Carbon chain-modified nucleic acids and uses thereof for bacterial cell delivery

Abstract

A bacterial cell penetrating conjugate comprising Formula (I) : A–B–C (I), in which A is a nucleic acid moiety, B is null or a linker moiety; and C comprises an aliphatic moiety. Also provided herein is a method for delivering a nucleic acid into bacterial cells using the bacterial cell penetrating conjugates disclosed herein.

Description

CARBON CHAIN-MODIFIED NUCLEIC ACIDS AND USES THEREOF FOR BACTERIAL CELL DELIVERY

[0001] CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims the benefit of the filing dates of PCT / CN2023 / 141469, filed December 25, 2023, the entire contents of which is incorporated by reference herein.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0003] Nucleic acids have proven to be an efficacious drug modality for their easy generation and specificity to their targets. Nucleic acid-based drug candidates have been explored for treating various diseases, including infectiouis diseases. Many infectious diseases are caused by bacterial cells.

[0004] Most, if not all, bacterial cells have complex cell barrier structures, including cell membrane and cell wall, which is a rigid structure around the cell and is responsible for forming specific shapes of the cell and protecting the cell from damages. Due to these structures, it is challenging to deliver nucleic acids into bacterial cells with high efficiencies. Methods for efficaciously delivering nucleic acids into bacterial cells are needed to enable targeting of pathogenic bacteria.SUMMARY OF THE INVENTION

[0005] The present disclosure is based, at least in part, on the development of nucleic acid-carbon chain conjugates, which exhibited surprising activity in penetrating bacterial cells. As such, the nucleic acid conjugates provided herein (i.e., bacterial cell penetrating conjugates) can be used for delivering the nucleic acid components therein into bacterial cells.

[0006] Accordingly, one aspect of the present disclosure features a bacterial cell penetrating conjugate comprising Formula (I) : A –B –C (I) , in which A is a nucleic acid moiety; B is either null or a linker moiety; and C comprises an aliphatic moiety. In some instances, the bacterial cell penetrating conjugate may further comprise a detectable moiety. In some examples, the detectable moiety can be linked to the nucleic acid component in the conjugate.

[0007] In some embodiments, the aliphatic moiety in C is an alkyl moiety. For example, the alkyl moiety can be an unsubstituted C6 to C22alkyl moiety. In some instances, the alkyl moiety can be an unsubstituted C12 to C18 alkyl moiety.

[0008] Alternatively, the aliphatic moiety in C can be an alkenyl moiety. For example, the alkenyl moiety may be an unsubstituted C12 to C20 alkenyl moiety. In one example, the alkenyl moiety can be an unsubstituted C18 alkenyl moiety. In some instances, the alkenyl moiety may have 1 double-bond. Alternatively, the alkenyl moiety may have 2 double-bonds.

[0009] In some examples, the aliphatic moiety in C can be the alkyl or alkenyl moiety of a fatty acid of Myristoleic acid, Pentadecanoic acid, Palmitic acid, Palmitoleic acid, Stearic acid, Petroselinic acid, trans-Petroselinic acid, Oleic acid, Elaidic acid, Richnoleic acid, cis-Vaccenic acid, trans-Vaccenic acid, Linoleic acid, Linolelaicid acid, or Linolenic acid. In specific examples, the aliphatic moiety in C is the alkyl or alkenyl moiety of the fatty acid of Pentadecanoic acid, Palmitic acid, Stearic acid, Petroselinic acid, trans-Petroselinic acid, Oleic acid, Elaidic acid, cis-Vaccenic acid, trans-Vaccenic acid, or Linolelaicid acid.

[0010] In some embodiments, the bacterial cell penetrating conjugate provided herein does not contain the B linker moiety (B is null) . In that case, C is attached directly to the 5’ end or the 3’ end phosphate group of the nucleic acid of A.

[0011] In other embodiments, the bacterial cell penetrating conjugate provided herein contain the B linker moiety connecting the nucleic acid moiety of A and the C moiety. In some instances, one end of the linker moiety is covalently linked to the 5’ end or the 3’ end phosphate group of the nucleic acid of A and the other end of the linker moiety is covalently linked to the aliphatic moiety in C via, including but not limited to, an -NHC (O) -bond, a phosphoester bond, an ester bond, a thioester bond, a carbonate bond, a disulfide bond, a maleimide linker, a PEG linker, or a triazole moiety.

[0012] In some instances, the linker moiety comprises a C1-C10 alkyl group, for example, a C3-C7 alkyl group. In other instances, the linker moiety comprises a C2-C10 alkenyl group, for example, a C3-C7 alkenyl group.

[0013] Exemplary bacterial cell penetrating conjugates disclosed herein are provided in FIGs. 3A-3G, each of which is within the scope of the present disclosure.

[0014] In any of the bacterial cell penetrating conjugates provided herein, the nucleic acid component can be a DNA moiety. Alternatively, it can be an RNA moiety. In some instances, the nucleic acid is about 10 to about 50 nucleotides in length. In some examples, the nucleic acid is about 15 to about 30 nucleotides in length. In other examples, the nucleic acid is about 17 to about 25 nucleotides in length. The nucleic acid provided herein may comprise at least one modified nucleotide.

[0015] In another aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising any of the bacterial penetrating conjugates disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0016] Further, provided herein is a method of delivering a nucleic acid into a bacterial cell, the method comprising contacting the bacterial cell with the bacterial cell penetrating conjugate disclosed herein to allow for entry of the bacterial cell penetrating conjugate into the bacterial cell. In some instances, the bacterial cell is a gram-negative bacterial cell. Alternatively, the bacterial cell is a pathogenic bacterial cell.

[0017] In some instances, the bacterial cell to which the bacterial penetrating conjugate is to be delivered can be a gram-negative bacterial cell. Examples include, but are not limited to, a Bacteroides, a Fusobacterium (e.g., F. nucleatum) , a Phocaeicola, an Odoribacter, a Pseudomonas (e.g., P. aeruginosa) , a Helicobacter (e.g., H. pylori) , an Aggregatibacter (e.g., A. actinomycetemcomitans) or a Porphyromonas (e.g., P. gingivalis) . In other instances, the bacterial cell can be a gram-positive bacterial cell. Examples include, but are not limited to, a Blautia, a Clostridium, a Dorea, an Erysipelatoclostridium, an Eubacterium, a Lacrimispora, a Longicatena, or a Ruminococcus.

[0018] In some examples, the nucleic acid moiety is an antisense oligonucleotide (ASO) targeting a gene of the bacterial cell. Such an ASO may be complementary to a genomic site of interest to interfere with expression of a bacterial gene of interest. Alternatively, the ASO may be complementary to a transcript of the gene of interest to interfere with protein translation.

[0019] In some examples, the contacting step in any of the methods disclosed herein can be performed by administering a pharmaceutical composition comprising the bacterial penetrating conjugate to a subject infected with the bacterial cell. In some instances, the subject is a human patient infected by the bacterial cell.

[0020] Also within the scope of the present disclosure is any of the bacterial penetrating conjugates as disclosed herein or a pharmaceutical composition comprising such for use in delivering the nucleic acid carried thereby into bacterial cells (e.g., for treating an infectious disease caused by the bacterial cells in a subject such as a human patient) , as well as use of the bacterial penetrating conjugate as disclosed herein or a pharmaceutical composition comprising such for manufacturing a medicament for use in inhibiting growth of the bacterial cell or treating an infectious disease caused by the bacterial cell.

[0021] The details of one or more embodiments of the invention are set forth in the description below. Other features or advantages of the present invention will be apparent from the following drawings and detailed description of several embodiments, and also from the appended claims.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0022] The following drawings form part of the present specification and are included to further demonstrate certain aspects of the present disclosure, which can be better understood by reference to the drawing in combination with the detailed description of specific embodiments presented herein.

[0023] FIGs. 1A-1E include diagrams illustrating exemplary oligonucleotide-carbon chain conjugates and preparation processes. FIG. 1A: C16-oligonucleotide conjugate with C3 linker. FIG. 1B: C16-oligonucleotide conjugate with C6 linker. FIG. 1C: C18-oligonucleotide conjugate with no linker. FIG. 1D: C18-oligonucleotide conjugate with C6 linker. FIG. 1E: DSEP-oligonucleotide conjugate with a C6 linker.

[0024] FIGs. 2A-2C include diagrams showing bacterial cell entry of oligonucleotides modified by carbon chains as relative to a cell-penetrating peptide (CPP) . FIG. 2A: a diagram showing conversion of a quenched fluorescent dye to a signal-emitting dye after entering bacterial cells. FAM: 6-Carboxyfluorescein. BHQ: Black hole quencher. BF: BHQ-C6-S-S-C6-FAM. ON: oligonucleotide. FIG. 2B: an image showing fluorescent signals in bacterial cells incubated with oligonucleotides conjugated with various agents as indicated. FIG. 2C: an image showing fluorescent signals in bacterial cells incubated with a sequence-specific oligonucleotide or a polyA nucleotide (25) conjugated with a C16 or a C18 carbon chain.

[0025] FIGs. 3A-3G include diagrams depicting structures of exemplary oligonucleotide-carbon chain conjugates. FIG. 3A: ON-C6～C12 conjugates with C6 linker, and ON-C18 conjugate with no linker. FIG. 3B: ON-C14～C18 conjugates with C6 linker. FIG. 3C: ON-C20～C24 conjugates with C6 linker. FIGs. 3D-3F: ON-fatty acid conjugates with C6 linker. FIG. 3G: oligonucleotide conjugated with DSPE or cholesterol.

[0026] FIGs. 4A-4C are charts showing inhibitory / delivery activity of various oligonucleotide-carbon chain conjugates on bacterial cell growth. FIG. 4A: inhibitory / delivery activity of oligonucleotide-carbon chain conjugates. FIGs. 4B-4C: inhibitory / delivery activity of the anti-microbial oligonucleotide conjugated to alkane or alkene chains. FIG. 4D: no inhibitory / delivery activity was observed for DSPE or cholesterol.

[0027] FIG. 5A-5F include diagrams showing entry of oligonucleotide-carbon chain conjugate into various bacterial cells. FIG. 5A: a schematic showing the structure of the oligonucleotide-carbon chain conjugate with a quenched fluorescent dye (FAc) and its conversion of to a signal-emitting dye via catalyzation by esterase enzymes after entering bacterial cells. FIG. 5B: representative images showing entry of the oligonucleotide-carbon chain conjugate intoF. nucleatum cells. FIG. 5C: representative images showing entry of the oligonucleotide-carbon chain conjugate into H. pylori. FIG. 5D: representative images showing entry of the oligonucleotide-carbon chain conjugate into P. aeruginosa. FIG. 5E: representative images showing entry of the oligonucleotide-carbon chain conjugate intoA. actinomycetemcomitans. FIG. 5F: representative images showing entry of the oligonucleotide-carbon chain conjugate into P. gingivalis.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0028] Described herein are bacterial penetrating conjugates comprising a nucleic acid moiety conjugated to an aliphatic moiety, directly or via a linker moiety. It is reported herein that such bacterial penetrating conjugates exhibited high efficiency in penetrating bacterial cells, thereby delivering the nucleic acid carried thereby into the bacterial cells. Certain bacterial penetrating conjugates showed better delivery efficiencies relative to the same nucleic acid moiety conjugated to a cell-penetrating peptide (CPP) , which was used in the art to facilitate delivery of nucleic acids into bacterial cells.

[0029] DEFINITIONS

[0030] The abbreviations used herein have their conventional meaning within the chemical and biological arts. The chemical structures and formulae set forth herein are constructed according to the standard rules of chemical valency known in the chemical arts.

[0031] Definitions of specific functional groups and chemical terms are described in more detail below. The chemical elements are identified in accordance with the Periodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed., inside cover, and specific functional groups are generally defined as described therein. Additionally, general principles of organic chemistry, as well as specific functional moieties and reactivity, are described in Thomas Sorrell, Organic Chemistry, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley &Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; and Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987. The disclosure is not intended to be limited in any manner by the exemplary listing of substituents described herein.

[0032] Compounds described herein can comprise one or more asymmetric centers, and thus can exist in various isomeric forms, e.g., enantiomers and / or diastereomers. For example, the compounds described herein can be in the form of an individual enantiomer, diastereomer or geometric isomer, or can be in the form of a mixture of stereoisomers, including racemic mixtures and mixtures enriched in one or more stereoisomer. Isomers can be isolated from mixtures by methods known to those skilled in the art, including chiral high pressure liquid chromatography (HPLC) and the formation and crystallization of chiral salts; or preferred isomers can be prepared by asymmetric syntheses. See, for example, Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Tnterscience, New York, 1981) ; Wilen et al., Tetrahedron 33: 2725 (1977) ; Eliel, Stereochemistiy of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962) ; and Wilen, Tables of Resolving Agents and Optical Resolutionsp. 268 (E. L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972) . The disclosure additionally encompasses compounds described herein as individual isomers substantially free of other isomers, and alternatively, as mixtures of various isomers.

[0033] When a range of values is listed, it is intended to encompass each value and sub-range within the range. For example, “C1-6” is intended to encompass at least C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5, and C5-6.

[0034] Where substituent groups are specified by their conventional chemical formulae, written from left to right, they equally encompass the chemically identical substituents that would result from writing the structure from right to left, e.g., -CH2O-is equivalent to -OCH2-.

[0035] The term "aliphatic" includes both saturated and unsaturated, straight chain (i.e., unbranched) or branched, acyclic aliphatic hydrocarbons, which are either unsubstituted or substituted with one or more functional groups. As will be appreciated by one of ordinary skill in the art, “aliphatic” is intended herein to include, but is not limited to, alkyl, alkenyl, and alkynyl moieties.

[0036] The term “alkyl, ” by itself or as part of another substituent, means, unless otherwise stated, a straight (i.e., unbranched) or branched carbon chain (or carbon) , or combination thereof, which may be fully saturated, mono-or polyunsaturated and can include mono-, di-and multivalent radicals. The alkyl may include a designated number of carbons (e.g., C1-C10 means one to ten carbons) . Alkyl is an uncyclized chain. Examples of saturated hydrocarbon radicals include, but are not limited to, groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, t-butyl, isobutyl, sec-butyl, methyl, homologs and isomers of, for example, n-pentyl, n-hexyl, n-heptyl, n-octyl, and the like. An unsaturated alkyl group is one having one or more double bonds or triple bonds. Examples of unsaturated alkyl groups include, but are not limited to, vinyl, 2-propenyl, crotyl, 2-isopentenyl, 2- (butadienyl) , 2, 4-pentadienyl, 3- (1, 4-pentadienyl) , ethynyl, 1-and 3-propynyl, 3-butynyl, and the higher homologs and isomers. An alkoxy is an alkyl attached to the remainder of the molecule via an oxygen linker (-O-) . An alkyl moiety may be an alkenyl moiety. An alkyl moiety may be an alkynyl moiety. An alkyl moiety may be fully saturated. An alkenyl may include more than one double bond and / or one or more triple bonds in addition to the one or more double bonds. An alkynyl may include more than one triple bond and / or one or more double bonds in addition to the one or more triple bonds.

[0037] The term “alkylene, ” by itself or as part of another substituent, means, unless otherwise stated, a divalent radical derived from an alkyl, as exemplified, but not limited by, -CH2CH2CH2CH2-. Typically, an alkyl (or alkylene) group will have from 1 to 24 carbon atoms, with those groups having 10 or fewer carbon atoms being preferred herein. A “lower alkyl” or “lower alkylene” is a shorter chain alkyl or alkylene group, generally having eight or fewer carbon atoms. The term “alkenylene, ” by itself or as part of another substituent, means, unless otherwise stated, a divalent radical derived from an alkene.

[0038] The term “heteroalkyl, ” by itself or in combination with another term, means, unless otherwise stated, a stable straight or branched chain, or combinations thereof, including at least one carbon atom and at least one heteroatom (e.g., O, N, P, Si, and S) , and wherein the nitrogen and sulfur atoms may optionally be oxidized, and the nitrogen heteroatom may optionally be quaternized. The heteroatom (s) (e.g., O, N, S, Si, or P) may be placed at any interior position of the heteroalkyl group or at the position at which the alkyl group is attached to the remainder of the molecule. Heteroalkyl is an uncyclized chain. Examples include, but are not limited to: -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N (CH3) -CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-S-CH2, -S (O) -CH3, -CH2-CH2-S (O) 2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si (CH3) 3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N (CH3) -CH3, -O-CH3, -O-CH-2-CH3, and -CN. Up to two or three heteroatoms may be consecutive, such as, for example, -CH2-NH-OCH3 and -CH2-O-Si (CH3) 3.

[0039] A heteroalkyl moiety may include one heteroatom (e.g., O, N, S, Si, or P) . A heteroalkyl moiety may include two optionally different heteroatoms (e.g., O, N, S, Si, or P) . A heteroalkyl moiety may include three optionally different heteroatoms (e.g., O, N, S, Si, or P) . A heteroalkyl moiety may include four optionally different heteroatoms (e.g., O, N, S, Si, or P) . A heteroalkyl moiety may include five optionally different heteroatoms (e.g., O, N, S, Si, or P) . A heteroalkyl moiety may include up to 8 optionally different heteroatoms (e.g., O, N, S, Si, or P) . The term “heteroalkenyl, ” by itself or in combination with another term, means, unless otherwise stated, a heteroalkyl including at least one double bond.

[0040] A heteroalkenyl may optionally include more than one double bond and / or one or more triple bonds in additional to the one or more double bonds. The term “heteroalkynyl, ” by itself or in combination with another term, means, unless otherwise stated, a heteroalkyl including at least one triple bond. A heteroalkynyl may optionally include more than one triple bond and / or one or more double bonds in additional to the one or more triple bonds.

[0041] Similarly, the term “heteroalkylene, ” by itself or as part of another substituent, means, unless otherwise stated, a divalent radical derived from heteroalkyl, as exemplified, but not limited by, -CH2-CH2-S-CH2-CH2-and -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. For heteroalkylene groups, heteroatoms can also occupy either or both of the chain termini (e.g., alkyleneoxy, alkylenedioxy, alkyleneamino, alkylenediamino, and the like) . Still further, for alkylene and heteroalkylene linking groups, no orientation of the linking group is implied by the direction in which the formula of the linking group is written. For example, the formula -C (O) 2R'-represents both -C (O) 2R'-and -R'C (O) 2-. As described above, heteroalkyl groups, as used herein, include those groups that are attached to the remainder of the molecule through a heteroatom, such as -C (O) R', -C (O) NR', -NR'R” , -OR', -SR', and / or -SO2R'. Where “heteroalkyl” is recited, followed by recitations of specific heteroalkyl groups, such as -NR'R” or the like, it will be understood that the terms heteroalkyl and -NR'R” are not redundant or mutually exclusive. Rather, the specific heteroalkyl groups are recited to add clarity. Thus, the term “heteroalkyl” should not be interpreted herein as excluding specific heteroalkyl groups, such as -NR'R” or the like.

[0042] I. Bacterial Cell Penetrating Conjugates

[0043] Provided herein, inter alia, are bacterial cell penetrating conjugates including a nucleic acid moiety attached, directly or indirectly, to an aliphatic moiety (acarbon chain) , for example, an alkyl moiety or an alkenyl moiety. It is reported herein that conjugation of a carbon chain (e.g., including 12-18 carbon atoms) to a nucleic acid moiety, either directly or via a linker moiety (e.g., C3-C7 alkyl) enhances penetration of the nucleic acid moiety into a bacterial cell relative to penetration of the nucleic acid moiety in the absence of the carbon chain or in conjugation with the CPP used in the art for facilitating nucleic acid delivery to bacterial cells.

[0044] As used herein, the term “conjugate” refers to the association between atoms or molecules. The association can be direct or indirect. In embodiments, conjugates are formed using conjugate chemistry including, but are not limited to nucleophilic substitutions (e.g., reactions of amines and alcohols with acyl halides, active esters) , electrophilic substitutions (e.g., enamine reactions) and additions to carbon-carbon and carbon-heteroatom multiple bonds (e.g., Michael reaction, Diels-Alder addition) . These and other useful reactions are discussed in, for example, March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3rd Ed., John Wiley &Sons, New York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; and Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D. C., 1982.

[0045] The bacterial cell penetrating conjugate provided herein may have a structure of Formula (I) : A –B –C (I) , in which A is a nucleic acid moiety; B is either null or a linker moiety; and C comprises an aliphatic moiety (acarbon chain) . The bacterial cell penetrating conjugates provided here can facilitate the nucleic acid carried thereby to pass from the extracellular environment into a bacterial cell in a significant or effective amount. For example, a bacterial cell penetrating conjugate provided herein may penetrates a bacterial cell at least about 1, 5, 10, 20, 50, 80, 90, or 100-fold more than the same nucleic acid moiety in the absence of the aliphatic moiety.

[0046] (a) Carbon Chains

[0047] The bacterial cell penetrating conjugate provided herein comprises an aliphatic moiety (acarbon chain) in C of Formula (I) . In some instances, the aliphatic moiety in C may be directly conjugated to either the 5’ or the 3’ end phosphate group of the nucleic acid of A. Alternatively, the aliphatic moiety in C may be conjugated to the linker moiety of B via a suitable covalent bond.

[0048] In some embodiments, the carbon chain can be unsubstituted C4 to C22alkyl. In some examples, the carbon chain can be an unsubstituted C6 to C22alkyl. In some examples, the carbon chain can be an unsubstituted C8 to C22alkyl. In some examples, the carbon chain can be C10 to C22alkyl. In some examples, the carbon chain can be an unsubstituted C12 to C22 alkyl. In some examples, the carbon chain can be an unsubstituted C12 to C20alkyl. In specific examples, the carbon chain can be an unsubstituted C12 to C18alkyl. Exemplary carbon chains for use in modifying nucleic acids for bacteria cell delivery can be found in FIGs. 3A-3F, all of which are within the scope of the present disclosure.

[0049] In other embodiments, the carbon chain in C of Formula (I) may be an alkenyl moiety. In some examples, the carbon chain may be an unsubstituted C2-C22 alkenyl moiety. In some examples, the carbon chain can be an unsubstituted C6 to C22alkenyl moiety. In some examples, the carbon chain can be an unsubstituted C8 to C22alkenyl moiety. In some examples, the carbon chain can be C10 to C22alkenyl. In some examples, the carbon chain can be an unsubstituted C12 to C22alkenyl moiety. In some examples, the carbon chain can be an unsubstituted C12 to C20alkenyl moiety. In specific examples, the carbon chain can be an unsubstituted C18 alkenyl moiety.

[0050] In embodiments, the alkenyl moiety includes at least 1 double-bond (e.g., only one double bond) . In embodiments, the alkenyl moiety includes at least 2 double-bonds (e.g., only two double bond) .

[0051] Example of alkenyl carbon chains for use in the bacterial penetrating conjugates provided herein may be:

[0052] See also those provided in FIGs. 3D-3F, all of which are within the scope of the present disclosure.

[0053] In some embodiments, the carbon chain used in the bacterial cell penetrating conjugated disclosed herein may be derived from a suitable fatty acid (i.e., via conjugation of a fatty acid to an oligonucleotide moiety, either directly or via a linker such as those provided herein) . The fatty chain may carry a saturated carbon chain. Alternatively, the fatty acid may carry one, two, or three double bonds, each of which independently may be in cis-or trans-format.

[0054] In some examples, the fatty acid can be a C14 fatty acid (e.g., Myristoleic acid) . In some examples, the fatty acid can be a C15 fatty acid (e.g., Pentadecanoic acid) . In some examples, the fatty acid can be a C16 fatty acid (e.g., Palmitic acid or Palmitoleic acid) . In other examples, the fatty acid can be a C18 fatty acid (e.g., Stearic acid, Petroselinic acid, trans-Petroselinic acid, Oleic acid, Elaidic acid, Ricinoleic acid, cis-Vaccenic acid, trans-Vaccenic acid, Linoleic acid, Linolelaidic acid, and Linolenic acid) .

[0055] (b) Linker Moiety

[0056] In some embodiments, the bacterial cell penetrating conjugate provided herein may contain a linker moiety (B in Formula (I) ) connecting the nucleic acid of A and the aliphatic moiety-containing C components. The linker moiety may be a low alkyl or alkenyl chain, for example, C1-C8 alkyl, C1-C3 alkyl, C3-C7 alkyl, C2-C8 alkenyl, C2-C4 alkenyl, or C4-C7 alkenyl. In one example, the linker is C3 alkyl. In another example, the linker is C6 alkyl. In yet an example, the linker is C7 alkyl.

[0057] In bacterial cell penetrating conjugates that have the B linker moiety, one end of the linker moiety may be directly linked covalently to either the 5’ end or the 3’ end phosphate group of the nucleic acid of A and the other end of the linker moiety may be covalently linked to the aliphatic moiety in C via a suitable bond or linker / moiety. Examples include, but are not limited to, an -NHC (O) -bond, a phosphoester bond, an ester bond, a thioester bond, a carbonate bond, a disulfide bond, a maleimide linker, a PEG linker, or a triazole moiety (e.g., via a click chemistry reaction) .

[0058] In some instances, B may have the structure of - (CH2) mNHC (O) -, in which m can be an integer between about 1 and about 10. In embodiments, m is 1. In embodiments, m is 2. In embodiments, m is 3. In embodiments, m is 4. In embodiments, m is 5. In embodiments, m is 6.In embodiments, m is 7. In embodiments, m is 8. In embodiments, m is 9. In embodiments, m is 10.

[0059] (c) Nucleic Acids

[0060] As may be used herein, the terms “nucleic acid, ” “nucleic acid molecule, ” “nucleic acid oligomer, ” “oligonucleotide, ” “nucleic acid sequence, ” “nucleic acid fragment” and “polynucleotide” are used interchangeably and are intended to include, but are not limited to, a polymeric form of nucleotides covalently linked together that may have various lengths, either deoxyribonucleotides or ribonucleotides, or analogs, derivatives or modifications thereof. In some examples, the nucleic acid provided herein may be an DNA molecule. In other examples, the nucleic acid provided herein may be an RNA molecule.

[0061] In some embodiments, the nucleic acid in the bacterial penetrating conjugates disclosed herein may be about 10 to about 30 nucleotides in length. In embodiments, the nucleic acid is about 12 to about 30 nucleotides in length. In embodiments, the nucleic acid is about 14 to about 30 nucleotides in length. In embodiments, the nucleic acid is about 16 to about 30 nucleotides in length. In embodiments, the nucleic acid is about 18 to about 30 nucleotides in length. In embodiments, the nucleic acid is about 20 to about 30 nucleotides in length. In embodiments, the nucleic acid is about 24 to about 30 nucleotides in length. In embodiments, the nucleic acid is about 26 to about 30 nucleotides in length. In embodiments, the nucleic acid is about 28 to about 30 nucleotides in length.

[0062] The nucleic acid in the bacterial penetrating conjugates provided herein may contain one or more modifications. For example, the nucleic acid may include a modification that enhances stability. Thus, in embodiments, the nucleic acid includes at least one modified nucleotide. In embodiments, the nucleotide modification includes a 2’ -deoxy, a 2’ -O-methyl, a 2-O-methoxy, a 2’ -fluoro, or a 2’ to 4’ bridge. In embodiments, the nucleic acid may include known nucleotide analogs or modified backbone residues or linkages, as described herein. In embodiments, the nucleic acid may include modifications to the nucleotide bases such as in 5-methyl cytidine or pseudouridine; and peptide nucleic acid backbones and linkages.

[0063] In embodiments, the nucleic acid includes a modified internucleoside linkage. In embodiments, the modified internucleoside linkage includes a phosphorothioate moiety. In embodiments, one or more of the nucleosides of the nucleic acid moiety are linked through a phosphorothioate moiety (e.g. monothiophosphate (e.g. -P (O) 3 (S) 3--) moiety, and the remaining nucleosides are linked through a phosphodiester moiety (-P (O) 43--) . In embodiments, the nucleic acid includes modified backbone residues or linkages, which are synthetic, naturally occurring, and non-naturally occurring.

[0064] In some embodiments, the nucleic acid provided herein may include one or more nucleotide analogs. As used herein, the term “nucleotide analog” encompasses altered bases, different (or unusual) sugars, altered phosphate backbones, or any combination of these alterations. Examples of such analogues include, without limitation, phosphodiester derivatives including, e.g., phosphoramidate, phosphorodiamidate, phosphorothioate (also known as phosphothioate) , phosphorodithioate, phosphonocarboxylic acids, phosphonocarboxylates, phosphonoacetic acid, phosphonoformic acid, methyl phosphonate, boron phosphonate, or O-methylphosphoroamidite linkages (see Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) ; and peptide nucleic acid backbones and linkages. Other analogue nucleic acids include those with positive backbones; non-ionic backbones, modified sugars, and non-ribose backbones (e.g., phosphorodiamidate morpholino oligos or locked nucleic acids (LNA) ) , including those described in U.S. Patent Nos. 5,235,033 and 5,034,506, and Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui &Cook, eds. Nucleic acids containing one or more carbocyclic sugars are also included within one definition of nucleic acids. Modifications of the ribose-phosphate backbone may be done for a variety of reasons, e.g., to increase the stability and half-life of such molecules in physiological environments or as probes on a biochip. Nucleotide analogues used herein also include nucleotides having modified 2’ position of the ribose ring. For example, the 2’ position of the ribose ring is substituted by O-methyl, O-alkyl, O-allyl, S-alkyl, S-allyl, or halo group. Mixtures of naturally occurring nucleic acids and analogues can be made; alternatively, mixtures of different nucleic acid analogues, and mixtures of naturally occurring nucleic acids and analogues may be made. In embodiments, the internucleotide linkages in DNA are phosphodiester, phosphodiester derivatives, or a combination of both.

[0065] In some embodiments, the nucleic acid in the bacterial cell penetrating conjugate may target a specific bacterial cell, for example, a pathogenic bacterium. Such a nucleic acid may target a gene of the bacterial cell so as to interfere with expression of the target gene and consequently inhibiting growth of the bacterial cell. Exemplary pathogenic bacterial cells include M. tuberculosis, Salmonella species, E. coli, Chlamydia species, Staphylococcus species, Bacillus species, andPsudomonas species.

[0066] In some embodiments, the bacterial cell penetrating conjugate provided herein including embodiments thereof is contemplated to be effective for treating and / or reducing the risk for an infectious disease. An infectious disease refers to diseases or disorders associate with infection, presence and / or growth of a pathogenic agent in a host subject. In embodiments, the infectious pathogenic agent is a bacterium. Bacteria associated with infectious disease include, but are not limited to, M. tuberculosis, Salmonella species, E. coli, Chlamydia species, Staphylococcus species, Bacillus species, andPsudomonas species.

[0067] In some examples, the nucleic acid may be complementary to a site within the genome of the target bacterial cell or a site within a transcript of the target bacterial cell so as to interfere with gene expression.

[0068] The term “complementary” or “complementarity” refers to the ability of a nucleic acid to form hydrogen bond (s) with another nucleic acid sequence by either traditional Watson-Crick or other non-traditional types. For example, the sequence A-G-T is complementary to the sequence T-C-A. A percent complementarity indicates the percentage of residues in a nucleic acid molecule which can form hydrogen bonds (e.g., Watson-Crick base pairing) with a second nucleic acid sequence (e.g., being 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, and 100%complementary) . “Perfectly complementary” means that all the contiguous residues of a nucleic acid sequence will hydrogen bond with the same number of contiguous residues in a second nucleic acid sequence. “Substantially complementary” as used herein refers to a degree of complementarity that is at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%. 97%, 98%, 99%, or 100%over a region of 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, or more nucleotides, or refers to two nucleic acids that hybridize under stringent conditions.

[0069] “Hybridization” refers to a reaction in which one or more polynucleotides react to form a complex that is stabilized via hydrogen bonding between the bases of the nucleotide residues. The hydrogen bonding may occur by Watson Crick base pairing, Hoogstein binding, or in any other sequence specific manner. The complex may comprise two strands forming a duplex structure, three or more strands forming a multi stranded complex, a single self-hybridizing strand, or any combination of these. A hybridization reaction may constitute a step in a more extensive process, such as the initiation of PCR, or the cleavage of a polynucleotide by an enzyme. A sequence capable of hybridizing with a given sequence is referred to as the “complement” of the given sequence.

[0070] (d) Detectable Moiety

[0071] In embodiments, the bacterial cell penetrating conjugate may include one or more moieties allowing detection of a bacterial cell. In embodiments, the bacterial cell penetrating conjugate allows detection of a target within a bacterial cell. Thus, in embodiments, the bacterial cell penetrating conjugate further includes a detectable moiety. A “detectable moiety” is a composition detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, chemical, or other physical means. For example, useful labels include 32P, fluorescent dyes, electron-dense reagents, enzymes (e.g., as commonly used in an ELISA) , biotin, digoxigenin, or haptens and proteins or other entities which can be made detectable, e.g., by incorporating a radiolabel into a peptide or antibody specifically reactive with a target peptide.

[0072] The detectable moiety may be linked to any part of the bacterial cell penetrating conjugate disclosed herein. In some instances, the detectable moiety may be linked to the nucleic acid component in the bacterial cell penetrating conjugate, e.g., via a covalent bond.

[0073] II. Pharmaceutical Compositions Comprising Bacterial Cell Penetrating Conjugates

[0074] Any of the bacterial cell penetrating conjugates provided herein may be formulated into a suitable pharmaceutical composition. The pharmaceutical compositions as described herein can further comprise pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or stabilizers in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions. Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover. Such carriers, excipients or stabilizers may enhance one or more properties of the active ingredients in the compositions described herein, e.g., bioactivity, stability, bioavailability, and other pharmacokinetics and / or bioactivities.

[0075] Acceptable carriers, excipients, or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations used, and may comprise buffers such as phosphate, citrate, and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid and methionine; preservatives (such as octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; benzoates, sorbate and m-cresol) ; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; proteins, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, serine, alanine or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates including glucose, mannose, or dextrans; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counter-ions such as sodium; metal complexes (e.g., Zn-protein complexes) ; and / or non-ionic surfactants such as TWEEN TM (polysorbate) , PLURONICS TM (nonionic surfactants) , or polyethylene glycol (PEG) .

[0076] In other examples, the pharmaceutical composition described herein can be formulated in sustained-release format. Suitable examples of sustained-release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers which matrices are in the form of shaped articles, e.g., films, or microcapsules. Examples of sustained-release matrices include polyesters, hydrogels (for example, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) , or poly (vinylalcohol) ) , polylactides (U.S. Pat. No. 3,773,919) , copolymers of L-glutamic acid and 7 ethyl-L-glutamate, non-degradable ethylene-vinyl acetate, degradable lactic acid-glycolic acid copolymers such as the LUPRON DEPOT TM (injectable microspheres composed of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate) , sucrose acetate isobutyrate, and poly-D- (-) -3-hydroxybutyric acid.

[0077] The pharmaceutical compositions to be used for in vivo administration must be sterile. This is readily accomplished by, for example, filtration through sterile filtration membranes. Therapeutic compositions are generally placed into a container having a sterile access port, for example, an intravenous solution bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle or a sealed container to be manually accessed.

[0078] The pharmaceutical compositions described herein can be in unit dosage forms such as solids, solutions or suspensions, or suppositories, for administration by inhalation or insufflation, intrathecal, intrapulmonary or intracerebral routes, oral, parenteral or rectal administration.

[0079] For preparing solid compositions, the principal active ingredient can be mixed with a pharmaceutical carrier, e.g., conventional tableting ingredients such as corn starch, lactose, sucrose, sorbitol, talc, stearic acid, magnesium stearate, dicalcium phosphate or gums, and other pharmaceutical diluents, e.g., water, to form a solid preformulation composition containing a homogeneous mixture of a compound of the present invention, or a non-toxic pharmaceutically acceptable salt thereof. When referring to these preformulation compositions as homogeneous, it is meant that the active ingredient is dispersed evenly throughout the composition so that the composition may be readily subdivided into equally effective unit dosage forms such as powder collections, tablets, pills and capsules. This solid preformulation composition is then subdivided into unit dosage forms of the type described above containing a suitable amount of the active ingredient in the composition.

[0080] Suitable surface-active agents include, in particular, non-ionic agents, such as polyoxyethylenesorbitans (e.g.,  20, 40, 60, 80 or 85) and other sorbitans (e.g.,  20, 40, 60, 80 or 85) . Compositions with a surface-active agent will conveniently comprise between 0.05 and 5%surface-active agent, for example, between 0.1 and 2.5%. It will be appreciated that other ingredients may be added, for example mannitol or other pharmaceutically acceptable vehicles, if necessary.

[0081] Suitable emulsions may be prepared using commercially available fat emulsions, such as INTRALIPID TM, LIPOSYN TM, INFONUTROL TM, LIPOFUNDIN TM, and LIPIPHYSAN TM. The active ingredient may be either dissolved in a pre-mixed emulsion composition or alternatively it may be dissolved in an oil (e.g., soybean oil, safflower oil, cottonseed oil, sesame oil, corn oil or almond oil) and an emulsion formed upon mixing with a phospholipid (e.g., eggphospholipids, soybean phospholipids or soybean lecithin) and water. It will be appreciated that other ingredients may be added, for example glycerol or glucose, to adjust the tonicity of the emulsion. Suitable emulsions will typically contain up to 20%oil, for example, between 5 and 20%.

[0082] Injectable compositions may contain various carriers such as vegetable oils, dimethylactamide, dimethyformamide, ethyl lactate, ethyl carbonate, isopropyl myristate, ethanol, and polyols (glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, and the like) . For intravenous injection, a water soluble bacterial cell penetrating conjugate can be administered by the drip method, whereby a pharmaceutical formulation containing the interfering RNA and a physiologically acceptable excipients is infused. Physiologically acceptable excipients may include, for example, 5%dextrose, 0.9%saline, Ringer’s solution or other suitable excipients. Intramuscular preparations, e.g., a sterile formulation of a suitable soluble salt form of the conjugate disclosed herein, can be dissolved and administered in a pharmaceutical excipient such as Water-for-Injection, 0.9%saline, or 5%glucose solution.

[0083] Pharmaceutical compositions for inhalation or insufflation include solutions and suspensions in pharmaceutically acceptable, aqueous or organic solvents, or mixtures thereof, and powders. The liquid or solid compositions may contain suitable pharmaceutically acceptable excipients as set out above. In some embodiments, the compositions are administered by the oral or nasal respiratory route for local or systemic effect. In some embodiments, the compositions are composed of particle sized between 10 nm to 100 mm.

[0084] Compositions in preferably sterile pharmaceutically acceptable solvents may be nebulized by use of gases. Nebulized solutions may be breathed directly from the nebulizing device or the nebulizing device may be attached to a face mask, tent, endotracheal tube and / or intermittent positive pressure breathing machine (ventilator) . Solution, suspension or powder compositions may be administered, preferably orally or nasally, from devices which deliver the formulation in an appropriate manner.

[0085] In some embodiments, any of the bacterial cell penetrating conjugates provided herein can be encapsulated or attached to a liposome, which can be prepared by methods known in the art, such as described in Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985) ; Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980) ; and U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545. Liposomes with enhanced circulation time are disclosed in U.S. Pat. No. 5,013,556. Particularly useful liposomes can be generated by the reverse phase evaporation method with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized phosphatidylethanolamine (PEG-PE) . Liposomes are extruded through filters of defined pore size to yield liposomes with the desired diameter.

[0086] In some embodiments, any of the bacterial cell penetrating conjugates provided herein may also be entrapped in microcapsules prepared, for example, by coacervation techniques or by interfacial polymerization, for example, hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly- (methylmethacylate) microcapsules, respectively, in colloidal drug delivery systems (for example, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nano-particles and nanocapsules) or in macroemulsions. Such techniques are known in the art, see, e.g., Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000) .

[0087] III. Methods for Delivering Nucleic Acids to Bacterial Cells

[0088] In another aspect is provided a method of delivering a nucleic acid moiety into a bacterial cell, the method including contacting a bacterial cell with the bacterial cell penetrating conjugate provided herein including embodiments thereof. In embodiments, the bacterial cell is a gram-negative bacterial cell. In embodiments, the bacterial cell is a pathogenic bacterium.

[0089] In embodiments, the bacterial cell penetrating conjugate includes a nucleic acid moiety that targets a bacterial cell nucleic acid. For example, the nucleic acid moiety may be at least partially complementary to a bacterial cell nucleic acid. In embodiments, the nucleic acid moiety at least partially hybridizes to a bacterial cell nucleic acid.

[0090] In embodiments, the bacterial cell penetrating conjugate provided herein is used to treat or reducing the risk for an infectious disease caused by a pathogenic bacterium. Thus, for the method provided herein, in embodiments, the contacting step is performed by administering a pharmaceutical composition including the bacterial penetrating conjugate to a subject infected with the bacterial cell. In embodiments, the subject is a human patient infected by the bacterial cell.

[0091] In some aspects, the present disclosure provides uses of a bacterial cell penetrating conjugate that carries a nucleic acid targeting a pathogenic bacterium or a pharmaceutical composition comprising such for treating an infectious disease caused by the pathogenic bacterium in a subject in need thereof. The methods generally involve administering to the subject in need of the treatment a therapeutically effective amount of a therapeutically effective amount of the composition herein.

[0092] The terms “subject” , “individual” , and “patient” are used interchangeably herein and refer to a mammal being assessed for treatment and / or being treated. Subjects may be human, but also include other mammals, particularly those mammals useful as laboratory models for human disease, e.g., mouse, rat, rabbit, dog, etc. A human subject who needs the treatment may be a human patient having, at risk for, or suspected of having a target disease / disorder, such as an infection by a pathogenic bacterium. In some embodiments, the subject (e.g., a human patient) may have or be suspected of having infection by a bacterium. In some examples, the subject is a human patient having or suspected of having infection by a pathogenic bacterium. Treatment efficacy for a target disease / disorder can be assessed by methods well-known in the art.

[0093] To practice the method disclosed herein, an effective amount of the pharmaceutical composition described herein that contains a bacterial cell penetrating conjugate as disclosed herein can be administered to a subject (e.g., a human) in need of the treatment via a suitable route, such as intravenous administration, e.g., as a bolus or by continuous infusion over a period of time, by intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutaneous, intra-articular, intrasynovial, intrathecal, oral, inhalation or topical routes.

[0094] As used herein, “an effective amount” refers to the amount of each active agent required to confer therapeutic effect on the subject, either alone or in combination with one or more other active agents. In some embodiments, the therapeutic effect is reduced replication and / or production of the pathogenic bacterium. Determination of whether an amount of the nucleic acid in the bacterial cell penetrating conjugate achieved the therapeutic effect would be evident to one of skill in the art. Effective amounts vary, as recognized by those skilled in the art, depending on the particular condition being treated, the severity of the condition, the individual patient parameters including age, physical condition, size, gender and weight, the duration of the treatment, the nature of concurrent therapy (if any) , the specific route of administration and like factors within the knowledge and expertise of the health practitioner. These factors are well known to those of ordinary skill in the art and can be addressed with no more than routine experimentation. It is generally preferred that a maximum dose of the individual components or combinations thereof be used, that is, the highest safe dose according to sound medical judgment.

[0095] Empirical considerations, such as the half-life, generally will contribute to the determination of the dosage. Frequency of administration may be determined and adjusted over the course of therapy, and is generally, but not necessarily, based on treatment and / or suppression and / or amelioration and / or delay of a target disease / disorder. Alternatively, sustained continuous release formulations of the bacterial cell penetrating conjugate may be appropriate. Various formulations and devices for achieving sustained release are known in the art.

[0096] In one example, dosages for the bacterial cell penetrating conjugate as described herein may be determined empirically in individuals who have been given one or more administration (s) of the bacterial cell penetrating conjugate. Individuals are given incremental dosages of the antagonist. To assess efficacy of the antagonist, an indicator of the disease / disorder can be followed.

[0097] Generally, for administration of any of the bacterial cell penetrating conjugates described herein, an initial candidate dosage can be about 2 mg / kg. For the purpose of the present disclosure, a typical daily dosage might range from about any of 0.1 μg / kg to 3 μg / kg to 30 μg / kg to 300 μg / kg to 3 mg / kg, to 30 mg / kg to 100 mg / kg or more, depending on the factors mentioned above. For repeated administrations over several days or longer, depending on the condition, the treatment is sustained until a desired suppression of symptoms occurs or until sufficient therapeutic levels are achieved to alleviate a target disease or disorder, or a symptom thereof. An exemplary dosing regimen comprises administering an initial dose of about 2 mg / kg, followed by a weekly maintenance dose of about 1 mg / kg of the bacterial cell penetrating conjugate, or followed by a maintenance dose of about 1 mg / kg every other week. However, other dosage regimens may be useful, depending on the pattern of pharmacokinetic decay that the practitioner wishes to achieve. For example, dosing from one-four times a week is contemplated. In some embodiments, dosing ranging from about 3 μg / mg to about 2 mg / kg (such as about 3 μg / mg, about 10 μg / mg, about 30 μg / mg, about 100 μg / mg, about 300 μg / mg, about 1 mg / kg, and about 2 mg / kg) may be used. In some embodiments, dosing frequency is once every week, every 2 weeks, every 4 weeks, every 5 weeks, every 6 weeks, every 7 weeks, every 8 weeks, every 9 weeks, or every 10 weeks; or once every month, every 2 months, or every 3 months, or longer. The progress of this therapy is easily monitored by conventional techniques and assays. The dosing regimen can vary over time.

[0098] The term “about” or “approximately” used herein means within an acceptable error range for the particular value as determined by one of ordinary skill in the art, which will depend in part on how the value is measured or determined, i.e., the limitations of the measurement system. For example, “about” can mean within an acceptable standard deviation, per the practice in the art. Alternatively, “about” can mean a range of up to ± 20%, preferably up to ± 10%, more preferably up to ± 5%, and more preferably still up to ± 1%of a given value. Alternatively, particularly with respect to biological systems or processes, the term can mean within an order of magnitude, preferably within 2-fold, of a value. Where particular values are described in the application and claims, unless otherwise stated, the term “about” is implicit and in this context means within an acceptable error range for the particular value.

[0099] In some embodiments, for an adult patient of normal weight, doses ranging from about 0.3 to 5.00 mg / kg may be administered. The particular dosage regimen, i.e., dose, timing and repetition, will depend on the particular individual and that individual's medical history, as well as the properties of the individual agents (such as the half-life of the agent, and other considerations well known in the art) .

[0100] For the purpose of the present disclosure, the appropriate dosage of the bacterial cell penetrating conjugate as described herein will depend on the specific nucleic acid carried thereby, the type and severity of the disease / disorder, whether the conjugate is administered for preventive or therapeutic purposes, previous therapy, the patient’s clinical history and response to the antagonist, and the discretion of the attending physician. A clinician may administer a bacterial cell penetrating conjugate until a dosage is reached that achieves the desired result. In some embodiments, the desired result is a decrease in tumor burden, a decrease in cancer cells, or increased immune activity. Methods of determining whether a dosage resulted in the desired result would be evident to one of skill in the art. Administration of one or more bacterial cell penetrating conjugates can be continuous or intermittent, depending, for example, upon the recipient's physiological condition, whether the purpose of the administration is therapeutic or prophylactic, and other factors known to skilled practitioners. The administration of the bacterial cell penetrating conjugate may be essentially continuous over a preselected period of time or may be in a series of spaced dose, e.g., either before, during, or after developing a target disease or disorder.

[0101] As used herein, the term “treating” refers to the application or administration of a composition including one or more active agents to a subject, who has a target disease or disorder, a symptom of the disease / disorder, or a predisposition toward the disease / disorder, with the purpose to cure, heal, alleviate, relieve, alter, remedy, ameliorate, improve, or affect the disorder, the symptom of the disease, or the predisposition toward the disease or disorder.

[0102] Alleviating a target disease / disorder includes delaying the development or progression of the disease or reducing disease severity. Alleviating the disease does not necessarily require curative results. As used therein, “delaying” the development of a target disease or disorder means to defer, hinder, slow, retard, stabilize, and / or postpone progression of the disease. This delay can be of varying lengths of time, depending on the history of the disease and / or individuals being treated. A method that “delays” or alleviates the development of a disease, or delays the onset of the disease, is a method that reduces probability of developing one or more symptoms of the disease in a given time frame and / or reduces extent of the symptoms in a given time frame, when compared to not using the method. Such comparisons are typically based on clinical studies, using a number of subjects sufficient to give a statistically significant result.

[0103] “Development” or “progression” of a disease means initial manifestations and / or ensuing progression of the disease. Development of the disease can be detectable and assessed using standard clinical techniques as well known in the art. However, development also refers to progression that may be undetectable. For purpose of this disclosure, development or progression refers to the biological course of the symptoms. “Development” includes occurrence, recurrence, and onset. As used herein “onset” or “occurrence” of a target disease or disorder includes initial onset and / or recurrence.

[0104] Conventional methods, known to those of ordinary skill in the art of medicine, can be used to administer the pharmaceutical composition to the subject, depending upon the type of disease to be treated or the site of the disease. This composition can also be administered via other conventional routes, e.g., administered orally, parenterally, by inhalation spray, topically, rectally, nasally, buccally, vaginally or via an implanted reservoir. The term “parenteral” as used herein includes subcutaneous, intracutaneous, intravenous, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional, and intracranial injection or infusion techniques. In addition, it can be administered to the subject via injectable depot routes of administration such as using 1-, 3-, or 6-month depot injectable or biodegradable materials and methods. In some embodiments, the composition can be administered via a nasal route, for example, intranasal spray, nasal spray, or nasal drops. In specific examples, the composition can be administered to a subject in need of the treatment (e.g., prophylactic or actual) via both intranasal instillation and aerosol inhalation.

[0105] In one embodiment, the bacterial cell penetrating conjugate may be administered via site-specific or targeted local delivery techniques. Examples of site-specific or targeted local delivery techniques include various implantable depot sources of the conjugate or local delivery catheters, such as infusion catheters, an indwelling catheter, or a needle catheter, synthetic grafts, adventitial wraps, shunts and stents or other implantable devices, site specific carriers, direct injection, or direct application. See, e.g., PCT Publication No. WO 00 / 53211 and U.S. Pat. No. 5,981,568.

[0106] Targeted delivery of therapeutic compositions containing the bacterial cell penetrating conjugate can also be used. Receptor-mediated DNA delivery techniques are described in, for example, Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11: 202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed. ) (1994) ; Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263: 621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269: 542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266: 338.

[0107] Any of the bacterial cell penetrating conjugates provided herein can be used for delivering nucleic acids to various bacterial cells, including both gram-negative and gram-positive cells. Examples gram-negative bacterial cells include, but are not limited to, a Bacteroides, a Fusobacterium (e.g., F. nucleatum) , a Phocaeicola, an Odoribacter, a Pseudomonas (e.g., P. aeruginosa) , a Helicobacter (e.g., H. pylori) , an Aggregatibacter (e.g., A.actinomycetemcomitans) or a Porphyromonas (e.g., P. gingivalis) . Exemplary gram-positive bacterial cells include, but are not limited to, a Blautia, a Clostridium, a Dorea, an Erysipelatoclostridium, an Eubacterium, a Lacrimispora, a Longicatena, or a Ruminococcus.

[0108] IV. Kits for Delivering Nucleic Acids to Bacterial Cells

[0109] The present disclosure also provides kits for use in delivering nucleic acids to bacterial cells and / or treating bacterial infection. Such kits can include one or more containers comprising the bacterial cell penetrating conjugate or a composition comprising such as described herein.

[0110] In some embodiments, the kit can comprise instructions for use in accordance with any of the methods described herein. The included instructions can comprise, for example, a description of administration of the bacterial cell penetrating conjugate and optionally a description of administration of the second therapeutic agent (s) to improve medical conditions of bacterial infection or in the rick of bacterial infection. The kit may further comprise a description of selecting an individual suitable for treatment based on identifying whether that individual has the disease or is at risk for the disease. In still other embodiments, the instructions comprise a description of administering one or more agents of the disclosure to an individual at risk of bacterial infection.

[0111] The instructions relating to the use of the bacterial cell penetrating conjugate to achieve the intended therapeutic effects generally include information as to dosage, dosing schedule, and route of administration for the intended treatment. The containers may be unit doses, bulk packages (e.g., multi-dose packages) or sub-unit doses. Instructions supplied in the kits of the invention are typically written instructions on a label or package insert (e.g., a paper sheet included in the kit) , but machine-readable instructions (e.g., instructions carried on a magnetic or optical storage disk, or QR code) are also acceptable.

[0112] The label or package insert may indicate that the composition is used for the intended therapeutic utilities. Instructions may be provided for practicing any of the methods described herein.

[0113] The kits of this invention are in suitable packaging. Suitable packaging includes, but is not limited to, chambers, vials, bottles, jars, flexible packaging (e.g., sealed Mylar or plastic bags) and the like. Also contemplated are packages for use in combination with a specific device, such as an inhaler, nebulizer, ventilator, nasal administration device (e.g., an atomizer) or an infusion device such as a minipump. A kit may have a sterile access port (for example the container may be an intravenous solution bag or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle) . The container may also have a sterile access port (for example the container may be an intravenous solution bag or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle) .

[0114] Kits may optionally provide additional components such as buffers and interpretive information. Normally, the kit comprises a container and a label or package insert (s) on or associated with the container. In some embodiments, the invention provides articles of manufacture comprising contents of the kits described above.

[0115] General techniques

[0116] The practice of the present disclosure will employ, unless otherwise indicated, conventional techniques of molecular biology (including recombinant techniques) , microbiology, cell biology, biochemistry, and immunology, which are within the skill of the art. Such techniques are explained fully in the literature, such as Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed. 1984) ; Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. 1987) ; Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc. ) ; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds. ) : Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987) ; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds. 1987) ; PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994) ; Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991) ; Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999) ; Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997) ; Antibodies (P. Finch, 1997) ; Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989) ; Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000) ; Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) ; The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995) ; DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985) ; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames &S. J. Higgins eds. (1985) ; Transcription and Translation (B.D. Hames &S.J. Higgins, eds. (1984) ; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986) ; Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986) ; and B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984) ; F.M. Ausubel et al. (eds. ) .

[0117] Without further elaboration, it is believed that one skilled in the art can, based on the above description, utilize the present invention to its fullest extent. The following specific embodiments are, therefore, to be construed as merely illustrative, and not limitative of the remainder of the disclosure in any way whatsoever. All publications cited herein are incorporated by reference for the purposes or subject matter referenced herein.

[0118] EXAMPLES

[0119] While the present disclosure has been described with reference to the specific embodiments thereof, it should be understood by those skilled in the art that various changes may be made and equivalents may be substituted without departing from the true spirit and scope of the disclosure. In addition, many modifications may be made to adapt a particular situation, material, composition of matter, process, process step or steps, to the objective, spirit, and scope of the present disclosure. All such modifications are intended to be within the scope of the disclosure.

[0120] Example 1: Preparation of Oligonucleotide-Carbon Chain Conjugates

[0121] (a) C16-Oligonucleotide Conjugate with C3 Linker

[0122] A C16 carbon chain, linked to a C3 linker via an amide bond, was immobilized on a controlled pore glass (CPG) support. The carbon chain modified CPG supports were used for oligonucleotide synthesis via solid phase synthesis to produce the C16-oligonucleotide conjugate with the C3 linker. The resultant C16-oligonucleotide conjugate is illustrated in FIG. 1A.

[0123] (b) C16-Oligonucleotide Conjugate with C6 Linker

[0124] An oligonucleotide was synthesized with an NH2 functional group on either the 5’ end or the 3’ end via a C6 linker. The oligonucleotide was then coupled with a C16 carbon chain that carries an NHS-ester (see FIG. 1B) . The coupling process is provided below (see also FIG. 1B) :

[0125] 1. Dissolve C16-NHS esters (15 eq) in an acetonitrile (anhydrous) solution;

[0126] 2. Dissolve the oligonucleotide in a bicarbonate buffer;

[0127] 3. Mix 1 and 2 to form a mixture. Vortex and sonicate the mixture to form a solution;

[0128] 4. Place the solution of 3 at 40℃ for 16 hours to allow for coupling of the C16 carbon chain with the oligonucleotide via the C6 linker; and

[0129] 5. Purify the thus formed C16-conjugated oligonucleotide via HPLC.

[0130] (c) C18-Oligonucleotide Conjugate with No Linker

[0131] An oligonucleotide was synthesized by conventional solid phase synthesis. After the last step of oligonucleotide synthesis, aphosphoramidite carrying a C18 carbon chain (shown in FIG. 1C) was reacted with the oligonucleotide, resulting in direct conjugation of the C18 carbon chain to the oligonucleotide (at the 5’ end) . FIG. 1C illustrates the structure of the resultant C18-oligonucleotide conjugate.

[0132] (d) C18-Oligonucleotide Conjugate with C6 Linker

[0133] An oligonucleotide was synthesized with an NH2 functional group on either the 5’ end or the 3’ end via a C6 linker. The oligonucleotide was then coupled with a C18 carbon chain that carries a NHS-ester (see FIG. 1D) . The coupling process is provided below (see also FIG. 1D) :

[0134] 1. Dissolve C18-NHS esters (15 eq) in an acetonitrile (anhydrous) solution;

[0135] 2. Dissolve the oligonucleotide in a bicarbonate buffer;

[0136] 3. Mix 1 and 2 to form a mixture. Vortex and sonicate the mixture to form a solution;

[0137] 4. Place the solution of 3 at 40℃ for 16 hours to allow for coupling of the C18 carbon chain with the oligonucleotide via the C8 linker; and

[0138] 5. Purify the thus formed C18-conjugated oligonucleotide via HPLC.

[0139] (e) DSPE-Oligonucleotide Conjugate with C6 Linker

[0140] An oligonucleotide was synthesized with an NH2 functional group on either the 5’ end or the 3’ end via a C6 linker. The oligonucleotide was then coupled with NHS-ester modified 1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE) (see FIG. 1E) . The coupling process is provided below (see also FIG. 1E) :

[0141] 1. Dissolve DSPE-NHS esters (15 eq) in an acetonitrile (anhydrous) solution;

[0142] 2. Dissolve the oligonucleotide in a bicarbonate buffer;

[0143] 3. Mix 1 and 2 to form a mixture. Vortex and sonicate the mixture to form a solution;

[0144] 4. Place the solution of 3 at 40℃ for 16 hours to allow for coupling of DSPE with the oligonucleotide via the C6 linker; and

[0145] 5. Purify the thus formed DSPE-conjugated oligonucleotide via HPLC.

[0146] Example 2: Carbon Chain Conjugation Facilitates Delivery of Nucleic Acids to Bacterial Cells

[0147] This example explores the capacity of carbon chains in facilitating delivery of nucleic acids into bacterial cells.

[0148] Oligonucleotides (ON) covalently conjugated with a C16 carbon chain (see Example 1) , or a cell-penetrating peptide (CPP) (Martina Traykovska and Robert Penchovsky ACS Synthetic Biology 2022 11 (5) , 1845-1855 DOI: 10.1021 / acssynbio. 2c00013) were prepared following routine practice or disclosures provided herein. See Example 1 and (Martina Traykovska and Robert Penchovsky ACS Synthetic Biology 2022 11 (5) , 1845-1855 DOI: 10.1021 / acssynbio. 2c00013) . The oligonucleotide conjugates were further covalently linked to BHQ1-C6-S-S-C6-dT (FAM) for monitoring cell entry of the oligonucleotides as illustrated in FIG. 2A. After FAM-S-S-BHQ-containing oligonucleotides entering bacterial cells, the disulfide bond in FAM would be cut by reducing substances inside the bacterial cells, leading to removal of the BHQ quenching group from FAM and emission of a fluorescent signal.

[0149] F. nucleatum ATCC 25586 (Fnn) cells were grown overnight at 37 ℃ in a BHI medium under anaerobic conditions to reach an OD600 value of 0.7～0.8. Around 4 x 108 CFU Fnn cells were incubated with 5 μM of BF-ON-CPP, BF-ON-C16, or BF-ON at 37 ℃ for 4 hours. After co-incubation, the bacterial cells were washed twice with the SELEX buffer (40 mM HEPES, pH 7.5, 5 mM KCl, 111 mM NaCl, 1 mM CaCl2 and 1 mM MgCl2) , and visualized under a Zeiss LSM 800 confocal laser scanning microscope for intensity of fluorescent signals, which indicate delivery of the C16-or CPP-conjugated oligonucleotides into the bacterial cells.

[0150] Fnn cells incubated with the C16-oligonucleotide conjugate showed stronger fluorescent signals relative to the Fnn cells incubated with the CPP-oligonucleotide conjugate, indicating that carbon chains such as C16 would be a better carrier for facilitating delivery of nucleic acids into bacterial cells as relative to CPP. See FIG. 2B.

[0151] A similar assay was performed comparing bacterial cell entry of the oligonucleotide noted above with a polyA oligonucleotide (containing 25 A residues) , both conjugated with a carbon chain (C16 or C18; see Example 1) . As shown in FIG. 2C, both the oligonucleotide and the polyA oligonucleotide, when conjugated with the C16 or C18 carbon chain, showed similar levels of bacterial cell entry. This result indicates that the carbon chain conjugation contributes to the enhanced bacterial cell entry and this effect is independent to the sequences of the nucleic acids conjugated thereto.

[0152] Example 3: Optimization of Carbon Chain-Oligonucleotide Conjugates for Entering Bacterial Cells

[0153] This example explores the efficiency of various carbon chains for enhancing delivery of nucleic acids conjugated thereto, using an anti-microbial oligonucleotide as an example and the growth inhibition of the target bacterium (F. nucleatum as an example) as the readout. The various oligonucleotide-carbon chain conjugates examined in this Example are provided in FIGs. 3A-3E.

[0154] F. nucleatum cells were grown overnight at 37 ℃ in a BHI medium under anaerobic conditions to reach an OD600 value of 0.6～0.7. The bacterial culture was diluted 1: 10 in fresh prepared BHI medium containing 0.05%w / v L-Cysteine. The diluted culture was placed in a 96-well plate (Thermo Fisher Scientific) 160 μl / well, and 20 μl / well of an oligonucleotide-conjugate (at various concentrations) was added into each well. The bacterial cells were cultured at 37 ℃ with supplies of 15%CO2 / 85%N2 and the cell growth was monitored by measuring the OD values at 600 nm every 30 min in a Synergy neo2 plate reader with CO2 / N2 gas controller (Biotek) for 24 h. The growth was kept under non-shaking incubation until each 30-min timepoint to start a 5 sec linear shaking (567 cpm) for even OD measurement. The initial OD600 was around 0.10～0.13 (1 x 106～5 x 106 CFU / ml) .

[0155] The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined as the lowest concentration of the tested oligonucleotide-conjugate that inhibited visible growth in the wells.

[0156] As shown in FIG. 4A, the anti-microbial oligonucleotide showed some levels of inhibition of target cell growth when conjugated with the C6-C22 carbon chains with the C16-C18 chains showing better inhibitory activity. Both alkane chains and alkene chains showed similar inhibitory activity, regardless of whether the carbon chain is conjugated to the 5’ end or the 3’ end of the oligonucleotide. FIGs. 4B-4C. On the other hand, the anti-microbial oligonucleotide conjugated to DSPE or cholesterol showed little of no inhibitory activity against the target bacterial cells, indicating no entry into the bacterial cells. FIG. 4D.

[0157] Example 4: Use of Carbon Chain-Oligonucleotide Conjugates for Delivering Agents into Various Bacterial Cells

[0158] This example describes the use of the carbon chain oligonucleotide conjugates as described in Examples 1-3 (with the C6 linker as an example) for delivering agents into various bacterial cells, including both Gram-positive and Gram-negative bacterial cells. The capacity of the carbon chains in facilitating the delivery of nucleic acids into various bacterial species as indicated below was experimentally evaluated.

[0159] (i) Delivery of Nucleic Acids to H. pylori and P. aeruginosa

[0160] Bacterial cell entry of a polyA oligonucleotide containing 25 A residues conjugated with a C16 carbon chain into H. pylori andP. aeruginosa was evaluated using an assay as described in Example 2. H. pylori causes stomach ulcers andP. aeruginosa causes infection of blood and lung among other organs. FIG. 5A schematically illustrates the oligonucleotide conjugates used for this study. 6-FAM-Ac NHS Ester was used as a detecting label in this study. 6-FAM-Ac NHS Ester was conjugated to the polyA-C16 complex. After being delivered into bacterial cells, the non-fluorescent 6-FAM-Ac NHS Ester-polyA-C16 conjugate converts to a fluorescent conjugate via cellular esterase. This process is also illustrated in FIG. 5A.

[0161] As shown in FIG. 5B-5F, the polyA oligonucleotide conjugated with the C16 carbon chain showed similar levels of bacterial cell entry toH. pylori (which can cause stomach ulcers) , P. aeruginosa (which can cause pneumonia, septic shock, urinary tract infection, gastrointestinal infection, or skin and soft tissue infections) , A. actinomycetemcomitans (which can cause periodontal disease, dental caries, soft tissue abscesses, or endocargitis) , andP. gingivalis (which can cause gingivitis or periodontitis) .

[0162] (ii) Identification of Bacterial Species Compatible with the Oligonucleotide-Carbon Chain Delivery System

[0163] To identify other bacterial species compatible with the delivery system disclosed herein, a total of 5×107 CFU of human fecal microbiota was inoculated into 1 mL of Mipro medium and incubated under anaerobic conditions (5%H2, 15%CO2, 80%N2) in a Whitley A35 Anaerobic Chamber at 37℃  / 50%RH for 24 hours. Following incubation, approximately 1 mL of the culture (～1011 CFU) was collected into a 1.5 mL microcentrifuge tube. The culture was centrifuged at 8,000 × g for 5 minutes to pellet the fecal microbiota. The centrifuged bacterial pellet was resuspended in 100 μL of SELEX buffer with final 5 μM of FAc-NC25-C16 and incubated under anaerobic conditions for 3 hours. Following incubation, the sample was sorted using a Sony SH800S sorter (FSC channel value 0.3%, nozzle size 70 μm, auto-optimized parameters) . A total of 25 million FITC-positive events were collected. Genomic DNA of sorted bacteria was extracted following the manufacturer’s protocol of the QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit (QIAGEN, Cat. No. 51804) . Multiple displacement amplification was performed using the REPLI-g Single Cell Kit (QIAGEN, Cat. No. 150343) to amplify DNA to a sufficient quantity. The amplified DNA was then subjected to shotgun sequencing for bacteria identification. Table 1 below lists the bacterial species identified as compatible with the delivery system (the oligonucleotide-carbon chain conjugate can be delivered into those bacterial species) .

[0164] Table 1: Bacterial Species Compatible with the Oligonucleotide-Conjugate Delivery System

[0165] Example 5: Uses of Various Fatty Acids in Bacterial Delivery System

[0166] This example explores delivery efficiency of oligonucleotide-carbon chain conjugates to bacterial cells (usingF. nucleatum as an example) , using various fatty acids listed in Table 2 below conjugated to the anti-bacterial oligonucleotide disclosed in Example 3 above via a C6 linker as disclosed herein. Preparation of the oligonucleotide-carbon chain conjugates and detection of their delivery into the bacterial cells follow the methods disclosed in Examples 1-4 above. The delivery efficiency of each oligonucleotide-carbon chain conjugate is measured using the efficiency of bacterial cell growth inhibition as the readout. The inhibition / delivery efficiency was normalized against that of the C16-oligonucleotide (C16-ON; see Example 3 above) and the relative inhibitor / delivery efficiency is also provided in Table 2 below.

[0167] Table 2: Delivery Efficiencies of Bacterial Delivery Conjugates with Various Carbon Chains

[0168] *: In comparison with C16-ON

[0169] OTHER EMBODIMENTS

[0170] All of the features disclosed in this specification may be combined in any combination. Each feature disclosed in this specification may be replaced by an alternative feature serving the same, equivalent, or similar purpose. Thus, unless expressly stated otherwise, each feature disclosed is only an example of a generic series of equivalent or similar features.

[0171] From the above description, one skilled in the art can easily ascertain the essential characteristics of the present invention, and without departing from the spirit and scope thereof, can make various changes and modifications of the invention to adapt it to various usages and conditions. Thus, other embodiments are also within the claims.

[0172] EQUIVALENTS

[0173] While several inventive embodiments have been described and illustrated herein, those of ordinary skill in the art will readily envision a variety of other means and / or structures for performing the function and / or obtaining the results and / or one or more of the advantages described herein, and each of such variations and / or modifications is deemed to be within the scope of the inventive embodiments described herein. More generally, those skilled in the art will readily appreciate that all parameters, dimensions, materials, and configurations described herein are meant to be exemplary and that the actual parameters, dimensions, materials, and / or configurations will depend upon the specific application or applications for which the inventive teachings is / are used. Those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific inventive embodiments described herein. It is, therefore, to be understood that the foregoing embodiments are presented by way of example only and that, within the scope of the appended claims and equivalents thereto, inventive embodiments may be practiced otherwise than as specifically described and claimed. Inventive embodiments of the present disclosure are directed to each individual feature, system, article, material, kit, and / or method described herein. In addition, any combination of two or more such features, systems, articles, materials, kits, and / or methods, if such features, systems, articles, materials, kits, and / or methods are not mutually inconsistent, is included within the inventive scope of the present disclosure.

[0174] All definitions, as defined and used herein, should be understood to control over dictionary definitions, definitions in documents incorporated by reference, and / or ordinary meanings of the defined terms.

[0175] All references, patents and patent applications disclosed herein are incorporated by reference with respect to the subject matter for which each is cited, which in some cases may encompass the entirety of the document.

[0176] The indefinite articles “a” and “an, ” as used herein in the specification and in the claims, unless clearly indicated to the contrary, should be understood to mean “at least one. ”

[0177] The phrase “and / or, ” as used herein in the specification and in the claims, should be understood to mean “either or both” of the elements so conjoined, i.e., elements that are conjunctively present in some cases and disjunctively present in other cases. Multiple elements listed with “and / or” should be construed in the same fashion, i.e., “one or more” of the elements so conjoined. Other elements may optionally be present other than the elements specifically identified by the “and / or” clause, whether related or unrelated to those elements specifically identified. Thus, as a non-limiting example, a reference to “A and / or B”, when used in conjunction with open-ended language such as “comprising” can refer, in one embodiment, to A only (optionally including elements other than B) ; in another embodiment, to B only (optionally including elements other than A) ; in yet another embodiment, to both A and B (optionally including other elements) ; etc.

[0178] As used herein in the specification and in the claims, “or” should be understood to have the same meaning as “and / or” as defined above. For example, when separating items in a list, “or” or “and / or” shall be interpreted as being inclusive, i.e., the inclusion of at least one, but also including more than one, of a number or list of elements, and, optionally, additional unlisted items. Only terms clearly indicated to the contrary, such as “only one of” or “exactly one of, ” or, when used in the claims, “consisting of, ” will refer to the inclusion of exactly one element of a number or list of elements. In general, the term “or” as used herein shall only be interpreted as indicating exclusive alternatives (i.e. “one or the other but not both” ) when preceded by terms of exclusivity, such as “either, ” “one of, ” “only one of, ” or “exactly one of. ” “Consisting essentially of, ” when used in the claims, shall have its ordinary meaning as used in the field of patent law.

[0179] As used herein in the specification and in the claims, the phrase “at least one, ” in reference to a list of one or more elements, should be understood to mean at least one element selected from any one or more of the elements in the list of elements, but not necessarily including at least one of each and every element specifically listed within the list of elements and not excluding any combinations of elements in the list of elements. This definition also allows that elements may optionally be present other than the elements specifically identified within the list of elements to which the phrase “at least one” refers, whether related or unrelated to those elements specifically identified. Thus, as a non-limiting example, “at least one of A and B” (or, equivalently, “at least one of A or B, ” or, equivalently “at least one of A and / or B” ) can refer, in one embodiment, to at least one, optionally including more than one, A, with no B present (and optionally including elements other than B) ; in another embodiment, to at least one, optionally including more than one, B, with no A present (and optionally including elements other than A) ; in yet another embodiment, to at least one, optionally including more than one, A, and at least one, optionally including more than one, B (and optionally including other elements) ; etc.

[0180] It should also be understood that, unless clearly indicated to the contrary, in any methods claimed herein that include more than one step or act, the order of the steps or acts of the method is not necessarily limited to the order in which the steps or acts of the method are recited.

Claims

1.A bacterial cell penetrating conjugate comprising Formula (I) : A –B –C (I) ,wherein A is a nucleic acid moiety;wherein B is null or a linker moiety; andwherein C comprises an aliphatic moiety.2.The bacterial cell penetrating conjugate of claim 1, wherein the aliphatic moiety in C is an alkyl moiety or an alkenyl moiety.3.The bacterial cell penetrating conjugate of claim 2, wherein the aliphatic moiety in C is an unsubstituted C6 to C22alkyl moiety, optionally an unsubstituted C12 to C18 alkyl moiety.4.The bacterial cell penetrating conjugate of claim 2, wherein the aliphatic moiety in C is an unsubstituted C12 to C20 alkenyl moiety, optionally an unsubstituted C18 alkenyl moiety.5.The bacterial cell penetrating conjugate of any one of claims 1-4, wherein the aliphatic moiety in C is an alkenyl moiety, which comprises 1 double-bond or 2 double-bonds.6.The bacterial cell penetrating conjugate of claim 1, wherein the aliphatic moiety in C is the alkyl or alkenyl moiety of a fatty acid selected from the group consisting of Myristoleic acid, Pentadecanoic acid, Palmitic acid, Palmitoleic acid, Stearic acid, Petroselinic acid, trans-Petroselinic acid, Oleic acid, Elaidic acid, Richnoleic acid, cis-Vaccenic acid, trans-Vaccenic acid, Linoleic acid, Linolelaicid acid, and Linolenic acid.7.The bacterial cell penetrating conjugate of claim 6, wherein wherein the aliphatic moiety in C is the alkyl or alkenyl moiety of a fatty acid selected from the group consisting of Pentadecanoic acid, Palmitic acid, Stearic acid, Petroselinic acid, trans-Petroselinic acid, Oleic acid, Elaidic acid, cis-Vaccenic acid, trans-Vaccenic acid, and Linolelaicid acid.8.The bacterial cell penetrating conjugate of any one of claims 1 to 7, wherein B is null and C is attached to the 5’ end or the 3’ end phosphate group of the nucleic acid of A.9.The bacterial cell penetrating conjugate of any one of claims 1 to 7, wherein Formula I comprises B, which is a linker moiety.10.The bacterial cell penetrating conjugate of claim 9, wherein the linker moiety comprises a C1-C10 alkyl group or a C2-C10 alkenyl group, optionally a C3-C7 alkyl or alkenyl group.11.The bacterial cell penetrating conjugate of claim 9 or claim 10, wherein one end of the linker moiety is covalently linked to the 5’ end or the 3’ end phosphate group of the nucleic acid of A and the other end of the linker moiety is covalently linked to the aliphatic moiety in C via an -NHC (O) -bond, a phosphoester bond, an ester bond, a thioester bond, a carbonate bond, a disulfide bond, a maleimide linker, a PEG linker, or a triazole moiety.12.The bacterial cell penetrating conjugate of claim 1, which has a structure set forth in FIGs. 3A-3F.13.The bacterial cell penetrating conjugate of any one of claims 1 to 12, wherein the nucleic acid is DNA or RNA.14.The bacterial cell penetrating conjugate of any one of claims 1 to 13, wherein the nucleic acid is about 10 to about 50 nucleotides in length, optionally about 15 to about 30 nucleotides in length.15.The bacterial cell penetrating conjugate of claim 14, wherein the nucleic acid is about 17 to about 25 nucleotides in length.16.The bacterial cell penetrating conjugate of any one of claims 1 to 15, wherein the nucleic acid comprises at least one modified nucleotide.17.The bacterial cell penetrating conjugate of any one of claims 1 to 6, further comprising a detectable moiety.18.A pharmaceutical composition comprising the bacterial penetrating conjugate of any one of claims 1 to 17 and a pharmaceutically acceptable carrier.19.A method of delivering a nucleic acid into a bacterial cell, the method comprising contacting the bacterial cell with the bacterial cell penetrating conjugate of any one of claims 1 to 17 to allow for entry of the bacterial cell penetrating conjugate into the bacterial cell.20.The method of claim 19, wherein the bacterial cell is a gram-negative bacterial cell.21.The method of claim 20, wherein the gram-negative bacterial cell is an Aggregatibacter, a Bacteroides, a Fusobacterium, a Helicobacter, an Odoribacter, a Phocaeicola, a Porphyromonas, or a Pseudomonas.22.The method of claim 19, wherein the bacterial cell is a gram-positive bacterial cell.23.The method of claim 22, wherein the gram-positive bacterial cell is a Blautia, a Clostridium, a Dorea, an Erysipelatoclostridium, an Eubacterium, a Lacrimispora, a Longicatena, or a Ruminococcus.24.The method of any one of claims 19-23, wherein the bacterial cell is a pathogenic bacterial cell.25.The method of any one of claims 19-24, wherein the nucleic acid moiety is an antisense oligonucleotide (ASO) targeting a gene of the bacterial cell.26.The method of any one of claims 19-25, wherein the contacting step is performed by administering a pharmaceutical composition comprising the bacterial penetrating conjugate to a subject infected with the bacterial cell.27.The method of claim 26, wherein the subject is a human patient infected by the bacterial cell.

Images