Stable liquid protease compositions for use in animal feed

Abstract

A liquid formulation of a protease suitable for use in as an animal feed additive comprises at least 30% and not more than 70% of a polyol, wherein the polyol consists essentially of glycerol and sorbitol. The liquid formulation provides improved protease stability during storage at elevated temperatures.

Description

STABLE LIQUID PROTEASE COMPOSITIONS FOR USE IN ANIMAL FEED

[0001] Reference to sequence listing

[0002] This application contains a Sequence Listing in computer readable form. The computer readable form is incorporated herein by reference.FIELD OF THE INVENTION

[0003] The invention is directed to a liquid formulation of a protease with improved stability for use as an animal feed additive.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0004] The use of enzymes in solution form has increased in recent years. There are concerns about handling enzymes in powder or granulate form due to dust, irritation or allergy issues, and to alleviate this problem, the provision of the enzymes in the form of a liquid composition or solution has been attempted. However, enzymes in a liquid solution are notoriously unstable, in particular under storage for an extended period of time.

[0005] This problem is considered particularly difficult in relation to proteases. Carbohydrase products, such as XT, which is a liquid preparation containing a xylanase, is commercially available in two liquid forms, both of which comprise about 35%sorbitol and about 1%citric acid.  is also a commercially available liquid preparation containing a xylanase. It contains much lower amounts of sorbitol and further comprises 0.1-0.4%potassium sorbate. The commercially available carbohydrase-containing product furthermore comprises 30-40%sorbitol and further comprises about 5%monosodium glutamate.

[0006] is a liquid phytase fermentation product preparation comprising sorbitol, sodium chloride, potassium sorbate, sodium benzoate and water.  is a liquid phytase concentrate comprising 30%sucrose, sodium benzoate and water.

[0007] EP3390626 discloses a liquid enzyme formulation of an alpha-amylase using glycerol as a stabilizer.

[0008] US 3,717,550 discloses a liquid protease preparation containing 40 to 98%glycerol and 2 to 60%enzyme solids. However, with many serine proteases, it was found that 50%or more glycerol formulations form cloudy suspensions that are unrealistic to work with in production scale and are not considered practical due to settling upon storage.

[0009] WO 2019 / 043191 discloses a liquid formulation an S8 protease in liquid formulation comprising 20%to 80%w / w of polyol, wherein the polyol is selected from the group consisting of glycerol, sorbitol, propylene glycol (MPG) , ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, 1, 2-propylene glycol or 1, 3-propylene glycol, dipropylene glycol, polyethylene glycol (PEG) having an average molecular weight below about 600 and polypropylene glycol (PPG) having an average molecular weight below about 600 or any combination thereof. WO 2019 / 043191 further discloses a liquid formulation of a protease having 0.1%to 10%w / w enzyme protein, 40-60%glycerol as polyol, 0.1 to 0.5%sodium benzoate and water.

[0010] CN 116064497 discloses an oil-soluble liquid protease for use in animal feed.

[0011] There is a need in the animal feed industry for a storage-stable protease formulation. There is in particular a desire in the industry to have a liquid protease formulation having at least 50%proteolytic activity after several weeks of storage at elevated temperatures.

[0012] It has been surprisingly found that liquid compositions comprising a combination of the polyols sorbitol and glycerol provide improved stability compared to compositions comprising individual polyols.SUMMARY OF THE INVENTION

[0013] There is a need in the animal feed industry for a liquid protease formulation that is storage-stable, for example having residual activity above 60%after at least 10 weeks at temperatures above room temperature (such as at 30℃ or higher, such as at 35℃ or at 40℃) . It has surprisingly been found that using a combination of certain amounts of glycerol and sorbitol provides greater stability than the use of other polyols or glycerol and sorbitol individually. It has thus been found that improved stability may be obtained by means of a combined weight content of sorbitol and glycerol of at least 30%and up to 70%.

[0014] Accordingly, an aspect of the invention is directed to a liquid composition comprising

[0015] a. a polypeptide having protease activity; and

[0016] b. a polyol consisting of or consisting essentially of sorbitol and glycerol, wherein the composition comprises at least 30%and not more than 70%polyol.

[0017] In some particular embodiments, the invention is directed to a liquid composition comprising

[0018] a. a polypeptide having protease activity,

[0019] b. a polyol consisting of or consisting essentially of glycerol and sorbitol; and

[0020] i. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 25% sorbitol and about 25%glycerol;

[0021] ii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 27.5%sorbitol and about 27.5%glycerol;

[0022] iii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 30% sorbitol and about 30%glycerol;

[0023] iv. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 32.5%sorbitol and about 32.5%glycerol; .

[0024] v. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 35% sorbitol and about 35%glycerol;

[0025] vi. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 33.3%sorbitol and about 16.7%glycerol;

[0026] vii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 36.7%sorbitol and about 18.3%glycerol;

[0027] viii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 40% sorbitol and about 20%glycerol;

[0028] ix. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 43.3%sorbitol and about 21.7%glycerol;

[0029] x. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 46.7%sorbitol and about 23.3%glycerol;

[0030] xi. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 16.7%sorbitol and about 33.3%glycerol;

[0031] xii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 18.3%sorbitol and about 36.7%glycerol;

[0032] xiii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 20% sorbitol and about 40%glycerol;

[0033] xiv. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 21.7%sorbitol and about 43.3%glycerol;

[0034] xv. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 23.3%sorbitol and about 46.7%glycerol;

[0035] xvi. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 37.5%sorbitol and about 12.5%glycerol;

[0036] xvii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 41.25%sorbitol and about 13.75%glycerol;

[0037] xviii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 45% sorbitol and about 15%glycerol;

[0038] xix. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 48.5%sorbitol and about 16.25%glycerol;

[0039] xx. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 52.5%sorbitol and about 17.5%glycerol;

[0040] xxi. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 12.5%sorbitol and about 37.5%glycerol;

[0041] xxii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 13.75%sorbitol and about 41.25%glycerol;

[0042] xxiii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 15% sorbitol and about 45%glycerol;

[0043] xxiv. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 16.25%sorbitol and about 48.75%glycerol; or

[0044] xxv. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 17.5%sorbitol and about 52.5%glycerol.

[0045] A particular aspect of the invention relates to a liquid composition comprising

[0046] a. a polypeptide having protease activity; and

[0047] b. a polyol consisting of or consisting essentially of sorbitol and glycerol,

[0048] wherein the composition comprises at least 30%and not more than 70%polyol, preferably 35-65%polyol, such as 40-60%polyol, and wherein the weight ratio of sorbitol to glycerol is substantially 1: 1.

[0049] A further aspect of the invention is directed to a liquid composition as defined in the present description and claims for use in animal feed for improving BWG (body weight gain) and / or FCR (feed conversion ratio) in an animal.

[0050] A further aspect of the invention is directed to an animal feed or animal feed additive comprising the liquid composition as defined in the present description and claims.

[0051] Another aspect of the invention is directed to a method of preparing an animal feed additive or animal feed comprising a protease, the method comprising applying the liquid composition as defined by the present description and claims to an animal feed additive or an animal feed.

[0052] A still further aspect of the invention is directed to a method of improving BWG and / or FCR in an animal comprising applying the liquid composition as defined by the present description and claims to an animal feed or to an animal feed additive, and feeding said animal feed or animal feed additive to the animal.

[0053] Another aspect of the invention is directed to the method of stabilizing a protease in a liquid solution, comprising preparing a solution comprising more than 50%and not more than 70%polyol, wherein the solution comprises the protease, 20-40%glycerol and 20-40%sorbitol, and wherein the polyol consists of or consists essentially of glycerol and sorbitol.

[0054] The invention further relates to a method of stabilizing a protease in a liquid solution, comprising preparing a solution comprising at least 30%and not more than 70%polyol, such as 40-60%polyol, wherein the polyol consists of or consists essentially of sorbitol and glycerol, and wherein the weight ratio of sorbitol to glycerol is substantially 1: 1.

[0055] OVERVIEW OF SEQUENCE LISTING

[0056] SEQ ID NO: 1 is a polypeptide having protease activity originating from Nocardiopsis prasina.

[0057] SEQ ID NO: 2 is a polypeptide having protease activity originating from Bacillus sp.

[0058] SEQ ID NO: 3 is a polypeptide having protease activity originating from Bacillus licheniformis

[0059] SEQ ID NO: 4 is a polypeptide having subtilisin / protease activity originating from Bacillus amyloliquefaciens

[0060] SEQ ID NO: 5 is a polypeptide having protease activity originating from Streptomyces fradiae.

[0061] SEQ ID NO: 6 is a polypeptide having protease activity originating from Bacillus amyloliquefaciens.

[0062] SEQ ID NO: 7 is a polypeptide having protease activity originating from Bacillus lentus.

[0063] SEQ ID NO: 8 is a polypeptide having protease activity originating from Bacillus licheniformis.

[0064] SEQ ID NO: 9 is a polypeptide having protease activity originating from Bacillus amyloliquefaciens.

[0065] SEQ ID NO: 10 is a polypeptide having protease activity originating from Bacillus gibsonii.

[0066] SEQ ID NO: 11 is a polypeptide having protease activity originating from Bacillus gibsonii.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0067] The term “protease” is defined herein as an enzyme that hydrolyses peptide bonds. It includes any enzyme belonging to the EC 3.4 enzyme group (including each of the thirteen subclasses thereof) . The EC number refers to Enzyme Nomenclature 1992 from NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, including supplements 1-5 published in Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; and Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; respectively. The term "subtilases" refer to a sub-group of serine protease according to Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 and Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Serine proteases or serine peptidases are a subgroup of proteases characterised by having a serine in the active site, which forms a covalent adduct with the substrate. Further, the subtilases (and the serine proteases) are characterised by having two active site amino acid residues apart from the serine, namely a histidine and an aspartic acid residue. The subtilases may be divided into 6 sub-divisions, i.e. the Subtilisin family, the Thermitase family, the Proteinase K family, the Lantibiotic peptidase family, the Kexin family and the Pyrolysin family.

[0068] The term “protease activity” means a proteolytic activity (EC 3.4) . Proteases of the invention are endopeptidases (EC 3.4.21) . There are several protease activity types. The three main activity types are: trypsin-like, where there is cleavage of amide substrates following Arg or Lys at P1, chymotrypsin-like, where cleavage occurs following one of the hydrophobic amino acids at P1, and elastase-like, with cleavage following an Ala at P1.

[0069] The term “stability” or “stable” includes storage stability and stability during use and reflects the stability of the protease according to the invention as a function of time, e.g. how much activity is retained when the protease is kept in solution. Protease activity and protease stability, expressed as residual activity, may be determined as described in Example 1.

[0070] The term “residual activity” means the activity of the protease, as determined by the method described in Example 1, after storage, for example at 25℃ and 40℃ for 4 weeks and 13 weeks, compared to the activity immediately measured after storage at -18℃.

[0071] The term “solution” means a homogeneous or substantially homogenous mixture of two or more substances. In the present instance, it relates to the protease dissolved in the polyol of the composition.

[0072] The terms “%polyol” , “%sorbitol” or “%glycerol” are intended to mean the weight / weight percentage of the respective or total polyol in the composition. According to the invention, the polyol content consists of or consists substantially of only two polyols, namely sorbitol and glycerol.

[0073] The term “consists essentially of” or “consists substantially of” in relation to the polyols means that the essentially all of the polyol content of the compositions of the invention will be sorbitol and glycerol. In other words, if any other polyols are present in the compositions, these will only be present in minor amounts that do not impact the stabilizing effect of the combination of sorbitol and glycerol. For example, if any polyols other than sorbitol or glycerol are present in the compositions, they are preferably present in an amount (by weight of the composition) of less than 10%, more preferably less than 5%, such as less than 4%, less than 3%, less than 2%or less than 1%. In preferred embodiments, the polyol of the formulations of the invention consists of sorbitol and glycerol.

[0074] A ” substantially 1: 1 ratio” of sorbitol to glycerol means that the amounts (by weight) of sorbitol and glycerol in a liquid composition of the invention are substantially the same. It will be understood that a substantially 1: 1 ratio need not be exactly 1: 1, but that there may be some variation in the ratio while still being approximately 1: 1. In such embodiments, the ratio is typically from about 1: 1.25 to about 1.25: 1, such as from about 1: 1.2 to about 1.2: 1, such as from about 1: 1.15 to about 1.15: 1, e.g. from about 1: 1.1 to about 1.1: 1.

[0075] Liquid protease compositions, when kept at room temperature (25℃) or below, can maintain a residual activity level for a few months. However, the reality is that shipping and storage of liquid protease formulations cannot be maintained at or below 25℃ in a commercial or industrial setting, without refrigeration. This is not viable or practical from a commercial standpoint.

[0076] Accordingly, there is the need in the animal feed industry for a liquid protease composition which can withstand temperatures of up to 40℃ while still allowing the protease of the liquid composition to retain most of its activity for several weeks. The invention is directed to a liquid protease composition where the protease of the liquid composition has a residual activity level of at least 60%, such as at least 65%, such as at least 70%, such as at least 75%, after 4 weeks at 40℃, such as after 6 weeks, at least 8 weeks, at least 10 weeks, or at least 12 weeks, such as 13 weeks.

[0077] A first aspect of the invention is directed to a liquid composition comprising

[0078] a. a polypeptide having protease activity; and

[0079] b. a polyol consisting of or consisting essentially of sorbitol and glycerol; wherein the composition comprises at least 50%polyol.

[0080] In a preferred embodiment, the composition comprises more than 50%and not more than 70%polyol, such as from 55%to 70%polyol, e.g. from 60%to 70%polyol.

[0081] Preferably, the protease in the liquid composition has a residual activity level of at least 60%, such as at least 65%, such as at least 70%, such as at least 80%, after storage for 4 weeks, such as after 6 weeks, at least 8 weeks, at least 10 weeks, or at least 12 weeks, such as 13 weeks. More preferably, the protease has a residual activity of at least 60%, such as at least 70%, such as at least 75%, such as at least 80%, such as at least 85%, such as at least 90%, after at least 8 weeks, such as at least 10 weeks, such as at least 12 weeks, such as 13 weeks. Preferably, these residual activity levels after storage are obtained even after storage at elevated temperatures, for example after storage at 40℃.

[0082] As shown in Example 2, the use of composition comprising 50%glycerol as the sole polyol, 50%sorbitol as the sole polyol, a combination of equal amounts of sorbitol and glycerol, or a mixture of propylene glycol (MPG) , sorbitol and glycerol provided stable liquid formulations (nearly 100%residual activity) at temperatures of 25℃ (or less) after 4 weeks. However, when the temperature was raised to 40℃, the residual activity was reduced to about 70%, about 80%, about 90%and about 27%, respectively, after 4 weeks. After 13 weeks at 40℃, however, the formulation comprising 50%glycerol as the sole polyol retained only about 40%residual activity and the formulation comprising 50%sorbitol retained only 50%residual activity, whereas the formulation comprising 30%sorbitol and 30%glycerol retained 68%residual activity.

[0083] The Examples show that a combination of glycerol and sorbitol provided better stability, i.e. higher residual activity, at elevated temperatures after several weeks, whereas the use of either polyol individually did not provide the desired stability.

[0084] The liquid compositions of the invention are typically essentially free of other polyols than glycerol and sorbitol.

[0085] The inventors further investigated liquid compositions comprising a 1: 1 ratio of sorbitol and glycerol in formulations with different total polyol contents. For example, Example 3 shows liquid compositions with a ratio of sorbitol to glycerol of 1: 1, a pH of 5.4, a content of K-sorbate of 0.3%, and a total polyol content of either 50%, 60%or 70%. The compositions having a 1: 1 ratio of sorbitol and glycerol had a residual activity after 4 weeks at 40℃ of at least 70%, but with the protease used in this example, only those compositions containing more than 50%polyol, i.e. 60%and 70%polyol, were able to retain at least 60%residual activity after 13 weeks at 40℃.

[0086] However, as shown in Example 7, for some proteases (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 8 in this example) , even a polyol content of 40%consisting of sorbitol and glycerol in a 1: 1 ratio was able to provide excellent storage stability. Thus, a polyol content as low as about 40%or even lower and consisting of or consisting essentially of sorbitol and glycerol in a substantially 1: 1 ratio is also of interest.

[0087] Accordingly, in one aspect, the liquid composition composition comprises a polypeptide having protease activity, a polyol consisting of or consisting essentially of glycerol and sorbitol, said composition having a polyol content of at least 30%and not more than 70%and a weight ratio of sorbitol to glycerol of substantially 1: 1. In preferred embodiments of this aspect, the polyol content is in the range of 35-65%, such as 40-60%.

[0088] The effect of the ratio of sorbitol to glycerol was also investigated. As can be seen in Table 8 (Example 4) , at 50%polyol content and a sorbitol to glycerol ratio of 3: 7 or 7: 3, despite having a high residual activity after 4 weeks at 40℃, the residual activity after 13 weeks at 40℃ dropped below the desired 60%residual activity. However, at more than 50%polyol content (60%here) , irrespective of the ratio of sorbitol to glycerol, the residual activity of the protease was over the desired 60%residual activity after after 13 weeks at 40℃. A tendency towards higher activity with more sorbitol than glycerol is also seen.

[0089] Accordingly, in a preferred embodiment, the liquid formulation comprises more than 50%and not more than 70%polyol, and sorbitol and glycerol in a ratio of from 1: 5 to 5: 1, such as from 1: 4 to 5: 1, such as from 1: 3 to 5: 1, such as from 1: 4 to 4: 1, such as from 1: 3 to 4: 1 such as from 1: 3 to 3: 1, such as about 1: 3, about 1: 2, about 1: 1, about 2: 1 or about 3: 1. Preferably, such compositions comprise at least 55%polyol, such as at least 60%polyol.

[0090] In some preferred embodiments, the sorbitol content is at least as much as the glycerol content, i.e. a ratio of sorbitol to glycerol of at least about 1: 1, preferably from about 1: 1 to about 2: 1, such as from about 1: 1 to about 1.5: 1.

[0091] In a particular embodiment, the composition comprises 55-70%, polyol, such as 60-70%polyol, and has a ratio of sorbitol to glycerol of at least about 1: 1, preferably from about 1: 1 to about 2: 1, such as from about 1: 1 to about 1.5: 1, for example about 1: 1, about 1.1: 1, about 1.2: 1, about 1.3: 1, about 1.4: 1 or about 1.5: 1.

[0092] In one embodiment, the composition has a polyol content of more than 50%and not more than 70%, such as from 55%to 70%, such as from 60%to 70%polyol, and suitably comprises at least 20%glycerol and at least 30%sorbitol, such as 20-25%glycerol and 30-35%sorbitol.

[0093] In a further embodiment, the liquid composition has a polyol content of more than 50%and not more than 70%, such as from 55%to 70%, such as from 60%to 70%polyol, and comprises 20-30%glycerol and 30-40%sorbitol, such as 22.5%-27.5%glycerol and 32.5%-37.5%sorbitol, such as about 25%glycerol and about 35%sorbitol.

[0094] In another embodiment, the composition has a polyol content of more than 50%and not more than 70%, and wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of or consisting essentially of sorbitol and glycerol, and comprises more than 25%but less than 40%sorbitol and more than 25%but less than 40%glycerol, for example 30-35%sorbitol and 30-35%glycerol.

[0095] In an embodiment, the liquid composition comprises more than 50%and not more than 70%polyol, including 12.5-20%sorbitol and 37.5-50%glycerol. The polyol consists of or consists essentially of sorbitol and glycerol and is suitably in amounts of 15-30%sorbitol and 30-55%glycerol, such as 16.7-26.7%sorbitol and 33.3%-53.3%glycerol.

[0096] In an alternative embodiment, the liquid composition comprises more than 50%and not more than 70%polyol, including 37.5-50%sorbitol and 12.5-20%glycerol. The polyol consists of or consists essentially sorbitol and glycerol and is suitably in amounts of 30-55%sorbitol and 15-30%glycerol, such as 33.3%-53.3%sorbitol and 16.7-26.7%glycerol. Suitably, the liquid composition comprises at least 20%glycerol and at least 30%sorbitol, such as 25%glycerol and 35%sorbitol.

[0097] In an embodiment, the liquid composition comprises more than 50%and not more than 70%polyol, such as from 55%to 70%, such as from 60%to 70%polyol, wherein the composition comprises 20-40%glycerol and 20-40%sorbitol, such as 25-40%glycerol and 25-40%sorbitol, preferably 25-35%glycerol and 25-35%sorbitol.

[0098] In Tables 1a-1c, examples of suitable liquid compositions (LC) , referred to as compositions i-xxv, are illustrated, along with an indication of the sorbitol-glycerol ratio (Ratio S: G) .

[0099] Table 1 a

[0100] Table 1 b

[0101] Table 1 c

[0102] Suitably, the polypeptide is stable in the liquid formulations of the invention in that it retains at least 50%of its protease activity after 13 weeks at 30℃, such as at least 50%of its protease activity after 13 weeks at 35℃, such as at least 50%of its protease activity after 13 weeks at 40℃. Preferably the polypeptide is stable in that it retains at least 60%of its protease activity after 13 weeks at 30℃, such as at least 60%of its protease activity after 13 weeks at 35℃, such as at least 60%of its protease activity after 13 weeks at 40℃.

[0103] The proteases used in the liquid composition of the invention are catalytic proteins, and the term “active enzyme protein” is defined herein as the amount of catalytic protein (s) , which exhibits proteolytic activity. This can be determined using an activity-based analytical enzyme assay. In such assays, the protease typically catalyzes a reaction generating a colored compound. The amount of the colored compound can be measured and correlated to the concentration of the active enzyme protein. This technique is well-known in the art.

[0104] The protease may be a serine protease, such as a subtilisin. The protease may be a naturally occurring protease of bacterial or fungal origin, or it may be a variant derived from one or more naturally occurring proteases by gene shuffling and / or by substituting, deleting or inserting one or more amino acids. Chemically modified or protein engineered mutants are included. A serine protease may for example be of the S1 family, such as trypsin, or the S8 family such as a subtilisin. A metalloprotease may for example be a thermolysin, e.g. from the M4 family, or another metalloprotease such as those from the M5, M7 or M8 families. The term "subtilases" refers to a sub-group of serine proteases according to Siezen et al., Protein Eng. 4 (1991) 719-737 and Siezen et al., Protein Sci. 6 (1997) 501-523. Serine proteases are a subgroup of proteases characterized by having a serine in the active site, which forms a covalent adduct with the substrate. The subtilases may be divided into six subdivisions, the Subtilisin family, the Thermitase family, the Proteinase K family, the Lantibiotic peptidase family, the Kexin family and the Pyrolysin family.

[0105] Although proteases may be obtained from a variety of organisms, including fungi such as Aspergillus, proteases have generally been obtained from bacteria and in particular from Bacillus. Examples of Bacillus species from which subtilases have been derived include Bacillus lentus, Bacillus alkalophilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus and Bacillus gibsonii. Particular subtilisins include subtilisin lentus, subtilisin Novo, subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN’ , subtilisin 309, subtilisin 147 and subtilisin 168 and e.g. protease PD138 (described in WO 93 / 18140) . Other useful proteases are e.g. those described in WO 01 / 16285 and WO 02 / 16547.

[0106] In an embodiment of the invention, the polypeptide having protease activity is obtainable from Bacillus sp, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus horneckiae, Bacillus licheniformis, Nocardiopsis sp. NRRL 18262, Nocardiopsis alba or Bacillus subtilis ATCC SD-2107.

[0107] In some preferred embodiments, the protease is selected from the group consisting of a polypeptide having at least 80%sequence identity, such as at least 85%sequence identity, such as at least 90%sequence identity, such as at least 95%sequence identity, such as at least 96%, such as at least 97%, such as at least 98%, such as at least 99%, such as 100%sequence identity to any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11.

[0108] In a preferred embodiment of the invention, the protease is the protease from a commercially available protease product used in animal feed, more preferably the protease is any one of or As known to the person skilled in the art, polypeptide sequences often comprise signal sequences, N-terminal and / or C-terminal sequences for purposes of expression and manipulation. Accordingly, the polypeptide sequences of the commercially available products may be varied at either terminal within the scope of the present invention.

[0109] Amino acid alterations, as described above, may be of a minor nature, that is conservative amino acid substitutions or insertions that do not significantly affect the folding and / or activity of the protein; small deletions, typically of 1-30 amino acids; small amino-or carboxyl-terminal extensions, such as an amino-terminal methionine residue; a small linker peptide of up to 20-25 residues; or a small extension that facilitates purification by changing net charge or another function, such as a poly-histidine tract, an antigenic epitope or a binding module.

[0110] Essential amino acids in a polypeptide can be identified according to procedures known in the art, such as site-directed mutagenesis or alanine-scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085) . In the latter technique, single alanine mutations are introduced at every residue in the molecule, and the resultant molecules are tested for protease activity to identify amino acid residues that are critical to the activity of the molecule. See also, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. The active site of the enzyme or other biological interaction can also be determined by physical analysis of structure, as determined by such techniques as nuclear magnetic resonance, crystallography, electron diffraction, or photoaffinity labeling, in conjunction with mutation of putative contact site amino acids. See, for example, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. The identity of essential amino acids can also be inferred from an alignment with a related polypeptide, and / or be inferred from sequence homology and conserved catalytic machinery with a related polypeptide or within a polypeptide or protein family with polypeptides / proteins descending from a common ancestor, typically having similar three-dimensional structures, functions, and significant sequence similarity. Additionally or alternatively, protein structure prediction tools can be used for protein structure modelling to identify essential amino acids and / or active sites of polypeptides. See, for example, Jumper et al., 2021, “Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold” , Nature 596: 583-589.

[0111] Single or multiple amino acid substitutions, deletions, and / or insertions can be made and tested using known methods of mutagenesis, recombination, and / or shuffling, followed by a relevant screening procedure, such as those disclosed by Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95 / 17413; or WO 95 / 22625. Other methods that can be used include error-prone PCR, CRISPR gene editing, phage display (e.g., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; US 5,223,409; WO 92 / 06204) , and region-directed mutagenesis (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127) .

[0112] In one embodiment, the polypeptide having protease activity is selected from the group consisting of

[0113] i. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 1;

[0114] ii. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 2;

[0115] iii. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 3;

[0116] iv. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 4;

[0117] v. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 5;

[0118] vi. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 6;

[0119] vii. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 7;

[0120] viii. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 8;

[0121] ix. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 9;

[0122] x. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 10; and

[0123] xi. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 11.

[0124] For purposes of the present invention, the sequence identity between two amino acid sequences is determined as the output of “longest identity” using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) as implemented in the Needle program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) , preferably version 6.6.0 or later. The parameters used are a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 (EMBOSS version of BLOSUM62) substitution matrix. In order for the Needle program to report the longest identity, the -nobrief option must be specified in the command line. The output of Needle labeled “longest identity” is calculated as follows:

[0125] (Identical Residues x 100)  /  (Length of Alignment –Total Number of Gaps in Alignment)

[0126] Other suitable commercially available protease enzymes include those sold under the trade names Duralase, Durazym,  Ultra,  Ultra, Primase,  Kannase,  Ultra,  Ultra,  Uno,  Key and Excel (Novozymes) , those sold under the tradename Maxatase, Maxacal, Maxapem,  Prime,  MA,  Ox,  OxP,  Properase, FN2, FN3, FN4,  Eraser, Opticlean, Optimase,  P200, and P300 (DuPont / IFF) , BLAP (sequence shown in Figure 29 of US 5352604) and variants hereof (Henkel AG) , KAP (Bacillus alkalophilus subtilisin from Kao) , and  Pro (BASF) .

[0127] As known to the person skilled in the art, the dose of the protease in the liquid solution will vary according to the activity of the protease and to the needs of the user. The liquid composition suitably comprises the protease (or subtilisin) in an amount of 0.5%w / w to 30%w / w, such as 1%w / w to 25%w / w, typically 2%w / w to 25%, such as 5%w / w to 25%. In some embodiments, a high dose of protease is preferred and the composition comprises at least 10%w / w active enzyme protein, such as at least 11%w / w, at least 12%w / w, at least 13%w / w, at least 14%w / w, or at least 15%w / w active enzyme protein. The liquid formulation comprises at most 30%w / w active enzyme protein, such as at most 25%w / w active enzyme protein. The protease is typically dosed in the liquid composition between 0.01%to 25%w / w of liquid formulation, preferably 0.05%to 20%w / w, more preferably 0.2%to 15%w / w, even more preferably 0.5%to 15%, such as 0.5%to 10%w / w polypeptide.

[0128] As demonstrated, the liquid composition of the invention comprises a polyol selected from the group consisting of or consisting essentially of glycerol and sorbitol, said composition having a polyol content of more than 50%and up to 70%, such as from 55 to 70%, such as 60 to 70%polyol.

[0129] In a typical embodiment, the pH of the composition is from 4 to 7, such as 4 to 6, such as 4.5 to 6, preferably 5 to 6, such as 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5, 4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 or 6, more preferably from 5.2 to 5.6, such as 5.2, 5.3, 5.4, 5.5 or 5.6.

[0130] In an embodiment of the invention, the liquid composition further comprises a preservative suitable to provide microbial stability. The liquid formulation typically comprises 0.01%to 3.5%w / w preservative. The preservative may be selected from the group consisting of sodium sorbate, sodium formate, sodium benzoate, potassium sorbate, potassium formate and potassium benzoate or any combination thereof. As known to the person skilled in the art, the corresponding acids of sodium sorbate, sodium formate, sodium benzoate, potassium sorbate, potassium formate and potassium benzoate could be used and then titrated to reach the desired pH.

[0131] In a preferred embodiment, the preservative is selected from the group consisting of sodium benzoate, potassium benzoate, sodium sorbate and potassium sorbate, more preferably selected from the group consisting of sodium benzoate, potassium benzoate, sodium sorbate and potassium sorbate, even more preferably from sodium benzoate, sodium sorbate and potassium sorbate, even more preferably sodium benzoate and potassium sorbate. Corresponding acids are also suitable embodiments.

[0132] Preferably, the liquid formulation comprises 0.01%to 3.5%w / w preservative, such as 0.05%to 2.0%w / w preservative, such as 0.1%to 1.5%w / w preservative, such as 0.1%to 1.0%w / w preservative. In a preferred embodiment, the preservative is selected from 0.1 to 0.5%sodium benzoate and 0.1 to 0.5%potassium sorbate, such as selected from 0.2 to 0.4%sodium benzoate and 0.2 to 0.4%potassium sorbate.

[0133] In a combination of preferred embodiments, the liquid composition has a pH of about 5.4, and a content of potassium sorbate of about 0.3%.

[0134] The liquid composition may be a solution or a suspension, preferably a solution. Accordingly, the composition typically is a solution, has polyol content of more than 50%and up to 70%, such as from 55%to 70%, such as 60%to 70%polyol, has a pH of 4.5 to 5.5, and comprises 0.1%to 0.5%w / w preservative, such as potassium sorbate and / or sodium benzoate.

[0135] In a similar embodiment, the composition may be one having a substantially 1: 1 ratio of sorbitol to glycerol and comprising 35-65%polyol, such as 40-60%polyol, having a pH of 4.5 to 5.5, and comprising 0.1%to 0.5%w / w preservative, such as potassium sorbate and / or sodium benzoate.

[0136] In another embodiment, the animal feed may include one or more vitamins, such as one or more fat-soluble vitamins and / or one or more water-soluble vitamins. In another embodiment, the animal feed may optionally include one or more minerals, such as one or more trace minerals and / or one or more macro minerals.

[0137] Usually fat-and water-soluble vitamins, as well as trace minerals form part of a so-called premix intended for addition to the feed, whereas macro minerals are usually separately added to the feed. Non-limiting examples of fat-soluble vitamins include vitamin A, vitamin D3, vitamin E, and vitamin K, e.g., vitamin K3. Non-limiting examples of water-soluble vitamins include vitamin C, vitamin B12, biotin and choline, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, niacin, folic acid and panthothenate, e.g., Ca-D-panthothenate.

[0138] Non-limiting examples of trace minerals include boron, cobalt, chloride, chromium, copper, fluoride, iodine, iron, manganese, molybdenum, iodine, selenium and zinc. Non-limiting examples of macro minerals include calcium, magnesium, phosphorus, potassium and sodium.

[0139] In one embodiment, the amount of vitamins is 0.001%to 10%by weight of the composition. In one embodiment, the amount of minerals is 0.001%to 10%by weight of the composition. The nutritional requirements of these components (exemplified with poultry and piglets / pigs) are listed in Table A of WO 01 / 58275.

[0140] Nutritional requirement means that these components should be provided in the diet in the concentrations indicated. In the alternative, the animal feed additive of the invention comprises at least one of the individual components specified in Table A of WO 01 / 58275. At least one means either of, one or more of, one, or two, or three, or four and so forth up to all thirteen, or up to all fifteen individual components. More specifically, this at least one individual component is included in the additive of the invention in such an amount as to provide an in-feed-concentration within the range indicated in column four, or column five, or column six of Table A.

[0141] In a still further embodiment, the animal feed additive of the invention comprises at least one of the below vitamins, preferably to provide an in-feed-concentration within the ranges specified in the below Table 2 (for piglet diets, and broiler diets, respectively) .

[0142] Table 2: Typical vitamin recommendations

[0143] The compositions of the invention may further comprise coloring agents, stabilizers, growth improving additives and aroma compounds / flavorings, polyunsaturated fatty acids (PUFAs) ; reactive oxygen generating species, antioxidants, anti-microbial peptides, anti-fungal polypeptides and mycotoxin management compounds.

[0144] Examples of coloring agents are carotenoids such as beta-carotene, astaxanthin, and lutein.

[0145] Examples of aroma compounds / flavorings are creosol, anethol, deca-, undeca-and / or dodeca-lactones, ionones, irone, gingerol, piperidine, propylidene phatalide, butylidene phatalide, capsaicin and tannin.

[0146] Examples of antimicrobial peptides (AMP’s ) are CAP18, Leucocin A, Tritrpticin, Protegrin-1, Thanatin, Defensin, Lactoferrin, Lactoferricin, and Ovispirin such as Novispirin (Robert Lehrer, 2000) , Plectasins, and Statins, including the compounds and polypeptides disclosed in WO 03 / 044049 and WO 03 / 048148, as well as variants or fragments of the above that retain antimicrobial activity.

[0147] Examples of antifungal polypeptides (AFP’s ) are the Aspergillus giganteus, and Aspergillus niger peptides, as well as variants and fragments thereof which retain antifungal activity, as disclosed in WO 94 / 01459 and WO 02 / 90384.

[0148] Examples of polyunsaturated fatty acids are C18, C20 and C22 polyunsaturated fatty acids, such as arachidonic acid, docosohexenoic acid, eicosapentenoic acid and gamma-linoleic acid.

[0149] Examples of reactive oxygen generating species are chemicals such as perborate, persulphate, or percarbonate; and enzymes such as an oxidase, an oxygenase or a synthetase.

[0150] Antioxidants can be used to limit the number of reactive oxygen species which can be generated such that the level of reactive oxygen species is in balance with antioxidants.

[0151] Mycotoxins, such as deoxynivalenol, aflatoxin, zearalenone and fumonisin can be found in animal feed and can result in negative animal performance or illness. Compounds which can manage the levels of mycotoxin, such as via deactivation of the mycotoxin or via binding of the mycotoxin, can be added to the feed to ameliorate these negative effects. Examples of mycotoxin management compounds are Ultra (Nuscience) ,  Secure,  BBSH,  MTV (Biomin) ,  and Plus (Nutriad) .

[0152] Animal feed

[0153] As stated above, there is a need in the animal feed industry for a liquid protease composition that is stable at 40℃ for several weeks. Previously disclosed liquid compositions, comprising only sorbitol or only glycerol, albeit in high amounts, did not give the desired stability. Furthermore, the use of propylene glycol or other polyols did not provide the desired stability for use as a commercial animal feed addtive. Accordingly, an aspect of the invention is directed to a liquid animal feed additive which is stable in that the residual protease activity at 40℃ allows for the transport and storage of the liquid feed additive as required in a typical commercial setting and process. The animal feed additive comprises at least 50%polyol, wherein the polyol consists of or consists essentially of both sorbitol and glycerol.

[0154] Typically, the liquid animal feed additive comprises a protease as the sole enzyme and wherein the protease has a residual activity of at least 60%after 13 weeks at 40℃, wherein the liquid animal feed additive comprises at least 50%polyol, wherein the polyol consists of or consists essentially of both sorbitol and glycerol. The protease of the animal feed additive is preferably a serine protease, such as an S1 or S8 serine protease and the animal feed additive preferably comprises 0.5%to 15%w / w protease polypeptide or most preferably 1.0%to 10%w / w protease polypeptide.

[0155] The invention further relates to a liquid formulation of the animal feed additive or zootechnical additive; to methods of improving one or more performance parameters of an animal by administering the liquid animal feed additive; to methods of preparing an animal feed by spraying or otherwise applying the animal feed with the liquid composition or liquid animal feed additive of the invention; methods for the treatment of proteins; to methods for increasing digestibility and / or solubility of protein comprising applying the liquid composition or liquid animal feed additive of the invention; and to methods for improving the nutritional value of an animal feed using the animal feed additive of the invention.

[0156] The invention further relates to a use of the animal feed additive invention or the liquid formulation in the preparation of a composition for use in animal feed; for improving the nutritional value of an animal feed; for increasing digestible and / or soluble protein in animal feed; for increasing the degree of hydrolysis of proteins in animal diets; for improving one or more performance parameters in an animal; and / or for the treatment of proteins or pre-treatment of proteins in animal feed.

[0157] Methods of improving animal performance

[0158] The invention further relates to a method of improving one or more performance parameters of an animal, comprising administering to one or more animals the liquid animal feed additive of the invention.

[0159] In one embodiment, an animal feed is prepared from the liquid animal feed additive, as described herein and administered to the animal. The invention further relates to a method of improving one or more performance parameters of an animal, comprising administering to said animal a liquid composition comprising a protease, said composition as described herein.

[0160] In one embodiment, ‘improving the performance of an animal’ means that there is an increase in body weight gain (BWG) . In another embodiment, ‘improving the performance of an animal’ means that there is an improved feed conversion ratio (FCR) . In a further embodiment, ‘improving the performance of an animal’ means that there is an increased feed efficiency. In a further embodiment, ‘improving the performance of an animal’ means that there is an increase in body weight gain and / or an improved feed conversion ratio and / or an increased feed efficiency, preferably an increase in body weight gain and / or an improved feed conversion.

[0161] Method for improving the nutritional value of animal feed

[0162] The term “improving the nutritional value of an animal feed” is intended to mean improving the availability of nutrients in the feed. In this invention, improving the nutritional values refers in particular to improving the availability of the protein fraction of the feed, thereby leading to increased protein extraction, higher protein yields, and / or improved protein utilization. When the nutritional value of the feed is increased, the protein and / or amino acid digestibility is increased and the growth rate and / or weight gain and / or feed conversion (i.e., the weight of ingested feed relative to weight gain) of the animal is improved.

[0163] Thus, the invention further relates to a method of improving the nutritional value of an animal feed, comprising adding the animal feed additive an animal feed.

[0164] In an embodiment, the feed comprises legumes, cereals, oats, rye, barley, wheat, maize, corn, sorghum, switchgrass, millet, pearl millet, foxtail millet, soybean, wild soybean, beans, lupin, tepary bean, scarlet runner bean, slimjim bean, lima bean, French bean, Broad bean (fava bean) , chickpea, lentil, peanut, Spanish peanut, canola, rapeseed (oilseed rape) , rice, beet, cabbage, sugar beet, spinach, quinoa, or pea, in a processed form thereof (such as soybean meal, rapeseed meal) or any combination thereof. In a preferred embodiment, the feed comprises soybean meal.

[0165] The protein may be an animal protein, such as meat and bone meal, feather meal, and / or fish meal; or it may be a vegetable protein.

[0166] The term vegetable proteins as used herein refers to any compound, composition, preparation or mixture that includes at least one protein derived from or originating from a vegetable, including modified proteins and protein-derivatives. In embodiments, the protein content of the vegetable proteins is at least 10, 20, 30, 40, 50, or 60% (w / w) .

[0167] Vegetable proteins may be derived from vegetable protein sources, such as legumes and cereals, for example materials from plants of the families Fabaceae (Leguminosae) , Cruciferaceae, Chenopodiaceae, and Poaceae, such as soy bean meal, lupin meal and rapeseed meal.

[0168] In an embodiment, the vegetable protein source is material from one or more plants of the family Fabaceae, e.g., soybean, lupine, pea, or bean.

[0169] In another embodiment, the vegetable protein source is material from one or more plants of the family Chenopodiaceae, e.g., beet, sugar beet, spinach or quinoa.

[0170] Other examples of vegetable protein sources are rapeseed, sunflower seed, cotton seed, and cabbage.

[0171] Soybean is a preferred vegetable protein source.

[0172] Other examples of vegetable protein sources are cereals such as barley, wheat, rye, oat, maize (corn) , rice, triticale, and sorghum.

[0173] In the use according to the invention the liquid animal feed additive can be fed to the animal before, after, or simultaneously with the animal feed diet. The latter is preferred.

[0174] Typically, the protease when combined with the polyol is at least 50%pure as determined by size-exclusion chromatography (see Example 12 of WO 01 / 58275) . In other embodiments, the protease preparation is at least 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, or at least 95%pure as determined by this method. A well-defined protease preparation is advantageous. For instance, it is much easier to dose correctly to the feed a protease that is essentially free from interfering or contaminating other proteases. The term dose correctly refers in particular to the objective of obtaining consistent and constant results, and the capability of optimizing dosage based upon the desired effect. For the use in animal feed, however, the protease need not necessarily be pure. It may be in an extract comprising other components including other enzymes or microbes, in which case it could be termed a protease preparation.

[0175] The protease preparation can be (a) added directly to the feed, or (b) it can be used in the production of one or more intermediate compositions such as feed additives or premixes that is subsequently added to the feed.

[0176] In an embodiment of a treatment process the protease (s) in question is affecting (or acting on, or exerting its hydrolyzing or degrading influence on) the proteins, such as vegetable proteins or protein sources. To achieve this, the protein or protein source is typically suspended in a solvent, e.g., an aqueous solvent such as water, and the pH and temperature values are adjusted paying due regard to the characteristics of the enzyme in question. For example, the treatment may take place at a pH-value at which the activity of the actual protease is at least 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or at least 90%. Likewise, for example, the treatment may take place at a temperature at which the activity of the actual protease is at least 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or at least 90%. The above percentage activity indications are relative to the maximum activities. The enzymatic reaction is continued until the desired result is achieved, following which it may or may not be stopped by inactivating the enzyme, e.g., by a heat-treatment step.

[0177] In another embodiment of a treatment process of the invention, the protease action is sustained, meaning, e.g., that the protease is added to the proteins, but its hydrolyzing influence is so to speak not switched on until later when desired, once suitable hydrolyzing conditions are established, or once any enzyme inhibitors are inactivated, or whatever other means could have been applied to postpone the action of the enzyme.

[0178] In one embodiment, the treatment is a pre-treatment of animal feed or proteins for use in animal feed, i.e., the proteins are hydrolyzed before intake.

[0179] The term improving the nutritional value of an animal feed means improving the availability of nutrients in the feed. In this invention improving the nutritional values refers in particular to improving the availability of the protein fraction of the feed, thereby leading to increased protein extraction, higher protein yields, and / or improved protein utilization. When the nutritional value of the feed is increased, the protein and / or amino acid digestibility is increased and the growth rate and / or weight gain and / or feed conversion (i.e., the weight of ingested feed relative to weight gain) of the animal might be improved.

[0180] PREFERRED EMBODIMENTS

[0181] The present invention is further described by the following paragraphs.

[0182] 1. A liquid composition comprising

[0183] a. a polypeptide having protease activity; and

[0184] b. a polyol consisting of or consisting essentially of sorbitol and glycerol;

[0185] wherein the composition comprises at least 30%and not more than 70%polyol.

[0186] 2. The liquid composition according to paragraph 1, wherein the composition comprises more than 50%polyol, such as at least 55%polyol or at least 60%polyol.

[0187] 3. The liquid composition according to any of paragraphs 1 or 2, comprising sorbitol and glycerol in a weight ratio of 1: 5 to 5: 1, such as 1: 4 to 5: 1, such 1: 3 to 5: 1, such as 1: 4 to 4: 1, such as 1: 3 to 4: 1 such as 1: 3 to 3: 1, such as about 1: 3, about 1: 2, about 1: 1, about 2: 1 or about 3: 1.

[0188] 4. The liquid composition according to any of paragraphs 1 to 3, wherein the sorbitol content is at least as much as the glycerol content.

[0189] 5. The liquid composition according to any of paragraphs 1 to 4, comprising 20-30%glycerol and 30-40%sorbitol, such as 22.5%-27.5%glycerol and 32.5%-37.5%sorbitol, such as about 25%glycerol and about 35%sorbitol.

[0190] 6. The liquid composition according to any of paragraphs 1 to 5, comprising sorbitol and glycerol in a weight ratio of from about 1: 1 to about 2: 1, such as from about 1: 1 to about 1.5: 1.

[0191] 7. The liquid composition according to paragraph 1, wherein the composition comprises 30-70%polyol, and wherein the weight ratio of sorbitol to glycerol is substantially 1: 1.

[0192] 8. The liquid composition according to paragraph 7, wherein the composition comprises 35-65%polyol, such as 40-60%polyol.

[0193] 9. The liquid composition according to paragraph 7 or 8, wherein the weight ratio of sorbitol to glycerol is from about 1: 1.25 to about 1.25: 1, such as from about 1: 1.2 to about 1.2: 1, such as from about 1: 1.15 to about 1.15: 1, e.g. from about 1: 1.1 to about 1.1: 1.

[0194] 10. The liquid composition of any of paragraphs 1 to 6, comprising from 55%to 70%polyol, such as from 55%to 70%, or from 60%to 70%polyol.

[0195] 11. The liquid composition according to any of paragraphs 1 to 6, comprising 15-30%sorbitol and 30-55%glycerol, such as 16.7-26.7%sorbitol and 33.3%-53.3%glycerol.

[0196] 12. The liquid composition according to any of paragraphs 1 to 6, comprising 30-55%sorbitol and 15-30%glycerol, such as 33.3%-53.3%sorbitol and 16.7-26.7%glycerol.

[0197] 13. The liquid composition according to any of paragraphs 1 to 6, comprising at least 20%glycerol and at least 30%sorbitol, such as 25%glycerol and 35%sorbitol.

[0198] 14. The liquid composition according to any of paragraphs 1 to 6, comprising more than 50%and not more than 70%polyol, such as from 55 to 70%, such as 60 to 70%polyol, wherein the composition comprises 20-40%glycerol and 20-40%sorbitol, such as 25-40%glycerol and 25-40%sorbitol, such as 25-35%glycerol and 25-35%sorbitol.

[0199] 15. The liquid composition according to any of paragraphs 1 to 6, comprising at least 50%polyol, preferably more than 50%polyol, and wherein the liquid composition comprises 37.5-50%sorbitol and 12.5-20%glycerol.

[0200] 16. The liquid composition according to any of paragraphs 1 to 6, comprising at least 50%polyol, preferably more than 50%polyol, and wherein the liquid composition comprises 12.5-20%sorbitol and 37.5-50%glycerol.

[0201] 17. A liquid composition comprising

[0202] a. a polypeptide having protease activity,

[0203] b. a polyol consisting of or consisting essentially of glycerol and sorbitol; and

[0204] i. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 25% sorbitol and about 25%glycerol;

[0205] ii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 27.5%sorbitol and about 27.5%glycerol;

[0206] iii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 30% sorbitol and about 30%glycerol;

[0207] iv. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 32.5%sorbitol and about 32.5%glycerol; .

[0208] v. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 35% sorbitol and about 35%glycerol;

[0209] vi. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 33.3%sorbitol and about 16.7%glycerol;

[0210] vii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 36.7%sorbitol and about 18.3%glycerol;

[0211] viii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 40% sorbitol and about 20%glycerol;

[0212] ix. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 43.3%sorbitol and about 21.7%glycerol;

[0213] x. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 46.7%sorbitol and about 23.3%glycerol;

[0214] xi. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 16.7%sorbitol and about 33.3%glycerol;

[0215] xii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 18.3%sorbitol and about 36.7%glycerol;

[0216] xiii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 20% sorbitol and about 40%glycerol;

[0217] xiv. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 21.7%sorbitol and about 43.3%glycerol;

[0218] xv. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 23.3%sorbitol and about 46.7%glycerol;

[0219] xvi. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 37.5%sorbitol and about 12.5%glycerol;

[0220] xvii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 41.25%sorbitol and about 13.75%glycerol;

[0221] xviii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 45% sorbitol and about 15%glycerol;

[0222] xix. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 48.5%sorbitol and about 16.25%glycerol;

[0223] xx. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 52.5%sorbitol and about 17.5%glycerol;

[0224] xxi. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 12.5%sorbitol and about 37.5%glycerol;

[0225] xxii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 13.75%sorbitol and about 41.25%glycerol;

[0226] xxiii. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 15% sorbitol and about 45%glycerol;

[0227] xxiv. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 16.25%sorbitol and about 48.75%glycerol; or

[0228] xxv. wherein the liquid composition comprises a polyol consisting of about 17.5%sorbitol and about 52.5%glycerol.

[0229] 18. The liquid composition according to any one of paragraphs 1 to 17, wherein the polypeptide is stable in that it retains at least 50%of its protease activity after 13 weeks at 30℃, such as at least 50%of its protease activity after 13 weeks at 35℃, such as at least 50%of its protease activity after 13 weeks at 40℃.

[0230] 19. The liquid composition according to any one of paragraphs 1 to 17, wherein the protease of the liquid composition has a residual activity level of at least 60%, such as at least 70%after 4 weeks at 40℃, such as after 6 weeks, at least 8 weeks, at least 10 weeks, at least 12 weeks, such as 13 weeks.

[0231] 20. The liquid composition according to any one of the preceding paragraphs, wherein the composition is a solution.

[0232] 21. The liquid composition according to any one of the preceding paragraphs, wherein the polypeptide having protease activity is a serine protease.

[0233] 22. The liquid composition according to any one of paragraphs 1 to 21, wherein the polypeptide having protease activity is selected from the group consisting of a subtilisin such as  an S1 protease, and an S8 protease.

[0234] 23. The liquid composition according to any one of paragraphs 1 to 22, wherein the polypeptide having protease activity is obtainable from Bacillus sp, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus horneckiae, Bacillus licheniformis, Nocardiopsis sp. NRRL 18262, Nocardiopsis alba or Bacillus subtilis ATCC SD-2107.

[0235] 24. The liquid composition according to any of one of paragraphs 1 to 23, wherein the polypeptide having protease activity is selected from the group consisting of

[0236] i. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 1;

[0237] ii. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 2;

[0238] iii. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 3;

[0239] iv. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 4;

[0240] v. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 5;

[0241] vi. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 6;

[0242] vii. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 7;

[0243] viii. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 8;

[0244] ix. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 9;

[0245] x. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 10: and

[0246] xi. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 11.

[0247] 25. The liquid composition according to any one of paragraphs 1 to 24, wherein the polypeptide is stable in that it retains at least 60%of its protease activity 13 weeks at 40℃ under test conditions of Test Method 1.

[0248] 26. The liquid composition according to any one of paragraphs 1 to 25, further comprising one or more of

[0249] i. a vitamin;

[0250] ii. a mineral;

[0251] iii. an organic acid;

[0252] iv. an enzyme selected from the group consisting of a phytase, a xylanase, a beta-glucanase, a pectinase, a carbohydrase, a muramidase and an amylase.

[0253] 27. A liquid composition for use in animal feed for improving BWG and / or FCR in an animal, said composition defined according to any one of paragraphs 1 to 26.

[0254] 28. Use of a liquid composition defined in any one of paragraphs 1 to 26 for improving BWG and / or FCR in an animal.

[0255] 29. An animal feed or animal feed additive comprising the liquid composition defined in any one of paragraphs 1 to 26.

[0256] 30. A method of preparing an animal feed additive or animal feed comprising applying the liquid composition as defined in any one of paragraphs 1 to 26.

[0257] 31. A method of improving BWG and / or FCR in an animal comprising applying the liquid composition as defined in any one of paragraphs 1 to 26 to an animal feed or to an animal feed additive.

[0258] 32. A method of improving BWG and / or FCR in an animal comprising applying the liquid composition as defined in any one of paragraphs 1 to 26 to an animal feed or animal feed additive and feed said animal said animal feed or animal feed additive.

[0259] 33. A method of improving BWG and / or FCR in an animal comprising feeding the animal feed or animal feed additive of paragraph 29.

[0260] 34. A method of stabilizing a protease in a liquid solution, comprising preparing a solution comprising more than 50%and not more than 70%polyol, wherein the solution comprises the protease, 20-40%glycerol and 20-40%sorbitol, such as 20-35%glycerol and 20-35%sorbitol, and wherein the polyol consists of or consists essentially of glycerol and sorbitol.

[0261] 35. A method of stabilizing a protease in a liquid solution, comprising preparing a solution comprising at least 30%and not more than 70%polyol, such as 40-60%polyol, wherein the polyol consists of or consists essentially of sorbitol and glycerol, and wherein the weight ratio of sorbitol to glycerol is substantially 1: 1.

[0262] The present invention is further described by the following examples which should not be construed as limiting the scope of the invention.

[0263] EXAMPLES

[0264] Chemicals were commercial products of at least reagent grade. The protease used in Examples 1-5 is SEQ ID NO: 2, while in Example 7, SEQ ID Nos. 1, 2, 9 and 8 were used. Example 1

[0265] Determination of protease activity and residual activity

[0266] The protease activity is measured as specified in the analytical method “NFP (A) , NFP (A) -GT protease determination” from Novozymes This method is based on serine endopeptidase hydrolysis of the substrate N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide (Suc-AAPF-PNA) , which is a blocked peptide that can be cleaved by endo-proteases. Following cleavage, a free pNA molecule is liberated which has a yellow color and can be measured by visible spectrophotometry at wavelength 405 nm. An increase of absorbance at 405 nm is proportional to the enzyme activity. A Suc-AAPF-PNA substrate is available from Bachem (cat. no. L1400, dissolved in DMSO) .

[0267] The protease formulations were incubated in closed vials at -18℃, 25℃ and 40℃ for 4 weeks and 13 weeks. The protease activity was then measured in the stored samples and residual activity was calculated by using protease activity in samples stored at -18℃ as a reference, the residual activity being the percent activity in a sample compared to the activity of the reference.

[0268] The protease samples to be analyzed were diluted in residual activity buffer (100mM Tris pH 8.6) . The assay was performed by transferring 60μl of diluted enzyme samples to 96 well microtiter plates and adding 140μl substrate working solution (0.72mg / ml in 100mM Tris pH8.6) . The solution was mixed at room temperature and absorption was measured every 20 sec. over 5 minutes at OD 405 nm.

[0269] The slope (absorbance per minute) of the time-dependent absorption curve is directly proportional to the specific activity (activity per mg enzyme) of the protease in the composition in question under the given set of conditions. The protease sample should be diluted to a level where the slope is linear.

[0270] Example 2

[0271] Protease stability in polyol formulations with different polyols

[0272] Four different protease formualtions, A, B, C and D, with the composition as shown in Table 3, were prepared.

[0273] Table 3. Composition of liquid protease formulations

[0274] An aqueous protease solution was produced by microbial fermentation and was recovered by removal of cells and concentrated using ultrafiltration to form a protein solution. The liquid protease solution A was formulated with 50%w / w glycerol and 0.3%w / w K-sorbate at pH 5.4 to a final enzyme protein concentration of 5.18%w / w (per se protease activity 450,000 NFP (A)  / g) . The liquid protease solution B was formulated with 50%w / w sorbitol and 0.3%w / w K-sorbate at pH 5.4 to a final enzyme protein concentration of 5.18%w / w (per se protease activity 450,000 NFP(A)  / g) . The liquid protease solution C was formulated with 30%w / w sorbitol, 30%w / w glycerol and 0.3%w / w K-sorbate at pH 5.4 to a final enzyme protein concentration of 3.48%w / w (per se protease activity 300,000 NFP (A)  / g) . The liquid protease solution D was formulated with 4.6%w / w sorbitol, 12%w / w glycerol, 43.4%w / w MPG and 0.3%w / w K-sorbate at pH 5.4 to a final enzyme protein concentration of 3.48%w / w (per se protease activity 300,000 NFP (A)  / g) .

[0275] The formulated protease solutions were incubated in closed vials at -18℃, 25℃ and 40℃ for 4 and 13 weeks. The protease activity was measured in the stored samples and the residual activity was calculated by using protease activity in samples stored at -18℃ as a reference. The results (residual activity at 4 weeks at 25℃ and 40℃, and at 13 weeks at 40℃) are shown in Table 4 together with information on the polyol content.

[0276] Table 4: Residual protease activity in different liquid polyol formulations

[0277] It may be seen from Table 4 that each of the compositions provided stable liquid formulations (nearly 100%residual activity) at 25℃ after 4 weeks. However, when the temperature was raised to 40℃, the residual activity was reduced 4 weeks, especially for formulation D containing propylene glycol and only small amounts of sorbitol and glycerol. After 13 weeks at 40℃, it is seen that the formulation comprising 30%sorbitol and 30%glycerol still had 68%residual activity.

[0278] Example 3

[0279] Protease stability in formulations with 1: 1 glycerol-sorbitol content

[0280] Six different liquid protease formulations were prepared, each containing equal weight amounts of glycerol and sorbitol as shown in Table 5.

[0281] Table 5. Formulations of protease solutions with different total polyol amounts * active enzyme protein, %w / w

[0282] An aqueous protease solution was produced by microbial fermentation and was recovered by removal of cells and concentrated using ultrafiltration to form a protein solution. Six protease solutions were formulated separately containing 50%, 60%or 70%w / w totol polyol (the ratio of sorbitol to glycerol in each case being 1: 1) and 0.3%w / w K-sorbate at pH 5.4 to a final enzyme protein concentration of 6.9%w / w (per se protease activity 600,000 NFP (A)  / g) or 5.18%w / w (per se protease activity 450,000 NFP (A)  / g) . The protease activity was measured in the stored samples and the residual activity was calculated by using protease activity in samples stored at -18℃ as a reference. The results (residual activity at 4 weeks and 13 weeks at 40℃) are shown in Table 6.

[0283] Table 6: Residual protease activity in formulations with different total polyol content and 1: 1 glycerol-sorbitol content

[0284] It may be seen from Table 6 that each of the compositions had more than 70%residual activity after 4 weeks at 40℃. It is also seen that only the compositions having 60%or 70%total polyol were able to retain at least 60%residual activity after 13 weeks at 40℃, whereas the compositions containing 50%total polyol only had a residual activity of about 44-45%after 13 weeks at 40℃.

[0285] Example 4

[0286] Protease stability in formulations with different polyol contents and different glycerol-sorbitol ratios

[0287] Different protease formualtions containing different total amounts of polyol and different ratios of glycerol to sorbitol (amounts in %by weight) as shown in Table 7 below were prepared.

[0288] Table 7: Liquid protease formulations *Active enzyme protein

[0289] An aqueous protease solution was produced by microbial fermentation and was recovered by removal of cells and concentrated using ultrafiltration to form a protein solution. Two protease solutions (formulations 1 and 2 ) were formulated with 60%w / w totol polyols (the ratio of glycerol to sorbitol being 3: 1 and 1: 3, respectively) . The other two protease solutions (formulations 3 and 4) were formulated with 50%w / w totol polyols (the ratio of glycerol to sorbitol being 3: 7 and 7: 3, respectively) . All four formulations included 0.3%w / w K-sorbate and had a pH 5.4 and a final enzyme protein concentration of 3.45%w / w (per se protease activity 300,000 NFP (A)  / g) .

[0290] The formulated protease solutions were incubated in closed vials at -18℃ and 40℃ for 4 weeks and 13 weeks. The protease activity was measured in the stored samples and the residual activity was calculated using protease activity in samples stored at -18℃ as a reference. The results are shown in Table 8 below for 13 weeks at 25℃ and for 4 weeks and 13 weeks at 40℃.

[0291] Table 8: Residual protease activity in formulations with different total polyol contents and different glycerol-sorbitol ratios

[0292] It may be seen from Table 8 that a total polyol content of 60%provides better protease stability than a polyol content of 50%. This is especially noticeable after 13 weeks at 40℃. The results in Table 8 also suggest that when the ratio between glycerol and sorbitol is not 1: 1, having more sorbitol than glycerol provides better stability than having more glycerol than sorbitol.

[0293] Example 5

[0294] Microbial Stability

[0295] A liquid protease solution was formulated with 25%w / w glycerol, 35%w / w sorbitol, 0.3%K-sorbate and 0.2%Na-benzoate at pH 5.4 to a final enzyme protein concentration of 3.45%w / w. The formulation was shown to be microbially robust towards bacteria (Lactobacilli) as well as yeast and mold. This was done by spiking / challenging the formulation with the microorganisms in Table 9. Each of three bottles were inoculated to a total of 1x105 CFU / ml of the test microorganisms.

[0296] Table 9. Test microorganisms used in bottles 1-3

[0297] The bottles were analyzed for CFU / ml before inoculation (blind) and after 1, 2, 3 and 4 weeks of incubation at 20-25℃. CFU (colony forming units) per ml was measured using standard microbiological methods.

[0298] Table 10. Microbial stability of the liquid enzyme formulation, measured as CFU / ml.

[0299] Example 6

[0300] Preparation of formulations with 1: 1 glycerol-sorbitol content

[0301] Four different protease liquid formulations with a 1: 1 ratio of glycerol and sorbitol but with different total polyol contents were prepared as shown in Table 11.

[0302] Table 11. Composition of liquid formulations

[0303] The sorbitol stock solution was prepared by adding 158.17 g of deionized, microfiltered water to a large glass beaker and gradually adding 341.84 g of D-sorbitol (>98%) to the water while stirring. The sorbitol was allowed to dissolve overnight while stirring, and the solution was then stored at room temperature.

[0304] A 10%v / v acetic acid solution was prepared by adding approximately 80 ml of deionized, microfiltered water to a 100 ml volumetric flask, followed by the addition of 10 ml of acetic acid (99-100%) . Deionized, microfiltered water was then added to bring the total volume to 100 ml, and the solution was stored at room temperature.

[0305] The assay buffer with pH 7.0 (0.1 M citric acid-phosphate, 0.01%w / v Tween 20) was prepared by transferring 85.75 ml of 0.1 M citric acid solution to a 1000 ml volumetric flask. Then, 5 ml of a 1%w / v Tween 20 solution was added to the flask, followed by 409.25 ml of a 0.2 M sodium phosphate solution. The pH of the solution was adjusted to 7.00 ± 0.05, and the solution was stored at 4℃.

[0306] Nine grams of each polyol formulation stock (A, B, C, D) were added to six 15 ml tubes. One gram of assay buffer was added to one tube of each polyol formulation stock. Additionally, one gram of each enzyme protein sample was added to a tube of each polyol formulation stock. All tubes were mixed, and the formulated protease solutions were incubated in closed vials at -18℃, 37℃, and 48℃ for 4, 8 and 13 weeks. The protease activity was measured in the stored samples, and the residual activity was calculated using the protease activity in samples stored at -18 ℃ as a reference as described above.

[0307] Granulate extracts were prepared as follows: Two grams of solid granulated samples were weighed into a beaker. Eighteen grams of extraction buffer (0.1 g granulate / g extract) was added to the beaker. The sample was then stirred for 1 hour at 5℃. The extracts were transferred to centrifuge tubes and spun for 15 minutes at 3000 rpm and 5℃. The supernatants were then filtered with a 1.2 μm syringe filter and stored frozen at -18℃ until use.

[0308] The extraction buffer was 0.1 M acetate, 5 mM calcium, 0.01%w / v Tween 20, pH 5.0. To prepare 250 ml of extraction buffer, 2.5 ml of a 1%w / v Tween 20 solution was added to a 250 ml volumetric flask. A 0.1 M acetate buffer with 5 mM calcium, pH 5.0, was added to fill the flask to 250 ml. The solution was then mixed on a magnetic stirrer and stored cool.

[0309] Example 7

[0310] Stability of proteases in formulations with 1: 1 glycerol-sorbitol content

[0311] The storage stability of four proteases with SEQ ID Nos. 1, 2, 9 and 8 was evaluated in the four formulations A, B, C and D shown in Example 6, each containing a 1: 1 ratio of glycerol and sorbitol but with total polyol contents of 40%, 50%, 60%and 70%, respectively. Stability was evaluated at two different incubation temperatures, 37℃ and 48℃, to determine the impact of both formulation composition and temperature on enzyme stability and activity. The protease content in these formulations was lower than in the formulations of Examples 2, 3 and 4 above.

[0312] Tables 12 and 13 provide a comprehensive overview of the results of these analyses. The data reveal that formulations A, B and C were effective in preserving the enzymatic activity of the proteases across all sequences tested, at least at 37℃. This suggests that at these total polyol amounts and with a lower content of enzyme protein, this ratio of glycerol to sorbitol is conducive to maintaining enzyme stability. The preservation of enzyme activity in these formulations indicates their utility in applications where maintaining protease function is critical, such as in animal feed.

[0313] In contrast, the analysis highlighted a surprising finding regarding formulation D. Unlike the other formulations with lower polyol contents, formulation D, containing 70%polyol, resulted in reduced enzyme activity and stability of the proteases. This effect was consistent across the four sequences tested and suggests a possible upper limit of total polyol content in relation to the benefits of using glycerol and sorbitol as polyols for liquid compositions with a relatively low content of enzyme protein.

[0314] These findings underscore the importance of selecting appropriate formulation components and concentrations to ensure enzyme stability, particularly under varying thermal conditions. The differential effects observed among the formulations highlight the nuanced interactions between the enzyme molecules and the stabilizing agents, with formulations A, B and C demonstrating promising characteristics for preserving the functional integrity of proteases.

[0315] Table 12. Residual activity of protease samples incubated at 37℃

[0316] Table 13. Residual activity of protease samples incubated at 48℃

Claims

1.A liquid composition comprisinga. a polypeptide having protease activity; andb. a polyol consisting of or consisting essentially of sorbitol and glycerol;wherein the composition comprises at least 30%and not more than 70%polyol.2.The liquid composition according to claim 1, wherein the composition comprises more than 50%polyol, such as from 55%to 70%or from 60%to 70%polyol.3.The liquid composition according to claim 1 or 2, comprising sorbitol and glycerol in a weight ratio of from 1: 5 to 5: 1, such as from 1: 4 to 5: 1, such as from 1: 3 to 5: 1, such as from 1: 4 to 4: 1, such as from 1: 3 to 4: 1 such as from 1: 3 to 3: 1, such as about 1: 3, about 1: 2, about 1: 1, about 2: 1 or about 3: 1.4.The liquid composition according to any of claims 1 to 3, wherein the sorbitol content is at least as much as the glycerol content.5.The liquid composition according to any of claims 1 to 4, comprising 20-30%glycerol and 30-40%sorbitol, such as 22.5%-27.5%glycerol and 32.5%-37.5%sorbitol, such as about 25%glycerol and about 35%sorbitol.6.The liquid composition according to any of claims 1 to 5, comprising sorbitol and glycerol in a weight ratio of from about 1: 1 to about 2: 1, such as from about 1: 1 to about 1.5: 1.7.The liquid composition according to claim 1, wherein the composition comprises 30-70%polyol, and wherein the weight ratio of sorbitol to glycerol is substantially 1: 1.8.The liquid composition according to claim 7, wherein the composition comprises 35-70%polyol, such as 40-65%polyol, such as 40-60%polyol.9.The liquid composition according to any one of the preceding claims, wherein the polypeptide having protease activity is selected from the group consisting of a subtilisin, an S1 protease, and an S8 protease.10.The liquid composition according to any one of the preceding claims, wherein the polypeptide having protease activity is selected from the group consisting ofi. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 1;ii. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 2;iii. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 3;iv. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 4;v. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 5;vi. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 6;vii. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 7;viii. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 8;ix. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 9;x. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 10; andxi. a polypeptide having at least 85%sequence identity to SEQ ID NO: 11.11.A liquid composition for use in animal feed for improving body weight growth (BWG) and / or feed conversion ratio (FCR) in an animal, said composition defined according to any one of claims 1 to 10.12.An animal feed or animal feed additive comprising the liquid composition defined in any of claims 1 to 10.13.A method of preparing an animal feed additive or animal feed comprising a protease, the method comprising applying the liquid composition as defined in any one of claims 1 to 10 to an animal feed additive or an animal feed.14.A method of stabilizing a protease in a liquid solution, comprising preparing a solution comprising more than 50%and not more than 70%polyol, wherein the solution comprises the protease, 20-40%glycerol and 20-40%sorbitol, such as 20-35%glycerol and 20-35%sorbitol, and wherein the polyol consists of or consists essentially of glycerol and sorbitol.15.A method of stabilizing a protease in a liquid solution, comprising preparing a solution comprising at least 30%and not more than 70%polyol, such as 40-60%polyol, wherein the polyol consists of or consists essentially of sorbitol and glycerol, and wherein the weight ratio of sorbitol to glycerol is substantially 1: 1.

Images