Ionizable cationic lipid compounds for delivery system and uses thereof

Abstract

The present disclosure relates to novel lipids for delivering one or more biologically active molecules to a subject. The present application also relates to a composition or a nanoparticle comprising said lipid, methods of preparing said lipid, use of said lipid and method of using said lipid.

Description

IONIZABLE CATIONIC LIPID COMPOUNDS FOR DELIVERY SYSTEM AND USES THEREOFFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present disclosure belongs to the field of drug delivery. Specifically, the present application relates to novel lipid compounds and nanoparticles comprising said lipid compounds for delivering one or more biologically active agents to a subject. Also provided are methods of preparing and using said lipid compounds and nanoparticles, as well as use of said lipid compounds and nanoparticles.

[0002] SEQUNCE LISTING

[0003] The present disclosure includes a sequence listing as a part of the disclosure.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0004] Nucleic acid-based therapeutics have enormous potential therapeutical application. These therapeutic nucleic acids include messenger RNA (mRNA) , antisense oligonucleotides, siRNA, miRNA, ribozymes, guide RNA, DNAzymes, plasmids, plasmids-based interfering nucleic acids, closed-end DNA, and aptamers. Different types of nucleic acids are currently being developed as therapeutics for the treatment of a number of diseases.

[0005] Some nucleic acids, such as mRNA, plasmids, closed-end DNA, can be used to express specific protein or enzyme, as would be useful in the treatment of, for example, single gene diseases related to deficiency or misfunction of such protein or enzyme. Nucleic acids encoding an antigen of a pathogen, including mRNA and DNA, could be used as vaccine for the prophylaxis of infectious diseases, such as COVID-19. Nucleic acids encoding one or more neoantigens could be used as tumor vaccines, which can effectively activate the body’s immune system to kill tumor cells, making individualized immunotherapy based on tumor neoantigens a new direction for the development of personalized immunotherapy for treating tumors.

[0006] Other nucleic acids can down-regulate or up-regulate intracellular levels of specific mRNA, which subsequently affect expression of specific cellular proteins. These nucleic acids, such as siRNAs and miRNAs, have extremely broad therapeutic applications. Targets may include mRNAs associated with disease-states, such as tumor suppressor, and mRNAs of infectious agents. Antisense oligonucleotide constructs have shown the ability to specifically down-regulate target proteins through degradation of the cognate mRNA. Nucleic acids such as miRNA inhibitors would be useful in the treatment of diseases related to deficiency of protein or enzyme.

[0007] Although nucleic acid-based therapeutics have enormous potential, effective delivery of these molecules to appropriate sites within a cell or organism are prerequisite to realize this potential. There are many challenges associated with the delivery of nucleic acids to achieve a desired response in a biological system. RNA molecules are susceptible to nuclease digestion in plasma and have extremely short half-life. Furthermore, nucleic acids are impermeable to cell membrane due to its unique molecular characteristics. Thus, these molecules can hardly gain access to the intracellular compartment where the relevant translation machinery resides. Therefore, nucleic acids are usually considered have no druggability in its naked form. Improvement of delivery vehicle for nucleic acid is crucial for these molecules to fulfill their therapeutic potentials.

[0008] Nanoscale delivery vehicles, including lipid and polymeric nanoparticles have been used to facilitate the cellular uptake of the nucleotides and prevent their degradation in biological environment. Lipid nanoparticles formed from ionizable cationic lipids with other lipid components, such as neutral lipids, cholesterol, PEGylated lipids, and oligonucleotides have been proved to be one of the most potent delivery systems. Cationic lipids are critical for protecting the nucleic acid cargo from degradation and facilitating intracellular delivery of the nucleic acid.

[0009] Many cationic lipids with diverse structures have been developed to enhance mRNA delivery. Several groups have reported that lipids with branched tails are beneficial for the delivery of mRNA when compared to linear lipids. At the same time, the cationic lipids should be biodegradable, well-tolerated and easily synthesized. Xu group used simple Michael addition chemistry to synthesize a library of cationic lipidoids for mRNA delivery in vitro and in vivo. These lipidoids contain degradable  bond such as ester and disulfide bond, and have shown great biocompatibility both in vitro and in vivo. There still exists unmet needs for cationic lipids that possess above-mentioned properties and can be used to prepare lipid nanoparticles for delivering therapeutic or prophylactic oligonucleotides.SUMMARY OF THE INVENTION

[0010] The present inventors have developed novel cationic lipids with branched tails with sulfi ether bond, which can form nanoparticles for the intracellular delivery of biologically active agents (e.g., mRNA, ceDNA, gRNA) both in vitro and in vivo.

[0011] In an aspect, the present disclosure provides a lipid having formula (I) , or a salt, tautomer, or stereoisomer thereof,

[0012] wherein: m and n are independently selected from any integer ranging from 3 to 12; p is selected from any integer of 1, 2 or 3, and the sum of m and p is selected from any integer ranging from 6 to 9; o is selected from any integer ranging from 1 to 6; X1 is a bond, -C (O) O-, -OC (O) -, -OC (O) O-, or a biodegradable group; R1 is a hydrogen bond donor-containing group or hydrogen bond acceptor-containing group; both of R2 are same and selected from C1-C16 alkyl, substituted C1-C16 alkyl, C2-C16 alkenyl, substituted C2-C16 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof; R3 is selected from C4-C22 alkyl, substituted C4-C22 alkyl, C4-C22 alkenyl, substituted C4-C22 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof; or R3 is bis-thioether of wherein both of R4 are same and selected from C1-C16 alkyl, substituted C1-C16 alkyl, C2-C16 alkenyl, substituted C2-C16 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof.

[0013] In some embodiments, the lipid of the first aspect has formula (II) , or a salt, tautomer, or stereoisomer thereof,

[0014] wherein the sum of n and p is selected from any integer ranging from 6 to 9.

[0015] In some embodiments, R1 is selected from hydroxyl, carboxyl, C1-C3 alkylamine, C5-C12 heteroaryl, C5-C12 heteroaryl ketone, C3-C8 heterocycloalkane, C3-C8 heterocycloalkenone, and combinations thereof with a carbonyl group, an amide group, an imide group, a sulfinyl group, a sulfonamido group, or a sulfonamide group.

[0016] In some embodiments, R1 is selected from one of the following formulas:

[0017] In some embodiments, each R2 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains; and / or R3 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains.

[0018] In some embodiments, each R2 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains; and / or each R4 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains.

[0019] In some embodiments, said carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains is the second or more distant carbon atom counting from the junction.

[0020] In some embodiments, said one or two side chains are C1-C4 alkyls.

[0021] In some embodiments, each R2, R3 and / or each R4 is independently selected from one of the following formulas:

[0022] In some embodiments, the lipid is selected from one of the following formulas:

[0023] In an aspect, the present disclosure provides a lipid nanoparticle (LNP) comprising the lipid of the present disclosure, a neutral lipid, a PEG lipid and a steroid.

[0024] In some embodiments, said neutral lipid is disteroylphosphatidylcholine (DSPC) or dioleoyl-phosphatidylethanolamine (DOPE) .

[0025] In some embodiments, said PEG lipid is PEG-DMG.

[0026] In some embodiments, said steroid is cholesterol, sitosterol or stigmasterol.

[0027] In some embodiments, said lipid is comprised with a molar ratio of about 40%to about 60%, said neutral lipid is comprised with a molar ratio of about 5%to about 20%, said PEG lipid is  comprised with a molar ratio of about 0.5%to about 5%, and said steroid is comprised with a molar ratio of about 25%to about 50%.

[0028] In some embodiments, said lipid is comprised with a molar ratio of about 50%, said neutral lipid is comprised with a molar ratio of about 10%, said PEG lipid is comprised with a molar ratio of about 1.5%, and said steroid is comprised with a molar ratio of about 38.5%.

[0029] In some embodiments, said LNP further comprises a nucleic acid molecule.

[0030] In some embodiments, said nucleic acid molecule is DNA or RNA.

[0031] In some embodiments, said nucleic acid molecule is plasmid DNA or closed-ended DNA (ceDNA) .

[0032] In some embodiments, said nucleic acid molecule is selected from a group consisting of messenger RNA (mRNA) , guide RNA (gRNA) , a short interfering RNA (siRNA) , an RNA interference (RNAi) molecule, a microRNA (miRNA) , an antagomir, an antisense RNA, a ribozyme, a small hairpin RNA (shRNA) , or a mixture thereof.

[0033] In an aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the LNP of the present disclosure, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0034] In an aspect, the present disclosure provides a method of delivering a nucleic acid molecule to a cell in vivo or in vitro, comprising contacting said cell with the LNP of the present disclosure.

[0035] In an aspect, the present disclosure provides a method of treating or preventing a disease in a subject in need thereof, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of the LNP of the present disclosure, wherein said LNP comprising a nucleic acid molecule having therapeutic activity.

[0036] In some embodiments, said LNP is administered by injection.

[0037] Additional aspects and advantages of the present disclosure will become readily apparent to those skilled in this art from the following detailed description, wherein only illustrative embodiments of the present disclosure are shown and described. As will be realized, the present disclosure is capable of other and different embodiments, and its several details are capable of modifications in  various obvious respects, all without departing from the disclosure. Accordingly, the drawings and description are to be regarded as illustrative in nature, and not as restrictive.

[0038] INCORPORATION BY REFERENCE

[0039] All publications, patents, and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication, patent, or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference.

[0040] BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWING

[0041] The novel features of the invention are set forth with particularity in the appended claims. A better understanding of the features and advantages of the present invention will be obtained by reference to the following detailed description that sets forth illustrative embodiments, in which the principles of the invention are employed, and the accompanying drawings (also “figure” and “FIG. ” herein) , of which:

[0042] FIG. 1 illustrates the expression levels in HEK293 cells of GFP mRNA delivered by lipid nanoparticles with different lipids of the present disclosure.

[0043] FIG. 2 illustrates the expression levels in HepG2 cells of GFP mRNA delivered by lipid nanoparticles with different lipids of the present disclosure.

[0044] FIG. 3 illustrates the hEPO protein expression level following administration of lipid nanoparticles with different lipids of the present disclosure to mice, tested at 6 hours and 24 hours after injection.DETAILED DESCRIPTION

[0045] While various embodiments of the invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Numerous variations, changes, and substitutions may occur to those skilled in the art without departing from the invention. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed.

[0046] I. Definition

[0047] The term “lipid nanoparticle” or its abbreviation “LNP” used herein refers to a drug carrier on the order of nanometers and composed of one layer of lipids. In the context of the present application, the term “lipid nanoparticle” also contemplates “lipid-polymer hybrid nanoparticle” which include both lipid portions and hydrophobic polymer portions.

[0048] The term “lipid” refers to a group of organic compounds that are poorly soluble in water, while soluble in nonpolar solvents. Lipids include, but are not limited to, esters of fatty acids.

[0049] The term “cationic lipid” as used herein refers to positively charged amphiphiles consisting of a hydrophilic head group connected to a hydrophobic tail via a linker. Cationic lipid is positively charged so that it can bind to negatively charged molecules or entities such as membrane.

[0050] The term “polymer conjugated lipid” refers to a molecule comprising a lipid portion and a polymer portion.

[0051] The term “PEGylated lipid” refers to a molecule comprising a lipid portion and a polyethylene glycol portion.

[0052] The term “neutral lipid” or “helper lipid” in the context of LNP is interchangeable and refers to lipids that are uncharged or stay in a neutral zwitterionic form at a selected pH.

[0053] The term “charged lipid” refers to lipids that are positively charged or negatively charged.

[0054] The term “alkyl” as used herein refers to a straight or branched hydrocarbon chain radical consisting solely of carbon and hydrogen atoms, which is saturated.

[0055] The term “alkenyl” as used herein refers to a straight or branched hydrocarbon chain radical consisting solely of carbon and hydrogen atoms, which contains one or more double bonds.

[0056] The term “stereoisomers” refer to compounds consisting of the same atoms bonded by the same bonds but having different three-dimensional structures.

[0057] The term “tautomers” refer to structural isomers in which a proton shifts from one atom of a molecule to another atom of the same molecule.

[0058] The term “nucleotide” , “oligonucleotide” and “nucleic acid” can be used interchangeable herein to refer to the base-sugar-phosphate unit consisting a nucleic acid sequence, e.g., a deoxyribonucleic acid (DNA) sequence or a ribonucleic acid (RNA) sequence.

[0059] The terms "peptide" , "polypeptide" and "protein" are used interchangeably herein to refer to a polymer of at least two amino acid residues linked by one or more peptide bonds.

[0060] The term “subject” as used herein refers to an individual, preferably a vertebrate, more preferably a non-human mammal or human. The non-human mammal can be rodents such as murines, or non-human primates such as simians. The term “subject” may also encompass cells, tissues and progenies of a biological entity obtained in vivo or culture in vitro.

[0061] The phrase “effective amount” or “therapeutically effective amount” refers to the quantity of a composition, e.g., a composition comprising the LNP that is sufficient to result in a desired activity when being delivered to a subject in need thereof. Said desired activity may encompass delaying the manifestation of a disorder, arresting or delaying the progression of a disorder, or alleviating at least one symptom of a disorder.

[0062] II. Ionizable cationic lipids

[0063] The present application provides a group of new ionizable cationic lipids, which are suitable for preparing lipid nanoparticles.

[0064] In some embodiments, the ionizable cationic lipids of the present application is a compound having formula (I) , or a salt, tautomer, or stereoisomer thereof,

[0065] wherein: m and n are independently selected from any integer ranging from 3 to 12; p is selected from any integer of 1, 2 or 3; o is selected from any integer ranging from 1 to 6; X1 is a bond, -C (O) O-, -OC (O) -, -OC (O) O-, or a biodegradable group; R1 is a hydrogen bond donor-containing group or hydrogen bond acceptor-containing group; both of R2 are same and selected from C1-C16 alkyl,  substituted C1-C16 alkyl, C2-C16 alkenyl, substituted C2-C16 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof; R3 is selected from C4-C22 alkyl, substituted C4-C22 alkyl, C4-C22 alkenyl, substituted C4-C22 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof; or R3 is bis-thioether of wherein both of R4 are same and selected from C1-C16 alkyl, substituted C1-C16 alkyl, C2-C16 alkenyl, substituted C2-C16 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof.

[0066] In some embodiments, the lipid of the first aspect is a compound having formula (II) , or a salt, tautomer, or stereoisomer thereof,

[0067] In the structure as shown by Formula (I) and Formula (II) , R1- (CH2) O-and the central nitrogen atom (N) constitutes the head group of the lipid compound of the present application. Head group of a cationic lipid is positively charged at acidic environment and is essential for the delivery of nucleic acid payloads, as it interacts with the negatively charged phosphate groups of nucleic acids. Unlike double-stranded DNA or siRNA, in which only the phosphate backbone is exposed while the nucleobases are facing inward, mRNA has a more complex secondary structure, comprising single-and double-stranded regions with some nucleosides exposed to the surrounding environment, such as the solvent. Therefore, other interactions, such as hydrogen bonding, of the head group with the riboses and nucleobases of mRNA could contribute to an improved LNP expression. In the structure as shown by Formula (I) and Formula (II) , R1 serves to provide a set of hydrogen bond donors and / or acceptors with varying hydrogen-bonding ability in the head group.

[0068] H-bond donor-or acceptor-containing groups can be those comprising nitrogen (N) , oxygen (O) , carbon (C) or fluorine (F) atoms serving as H-bond donor or H-bond acceptor. Exemplary H-bond donor-or acceptor-containing groups may include but not limited to hydroxyl-containing group,  carboxyl-containing group, carbonyl-containing group, amide, imide, sulfoxide, and sulfonamide.

[0069] In some embodiments, R1 is selected from hydroxyl, carboxyl, C1-C3 alkylamine, C5-C12 heteroaryl, C5-C12 heteroaryl ketone, C3-C8 heterocycloalkane, C3-C8 heterocycloalkenone, and combinations thereof with a carbonyl group, an amide group, an imide group, a sulfinyl group, a sulfonamido group, or a sulfonamide group.

[0070] In preferred embodiments of the present application, R1 is selected from a group consisting of following formulae:

[0071] In some embodiments, the sum of m and p is selected from any integer ranging from 6 to 9.

[0072] In some embodiments, the sum of n and p is selected from any integer ranging from 6 to 9. In specific embodiments, the sum of m and p, and the sum of n and p have same value selected from the integer of 6, 7, 8 or 9.

[0073] In preferred embodiments, p is 1, and X1 is -C (O) O-.

[0074] In some embodiments, each R2 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains; and / or R3 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains.

[0075] In some embodiments, each R2 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains; and / or each R4 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains.

[0076] In some embodiments, said carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains is the second or more distant carbon atom counting from the junction.

[0077] In some embodiments, said one or two side chains are C1-C4 alkyls.

[0078] In preferred embodiments, R2 is branched alkyl or branched alkenyl. As a hyperbranched structure may augment the cone-shaped morphology, and therefore increase intracellular delivery efficiency, it is preferred in the present application. Accordingly, both R2, R3 and R4 are preferably branched. For example, R2 and / or R3 may have one or more side chains. In specific embodiments, R2 and R3 are independently selected from 2-methylhexyl or 2, 6-dimethyloctyl.

[0079] In some embodiments, each R2, R3 and / or each R4 is independently selected from one of the following formulas:

[0080] In specific embodiments, the present disclosure provides a compound of Formula (I-I) or Formula (II-I) :

[0081] wherein each L is independently absent, C1-10 alkylenyl, or C3-7 cycloalkylenyl; each R5 and R6 are independently hydrogen, C1-C12 alkyl, substituted C1-C12 alkyl, C2-C12 alkenyl, substituted C2-C12 alkenyl, and C3-C12 cycloalkyl.

[0082] In some embodiments of any of Formula (I-I) and Formula (II-I) , each -L-C (R5) R6, is independently selected from the group consisting of:

[0083] The branched tail containing bis-alkylthio group could easily been synthesized by conjugate R2-SH or R3-SH to the alkynyl group. In specific embodiments, the intermediate structure containing bis-alkylthio group were synthesized using the following reactions:

[0084] In specific embodiments, the lipid compound is selected from any one of following Compounds as shown below, including Compounds 1-27, 41 and 42 which have a chemical structure of formula (I) , and Compounds 28-40 and 43 which have a chemical structure of formula (II) .

[0085] Included in the present invention is the free form of the cationic lipids described herein, as well as pharmaceutically acceptable salts and stereoisomers thereof. The cationic lipid can be a protonated salt of the amine cationic lipid. The term “free form” refers to the amine cationic lipids in non-salt form. The free form may be regenerated by treating the salt with a suitable dilute aqueous base solution such as dilute aqueous NaOH, potassium carbonate, ammonia and sodium bicarbonate.

[0086] The compounds of the disclosure, or their pharmaceutically acceptable salts may contain one or more stereocenters and may thus give rise to enantiomers, diastereomers, and other stereoisomeric forms that may be defined, in terms of absolute stereochemistry, as (R) -or (S) -or, as (D) -or (L) -for amino acids. The present disclosure is meant to include all such possible isomers, as well as their racemic and optically pure forms. Optically active (+) and (-) , (R) -and (D) -, or (D) -and (L) -isomers may be prepared using chiral synthons or chiral reagents, or resolved using conventional techniques, for example, chromatography and fractional crystallization. Conventional techniques for the preparation / isolation of individual enantiomers include chiral synthesis from a suitable optically pure precursor or resolution of the racemate (or the racemate of a salt or derivative) using, for example, chiral high pressure liquid chromatography (HPLC) . When the compounds described herein contain olefinic double bonds or other centers of geometric asymmetry, and unless specified otherwise, it is intended that the compounds include both E and Z geometric isomers. Likewise, all tautomeric forms are also intended to be included.

[0087] The pharmaceutically acceptable salts of the instant cationic lipids can be synthesized from the cationic lipids of this invention which contain a basic or acidic moiety by conventional chemical methods. Generally, the salts of the basic cationic lipids are prepared either by ion exchange chromatography or by reacting the free base with stoichiometric amounts or with an excess of the desired salt-forming inorganic or organic acid in a suitable solvent or various combinations of solvents.  Similarly, the salts of the acidic compounds are formed by reactions with the appropriate inorganic or organic base.

[0088] III. Other lipid components of LNP

[0089] In addition to the ionizable cationic lipid, the lipid components comprised in the LNPs of the present application comprises a neutral lipid, a polymer conjugated lipid, and a steroid. In another embodiment, the lipid components further comprise a charged lipid.

[0090] Neutral lipid

[0091] The neutral lipid such as a phospholipid helps the LNP to bind to and cross the cell membrane. Exemplary neutral lipids include, but are not limited to, distearoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine, distearoylphosphatidylcholine (DSPC) , dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) , dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) , dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) , dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) , dioleoyl-phosphatidylethanolamine (DOPE) , palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC) , palmitoyloleoylphosphatidylethanolamine (POPE) , dioleoyl-phosphatidylethanolamine 4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate (DOPE-mal) , dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine (DPPE) , dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE) , di stearoyl-phosphatidyl-ethanolamine (DSPE) , monomethyl-phosphatidylethanolamine (such as 16-O-monomethyl PE) , dimethyl-phosphatidylethanolamine (such as 16-0-dimethyl PE) , 18-1-trans PE, 1-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidyethanolamine (SOPE) , hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC) , egg phosphatidylcholine (EPC) , dioleoylphosphatidylserine (DOPS) , sphingomyelin (SM) , dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) , dimyristoyl phosphatidylglycerol (DMPG) , di stearoylphosphatidylglycerol (DSPG) , dierucoylphosphatidylcholine (DEPC) , palmitoyloleyolphosphatidylglycerol (POPG) , dielaidoyl-phosphatidylethanolamine (DEPE) , lecithin, phosphatidylethanolamine, lysolecithin, lysophosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, sphingomyelin, egg sphingomyelin (ESM) , cephalin, cardiolipin, phosphatidicacid, cerebrosides, dicetylphosphate, lysophosphatidylcholine, dilinoleoylphosphatidylcholine, or mixtures thereof. It is understood that other diacylphosphatidylcholine and diacylphosphatidylethanolamine phospholipids can also be used. The acyl groups in these lipids are preferably acyl groups derived from fatty acids having C10-C24 carbon chains, e.g., lauroyl, myristoyl, palmitoyl, stearoyl, or oleoyl. In various embodiments, the molar ratio of the ionizable cationic lipid to the neutral lipid ranges from about 2: 1 to about 8: 1, preferably 5: 1.

[0092] Polymer conjugated lipid

[0093] The polymer conjugated lipid can be a PEGylated lipid or PEG lipid. In various embodiments, the PEG lipid is a pegylated diacylglycerol (PEG-DAG) such as 1- (monomethoxy- polyethyleneglycol) -2, 3-dimyristoylglycerol (PEG-DMG) , a pegylated phosphatidylethanoloamine (PEG-PE) , a PEG succinate diacylglycerol (PEG-S-DAG) such as 4-O- (2′, 3′-di (tetradecanoyloxy) propyl-1-O- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) butanedioate (PEG-S-DMG) , a pegylated ceramide (PEG-cer) , or a PEG dialkoxypropylcarbamate such as ω-methoxy (polyethoxy) ethyl-N- (2, 3-di (tetradecanoxy) propyl) carbamate or 2, 3-di (tetradecanoxy) propyl-N- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) carbamate. In various embodiments, the molar ratio of the ionizable cationic lipid to the pegylated lipid ranges from about 100: 1 to about 20: 1.

[0094] Steroid

[0095] The steroid or steroid analogue. In certain embodiments, the steroid or steroid analogue is cholesterol, sitosterol or stigmasterol. In certain embodiments, the steroid or steroid analogue is cholesterol. In certain embodiments, the steroid or steroid analogue is beta-Sitosterol. In certain embodiments, the steroid or steroid analogue is Stigmastanol. In some of these embodiments, the molar ratio of the ionizable cationic lipid to cholesterol ranges from about 5: 1 to 1: 1, preferably 3: 1 to 1: 1.

[0096] In preferred embodiments, the nanoparticle of the present disclosure comprises the following in a mole ratio of 50: 10: 38.5: 1.5 or 40: 10: 48.5: 1.5: (1) the cationic lipid of the present disclosure, preferable selected from Compound 15-22 and 31-35; (2) a neutral lipid selected from DSPC or DOPE; (3) a steroid which is cholesterol; and (4) polymer conjugated lipid which is PEG-DMG.

[0097] IV. Nucleic acid payload

[0098] The LNPs of the present application are particularly suitable for delivering nucleic acid molecules into cells.

[0099] The nucleic acid molecule can be either DNA or RNA or a mixture thereof, such as chimeric oligonucleotides. The nucleic acid molecule can comprise naturally occurring or modified polynucleotides. The nucleic acid molecule can be a coding sequence or non-coding sequence. The nucleic acid molecule can be DNA molecule such as plasmid DNA, closed-ended DNA or a mixture thereof. The nucleic acid molecule can be RNA molecule such as messenger RNA (mRNA) , guide RNA (gRNA) , a short interfering RNA (siRNA) , an RNA interference (RNAi) molecule, a microRNA (miRNA) , an antagomir, an antisense RNA, a ribozyme, a small hairpin RNA (shRNA) , or a mixture thereof.

[0100] Plasmid DNA or closed-ended DNA may have a lengths at a range of 500 to 500,000 base pairs. mRNA may have a length at a range of 200 to 100,000 base pairs. gRNA may have a length at a range of 30 to 1,000 base pairs. siRNAi, miRNA, or shRNA may have a length at a range of 15 to 1,000 base pairs.

[0101] The nucleic acid molecules can comprise modifications, such as one or more modifications to the backbone, one or more modifications to the base and / or one or more modifications to the sugar moiety.

[0102] V. Compound Synthesis

[0103] Compounds of the present disclosure can be prepared in a variety of ways using commercially available starting materials, compounds known in the literature, or from readily prepared intermediates, by employing standard synthetic methods and procedures either known to those skilled in the art, or which will be apparent to the skilled artisan in light of the teachings herein. Standard synthetic methods and procedures for the preparation of organic molecules and functional group transformations and manipulations can be obtained from the relevant scientific literature or from standard textbooks in the field.

[0104] General reaction scheme

[0105] The following descriptions of synthetic methods are designed to illustrate, but not to limit, general procedures for the preparation of compounds of the present disclosure. The compounds of this disclosure having a structure of Formula (I) may be prepared via step 1～4 according to the procedures illustrated in Scheme 1. The compounds of this disclosure having a structure of Formula (II) may be prepared via step 1～3 according to the procedures illustrated in Scheme 1. One of ordinary skill in the art will note that, during the reaction sequences and synthetic schemes described herein, the order of certain steps may be changed, such as the introduction and removal of protecting groups.

[0106] X is a reactive moiety selected to facilitate the desired reaction (e.g., halo) . Condensation reaction of A-1 and A-2 under appropriate conditions (e.g., using EDCI and DMAP) yields the product A-3. A-3 reacts with mercapto A-4 under suitable conditions (e.g., AIBN, dioxane and heat) to afford A-5. Halide A-5 is then reacted with primary amine of A-6 under suitable conditions (e.g. heat) to yield a compound of Formula (II) or A-7. A-7 is then reacted with another halide A-5 using appropriate conditions (e.g., DIEA and heat) to yield a compound of Formula (I) .

[0107] VI. Preparation of Nanoparticles

[0108] Nanoparticles can be made with mixing processes such as microfluidics and T-tube mixing of two fluid streams, one of which contains the therapeutic and / or prophylactic and the other has the lipid components.

[0109] Lipid compositions are prepared by combining a cationic lipid, such as lipid according to formula (I) , helper lipids (such as DSPC) , a steroid (such as cholesterol) , and a PEG lipid (such as 1, 2- dimyristoyl-sn-glycerol methoxypolyethylene glycol, also known as DMG-PEG2000) at concentrations of about 5 mg / mL and 25 mg / mL in ethanol. Solutions should be refrigerated for storage at, for example, -80 ℃.

[0110] Nanoparticles compositions including a therapeutic and / or prophylactic and a lipid component are prepared by combining the lipid solution with a solution including the therapeutic and / or prophylactic at lipid component to therapeutic and / or prophylactic wt: wt ratios between about 10:1about 20: 1. The lipid solution is injected using a microfluidic based system at flow rates between 0.25 mL / min and 2.0 mL / min into the therapeutic and / or prophylactic solution to produce a suspension with a water to ethanol ratio between about 3: 1.

[0111] For nanoparticle compositions including RNA or pDNA, solutions of the RNA or pDNA are diluted with 50 mM sodium citrate buffer at a pH between 3 and 4 to form a stock solution at concentrations of 0.1-0.5 mg / mL.

[0112] Nanoparticle compositions can be processed by dialysis to remove ethanol and achieve buffer exchange. Formulations were dialyzed twice against Tris-HCl Solution (20 mM, pH 7.4) at volumes about 2500 times that of the primary product using Slide-A-Lyzer cassettes (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, Ill. ) with a molecular weight cutoff of 10 KD at 0-4 ℃ for 2 h. Then 40%sucrose solution was added, the final nanoparticle composition solution of 0.03 mg / mL to and 0.1 mg / mL (mRNA or pDNA) are generally obtained and stored at -80 ℃.

[0113] VII. Characteristics of Nanoparticle Compositions

[0114] The physical and chemical properties of the lipid nanoparticle of the present application depend on the formulation of the LNPs.

[0115] For example, it has been found by the present inventors that the choice of the ionizable cationic lipid dramatically influences the size of the formulated LNPs. For example, the lipid nanoparticles have a mean diameter of from about 100 nm to about 350 nm, preferably 150 nm to 250 nm. In specific embodiments, the lipid nanoparticles have a mean diameter of about 100 nm, 110 nm, 120 nm, 130 nm, 140 nm, 150 nm, 160 nm, 170 nm, 180 nm, 190 nm, 200 nm, 210 nm, 220 nm, 230 nm, 240 nm, 250 nm, 260 nm, 270 nm, 280 nm, 290 nm or 300 nm.

[0116] Polydispersity index (PDI) is a parameter describing the distribution of molecular weight of the particles in an LNP formulation. A lager PDI describes a broader distribution of molecular weight. For example, the PDI of the formulation can be 0.10 to 0.50, preferably 0.20 to 0.45, more preferably 0.05 to 0.30.

[0117] In some embodiments, the lipid nanoparticles are substantially non-toxic or having acceptable toxicity to the subject. For example, the lipid nanoparticles of the present application have a reduced liver toxicity as compared to nanoparticles comprising a different cationic lipid. The liver toxicity can be measured based known method in the art.

[0118] The lipid nanoparticle of the present disclosure can provide desirable transduction efficiency, which can be measured by e.g. the amount or expression level of the payload. In preferred embodiments, the lipid nanoparticles of the present application provide a comparable or increased amount of payload or expression of payload as compared to a nanoparticle comprising a different cationic lipid.

[0119] VIII. Uses

[0120] The LNP formed by the ionizable cationic lipid and loaded with nucleic acid molecules may have diverse uses, depending on the type and function of the nucleic acid molecules.

[0121] For example, the LNPs can be used for treating a disease or disorder. In some embodiments, the disease or disorder is caused by insufficiency of a protein, and the LNP comprises nucleic acid molecule encoding for the protein.

[0122] For example, the LNPs can be used for preventing a disease or disorder. For example, the LNPs can be formed as a vaccine, in which the nucleic acid molecule encodes for an antigen, such as an antigen derived from a pathogen, e.g. a bacterium, a fungi, or a virus, or an antigen derived from tumor cell, e.g. tumor associated antigen.

[0123] For example, the LNPs can be used for treating a disease or disorder by affecting expression of specific cellular proteins. In some embodiments, the LNPs comprise nucleic acids, such as siRNAs and miRNAs, which down-regulate or up-regulate intracellular levels of target mRNA associated with a disease state. For example, the target mRNA can be the mRNA of a tumor suppressor or mRNAs of infectious agents.

[0124] For example, the LNPs can be used for treating a disease or disorder by affecting expression of specific cellular proteins via genome editing. In some embodiments, to treat a disease or disorder caused by or related to a certain mutation, which for example causes loss-of-function or gain-of-toxicity of a protein, the LNPs may comprise nucleic acid molecule encoding for genome editing tool. For example, the LNPs can be used to deliver mRNA of a nuclease, e.g. Cas nuclease, and / or a guide RNA, so as to conduct nuclease-mediated gene editing.

[0125] Examples

[0126] The following examples are set forth so as to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present invention, and are not intended to limit the scope of what the inventors regard as their invention nor are they intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (e.g. amounts, temperature, etc. ) but some experimental errors and deviations should be accounted for. Unless indicated otherwise, parts are parts by weight, molecular weight is weight average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is at or near atmospheric. Standard abbreviations may be used, e.g., bp, base pair (s) ; kb, kilobase (s) ; pl, picoliter (s) ; s or sec, second (s) ; min, minute (s) ; h or hr, hour (s) ; aa, amino acid (s) ; nt, nucleotide (s) ; i.m., intramuscular (ly) ; i. p., intraperitoneal (ly) ; s. c., subcutaneous (ly) ; and the like.

[0127] Example 1. Synthesis of Compounds

[0128] 1. General Considerations

[0129] All solvents and reagents used were obtained commercially and used as such unless noted otherwise. 1H NMR spectra were recorded in CDCl3, at 400 MHz instrument. Chemical shifts are reported as parts per million (ppm) relative to TMS (0.00) for 1H.

[0130] The procedures described below are useful in the synthesis of Compounds 1-43.

[0131] The following abbreviations are employed herein.

[0132] ACN: Acetonitrile

[0133] LAH: Lithium Aluminum Hydride

[0134] DCM: Dichloromethane

[0135] DMAP: 4-Dimethylaminopyridine

[0136] DIEA: Diisopropylethylamine

[0137] EDCI: 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide

[0138] PPTS: Pyridinium p-toluenesulfonate

[0139] RT: Room Temperature

[0140] THF: Tetrahydrofuran

[0141] TLC: Thin-layer chromatography

[0142] 2. Synthesis of exemplary compounds

[0143] Compound 1: 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) hexanoate

[0144] Synthesis of prop-2-yn-1-yl 6-bromohexanoate

[0145] To a solution of compound 6-bromohexanoic acid (20 g, 103 mmol, 1.0 eq) in DCM (140 mL) was added prop-2-yn-1-ol (8.12 g, 145 mmol, 8.56 mL, 1.41 eq) , EDCI (29.5 g, 154 mmol, 1.5 eq) and DMAP (2.51 g, 20.5 mmol, 0.2 eq) at 0 ℃, then the mixture was stirred at 25 ℃ for 1.5 hrs. TLC (Petroleum ether / Ethyl acetate = 5 / 1, product Rf = 0.45) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 100 / 1 to 0 / 1) to give prop-2-yn-1-yl 6-bromohexanoate (21 g, 80.4 mmol, 78.4%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.68 (d, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.41 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.47 (t, J = 2.4 Hz, 1H) , 2.38 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.87-1.90 (m, 2H) , 1.67-1.71 (m, 2H) , 1.47-1.51 (m, 2H) .

[0146] Synthesis of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6-bromohexanoate

[0147] To a solution of prop-2-yn-1-yl 6-bromohexanoate (10.5 g, 45.0 mmol, 1.0 eq) in dioxane (70 mL) was added heptane-1-thiol (17.9 g, 135 mmol, 21.2 mL, 3.0 eq) , then the solution was stirred at 25-100 ℃ for 1 hr, AIBN (740 mg, 4.50 mmol, 0.1 eq) was added the mixture and stirred at 100 ℃ for 12 hrs. TLC (Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1, product Rf = 0.35) showed the reaction was completed. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 1 / 0 to 50 / 1) to give 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6-bromohexanoate (20 g, 40.1 mmol, 89.2%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 5.2, 11.6 Hz, 1H) , 4.25 (dd, J = 6.0, 11.2 Hz, 1H) , 3.41 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.97-3.04 (m, 1H) , 2.78 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.54-2.61 (m, 4H) , 2.37 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.86-1.93 (m, 2H) , 1.50-1.72 (m, 9H) , 1.25-1.40 (m, 17H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 6H) .

[0148] Synthesis of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0149] To a solution of 2-aminoethan-1-ol (1.84 g, 30.2 mmol, 1.82 mL, 3.0 eq) and 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6-bromohexanoate (5 g, 10.1 mmol, 1.0 eq) in MeCN (35 mL) at 25 ℃, then the mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 7 / 1, product Rf = 0.20) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine (20 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to Dichloromethane / Methanol = 5 / 1) to give 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (2.6 g, 5.44 mmol, 54.1%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 5.2, 11.6 Hz, 2H) , 4.25 (dd, J = 5.2, 11.6 Hz, 2H) , 3.52 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.97-3.03 (m, 2H) , 2.78 (d, J = 6.8 Hz, 4H) , 2.54-2.62 (m, 10H) , 2.45 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 2.34 (t, J =7.2 Hz, 4H) , 1.56-1.69 (m, 13H) , 1.28-1.46 (m, 41H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 12H) .

[0150] Synthesis of undecyl 6-bromohexanoate

[0151] To a solution of undecan-1-ol (30.0 g, 174 mmol, 1.0 eq) and 6-bromohexanoic acid (50.9 g, 261 mmol, 1.5 eq) in DCM (180 mL) was added DMAP (4.25 g, 34.8 mmol, 0.2 eq) and EDCI (50.1 g, 261 mmol, 1.5 eq) . The reaction was stirred at 20℃ for 3 h. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate=10: 1, Rf=0.51) indicated the undecan-1-ol was consumed completely. The residue was diluted  with saturated sodium carbonate solution (100 mL) and extracted with EtOAc (200 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (50.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=70 / 1 to 50 / 1) . The product of et49878-110 was combined to et49878-118. Undecyl 6-bromohexanoate (61.0 g, 175 mmol, 85.9%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.07 (t, J = 6.4 Hz, 2 H) , 3.41 (t, J = 6.4 Hz, 2 H) , 2.32 (t, J =7.6 Hz, 2 H) , 1.86 -1.90 (m, 2 H) 1.60 -1.68 (m, 4 H) , 1.44 -1.50 (m, 2 H) , 1.29 -1.31 (m, 5 H) , 1.27 -1.31 (s, 10 H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3 H) .

[0152] Synthesis of Compound 1

[0153] To solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (1 g, 2.09 mmol, 1.0 eq) and undecyl 6-bromohexanoate (877 mg, 2.51 mmol, 1.2 eq) in EtOH (7 mL) was added DIEA (541 mg, 4.19 mmol, 729 uL, 2.0 eq) at 25 ℃, then the mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 10 / 1, product Rf = 0.40) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to THF / EtOH = 5 / 1) to give Compound 1 (770 mg, 1.03 mmol, 49.3%yield) as a yellow oil. 1HNMR (400 MHz CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 5.2, 11.6 Hz, 1H) , 4.25 (dd, J = 6.4, 11.2 Hz, 1H) , 4.06 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.53 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 2.97-3.03 (m, 1H) , 2.78 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.54-2.62 (m, 6H) , 2.46 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 2.29-2.36 (m, 4H) , 1.56-1.69 (m, 11H) , 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 9H) .

[0154] Compound 2: nonyl 8- ( (6- (2, 3-bis (heptylthio) propoxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0155] Synthesis of nonyl 8-bromooctanoate

[0156] To a solution nonan-1-ol (5 g, 34.7 mmol, 1.0 eq) in DCM (35 mL) was added 8-bromooctanoic  acid (9.28 g, 41.6 mmol, 1.2 eq) , EDCI (9.97 g, 52.0 mmol, 1.5 eq) and DMAP (847 mg, 6.93 mmol, 0.2 eq) at 0 ℃, then the mixture was stirred at 25 ℃ for 4 hrs. TLC (Petroleum ether / Ethyl acetate =5 / 1, product Rf = 0.60) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 1 / 0 to 20 / 1) to give nonyl 8-bromooctanoate (11 g, 31.4 mmol, 90.8%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.41 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.83-1.90 (m, 2H) , 1.59-1.67 (m, 4H) , 1.25-1.46 (m, 19H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 3H) .

[0157] Synthesis of Compound 2

[0158] To solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (1 g, 2.09 mmol, 1.0 eq) and nonyl 8-bromooctanoate (877 mg, 2.51 mmol, 43.0 uL, 1.2 eq) in EtOH (7 mL) was added DIEA (541 mg, 4.19 mmol, 729 uL, 2.0 eq) at 25 ℃, then the mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 10 / 1, product Rf = 0.40) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , the combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to THF / EtOH = 5 / 1) to give Compound 2 (700 mg, 938 umol, 44.8%yield) as a yellow oil. 1HNMR (400 MHz CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 4.8, 11.2 Hz, 1H) , 4.25 (dd, J = 6.4, 11.6 Hz, 1H) , 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.53 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.97-3.03 (m, 1H) , 2.78 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.54-2.62 (m, 6H) , 2.43-2.48 (m, 4H) , 2.27-2.36 (m, 4H) , 1.55-1.69 (m, 11H) , 1.28-1.51 (m, 41H) , 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 9H) .

[0159] Compound 3: 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (3-hydroxypropyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) hexanoate

[0160] Synthesis of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (3-hydroxypropyl) amino) hexanoate

[0161] To a solution of 3-aminopropan-1-ol (3.14 g, 41.8 mmol, 3.22 mL, 8.0 eq) and 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6-bromohexanoate (2.6 g, 5.22 mmol, 1.0 eq) in EtOH (10 mL) and MeCN (10 mL) at 25 ℃, then the mixture was stirred at 60 ℃ for 4 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 7 / 1, product Rf = 0.20) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (30 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine (20 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate =10 / 1 to DCM / MeOH = 5 / 1) to give 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (3-hydroxypropyl) amino) hexanoate (1.8 g, 3.66 mmol, 70.0%yield) as a yellow oil.

[0162] Synthesis of Compound 3

[0163] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (3-hydroxypropyl) amino) hexanoate (1.8 g, 3.66 mmol, 1.0 eq) and undecyl 6-bromohexanoate (1.28 g, 3.66 mmol, 1.0 eq) in MeCN (10 mL) and EtOH (10 mL) at 25 ℃, then DIEA (946 mg, 7.32 mmol, 1.27 mL, 2.0 eq) was added the mixture and stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 10 / 1, product Rf = 0.40) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (20 mL) and extracted with EtOAc (20 mL, 10 mL, 5 mL) , The combined organic layers were washed with brine (5 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to EtOAc / MeOH = 5 / 1) to give compound 3 (1.4 g, 1.84 mmol, 50.3%yield) as a yellow oil.

[0164] Compound 4: 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (3- (dimethylamino) propyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) hexanoate

[0165] Synthesis of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (3-chloropropyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) hexanoate

[0166] To a solution of compound 3 (1.4 g, 1.84 mmol, 1.0 eq) in DCM (15 mL) was added TEA (745 mg, 7.37 mmol, 1.03 mL, 4.0 eq) at 0℃, then TosCl (702 mg, 3.68 mmol, 2.0 eq) was added the reaction solution at 0 ℃, the mixture was stirred at 25 ℃ for 12 hrs. LCMS (ET50202-318-P1B, product: RT = 1.236 min) showed the starting material was consumed completely. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with DCM (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (3-chloropropyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) hexanoate (1.9 g, crude) as a colorless oil.

[0167] Synthesis of Compound 4

[0168] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (3-chloropropyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) hexanoate (1.0 g, 1.28 mmol, 1.0 eq) and NaI (96.2 mg, 642 umol, 0.5 eq) in THF (15 mL) was added N-methylmethanamine (2 M, 3.21 mL, 5 eq) at 25 ℃, then the mixture was stirred 75 ℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 5 / 1) showed a trace amount of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (3-chloropropyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) hexanoate (Rf =0.65) remained and a main spot (desired Rf = 0.19) was formed. The reaction mixture concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to THF / MeOH = 5 / 1) to give Compound 4 (280 mg, 355 umol, 27.6%yield) as a brown oil. 1HNMR (400 MHz CDCl3) δ 4.34 (dd, J = 5.2, 11.2 Hz, 1H) , 4.25 (dd, J = 6.4, 11.2 Hz, 1H) , 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.10 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.98-3.04 (m, 3H) , 2.92 (t, J =8.0 Hz, 4H) , 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.66 (s, 5H) , 2.54-2.62 (m, 4H) , 2.24-2.41 (m, 6H) , 1.55-1.78 (m, 15H) , 1.26-1.44 (m, 38H) , 0.87-0.90 (m, 9H) .

[0169] Compound 5: nonyl 8- ( (6- (2, 3-bis (octylthio) propoxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0170] Synthesis of 2, 3-bis (octylthio) propyl 6-bromohexanoate

[0171] To a solution of prop-2-yn-1-yl 6-bromohexanoate (10.5 g, 45.0 mmol, 1.0 eq) in dioxane (70 mL) was added octane-1-thiol (20.6 g, 141 mmol, 24.5 mL, 3.13 eq) , then the solution was stirred at 25-100 ℃ for 1 hr, AIBN (740 mg, 4.50 mmol, 0.1 eq) was added the mixture and stirred at 100 ℃for 12 hrs. TLC (Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1, desired Rf = 0.35) showed the reaction was completed. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 1 / 0 to 50 / 1) to give 2, 3-bis (octylthio) propyl 6-bromohexanoate (20.5 g, 39.0 mmol, 86.5%yield) as a yellow oil. 1HNMR (400 MHz CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 5.2, 11.2 Hz, 1H) , 4.25 (dd, J = 6.4, 11.6 Hz, 1H) , 3.42 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.97-3.03 (m, 1H) , 2.78 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.54-2.62 (m, 4H) , 2.36 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.85-1.93 (m, 2H) , 1.46-1.72 (m, 9H) , 1.25-1.40 (m, 21H) , 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0172] Synthesis of 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0173] To a solution of 2-aminoethan-1-ol (1.74 g, 28.5 mmol, 1.73 mL, 3.0 eq) and 2, 3-bis (octylthio) propyl 6-bromohexanoate (5.0 g, 9.51 mmol, 1.0 eq) in MeCN (35 mL) at 25 ℃, then the mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 7 / 1, desired Rf = 0.20) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine (20 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to Dichloromethane / Methanol = 5 / 1) to give 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (2.6 g, 5.14 mmol, 54.0%yield) as a yellow oil. 1HNMR (400 MHz CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 5.2, 11.2 Hz, 1H) , 4.25 (dd, J = 6.4, 11.6 Hz, 1H) , 3.68 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.97-3.03 (m, 1H) , 2.68 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.53-2.62 (m, 6H) , 2.35 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.53-1.70 (m, 8H) , 1.29-1.44 (m, 23H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 6H) .

[0174] Synthesis of Compound 5

[0175] To solution of 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (1.0 g, 1.98 mmol, 1.0 eq) and nonyl 8-bromooctanoate (829 mg, 2.37 mmol, 43.0 uL, 1.2 eq) in EtOH (5 mL) was added DIEA (511 mg, 3.95 mmol, 689 uL, 2.0 eq) at 25 ℃, then the mixture was stirred at 90 ℃for 12 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 10 / 1, product Rf = 0.40) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to THF / EtOH = 5 / 1) . Compound 5 (570 mg, 736 umol, 37.2%yield) as a yellow oil. 1HNMR (400 MHz CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 5.2, 11.2 Hz, 1H) , 4.25 (dd, J = 6.4, 11.6 Hz, 1H) , 3.53 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.78 (d, J = 6.8Hz, 2H) , 2.54-2.62 (m, 6H) , 2.43-2.48 (m, 4H) , 2.28-2.36 (m, 4H) , 1.56-1.69 (m, 11H) , 1.28-1.47 (m, 46H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 9H) .

[0176] Compound 6: 2- ( (6- (2, 3-bis (octylthio) propoxy) -6-oxohexyl) (3- (dimethylamino) propyl) amino) ethyl (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dienoate

[0177] Synthesis of 2- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) acetaldehyde

[0178] To a solution of 2- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) ethan-1-ol (10.0 g, 56.7 mmol, 1.00 eq) in ACN (160 mL) was added IBX (23.8 g, 85.0 mmol, 1.50 eq) . The mixture was stirred at 85 ℃for 5 hrs. TLC (Petroleum ether : Ethyl acetate = 3: 1, Product Rf = 0.6) indicated Reactant 1 was consumed completely and one new spot formed. The reaction was clean according to TLC. The reaction mixture was filtered, the filtrate was concentrated under reduced pressure to give 2- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) acetaldehyde (5.00 g, 28.6 mmol, 50.5%yield) as a yellow oil.

[0179] Synthesis of 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- ( (3- (dimethylamino) propyl) amino) hexanoate

[0180] To a solution of 2, 3-bis (octylthio) propyl 6-bromohexanoate (5 g, 9.51 mmol, 1.0 eq) and N1, N1-dimethylpropane-1, 3-diamine (4.86 g, 47.6 mmol, 5.95 mL, 5.0 eq) in MeCN (35 mL) at 25 ℃, then the mixture was stirred at 90 ℃ for 40 mins. TLC (Dichloromethane / Methanol = 7 / 1, product Rf = 0.20) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine (20 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to Dichloromethane / Methanol = 5 / 1) to give 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- ( (3- (dimethylamino) propyl) amino) hexanoate (1.7 g, 3.11 mmol, 32.6%yield) as a yellow oil. 1HNMR (400 MHz CDCl3) δ 4.34 (dd, J = 5.2, 11.2 Hz, 1H) , 4.25 (dd, J = 6.4, 11.2 Hz, 1H) , 2.96-3.03 (m, 3H) , 2.78-2.84 (m, 4H) , 2.53-2.62 (m, 6H) , 2.33-2.38 (m, 8H) , 1.91-1.96 (m, 2H) , 1.55-1.76 (m, 8H) , 1.28-1.44 (m, 23H) , 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0181] Synthesis of 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- ( (3- (dimethylamino) propyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0182] To a solution of 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- ( (3- (dimethylamino) propyl) amino) hexanoate (0.5 g, 914 umol, 1.0 eq) and 2- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) acetaldehyde (191 mg, 1.10 mmol, 209 uL, 1.2 eq) in DCM (5 mL) at 0 ℃, the mixture was stirred 10 mins, NaBH (OAc) 3 (387 mg, 1.83 mmol, 2.0 eq) was added the mixture at stirred at 25 ℃ for 5 hrs. LCMS (ET50202-178-P1A, product: RT =0.758 min) showed the starting material was consumed completely. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- ( (2- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) ethyl) (3-  (dimethylamino) propyl) amino) hexanoate (0.67 g, crude) as a colorless oil. 1HNMR (400 MHz CDCl3) δ 4.33 (dd, J = 5.2, 11.2 Hz, 1H) , 4.25 (dd, J = 6.4, 11.2 Hz, 1H) , 4.05 (t, J = 4.4 Hz, 2H) , 3.18-3.27 (m, 6H) , 3.10-3.14 (m, 2H) , 2.96-3.02 (m, 1H) , 2.83 (s, 6H) , 2.77 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.53-2.61 (m, 4H) , 2.43-2.50 (m, 2H) , 2.35 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.07 (s, 3H) , 1.79-1.87 (m, 2H) , 1.64-1.72 (m, 2H) , 1.55-1.62 (m, 5H) , 1.24-1.43 (m, 27H) , 0.86-0.91 (m, 18H) , 0.10 (s, 6H) .

[0183] To a solution of 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- ( (2- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) ethyl) (3- (dimethylamino) propyl) amino) hexanoate (0.67 g, 950 umol, 1.0 eq) in TBAF (13 mL) at 25 ℃ the mixture was stirred at 25 ℃ for 12 hrs. LCMS (ET50202-182-P1A, product: RT = 0.673 min) showed the starting material was consumed completely. The reaction mixture was poured into water (10 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give 2, 3-bis(octylthio) propyl 6- ( (3- (dimethylamino) propyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (1.34 g, 680 umol, 71.6%yield, 30%purity) as a colorless oil.

[0184] Synthesis of Compound 6

[0185] To a solution of 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- ( (3- (dimethylamino) propyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (1.34 g, 680 umol, 30%purity, 1.0 eq) in DCM (5 mL) was added (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dienoic acid (286 mg, 1.02 mmol, 286 uL, 1.5 eq) , EDCI (196 mg, 1.02 mmol, 1.5 eq) and DMAP (16.6 mg, 136 umol, 0.2 eq) at 0 ℃, then the mixture was stirred at 25 ℃ for 1.5 hrs. TLC (Dichloromethane  / Methanol = 5 / 1, product Rf = 0.05) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (10 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to Dichloromethane / Methanol = 10 / 1) to give Compound 6 (120 mg, 140 umol, 20.6%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ2.30-5.42 (m, 3H) , 4.32-4.38 (m, 1H) , 4.22-4.27 (m, 1H) , 4.11 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 3.31-3.34 (m, 1H) , 3.00-3.03 (m, 1H) , 2.76-2.80 (m, 3H) , 2.68 (t, J = 6.4 Hz, 1H) , 2.44-2.62 (m, 7H) , 2.26-2.35 (m, 7H) , 2.03-2.08 (m, 4H) , 1.53-1.68 (m, 8H) , 1.28-1.46 (m, 35H) , 0.87-0.90 (m, 9H) .

[0186] Compound 7: 2- ( (6- (2, 3-bis (octylthio) propoxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) ethyl  (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dienoate2- ( (6- (2, 3-bis (octylthio) propoxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) ethyl (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dienoate

[0187] Synthesis of 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- (bis (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0188] To solution of 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (1 g, 1.98 mmol, 1.0 eq) and 2-bromoethanol (371 mg, 2.97 mmol, 211 uL, 1.5 eq) in MeCN (10 mL) was added K2CO3 (410 mg, 2.97 mmol, 1.5 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 12 hrs. LCMS (ET50202-192-P1A, product: RT = 0.687 min) showed the starting material was consumed completed. The reaction mixture was poured into water (10 mL) and extracted with EtOAc (10 mL, 5 mL, 3 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- (bis (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (1 g, crude) as a yellow oil.

[0189] Synthesis of Compound 7

[0190] To solution of 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- (bis (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (0.9 g, 1.64 mmol, 1.0 eq) and (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dienoic acid (459 mg, 1.64 mmol, 459 uL, 1.0 eq) in DCM (8 mL) was added DMAP (40.0 mg, 327 umol, 0.2 eq) and EDCI (471 mg, 2.45 mmol, 1.5 eq) at 0℃, then the mixture was stirred at 25℃ for 3 hrs. LCMS (ET50202-205-P1A1, product RT = 2.437) showed the starting material was completed. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by prep-HPLC (column: Welch Xtimate C1 100 x 30 mm x 5 um; mobile phase: [water (TFA) -ACN] ; B%: 65%-95%, 8 min) to give Compound 7 (250 mg) as a colorless oil. The pH value of the reaction was adjusted to around 8-9 with aq. Na2CO3 at 0 ℃. The mixture was extracted with EtOAc (5 mL x 4) and the combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give Compound 7 (145 mg, 178 umol,  10.9%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 5.30-5.42 (m, 4H) , 4.36 (dd, J = 5.2, 11.2 Hz, 1H) , 4.25 (dd, J = 6.4, 11.6 Hz, 1H) , 4.14 (t, J = 6.0 Hz, 2H) , 3.54 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.97-3.03 (m, 1H) , 2.76-2.97 (m, 6H) , 2.52-2.66 (m, 8H) , 2.29-2.36 (m, 4H) , 2.03-2.08 (m, 4H) , 1.55-1.67 (m, 9H) , 1.28-1.50 (m, 39H) , 0.87-0.91 (m, 9H) .

[0191] Compound 8: 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) ( (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-yl) amino) heptanoate

[0192] Synthesis of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7-bromoheptanoate

[0193] To a solution of 7-bromoheptanoic acid (15.0 g, 71.7 mmol, 3.40 mL, 1.0 eq) and prop-2-yn-1-ol (4.77 g, 85.1 mmol, 5.03 mL, 1.19 eq) in DCM (90.0 mL) was added EDCI (20.6 g, 108 mmol, 1.5 eq) and DMAP (1.75 g, 14.4 mmol, 0.2 eq) at 0 ℃. The reaction was stirred at 20 ℃ for 3 h. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate=10: 1, Rf=0.50) indicated the 7-bromoheptanoic acid was consumed completely. The residue was diluted with water (100 mL) and extracted with EtOAc (100 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (50.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=60 / 1 to 50 / 1) . Prop-2-yn-1-yl 7-bromoheptanoate (28.0 g, 113 mmol, 79.0%yield) was obtained as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.68 (d, J = 2.4 Hz, 2 H) , 3.40 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 2.47 (t, J = 2.8 Hz, 1 H) , 2.37 (t, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.04 (s, 1 H) , 1.83 -1.90 (m, 2 H) , 1.63 -1.70 (m, 2 H) , 1.34 -1.50 (m, 4 H) .

[0194] To a solution of prop-2-yn-1-yl 7-bromoheptanoate (15.0 g, 60.7 mmol, 1.0 eq) in dioxane (90.0 mL) was added heptane-1-thiol (24.1 g, 182 mmol, 28.5 mL, 3.0 eq) , then the solution was stirred at 25-100 ℃ for 1 hr, AIBN (1.99 g, 12.1 mmol, 0.2 eq) was added the mixture and stirred at 100 ℃for 12 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate=10: 1, start material: Rf=0.51; product: Rf= 0.57) indicated the prop-2-yn-1-yl 7-bromoheptanoate was consumed completely. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to remove solvent. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=100 / 1 to 60 / 1) . 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7-bromoheptanoate (25.0 g, 48.9 mmol, 80.5%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.34 (dd, J = 4.8 Hz, J = 5.2 Hz, 1 H) , 4.26 (dd, J = 4.8 Hz, J = 5.2 Hz, 1 H) , 3.41 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 2.97 -3.03 (m, 1 H) , 2.79 (d, J = 6.8 Hz, 2 H) , 2.53 -2.62 (m, 4 H) , 2.35 (t, J = 7.2 Hz, 2 H) , 1.85 -1.89 (m, 2 H) , 1.56 -1.68 (m, 7 H) , 1.45 -1.47 (m, 2 H) , 1.28 -1.38 (m, 17 H) , 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6 H) .

[0195] Synthesis of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate

[0196] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7-bromoheptanoate (3.00 g, 5.86 mmol, 1.0 eq) and 2-aminoethanol (1.07 g, 17.6 mmol, 1.06 mL, 3.0 eq) in MeCN (15.0 mL) at 25℃, then the mixture was stirred at 90 ℃ for 40 mins. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate=10: 1, start material: Rf=0.51; product: Rf= 0.1) indicated the 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7-bromoheptanoate was consumed completely. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to remove solvent. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH = 10: 1) . 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate (1.60 g, crude) was obtained as yellow oil.

[0197] Synthesis of (6Z, 9Z) -18-bromooctadeca-6, 9-diene

[0198] To a suspension of LAH (2.71 g, 71.3 mmol, 1.00 eq) in THF (50.0 mL) was added a solution of (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dienoic acid (20.0 g, 71.3 mmol, 20.0 mL, 1.00 eq) in THF (70.0 mL) to the reaction mixture dropwise at 0 ℃. The mixture was stirred at 25 ℃ for 2 hrs. TLC (Petroleum ether : Ethyl acetate = 10: 1, Rf = 0.3) indicated (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dienoic acid was consumed completely and one new spot formed. The reaction mixture was quenched by addition H2O (3.00 mL) at 0℃, and then the reaction mixture was filtered and the filtrate was concentrated. Without purification. (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-ol (14.7 g, 55.2 mmol, 77.4%yield) was obtained as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 5.29 -5.49 (m, 4H) , 3.66 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.80 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.01 -2.15 (m, 5H) , 1.55-1.62 (m, 3H) , 1.22 -1.45 (m, 19H) , 0.91 (t, J = 6.4 Hz, 3H)

[0199] To a solution of (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-ol (14.7 g, 55.2 mmol, 1.00 eq) in DCM (90.0 mL) was added PPh3 (23.2 g, 88.3 mmol, 1.60 eq) , and then CBr4 (29.3 g, 88.3 mmol, 1.60 eq) was added to the reaction mixture at 0 ℃ in portions. The mixture was stirred at 25 ℃ for 12 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 10: 1, Rf = 0.7) indicated (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-ol was consumed completely and two new spots formed. The reaction mixture was poured into H2O (100 mL) and extracted with DCM (200 mL, 100 mL) . The combined organic layers were washed with brine (100 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 0 / 1 to 5 / 1) .  (6Z, 9Z) -18-bromooctadeca-6, 9-diene (25.0 g, crude) was obtained as a colourless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 5.23 -5.54 (m, 4H) , 3.43 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.80 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.07 (q, J = 6.8 Hz, 4H) , 1.88 (quin, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.24 -1.51 (m, 17H) , 0.91 (t, J = 6.8 Hz, 3H)

[0200] Synthesis of Compound 8

[0201] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate (1.00 g, 2.03 mmol, 1.0 eq) and (6Z, 9Z) -18-bromooctadeca-6, 9-diene (804 mg, 2.44 mmol, 1.2 eq) in EtOH (10.0 mL) was added DIEA (420 mg, 3.25 mmol, 566 uL, 1.6 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 12 hrs. LCMS (ET49878-166-p1a, product: RT = 0.855 min; start material: RT = 0.710 min) showed the starting material was consumed completely. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (10.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=5 / 1 to 2 / 1) . Compound 8 (200 mg, 262 umol, 12.9%yield, 97.1%purity) was obtained as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 5.32 -5.42 (m, 4 H) , 4.33 -4.37 (m, 1 H) , 4.22 -4.25 (m, 1 H) , 3.52 (t, J = 5.2 Hz, 2 H) , 2.98 -3.01 (m, 1 H) , 2.76 -2.80 (m, 4 H) , 2.53 -2.62 (m, 6 H) , 2.42-2.46 (m, 4 H) , 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.03 -2.08 (m, 4 H) , 1.55 -1.66 (m, 9 H) , 1.28 -1.45 (m, 43 H) , 0.87 -0.91 (m, 9 H) .

[0202] Compound 9: 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) heptanoate

[0203] Synthesis of Compound 9

[0204] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate (1.00 g, 2.03 mmol, 1.0 eq) and undecyl 6-bromohexanoate (852 mg, 2.44 mmol, 1.2 eq) in EtOH (20.0 mL) was added DIEA (525 mg, 4.07 mmol, 708 uL, 2.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for  12 hrs. LCMS (ET49878-167-p1a, product: RT = 0.839 min; start material: RT = 0.707 min) showed the starting material was consumed completely. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (10.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=2 / 1 to 1 / 1) . Compound 9 (500 mg, 658 umol, 32.4%yield, 100%purity) was obtained as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.33 -4.36 (m, 1 H) , 4.25 -4.26 (m, 1 H) , 4.06 (t, J = 6.4 Hz, 2 H) , 3.52 (t, J = 5.6 Hz, 2 H) , 2.80 -3.10 (m, 2 H) , 2.57 -2.58 (m, 2 H) , 2.55 -2.57 (m, 6 H) , 2.41 -2.50 (m, 4 H) , 2.30 -2.33 (m, 4 H) , 1.59 -1.66 (m, 11 H) , 1.27 -1.38 (m, 43 H) , 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 9 H) .

[0205] Compound 10: nonyl 8- ( (7- (2, 3-bis (heptylthio) propoxy) -7-oxoheptyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0206] Synthesis of Compound 10

[0207] To a soluton of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate (1.00 g, 2.03 mmol, 1.0 eq) and nonyl 8-bromooctanoate (852 mg, 2.44 mmol, 1.2 eq) in EtOH (20.0 mL) was added DIEA (420 mg, 3.25 mmol, 567 uL, 1.6 eq) . The reaction was stirred at 90 ℃ for 12 h. LCMS (ET49878-166-p1a, product: RT = 0.855 min; start material: RT = 0.710 min) showed the starting material was consumed completely. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (10.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=2 / 1 to 1 / 1) . Compound 10 (400 mg, 526 umol, 25.9%yield) was obtained as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.33 -4.37 (m, 1 H) , 4.23 -4.26 (m, 1 H) , 4.06 (t, J = 6.4 Hz, 2 H) , 3.52 (t, J = 5.2 Hz, 2 H) , 2.98 -3.01 (m, 1 H) , 2.77 -2.79 (m, 2 H) , 2.53 -2.62 (m, 6 H) , 2.41 -2.45 (m, 4 H) , 2.27 -2.35 (m, 4 H) , 1.55 -1.67 (m, 11 H) , 1.23 -1.47 (m, 44 H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9 H) .

[0208] Compound 11: 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (3-hydroxypropyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) heptanoate

[0209] Synthesis of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (3-hydroxypropyl) amino) heptanoate

[0210] To a solurion of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7-bromoheptanoate (1.00 g, 1.95 mmol, 1.0 eq) and 3-aminopropan-1-ol (1.47 g, 19.5 mmol, 1.51 mL, 10 eq) in EtOH (28.0 mL) was stirred at 50 ℃ for 8 h. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate=10: 1, start material: Rf=0.51; product: Rf= 0.07) indicated the 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7-bromoheptanoate was consumed completely. The residue was diluted with water (40.0 mL) and extracted with Dimethyltetrahydrofuran (20.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL*2) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (3-hydroxypropyl) amino) heptanoate (500 mg, 988 umol, 50.6%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.32 -4.37 (m, 1 H) , 4.21 -4.26 (m, 1 H) , 3.81 -3.83 (m, 2 H) , 2.98 -3.03 (m, 1 H) , 2.92 (t, J = 5.6 Hz, 2 H) , 2.78 (d, J = 6.8 Hz, 2 H) , 2.53 -2.67 (m, 5 H) , 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 2 H) , 1.71 -1.77 (m, 2 H) , 1.51 -1.65 (m, 8 H) , 1.27 -1.39 (m, 19 H) , 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 5 H) .

[0211] Synthesis of Compound 11

[0212] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (3-hydroxypropyl) amino) heptanoate (500 mg, 988 umol, 1.0 eq) and undecyl 6-bromohexanoate (518 mg, 1.48 mmol, 1.5 eq) in EtOH (10.0 mL) was added DIEA (255 mg, 1.98 mmol, 344 uL, 2.0 eq) . The reaction was stirred at 90 ℃ for 12 h. LCMS (ET49878-223-p1a2, product: RT = 1.25 min; start material: RT = 0.866 min) showed the starting material was consumed completely. The residue was diluted with water (10.0 mL) and extracted with EtOAc (10.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH=40 / 1 to 30 / 1) . Compound 11 (300 mg, 387 umol, 39.2%yield) was obtained as yellow oil, 100 mg was delivered with test purity on page et49878-239. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.33 -4.37 (m, 1 H) , 4.23 -4.27 (m, 1 H) , 4.06 (t, J=6.4 Hz, 2 H) , 3.83 (t, J=4.8 Hz, 2 H) , 2.89 -3.10 (m, 5 H) , 2.78 -2.88 (m, 2 H) , 2.54 -2.63 (m, 4 H) , 2.29 -2.36 (m, 4  H) , 1.88 -1.94 (m, 1 H) , 1.52 -1.74 (m, 13 H) , 1.27 -1.48 (m, 36 H) , 1.18 -1.21 (m, 1 H) , 0.84 -0.90 (m, 9 H) .

[0213] Compound 12: 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (3- (dimethylamino) propyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) heptanoate

[0214] Synthesis of Compound 12

[0215] To a solution of Compound 11 (1.50 g, 1.94 mmol, 1.0 eq) in DCM (15.0 mL) was added TEA (784 mg, 7.75 mmol, 1.08 mL, 4.0 eq) . Then TosCl (739 mg, 3.87 mmol, 2.0 eq) was added at 0 ℃. The reaction was stirred at 20 ℃ for 12 h. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate=10: 1, start material: Rf=0.37; product: Rf= 0.65) indicated the compound 67-5-3 was consumed completely. The reaction of et49878-256 was combined to et49878-263 for work up. The residue was diluted with water (30.0 mL) and extracted with DCM (20.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (20.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH=80 / 1 to 60 / 1) . The product of et49878-256 was combined to et49878-263.2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) (3-(tosyloxy) propyl) amino) heptanoate (2.1 g, crude) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.33 -4.37 (m, 1 H) , 4.22 -4.26 (m, 1 H) , 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 3.61 (br s, 2 H) , 2.98 -3.01 (m, 2 H) , 2.78 -2.79 (m, 2 H) , 2.53 -2.62 (m, 5 H) , 2.28 -2.43 (m, 9 H) , 1.86 (br s, 2 H) , 1.55 -1.65 (m, 12 H) , 1.27 -1.39 (m, 42 H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 9 H) .

[0216] To a solution of N-methylmethanamine (2 M, 1.26 mL, 5.0 eq) in THF (8.00 mL) was added NaI (37.8 mg, 252 umol, 0.5 eq) and 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) (3- (tosyloxy) propyl) amino) heptanoate (400 mg, 504 umol, 1.0 eq) . The mixture was stirred at 80 ℃ for 48 hrs. LCMS (ET49878-274-p1a1, product: RT = 0.781 min; start material: RT = 0.87 min) showed the starting material was consumed completely. Four reactions were combined for workup / purification.  The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to remove solvent. The residue was purified by prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 3: 1 to 1: 1) . Compound 12 (300 mg, 374 umol, 18.6%yield) was obtained as brown oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.33 -4.37 (m, 1 H) , 4.24 -4.27 (m, 1 H) , 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 2.92 -3.01 (m, 3 H) 2.78 -2.85 (m, 6 H) , 2.70 -2.73 (m, 2 H) , 2.54 -2.62 (m, 4 H) , 2.46 (s, 6 H) , 2.30 -2.36 (m, 5 H) , 2.00 -2.03 (m, 2 H) , 1.55 -1.70 (m, 14 H) 1.27 -1.41 (m, 39 H) 0.88 (t, J=6.4 Hz, 9 H) .

[0217] Compound 13: 2- ( (7- (2, 3-bis (heptylthio) propoxy) -7-oxoheptyl) (2-hydroxyethyl) amino) ethyl (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dienoatev

[0218] Compound 13 was prepared using similar procedure as for compound 7, starting with 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate. Briefly, to a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate (1.00 g, 2.03 mmol, 1.0 eq) and 2-bromoethanol (508 mg, 4.07 mmol, 289 uL, 2.0 eq) in ACN (6.00 mL) was added K2CO3 (562 mg, 4.07 mmol, 2.0 eq) . The reaction was stirred at 90 ℃ for 6 h. LCMS (ET49878-195-P1A1, product: RT = 0.724 min; ) showed the starting material was consumed completely. The residue was diluted with water (10.0 mL) and extracted with EtOAc (10.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL*2) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- (bis (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate (1.0 g, crude) was obtained as yellow oil. To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- (bis (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate (1.00 g, 1.87 mmol, 1.0 eq) and (9Z, 12Z) -heptadeca-9, 12-dienoic acid (596 mg, 2.24 mmol, 1.2 eq) in DCM (7.80 mL) was added EDCI (536 mg, 2.80 mmol, 1.5 eq) and DMAP (45.6 mg, 373 umol, 0.2 eq) at 0 ℃. The reaction was stirred at 20℃ for 4 h. LCMS (ET49878-198-p1a1, product: RT = 0.890 min) showed the starting material was consumed completely. The residue was diluted with water (10.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=5 / 1 to 3 / 1) . Compound 13 (700 mg, 833 umol, 44.6%yield, 95.0%purity) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 5.32 -5.39 (m, 4 H) , 4.33 -4.36 (m, 1 H) , 4.25  -4.26 (m, 1 H) , 4.12 -4.15 (m, 2 H) , 3.53 -3.55 (m, 2 H) , 2.98 -3.00 (m, 1 H) , 2.77 -2.79 (m, 6 H) , 2.53 -2.57 (m, 7 H) , 2.31 -2.33 (m, 4 H) , 2.04 -2.06 (m, 4 H) 1.59 -1.61 (m, 9 H) , 1.28 -1.37 (m, 37 H) , 0.87 -0.90 (m, 9 H) .

[0219] Compound 14: 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (5- (dodecyloxy) -5-oxopentyl) (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate

[0220] Synthesis of Compound 14

[0221] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate (0.6 g, 1.22 mmol, 1.0 eq) in EtOH (12.0 mL) was added DIEA (315 mg, 2.44 mmol, 425 uL, 2.0 eq) and dodecyl 5-bromopentanoate (511 mg, 1.46 mmol, 1.2 eq) . The mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hrs. The residue was diluted with water (10.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH=60 / 1 to 40 / 1) . Compound 14 (300 mg, 395 umol, 32.4%yield, 100%purity) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.33 -4.37 (m, 1 H) , 4.22 -4.26 (m, 1 H) , 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 3.56 (s, 2 H) , 2.98 -3.01 (m, 1 H) , 2.78 -2.80 (m, 2 H) , 2.48 -2.62 (m, 10 H) , 2.30 -2.35 (m, 4 H) , 1.57 -1.65 (m, 12 H) , 1.26 -1.39 (m, 40 H) , 0.89 (t, J=6.8 Hz, 9 H) .

[0222] Compound 15: nonyl 8- ( (7- (2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propoxy) -7-oxoheptyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0223] Synthesis of nonyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0224] A solution of nonyl 8-bromooctanoate (3.00 g, 8.59 mmol) and 2-aminoethan-1-ol (15.2 g, 249 mmol) in EtOH (30 mL) was stirred at 85 ℃ for 3 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 10: 1) indicated starting material was consumed completely and one new spot formed. The reaction was diluted with EtOAc (100 mL) , washed with water, dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 20+12  g Silica Flash Column, Eluent of 0～15%MeOH / CH2Cl2 gradient @30 mL / min) to give nonyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (1.30 g, 3.95 mmol, 45.9%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) . δ 4.05 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.61-3.68 (m, 2H) , 2.75-2.82 (m, 2H) , 2.62 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.29 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.19 (br s, 2H) , 1.56-1.68 (m, 4H) , 1.44-1.54 (m, 2H) , 1.20-1.39 (m, 18H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0225] Synthesis of 3-butylheptane-1-thiol

[0226] To a solution of 3-butylheptan-1-ol (5.00 g, 20.0 mmol) in CH2Cl2 (50.0 mL) was added TsCl (6.09 g, 31.9 mmol) , DMAP (354 mg, 2.90 mmol) and TEA (5.87 g, 58.0 mmol) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 16 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 10: 1) indicated the reaction was completed. The reaction mixture was diluted with CH2Cl2 (100 mL) and washed with aqueous citric acid (50 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give 3-butylheptyl 4-methylbenzenesulfonate (9.00 g, crude) as black brown oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) . δ 7.80 (d, J = 8.4 Hz, 2H) , 7.35 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 4.06 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.46 (s, 3H) , 1.51-1.63 (m, 3H) 1.11-1.27 (m, 12H) , 0.82-0.90 (m, 6H) .

[0227] To a solution of 3-butylheptyl 4-methylbenzenesulfonate (9.00 g, 27.6 mmol) in acetone (90 mL) was added potassium ethanethioate (3.78 g, 33.1 mmol) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 12 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 10: 1) indicated the reaction was completed. The reaction mixture was diluted with water (300 mL) and extracted with CH2Cl2 (100 mL x 3) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give black brown oil (6.00 g) . The black oil (6.00 g) was dissolved in MeOH (30 mL) and added aqueous aq. NaOH (3.0 mL, 20%purity) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 2 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 10: 1) indicated the reaction was completed. The reaction mixture was diluted with water (100 mL) and extracted with CH2Cl2 (30 mL x 3) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue, which was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 1 / 0 to 20 / 1) to give 3-butylheptane-1-thiol (3.30 g, 17.5 mmol, 6.34%yield) as light yellow oil. 1H NMR: (400 MHz, CDCl3) . δ 2.45-2.57 (m, 2H) , 1.52-1.61 (m, 2H) , 1.44 (s, 1H) , 1.19-1.33 (m, 12H) , 0.87-0.93 (m, 6H) .

[0228] Synthesis of 2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate

[0229] To a solution of 3-butylheptane-1-thiol (0.60 g, 2.43 mmol) and prop-2-yn-1-yl 7-bromoheptanoate (1.37 g, 7.28 mmol) in 1, 4-dioxane (10 mL) was added AIBN (79.7 mg, 486 μmo, 0.2 eq) at 25 ℃. The mixture was stirred at 100 ℃ for 13 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate =10: 1) indicated the reaction was completed. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue, which was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 1 / 0 to 20 / 1) to give (E) -3- ( (3-butylheptyl) thio) allyl 7-bromoheptanoate (1.00 g, 2.30 mmol, 94.7%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.17-6.44 (m, 1H) , 5.53-5.74 (m, 1H) , 4.53-4.73 (m, 2H) , 3.36-3.46 (m, 2H) , 2.65-2.73 (m, 2H) , 2.29-2.36 (m, 2H) , 1.82-1.92 (m, 2H) , 1.58-1.72 (m, 4H) , 1.20-1.30 (m, 17H) , 0.89-0.92 (m, 6H) .

[0230] To a mixture of (E) -3- ( (3-butylheptyl) thio) allyl 7-bromoheptanoate (842 mg, 1.93 mmol) and 3-butylheptane-1-thiol (728 mg, 3.86 mmol) in 1, 4-dioxane (6.0 mL) was added AIBN (70.0 mg, 426 μmol) and stirred at 100 ℃ for 12 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 20: 1) indicated starting material was consumed completely and one new spot formed. The reaction was concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 12 g Silica Flash Column, Eluent of 0～2%Ethyl acetate / Petroleum ether gradient @20 mL / min) to give 2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate (1.00 g, 1.60 mmol, 82.9%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.34-4.41 (m, 1H) , 4.24-4.31 (m, 1H) , 3.42 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.98-3.07 (m, 1H) , 2.81 (d, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.54-2.63 (m, 3H) , 2.37 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.80-1.93 (m, 2H) , 1.60-1.70 (m, 2H) , 1.52-1.60 (m, 5H) , 1.36-1.51 (m, 6H) , 1.23-1.34 (m, 24H) , 0.87-0.95 (m, 12H) .

[0231] Synthesis of Compound 15

[0232] A mixture of nonyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (200 mg, 607 μmol) , 2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate (450 mg, 721 μmol) in EtOH (2.00 mL) DIEA (163 mg, 1.26 mmol) was stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane: Methanol = 10: 1) indicated one new spot was detected. The mixture was diluted with EtOAc (20 mL) , washed with water, then dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～3%MeOH / CH2Cl2 gradient @20 mL / min) to give the title compound 15 (243 mg, 98.7%purity, 45.9%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.30-4.39 (m, 1H) , 4.21-4.29 (m, 1H) , 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.56 (br s, 2H) , 2.94-3.05 (m, 1H) , 2.79 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.40-2.67 (m, 10H) , 2.26-2.36 (m, 4H) , 1.58-1.66 (m, 6H) , 1.39-1.56 (m, 10H) , 1.20-1.36 (m, 47H) , 0.81-0.95 (m, 15H) .

[0233] Compound 16: 3-butylheptyl 8- ( (7- (2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propoxy) -7-oxoheptyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0234] Synthesis of 3-butylheptyl 8-bromooctanoate

[0235] To a solution of 8-bromooctanoic acid (1.00 g, 4.48 mmol) and 3-butylheptan-1-ol (772 mg, 4.48 mmol) in DCM (6.00 mL) was added EDCI (1.29 g, 6.72 mmol) and DMAP (109 mg, 896 μmol) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 3 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 10: 1) indicated the reaction was completed. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue, which was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 1 / 0 to 20 / 1) to give 3-butylheptyl 8-bromooctanoate (1.30 g, 3.44 mmol, 76.8%yield) as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.41 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.30 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.81-1.91 (m, 2H) , 1.53-1.66 (m, 5H) , 1.18-1.48 (m, 19H) , 0.85-0.94 (m, 6H) .

[0236] Synthesis of 3-butylheptyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0237] To a solution of 3-butylheptyl 8-bromooctanoate (2.50 g, 6.62 mmol) and 2-aminoethan-1-ol (4.05 g, 66.2 mmol) in EtOH (25.0 mL) was stirred at 75 ℃ for 2 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 10: 1) indicated the starting material was consumed completed and one new spot was formed. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue, which was purified  by column chromatography (SiO2, Dichloromethane: Methanol = 1 / 0 to 100 / 15) to give to 3-butylheptyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (1.20 g, 3.36 mmol, 50.6%yield) as colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.65 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.75-2.83 (m, 2H) , 2.62 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.29 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.55-1.68 (m, 4H) , 1.45-1.54 (m, 2H) , 1.18-1.39 (m, 19H) , 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0238] Synthesis of compound 16

[0239] A mixture of 3-butylheptyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (280 mg, 783 μmol) , 2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate (550 mg, 882 μmol) and DIEA (0.3 mL, 1.72 mmol) in EtOH (3.00 mL) was added and stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane: Methanol = 10: 1) indicated one new spot formed. The mixture was diluted with EtOAc (20 mL) , washed with water, then dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～3%MeOH / CH2Cl2 gradient @20 mL / min) to give the title compound 16 (236 mg, 259 μmol, 33.0%yield, 98.67%purity) as a light-yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 4.30-4.39 (m, 1H) , 4.20-4.29 (m, 1H) , 4.08 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.71 (br s, 2H) , 2.94-3.06 (m, 1H) , 2.75-2.88 (m, 4H) , 2.62-2.74 (m, 3H) , 2.46-2.58 (m, 4H) , 2.25-2.36 (m, 4H) , 1.48-1.69 (m, 15H) , 1.20-1.42 (m, 50H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 18H) .

[0240] Compound 17: 3-butylheptyl 8- ( (7- (2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propoxy) -7-oxoheptyl) (3- ( (2- (methylamino) -3, 4-dioxocyclobut-1-en-1-yl) amino) propyl) amino) octanoate

[0241] Synthesis of benzyl (3-aminopropyl) carbamate

[0242] A 500 mL three-necked round bottom flask equipped with magnetic stirrer, addition funnel and  thermometer. To a solution of tert-butyl (3-aminopropyl) carbamate (20.0 g, 115 mmol, 20.0 mL, 1.0 eq) in THF (120 mL) and H2O (80.0 mL) was added K2CO3 (23.8 g, 172 mmol, 1.5 eq) and CbzCl (29.4 g, 172 mmol, 24.5 mL, 1.5 eq) at 0 ℃. The mixture was stirred at 0-15 ℃ for 40 mins. The residue was diluted with water (100 mL) and extracted with EtOAc (100 mL, 50.0 mL, 25.0 mL) . The combined organic layers were washed with brine (20.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether: Ethyl acetate=20 / 1 to 10 / 1) . Benzyl tert-butyl propane-1, 3-diyldicarbamate (42.0 g, crude) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.29 -7.38 (m, 5 H) , 5.26 (s, 1 H) , 5.10 (s, 2 H) , 4.83 (s, 1 H) , 3.17 -3.27 (m, 4 H) , 1.60 -1.66 (m, 4 H) , 1.44 (s, 9 H) .

[0243] A 100 mL three-necked round bottom flask equipped with magnetic stirrer, addition funnel and thermometer. To a solution of benzyl tert-butyl propane-1, 3-diyldicarbamate (20.0 g, 64.9 mmol, 1.0 eq) in DCM (120 mL) was added TFA (92.4 g, 810.3 mmol, 60.0 mL, 12.5 eq) at 0 ℃. The mixture was stirred at 20 ℃ for 2 hrs. The reaction was quenched by the slow addition of ca. 200 mL of a saturated aqueous sodium bicarbonate solution at 0 ℃ and extracted with EtOAc / THF (2 / 1, 100 mL *5) . The organic layer was separated, washed with a saturated aqueous sodium bicarbonate solution, then the Organic phase was adjusted pH 7 to 8 by a 0.1N sodium hydroxide solution and then brine (20.0 mL) , dried, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. Without purification. Benzyl (3-aminopropyl) carbamate (11.2 g, crude) was obtained as green oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.28 -7.41 (m, 5 H) , 5.38 (s, 1 H) , 5.05 -5.13 (m, 2 H) , 3.27 -3.28 (m, 2 H) , 2.92 (s, 2 H) , 2.75 -2.81 (m, 2 H) , 1.63 -1.68 (m, 2 H) .

[0244] Synthesis of 3-butylheptyl 8- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) amino) octanoate

[0245] To a solution of benzyl (3-aminopropyl) carbamate (4.54 g, 18.5 mmol) in EtOH (30 mL) was added 3-butylheptyl 8-bromooctanoate (1.40 g, 3.71 mmol) and DIEA (2.40 g, 18.5 mmol, 3.23 mL) . Then the mixture was stirred at 75 ℃ for 12 hrs. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.13) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL x 2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～2%MeOH: CH2Cl2 @15 mL / min) to give 3-butylheptyl 8- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) amino) octanoate (1.10  g, 58.7%yield) as colorless oil. 1H NMR: (400 MHz, CDCl3) δ 7.29-7.39 (m, 5H) , 5.06-5.12 (m, 2H) , 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.30 (d, J = 4.4 Hz, 2H) , 2.69 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.52-2.61 (m, 2H) , 2.28 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.64-1.74 (m, 2H) , 1.56-1.63 (m, 4H) , 1.37-1.52 (m, 4H) , 1.22-1.34 (m, 19H) , 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0246] Synthesis of 3-butylheptyl 8- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) (7- (2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propoxy) -7-oxoheptyl) amino) octanoate

[0247] To a solution of 3-butylheptyl 8- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) amino) octanoate (800 mg, 1.58 mmol) in EtOH (2 mL) was added 2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate (915 mg, 1.58 mmol) and DIEA (409 mg, 3.17 mmol, 552 μL) . Then the mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.43) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with CH2Cl2 (20.0 mL x 2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～20%MeOH: CH2Cl2 @15 mL / min) to give 3-butylheptyl 8- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) (7- (2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propoxy) -7-oxoheptyl) amino) octanoate (900 mg, 56.7%yield) as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.29-7.42 (m, 5H) , 6.80 (br s, 1H) , 5.06 (s, 2H) , 4.30-4.36 (m, 1H) , 4.20-4.28 (m, 1H) , 4.07 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.10-3.25 (m, 2H) , 2.92-3.08 (m, 1H) , 2.72-2.86 (m, 4H) , 2.46-2.72 (m, 6H) , 2.24-2.36 (m, 4H) , 1.47-1.69 (m, 17H) , 1.20-1.43 (m, 50H) , 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 18H) .

[0248] Synthesis of 3-butylheptyl 8- ( (3-aminopropyl) (7- (2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propoxy) -7-oxoheptyl) amino) octanoate

[0249] A solution of 3-butylheptyl 8- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) (7- (2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propoxy) -7-oxoheptyl) amino) octanoatev (1.1 g, 1.10 mmol) in THF (10 mL) was added Pd / C (0.11 g, 0.13 mmol) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with H2 for 3 times. The mixture was stirred under H2 (15 Psi) at 25 ℃ for 12 hrs. TLC (CH2Cl2: MeOH =10 / 1, Rf = 0.32) showed the reaction was completed. The reaction mixture was filtered and the filter was concentrated. to give the 3-butylheptyl 8- ( (3-aminopropyl) (7- (2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propoxy) -7-oxoheptyl) amino) octanoate (900 mg, 94.4%yield) as a colorless oil. 1H NMR: (400 MHz, CDCl3) : δ 4.31-4.37 (m, 1H) , 4.21-4.29 (m, 1H) , 4.08 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.93-3.06 (m, 1H) , 2.73-2.88 (m, 6H) , 2.61-2.74 (m, 6H) , 2.45-2.59 (m, 4H) , 2.23-2.37 (m, 4H) , 1.46-1.68 (m, 15H) , 1.21-1.42 (m, 50H) , 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 18H) .

[0250] Synthesis of Compound 17

[0251] A mixture of 3, 4-dimethoxycyclobut-3-ene-1, 2-dione (213 mg, 1.50 mmol) and 3-butylheptyl 8- ( (3-aminopropyl) (7- (2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propoxy) -7-oxoheptyl) amino) octanoate (0.87 g, 1.00 mmol) in THF (9 mL) was stirred at 25 ℃ for 1 hr. Then methanamine (2 M, 5.01 mL) was added, the reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 24 hrs. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.43) showed the reaction was complete. The reaction mixture was concentrated under vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～9%MeOH / CH2Cl2 gradient @15 mL / min) to give compound 17 (400 mg, 40.8%yield) as yellow oil. 1HNMR (400 MHz CDCl3) : δ 4.31-4.38 (m, 1H) , 4.22-4.29 (m, 1H) , 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.75-3.06 (m, 10H) , 2.62-2.75 (m, 3H) , 2.44-2.58 (m, 6H) , 2.24-2.36 (m, 4H) , 1.21-1.69 (m, 66H) , 0.89 (t,  J = 6.4 Hz, 18H) .

[0252] Compound 18: 2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propyl 7- ( (6- ( (3-butylheptyl) oxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate

[0253] Synthesis of 3-butylheptyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0254] To a solution of 3-butylheptan-1-ol (2.90 g, 16.8 mmol) and 6-bromohexanoic acid (4.92 g, 25.3 mmol) in CH2Cl2 (18.0 mL) was added EDCI (4.84 g, 25.3 mmol) and DMAP (411 mg, 3.37 mmol) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 12 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate=10: 1, start material: Rf=0.18; product: Rf= 0.60) indicated the 6-bromohexanoic acid was consumed complete. The residue was diluted with water (20 mL) and extracted with CH2Cl2 (20 mL x 3) . The combined organic layers were washed with brine (30 mL x 3) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether: Ethyl acetate=80 / 1 to 60 / 1) . 3-butylheptyl 6-bromohexanoate (4.1 g, 11.7 mmol, 69.7%yield) was obtained as colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.10 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.41 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.89 (m, 2H) , 1.63-1.72 (m, 2H) , 1.54-1.62 (m, 2H) , 1.45-1.53 (m, 2H) , 1.36-1.44 (m, 1H) , 1.19-1.35 (m, 12H) , 0.87-0.93 (m, 6H) .

[0255] To a solution of 3-butylheptyl 6-bromohexanoate (1.26 g, 3.61 mmol) in EtOH (25 mL) was added 2-aminoethanol (6.61 g, 108 mmol, 6.53 mL) . The mixture was stirred at 75 ℃ for 1 hr. The residue was diluted with water (20 mL) and extracted with EtOAc (20 mL x 3 mL) . The combined organic layers were washed with brine (20 x 3 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. 3-butylheptyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (1.11 g, crude) was obtained as colorless oil.

[0256] Synthesis of Compound 18

[0257] Compound 18 was prepared analogously to compound 16 but using 3-butylheptyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.31-4.40 (m, 1H) , 4.19-4.28 (m, 1H) , 4.07 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.70 (br s, 2H) , 2.92-3.05 (m, 1H) , 2.72-2.89 (m, 4H) , 2.61-2.75 (m, 3H) , 2.45-2.58 (m, 4H) , 2.23-2.37 (m, 4H) , 1.47-1.68 (m, 15H) , 1.21-1.43 (m, 46H) , 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 18H) .

[0258] Compound 19: 3-propylhexyl 8- ( (7- (2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propoxy) -7-oxoheptyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0259] Compound 19 was synthesized with similar procedure as Compound 16 but using 2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate and 3-propylhexyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate. Compound 065 was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.28-4.38 (m, 1H) , 4.21-4.26 (m, 1H) , 4.05 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.70 (br s, 2H) , 2.92-3.04 (m, 1H) , 2.73-2.84 (m, 4H) , 2.61-2.71 (m, 3H) , 2.45-2.55 (m, 4H) , 2.24-2.33 (m, 4H) , 1.44-1.67 (m, 15H) , 1.21-1.45 (m, 46H) , 0.86 (t, J = 6.4 Hz, 18H) .

[0260] Compound 20: 3-propylhexyl 8- ( (7- (2, 3-bis ( (3-propylhexyl) thio) propoxy) -7-oxoheptyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0261] Compound 20 was synthesized with similar procedure as Compound 16 starting from 3-propylhexan-1-ol instead of 3-butylheptan-1-ol. Compound 20 was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.25-4.37 (m, 1H) , 4.22-4.25 (m, 1H) , 4.04 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.72 (br s, 2H) , 2.90-3.06 (m, 1H) , 2.69-2.85 (m, 4H) , 2.63-2.70 (m, 3H) , 2.43-2.58 (m, 4H) , 2.23-2.35 (m, 4H) , 1.43-1.68 (m, 15H) , 1.23-1.48 (m, 38H) , 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 18H) .

[0262] Compound 21: nonyl 8- ( (7- (2, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) thio) propoxy) -7-oxoheptyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0263] Synthesis of 3, 7-dimethyloctane-1-thiol

[0264] To a solution of 1-bromo-3, 7-dimethyloctane (20.0 g, 90.4 mmol) in acetone (600 mL) was added potassium ethanethioate (11.4 g, 99.8 mmol) , then stirred at 20 ℃ for 12 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 20: 1) indicated starting material was consumed completely. The reaction was diluted with water (200 mL) , then extracted with CH2Cl2 (200 mL x 2) . The combined organic phase was washed with brine, dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum to give colorless oil (19.0 g, 87.8 mmol, 97.1%yield) . The colorless oil (19.0 g, 87.8 mmol) was dissolved in MeOH (190 mL) and added 20%aq. NaOH (19.0 mL) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 2 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 20: 1) indicated starting material was consumed completely and one new spot formed. The reaction was added HCl (1 N) to adjusted pH = 6, then extracted with CH2Cl2 (50 mL x 2) . The combined organic phase was washed with brine, dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 80 g Silica Flash Column, Eluent of 0～0%Ethyl acetate / Petroleum ether gradient @50 mL / min) to give 3, 7-dimethyloctane-1-thiol (17.0 g, 97.5 mmol)  as colorless oil. 1H NMR: (400 MHz, CDCl3) . δ 2.43-2.64 (m, 2H) , 1.44-1.67 (m, 4H) , 1.20-1.34 (m, 4H) , 1.05-1.18 (m, 3H) , 0.87 (d, J = 6.8 Hz, 9H) .

[0265] Synthesis of 2, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate

[0266] A solution of 3, 7-dimethyloctane-1-thiol (10.0 g, 57.4 mmol) in 1, 4-dioxane (30 mL) was added prop-2-yn-1-yl 7-bromoheptanoate (4.70 g, 19.0 mmol) and stirred at 25 ℃ for 1 hr. Then the mixture was added AIBN (625 mg, 3.81 mmol) and stirred at 100 ℃ for another 2 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 20: 1) indicated starting material was consumed completely. The reaction was added diluted with CH2Cl2 (100 mL) , washed with brine, dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 80 g  Silica Flash Column, Eluent of 0～5%Ethyl acetate / Petroleum ether gradient @55 mL / min) to give 2, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate (10.0 g, 16.8 mmol, 88.1%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.31-4.39 (m, 1H) , 4.21-4.29 (m, 1H) , 3.36-3.56 (m, 2H) , 2.95-3.05 (m, 1H) , 2.79 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.48-2.69 (m, 4H) , 2.34 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.74-1.91 (m, 2H) , 1.57-1.69 (m, 4H) , 1.47-1.56 (m, 5H) , 1.33-1.45 (m, 5H) , 1.20-1.33 (m, 6H) , 1.05-1.19 (m, 6H) , 0.83-0.91 (m, 18H) .

[0267] Synthesis of compound 21

[0268] A solution of 2, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate (1.40 g, 2.35 mmol) , nonyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (600 mg, 1.82 mmol) and DIEA (0.64 mL, 3.67 mmol) in EtOH (6.00 mL) was stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10: 1) indicated starting material was consumed completely and one new spot formed. The reaction was diluted with EtOAc (30 mL) , then washed with water, dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum.  The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 12 g Silica Flash Column, Eluent of 0～4%MeOH / CH2Cl2 gradient @30 mL / min) to give the title compound 21 (360 mg, 424 μmol, 23.3%yield, 99.37%purity) as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.31-4.40 (m, 1H) , 4.20-4.29 (m, 1H) , 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.56 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 2.95-3.04 (m, 1H) , 2.78 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.45-2.68 (m, 11H) , 2.26-2.36 (m, 4H) , 1.57-1.66 (m, 8H) , 1.41-1.56 (m, 10H) , 1.24-1.36 (m, 28H) , 1.08-1.17 (m, 6H) , 0.84-0.90 (m, 21H) .

[0269] Compound 22: 2, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) thio) propyl 7- ( (6- ( (3-butylheptyl) oxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate

[0270] Synthesis of 3-butylheptyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0271] To a mixture of 6-bromohexanoic acid (300 mg, 1.54 mmol) and 3-butylheptan-1-ol (292 mg, 1.69 mmol) in CH2Cl2 (2 mL) was added DMAP (38.0 mg, 311 μmol) and EDCI (442 mg, 2.31 mmol) at 0℃, then the mixture was stirred at 20 ℃ for 3 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 10: 1) indicated starting material was consumed completely and one new spot formed. The reaction was concentrated in vacuum to give a residue, which was purified by flash silica gel chromatography ( 4+4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～10%Ethyl acetate / Petroleum ether gradient @20 mL / min) to give 3-butylheptyl 6-bromohexanoate (467 mg, 1.34 mmol, 86.9%yield) as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) . δ 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.40 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.31 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.83-1.92 (m, 2H) , 1.61-1.70 (m, 2H) , 1.57 (q, J = 6.8 Hz, 2H) , 1.45-1.52 (m, 2H) , 1.36-1.43 (m, 1H) , 1.21-1.32 (m, 12H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 6H) .

[0272] A solution of 3-butylheptyl 6-bromohexanoate (360 mg, 1.03 mmol, 1 eq) and 2-aminoethan-1-ol (1.82 g, 29.8 mmol, 30 eq) in EtOH (4.0 mL) was stirred at 85 ℃ for 2 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 10: 1) indicated starting material was consumed completely. The reaction was diluted with EtOAc (20 mL) , washed with brine, dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～15%MeOH / CH2Cl2 gradient @20 mL / min) to give 3-butylheptyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (250 mg, 759 μmol, 73.6%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) . δ 4.08 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.65 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.79 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.64 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.30 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.09 (br s, 2H) , 1.48-1.69 (m, 6H) , 1.33-1.43 (m, 3H) , 1.20-1.32 (m, 12H) , 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0273] Synthesis of compound 22

[0274] A solution of 3-butylheptyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (245 mg, 744 μmol) , 2, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate (665 mg, 1.12 mmol) and DIEA (0.26 mL, 1.49 mmol) in EtOH (5.00 mL) was stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC (CH2Cl2: MeOH = 8: 1) indicated starting material was consumed completely. The reaction was diluted with EtOAc (30 mL) , washed with water, then dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～5%MeOH / CH2Cl2 gradient @20 mL / min) to give the title compound 22 (230 mg, 269 μmol, 36.2%yield, 98.9%purity) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) . δ 4.31-4.39 (m, 1H) , 4.20-4.28 (m, 1H) , 4.08 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.56 (br s, 2H) , 2.95-3.05 (m, 1H) , 2.79 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.42-2.68 (m, 10H) , 2.26-2.36 (m, 4H) , 1.38-1.68 (m, 20H) , 1.20-1.36 (m, 24H) , 1.05-1.18 (m, 6H) , 0.79-0.96 (m, 24H) .

[0275] Compound 23: 2, 3-bis (pentylthio) propyl 8- ( (2-hydroxyethyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) octanoate

[0276] Synthesis of 2, 3-bis (pentylthio) propyl 8-bromooctanoate

[0277] To a solution of prop-2-yn-1-ol (3.79 g, 67.6 mmol, 3.99 mL, 1.26 eq) in DCM (80 mL) was added 8-bromooctanoic acid (12 g, 53.8 mmol, 1.0 eq) , EDCI (15.5 g, 80.7 mmol, 1.5 eq) and DMAP (1.31 g, 10.8 mmol, 0.2 eq) at 0℃, then the mixture was stirred at 25℃ for 1.5 hrs. TLC (Petroleum ether / Ethyl acetate = 5 / 1, product Rf = 0.45) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2,  Petroleum ether / Ethyl acetate = 100 / 1 to 0 / 1) to give prop-2-yn-1-yl 8-bromooctanoate (11.5 g, 44.0 mmol, 81.8%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.68 (d, J = 2.8 Hz, 2H) , 3.41 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.47 (t, J = 2.4 Hz, 1H) , 2.36 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.84-1.88 (m, 2H) , 1.62-1.67 (m, 2H) , 1.41-1.48 (m, 2H) , 1.33-1.35 (m, 4H) .

[0278] To a solution of prop-2-yn-1-yl 8-bromooctanoate (6.2 g, 23.7 mmol, 1.0 eq) in dioxane (40 mL) was added pentane-1-thiol (7.42 g, 71.2 mmol, 3.0 eq) , then the solution was stirred at 25-100 ℃for 1 hr, AIBN (390 mg, 2.37 mmol, 0.1 eq) was added the mixture and stirred at 100 ℃ for 12 hrs. TLC (Petroleum ether / Ethyl acetate = 50 / 1, product Rf = 0.35) showed the reaction was completed. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 1 / 0 to 50 / 1) to give 2, 3-bis(pentylthio) propyl 8-bromooctanoate (7.7 g, 16.4 mmol, 69.0%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 5.2, 11.6 Hz, 1H) , 4.25 (dd, J = 6.4, 11.2 Hz, 1H) , 3.41 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.97-3.03 (m, 1H) , 2.79 (d, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.54-2.63 (m, 4H) , 2.34 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.84-1.89 (m, 2H) , 1.55-1.66 (m, 8H) , 1.32-1.39 (m, 15H) , 0.91 (t, J = 7.2 Hz, 6H) .

[0279] Synthesis of 2, 3-bis (pentylthio) propyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0280] To a solution of 2, 3-bis (pentylthio) propyl 8-bromooctanoate (7.7 g, 16.4 mmol, 1.0 eq) and 2-aminoethan-1-ol (3.0 g, 49.2 mmol, 2.98 mL, 3.0 eq) in MeCN (50 mL) at 25℃, then the mixture was stirred at 90 ℃ for 24 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 7 / 1, product Rf = 0.20) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine 20 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by prep-TLC (SiO2, Dichloromethane / Methanol = 5 / 1) to give 2, 3-bis (pentylthio) propyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (5 g, 11.12 mmol, 67.80%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 5.2, 11.2 Hz, 1H) , 4.23 (dd, J = 6.4, 11.2 Hz, 1H) , 3.64 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.97-3.03 (m, 1H) , 2.77-2.80 (m, 4H) , 2.54-2.64 (m, 6H) , 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.99 (brs, 3H) , 1.56-1.65 (m, 6H) , 1.48-1.52 (m, 2H) , 1.30-1.39 (m, 14H) , 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0281] Synthesis of Compound 23

[0282] To solution of 2, 3-bis (pentylthio) propyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (500 mg, 1.11 mmol, 1.0 eq) and undecyl 6-bromohexanoate (388.38 mg, 1.11 mmol, 1.0 eq) in EtOH (5 mL) was added DIEA (287 mg, 2.22 mmol, 387 uL, 2.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 10 / 1, product Rf = 0.40) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine 3 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to THF / EtOH = 5 / 1) to give Compound 23 (270 mg, 375 umol, 33.8%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.33-4.37 (m, 1H) , 4.22-4.26 (m, 1H) , 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.54 (brs, 2H) , 3.00-3.04 (m, 1H) , 2.78 (dd, J = 2.0, 6.8 Hz, 2H) , 2.54-2.63 (m, 6H) , 2.46 (brs, 4H) , 2.29-2.33 (m, 4H) , 1.58-1.66 (m, 9H) , 1.27-1.46 (m, 38H) , 0.87-0.92 (m, 9H) .

[0283] Compound 24: 2, 3-bis (pentylthio) propyl 8- ( (2-hydroxyethyl) ( (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dien-1-yl) amino) octanoate

[0284] Synthesis of Compound 24

[0285] To a solution of 2, 3-bis (pentylthio) propyl 8-bromooctanoate (500 mg, 1.11 mmol, 1.0 eq) and (6Z, 9Z) -18-bromooctadeca-6, 9-diene (366 mg, 1.11 mmol, 1.0 eq) in EtOH (5 mL) was added DIEA (287 mg, 2.22 mmol, 387 uL, 2.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 10 / 1, product Rf = 0.40) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2,  Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to THF / EtOH = 5 / 1) to give Compound 24 (180 mg, 257 umol, 23.1%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.32-5.40 (m, 4H) , 4.34-4.39 (m, 1H) , 4.22-4.27 (m, 1H) , 3.54-3.56 (m, 2H) , 2.97-3.04 (m, 1H) , 2.77-2.80 (m, 4H) , 2.54-2.63 (m, 5H) , 2.46 (brs, 4H) , 2.33 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.06 (q, J = 6.8 Hz, 4H) , 1.57-1.65 (m, 6H) , 1.29-1.45 (m, 37H) , 0.89-0.93 (m, 9H) .

[0286] Compound 25: 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8- ( (2-hydroxyethyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) octanoate

[0287] Synthesis of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8-bromooctanoate

[0288] To a solution of 8-bromooctanoic acid (20.0 g, 89.6 mmol, 1.00 eq) in DCM (130 mL) was added EDCI (25.8 g, 134 mmol, 1.50 eq) , DMAP (2.19 g, 17.9 mmol, 0.20 eq) and prop-2-yn-1-ol (6.23 g, 111 mmol, 6.56 mL, 1.24 eq) at 0 ℃. The mixture was stirred at 25 ℃ for 1.5 hrs. TLC (Petroleum ether  / Ethyl acetate = 5: 1, Product Rf = 0.5) showed the reactant 1 was completed and a main spot was formed. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with DCM (80 mL, 50 mL, 30 mL) , The combined organic layers were washed with brine 30 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 1: 0 to 50: 1) to give a prop-2-yn-1-yl 8-bromooctanoate (21.5 g, 82.3 mmol, 91.8%yield) as a transparent oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.68 (d, J = 2.4 Hz, 2H) , 3.40 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.47 (t, J = 2.4 Hz, 1H) , 2.36 (t, J =7.6 Hz, 2H) , 1.82-1.89 (m, 2H) , 1.61-1.69 (m, 2H) , 1.40-1.47 (m, 2H) , 1.32-1.35 (m, 4H) .

[0289] To a solution of prop-2-yn-1-yl 8-bromooctanoate (10.0 g, 38.2 mmol, 1.00 eq) in dioxane (70 mL) was added heptane-1-thiol (15.9 g, 119 mmol, 18.8 mL, 3.13 eq) at 25 ℃, then the solution was stirred at 100 ℃ for 1 h, AIBN (629 mg, 3.83 mmol, 0.10 eq) was added the mixture and stirred at 100℃ for 12 hrs. TLC (Petroleum ether : Ethyl acetate = 5: 1, product Rf = 0.6) showed the reactant 1 was completed and a main spot was formed. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 1 / 0 to 10: 1) to give a 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8-bromooctanoate (18.0 g, 34.2 mmol, 89.4%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.28 (dd, J = 5.2 , 11.2 Hz, 1H) , 4.17 (dd, J = 6.4 , 11.6 Hz, 1H) , 3.33 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.89-2.96 (m, 1H) , 2.71 (d, J = 6.8 Hz, 2H) ,  2.46-2.56 (m, 4H) , 2.26 (t, J=7.6 Hz, 2H) , 1.75-1.82 (m, 2H) , 1.48-1.61 (m, 9H) , 1.17-1.41 (m, 24H) , 0.82 (t, J = 6.4 Hz, 6H) .

[0290] Synthesis of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0291] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8-bromooctanoate (8.00 g, 15.2 mmol, 1.00 eq) in MeCN (56 mL) was added 2-aminoethanol (2.79 g, 45.6 mmol, 2.76 mL, 3.00 eq) . The mixture was stirred at 85 ℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane: Methanol = 5; 1, Product Rf (P1) = 0.1, Product Rf (P2) = 0.39 ) indicated 10%of Reactant 1 was remained, and one major new spot with larger polarity was detected. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (300 mL, 200 mL, 100 mL) , The combined organic layers were washed with brine 30 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate to Dichloromethane: Methanol =20 / 1 to 1 / 1) to give a 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (3.5 g, 6.92 mmol, 45.4%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 5.2 , 11.2 Hz, 1H) , 4.24 (dd, J = 6.4 , 11.2 Hz, 1H) , 3.65 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.97-3.03 (m, 1H) , 2.76-2.83 (m, 4H) , 2.54-2.65 (m, 6H) , 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.24 (s, 2H) , 1.56-1.65 (m, 6H) , 1.45-1.51 (m, 2H) , 1.28-1.43 (m, 23H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 6H) .

[0292] Synthesis of Compound 25

[0293] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (600 mg, 1.19 mmol, 1.00 eq) in EtOH (6 mL) was added undecyl 6-bromohexanoate (497 mg, 1.42 mmol, 1.20 eq) and DIEA (307 mg, 2.37 mmol, 413 uL, 2.00 eq) . The mixture was stirred at 85℃ for 12 hrs. LC-MS (Product Rt = 0.752, MS+1 = 774.6) showed Reactant 1 was consumed completely and one main peak with desired mass was detected. The reaction mixture was poured into water (20 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine 15 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a  residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 20 / 1 to 0 / 1) to give a Compound 25 (180 mg, 232 umol, 19.6%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 5.2 , 11.2 Hz, 1H) , 4.24 (dd, J = 6.4 , 11.2 Hz, 1H) , 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.53 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 2.97-3.04 (m, 1H) , 2.76-2.84 (m, 2H) , 2.54-2.64 (m, 6H) , 2.44-2.51 (m, 4H) , 2.29-2.35 (m, 4H) , 1.56-1.68 (m, 10H) , 1.21-1.51 (m, 44H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 9H) .

[0294] Compound 26: 2- ( (8- (2, 3-bis (heptylthio) propoxy) -8-oxooctyl) (3- (dimethylamino) propyl) amino) ethyl (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dienoate

[0295] Synthesis of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8- ( (3- (dimethylamino) propyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0296] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8-bromooctanoate (2.00 g, 3.80 mmol, 1.00 eq) in MeCN (14 mL) was added N', N'-dimethylpropane-1, 3-diamine (1.17 g, 11.4 mmol, 1.43 mL, 3.00 eq) . The mixture was stirred at 90 ℃ for 1h. The reaction was added water (30 mL) and the reaction was extracted with DCM (50 mL, 30 mL) . The organic phase was separated, washed with brine 15 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a 2, 3-bis(heptylthio) propyl 8- ( (3- (dimethylamino) propyl) amino) octanoate (1.5 g, crude) as a yellow oil.

[0297] To a solution of 2- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) acetaldehyde (191 mg, 1.10 mmol, 209 uL, 1.20 eq) and 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8- ( (3- (dimethylamino) propyl) amino) octanoate (500 mg, 914 umol, 1.00 eq) in DCM (5 mL) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 30 mins, was added (CH3COO) 3BHNa (387 mg, 1.83 mmol, 2.00 eq) . The mixture was stirred at 25℃ for 12 hrs. The reaction was added water (10 mL) and the reaction was extracted with EtOAc (50 mL、30 mL) . The organic phase was separated, washed with brine 5 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8- ( (2- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) ethyl) (3- (dimethylamino) propyl) amino) octanoate (800 mg, crude) as a yellow oil.

[0298] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8- ( (2- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) ethyl) (3- (dimethylamino) propyl) amino) octanoate (800 mg, 1.13 mmol, 1.00 eq) in TBAF (1.00 M, 4.54 mL, 4.00 eq) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 12 hrs. The reaction mixture was poured into water (20  mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 15 mL) , The combined organic layers were washed with brine 20 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8- ( (3- (dimethylamino) propyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (900 mg, crude) as a yellow oil.

[0299] Synthesis of Compound 26

[0300] To a solution of compound 77-4-3 (900 mg, 1.52 mmol, 1.00 eq) in DCM (9 mL) was added (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dienoic acid (512 mg, 1.83 mmol, 512 uL, 1.20 eq) , EDCI (438 mg, 2.28 mmol, 1.50 eq) and DMAP (37.2 mg, 304 umol, 0.20 eq) at 0 ℃. The mixture was stirred at 25 ℃ for 3 hrs. LC-MS (product Rt = 0.692, MS+1 = 853.7) showed several new peaks were shown on LC-MS and 10%of desired compound was detected. The reaction was added water (10 mL) and the reaction was extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL) . The organic phase was separated, washed with brine 5 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate to DCM: MeOH = 0 / 1 to 0 / 1) to give a residue. The residue was purified by prep-HPLC (column: Welch Xtimate C1 100*30mm*5um; mobile phase: [water (TFA) -ACN] ; B%: 65%-85%, 8min) to give a Compound 26 (TFA) . The PH value of the aqueous phase was adjusted to around 8-9 with NaHCO3. The reaction was extracted with EtOAc (50 mL、30 mL) phase was separated, washed with brine 5 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a Compound 26 (70 mg, 83.2 umol, 5.46%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.30-5.41 (m, 4H) , 4.35 (dd, J = 5.2 , 11.2 Hz, 1H) , 4.24 (dd, J = 6.4 , 11.2 Hz, 1H) , 4.12 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.97-3.04 (m, 1H) , 2.76-2.80 (m, 4H) , 2.68 (t, J = 6.0 Hz, 2H) , 2.43-2.63 (m, 9H) , 2.25-2.35 (m, 11H) , 2.03-2.08 (m, 4H) , 1.56-1.63 (m, 11H) , 1.29-1.46 (m, 40H) , 0.88-0.90 (m, 9H) .

[0301] Compound 27: 2- ( (8- (2, 3-bis (heptylthio) propoxy) -8-oxooctyl) (2-hydroxyethyl) amino) ethyl (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dienoate

[0302] Synthesis of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8- (bis (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0303] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (1.00 g, 1.98 mmol, 1.00 eq) in MeCN (7 mL) was added K2CO3 (546 mg, 3.95 mmol, 2.00 eq) and 2-bromoethanol (741 mg, 5.93 mmol, 421 uL, 3.00 eq) . The mixture was stirred at 90 ℃ for 12 h. LC-MS (product Rt = 0.486, MS+1 = 550.5) showed Reactant 1 was consumed completely and one main peak with desired mass was detected. The reaction mixture was poured into water (20 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 15 mL) , The combined organic layers were washed with brine 20 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8- (bis (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (1.20 g, crude) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.53 (s, 2H) , 4.35 (dd, J = 5.2 , 11.2 Hz, 1H) , 4.24 (dd, J = 6.4 , 11.2 Hz, 1H) , 3.63 (t, J = 6.0 Hz, 3H) , 2.97-3.03 (m, 1H) , 2.79 (dd, J = 1.6 , 6.8 Hz, 2H) , 2.67 (t, J = 5.6 Hz, 3H) , 2.52-2.62 (m, 6H) , 2.33 (t, J =7.6 Hz, 2H) , 1.56-1.65 (m, 7H) , 1.28-1.49 (m, 25H) , 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 6H) .

[0304] Synthesis of Compound 27

[0305] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8- (bis (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (600 mg, 1.09 mmol, 1.00 eq) in DCM (6 mL) was added (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dienoic acid (367 mg, 1.31 mmol, 367 uL, 1.20 eq) , EDCI (314 mg, 1.64 mmol, 1.50 eq) and DMAP (26.7 mg, 218 umol, 0.20 eq) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 3 hrs. LC-MS (ET49811-212-P1A1, product Rt = 0.790, MS+1 = 812.6) showed Reactant 1 was consumed completely and one main peak with desired mass was detected. The reaction mixture was poured into water (30 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL) , The combined organic layers were washed with brine 20 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 20 / 1 to 0 / 1) to give a Compound 27 (200 mg, 246 umol, 22.5%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.30-5.42 (m, 4H) , 4.35 (dd, J = 5.2 , 11.2 Hz, 1H) , 4.24 (dd, J = 6.4 , 11.2 Hz, 1H) , 4.14 (t, J = 6.0 Hz, 2H) , 3.55 (t, J = 4.4 Hz, 2H) ,  2.97-3.03 (m, 1H) , 2.76-2.84 (m, 6H) , 2.50-2.66 (m, 8) , 2.30-2.35 (m, 4H) , 2.03-2.08 (m, 4H) , 1.56-1.63 (m, 10H) , 1.27-1.45 (m, 41H) , 0.89 (t, J = 3.6 Hz, 9H) .

[0306] Compound 28: bis (2, 3-bis (heptylthio) propyl) 6, 6'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) dihexanoate

[0307] Synthesis of Compound 28

[0308] To a solution of 2-aminoethan-1-ol (1.84 g, 30.2 mmol, 1.82 mL, 3.0 eq) and 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6-bromohexanoate (5 g, 10.1 mmol, 1.0 eq) in MeCN (35 mL) at 25 ℃, then the mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 7 / 1, product Rf = 0.20) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine (20 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to Dichloromethane / Methanol = 5 / 1) to give 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (2.6 g, 5.44 mmol, 54.1%yield) as a yellow oil and Compound 28 (0.51 g, 570 umol, 5.67%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.34 (dd, J = 4.8, 11.2 Hz, 1H) , 4.24 (dd, J = 6.4, 11.2 Hz, 1H) , 3.69 (t, J = 4.4 Hz, 2H) , 2.96-3.03 (m, 2H) , 2.77-2.84 (m, 4H) , 2.69 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.53-2.62 (m, 4H) , 2.34 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.54-1.70 (m, 8H) , 1.27-1.43 (m, 19H) , 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 6H) .

[0309] Compound 29: bis (2, 3-bis (heptylthio) propyl) 6, 6'- ( (3-hydroxypropyl) azanediyl) dihexanoate

[0310] Synthesis of Compound 29

[0311] To a solution of 3-aminopropan-1-ol (4.83 g, 64.3 mmol, 4.96 mL, 8.0 eq) and 2, 3-bis (heptylthio) propyl 6-bromohexanoate (4 g, 8.04 mmol, 1.0 eq) in EtOH (20 mL) and MeCN (20 mL) at 25℃, then the mixture was stirred at 60℃ for 4 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 7 / 1, product Rf1 = 0.20, Rf2 = 0.52) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (30 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine (20 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to Dichloromethane / Methanol = 5 / 1) to give compound 29 (0.17 g, 187 umol, 2.33%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 4.8, 11.2 Hz, 2H) , 4.24 (dd, J = 5.4, 11.2 Hz, 2H) , 3.79 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.97-3.03 (m, 2H) , 2.78 (d, J = 6.8 Hz, 4H) , 2.54-2.67 (m, 10H) , 2.33-2.44 (m, 6H) , 1.46-1.70 (m, 20H) , 1.28-1.39 (m, 38H) , 0.90 (t, J = 6.4 Hz, 9H) .

[0312] Compound 30: bis (2, 3-bis (heptylthio) propyl) 6, 6'- ( (3- (dimethylamino) propyl) azanediyl) dihexanoate

[0313] Synthesis of Compound 30

[0314] To a solution of compound 29 (150 mg, 165umol, 1.0 eq) in DCM (5 mL) was added TEA (66.8 mg, 660 umol, 91.9 uL, 4.0 eq) at 0℃, then TosCl (62.9 mg, 330 umol, 2.0 eq) was added the reaction solution at 0℃, the mixture was stirred at 25℃ for 12 hrs. LCMS (ET50202-252-P1A, product: RT = 0.891 min) showed the starting material was consumed completely. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with DCM (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give bis (2, 3-bis (heptylthio) propyl) 6, 6'- ( (3-chloropropyl) azanediyl) dihexanoate (240 mg, crude) as a colorless oil.

[0315] To a solution of bis (2, 3-bis (heptylthio) propyl) 6, 6'- ( (3-chloropropyl) azanediyl) dihexanoate (240 mg, 259 umol, 1.0 eq) and NaI (19.4 mg, 129 umol, 0.5 eq) in THF (5 mL) was added N-methylmethanamine (2 M, 647 uL, 5 eq) at 25℃, then the mixture was stirred 80℃ for 36 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 5 / 1) showed a trace amount of bis (2, 3-bis (heptylthio) propyl) 6, 6'- ( (3- chloropropyl) azanediyl) dihexanoate (Rf = 0.65) remained and a main spot (desired Rf = 0.19) was formed. The reaction mixture concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=10 / 1 to THF / MeOH = 5 / 1) to give Compound 30 (180 mg, 192 umol, 74.3%yield) as a yellow oil. 1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.34 (dd, J = 5.2, 11.6 Hz, 2H) , 4.25 (dd, J = 6.4, 11.2 Hz, 2H) , 2.97-2.79 (m, 2H) , 2.78 (d, J = 6.8 Hz, 6H) , 2.54-2.66 (m, 13H) , 2.43 (s, 4H) , 2.36 (t, J = 7.6 Hz, 4H) , 1.89 (brs, 3H) , 1.55-1.71 (m, 16H) , 1.28-1.40 (m, 37H) , 0.86-0.91 (m, 12H) .

[0316] Compound 31: bis (2, 3-bis (octylthio) propyl) 6, 6'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) dihexanoate

[0317] To a solution of 2-aminoethan-1-ol (1.74 g, 28.5 mmol, 1.73 mL, 3.0 eq) and 2, 3-bis (octylthio) propyl 6-bromohexanoate (5.0 g, 9.51 mmol, 1.0 eq) in MeCN (35 mL) at 25 ℃, then the mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 7 / 1, desired Rf = 0.20) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine (20 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to Dichloromethane / Methanol = 5 / 1) to give 2, 3-bis (octylthio) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (2.6 g, 5.14 mmol, 54.0%yield) as a yellow oil and Compound 31 (0.49 g, 515 umol, 5.42%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 5.2, 11.2 Hz, 2H) , 4.25 (dd, J = 6.4, 11.6 Hz, 2H) , 3.53 (t, J = 5.6 Hz, 2H) , 2.97-3.03 (m, 2H) , 2.78 (d, J = 6.8 Hz, 4H) , 2.54-2.62 (m, 10H) , 2.45 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 2.34 (t, J = 7.6 Hz, 4H) , 1.55-1.69 (m, 14H) , 1.28-1.50 (m, 51H) , 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 12H) .

[0318] Compound 32: bis (2, 3-bis ( ( (2E, 6Z) -nona-2, 6-dien-1-yl) thio) propyl) 6, 6'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) dihexanoate

[0319] Compound 32 was prepared analogously to compound 28 starting with (2E, 6Z) -nona-2, 6-diene-1-thiol. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 5.40-5.78 (m, 16H) , 4.34 (dd, J = 5.0, 11.6 Hz, 2H) , 4.25 (dd, J = 6.4, 11.6 Hz, 2H) , 3.57 (t, J = 5.6 Hz, 2H) , 3.10-3.45 (m, 8H) , 2.95-3.04 (m, 2H) , 2.78-2.88 (m, 4H) , 2.51-2.63 (m, 5H) , 2.34 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 1.55-1.69 (m, 26H) , 1.28-1.50 (m, 12H) , 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 12H) .

[0320] Compound 33: bis (2, 3-bis (heptylthio) propyl) 7, 7'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) diheptanoate

[0321] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7-bromoheptanoate (5.0 g, 9.77 mmol, 1.0 eq) and 2-aminoethanol (1.79 g, 29.3 mmol, 1.77 mL, 3.0 eq) in MeCN (32.5 mL) at 25℃, then the mixture was stirred at 90 ℃ for 4 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate=10: 1, start material: Rf=0.51; Dichloromethane: Methanol=10: 1, product: Rf= 0.05) indicated the 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7-bromoheptanoate was consumed completely. The residue was diluted with water (50.0 mL) and extracted with EtOAc (30.0 mL) . The combined organic layers were washed with brine (20.0*2 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH = 60: 1 to DCM: MeOH = 10: 1) . Compound 33 (500 mg, 542 umol, 5.55%yield, 100%purity) and 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate (1.20 g, 2.44 mmol, 25.0%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.35 (m, 2 H) , 4.24 (m, 2 H) , 3.52 (t, J = 5.2 Hz, 2 H) , 2.98 -3.01 (m, 2  H) , 2.76 -2.81 (m, 4 H) , 2.53 -2.62 (m, 10 H) , 2.42 -2.46 (m, 4 H) , 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 4 H) 1.55 -1.67 (m, 13 H) 1.28 -1.48 (m, 45 H) 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 12 H) .

[0322] Compound 34: bis (2, 3-bis (heptylthio) propyl) 7, 7'- ( (3-hydroxypropyl) azanediyl) diheptanoate

[0323] Synthesis of Compound 34

[0324] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7-bromoheptanoate (3.00 g, 5.86 mmol, 1.0 eq) in EtOH (30.0 mL) was added 3-aminopropan-1-ol (4.40 g, 58.6 mmol, 4.52 mL, 10 eq) . The reaction was stirred at 50 ℃ for 2.5 h. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate=10: 1, start material: Rf=0.51; Dichloromethane: Methanol, product: Rf= 0.07) indicated the 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7-bromoheptanoate was consumed completely. The residue was diluted with water (100 mL) and extracted with Ethyl acetate (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL*2) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH = 15: 1 to 1 / 1) . Compound 34 (0.2 g, 214 umol, 3.64%yield) and 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (3-hydroxypropyl) amino) heptanoate (2.0 g, 3.95 mmol, 67.4%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.33 -4.37 (m, 2 H) , 4.22 -4.26 (m, 2 H) , 3.80 (br t, J = 5.2 Hz, 2 H) , 2.97 -3.02 (m, 2 H) , 2.76 -2.83 (m, 5 H) , 2.54 -2.69 (m, 10 H) , 2.32 -2.50 (m, 7 H) , 1.43 -1.69 (m, 22 H) , 1.28 -1.39 (m, 42 H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 12 H) .

[0325] Compound 35: bis (2, 3-bis (heptylthio) propyl) 7, 7'- ( (3- (dimethylamino) propyl) azanediyl) diheptanoate

[0326] To a solution of Compound 34 (500 mg, 533 umol, 1.0 eq) in DCM (5.0 mL) was added TEA (216 mg, 2.14 mmol, 297 uL, 4.0 eq) . Then TosCl (203 mg, 1.07 mmol, 2.0 eq) was added at 0 ℃. The reaction was stirred at 20 ℃ for 12 h. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate=10: 1, start material: Rf=0.37; product: Rf=0.65) indicated the Compound 34 was consumed completely. The residue was diluted with water (10.0 mL) and extracted with DCM (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH=80 / 1 to 60 / 1) . bis (2, 3-bis (heptylthio) propyl) 7, 7'- ( (3-chloropropyl) azanediyl) diheptanoate (0.40 g, 419 umol, 78.4%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.33 -4.37 (m, 2 H) , 4.22 -4.26 (m, 2 H) , 3.60 (t, J = 6.4 Hz, 2 H) , 2.98 -3.01 (m, 2 H) , 2.78 -2.80 (m, 4 H) , 2.52 -2.62 (m, 10 H) , 2.32 -2.38 (m, 8 H) , 1.77 -1.96 (s, 4 H) , 1.55 -1.67 (m, 21 H) , 1.28 -1.39 (m, 47 H) , 0.87 -0.90 (m, 12 H) .

[0327] To a solution of bis (2, 3-bis (heptylthio) propyl) 7, 7'- ( (3-chloropropyl) azanediyl) diheptanoate (200 mg, 209 umol, 1.0 eq) in THF (1.00 mL) was added NaI (15.7 mg, 105 umol, 0.5 eq) and N-methylmethanamine (2 M, 524 uL, 5.0 eq) . The mixture was stirred at 70 ℃ for 168 hrs. LCMS (ET49878-321-p1a1, product: RT=2.694 min) showed the starting material was consumed completely. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to remove solvent. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH=1 / 1 to 60 / 1) . Compound 35 (100 mg, 104 umol, 49.6%yield) was obtained as brown oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.32 -4.37 (m, 2 H) 4.22 -4.27 (m, 2 H) 3.33 (s, 1 H) 2.95 -3.01 (m, 4 H) 2.74 -2.85 (m, 8 H) 2.50 -2.63 (m, 11 H) 2.32 -2.37 (m, 4 H) 2.0 -2.2 (m, 2 H) 1.55 -1.69 (m, 15 H) 1.16 -1.37 (m, 41 H) 0.83 -0.90 (m, 12 H) .

[0328] Compound 36: bis (2, 3-bis ( (5-methylhexyl) thio) propyl) 7, 7'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) diheptanoate

[0329] Synthesis of 5-methylhexane-1-thiol

[0330] To a solution of 1-bromo-5-methylhexane (30.0 g, 168 mmol) in acetone (500 mL) was added potassium ethanethioate (21.1 g, 185 mmol) and stirred at 20 ℃ for 12 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 1: 0) indicated Reactant 1 was consumed completely and one new spot formed. The reaction was added H2O (300 mL) , extracted with CH2Cl2 (200 mL x 2) . The combined organic phase was washed with brine, dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum to give yellow oil (30.8 g) , used into second step. To the yellow oil (25.8 g, 148 mmol, 1 eq) in MeOH (250 mL) was added aq. NaOH (148 mmol, 25 mL, 20%purity) and stirred at 20 ℃ for 2 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 1: 0) indicated starting material was consumed completely. The reaction was extracted with petroleum ether (200 mL x 3) . The combined organic phase was washed with brine, dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 120 g Silica Flash Column, Eluent of 0～0%Ethyl acetate / Petroleum ether gradient @65 mL / min) to give 5-methylhexane-1-thiol (15.8 g, 119 mmol, 80.70%yield) as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) . δ 2.53 (q, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.47-1.67 (m, 3H) , 1.28-1.44 (m, 3H) , 1.13-1.22 (m, 2H) , 0.87 (d, J = 6.4 Hz, 6H)

[0331] Synthesis of 2, 3-bis ( (5-methylhexyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate

[0332] To a solution of 5-methylhexane-1-thiol (10.0 g, 75.6 mmol) in dioxane (40 mL) was added prop-2-yn-1-yl 7-bromoheptanoate (6.00 g, 24.3 mmol) and stirred at 25 ℃ for 1 hr. Then the reaction was added AIBN (798 mg, 4.86 mmol) and stirred for another 3 hrs at 100 ℃. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 20: 1) indicated prop-2-yn-1-yl 7-bromoheptanoate was consumed completely. The reaction was diluted with CH2Cl2 (50 mL) , washed with brine, dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 40+20 g Silica Flash Column, Eluent of 0～5%Ethyl acetate / Petroleum ether gradient @45 mL / min) to give 2, 3-bis ( (5-methylhexyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate (9.75 g, 19.1 mmol, 78.5%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) . δ 4.31-4.39 (m, 1H) , 4.20-4.29 (m, 1H) , 3.40 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.94-3.05 (m, 1H) , 2.78 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.51-2.64 (m, 4H) , 2.34 (t, J = 7.6 Hz, 2H) ,  1.73-1.92 (m, 2H) , 1.61-1.69 (m, 2H) , 1.50-1.60 (m, 6H) , 1.43-1.50 (m, 2H) , 1.33-1.43 (m, 6H) , 1.12-1.23 (m, 4H) , 0.87 (d, J = 6.4 Hz, 12H) .

[0333] Synthesis of 2, 3-bis ( (5-methylhexyl) thio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate

[0334] A solution of 2, 3-bis ( (5-methylhexyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate (3.00 g, 5.86 mmol) and 2-aminoethanol (10.7 g, 176 mmol) in EtOH (21 mL) was stirred at 75 ℃ for 2 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 10: 1) indicated 2, 3-bis ( (5-methylhexyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate was consumed completely. The reaction was diluted EtOAc (30 mL) , washed with water (10 mL x 3) , dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 20 g Silica Flash Column, Eluent of 0～15%MeOH / CH2Cl2 gradient @30 mL / min) to give 2, 3-bis ( (5-methylhexyl) thio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate (1.50 g, 3.05 mmol, 52.0%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.30-4.38 (m, 1H) , 4.20-4.28 (m, 1H) , 3.60-3.68 (m, 2H) , 2.94-3.04 (m, 1H) , 2.75-2.81 (m, 4H) , 2.52-2.66 (m, 6H) , 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.04 (s, 2H) , 1.47-1.68 (m, 10H) , 1.32-1.42 (m, 8H) , 1.15-1.21 (m, 4H) , 0.86 (d, J = 6.4 Hz, 12H) .

[0335] Synthesis of Compound 36

[0336] A solution of 2, 3-bis ( (5-methylhexyl) thio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate (700 mg, 1.42 mmol) , DIEA (0.5 mL, 2.87 mmol) and 2, 3-bis ( (5-methylhexyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate (1.09 g, 2.13 mmol) in EtOH (7 mL) was stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane: Methanol = 10: 1) indicated one new spot was detected. The reaction was concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g  Silica Flash Column, Eluent of 0～5%MeOH / CH2Cl2 gradient @18 mL / min) to give compound 36 (550 mg, 575 μmol, 40.4%yield, 96.3%purity) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.31-4.39 (m, 2H) , 4.19-4.29 (m, 2H) , 3.50-3.64 (m, 2H) , 2.95-3.04 (m, 2H) , 2.75-2.81 (m, 4H) , 2.45-2.67 (m, 13H) , 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 4H) , 1.45-1.68 (m, 21H) , 1.25-1.42 (m, 17H) , 1.14-1.21 (m, 8H) , 0.87 (d, J = 6.8 Hz, 24H) .

[0337] Compound 37: 2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propyl 8- ( (7- (2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propoxy) -7-oxoheptyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0338] Compound 37 was prepared using similar procedure as Compound 36 but using 3-butylheptane-1-thiol. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.31-4.37 (m, 2H) , 4.21-4.26 (m, 2H) , 3.70 (br s, 2H) , 2.92-3.04 (m, 2H) , 2.75-2.81 (m, 4H) , 2.45-2.67 (m, 13H) , 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 4H) , 1.22-1.69 (m, 80H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 24H) .

[0339] Compound 38: bis (2, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) thio) propyl) 7, 7'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) diheptanoate

[0340] A mixture of 2, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) thio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate (500 mg, 868 μmol) , 2, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate (776 mg, 1.30 mmol) and DIEA (225 mg, 1.74 mmol) in EtOH (5 mL) was added and stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC  (CH2Cl2: MeOH = 10: 1) indicated one new spot formed. The reaction was diluted with EtOAc (20 mL) , then washed with brine, dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4+4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～5%MeOH / CH2Cl2 gradient @20 mL / min) to give compound 38 (300 mg, 274 μmol, 31.6%yield, 99.6%purity) as light yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.31-4.39 (m, 2H) , 4.20-4.29 (m, 2H) , 3.56-3.78 (m, 2H) , 2.95-3.04 (m, 2H) , 2.43-2.85 (m, 18H) , 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 4H) , 1.48-1.66 (m, 19H) , 1.21-1.45 (m, 25H) , 1.06-1.17 (m, 12H) , 0.82-0.93 (m, 36H) .

[0341] Compound 39: bis (2, 3-bis (pentylthio) propyl) 8, 8'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) dioctanoate

[0342] Synthesis of Compound 39

[0343] To a solution of 2, 3-bis (pentylthio) propyl 8-bromooctanoate (1.2 g, 2.56 mmol, 2.23 eq) in EtOH (10 mL) was added DIEA (296 mg, 2.29 mmol, 399 uL, 2.0 eq) and 2-aminoethanol (70 mg, 1.15 mmol, 69.3 uL, 1.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane / Methanol = 10 / 1, product Rf = 0.40) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=10 / 1 to THF / EtOH = 5 / 1) to give Compound 39 (234 mg, 279 umol, 24.3%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 5.2, 11.6 Hz, 2H) , 4.24 (dd, J = 6.4, 11.2 Hz, 2H) , 3.59 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 2.97-3.05 (m, 2H) , 2.78-2.80 (m, 4H) , 2.50-2.65 (m, 14 H) , 2.33 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 1.56-1.65 (m, 14H) , 1.48 (brs, 5H) , 1.32-1.39 (m, 30H) , 0.90 (t, J =7.2 Hz, 12H) .

[0344] Compound 40: bis (2, 3-bis (heptylthio) propyl) 8, 8'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) dioctanoate

[0345] Synthesis of Compound 40

[0346] To a solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8-bromooctanoate (8.00 g, 15.2 mmol, 1.00 eq) in MeCN (56 mL) was added 2-aminoethanol (2.79 g, 45.6 mmol, 2.76 mL, 3.00 eq) . The mixture was stirred at 85 ℃ for 12 hrs. TLC (Dichloromethane : Methanol = 5; 1, Product Rf (P1) = 0.1, Product Rf (P2) = 0.39 ) indicated 10%of Reactant 1 was remained, and one major new spot with larger polarity was detected. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (300 mL, 200 mL, 100 mL) , The combined organic layers were washed with brine 30 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate to Dichloromethane: Methanol =20 / 1 to 1 / 1) to give a 2, 3-bis (heptylthio) propyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (3.5 g, 6.92 mmol, 45.4%yield) and Compound 40 (520 mg, 547 umol, 3.59%yield) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.35 (dd, J = 5.2 , 11.6 Hz, 2H) , 4.24 (dd, J = 6.4 , 11.6 Hz, 2H) , 3.55 (s, 2H) , 2.97-3.04 (m, 2H) , 2.75-2.83 (m, 4H) , 2.54-2.63 (m, 10H) , 2.46 (s, 3H) , 2.34 (t, J = 7.6 Hz, 4H) , 1.56-1.65 (m, 13H) , 1.28-1.45 (m, 49H) , 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 12H) .

[0347] Compound 41: 3-butylheptyl 8- ( (7- (2, 3-bis (heptylthio) propoxy) -7-oxoheptyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0348] A solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate (500 mg, 1.02 mmol) , 3-butylheptyl 8-bromooctanoate (576 mg, 1.52 mmol) and DIEA (263 mg, 2.03 mmol) in EtOH (5.00 mL) was stirred at 75 ℃ for 16 hrs. TLC (Dichloromethane: Methanol = 10: 1) indicated the starting material was consumed completed. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue, which was purified by column chromatography (SiO2, Dichloromethane:  Methanol = 1 / 0 to 100 / 15) to give compound 41 (350 mg, 42.7%yield) as light yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.23-4.36 (m, 2H) , 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.85 (br s, 2H) , 2.65-3.17 (m, 9H) , 2.54-2.61 (m, 4H) , 2.29-2.39 (m, 4H) , 1.45-1.78 (m, 13H) , 1.26-1.43 (m, 40H) , 0.87-0.90 (m, 12H)

[0349] Compound 42: 2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propyl 7- ( (7- (2, 3-bis (heptylthio) propoxy) -7-oxoheptyl) (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate

[0350] A solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 7- ( (2-hydroxyethyl) amino) heptanoate (400 mg, 813 μmol) and 2, 3-bis ( (3-butylheptyl) thio) propyl 7-bromoheptanoate (609 mg, 976 μmol) and DIEA (210 mg, 1.63 mmol) in EtOH (10.0 mL) was stirred at 90 ℃ for 12 hrs. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10: 1) indicated the starting material was consumed completely. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, CH2Cl2: MeOH = 1 / 0 to 100 / 15) to give the title compound 42 (300 mg, 34.4%yield, 96.4%purity) as light brown oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.23-4.38 (m, 4H) , 3.97 (s, 1H) , 3.12 (s, 2H) , 3.00-3.02 (m, 4H) , 2.79 (dd, J = 6.4, 3.6 Hz, 4H) , 2.53-2.62 (m, 8H) , 2.35 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 1.81-1.86 (m, 4H) , 1.51-1.67 (m, 14 H) , 1.25-1.40 (m, 52 H) , 0.87 -0.92 (m, 18 H)

[0351] Compound 43: bis (2, 3-bis (heptylthio) propyl) 3, 3'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) dipropionate

[0352] Synthesis of prop-2-yn-1-yl 3-bromopropanoate

[0353] To a mixture of 3-bromopropanoic acid (40.0 g, 261 mmol) and prop-2-yn-1-ol (18.5 g, 330 mmol) in CH2Cl2 (250 mL) was added EDCI (60.8 g, 317 mmol) and DMAP (4.80 g, 39.3 mmol) at 0 ℃, then stirred at 20 ℃ for 3 hrs under N2. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 10: 1) indicated  3-bromopropanoic acid was consumed completely. The reaction was washed with H2O (100 mL x 3) , dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 80 g Silica Flash Column, Eluent of 0～10%Ethyl acetate / Petroleum ether gradient @80 mL / min) to give prop-2-yn-1-yl 3-bromopropanoate (3.66 g, 19.2 mmol, 7.33%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.74 (d, J = 2.4 Hz, 2H) , 2.59 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.98 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.50 (d, J = 2.4 Hz, 1H) .

[0354] Synthesis of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 3-bromopropanoate

[0355] To a mixture of prop-2-yn-1-yl 3-bromopropanoate (3.00 g, 15.7 mmol) and heptane-1-thiol (6.59 g, 49.8 mmol) in 1, 4-dioxane (30 mL) was added AIBN (516 mg, 3.14 mmol) at 20 ℃, then the mixture was stirred at 100 ℃ for 13 hrs under N2. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 10: 1) indicated prop-2-yn-1-yl 3-bromopropanoate was consumed completely. The reaction was concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 40 g  Silica Flash Column, Eluent of 0～5%Ethyl acetate / Petroleum ether gradient @30 mL / min) to give 2, 3-bis (heptylthio) propyl 3-bromopropanoate (5.15 g, 11.3 mmol, 72.0%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.25-4.45 (m, 2H) , 3.54-3.80 (m, 2H) , 2.91-3.06 (m, 3H) , 2.75-2.85 (m, 2H) , 2.51-2.64 (m, 4H) , 1.53-1.64 (m, 5H) , 1.25-1.41 (m, 15H) , 0.86-0.90 (m, 6H) .

[0356] Synthesis of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 3- ( (2-hydroxyethyl) amino) propanoate

[0357] A solution of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 3-bromopropanoate (2.50 g, 5.49 mmol) and 2-aminoethan-1-ol (8.60 g, 141 mmol) in EtOH (20 mL) was stirred at 75 ℃ for 2 hrs. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 10: 1) indicated 2, 3-bis (heptylthio) propyl 3-bromopropanoate was consumed completely. The reaction was diluted with EtOAc (100 mL) , washed with brine, then dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 12 g Silica Flash Column, Eluent of 0～10%MeOH  / CH2Cl2 gradient @30 mL / min) to give 2, 3-bis (heptylthio) propyl 3- ( (2-hydroxyethyl) amino) propanoate (1.10  g, 2.52 mmol, 46.0%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.24-4.40 (m, 2H) , 3.63 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.96-3.04 (m, 1H) , 2.93 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.74-2.83 (m, 4H) , 2.51-2.63 (m, 6H) , 1.81-1.91 (m, 2H) , 1.53-1.63 (m, 4H) , 1.23-1.41 (m, 16H) , 0.84-0.93 (m, 6H) .

[0358] Synthesis of Compound 43

[0359] A mixture of 2, 3-bis (heptylthio) propyl 3- ( (2-hydroxyethyl) amino) propanoate (300 mg, 689 μmol) , 2, 3-bis (heptylthio) propyl 3-bromopropanoate (470 mg, 1.03 mmol) and DIEA (0.25 mL, 1.44 mmol) in DMF (5 mL) was stirred at 95 ℃ for 16 hrs. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10: 1) indicated 2, 3-bis (heptylthio) propyl 3- ( (2-hydroxyethyl) amino) propanoate was consumed completely. The reaction was diluted EtOAc (30 mL) , washed with brine, dried with anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated in vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4+4 g  Silica Flash Column, Eluent of 0～3%MeOH / CH2Cl2 gradient @20 mL / min) to give the title compound 43 (230 mg, 284 μmol, 41.2%yield, 99.9%purity) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) . δ 4.25-4.37 (m, 4H) , 3.53-3.64 (m, 2H) , 2.75-3.05 (m, 11H) , 2.47-2.64 (m, 13H) , 1.57-1.63 (m, 6H) , 152-1.55 (m, 3H) , 1.23-1.42 (m, 32H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H) .

[0360] Example 2. Production of Nanoparticle Compositions

[0361] This example exemplifies the production and characterization of lipid nanoparticles comprising the cationic lipid as synthesized in Example 1. Nanoparticles were prepared by mixing aqueous phase which contains RNA with ethanol phase which contains the lipid components. The two phases were mixed by using a microfluidic mixing process with a standard staggered herringbone mixer.

[0362] The ethanol phase was prepared by adding (1) an ionizable cationic lipid, specifically a cationic lipid as prepared in Example 1, (2) a neutral lipid, specifically DSPC, (3) a steroid, specifically cholesterol, and (4) a PEG lipid, specifically DMG-PEG2000 into ethanol. Unless otherwise stated, the ratio of the lipid components was 50: 10: 38.5: 1.5 mol%of ionizable cationic lipid: DSPC: cholesterol: PEG-DMG.

[0363] RNA was dissolved in 50 mM sodium citrate buffer (pH=4) at concentrations of 0.1 mg / mL. The weight ratio of the RNA or DNA molecules to the ionizable cationic lipid was kept at 1: 10.

[0364] The lipid solution (ethanol phase) was injected at 1 mL / min, and aqueous phase was injected at 3 mL / min into the mixer. The volume ratio of the aqueous phase to the ethanol phase was 3: 1.

[0365] After mixed, the solution with LNP were obtained and subsequently processed by dialysis to remove ethanol and achieve buffer exchange. Dialysis was conducted twice against Tris-HCl Solution (20 mM, pH 7.4) at volumes about 2500 times that of the mixed solution using Slide-A-Lyzer cassettes (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, Ill. ) with a molecular weight cutoff of 10 KD at 4 ℃ for 2 h. Then 40%sucrose solution was added and the final nanoparticle solution with 8%sucrose were stored at -80 ℃.

[0366] A Zetasizer Nano ZS (BeNano, Bettersize) were used to determine the particle size and the polydispersity index (PDI) of the nanoparticle compositions in PBS or Tris-HCl.

[0367] Ultraviolet-visible spectroscopy was used to determine the concentration of a therapeutic and / or prophylactic (e.g., RNA) in the nanoparticle compositions. The absorbance spectrum of the solution was recorded. The concentration of the therapeutic and / or prophylactic agent (e.g., RNA) in the nanoparticle compositions was calculated based on the extinction coefficient of the therapeutic and / or prophylactic (e.g., RNA) and on the difference between the absorbance at a wavelength of, for example, 260 nm and the baseline value at a wavelength of, for example, 330 nm.

[0368] A QUANT-ITTM RIBOGREEN RNA assay (Shanghai ShineGene Molecular Biotechnology Co., LTD. ) , was used to evaluate the encapsulation of RNA by the nanoparticle composition. The samples were diluted in TE buffer solution (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4) , and then100 μL of the diluted samples were transferred to a polystyrene 96 well plate. The plate was incubated at a temperature of 40 ℃ for 10 minutes. The RIBOGREEN or PICOGREEN reagent is diluted 1: 200 in TE buffer, and 100 μL of this solution is added to each well. The fluorescence intensity was measured using a microplate reader (Molecular Devices i3max) at an excitation wavelength of, for example, about 488 nm and an emission wavelength of, for example, about 525 nm. The fluorescence values of the reagent blank were subtracted from that of each of the samples and the percentage of free RNA or DNA was determined by dividing the fluorescence intensity of the intact sample (without addition of Triton X-100) by the fluorescence value of the disrupted sample (caused by the addition of Triton X-100) .

[0369] Example 3. Expression of GFP in Cells Induced by Sample Formulations

[0370] This example shows the study of transfection and expression efficiency of the LNPs including the lipid compounds of present application and GFP mRNA (SEQ ID NO: 1) as payload in two cell lines (HEK293 and HepG2) . The LNP formulations were prepared and characterized according to the procedures as described in Example 2.

[0371] The sequence of mRNA coding EGFP (mGFP) is shown as following:

[0372] Two FDA approved cationic lipids, DLin-MC3-DMA (MC3) and SM-102 were also included as references in the study for comparison. MC3 is a current standard in the art and includes about 50 mol%MC3, about 10 mol %DSPC, about 38.5 mol%cholesterol, and about 1.5 mol%PEG-DMG. SM-102 was used in Covid-19 mRNA vaccine.

[0373] Table 1 summarizes particle size and PDI value as determined for the formulations prepared with the lipid compounds of the present application and the two references. As shown in Table 1, the choice of compound according to formula (I) dramatically affected the particle size (e.g., diameter) , and polydispersity index (PDI) of the compositions. The tested LNPs had particle size between approximately 100 nm and 300 nm, polydispersity indices between 0.1 and 0.6, and encapsulation efficiency of about 20-85%, which is ideal for RNA delivery.

[0374] Table 1. Characteristics of nanoparticle composition encapsulated mGFP

[0375] HEK293 and HepG2 cells were placed at a density of 5x105 cells in tissue culture 24-well plates with 1 mL of Eagle's Minimum Essential Medium. LNPs containing a total amount of 500 ng, 1000 ng and 2000 ng GFP mRNA were added to the wells respectively and cultured for 6 h. Cells were analyzed by flow cytometry to measure GFP fluorescence intensity to determine the expression level. Data were presented as expression level relative to MC3 LNP at the same concentration. The results are shown in Fig. 1 (in HEK293 cells) and Fig. 2 (in HepG2 cells) .

[0376] As shown in Fig. 1 and Fig. 2, LNP composed of compounds (35, 26, 14) achieved higher GFP expression in both cells than MC3. Compounds (1, 31, 33, 34) also exhibited comparable GFP expression levels to MC3.

[0377] Example 4. Expression of hEPO Induced by Sample Formulations in Mice

[0378] To assess potency of expression via the lipids of the present disclosure, the hEPO protein expression level following administration of the nanoparticles of the present disclosure to mice was measured.

[0379] Nanoparticle compositions including cholesterol as a structural lipid, DSPC as helper lipid,  DMP-PEG as PEG lipid, the compound as prepared in Example 1 as cationic lipid, and EPO mRNA (SEQ ID NO: 2) as payload, were prepared according to or via methods similar to those described in

[0380] Example 2. The particle size, PDI value and encapsulation efficiencies were determined and shown in Table 2.

[0381] The sequence of mRNA coding hEPO is shown as following :

[0382] Table 2. Characteristics of nanoparticle composition encapsulated hEPO

[0383] The lipid nanoparticles were intravenously administered to CD-1 mice at a dosage of 0.5 mg / kg. The concentration of hEPO in serum was tested at 6, and 24 h after injection. The fold of hEPO concentration at 6 hours induced by formulations with different lipids relative to MC3 was shown in Table 2 and Fig. 3.

[0384] As Table 2 shows, compounds 8, 22, 34, achieved comparable EPO expression to MC3 in mice after IV injection. According to the result of EPO expression of nanoparticle composition comprising Compound 43, it shows that a relatively short chain of in formula (II) is incapable of achieving a good delivery performance. In preferred embodiments, sum of m and p and sum of n and p selected from 6, 7, 8 and 9 are both needed.

[0385] While preferred embodiments of the present invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. It is not intended that the invention be limited by the specific examples provided within the specification. While the invention has been described with reference to the aforementioned  specification, the descriptions and illustrations of the embodiments herein are not meant to be construed in a limiting sense. Numerous variations, changes, and substitutions will now occur to those skilled in the art without departing from the invention. Furthermore, it shall be understood that all aspects of the invention are not limited to the specific depictions, configurations or relative proportions set forth herein which depend upon a variety of conditions and variables. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed in practicing the invention. It is therefore contemplated that the invention shall also cover any such alternatives, modifications, variations or equivalents. It is intended that the following claims define the scope of the invention and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby.

Claims

1.A lipid having formula (I) , or a salt, tautomer, or stereoisomer thereof, wherein:a) m and n are independently selected from any integer ranging from 3 to 12;b) p is selected from any integer of 1, 2 or 3, and the sum of m and p is selected from any integer ranging from 6 to 9;c) o is selected from any integer ranging from 1 to 6;d) X1 is a bond, -C (O) O-, -OC (O) -, -OC (O) O-, or a biodegradable group;e) R1 is a hydrogen bond donor-containing group or hydrogen bond acceptor-containing group;f) both of R2 are same and selected from C1-C16 alkyl, substituted C1-C16 alkyl, C2-C16 alkenyl, substituted C2-C16 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof;g) R3 is selected from C4-C22 alkyl, substituted C4-C22 alkyl, C4-C22 alkenyl, substituted C4-C22 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof; or R3 is bis-thioether ofwherein both of R4 are same and selected from C1-C16 alkyl, substituted C1-C16 alkyl, C2-C16 alkenyl, substituted C2-C16 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof.2.The lipid according to claim 1, wherein having formula (II) , or a salt, tautomer, or stereoisomer thereof, wherein the sum of n and p is selected from any integer ranging from 6 to 9.3.The lipid according to claim 1 or 2, wherein R1 is selected from hydroxyl, carboxyl, C1-C3 alkylamine, C5-C12 heteroaryl, C5-C12 heteroaryl ketone, C3-C8 heterocycloalkane, C3-C8 heterocycloalkenone, and combinations thereof with a carbonyl group, an amide group, an imide group, a sulfinyl group, a sulfonamido group, or a sulfonamide group.4.The lipid according to claim 3, wherein R1 is selected from one of the following formulas: 5.The lipid according to claim 1, wherein:a) each R2 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains; and / orb) R3 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains.6.The lipid according to claim 2, wherein:a) each R2 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains; and / orb) each R4 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains.7.The lipid according to claim 5 or 6, wherein said carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains is the second or more distant carbon atom counting from the junction.8.The lipid according to any one of claim 5 to 7, wherein said one or two side chains are C1-C4 alkyls.9.The lipid according to claim 5 or 6, wherein each R2, R3 and / or each R4 is independently selected from one of the following formulas: 10.The lipid according to any one of claims 1-9, wherein the lipid is selected from one of the following formulas: 11.A lipid nanoparticle (LNP) comprising the lipid of claims 1-10, a neutral lipid, a PEG lipid and a steroid.12.The LNP according to claim 11, wherein said neutral lipid is disteroylphosphatidylcholine (DSPC) or dioleoyl-phosphatidylethanolamine (DOPE) .13.The LNP according to claim 11 or claim 12, wherein said PEG lipid is PEG-DMG.14.The LNP according to any one of claims 11-13, wherein said steroid is cholesterol, sitosterol or stigmasterol.15.The LNP according to any one of claims 11-14, wherein said lipid is comprised with a molar ratio of about 40%to about 60%, said neutral lipid is comprised with a molar ratio of about 5%to about 20%, said PEG lipid is comprised with a molar ratio of about 0.5%to about 5%, and said steroid is comprised with a molar ratio of about 25%to about 50%.16.The LNP according to claim 15, wherein said lipid is comprised with a molar ratio of about 50%, said neutral lipid is comprised with a molar ratio of about 10%, said PEG lipid is  comprised with a molar ratio of about 1.5%, and said steroid is comprised with a molar ratio of about 38.5%.17.The LNP according to any one of claims 11-16, wherein further comprising a nucleic acid molecule.18.The LNP according to claim 17, wherein said nucleic acid molecule is DNA or RNA.19.The LNP according to claim 17 or 18, wherein said nucleic acid molecule is plasmid DNA or closed-ended DNA (ceDNA) .20.The LNP according to claim 17 or 18, wherein said nucleic acid molecule is selected from a group consisting of messenger RNA (mRNA) , guide RNA (gRNA) , a short interfering RNA (siRNA) , an RNA interference (RNAi) molecule, a microRNA (miRNA) , an antagomir, an antisense RNA, a ribozyme, a small hairpin RNA (shRNA) , or a mixture thereof.21.A pharmaceutical composition comprising the LNP of any one of claims 11-20, and a pharmaceutically acceptable carrier.22.A method of delivering a nucleic acid molecule to a cell in vivo or in vitro, comprising contacting said cell with the LNP of any one of claims 11-20.23.A method of treating or preventing a disease in a subject in need thereof, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of the LNP of any one of claims 11-20, wherein said LNP comprising a nucleic acid molecule having therapeutic activity.24.The method according to claim 23, wherein said LNP is administered by injection.

Images