precursors in 30mM Mg2+-containing buffer at 55 ℃for 15min. The agarose gel data showed that most of the precursor RNA can undergo complete self-cleavage to form RL RNA (Figure 2 and 3) . The linear RNA with ribozyme cleavage site mutations or with same length is used as the markers to indicated precursor (Pre RL POLR2A mutant, Pre RL nLuc) , 5' precursor (5’ Pre RL POLR2A mutant, 5’ Pre RL nLuc) , and 3' precursor (3’Pre RL POLR2A mutant, 3’ Pre RL nLuc) .

[0540] Example 2. Determination of RL RNA end groups

[0541] To further verify that the 3’-terminus of the RL RNA is a cyclic phosphate group, we generated RL POLR2A RNA (SEQ ID NO: 38) using P3 Twister U2A and P1 Twister ribozyme based on the method described in Example 1, and purified high-purity RL RNA by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (denaturing PAGE) (Figure 4A and 5) and then, performed tailing experiments using polyadenylate polymerase (PAP) according to the manufacturer's instructions (TINZYME) , which is an enzyme that catalyzes the addition of a poly A tail to 3’ hydroxyl-terminated RNA. As expected, compared with the linear POLR2A produced by in vitro transcription, Poly A tail cannot be added to the 3’-terminus of RL POLR2A RNA after PAP treatment (Figure 4B) . Then, before the PAP reaction, we treated the RL POLR2A RNA with T4 PNK (T4 polynucleotide kinase (NEB) ) , an enzyme that converts the 2’, 3’-cyclic phosphate group at the 3’-terminus of the RNA to a hydroxyl. The data showed that after T4 PNK treatment, RL POLR2A RNA could be completely poly A-tailed during the PAP reaction (Figure 4B) . In conclusion, the 3’-terminus of RL RNA produced by ribozyme self-cleavage has a 2’, 3’-cyclic phosphate group instead of a hydroxyl group and the 5' end of the cleaved ribozyme II is a hydroxyl group. Similarly, the 5' end of the RL RNA generated by ribonuclease I is a hydroxyl group, and the 3' end of the cleaved ribonuclease I is a 2’, 3’-cyclic phosphate.

[0542] Example 3. Ribozyme autocatalyzed linear RNA (RL RNA) does not activate innate immune responses

[0543] Foreign linear RNA can activate a number of innate immune receptors, including Toll-like receptor 3 (TLR3) , TLR7, TLR8 and RIG-I, which may in turn initiate immune responses. TLR-mediated immunogenicity of linear RNA can be reduced by incorporating base modifications found in natural RNA, such as m5C, N6-methyladenosine (m6A) , Ψ, m1-Ψ, 5-methyluridine (m5U) , and 2-thiouridine (s2U) , individually or in combination into linear RNA. To test whether RL RNA can activate the innate immune response, RL POLR2A (SEQ ID NO: 38) and RL Nano-Luciferase (SEQ ID NO: 83) , which were generated by P3 Twister U2A and P1 Twister ribozyme based on the method described in Example 1, were transfected into 1.5x105 human A549 cells at 200ng or 500ng using Lipofectamine MessengerMAXTM (Thermo Fisher) RNA transfection reagent, respectively, and then detected the expression level of cytokines, like IFNβ, TNF-α, IL6 and RIG-I by quantitative RT-PCR and normalized to 18S rRNA. mRNA modified with m1Ψ and circular RNA (circular POLR2A is expressed in cells and cannot be recognized as the foreign) , were used as negative RNA control. Poly (I: C) , a long double-stranded RNA that mimics viral infection activating cellular immune responses, was used as a positive control. The results showed that there was no significant difference in the expression levels of cytokines after transfection of RL POLR2A or RL NanoLuc (Figures 6 and 7) . In contrast, unpurified RL RNA, unmodified mRNA, and conventional linear RNA generated by IVT all showed strong induction of cytokine expression (Figures 6 and 7) . IFNβ, TNF-α, IL6 and RIG-I are commonly used as marker gene for the measurement of cellular immunogenicity. This data demonstrated that the RL RNA generated by ribozyme autocatalyzation did not cause significant immune responses and further supported that RL RNA could be a new therapeutic modality.

[0544] Example 4. RL RNA evades the surveillance of Toll-like receptors

[0545] To further confirm that RL RNA is non-immunogenic, we transfected the RL RNA into Toll-like receptor cell lines, such as the HEK-BlueTM-hTLR7 / 8 / 9 reporter cell line (InvivoGen, San Diego, USA) and the TLR3 / NF-Kb-Luc / HEK293 cell line (Cobioer, Nanjing, China) , and monitored the activation of the NF-κB pathway using a secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) reporter gene or detected the activity of the luciferase reporter gene using the One-Glo Ex reagent (Promega) . Briefly, the different RNAs modality were transfected into cells at a density of 40,000 cells per well in 96-well plates at a concentration range of 0-2μg / ml. After 24h post-transfection, supernatant was collected for SEAP activity and luciferase activity detection. The data showed that RL POLR2A did not induce the Toll-like receptor signaling pathway, indicating no immune response to RL RNA (Figure 8) . Lipo is transfection reagent used as the negative  control. R848, Poly I: C or ODN2006, which activated TLR7 / 8, TLR3 and TLR9, respectively, were used as the positive control.

[0546] Example 5. The stability of RL RNA in cells

[0547] RL POLR2A and RL Nano-Luciferase were then used as the example (SEQ ID NOs: 38 and 83) to test the intracellular stability of in vitro synthesized RL RNA and linear RNA. Briefly, we transfected an equal amount (200 ng) of RL RNA and conventional linear RNA into human HEK293FT cells using Lipofectamine MessengerMAXTM (Thermo Fisher) RNA transfection reagent, respectively. Next, at the time points shown in Figures 9 and 10, HEK293FT cells transfected with RL RNA and linear RNA were collected, and Trizol reagent was added to extract the total RNA from the cells. Northern Blot (NB) and quantitative RT-PCR were used to detect the amount of RL RNA and linear RNA in cells. The results (Figures 9 and 10) showed that RL RNA exhibit better in vivo stability than linear RNAs produced by transcription, regardless of whether it is mRNA or IVT generated RNA.

[0548] Example 6. Translation of RL RNA in cells

[0549] To verify whether RL RNA can achieve protein translation in vivo and become a new modality, we transfected RL NanoLuc containing the IRES sequence (SEQ ID NO: 144) into cells to assess its translation efficiency (SEQ ID NO: 83) . Briefly, 200ng RL RNAs were transfected into HEK293FT cells at a density of 200,000 cells per well in 12-well plates. After 24h post-transfection, the Nano-Luciferse expression levels were measured by luminescence signal of Nano-Luciferase by adding the corresponding substrate (Promega) . The data showed that RL Nano-Luciferase can be efficiently translated at a high level by the IRES (Figure 11) .

[0550] Example 7. The self-catalytic cleavage efficiency of different ribozyme types

[0551] To demonstrate that besides the ribozyme we used in Examples 1-3 can produce RL RNA, other types of ribozymes also have self-cleavage activity and can generate RL RNA. We selected ribozymes from 8 different types, including Twister, Twister Sister, HDV Ribozyme, Hammerhead Ribozyme, Hovlinc, Hatchet, Pistol, and LINE-1, and tested their self-cleavage efficiency. Briefly, we inserted the ribozyme sequences at the 5' or 3' end of the POLR2A, IRES-Luciferase, or IRES-NanoLuc sequences, and constructed the corresponding plasmids (SEQ ID NOs: 41-46, 53-65 and 78-82) . Next, we generated the RL RNA by in vitro transcription from linearized plasmid template using T7 RNA polymerase according to the manufacturer's instructions and further ribozyme self-cleavage in 30mM Mg2+-containing buffer at 55 ℃ for 15min. Then, we analyzed the ribozyme cleavage efficiency using PAGE or agarose gel. The  results showed that all ribozymes exhibited self-cleavage activity and can generate RL RNA, with ribozymes such as Sm, Os, TS-2, vLTSV-A, Es, and Cb showing significantly higher cleavage activity (SEQ ID NOs: 3, 6, 8, 10, 14 and 17) (Figures 12-16) .

[0552] Example 8. The efficacy of IRES to drive RL RNA translation in varying cells

[0553] To establish RL RNA as a reliable alternative to existing linear mRNA technology, it is desirable to maximize protein expression. Cap-independent translation mediated by an IRES can exhibit varying levels of efficiency depending on cell context and is generally considered less efficient than cap-dependent translation when included in bicistronicity linear mRNA (Borman, A.M., et al., Comparison of picornaviral IRES-driven internal initiation of translation in cultured cells of different origins. Nucleic Acids Res. 25, 925–932 (1997) ) . However, the efficiency of different IRES sequences within the context of RL RNA has not been investigated. We selected the 5’UTR from the 12 viral transcripts that contain known or putative IRESs to drive the RL Luciferase (SEQ ID NOs: 107-117 and 123) translation in 5 cell lines, including C2C12, HeLa, HaCaT, 293T / 17 and Hep3B. We found that these IRES sequences can all drive RL Luciferase translation, with significant differences observed in different cell types, especially the 18-675 IRES, which performed well in HeCaT and Hep3B cells but showed lower activity in 293T / 17 and HeLa cells (Figure 17) .

[0554] Example 9. The RL RNA is translatable in vivo

[0555] The translation and immunogenicity of RL RNA have been identified, but whether it can be delivered for in vivo expression is still unknown. We first prepared three RL Luciferase RNAs driven by different IRES (SEQ ID NOs: 109, 110 and 123) . Subsequently, using the LNP system, we delivered 1μg of each RL RNA into mice (Balb / C, Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. ) and assessed the expression levels of luciferase protein in vivo at 6h, 24h, 48h, and 72h. The results showed that within 72 hours, all RL RNAs exhibited sustained and stable expression, but different IRES sequences showed varying expression levels in vivo. These results indicate that RL RNA can achieve diversified in vivo expression through IRES, demonstrating its potential for application in the treatment of various diseases (Figure 18) .

[0556] Sequences mentioned herein:

Claims

1.An isolated engineered RNA polynucleotide comprising:(a) a 5’ terminal hydroxyl group,(b) a nucleotide sequence of interest, and(c) a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group.2.The engineered RNA polynucleotide of claim 1, wherein said engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved stability.3.The engineered RNA polynucleotide of claim 2 or 3, wherein the nucleotide sequence of interest comprises one or more coding or non-coding sequences.4.The engineered RNA polynucleotide of claim 3, wherein the nucleotide sequence of interest further comprises a translation initiation element (TIE) , or a non-TIE functional element.5.The engineered RNA polynucleotide of any one of claims 1 to 4, which is generated via (i) intramolecular self-cleavage of ribozyme, (ii) chemical synthesis, or (iii) in vitro translation from a DNA template followed by terminal modification.6.An isolated RNA polynucleotide precursor, comprising:(a) a self-cleaving ribozyme I or a fragment thereof,(b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, and a 3’ ribozyme II recognition site, and(c) a self-cleaving ribozyme II or a fragment thereof,wherein said self-cleaving ribozyme I or fragment thereof and said self-cleaving ribozyme II or fragment thereof are capable of catalyzing intramolecular self-cleavage from said RNA polynucleotide precursor, thereby forming an engineered RNA polynucleotide in linear form.7.An isolated RNA polynucleotide precursor, comprising:(a) a self-cleaving ribozyme I fragment,(b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, and a 3’ ribozyme II recognition site, and(c) a self-cleaving ribozyme II fragment,wherein said self-cleaving ribozyme I fragment and said self-cleaving ribozyme II fragment have a sequence identity of at least 85%to the catalytic domain of said ribozyme I and ribozyme II respectively and are capable of catalyzing the intramolecular self-cleavage from said RNA polynucleotide precursor, thereby forming an engineered RNA polynucleotide in linear form.8.The RNA polynucleotide precursor of claim 6 or 7, wherein the self-cleaving ribozyme I and self-cleaving ribozyme II are the same or different ribozymes.9.The RNA polynucleotide precursor of any one of claims 6 to 8, wherein the self-cleaving  ribozyme I and self-cleaving ribozyme II are selected from Table 1.10.The RNA polynucleotide precursor of any one of claims 6 to 9, wherein the engineered RNA polynucleotide in linear form comprises a 5’ end hydroxyl group, the polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, the 5’ ribozyme I recognition site, the nucleotide sequence of interest, and the 3’ ribozyme II recognition site, and a 3’ end 2’, 3’-cyclic phosphate group.11.The RNA polynucleotide precursor of any one of claims 6 to 10, further comprising a first linker at 5' upstream of the 5' ribozyme I and / or a second linker at 3' downstream of the 3' ribozyme II.12.The RNA polynucleotide precursor of claim 11, wherein the first linker comprises a first ligand sequence and / or the second linker comprises a second ligand sequence.13.An isolated engineered RNA polynucleotide comprising:(a) a 5’ terminal hydroxyl group,(b) a polynucleotide sequence comprising from 5’ to 3’ direction, a 5’ ribozyme I recognition site, a nucleotide sequence of interest, and a 3’ ribozyme II recognition site, and(c) a 3’ terminal 2’, 3’-cyclic phosphate group.14.The engineered RNA polynucleotide of claim 13, wherein said engineered RNA polynucleotide has reduced immunogenicity and / or improved stability.15.The engineered RNA polynucleotide of claim 13 or 14, wherein the nucleotide sequence of interest comprises one or more coding or non-coding sequences.16.The engineered RNA polynucleotide of claim 15, wherein the nucleotide sequence of interest further comprises a translation initiation element (TIE) , or a non-TIE functional element.17.The engineered RNA polynucleotide of any one of claims 13 to 16, which is generated via intramolecular self-cleavage of the RNA polynucleotide precursor of any one of claims 6 to 12.18.A vector comprising a DNA sequence encoding the RNA polynucleotide precursor of any one of claims 6 to 12.19.A cell comprising the vector of claim 18.20.A method of providing a polypeptide to a subject, comprising(a) delivering to the subject the engineered RNA polynucleotide of any one of claims 1 to 5 and 13 to 17, wherein the sequence of interest comprises (i) one or more coding sequences of the polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) one or more translation initiation elements, for example, an IRES, and(b) expressing the nucleotide sequence of interest.21.A method of delivering a nucleotide sequence of interest to a subject, comprising:(a) preparing the engineered RNA polynucleotide of any one of claims 1 to 5 and 13 to 17,(b) administering to the subject the engineered RNA polynucleotide prepared in (a) , and(c) optionally expressing the nucleotide sequence of interest in the subject.22.A method of diagnosing a disease in a subject, comprising(a) delivering to a subject the engineered RNA polynucleotide of any one of claims 1 to 5 and 13 to 17, wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a diagnostic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and(b) expressing the coding sequence of the polypeptide, and(c) detecting the occurrence or level of a signal in a tissue of the subject or in a biological sample obtained from the subject, wherein the signal is associated with the expression or activity of the polypeptide, and wherein the occurrence or level of the signal is indicative the presence or absence of the disease in the subject.23.A composition, which comprises:(a) the engineered RNA polynucleotide of any one of claims 1 to 5 and 13 to 17, and(b) an acceptable carrier or excipient.24.The composition of claim 23, wherein said composition is a pharmaceutical composition.25.The composition of claim 23, wherein said composition is a cosmetic composition.26.The composition of claim 24, which comprises(a) the engineered RNA polynucleotide of any one of claims 1 to 5 and 13 to 17, wherein the polynucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and(b) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.27.The composition of claim 25, which comprises(a) the engineered RNA polynucleotide of any one of claims 1 to 5 and 13 to 17, wherein the polynucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and(b) a cosmetically acceptable carrier or excipient.28.The composition of claim 26 or 27, wherein the pharmaceutically or cosmetically acceptable carrier encapsulates or covalently binds to the engineered RNA polynucleotide, for example the carrier is a lipid nanoparticle.29.A method for preparing an engineered RNA polynucleotide, which comprises:(a) providing an RNA polynucleotide precursor of any one of claims 6 to 12,(b) allowing the RNA polynucleotide precursor to undergo intramolecular self-cleavage, thereby producing an engineered RNA polynucleotide in linear form, and(c) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (b) .30.A method for preparing a composition for delivering to a subject, comprising:(a) providing the engineered RNA polynucleotide of any one of claims 1 to 5 and 13 to 17,(b) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (a) , and(c) optionally, formulating the enriched engineered RNA polynucleotide.31.A method for preparing a composition for delivering to a subject, comprising:(a) providing an RNA polynucleotide precursor of any one of claims 6 to 12,(b) allowing the RNA polynucleotide precursor to undergo intramolecular self-cleavage, thereby producing an engineered RNA polynucleotide in linear form,(c) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (b) , and(d) optionally formulating the enriched engineered RNA polynucleotide.32.A method for preparing a pharmaceutical or cosmetic composition, comprising:(a) providing the engineered RNA polynucleotide of any one of claims 1 to 5 and 13 to 17,(b) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (a) , wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a biological active protein, a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and(c) optionally formulating the enriched engineered RNA polynucleotide with a pharmaceutically or cosmetically acceptable carrier or excipient.33.A method for preparing a pharmaceutical or cosmetic composition, comprising:(a) providing an RNA polynucleotide precursor of any one of claims 6 to 12,(b) allowing the RNA polynucleotide precursor to undergo intramolecular self-cleavage, thereby producing an engineered RNA polynucleotide in linear form,(c) enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form produced from step (b) , wherein the nucleotide sequence of interest comprises (i) a coding sequence of a polypeptide, for example a biological active protein, a therapeutic protein or an enzyme, and (ii) a translation initiation element, for example, an IRES, and / or a translation regulatory element, and(d) optionally formulating the enriched engineered RNA polynucleotide with a pharmaceutically or cosmetically acceptable carrier or excipient.34.The method of any one of claims 29 to 33, wherein the engineered RNA polynucleotide exhibits reduced immunogenicity and / or improved stability upon administration to a subject in need thereof.35.The method of any one of claims 29 to 34, wherein the pharmaceutically or cosmetically acceptable carrier encapsulates or covalently binds to the engineered RNA polynucleotide.36.The method of any one of claims 29 to 33, wherein enriching the engineered RNA polynucleotide in linear form comprises removing the cleaved ribozymes by chromatography.37.The method of claim 36, wherein the chromatography comprises an affinity medium capable of specifically binding to the linker or ligand sequence.38.A product prepared using the engineered RNA polynucleotide of any one of claims 1 to 5 and 13 to 17, the RNA polynucleotide precursor of any one of claims 6 to 12, the vector of claim 18, the cell of claim 19 or a composition of any one of claims 23 to 28.39.A product comprising the engineered RNA polynucleotide of any one of claims 1 to 5 and 13 to 17, the RNA polynucleotide precursor of any one of claims 6 to 12 or a composition of any one of claims 23 to 28.40.The product of claim 39, which further comprises a device or an appliance for application.41.Use of the engineered RNA polynucleotide of any one claims 1 to 5 and 13 to 17, the RNA polynucleotide precursor of any one of claims 6 to 12, the vector of claim 18, the cell of claim 19 or a composition of any one of claims 23 to 28 in the manufacture of a medicament for preventing or treating a disease or condition in a subject.42.Use of the engineered RNA polynucleotide of any one claims 1 to 5 and 13 to 17, the RNA polynucleotide precursor of any one of claims 6 to 12, the vector of claim 18, the cell of claim 19 or a composition of any one of claims 23 to 28 for cosmetic treatment or personal care.

Images