Methods for producing immune-compatible cells

Abstract

Provided are methods for producing immune-compatible cells. More specifically, provided are methods of disrupting the HLA-A genes and / or HLA-B genes of a cell.

Description

METHODS FOR PRODUCING IMMUNE-COMPATIBLE CELLSCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONSThis application claims benefit of priority from International Patent Application Nos. PCT / CN2024 / 082765 filed on March 20, 2024, and PCT / CN2024 / 095192 filed on May 24, 2024, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.SUBMISSION OF SEQUENCE LISTING ON XML TEXT FILEThe content of the following submission on XML text file is incorporated herein by reference in its entirety: a computer readable form (CRF) of the Sequence Listing (file name: IEC250013PCT-seql. XML, date recorded: March 18, 2025, size: 81 KB) .TECHNICAL FIELD

[0001] This disclosure relates methods for producing immune-compatible cells by disrupting the HLA-A genes and / or HLA-B genes expression, and modified cells produced by the methods described herein.BACKGROUND

[0002] The treatment of many cancers and genetic diseases relies on transplantation approaches such as cell therapy, e.g., Chimeric Antigen Receptor T Cell (CAR-T) therapy and hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) . However, these transplantation approaches are hindered by the alloreactive immune responses triggered by incompatible human leukocyte antigen (HLA) molecules.

[0003] One approach to increase the immune compatibility of the transplanted cells is to reduce expression of HLA genes by gene silencing method, e.g., using clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR-associated protein 9 nuclease (CRISPR / Cas9) . However, there are multiple HLA genes, and even for the same HLA genes, sequence diversity among individuals is large. Thus, it is difficult to determine an appropriate target sequence for gene silencing. Thus, there is a need for an improved method for producing immune-compatible cells.SUMMARY

[0004] This disclosure relates methods for producing immune-compatible cells. More specifically, the disclosure relates to methods to disrupt the HLA-A genes and / or HLA-B genes of a cell by using one or more universal guide RNAs (gRNA) . The methods may involve introducing in the immune cell the universal gRNA and a RNA-guided nuclease or a base editor.

[0005] This disclosure also relates to modified cells produced by the methods described herein. The modified cells may elicit no or reduced host-versus-graft (HvG) response in a histoincompatible individual as compared to the HvG response elicited by a primary T cell isolated from the donor of the starting T cell from which the modified cell is derived.

[0006] The disclosure also relates to methods for designing universal gRNAs that can be used to disrupt the HLA-A genes and / or HLA-B genes of a cell, without the need for determining the HLA-A haplotype and / or the HLA-B haplotype in the cell.

[0007] The disclosure also relates to compositions comprising the universal gRNAs described herein. Such compositions can be used to engineer a starting cell (e.g., donor cell) to increase its immune compatibility, without the need for determining the HLA-A haplotype and / or the HLA-B haplotype in the cell.

[0008] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing a modified cell, comprising disrupting HLA-A gene and / or HLA-B gene of a cell by a universal gRNA and a RNA-guided nuclease or a base editor, wherein the universal gRNA targets a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and / or more than one HLA-B haplotypes.

[0009] In some embodiments, the modified cell has reduced or eliminated HLA-A and / or HLA-B expression.

[0010] In some embodiments, the universal gRNA is not specifically designed based on the HLA-A haplotype and / or the HLA-B haplotype of the cell prior to disruption of HLA-A gene and / or HLA-B gene.

[0011] In some embodiments, the HLA-A haplotype and / or the HLA-B haplotype in the cell is undetermined prior to disruption of HLA-A gene and / or HLA-B gene.

[0012] In some embodiments, the method does not comprise determining the HLA-Ahaplotype and / or the HLA-B haplotype in the cell.

[0013] In some embodiments, the group of HLA-I haplotypes comprises: (i) at least 2338 different HLA-A haplotypes and / or at least 2782 different HLA-B haplotypes; (ii) at least 3897 different HLA-A haplotypes; (iii) at least 4637 different HLA-B haplotypes; or (iv) at least 7339 different HLA-A haplotypes and at least 3483 different HLA-B haplotype.

[0014] In some embodiments, the group of HLA-I haplotypes comprises: (i) at least 30%global HLA-A haplotypes and / or at least 30%global HLA-B haplotypes; (ii) at least 50%global HLA-A haplotypes; (iii) at least 50%global HLA-B haplotypes; or (iv) at least 94%global HLA-A haplotypes and at least 37%global HLA-B haplotypes.

[0015] In some embodiments, haplotypes in the group of HLA-I haplotypes are capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population.

[0016] In some embodiments, the group of HLA-I haplotypes comprises no HLA-C haplotype.

[0017] In some embodiments, the group of HLA-I haplotypes comprises no more than 30%global HLA-C haplotypes.

[0018] In some embodiments, the universal gRNA comprises a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78.

[0019] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing a modified cell , comprising disrupting HLA-A gene and HLA-B gene of a cell through a gene silencing method that targets a nucleotide sequence on HLA gene, optionally wherein the method comprises disrupting HLA-A gene and HLA-B gene of a cell by a first universal gRNA, a second universal gRNA and a RNA-guided nuclease or a base editor, wherein the first universal gRNA targets a group of HLA-A haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes, and wherein the second universal gRNA targets a group of HLA-B haplotypes comprising more than one HLA-B haplotypes.

[0020] In some embodiments, the modified cell has reduced or eliminated HLA-A and HLA-B expression.

[0021] In some embodiments, the first universal gRNA is not specifically designed based on the HLA-A haplotype of the cell prior to disruption of HLA-A gene, and wherein the second universal gRNA is not specifically designed based on the HLA-B haplotype of the cell prior to disruption of HLA-B gene.

[0022] In some embodiments, the HLA-A haplotype and the HLA-B haplotype in the cell is undetermined prior to disruption of HLA-A gene and HLA-B gene.

[0023] In some embodiments, the method does not comprise determining the HLA-Ahaplotype and the HLA-B haplotype in the cell.

[0024] In some embodiments, the group of HLA-A haplotypes comprises at least 3897 different HLA-A haplotypes and the group of HLA-B haplotypes comprises at least 4637 different HLA-B haplotypes.

[0025] In some embodiments, the group of HLA-A haplotypes comprises at least 50%global HLA-A haplotypes, and wherein the group of HLA-B haplotypes comprises at least 50%global HLA-B haplotypes.

[0026] In some embodiments, the group of HLA-A haplotypes are capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 50%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population and / or wherein the group of HLA-B haplotypes are capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 50%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population.

[0027] In some embodiments, the group of HLA-A haplotypes and / or the group of HLA-B haplotypes comprises no HLA-C haplotype.

[0028] In some embodiments, the group of HLA-A haplotypes and / or the group of HLA-B haplotypes comprises no more than 30%global HLA-C haplotypes.

[0029] In some embodiments, the first universal gRNA comprises a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-35 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-35.

[0030] In some embodiments, the second universal gRNA comprises a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78.

[0031] In some embodiments, modified cell expresses HLA-C.

[0032] In some embodiments, the method further comprises reducing or eliminating the expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) in the modified cell.

[0033] In some embodiments, the RNA-guided nuclease is a Cas9 nuclease.

[0034] In some embodiments, the RNA-guided base editor is an inactivated Cas9 nuclease with a cytosine base editor or an adenine base editor.

[0035] In some embodiments, the modified cell is a stem cell, a T cell, a NK cell, a NKT, a NKT-like cell, a cytokine induced killer cell (CIK) , a macrophage, a monocyte, a neutrophil, a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , a cord blood cell, or a hematopoietic stem cell (HSC) .

[0036] In some embodiments, the modified cell expresses an engineered receptor.

[0037] In some embodiments, the engineered receptor is an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , a T cell antigen coupler (TAC) or a portion thereof.

[0038] In some embodiments, the CAR or TCR targets CD19, PSCA, CD123, CD20, CEA (carcinoembryonic antigen) , FAP, CD133, EGFR, EGFRVIII, BCMA, PSMA, Her2, CA125, EphA2, C-met, L1CAM, VEGFR, CS1, ROR1, EC, NY-ESO-1, MUC1, MUC16, mesothelin, LewisY, GPC3, GD2, EPG, DLL3, CD99, 5T4, CD22, CD30, CD33, CD138, or CD171.

[0039] In one aspect, the disclosure is related to a modified cell prepared according to the method described herein.

[0040] In one aspect, the disclosure is related to a modified cell, wherein HLA-A gene and / or HLA-B gene of the modified cell is disrupted using a gene editing system comprising a universal guide RNA (gRNA) and a RNA-guided nuclease or a base editor, wherein the universal gRNA targets a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and / or more than one HLA-B haplotypes.

[0041] In some embodiments, the modified cell comprises no more than two types of said universal gRNA.

[0042] In some embodiments, the group of HLA-I haplotypes comprises at least 30%global HLA-A haplotypes and / or at least 30%global HLA-B haplotypes.

[0043] In some embodiments, the group of HLA-I haplotypes are capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 50%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population.

[0044] In some embodiments, the group of HLA-I haplotypes comprises no HLA-C haplotype.

[0045] In some embodiments, the group of HLA-I haplotypes comprises no more than 30%global HLA-C haplotypes.

[0046] In some embodiments, the universal gRNA comprises a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78.

[0047] In some embodiments, the modified cell comprises reduced or eliminated expression of CIITA.

[0048] In some embodiments, the modified cell expresses a chimeric antigen receptor (CAR) .

[0049] In one aspect, the disclosure is related to a modified cell, which has reduced or eliminated surface expression of HLA-A and / or HLA-B relative to an unmodified cell, comprising a genetic modification in the HLA-A and / or HLA-B gene, wherein the genetic modification comprises at least one mutation within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78 on HLA gene.

[0050] In some embodiments, the modified cell expresses HLA-C.

[0051] In some embodiments, the modified cell express at least one HLA-C allele selected from the group comprising C*01: 02, C*07: 02, C*03: 04, C*06: 02, C*08: 01, C*03: 03, C*03: 02, C*04: 01, C*14: 02, C*15: 02, C*12: 02, C*12: 03, C*14: 03, C*04: 03, C*08: 22, C*07: 04, C*05: 01, C*07: 06, C*08: 03, and C*15: 05.

[0052] In some embodiments, the modified cell is a stem cell, a T cell, a NK cell, a NKT, a NKT-like cell, a cytokine induced killer cell (CIK) , a macrophage, a monocyte, a neutrophil, a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , a cord blood cell, or a hematopoietic stem cell (HSC) .

[0053] In one aspect, the disclosure is related to a cell bank comprising: the modified cell produced by the method described herein, or the modified cell described herein.

[0054] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition, comprising the modified cell described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0055] In one aspect, the disclosure is related to a composition comprising (i) a universal guide RNA (gRNA) and a RNA-guided nuclease or a base editor, or (ii) a universal guide RNA (gRNA) and a nucleic acid encoding an RNA-guided nuclease or a base editor; wherein the universal gRNA targets a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-Ahaplotypes and / or more than one HLA-B haplotypes.

[0056] In some embodiments, the composition comprises no more than two types of said universal gRNA.

[0057] In some embodiments, the group of HLA-I haplotype comprises more than 30%global HLA-A haplotypes and / or more than 30%global HLA-B haplotypes.

[0058] In some embodiments, the group of HLA-I haplotypes are capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 50%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population.

[0059] In some embodiments, the group of HLA-I haplotypes comprises no HLA-C haplotypes, or no more than 30%global HLA-C haplotypes.

[0060] In some embodiments, the universal gRNA comprises a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78.

[0061] In one aspect, the disclosure is related to a vector comprising the universal gRNA described herein, optionally wherein the vector is a viral vector or a non-viral vector.

[0062] In one aspect, the disclosure is related to a kit comprising the modified cell described herein, the cell bank described herein, the pharmaceutical composition described herein, or the composition described herein.

[0063] In some embodiments, the kit further comprises written instructions for using the modified cell, the cell bank, the pharmaceutical composition, or the composition.

[0064] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering to the subject in need thereof the modified cell described herein, or the pharmaceutical composition described herein.

[0065] In some embodiments, the disease or disorder is cancer, an autoimmune disease, or an injury.

[0066] In one aspect, the disclosure is related to a method of reducing the risk of eliciting a host-versus-graft reaction when administering a cell to a subject, comprising disrupting HLA-Agene and / or HLA-B gene in the cell by (i) an RNA-guided nuclease or base editor and (ii) a universal guide RNA (gRNA) , wherein the universal gRNA targets a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and / or more than one HLA-B haplotypes.

[0067] In one aspect, the disclosure is related to a method of reducing the risk of eliciting a host-versus-graft reaction when administering a cell to a subject, comprising disrupting HLA-Agene and HLA-B gene in the cell by (i) an RNA-guided nuclease or base editor, (ii) a first universal guide RNA (gRNA) , and (iii) a second universal guide RNA (gRNA) , wherein the first universal gRNA targets a group of HLA-A haplotypes comprising more than one HLA-Ahaplotypes, and wherein the second universal gRNA targets a group of HLA-B haplotypes comprising more than one HLA-B haplotypes.

[0068] In one aspect, the disclosure is related to a method of administering a modified cell to a recipient subject in need thereof, the method comprising administering the modified cell described herein or a modified cell from the cell bank described herein, regardless of HLA-Ahaplotype and HLA-B haplotype of the recipient subject.

[0069] In some embodiments, the method comprises determining HLA-C haplotype of the recipient subject.

[0070] In some embodiments, the modified cell comprises at least one of the same HLA-C haplotypes as the recipient subject.

[0071] In some embodiments, the method does not comprise determining the HLA-Ahaplotype and HLA-B haplotype of the recipient subject.

[0072] In one aspect, the disclosure is related to a method of designing a universal gRNA targeting HLA-A and / or HLA-B, comprising: (a) collecting a plurality of HLA-A, HLA-B and HLA-C haplotype sequences; and (b) designing a universal gRNA that targets at least 50%of the HLA-A or HLA-B haplotype sequences in the plurality of sequences.

[0073] In some embodiments, the method comprises (c) excluding the universal gRNA that targets HLA-C haplotype sequences in the plurality of sequences.

[0074] In some embodiments, the method comprises (d) selecting the universal gRNA that targets HLA-A and HLA-B haplotype sequences in the plurality of sequences.

[0075] In some embodiments, the plurality of HLA-A, HLA-B and HLA-C haplotype sequences consists of all of the global HLA-A, HLA-B and HLA-C haplotype sequences.

[0076] In one aspect, the disclosure is related to a universal gRNA designed according to the method described herein.

[0077] In some embodiments, the universal gRNA comprises a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78.

[0078] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing a modified cell, comprising disrupting HLA-A gene and / or HLA-B gene of a cell by a universal guide RNA (gRNA) designed according to the method described herein, and a RNA-guided nuclease or a base editor.

[0079] In one aspect, the disclosure is related to a modified cell, wherein HLA-A gene and / or HLA-B gene of the modified cell is disrupted using a gene editing system comprising a universal guide RNA (gRNA) designed according to the method described herein, and a RNA-guided nuclease or a base editor.

[0080] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing a modified cell, comprising disrupting the expression of HLA-A gene and / or HLA-B gene of a cell through a gene silencing method that targets a nucleotide sequence on HLA gene, wherein the gene silencing method targets the HLA-A gene and / or the HLA-B gene on the modified cell regardless of the haplotypes of HLA-A and / or HLA-B.

[0081] In some embodiments, the gene silencing method comprises contacting the cell with a universal gRNA and a RNA guided nuclease or a base editor.

[0082] In some embodiments, the modified cell comes from any one of a plurality of different donors, wherein the HLA haplotypes of each donor differs from at least one of the other donors on at least one HLA haplotype.

[0083] In one aspect, the disclosure is related to a method of building a cell bank for allogeneic cell therapy, comprising: (1) obtaining cells from a plurality of different donors; (2) disrupting the expression of HLA-A gene and HLA-B gene of these cells without identifying the HLA-A and HLA-B haplotypes; (3) selecting cells that do not express the HLA-A and HLA-B.

[0084] In some embodiments, the method comprises (4) selecting cells that are homozygous for HLA-C.

[0085] In some embodiments, the selected cells expresses HLA-C haplotype selected from the group comprising C*01: 02, C*07: 02, C*03: 04, C*06: 02, C*08: 01, C*03: 03, C*03: 02, C*04: 01, C*14: 02, C*15: 02, C*12: 02, C*12: 03, C*14: 03, C*04: 03, C*08: 22, C*07: 04, C*05: 01, C*07: 06, C*08: 03, and C*15: 05.

[0086] In some embodiments, the method comprises disrupting the expression of HLA-Agene and HLA-B gene of these cells using a universal gRNA comprising a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78.

[0087] Other features and advantages of the disclosure will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0088] FIG. 1 shows an exemplary flowchart of the process of designing universal gRNAs for HLA-A and / or HLA-B but not for HLA-C.

[0089] FIGs. 2A-2C show the knocking-out efficacies of the universal HLA-A gRNAs for HLA-A after CRISPR / Cas9 editing.

[0090] FIGs. 3A-3C show the knocking-out efficacies of the universal HLA-B gRNAs for HLA-B after CRISPR / Cas9 editing.

[0091] FIGs. 4A-4B show the knocking-out efficacies of the selected universal HLA-B gRNAs for HLA-A and HLA-B gene after CRISPR / Cas9 editing. The target nucleotide sequences of these gRNAs could also be mapped to the nucleotide sequences of HLA-A.

[0092] FIGs. 5A-5E show the knocking-out efficacies of the selected universal HLA-AgRNAs for HLA-A and HLA-B gene locus after base editing (FIGs. 5A-5B) and the knocking-out efficacies of the selected universal HLA-B gRNAs for HLA-B gene locus after base editing (FIGs. 5C-5E) .

[0093] FIGs. 6A-6E show the results of mixed lymphocyte reaction assay to evaluate cytotoxicity of CD8+T cells (FIGs. 6A-6C) and NK cells (FIGs. 6D-6E) on allogeneic B2M- / -cells or HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells. MACS-sorted B2M- / -cells (denoted as “B2M-” ) or HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells (denoted as “HLA-A-, HLA-B-, CIITA-” ) were used as target cells to coculture with allogeneic CD8+ T cells from three different donors with E / T ratio 1: 20 for 72 hours. Bar plots in FIGs. 6A-6C indicate the killing efficiency to target cells. MACS-sorted B2M- / -cells or HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells were used as target cells to coculture with allogeneic NK cells from two different donors with E / T ratio 1: 1 for 24 hours, and bar plots in FIGs. 6D-6E indicate the killing efficiency to target cells. In both T and NK cytotoxicity assays, untreated (UnT) cells served as the control.

[0094] FIGs. 7A-7F show the results of mixed lymphocyte reaction assay comparing the resistance of B2M- / -HLA-EOE cells and HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells to the cytotoxicity of allogeneic CD8+T cells (FIGs. 7A-7C) and NK cells (FIGs. 7D-7F) . MACS-sorted B2M- / -HLA-EOE cells (denoted as “B2M-+ HLA-E” ) and HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells (denoted as “HLA-A-, HLA-B-, CIITA-” ) were used as target cells to coculture with allogeneic CD8+ T cells (FIGs. 7A-7C) or NK cells (FIGs. 7D-7F) each from three different donors. UnT together with B2M- / -cells (denoted as “B2M-” ) and HLA-EOE cells (denoted as “HLA-E” ) were taken as controls. Bar plots indicate killing efficiency to target cells.

[0095] FIG. 8 shows the knocking-out efficiency of the gRNA combinations.DETAILED DESCRIPTION

[0096] The risk and potential life-threatening complications associated with graft versus host disease (GvHD) or host versus graft (HvG) response have restricted the utility of cell therapies (e.g., CAR-T or allo-HSCT) for the treatment of acquired, malignant, and inherited hematologic diseases. The disclosure provides a method for alteration of one or more immunogenicity gene loci (e.g., HLA loci) in a starting cell (e.g., donor cells, or untreated (UnT) cells) to increase immune compatibility of the modified cell.

[0097] T-cells engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) aim to strengthen the power of T-cells to recognize and eliminate tumor cells in a human leukocyte antigen (HLA) -independent manner. The two biggest hurdles in the use of allogeneic T-cells are graft versus host disease (GvHD) and host versus graft (HvG) response. The former can be avoided by eliminating the T cell receptor (TCR) , usually through the knockout (KO) of the constant domain of one of its chains (α and / or β) , or by replacing some TCR subunits, which impedes its antigen recognition function. However, although this takes care of the alloreactivity, the cells would still be susceptible to HvG response. The most common antigens driving HvG response are the mismatched donor-HLA-I molecules on the donor cells. These are recognized by the patient αβT-cells that are CD8+ through the direct pathway of allorecognition. By knocking-out the common subunit β2-microglobulin (encoded by the B2M gene) , the HLA-I molecule will not be expressed on the cell surface, thus making the cell susceptible to NK-cell lysis. To avoid recognition by NK-cells, different strategies have been developed, most commonly utilizing overexpression of a non-classical HLA-I such as HLA-E or G fusion protein to avoid lysis. Other strategy to avoid HvG response includes reducing expression of HLA-A and / or HLA-B, by, e.g., genome editing.

[0098] A protein that plays the most important role in distinguishing between self cells and non-self cells is a cell surface protein called a human leukocyte antigen (HLA) or a major histocompatibility complex (MHC) . Mismatched HLA proteins that are presented to T cells as foreign antigens activate this allo-immune response. MHC genes can be subdivided into Class I and Class II. MHC Class I, which include HLA-A, -B, -C, HLA-E, HLA-F, and HLA-G, are expressed on the surface of all somatic cells. Among these, HLA-A, HLA-B, and HLA-C have particularly great sequence diversity among individuals and play a major role in identifying self cells and non-self cells in transplantation immunity. The MHC Class I protein has a function of forming a heterodimer with β2-Microglobulin (B2M) to be expressed on a cell surface, and presenting intracellular peptides to CD8 T cells to induce cytotoxic lymphocyte activation and killing of host cells. In contrast, MHC Class II (e.g., HLA-DR, -DQ, -DP) presents extracellular derived antigens to CD4 T cells and are generally expressed on professional antigen presenting cells (APCs, e.g., dendritic cells, macrophages) , activating CD4 T cells help to drive a B-cell mediated antibody response to host antigens.

[0099] The allelic diversity of the MHC locus allows for presentation of a wide range of antigens thereby providing comprehensive immunity against a broad spectrum of potential pathogens. The MHC genes are inherited as a haplotype in a Mendelian manner and both alleles for each gene are expressed in a codominant fashion. Each child has a 25%chance of inheriting the same HLA haplotypes from their parents. In order to protect allo-HSCT subjects, transplant centers require matching at Class I (HLA-A, -B, -C) and Class II HLA-DRB1 loci. The matching criteria for allo-HSCT in which adult marrow is the cell source is either 7 / 8, or 9 / 10 if HLA-DQB1 is included. Umbilical cord blood HSCT requires a lesser degree of matching between donor and recipient, with the minimal matching requirement at 4 / 6 loci (HLA-A, -B, -DRB1) .

[0100] The methods, compositions, and cells described herein can be used to improve the outcome of transplantation, e.g., by preventing GvHD or HvG response, reducing requirement for conditioning and immunosuppression. For example, the methods, compositions, and cells described herein can provide for a therapy, e.g., a one-time therapy or a multi-dose therapy with reduced GvHD or HvG response.

[0101] The methods, compositions, and cells described herein can prevent, inhibit, or reduce the occurrence or severity of GvHD and / or HvG response in a subject, e.g., a recipient following cell therapies (e.g., CAR-T therapy or allo-HSCT) . Without being bound by theory, it is believed that inactivation of one or more donor HLA alleles, e.g., by knocking out or knocking down one or more HLA genes or loci in the donor cells can prevent, inhibit, or reduce the occurrence or severity of GvHD and / or HvG response in a subject, e.g., a recipient following cell therapies.

[0102] In one aspect, the present application provides the prevention or mitigation of HvG response related to cell therapies (e.g., CAR-T or CAR-NT therapies) . The present disclosure is based on, in part, the finding that by targeting a HLA gene sequence through a gene silencing method, the HLA-A and / or HLA-B gene expression can be disrupted, regardless of the HLA-Ahaplotype and / or HLA-B haplotype. Exemplary gene silencing methods include, but are not limited to, CRISPR / Cas9, RNA interference (RNAi) technology, transcription activator-like (TAL) effector nucleases (TALENs) and Zinc finger nucleases (ZFNs) . A CRISPR / Cas9 system or base editor system can be established to target the nucleotide sequence described herein. For example, a universal gRNA comprising a nucleic acid sequence that is complementary to the target nucleotide sequence can be used to disrupt HLA-A genes and / or HLA-B genes in a cell, without the need for determining the HLA-A haplotype and / or the HLA-B haplotype in the cell. Using the universal gRNA to disrupt HLA-A genes and HLA-B genes may reduce the HvG response. The universal gRNA can be used to disrupt HLA-A genes and / or HLA-B genes in adoptive transferred cells, such as chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells, and sustain the anti-tumor activity of adoptive transferred cells. The gRNA can target more than 50%of the HLA-A gene haplotypes in the population. The gRNA can target more than 50%of the HLA-B gene haplotypes in the population. The universal gRNA does not disrupt HLA-C genes. The universal gRNA can target less than 30%of the HLA-C gene haplotypes in the population. The biochemical properties of the HLA-C antigen differ substantially from those of HLA-A and -B molecules. HLA-C can help maintain NK cell inhibition. It may be desirable to keep endogenous HLA-C genes because, without being bound by theory, the HLA-C genes can protect the modified cells from NK cell mediated clearance.

[0103] The term “Cas9” or “Cas9 domain” refers to an RNA guided nuclease comprising a Cas9 protein, or a fragment thereof (e.g., a protein comprising an active, inactive, or partially active DNA cleavage domain of Cas9, and / or the gRNA binding domain of Cas9) . A Cas9 nuclease is also referred to sometimes as a casnl nuclease or a CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) associated nuclease. The CRISPR (clustered regularly interspersed short palindromic repeats)  / Cas (CRISPR-associated) system is a natural immune system peculiar to prokaryotes, which is used to resist the attack of viruses or exogenous plasmids. The type II CRISPR / Cas system, as a RNA directly mediated gene editing tool, has been successfully applied in many eukaryotes and prokaryotes. The simplified CRISPR / Cas9 system consists of two parts: the Cas9 protein and sgRNA. Its working principle is that the sgRNA forms a Cas9-sgRNA complex with Cas9 protein through its own Cas9 handle. The sequence of the base complementary pairing region of the sgRNA in the Cas9-sgRNA complex and the target nucleotide sequence of the target gene are paired according to the principle of base complementary pairing. Cas9 uses its own endonuclease activity to cleave the target DNA sequence.

[0104] The term “base editor (BE) , ” or “nucleobase editor polypeptide (NBE) ” refers to an agent that binds a polynucleotide and has nucleobase modifying activity. In various embodiments, the base editor comprises a nucleobase modifying polypeptide (e.g., a deaminase) and a polynucleotide programmable nucleotide binding domain (e.g., Cas9 or Cpfl) in conjunction with a guide polynucleotide (e.g., guide RNA (gRNA) ) . Any base editors known in the art may be used in the method of producing a modified cell described herein. Representative nucleic acid and protein sequences of base editors include, but not limited to, those sequences disclosed in PCT / US2020 / 016285 and CN202010163058.3, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes. “Base editing activity” is meant acting to chemically alter a base within a polynucleotide. A first base can be converted to a second base. The base editing activity can be cytidine deaminase activity, e.g., converting target G*C to T·A. The base editing activity can be adenosine or adenine deaminase activity, e.g., converting A·T to G*C.

[0105] The term “base editor system” refers to an intermolecular complex for editing a nucleobase of a target nucleotide sequence. In various embodiments, the base editor (BE) system comprises (1) a polynucleotide programmable nucleotide binding domain, a deaminase domain (e.g., cytidine deaminase or adenosine deaminase) for deaminating nucleobases in the target nucleotide sequence; and (2) one or more guide polynucleotides (e.g., guide RNA) in conjunction with the polynucleotide programmable nucleotide binding domain. In various embodiments, the base editor (BE) system comprises a nucleobase editor domain selected from an adenosine deaminase or a cytidine deaminase, and a domain having nucleic acid sequence specific binding activity. The base editor system may comprise (1) a base editor (BE) comprising a polynucleotide programmable DNA binding domain and a deaminase domain for deaminating one or more nucleobases in a target nucleotide sequence; and (2) one or more guide RNAs in conjunction with the polynucleotide programmable DNA binding domain. The polynucleotide programmable nucleotide binding domain can be a polynucleotide programmable DNA binding domain. The base editor can be a cytidine base editor (CBE) . The base editor can be an adenine or adenosine base editor (ABE) . The base editor can be an adenine or adenosine base editor (ABE) or a cytidine or cytosine base editor (CBE) . The base editor system (e.g., a base editor system comprising a cytidine deaminase) may comprise a uracil glycosylase inhibitor or other agent or peptide (e.g., a uracil stabilizing protein such as provided in W02022015969, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes) that inhibits the inosine base excision repair system.

[0106] The term “nucleic acid programmable DNA binding protein” or “napDNAbp” may be used interchangeably with “polynucleotide programmable nucleotide binding domain” to refer to a protein that associates with a nucleic acid (e.g., DNA or RNA) , such as a guide nucleic acid or guide polynucleotide (e.g., gRNA) , that guides the napDNAbp to a specific nucleic acid sequence. The polynucleotide programmable nucleotide binding domain can be a polynucleotide programmable DNA binding domain. The polynucleotide programmable nucleotide binding domain can be a polynucleotide programmable RNA binding domain (i.e., RNA-guided nuclease) . The RNA-guided nuclease domain can be a Cas9 protein. A Cas9 protein can associate with a guide RNA that guides the Cas9 protein to a specific DNA sequence that is complementary to the guide RNA. The napDNAbp can be a Cas9 domain, for example a nuclease active Cas9, a Cas9 nickase (nCas9) , or a nuclease inactive Cas9 (dCas9) . Non-limiting examples of nucleic acid programmable DNA binding proteins include, Cas9 (e. g, dCas9 and nCas9) , Casl2a / Cpfl, Casl2b / C2cl, Casl2c / C2c3, Casl2d / CasY, Casl2e / CasX, Casl2g, Casl2h, Casl2i, and Casl2j / Cas<E> (Casl2j / Casphi) . Non-limiting examples of Cas enzymes include Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5d, Cas5t, Cas5h, Cas5a, Cas6, Cas7, Cas8, Cas8a, Cas8b, Cas8c, Cas9 (also known as Csnl or Csxl2) , CaslO, CaslOd, Casl2a / Cpfl, Casl2b / C2cl, Casl2c / C2c3, Casl2d / CasY, Casl2e / CasX, Casl2g, Casl2h, Casl2i, Casl2j / Cas<E>, Cpfl, Csyl , Csy2, Csy3, Csy4, Csel, Cse2, Cse3, Cse4, Cse5e, Cscl, Csc2, Csa5, Csnl, Csn2, Csml, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, CsxlO, Csxl6, CsaX, Csx3, Csxl, CsxlS, Csxll, Csfl, Csf2, CsO, Csf4, Csdl, Csd2, Cstl, Cst2, Cshl, Csh2, Csal, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, Type II Cas effector proteins, Type V Cas effector proteins, Type VI Cas effector proteins, CARF, DinG, homologues thereof, or modified or engineered versions thereof. Other nucleic acid programmable DNA binding proteins are also within the scope of this disclosure, although they may not be specifically listed in this disclosure. See, e.g., Makarova et al. “Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here? ” CRISPRJ. 2018 Oct; 1: 325-336. doi: 10.1089 / crispr. 2018.0033; Yan et al., “Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems” Science. 2019 Jan 4; 363 (6422) : 88-91. doi: 10.1126 / science. aav7271, the entire contents of each are hereby incorporated by reference.

[0107] As used herein, the term “guide RNA” or “gRNA” generally refers to short ribonucleic acid that can interact with, e.g., bind to, to an endonuclease and bind, or hybridize to a target genomic site or region. A gRNA can be a single-molecule guide RNA (sgRNA) . A gRNA may comprise a spacer extension region. A gRNA may comprise a tracrRNA extension region. A gRNA can be single-stranded. A gRNA may comprise naturally occurring nucleotides. A gRNA can be a chemically modified gRNA. A chemically modified gRNA may be a gRNA that comprises at least one nucleotide with a chemical modification, e.g., a 2′-O-methyl sugar modification. A chemically modified gRNA may comprise a modified nucleic acid backbone. A chemically modified gRNA may comprise a 2′-O-methyl-phosphorothioate residue. A gRNA may be pre-complexed with a DNA endonuclease. The term “universal gRNA” refers to a gRNA comprising a target-specific sequence that is complementary to a target nucleotide sequence on more than one HLA haplotypes.

[0108] A “splice site, ” as used herein, refers to the three nucleotides that make up an acceptor splice site or a donor splice site (defined below) , or any other nucleotides known in the art that are part of a splice site. See e.g., Burset et al., Nucleic Acids Research 28 (21) : 4364-4375 (2000) (describing canonical and non-canonical splice sites in mammalian genomes) . The three nucleotides that make up an “acceptor splice site” are two conserved residues (e.g., AG in humans) at the 3’ of an intron and a boundary nucleotide (i.e., the first nucleotide of the exon 3’ of the AG) . The “splice site boundary nucleotide” of an acceptor splice site is designated as “Y” in the diagram below and may also be referred to herein as the “acceptor splice site boundary nucleotide, ” or “splice acceptor site boundary nucleotide. ” The terms “acceptor splice site, ” “splice acceptor site, ” “acceptor splice sequence, ” or “splice acceptor sequence” may be used interchangeably herein. The three nucleotides that make up a “donor splice site” are two conserved residues (e.g., GT (gene) or GU (in RNA such as pre-mRNA) in human) at the 5’ end of an intron and a boundary nucleotide (i.e., the first nucleotide of the exon 5’ of the GT) . The “splice site boundary nucleotide” of a donor splice site is designated as “X” in the diagram below and may also be referred to herein as the “donor splice site boundary nucleotide, ” or “splice donor site boundary nucleotide. ” The terms “donor splice site, ” “splice donor site, ” “donor splice sequence, ” or “splice donor sequence” may be used interchangeably herein.

[0109] “Homology” or “identity” or “similarity” refers to sequence similarity between two peptides or between two nucleic acid molecules. Homology can be determined by comparing a position in each sequence which may be aligned for purposes of comparison. When a position in the compared sequence is occupied by the same base or amino acid, then the molecules are homologous at that position. A degree of homology between sequences is a function of the number of matching or homologous positions shared by the sequences.

[0110] As used herein, the term “homozygous” refers to having two identical alleles of a particular gene.

[0111] As used herein, the term “global HLA-A haplotypes” refers to the HLA-A haplotypes from various countries and / or various ethnic groups in a database containing HLA haplotype sequences. Similarly, the term “global HLA-B haplotypes” refers to the HLA-B haplotypes from various countries and / or various ethnic groups in a database containing HLA haplotype sequences. Similarly, the term “global HLA-C haplotypes” refers to the HLA-C haplotypes from various countries and / or various ethnic groups in a database containing HLA haplotype sequences. The database containing HLA haplotype sequences can be established using a publicly available data set that includes HLA allelic variants (www. ebi. ac. uk / ipd / imgt / hla) . The term “global HLA-Ahaplotypes, ” “global HLA-B haplotypes, ” or “global HLA-C haplotypes, ” can refer to all known HLA-A, HLA-B, or HLA-C haplotypes.

[0112] As used herein, the term “the global population” refers to the general population from all countries in a database containing HLA haplotype sequences. The database containing HLA haplotype sequences can be established using a publicly available data set that includes HLA allelic variants. The database may be the IPD-IMGT / HLA Database (www. ebi. ac. uk / ipd / imgt / hla) .

[0113] As used herein, the term “endonuclease” generally refers to an enzyme that cleaves phosphodiester bonds within a polynucleotide. An endonuclease may be able to specifically cleave phosphodiester bonds within a DNA polynucleotide. An endonuclease can be a zinc finger nuclease (ZFN) , transcription activator like effector nuclease (TALEN) , homing endonuclease (HE) , meganuclease, MegaTAL, or a CRISPR-associated endonuclease. An endonuclease may be a RNA-guided endonuclease. The RNA-guided endonuclease may be a CRISPR nuclease, e.g., a Type II CRISPR Cas9 endonuclease or a Type V CRISPR Cpf1 endonuclease. An endonuclease can be a Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cash, Cas7, Cas8, Cas9 (also known as Csn1 and Csx12) , Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, or Cpf1 endonuclease, or a homolog thereof, a recombination of the naturally occurring molecule thereof, a codon-optimized version thereof, or a modified version thereof, or combinations thereof. An endonuclease may introduce one or more single-stranded breaks (SSBs) and / or one or more double-stranded breaks (DSBs) .

[0114] As used herein, the term “starting cell” or “untreated cell” refers to a cell that has not been subjected to the genetic modifications described herein. An untreated cell may be a stem cell. An untreated cell may be an embryonic stem cell (ESC) , an adult stem cell (ASC) , an induced pluripotent stem cell (iPSC) , or a hematopoietic stem or progenitor cell (HSPC) . An untreated cell may be a differentiated cell. An untreated cell may be selected from somatic cells (e.g., immune system cells, e.g., a NK cell, a T cell such as a CD8+ T cell) . If a modified cell is compared “relative to an untreated cell” , the modified cell and the untreated cell are the same cell type or share a common parent cell line, e.g., a modified iPSC is compared relative to an unmodified iPSC.

[0115] The term “engineered receptor” as used herein, refers to an exogenous receptor (such as CAR (e.g., antibody-based CAR, ligand / receptor-based CAR, or ACTR (antibody-coupled T cell receptor) ) , engineered TCR (e.g., traditional engineered TCR, chimeric TCR (cTCR) ) , T cell antigen coupler (TAC) , or TAC-like chimeric receptor) that retains its biological activity after being introduced into the T cells or modified cells described herein. The biological activity includes but are not limited to the ability of the engineered receptor in specifically binding to a molecule (e.g., cancer antigen) , properly transducing downstream signals, such as inducing cellular proliferation, cytokine production and / or performance of regulatory or cytolytic effector functions.

[0116] As used herein, the term “chimeric antigen receptor” or “CAR” as used herein refers to genetically engineered receptors, which can be used to graft one or more antigen specificity onto immune effector cells, such as T cells. Some CARs are also known as “artificial T-cell receptors, ” “chimeric T cell receptors, ” or “chimeric immune receptors. ” A CAR may comprise an extracellular ligand binding domain or an extracellular antigen binding domain specific for one or more ligands or antigens (such as tumor antigens) , a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain. “CAR-T cell” refers to a T cell that expresses a CAR. “CD20 CAR” refers to a CAR having an extracellular binding domain specific for CD20.

[0117] “Graft versus host disease” (GVHD) refers to a pathological condition where transplanted cells of a donor generate an immune response against cells of the host.

[0118] “Host versus graft” (HvG) response or rejection refers to a pathological condition where the immune system of a host generates an immune response against transplanted cells.

[0119] As used herein, the term “cancer” refers to cells having the capacity for autonomous growth. Examples of such cells include cells having an abnormal state or condition characterized by rapidly proliferating cell growth. The term is meant to include cancerous growths, e.g., tumors; oncogenic processes, metastatic tissues, and malignantly transformed cells, tissues, or organs, irrespective of histopathologic type or stage of invasiveness. Also included are malignancies of the various organ systems, such as respiratory, cardiovascular, renal, reproductive, hematological, neurological, hepatic, gastrointestinal, endocrine systems and neuroendocrine tumor (NET) ; as well as adenocarcinomas which include malignancies such as most colon cancers, renal-cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular tumors, small cell lung cancer (SCLC) , large cell neuroendocrine cancer (LCNC) , neuroendocrine prostate cancer (NEPC) , pancreatic neuroendocrine tumor (PNET) , gastrointestinal neuroendocrine cancers, and cancer of the small intestine. Cancer that is “naturally arising” includes any cancer that is not experimentally induced by implantation of cancer cells into a subject, and includes, for example, spontaneously arising cancer, cancer caused by exposure of a patient to a carcinogen (s) , cancer resulting from insertion of a transgenic oncogene or knockout of a tumor suppressor gene, and cancer caused by infections, e.g., viral infections. The term “carcinoma” is art recognized and refers to malignancies of epithelial or endocrine tissues. The term also includes carcinosarcomas, which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. An “adenocarcinoma” refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which the tumor cells form recognizable glandular structures. The term “sarcoma” is art recognized and refers to malignant tumors of mesenchymal derivation. The term “hematopoietic neoplastic disorders” includes diseases involving hyperplastic / neoplastic cells of hematopoietic origin. A hematopoietic neoplastic disorder can arise from myeloid, lymphoid or erythroid lineages, or precursor cells thereof.

[0120] The terms “polypeptide” and “peptide” and “protein” are used interchangeably herein and refer to polymers of amino acids of any length. The polymer may be linear or branched, it may comprise modified amino acids, and it may be interrupted by non-amino acids. The terms also encompass an amino acid polymer that has been modified naturally or by intervention; for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, or any other manipulation or modification. Also included within the definition are, for example, polypeptides containing one or more analogs of an amino acid, including but not limited to, unnatural amino acids, as well as other modifications known in the art.

[0121] As used herein, the term “autologous” is meant to refer to any material derived from the same individual to whom it is later to be re-introduced into the individual.

[0122] As used herein, the term “allogeneic” refers to a graft derived from a different individual of the same species.

[0123] As used herein, the term “transfected” or “transformed” or “transduced” as used herein refers to a process by which exogenous nucleic acid is transferred or introduced into the host cell. A “transfected” or “transformed” or “transduced” cell is one which has been transfected, transformed or transduced with exogenous nucleic acid. The cell includes the primary subject cell and its progeny.

[0124] It is noted that, in this description, a term “no less than” refers to the “equal to” and / or “more than” , a term “no more than” refers to the “equal to” and / or “less than” .

[0125] Reference to "about" a value or parameter herein includes (and describes) variations that are directed to that value or parameter per se. For example, description referring to "about X" includes description of "X" . The term “about X-Y” used herein has the same meaning as “about X to about Y. ”

[0126] As used herein and in the appended claims, the singular forms "a, " "an, " and "the" include plural referents unless the context clearly dictates otherwise.

[0127] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs. Methods and materials are described herein for use in the present disclosure; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. Designing universal gRNAs

[0128] In one aspect, the disclosure provides a method of designing universal gRNAs that can target a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and / or more than one HLA-B haplotypes. The universal gRNAs can be used directly to knock out both alleles of an HLA gene without having to detect the donor’s HLA genotypes and then design multiple gRNAs. For example, the universal gRNAs can be designed based on the below method. First, a database containing HLA haplotype sequences is established using a publicly available data set that includes HLA allelic variants (www. ebi. ac. uk / ipd / imgt / hla) . Second, from the HLA haplotype sequences, a nucleotide sequence corresponding to “NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG” (SEQ ID NO: 75) can be extracted as a candidate target nucleotide sequence of a universal gRNA. Third, the candidate target nucleotide sequences of HLA-A haplotypes and HLA-B haplotypes can be mapped to the nucleotide sequences of all HLA haplotypes and ones showing >50%(e.g., >55%, >60%, or >70%) coverage of HLA-A or HLA-B haplotypes but <30% (e.g., <20%) coverage of HLA-C haplotypes can be kept as a target nucleotide sequence to disrupt HLA-Aand / or HLA-B genes. The established database may contain HLA haplotype sequences that exhibit high frequency in a selected population, such as in the United States population. A gRNA (i.e., universal gRNA) can be designed according to the target nucleotide sequence and a CRISPR-Cas9 system or base editing system can be used to disrupt HLA-A haplotypes and / or HLA-B haplotypes. In this way, the universal gRNAs can target a plurality of HLA-A and / or HLA-B haplotype sequences, with minimal effects on HLA-C haplotype sequences. A schematic flowchart of this method is shown in FIG. 1. Exemplary universal gRNAs for HLA-A haplotypes can be found in Table 1 and exemplary universal gRNAs for HLA-B haplotypes can be found in Table 2.

[0129] In one aspect, the disclosure provides a method of designing universal gRNAs that can target a group of HLA-A haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes. The universal gRNAs can be used directly to knock out both alleles of an HLA-A gene without having to detect the donor’s HLA-A genotypes and then design multiple gRNAs. For example, the universal gRNAs can be designed based on the below method. First, a database containing HLA haplotype sequences is established using a publicly available data set that includes HLA allelic variants (www. ebi. ac. uk / ipd / imgt / hla) . Second, from the HLA haplotype sequences, a nucleotide sequence corresponding to “NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG” (SEQ ID NO: 75) can be extracted as a candidate target nucleotide sequence of a universal gRNA. Third, the candidate target nucleotide sequences of HLA-A haplotypes can be mapped to the nucleotide sequences of all HLA haplotypes and ones showing >50% (e.g., >55%, >60%, or >70%) coverage of HLA-A haplotypes but <30% (e.g., <20%) coverage of HLA-C haplotypes can be kept as a target nucleotide sequence to disrupt HLA-A genes. The established database may contain HLA haplotype sequences that exhibit high frequency in a selected population, such as in the United States population. A gRNA (i.e., universal gRNA) can be designed according to the target nucleotide sequence and a CRISPR-Cas9 system or base editing system can be used to disrupt HLA-A haplotypes. In this way, the universal gRNAs can target a plurality of HLA-A haplotype sequences, with minimal effects on HLA-C haplotype sequences. A schematic flowchart of this method is shown in FIG. 1. Exemplary universal gRNAs for HLA-A haplotypes can be found in Table 1.

[0130] In one aspect, the disclosure provides a method of designing universal gRNAs that can target a group of HLA-B haplotypes comprising more than one HLA-B haplotypes. The universal gRNAs can be used directly to knock out both alleles of an HLA-B gene without having to detect the donor’s HLA-B genotypes and then design multiple gRNAs. For example, the universal gRNAs can be designed based on the below method. First, a database containing HLA haplotype sequences is established using a publicly available data set that includes HLA allelic variants (www. ebi. ac. uk / ipd / imgt / hla) . Second, from the HLA haplotype sequences, a nucleotide sequence corresponding to “NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG” (SEQ ID NO: 75) can be extracted as a candidate target nucleotide sequence of a universal gRNA. Third, the candidate target nucleotide sequences of HLA-B haplotypes can be mapped to the nucleotide sequences of all HLA haplotypes and ones showing >50% (e.g., >55%, >60%, or >70%) coverage of HLA-B haplotypes but <30% (e.g., <20%) coverage of HLA-C haplotypes can be kept as a target nucleotide sequence to disrupt HLA-B genes. The established database may contain HLA haplotype sequences that exhibit high frequency in a selected population, such as in the United States population. A gRNA (i.e., universal gRNA) can be designed according to the target nucleotide sequence and a CRISPR-Cas9 system or base editing system can be used to disrupt HLA-B haplotypes. In this way, the universal gRNAs can target a plurality of HLA-B haplotype sequences, with minimal effects on HLA-C haplotype sequences. A schematic flowchart of this method is shown in FIG. 1. Exemplary universal gRNAs for HLA-B haplotypes can be found in Table 2.

[0131] In one aspect, the disclosure provides a method of designing universal gRNAs that can target a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and more than one HLA-B haplotypes. The universal gRNAs can be used directly to knock out both alleles of an HLA gene without having to detect the donor’s HLA genotypes and then design multiple gRNAs. For example, the universal gRNAs can be designed based on the below method. First, a database containing HLA haplotype sequences is established using a publicly available data set that includes HLA allelic variants (www. ebi. ac. uk / ipd / imgt / hla) . Second, from the HLA haplotype sequences, a nucleotide sequence corresponding to “NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG” (SEQ ID NO: 75) can be extracted as a candidate target nucleotide sequence of a universal gRNA. Third, the candidate target nucleotide sequences of HLA-A haplotypes and HLA-B haplotypes that can be mapped to the nucleotide sequences of all HLA haplotypes and ones showing >50% (e.g., >55%, >60%, or >70%) coverage of HLA-Aand / or HLA-B haplotypes but <30% (e.g., <20%) coverage of HLA-C haplotypes can be kept as a target nucleotide sequence to disrupt HLA-A and / or HLA-B genes. A gRNA (i.e., universal gRNA) can be designed according to the target nucleotide sequence. Fourth, the universal gRNA that targets both HLA-A haplotype and HLA-B haplotype can be selected. The target nucleotide sequences of these gRNAs could be mapped to the nucleotide sequences of both HLA-A and HLA-B. The established database may contain HLA haplotype sequences that exhibit high frequency in a selected population, such as in the United States population. In this way, the universal gRNAs can target a plurality of HLA-A and HLA-B haplotype sequences, with minimal effects on HLA-C haplotype sequences. A schematic flowchart of this method is shown in FIG. 1. Exemplary universal gRNAs for HLA-A haplotypes and HLA-B haplotypes can comprise a sequence having at least 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identity to in the sequence of any one of SEQ ID NOs: 4, 6, 16, 17, 18, 20, 22, 31, 38, 39, 40, 47, 59, 60, and 61.

[0132] The universal gRNAs can comprise a sequence (i.e., target-specific sequence) having at least 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identity to in the sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-35 (see Table 1) . The universal gRNAs can comprise a sequence having at least 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identity to in the sequence of any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78 (see Table 2) .

[0133] The universal gRNAs can target a nucleotide sequence having at least 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identity to in the sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-35 (see Table 1) . The universal gRNAs can target a nucleotide sequence complimentary to the sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-35 (see Table 1) . The universal gRNAs can target a sequence having at least 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identity to in the sequence of any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78 (see Table 2) . The universal gRNAs can target a nucleotide sequence complimentary to the sequence of any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78 (see Table 2) .

[0134] In one aspect, the disclosure provides a method of designing a universal gRNA targeting HLA-A and / or HLA-B, comprising (a) collecting a plurality of HLA-A, HLA-B and HLA-C haplotype sequences; and (b) designing a universal gRNA that targets at least 50%of the HLA-A or HLA-B haplotype sequences in the plurality of sequences. The method may further comprise (c) excluding the universal gRNA that targets HLA-C haplotype sequences in the plurality of sequences. The method may further comprise (d) selecting the universal gRNA that targets HLA-A and HLA-B haplotype sequences in the plurality of sequences. The plurality of HLA-A, HLA-B and HLA-C haplotype sequences can consist of all the global HLA-A, HLA-B and HLA-C haplotype. The plurality of HLA-A, HLA-B and HLA-C haplotype sequences can consist of haplotypes from a group of selected donors.

[0135] There may be no need to design the universal gRNA based on the HLA-A haplotype and / or the HLA-B haplotype of the starting cell (e.g., donor cell or untreated cell) prior to disruption of HLA-A gene and / or HLA-B gene. The HLA-A haplotype and / or the HLA-B haplotype in the cell may be undetermined prior to disruption of HLA-A gene and / or HLA-B gene. Whether the HLA-C gene on the cell is homozygous or heterozygous may be undetermined prior to disruption of HLA-A gene and / or HLA-B gene. The method described herein may not comprise determining the HLA-A haplotype and / or the HLA-B haplotype in the cell. The method may not comprise distinguishing whether the HLA-C gene on the cell is homozygous or heterozygous.

[0136] The universal gRNA can target a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and / or more than one HLA-B haplotypes. The group of HLA-I haplotypes may comprise: (i) at least 2338 different HLA-A haplotypes and / or at least 2782 different HLA-B haplotypes; (ii) at least 3897 different HLA-A haplotypes; (iii) at least 4637 different HLA-B haplotypes; or (iv) at least 7339 different HLA-A haplotypes and at least 3483 different HLA-B haplotype. The group of HLA-I haplotypes may comprise: (i) at least 30%global HLA-Ahaplotypes and / or at least 30%global HLA-B haplotypes; (ii) at least 50%global HLA-Ahaplotypes; (iii) at least 50%global HLA-B haplotypes; or (iv) at least 94%global HLA-Ahaplotypes and at least 37%global HLA-B haplotypes. Haplotypes in the group of HLA-I haplotypes can be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, or at least 90%of the global population. The group of HLA-I haplotypes may comprise no HLA-C haplotype. The group of HLA-I haplotypes may comprise no more than 30%global HLA-C haplotypes. The universal gRNA may comprise a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78.

[0137] The universal gRNA can target at least 500, at least 1000, at least 1500, at least 2000, at least 2500, at least 3000, at least 3500, at least 4000, at least 4500, at least 5000, at least 5500, at least 6000, at least 6500, at least 7000, at least 7500, or at least 7793 different HLA-A haplotypes. the universal gRNA can target at least 500, at least 1000, at least 1500, at least 2000, at least 2500, at least 3000, at least 3500, at least 4000, at least 4500, at least 5000, at least 5500, at least 6000, at least 6500, at least 7000, at least 7500, at least 8000, at least 8500, at least 9000, or at least 9274 different HLA-B haplotypes. The universal gRNA can target at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of global HLA-A haplotypes. The universal gRNA can target at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of global HLA-B haplotypes. The universal gRNA can target less than 10%, less than 20%, less than 30%, less than 40%, less than 50%, less than 60%, less than 70%, less than 80%, less than 90%of global HLA-C haplotypes.

[0138] In one aspect, the disclosure provides methods for producing immune-compatible cells using the universal gRNA described therein. The method described herein may use one or more universal gRNAs. the method described herein may comprise disrupting HLA-A gene and HLA-B gene of a cell by a first universal gRNA, a second universal gRNA and a RNA-guided nuclease or a base editor. The first universal gRNA can target a group of HLA-A haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes, and wherein the second universal gRNA can target a group of HLA-B haplotypes comprising more than one HLA-B haplotypes. There may be no need to design the first universal gRNA based on the HLA-A haplotype of the cell prior to disruption of HLA-Agene, and there may be no need to design the second universal gRNA based on the HLA-B haplotype of the cell prior to disruption of HLA-B gene. The group of HLA-A haplotypes may comprise at least 3897 different HLA-A haplotypes and the group of HLA-B haplotypes comprises at least 4637 different HLA-B haplotypes. The group of HLA-A haplotypes may comprise at least 50%global HLA-A haplotypes, and wherein the group of HLA-B haplotypes may comprise at least 50%global HLA-B haplotypes. HLA-A haplotypes in the group of HLA-A haplotypes may be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, or at least 90%of the global population and / or wherein HLA-B haplotypes in the group of HLA-B haplotypes may be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, or at least 90%of the global population. The group of HLA-A haplotypes and / or the group of HLA-B haplotypes may comprise no HLA-C haplotype. The group of HLA-A haplotypes and / or the group of HLA-B haplotypes may comprise no more than 30%global HLA-C haplotypes. The first universal gRNA may comprise a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-35 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-35. The second universal gRNA may comprise a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78. In one aspect, the disclosure provides a combination of the universal gRNA described herein, wherein the combination comprises two universal gRNA. The first universal gRNA may comprise a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-35 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-35. The second universal gRNA may comprise a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 2 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 2 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73 74, 76, 77, or 78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 4 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 4 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 5 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 5 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 15 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 15 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 17 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 17 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 18 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 18 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 23 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 23 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 30 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 30 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 31 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 31 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 33 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 33 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, 76, 77, or 78. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 4 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 4 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 70 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 70. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 4 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 4 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 76 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 76. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 4 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 4 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 77 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 77. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 4 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 4 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 78. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 6 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 6 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 70 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 70. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 6 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 6 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 76 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 76. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 6 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 6 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 77 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 77. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 6 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 6 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 78. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 23 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 23 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 70 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 70. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 23 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 23 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 65 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 65. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 33 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 33 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 65 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 65. The combination may comprise a first universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 34 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 34 and a second universal gRNA comprising a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to SEQ ID NO: 65 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 65. The combination of the universal gRNA described herein can be used to disrupt HLA-A genes and HLA-B genes in a cell. The disclosure also provides a composition, a vector, or a cell comprising the combination of the universal gRNA described herein and a method for producing immune-compatible cells using the combination of the universal gRNA described herein.

[0139] In one aspect, the disclosure provides a composition comprising (i) a universal guide RNA (gRNA) and a RNA-guided nuclease or a base editor, or (ii) a universal guide RNA (gRNA) and a nucleic acid encoding an RNA-guided nuclease or a base editor; wherein the universal gRNA targets a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and / or more than one HLA-B haplotypes. The composition may comprise no more than two types of said universal gRNA. The group of HLA-I haplotypes may comprise more than 30%global HLA-A haplotypes and / or more than 30%global HLA-B haplotypes. Haplotypes in the group of HLA-I haplotypes may be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population. The group of HLA-I haplotypes may comprise no HLA-C haplotypes. The group of HLA-I haplotypes may comprise no more than 30%global HLA-C haplotypes. The universal gRNA may comprise a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID Nos: 1-74 and 76-78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID Nos: 1-74 and 76-78.

[0140] Any known means for delivery of nucleotide and / or protein can be used for delivery of the gRNA or the compositions disclosed herein. Lipid nanoparticles (LNP compositions) are a well-known means for delivery of nucleotide and protein cargo. The LNP compositions can deliver nucleic acid, protein, or nucleic acid together with protein. The disclosure provides a method for delivering any of the universal gRNAs disclosed herein to a subject, wherein the gRNA is formulated as an LNP. The LNP may comprise the universal gRNA and a Cas9 or an mRNA encoding Cas9. The LNP may comprise the universal gRNA and a base editor or an mRNA encoding a base editor. The gRNAs disclosed herein can be formulated as LNP compositions for use in preparing a medicament for treating a disease or disorder.

[0141] Electroporation is a well-known mean for delivery of cargo, and any electroporation methodology may be used for delivery of any one of the universal gRNAs disclosed herein. Electroporation may be used to deliver any one of the universal gRNAs disclosed herein and Cas9 or an mRNA encoding Cas9. Electroporation may be used to deliver any one of the universal gRNAs disclosed herein and a base editor or an mRNA encoding a base editor.

[0142] The disclosure provides DNA or RNA vectors encoding any of the universal gRNAs and comprising any one or more of the universal gRNA sequences described herein. In addition to universal gRNA sequences, the vectors may further comprise nucleic acids that do not encode gRNAs. Nucleic acids that do not encode gRNA include, but are not limited to, promoters, enhancers, regulatory sequences, and nucleic acids encoding an RNA-guided nuclease, which can be a nuclease such as Cas9 or base editor. The universal gRNAs and the nucleic acids encoding an RNA-guided nuclease may be included in a same vector. The universal gRNAs and the nucleic acids encoding an RNA-guided nuclease may be included in a different vector. The vector described herein may be a viral vector. The vector described herein may comprise a sequence isolated or derived from a lentivirus, an adenovirus, an adeno-associated virus (AAV) vector, or a retrovirus. The vector of the disclosure can be a non-viral vector. The vector may comprise or consist of a nanoparticle, a micelle, a liposome or lipoplex, a polymersome, a polyplex or a dendrimer.

[0143] The RNA-guided nuclease or base editor, when in conjunction with a guide polynucleotide (e.g., gRNA) , can specifically bind to a target nucleotide sequence (i.e., via complementary base pairing between bases of the guide nucleic acid and bases of the target nucleotide sequence) and thereby localize the RNA-guided nuclease or the base editor to the target nucleic acid sequence desired to be edited.

[0144] The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)  / Cas9 system is an RNA-guided endonuclease complex that utilizes short RNA guides to cleave matching viral DNA sequences in the bacterial genome. In its native configuration, the Cas9 holoenzyme consists of the Cas9 endonuclease in complex with two RNAs: a 42-nucleotide (nt) CRISPR RNA (crRNA) which contains a 20-nt target-specific sequence, and a 89-nt trans-activating crRNA (tracrRNA) which serves as a scaffold for the crRNA. Together, this complex recognizes an “NGG” protospacer adjacent motif (PAM) sequence 3′to the target site that serves to anchor Cas9 binding. Strand invasion by the crRNA 20-mer and its complementation with the target DNA sequence leads to double-stranded DNA cutting by Cas9 and the subsequent mutagenesis of the target DNA.

[0145] In nature, DNA-binding and cleavage typically requires protein and both RNAs. However, single guide RNAs ( “sgRNA” , or simply “gRNA” ) can be engineered so as to incorporate aspects of both the crRNA and tracrRNA into a single RNA species. See, e.g., Jinek M., et al. Science 337: 816-821 (2012) , the entire contents of which is hereby incorporated by reference. Cas9 recognizes a short motif in the CRISPR repeat sequences (the PAM or protospacer adjacent motif) to help distinguish self versus non-self. See e.g., “Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes Ferretti, J. J. et al., Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 4658-4663 (2001) ; “CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor Rnase III. ” Deltcheva E. et al., Nature 471 : 602-607 (2011) ; and “Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. ” Jinek M . etal, Science 337: 816-821(2012) , the entire contents of each of which are incorporated herein by reference) .

[0146] The PAM sequence can be any PAM sequence known in the art. Suitable PAM sequences include, but are not limited to, NGG, NGA, NGC, NGN, NGT, NGCG, NGAG, NGAN, NGNG, NGCN, NGCG, NGTN, NNGRRT, NNNRRT, NNGRR (N) , TTTV, TYCV, TYCV, TATV, NNNNGATT, NNAGAAW, or NAAAAC. Y is a pyrimidine; N is any nucleotide base; W is A or T.

[0147] The gRNA described herein may comprise two or more individual polynucleotides, which can interact with one another via for example complementary base pairing. For example, a gRNA can comprise a CRISPRRNA (crRNA) and a trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) or can comprise one or more trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) . The framework sequence of the gRNA (the sequence except the base complementary pairing region) can be any disclosed in the prior art, for example, as disclosed in PCT / US2013 / 032589 and PCT / US2013 / 074825. Thus, a skilled artisan can change the genomic target of the Cas protein specificity is partially determined by how specific the gRNA targeting sequence is for the genomic target compared to the rest of the genome. In the present disclosure, “the sequence of gRNA” can mean the target-specific sequence (base complementary pairing region) of the gRNA.

[0148] A gRNA may include natural or non-natural (or unnatural) nucleotides. In some cases, the base complementary pairing region of a gRNA can be at least 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 nucleotides in length. A base complementary pairing region of a gRNA can be between 10-30 nucleotides in length, or between 15-25 nucleotides in length, or between 15-20 nucleotides in length.

[0149] The gRNA can be synthesized chemically, synthesized enzymatically, or a combination thereof. For example, the gRNA can be synthesized using standard phosphoramidite-based solid-phase synthesis methods. Alternatively, the gRNA can be synthesized in vitro by operably linking DNA encoding the gRNA to a promoter control sequence that is recognized by a phage RNA polymerase. Examples of suitable phage promoter sequences include T7, T3, SP6 promoter sequences, or variations thereof. In embodiments in which the gRNA comprises two separate molecules (e.g., crRNA and tracrRNA) , the crRNA can be chemically synthesized and the tracrRNA can be enzymatically synthesized.

[0150] A gRNA may be expressed, for example, by a DNA that encodes the gRNA, e.g., a DNA vector comprising a sequence encoding the gRNA. The gRNA may be encoded alone or together with an encoded base editor or Cas9. Such DNA sequences may be introduced into an expression system, e.g., a cell, together or separately. For example, DNA sequences encoding a polynucleotide programmable nucleotide binding domain and a gRNA may be introduced into a cell, each DNA sequence can be part of a separate molecule (e.g., one vector containing the polynucleotide programmable nucleotide binding domain coding sequence and a second vector containing the gRNA coding sequence) or both can be part of a same molecule (e.g., one vector containing coding (and regulatory) sequence for both the polynucleotide programmable nucleotide binding domain and the gRNA) . An RNA can be transcribed from a synthetic DNA molecule, e.g., a gene fragment. A gRNA molecule can be transcribed in vitro.

[0151] A gRNA can target a nucleic acid sequence of about 20 nucleotides or less than about 20 nucleotides (e.g., at least about 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 nucleotides) , or anywhere between about 1-100 nucleotides (e.g., 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100) . A target nucleic acid sequence can be or can be about 20 bases immediately 5’ of the first nucleotide of the PAM. A gRNA can target a nucleic acid sequence. A target nucleic acid can be at least or at least about 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 1-70, 1-80, 1-90, or 1-100 nucleotides.

[0152] Methods for selecting, designing, and validating guide polynucleotides, e.g., gRNAs described herein, are known to those skilled in the art. A software tool can be used to optimize the choice of gRNA, e.g., to minimize total off-target activity across the genome. Off target activity may be other than cleavage. For each possible gRNA choice using S. pyogenes Cas9, the tool can identify all off-target sequences (preceding either NAG or NGG PAMs) across the genome that contain up to certain number (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10) of mismatched base-pairs. The cleavage efficiency at each off-target sequence can be predicted, e.g., using an experimentally-derived weighting scheme. Each possible gRNA is then ranked according to its total predicted off-target cleavage; the top-ranked gRNAs represent those that are likely to have the greatest on-target and the least off-target cleavage. Other functions, e.g., automated reagent design for CRISPR construction, primer design for the on-target Surveyor assay, and primer design for high-throughput detection and quantification of off-target cleavage via next-gen sequencing, can also be included in the tool. Candidate universal gRNAs in the present application can be generated and functionally evaluated by using methods known in the art and / or as set forth herein.

[0153] Following identification, gRNAs can be grouped based on the frequency at which the gRNA target the sequences of allelic variants of a specific locus, e.g., HLA-A, HLA-B, or HLA-C. “Coverage” refers to the number of the alleleic variants the gRNA target over the total number of the alleleic variants, e.g., as disclosed in the database described herein, for a specific locus. E. g., HLA-A, HLA-B, or HLA-C. For example, if a gRNA targets all of the alleleic variants in a locus, e.g., HLA-A, HLA-B, or HLA-C, the gRNA targets the alleleic variants of a specific locus at a coverage of 100%.

[0154] After that, the gRNAs can be ranked into tiers based on their distance to the target site, their orthogonality or presence of a 5’ G (based on identification of close matches in the human genome containing a relevant PAM , e.g., in the case of S. pyogenes, a NGG PAM) PAM. Orthogonality refers to the number of sequences in the human genome that contain a minimum number of mismatches to the target sequence. A “high level of orthogonality” or “good orthogonality” may, for example, refer to 20-mer gRNAs that have no identical sequences in the human genome besides the intended target, nor any sequences that contain one or two mismatches in the target sequence. Targeting domains with good orthogonality are selected to minimize off-target DNA cleavage.

[0155] During virus-host co-evolution, viral RNA capping that mimics capping of mRNA evolved to allow viral RNA to escape detection from the cell’s innate immune system. Toll-like receptors in target cells (e.g., HSPCs) sense the presence of foreign single and double stranded RNA that can lead to innate immune response, cell senescence, and programmed cell death. Human HSPCs electroporated with unmodified (e.g. gRNAs synthesized without a 5’ cap or 3’ polyA-tail) gRNA molecules and Cas9 mRNA may lead to reduced cell survival, proliferation potential, or multipotency compared to cells electroporated with GFP mRNA alone. To evade the cell’s innate immune response to foreign nucleic acid, modifying the gRNA molecules to resemble mRNA (e.g., addition of 5’ cap and 3’ polyA tail) can prevent innate immune response in the cell, interferon response in the cell, cell senescence, or programmed cell death caused by sensing the foreign nucleic acid. The target cell can be contacted with a capped and tailed gRNA molecule. The target cell may be contacted with a Cas9 molecule / gRNA molecule complex containing a capped and tailed gRNA molecule. Contacting target cells with capped and tailed gRNA molecules can increase survival of modified target cells, preserve target cell multipotency, proliferation potential, or viability, or prevent cell senescence and programmed cell death.

[0156] One of ordinary skill in the art would understand that sequences disclosed herein which are described as RNA (e.g., “gRNA” ) and which include “T” residues encompass the corresponding sequence comprising U’s substituted for the T’s , and vice versa (e.g., sequences comprising U’s encompass the corresponding sequence comprising T’s ) . As such, in any sequence disclosed herein (e.g., gRNA sequences) , each uracil base (U) may independently and optionally be replaced with a thymine base (T) and each T may independently and optionally be replaced with a U. For example, one or more (e.g., all) of the U’s in a given sequence can be substituted with T’s , and one or more (e.g., all) of the T’s in a given sequence can be substituted with U’s . It should be understood that while sequences disclosed herein are shown with T or U nucleotides, both RNA and DNA sequences are contemplated, such that a sequence disclosed herein comprising T’s can also be provided or used with U’s in place of the T’s , and a sequence comprising U’s can also be provided or used with T’s in place of the U’s . Disrupting HLA genes using universal gRNAs

[0157] In one aspect, the disclosure provides a method of producing a modified cell, which has reduced or eliminated HLA expression relative to a starting cell, the method comprising disrupting HLA-A gene and / or HLA-B gene expression of a starting cell by targeting a nucleotide sequence on HLA gene through a gene silencing method, regardless of the HLA-Ahaplotype and / or HLA-B haplotype of the starting cell. Exemplary gene silencing methods include, but not limited to, CRISPR / Cas9, RNA interference (RNAi) technology, transcription activator-like (TAL) effector nucleases (TALENs) and Zinc finger nucleases (ZFNs) . The nucleotide sequence may be identical to any one of SEQ ID Nos: 1-74 and 76-78 or at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to any one of SEQ ID Nos: 1-74 and 76-78. An exemplary gene editing system of CRISPR / Cas9 or base editing can be established to target the nucleotide sequence described herein. The gene editing system may comprise a guide polynucleotide (e.g., gRNA) targeting the nucleotide sequence. An exemplary RNAi technology can be established to target the nucleotide sequence described herein. The RNAi technology may comprise a double-stranded RNA (dsRNA) targeting the nucleotide sequence described herein. The method may further comprise reducing or eliminating the expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) in the modified cell. The modified cell may come from any one of a plurality of different donors, wherein the HLA haplotypes of each donor differs from at least one of the other donors on at least one HLA haplotype.

[0158] In one aspect, the disclosure provides a method of producing a modified cell, the method comprising disrupting HLA-A gene and / or HLA-B gene of a cell by a gene editing system. The gene editing system can comprise a universal gRNA and a RNA-guided nuclease or a base editor, wherein the universal gRNA targets a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and / or more than one HLA-B haplotypes. The modified cell may have reduced or eliminated HLA-A and / or HLA-B expression. The universal gRNA in the method can be not specifically designed based on the HLA-A haplotype and / or the HLA-B haplotype of the cell prior to disruption of HLA-A gene and / or HLA-B gene. The HLA-Ahaplotype and / or the HLA-B haplotype in the cell may be undetermined prior to disruption of HLA-A gene and / or HLA-B gene. Whether the HLA-C gene on the cell is homozygous or heterozygous may be undetermined prior to disruption of HLA-A gene and / or HLA-B gene. There may be no need to determine the HLA-A haplotype and / or the HLA-B haplotype in the cell. The group of HLA-I haplotypes in the method may comprise: (i) at least 2338 different HLA-A haplotypes and / or at least 2782 different HLA-B haplotypes; (ii) at least 3897 different HLA-A haplotypes; (iii) at least 4637 different HLA-B haplotypes; or (iv) at least 7339 different HLA-A haplotypes and at least 3483 different HLA-B haplotypes. The group of HLA-I haplotypes in the method may comprise: (i) at least 30%global HLA-A haplotypes and / or at least 30%global HLA-B haplotypes; (ii) at least 50%global HLA-A haplotypes; (iii) at least 50%global HLA-B haplotypes; or (iv) at least 94%global HLA-A haplotypes and at least 37%global HLA-B haplotypes. The group of HLA-I haplotypes may be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%global population. The group of HLA-I haplotypes in the method may comprise no HLA-C haplotype. The group of HLA-I haplotypes in the method may comprise no more than 30%global HLA-C haplotypes. The universal gRNA in the method may comprise a sequence that is identical to any one of SEQ ID Nos: 1-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID Nos: 1-74 and 76-78. The method may further comprise reducing or eliminating the expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) in the modified cell.

[0159] In one aspect, the disclosure provides a method of producing a modified cell, comprising disrupting HLA-A gene of a cell by a gene editing system. The gene editing system can comprise a universal gRNA and a RNA-guided nuclease or a base editor, wherein the universal gRNA targets a group of HLA-A haplotypes comprising more than one HLA-Ahaplotypes. The modified cell may have reduced or eliminated HLA-A expression. The universal gRNA in the method can be not specifically designed based on the HLA-A haplotype of the cell prior to disruption of HLA-A gene. The HLA-A haplotype in the cell may be undetermined prior to disruption of HLA-A gene. There may be no need to determine the HLA-A haplotype in the cell. The group of HLA-A haplotypes in the method may comprise at least 3897 or at least 4286 different HLA-A haplotypes. The group of HLA-A haplotypes in the method may comprise at least 50% (e.g., more than 55%) global HLA-A haplotypes. The group of HLA-A haplotypes may be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%global population. The group of HLA-A haplotypes in the method may comprise no HLA-C haplotype. The group of HLA-A haplotypes in the method may comprise no more than 30% (e.g., less than 20%) global HLA-C haplotypes. The universal gRNA in the method may comprise a sequence that is identical to any one of SEQ ID Nos: 1-35 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID Nos: 1-35. The modified cell may be homozygous for HLA-B and HLA-C. The method may further comprise reducing or eliminating the expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) in the modified cell.

[0160] In one aspect, the disclosure provides a method of producing a modified cell, comprising disrupting HLA-B gene of a cell by a gene editing system. The gene editing system can comprise a universal gRNA and a RNA-guided nuclease or a base editor, wherein the universal gRNA targets a group of HLA-B haplotypes comprising more than one HLA-B haplotypes. The modified cell in the method may have reduced or eliminated HLA-B expression. The universal gRNA in the method can be not specifically designed based on the HLA-B haplotype of the cell prior to disruption of HLA-B gene. The HLA-B haplotype in the cell may be undetermined prior to disruption of HLA-B gene. There may be no need to determine the HLA-B haplotype in the cell. The group of HLA-B haplotypes in the method may comprise at least 4637 or at least 5100 different HLA-B haplotypes. The group of HLA-B haplotypes in the method may comprise at least 50% (e.g., more than 55%) global HLA-B haplotypes. The group of HLA-B haplotypes may be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%global population. The group of HLA-B haplotypes in the method may comprise no HLA-C haplotype. The group of HLA-B haplotypes in the method may comprise no more than 30% (e.g., less than 20%) global HLA-C haplotypes. The universal gRNA in the method may comprise a sequence that is identical to any one of SEQ ID Nos: 36-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID Nos: 36-74 and 76-78. The modified cell may be homozygous for HLA-A and HLA-C. The method may further comprise reducing or eliminating the expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) in the modified cell.

[0161] In one aspect, the disclosure provides a method of producing a modified cell, comprising disrupting HLA-A gene and HLA-B gene of a cell by a gene editing system. The gene editing system can comprise a universal gRNA and a RNA-guided nuclease or a base editor, wherein the universal gRNA targets a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and more than one HLA-B haplotypes. The modified cell may have reduced or eliminated HLA-A and HLA-B expression. The universal gRNA in the method can be not specifically designed based on the HLA-A haplotype and the HLA-B haplotype of the cell prior to disruption of HLA-A gene and HLA-B gene. The HLA-A haplotype and the HLA-B haplotype in the cell may be undetermined prior to disruption of HLA-A gene and HLA-B gene. Whether the HLA-C gene on the cell is homozygous or heterozygous may be undetermined prior to disruption of HLA-A gene and HLA-B gene There may be no need to determine the HLA-Ahaplotype and the HLA-B haplotype in the cell. The group of HLA-I haplotypes in the method may comprise at least 2338 different HLA-A haplotypes and at least 2782 different HLA-B haplotypes. The group of HLA-I haplotypes in the method may comprise at least 30%global HLA-A haplotypes and at least 30%global HLA-B haplotypes. The group of HLA-I haplotypes may be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%global population. The group of HLA-I haplotypes in the method may comprise no HLA-C haplotype. The group of HLA-I haplotypes in the method may comprise no more than 30% (e.g., less than 20%) global HLA-C haplotypes. The universal gRNA in the method may comprise a sequence that is identical to any one of SEQ ID Nos: 4, 6, 16, 17, 18, 20, 22, 31, 38, 39, 40, 47, 59, 60, and 61 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID Nos: 4, 6, 16, 17, 18, 20, 22, 31, 38, 39, 40, 47, 59, 60, and 61. The method may further comprise reducing or eliminating the expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) in the modified cell.

[0162] In one aspect, the disclosure provides a method of producing a modified cell, comprising disrupting HLA-A gene and HLA-B gene of a cell by a gene editing system. The gene editing system can comprise a first universal gRNA, a second universal gRNA and a RNA-guided nuclease or a base editor. The first universal gRNA can target a group of HLA-A haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes, and the second universal gRNA can target a group of HLA-B haplotypes comprising more than one HLA-B haplotypes. The modified cell may have reduced or eliminated HLA-A and HLA-B expression. The first universal gRNA may not be specifically designed based on the HLA-A haplotype of the cell prior to disruption of HLA-A gene, and the second universal gRNA may not be specifically designed based on the HLA-B haplotype of the cell prior to disruption of HLA-B gene. The HLA-A haplotype and the HLA-B haplotype in the cell may be undetermined prior to disruption of HLA-A gene and HLA-B gene. Whether the HLA-C gene on the cell is homozygous or heterozygous may be undetermined prior to disruption of HLA-A gene and HLA-B gene. There may be no need to determine the HLA-A haplotype and the HLA-B haplotype in the cell. The group of HLA-A haplotypes may comprise at least 3897 or at least 4286 different HLA-Ahaplotypes and the group of HLA-B haplotypes may comprise at least 4637 or at least 5100 different HLA-B haplotypes. The group of HLA-A haplotypes may comprise at least 50% (e.g., at least 55%) global HLA-A haplotypes, and the group of HLA-B haplotypes may comprise at least 50% (e.g., at least 55%) global HLA-B haplotypes. HLA-A haplotypes in the group of HLA-A haplotypes may be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%global population and / or HLA-B haplotypes in the group of HLA-B haplotypes may be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%global population. The group of HLA-A haplotypes and / or the group of HLA-B haplotypes comprises no HLA-C haplotype. The group of HLA-A haplotypes and / or the group of HLA-B haplotypes may comprise no more than 30% (e.g., less than 20%) global HLA-C haplotypes. The first universal gRNA may comprise a sequence that is identical to any one of SEQ ID Nos: 1-35 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID Nos: 1-35. The second universal gRNA may comprise a sequence that is identical to any one of SEQ ID Nos: 36-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID Nos: 36-74 and 76-78. The method may further comprise reducing or eliminating the expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) in the modified cell.

[0163] In one aspect, the disclosure provides a method of producing a modified cell, comprising disrupting HLA-A gene of a cell by a gene editing system. The HLA-A haplotype of the cell can be any of A*02: 01, A*02: 03, A*02: 07, A*03: 01, A*11: 01, and A*24: 02. The modified cell may have reduced or eliminated HLA-A expression. The gene editing system may comprise a gRNA comprising a sequence that is identical to SEQ ID NO: 4, 6, 18 or 23 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 4, 6, 18 or 23. The modified cell may be homozygous for HLA-B and HLA-C. The method may further comprise reducing or eliminating the expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) in the modified cell.

[0164] In one aspect, the disclosure provides a method of producing a modified cell, comprising disrupting HLA-B gene of a cell by a gene editing system. The HLA-B haplotype of the cell can be any of B*07: 02, B*08: 01, B*18: 01, B*35: 08, B*39: 01, B*40: 01, B*46: 01, B*54: 01, B*55: 01, and B*55: 02. The modified cell may have reduced or eliminated HLA-B expression. The gene editing system may comprise a gRNA comprising a sequence that is identical to SEQ ID NO: 70, 71, 140, or 141 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 70, 71, 140, or 141. The modified cell may be homozygous for HLA-A and HLA-C. The method may further comprise reducing or eliminating the expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) in the modified cell.

[0165] In one aspect, the disclosure provides a method of producing a modified cell, comprising disrupting HLA-A gene and HLA-B gene of a cell by a gene editing system. The HLA-A haplotype of the cell can be any of A*02: 01, A*02: 03, A*02: 07, A*03: 01, A*11: 01, and A*24: 02. The HLA-B haplotype of the cell can be any of B*07: 02, B*08: 01, B*18: 01, B*35: 08, B*39: 01, B*40: 01, B*46: 01, B*54: 01, B*55: 01, and B*55: 02. The gene editing system can comprise a first gRNA comprising a sequence that is identical to SEQ ID NO: 4, 6, 18 or 23 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 4, 6, 18 or 23. The gene editing system can further comprise a second gRNA comprising a sequence that is identical to SEQ ID NO: 70, 71, 140, or 141 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 70, 71, 140, or 141. The modified cell may be homozygous for HLA-C. The method may further comprise reducing or eliminating the expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) in the modified cell.

[0166] The RNA-guided nuclease described herein may be a Cas9 nuclease. The RNA-guided nuclease described herein may be an inactivated Cas9 nuclease with a cytosine base editor or an adenine base editor. The modified cell in the method described herein may be a stem cell, a T cell, a NK cell, a NKT-like cell, a cytokine induced killer cell (CIK) , a macrophage, a monocyte, a neutrophil, a NKT, a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , a cord blood cell, or a hematopoietic stem cell (HSC) . The method described herein may further comprise introducing a nucleotide encoding an engineered receptor into the modified cell. The engineered receptor may be an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , a T cell antigen coupler (TAC) or a portion thereof. The CAR or TCR can target CD19, PSCA, CD123, CD20, CEA (carcinoembryonic antigen) , FAP, CD133, EGFR, EGFRVIII, BCMA, PSMA, Her2, CA125, EphA2, C-met, L1CAM, VEGFR, CS1, ROR1, EC, NY-ESO-1, MUC1, MUC16, mesothelin, LewisY, GPC3, GD2, EPG, DLL3, CD99, 5T4, CD22, CD30, CD33, CD138, or CD171.

[0167] In one aspect, this disclosure provides methods for producing immune-compatible cells. The disclosure provides methods to disrupt the HLA-A genes and / or HLA-B genes of a cell by using a universal guide RNA (gRNA) . For example, the method can include one or more of the following steps: 1) designing, tiering, and screening of a universal gRNA that can target HLA-A genes and / or HLA-B genes, 2) delivery of a RNA-guided nuclease / based editor and the universal gRNA to disrupt (e.g., knock out or knock down) HLA-A genes and / or HLA-B genes, and 3) validating loss of HLA expression at the cell surface by flow cytometry. The RNA-guided nuclease may be a Cas9 nuclease. The RNA-guided nuclease may be an inactivated Cas9 nuclease with a cytosine base editor (CBE) or an adenine base editor (ABE) . CBEs mediate a C to T change (or a G to A change on the opposite strand) . ABEs make an A to G change (or a T to C change on the opposite strand) . In general, base editing requires (1) a Cas nickase or Cas fused to a base editor (e.g., a deaminase, a cytosine base editor or an adenine base editor) that makes the edit; (2) a gRNA targeting Cas to a specific locus; (3) a target base for editing within the editing window specified by the Cas protein.

[0168] Before and after gene editing, cells can be cultured in media under optimized cell culture conditions to promote cell survival and preservation of cell (e.g., T cells or HSPC) phenotype and functionality and to prevent cell immune response from exposure to Cas9 and gRNA components. Cells can be expanded or cultured under optimized conditions to promote cell maintenance and to prevent differentiation. The cell can be expanded or cultured under optimized conditions before editing the HLA genes. The cell (e.g., HSPCs) can be expanded or cultured under optimized conditions after editing the HLA genes.

[0169] The cells for engineering can be isolated from a sample, such as a biological sample, e.g., one obtained from or derived from a subject. The subject from which the cell is isolated can be one having the disease or condition or in need of a cell therapy (autologous cells) . The subject from the which the cell is isolated can be a different subject other than the one having the disease or condition or in need of a cell therapy (e.g., allogeneic cells) .

[0170] The cells may be primary cells, e.g., primary human cells. The samples may include tissue, fluid, and other samples taken directly from the subject, as well as samples resulting from one or more processing steps, such as separation, centrifugation, genetic engineering (e.g., transduction with viral vector) , washing, and / or incubation. The biological sample may be a sample obtained directly from a biological source or a sample that is processed. Biological samples include, but are not limited to, body fluids, such as blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, synovial fluid, urine and sweat, tissue and organ samples, including processed samples derived therefrom.

[0171] The modified cells may express a decreased level of HLA-A genes and / or HLA-B genes as compared to that in the starting cell and / or a decreased level of endogenous T cell receptor (TCR) as compared to that in the starting cell. The modified cell may elicit no or reduced GvHD and / or HvD response in a histoincompatible individual as compared to the GvHD and / or HvG response elicited by a primary T cell isolated from the donor of the starting T cell from which the modified cell is derived.

[0172] Primary T cells can be isolated from human PBMC. The primary T cells can be activated with anti-CD3 / CD28 beads and cultured in RPMI1640 medium supplemented with 300 IU / mL IL-2. Cas9 protein and gRNAs can be introduced into the activated T cells by electroporation. The knocking out efficiency can be determined by flow cytometry analysis, by detecting the cell surface expression of HLA-A genes and / or HLA-B genes. Exemplary knocking out efficiencies of gRNAs are shown in Tables 3-5.

[0173] Primary T cells can be isolated from human PBMC. The primary T cells can be activated with anti-CD3 / CD28 beads and cultured in RPMI1640 medium supplemented with 300 IU / mL IL-2. Cytosine base editor (CBE) protein and gRNAs can be introduced into the activated T cells by electroporation. The knocking out efficiency can be determined by flow cytometry analysis, by detecting the cell surface expression of HLA-A genes and / or HLA-B genes. Exemplary knocking out efficiencies of gRNAs are shown in Table 6.

[0174] Additional gRNAs may be used to knock out the B2M gene and / or the CIITA gene. The method described herein may further comprise disrupting the expression of endogenous TCR.

[0175] The methods described herein can knock out HLA-A genes with a knocking out efficiency of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The methods described herein can knock out HLA-A genes with a knocking out efficiency of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. The methods described herein can knock out HLA-A genes with a knocking out efficiency of 10%-90%, 30%-90%, or 50%-90%.

[0176] The methods described herein can knock out HLA-B genes with a knocking out efficiency of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The methods described herein can knock out HLA-B genes with a knocking out efficiency of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. The methods described herein can knock out HLA-B genes with a knocking out efficiency of 5%-90%, 30%-90%, or 50%-90%.

[0177] The methods described herein can knock out both HLA-A genes and HLA-B genes with a knocking out efficiency of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The methods described herein can knock out both HLA-A genes and HLA-B genes with a knocking out efficiency of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. The methods described herein can knock out both HLA-A genes and HLA-B genes with a knocking out efficiency of 10%-90%, 30%-90%, or 50%-90%.

[0178] The methods described herein can knock out HLA-C genes with a knocking out efficiency of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. The methods described herein can knock out HLA-C genes with a knocking out efficiency of 0%-90%, 0%-30%, or 0%-10%.

[0179] Disclosed herein are methods for disrupting a target position in a gene or locus, e.g., an HLA gene or locus. Disrupting the target position can be achieved, e.g., by disrupting one or more locus or allelic variants in the gene. Disrupting the target position can be achieved, e.g., by: (1) knocking out a gene: (a) insertion or deletion (e.g., NHEJ-mediated insertion or deletion) of one or more nucleotides in the gene, or (b) deletion (e.g., NHEJ-mediated deletion) of a genomic sequence including at least a portion of the gene, or (2) knocking down a gene mediated by enzymatically inactive Cas9 (eiCas9) molecule or an eiCas9-fusion protein (e.g., fused to a transcriptional repressor) by targeting the promoter region of the gene. Both approaches give rise to disruption of the gene.

[0180] The method may comprise introducing an insertion or deletion of one more nucleotides within a locus, e.g., an HLA locus, e.g., the coding region of an HLA locus (e.g., HLA-A or HLA-B) .As described herein, in one embodiment, the method comprises the introduction of one or more breaks (e.g., single strand breaks or double strand breaks) within an HLA locus, e.g., the coding region of an HLA locus (e.g., HLA-A or HLA-B) . NHEJ-mediated repair of the break (s) allows for the NHEJ-mediated introduction of an indel within an HLA locus, e.g., the coding region of an HLA locus (e.g., HLA-A or HLA-B) .

[0181] The method may comprise introducing a deletion of a genomic sequence comprising at least a portion (e.g., a portion within a coding region, e.g., an early coding region, or a portion within a non-coding region, e.g., a non-coding sequence of the HLA locus, e.g., a promoter, an enhancer, an intron, a 3’ UTR, and / or a polyadenylation signal) of an HLA locus (e.g., HLA-A or HLA-B) . As described herein, The method may comprise the introduction of two double stand breaks-one 5’ and the other 3’ to (i.e., flanking) a position (e.g., within a coding region, e.g., an early coding region, or within a non-coding region, e.g., a non-coding sequence of the HLA locus, e.g., a promoter, an enhancer, an intron, a 3’ UTR, and / or a polyadenylation signal) of an HLA locus (e.g., HLA-A or HLA-B) . Two gRNAs, e.g., unimolecular (or chimeric) or modular gRNA molecules, may be configured to position the two double strand breaks on opposite sides of a position (e.g., within a coding region, e.g., an early coding region, or within a non-coding region, e.g., a non-coding sequence of the HLA locus, e.g., a promoter, an enhancer, an intron, a 3’ UTR, and / or a polyadenylation signal) of an HLA locus (e.g., HLA-A or HLA-B) .

[0182] A single strand break may be introduced (e.g., positioned by one gRNA molecule) within an HLA locus, e.g., the coding region of an HLA locus (e.g., HLA-A or HLA-B) . A single gRNA molecule (e.g., with a Cas9 nickase) may be used to create a single strand break within an HLA locus, e.g., the coding region of an HLA locus (e.g., HLA-A or HLA-B or downstream of a position within an HLA locus, e.g., of the coding region of an HLA locus (e.g., HLA-A or HLA-B) .The break can be positioned to avoid unwanted target chromosome elements, such as repeat elements, e.g., an Alu repeat.

[0183] A double strand break can be introduced (e.g., positioned by one gRNA molecule) within an HLA locus, e.g., the coding region of an HLA locus (e.g., HLA-A or HLA-B) . A single gRNA molecule (e.g., with a Cas9 nuclease other than a Cas9 nickase) can be used to create a double strand break within an HLA locus, e.g., the coding region of an HLA locus (e.g., HLA-Aor HLA-B) , e.g., the gRNA molecule is configured such that the double strand break is positioned either upstream or downstream of a position within an HLA locus, e.g., of the coding region of an HLA locus (e.g., HLA-A or HLA-B) . The break can be positioned to avoid unwanted target chromosome elements, such as repeat elements, e.g., an Alu repeat.

[0184] Humans are diploid organisms containing two pairs of homologous chromosome that share the same genes but vary in alleles. Only one allele of a gene can be present at the gene loci of a single chromosome, as a result a pair of homologous chromosome contain two alleles of a gene. The universal gRNA can target both alleles of a given HLA-A gene in a cell. The universal gRNA can target both alleles of a given HLA-B gene in a cell.

[0185] A targeted knockdown approach reduces or eliminates expression of functional gene product, e.g., a functional HLA gene product (e.g., HLA-A or HLA-B) . A targeted knockdown can be mediated by targeting an enzymatically inactive Cas9 (eiCas9) molecule or an eiCas9 fused to a transcription repressor domain or chromatin modifying protein to alter transcription, e.g., to block, reduce, or decrease transcription, of an HLA gene.

[0186] In one aspect, the disclosure provides a method of building a cell bank for allogeneic cell therapy, comprising: (1) obtaining cells from a plurality of different donors; (2) disrupting the expression of HLA-A gene and HLA-B gene of these cells without identifying the HLA-Aand HLA-B haplotypes; (3) selecting cells that do not express the HLA-A and HLA-B.

[0187] In some embodiments, the method comprises (4) selecting cells that are homozygous for HLA-C.

[0188] In some embodiments, the selected cells expresses HLA-C haplotype selected from the group comprising C*01: 02, C*07: 02, C*03: 04, C*06: 02, C*08: 01, C*03: 03, C*03: 02, C*04: 01, C*14: 02, C*15: 02, C*12: 02, C*12: 03, C*14: 03, C*04: 03, C*08: 22, C*07: 04, C*05: 01, C*07: 06, C*08: 03, and C*15: 05.

[0189] In some embodiments, the method comprises disrupting the expression of HLA-Agene and HLA-B gene of these cells using a universal gRNA comprising a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78.

[0190] The methods and composition described herein may also include additional non-HLA genetic modifications to donor cells. The methods may also involve knocking out the β2 microglobulin (B2M) gene. B2M is a component of MHC class I molecules. Without being bound by theory, knocking out the B2M gene can further increase the immune compatibility of the modified cells. The method may further involve knocking out the class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) gene. CIITA controls the expression of HLA class II genes. Without being bound by theory, knocking out the CIITA gene can further increase the immune compatibility of the modified cells. The method may further involve overexpressing the HLA-E gene (e.g., in a single chain trimer (SCT) form) . HLA-E has a very specialized role in cell recognition by natural killer cells (NK cells) . Without being bound by theory, overexpressing HLA-E can protect the modified cells from NK cell mediated cell killing. The methods may further involve disrupting the expression of an endogenous TCR. Modified cells

[0191] In one aspect, the present disclosure provides a modified cell which has reduced or eliminated expression of HLA-A and / or HLA-B relative to an unmodified cell, comprising a genetic modification in the HLA-A and / or HLA-B gene. The modification may comprise at least one splice site mutation within the genomic coordinates chr6: 29942532-29945870 and / or chr6: 31353875-31357179. The modification may comprise at least one C to T substitution or at least one A to G substitution within the genomic coordinates chr6: 29942532-29945870 and / or chr6: 31353875-31357179. The modification may comprise at least one splice site mutation within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NO: 1-74 and 76-78 or within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NO: 1-74 and 76-78. The modification may comprise at least one C to T substitution or at least one A to G substitution within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NO: 1-74 and 76-78 or within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NO: 1-74 and 76-78. The modified cell may have no genetic modification in the HLA-C gene. The modified cell may be homozygous or heterozygous for HLA-C. The modified cell may have reduced or eliminated expression of CIITA. The modified cell may be used to treat various disorder or disease as described herein (e.g., cancer) .

[0192] In one aspect, the present disclosure provides a modified cell which has reduced or eliminated expression of HLA-A relative to an unmodified cell, comprising a genetic modification in the HLA-A gene. The modification may comprise at least one splice site mutation within the genomic coordinate chr6: 29942532-29945870. The modification may comprise at least one C to T substitution or at least one A to G substitution within the genomic coordinate chr6: 29942532-29945870. The modification may comprise at least one splice site mutation within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NO: 1-35 or within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NO: 1-35. The modification may comprise at least one C to T substitution or at least one A to G substitution within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NO: 1-35 or within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NO: 1-35. The modified cell may have no genetic modification in the HLA-C gene. The modified cell may be homozygous or heterozygous for HLA-C. The modified cell may have reduced or eliminated expression of CIITA. The modified cell may be used to treat various disorder or disease as described herein (e.g., cancer) .

[0193] In one aspect, the present disclosure provides a modified cell which has reduced or eliminated expression of HLA-B relative to an unmodified cell, comprising a genetic modification in the HLA-B gene. The modification may comprise at least one splice site mutation within the genomic coordinate chr6: 31353875-31357179. The modification may comprise at least one C to T substitution or at least one A to G substitution within the genomic coordinate chr6: 31353875-31357179. The modification may comprise at least one splice site mutation within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78 or within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78. The modification may comprise at least one C to T substitution or at least one A to G substitution within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78 or within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78. The modified cell may have no genetic modification in the HLA-C gene. The modified cell may be homozygous or heterozygous for HLA-C. The modified cell may have reduced or eliminated expression of CIITA. The modified cell may be used to treat various disorder or disease as described herein (e.g., cancer) .

[0194] In one aspect, the present disclosure provides a modified cell which has reduced or eliminated expression of HLA-A and HLA-B relative to an unmodified cell, comprising a genetic modification in the HLA-A and HLA-B gene. The modification may comprise at least one splice site mutation within the genomic coordinates chr6: 29942532-29945870 and chr6: 31353875-31357179. The modification may comprise at least one C to T substitution or at least one A to G substitution within the genomic coordinates chr6: 29942532-29945870 and chr6: 31353875-31357179. The modification may comprise at least one splice site mutation within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 4, 6, 16, 17, 18, 20, 22, 31, 38, 39, 40, 47, 59, 60 and 61 on HLA gene. The modification may comprise at least one splice site mutation within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NOs: 4, 6, 16, 17, 18, 20, 22, 31, 38, 39, 40, 47, 59, 60, and 61 on HLA gene. The modification may comprise at least one C to T substitution or at least one A to G substitution within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 4, 6, 16, 17, 18, 20, 22, 31, 38, 39, 40, 47, 59, 60 and 61 on HLA gene. The modification may comprise at least one C to T substitution or at least one A to G substitution within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NOs: 4, 6, 16, 17, 18, 20, 22, 31, 38, 39, 40, 47, 59, 60, and 61 on HLA gene. The modification may comprise at least one splice site mutation within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1-36 on HLA-A gene and within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78 on HLA-B gene. The modification may comprise at least one splice site mutation within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NOs: 1-36 on HLA-A gene and within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78 on HLA-B gene. The modification may comprise at least one C to T substitution or at least one A to G substitution within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1-36 on HLA-A gene and within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78 on HLA-B gene. The modification may comprise at least one C to T substitution or at least one A to G substitution within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NOs: 1-36 on HLA-A gene and within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NOs: 36-74, and 76-78 on HLA-B gene. The modification may comprise at least one splice site mutation within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 15, 17, 18, 23, 30, 31 and 33 on HLA-A gene and within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, and 76-78. The modification may comprise at least one splice site mutation within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 15, 17, 18, 23, 30, 31 and 33 on HLA-A gene and within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, and 76-78. The modification may comprise at least one C to T substitution or at least one A to G substitution within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 15, 17, 18, 23, 30, 31 and 33, and within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, and 76-78. The modification may comprise at least one C to T substitution or at least one A to G substitution within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 15, 17, 18, 23, 30, 31 and 33, and within the nucleotide sequence complimentary to any of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, and 76-78. The modified cell may have no genetic modification in the HLA-C gene. The modified cell may be homozygous or heterozygous for HLA-C. The modified cell may have reduced or eliminated expression of CIITA. The modified cell may be used to treat various disorder or disease as described herein (e.g., cancer) .

[0195] In one aspect, the present disclosure provides modified cells (e.g., modified immune cells) with an improved immune compatibility. In one aspect, the present disclosure provides modified cells with disrupted HLA-A genes and / or HLA-B genes. The HLA-A gene and / or HLA-B gene of the modified cell can be disrupted using a gene editing system comprising a universal guide RNA (gRNA) and a RNA-guided nuclease or a base editor. The universal gRNA can target a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and / or more than one HLA-B haplotypes. The group of HLA-I haplotypes may comprise at least 30%global HLA-Ahaplotypes and / or at least 30%global HLA-B haplotypes. Haplotypes in the group of HLA-I haplotypes can be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population. The group of HLA-I haplotypes may comprise no HLA-C haplotype. The group of HLA-I haplotypes may comprise no more than 30% (e.g., less than 20%) global HLA-C haplotypes. The universal gRNA may comprise a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID Nos: 1-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID Nos: 1-74 and 76-78. The modified cells may have reduced or eliminated expression of CIITA. The modified immune cells may be used to treat various disorder or disease as described herein (e.g., cancer) .

[0196] In one aspect, the present disclosure provides modified cells (e.g., modified immune cells) with an improved immune compatibility. In one aspect, the present disclosure provides modified cells with disrupted HLA-A genes. The HLA-A gene and of the modified cell can be disrupted using a gene editing system comprising a universal guide RNA (gRNA) and a RNA-guided nuclease or a base editor. The universal gRNA can target a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes. The group of HLA-I haplotypes may comprise at least 30% (e.g., more than 55%, 60%, 70%, 80%or 90%) global HLA-A haplotypes. Haplotypes in the group of HLA-I haplotypes can be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population. The group of HLA-I haplotypes may comprise no HLA-C haplotype. The group of HLA-I haplotypes may comprise no more than 30% (e.g., less than 20%) global HLA-C haplotypes. The universal gRNA may comprise a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-35 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-35. The modified cells may have reduced or eliminated expression of CIITA. The modified immune cells may be used to treat various disorder or disease as described herein (e.g., cancer) .

[0197] In one aspect, the present disclosure provides modified cells (e.g., modified immune cells) with an improved immune compatibility. In one aspect, the present disclosure provides modified cells with disrupted HLA-B genes. The HLA-B gene and of the modified cell can be disrupted using a gene editing system comprising a universal guide RNA (gRNA) and a RNA-guided nuclease or a base editor. The universal gRNA can target a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-B haplotypes. The group of HLA-I haplotypes may comprise at least 30% (e.g., more than 55%, 60%, 70%, 80%or 90%) global HLA-B haplotypes. haplotypes in the group of HLA-I haplotypes can be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population. The group of HLA-I haplotypes may comprise no HLA-C haplotype. The group of HLA-I haplotypes may comprise no more than 30% (e.g., less than 20%) global HLA-C haplotypes. The universal gRNA may comprise a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78. The modified cells may have reduced or eliminated expression of CIITA. The modified immune cells may be used to treat various disorder or disease as described herein (e.g., cancer) .

[0198] In one aspect, the present disclosure provides modified cells (e.g., modified immune cells) with an improved immune compatibility. In one aspect, the present disclosure provides modified cells with disrupted HLA-A genes and HLA-B genes. The HLA-A gene and HLA-B gene of the modified cell can be disrupted using a gene editing system comprising a universal guide RNA (gRNA) and a RNA-guided nuclease or a base editor. The universal gRNA can target a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and more than one HLA-B haplotypes. The group of HLA-I haplotypes may comprise at least 30%global HLA-Ahaplotypes and at least 30%global HLA-B haplotypes. The group of HLA-I haplotypes can be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population. The group of HLA-I haplotypes may comprise no HLA-C haplotype. The group of HLA-I haplotypes may comprise no more than 30%(e.g., less than 20%) global HLA-C haplotypes. The universal gRNA may comprise a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 4, 6, 16, 17, 18, 20, 22, 31, 38, 39, 40, 47, 59, 60, and 61 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 4, 6, 16, 17, 18, 20, 22, 31, 38, 39, 40, 47, 59, 60, and 61. The modified cells may have reduced or eliminated expression of CIITA. The modified immune cells may be used to treat various disorder or disease as described herein (e.g., cancer) .

[0199] In one aspect, the present disclosure provides modified cells (e.g., modified immune cells) with an improved immune compatibility. In one aspect, the present disclosure provides modified cells with disrupted HLA-A genes and HLA-B genes. The HLA-A gene and HLA-B gene of the modified cell can be disrupted using a gene editing system comprising a universal guide RNA (gRNA) and a RNA-guided nuclease or a base editor. The gene editing system may comprise two universal guide RNA (gRNA) . The first universal gRNA can target a group of HLA-A haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes, and the second universal gRNA can target a group of HLA-B haplotypes comprising more than one HLA-B haplotypes. The group of HLA-A haplotypes may comprise at least 30% (e.g., more than 55%, 60%, 70%, 80%or 90%) global HLA-A haplotypes and the group of HLA-B haplotypes may comprise at least 30% (e.g., more than 55%, 60%, 70%, 80%or 90%) global HLA-B haplotypes. The group of HLA-A haplotypes may comprise at least 3897 different HLA-A haplotypes and the group of HLA-B haplotypes may comprise at least 4637 different HLA-B haplotypes. The group of the HLA-A haplotypes and the group of the HLA-B haplotypes may be capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population. The group of HLA-A haplotypes and / or the group of HLA-B haplotypes may comprise no HLA-C haplotype. The group of HLA-A haplotypes and / or the group of HLA-B haplotypes may comprise no more than 30% (e.g., less than 20%) global HLA-C haplotypes. The first universal gRNA may comprise a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-35 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-35. The second universal gRNA may comprise a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78. The first universal gRNA may comprise a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 15, 17, 18, 23, 30, 31 and 33, and the second universal gRNA may comprise a sequence (i.e., target-specific sequence) that is identical to any one of SEQ ID NOs: 40, 43, 58, 63, 65, 67, 70, 72, 73, 74, and 76-78. The modified cells may have reduced or eliminated expression of CIITA. The modified immune cells may be used to treat various disorder or disease as described herein (e.g., cancer) .

[0200] The modified cells described herein can express at least one HLA-C haplotype. The HLA-C gene on the modified cells may be homozygous or heterozygous. The HLA-C haplotype can be any one of or any combination of: C*01: 02, C*07: 02, C*03: 04, C*06: 02, C*08: 01, C*03: 03, C*03: 02, C*04: 01, C*14: 02, C*15: 02, C*12: 02, C*12: 03, C*14: 03, C*04: 03, C*08: 22, C*07: 04, C*05: 01, C*07: 06, C*08: 03, and C*15: 05.

[0201] The modified cells disclosed herein therefore provide a “partial matching” approach to the problem of allogeneic cell transfer and MHC class I compatibility. The use of cells that have reduced or eliminated expression of HLA-A and HLA-B, limits the number of donors that are necessary to provide a therapy that covers a majority of recipients in population because the disclosed partial matching approach requires only matching HLA-C allele. The cell may be used in an allogeneic cell therapy. The modified cell may be transferred to a recipient that has at least one of the same HLA-C haplotype with the modified cell. The modified cell may be transferred to a recipient that has one same HLA-C haplotype with the modified cell. The modified cell may be transferred to a recipient that has two same HLA-C haplotypes with the modified cell.

[0202] In one aspect, the present disclosure also provides a cell bank comprising the modified cell described herein. The cell bank may comprise information documenting the HLA-C haplotypes of the modified cells in the cell bank.

[0203] The modified cell may be a stem cell, a T cell, a NK cell, a NKT, a NKT-like cell, a cytokine induced killer cell (CIK) , a macrophage, a monocyte, a neutrophil, a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , a cord blood cell, or a hematopoietic stem cell (HSC) . The modified cell can express an engineered receptor (e.g., a CAR or TCR) . The modified cells described herein can express more than one engineered receptor, such as any combination of CAR, TCR, or TAC receptors. The CAR or TCR targets CD19, PSCA, CD123, CD20, CEA (carcinoembryonic antigen) , FAP, CD133, EGFR, EGFRVIII, BCMA, PSMA, Her2, CA125, EphA2, C-met, L1CAM, VEGFR, CS1, ROR1, EC, NY-ESO-1, MUC1, MUC16, mesothelin, LewisY, GPC3, GD2, EPG, DLL3, CD99, 5T4, CD22, CD30, CD33, CD138, or CD171.

[0204] In one aspect, the present disclosure provides a modified T cell (e.g., allogeneic T cell) comprising disrupted HLA-A genes and / or HLA-B genes. The modified cell may comprise reduced surface expression of HLA-A genes and / or HLA-B genes. The cell surface expression of HLA-A genes and / or HLA-B genes may be down-regulated by at least about any of 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%or 97%. The expression of endogenous HLA-C genes may be not down-regulated.

[0205] The starting cell that is to be engineered can be obtained from e.g., humans or non-human animals. For example, the starting cell can be obtained from humans, rats or mice. The starting cell may be a blood cell. The starting cell may be a leukocyte (e.g., a T cell) , lymphocyte or any other suitable blood cell type. The starting cell may be a peripheral blood cell. The starting cell may be a tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) . The starting cell may be a T cell, a B cell, an NKT cell or an NK cell. The starting cells may be human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) . The human PBMCs may be CD3+ cells. The human PBMCs may be CD8+ cells or CD4+ cells. The starting cell may be a T cell. The starting T cells may express one or more engineered receptors that recognize a specific antigen on the surface of a target cell. T cells can be obtained by various methods known in the art, e.g., in vitro culture of T cells (e.g., tumor infiltrating lymphocytes) isolated from subjects. The T cells may be CD4+ T cells, CD8+ T cells, or regulatory T cells. The T cells may be T helper type 1 T cells and / or T helper type 2 T cells. The T cell may be an αβ-T cell. The T cell may be a γδ-T cell. The T cells may be central memory T cells. The T cells may be effector memory T cells. The T cells may be  T cells. The starting cells may be stem cells, such as hematopoietic stem cell, embryonic stem cell and pluripotent stem cell, including induced pluripotent stem cells (iPSCs) . The starting cells can be primary cells, such as those isolated directly from a subject and / or isolated from a subject and frozen. The stem cells may be cultured with additional differentiation factors to obtain desired cell types (e.g., T cells) .

[0206] Different cell types can be obtained via appropriate isolation methods. The isolation methods include the separation of different cell types based on the expression or presence in the cell of one or more specific molecules, such as surface markers, e.g., surface proteins, intracellular markers, or nucleic acid. Any known method for separation based on such markers can be used. The separation may be affinity-or immunoaffinity-based separation. For example, the isolation in some aspects includes separation of cells and cell populations based on the cells’ expression or expression level of one or more markers, typically cell surface markers, for example, by incubation with an antibody or binding partner that specifically binds to such markers, followed generally by washing steps and separation of cells having bound the antibody or binding partner, from those cells having not bound to the antibody or binding partner.

[0207] Such separation steps can be based on positive selection, in which the cells having bound the reagents are retained for further use, and / or negative selection, in which the cells having not bound to the antibody or binding partner are retained. Both fractions may be retained for further use. Negative selection can be particularly useful where no antibody is available that specifically identifies a cell type in a heterogeneous population, such that separation is best carried out based on markers expressed by cells other than the desired population.

[0208] Comparing to the starting cells (e.g., donor cells or untreated cells) , the modified cells may have reduced expression of HLA-A genes and / or HLA-B genes. Comparing to the starting cells, the modified cells described herein may elicit reduced HVG response in a histoincompatible individual. The modified cells may express HLA-C genes. The modified cells may have reduced expressions of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) . The modified cells may have reduced expressions of endogenous TCR.

[0209] The modified cells can be autologous cells, syngeneic cells, allogeneic cells, or xenogeneic cells with respect to the individual receiving them. The modified cells can be modified by changing the major histocompatibility complex (MHC) profile, by inactivating β2-microglobulin to prevent the formation of functional Class I MHC molecules, or by inactivating Class II MHC molecules.

[0210] The modified cells may be modified to knock out the HLA-A genes and HLA-B genes. The modified cells may be further modified to knock out the B2M gene. the modified cells may be further modified to knock out the CIITA gene. The modified cell may be further modified to overexpress HLA-E. HLA-E can be overexpressed in a form of single chain trimer (SCT) , comprising a signal peptide, a bound peptide, a linker, mature human B2M, a linker, and mature HLA-E heavy chain. The cytotoxicity of the modified cells can be determined by a cytotoxicity assay. The modified cells may be labeled with Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) and co-cultured with CD8+ T cells derived from another donor (e.g., for 72 hours) . The modified cells may be labeled with CFSE and co-cultured with NK cells derived from another donor (e.g., for 24 hours) . The cells may be then stained for LIVE / DEAD to check the viability of cells via flow cytometry analysis.

[0211] Comparing to the starting cells (e.g., donor cells, or untreated (UnT) cells) , the modified cell described herein can have reduced cell killing by allogeneic CD8+ T cells. The viability of the modified cells may be at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%after incubation with allogeneic CD8+ T cells. By contrast, the viability of the starting cells (e.g., UnT cells) may be less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, less than 85%, less than 90%, less than 91%, less than 92%, less than 93%, less than 94%, less than 95%or less than 96%after incubation with allogeneic CD8+ T cells. As compared to the viability of the starting cells (e.g., UnT cells) , the viability of the modified cells may be at least 10%, at least 20%, at least 30%, least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 100%, at least 150%, at least 200%, at least three times, at least four times, at least five times, at least six times, at least seven times, at least eight times, at least nine times, at least ten times, at least 50 times, or at least 100 times higher after incubation with allogeneic CD8+ T cells. The methods described herein can decrease the killing efficiency by allogeneic CD8+ T cells against the modified cells. The methods described herein can decrease the killing efficiency by allogeneic CD8+ T cells against the modified cells by at least 10%, at least 20%, at least 30%, least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%.

[0212] Comparing to the starting cells (e.g., donor cells or UnT cells) , the modified cell described herein can have reduced cell killing by allogeneic NK cells. The viability of the modified cells may be at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%after incubation with allogeneic NK cells. By contrast, the viability of the starting cells (e.g., UnT cells) may be less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, less than 85%, less than 90%, less than 91%, less than 92%, less than 93%, less than 94%, less than 95%or less than 96%after incubation with allogeneic NK cells. As compared to the viability of the starting cells (e.g., UnT cells) , the viability of the modified cells may be at least 10%, at least 20%, at least 30%, least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 100%, at least 150%, at least 200%, at least three times, at least four times, at least five times, at least six times, at least seven times, at least eight times, at least nine times, at least ten times, at least 50 times, or at least 100 times higher after incubation with allogeneic NK cells. The methods described herein can decrease the killing efficiency by allogeneic NK cells against the modified cells. The methods described herein can decrease the killing efficiency by allogeneic NK cells against the modified cells by at least 10%, at least 20%, at least 30%, least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%.

[0213] HLA-E overexpression can also decrease the killing efficiency by allogeneic CD8+ T cells. HLA-E overexpression can also decrease the killing efficiency by allogeneic CD8+ T cells by at least 10%, at least 20%, at least 30%, least 40%, or at least 50%. HLA-E overexpression can also decrease the killing efficiency by allogeneic NK cells. HLA-E overexpression can also decrease the killing efficiency by allogeneic NK cells by at least 10%, at least 20%, at least 30%, least 40%, or at least 50%.

[0214] Knocking out the B2M gene can also decrease the killing efficiency by allogeneic CD8+ T cells. Knocking out the B2M gene can increase the killing efficiency by allogeneic NK cells by at least 10%, at least 20%, at least 30%, least 40%, or at least 50%. This increased killing efficiency by allogeneic NK cells can be mitigated by HLA-E overexpression. This increased killing efficiency by allogeneic NK cells can be mitigated by HLA-E overexpression by at least 10%, at least 20%, at least 30%, least 40%, or at least 50%. Engineered receptor

[0215] One aspect of the present disclosure provides modified cells that also express an engineered receptor. The engineered receptor can comprise an extracellular ligand binding domain or an extracellular antigen binding domain that specifically binds to an antigen (e.g., a tumor antigen) , a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain. The engineered receptor may comprise a signal peptide located at the N-terminus of the extracellular ligand binding domain. The engineered receptor can be encoded by a heterologous polynucleotide operably linked to a promoter (such as a constitutive promoter or an inducible promoter) . Exemplary engineered receptors include, but are not limited to, chimeric antigen receptor (CAR) , engineered T-cell receptor (TCR) , and T-cell antigen coupler (TAC) receptor.

[0216] The engineered receptor can be monovalent and monospecific. The engineered receptor can be multivalent and monospecific. The engineered receptor can be multivalent and multispecific.

[0217] The engineered receptor can comprise: (a) an extracellular ligand binding domain, (b) a transmembrane domain (e.g., derived from CD8α) , and (c) an intracellular signaling domain (ISD) comprising a chimeric signaling domain (CMSD) . The CMSD may contain one or a plurality signaling motifs known as Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs, or ITAMs. The plurality of ITAMs may be connected by one or more linkers. The plurality of ITAMs may be directly connected to each other. The ITAMs may be derived from a protein selected from the group consisting of CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, common FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon Rib) , CD79a, CD79b, Fcgamma R IIa, DAP10, and DAP 12. The engineered receptor may have an intracellular signaling domain derived from CD3ζ. The engineered receptor may not have any sequence derived from CD3ζ (e.g., human CD3ζ) .

[0218] The antigen of the engineered receptor may be a tumor antigen selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, hTERT, IL-13Rα2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, PD-L2, and other tumor antigens with clinical significance, and combinations thereof. The antigen may be CD20. The tumor antigen can be derived from an intracellular protein of tumor cells. The tumor antigen can be expressed on the surface of tumor cells. Many TCRs specific for tumor antigens (including tumor-associated antigens) have been described, including, for example, NY-ESO-1 cancer-testis antigen, the p53 tumor suppressor antigens, TCRs for tumor antigens in melanoma (e.g., MARTI, gp 100) , leukemia (e.g., WT1, minor histocompatibility antigens) , and breast cancer (e.g., HER2, NY-BR1) .

[0219] The engineered receptor described herein can be a chimeric antigen receptor (CAR) . Many chimeric antigen receptors are known in the art and can be suitable for the modified cells described herein. CARs can also be constructed with a specificity for any cell surface marker by utilizing antigen binding fragments or antibody variable domains of, for example, antibody molecules.

[0220] CARs of the present disclosure may comprise an extracellular domain comprising at least one antigen binding domain that specifically binds at least one tumor antigen, a transmembrane region, and an intracellular signaling domain.

[0221] The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes an immune effector function of the CAR-containing cell, e.g., a CAR-T cell. Immune effector function or immune effector response refers to function or response, e.g., of an immune effector cell, that enhances or promotes an immune attack of a target cell. For example, an immune effector function or response can refer to a property of a T or NK cell that promotes killing or the inhibition of growth or proliferation, of a target cell. Examples of immune effector function, e.g., in a CAR-T cell, include cytolytic activity (such as antibody-dependent cellular toxicity, or ADCC) and helper activity (such as the secretion of cytokines) . The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes proliferation and / or survival of the CAR containing cell. The signaling domain of a naturally occurring molecule can comprise the entire intracellular or cytoplasmic portion, or the entire native intracellular signaling domain, of the molecule, or a fragment or derivative thereof.

[0222] The intracellular signaling domain of a CAR can comprise one or more (such as any of 1, 2, 3, or more) co-stimulatory signaling domains. “Co-stimulatory signaling domain” can be the intracellular portion of a co-stimulatory molecule. The term “co-stimulatory molecule” refers to a cognate binding partner on an immune cell (such as T cell) that specifically binds with a co-stimulatory ligand, thereby mediating a co-stimulatory response by the immune cell, such as, but not limited to, proliferation and survival. Co-stimulatory molecules are cell surface molecules other than antigen receptors or their ligands that contribute to an efficient immune response. A co-stimulatory molecule can be represented in the following protein families: TNF receptor proteins, Immunoglobulin-like proteins, cytokine receptors, integrins, signaling lymphocytic activation molecules (SLAM proteins) , and activating NK cell receptors. Co-stimulatory molecules include, but are not limited to an MHC class I molecule, BTLA and a Toll ligand receptor, as well as OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a / CD18) , ICOS (CD278) , and 4-1BB (CD137) . Further examples of such co-stimulatory molecules include CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE / RANKL, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CDIOO (SEMA4D) , CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG / Cbp, CD19a, and a ligand that specifically binds with CD83.

[0223] The CAR can comprise a single co-stimulatory signaling domain. The CAR can comprise two or more co-stimulatory signaling domains. The intracellular signaling domain can comprise a functional primary intracellular signaling domain (e.g., a chimeric signaling domain (CMSD) set forth herein) and one or more co-stimulatory signaling domains. The CAR may not comprise a functional primary intracellular signaling domain (such as CD3ζ) . The CAR can comprise an intracellular signaling domain consisting of or consisting essentially of one or more co-stimulatory signaling domains. The CAR can comprise an intracellular signaling domain consisting of or consisting essentially of a nonfunctional or attenuated primary intracellular signaling domain (such as a mutant CD3ζ) and one or more co-stimulatory signaling domains. Upon binding of the antigen binding domain to tumor antigen, the co-stimulatory signaling domains of the CAR can transduce signals for enhanced proliferation, survival and differentiation of the modified immune cells having the CAR (such as T cells) , and inhibit activation induced cell death. The one or more co-stimulatory signaling domains can be derived from one or more molecules selected from the group consisting of CD27, CD28, 4-1BB (i.e., CD137) , OX40, CD30, CD40, CD3, lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) , CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 and ligands that specially bind to CD83.

[0224] The antigen binding domain of a CAR may comprise one or more (such as any one of 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more) antibodies or antibody fragments, which can be selected from an scFv, a Fv, a Fab, a (Fab’ ) 2, a minibody, a diabody, a single domain antibody (sdAb) , or a VHH domain. The antigen binding domain of a CAR can comprise a ligand or an extracellular portion of a receptor that specifically binds to a tumor antigen. The CAR can be a monospecific, bispecific or multispecific CAR. The antigen binding domain of a CAR can specifically bind to a single tumor antigen. The antigen binding domain of a CAR can bind to two or more tumor antigens. The engineered receptor (e.g., CAR) may redirect the specificity of the modified cells through the expression of a chimeric antigen receptor (CAR) or TCR on these cells.

[0225] The transmembrane region of a CAR comprises a transmembrane region can be selected from the transmembrane region of an alpha, beta or zeta chain of a T-cell receptor, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18) , ICOS (CD278) , 4-1BB (CD137) , GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , CD160, CD19, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CDIOO (SEMA4D) , SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, and / or NKG2C. The transmembrane domain of the CAR can be a CD4, CD3, CD8α, or CD28 transmembrane domain. The transmembrane region of the CAR can comprise a CD8αtransmembrane domain.

[0226] The extracellular domain can be connected to the transmembrane domain by a hinge domain. The hinge domain can be a hinge domain of CD8α. The CAR can also comprise a signal peptide (SP) , such as a CD8α signal peptide.

[0227] Many CARs targeting different tumor antigens have been widely disclosed in the field, such as CD19 CARs or BCMA CARs. The extracellular antigen binding domain of CD19 CARs can be or include the CD19 binding fragment (e.g., FMC63, SJ25C1, or those disclosed in different patents such as WO 2022 / 012683, etc) . BCMA CARs also have been well described, related patents include but not limited to WO 2016 / 014789, WO 2016 / 014565, WO 2013 / 154760, and WO 2018 / 028647, etc. The extracellular antigen binding domain of BCMA CARs may be or include BCMA binding fragment. The BCMA binding fragment may bind to one or more epitopes on BCMA. The BCMA CARs may be bivalent CARs comprising two anti-BCMA sdAbs targeting same or different BCMA epitopes.

[0228] The engineered receptor can be a modified T-cell receptor or engineered T-cell receptor. The engineered TCR can be specific for any tumor antigen set forth herein. Any of the TCRs known in the art can be used. The TCR can have an enhanced affinity to the tumor antigen. Exemplary TCRs and methods for introducing the TCRs to immune cells have been described, for example, in U.S. Pat. No. 5,830,755, and Kessels et al. Immunotherapy through TCR gene transfer. Nat. Immunol. 2, 957-961 (2001) , which are incorporated herein by reference in the entirety.

[0229] The TCR receptor complex is an octomeric complex formed by variable TCR receptor α and β chains (or γ and δ chains on case of γδ T cells) with three dimeric signaling modules CD3δ / ε, CD3γ / ε and CD247 (T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain) ζ / ζ or ζ / η. Ionizable residues in the transmembrane region of each subunit form a polar network of interactions that hold the complex together. TCR complex has the function of activating signaling cascades in T cells.

[0230] The engineered receptor can be an engineered TCR comprising one or more T-cell receptor (TCR) fusion proteins (TFPs) . Exemplary TFPs have been described, for example, in US20170166622A1, which is incorporated herein by reference in its entirety. The TFP can comprise an extracellular domain of a TCR subunit that comprises an extracellular domain or portion thereof of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications. The TFP can comprise a transmembrane region that comprises a transmembrane region of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications. The TFP can comprise a transmembrane region that comprises a transmembrane region of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a TCR zeta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications.

[0231] The TFP can comprise a TCR subunit comprising at least a portion of a TCR extracellular domain, and a TCR intracellular domain comprising a stimulatory domain from an intracellular signaling domain of CD3 epsilon; and an antigen binding domain, wherein the TCR subunit and the antigen binding domain are operatively linked, and wherein the TFP incorporates into a TCR when expressed in a T cell.

[0232] The engineered receptor can be a T-cell antigen coupler (TAC) receptor. Exemplary TAC receptors have been described, for example, in US20160368964A1, which is incorporated herein by reference. The TAC can comprise an antigen binding domain, a TCR-binding domain that specifically binds a protein associated with the TCR complex, and a T-cell receptor signaling domain. The antigen binding domain can be an antibody fragment, such as scFv or VHH, which specifically binds to a tumor antigen. The antigen binding domain can be a designed Ankyrin repeat (DARPin) polypeptide. The tumor antigen can be any of the antigens set forth herein. The protein associated with the TCR complex can be CD3, such as CD3E. The TCR-binding domain can be a single chain antibody, such as scFv, or a VHH. The TCR-binding domain can be derived from UCHT1. The TAC receptor can comprise a cytosolic domain and a transmembrane region. The T-cell receptor signaling domain can comprise a cytosolic domain derived from a TCR co-receptor. Exemplary TCR co-receptors include, but are not limited to, CD4, CD8, CD28, CD45, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 and CD 154. The TAC receptor can comprise a transmembrane region and a cytosolic domain derived from CD4. The TAC receptor can comprise a transmembrane region and a cytosolic domain derived from CD8 (such as CD8α) .

[0233] T cell co-receptors are expressed as membrane proteins on T cells. They can provide stabilization of the TCR: peptide: MEC complex and facilitate signal transduction. The two subtypes of T cell co-receptor, CD4 and CD8, display strong specificity for particular MEC classes. The CD4 co-receptor can only stabilize TCR: MEC II complexes while the CD8 co-receptor can only stabilize the TCR: MEC I complex. The differential expression of CD4 and CD8 on different T cell types results in distinct T cell functional subpopulations. CD8+ T cells are cytotoxic T cells.

[0234] The engineered receptor (such as CAR, engineered TCR, or TAC) can target one or more tumor antigens. Tumor antigens are proteins that are produced by tumor cells that can elicit an immune response, particularly T-cell mediated immune responses. The selection of the targeted antigen will depend on the particular type of cancer to be treated. Exemplary tumor antigens include, for example, a glioma-associated antigen, carcinoembryonic antigen (CEA) , β-human chorionic gonadotropin, alphafetoprotein (AFP) , lectin-reactive AFP, thyroglobulin, RAGE-1, MN-CAIX, human telomerase reverse transcriptase, RU1, RU2 (AS) , intestinal carboxyl esterase, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, prostate-specific antigen (PSA) , PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, prostein, PSMA, HER2 / neu, survivin and telomerase, prostate-carcinoma tumor antigen-1 (PCTA-1) , MAGE, ELF2M, neutrophil elastase, ephrinB2, CD22, insulin growth factor (IGF) -I, IGF-II, IGF-I receptor and mesothelin.

[0235] The tumor antigen can comprise one or more antigenic cancer epitopes associated with a malignant tumor. Malignant tumors express a number of proteins that can serve as target antigens for an immune attack. These molecules include but are not limited to tissue-specific antigens such as MART-1, tyrosinase and gp100 in melanoma and prostatic acid phosphatase (PAP) and prostate-specific antigen (PSA) in prostate cancer. Other target molecules belong to the group of transformation-related molecules such as the oncogene HER2 / Neu / ErbB-2. Yet another group of target antigens are onco-fetal antigens such as carcinoembryonic antigen (CEA) . In B-cell lymphoma the tumor-specific idiotype immunoglobulin constitutes a truly tumor-specific immunoglobulin antigen that is unique to the individual tumor. B cell differentiation antigens such as CD 19, CD20 and CD37 are other candidates for target antigens in B-cell lymphoma.

[0236] The tumor antigen can be a tumor-specific antigen (TSA) or a tumor-associated antigen (TAA) . A TSA is unique to tumor cells and does not occur on other cells in the body. A TAA associated antigen is not unique to a tumor cell, and instead is also expressed on a normal cell under conditions that fail to induce a state of immunologic tolerance to the antigen. The expression of the antigen on the tumor can occur under conditions that enable the immune system to respond to the antigen. TAAs can be antigens that are expressed on normal cells during fetal development, when the immune system is immature, and unable to respond or they can be antigens that are normally present at extremely low levels on normal cells, but which are expressed at much higher levels on tumor cells.

[0237] Non-limiting examples of TSA or TAA antigens include the following: Differentiation antigens such as MART-1 / MelanA (MART-I) , gp 100 (Pmel 17) , tyrosinase, TRP-1, TRP-2 and tumor-specific multilineage antigens such as MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; overexpressed embryonic antigens such as CEA; overexpressed oncogenes and mutated tumor-suppressor genes such as p53, Ras, HER2 / neu; unique tumor antigens resulting from chromosomal translocations; such as BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; and viral antigens, such as the Epstein Barr virus antigens EBVA and the human papillomavirus (HPV) antigens E6 and E7. Other large, protein-based antigens include TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenin, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alpha-fetoprotein, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB / 70K, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90\Mac-2 binding protein\cyclophilin C-associated protein, TAAL6, TAG72, TLP, and TPS. Methods of treatment

[0238] The modified cells (e.g., modified immune cells) with reduced expression of HLA-Agenes and / or HLA-B genes can be used in a variety of experimental, therapeutic and commercial applications.

[0239] In one aspect, the disclosure provides a method of treating a disease or disorder in a subject (e.g., human subject) , the method comprising administering to the subject, an effective amount of the modified cell described herein, or the pharmaceutical composition described herein. The disease or disorder may be cancer, an autoimmune disease, or an infection.

[0240] The disease or disorder may be solid tumor. “Solid tumor” refers to an abnormal mass of tissue that usually does not contain cysts or liquid areas. Solid tumors may be benign (not cancer) , or malignant (cancer) . Different types of solid tumors are named for the type of cells that form them. Examples of solid tumors are sarcomas, carcinomas, and lymphomas. Leukemias (cancers of the blood) generally do not form solid tumors.

[0241] In one aspect, the disclosure provides a method of modulating an immune response comprising administering an effective amount of modified cells described herein to a subject in need thereof.

[0242] The term “effective amount” as used herein means an amount effective, at dosages and for periods of time necessary to achieve the desired results.

[0243] In another aspect, the present disclosure provides a method for treating cancer comprising administering an effective amount of modified cells described herein to a subject in need thereof. Examples of cancer that can be treated include, but are not limited to, small cell lung cancer (SCLC) , large cell neuroendocrine cancer (LCNC) , neuroendocrine prostate cancer (NEPC) , pancreatic neuroendocrine tumor (PNET) , gastrointestinal neuroendocrine cancers, leukemias including chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute myelogenous leukemia, acute lymphoblastic leukemia, and T cell and B cell leukemias, lymphomas (Hodgkin’s and non-Hodgkins) , lymphoproliferative disorders, plasmacytomas, histiocytomas, melanomas, adenomas, sarcomas, carcinomas of solid tissues, hypoxic tumors, squamous cell carcinomas, genitourinary cancers such as cervical and bladder cancer, hematopoietic cancers, head and neck cancers, and nervous system cancers.

[0244] The disclosure further includes the use of the modified cells described herein in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition to modulate an immune response, to treat an infection or to treat cancer as described hereinabove.

[0245] The modified cells can also be used in experimental models, for example, to further study and elucidate the function of the cells.

[0246] One or more of the modified cells described herein can be administered to a subject in a single, unified form, such as an intravenous injection, or in multiple forms, for example, as multiple intravenous infusions or injections, or subcutaneous injections. In some cases, the modified cells can expand within a subject’s body, in vivo, after administration to a subject. The modified cells can be frozen to provide cells for multiple treatments with the same cell preparation. The modified cells of the disclosure, and pharmaceutical compositions comprising the same, can be packaged as a kit. A kit can include instructions (e.g., written instructions) on the use of the modified cells and compositions comprising the same.

[0247] A method of treatment can comprise administering to a subject a therapeutically effective amount of the modified cells. The therapeutically effective amount of the modified cells may be administered for at least 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, or 1 year. The therapeutically effective amount of the modified cells may be administered for at least one week. The therapeutically effective amount of the modified cells may be administered for at least two weeks.

[0248] The modified cells described herein can be administered before, during, or after the occurrence of a disease or condition, and the timing of administering the modified cells can vary. For example, the modified cells can be used as a prophylactic and can be administered continuously to subjects with a propensity to conditions or diseases in order to lessen a likelihood of the occurrence of the disease or condition. The modified cells can be administered to a subject during or as soon as possible after the onset of the symptoms. The administration of the modified cells can be initiated immediately within the onset of symptoms, within the first 3 hours of the onset of the symptoms, within the first 6 hours of the onset of the symptoms, within the first 24 hours of the onset of the symptoms, within 48 hours of the onset of the symptoms, or within any period of time from the onset of symptoms. The initial administration can be via any route practical (e.g., intravenous infusions or injections) , such as by any route described herein using any formulation described herein. In some examples, the administration of the modified cells of the disclosure is an intravenous administration. One or multiple dosages of the modified cells can be administered as soon as is practicable after the onset of a cancer or an infectious disease, and for a length of time necessary for the treatment of the disease, such as, for example, from about 24 hours to about 48 hours, from about 48 hours to about 1 week, from about 1 week to about 2 weeks, from about 2 weeks to about 1 month, from about 1 month to about 3 months. For the treatment of cancer, one or multiple dosages of the modified cells can be administered years after onset of the cancer and before or after other treatments. In some examples, the modified cells can be administered for at least about 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, at least 48 hours, at least 72 hours, at least 96 hours, at least 1 week, at least 2 weeks, at least 3 weeks, at least 4 weeks, at least 1 month, at least 2 months, at least 3 months, at least 4 months, at least 5 months, at least 6 months, at least 7 months, at least 8 months, at least 9 months, at least 10 months, at least 11 months, at least 12 months, at least 1 year, at least 2 years at least 3 years, at least 4 years, or at least 5 years. The length of treatment can vary for each subject.

[0249] Methods for administration of modified cells for adoptive cell therapy are known and can be used in connection with the provided methods and compositions. For example, adoptive T cell therapy methods are described, e.g., in US Patent Application Publication No. 2003 / 0170238 to Gruenberg et al; US Patent No. 4, 690, 915 to Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10) : 577-85) . See, e.g., Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10) : 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1) : 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4) : e61338. The cell therapy, e.g., adoptive T cell therapy can be carried out by autologous transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from the subject who is to receive the cell therapy, or from a sample derived from such a subject. Thus, in some aspects, the cells are derived from a subject, e.g., patient, in need of a treatment and the cells, following isolation and processing are administered to the same subject.

[0250] The cell therapy (e.g., adoptive T cell therapy) can be carried out by allogeneic transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from a subject other than a subject who is to receive or who ultimately receives the cell therapy, e.g., a first subject. In such embodiments, the cells then are administered to a different subject, e.g., a second subject, of the same species. The first and second subjects may be genetically identical. The first and second subjects may be genetically similar. The second subject may express the same HLA class or supertype as the first subject.

[0251] The subject (e.g., human subject) may have been treated with a therapeutic agent targeting the disease or condition, e.g., the tumor, prior to administration of the cells or composition containing the cells. The subject may be refractory or non-responsive to the other therapeutic agent. The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogenic HSCT. In some cases, the administration can effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0252] The subject may be responsive to the other therapeutic agent, and treatment with the therapeutic agent reduces disease burden. The subject may be initially responsive to the therapeutic agent, but exhibits a relapse of the disease or condition over time. The subject may have not relapsed. The subject may be determined to be at risk for relapse, such as at a high risk of relapse, and thus the cells are administered prophylactically, e.g., to reduce the likelihood of or prevent relapse. The subject may has not received prior treatment with another therapeutic agent.

[0253] The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogenic HSCT. The administration may effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0254] The modified cells described herein can be administered to an animal, such as a mammal, even more a human, to treat a cancer. In addition, the modified cells can be used for the treatment of any condition related to a cancer, especially a cell-mediated immune response against a tumor cell (s) , where it is desirable to treat or alleviate the disease.

[0255] The modified cells (e.g., immune cells, T cells, or NK cells) described herein can be included in a composition for immunotherapy. The composition can include a pharmaceutical composition and further include a pharmaceutically acceptable carrier. In one aspect, the disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the modified cell described herein and a pharmaceutically acceptable carrier. A therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition comprising the modified cells can be administered.

[0256] The modified cells can be immediately used in the above therapeutic, experimental or commercial applications or the cells can be cryopreserved for use at a later date. The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration.

[0257] The modified cells disclosed herein can be formulated in unit dosage forms suitable for single administration of precise dosages. The unit dosage forms may comprise additional lymphocytes. In unit dosage form, the formulation is divided into unit doses containing appropriate quantities of one or more compounds. The unit dosage can be in the form of a package containing discrete quantities of the formulation. Non-limiting examples are packaged tablets or capsules, and powders in vials or ampoules. Aqueous suspension compositions can be packaged in single-dose non-reclosable containers. Multiple-dose reclosable containers can be used, for example, in combination with a preservative or without a preservative. The pharmaceutical composition may not comprise a preservative. Formulations for parenteral injection can be presented in unit dosage form, for example, in ampoules, or in multi-dose containers with a preservative. EXAMPLES

[0258] The disclosure is further described in the following examples, which do not limit the scope of the disclosure described in the claims. Example 1. Design of universal gRNA for HLA-A and / or HLA-B but not for HLA-C

[0259] The universal gRNAs can be used directly to knock out both alleles of an HLA gene without having to detect the donor’s HLA genotypes. Since HLA genes are among the most polymorphic regions of human genome, finding a consensus region among various alleles of an HLA gene is extremely difficult.

[0260] Target nucleotide sequences of gRNA that recognize HLA-A alleles, HLA-B alleles, or HLA-C alleles were determined by the following method. All HLA allele sequences of global, Chinese and United States from the IPD-IMGT / HLA database (www. ebi. ac. uk / ipd / imgt / hla / ) were collected and a file including nucleotide sequences of genomic DNA of all HLA haplotypes was downloaded. Then, from the nucleotide sequences of genomic DNA of all HLA haplotypes, a nucleotide sequence corresponding to “NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG” (SEQ ID NO: 75, where N is any nucleotide) was extracted as a candidate target nucleotide sequence of a gRNA of SpCas9 (sgRNA) . Furthermore, candidate nucleotide sequences of HLA-A alleles and HLA-B alleles were mapped to the nucleotide sequences of all HLA haplotypes and ones showing >55%coverage of HLA-A or HLA-B haplotype but <20%coverage of HLA-C haplotype were kept as the most efficient gRNAs with the lowest off-target rate. In total, 35 gRNAs (A1-A35) were picked from universal gRNAs for HLA-A alleles, and 41 gRNAs (B36-B71, B76, B77, B81, B113, B141, B155) were picked from universal gRNAs for HLA-B alleles. The above process is also shown in FIG. 1. Table 1 shows the sequences of A1-A35 and the ratio of the target alleles to total HLA-Ahaplotypes and Table 2 shows the sequences of B36-B71, B76, B77, B81, B113, B141, and B155, and the ratio of the target alleles to total HLA-B haplotypes. Table 1. Universal gRNAs for HLA-A alleles Table 2. Universal gRNAs for HLA-B alleles Example 2. Using CRISPR / Cas9 editing to knockout HLA-A and HLA-B gene loci in  primary T cells

[0261] Primary T cells were isolated from human PBMC using a pan T cell isolation Kit (Miltenyi Biotech) according to the manufacturer’s instructions. They were then activated with anti-CD3 / CD28 beads and cultured in RPMI1640 medium supplemented with 300 IU / mL IL-2. T cells were washed and counted before the electroporation. Meanwhile electroporation buffer A and electroporation buffer B (Celetrix, cat#1204) were mixed well at a 1: 1 ratio ( “electroporation buffer A / B” ) and afterwards aliquoted at a volume of 130 μL in sterile 1.5 mL RNase-free microcentrifuge tubes. 16 μg Cas9 protein (KACTUS-CAS9-1MG, CAS-EE11) and 0.1 nmol gRNA were added to 60 μL mixed electroporation buffer A / B, mixed well and incubated for 10 mins at room temperature to allow the formation of the gRNA / Cas9 ribonucleoprotein complex (gRNA / Cas9) . 107 T cells were resuspended in 65 μL mixed electroporation buffer A / B, mixed with the 60 μL gRNA / Cas9 described above, and electroporated. After that, the T cells were immediately cultured in RPMI1640 medium supplemented with 300 IU / mL IL-2 at 37 ℃ with 5%CO2. The same electroporation steps were applied to all 35 gRNAs for HLA-A (A1-A35) and 30 gRNAs for HLA-B (B36-B65) . 72h after electroporation, approximate 5 × 105 cells were stained with 1 μL PE anti-human HLA-A2 antibody (Biolegend, cat#343306) or 1 μL PE anti-human HLA-B7 / B27 antibody (Miltenyi Biotech, cat#130-118-332) at 4℃ for 30 min. Flow cytometry analysis was performed to check the percentage of HLA-A- / -and HLA-B- / - (the knocking-out efficiency) . Un-transfected T cells (UnT) were used as the negative control.

[0262] gRNAs targeting HLA-A showed significant knocking-out efficiency ranging from 9.4%to 75.7% (FIGs. 2A-2B and Table 3) and gRNAs targeting HLA-B showed significant knocking-out efficiency ranging from 5.04%to 69.4% (FIGs. 3A-3B and Table 4) . 7 gRNAs (B38, B39, B40, B47, B59, B60, and B61) were selected to check their HLA-A knocking-out efficiency. The target nucleotide sequences of these gRNAs could also be mapped to the nucleotide sequences of HLA-A, and indeed some of them showed 37.77%-64.56%knocking-out efficiency for HLA-A(FIGs. 4A-4B and Table 5) . These data show that the universal gRNAs are capable of knocking out HLA-A or / and HLA-B. Table 3. HLA-A knocking-out efficiency of HLA-A gRNA Table 4. HLA-B knocking-out efficiency of HLA-B gRNA Table 5. HLA-A and HLA-B knocking-out efficiency Example 3. Using base editing knocking-out HLA-A and HLA-B gene locus in primary T  cells

[0263] The same protocol used in Example 2 was used for primary T cells preparation. 107 T cells were resuspended in 100 μL mixed electroporation buffer A / B and afterwards supplemented with 0.4 nmol gRNA and 0.4 nmol cytosine base editor (CBE) protein (from Kactus Biosystems) . The gRNAs and the CBE protein formed the gRNA / CBE complex. After the electroporation, the T cells were immediately cultured in RPMI1640 medium supplemented with 300 IU / mL IL-2 at 37 ℃ with 5%CO2. The same electroporation steps were applied to 8 selected gRNAs (A4, A6, A16, A17, A18, A20, A22 and A31) . The target nucleotide sequences of these gRNAs could also be mapped to the nucleotide sequences of HLA-B. The same electroporation steps were also applied to 17 selected HLA-B gRNAs (B36, B51, B54, B58, B65, B66, B67, B68, B69, B70, B71, B76, B77, B81, B113, B141, and B155) . 72h after electroporation, approximately 5 × 105 cells were stained with 1 μL APC / Cy7 anti-human HLA-A2 antibody (Biolegend, cat#343310) and 1 μL PE (or APC) anti-human HLA-B7 / B27 antibody at 4℃ for 30 min. Flow cytometry analysis was performed to check the percentage of HLA-A- / -and HLA-B- / -. Primary T cells with different HLA-A or HLA-B haplotypes were also prepared to evaluate the knocking-out efficiency of the gRNAs in different haplotypes. The knocking-out efficiencies of gRNA combinations were also measured.

[0264] As shown in FIGs. 5A-5D and Table 6, these eight HLA-A gRNAs showed significant HLA-A knocking-out efficiency ranging from 26.7%to 85.9%after base editing, and A6 was found capable of knocking out HLA-B with efficiency of 82.21%. As shown in FIGs. 5C-5E and Table 6, these 17 HLA-B gRNAs showed HLA-B knocking-out efficiency ranging from 1.09%to 73.78%after base editing. These data show that the universal gRNAs are capable of knocking out HLA-A or / and HLA-B after base editing. As shown in Table 7, A4 and A6 showed high knocking-out efficiency in A*02: 01, A*02: 03, A*02: 07, A*03: 01, A*11: 01, and A*24: 02. As shown in Tables 8A-8C, B70, B71, B140, and B141 showed high knocking-out efficiency in B*07: 02, B*08: 01, B*18: 01, B*35: 08, B*39: 01, B*40: 01, B*46: 01, B*54: 01, B*55: 01, B*55: 02. As shown in FIG. 8, the combinations of A4&B70, A23&B70, A23&B65, A33&B65, or A34&B65 could produce HLA-Aneg and HLA-Bneg cells, with corresponding cell ratios of 21.42%, 16.22%, 15.54%, 28.50%, 21.45%, respectively. Table 6. HLA gRNA knocking-out efficiency in Base Editing Table 7. HLA-A gRNA knocking-out efficiency in different haplotypes Table 8A. HLA-B gRNA-B70 knocking-out efficiency in different haplotypes Table 8B. HLA-B gRNA-B71 knocking-out efficiency in different haplotypes Table 8C. HLA-B gRNA-B140&B141 knocking-out efficiency in different haplotypes Example 4. Evaluation of cytotoxicity of CD8+T and NK cells on allogeneic B2M- / -cells or  HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells 1) Preparation of allogeneic B2M- / -cells or HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells.

[0265] Similar to example 2, primary T cells were isolate from healthy donors and cultured in RPMI1640 medium supplemented with 300 IU / mL IL-2 at 37 ℃ with 5%CO2.107 activated T cells were, electroporated with gRNAs targeting B2M, or HLA-A, HLA-B and CIITA in a CRISPR / Cas9 editing system and afterwards immediately cultured in RPMI1640 medium supplemented with 300 IU / mL IL-2 at 37 ℃ with 5%CO2.72h after electroporation, B2M- / -cells and HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells were enriched using (1) biotin-anti-human HLA-ABC (Miltenyi Biotech, cat#130-118-332) antibodies combined with an anti-biotin reagent (Miltenyi Biotech, cat#6190312010) and (2) a mixture of biotin-anti-human HLA-A2 (Miltenyi Biotech, cat#130-123-242) , biotin-anti-human HLA-B7 / B27 (Miltenyi Biotech, cat#130-105-997) , biotin-anti-human HLA-DR / DP / DQ (Miltenyi Biotech, cat#130-126-622) combined with an anti-biotin reagent (Miltenyi Biotech, cat#6190312010) , respectively, according to the manufacturer’s instructions. The effective gRNAs discovered above were used to knock out HLA-A and HLA-B. Un-transfected T cells (UnT) were used as a control. 2) Evaluation of cytotoxicity of CD8+T and NK cells on allogeneic cells

[0266] Similar to example 2, primary T cells were isolated from healthy donors, activated and cultured in RPMI1640 medium supplemented with 300 IU / mL IL-2 at 37 ℃ with 5%CO2. CD8+T cells were enriched using CD8+ T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotech, cat#130-096-495) and NK cells were isolated from PBMC using NK cell Isolation Kit according to their manufacturer’s instructions.

[0267] 106 UnT cells, 106 B2M- / -cells (single knockout T cells) , and 106 HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells (triple knockout T cells) were separately labeled by 1 μM CFSE (Thermo Fisher, cat#C34554) at room temperature for 5 mins. After 3 repetitive washing steps with Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) , CFSE-labeled UnT, B2M- / -cells and HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells were co-cultured with CD8+T cells derived from another donor at a ratio of 1: 20 for 72h. After that, cells were stained for LIVE / DEAD and the viability of cells was checked via flow cytometry analysis. The killing efficiency of CD8+ T cell on allogeneic cells = %Viability of UnT, B2M- / -cells or HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells alone group -%Viability of UnT, B2M- / -cells or HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells co-cultured with allogeneic CD8+T cell group. CD8+T cells from three different donors were included in the experiment. The results from three different donors are shown in FIGs. 6A-6C, respectively.

[0268] For the evaluation of the killing effects of NK cells on the allogenic cells, CFSE-labeled UnT, B2M- / -cells and HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells were co-cultured with allogeneic NK cells at a 1: 1 ratio for 24h. After that, cells were stained for LIVE / DEAD and the viability of cells was checked via flow cytometry analysis. The killing efficiency of NK cell on allogeneic cells = %Viability of UnT, B2M- / -cells or HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells alone group -%Viability of UnT, B2M- / -cells or HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells co-cultured with allogeneic NK cell group. NK cells from two different donors were included in the experiment. The results from two different donors are shown in FIGs. 6D-6E, respectively.

[0269] CD8+T cells showed strong cytotoxicity on allogeneic UnT cells, while barely showed any cytotoxicity on allogenic B2M- / -cells and HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells (FIGs. 6A-6C) . Meanwhile, although NK cells exhibited strong cytotoxicity on allogeneic B2M- / -cells, no obvious cytotoxicity was detected from NK cells on allogeneic HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells (N=2) (FIGs. 6D-6E) . These results indicate that HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cell is capable of escaping rejection not only from allogeneic CD8+ T cells but also from NK cells. Example 5. Evaluation of cytotoxicity of CD8+T and NK cells on allogeneic B2M- / -HLA-EOE  cells and HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells. 1) Preparation of allogeneic B2M- / -HLA-EOE cells or HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells.

[0270] Similar to example 2, primary T cells were isolated from healthy donors and cultured in RPMI1640 medium supplemented with 300 IU / mL IL-2 at 37 ℃ with 5%CO2. On day 2, 5 ×106 activated T cells were taken out and transduced with HLA-E adenovirus vector to overexpress HLA-E in a single chain trimer (SCT) form (HLA-EOE) . After that cell suspension was plated to 24-well plate and cultured overnight at 37 ℃ with 5%CO2. 3 days post transduction, cells were collected for electroporation with gRNAs targeting B2M or HLA-A, HLA-B and CIITA in CRISPR / Cas9 editing system and afterwards enriched for B2M- / -HLA-EOE (B2M knockout and HLA-E overexpression) and HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells as described in example 4. 2) Evaluation of cytotoxicity of CD8+T and NK cells on allogeneic cells

[0271] CD8+T cells and NK cells from three different donors were prepared as described in Example 4. CFSE-labelled UnT, B2M- / -HLA-EOE and HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells were co-cultured with CD8+T cells derived from another donor at a ratio of 1: 20 for 72h. After that, cells were stained for LIVE / DEAD and the viability of cells was checked via flow cytometry analysis to evaluate the cytotoxicity of CD8+T cells on allogeneic cells. To evaluate the cytotoxicity of NK on the allogenic cells, CFSE-labeled UnT, B2M- / -HLA-EOE and HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells were co-cultured with allogeneic NK cells at a 1: 1 ratio for 24h. After that, cells were stained for LIVE / DEAD to check the viability of cells via flow cytometry analysis. Un-transfected T cells (UnT) were used as a control. B2M- / -cells and HLA-EOE cells were also tested.

[0272] As shown in FIGs. 7A-7C, CD8+T cells showed strong cytotoxicity on allogeneic UnT, while barely showed any cytotoxicity on allogenic B2M- / -cells and HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells (N=3) . Meanwhile, HLA-E overexpression in T cells ameliorated the rejection mediated by allogeneic CD8+ T cells but only limited effects were observed (FIGs. 7A-7C) . Furthermore, NK cells barely reacted to allogeneic UnT and HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cells while showing strong cytotoxicity on allogeneic B2M- / -cells. HLA-E overexpression in B2M- / -cells showed certain benefits in protection from allogeneic NK rejection, but still the protection was limited and not as robust as HLA-A- / -HLA-B- / -CIITA- / -cell group (FIG. 7D-7F) . These results indicate that knocking out B2M helps cells escape from allogeneic CD8+T cell rejection while results in strong NK-mediated rejection. HLA-E overexpression could enhance the resistance of B2M- / -cells to NK cells, but it could not completely prevent the cytotoxicity of allogeneic NK cells on B2M- / -cells. HLA-A, HLA-B and CIITA knocked-out cells not only have stronger resistance to the killing by NK cells, but also resist to the killing mediated by allogeneic T cells. OTHER EMBODIMENTS

[0273] It is to be understood that while the disclosure has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the disclosure, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.A method of producing a modified cell, comprising disrupting HLA-A gene and / or HLA-B gene of a cell by a universal gRNA and a RNA-guided nuclease or a base editor, wherein the universal gRNA targets a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and / or more than one HLA-B haplotypes.2.The method of claim 1, wherein the modified cell has reduced or eliminated HLA-A and / or HLA-B expression.3.The method of claim 1 or 2, wherein the universal gRNA is not specifically designed based on the HLA-A haplotype and / or the HLA-B haplotype of the cell prior to disruption of HLA-A gene and / or HLA-B gene.4.The method of any one of claims 1-3, wherein the HLA-A haplotype and / or the HLA-B haplotype in the cell is undetermined prior to disruption of HLA-A gene and / or HLA-B gene.5.The method of claim 4, wherein the method does not comprise determining the HLA-A haplotype and / or the HLA-B haplotype in the cell.6.The method of any one of claims 1-5, wherein the group of HLA-I haplotypes comprises: (i) at least 2338 different HLA-A haplotypes and / or at least 2782 different HLA-B haplotypes; (ii) at least 3897 different HLA-A haplotypes; (iii) at least 4637 different HLA-B haplotypes; or (iv) at least 7339 different HLA-A haplotypes and at least 3483 different HLA-B haplotype.7.The method of any one of claims 1-5, wherein the group of HLA-I haplotypes comprises: (i) at least 30%global HLA-A haplotypes and / or at least 30%global HLA-B haplotypes; (ii) at least 50%global HLA-A haplotypes; (iii) at least 50%global HLA-B haplotypes; or (iv) at least 94%global HLA-A haplotypes and at least 37%global HLA-B haplotypes.8.The method of any one of claims 1-7, wherein haplotypes in the group of HLA-I haplotypes are capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population.9.The method of any one of claims 1-8, wherein the group of HLA-I haplotypes comprises no HLA-C haplotype.10.The method of any one of claims 1-9, wherein the group of HLA-I haplotypes comprises no more than 30%global HLA-C haplotypes.11.The method of any one of claims 1-10, wherein the universal gRNA comprises a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78.12.A method of producing a modified cell , comprising disrupting HLA-A gene and HLA-B gene of a cell by a first universal gRNA, a second universal gRNA and a RNA-guided nuclease or a base editor, wherein the first universal gRNA targets a group of HLA-A haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes, and wherein the second universal gRNA targets a group of HLA-B haplotypes comprising more than one HLA-B haplotypes.13.The method of claim 12, wherein the modified cell has reduced or eliminated HLA-A and HLA-B expression.14.The method of claim 12 or 13, wherein the first universal gRNA is not specifically designed based on the HLA-A haplotype of the cell prior to disruption of HLA-A gene, and wherein the second universal gRNA is not specifically designed based on the HLA-B haplotype of the cell prior to disruption of HLA-B gene.15.The method of any one of claims 12-14, wherein the HLA-A haplotype and the HLA-B haplotype in the cell is undetermined prior to disruption of HLA-A gene and HLA-B gene.16.The method of claim 15, wherein the method does not comprise determining the HLA-A haplotype and the HLA-B haplotype in the cell.17.The method of any one of claims 12-16, wherein the group of HLA-A haplotypes comprises at least 3897 different HLA-A haplotypes and the group of HLA-B haplotypes comprises at least 4637 different HLA-B haplotypes.18.The method of any one of claims 12-17, wherein the group of HLA-A haplotypes comprises at least 50%global HLA-A haplotypes, and wherein the group of HLA-B haplotypes comprises at least 50%global HLA-B haplotypes.19.The method of any one of claims 12-18, wherein the group of HLA-A haplotypes are capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population and / or wherein the group of HLA-B haplotypes are capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population.20.The method of any one of claims 12-19, wherein the group of HLA-A haplotypes and / or the group of HLA-B haplotypes comprises no HLA-C haplotype.21.The method of any one of claims 12-19, wherein the group of HLA-A haplotypes and / or the group of HLA-B haplotypes comprises no more than 30%global HLA-C haplotypes.22.The method of any one of claims 12-21, wherein the first universal gRNA comprises a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-35 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-35.23.The method of any one of claims 12-21, wherein the second universal gRNA comprises a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 36-74 and 76-78.24.The method of any one of claims 1-23, wherein modified cell expresses HLA-C.25.The method of any one of claims 1-24, wherein the method further comprises reducing or eliminating the expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) in the modified cell.26.The method of any one of claims 1-25, wherein the RNA-guided nuclease is a Cas9 nuclease.27.The method of any one of claims 1-26, wherein the RNA-guided base editor is an inactivated Cas9 nuclease with a cytosine base editor or an adenine base editor.28.The method of any one of claims 1-27, wherein the modified cell is a stem cell, a T cell, a NK cell, a NKT, a NKT-like cell, a cytokine induced killer cell (CIK) , a macrophage, a monocyte, a neutrophil, a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , a cord blood cell, or a hematopoietic stem cell (HSC) .29.The method of claim 28, wherein the modified cell expresses an engineered receptor.30.The method of claim 29, wherein the engineered receptor is an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , a T cell antigen coupler (TAC) or a portion thereof.31.The method of claim 30, wherein the CAR or TCR targets CD19, PSCA, CD123, CD20, CEA (carcinoembryonic antigen) , FAP, CD133, EGFR, EGFRVIII, BCMA, PSMA, Her2, CA125, EphA2, C-met, L1CAM, VEGFR, CS1, ROR1, EC, NY-ESO-1, MUC1, MUC16, mesothelin, LewisY, GPC3, GD2, EPG, DLL3, CD99, 5T4, CD22, CD30, CD33, CD138, or CD171.32.A modified cell prepared according to the method of any one of claims 1-31.33.A modified cell, wherein HLA-A gene and / or HLA-B gene of the modified cell is disrupted using a gene editing system comprising a universal guide RNA (gRNA) and a RNA-guided nuclease or a base editor, wherein the universal gRNA targets a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and / or more than one HLA-B haplotypes.34.The modified cell of claim 33, comprising no more than two types of said universal gRNA.35.The modified cell of claim 33 or 34, wherein the group of HLA-I haplotypes comprises at least 30%global HLA-A haplotypes and / or at least 30%global HLA-B haplotypes.36.The modified cell of any one of claims 33-35, wherein the group of HLA-I haplotypes are capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population.37.The modified cell of any one of claims 33-36, wherein the group of HLA-I haplotypes comprises no HLA-C haplotype.38.The modified cell of any one of claims 33-37, wherein the group of HLA-I haplotypes comprises no more than 30%global HLA-C haplotypes.39.The modified cell of any one of claims 33-38, wherein the universal gRNA comprises a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78.40.The modified cell of any one of claims 33-39, comprising reduced or eliminated expression of CIITA.41.The modified cell of any one of claims 33-40, expressing a chimeric antigen receptor (CAR) .42.A modified cell, which has reduced or eliminated surface expression of HLA-A and / or HLA-B relative to an unmodified cell, comprising a genetic modification in the HLA-A and / or HLA-B gene, wherein the genetic modification comprises at least one mutation within the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78 on HLA gene.43.The modified cell of any one of claims 33-42, wherein the modified cell expresses HLA-C.44.The modified cell of any one of claims 33-43, expressing at least one HLA-C allele selected from the group comprising C*01: 02, C*07: 02, C*03: 04, C*06: 02, C*08: 01, C*03: 03, C*03: 02, C*04: 01, C*14: 02, C*15: 02, C*12: 02, C*12: 03, C*14: 03, C*04: 03, C*08: 22, C*07: 04, C*05: 01, C*07: 06, C*08: 03, and C*15: 05.45.The modified cell of any one of claim 33-44, wherein the modified cell is a stem cell, a T cell, a NK cell, a NKT, a NKT-like cell, a cytokine induced killer cell (CIK) , a macrophage, a monocyte, a neutrophil, a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , a cord blood cell, or a hematopoietic stem cell (HSC) .46.A cell bank comprising:the modified cell produced by the method of any one of claims 1-31, or the modified cell of any one of claims 32-45.47.A pharmaceutical composition, comprising the modified cell of any one of claims 32-45, and a pharmaceutically acceptable carrier.48.A composition comprising (i) a universal guide RNA (gRNA) and a RNA-guided nuclease or a base editor, or (ii) a universal guide RNA (gRNA) and a nucleic acid encoding an RNA-guided nuclease or a base editor; wherein the universal gRNA targets a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and / or more than one HLA-B haplotypes.49.The composition of claim 48, comprising no more than two types of said universal gRNA.50.The composition of claim 48 or 49, wherein the group of HLA-I haplotype comprises more than 30%global HLA-A haplotypes and / or more than 30%global HLA-B haplotypes.51.The composition of any one of claims 48-50, wherein the group of HLA-I haplotypes are capable to cover at least 30%, least 35%, least 40%, least 45%, least 50%, least 55%, at least 60%, at least 80%, or at least 90%of the global population.52.The composition of any one of claims 48-51, wherein the group of HLA-I haplotypes comprises no HLA-C haplotypes, or no more than 30%global HLA-C haplotypes.53.The composition of any one of claims 48-53, wherein the universal gRNA comprises a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78 or a sequence that is at least 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78.54.A vector comprising the universal gRNA of any one of claims 48-53, optionally wherein the vector is a viral vector or a non-viral vector.55.A kit comprising the modified cell of any one of claims 32-45, the cell bank of claim 46, the pharmaceutical composition of claim 47, or the composition of any one of claims 48-53.56.The kit of claim 55, further comprising written instructions for using the modified cell, the cell bank, the pharmaceutical composition, or the composition.57.A method of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering to the subject in need thereof the modified cell of any one of claim 32-45, or the pharmaceutical composition of claim 47.58.The method of claim 57, wherein the disease or disorder is cancer, an autoimmune disease, or an injury.59.A method of reducing the risk of eliciting a host-versus-graft reaction when administering a cell to a subject, comprising disrupting HLA-A gene and / or HLA-B gene in the cell by (i) an RNA-guided nuclease or base editor and (ii) a universal guide RNA (gRNA) , wherein the universal gRNA targets a group of HLA-I haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes and / or more than one HLA-B haplotypes.60.A method of reducing the risk of eliciting a host-versus-graft reaction when administering a cell to a subject, comprising disrupting HLA-A gene and HLA-B gene in the cell by (i) an RNA-guided nuclease or base editor, (ii) a first universal guide RNA (gRNA) , and (iii) a second universal guide RNA (gRNA) , wherein the first universal gRNA targets a group of HLA-A haplotypes comprising more than one HLA-A haplotypes, and wherein the second universal gRNA targets a group of HLA-B haplotypes comprising more than one HLA-B haplotypes.61.A method of administering a modified cell to a recipient subject in need thereof, the method comprising administering the modified cell of any one of claims 32-45 or a modified cell from the cell bank of claim 46, regardless of HLA-A haplotype and HLA-B haplotype of the recipient subject.62.The method of claim 61, comprising determining HLA-C haplotype of the recipient subject.63.The method of claim 61 or 62, wherein the modified cell comprises at least one of the same HLA-C haplotype as the recipient subject.64.The method any one of claim 61-63, wherein the method does not comprise determining the HLA-A haplotype and HLA-B haplotype of the recipient subject.65.A method of designing a universal gRNA targeting HLA-A and / or HLA-B, comprising:(a) collecting a plurality of HLA-A, HLA-B and HLA-C haplotype sequences; and(b) designing a universal gRNA that targets at least 50%of the HLA-A or HLA-B haplotype sequences in the plurality of sequences.66.The method of claim 65, comprising (c) excluding the universal gRNA that targets HLA-C haplotype sequences in the plurality of sequences.67.The method of claim 66, comprising (d) selecting the universal gRNA that targets HLA-A and HLA-B haplotype sequences in the plurality of sequences.68.The method of claim 67, wherein the plurality of HLA-A, HLA-B and HLA-C haplotype sequences consists of all of the global HLA-A, HLA-B and HLA-C haplotype sequences.69.A universal gRNA designed according to the method of any one of claims 65-68.70.The universal gRNA of claim 69, comprising a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78.71.A method of producing a modified cell, comprising disrupting HLA-A gene and / or HLA-B gene of a cell by a universal guide RNA (gRNA) designed according to the method of any one of claims 65-68, and a RNA-guided nuclease or a base editor.72.A modified cell, wherein HLA-A gene and / or HLA-B gene of the modified cell is disrupted using a gene editing system comprising a universal guide RNA (gRNA) designed according to the method of any one of claims 65-68, and a RNA-guided nuclease or a base editor.73.A method of producing a modified cell, comprising disrupting the expression of HLA-A gene and / or HLA-B gene of a cell through a gene silencing method that targets a nucleotide sequence on HLA gene, wherein the gene silencing method targets the HLA-A gene and / or the HLA-B gene on the modified cell regardless of the haplotypes of HLA-A and / or HLA-B.74.The method of claim 73, wherein the gene silencing method comprises contacting the cell with a universal gRNA and a RNA guided nuclease or a base editor.75.The method of claim 73 or 74, wherein the modified cell comes from any one of a plurality of different donors, wherein the HLA haplotypes of each donor differs from at least one of the other donors on at least one HLA haplotype.76.A method of building a cell bank for allogeneic cell Therapy, comprising:(1) obtaining cells from a plurality of different donors;(2) disrupting the expression of HLA-A gene and HLA-B gene of these cells without identifying the HLA-A and HLA-B haplotypes;(3) selecting cells that do not express the HLA-A and HLA-B.77.The method of claim 76, comprising (4) selecting cells that are homozygous for HLA-C.78.The method of claim 77, wherein the selected cells expresses HLA-C haplotype selected from the group comprising C*01: 02, C*07: 02, C*03: 04, C*06: 02, C*08: 01, C*03: 03, C*03: 02, C*04: 01, C*14: 02, C*15: 02, C*12: 02, C*12: 03, C*14: 03, C*04: 03, C*08: 22, C*07: 04, C*05: 01, C*07: 06, C*08: 03, and C*15: 05.79.The method of claims 76, comprising disrupting the expression of HLA-A gene and HLA-B gene of these cells using a universal gRNA comprising a sequence that is identical to any one of SEQ ID NOs: 1-74 and 76-78 or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs:1-74 and 76-78.

Images