Compostions in-vitro generated pancreatic islet-like organoids and methods of making and using thereof

Abstract

Disclosed are compositions containing human pancreatic islet organoids. The disclosed human pancreatic islet organoid culture systems mimic the morphogenic event in the natural islet development process, thereby enabling spontaneous generation of islet structure with high efficiency and preserving crucial islet structure. Also disclosed are methods of generating human pancreatic islet organoids, wherein the methods require a six-stage culture system. Further disclosed are methods using the in vitro generated organoids and compositions thereof. The in vitro generated organoids are particularly suited for research purposes, providing optimized cell models for the study of pancreatic islet biology, endocrine biology and metabolic disease pathology. The in vitro generated organoids are also particularly suitable for biomarker identification, and evaluation of new molecules and existing therapies for treating metabolic and / or endocrine diseases.

Description

COMPOSTIONS IN-VITRO GENERATED PANCREATIC ISLET-LIKE ORGANOIDS AND METHODS OF MAKING AND USING THEREOF

[0001] CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims the benefit of and priority to U.S. Provisional Patent Application No. 63 / 637,745, filed April 23, 2024, the contents of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0003] REFERENCE TO SEQUENCE LISTINGThe Sequence Listing XML submitted as a file named “UHK_01381PCT_ST26. xml, ” created on April 3, 2025, and having a size of 6, 486 bytes is hereby incorporated by reference pursuant to 37 C.F.R. § 1.834 (c) (1) .FIELD OF THE INVENTION

[0004] The disclosed invention is generally in the field of organoids and specifically in the area of human pancreatic islet organoids.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0005] Human pluripotent stem cells (hPSCs) , which include human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and human embryonic stem cells (hESCs) , provide unlimited sources of functional islets for research purposes and the treatment of diabetes that affect approximately 536.6 million adults (ages 20-79) worldwide in 2021 (Sun et al., Diabetes Research and Clinical Practice, 183: 109119 (2022) ) . To adopt hPSCs as sources for both research in pancreatic endocrine and islet replacement therapy, it is important to generate not only pancreatic β-cells, but also other endocrine cell types in the islet such as α-cells and δ-cells, which can lead to the formation of islets that are structurally and functionally similar to native pancreatic islet cells.

[0006] The in vitro derivation of functional islets is complicated by the requirement for delicate control of signaling pathways in the differentiation process to produce functional endocrine cells, and the presence of an event known as secondary transition, in which endocrine progenitor cells delaminate from the branching ductal epithelium and then undergo differentiation, migration and consolidation into islet clusters (Tran, et al., Front Bioeng Biotechnol., 8: 583970 (2020) ) . The generation of mature and functional human β-cells require the initial expression of PDX1 and SOX9, followed by NKX6-1 expression, all of which should occur prior to the transient activation of NGN3 (Nostro, et al., Stem Cell Reports, 4 (4) : 591-604 (2015) ; Russ, et al., EMBO J., 34 (13) : 1759-72 (2015) ) . The expression of NGN3 leads to the formation of endocrine progenitor cells and coincides with the morphogenetic transformation of secondary transition [Tran, et al., Front Bioeng Biotechnol., 8: 583970 (2020) ; Bruin, et al., Science translational medicine, 7 (316) : 316ps23 (2015) , Pan and Wright, Developmental Dynamics, 240 (3) : 530-565 (2011) ] . The delaminated cells are then clustered in the interstitia of the developing pancreas to form the early and immature islet which will undergo further maturation processes (Villasenor, et al., Developmental Dynamics, 241 (5) : 1008-1019 (2012) ; Herrera, et al., Development, 113 (4) : 1257-1265 (1991) ; Perez-Frances, et al., Cell Reports, 38 (7) : 110377 (2022) ) . These transcription factors need to be expressed in the proper order during the differentiation process, the failure of which could lead to reduced differentiation efficiency and the generation of unwanted cell types. For example, premature expression of NGN3 before NKX6-1 results in nonfunctional polyhormonal cells (Nostro, et al., Stem Cell Reports, 4 (4) : 591-604 (2015) ; Nelson, et al., Development, 134 (13) : 2491-2500 (2007) ; Johansson, et al., Developmental Cell, 12 (3) : 457-465 (2007) ) . Therefore, the in vitro generation of islets from pluripotent stem cells is dependent upon the accurate recapitulation of signaling events and the morphological change during secondary transition through well-established and validated approaches together with the compositions.

[0007] A variety of differentiation protocols have been proposed for the generation of β-cells or islets, but numerous hurdles impede the use of these methods to faithfully mimic the natural development of islets for research and for therapeutic purposes (Nostro, et al., Development, 138 (5) : 861-871 (2011) ; Rezania, et al., Diabetes, 61 (8) : 2016-29 (2012) ; Thowfeequ, et al., Diabetologia, 50 (8) : 1688-1697 (2007) ; Aguayo-Mazzucato, et al., Diabetes, 62 (5) : 1569-1580 (2013) ; D'Amour, et al., Nature Biotechnology, 24 (11) : 1392-1401 (2006) ; Hrvatin, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 111 (8) : 3038-43 (2014) ; Rezania, et al., Nature biotechnology, 32 (11) : 1121-1133 (2014) ; Pagliuca, et al., Cell, 159 (2) : 428-39 (2014) ; Schulz, et al., PLOS ONE, 7 (5) : e37004 (2012) ) . Drawbacks with existing 2D culture systems for producing pancreatic islets include the failure of recapitulating the signaling events and morphogenetic transformation, such as the delamination of pancreatic progenitors and the formation of islet structure, observed in secondary transition. Stem cell differentiation could be guided through the modulation of cytoskeletal polymerization status and the recruitment of adhesion proteins, which leads to the regulation of downstream signaling pathways (Janmey and Miller, Journal of cell science, 124 (1) : 9-18 (2011) ; Swift, et al., Science, 341 (6149) : 1240104 (2013) ; Dupont, et al., Nature, 474 (7350) : 179-183 (2011) ; Olson and Nordheim, Nature reviews Molecular cell biology, 11 (5) : 353-365 (2010) ) . Depolymerized cytoskeleton during the endocrine induction negatively regulates YAP1 (Yes-associated protein 1) activity, which facilitates NGN3 (Neurogenin-3) expression through the inhibition of HES1 gene (Hes Family BHLH Transcription Factor 1) (Mamidi, et al., Nature, 564: 114-118 (2018) ) . Latrunculin A is used in 2D culture system as an F-actin depolymerizer to promote the induction of endocrine lineage from pancreatic progenitor (Hogrebe, et al., Nature biotechnology, 38 (4) : 460-470 (2020) ) . However, the cells seeded onto the tissue culture polystyrene (TCP) plates remain attached to the culture surface, which impedes the delamination process during secondary transition. Therefore, in order to obtain islets, cells in 2D culture platform need to be manually dissociated and clustered into aggregates (Hogrebe, et al., Nature biotechnology, 38 (4) : 460-470 (2020) ) .

[0008] Further, 3D culture system tends to be more expensive, and the cells require dissociation and reaggregation at certain point in differentiation to achieve higher efficiency (Hogrebe, et al., Nature biotechnology, 38 (4) : 460-470 (2020) ) , possibly due to the uneven exposure to stimuli among cells in the original aggregates. Hypoxia in the core region of large aggregates is also another limitation of existing 3D culture systems (Fontana, et al., International Journal of Molecular Sciences, 21 (18) : 6806 (2020) ) .

[0009] Thus, there is a need for improved protocols to differentiate human pluripotent stem cells to functional islets that faithfully recapitulate the key signaling events and morphological changes in islet organogenesis without relying on manual dissociation and re-aggregation of endocrine progenitors and endocrine cells.

[0010] Therefore, it is an object of the present invention to provide improved compositions of two-dimensional cell cultures of pancreatic islet cells and three-dimensional cultures of pancreatic islet organoids.

[0011] It is another object of the invention to provide improved methods for generating two-dimensional cell cultures of pancreatic islet cells and three-dimensional cultures of pancreatic islet organoids.

[0012] It is also an object of the present invention to provide methods of using the pancreatic islet organoids for the study of endocrine biology, biomarker identification, and evaluation of new and existing treatments.

[0013] BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION

[0014] Disclosed are compositions containing human pancreatic islet organoids. The disclosed human pancreatic islet organoid culture systems mimic the morphogenic event in the natural islet development process, thereby enabling spontaneous generation of islet structure with high efficiency and preserving crucial islet structure.

[0015] Exemplary features of the disclosed pancreatic islet organoids include but are not limited to: (1) utilization of extracellular matrix (ECM) -coated glass surface coupled with human serum albumin-based media facilitates the spontaneous formation of islet organoids, which spontaneously delaminate from the culture surface in stage E of differentiation and have sizes similar to native human islets; (2) preservation of the structural integrity and cellular interactions of the islet organoids, thus recapitulating and promoting insulin secretion; (3) the disclosed islet organoids have cellular composition similar to native human islets; (4) replacement of animal-derived bovine serum albumin with human serum albumin as the protein improves the clinical safety of the resulting cells; and (5) rather than manual dissociation and re-aggregation of the pancreatic endocrine cells, the disclosed islet organoids are produced via spontaneous formation, which preserves crucial islet structure that is important for functional maturation of islet organoids.

[0016] Also disclosed are methods of generating human pancreatic islet organoids. The methods generally require a six-stage culture system. Generally, the method for generating pancreatic islet-like organoids from pluripotent stem cells, include the following stages:

[0017] (A) inducing differentiation of the pluripotent stem cells into definitive endoderm cells;

[0018] (B) culturing the definitive endoderm cells from Stage (A) in suitable conditions to induce their differentiation into primitive gut tube cells;

[0019] (C) culturing the primitive gut tube cells from Stage (B) in suitable conditions to induce their differentiation into PDX1+ pancreatic progenitor cells;

[0020] (D) culturing the PDX1+ pancreatic progenitor cells from Stage (C) in suitable conditions to induce their differentiation into PDX1+ / NKX6-1+ pancreatic progenitor cells;

[0021] (E) culturing the PDX1+ / NKX6-1+ pancreatic progenitor cells from Stage (D) in suitable conditions to induce their differentiation into pancreatic endocrine cell aggregates followed by their spontaneous detachment from the culture surface; and

[0022] (F) growing the pancreatic endocrine cell aggregates from Stage (D) under conditions conducive for pancreatic islet cell development, thereby generating pancreatic islet-like organoids.

[0023] Further disclosed are methods using the in vitro generated organoids and compositions thereof are disclosed. The in vitro generated organoids are particularly suited for research purposes, providing optimized cell models for the study of pancreatic islet biology, endocrine biology and metabolic disease pathology. The in vitro generated organoids are also particularly suitable for biomarker identification, and evaluation of new molecules and existing therapies for treating metabolic and / or endocrine diseases.

[0024] An exemplary method for treating Type 1 diabetes in a subject, the method comprising:

[0025] (i) implanting the population of pancreatic islet-like cells into the subject's pancreatic tissue or an area near the pancreatic tissue e.g., under or near the abdominal anterior rectus sheath;

[0026] (ii) allowing the implanted pancreatic islet organoids to mature and functionally integrate with the subject's pancreatic tissue or abdominal tissue; and

[0027] (iii) monitoring and controlling blood glucose levels in the subject to manage and treat diabetes e.g., Type I Diabetes and Type II Diabetes.

[0028] In some forms, the population of pancreatic islet-like cells can be implanted underneath the abdominal anterior rectus sheath. This transplantation method is preferred due to the ease of surgery and monitoring of the graft for any expansion or displacement by ultrasonography. Alternatively, the pancreatic islet-like cells are transplanted into the subject’s liver via the portal vein. In this method, the pancreatic-islet cells can be re-vascularized and integrated into the liver parenchyma.

[0029] Additional advantages of the disclosed method and compositions will be set forth in part in the description which follows, and in part will be understood from the description, or can be learned by practice of the disclosed method and compositions. The advantages of the disclosed method and compositions will be realized and attained by means of the elements and combinations particularly pointed out in the appended claims. It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory only and are not restrictive of the invention as claimed.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0030] The accompanying drawings illustrate several embodiments of the disclosed method and compositions and together with the description, serve to explain the principles of the disclosed method and compositions.

[0031] Figure 1 is a schematic diagram for a multi-staged culture process for the differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) to stem cell-derived islets. MatrigelTM and glass surface are only required for 2D culture system in stage 5 for cell aggregates not yet automatically detached from the surface.

[0032] Figure 2 is a collection of micrographs showing the immunofluorescence staining of definitive endoderm markers FOXA2 and SOX17 in cells after definitive endoderm induction (stage 1) , indicative of robust definitive endoderm formation. DAPI is used for the visualization of nucleus. The relative fluorescence intensities of the corresponding group of micrographs are shown in the bar graphs.

[0033] Figure 3 are micrographs showing the immunofluorescence staining of pancreatic progenitor markers PDX1 and NKX6-1 in PDX1+ pancreatic progenitors (PP1) at the end of stage 3. NKX6-1 is absent in these early progenitors. DAPI is used for the visualization of nucleus.

[0034] Figure 4 are micrographs showing the immunofluorescence staining of pancreatic progenitor markers PDX1 and NKX6-1 in PDX1+ / NKX6-1+ pancreatic progenitors (PP2) at the end of stage 4. High expression of PDX1 and NKX6-1 indicates the robust differentiation of PP2. DAPI was used for the visualization of nucleus.

[0035] Figure 5 is a bar graph showing the fluorescence intensities of PDX1 and NKX6-1 of the corresponding group of micrographs in Figure 3 and Figure 4.

[0036] Figure 6 is a bar graph showing gene expression pattern of FOXA2 and SOX17 by qPCR for cells at different differentiation stages (und: undifferentiated; St3_D8: pancreatic progenitor 1; St4_D12: pancreatic progenitor 2) .

[0037] Figure 7 is a bar graph showing gene expression pattern of PDX1 and NKX6-1 by qPCR for cells at different differentiation stages (und: undifferentiated; St3_D8: pancreatic progenitor 1; St4_D12: pancreatic progenitor 2) .

[0038] Figures 8A and 8B are collections of micrographs showing the morphological change of cells during the first 4 days in differentiation 5. Figure 8A is a collection of micrographs showing the spontaneous delamination process of cells cultured on MatrigelTM-coated glass surface. After day 4 of stage 5, the delaminated cell aggregates are transferred to suspension culture system for maturation. Figure 8B is a collection of micrographs showing the failure in aggregation and the alteration in PDX1 expression of cells cultured on MatrigelTM-coated tissue culture plate. The cells in Figures 8A and 8B are differentiated towards pancreatic endocrine fate in a same trial of experiment and were engineered to harbor an EGFP reporter downstream of PDX1 gene for real-time visualization of PDX1 expression.

[0039] Figure 9 is a collection of micrographs showing the spontaneously delaminated cell aggregates at the end of differentiation stage 5. These cells were treated by either 0.5 μM or 1.0 μM latrunculin A and demonstrated further maturation to become functional pancreatic endocrine cells. The images were captured both in 4X and 10X magnifications.

[0040] Figure 10 is a collection of micrographs showing the expression of PDX1, NKX6-1, GCG, INS, and SST in both large and small stem cell-derived islets at the end of the differentiation protocol, indicating the presence of α-cells, β-cells and δ-cells. The samples are prepared by cryosectioning before immunofluorescence staining. The percentage of cells positive for each marker is quantified in the bar graphs in the lower panel of Figure 10.

[0041] Figure 11 is a collection of micrographs showing the expression of PDX1 and endocrine markers that are essential for islet functionality in both large and small stem cell-derived islets at the end of the differentiation protocol. The samples were prepared by cryosectioning before immunofluorescence staining. The percentage of cells positive for each marker is shown in the corresponding bar graphs in the right panels.

[0042] Figure 12 is a bar graph showing the static glucose-stimulated insulin secretion of stem cell-derived islets at the end of the differentiation protocol.

[0043] Figures 13A and 13B are a collection of bar graphs (Figure 13A) and table (Figure 13B) showing the cellular distribution of the stem cell-derived islets produced by the disclosed methods labeled as “SC-islet (I) ” , the stem cell-derived islets produced by closest related existing technology labeled as “Augsornworawat et al., 2020” , and the three native human islets. Gene set enrichment analysis (GSEA) was conducted to compare the SC-β (I) cells of the present study with the published SC-β cells i.e., those cells from Augsornworawat, et al., 2020 using pancreatic endocrine cell ID gene sets, KEGG gene sets and gene ontology (GO) terms. It was observed that compared with the published SC-β cells of Augsornworawat et al, 2020, the SC-β (I) of the present study exhibited stronger β-cell identity and lower identities of the other three pancreatic endocrine cell types. Regulation of cytoskeleton and endocrine pancreas development were also upregulated as shown in the GO result of Figure 23A and 23B. Further, signaling pathways important for β-cells and the cell-cell interaction-related pathways are upregulated in the SC-β (I) cells of the present study as shown in Figure 23A and 23B.

[0044] Figure 14 is a table showing the top 20 markers of the α-cells, β-cells, PP cells (γ-cells) , δ-cells and ε-cells. Data produced from single-cell RNA seq analysis.

[0045] Figure 15 is a collection of violin plots showing the expression of PDX1, NKX6-1, GCG, INS, CHGA, ISL1, NEUROD1 and SST in cluster “α / SC-α cells” , “β / SC-βcells” and “δ / SC-δ cells” . Data produced from single-cell RNA seq analysis.

[0046] Figure 16 are heat maps of differentially expressed genes between the stem cell-derived β-cells produced by this invention labelled as “SC-β (I) ” , and the stem cell-derived β-cells produced by closest related existing technology labeled as “Augsornworawat et al., 2020” . Genes in the heat map on the left are those with significant differences (FDR < 0.05) and are in the “β-ID” gene set, while the genes in the heat map on the right are the leading-edge genes generated by GSEA analysis on the “β-ID” gene set.

[0047] Figures 17A-17D are a collection of violin plots showing the expression of the leading-edge genes illustrated in the heat maps of Figure 16.

[0048] Figure 18 is a schematic outline of the experimental design. cr1 (SEQ ID NO: 3) and cr2 (SEQ ID NO: 4) were constructed to target sequences proximal to the stop codon indicated by red letters. The pair of genotyping PCR primers are indicated with red arrowheads. HAL: homology arm left; HAR: homology arm right; HDR: homology-directed repair.

[0049] Figure 19 is a DNA gel electrophoresis image showing the three correctly targeted lines identified by genotyping PCR [Wild-type (WT) : 1, 132 bp; Knock-in (KI) : 4,043 bp] . Among these lines, clone #2 was heterozygous, clone #6 was suspected to be heterozygous and clone #7 was homozygous. Possible wild-type band from clone #6 sample was indicated by the red box.

[0050] Figure 20 is a sanger sequencing result of the PDX1 alleles from clone #7. The sequence for the wildtype PDX1, including STOP (SEQ ID NO: 5) and the sequence for the knock-in PDX1 with linker and P2A-EGFP (SEQ ID NO: 6) are shown. The correct targeted PDX1 loci were free of mutations.

[0051] Figure 21A and 21B are bar graphs showing qRT-PCR analysis for pluripotency markers NANOG (Figure 21A) and OCT4 (Figure 21B) indicating the preservation of pluripotency in clone #7. Error bars represent the standard deviation (SD) of three independent experiments.

[0052] Figure 22 is a collection of representative transmission electron micrographs of stem cell-derived β-cell (Improved) [SC-β (I) ] and stem cell-derived α-cell (Improved) [SC-α (I) ] cells in S6D14 SC-islets (I) , showing polymorphous crystalline insulin granules (top) or glucagon granules (bottom) , with magnified images of representative granules shown on the right. Scale bars are 1.0 μm for 5, 200X images and 0.2 μm for 15,500X images.

[0053] Figure 23A and 23B are a collection of waterfall charts illustrating the GSEA results quantified by the normalized enrichment score (NES) , on gene sets of pancreatic endocrine cell ID (Figure 23A upper panel) , top 10 most significantly enriched GO terms from the filtered result (Figure 23A lower panel) , gene sets of signaling pathways that are crucial for β-cells (Figure 23B upper panel) , and gene sets of cell-cell interactions (Figure 23B lower panel) . Positive value of NES indicates the pathway or gene set was upregulated in the stem cell-derived β-cells produced by the disclosed methods [SC-β (I) ] compared with those produced by Augsornworawat et al., 2020.

[0054] Figure 24A and 24B are a collection of enrichment plots on gene sets of pancreatic endocrine cell ID shown in Figure 23A upper panel. Data produced from GSEA analysis.

[0055] Figure 25 are representative phase-contrast images showing morphological differences between cultures maintained in BSA-based medium (top row) and recombinant human serum albumin (rHSA) -based medium (bottom row) on Day 2 (left column) and Day 3 (right column) of Stage 5. Cells in BSA-based medium remain adherent and form monolayer-like structures with limited aggregation. In contrast, cells in rHSA-based medium begin forming rounded, free-floating clusters by Day 2, which further mature into compact three-dimensional aggregates by Day 3. These findings demonstrate that rHSA supports early spontaneous delamination and aggregation of endocrine progenitors, facilitating islet-like organoid formation.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0056] The disclosed method and compositions can be understood more readily by reference to the following detailed description of particular embodiments and the Example included therein and to the Figures and their previous and following description.

[0057] I. DEFINITIONS

[0058] "Organoid" as used herein refers to an artificial, in vitro construct derived from adult stem cells and / or pluripotent stem cells created to mimic or resemble the functionality and / or histological structure of an organ or portion thereof.

[0059] "Media" or "culture media" as used herein refers to an aqueous based solution that is provided for the growth, viability, or storage of cells used in carrying out the present invention. A media or culture media may be natural or artificial. A media or culture media may include a basal medium and may be supplemented with nutrients (e.g., salts, amino acids, vitamins, trace elements, antioxidants) to promote the desired cellular activity, such as cell viability, growth, proliferation, and / or differentiation of the cells cultured in the media. A "basal medium, " as used herein, refers to a basal salt nutrient or an aqueous solution of salts and other elements that provide cells with water and certain bulk inorganic ions essential for normal cell metabolism and maintains intra-cellular and / or extra-cellular osmotic balance.

[0060] The term “culturing” as used herein refers to incubating and / or passaging cells in an adherent, suspension or 3D culture. As used herein, the term “adherent culture” refers to a cell culture system whereby cells are cultured on a solid surface, which may in turn be coated with an insoluble substrate that may in turn be coated with another surface coat of a substrate, such as those listed below, or any other chemical or biological material that allows the cells to proliferate or be stabilized in culture. The cells may or may not tightly adhere to the solid surface or to the substrate.

[0061] The substrate for the adherent culture may be any one or combination of tissue culture treated plastic, polyornithine, laminin, poly-lysine, purified collagen, gelatin, fibronectin, tenascin, vitronectin, entactin, heparin sulfate proteoglycans, poly glycolytic acid (PGA) , poly lactic acid (PLA) , and poly lactic-glycolic acid (PLGA) . In one embodiment, the cells are plated on plates. In another embodiment, the cells are plated on fibronectin-coated plates. Cells can be cultured in filter cultures and micromass cultures. In an embodiment, cells are plated onto membrane filters, optionally those that are placed into tissue cultures dishes as part of a transwell system (e.g.,  ) . The substrate could also be a bone scaffold substitute such as CPP (calcium polyphosphate) or other pharmaceutically available scaffolds available (e.g., BioOss) .

[0062] The term “contacting” or “culturing ... with” is intended to include incubating the component (s) and the cell / tissue together in vitro (e.g., adding the compound to cells in culture) and the step of “contacting” or “culturing ... with” can be conducted in any suitable manner. For example, the cells may be treated in adherent culture, in suspension culture, or in 3D culture; the components can be added temporally substantially simultaneously (e.g., together in a cocktail) or sequentially (e.g., within 1 hour, 1 day or more from an addition of a first component) . The cells can also be contacted with another agent such as a growth factor or other differentiation agent or environments to stabilize the cells, or to differentiate the cells further and include culturing the cells under conditions known in the art. The population of cells can be enriched using different methods such as methods based on markers such as cell surface markers (e.g., FACS sorting etc. ) .

[0063] The term “expressing” also represented as “+” means, with respect to a cell protein level, detectable protein expression compared to a cell that is not expressing the protein, for example as measured by FACS analysis. The term “fold change” in relation to expression, refers to how much a quantity changes between an original and a subsequent measurement. Fold change is considered to be the ratio between the two quantities, e.g., quantities A and B the fold change of B with respect to A is B / A. For example, a change from 30 to 60 is defined as a fold-change of 2. This is also referred to as a "one-fold increase" . For a given comparison, a positive fold change value indicates an increase of expression, while a negative fold change indicates a decrease in expression. This value is typically reported in logarithmic scale (base 2) . For example, log2 fold change of 1.5 for a specific gene in the “WT vs KO comparison” means that the expression of that gene is increased in WT relative to KO by a multiplicative factor of 2^1.5 ≈ 2.82.

[0064] The term “agonist” means an activator, for example, of a pathway or signaling molecule. An agonist of a molecule can retain substantially the same, or a subset, of the biological activities of the molecule (e.g., nodal) . For example, a nodal agonist means a molecule that selectively activates nodal signaling.

[0065] The term “inhibitor” means a selective inhibitor, for example, of a pathway or signaling molecule. An inhibitor or antagonist of a molecule (e.g., TGFβ inhibitor) can inhibit one or more of the activities of the naturally occurring form of the molecule. For example, a TGFβ inhibitor is a molecule that selectively inhibits TGFβ signaling.

[0066] The term “stem cell” or “undifferentiated cell” refers to a cell which is capable of proliferation, self-renewal and giving rise to more progenitor or precursor cells having the ability to generate a large number of mother cells that can in turn give rise to differentiated, or differentiable, daughter cells. The daughter cells can for example be induced to proliferate and produce progeny cells that subsequently differentiate into one or more mature cell types, while also retaining one or more cells with parental developmental potential. The term “stem cell” includes pluripotent stem cell.

[0067] As used herein, the term "differentiation" refers to a phenomenon in which a cell divides and proliferates, and the structure or function of a cell is specialized during the growth of an entire object. In other words, it refers to the process by which cells, tissues, etc. of living organisms change into a form and function suitable for performing the role given to each. etc. and the process of changing into endoderm cells, as well as the process of changing hematopoietic stem cells into red blood cells, leukocytes, platelets, etc., that is, progenitor cells expressing specific differentiation traits, can all be included in differentiation.

[0068] The term “pluripotency” (or pluripotent) , as used herein refers to a stem cell that has the potential to differentiate into any of the three germ layers: endoderm (for example, interior stomach lining, gastrointestinal tract, the lungs) , mesoderm (for example, muscle, bone, blood, urogenital) , or ectoderm (for example, epidermal tissues and nervous system) .

[0069] The term “Induced pluripotent stem cell” (iPSC) , as used herein, is a type of pluripotent stem cell artificially derived from a non-pluripotent cell.

[0070] Disclosed are materials, compositions, and components that can be used for, can be used in conjunction with, can be used in preparation for, or are products of the disclosed method and compositions. These and other materials are disclosed herein, and it is understood that when combinations, subsets, interactions, groups, etc. of these materials are disclosed that while specific reference of each various individual and collective combinations and permutation of these compounds may not be explicitly disclosed, each is specifically contemplated and described herein. For example, if a ligand is disclosed and discussed and a number of modifications that can be made to a number of molecules including the ligand are discussed, each and every combination and permutation of ligand and the modifications that are possible are specifically contemplated unless specifically indicated to the contrary. Thus, if a class of molecules A, B, and C are disclosed as well as a class of molecules D, E, and F and an example of a combination molecule, A-D is disclosed, then even if each is not individually recited, each is individually and collectively contemplated. Thus, in this example, each of the combinations A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, and C-F are specifically contemplated and should be considered disclosed from disclosure of A, B, and C; D, E, and F; and the example combination A-D. Likewise, any subset or combination of these is also specifically contemplated and disclosed. Thus, for example, the sub-group of A-E, B-F, and C-E are specifically contemplated and should be considered disclosed from disclosure of A, B, and C; D, E, and F; and the example combination A-D. Further, each of the materials, compositions, components, etc. contemplated and disclosed as above can also be specifically and independently included or excluded from any group, subgroup, list, set, etc. of such materials.

[0071] These concepts apply to all aspects of this application including, but not limited to, steps in methods of making and using the disclosed compositions. Thus, if there are a variety of additional steps that can be performed it is understood that each of these additional steps can be performed with any specific form or combination of forms of the disclosed methods, and that each such combination is specifically contemplated and should be considered disclosed.

[0072] All methods described herein can be performed in any suitable order unless otherwise indicated or otherwise clearly contradicted by context. The use of any and all examples, or exemplary language (e.g., “such as” ) provided herein, is intended merely to better illuminate the forms and does not pose a limitation on the scope of the forms unless otherwise claimed. No language in the specification should be construed as indicating any non-claimed element as essential to the practice of the invention.

[0073] Recitation of ranges of values herein are merely intended to serve a shorthand method of referring individually to each separate value falling within the range, unless otherwise indicated herein, and each separate value is incorporated into the specification as if it were individually recited herein.

[0074] Use of the term "about" is intended to describe values either above or below the stated value in a range of approx. + / -10%; in other embodiments the values may range in value either above or below the stated value in a range of approx. + / -5%; in other embodiments the values may range in value either above or below the stated value in a range of approx. + / -2%; in other embodiments the values may range in value either above or below the stated value in a range of approx. + / -1%. The preceding ranges are intended to be made clear by context, and no further limitation is implied. All methods described herein can be performed in any suitable order unless otherwise indicated herein or otherwise clearly contradicted by context. The use of any and all examples, or exemplary language (e.g., "such as" ) provided herein, is intended merely to better illuminate the invention and does not pose a limitation on the scope of the invention unless otherwise claimed. No language in the specification should be construed as indicating any non-claimed element as essential to the practice of the invention.

[0075] Disclosed are in vitro generated organoids. In some forms, these organoids include a population of differentiated pancreatic islet cells having cellular heterogeneity and molecular markers similar to mature pancreatic tissue. In some forms, the population of differentiated pancreatic islet cells are human pancreatic islet cells.

[0076] II. COMPOSITIONS

[0077] Robust human pancreatic islet organoid culture systems, including two-dimensional cell cultures of pancreatic islet cells and three-dimensional human pancreatic islet organoids cultures and culture systems have been established. The disclosed human pancreatic islet organoid culture systems mimic the morphogenic event in the natural islet development process, thereby enabling spontaneous generation of islet structure with high efficiency and preserving crucial islet structure.

[0078] Although not intended to be limiting, the following are exemplary features of the disclosed pancreatic islet organoids: (1) utilization of extracellular matrix (ECM) -coated glass surface coupled with human serum albumin-based media facilitates the spontaneous formation of islet organoids, which spontaneously delaminate from the culture surface in stage E of differentiation and have sizes similar to native human islets; (2) preservation of the structural integrity and cellular interactions of the islet organoids, thus recapitulating and promoting insulin secretion; (3) the disclosed islet organoids have cellular composition similar to native human islets; (4) replacement of animal-derived bovine serum albumin with human serum albumin as the protein improves the clinical safety of the resulting cells; and (5) rather than manual dissociation and re-aggregation of pancreatic endocrine cells, the disclosed islet organoids are produced via spontaneous formation, which preserves crucial islet structure that is important for functional maturation of islet organoids.

[0079] A. Pancreatic Islet Organoids

[0080] As described in the non-limiting Examples, pluripotent stem cells were induced to generate differentiated pancreatic islet organoids. It was also demonstrated that the cellular distribution of the stem cell-derived α-cells, β-cells, γ-cells (also referred to as pancreatic polypeptide or PP cells) , ε-cells, δ-cells in the differentiated pancreatic islet organoids resemble that of native human islet cells (Figures 13A and 13B) . Further, it was demonstrated that the differentiated pancreatic islet organoids can be stimulated to secrete insulin in a dose-dependent manner (Figure 12) .

[0081] Thus, differentiated pancreatic islet organoids are disclosed. The pancreatic islet organoids exhibit cellular heterogeneity, molecular composition, structural complexity, and functionality similar to the islet structures of the human pancreas.

[0082] 1. Structure of the Pancreatic Islet Organoids

[0083] The disclosed differentiated pancreatic islet organoids typically exhibit morphological characteristics and molecular markers similar to mature human pancreatic islet of Langerhans’ tissue. The pancreatic islet organoids typically contain a population of differentiated pancreatic cells, including α-cells, β-cells, and δ-cells. In some forms, the pancreatic islet organoids may also contain ε-cells and / or γ-cells (also known as or pancreatic polypeptide (PP) cells) . In some forms, the stem cell derived β-cells, α-cells, δ-cells, ε-cells, and γ-cells are organized into clusters to form the 3D pancreatic islet organoid.

[0084] In some forms, the pancreatic islet organoids contain α-cells in a percentage from about 15%to about 35%of the total cells forming the pancreatic islet organoid. In some forms, the α-cells account for about 15%, about 20%, about 25%, about 30%, about 33%, or about 35%of the total cells forming the pancreatic islet organoids. In preferred forms, the α-cells account for about 25%of the total cells forming the pancreatic islet organoid.

[0085] In some forms, the pancreatic islet organoids contain β-cells in a percentage from about 25%to about 40%of the total cells forming the pancreatic islet organoid. In some forms, the β-cells account for about 25%, about 27%, about 30%, about 33%, about 36%, or about 40%of the total cells forming the pancreatic islet organoids. In preferred forms, the β-cells account for about 32.1%of the total cells forming the pancreatic islet organoid.

[0086] In some forms, the pancreatic islet organoids contain δ-cells in a percentage from about 2.0%to about 10.0%of the total cells forming the pancreatic islet organoid. In some forms, the δ-cells account for about 2.0%, about 4.0%, about 6.0%, about 7.0%, about 8.0%, or about 10.0%of the total cells forming the pancreatic islet organoids. In preferred forms, the δ-cells account for about 5.3%of the total cells forming the pancreatic islet organoid.

[0087] In some forms, when γ-cells are present in the pancreatic islet organoids, the γ-cells account for a percentage from about 0.5%to about 1.5%of the total cells forming the pancreatic islet organoid. In some forms, the γ-cells account for about 0.5%, about 0.7%, about 0.9%, about 1.1%, about 1.3%, or about 1.5%of the total cells forming the pancreatic islet organoids. In preferred forms, the γ-cells account for about 0.81%of the total cells forming the pancreatic islet organoid.

[0088] In some forms, the pancreatic islet organoids contain ε-cells in a percentage from about 0.1%to about 0.6%of the total cells forming the pancreatic islet organoid. In some forms, the ε-cells account for about 0.1%, about 0.2%, about 0.3%, about 0.4%, about 0.5%, or about 0.6%of the total cells forming the pancreatic islet organoids. In preferred forms, the ε-cells account for about 0.1%of the total cells forming the pancreatic islet organoid.

[0089] In some forms, the pancreatic islet organoids may express one or more genes associated with α-cell identity. For example, the pancreatic islet organoids may express one or more genes selected from TM4SF4 transmembrane 4 L six family member 4 (TM4SF4) , glucagon (GCG) , FXYD3 (FXYD3 FXYD domain containing ion transport regulator 3) , TMEM176B (TMEM176B transmembrane protein 176B) , TTR (transthyretin) , NAA20 (N-Alpha-Acetyltransferase 20, NatB Catalytic Subunit) , SCG5 (Secretogranin V) , C19orf77 (small integral membrane protein 24 or SMIM24) , CLU (Clusterin) , GPX3 (glutathione peroxidase 3) , CHGB (chromogranin B) , B2M (beta-2-microglobulin) , PEMT (phosphatidylethanolamine N-methyltransferase) , PCSK2 (proprotein convertase subtilisin / kexin type 2) , SCGB2A1 (secretoglobin family 2A member 1) , C10orf10 (DEPP autophagy regulator 1) , RNASEK-C18orf49 (ribonuclease, RNase K and chromosome 17 open reading frame 49) , VGF (VGF nerve growth factor inducible) , HLA-A (HLA-Amajor histocompatibility complex, class I, A) , and SERPINA1 (encodes alpha-1 antitrypsin) .

[0090] In some forms, the pancreatic islet organoids may express one or more genes associated with β-cell identity. For example, the pancreatic islet organoids may express one or more genes selected from INS (insulin) , RBP4 (Retinol Binding Protein 4) , HADH (HADH hydroxyacyl-CoA dehydrogenase) , IAPP (Islet Amyloid Polypeptide) , MT-RNR2, FAM159B, NPTX2, PCP4, RAPL31, EEF1G, GSN, SNORA33, MEG3, RPL17, RPS20, G6PC2, C17orf76-AS1, ERO1B, ID1, and ACVR1C.

[0091] In some forms, the pancreatic islet organoids may express one or more genes associated with γ-cell identity. For example, the pancreatic islet organoids may express one or more genes selected from CPB1, MEIS2, PCSK1N, PPY, DIRAS3, TM4SF4, CPE, AQP3, PAM, SCGB2A1, IDS, ADCYAP1, PEG10, DLK1, TUBB2B, RASD1, ID1, IGFBP3, BCAM, and IGFBP2.

[0092] In some forms, the pancreatic islet organoids may express one or more genes associated with δ-cell identity. For example, the pancreatic islet organoids may express one or more genes selected from SST, HHEX, FXYD2, NEAT1, TRIR, LOC728392, AMBP, C1QTNF4, PRXL2A, SELENOF, RTRAF, APOC3, ST3GAL1, SEPTIN2, PIM3, ASCL1, TLCD4, SELENOH, SELENOK, and STMP1.

[0093] In some forms, the pancreatic islet organoids may express one or more genes associated with ε-cell identity. For example, the pancreatic islet organoids may express one or more genes selected from C3orf58, CHL1, GFRA3, CTC-340A1F. 2, NRFA3, NTRK2, GPIHBP1, GPRIN2, GHRL, C9orf66, ACSL1, PON1, B3GNT7, RAMP1, SPNK1, RP11-182L21.6, AC012146.7, ANXA13, PLAC9, and GPR64.

[0094] In some forms, the pancreatic islet organoids may express one or more cell type markers associated with the presence of α-cells, β-cells, and δ-cells in the pancreatic islet organoids. In some forms, the islet organoids may express one or more of the following cell type markers: pancreatic and duodenal homeobox 1 (PDX1) , homeobox protein Nkx-6.1 (NKX6.1) , glucagon (GCG) , insulin (INS) , chromogranin A (CHGA) , ISL LIM homeobox 1 (ISL1) , neuronal differentiation 1 (NEUROD1) , and somatostatin (SST) . For example, the expression levels for PDX1, NKX6.1, GCG, INS, CHGA, ISL1, NEUROD1, and SST in exemplary α-cells, β-cells and δ-cells are shown in Figure 15.

[0095] In some forms, the islet organoids express pancreatic and duodenal homeobox 1 (PDX1) . PDX1 is a transcriptional activator of several genes, including insulin, somatostatin, glucokinase, islet amyloid polypeptide, and glucose transporter type 2. The encoded nuclear protein is involved in the early development of the pancreas and plays a major role in glucose-dependent regulation of insulin gene expression.

[0096] In some forms, the islet organoids express homeobox protein Nkx-6.1 (NKX6.1) . NKX6.1 is required in the pancreas for the development of beta cells and is a potent bifunctional transcription regulator that binds to AT-rich sequences within the promoter region of target genes.

[0097] In some forms, the islet organoids express glucagon (GCG) . GCG is also known as GLP1, GLP2, and GRPP. GCG is a preproprotein that is cleaved into four mature peptides. One of these, glucagon, is a pancreatic hormone that counteracts the glucose-lowering action of insulin by stimulating glycogenolysis and gluconeogenesis. Glucagon is a ligand for a specific G-protein linked receptor whose signaling pathway controls cell proliferation. Two of the other peptides are secreted from gut endocrine cells and promote nutrient absorption through distinct mechanisms. Finally, the fourth peptide is similar to glicentin, an active enteroglucagon.

[0098] In some forms, the islet organoids express insulin (INS) . Insulin is a peptide hormone that plays an important role in the regulation of carbohydrate and lipid metabolism. After removal of the precursor signal peptide, proinsulin is post-translationally cleaved into three peptides: the B chain and A chain peptides, which are covalently linked via two disulfide bonds to form insulin, and C-peptide. Binding of insulin to the insulin receptor (INSR) stimulates glucose uptake.

[0099] In some forms, the islet organoids express chromogranin A (CHGA) . CHGA is a member of the chromogranin / secretogranin family of neuroendocrine secretory proteins. It is found in secretory vesicles of neurons and endocrine cells. This gene product is a precursor to three biologically active peptides; vasostatin, pancreastatin, and parastatin. These peptides act as autocrine or paracrine negative modulators of the neuroendocrine system.

[0100] In some forms, the islet organoids express ISL LIM homeobox 1 (ISL1) . ISL1 is a member of the LIM / homeodomain family of transcription factors. The encoded protein binds to the enhancer region of the insulin gene, among others, and may play an important role in regulating insulin gene expression. The encoded protein is central to the development of pancreatic cell lineages and may also be required for motor neuron generation.

[0101] In some forms, the islet organoids express neuronal differentiation 1 (NEUROD1) . NEUROD1 is a member of the NeuroD family of basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors. The protein forms heterodimers with other bHLH proteins and activates transcription of genes that contain a specific DNA sequence known as the E-box. It regulates expression of the insulin gene.

[0102] In some forms, the islet organoids express somatostatin (SST) . SST is a hormone that has active 14 aa and 28 aa forms that are produced by alternate cleavage of the single preproprotein encoded by this gene. Somatostatin is expressed throughout the body and inhibits the release of numerous secondary hormones by binding to high-affinity G-protein-coupled somatostatin receptors.

[0103] The disclosed islet organoids demonstrate increased β-cells compared to existing models. As demonstrated in the non-limiting Examples, it was observed that compared with the published SC-β cells of Augsornworawat et al, 2020, the SC-β (I) of the present study exhibited stronger β-cell identity and lower identities of the other three pancreatic endocrine cell types (see Figure 23A and 23B) . Regulation of cytoskeleton and endocrine pancreas development were also upregulated as shown in the GO result of Figures 23A and 23B. Further, signaling pathways important for β-cells and the cell-cell interaction-related pathways are upregulated in the SC-β (I) cells of the present study as shown in Figure 23A and 23B.

[0104] 2. Function of the Pancreatic Islet Organoids

[0105] The disclosed differentiated pancreatic islet organoids typically recapitulates pancreatic functions similar to that of the native pancreatic islets, thereby providing an improved research platform to investigate various aspects of endocrine physiology. For example, as described in the non-limiting Examples, it was demonstrated that the differentiated pancreatic islet organoids can be stimulated to secrete insulin in a dose-dependent manner (Figure 12) .

[0106] Generally, the different cell types forming the pancreatic islet organoids mimic a variety of functions that contribute to insulin production and secretion, and glucose sensing and regulation. In some forms, the α-cells forming the pancreatic islet organoids produce and secrete glucagon, a hormone that raises blood glucose levels by promoting the release of glucose from the liver. In some forms, the β-cells forming the pancreatic islet organoids produce and secrete insulin, a hormone that facilitates the uptake of glucose by cells and lowers blood glucose levels.

[0107] In some forms, the δ-cells forming the pancreatic islet organoids secrete somatostatin, a hormone that regulates the secretion of both insulin and glucagon. Somatostatin acts as a modulator, preventing excessive fluctuations in hormone levels and maintaining glucose homeostasis. In some forms, the γ-cells forming the pancreatic islet organoids produce pancreatic polypeptide, which plays a role in controlling food intake and digestion by reducing appetite and regulating the secretion of digestive enzymes. In some forms, ε-cells are present in the pancreatic islet organoids and secrete ghrelin.

[0108] B. Formulations

[0109] Formulations containing the pancreatic islet organoids are also provided. In some forms, the formulation includes pancreatic islet organoids provided in a cell culture media. In some forms, the formulation contains pancreatic islet cells suspended in cell culture media. When the formulation provides pancreatic islet cells suspended in cell culture media, these cells can initially be cultured in a 2D single-layer format, such as a 2D monolayer. Over time, this monolayer spontaneously aggregates, forming 3D clusters, thereby giving rise to 3D pancreatic islet organoids. Subsequently, these 3D clusters or pancreatic islet organoids disengage from the culture surface and become free-floating within the culture medium.

[0110] In some forms, the PDX1+ / NKX6.1-pancreatic progenitor cells from stage 3 (i.e. stage C) are selected for dissociation and / or replating. In some forms, the PDX1+ / NKX6.1+ pancreatic progenitor cells from stage 4 (i.e. stage D) are selected for dissociation and re-plating. Alternatively, in some forms, if the cells are already in stage 5 (i.e. stage E) or even in stage 6 (i.e. stage F) , the dissociated cells in suspension can be put on an orbital shaker (placed in a cell culture incubator) at 100 rpm to form islet organoids.

[0111] Typically, one pancreatic islet equivalent (IEQ) contains about 1,500 to about 2,000 cells. In some forms, the formulation contains between about 1 IEQ and 70,000 IEQ. In some forms, the formulation contains between about 2,500 IEQ and 34,000 IEQ. Preferably, the formulation contains from about 2,500 to about 3, 300 IEQ. In some forms, the number of cells in the formulation is between about 1 and 100 million cells, between about 5 and 50 million cells, or preferably about 5 million cells.

[0112] In some forms, the formulation contains pancreatic islet organoids surrounded by an extracellular matrix (ECM) . In some forms, the formulation contains pancreatic islet cells surrounded by an extracellular matrix (ECM) . The injectable material could contain biomaterials such as collagens, polyglycolic acid (PGA) , polylactic acid, alginates (for example, the calcium salt) , polyethylene oxide, fibrin adhesive, polylactic acid-polyglycolic acid copolymer, proteoglycans, glycosaminoglycans, natural biomaterials such as Matrigel.

[0113] In some forms, the formulation includes pancreatic islet organoids provided in a cryopreservative. In some forms, the formulation includes pancreatic islet cells provided in a cryopreservative. In some forms, the number of cells in the formulation is between about 1 and 30 million cells, preferably about 10 million cells, more preferably about 5 million cells.

[0114] Media for preservation of cells are known in the art, for example, CRYO-GOLDTM (cryopreservation medium) and  (cryopreservation freeze media) designed to mitigate temperature-induced molecular cell stress responses during freezing and thawing. All products are pre-formulated with USP grade DMSO, a permeant solute cryoprotective agent which helps mitigate damage from the formation of intracellular ice.  is offered in several packages and pre-formulated with DMSO in final concentrations of 2%, 5%, and 10%. A preferred medium for cell preservation includes 5-10 %DMSO, for example,  CS10 (auniquely formulated serum-free, animal component-free, and defined cryopreservation medium containing 10%dimethyl sulfoxide (DMSO) ) . Additionally, cryoprotectants / cryoprotectant additives which can be include in a cell composition (for cryopreservation) are known in the art and include, ethylene glycol (EG) , antioxidants such as taurine, Metformin, gamma amino butyric acid (GABA) . Cells may be suspended in a "freeze medium" such as cell culture medium containing 15-20%fetal bovine serum (FBS) and 7-10%DMSO, with or without 5-10%glycerol, at a density, for example, of about 1-10 x 106 cells / ml. The cells are dispensed into glass or plastic vials, which are then sealed and transferred to a freezing chamber of a programmable or passive freezer. The optimal rate of freezing may be determined empirically. For example, a freezing program that gives a change in temperature of -1 ℃ / min through the heat of fusion may be used. Once vials containing the cells have reached -80 ℃, they are transferred to a liquid nitrogen storage area.

[0115] C. Kits

[0116] The materials described above as well as other materials can be packaged together in any suitable combination as a kit useful for performing, or aiding in the performance of, the disclosed method. It is useful if the kit components in a given kit are designed and adapted for use together in the disclosed method.

[0117] In some forms, the kit may be a cell culture kit. In some forms, the cell culture kit may include one or more undifferentiated pancreatic progenitor cells, culture reagents, and materials suitable for culturing the pancreatic islet organoids.

[0118] In an exemplary form, a kit for generating pancreatic islet organoids can contain a combination of two or more of:

[0119] (i) Expansion culture medium for promoting expansion of the PSCs containing basal medium containing a Rho Kinase inhibitor;

[0120] (ii) one or more differentiation mediums, including but not limited to HS1-1, HS1-2 medium, HS2 medium, HS3 medium, HS4 medium, HS5-1 medium, HS5-2 medium, and / or HS6 medium; and / or

[0121] (iii) one or more scaffold or support structures.

[0122] In some forms, the kit includes reagents and small molecules for preparation of the HS1-1 medium. Table 10 provides an exemplary list of reagents and small molecules that can be included in a kit for the preparation of HS1-1 medium.

[0123] Table 10: List of Reagents for HS1-1 Medium Kit

[0124] In some forms, the kit includes reagents and small molecules for preparation of the HS1-2 medium. Table 11 provides an exemplary list of reagents and small molecules that can be included in a kit for the preparation of HS1-2 medium.

[0125] Table 11: List of Reagents for HS1-2 Medium Kit

[0126] In some forms, the kit includes reagents and small molecules for preparation of the HS2 medium. Table 12 provides an exemplary list of reagents and small molecules that can be included in a kit for the preparation of HS2 medium.

[0127] Table 12: List of Reagents for HS2 Medium Kit

[0128] In some forms, the kit includes reagents and small molecules for preparation of the HS3 medium. Table 13 provides an exemplary list of reagents and small molecules that can be included in a kit for the preparation of HS3 medium.

[0129] Table 13: List of Reagents for HS3 Medium Kit

[0130] In some forms, the kit includes reagents and small molecules for preparation of the HS4 medium. Table 14 provides an exemplary list of reagents and small molecules that can be included in a kit for the preparation of HS4 medium.

[0131] Table 14: List of Reagents for HS4 Medium Kit

[0132] In some forms, the kit includes reagents and small molecules for preparation of the HS5-1 medium. Table 15 provides an exemplary list of reagents and small molecules that can be included in a kit for the preparation of HS5-1 medium.

[0133] Table 15: List of Reagents for HS5-1 Medium Kit

[0134] In some forms, the kit includes reagents and small molecules for preparation of the HS5-2 medium. Table 16 provides an exemplary list of reagents and small molecules that can be included in a kit for the preparation of HS5-2 medium.

[0135] Table 16: List of Reagents for HS5-2 Medium Kit

[0136] In some forms, the kit includes reagents and small molecules for preparation of the HS6 medium. Table 17 provides an exemplary list of reagents and small molecules that can be included in a kit for the preparation of HS6 medium.

[0137] Table 17: List of Reagents for HS6 Medium Kit

[0138] In some forms, the one or more culture media in the kit may be formulated in deionized, distilled water. In some forms, one or more culture media will typically be sterilized prior to use to prevent contamination, e.g., by ultraviolet light, heating, irradiation, or filtration. In some forms, the one or more culture media may be frozen (for example, at -20 ℃ or -80 ℃) for storage or transport. In some forms, one or more culture media may contain one or more antibiotics to prevent contamination.

[0139] The one or more media in the kit may be contained in hermetically sealed vessels which prevent contamination. Hermetically sealed vessels may be preferred for transport or storage of the culture media. The vessel may be any suitable vessel, such as a flask, a plate, a bottle, a jar, a vial, or a bag.

[0140] The kit may also include instructions for use, e.g., for using the expansion medium for deriving the pancreatic islet organoids, facilitating the spontaneous formation of the pancreatic islets, and / or for extracting the differentiated pancreatic islets.

[0141] III. METHODS OF MAKING PANCREATIC ISLET ORGANOIDS

[0142] Methods of making pancreatic islet organoids are also provided. The disclosed methods outline steps for culturing cells obtained from pluripotent stem cells. The methods generally require a six-stage culture system (FIG. 1) . The differentiated pancreatic organoids adequately simulate the structure and function of the human pancreatic islet of Langerhans tissue. Namely, the pancreatic islet culture system facilitates a highly efficient reconstruction and stable expansion of the human pancreatic islets in culture plates for various experimental and therapeutic applications.

[0143] The pancreatic islet organoids disclosed herein, once established, are stable for up to one month, two months, or longer, while displaying remarkable phenotypic and genotype stability. In some forms, the pancreatic islet organoids, once established, are stable for up to one year without passaging. In some forms, the pancreatic islet organoids, once established are stable for three months, six months, nine months, ten months, eleven months, or twelve months without passing. They thus overcome the reproducibility and availability limitations of the current in vitro model systems. These pancreatic islet organoids, include the four major types of pancreatic islet cells, i.e., α-cells, β-cells, δ-cells, γ-cells, and ε-cells (FIG. 13A and 13B) . In some forms, generating a line of pancreatic islet organoids from pluripotent stem cells using the disclosed methods takes between about 3 weeks and about 6 weeks, more preferably, between about 3 weeks and about 5 weeks. In some forms, generating a line of pancreatic islet organoids from pluripotent stem cells using the disclosed methods takes at least 3 weeks.

[0144] A. Sources of Cells

[0145] The pluripotent stem cells used to generate pancreatic islet organoids can be obtained from a variety of sources. In a preferred embodiment, the pluripotent stem cells are human pluripotent stem cells (hPSCs) . In one preferred form, the hPSCs are H1-human embryonic stem cells (H1-hESCs) .

[0146] In some forms, the pluripotent stem cells used to generate the pancreatic islet organoids are from a human embryonic stem cell (hESC) line. Exemplary human embryonic stem cell lines include H1, H7, H9, Man1 / M1, and Man10 / M10.

[0147] In some forms, the pluripotent stem cells used to generate the pancreatic islet organoids are human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) . hiPSCs can be obtained from primary cells such as fibroblasts through transfection of plasmid DNA encoding reprogramming factors e.g., Yamanaka factors. Human induced pluripotent stem cells are commercially available e.g., ATCC-DYS0100 Human Induced Pluripotent Stem (IPS) Cells (ATCC, Catalog#ACS-1019) , and iPS (IMR90) -1, iPS (IMR90) -2, iPS (IMR90) -3, iPS(IMR90) -4 from WiCell Research Institute. Human-induced pluripotent stem cells can also be generated from a variety of somatic cell types using methods known in the art (Yu et al., Science, 324 (5928) : 797-801 (2009) ) .

[0148] In some forms, the pluripotent stem cells used to generate the pancreatic islet organoids are human chemically induced pluripotent stem cells (hCiPSCs) . Chemical-mediated cellular reprogramming via small molecules alone i.e., without Yamanaka factors, can be used to generate iPSCs from somatic cells. Methods for generating hCiPSCs from somatic cells are known in the art (Guan et al., Nature, 605: 325-331 (2022) ; Liuyang et al., Cell Stem Cell, 30 (4) : 450-459 (2023) ) .

[0149] B. Improved Materials for Generating Pancreatic Islet Organoids

[0150] One of the limitations of existing pancreatic islet organoid culture protocols lies in the choice of solid substrates used during differentiation. Conventional 2D culture platforms, such as tissue culture polystyrene (TCP) , fail to recapitulate key signaling events and morphogenetic transformations that naturally occur during the secondary transition of pancreas development. Specifically, these systems do not mimic the delamination of endocrine progenitor cells, a hallmark of islet formation in vivo.

[0151] Mechanistic studies have demonstrated that stem cell fate decisions are closely regulated by the physical properties of the cell microenvironment, such as through cytoskeletal dynamics and cell-substrate adhesion. Modulation of cytoskeletal polymerization affects downstream signaling pathways; for instance, cytoskeletal depolymerization during endocrine induction downregulates YAP1 activity, which in turn facilitates NGN3 expression via inhibition of HES1. Compounds such as Latrunculin A have been used to depolymerize F-actin and promote endocrine lineage commitment. However, in standard 2D culture on TCP, cells remain strongly attached to the substrate surface, preventing the natural delamination and spatial organization of endocrine progenitors into islet-like structures.

[0152] To address this, researchers often resort to manual dissociation of adherent cells followed by forced aggregation to generate islet-like clusters-an approach that is labor-intensive and does not reflect natural developmental processes. Similarly, while 3D culture systems can offer a more physiologically relevant environment, they present other drawbacks such as higher cost, complex handling, and challenges with uniform exposure to differentiation cues. Additionally, hypoxia in the core of large cell aggregates further limits the efficiency and quality of islet formation.

[0153] Thus, also provided are improved materials and methods of differentiation which facilitate the spontaneous formation of functional islet-like organoids (SC-islets) by leveraging cell-intrinsic morphogenetic behaviors, rather than relying on artificial dissociation and re-aggregation steps. As demonstrated in the non-limiting Examples, it was found that reducing cell attachment-by using ECM-coated glass-support the spontaneous delamination and 3D aggregation of pancreatic endocrine progenitors (see Figure 8A and 8B) . Solid substrates such as ECM-coated glass facilitated earlier and more robust formation of free-floating SC-islets (Figure 8B) , in contrast to ECM-coated plastic surfaces where cells remained attached and failed to aggregate (Figure 8A) . Thus, the type of culture substrate is important in supporting the morphogenetic events important for islet organogenesis and functional maturation.

[0154] In one exemplary form, the improved methods include culturing the cells on a solid substrate containing a glass surface coated with an extracellular matrix (ECM) component under conditions suitable to promote the spontaneous formation and detachment of pancreatic islet-like organoids from human pluripotent stem cells or pancreatic progenitor cells. In some forms, the glass surface can be a petri dish, a multi-well plate, a microscope slide, or a coverslip. In other forms, the glass surface can be a part of a petri dish, a multi-well plate, a microscope slide, or a coverslip. The glass surface is generally coated with extracellular matrix such as a laminin, collagen IV, fibronectin, or vitronectin, or a combination thereof.

[0155] The methods can also include allowing the cells to undergo spontaneous delamination and aggregation to form three-dimensional pancreatic islet-like organoids. In some forms, the methods also include transferring the free-floating organoids to a suspension culture system for further maturation.

[0156] In addition to the physical properties of the culture substrate, the composition of the culture medium plays an important role in supporting the spontaneous formation of islet-like organoids. As demonstrated in the non-limiting Examples, recombinant human serum albumin (rHSA) significantly increased the spontaneous aggregation and delamination of pancreatic endocrine progenitors during stage 5, an important phase for 3D structure formation compared to bovine serum albumin (Figure 25) . This improved performance of rHSA can potentially be attributed to species-specific interactions or differences in protein binding and transport properties, which could influence the bioavailability of morphogens or signaling molecules in the culture environment. Thus in some forms, BSA is fully replaced with rHSA in the medium formulation for all stages. As demonstrated in the examples, this substitution did not interfere with earlier lineage specification steps and, importantly, facilitated more robust and reproducible formation of spontaneously delaminated, free-floating islet organoids during endocrine induction (Figure 25) .

[0157] C. Stages of Generating Pancreatic Islet Organoids

[0158] The disclosed methods outline steps for culturing cells obtained from pluripotent stem cells. The methods generally require a six-stage culture system (FIG. 1) . Generally the method for generating pancreatic islet-like organoids from pluripotent stem cells, include the following stages:

[0159] (A) inducing differentiation of the pluripotent stem cells into definitive endoderm cells;

[0160] (B) culturing the definitive endoderm cells from Stage (A) in suitable conditions to induce their differentiation into primitive gut tube cells;

[0161] (C) culturing the primitive gut tube cells from Stage (B) in suitable conditions to induce their differentiation into PDX1+ pancreatic progenitor cells;

[0162] (D) culturing the PDX1+ pancreatic progenitor cells from Stage (C) in suitable conditions to induce their differentiation into PDX1+ / NKX6-1+ pancreatic progenitor cells;

[0163] (E) culturing the PDX1+ / NKX6-1+ pancreatic progenitor cells from Stage (D) in suitable conditions to induce their differentiation into pancreatic endocrine cell aggregates; and

[0164] (F) growing the pancreatic endocrine cell aggregates from Stage (E) under conditions conducive for pancreatic islet cell development, thereby generating pancreatic islet-like organoids.

[0165] In some forms, the PDX1+ / NKX6-1+ pancreatic progenitor cells from Stage (D) spontaneously form aggregates by the end of Stage (E) , and subsequently detached from the culture surface before entering Stage (F) . Following detachment, these "pancreatic endocrine cell aggregates" are referred to as "islet organoids" . In some forms, Stage (F) represents a maturation stage for the “islet organoids” formed in Stage (E) .

[0166] 1. Stage A –Definitive Endoderm Induction

[0167] Stage (A) involves inducing differentiation of the pluripotent stem cells into definitive endoderm cells. Generally, Stage A includes the following steps:

[0168] (i) seeding the pluripotent stem cells (PSCs) onto a solid substrate in a basal medium supplemented with a Rho Kinase inhibitor to promote expansion of the PSCs;

[0169] (ii) culturing the pluripotent stem cells from Step (i) in a first differentiation medium (HS1-1 medium) for a period of time, wherein the period of time is from about 20 hours to about 30 hours, preferably for about 24 hours; and

[0170] (iii) culturing PSCs from Step (ii) in a second differentiation medium (HS1-2 medium) for a period of time, wherein the period of time is from about 50 hours to about 80 hours, preferably for about 72 hours.

[0171] In some forms, the basal media used to seed the pluripotent cells onto the solid substrate in Step (i) contains a Rho Kinase (ROCK) inhibitor. Preferably, the ROCK inhibitor used is Y27632 in an amount ranging from about 2 μM to about 30 μM, preferably about 10 μM. Other alternative ROCK inhibitors that can be used include but are not limited to H-1152 and Fasudil (HA-1077) .

[0172] In some forms, the basal media used for seeding the PSCs in Step (i) is selected from the group comprising Essential 8TM Medium and mTeSRTM Plus medium. Alternative basal mediums that can be used include but are not limited to mTeSRTM1 cGMP, feeder-free maintenance medium for human ES and iPS cells (STEMCELLTMTechnologies, Catalog##85850) ; TeSRTM2 Xeno-free, defined, feeder-free medium for maintenance of undifferentiated human ES and iPS cells (STEMCELLTM Technologies Catalog #05860) ; TeSRTM-E8TM Feeder-free, animal component-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells (STEMCELLTM Technologies, Catalog # 05990) ; StemProTM MSC SFM (ThermoFisher Scientific, Catalog#A1033201) ; PluriSTEMTM Human ES / iPS Cell Medium (Millipore Sigma, Catalog#SCM130) ; StemMACSTM iPS-Brew XF xeno-free cell culture medium for the maintenance of human ES and iPS cells (Miltenyi Biotec, Catalog#130-104-368) ; StemFitTM Basic02 Stem Cell Culture Media (AMSBIO, Catalog#SFB-500) ; StemFlexTM Medium (ThermoFisher Scientific, Catalog#A3349401) ; and  DEF-CSTM (Takara Bio., Catalog#Y30012 and Y30017) . In some forms, the number of cells that are seeded onto the solid substrate in Step (i) ranges from about 0.32 x 106 cells / cm2 to about 0.74 x 106 cells / cm2.

[0173] In preferred forms, the solid substrate is an extracellular matrix (ECM) -coated glass surface. It has been found that using an ECM-coated glass surface facilitated efficient spontaneous formation of pancreatic islet clusters which delaminate from the culture surface. Cells appear to be less tightly attached to the coated glass surface compared with the coated plastic surface in regular tissue culture plate (TCP) . It is believed that the regulation of cytoskeleton is improved in part because it was found in the KEGG pathway analysis that "Regulation of actin cytoskeleton" is enhanced in the disclosed β cells compared with published cells (see Figures 23A and 23B) . Images captured during islet organoid differentiation demonstrate the difference between TCP and glass surface (Figures 8A and 8B) . Cells seeded on TCP remain firmly attached to the surface while those seeded on glass surface formed islet organoids (Figures 8A and 8B) .

[0174] In some forms, Step (i) further includes coating the solid substrate with a basement membrane diluted in a basal media. In some forms, the basement membrane is MatrigelTM. In some forms, the basal media is DMEM / F-12. In some forms, the ratio of basement membrane to basal media is about 1: 70.

[0175] In some forms, HS1-1 medium supplement contains basal media comprising one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements, and one or more buffering agents. In some forms, the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL.

[0176] In some forms, the carbohydrate included in the HS1-1 medium supplement is glucose in an amount from about 0.600 g to about 1.000 g, preferably about 0.800 g. In some forms, the protein is recombinant Human Serum Albumin (rHSA) in an amount ranging from about 0.450g to about 0.550g, preferably about 0.500g. Acceptable alternative proteins to recombinant Human Serum Albumin include but are not limited to Human serum albumin (HSA) , recombinant bovine serum albumin (rBSA) , and recombinant albumin (rAlbumin) .

[0177] In some forms, the growth factor included in the HS1-1 medium supplement is selected from the group containing a TGFβ / Activin agonist, basic fibroblast growth factor (bFGF) , and glycogen synthase kinase 3-beta (GSK 3β inhibitor) . In some forms, the TGFβ / Activin agonist is Activin A. In some forms, Activin A is present in the HS1-1 supplement in an amount ranging from about 40 μg to about 60 μg. Preferably, Activin A is present in the amount of about 50 μg. Regarding the HS1-1 medium supplement, “ng / mL” and “μM” indicates the volume and concentration for the final working concentration in the complete medium (i.e. 100 mL HS1-1 supplement + 400 mL basal medium) . In some forms, Activin A is present in an amount ranging from about 80 ng / mL to about 120 ng / mL. Preferably, Activin A is present in the amount of about 100 ng / mL. Alternative TGFβ / Activin agonists that can be used include but are not limited to IDE1 (Definitive Endoderm 1 Inducer) and IDE2 (Definitive Endoderm 2 Inducer) .

[0178] In some forms, the bFGF is present in an amount ranging from about 4 μg to about 6 μg. Preferably, the bFGF is present in the HS1-1 medium supplement in an amount of about 5 μg. Alternative small molecules to bFGF that can be used include but are not limited to peptides designed to mimic the function of bFGF / FGF2 protein e.g., DJ-1, SUN11602, and any bFGF / FGF2 mimetic peptide. In some forms, the growth factor from the FGF family contains a polypeptide having an amino acid sequence at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%, or greater identical to the human FGF2 polypeptide sequence (GenBank Accession: NP_001997) .

[0179] In some forms, the GSK 3b inhibitor is CHIR99021 present in the HS1-1 medium in an amount ranging from about 558.41 μg to about 837.61 μg, preferably about 698.01 μg.Alternative GSK 3β inhibitors and small molecules that can be used include but are not limited to 3F8, A1070722, AR-A014418, BIO, BlO-acetoxime, FRATide, 10Z-Hymenialdisine, Indirubin-3'-oxime, kenpaullone, L803, L803-mts, lithium carbonate, NSC 693868, SB216763, SB415286, TC-G 24, TCS 2002, TCS 21311, TWS119, and analogs or derivatives thereof. In some forms, Wnt3a recombinant protein (WNT signaling pathway activator) can be used as an alternative to the GSK 3β inhibitor.

[0180] In some forms, the HS1-1 medium supplement contains a buffering agent. Preferably, the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.520g to about 0.620g, more preferably about 0.587g. Alternative buffering agents can be used and include but are not limited to HEPES buffer.

[0181] In some forms, the HS1-1 medium supplement contains one or more additional supplement agents. Preferably, the supplement agent is 1X GlutaMax (i.e., the working concentration of GlutaMax) . In some forms, the supplement agent is L-Glutamine. In some forms, the supplement agent in the HS1-1 medium is 5X GlutaMax or 5 mL 100X GlutaMax.

[0182] The HS1-2 medium supplement typically includes basal media containing one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements, and one or more buffering agents. Basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL.

[0183] In some forms, the carbohydrate included in the HS1-2 medium supplement is glucose in an amount from about 0.600 g to about 1.000 g, preferably about 0.800 g. In some forms, the protein is recombinant Human Serum Albumin (rHSA) in an amount ranging from about 0.450g to about 0.550g, preferably about 0.500g. Acceptable alternative proteins to recombinant Human Serum Albumin include but are not limited to Human serum albumin (HSA) , recombinant bovine serum albumin (rBSA) , and recombinant albumin (rAlbumin) .

[0184] In some forms, the growth factor included in the HS1-2 medium supplement is selected from the group containing a TGFβ / Activin agonist and basic fibroblast growth factor (bFGF) . In some forms, the TGFβ / Activin agonist is Activin A. In some forms, Activin A is present in an amount ranging from about 40 μg to about 60 μg. Preferably, Activin A is present in the amount of about 50 μg. Alternative TGFβ / Activin agonists that can be used include but are not limited to IDE1 (Definitive Endoderm 1 Inducer) and IDE2 (Definitive Endoderm 2 Inducer) .

[0185] In some forms, the bFGF is present in an amount ranging from about 4 μg to about 6 μg, preferably about 5 μg. Alternative small molecules to bFGF that can be used include but are not limited to peptides designed to mimic the function of bFGF / FGF2 protein e.g., DJ-1, SUN11602, and any bFGF / FGF2 mimetic peptide. In some forms, the growth factor from the FGF family contains a polypeptide having an amino acid sequence at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%, or greater identical to the human FGF2 polypeptide sequence (GenBank Accession: NP_001997) .

[0186] In some forms, the HS1-2 medium supplement contains a buffering agent. Preferably, the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.520g to about 0.620g, more preferably about 0.587g. Alternative buffering agents can be used and include but are not limited to HEPES buffer.

[0187] In some forms, the HS1-2 medium supplement contains one or more supplement agents. Preferably, the supplement agent is 1X GlutaMax (i.e., the working concentration of GlutaMax) . In some forms, the supplement agent is L-Glutamine. In some forms, the supplement agent in the HS1-2 medium is 5X GlutaMax or 5 mL 100X GlutaMax.

[0188] An exemplary protocol for defining the endoderm induction includes:

[0189] (i) seeding hPSCs at 100%confluency, or 0.32 × 106 cells / cm2 to 0.74 × 106 cells / cm2, onto the ECM-coated glass surface in commercially available serum-free media for feeder-free culture of hPSCs with a Rho Kinase inhibitor (ROCKi) . In one form, 1: 70 diluted MatrigelTM in cold DMEM / F-12 is used to coat the glass surface. In one form, Y-27632 is used as ROCKi. In one form, the hPSC is H1-hESC. In one form, mTeSR Plus is used to seed the hPSCs. In one form, Essential 8 Medium is used to seed the hPSCs;

[0190] (ii) 24 hours after seeding, hPSCs are exposed to stage 1 day 1 differentiation medium, thereafter referred to as HS1-1 medium, that contains 400 mL MCDB 131 and 100-mL supplement HS1-1S (Table 3) ; and

[0191] (iii) In one form, HS1-1 medium is replaced with stage 1 differentiation medium, thereafter referred to as HS1-2 medium, after culturing the cells for 24 hours. In one form, HS1-2 medium contains 400 mL MCDB 131-and 100-mL supplement HS1-2 (Table 3) . In one form, the medium is refreshed every 24 hours. In one form, the cells are cultured in HS1-2 medium for 3 days. Exemplary recipes for HS1-1 and HS1-2 medium supplements are shown in Table 3 below.

[0192] Table 3: Recipe for HS1-1 medium and HS1-2 medium supplements (hereafter HS1-1S and HS1-2S)

[0193] 2. Stage B –Primitive Gut Tube Induction

[0194] Stage (B) involves culturing the definitive endoderm cells from Stage (A) in suitable conditions to induce their differentiation into primitive gut tube cells. Generally, Stage B includes the following steps:

[0195] (i) removing the HS1-2 medium;

[0196] (ii) without washing, culturing the definitive endoderm cells from Step (iii) of Stage (A) in a basal media containing a third differentiation medium (HS2 medium) for a period of time. The HS2 medium contains basal media and an HS2 Medium supplement. In preferred forms, the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 450 mL, preferably about 400 mL, and wherein the period of time is from about 36 hours to about 56 hours, preferably for about 48 hours; and

[0197] (iii) replacing the HS2 medium every 24 hours.

[0198] The HS2 Medium supplement generally contains basal media containing one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements, and one or more buffering agents; wherein the basal media is a reduced serum supplemented media.

[0199] In some forms, the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL.

[0200] In preferred forms, the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.300g to about 0.500g, preferably about 0.400g. Acceptable alternative carbohydrates to glucose include but are not limited to fructose, maltose, and mannose.

[0201] In some forms, the growth factor is fibroblast growth factor 7 (FGF7) present in an amount ranging from about 20 μg to about 30 μg, preferably about 25 μg. Alternative small molecules to FGF7 that can be used include but are not limited to FGF3, FGF10, FGF22, any mimetic peptide for FGF7 subfamily members (FGF7, FGF3, FGF10 and FGF22) , and any FGFR2b agonist. In some forms, the growth factor from the FGF family contains a polypeptide having an amino acid sequence similarity of at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%, or greater to the human KGF polypeptide sequence (GenBank Accession No. AAB21431) .

[0202] In some forms, the protein is rHSA (recombinant Human Serum Albumin) in an amount ranging from about 0.450g to about 0.550g, preferably about 0.500g. Acceptable alternative proteins to recombinant Human Serum Albumin include but are not limited to Human serum albumin (HSA) , recombinant bovine serum albumin (rBSA) , and recombinant albumin (rAlbumin) .

[0203] In preferred forms, the vitamin is Ascorbic Acid present in the HS2 Medium supplement in an amount ranging from about 17.612 mg to about 26.418 mg, preferably about 22.015 mg. Alternative vitamins that can be used include but are not limited to L-ascorbic acid 2-phosphate (A2-P) .

[0204] In some forms, the supplement agent is about (i.e., the working concentration of GlutaMax) . In some forms, the supplement agent is L-Glutamine. In some forms, the supplement agent in the HS2 Medium is 5X GlutaMax or 5 mL 100X GlutaMax.

[0205] In some forms, the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.520g to about 0.620g, preferably about 0.587g. Alternative buffering agents can be used and include but are not limited to HEPES buffer.

[0206] An exemplary protocol for Stage (B) includes exposing the definitive endoderm cells from Stage (A) to HS2 medium, after removing used HS1-2 medium and without washing. In one form, HS2 medium contains 400 mL MCDB 131-and 100-mL supplement HS2 Medium 100 mL HS2-S5X supplement (Table 4) . In one form, the HS2 medium is refreshed every 24 hours. In one form, the cells are cultured in HS2 medium for 2 days. An exemplary recipe for HS2 Medium Supplement is provided in Table 4 below.

[0207] Table 4. Recipe for HS2 medium supplement (hereafter HS2-S)

[0208] 3. Stage C –PDX1+ Pancreatic Progenitor Induction

[0209] Stage (C) involves culturing the primitive gut tube cells from Stage (B) in suitable conditions to induce their differentiation into PDX1+ pancreatic progenitor cells. Generally, Stage C includes the following steps:

[0210] (i) removing the HS2 medium;

[0211] (ii) without washing, culturing the primitive gut tube cells from Step (iii) of Stage (B) in a basal media comprising a fourth differentiation medium (HS3 medium) for a period of time. The HS3 Medium contains basal media and an HS3 Medium supplement. In preferred forms, the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 450 mL, preferably about 400 mL. In some forms, the period of time for incubation is from about 36 hours to about 56 hours, preferably for about 48 hours; and

[0212] (iii) replacing the HS3 medium every 24 hours.

[0213] Generally, the HS3 Medium Supplement contains basal media containing one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements, and one or more buffering agents; wherein the basal media is a reduced serum supplemented media.

[0214] In some forms, the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL.

[0215] In preferred forms, the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.200 g to about 0.250 g, preferably about 0.220 g. Acceptable alternative carbohydrates to glucose include but are not limited to fructose, maltose, and mannose.

[0216] In some forms, the growth factor is selected from the group containing an FGF agonist, a bone morphogenic protein inhibitor (BMP) , and a hedgehog inhibitor.

[0217] In preferred forms, the FGF agonist is FGF7. In some forms, the FGF7 is present in an amount ranging from about 20 μg to about 30 μg, preferably about 25 μg. Alternative small molecules to FGF7 that can be used include but are not limited to FGF3, FGF10, FGF22, any mimetic peptide for FGF7 subfamily members (FGF7, FGF3, FGF10 and FGF22) , and any FGFR2b agonist. In some forms, the growth factor from the FGF family contains a polypeptide having an amino acid sequence similarity of at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%, or greater to the human KGF polypeptide sequence (GenBank Accession No. AAB21431) .

[0218] In preferred forms, the BMP inhibitor is LDN193189 present in an amount ranging from about 31 μg to about 41 μg, preferably from about 32.518 μg to about 48.778 μg, more preferably about 40.648 μg. LDN193189 is a BMP signaling pathway inhibitor. Acceptable alternative BMP inhibitors that can be used include but are not limited to analogs or derivatives of LDN193189 e.g., LDN193189 2HCl, K02288, LDN214117, ML347, LDN212854, DMH1, noggin, and dorsomorphin.

[0219] In preferred forms, the Hedgehog inhibitor is SANT-1 present in an amount ranging from about 36 μg to about 58 μg, preferably about 37.348 μg to about 56.024 μg, preferably about 46.686 μg. SANT-1 is a hedgehog signaling inhibitor. Acceptable alternative Hedgehog inhibitors that can be used include but are not limited to SANT-2, SANT-3, SANT-4, Forskolin, Vismodegib, Tomatidine, AY9944, Triparanol, Ciliobrevin D, Hedgehog IN-2 (Compound 20) , Hedgehog IN-3 (compound 3) , Hedgehog IN-5, Ciliobrevin A, JK184, RU-SKI 43, RU-SKI 43 hydrochloride, Jervine (11-Ketocyclopamine) , CUR61414, MK-4101, 3-epi-Vitamin D3 (Epicholecalciferol) (Compound 4) , SMO-IN-3 (compound 12a) , TAK-441, SMO-IN-2 (compound 1) , Physalin H, Robotnikinin, SMANT hydrochloride, TPB15, and steroidal alkaloids that antagonizes hedgehog signaling e.g., cyclopamine or a derivative thereof such as KAAD-Cyclopamine.

[0220] In some forms, the protein is recombinant Human Serum Albumin (rHSA) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.0 g. Acceptable alternative proteins to recombinant Human Serum Albumin include but are not limited to Human serum albumin (HSA) , recombinant bovine serum albumin (rBSA) , and recombinant albumin (rAlbumin) .

[0221] In some forms, the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.850 g to about 0.920 g, preferably about 0.877 g. Alternative buffering agents can be used and include but are not limited to HEPES buffer.

[0222] In some forms, the vitamin is Ascorbic Acid present in an amount ranging from about 17 mg to about 28 mg, preferably about 17.612 mg to about 26.418 mg, more preferably about 22.015 mg. Alternative vitamins that can be used include but are not limited to L-ascorbic acid 2-phosphate (A2-P) .

[0223] In some forms, the one or more supplementing agents are selected from the group comprising ITS-X 100X, GlutaMax 100X, and retinoic acid, wherein the ITS-X and GlutaMax are each present in the HS3 medium supplement at about 2.5X or 2.5%, and wherein the retinoic acid is present in an amount ranging from about 238 μg to about 362 μg, preferably from about 240.32 μg to about 360.48 μg, more preferably about 300.40 μg.In some forms, the supplement agent is L-Glutamine. In some forms, the supplement agent in the HS3 Medium is 5X GlutaMax or 5 mL 100X GlutaMax.

[0224] The HS3 Medium Supplement also contains a retinoic acid receptor agonist. In some forms, the retinoic acid receptor agonist is present in the HS3 medium supplement in an amount ranging from about 1.50 μM to about 3.0 μM, preferably about 2.0 μM. In preferred forms, the retinoic acid receptor agonist is Retinoic acid. Alternative retinoic acid receptor agonists that can be used include but are not limited to CD1530, AM580, TTNPB, CD437, Ch55, BMS961, AC261066, AC55649, AM80, BMS753, tazarotene, adapalene, and CD2314.

[0225] The HS3 Medium Supplement typically contains a PKC activator to induce cellular reprogramming and differentiation. In preferred forms, the PKC activator is (2E, 4E) -N- [ (2S, 5S) -1, 2, 3, 4, 5, 6-Hexahydro-5- (hydroxymethyl) -1-methyl-2- (1-methylethyl) -3-oxo-1, 4-benzodiazocin-8-yl] -5- [4- (trifluoromethyl) phenyl] -2, 4-pentadienamide (TPPB) . In some forms TPPB is present in the HS3 Medium supplement in an amount of about 40.123 μg to about 60.184 μg, preferably about 50.154 μg. In some forms, the PKC activator is present in the HS3 medium supplement in an amount ranging from about 0.10 μM to about 1.50 μM, preferably about 1.0 μM. Alternative PKC activators that can be used include but are not limited to Phorbol 12, 13-dibutyrate (PdbU) , cyclopropanated polyunsaturated fatty acids, cyclopropanated monounsaturated fatty acids, cyclopropanated polyunsaturated fatty alcohols, cyclopropanated monounsaturated fatty alcohols, cyclopropanated polyunsaturated fatty acid esters, cyclopropanated monounsaturated fatty acid esters, cyclopropanated polyunsaturated fatty acid sulfates, cyclopropanated monounsaturated fatty acid sulfates, cyclopropanated polyunsaturated fatty acid phosphates, cyclopropanated monounsaturated fatty acid phosphates, macrocyclic lactones, DAG derivatives, isoprenoids, octylindolactam V, gnidimacrin, iripallidal, ingenol, napthalenesulfonamides, diacylglycerol kinase inhibitors, fibroblast growth factor 18 (FGF18) , bryostatin-1, bryostatin-2, bryostatin-3, bryostatin-4, bryostatin-5, bryostatin-6, bryostatin-7, bryostatin-8, bryostatin-9, bryostatin-10, bryostatin-I1, bryostatin-12, bryostatin-13, bryostatin-14, bryostatin-15, bryostatin-16, bryostatin-17, and bryostatin-18.

[0226] An exemplary protocol for generating PDX1+ pancreatic progenitor cells include exposing primitive gut tube cells from Stage (B) to stage C differentiation medium, hereafter referred to as HS3 medium, after removing used HS2 medium and without washing. In one form, HS3 medium comprises 400 mL MCDB 131-and 100-mL supplement HS3-S (Table 5) . In one form, the medium is refreshed every 24 hours. In one form, the cells are cultured in HS3 medium for 2 days. An exemplary recipe for HS3-SMedium is provided in Table 5 below.

[0227] Table 5. Recipe for HS3 medium supplement (hereafter HS3-SMedium)

[0228] 4. Stage D –PDX1+ / NK6-1+ Pancreatic Progenitor Induction

[0229] Stage (D) involves culturing the PDX1+ pancreatic progenitor cells from Stage (C) in suitable conditions to induce their differentiation into PDX1+ / NKX6-1+pancreatic progenitor cells. Generally, Stage D includes the following steps:

[0230] (i) removing the HS3 medium;

[0231] (ii) without washing, culturing the PDX1+ from Step (iii) of Stage (C) in a basal media comprising a fifth differentiation medium (HS4 medium) for a period of time. The HS4 medium contains basal media and an HS4 Medium supplement. In preferred forms, the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 450 mL, preferably about 400 mL. In some forms, the period of time for incubation is from about 84 hours to about 106 hours, preferably for about 96 hours; and

[0232] (iii) wherein the HS4 medium is replaced every 24 hours.

[0233] The HS4 medium supplement (hereinafter referred to as HS4-S) includes basal media containing one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements or supplementing agents, and one or more buffering agents; wherein the basal media is a reduced serum supplemented media.

[0234] In some forms, the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL.

[0235] In preferred forms, the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.200 g to about 0.250 g, preferably about 0.220 g. Acceptable alternative carbohydrates to glucose include but are not limited to fructose, maltose, and mannose.

[0236] In some forms, the growth factor is selected from the group containing a FGF agonist, a bone morphogenic protein inhibitor (BMP) , and a hedgehog inhibitor.

[0237] In preferred forms, the FGF agonist is FGF7. In some forms, the FGF7 is present in an amount ranging from about 20 μg to about 30 μg, preferably about 25 μg. Alternative small molecules to FGF7 that can be used include but are not limited to FGF3, FGF10, FGF22, any mimetic peptide for FGF7 subfamily members (FGF7, FGF3, FGF10 and FGF22) , and any FGFR2b agonist. In some forms, the growth factor from the FGF family contains a polypeptide having an amino acid sequence similarity of at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%, or greater to the human KGF polypeptide sequence (GenBank Accession No. AAB21431) .

[0238] In preferred forms, the BMP inhibitor is LDN193189 present in an amount ranging from about 30 μg to about 42 μg, preferably about 32.518 μg to about 48.778 μg, more preferably about 40.648 μg. LDN193189 is a BMP signaling pathway inhibitor. Acceptable alternative BMP inhibitors that can be used include but are not limited to analogs or derivatives of LDN193189 e.g., LDN193189 2HCl, K02288, LDN214117, ML347, LDN212854, DMH1, noggin, and dorsomorphin.

[0239] In preferred forms, the Hedgehog inhibitor is SANT-1 present in an amount ranging from about 35 μg to about 48 μg, such as from about 37.348 μg to about 56.024 μg, preferably about 46.686 μg. SANT-1 is a hedgehog signaling inhibitor. Acceptable alternative Hedgehog inhibitors that can be used include but are not limited to SANT-2, SANT-3, SANT-4, Forskolin, Vismodegib, Tomatidine, AY9944, Triparanol, Ciliobrevin D, Hedgehog IN-2 (Compound 20) , Hedgehog IN-3 (compound 3) , Hedgehog IN-5, Ciliobrevin A, JK184, RU-SKI 43, RU-SKI 43 hydrochloride, Jervine (11-Ketocyclopamine) , CUR61414, MK-4101, 3-epi-Vitamin D3 (Epicholecalciferol) (Compound 4) , SMO-IN-3 (compound 12a) , TAK-441, SMO-IN-2 (compound 1) , Physalin H, Robotnikinin, SMANT hydrochloride, TPB15, and steroidal alkaloids that antagonizes hedgehog signaling e.g., cyclopamine or a derivative thereof such as KAAD-Cyclopamine.

[0240] In some forms, the vitamin is Ascorbic Acid present in an amount ranging from about 15 mg to about 25 mg, such as from about 17.612 mg to about 26.418 mg, preferably about 22.015 mg. Alternative vitamins that can be used include but are not limited to L-ascorbic acid 2-phosphate (A2-P) .

[0241] In some forms, the protein is rHSA (recombinant Human Serum Albumin) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.0 g. Acceptable alternative proteins to recombinant Human Serum Albumin include but are not limited to Human serum albumin (HSA) , recombinant bovine serum albumin (rBSA) , and recombinant albumin (rAlbumin) .

[0242] In some forms, the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.850 g to about 0.920 g, preferably about 0.877 g. Alternative buffering agents can be used and include but are not limited to HEPES buffer.

[0243] In some forms, the one or more supplementing agents are selected from the group containing ITS-X 100X, GlutaMax 100X, and retinoic acid, wherein the ITS-X and GlutaMax are each present in the HS4 medium at about 2.5X or 2.5%, and wherein the retinoic acid is present in an amount ranging from about 10 μg to about 18 μg, such as from about 12.016 μg to about 18.024 μg, preferably about 15.020 μg. In some forms, the supplement agent is L-Glutamine. In some forms, the supplement agent in the HS4 Medium is 5X GlutaMax or 5 mL 100X GlutaMax.

[0244] The HS4 Medium Supplement also contains a retinoic acid receptor agonist. In some forms, the retinoic acid receptor agonist is present in the HS4 medium supplement in an amount ranging from about 0.05 μM to about 0.3 μM, preferably about 0.1 μM. In preferred forms, the retinoic acid receptor agonist is Retinoic acid. Alternative retinoic acid receptor agonists that can be used include but are not limited to CD1530, AM580, TTNPB, CD437, Ch55, BMS961, AC261066, AC55649, AM80, BMS753, tazarotene, adapalene, and CD2314.

[0245] The HS4 Medium supplement typically contains a PKC activator to induce cellular reprogramming and differentiation. In preferred forms, the PKC activator is (2E, 4E) -N- [ (2S, 5S) -1, 2, 3, 4, 5, 6-Hexahydro-5- (hydroxymethyl) -1-methyl-2- (1-methylethyl) -3-oxo-1, 4-benzodiazocin-8-yl] -5- [4- (trifluoromethyl) phenyl] -2, 4-pentadienamide (TPPB) . In some forms, TPPB is present in the HS4 Medium supplement in an amount ranging from about 38 μg to about 52 μg, such as from about 40.123 μg to about 60.184 μg, preferably about 50.154 μg. In some forms, the PKC activator is present in the HS4 medium supplement in an amount ranging from about 0.10 μM to about 1.50 μM, preferably about 1.00 μM. Alternative PKC activators that can be used include but are not limited to Phorbol 12, 13-dibutyrate (PdbU) , cyclopropanated polyunsaturated fatty acids, cyclopropanated monounsaturated fatty acids, cyclopropanated polyunsaturated fatty alcohols, cyclopropanated monounsaturated fatty alcohols, cyclopropanated polyunsaturated fatty acid esters, cyclopropanated monounsaturated fatty acid esters, cyclopropanated polyunsaturated fatty acid sulfates, cyclopropanated monounsaturated fatty acid sulfates, cyclopropanated polyunsaturated fatty acid phosphates, cyclopropanated monounsaturated fatty acid phosphates, macrocyclic lactones, DAG derivatives, isoprenoids, octylindolactam V, gnidimacrin, iripallidal, ingenol, napthalenesulfonamides, diacylglycerol kinase inhibitors, fibroblast growth factor 18 (FGF18) , bryostatin-1, bryostatin-2, bryostatin-3, bryostatin-4, bryostatin-5, bryostatin-6, bryostatin-7, bryostatin-8, bryostatin-9, bryostatin-10, bryostatin-I1, bryostatin-12, bryostatin-13, bryostatin-14, bryostatin-15, bryostatin-16, bryostatin-17, and bryostatin-18.

[0246] An exemplary protocol for generating PDX1+ / NK6-1+ pancreatic progenitor cells include exposing PDX1+ pancreatic progenitors from Stage C to stage D differentiation medium, hereafter referred to as HS4 medium, after removing used HS3 medium and without washing. In one form, HS4 medium comprises 400 mL MCDB 131-and 100-mL supplement HS4-S (Table 6) . In one form, the medium is refreshed every 24 hours. In one form, the cells are cultured in HS4 medium for 4 days. An exemplary recipe for HS4 Medium is provided in Table 6 below.

[0247] Table 6. Recipe for HS4 medium supplement (hereafter HS4-SMedium)

[0248] 5. Stage E –Pancreatic Endocrine Fate Specification

[0249] Stage (E) involves culturing the PDX1+ / NKX6-1+ pancreatic progenitor cells from Stage (D) in suitable conditions to induce their differentiation into pancreatic endocrine cell aggregates. Generally, Stage (D) includes the following steps:

[0250] (i) removing the HS4 medium;

[0251] (ii) without washing, culturing the PDX1+ / NKX6-1+ cells from Step (iii) of Stage (D) in a basal media comprising a sixth differentiation medium (HS5-1 medium) for a period of time. The HS5-1 medium contains basal media and an HS5-1 medium supplement. In preferred forms, the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 450 mL, preferably about 400 mL. In some forms, the period of time for incubation is from about 20 hours to about 30 hours, preferably for about 24 hours;

[0252] (iii) culturing the PDX1+ / NKX6-1+ cells from Step (ii) of Stage (E) in a basal medium comprising a seventh differentiation medium (HS5-2 medium) to promote spontaneous formation and detachment of cell aggregates for a period of time. The HS5-2 medium contains basal media and an HS5-2 medium supplement. In preferred forms, the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 450 mL, preferably about 400 mL. In some forms, the period of time for incubation is from about 5 days to about 7 days, preferably for about 6 days, and wherein the basal media comprising the HS5-2 medium is replaced every 24 hours;

[0253] (iv) removing the detached cell aggregates from Step (iii) ; and

[0254] (v) incubating the detached cell aggregates from Step (iv) under conditions to prevent the cell aggregates from fusing to form a large cell mass.

[0255] In some forms, the "cell aggregates" detach from the culture surface, forming what is referred to as the "islet organoids. " Once detached in step (iv) , these islet organoids are subsequently relocated to a 6-well ultra-low attachment plate and cultured on an orbital shaker at approximately 100 rpm within a cell culture incubator.

[0256] HS5-1 medium supplement (HS5-1S) generally contains basal media containing one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more trace elements, one or more supplements, one or more antibiotics, and one or more buffering agents.

[0257] In some forms, the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL.

[0258] In preferred forms, the carbohydrate is glucose in an amount from about 1.5 g to about 2.1 g, preferably about 1.8 g. Acceptable alternative carbohydrates to glucose include but are not limited to fructose, maltose, and mannose.

[0259] In some forms, the small molecule is selected from the group containing a y-secretase inhibitor and an ALK (anaplastic lymphoma kinase) inhibitor or TGF-β-RI / ALK5 inhibitor.

[0260] In preferred forms, the TGF-β-RI / ALK5 inhibitor is Alk5i II (RepSox) present in an amount ranging from about 0.5 mg to about 2.5 mg, such as from about 0.718 mg to about 2.156 mg, preferably about 1.437 mg. Alternative TGF-β-RI / ALK5 inhibitors that can be used include but are not limited to SB-431542, A83-01, A83-01 sodium, GW788388, D4476, LY-364947, LY-580276, SB525334, SB505124, SD-208, GW6604, Vactosertib (EW-7197) , Vactosertib Hydrochloride (EW-7197 Hydrochloride) , IN-1130, R-268712, Itacnosertib (TP-0184) , EW-7195, AZ12799734, ALK5-IN-34, ALK5-IN-33 (Compound EX-10) , ALK5-IN-25 (compound EX-02) , ALK5-IN-27 (Compound EX-04) , ALK5-IN-28 (compound Ex-05) , and J-1063.

[0261] In preferred forms, the γ-secretase inhibitor is XXI (Compound E) present in an amount ranging from about 120 μg to about 250 μg, such as from about 122.625 μg to about 367.875 μg, preferably about 245.250 μg. Acceptable γ-secretase inhibitors that can be used include but are not limited to DAPT, LY-411575, YO-01027, RO4929097 (RG-4733) , LY900009, Nirogacestat (PF-3084014) , Crenigacestat (LY3039478) , Semagacestat, L-685458, MK-0752, BMS-906024, Sulindac sulfide, Avagacestat (BMS-708163) , BMS 299897, SPL-707, MRK-560, Z-Ile-Leu-aldehyde (Z-IL-CHO) , ELN318463, Nirogacestat dihydrobromide (PF-3084014 dihydrobromide) , 3, 5-Bis (4-nitrophenoxy) benzoic acid, BT-GSI, Z-LLNle-CHO (Z-Leu-Leu-Nle-CHO) , and BMS 433796.

[0262] In some forms, the protein is recombinant Human Serum Albumin (rHSA) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.0 g. Acceptable alternative proteins to recombinant Human Serum Albumin include but are not limited to Human serum albumin (HSA) , recombinant bovine serum albumin (rBSA) , and recombinant albumin (rAlbumin) .

[0263] In some forms, the hormone is a thyroid hormone receptor agonist. In preferred forms, the thyroid hormone receptor agonist is triiodothyronine (T3) in an amount ranging from about 160 μg to about 350μg, such as from about 168.240 μg to about 504.720 μg, preferably about 336.480 μg. Alternative thyroid hormone receptor agonists that can be used include but are not limited to analogs or derivatives of T3. Exemplary analogs of T3 include but are not limited to selective and non-selective thyromimetics; TRβ selective agonist GC-1; GC-24; 4-Hydroxy-PCB106; MB07811; MB07344; 3, 5-diiodothyropropionic acid (DITPA) ; 3-lodothyronamine (T (1) AM) ; 3, 5, 3'-Triiodothyroacetic Acid (Triac) ; bioactive metabolites of the hormone thyroxine (T4) such as KB-2115, KB-141, thyronamines, SKF L-94901, DIBIT, 3'-AC-T2; tetraiodothyroacetic acid (Tetrac) and triiodothyroacetic acid (Triac) (via oxidative deamination and decarboxylation of thyroxine [T4] and triiodothyronine [T3] alanine chain) , 3, 3', 5'-triiodothyronine (rT3) (via T4 and T3 deiodination) , 3, 3'-diiodothyronine (3, 3'-T2) and 3, 5-diiodothyronine (T2) (via T4, T3, and rT3 deiodination) , and 3-iodothyronamine (TiAM) and thyronamine (TOAM) (via T4 and T3 deiodination and amino acid decarboxylation) , as well as for TH structural analogs, such as 3, 5, 3'-triiodothyropropionic acid (Triprop) , 3, 5-dibromo-3-pyridazinone-1-thyronine (L-940901) , N- [3, 5-dimethyl-4- (4'-hydroxy-3'-isopropylphenoxy) -phenyl] -oxamic acid (CGS-23425) , 3, 5-dimethyl-4- [ (4'-hydroxy-3-isopropylbenzyl) -phenoxy] acetic acid (GC-1) , 3, 5-dichloro-4- [ (4-hydroxy-3-isopropylphenoxy) phenyl] acetic acid (KB-141) , and 3, 5-diiodothyropropionic acid (DITPA) .

[0264] In some forms, the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.850 g to about 0.920 g, preferably about 0.877 g. Alternative buffering agents can be used and include but are not limited to HEPES buffer.

[0265] In some forms, the cytoskeleton modulator (also referred to as “actin depolymerizer” ) is Latrunculin A (LatA) (237.2 μM stock solution) present in an amount ranging from about 1.05 mL to about 3.15 mL, preferably about 2.10 mL. Latrunculin A is usually available in liquid form: 237.2 μM in ethanol. In other forms, if concentration is used for this chemical in preparing the 5x supplement, the actin depolymerizer is Latrunculin A (LatA) present in an amount ranging from about 2.5 μM to about 7.5 μM, preferably about 5.0 μM. Exemplary alternative actin depolymerizers that can be used include but are not limited to Latrunculin B (LatB) .

[0266] In some forms, the vitamin is Ascorbic Acid present in an amount from about 200 μM to about 300 μM, preferably about 250 μM. Alternative vitamins that can be used include but are not limited to L-ascorbic acid 2-phosphate (A2-P) .

[0267] In preferred forms, the antibiotic is Penicillin / Streptomycin 100X present at about 5X or 5%. Alternative antibiotics that can be used include but are not limited to Antimycotic (100X) .

[0268] In some forms, the one or more supplements are selected from the group comprising ITS-X 100X, GlutaMax 100X, retinoic acid, and heparin, wherein the ITS-X and GlutaMax are each present in the HS5-1 medium supplement at about 1X or 1%, wherein the retinoic acid is present in an amount ranging from about 10 μg to about 20 μg, such as from about 12.016 μg to about 18.024 μg, preferably about 15.020 μg, and wherein the heparin is present in an amount ranging from 2.5 mg to about 7.5 mg, preferably about 5.0 mg.

[0269] HS5-2 medium supplement contains the same ingredients as HS5-1 medium supplement, with the exception that HS5-2 medium does not contain Latrunculin A. In some forms, the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL.

[0270] In preferred forms, the carbohydrate is glucose in an amount from about 1.5 g to about 2.1 g, preferably about 1.8 g. Acceptable alternative carbohydrates to glucose include but are not limited to fructose, maltose, and mannose.

[0271] In some forms, the growth factor is selected from the group containing a γ-secretase inhibitor and an ALK (anaplastic lymphoma kinase) inhibitor. Exemplary TGF-β-RI / ALK5 inhibitors that can be used include but are not limited to SB-431542, A83-01, A83-01 sodium, GW788388, D4476, LY-364947, LY-580276, SB525334, SB505124, SD-208, GW6604, Vactosertib (EW-7197) , Vactosertib Hydrochloride (EW-7197 Hydrochloride) , IN-1130, R-268712, Itacnosertib (TP-0184) , EW-7195, AZ12799734, ALK5-IN-34, ALK5-IN-33 (Compound EX-10) , ALK5-IN-25 (compound EX-02) , ALK5-IN-27 (Compound EX-04) , ALK5-IN-28 (compound Ex-05) , and J-1063. Exemplary γ-secretase inhibitors that can be used include but are not limited to DAPT, LY-411575, YO-01027, RO4929097 (RG-4733) , LY900009, Nirogacestat (PF-3084014) , Crenigacestat (LY3039478) , Semagacestat, L-685458, MK-0752, BMS-906024, Sulindac sulfide, Avagacestat (BMS-708163) , BMS 299897, SPL-707, MRK-560, Z-Ile-Leu-aldehyde (Z-IL-CHO) , ELN318463, Nirogacestat dihydrobromide (PF-3084014 dihydrobromide) , 3, 5-Bis (4-nitrophenoxy) benzoic acid, BT-GSI, Z-LLNle-CHO (Z-Leu-Leu-Nle-CHO) , and BMS 433796.

[0272] In preferred forms, the ALK inhibitor is Alk5i II (RepSox) present in an amount ranging from about 0.5 mg to about 2.0 mg, such as from about 0.718 mg to about 2.156 mg, preferably about 1.437 mg. In preferred forms, the γ-secretase inhibitor is XXI (Compound E) present in an amount ranging from about 125 μg to about 370 μg, such as from about 122.625 μg to about 367.875 μg, preferably about 245.250 μg.

[0273] In some forms, the protein is recombinant Human Serum Albumin (rHSA) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.0 g. Acceptable alternative proteins to recombinant Human Serum Albumin include but are not limited to Human serum albumin (HSA) , recombinant bovine serum albumin (rBSA) , and recombinant albumin (rAlbumin) .

[0274] In some forms, the hormone is a thyroid hormone receptor agonist. In preferred forms, the thyroid hormone receptor agonists is triiodothyronine (T3) in an amount ranging from about 160 μg to about 340 μg, such as from about 168.240 μg to about 504.720 μg, preferably about 336.480 μg. Alternative thyroid hormone receptor agonists that can be used include but are not limited to analogs or derivatives of T3. Exemplary analogs of T3 include but are not limited to selective and non-selective thyromimetics; TRβ selective agonist GC-1; GC-24; 4-Hydroxy-PCB106; MB07811; MB07344; 3, 5-diiodothyropropionic acid (DITPA) ; 3-lodothyronamine (T (1) AM) ; 3, 5, 3'-Triiodothyroacetic Acid (Triac) ; bioactive metabolites of the hormone thyroxine (T4) such as KB-2115, KB-141, thyronamines, SKF L-94901, DIBIT, 3'-AC-T2; tetraiodothyroacetic acid (Tetrac) and triiodothyroacetic acid (Triac) (via oxidative deamination and decarboxylation of thyroxine [T4] and triiodothyronine [T3] alanine chain) , 3, 3', 5'-triiodothyronine (rT3) (via T4 and T3 deiodination) , 3, 3'-diiodothyronine (3, 3'-T2) and 3, 5-diiodothyronine (T2) (via T4, T3, and rT3 deiodination) , and 3-iodothyronamine (TiAM) and thyronamine (TOAM) (via T4 and T3 deiodination and amino acid decarboxylation) , as well as for TH structural analogs, such as 3, 5, 3'-triiodothyropropionic acid (Triprop) , 3, 5-dibromo-3-pyridazinone-1-thyronine (L-940901) , N- [3, 5-dimethyl-4- (4'-hydroxy-3'-isopropylphenoxy) -phenyl] -oxamic acid (CGS-23425) , 3, 5-dimethyl-4- [ (4'-hydroxy-3-isopropylbenzyl) -phenoxy] acetic acid (GC-1) , 3, 5-dichloro-4- [ (4-hydroxy-3-isopropylphenoxy) phenyl] acetic acid (KB-141) , and 3, 5-diiodothyropropionic acid (DITPA) .

[0275] In some forms, the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.850 g to about 0.920 g, preferably about 0.877 g. Alternative buffering agents can be used and include but are not limited to HEPES buffer.

[0276] In some forms, the vitamin is Ascorbic Acid present in an amount from about 15 mg to about 25 mg, such as from about 17.612 mg to about 26.418 mg, preferable about 22.015 mg. Alternative vitamins that can be used include but are not limited to L-ascorbic acid 2-phosphate (A2-P) .

[0277] In preferred forms, the antibiotic is Penicillin / Streptomycin 100X present at about 5X or 5%. Alternative antibiotics that can be used include but are not limited to Antimycotic (100X) .

[0278] In some forms, the one or more supplements are selected from the group comprising ITS-X 100X, GlutaMax 100X, retinoic acid, and heparin, wherein the ITS-X and GlutaMax are each present in the HS5-2 medium supplement at about 2.5X or 2.5%, and GlutaMax is present in the HS5-2 medium supplement at about 5X or 5%. The retinoic acid is present in an amount ranging from about 10 μg to about 20 μg, such as from about 12.016 μg to about 18.024 μg, preferably about 15.020 μg, and wherein the heparin is present in an amount ranging from 2.5 mg to about 7.5 mg, preferably about 5.0 mg.

[0279] In some forms, the detached cell aggregates in Step (iv) includes transferring the detached cell aggregates to a solid substrate. In some forms, the solid substrate is a flat bottom ultra-low attachment plate. In some forms, the conditions to prevent the cell aggregates from fusing to form a large cell mass comprise incubating the detached cell aggregates in a cell culture incubator on an orbital shaker. In some forms, the "cell aggregates" detach from the culture surface, forming what is referred to as the "islet organoids. " Once detached in step (iv) , these islet organoids are subsequently relocated to a 6-well ultra-low attachment plate and cultured on an orbital shaker at approximately 100 rpm in a cell culture incubator at about 37 ℃.

[0280] An exemplary protocol for generating pancreatic endocrine cells include exposing PDX1+ / NKX6-1+ pancreatic progenitors from Stage D to the HS5-1 medium, after removing used HS4 medium and without washing. In one form, HS5-1 medium comprises 400 mL MCDB 131-and 100-mL supplement HS5-1S 5X supplement (Table 7) . In one form, HS5-1 medium is changed to HS5-2 medium, after culturing the cells for 24 hours. In one form, HS5-2 medium comprises 400 mL MCDB 131-and 100-mL supplement HS5-2S 5X supplement (Table 7) . In one form, the medium is refreshed every 24 hours. In one form, the cells are cultured in HS5-2 medium for 6 days. In one form, cell aggregates are formed spontaneously and detached from the culture surface on any day from day 3 of Stage E. In one form, cell aggregates detached from the culture surface on day 3 of Stage E. In one from, the detached cell aggregates are transferred to a 6-well flat bottom ultra-low attachment plate. In one form, the 6-well flat bottom ultra-low attachment plate containing detached cell aggregates is placed on an orbital shaker with 100 rpm in a cell culture incubator at 37 ℃. Exemplary recipes for HS5-1 and HS5-2 Medium Supplements are provided in Table 7 below.

[0281] Table 7. Recipe for HS5-1 medium and HS5-2 medium supplement (hereafter HS5-1 Medium and HS5-2 Medium)

[0282] 6. Stage F –Stem-cell Derived Islet Maturation

[0283] Stage (F) involves culturing the pancreatic endocrine cell aggregates from Stage (D) under conditions conducive for pancreatic islet cell development, thereby generating pancreatic islet-like organoids. Generally Stage (F) includes the following steps:

[0284] (i) removing the HS5-2 medium;

[0285] (ii) without washing, culturing the pancreatic endocrine cell aggregates from Step (v) of Stage (E) in a basal media comprising an eighth differentiation medium (HS6 medium) for a period of time. The HS6 medium contains a basal media and HS6 medium supplement. In preferred forms, the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 450 mL, preferably about 400 mL. In some forms, the period of time for incubation is from about 7 days to about 16 days, preferably for about 14 days, and wherein the basal media comprising the HS6 medium is replaced every 48 hours; and

[0286] (iii) extracting the stem-cell derived pancreatic islet cells from Step (ii) .

[0287] Generally, the islet organoids should be kept in HS6 medium for at least 7 days (1 week) to promote maturation of the islet organoids. In some forms, the islet organoids can be maintained in HS6 medium for up to one year with the HS6 medium being changed every 48 hours or less. In some forms, the islet organoids can be maintained in HS6 medium for about 2 months, about 3 months, about 6 months, about 9 months, about 10 months, about 11 months, or about 12 months.

[0288] HS6 medium supplement (HS6-S) generally contains basal media comprising one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more trace elements, one or more supplements, one or more antibiotics, and one or more buffering agents.

[0289] In some forms, the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL.

[0290] In preferred forms, the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.15 g to about 0.30 g, preferably about 0.23 g. Acceptable alternative carbohydrates to glucose include but are not limited to fructose, maltose, and mannose.

[0291] In some forms, the protein is rHSA (recombinant Human Serum Albumin) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.5 g. Acceptable alternative proteins to recombinant Human Serum Albumin include but are not limited to Human serum albumin (HSA) , recombinant bovine serum albumin (rBSA) , and recombinant albumin (rAlbumin) .

[0292] In preferred forms, the antibiotic is Penicillin / Streptomycin 100X is present in an amount ranging from about 4.0 mL to about 6.0 mL, preferably about 5.2 mL. Alternative antibiotics that can be used include but are not limited to Antimycotic (100X) .

[0293] In preferred forms, the trace elements are selected from the group containing Trace Element A (1000X) , Trace Element B (1000X) , and ZnSO4.7H2O (1 mM) . In some forms, the Trace Element A (1000X) , Trace Element B (1000X) , and ZnSO4.7H2O (1 mM) are each present in the HS6 medium supplement in an amount ranging from 480 μL to about 550 μL preferably about 523 μL. Alternative trace elements for Trace Element A (1000X) include aqueous solutions containing a salt e.g., CuSO4 ·5H2O (1.6 mg / L) , ZnSO4·7H2O (863 mg / L) , Selenite·2Na (17.3 mg / L) , and Ferric citrate (1155.1 mg / L) . Alternative trace elements for Trace Element B (1000X) include aqueous solutions containing a salt e.g., MnSO4·H2O (0.17 mg / L) , Na2SiO3·9H2O (140 mg / L) , Molydbic acid, ammonium salt (1.24 mg / L) , NH4VO3 (0.65 mg / L) , NiSO4·6H2O (0.13 mg / L) , and SnCl2 (anhydrous) (0.12 mg / L) . An exemplary alternative trace element for ZnSO4.7H2O is ZnCl2.

[0294] In some forms, the one or more supplements are selected from the group containing GlutaMax (100X) , MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) , and heparin, wherein the supplement is GlutaMax (100X) present in an amount ranging from about 4.0 mL to about 6.0 mL, preferably about 5.2 mL, and wherein the heparin is present in an amount ranging from 1.5 mg to about 20 mg, such as from about 2.615 mg to about 15.690 mg, preferably about 5.230 mg. Exemplary alternative supplementing agents for GlutaMax (100X) include but are not limited to L-glutamine. Exemplary alternative supplementing agents for Heparin include but are not limited to Heparin sodium salt and Heparin Lithium salt. In some forms, the supplement is MEM Non-Essential Amino Acids Solution (MEM NEAA 100X) , present in an amount ranging from about 4.0 mL to about 6.0 mL, preferably about 5.2 mL.

[0295] In some forms, extracting the stem-cell derived pancreatic islet cells includes transferring the detached stem-cell derived pancreatic islet cells to a solid substrate. In some forms, the solid substrate is a flat bottom ultra-low attachment plate.

[0296] In some forms, the conditions to promote maturation of stem-cell derived pancreatic islet cells comprise incubating the detached the cell aggregates (i.e., the islet organoids) on an orbital shaker in a cell culture incubator.

[0297] An exemplary protocol for maturation of the pancreatic islet cells includes exposing pancreatic endocrine cell aggregates from stage E to stage F differentiation medium, hereafter referred to as HS6 medium, after removing used HS5-2 medium and without washing. In one form, HS6 medium comprises 400 mL MCDB 131-and 100-mL supplement HS6-S5X supplement (Table 8) . In one form, the medium is refreshed every 48 hours. In one form, the cells are cultured in HS6 medium for 14 days. In one form, the 6-well flat bottom ultra-low attachment plate containing stem cell-derived islets is placed on an orbital shaker with 100 rpm in a cell culture incubator. An exemplary recipe for HS6 Medium is provided in Table 8 below.

[0298] Table 8. Recipe for HS6 medium supplement (hereafter HS6-SMedium)

[0299] IV. METHODS OF USING PANCREATIC ISLET ORGANOIDS

[0300] Methods of using the in vitro generated organoids and compositions thereof are disclosed. The in vitro generated organoids are particularly suited for research purposes, providing optimized cell models for the study of pancreatic islet biology, endocrine biology and metabolic disease pathology. The in vitro generated organoids are also particularly suitable for biomarker identification, and evaluation of new molecules and existing therapies for treating metabolic and / or endocrine diseases.

[0301] A. Providing Cell Models for Studying Biology and Disease Pathology

[0302] The pancreatic islet organoids can be used to study endocrine biology in a physiologically relevant manner; thus, enabling improved understanding of the mechanisms underlying function of the pancreatic islet tissue and the impact of disrupted endocrine signaling and metabolic diseases. In some forms, the pancreatic islet organoids can be used to study the morphological features, cellular interactions, molecular kinetics, and tissue architecture specific to the human pancreatic islets. In some forms, the pancreatic islet organoids can be used to study the regulation of the development and maturation process of human islet. In some forms, the pancreatic islet organoids can be used to explore the endocrine signaling and glucose sensing functions of the pancreatic islet cells.

[0303] In some forms, the pancreatic islet organoids can be used to investigate the mechanisms underlying pancreatitis, and for drug screening and drug therapy. In some forms, the pancreatic islet organoids can be used to study the development of, and mechanisms underlying pancreatic tumors as well as the genetic and epigenetic risk factors of pancreatic cancer development.

[0304] B. Drug Screening and Evaluation

[0305] The compositions are particularly suitable for screening and identifying potential candidate agents for the treatment of pancreatic and metabolic diseases and conditions. Generally, the method includes contacting the in vitro generated organoid with the agent, and determining the effect of the agent on survival, proliferation, differentiation, morphologic parameters, genetic parameters, or functional parameters of the in vitro generated organoid.

[0306] An exemplary method of screening and evaluating candidate agents for treating pancreatic diseases and metabolic conditions include one or more of the following steps:

[0307] (i) contacting the in vitro generated organoid with a pre-determined concentration of a disease agent and incubating the in vitro generated organoid for a pre-determined period of time;

[0308] (ii) measuring one or more parameters indicative of a pathological cellular phenotype associated with the disease of interest;

[0309] (iii) administering a pre-determined concentration of a candidate agent to the in vitro generated organoid and incubating the in vitro generated organoid for a pre-determined period of time;

[0310] (iv) measuring one or more parameters indicative of cellular response to the candidate agent; and

[0311] (v) assessing the efficacy of the candidate agent by comparing the measured parameters of step (iv) to measured parameters of an untreated in vitro generated organoid, wherein a significant difference between the measured parameters of step (iv) and the measured parameters of the untreated control indicates that the candidate agent can be considered for treating a metabolic or pancreatic disease or condition.

[0312] In some forms, the method further includes comparing the response of the pancreatic islet organoid to the test agent with a control group to identify candidate agents with desirable effects on pancreatic islet function. In some forms, the desirable effects on pancreatic islet function comprise inducing pancreatic islet regeneration, improving pancreatic islet function, improving insulin secretion, improving glucose homeostasis, and protection from toxic agents.

[0313] In some forms, the agent is a nucleic acids or analogs thereof, polypeptides or analogs thereof, antibodies, chemicals, small molecules, and / or any combination thereof. In some forms, the treated and untreated cells from the pancreatic islet organoids are evaluated using PCR techniques, immunoassays, sequencing, biochemical assays, functional assays, cell viability assays, microscopy, or combinations thereof. Methods for screening agents are known in the art and include but are not limited to scintillation proximity assays, Direct fluorescence measurement, Fluorescence polarization, Fluorescence resonance energy transfer (FRET) , Time-resolved fluorescence (TRF, HTRF, and TiRF) , AlphaScreen, High-content screening (HCS) , Protein fragment complementation assays (PCA) , microfluidics, flow cytometry, and label-free technologies (reviewed in Janzen (2014) Chemistry and Biology Vol 21 (9) , pages 1162-1170) .

[0314] In some forms, the predetermined concentration and predetermined period of time in steps (i) and (iii) , respectively, are optimized based on the type of candidate agent. In some forms, the candidate agent is selected from a library of compounds comprising natural products, synthetic compounds, or a combination thereof.

[0315] In some forms, the functional parameters include assessing changes in insulin production, glucose metabolism, and cell viability. In some forms, the functional parameters include assessing changes in β cell mass. In some forms, the functional parameters include assessing changes in biochemical composition of β cells. In some forms, the functional parameters include assessing changes in β cell-specific protein expression and localization. In some forms, the functional parameters include assessing changes in β cell intracellular calcium ( [Ca2+] i) mobilization. In some forms, the functional parameters include assessing changes in NAD (P) H responses. In some forms, the functional parameters include assessing changes in β cell insulin resistance and insulin sensitivity.

[0316] C. Treating Metabolic and / or Pancreatic Diseases

[0317] The compositions are particularly suitable for the treatment of pancreatic and metabolic diseases and conditions. In particular, the methods are useful for treating Type 1 diabetes in a subject. An exemplary method includes one or more of the following steps:

[0318] (i) implanting the population of the disclosed pancreatic islet-like organoids into the subject's pancreatic tissue;

[0319] (ii) allowing the implanted pancreatic islet organoids to mature and functionally integrate with the subject's pancreatic tissue; and

[0320] (iii) monitoring and controlling blood glucose levels in the subject to manage and treat diabetes.

[0321] In some forms, the population of pancreatic islet-like cells can be implanted underneath the abdominal anterior rectus sheath. This transplantation method is preferred due to the ease of surgery and monitoring of the graft for any expansion or displacement by ultrasonography. Alternatively, the pancreatic islet-like cells are transplanted into the subject’s liver via the portal vein. In this method, the pancreatic-islet cells can be re-vascularized and integrated into the liver parenchyma.

[0322] The pancreatic organoids, compositions, and kits thereof, and methods of using the pancreatic organoids, compositions, and kits thereof can be further understood through the following numbered paragraphs.

[0323] Paragraph 1. A method for generating pancreatic islet-like organoids from pluripotent stem cells, including the stages of:

[0324] (A) inducing differentiation of the pluripotent stem cells into definitive endoderm cells;

[0325] (B) culturing the definitive endoderm cells from Stage (A) in suitable conditions to induce their differentiation into primitive gut tube cells;

[0326] (C) culturing the primitive gut tube cells from Stage (B) in suitable conditions to induce their differentiation into PDX1+ pancreatic progenitor cells;

[0327] (D) culturing the PDX1+ pancreatic progenitor cells from Stage (C) in suitable conditions to induce their differentiation into PDX1+ / NKX6-1+ pancreatic progenitor cells;

[0328] (E) culturing the PDX1+ / NKX6-1+ pancreatic progenitor cells from Stage (D) in suitable conditions to induce their differentiation into pancreatic endocrine cells and facilitate spontaneous formation and detachment of pancreatic islet organoids; and

[0329] (F) culturing the islet organoids from Stage (E) under conditions suitable for pancreatic islet cell development, thereby promoting the maturation of pancreatic islet-like organoids.

[0330] Paragraph 2. The method of paragraph 1, wherein Stage (A) further includes the steps of:

[0331] (i) seeding the pluripotent stem cells (PSCs) onto a solid substrate in a basal medium supplemented with a Rho Kinase inhibitor to promote expansion of the PSCs;

[0332] (ii) culturing the pluripotent stem cells from Step (i) in a first differentiation medium (HS1-1 medium) for a period of time, wherein the period of time is from about 20 hours to about 30 hours, preferably for about 24 hours; and

[0333] (iii) culturing PSCs from Step (ii) in a second differentiation medium (HS1-2 medium) for a period of time, wherein the period of time is from about 50 hours to about 80 hours, preferably for about 72 hours.

[0334] Paragraph 3. The method of paragraph 2, wherein the HS1-1 medium contains basal media containing one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements, and one or more buffering agents,

[0335] wherein the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 500 mL.

[0336] Paragraph 4. The method of paragraph 3, wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.600 g to about 1.000 g, preferably about 0.800 g.

[0337] Paragraph 5. The method of paragraph 3, wherein the growth factor is selected from the group comprising Activin A, basic fibroblast growth factor (bFGF) , and glycogen synthase kinase 3-beta (GSK 3β inhibitor) ,

[0338] wherein the Activin A is present in an amount ranging from about 80 ng / mL to about 120 ng / mL, preferably about 100 ng / mL,

[0339] wherein the bFGF is present in an amount ranging from about 6 ng / mL to about 12 ng / mL, preferably about 10 ng / mL, and

[0340] wherein the GSK 3β inhibitor is CHIR99021 present in an amount ranging from about 2 μM to about 4 μM, preferably about 3 μM.

[0341] Paragraph 6. The method of paragraph 3, wherein the protein is recombinant Human Serum Albumin (rHSA) in an amount ranging from about 0.450g to about 0.550g, preferably about 0.500g.

[0342] Paragraph 7. The method of paragraph 3, wherein the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.520g to about 0.620g, preferably about 0.587g.

[0343] Paragraph 8. The method of paragraph 3, wherein the supplement is 1X GlutaMax or L-Glutamine.

[0344] Paragraph 9. The method of paragraph 2, wherein the Rho Kinase inhibitor is Y27632, H-1152, or Fasudil (HA-1077) , in an amount ranging from about 2 μM to about 30 μM, preferably about 10 μM.

[0345] Paragraph 10. The method of paragraph 2, wherein the basal media used for seeding the PSCs in Step (i) is selected from the group of Essential 8 Medium and mTeSR Plus medium.

[0346] Paragraph 11. The method of paragraph 2, wherein the number of cells that are seeded onto the solid substrate ranges from about 0.32 x 106 cells / cm2 to about 0.74 x 106 cells / cm2.

[0347] Paragraph 12. The method of paragraph 2, wherein the solid substrate is an extracellular matrix (ECM) -coated glass surface.

[0348] Paragraph 13. The method of paragraph 2, further including coating the solid substrate with a basement membrane diluted in a basal media, wherein the basement membrane is MatrigelTM, wherein the basal media is DMEM / F-12, and wherein the ratio of basement membrane to basal media is about 1: 70.

[0349] Paragraph 14. The method of paragraph 2, wherein the HS1-2 medium contains basal media containing one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements, and one or more buffering agents;

[0350] wherein the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 500 mL;

[0351] wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.600g to about 1.000g, preferably about 0.800g;

[0352] wherein the growth factor is selected from the group of Activin A, and basic fibroblast growth factor (bFGF) ;

[0353] wherein the Activin A is present in an amount ranging from about 50ng / mL to about 150 ng / mL, preferably about 100 ng / mL,

[0354] wherein the bFGF is present in an amount ranging from about 5 ng / mL to about 15 ng / mL, preferably about 10 ng / mL, and

[0355] wherein the protein is rHSA (recombinant Human Serum Albumin) in an amount ranging from about 0.400g to about 0.600g, preferably about 0.500g;

[0356] wherein the supplement is 1X GlutaMax or L-Glutamine; and

[0357] wherein the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.520g to about 0.620g, preferably about 0.587g.

[0358] Paragraph 15. The method of any one of paragraphs 1-14, wherein Stage (B) includes the following steps:

[0359] (i) removing the HS1-2 medium;

[0360] (ii) without washing, culturing the definitive endoderm cells from Step (iii) of Stage (A) in a basal media comprising a third differentiation medium (HS2 medium) for a period of time, wherein the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 550 mL, preferably about 500 mL, and wherein the period of time is from about 36 hours to about 56 hours, preferably for about 48 hours; and

[0361] (iii) replacing the HS2 medium every 24 hours.

[0362] Paragraph 16. The method of paragraph 15, wherein HS2 medium contains basal media containing one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements, and one or more buffering agents; wherein the basal media is a reduced serum supplemented media,

[0363] wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL;

[0364] wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.300g to about 0.500g, preferably about 0.400g;

[0365] wherein the growth factor is fibroblast growth factor 7 (FGF7) present in an amount ranging from about 40 ng / mL to about 60 ng / mL, preferably about 50 ng / mL;

[0366] wherein the protein is rHSA (recombinant Human Serum Albumin) in an amount ranging from about 0.400g to about 0.600g, preferably about 0.500g;

[0367] wherein the vitamin is Ascorbic Acid present in an amount ranging from about 200 μM to about 300 μM, preferably 250 μM;

[0368] wherein the supplement is about 1X GlutaMax; and

[0369] wherein the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.520g to about 0.620g, preferably about 0.587g.

[0370] Paragraph 17. The method of any one of paragraphs 1-16, wherein Stage (C) includes the following steps:

[0371] (i) removing the HS2 medium;

[0372] (ii) without washing, culturing the primitive gut tube cells from Step (iii) of Stage (B) in a basal media comprising a fourth differentiation medium (HS3 medium) for a period of time, wherein the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 550 mL, preferably about 500 mL, and wherein the period of time is from about 36 hours to about 56 hours, preferably for about 48 hours; and

[0373] (iii) replacing the HS3 medium every 24 hours.

[0374] Paragraph 18. The method of paragraph 17, wherein HS3 medium contains basal media containing one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements, and one or more buffering agents; wherein the basal media is a reduced serum supplemented media,

[0375] wherein the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL,

[0376] wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.200 g to about 0.250 g, preferably about 0.220 g,

[0377] wherein the growth factor is selected from the group of FGF7, bone morphogenic protein inhibitor (BMP) , and a hedgehog inhibitor, wherein the FGF7 is present in an amount ranging from about 40 ng / mL to about 60 ng / mL, preferably about 50 ng / mL, wherein the BMP inhibitor is LDN193189 present in an amount ranging from about 0.10 μM to about 0.30 μM, preferably about 0.20 μM, and wherein the Hedgehog inhibitor is SANT-1 present in an amount ranging from about 0.15 μM to about 0.35μM, preferably 0.25 μM,

[0378] wherein the protein is recombinant Human Serum Albumin (rHSA) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.0 g,

[0379] wherein the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.800 g to about 1.000 g, preferably about 0.877 g,

[0380] wherein the vitamin is Ascorbic Acid present in an amount ranging from about 200 μM to about 300 μM, preferably about 250 μM,

[0381] wherein the one or more supplements are selected from the group comprising ITS-X 100X, GlutaMax 100X, and retinoic acid, wherein the ITS-X and GlutaMax are each present in the HS3 medium at about 1X or 1%, and wherein the retinoic acid is present in an amount ranging from about 1.00 μM to about 3.00 μM, preferably about 2.00 μM.

[0382] Paragraph 19. The method of any one of paragraphs 1-18, wherein Stage (D) includes the following steps:

[0383] (i) removing the HS3 medium;

[0384] (ii) without washing, culturing the PDX1+ from Step (iii) of Stage (C) in a basal media containing a fifth differentiation medium (HS4 medium) for a period of time, wherein the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 450 mL, preferably about 400 mL, and

[0385] wherein the period of time is from about 84 hours to about 106 hours, preferably for about 96 hours; and

[0386] (iii) wherein the HS4 medium is replaced every 24 hours.

[0387] Paragraph 20. The method of paragraph 19, wherein HS4 medium contains basal media containing one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements, and one or more buffering agents; wherein the basal media is a reduced serum supplemented media,

[0388] wherein the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL,

[0389] wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.200 g to about 0.250 g, preferably about 0.220 g,

[0390] wherein the growth factor is selected from the group of FGF7, bone morphogenic protein inhibitor (BMP) , and a hedgehog inhibitor, wherein the FGF7 is present in an amount ranging from about 40 ng / mL to about 60 ng / mL, preferably about 50 ng / mL, wherein the BMP inhibitor is LDN193189 present in an amount ranging from about 0.10 μM to about 0.30 μM, preferably about 0.20 μM, and wherein the Hedgehog inhibitor is SANT-1 present in an amount ranging from about 0.15 μM to about 0.35μM, preferably 0.25 μM,

[0391] wherein the protein is rHSA (recombinant Human Serum Albumin) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.0 g; and

[0392] wherein the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.800 g to about 1.000 g, preferably about 0.877 g, and

[0393] wherein the one or more supplements are selected from the group of ITS-X 100X, GlutaMax 100X, and retinoic acid, wherein the ITS-X and GlutaMax are each present in the HS4 medium at about 1X or 1%, and wherein the retinoic acid is present in an amount ranging from about 0.05 μM to about 0.50 μM, preferably about 0.10 μM.

[0394] Paragraph 21. The method of any one of paragraphs 1-20, wherein Stage (E) comprises the following steps:

[0395] (i) removing the HS4 medium;

[0396] (ii) without washing, culturing the PDX1+ / NKX6-1+ cells from Step (iii) of Stage (D) in a basal media containing a sixth differentiation medium (HS5-1 medium) for a period of time, wherein the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 450 mL, preferably about 400 mL, and wherein the period of time is from about 20 hours to about 30 hours, preferably for about 24 hours;

[0397] (iii) culturing the PDX1+ / NKX6-1+ cells from Step (ii) of Stage (E) in a bassal medium containing a seventh differentiation medium (HS5-2 medium) to promote spontaneous formation and detachment of cell aggregates or early islet organoids for a period of time, wherein the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 450 mL, preferably about 400 mL, and wherein the period of time is from about 5 days to about 7 days, preferably for about 6 days, and wherein the basal media comprising the HS5-2 medium is replaced every 24 hours;

[0398] (iv) removing the detached early islet organoids from Step (iii) ; and

[0399] (v) incubating the detached early islet organoids from Step (iv) under conditions to promote maturation of the pancreatic islet organoids.

[0400] Paragraph 22. The method of paragraph 21, wherein HS5-1 medium contains basal media containing one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more trace elements, one or more supplements, one or more antibiotics, and one or more buffering agents,

[0401] wherein the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL,

[0402] wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 1.5 g to about 2.1 g, preferably about 1.8 g,

[0403] wherein the growth factor is selected from the group containing a y-secretase inhibitor, and an ALK (anaplastic lymphoma kinase) inhibitor,

[0404] wherein the protein is recombinant Human Serum Albumin (rHSA) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.0 g,

[0405] wherein the hormone is triiodothyronine (T13) in an amount ranging from about 0.5 μM to about 1.5 μM, preferably about 1.0 μM,

[0406] wherein the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.800 g to about 1.000 g, preferably about 0.877 g,

[0407] wherein the cytoskeleton modulator is Latrunculin A (LatA) present in an amount ranging from about 0.5 μM to about 1.5 μM, preferably about 1.0 μM,

[0408] wherein the vitamin is Ascorbic Acid present in an amount from about 200 μM to about 300 μM, preferably about 250 μM,

[0409] wherein the antibiotic is Penicillin / Streptomycin 100X present at about 1X or 1%, and

[0410] wherein the one or more supplements are selected from the group containing ITS-X 100X, GlutaMax 100X, retinoic acid, and heparin, wherein the ITS-X and GlutaMax are each present in the HS5-1 medium at about 1X or 1%, wherein the retinoic acid is present in an amount ranging from about 0.05 μM to about 0.30 μM, preferably about 0.10 μM, and wherein the heparin is present in an amount ranging from 0.05 μM to about 0.30 μM, preferably about 0.10 μM.

[0411] Paragraph 23. The method of paragraph 22, wherein the ALK inhibitor is Alk5i II (RepSox) present in an amount ranging from about 5.0 μM to about 15.0 μM, preferably 10.0 μM, and wherein the γ-secretase inhibitor is XXI (Compound E) present in an amount ranging from about 0.5 μM to about 1.5 μM, preferably 1.0 μM.

[0412] Paragraph 24. The method of paragraph 21, wherein the HS5-2 medium contains basal media containing one or more small molecules, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more trace elements, one or more supplements, one or more antibiotics, and one or more buffering agents,

[0413] wherein the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL,

[0414] wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 1.5 g to about 2.1 g, preferably about 1.8 g,

[0415] wherein the small molecule is selected from the group containing a y-secretase inhibitor, and an ALK (anaplastic lymphoma kinase) inhibitor,

[0416] wherein the protein is rHSA (recombinant Human Serum Albumin) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.0 g,

[0417] wherein the hormone is triiodothyronine (T3) in an amount ranging from about 0.5 μM to about 1.5 μM, preferably about 1.0 μM,

[0418] wherein the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.800 g to about 1.000 g, preferably about 0.877 g,

[0419] wherein the vitamin is Ascorbic Acid present in an amount from about 200 μM to about 300 μM, preferably about 250 μM,

[0420] wherein the antibiotic is Penicillin / Streptomycin 100X present at about 1X or 1%, and

[0421] wherein the one or more supplements are selected from the group of ITS-X 100X, GlutaMax 100X, retinoic acid, and heparin, wherein the ITS-X is present at about 0.5X or 0.5%and GlutaMax is present at about 1X or 1%, wherein the retinoic acid is present in an amount ranging from about 0.05 μM to about 0.30 μM, preferably about 0.10 μM, and wherein the heparin is present in an amount ranging from about 2.5 mg to about 7.5 mg, preferably about 5.0 mg or a concentration from about 5 μg / mL to about 15 μg / mL, preferably about 10 μg / mL.

[0422] Paragraph 25. The method of paragraph 24, wherein the ALK inhibitor is Alk5i II (RepSox) present in an amount ranging from about 5.0 μM to about 15.0 μM, preferably 10.0 μM, and wherein the γ-secretase inhibitor is XXI (Compound E) present in an amount ranging from about 0.5 μM to about 1.5 μM, preferably 1.0 μM.

[0423] Paragraph 26. The method of any one of paragraphs 21-25, wherein removing the detached cell aggregates in Step (iv) comprising transferring the detached cell aggregates to a solid substrate.

[0424] Paragraph 27. The method of paragraph 26, wherein the solid substrate is a flat bottom ultra-low attachment plate.

[0425] Paragraph 28. The method of any one of paragraphs 21-27, wherein the conditions to promote spontaneous formation and detachment of pancreatic endocrine cell aggregates comprise incubating the detached cell aggregates in a cell culture incubator on an orbital shaker.

[0426] Paragraph 29. The method of any one of paragraphs 1-28, wherein Stage (F) includes the following steps:

[0427] (i) removing the HS5-2 medium;

[0428] (ii) without washing, culturing the pancreatic endocrine cell aggregates from Step (v) of Stage (E) in a basal media comprising a eighth differentiation medium (HS6 medium) for a period of time, wherein the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 550 mL, preferably about 500 mL, wherein the period of time is from about 12 days to about 16 days, preferably for about 14 days, and wherein the basal media comprising the HS6 medium is replaced every 48 hours; and

[0429] (iii) extracting the stem-cell derived pancreatic islet cells from Step (ii) .

[0430] Paragraph 30. The method of paragraph 29, wherein HS6 medium contains basal media containing one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or one or more trace elements, one or more supplements, one or more antibiotics, and one or more buffering agents,

[0431] wherein the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL,

[0432] wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.05 g to about 0.50 g, preferably about 0.23 g,

[0433] wherein the protein is rHSA (recombinant Human Serum Albumin) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.5 g,

[0434] wherein the antibiotic is Penicillin / Streptomycin 100X is present in an amount ranging from about 4.0 mL to about 6.0 mL, preferably about 5.2 mL,

[0435] wherein the trace elements are selected from the group of Trace Element A (1000X) , Trace Element B (1000X) , and ZnSO4.7H2O (1 mM) , and

[0436] wherein the one or more supplements are selected from the group of GlutaMax (100X) and heparin, wherein the supplement is GlutaMax (100X) present in an amount ranging from about 4.0 mL to about 6.0 mL, preferably about 5.2 mL, and wherein the heparin is present in an amount ranging from about 5.23 μg / mL to about 31.38 μg / mL, preferably about 10.46 μg / mL, and

[0437] wherein the supplement is MEM Non-Essential Amino Acids Solution (MEM NEAA 100X) , present in an amount ranging from about 4.0 mL to about 6.0 mL, preferably about 5.2 mL.

[0438] Paragraph 31. The method of paragraph 30, wherein the Trace Element A (1000X) , Trace Element B (1000X) , and ZnSO4.7H2O (1 mM) are each present in the HS6 medium in an amount ranging from 480 μL to about 580 μL preferably about 523 μL.

[0439] Paragraph 32. The method of any one of paragraphs 29-31, wherein extracting the stem-cell derived pancreatic islet cells includes transferring the detached stem-cell derived pancreatic islet organoids to a solid substrate.

[0440] Paragraph 33. The method of paragraph 28, wherein the solid substrate is a flat bottom ultra-low attachment plate.

[0441] Paragraph 34. The method of any one of paragraphs 29-33, wherein the conditions to promote expansion and maturation of stem-cell derived pancreatic islet cells include incubating the detached cell aggregates in a cell culture incubator on an orbital shaker at a temperature of about 37 ℃, humidity between about 90%and 95%, CO2 between about 4.5%to about 6.5%, preferably about 5%, and pH of about 7.0 to about 7.4.

[0442] Paragraph 35. The method of any one of paragraphs 1-34, wherein the pluripotent stem cells are selected from the group including embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells and chemically induced pluripotent stem cells.

[0443] Paragraph 36. The method of any one of paragraphs 1-35, wherein the pluripotent stem cells are mammalian pluripotent stem cells selected from the group of rodent pluripotent stem cells, non-human primate pluripotent stem cells and human pluripotent stem cells, preferably human pluripotent stem cells.

[0444] Paragraph 37. An in-vitro generated pancreatic islet-like organoid produced by the method of any of paragraphs 1-36.

[0445] Paragraph 38. A population of pancreatic islet-like cells produced by the method of any of paragraphs 1-36.

[0446] Paragraph 39. A method for screening an agent for an effect on the pancreatic islet cells, the method including contacting the in vitro generated organoid of paragraph 37 with the agent, and determining the effect of the agent on survival, proliferation, differentiation, morphologic parameters, genetic parameters, or functional parameters of the in vitro generated organoid.

[0447] Paragraph 40. The method of paragraph 39, wherein the agent is nucleic acids or analogs thereof, polypeptides or analogs thereof, antibodies, chemicals, small molecules, and / or any combination thereof.

[0448] Paragraph 41. The method of paragraph 39 or 40, wherein the functional parameters include assessing changes in insulin production, glucose metabolism, cell viability, β cell mass, biochemical composition, β cell-specific protein expression and localization, β cell intracellular calcium ( [Ca2+] i) mobilization, NAD (P) H response, and β cell insulin resistance.

[0449] Paragraph 42. The method of any of paragraphs 39-41 further comprising comparing the response of the pancreatic islet organoid to the test agent with a control group to identify candidate agents with desirable effects on pancreatic islet function.

[0450] Paragraph 43. The method of any of paragraphs 39-42, wherein the desirable effects on pancreatic islet function comprise inducing pancreatic islet regeneration, improving pancreatic islet function, improving insulin secretion, improving glucose homeostasis, protection from toxic agents, protection from allograft rejection after transplantation, promotion of angiogenesis after transplantation, reduction or elimination of the tumorigenicity, and prevention of transdifferentiation among pancreatic endocrine cell types.

[0451] Paragraph 44. A method for treating Type 1 diabetes in a subject, the method includes the following steps:

[0452] (i) implanting the population of pancreatic islet-like cells of paragraph 37 into the subject's pancreatic tissue or at a site near the pancreatic tissue, wherein the site near the pancreatic tissue is under the subject’s abdominal anterior rectus sheath;

[0453] (ii) allowing the implanted pancreatic islet organoids to mature and functionally integrate with the subject's pancreatic tissue or abdominal anterior rectus sheath; and

[0454] (iii) monitoring and controlling blood glucose levels in the subject to manage and treat diabetes.

[0455] Paragraph 45. A method for generating pancreatic islet-like organoids from human pluripotent stem cells or pancreatic progenitor cells, the method comprising:

[0456] (i) culturing the cells on a solid substrate comprising a glass surface coated with one or more extracellular matrix (ECM) components under conditions suitable to induce endocrine lineage commitment,

[0457] wherein culturing results in the spontaneous formation and detachment of pancreatic islet-like organoids from the substrate.

[0458] Paragraph 46. The method according to paragraph 45, further comprising:

[0459] (ii) allowing the cells to undergo spontaneous delamination and aggregation to form three-dimensional pancreatic islet-like organoids; and

[0460] (iii) transferring the free-floating organoids to a suspension culture system for further maturation.

[0461] Paragraph 46. The method of paragraph 45, wherein the glass surface is coated with an extracellular matrix (ECM) component selected from the group consisting of laminin, fibronectin, vitronectin, collagen IV, or a combination thereof.

[0462] Paragraph 47. The method of paragraph 45 or 46, wherein the culture medium comprises recombinant human serum albumin (rHSA) .

[0463] Paragraph 48. The method of paragraphs 45-47, wherein the glass surface is part of a Petri dish, a microscope slide, a coverslip, or a multi-well plate.

[0464] Paragraph 49. The method of paragraphs 45-48, wherein the glass surface has been sterilized and treated to enhance ECM protein adhesion prior to cell seeding.

[0465] Examples

[0466] Methods

[0467] Human Pluripotent Stem Cell (hPSC) Culture

[0468] hPSCs were maintained under feeder-free conditions in mTeSR1 medium (STEMCELL Technologies, Catalog #85850) or mTeSRTM Plus medium (STEMCELL Technologies, Catalog #100-0276) on tissue culture plates coated with Matrigel (Corning, Catalog #356231) that were diluted in DMEM / F-12 (Gibco, Catalog#1320033) in a ratio of 1: 70. The cells were cultured in a cell culture incubator at 37 ℃and 5%CO2 and were passaged every 3 or 4 days at split ratio of 1: 6. During passage, cells were dissociated either in clumps by 0.5 mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) diluted in DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) or in single cells by Accutase (Gibco, Catalog #A1110501) . The medium was supplemented with 10 μM of the Rho-kinase inhibitor (ROCKi) Y-27632 during the first 24 hours after seeding the cells in single-cell to prevent apoptosis.

[0469] Nucleofection of hPSCs

[0470] H1-hESCs were dissociated into single-cell suspension by Accutase (Gibco, Catalog #A1110501) , pelleted by centrifugation and re-suspended in DPBS. Live cells were counted by hemocytometer or LUNA-II automated cell counter, and 8×105 live cells were aliquoted into a 1.5 mL Eppendorf (EP) tubes. The cells were pelleted by centrifugation and DPBS was removed subsequently. Human Stem Cell Nucleofector Kit 1 (Lonza, Catalog #VPH-5012) was used to perform nucleofection and the manufacturer's protocol was followed. To construct H1-PDX1-EGFP-hESC line, 4 μg of PX459-PDX1-cr1 or PX459-PDX1-cr2 plasmid and 5 μg of pUC57-PDX1-EGFP-Puro plasmid were co-nucleofected in each nucleofection reaction. The cells were diluted in medium with 10 μM Y-27632 following nucleofection and were seeded into 3 wells of a 6-well plate. Y-27632 was retreated from the medium 24 hours after seeding the cells.

[0471] Selection of Nucleofected hPSCs

[0472] Puromycin selection was initiated when the nucleofected cells reached 70%–80%confluency. The cells were exposed to 1 μg / mL puromycin for 6 days before the surviving cells were passaged to a Matrigel-coated 6-well plate and were cultured until 70%–80%confluency was achieved. The expanded cells were dissociated into single cells with Accutase (Gibco, Catalog #A1110501) , counted and seeded to a Matrigel-coated 6 cm dish at 1, 350 cells / dish in medium with 10 μM Y-27632 to generate single-cell clones, while the rest of the cells were cryopreserved. Y-27632 was removed from the medium 24 hour after seeding the cells, and the cells were cultured for 7–10 days before the clones were suitable for picking. The clones were picked by 200 μL pipette tips and each picked clone was transferred to a Matrigel-coated well of a 48-well plate where the clone was cultured for 6 days before being passaged to a Matrigel-coated well of a 12-well plate for further expansion. The expanded cells were dissociated and collected for genotyping and cryopreservation.

[0473] Cryopreservation of hPSCs

[0474] Dissociated cells were washed once by DPBS and pelleted by centrifugation. After DPBS was removed, cells were re-suspended in 90%KnockOut Serum Replacement (Gibco, Catalog #10828028) + 10%DMSO. The cell suspension was aliquoted to properly labelled cryovials with 0.5 mL / vial and were placed on ice before being transferred to a Mr. FrostyTM container at room temperature. Cells were kept under -80℃ for 24 hours and were transferred to a liquid nitrogen tank subsequently for long-term storage.

[0475] Genomic DNA (gDNA) Extraction and Genotyping

[0476] Collected cells were washed once with DPBS and pelleted by centrifugation before gDNA extraction. TIANamp Genomic DNA Kit (TIANGEN, Catalog #DP304) was used to extract gDNA from the cells following the manufacturer's protocol. DNA concentration of each sample was determined by NanoDrop 2000 spectrophotometer. Purified DNA was preserved in -20℃ freezer. PrimeSTAR GXL DNA polymerase (Takara, Catalog #R050) was used for genotyping PCR, in which a 20 μL reaction comprised 100 ng gDNA, 1X PrimeSTAR GXL buffer, dNTP mixture (200 μM each) , 0.2 μM forward primer, 0.2 μM reverse primer and 0.5 U PrimeSTAR GXL DNA polymerase. The oligonucleotides included “PDX1 reporter genotyping-Forward” having the sequence 5’ -CCGTGTGTGAACTACACAACG -3’ (SEQ ID NO: 1) and “PDX1 reporter genotyping-Reverse” having the sequence 5’-CTTTTTCTTCCGGAAGGCCTG -3’ (SEQ ID NO: 2) were used for genotyping for wild type and PDX1-EGFP allele. The PCR conditions included: 98℃ for 5 minutes, 40 cycles of “98℃ for 10 seconds, 60℃ for 15 seconds, and 68℃ for 4 minutes 20 seconds” , 68℃ for 5 minutes and held at 4℃. The PCR products were subjected to agarose gel electrophoresis and the DNA bands were analyzed. The PCR product is 1,132 bp for wild type, and 4, 043 bp for PDX1-EGFP allele. The PCR products were also used for sanger sequencing for further analysis of the sequence.

[0477] In-Vitro Stem Cell-Derived Islets (SC-Islet) Production

[0478] To prepare for differentiation, hPSCs were dissociated into single-cell suspension by Accutase (Gibco, Catalog #A1110501) and the live cells were counted by hemocytometer or LUNA-II automated cell counter. Appropriate number of cells were re-suspended in mTeSR1 (STEMCELL Technologies, Catalog #85850) or mTeSR Plus (STEMCELL Technologies, Catalog #100-0276) medium with 10 μM Y-27632. Then, hPSCs were seeded onto the ECM-coated glass surface with 0.32 × 106 cells / cm2 to 0.74 × 106 cells / cm2.24 hours after seeding, the cells were exposed to differentiation medium and were differentiated towards stem cell-derived islets (SC-islet) through various stepwise protocols. Free-floating SC-islets were transferred to 6-well ultra-low attachment plates (Corning, Catalog #3471) and were cultured on an orbital shaker at 100 rpm (revolutions per minute) in a cell culture incubator at 37 ℃ and 5%CO2. If needed, images of the cultured cells were taken using a phase contrast microscope or a bright field microscope in the tissue culture room.

[0479] Static Glucose-Stimulated Insulin Secretion (GSIS) Assay

[0480] On the day of the assay, fresh Krebs buffer (KrB) was prepared from stock salt solutions and the pH was adjusted to 7.4 with 5M NaOH (Table 9) . 2 mM and 20 mM glucose solutions were also freshly prepared by diluting the 1 M stock solution in fresh KrB. All the prepared solutions were sterilized inside a tissue culture hood by 0.22 μm filter units prior to use.

[0481] Table 9: Stock and Working Solutions for Krebs Buffer

[0482] GSIS for SC-islets in suspension culture

[0483] Prior to the assay, a selected number of SC-islets were transferred to new wells of 12-well plates using a P1000 pipette. The medium was removed, and the cells were gently washed 3 times with KrB. The cells were then pre-incubated in 2 mL 2 mM glucose solution for 1 hour in a cell culture incubator with 37 ℃ and 5%CO2. After 1 hour, the low-glucose solution was removed and discarded, and the cells were washed once with KrB. Next, 2 mL 2 mM glucose solution was added to each well and the cells were incubated in the incubator for 1 hour.

[0484] Following incubation, the supernatant from each well was collected and aliquoted into two properly labelled 1.5 mL Eppendorf tubes at 1 mL per tube. The cells were washed once with KrB before adding 2 mL 20 mM glucose solution. Again, cells were incubated in the incubator for 1 hour. Meanwhile, the collected supernatant with 2 mM glucose was centrifuged under 2,000 rpm for 5 minutes in a benchtop centrifuge. 800 μL supernatant from each Eppendorf tube was carefully transferred to a new properly labelled 1.5 mL Eppendorf tube to prevent the collection of any detached cells that would affect the downstream insulin ELISA.

[0485] Following incubation, supernatant from each well was collected and aliquoted into two properly labelled 1.5 mL Eppendorf tubes with 1 mL per tube. The cells in each well were dissociated using 1 mL TrypLE Express (Gibco, Catalog #12605028) for 10 minutes in the incubator. Meanwhile, the collected supernatant with 20 mM glucose was centrifuged under 2,000 rpm for 5 minutes in a benchtop centrifuge. 800 μL supernatant from each Eppendorf tube was carefully transferred to a new properly labelled 1.5 mL Eppendorf tube. After 10 minutes, the cells were gently pipetted several times to disperse the cells into single cells. The cell suspension from each well was used to perform cell counts, which was used to determine the amount of insulin secreted per cell in the corresponding well. The supernatant samples collected were stored in -80℃ freezer and they would be used to perform insulin quantification by ELISA within one week. During the entire procedure, care was taken when removing liquid from wells to prevent the loss of SC-islet cells.

[0486] Insulin ELISA

[0487] To quantify the amount of insulin in each GSIS sample, a tube of supernatant for low-and high-glucose conditions collected from each group in GSIS assay was thawed and diluted 4× in KrB with corresponding glucose concentration. Human insulin ELISA kit (ALPCO, Catalog #80-INSHU-E01.1) was used to quantify the insulin amount in each sample and the manufacturer’s instructions were followed. The total cell counts for each well obtained in static GSIS was used to determine the amount of insulin secreted per cell in the corresponding well. The international unit of insulin (IU) was adopted when presenting the result, where 1 μIU (micro-international units) equals 0.0347 ng insulin.

[0488] SC-Islet Fixation and Cryosectioning

[0489] SC-islets were transferred to a 1.5 mL Eppendorf tube and were spun down briefly. Medium was carefully removed from the tube, after which ice-cold 4%PFA (paraformaldehyde) dissolved in DPBS was added to the tube to fix the SC-islets for 30 minutes on ice. After fixation, samples were spun down briefly and the PFA was removed. Fixed SC-islets were either dehydrated directly or preserved in DPBS containing 0.02%NaN3 under 4℃. Sucrose solutions (dissolved in DPBS) were used for dehydration. Samples were first exposed to 10% (w / v) sucrose solution (for preserved samples, SC-islets were first spun down briefly and then the DPBS containing 0.02%NaN3 were removed) before being incubated under 4℃. The sucrose solution was replaced by 20% (w / v) sucrose solution after samples sunk to the bottom of the tube and the incubation continued overnight under 4℃. Again, the sucrose solution was removed after incubation and 30% (w / v) sucrose solution was added to the samples and the incubation continued overnight under 4℃.

[0490] Following the incubation, samples were equilibrated to room temperature prior to the addition of trypan blue to achieve a 1: 50 dilution. The SC-islets were then incubated with diluted trypan blue for 10 minutes under room temperature to be slightly stained, which facilitated the visualization of the SC-islets during the subsequent procedure. The trypan blue-containing sucrose solution was removed and fresh 30% (w / v) sucrose solution was added to the SC-islets which were then transferred to a disposable base mold. Excess sucrose solution around the SC-islets on base mold was removed before the addition of optimal cutting temperature compound (OCT) (Sakura, Catalog #4583) . Using a needle, SC-islets were moved to the center of the OCT droplet, after which they were frozen and preserved in a -80℃ freezer. Frozen SC-islets were sectioned using CryoStar NX50 cryostat with 8 μM in thickness. The sections were transferred to a glass slide and preserved at -20℃.

[0491] Immunofluorescence (IF) Staining

[0492] IF staining for cells in planar culture (seeded on round coverslips)

[0493] Medium was removed in each well and the cells were washed briefly with DPBS. 4%PFA dissolved in DPBS was added to the cells after removing DPBS and the cells were fixed for 10 minutes under room temperature. The PFA was removed at the end of fixation and the cells were washed with DPBS 3 times for 3 minutes each. The washed cells were either permeabilized with 0.2%Triton X-100 in DPBS for 5 minutes under room temperature directly or preserved in DPBS containing 0.02%NaN3 under 4℃. For preserved cells, DPBS with 0.02%NaN3 was removed before the addition of permeabilization buffer. The buffer was removed after permeabilization, and the cells were blocked with blocking buffer (Beyotime, P0260) for 1 hour under room temperature. Cells were treated with primary antibodies diluted in primary antibody dilution buffer (Beyotime, P0262) for 1.5 hours under room temperature after the blocking buffer was removed. Following incubation, primary antibodies were removed, and the cells were washed with DPBS 3 times for 3 minutes each before the addition of corresponding fluorochrome-labeled secondary antibodies diluted in secondary antibody dilution buffer (Beyotime, P0265) . Cells were incubated with secondary antibodies for 1 hour under room temperature in a dark and moist environment, after which the antibodies were removed, and the cells were washed with DPBS 3 times for 3 minutes each. To stain the nucleus, cells were exposed to 1 μg / mL DAPI in DPBS for 30 minutes under room temperature in a dark and moist environment, after which DAPI solution was removed, and the cells were washed briefly with DPBS. The coverslips were mounted onto glass slides with antifade mounting medium (Invitrogen, S36938) and were sealed with nail polish.

[0494] IF staining for cryosectioned SC-islets

[0495] SC-islet sections were incubated with DPBS for 10 minutes under room temperature to remove OCT, after which hydrophobic barriers were drawn around the sections with a hydrophobic barrier pen (Vector Labs, H-4000) . Residual DPBS around the sections was removed before the addition of permeabilization buffer. The buffer was removed after permeabilization, and the sections were blocked with blocking buffer (Beyotime, P0260) for 1 hour under room temperature in a black wet box. After the blocking buffer was removed, primary antibodies diluted in primary antibody dilution buffer (Beyotime, P0262) were applied to the sections, which was followed by overnight incubation under 4℃ in a black wet box. Following incubation, primary antibodies were removed, and the sections were washed with DPBS 3 times for 3 minutes each before the addition of corresponding fluorochrome-labeled secondary antibodies diluted in secondary antibody dilution buffer (Beyotime, P0265) . Sections were incubated with secondary antibodies for 1 hour under room temperature in a black wet box, after which the antibodies were removed, and the sections were washed with DPBS 3 times for 3 minutes each. To stain the nucleus, sections were exposed to 1 μg / mL DAPI in DPBS for 30 minutes under room temperature in a black wet box, after which DAPI solution was removed, and the sections were washed with DPBS for 3 minutes, after which DPBS was discarded, and the residual liquid was removed with a Kimwipe paper. Antifade mounting medium (Invitrogen, S36938) was added to each section that was subsequently covered by a coverslip. The slides were sealed with nail polish.

[0496] Transmission Electron Microscopy (TEM)

[0497] SC-islet samples from each group were collected into 1.5 mL Eppendorf tubes and were spun down. Medium was removed from each tube before the addition of ice-cold 2.5%glutaraldehyde (GTA) . Samples were fixed in GTA under 4℃ overnight and were sent to the Electron Microscope Unit, HKU, for processing. TEM images were captured with either FEI Tecnai G2 20 S-TWIN scanning transmission electron microscope (STEM) or Philips CM100 TEM.

[0498] Single-cell RNA Sequencing (scRNA-seq) Preparation

[0499] Cells in both planar and suspension culture platforms were dispersed into single cells with TrypLE Express and were re-suspended in ice-cold DPBS with 0.04%BSA after being pelleted by centrifugation. The samples were delivered to Centre for PanorOmic Sciences (CPOS) of the HKU for library preparation and sequencing. For library preparations, the Chromium Single Cell 3'Reagent Kit v3.1 was used following the manufacturer’s protocol. In brief, the gene expression for individual cells were profiled with a microfluidic platform by encapsulating each cell into an emulsion with a unique barcoded cDNA, after which the emulsion was broken, and the cDNA was amplified. The raw data was generated in CPOS and was preliminarily analyzed by Cell Ranger.

[0500] scRNA-seq Data Analysis

[0501] Partek Flow Genomic Analysis Software provided by HKU CPOS and Rstudio with Seurat were was used to analyze scRNA-seq data. The initial quality control process included aligning the Cell Ranger pre-processed data to the human genome and filtering out the dying cells with high mitochondrial percentage (> 20%) . Then, data points with too low or too high gene counts, indicating debris and doublets respectively, were removed. Further analysis was performed using tasks available in the software.

[0502] RNA Extraction

[0503] Dissociated cells were washed with DPBS and pelleted by centrifugation. For cells collected from one well of a 6-well plate with 80%confluency, 500 μL RNAiso Plus (Takara Bio, 9109) was added to the cell pellet after DPBS was removed to lyse the cells. Samples were either stored under -80℃ or proceeded to RNA purification. Samples were pre-equilibrated to room temperature before the addition of 100 μL chloroform per tube of sample and were mixed thoroughly. The samples were incubated at room temperature for 5 minutes, followed by centrifugation under 12,000 rcf (rotational centrifugal force) and 4℃ for 15 minutes. The aqueous phase in each sample was transferred to a fresh tube, after which 250 μL isopropanol was added to each tube and was vortexed, then incubated for 10 minutes at room temperature. Following incubation, samples were centrifuged at 12,000 rcf and 4℃ for 10 minutes to pellet RNA. Supernatant was removed and the RNA pellet was washed once by vortexing with 700 μL 75%ethanol prepared in DEPC water, after which the sample was centrifuged at 7,500 rcf and 4℃ for 5 minutes. Supernatant was carefully removed and the RNA pellet was air-dried, then dissolved in 30 μL DEPC water. The RNA concentration was determined by NanoDrop 2000 spectrophotometer, and the purified RNA sample was stored in -80℃ freezer.

[0504] Reverse transcription

[0505] High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, 4374966) was used to perform reverse transcription. A 20 μL reaction comprised 2 μg RNA, 1X RT buffer, 1X dNTP mix (4 mM) , 1X RT random primers, 1 μL MultiScribe reverse transcriptase and 1 μL RNase inhibitor. DEPC water was used to supplement the volume to 20 μL. The reaction condition used was: 25℃ 10 minutes, 37℃ 120 minutes, 85℃ 5 minutes, and then held at 4℃. The products were stored under -20℃ for future use.

[0506] It is understood that the disclosed method and compositions are not limited to the particular methodology, protocols, and reagents described as these can vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to limit the scope of the present invention which will be limited only by the appended claims.

[0507] Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)

[0508] qRT-PCR was performed by StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) with StepOne Software v2.3, or by LightCycler 480 Instrument II (Roche) with LightCycler 480 Software v1.5.1. TB Green Premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) (Takara, RR420A) was used to set up the reactions. The reverse transcription product was diluted 10X in Milli-Q water before being used as template.

[0509] Each 10 μL reaction for StepOnePlus Real-Time PCR System was prepared manually and contained 0.5 μL diluted cDNA, 1X TB Green Premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) , 1X ROX reference dye, 0.2 μM forward primer and 0.2 μM reverse primer. The reaction condition used was 95℃ 30 seconds, 40 cycles of “95℃ 5 seconds, 60℃ 30 seconds” . The melting curve was measured by the program: 95℃ 15 seconds, 60℃ 1 minute followed by acquisition every 0.3℃ increments, 95℃ 15 seconds.

[0510] Each 10 μL reaction for LightCycler 480 Instrument II was prepared by Labcyte Echo550 Acoustic Liquid Handler (Agilent Technologies) and comprised 0.25 μL diluted cDNA, 1X TB Green Premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) , 0.2 μM forward primer and 0.2 μM reverse primer. The reaction condition used was: 95℃ 30 seconds, 40 cycles of “95℃ 5 seconds, 60℃ 30 seconds” . The melting curve was measured by the program: 95℃ 5 seconds, 60℃ 1 minute followed by an increase of temperature at 0.11℃ per second until 95℃ was reached, and 5 acquisitions were obtained every 1℃ increments. The final cooling step was carried out as: 50℃ 30 seconds with ramp rate at 2.2 ℃ per second.

[0511] Statistical Analysis

[0512] Data represent mean ± SD of 3 independent experiments unless specified. Statistical significance was tested by one-way ANOVA analysis. P value style is GP: P =0.1234 [not significant (ns) ] , P = 0.0332 (*) , P = 0.0021 (**) , P = 0.0002 (***) , and P <0.0001 (****) .

[0513] Results

[0514] Production and characterization of spontaneous-assembled stem cell-derived islets from H1-hESCs

[0515] Although various protocols have described approaches to generate stem cell-derived islets from hPSCs, cells differentiated in 2D culture platform need to be manually dissociated and clustered into aggregates, while 3D culture system tends to be more expensive, and the differentiated cells need to be dissociated and reaggregated at a certain point of differentiation to increase the efficiency (Hogrebe, et al., Nature biotechnology, 38 (4) : 460-470 (2020) ) . Thus, improved differentiation platforms for efficient, simplified environment for the production of human stem cell-derived islets for clinical use are urgently needed. In the present study, a glass surface is used to facilitate the secondary transition of the islet organoids as a mimic of the secondary transition observed for natural pancreatic islets.

[0516] Prior to the initiation of differentiation, glass bottom culture dishes were coated with 1: 70 diluted MatrigelTM in cold DMEM / F-12 for 1 hour under 37℃. To initiate differentiation towards the pancreatic endocrine lineages, 0.53 × 106 cells / cm2 H1-hESCs were seeded as a monolayer on Day (D) -1 in mTeSR Plus medium with 10 μM Y-27632, and were allowed to adhere and expand for about 24 hours. At this point, the maintenance medium was removed and replaced with HS1-1 medium at D0. After culturing for 24 hours, the medium was replaced with HS1-2 medium in which the cells were cultured for 3 days. The culture medium was changed every 24 hours until D19.

[0517] Cells acquired the definitive endoderm fate at D4, which was confirmed by the expression of definitive endoderm markers FOXA2 and SOX17 (FIG. 2) . As illustrated in FIG. 1, the culture medium was replaced with HS2 medium from D4 to D6 to generate the primitive gut tube.

[0518] The cells were subsequently cultured in HS3 medium from D6-D8 for the induction of PDX1+ pancreatic progenitors (FIG. 3 and FIG. 7) . The medium was replaced with HS4 for the differentiation of PDX1+ / NKX6-1+ pancreatic progenitors (FIG. 4 and FIG. 7) . The expression of FOXA2 and SOX17 decreased during the pancreatic progenitor induction process (FIG. 6) .

[0519] To induce the pancreatic endocrine fate specification of PDX1+ / NKX6-1+pancreatic progenitors and mimic the secondary transition process, cells remaining attached to the glass surface were treated with HS5-1 medium for 24 hours. The medium was changed to HS5-2 medium in which the cells were cultured for 6 days. At this stage of differentiation, some cells treated by HS5-1 medium underwent apoptosis while others survived and spontaneously formed cell aggregates. The cell aggregates gradually became more compact and rounder and were automatically detached from the glass surface in differentiation Stage 5 (also referred to as “Stage E) . The detached cell aggregates were collected and transferred to a 6-well ultra-low attachment plate and cultured on an orbital shaker with 100 rpm in a cell culture incubator at 37 ℃. The spontaneously detached cell aggregates at the end of differentiation Stage 5 are shown in FIG. 9.

[0520] The culture medium was replaced with HS6 medium on D19 for the maturation of the pancreatic endocrine cell aggregates to functional stem-cell derived islets. The medium was refreshed every 48 hours from D19 to D33. The expression of GCG, INS and SST together with PDX1 and NKX6-1 in both big and small stem-cell derived islets on D33 confirmed the existence of α-cells, β-cells and δ-cells regardless of the islets size (FIG. 10) . Other endocrine markers such as CHGA, ISL1 and NEUROD1 that are essential for islet maturation and functionality were present in both large and small stem cell-derived islets at the end of the differentiation protocol (FIG. 11) . The functionality of the generated stem cell-derived islets was confirmed by the presence of glucose-stimulated insulin secretion with statistical significance (FIG. 12) . Structurally, typical insulin granules with crystalline core and glucagon granules having high density core with limiting membrane around were observed under Transmission Electron Microscopy (TEM) (FIG. 22) , indicating the presence of mature hormone synthesis and packaging machinery in these endocrine cells.

[0521] Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) was carried out on D33 islet organoids for further analysis. The D33 islet organoids generated by the present study, hereafter referred to as SC-islets (improved) , or SC-islet (I) , were compared with their counterparts derived from an existing published protocol (Augsornworawat, et al., Cell reports, 32 (8) : 108067 (2020) ) ; and these organoids are hereafter referred to as SC-islets (published) or SC-islet (P) . The islet organoids (i.e., SC-islet (P) ) used for comparison demonstrated the same duration of differentiation, and their scRNA-seq data were generated using the identical kit and platform as SC-islets (I) . Data from three native human islets (Gene Expression Omnibus -GSE114297) were included in the analysis and were used as positive controls.

[0522] In the presence of human islets, SC-islets (P) (labeled as “Augsornworawat et al., 2020” in the figures) mainly included α cell-related cell types (FIG. 13A and 13B) . The cellular composition of SC-islet (I) was closer to native islet compared with that of SC-islet (P) . SC-β (I) cells also better recapitulated β cells. Analysis of differentially expressed genes in the β-cell identity gene set (van Gurp, et al., Nature communications, 13 (1) (2020) ) in SC-β cells implied that SC-β (I) cells possess more accurate β-cell identity compared with SC-β (P) cells (FIG. 16) . This was confirmed by GSEA analysis using the pancreatic endocrine cell identity gene sets, which indicated that compared with SC-β (P) cells, β-cell identity is improved in SC-β (I) cells while α-cell, δ-cell and γ-cell identities are suppressed (FIGs. 16, 17A, 17B, 17C, 17D, 23A, 24A and 24B) .

[0523] To gain insight into the functional importance of the expressed genes, gene set enrichment analysis (GSEA) was performed on gene ontology (GO) database. Subsequently, GO terms with statistically significant differences (q < 0.05) and relevant to β cells were filtered. Cell polarity, cell junctions and other means of cell-cell communication were demonstrated to be crucial for β cells (Benninger, et al., The Journal of Physiology, 589 (22) : 5453-5466 (2011) ; Collares-Buzato, et al., Journal of molecular histology, 35: 811-822 (2004) ; Gan, et al., Journal of cell science, 130 (1) : 143-151 (2017) ) . Thus, keywords involved in the description of these GO terms were also included during filtering. According to the top 10 enriched GO terms in the shortlisted result, cell-cell and cell-matrix interactions, endocrine pancreas development, and cytoskeleton organization were enriched in SC-β (I) cells (FIG. 23A) . Since a regulatory role of the microtubule network has been reported, and have been found to also be regulated by glucose levels on GSIS in β cells (Bracey, et al., Frontiers in Cell and Developmental Biology, 10: 915206 (2022) ) , the presence of such GO terms on the list indicated that SC-β (I) cells benefited from the modified platform in terms of functional maturation.

[0524] Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway database was used for GSEA to check whether any biological function described in the shortlisted GO-based result could be reflected in any pathway. Among the pathways that showed statistically significant difference between SC-β (I) and SC-β (P) cells, four were found related to β cell development, which are “Regulation of actin cytoskeleton (path: hsa04810) ” , “Focal adhesion (path: hsa04510) ” , “Adherens junction (path: hsa04520) ” and “Tight junction (path: hsa04530) . Enrichment analysis of the four pathways suggested that they were overrepresented in SC-β (I) cells (FIG. 23B) . Because cadherin is a crucial element in the pathway “adherens junction” and tight junction was demonstrated to regulate the functional state and polarity of β cells (Gan, et al., Journal of cell science, 130 (1) : 143-151 (2017) Li, et al., FEBS Open bio, 10 (1) : 28-40 (2020) ) , these results were in accord with those obtained from GO database. Moreover, gene sets of signaling pathways that are crucial for β-cells are also overrepresented in SC-β (I) cells (FIG. 23B) . In general, the modified platform facilitated the development of cell-cell interaction among SC-β (I) cells, which led to enhanced SC-islet (I) integrity, allowing these organoids to better mimic the human islets. The top genes are listed in the table shown in FIG. 14.

[0525] Visualization of PDX1 expression using H1-hESCs harboring an EGFP reporter downstream of PDX1 gene during the spontaneous delamination process of cells in differentiation Stage 5 (Stage E)

[0526] To confirm and visualize the PDX1 expression in cells during the spontaneous aggregation process in differentiation stage 5 in real-time, H1-hESCs were engineered to harbor an EGFP reporter downstream of PDX1 gene. To achieve this goal, two sgRNAs (cr1 and cr2) were designed to target DNA sequences in the vicinity of the PDX1 stop codon, and a PDX1-2A-EGFP donor vector with puromycin resistance gene (PuroR) for integrating the EGFP reporter into the PDX1 locus was used (FIG. 18) . Due to the presence of 2A peptide, it was believed that correctly targeted cells should express EGFP from the endogenous PDX1 locus without affecting the expression of PDX1 protein and the differentiation process. Four clones were successfully expanded following puromycin selection and single-cell-derived colony picking. Genotyping PCR showed that one clone (clone #7) had a strong band representing knock-in allele while the wild-type band was absent (FIG. 19) , indicating the biallelic integration. The successful targeting was further confirmed by Sanger sequencing (FIG. 20) and the pluripotency was not affected by the edited genome (FIG. 21A and FIG. 21B) .

[0527] These cells (clone #7) were subjected to the differentiation process as described in the Methods above. Strong EGFP signal, indicating the robust expression of PDX1, was observed in the nucleus of the cells attached on the glass surface on D12 that was D0 of differentiation stage (S) 5 (FIG. 8A) . As shown in FIG. 8A, 24 hours after being exposed to HS5-1 medium, the cells underwent a significant morphological change while retaining PDX1 expression. From S5D1 to S5D3, cells in HS5-2 medium gradually self-assembled into cell aggregates and on S5D4, the cell aggregates became more rounded and loosely attached to the glass surface or detached from the surface. PDX1 expression was maintained in the cells differentiating towards pancreatic endocrine lineages during the entire process mimicking the secondary transition including morphogenetic transformation. In comparison, cells cultured on MatrigelTM-coated tissue culture plate failed to establish the 3D islet structure and the PDX1 expression level decreased with time (FIG. 8B) .

[0528] Conclusions

[0529] Overall, this study demonstrated a multistage process of differentiating human pluripotent cells (hPSCs) to non-pluripotent cells or a partially differentiated cells, including, definitive endoderm (DE) , primitive gut tube (PGT) , PDX1+ pancreatic progenitors (PP1) , PDX1+ / NKX6-1+ pancreatic progenitors (PP2) , pancreatic endocrine (PE) cells and islet organoids.

[0530] In contrast to the existing methods, the present method utilizes extracellular matrix (ECM) -coated glass surface for the induction of hPSCs towards PE cells, which mimics and facilitates the secondary transition observed in natural pancreatic endocrine development. PE cells derived from hPSCs were obtained by seeding hPSCs at 100%confluency on ECM-coated glass surface and these cells were induced to differentiate in a monolayer format. A step-wise strategy was used to apply appropriate combinations of small molecules, growth factors and cytokines in the early-and mid-stages of the differentiation. As such, the method of the present study facilitated direct transfer of expanded hPSCs to adherent culture in a form of monolayer for immediate differentiation without requiring formation of cell aggregates from hPSCs that is utilized by existing 3D differentiation protocols. The PE cells produced by the present methods spontaneously formed aggregates and detached from the glass surface. Thus, the late stages of the differentiation process designed for the maturation of islet cells were carried out in a suspension culture platform. As such, the method of the present study facilitated autonomous cell aggregation to produce stem cell-derived islets without requiring manual dissociation and reaggregation of the cells. The present methods thus provides culture platforms that facilitated differentiating hPSCs to pancreatic endocrine cells and autonomous generation of stem-cell derived islets with high efficiency, without manual dissociation and reaggregation process.

[0531] Throughout the description and claims of this specification, the word “comprise” and variations of the word, such as “comprising” and “comprises, ” means “including but not limited to, ” and is not intended to exclude, for example, other additives, components, integers or steps.

[0532] “Optional” or “optionally” means that the subsequently described event, circumstance, or material may or may not occur or be present, and that the description includes instances where the event, circumstance, or material occurs or is present and instances where it does not occur or is not present.

[0533] Unless the context clearly indicates otherwise, use of the word “can” indicates an option or capability of the object or condition referred to. Generally, use of “can” in this way is meant to positively state the option or capability while also leaving open that the option or capability could be absent in other forms or embodiments of the object or condition referred to. Unless the context clearly indicates otherwise, use of the word “may” indicates an option or capability of the object or condition referred to. Generally, use of “may” in this way is meant to positively state the option or capability while also leaving open that the option or capability could be absent in other forms or embodiments of the object or condition referred to. Unless the context clearly indicates otherwise, use of “may” herein does not refer to an unknown or doubtful feature of an object or condition.

[0534] Ranges can be expressed herein as from “about” one particular value, and / or to “about” another particular value. When such a range is expressed, also specifically contemplated and considered disclosed is the range from the one particular value and / or to the other particular value unless the context specifically indicates otherwise. Similarly, when values are expressed as approximations, by use of the antecedent “about, ” it will be understood that the particular value forms another, specifically contemplated embodiment that should be considered disclosed unless the context specifically indicates otherwise. It will be further understood that the endpoints of each of the ranges are significant both in relation to the other endpoint, and independently of the other endpoint unless the context specifically indicates otherwise. It should be understood that all of the individual values and sub-ranges of values contained within an explicitly disclosed range are also specifically contemplated and should be considered disclosed unless the context specifically indicates otherwise. Finally, it should be understood that all ranges refer both to the recited range as a range and as a collection of individual numbers from and including the first endpoint to and including the second endpoint. In the latter case, it should be understood that any of the individual numbers can be selected as one form of the quantity, value, or feature to which the range refers. In this way, a range describes a set of numbers or values from and including the first endpoint to and including the second endpoint from which a single member of the set (i.e. a single number) can be selected as the quantity, value, or feature to which the range refers. The foregoing applies regardless of whether in particular cases some or all of these embodiments are explicitly disclosed.

[0535] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meanings as commonly understood by one of skill in the art to which the disclosed method and compositions belong. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present method and compositions, the particularly useful methods, devices, and materials are as described. Nothing herein is to be construed as an admission that the present invention is not entitled to antedate such disclosure by virtue of prior invention. No admission is made that any reference constitutes prior art. The discussion of references states what their authors assert, and applicants reserve the right to challenge the accuracy and pertinency of the cited documents. It will be clearly understood that, although a number of publications are referred to herein, such reference does not constitute an admission that any of these documents forms part of the common general knowledge in the art.

[0536] Although the description of materials, compositions, components, steps, techniques, etc. can include numerous options and alternatives, this should not be construed as, and is not an admission that, such options and alternatives are equivalent to each other or, in particular, are obvious alternatives.

[0537] Those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain, using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments of the method and compositions described herein. Such equivalents are intended to be encompassed by the following claims.

Claims

1.A method for generating pancreatic islet-like organoids from pluripotent stem cells, comprising the stages of:(A) inducing differentiation of the pluripotent stem cells into definitive endoderm cells;(B) culturing the definitive endoderm cells from Stage (A) in suitable conditions to induce their differentiation into primitive gut tube cells;(C) culturing the primitive gut tube cells from Stage (B) in suitable conditions to induce their differentiation into PDX1+ pancreatic progenitor cells;(D) culturing the PDX1+ pancreatic progenitor cells from Stage (C) in suitable conditions to induce their differentiation into PDX1+ / NKX6-1+ pancreatic progenitor cells;(E) culturing the PDX1+ / NKX6-1+ pancreatic progenitor cells from Stage (D) in suitable conditions to induce their differentiation into pancreatic endocrine cells and facilitate spontaneous formation and detachment of pancreatic islet organoids; and(F) culturing the islet organoids from Stage (E) under conditions suitable for pancreatic islet cell development, thereby promoting the maturation of pancreatic islet-like organoids.2.The method of claim 1, wherein Stage (A) comprises the steps of:(i) seeding the pluripotent stem cells (PSCs) onto a solid substrate in a basal medium supplemented with a Rho Kinase inhibitor to promote expansion of the PSCs;(ii) culturing the pluripotent stem cells from Step (i) in a first differentiation medium (HS1-1 medium) for a period of time, wherein the period of time is from about 20 hours to about 30 hours, preferably for about 24 hours; and(iii) culturing PSCs from Step (ii) in a second differentiation medium (HS1-2 medium) for a period of time, wherein the period of time is from about 50 hours to about 80 hours, preferably for about 72 hours.3.The method of claim 2, wherein the HS1-1 medium comprises basal media comprising one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements, and one or more buffering agents,wherein the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 500 mL,optionally wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.600 g to about 1.000 g;optionally wherein the growth factor is selected from the group consisting of Activin A, basic fibroblast growth factor (bFGF) , and glycogen synthase kinase 3-beta (GSK 3βinhibitor) ,optionally wherein the Activin A is present in an amount ranging from about 80 ng / mL to about 120 ng / mL;optionally wherein the bFGF is present in an amount ranging from about 6 ng / mL to about 12 ng / mL;optionally wherein the GSK 3β inhibitor is CHIR99021 present in an amount ranging from about 2 μM to about 4 μM;optionally wherein the protein is recombinant Human Serum Albumin (rHSA) in an amount ranging from about 0.450g to about 0.550g;optionally wherein the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.520g to about 0.620g; andoptionally wherein the supplement is 1X GlutaMax or L-Glutamine.4.The method of claim 2, wherein the Rho Kinase inhibitor is Y27632, H-1152, or Fasudil (HA-1077) , in an amount ranging from about 2 μM to about 30 μM, preferably about 10 μM;optionally wherein the basal media used for seeding the PSCs in Step (i) is selected from the group comprising Essential 8 Medium and mTeSR Plus medium.5.The method of claim 2, wherein the number of cells that are seeded onto the solid substrate ranges from about 0.32 x 106 cells / cm2 to about 0.74 x 106 cells / cm2.6.The method of claim 2, wherein the solid substrate is an extracellular matrix (ECM) -coated glass surface,optionally further comprising coating the solid substrate with a basement membrane diluted in a basal media, wherein the basement membrane is MatrigelTM, wherein the basal media is DMEM / F-12, and wherein the ratio of basement membrane to basal media is about 1: 70.7.The method of claim 2, wherein the HS1-2 medium comprises basal media comprising one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements, and one or more buffering agents;optionally wherein the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 500 mL;optionally wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.600g to about 1.000g, preferably about 0.800g;optionally wherein the growth factor is selected from the group comprising Activin A, and basic fibroblast growth factor (bFGF) ;optionally wherein the Activin A is present in an amount ranging from about 50ng / mL to about 150 ng / mL, preferably about 100 ng / mL,optionally wherein the bFGF is present in an amount ranging from about 5 ng / mL to about 15 ng / mL, preferably about 10 ng / mL, andoptionally wherein the protein is rHSA (recombinant Human Serum Albumin) in an amount ranging from about 0.400g to about 0.600g, preferably about 0.500g;optionally wherein the supplement is 1X GlutaMax or L-Glutamine; andoptionally wherein the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.520g to about 0.620g, preferably about 0.587g.8.The method of any one of claims 1-7, wherein Stage (B) comprises the following steps:(i) removing the HS1-2 medium;(ii) without washing, culturing the definitive endoderm cells from Step (iii) of Stage (A) in a basal media comprising a third differentiation medium (HS2 medium) for a period of time, wherein the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 550 mL, preferably about 500 mL, and wherein the period of time is from about 36 hours to about 56 hours, preferably for about 48 hours; and(iii) replacing the HS2 medium every 24 hours;optionally wherein HS2 medium comprises basal media comprising one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements, and one or more buffering agents; wherein the basal media is a reduced serum supplemented media,wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL;wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.300g to about 0.500g, preferably about 0.400g;wherein the growth factor is fibroblast growth factor 7 (FGF7) present in an amount ranging from about 40 ng / mL to about 60 ng / mL, preferably about 50 ng / mL;wherein the protein is rHSA (recombinant Human Serum Albumin) in an amount ranging from about 0.400g to about 0.600g, preferably about 0.500g;wherein the vitamin is Ascorbic Acid present in an amount ranging from about 200 μM to about 300 μM, preferably 250 μM;wherein the supplement is about 1X GlutaMax; andwherein the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.520g to about 0.620g, preferably about 0.587g.9.The method of any one of claims 1-8, wherein Stage (C) comprises the following steps:(i) removing the HS2 medium;(ii) without washing, culturing the primitive gut tube cells from Step (iii) of Stage (B) in a basal media comprising a fourth differentiation medium (HS3 medium) for a period of time, wherein the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 550 mL, preferably about 500 mL, and wherein the period of time is from about 36 hours to about 56 hours, preferably for about 48 hours; and(iii) replacing the HS3 medium every 24 hours;optionally wherein HS3 medium comprises basal media comprising one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements, and one or more buffering agents; wherein the basal media is a reduced serum supplemented media,optionally wherein the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL,optionally wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.200 g to about 0.250 g, preferably about 0.220 g,optionally wherein the growth factor is selected from the group comprising FGF7, bone morphogenic protein inhibitor (BMP) , and a hedgehog inhibitor, wherein the FGF7 is present in an amount ranging from about 40 ng / mL to about 60 ng / mL, preferably about 50 ng / mL, wherein the BMP inhibitor is LDN193189 present in an amount ranging from about 0.10 μM to about 0.30 μM, preferably about 0.20 μM, and wherein the Hedgehog inhibitor is SANT-1 present in an amount ranging from about 0.15 μM to about 0.35μM, preferably 0.25 μM,optionally wherein the protein is recombinant Human Serum Albumin (rHSA) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.0 g,optionally wherein the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.800 g to about 1.000 g, preferably about 0.877 g,optionally wherein the vitamin is Ascorbic Acid present in an amount ranging from about 200 μM to about 300 μM, preferably about 250 μM, andoptionally wherein the one or more supplements are selected from the group comprising ITS-X 100X, GlutaMax 100X, and retinoic acid, wherein the ITS-X and GlutaMax are each present in the HS3 medium at about 1X or 1%, and wherein the retinoic acid is present in an amount ranging from about 1.00 μM to about 3.00 μM, preferably about 2.00 μM.10.The method of any one of claims 1-9, wherein Stage (D) comprises the following steps:(i) removing the HS3 medium;(ii) without washing, culturing the PDX1+ from Step (iii) of Stage (C) in a basal media comprising a fifth differentiation medium (HS4 medium) for a period of time, wherein the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 450 mL, preferably about 400 mL, andwherein the period of time is from about 84 hours to about 106 hours, preferably for about 96 hours; and(iii) wherein the HS4 medium is replaced every 24 hours;optionally wherein HS4 medium comprises basal media comprising one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more supplements, and one or more buffering agents; wherein the basal media is a reduced serum supplemented media,optionally wherein the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL,optionally wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.200 g to about 0.250 g, preferably about 0.220 g,optionally wherein the growth factor is selected from the group comprising FGF7, bone morphogenic protein inhibitor (BMP) , and a hedgehog inhibitor, wherein the FGF7 is present in an amount ranging from about 40 ng / mL to about 60 ng / mL, preferably about 50 ng / mL, wherein the BMP inhibitor is LDN193189 present in an amount ranging from about 0.10 μM to about 0.30 μM, preferably about 0.20 μM, and wherein the Hedgehog inhibitor is SANT-1 present in an amount ranging from about 0.15 μM to about 0.35μM, preferably 0.25 μM,optionally wherein the protein is rHSA (recombinant Human Serum Albumin) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.0 g; andoptionally wherein the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.800 g to about 1.000 g, preferably about 0.877 g, andoptionally wherein the one or more supplements are selected from the group comprising ITS-X 100X, GlutaMax 100X, and retinoic acid, wherein the ITS-X and GlutaMax are each present in the HS4 medium at about 1X or 1%, and wherein the retinoic acid is present in an amount ranging from about 0.05 μM to about 0.50 μM, preferably about 0.10 μM.11.The method of any one of claims 1-10, wherein Stage (E) comprises the following steps:(i) removing the HS4 medium;(ii) without washing, culturing the PDX1+ / NKX6-1+ cells from Step (iii) of Stage (D) in a basal media comprising a sixth differentiation medium (HS5-1 medium) for a period of time, wherein the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 450 mL, preferably about 400 mL, and wherein the period of time is from about 20 hours to about 30 hours, preferably for about 24 hours;(iii) culturing the PDX1+ / NKX6-1+ cells from Step (ii) of Stage (E) in a bassal medium comprising a seventh differentiation medium (HS5-2 medium) to promote spontaneous formation and detachment of cell aggregates or early islet organoids for a period of time, wherein the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 450 mL, preferably about 400 mL, and wherein the period of time is from about 5 days to about 7 days, preferably for about 6 days, and wherein the basal media comprising the HS5-2 medium is replaced every 24 hours;(iv) removing the detached early islet organoids from Step (iii) ; and(v) incubating the detached early islet organoids from Step (iv) under conditions to promote maturation of the pancreatic islet organoids;optionally wherein HS5-1 medium comprises basal media comprising one or more growth factors, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more trace elements, one or more supplements, one or more antibiotics, and one or more buffering agents,optionally wherein the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL,optionally wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 1.5 g to about 2.1 g, preferably about 1.8 g,optionally wherein the growth factor is selected from the group comprising a y-secretase inhibitor, and an ALK (anaplastic lymphoma kinase) inhibitor,optionally wherein the protein is recombinant Human Serum Albumin (rHSA) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.0 g,optionally wherein the hormone is triiodothyronine (T13) in an amount ranging from about 0.5 μM to about 1.5 μM, preferably about 1.0 μM,optionally wherein the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.800 g to about 1.000 g, preferably about 0.877 g,optionally wherein the cytoskeleton modulator is Latrunculin A (LatA) present in an amount ranging from about 0.5 μM to about 1.5 μM, preferably about 1.0 μM,optionally wherein the vitamin is Ascorbic Acid present in an amount from about 200 μM to about 300 μM, preferably about 250 μM,optionally wherein the antibiotic is Penicillin / Streptomycin 100X present at about 1X or 1%, andoptionally wherein the one or more supplements are selected from the group comprising ITS-X 100X, GlutaMax 100X, retinoic acid, and heparin, wherein the ITS-X and GlutaMax are each present in the HS5-1 medium at about 1X or 1%, wherein the retinoic acid is present in an amount ranging from about 0.05 μM to about 0.30 μM, preferably about 0.10 μM, and wherein the heparin is present in an amount ranging from 0.05 μM to about 0.30 μM, preferably about 0.10 μM.12.The method of claim 11, wherein the ALK inhibitor is Alk5i II (RepSox) present in an amount ranging from about 5.0 μM to about 15.0 μM, preferably 10.0 μM, and wherein the γ-secretase inhibitor is XXI (Compound E) present in an amount ranging from about 0.5 μM to about 1.5 μM, preferably 1.0 μM.13.The method of claim 11, wherein the HS5-2 medium comprises basal media comprising one or more small molecules, one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or more vitamins, one or more trace elements, one or more supplements, one or more antibiotics, and one or more buffering agents,wherein the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL,wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 1.5 g to about 2.1 g, preferably about 1.8 g,wherein the small molecule is selected from the group comprising a y-secretase inhibitor, and an ALK (anaplastic lymphoma kinase) inhibitor,wherein the protein is rHSA (recombinant Human Serum Albumin) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.0 g,wherein the hormone is triiodothyronine (T3) in an amount ranging from about 0.5 μM to about 1.5 μM, preferably about 1.0 μM,wherein the buffering agent is sodium bicarbonate in an amount ranging from about 0.800 g to about 1.000 g, preferably about 0.877 g,wherein the vitamin is Ascorbic Acid present in an amount from about 200 μM to about 300 μM, preferably about 250 μM,wherein the antibiotic is Penicillin / Streptomycin 100X present at about 1X or 1%, andwherein the one or more supplements are selected from the group comprising ITS-X 100X, GlutaMax 100X, retinoic acid, and heparin, wherein the ITS-X is present at about 0.5X or 0.5%and GlutaMax is present at about 1X or 1%, wherein the retinoic acid is present in an amount ranging from about 0.05 μM to about 0.30 μM, preferably about 0.10 μM, and wherein the heparin is present in an amount ranging from about 2.5 mg to about 7.5 mg, preferably about 5.0 mg or a concentration from about 5 μg / mL to about 15 μg / mL, preferably about 10 μg / mL;optionally wherein the ALK inhibitor is Alk5i II (RepSox) present in an amount ranging from about 5.0 μM to about 15.0 μM, preferably 10.0 μM, and wherein the γ-secretase inhibitor is XXI (Compound E) present in an amount ranging from about 0.5 μM to about 1.5 μM, preferably 1.0 μM.14.The method of any one of claims 11-13, wherein removing the detached cell aggregates in Step (iv) comprising transferring the detached cell aggregates to a solid substrate,wherein the solid substrate is a flat bottom ultra-low attachment plate, andoptionally wherein the conditions to promote spontaneous formation and detachment of pancreatic endocrine cell aggregates comprise incubating the detached cell aggregates in a cell culture incubator on an orbital shaker.15.The method of any one of claims 1-14, wherein Stage (F) comprises the following steps:(i) removing the HS5-2 medium;(ii) without washing, culturing the pancreatic endocrine cell aggregates from Step (v) of Stage (E) in a basal media comprising a eighth differentiation medium (HS6 medium) for a period of time, wherein the basal media is MCDB 131 Medium in an amount ranging from about 350 mL to about 550 mL, preferably about 500 mL, wherein the period of time is from about 12 days to about 16 days, preferably for about 14 days, and wherein the basal media comprising the HS6 medium is replaced every 48 hours; and(iii) extracting the stem-cell derived pancreatic islet cells from Step (ii) ,optionally wherein HS6 medium comprises basal media comprising one or more proteins, one or more amino acids, one or more carbohydrates, one or one or more trace elements, one or more supplements, one or more antibiotics, and one or more buffering agents,optionally wherein the basal media is a reduced serum supplemented media, wherein the reduced serum supplemented media is MCDB 131 Medium present in an amount of about 100 mL,optionally wherein the carbohydrate is glucose in an amount from about 0.05 g to about 0.50 g, preferably about 0.23 g,optionally wherein the protein is rHSA (recombinant Human Serum Albumin) in an amount ranging from about 6.0 g to about 14.0 g, preferably about 10.5 g,optionally wherein the antibiotic is Penicillin / Streptomycin 100X is present in an amount ranging from about 4.0 mL to about 6.0 mL, preferably about 5.2 mL,optionally wherein the trace elements are selected from the group comprising Trace Element A (1000X) , Trace Element B (1000X) , and ZnSO4.7H2O (1 mM) , andoptionally wherein the one or more supplements are selected from the group comprising GlutaMax (100X) and heparin, wherein the supplement is GlutaMax (100X) present in an amount ranging from about 4.0 mL to about 6.0 mL, preferably about 5.2 mL, and wherein the heparin is present in an amount ranging from about 5.23 μg / mL to about 31.38 μg / mL, preferably about 10.46 μg / mL,optionally wherein the supplement is MEM Non-Essential Amino Acids Solution (MEM NEAA 100X) , present in an amount ranging from about 4.0 mL to about 6.0 mL, preferably about 5.2 mL, andoptionally wherein the Trace Element A (1000X) , Trace Element B (1000X) , and ZnSO4.7H2O (1 mM) are each present in the HS6 medium in an amount ranging from 480 μL to about 580 μL preferably about 523 μL.16.The method of claim 15, wherein extracting the stem-cell derived pancreatic islet cells comprises transferring the detached stem-cell derived pancreatic islet organoids to a solid substrate;wherein the solid substrate is a flat bottom ultra-low attachment plate; andwherein the conditions to promote expansion and maturation of stem-cell derived pancreatic islet cells comprise incubating the detached cell aggregates in a cell culture incubator on an orbital shaker at a temperature of about 37 ℃, humidity between about 90%and 95%, CO2 between about 4.5%to about 6.5%, preferably about 5%, and pH of about 7.0 to about 7.4.17.The method of any one of claims 1-16, wherein the pluripotent stem cells are selected from the group comprising embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells and chemically induced pluripotent stem cells;optionally wherein the pluripotent stem cells are mammalian pluripotent stem cells selected from the group of rodent pluripotent stem cells, non-human primate pluripotent stem cells and human pluripotent stem cells, preferably human pluripotent stem cells.18.An in-vitro generated pancreatic islet-like organoid produced by the method of any of claims 1-17.19.A population of pancreatic islet-like cells produced by the method of any of claims 1-17.20.A method for screening an agent for an effect on the pancreatic islet cells, the method comprising contacting the in vitro generated organoid of claim 18 with the agent, and determining the effect of the agent on survival, proliferation, differentiation, morphologic parameters, genetic parameters, or functional parameters of the in vitro generated organoid.21.A method for treating Type 1 diabetes in a subject, the method comprising:(i) implanting the population of pancreatic islet-like organoid of claim 18 into the subject's pancreatic tissue or at a site near the pancreatic tissue, wherein the site near the pancreatic tissue is under the subject’s abdominal anterior rectus sheath;(ii) allowing the implanted pancreatic islet organoids to mature and functionally integrate with the subject's pancreatic tissue or abdominal anterior rectus sheath; and(iii) monitoring and controlling blood glucose levels in the subject to manage and treat diabetes.22.A method for generating pancreatic islet-like organoids from human pluripotent stem cells or pancreatic progenitor cells, the method comprising:(i) culturing the cells on a solid substrate comprising a glass surface coated with one or more extracellular matrix (ECM) components under conditions suitable to induce endocrine lineage commitment,wherein culturing results in the spontaneous formation and detachment of pancreatic islet-like organoids from the substrate.

Images