RNA trans-splicing molecules and systems

Abstract

Provided herein are novel RNA editing / expression systems that involve trans-splicing. Provided herein are engineered RNA Trans¬ splicing Molecules (RTMs) that can repair endogenous mutant or dysfunctional proteins by editing the pre-mRNAs instead of the genes. Dual / multiple RTM systems based on two or more engineered RTMs are also provided. The dual / multiple RTM systems overcome the packaging capacity limitations of single vectors and allow efficient expression of large genes.

Description

RNA TRANS-SPLICING MOLECULES AND SYSTEMS

[0001] This application claims priority to PCT Patent Application No. PCT / CN2024 / 105047, filed July 11, 2024, which is incorporated herein by reference in its entirety. 1. Reference to Sequence Listing Submitted Electronically

[0002] This application incorporates by reference a Sequence Listing as an XML file entitled “098A004WO02_SL” created on July 10, 2025 and having a size of 225, 371 bytes.2. Field

[0003] The present invention relates to molecular biology and gene therapy. Provided herein include compositions and methods for RNA editing via the Trans-Splicing Molecular (RTM) system.3. Background

[0004] Current gene therapy involves the delivery of genetic material into a patient’s cells to correct or replace defective genes, treat diseases, or prevent the progression of genetic disorders. This therapeutic approach holds promise for treating a wide range of conditions, including inherited disorders, cancer, and certain viral infections. Previously, singular Trans-Splicing Molecules (RTMs) have been designed to target endogenous pre-mRNA and form matured mRNA with correct sequence by alternative trans-splicing events. However, the applications of these RTMs are limited by a number of factors, such as the requirement for splicing sites within native introns, low efficiency of alternative splicing is observed to be low, and packaging capacity limitation of delivery vectors. Thus, novel mRNA editing systems with engineered RTMs are urgently needed.

[0005] The compositions and methods provided in this disclosure address this need and provide related advantages.4. Summary

[0006] Provided herein are RNA Trans-Splicing Molecules (RTMs) that include a replacement fragment and a tail-end intron. The tail-end intron has a binding fragment that reverse complementarily pairs with a target pre-mRNA, and the replacement fragment comprises a coding sequence of the target mRNA. In some embodiments, the replacement fragment comprises an inserted intron, which can be either a natural intron or an engineered intron.

[0007] Provided herein are also RTMs where the tail-end intron can be a 5' intron or a 3' intron. In the case of a 5’ intron, the intron contains a 3’ trans-splicing fragment, which can include a splicing regulatory element (SRE) derived from a natural intron with an exon skipping probability (SkipProb) of at least 40%or higher, with specific examples including various introns such as AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33. The SREs in these sequences play a role in enhancing the efficiency of trans-splicing. In some embodiments, the RTM can have a 3’ intron containing a 5’ trans-splicing fragment, which can include a splice donor (SD) derived from natural introns.

[0008] Further provided are RTMs where the length of the complementary region between the binding fragments and the target pre-mRNA can vary from 30 to 1500 base pairs, with specific ranges from 50 to 1000 bp or from 200 to 600 bp. In some embodiments, these RTMs can also include RNA stabilizing elements, such as G-quadruplex (G4) motifs or kissing-loop-like structures, to enhance the stability of the RNA.

[0009] Provided herein are also vectors comprising these RTMs, which can include recombinant expression vectors or viral vectors, such as adenovirus (AV) , Adeno-Associated Virus (AAV) , lentivirus (LV) , retrovirus (RV) , and others. These vectors can also be non-viral, such as plasmids, liposomes, nanoparticles, and other delivery systems. Additionally, cells containing these RTMs or vectors, as well as pharmaceutical compositions comprising the RTMs, vectors, or cells, are provided.

[0010] Methods of using these RTMs to correct or edit pre-mRNA with a mutation are also provided, where the pre-mRNA is contacted with the RTM or vector under conditions suitable for trans-splicing. Further methods are provided for treating diseases or disorders associated with gene mutations by administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising the RTM.

[0011] Provided herein is also a dual RTM system comprising a 5’ splicing site (5’ss) RTM and a 3’ splicing site (3’ss) RTM. The 5’ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a replacement fragment and a 3’ intron, where the replacement fragment contains a coding sequence (N) , an inserted intron, and another coding sequence (M) . The 3’ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a 5’ intron and a replacement fragment, where the replacement fragment contains coding sequence (M) , a second inserted intron, and another coding sequence (C) . The coding sequences, when linked in the order N–M–C, form a contiguous coding sequence that encodes a functional protein or polypeptide. Each intron within the dual RTM system contains a binding fragment, and the binding fragments of the introns in the 5’ss RTM and 3’ss RTM reverse complementarily pair with each other. In some embodiments, the introns of the 3’ss RTM comprise a 3’ trans-splicing fragment that includes an SRE derived from a natural intron having a SkipProb of at least 40%or higher. The dual RTM system can further include RNA stabilizing elements such as G4 motifs or kissing-loop-like structures.

[0012] Also provided herein is a triple RTM system comprising three distinct RTMs: a N-ss RTM, an M-ss RTM, and a C-ss RTM. Each RTM in the triple system comprises specific sequences and introns that cooperate for efficient trans-splicing and the generation of a functional protein or polypeptide. The N-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a replacement fragment and a 3’ intron, where the replacement fragment contains a coding sequence (N) , an inserted intron, and another coding sequence (M1) . The M-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a 5’ intron, a replacement fragment, and a 3’ intron. The replacement fragment of the M-ss RTM contains coding sequence (M1) , a first inserted intron, another coding sequence (M2) , a second inserted intron, and a third coding sequence (M3) . The C-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a 5’ intron and a replacement fragment, where the replacement fragment contains coding sequence (M3) , an inserted intron, and coding sequence (C) . When the coding sequences (N–M1–M2–M3–C) are linked in this specific order, they form a contiguous, functional coding sequence.

[0013] Each of the introns in the triple RTM system contains a binding fragment, and the binding fragments of these introns form reverse complementary pairs to enable accurate and efficient trans-splicing and ensure the generation of a functional protein / peptides. In some embodiments, the 5’ intron and certain inserted introns of the M-ss RTM and / or the C-ss RTM can comprise a 3’ trans-splicing fragment having an SRE derived from a natural intron that has a SkipProb of at least 40%or higher. In some embodiments, the triple RTM system can also include RNA stabilizing elements such as G4 motifs or kissing-loop-like structures.

[0014] The dual / triple / multiple RTM systems disclosed herein can be utilized for recombinant expression of proteins or polypeptides in a system that does not rely on the presence of an endogenous template. These systems enable the synthesis of functional proteins directly by facilitating efficient trans-splicing reactions between the provided RTMs. These systems provide significant advantages for recombinant expression applications, particularly in cases where the endogenous expression of the target gene is difficult, undesirable, or not feasible, or where the target protein is oversized (encoding sequence > 5 kb) . The use of these systems offers a clean and controlled method for recombinant protein production, which can be useful in, for example, gene editing, recombinant protein production for therapeutic and non-therapeutic uses, and treatment of genetic diseases associated with specific mutations.5. Brief Description of Drawings

[0015] FIG. 1 provides the diagram for designed 5’ -splice site RNA trans-splicing molecule (5’ss-RTM) . As shown, 5’ss-RTM specifically pairs with target pre-mRNA and repairs mutations via spliceosome mediated alternative splicing. Mutations locating in the range from Exon X+1 to Exon Y of the Target pre-mRNA can be corrected with the normal / wild type coding fragment [Exon X+1: Exon Y] in the 5’ss-RTM.

[0016] FIG. 2 provides the diagram for designed 3’ -splice site RNA trans-splicing molecule (3’ss-RTM) . As shown, 3’ss-RTM specifically pairs with target pre-mRNA and repairs mutations via spliceosome mediated alternative splicing. Mutations locating in the range from Exon X+1 to Exon Y of the Target pre-mRNA can be corrected with normal / wild type coding fragment [Exon X+1 : Exon Y]in the 3’ss-RTM.

[0017] FIG. 3 provides the diagram for designed dual RTM system, wherein the 3’ss-RTM and 5’ -RTM pair with each other through complementary base pair binding, which independent of target pre-mRNA, generates full-length wild-type mature target mRNA via two alternative RNA splicing events.

[0018] FIG. 4 provides the diagram for triple RTM system. As show, M-ss RTM pairs simultaneously with both N-ss RTM and C-ss RTM, thereby forming a stable trimeric structure comprising three RTMs. And full-length target coding sequence can be generated via four RNA splicing events, as depicted.

[0019] FIG. 5 provides the diagram for a GFP reporter construct, which comprises three coding fragments separated by two intron sequences derived from human Col4A5. A stop codon replacement was introduced in the GFP-M fragment to mimic a lethal mutation in certain target genes.

[0020] FIG. 6 provides the diagram for the 3’ -ss RTM, which consists of two modified intron sequences. One contains a reverse complementary binding sequence that pairs with the mini-Target GFP reporter, while the other intron sequence links the two coding fragments GFP-M and GFP-C.

[0021] FIG. 7 provides the diagram for the 5’ -ss RTM, which consists of two modified intron sequences. One contains a reverse complementary binding sequence that pairs with the mini-Target GFP reporter, while the other intron sequence links the two coding fragments GFP-N and GFP-M.

[0022] FIG. 8 provides the diagram showing that the GFP 5’ -ss RTM and GFP 3’ -ss RTM can form complementary-paired structure.

[0023] FIG. 9 provides representative data showing that the dual RTMs system significantly enhanced the repair efficiency of mutations in the target gene and also independently expressed the target protein.

[0024] FIG. 10 provides the diagram showing the de novo engineered RTM structure (including inserted intron and hybrid intron with selected high active AS motif) and the normally designed RTM structure (without inserted intron) .

[0025] FIG. 11 provides representative data showing that the engineered RTM significantly enhanced the repair efficiency of mutations in the target gene, compared to the normally designed RTM.

[0026] FIG. 12 provides representative data showing that efficient in vivo expression of the reporter protein after the dual RTMs system designed for expression of the reporter protein was delivered to the mice using AAV.

[0027] FIG. 13 provides the diagram for triple RTM system for editing or expressing the GFP reporter gene. As shown, the triple RTM system consists of three GFP RTMs, which can form a heterotrimer structure through four complementary pairings.

[0028] FIG. 14 provides representative data showing the validation of triple RTM system. The expression of GFP by the triple RTM system was detected by both flow cytometry and Western Blot.

[0029] FIG. 15 provides representative data showing the optimization of the editing / expression efficiency of the RTM system by optimizing the SRE.

[0030] FIG. 16 provides representative data showing the optimization of the editing / expression efficiency of the RTM system by optimizing the length of complementary pair.

[0031] FIG. 17 provides representative data showing the overexpression of mCOL4A5 protein via optimized dual-RTM system.6. Detailed Description

[0032] Current gene therapy involves the delivery of genetic material into a subject’s cells to correct or replace defective genes, treat diseases, or prevent the progression of genetic disorders. This therapeutic approach holds promise for treating a wide range of conditions, including inherited disorders, cancer, and certain viral infections. Gene therapy techniques commonly use viral vectors, such as adeno-associated viruses (AAV) and lentiviruses, as well as non-viral vectors like plasmid DNA and RNA nanoparticles.

[0033] The adeno-associated virus (AAV) is a commonly used vehicle for in vivo genetic material delivery due to its favorable safety profile and high efficiency with low immunogenicity. The AAV genome is a single-stranded DNA that, once inside a host cell, can form a stable, double-stranded circular structure, known as an episome. This ring-like structure allows for long-term expression of the therapeutic gene without integrating into the host genome, reducing the risk of insertional mutagenesis. AAV vectors are engineered to carry therapeutic genes and are utilized in treating a variety of genetic disorders. Nevertheless, its restricted packaging capacity (～5kb) , poses a limitation for delivering large target constructs.

[0034] Single RNA trans-Splicing Molecules (RTMs) have been designed to target endogenous pre-mRNA and initiate alternative trans-splicing events between the RTM and endogenous targeted pre-mRNA, ultimately leading to the formation of corrected or modified mature mRNA. The trans-splicing strategy has been applied to AAV delivery. Specifically, the full-length target gene can be divided into two fragments, with a splice donor (SD) signal at the 3’ end of the 5’ -half vector and a splice acceptor (SA) signal at the 5’ end of the 3’ -half vector. A recent modification adds complementary binding sequences to both vectors to improve reconstitution efficiency (Riedmayr et al.., Nat Commun. 2023 Oct 18; 14 (1) : 6578) . However, the overall trans-splicing efficiency of such methods still appears low, likely due to the inefficient and / or unstable head-to-tail binding.

[0035] As such, there remain significant limitations and challenges for the existing technology. First, they exclusively address the repair of endogenous mutant genes, contingent upon the selection of splicing sites within native introns. Second, the efficiency of alternative splicing is low, leaving a significant portion of mutant pre-mRNA unrepaired. Third, the existing methods depend on the transcription process of the endogenous target gene, and therefore are inapplicable for exogenous expression of genes without endogenous counterpart. Fourth, because the length of a RTM required to repair a mutation in a target gene is constrained by the location of the mutation site and the size of the target gene, due to the limit of packaging capacity of delivery vectors, the existing RTM technology cannot be used to edit large target genes requiring long replacement sequence.

[0036] To address these challenges, provided herein is a novel RTM design, including dual / multiple-vector delivery technology based on reconstitution via pre-mRNA alternative trans-splicing, which significantly increases reconstitution efficiency and expands delivery capacity.

[0037] Before the present disclosure is further described, it is to be understood that the disclosure is not limited to the particular embodiments set forth herein, and it is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments, and is not intended to be limiting. 6.1 Definitions

[0038] Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in the present disclosures shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. Further, unless otherwise required by context, singular terms shall include pluralities and plural terms shall include the singular. Generally, nomenclatures used in connection with, and techniques of, cell and tissue culture, molecular biology, immunology, microbiology, genetics and protein and nucleic acid chemistry and hybridization described herein are those well-known and commonly used in the art.

[0039] Unless expressly stated otherwise or where the context clearly indicates a different species, any reference to an intron identified by gene name and intron number (e.g., “COL4A5 Intron 25” ) denotes the corresponding intron of the human (Homo sapiens) gene.

[0040] The term “a” or “an” entity refers to one or more of that entity; for example, “an antibody, ” is understood to represent one or more antibodies.

[0041] The term “and / or” where used herein is to be taken as specific disclosure of each of the two specified features or components with or without the other. Thus, the term “and / or” as used in a phrase such as “A and / or B” herein is intended to include “A and B, ” “A or B, ” “A” (alone) , and B” (alone) . Likewise, the term “and / or” as used in a phrase such as “A, B, and / or C” is intended to encompass each of the following aspects: A, B, and C; A, B, or C; A or C; A or B; B or C; A and C; A and B; B and C; A (alone) ; B (alone) ; and C (alone) .

[0042] As used herein, the term “about” is used to indicate that a value includes the inherent variation of error for the device, the method being employed to determine the value, or the variation that exists among the study subjects. The term “about” encompasses the exact number recited. In some embodiments, “about” means within plus or minus 10%of a given value or range. In some embodiments, “about” means that the variation is ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, ±1%, ±0.5%, ±0.2%, or ±0.1%of the value to which “about” refers. In some embodiments, “about” means that the variation is ±1%, ±0.5%, ±0.2%, or ±0.1%of the value to which “about” refers.

[0043] The terms “nucleic acid, ” “polynucleotide, ” as used interchangeably herein mean polymers of nucleotides of any length and include DNA and RNA. The nucleotides can be deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases, and / or their analogs, or any substrate that can be incorporated into a polymer by DNA or RNA polymerase. A nucleic acid or polynucleotide can be a natural nucleic acid or polynucleotide. A nucleic acid or polynucleotide can be an engineered nucleic acid or polynucleotide. As used herein, a “natural” nucleic acid or polynucleotide refers to a DNA or RNA molecule whose nucleotide sequence is endogenously produced by a living organism and remains unaltered from its naturally occurring form. Such molecules include genomic DNA, organellar DNA (e.g., mitochondrial or chloroplast genomes) , native messenger RNA (mRNA) , ribosomal RNA (rRNA) , transfer RNA (tRNA) , and other cellular or viral RNAs that arise through the organism’s normal transcription, replication, or processing pathways without intentional modification. In contrast, an “engineered” nucleic acid or polynucleotide refers to any DNA or RNA molecule whose sequence, chemistry, or structural context has been deliberately created, synthesized, or modified by human intervention to confer desired properties. Modifications can include, by way of example and without limitation, codon substitutions, insertion or deletion of regulatory motifs, chemical backbone alterations (e.g., phosphorothioate, 2′-O-methyl, or locked-nucleic-acid residues) , incorporation of non-natural bases, fusion to coding or non-coding sequences, or formatting within expression vectors, viral genomes, or synthetic oligonucleotides. Engineered nucleic acids may be designed to enhance stability, alter gene‐expression levels, redirect splicing, encode therapeutic proteins or guide RNAs, or otherwise perform functions that natural nucleic acids do not natively provide.

[0044] As used herein, the term “coding sequence” means the contiguous stretch of nucleotide bases in an mRNA-or in the corresponding genomic DNA-that specifies, in linear triplet codons, the amino-acid sequence of a polypeptide. A coding sequence is distinguished from adjacent untranslated regions (5′-UTR and 3′-UTR) and does not include introns, promoters, enhancers, or other regulatory elements. When exons are spliced together to form mature mRNA, the joined exonic coding regions collectively constitute the full-length coding sequence, or CDS, which is read by ribosomes to produce the corresponding protein. Full-length coding sequences typically include from the first translation initiation codon (typically AUG) to the translation termination codon (UAA, UAG, or UGA) .

[0045] As used herein, the term “nucleic acid analog” refers to a compound having structural similarity to a canonical purine or pyrimidine base occurring in DNA or RNA. The nucleic acid analog can comprise a modified sugar and or a modified nucleobase, as compared to a purine or pyrimidine base occurring naturally in DNA or RNA. In some embodiments, the nucleic acid analog is a 2'-deoxyribonucleoside, 2’ -ribonucleoside, 2’ -deoxyribonucleotide or a 2’ -ribonucleotide, wherein the nucleobase includes a modified base (such as, for example, xanthine, uridine, oxanine (oxanosine) , 7-methyl guanosine, dihydrouridine, 5-methylcytidine, 5-methyl dC, 5-hydroxy butynyl-2’ -deoxyuridine, 5-nitroindole, 5-methyliso-deoxycytosine, isodeoxyguanosine, deoxyuracil, isodeoxycytidine, other O-1 purine analogs, N-6-hydroxylaminopurine, nebularine, 7-deaza hypoxanthine, other 7-deazapurines, and 2-methylpurines) . In some embodiments, the nucleic acid analog can be selected from: inosine, 7-deaza-2’ -deoxyinosine, 2’ -aza-2 ’ -deoxyinosine, PNA-inosine, morpholino-inosine, LNA-inosine, phosphoramidate-inosine, 2’ -O-methoxyethyl-inosine, and 2’ -OMe-inosine. In some embodiments, the nucleic acid analog can be a nucleic acid mimic, such as, for example, artificial nucleic acids and xeno nucleic acids (XNA) .

[0046] The term “mRNA” or “messenger RNA, ” as used herein and consistently with its understanding in the art, is a single-stranded molecule of RNA that is synthesized from a DNA template during the process of transcription. It carries the genetic information copied from DNA in the form of a series of codons and serves as a template for protein synthesis during translation. The term “pre-mRNA” or “precursor mRNA, ” as used herein and consistently with its understanding in the art, refers to the initial form of mRNA that is transcribed from a gene before it undergoes processing. This form of RNA contains both introns (non-coding regions) and exons (coding regions) . Before pre-mRNA can be translated into protein, it must undergo several processing steps, including, for example: capping (addition of a 5'cap to the beginning of the RNA molecule) , polyadenylation (addition of a poly-A tail to the 3' end) , and splicing (removal of introns and joining of exons to produce a continuous coding sequence) . Once these modifications are complete, the mature mRNA is transported out of the nucleus and into the cytoplasm, where it can be translated into protein by ribosomes.

[0047] As used herein, the term “coding sequence” (often abbreviated “CDS” ) means the contiguous stretch of nucleotide bases in an mRNA-or in the corresponding genomic DNA-from the first translation initiation codon (typically AUG) to the translation termination codon (UAA, UAG, or UGA) that specifies, in linear triplet codons, the amino-acid sequence of a polypeptide. A coding sequence is distinguished from adjacent untranslated regions (5′-UTR and 3′-UTR) and does not include introns, promoters, enhancers, or other regulatory elements. When exons are spliced together to form mature mRNA, the joined exonic coding regions collectively constitute the full-length CDS, which is read by ribosomes to produce the corresponding protein.

[0048] The term “splicing” as used herein and consistently with its understanding in the art, refers to the crucial post-transcriptional modification process in eukaryotic cells where the non-coding regions (introns) are removed from the pre-mRNA transcript, and the coding regions (exons) are joined together. This process is essential for the generation of mature mRNA, which can then be translated into functional proteins. Splicing is generally carried out by a complex of proteins and small nuclear RNAs called the spliceosome. Splicing can be trans-splicing and cis-splicing. Cis-splicing refers to the conventional splicing process where introns are removed, and exons are joined within the same pre-mRNA molecule. This process occurs in a linear manner and is the predominant form of splicing in eukaryotic cells. The resulting mature mRNA consists of exons that were originally contiguous within the pre-mRNA transcript. In contrast, trans-splicing is a form of RNA processing where exons from two different pre-mRNA molecules are joined together, resulting in the generation of a single mature mRNA molecule that contains exons from multiple sources. The activity of a molecule (e.g., an RNA molecule) to engage in trans-splicing, including its own trans-splicing, is referred to as the “trans-splicing activity. ”

[0049] The term “exon” , as used herein and consistently with its understanding in the art, refers to a coding region within a gene that is transcribed into pre-mRNA and retained in the mature mRNA after the splicing process. Exons contain the sequences that code for the amino acids of a protein. As used herein, a “coding sequence” (or “CDS” ) is the contiguous stretch of nucleotide bases within an exon-or across multiple joined exons-that is read in triplet codons to specify the primary amino-acid sequence of a polypeptide. During splicing, exons are joined together to form a continuous coding sequence that will be translated into a functional protein.

[0050] The term “intron, ” as used herein and consistently with its understanding in the art, refers to a non-coding region within a gene that is transcribed into pre-mRNA but is removed during the splicing process. In other words, introns are intervening sequences that do not code for proteins and are excised by the spliceosome during the formation of mature mRNA. A gene can contain one or more introns. Introns can play roles in the regulation of gene expression and alternative splicing. As used herein, a “natural intron” is a naturally occurring intron sequence that is endogenously encoded within the genome and incorporated into the primary transcript without modification. In contrast, an “engineered intron” is an intron sequence that has been synthetically created or modified-e.g., by altering splice-site consensus motifs, inserting binding sequences, or adding regulatory elements-to impart desired functional characteristics such as enhanced splicing efficiency, controlled exon inclusion, or facilitation of targeted RNA trans-splicing. Engineered introns can have trans-splicing activity, cis-splicing activity, or both trans-and cis-splicing activities. In eukaryotic cells, the removal of introns from pre-mRNAs comprising two steps. Firstly, cleavage of the 5’ splice site occurs through a transesterification reaction, in which the 3’ -OH of the 5’ exon is replaced by the 3’ -OH or 2’ -OH of the branch point adenosine or a branch point-like element near the 3’ splice site. This is followed by a second reaction at the 3’ splice site, resulting in exon ligation and intron excision.

[0051] Consensus sequences for the 5’ and the 3’s region used in RNA splicing are well known in the art (e.g., Moore et al. ., 1993, The RNA World, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 303-358) . An intron is flanked at its 5′ end by the 5′ splice site (5′ss) , also called the splice donor (SD) . Typically, this signal begins with the dinucleotide GU and extends several nucleotides into both the upstream exon and the intron; a typical mammalian consensus can be written (C / A) AG | GURAGU (R = purine) , where “|” marks the exon–intron junction and positions -3 to +6 are most critical for U1 snRNP recognition. Although GU is dominant, non-canonical donors such as GC and, more rarely, GA / GG can be used; these sites typically appear in weak exons or alternative introns and are compensated by stronger 3’ s ignals or enhancer motifs. Toward the 3′ end of the intron lies a multipart 3′ splice site (3′ss) comprising, in 5′→3′ order: (i) the branch-point sequence (BP) -a short degenerate motif whose conserved adenosine nucleophile is situated ～40 nt upstream of the exon; (ii) an intervening polypyrimidine tract (PPT) immediately downstream of BP; and (iii) the splice acceptor (SA) motif, ending with the canonical AG at the intron–exon boundary. The BP consensus sequence in mammals is YNYURAC (Y = pyrimidine; N = any nucleotide; R = purine) . The underlined A is the site of branch formation. These three components together define the landing pad for spliceosomal assembly at the 3′ end. The physical distance between BP and AG can vary, but a stretch of ～70–80 nt upstream of the AG usually captures all functional motifs needed for efficient splicing.

[0052] Recently, pre-mRNA introns referred to as U12-dependent introns, many of which begin with the dinucleotide AU and end in the dinucleotide AC, have been described.

[0053] As used herein, the term “Splicing Regulatory Element, ” or “SRE” refers to the contiguous 3′-terminal segment of an intron that contains all requisite sequence motifs for 3′-end splice-site recognition and catalysis. An SRE comprises, in 5′→3′ order: BP, PPT, and the 3′ SA. The SRE is typically captured as a 70–80-nt stretch upstream of the intron–exon junction, although this length is not rigid-any shorter segment that still retains the BP, PPT, and SA in their natural order qualifies as an SRE. The term “SRE” is used interchangeably with the term “AS motif, ” which stands for “alternative splicing motif”

[0054] As used herein, the term “derived” when referring to a functional sequence motif, such as an SRE or SD “derived from” a certain intron, means that the nucleotide sequence of the motif is obtained, directly or indirectly, from the indicated intron. The sequence motif can be an exact nucleotide copy of the corresponding region in the indicated intron (e.g., a natural intron) , a fragment thereof, or a sequence that has been modified (e.g., by point mutation, truncation, extension, or the introduction of chemically modified bases) yet still retains the splicing-regulatory activity characteristic of that indicated intron. Thus, a sequence motif “derived from” a given intron encompasses both unaltered and engineered variants that originate from, and functionally correspond to, the specified intronic sequence.

[0055] As used herein in connection with a given intron, the term “exon skipping probability” (or “skipping probability, ” or “SkipProb” ) refers to the statistical likelihood that the exon located immediately upstream (5′) of that intron will be omitted from the mature mRNA after splicing. Operationally, it represents the fraction of splicing events in which the spliceosome joins the 3′ end of a preceding exon directly to the 5′ end of the downstream exon, thereby excising the intervening exon together with its flanking introns. A high exon-skipping probability indicates that the upstream exon is frequently excluded, whereas a low probability signifies that the exon is usually retained in the final transcript.

[0056] The term “RNA trans-splicing molecule” or “RTM” refers to an RNA molecule (or its DNA equivalent) designed to facilitate RNA trans-splicing via a tail-end intron. A “tail-end intron” refers to an intron that is present at its 5’ end or 3’ end of an RNA molecule. A tail-end intron situated at the 3′ end is termed a “3′ intron, ” whereas one at the 5′ end is termed a “5′ intron. ”

[0057] The tail-end intron of an RTM provided herein is engineered to include a binding fragment and a trans-splicing fragment. As used herein, the term “binding fragment” refers to the portion or fragment of an engineered intron that complementarily pairs with the target pre-mRNA (or a paired RTM in dual / multiple RTM systems) . The complementary base pairing ensures that the trans-splicing event occurs precisely at the intended site within the target RNA. As used herein, the term “trans-splicing fragment” refers to the portion or fragment of an engineered intron that can engage in and mediate trans-splicing, including, for example, a SD sequence, a SA sequence, or SRE.

[0058] As used herein, a “5′ trans-splicing fragment” means a trans-splicing fragment that provides a functional 5′ splice-donor (SD) capability and is positioned at the 5′ end of the RTM; an RTM carrying such a fragment is referred to herein as a “5′ss RTM” ; similarly, a “3′ trans-splicing fragment” means a trans-splicing fragment that provides a functional 3′ splice-acceptor (SA) capability and is positioned at the 3′ end of the RTM; an RTM carrying such a fragment is referred to herein as a “3′ss RTM. ” Thus, in the context of dual or multiple RTM systems, a 5′ss RTM contains a 5′ trans-splicing fragment, while a 3′ss RTM contains a 3′ trans-splicing fragment; complementary pairing of their binding fragments brings the SD of one RTM into proximity with the SA (or SRE) of its partner, enabling the intended trans-splicing event.

[0059] RTMs can replace defective or undesirable exons in the target pre-mRNA with functional exons carried by the RTM, allowing the production of corrected or modified mature mRNA transcripts. By replacing mutated sequences with wild-type sequences, or replacing the original sequence with modified sequences, RTMs can correct mutations at the RNA level, leading to the production of functional proteins from otherwise defective genes. The portion or fragment of an RTM that will become part of the resulting mRNA after the splicing event is referred to as the “replacement fragment. ” A replacement fragment can include the desired exon sequence, e.g., the “correct sequence” without the to-be-corrected mutation, or the “edited sequence” with the desired modification to the sequence. The replacement fragment can optionally include one more intron embedded within a coding sequence, referred to herein as the “inserted intron. ” The inserted intron can be a natural intron or an engineered intron. In some embodiments (e.g., in the dual / triple RTM systems) , the inserted intron and the tail-end intron can be engineered to have trans-splicing activity by containing a trans-splicing fragment and a binding fragment. The inserted introns in the RTM also retain cis-splicing activity, while being competent to participate in a trans-splicing reaction when a suitable partner intron is available.

[0060] As used herein, an “RNA-stabilizing element” refers to any contiguous nucleotide sequence or higher-order RNA structure that, when embedded in the RTM, promotes the hybridization of the RTM to the target pre-mRNA or other RTMs, increases the chemical or conformational stability of the molecule, enhances resistance to cellular nucleases, promotes correct intramolecular folding, or prolongs nuclear residence time.

[0061] The term “dual RTM system” refers to a coordinated pair of RTMs-a5′ss RTM and a 3′ss RTM-that can each act on the same target pre-mRNA and also partner with each other to achieve trans-splicing (e.g., FIGs. 1-3 and 6-8) . The 5′ss RTM contains a 5′ replacement fragment with an inserted intron, and a 3′ intron, whereas the 3′ss RTM contains a 5′ intron and a 3′ replacement fragment with an inserted intron. The inserted introns within the 5′ and 3′ replacement fragments, as well as the 5′ and 3′ introns can be engineered introns with trans-splicing activity. The introns in 5′ss RTM can include a SD site at their 5′s termini, and the introns in the 3′ss RTM can include an SRE at their 3′s termini. The tail-end introns of the 5′ss and 3′ RTMs are designed to base-pair in reverse-complementary fashion either with the target pre-mRNA, allowing trans-splicing between the 5′ss or 3′ RTMs and the pre-mRNA, or with the inserted introns of the 3′ss and 5′ RTMs, respectively, tethering the two molecules to one another and allowing trans-splicing between the 5′ss and 3′ RTMs. In the later case, when the introns align, the SD of the inserted intron in the 5′ RTM engages the SRE of the 3′ RTM’s 5′ intron, and the SD of the 3′ intron in the 5′ RTM engages the SRE element of the 3′ RTM’s inserted intron, producing trans-splicing reactions that fuse the two exogenous replacement fragments into a continuous sequence.

[0062] A triple RTM system extends this principle to three cooperating RTMs-designated N-ss, M-ss, and C-ss RTMs-that together reconstruct a longer coding region from three separate replacement fragments (e.g., FIGs. 4 and 13) . The N-ss RTM carries the N-terminal replacement fragment containing an inserted intron, and a 3′ intron; the M-ss RTM supplies a Middle replacement fragment and contains two inserted introns plus its own tail-end introns; and the C-ss RTM carries the C-terminal replacement fragment containing an inserted intron, and a 5′ intron. The binding fragments of these introns form a cyclic complementarity pattern-N-ss RTM’s inserted intron with M-ss RTM 5′ intron, M-ss RTM’s first inserted intron with N-ss RTM’s 3′ intron, M-ss RTM’s second inserted intron with C-ss RTM’s 5′ intron, and C-ss RTM’s inserted intron with M-ss RTM’s 3′ intron-so that four trans-splicing reactions can occur and yield an mRNA that incorporates all three exogenous segments contiguously. Target-specific binding fragments on each RTM can anchor the system to the correct pre-mRNA, while the interlocking intron network enforces the proper configuration; the same design logic can be scaled to systems containing four or more RTMs when still larger regions must be replaced or inserted.

[0063] The terms “peptide, ” “polypeptide, ” “protein, ” as used interchangeably herein refer to polymers of amino acids of any length, which can be linear or branched. It can include unnatural or modified amino acids or be interrupted by non-amino acids. A polypeptide, peptide, polypeptide chain, peptide chain, or protein can also be modified with, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, or any other manipulation or modification. A “functional” protein or polypeptide, as used herein, denotes a polypeptide chain-whether naturally occurring, recombinant, or synthetically engineered-that, when expressed in a cell-free system or in a living cell, adopts a conformation capable of performing at least one biological activity characteristic of the native protein family to which it belongs. Such activity may include, by way of example and without limitation, enzymatic catalysis, ligand binding, signal transduction, structural support, transport, or antigen recognition. A protein or polypeptide is considered “functional” if the encoded amino-acid sequence, once translated and (where applicable) post-translationally modified, can be shown-qualitatively or quantitatively-to exhibit the intended biochemical or physiological effect under standard in vitro or in vivo assay conditions.

[0064] The terms “identical, ” percent “identity, ” and their grammatical equivalents as used herein in the context of two or more polynucleotides or polypeptides, refer to two or more sequences or subsequences that are the same or have a specified percentage of nucleotides or amino acid residues that are the same, when compared and aligned (introducing gaps, if necessary) for maximum correspondence, not considering any conservative amino acid substitutions as part of the sequence identity. The percentage identity can be measured using sequence comparison software or algorithms or by visual inspection. Various algorithms and software that can be used to obtain alignments of amino acid or nucleotide sequences are well-known in the art. These include, but are not limited to, BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package, and variants thereof. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for aligning sequences, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared. For example, percent sequence identity values may be generated using the sequence comparison computer program BLAST.

[0065] In some embodiments, two polynucleotides or polypeptides provided herein are substantially identical, meaning they have at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, and in some embodiments at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%nucleotide or amino acid residue identity, when compared and aligned for maximum correspondence, as measured using a sequence comparison algorithm or by visual inspection. In some embodiments, identity exists over a region of the amino acid sequences that is at least about 10 residues, at least about 20 residues, at least about 40-60 residues, at least about 60-80 residues in length or any integral value there between. In some embodiments, identity exists over a longer region than 60-80 residues, such as at least about 80-100 residues, and in some embodiments the sequences are substantially identical over the full length of the sequences being compared, such as the coding region of a target protein or an antibody. In some embodiments, identity exists over a region of the nucleotide sequences that is at least about 10 bases, at least about 20 bases, at least about 40-60 bases, at least about 60-80 bases in length or any integral value there between. In some embodiments, identity exists over a longer region than 60-80 bases, such as at least about 80-100 bases or more, and in some embodiments the sequences are substantially identical over the full length of the sequences being compared, such as a nucleotide sequence encoding a protein of interest.

[0066] As one of skill in the art would understand, as used herein, for the purpose of determining percent sequence identity, a uridine nucleoside in an RNA molecule is considered equivalent to a thymidine nucleoside in a DNA molecule. Therefore, an RNA equivalent can be considered to have 100%sequence identity to a DNA polynucleotide if the RNA equivalent and DNA polynucleotide differ from one another only by the substitution of uridine nucleosides in the RNA equivalent with thymidine nucleosides in the DNA polynucleotide.

[0067] As used herein, terms “complementary, ” “complementarily paired, ” and “complementarity” refer to the relationship between two nucleic acid molecules having the capacity to form hydrogen bond (s) with one another by either traditional Watson-Crick base-paring or other non-traditional types of pairing. The two DNA / RNA strands with complementary sequences bind to form a duplex that follows the Watson–Crick base-pairing rules: A binds to T (U) with two hydrogen bonds; G binds to C with three hydrogen bonds. The degree of complementarity between two nucleotide sequences can be indicated by the percentage of nucleotides in a nucleotide sequence which can form hydrogen bonds (e.g., Watson-Crick base pairing) with a second nucleotide sequence (e.g., about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, and 100%complementary) . Two nucleotide sequences are “perfectly complementary” or “100%complementary” if all the contiguous nucleotides of a nucleotide sequence will hydrogen bond with the same number of contiguous nucleotides in a second nucleotide sequence. Two nucleotide sequences are “substantially complementary” if the degree of complementarity between the two nucleotide sequences is at least 60% (e.g., at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) over a region of at least 8 nucleotides (e.g., at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least 50, or more nucleotides) , or if the two nucleotide sequences hybridize under at least moderate, or, in some embodiments high, stringency conditions. Exemplary moderate stringency conditions include overnight incubation at 37℃ in a solution comprising 20%formamide, 5%SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate) , 50 mM sodium phosphate (pH 7.6) , 5x Denhardt’s solution, 10%dextran sulfate, and 20 mg / ml denatured sheared salmon sperm DNA, followed by washing the filters in 1*SSC at about 37-50℃, or substantially similar conditions, e.g., the moderately stringent conditions described in Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 4th edition (June 15, 2012) . High stringency conditions are conditions that use, for example (1) low ionic strength and high temperature for washing, such as 0.015 M sodium chloride / 0.0015 M sodium citrate / 0.1%sodium dodecyl sulfate (SDS) at 50℃, (2) employ a denaturing agent during hybridization, such as formamide, for example, 50% (v / v) formamide with 0.1%bovine serum albumin (BSA)  / 0.1%Ficoll / 0.1%polyvinylpyrrolidone (PVP)  / 50 mM sodium phosphate buffer at pH 6.5 with 750 mM sodium chloride and 75 mM sodium citrate at 42℃, or (3) employ 50%formamide, 5xSSC (0.75 M NaCl, 0.075 M sodium citrate) , 50 mM sodium phosphate (pH 6.8) , 0.1%sodium pyrophosphate, 5x Denhardt’s solution, sonicated salmon sperm DNA (50 pg / ml) , 0.1%SDS, and 10%dextran sulfate at 42℃, with washes at (i) 42℃ in 0.2*SSC, (ii) 55℃ in 50%formamide, and (iii) 55℃ in 0.1*SSC (optionally in combination with EDTA) . Additional details and an explanation of stringency of hybridization reactions are provided in, e.g., Sambrook, supra, and Ausubel et al. ., eds., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 5th ed., John Wiley &Sons, Inc., Hoboken, N. J. (2002) .

[0068] As is understood in the art, a nucleic acid strand is inherently directional, as the carbon atoms in the sugar ring are numbered from 1’ to 5’ . The “5’ end” or “5 prime end” has a free hydroxyl (or phosphate) on a 5’ carbon and the “3’ end” or “3 prime end” has a free hydroxyl (or phosphate) on a 3’ carbon. As used herein and understood in the art, a nucleic acid having certain sequence elements “from 5’ to 3’ ” means that these sequence elements are arranged linearly from the 5’ end to the 3’ end of the nucleic acid. A “reverse” sequence when used in connection with a nucleic acid refers to the sequence of nucleotide bases in the opposite order of the original sequence. The term “reverse complementary” refers to the sequence of nucleotides that is complementary to the reverse of a given nucleotide sequence. As used herein, “reverse complementarily paired” nucleic acids refer to a pair of two nucleic acids that are reverse complementary to each other.

[0069] The term “hybridization” or “hybridized” when referring to nucleotide sequences is the association formed between and / or among sequences having complementarity.

[0070] The term “homology” refers to the percent of identity between the nucleic acid residues of two polynucleotides or the amino acid residues of two polypeptides. The correspondence between one sequence and another can be determined by techniques known in the art. For example, homology can be determined by a direct comparison of the sequence information between two polypeptides by aligning the sequence information and using readily available computer programs. Two polynucleotide (e.g., DNA) or two polypeptide sequences are “substantially homologous” to each other when at least about 80%, preferably at least about 90%, and most preferably at least about 95%of the nucleotides, or amino acids, respectively match over a defined length of the molecules, as determined using the methods above.

[0071] The term “variant” as used herein in relation to a nucleic acid or a protein with particular sequence features (the “reference nucleic acid” or “reference protein” ) refer to a different nucleic acid or protein having one or more (such as, for example, about 1 to about 25, about 1 to about 20, about 1 to about 15, about 1 to about 10, or about 1 to about 5) nucleotide or amino acid substitutions, deletions, and / or additions as compared to the reference nucleic acid or reference protein. In some embodiments, a nucleic acid variant or a protein variant can have at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity as compared to the reference nucleic acid or reference protein. A variant of a nucleic acid or a protein typically maintains the basic structural and functional features of the reference nucleic acid or reference protein.

[0072] As used herein, the term “gene” refers to a region of DNA that encodes a protein. A gene can include regulatory regions and a protein-coding region. In some embodiments, a gene includes two or more introns and three or more exons, wherein each intron forms an intervening sequence between two exons. As used herein, the term “RNA equivalent” of a gene refers to an RNA polynucleotide that corresponds to a DNA polynucleotide that encodes the gene, such as an RNA transcript obtainable by transcription of a DNA polynucleotide that contains the gene.

[0073] As used herein, the term “encode” and its grammatical equivalents refer to the inherent property of specific sequences of nucleotides in a polynucleotide or a nucleic acid, such as a gene, a cDNA, or an mRNA, to serve as templates for synthesis of other polymers and macromolecules in biological processes having either a defined sequence of nucleotides (i.e., rRNA, tRNA and mRNA) or a defined sequence of amino acids and the biological properties resulting therefrom. Thus, a gene encodes a protein if transcription and translation of mRNA corresponding to that gene produces the protein. Unless otherwise specified, a “nucleotide sequence encoding an amino acid sequence” includes all nucleotide sequences that are degenerate versions of each other and that encode the same amino acid sequence. Nucleotide sequences that encode proteins and RNA can include introns.

[0074] As used herein, the term “endogenous” describes a molecule (e.g., a polypeptide, nucleic acid, or cofactor) that is found naturally in a particular organism (e.g., a human) or in a particular location within an organism (e.g., an organ, a tissue, or a cell, such as a human cell) .

[0075] As used herein, the term “therapeutic protein” refers to a protein known to or designed to have a therapeutic effect on a target subject (e.g., a mammal or a human) . Therapeutic proteins can be used to treat various diseases or conditions in the target subject. Therapeutic proteins can be naturally occurring proteins, or they can be artificially produced through genetic engineering techniques.

[0076] As used herein, the term “mutation” and its grammatical equivalents refer to a change in the nucleotide sequence of a gene or a change in the polypeptide sequence of a protein. Mutations in a gene or protein can occur naturally as a result of, for example, errors in DNA replication, DNA repair, irradiation, and exposure to carcinogens, or mutations can be induced as a result of administration of a transgene expressing a mutant gene. Mutations can result from single or multiple nucleotide insertions, deletions, or substitutions.

[0077] As used herein, the term “promoter” is a nucleic acid sequence enabling the initiation of the transcription of a gene in a messenger RNA, such transcription being initiated with the binding of an RNA polymerase on or nearby the promoter. Examples of other transcription regulatory elements are described, for example, in Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990) . The promoter is a constitutive promoter or an inducible promoter. Promoters can be cell-type specific or tissue specific, meaning that the promoter preferably, including exclusively, initiates gene transcription within particular types of cells or tissues of an organism. The selective activity of the promoter ensures that the associated gene is expressed only in the specific cells or tissues. A promoter can comprise a core promoter and an enhancer region.

[0078] As used herein, a “core promoter” refers to the nucleic acid segment (e.g., 50–100 bp) that provides the binding site for RNA polymerase and other transcriptional factors to initiate the transcription. Core promoters can contain the transcription starting site. A core promoter is the basal component of a promoter, or a promoter region, which can also comprise an enhancer region.

[0079] As used herein, an “enhancer” or “enhancer element” is regulatory nucleic acid sequence that can be located either adjacent to or at a considerable distance from the core promoter. An “enhancer region” can be a continuous nucleic acid sequence that contains one or more enhancer elements. An enhancer region can optionally contain spacer sequence between enhancer elements.

[0080] As used herein with reference to sequence elements in nucleic acid molecules, the term “operably linked” means that these sequence elements (e.g., a promoter and a coding sequence) are functionally related to each other. For example, a promoter is operably linked to a transcribable polynucleotide molecule if the promoter modulates transcription of the transcribable polynucleotide molecule of interest in a cell.

[0081] The term “codon” as used herein refers to any group of three consecutive nucleotide bases in a given messenger RNA molecule, or coding strand of DNA, that specifies a particular amino acid or a starting or stopping signal for translation. The term codon also refers to base triplets in a DNA strand.

[0082] As used herein, “codon optimization” refers a process of modifying a nucleic acid sequence in accordance with the principle that the frequency of occurrence of synonymous codons (e.g., codons that code for the same amino acid) in coding DNA is biased in different species. Such codon degeneracy allows an identical polypeptide to be encoded by a variety of nucleotide sequences. Sequences modified in this way are referred to herein as “codon-optimized. ” This process may be performed on any of the sequences described in this specification to enhance expression or stability. Codon optimization can be performed in a manner known in the art, such as that described in, e.g., U.S. Patent Nos. 7,561,972, 7,561,973, and 7,888,112, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. For example, the sequence surrounding the translational start site can be converted to a consensus Kozak sequence according to known methods. See, e.g., Kozak et al.., Nucleic Acids Res. 15 (20) : 8125-8148, incorporated herein by reference in its entirety.

[0083] As used herein, the term “vector” refers to a vehicle for delivering a gene of interest into a host cell. A vector can be a viral vector, such as an adenoviral vector, an adeno-associated viral vector, a lentiviral vector, and the like. A vector can also be a non-viral vector, such as a lipid-based nanoparticle, a polymer nanoparticle, a naked nucleic acid, and the like. When the gene of interest encodes an exogenous protein to be expressed in a prokaryote or eukaryote cell, the vector can be referred to as an “expression vector. ” Examples of such expression vectors are disclosed in, e.g., WO 1994 / 11026, the disclosure of which is incorporated herein by reference. Expression vectors described herein contain a polynucleotide sequence as well as, e.g., additional sequence elements used for the expression of proteins and / or the integration of these polynucleotide sequences into the genome of a mammalian cell. Certain vectors that can be used for the expression of transgenes described herein include plasmids that contain regulatory sequences, such as promoter and enhancer regions, which direct gene transcription. Other useful vectors for expression of transgenes contain polynucleotide sequences that enhance the rate of translation of these genes or improve the stability or nuclear export of the mRNA that results from gene transcription. These sequence elements include, e.g., 5’ and 3’ untranslated regions, an internal ribosomal entry site (IRES) , and polyadenylation signal site to direct efficient transcription of the gene carried on the expression vector. The expression vectors described herein can also contain a polynucleotide encoding a marker for selection of cells that contain such a vector. Examples of a suitable marker include genes that encode resistance to antibiotics, such as ampicillin, chloramphenicol, kanamycin, or nourseothricin.

[0084] The terms “transferring, ” “transfection, ” “transformation, ” and “transduction” are used interchangeably herein and refer to the introduction of one or more exogenous polynucleotides into a host cell by using physical or chemical methods.

[0085] As used herein, the term “pharmaceutical composition” refers to a mixture containing a therapeutic agent to be administered to a subject, such as a mammal, e.g., a human, in order to prevent, treat or control a particular disease or condition affecting or that may affect the subject.

[0086] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable” refers to those compounds, materials, compositions and / or dosage forms, which are suitable for contact with the tissues of a subject, such as a mammal (e.g., a human) without excessive toxicity, irritation, allergic response and other problem complications commensurate with a reasonable benefit / risk ratio.

[0087] As used herein in connection with a disease or a condition, or a subject having a disease or a condition (e.g., muscular dystrophy) , the term “treat” refer to an action that prevent or slow down (lessen) an undesired physiological change or disorder, that suppresses, eliminates, reduces, and / or ameliorates a symptom, the severity of the symptom, and / or the frequency of the symptom associated with the disease or condition being treated. Beneficial or desired clinical results include, but are not limited to, alleviation of symptoms, diminishment of extent of disease, stabilized (i.e., not worsening) state of disease, delay or slowing of disease progression, amelioration or palliation of the disease state, and remission (whether partial or total) , whether detectable or undetectable.

[0088] As used herein, the term “disease or disorder associated with a gene mutation” refers to a medical condition that arises due to alterations in the DNA sequence of a specific gene. These mutations can disrupt the normal function of the encoded protein, leading to a variety of physiological and biochemical abnormalities that manifest as disease. The mutations can be, for example, point mutations, insertions and deletions (indels) , copy number variations (CNVs) , and chromosomal rearrangements. The mutations can lead to a reduced or abolished function of the protein (loss of function mutations) , a new or abnormal function of the protein (gain of function mutations) , interference with normal function of the wild-type protein (dominant negative mutation) , or haploinsufficiency (i.e., a functional copy of the gene which is insufficient to maintain normal function) .

[0089] The term “subject” as used herein refers to any animal (e.g., a mammal) , including, but not limited to, humans, non-human primates, canines, felines, rodents, and the like, which is to be the recipient of a particular treatment. A subject can be a human. A subject can have a particular disease or condition.

[0090] The term “administer” and its grammatical equivalents as used herein refer to the act of delivering, or causing to be delivered, a therapeutic or a pharmaceutical composition to the body of a subject by a method described herein or otherwise known in the art. The therapeutic can be any compound, for example, a transgene, a vector, a peptide, or a virus. Administering a therapeutic or a pharmaceutical composition includes prescribing a therapeutic or a pharmaceutical composition to be delivered into the body of a subject. Exemplary forms of administration include oral dosage forms, such as tablets, capsules, syrups, suspensions; injectable dosage forms, such as intravenous (IV) , intramuscular (IM) , or intraperitoneal (IP) ; transdermal dosage forms, including creams, jellies, powders, or patches; buccal dosage forms; inhalation powders, sprays, suspensions, and rectal suppositories.

[0091] The terms “effective amount, ” “therapeutically effective amount, ” and their grammatical equivalents as used herein refer to the administration of an agent to a subject, either alone or as a part of a pharmaceutical composition and either in a single dose or as part of a series of doses, in an amount that is capable of having any detectable, positive effect on any symptom, aspect, or characteristics of a disease, disorder or condition when administered to the subject. The therapeutically effective amount can be ascertained by measuring relevant physiological effects. The exact amount required varies from subject to subject, depending on the age, weight, and general condition of the subject, the severity of the condition being treated, the judgment of the clinician, and the like. An appropriate “effective amount” in any individual case can be determined by one of ordinary skill in the art using routine experimentation.

[0092] Ranges: throughout this disclosure, various aspects of the invention can be presented in a range format. It should be understood that the description in range format is merely for convenience and brevity and should not be construed as an inflexible limitation on the scope of the invention. Accordingly, the description of a range should be considered to have specifically disclosed all the possible subranges as well as individual numerical values within that range. For example, description of a range such as from 1 to 6 should be considered to have specifically disclosed subranges such as from 1 to 3, from 1 to 4, from 1 to 5, from 2 to 4, from 2 to 6, from 3 to 6 etc., as well as individual numbers within that range, for example, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, and 6. This applies regardless of the breadth of the range.

[0093] Nomenclature for nucleotides, nucleic acids, nucleosides, and amino acids used herein is consistent with International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) standards (see, e.g., bioinformatics. org / smsylupac. html) . Exemplary genes and polypeptides are described herein with reference to GenBank numbers, GI numbers and / or SEQ ID NOS. It is understood that one skilled in the art can readily identify homologous sequences by reference to sequence sources, including but not limited to Uniprot (https:  / / www. uniprot. org / ) , GenBank (ncbi. nlm. nih. gov / genbank / ) and EMBL (embl. org / ) .

[0094] Suitable methods and materials for the practice and / or testing of embodiments of the disclosure are described below. Such methods and materials are illustrative only and are not intended to be limiting. Other methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used. For example, conventional methods well known in the art to which the disclosure pertains are described in various general and more specific references, including, for example, Sambrook et al.., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al. ., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al. ., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates, 1992 (and Supplements to 2000) ; Ausubel et al. ., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 4th ed., Wiley &Sons, 1999; the disclosures of which are incorporated in their entireties herein by reference. 6.1 RTM systems

[0095] Provided herein are novel RNA Trans-Splicing Molecules (RTMs) with enhanced efficiency and applicability. The RTM molecules comprise a replacement fragment and a tail-end intron, wherein the tail-end intron is an engineered intron comprising a trans-splicing fragment and a binding fragment, and wherein the replacement fragment comprises a coding sequence of the target mRNA. In some embodiments, the RTM is a 3’ss RTM. The 3’ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a 5’ intron and a replacement fragment, wherein the 5’ intron comprises, from 5’ to 3’ , a binding fragment and a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE. In some embodiments, the RTM is a 5’ss RTM. The 5’ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a replacement fragment and a 3’ intron, wherein the 3’ intron comprises, from 5’ to 3’ , a 5’ trans-splicing fragment containing a splice donor (SD) , and a binding fragment. In some embodiments, the RTM contains a potent SRE identified by methods disclosed herein (e.g., Section 5.1.1) .

[0096] In some embodiments, the RTMs provided herein further includes an inserted intron in its replacement fragment. The inserted intron can be a natural intron. The inserted intron can be an engineered intron. Accordingly, in some embodiments, the RTM comprises two engineered intron sequences: 1) the inserted intron, which is embedded in the coding sequence of the replacement fragment, and 2) the tail-end intron that is designed to pair with target pre-mRNA and induce a trans-splicing event between the RTM and the target pre-mRNA. The trans-splicing efficiency of the RTMs can be further enhanced. In some embodiments, the trans-splicing efficiency can be enhanced by optimizing the lengths of binding fragment of the RTMs that complementarily pairs with the target pre-mRNA. In some embodiments, the trans-splicing efficiency can be enhanced by introducing additional cis-elements into the RTM, such as an RNA stabilizing element (e.g., G-quadruplex (G4) motif or a kissing-loop-like structure) . 6.1.1 Methods of SRE Screening

[0097] In some embodiments, RTMs provided herein are 3’ss RTMs comprising, from 5’ to 3’ , a replacement fragment and a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE that is identified by methods disclosed herein.

[0098] It is disclosed herein that an intron’s propensity to be efficiently removed by the spliceosome correlates with how frequently the exon immediately upstream of that intron is skipped in naturally occurring transcripts. This previously unreported link allows splicing efficiency to be quantitatively inferred from the exon-skipping probability (SkipProb) , namely, the proportion of protein-coding transcripts of a given gene that lack the exon situated directly 5′ to the intron in question. A transcript missing that exon is herein referred to as a “skipped transcript. ”

[0099] Efficient RNA trans-splicing requires a 3′ trans-splicing element that harbors a highly active SRE. Provided herein are methods to identify candidate SREs from the introns with high SkipProb. Methods of validating such SREs in cell-based reporter assays that measure trans-splicing efficiency are also provided.

[0100] Step 1: Identification of Natural Introns with High-Probability Exon-Skipping

[0101] 1. Reference annotation: All annotated protein-coding transcripts and their exon–intron coordinates are retrieved from public genome databases (e.g., Ensembl GRCh38) .

[0102] 2. Intron indexing: Each intron is assigned a unique identifier composed of the gene symbol and intron ordinal (e.g., COL4A5-int25) .

[0103] 3. Calculation of Exon-Skipping Probability:

[0104] For every indexed intron, obtain:

[0105] Total transcripts (T) : Number of all protein-coding isoforms of the gene. For each intron, only transcripts whose transcription starting sites are upstream of the skipped exon are included, ensuring that the skipped exon is located within the transcribed region.

[0106] Skipped transcripts (S) : Number of isoforms that do not contain the exon immediately 5′ to the intron.

[0107] SkipProb: Compute S / T. A SkipProb of 0.70, for example, means 70 %of the gene’s protein-coding isoforms skip that exon.

[0108] 4. Selection Criteria: The following thresholds can be followed:

[0109] Tier I (very high activity) : SkipProb ≥ 0.85

[0110] Tier II (high activity) : 0.60 ≤ SkipProb < 0.85

[0111] Tier III (moderate activity) : 0.40 ≤ SkipProb < 0.60

[0112] 5. Quality Checks:

[0113] Candidate introns are screened to confirm: (1) presence of canonical or near-canonical SREs (including branch-point, polypyrimidine-tract, and splice-acceptor motifs) ; absence of secondary structures predicted to sequester those motifs; (2) optional cross-species conservation of splice-site elements.

[0114] Step 2: Experimental Validation

[0115] Construction of Reporter RTMs

[0116] Each candidate SRE is cloned immediately downstream of a 5′ replacement fragment to generate the 3’ trans-splicing fragment of a 3′-splice-site RTM (3′ss-RTM) . A complementary 5′-splice-site RTM (5′ss-RTM) harboring the cognate donor site and binding fragment is synthesized in parallel.

[0117] Cell-Based Assay

[0118] Cells (e.g., HEK293 cells) are co-transfected with the 5′ss-RTM and each 3′ss-RTM containing a candidate SRE. Cells are harvested 48 h post-transfection and subjected to flow cytometry analysis. Successful trans-splicing restores full-length reporter protein (e.g., EGFP) and provides a fluorescent read-out of editing efficiency.

[0119] These methods provide an effective and efficient way of identifying potent SREs. The transcriptome-wide scope captures rare but potent SREs overlooked by motif-only approaches; quantitative linkage between SkipProb and trans-splicing efficiency allows rational SRE ranking; modular assay format permits rapid head-to-head comparison of hundreds of SREs in a single high throughput screen; and integration with downstream RTM engineering workflows ensures that high-activity introns translate directly into increased RNA-editing yields.

[0120] Application of the above pipeline yielded illustrative SREs, provided in Example 5 below (e.g., CD38 intron 3 (SkipProb = 0.80) , COL4A5-int25 (SkipProb = 0.88) , and MRPL48-int4 (SkipProb = 0.92) . A person of ordinary skill in the art can identify additional highly potent SRE using methods disclosed herein.

[0121] In some embodiments, SRE provided herein is derived from an intron having a SkipProb of at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, or at least 90%. In some embodiments, the SRE is derived from an intron having a SkipProb of at least 50%. In some embodiments, the SRE is derived from an intron having a SkipProb of at least 60%. In some embodiments, the SRE is derived from an intron having a SkipProb of at least 70%. In some embodiments, the SRE is derived from an intron having a SkipProb of at least 75%. In some embodiments, the SRE is derived from an intron having a SkipProb of at least 80%. In some embodiments, the SRE is derived from an intron having a SkipProb of at least 85%. In some embodiments, the SRE is derived from an intron having a SkipProb of at least 90%.

[0122] For example, in some embodiments, SREs provided herein are derived from one or more the following introns: AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, and mouse Col4a5 Intron 33. In some embodiments, provided herein are RTMs comprising a 3’ trans-splicing fragment having at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37, 40, 41, 42, 47, 50, 73, 74, 77, 97, 105, 107, 113, 115, 131, 133, and 135.

[0123] In some embodiments, the SRE is derived from AZIN2 Intron 3. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 113.

[0124] In some embodiments, the SRE is derived from BRCA1 Intron 13. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 47.

[0125] In some embodiments, the SRE is derived from CD209 Intron 3. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 42.

[0126] In some embodiments, the SRE is derived from CD38 Intron 3. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 41.

[0127] In some embodiments, the SRE is derived from COL4A5 Intron 25. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 131.

[0128] In some embodiments, the SRE is derived from COL4A5 Intron 32. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 77.

[0129] In some embodiments, the SRE is derived from COL4A5 Intron 39.

[0130] In some embodiments, the SRE is derived from COL4A5 Intron 35. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 133.

[0131] In some embodiments, the SRE is derived from IFT122 Intron 8. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 74.

[0132] In some embodiments, the SRE is derived from KCNIP2 Intron 5.

[0133] In some embodiments, the SRE is derived from LCN10 Intron 2.

[0134] In some embodiments, the SRE is derived from LINC02889 Intron 8. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 97.

[0135] In some embodiments, the SRE is derived from MPHOSPH6 Intron 2.

[0136] In some embodiments, the SRE is derived from MRPL48 Intron 4. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 37.

[0137] In some embodiments, the SRE is derived from NMNAT3 Intron 5. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 107.

[0138] In some embodiments, the SRE is derived from NSF Intron 2. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 73.

[0139] In some embodiments, the SRE is derived from SHOC2 Intron 2. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 115.

[0140] In some embodiments, the SRE is derived from TBK1 Intron 14. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 50. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 105.

[0141] In some embodiments, the SRE is derived from ZNF346 Intron 2. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 40.

[0142] In some embodiments, the SRE is derived from mouse Col4a5 Intron 30. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 135.

[0143] In some embodiments, the SRE is derived from mouse Col4a5 Intron 33. 6.1.2 Engineered RTMs

[0144] In some embodiments, provided herein is an engineered RTM comprising: 1) a tail-end intron and 2) a replacement fragment; wherein the tail-end intron has a binding fragment that reverse complementarily pairs with a target pre-mRNA, and wherein the replacement fragment comprises a coding sequence of the target mRNA.

[0145] In some embodiments, the replacement fragment comprises an inserted intron embedded in the coding sequence, namely, situated between two exon sequences. The inserted intron can be a natural intron. The inserted intron can be an engineered intron. In some embodiments, the replacement fragment comprises two or more inserted introns, which can independently be natural intron (s) or engineered intron (s) .

[0146] In some embodiments, provided herein are 3’ss RTMs, comprising, from 5’ to 3’ , a 5’ intron and a replacement fragment. The 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment and a binding fragment. The 3’ trans-splicing fragments of the 3’ss RTMs comprises an SRE. In some embodiments, provided herein are 3’ss RTMs, comprising, from 5’ to 3’ , a binding fragment, a 3’ trans-splicing fragment, and a replacement fragment.

[0147] In some embodiments, the engineered 5’ intron in the 3’ss RTMs provided herein contain high-activity SREs disclosed herein or identified using methods described herein. In some embodiments, the SREs are screened based on SkipProb in the human transcriptome. By integrating efficient SREs, the splicing efficiency of RTMs can be enhanced. In some embodiments, the SRE is derived from a natural intron having a SkipProb of at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, or at least 90%. In some embodiments, the SRE is derived from an intron having a SkipProb of at least 50%. In some embodiments, the SRE is derived from an intron having a SkipProb of at least 60%. In some embodiments, the SRE is derived from an intron having a SkipProb of at least 70%. In some embodiments, the SRE is derived from an intron having a SkipProb of at least 75%. In some embodiments, the SRE is derived from an intron having a SkipProb of at least 80%. In some embodiments, the SRE is derived from an intron having a SkipProb of at least 85%. In some embodiments, the SRE is derived from an intron having a SkipProb of at least 90%.

[0148] In some embodiments, the engineered 5’ intron in the 3’ss RTMs provided herein comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37, 40, 41, 42, 47, 50, 73, 74, 77, 97, 105, 107, 113, 115, 131, 133, and 135.

[0149] In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from AZIN2 Intron 3. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 113. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from BRCA1 Intron 13. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 47. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from CD209 Intron 3. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 42. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from CD38 Intron 3. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from COL4A5 Intron 25. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 131. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from COL4A5 Intron 32. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 77. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from COL4A5 Intron 39. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from COL4A5 Intron 35. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 133. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from IFT122 Intron 8. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 74. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from KCNIP2 Intron 5. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from LCN10 Intron 2. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from LINC02889 Intron 8. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 97. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from MPHOSPH6 Intron 2. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from MRPL48 Intron 4. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 37. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from NMNAT3 Intron 5. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 107. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from NSF Intron 2. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100% sequence identity with SEQ ID NO: 73. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from SHOC2 Intron 2. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 115. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from TBK1 Intron 14. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 50. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 105. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from ZNF346 Intron 2. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 40. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from mouse Col4a5 Intron 30. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 135. In some embodiments, the engineered 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from mouse Col4a5 Intron 33.

[0150] In some embodiments, provided herein are 5’ss RTMs, comprising, from 5’ to 3’ , a replacement fragment and a 3’ intron. The 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment and a binding fragment. The 5’ trans-splicing fragments comprises the 5’s splice donor site (e.g., the GU dinucleotide, or the AU dinucleotide) . In some embodiments, provided herein are 5’ss RTMs, comprising, from 5’ to 3’ , a replacement fragment, a 5’ trans-splicing fragment, and a binding fragment.

[0151] In some embodiments, the engineered 3’ intron in the 5’ss RTMs provided herein comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from ADGRG1 Intron 8, AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 66-72, 76, 101, 109, 111, 117, 119, 132, 134, and 136.

[0152] In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from ADGRG1 Intron 8. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from AZIN2 Intron 3. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 117. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from BRCA1 Intron 13. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from CD209 Intron 3. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from CD38 Intron 3. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 70. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from COL4A5 Intron 25. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 66. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 69. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from COL4A5 Intron 32. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 132. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from COL4A5 Intron 35. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 76. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from COL4A5 Intron 39. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 134. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from IFT122 Intron 8. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from KCNIP2 Intron 5. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from LCN10 Intron 2. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from LINC02889 Intron 8. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 101. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from MPHOSPH6 Intron 2. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from MRPL48 Intron 4. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from NMNAT3 Intron 5. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 111. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from NSF Intron 2. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 71. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from SHOC2 Intron 2. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 119. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from TBK1 Intron 14. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 68. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 109. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from ZNF346 Intron 2. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 67. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from mouse Col4a5 Intron 30. In some embodiments, the engineered 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from mouse Col4a5 Intron 33. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 136.

[0153] As provided herein, the trans-splicing efficient of RTMs can also be enhanced by optimizing the length of the binding pair between the engineered tail-end intron and the target pre-mRNA. Without being bound by theory, the increase trans-splicing efficiency can be at least partly due to increased binding stability between the binding fragment of the RTMs and the target pre-mRNA. In some embodiments, the length for the reverse complementarily paired binding fragment and target pre-mRNA ranges from 30 to 1500 base pairs (bp) . In some embodiments, the length for the reverse complementarily paired binding fragment and target pre-mRNA ranges from 50 to 1000 bp, from 100 to 900 bp, from 200 to 900 bp, from 300 to 800 bp, from 400 to 700 bp, from 500 to 700 bp, from 150 to 600 bp, from 200 to 600 bp, from 300 to 600 bp, from 400 to 600 bp, from 500 to 600 bp, or from 180 to 300 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 50 to 1000 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 100 to 900 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 200 to 900 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 300 to 800 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 400 to 700 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 500 to 700 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 150 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 200 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 300 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 400 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 500 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 180 to 300 bp. In some embodiments, the length for the reverse complementarily paired binding fragment and target pre-mRNA is about 150 bp, about 200 bp, about 300 bp, about 400 bp, about 500 bp, about 600 bp, about 700 bp, about 800 bp, or about 900 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 150 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 300 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 400 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 500 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 600 bp.

[0154] The RTMs provided herein can be further optimized by incorporating an RNA-stabilizing element positioned between the binding fragment and the trans-splicing fragment. In some embodiments, provided herein are 3’ss RTMs, comprising, from 5’ to 3’ , a binding fragment, an RNA-stabilizing element, a 3’ trans-splicing fragment, and a replacement fragment. In some embodiments, provided herein are 5’ss RTMs, comprising, from 5’ to 3’ , a replacement fragment, a 5’ trans-splicing fragment, an RNA-stabilizing element, and a binding fragment.

[0155] Suitable RNA-stabilizing elements include, without limitation, G-quadruplex (G4) motifs formed by stacked guanine tetrads; kissing-loop-like duplexes in which two complementary hairpin loops base-pair to create a compact tertiary interaction; canonical stem–loop or hairpin structures (e.g., GC-rich clamps or thermodynamically stable tetraloops such as GNRA or UNCG) ; pseudoknots, including H-type and quasi-knot architectures; RNA triplex motifs comprising Hoogsteen base-paired third strands; tRNA-like scaffolds derived from plant viral 3′ termini; internal ribosome-entry site (IRES) core domains that adopt stable multi-stem conformations; self-dimerizing C-rich i-motifs; stabilizing aptamer folds (e.g., theophylline-binding or spinach aptamers) with or without cognate ligands; ribozyme core folds rendered catalytically inactive but conformationally rigid (e.g., HDV or hammerhead cores) ; and synthetic lock-and-key modules engineered from complementary sense / antisense micro-domains that anneal intramolecularly. The stabilizing element can be flanked by short linker sequences (1–10 nt) to avoid interfering with splice-site recognition and may itself carry chemical modifications-such as 2′-O-methyl, 2′-fluoro, phosphorothioate, or locked nucleic acid (LNA) residues-that further increase nuclease resistance without disrupting the desired secondary or tertiary structure. In some embodiments, the RTM further comprises a G4 motif (e.g., SEQ ID NO: 64) . In some embodiments, the RTM further comprises kissing-loop-like sequence (e.g., SEQ ID NO: 65 &137) .

[0156] The replacement fragment of the RTMs provided herein comprises a coding sequence. In some embodiments, the RTM is a 5’ss RTM, and upon trans-splicing, the replacement fragment, which is designed to carry a mutation-free sequence (correct sequence) can be seamlessly linked to the downstream exons in the target pre-mRNA, with the resulting mRNA contains the correct sequence in place of the original mutant region while leaving all downstream native exons intact. Translation of this edited transcript therefore yields a full-length, functional protein free of the mutation in the target pre-mRNA. In some embodiments, the RTM is a 3’ss RTM, and upon trans-splicing, the replacement fragment, which is designed to carry a mutation-free sequence (correct sequence) can be seamlessly linked to the upstream exons in the target pre-mRNA, with the resulting mRNA contains the correct sequence in place of the original mutant region while leaving all upstream native exons intact. Translation of this edited transcript therefore yields a full-length, functional protein free of the mutation in the target pre-mRNA. In some embodiments, the replacement fragment carries a sequence with desired modification (modified sequence) , and the trans-splicing thus generates mRNA containing the desired modification. In some embodiments, the replacement fragment can further include one or more inserted introns, which can be excised by cis-splicing. In some embodiments, the inserted intron (s) can be natural intron (s) . In some embodiments, the inserted intron (s) can be engineered intron (s) .

[0157] In some embodiments, the replacement fragment of a 5’ss RTM can further include 5’ untranslated region (5’ UTR) . The 5′ UTR can be selected or engineered to contain one or more regulatory features that influence translation initiation, transcript stability, nuclear export, or sub-cellular localization. Representative features include: (i) a canonical or optimized Kozak consensus and related translation-initiator sequence (TISU) to improve ribosome scanning and start-codon recognition; (ii) internal ribosome-entry sites (IRESs) or other cap-independent translation-enhancer elements that permit efficient initiation under stress or in cap-deficient contexts; (iii) strategically placed up-stream open-reading frames (uORFs) or attenuator peptides that fine-tune downstream ORF translation; (iv) an optional leader intron whose splicing is coupled to nuclear export and cap-binding-protein exchange; (v) RNA-folding motifs-such as stable GC-rich stem–loops, G-quadruplexes, or engineered pseudoknots-that modulate ribosome scanning speed or protect the 5′ end from nucleases; and (vi) ligand-responsive riboswitches or aptamers that enable small-molecule control of translation. Any of these structures can be used singly or in combination and may incorporate chemically modified bases (e.g., 2′-O-methyl, ψ-uridine) to enhance stability or reduce innate-immune activation. Certain elements-such as riboswitches, aptamers, G-quadruplexes, and other secondary structures-are functional whether placed in the 5′ UTR or the 3′ UTR, giving designers additional flexibility.

[0158] In some embodiments, the replacement fragment of a 3′ ss RTM can further comprise a 3′ untranslated region (3′ UTR) . The 3′ UTR can likewise be configured with regulatory elements that govern transcript half-life, localization, and translational efficiency. Exemplary elements include: (i) canonical or alternative polyadenylation signals flanked by upstream and downstream auxiliary motifs that dictate cleavage and tail addition; (ii) AU-rich or GU-rich elements, cytoplasmic polyadenylation elements (CPEs) , or other binding sites for RNA-stability factors such as HuR, TTP, or CPEB; (iii) microRNA-response elements (MREs) that allow cell-type-specific repression by endogenous miRNAs; (iv) clusters of m6A (N6-methyladenosine) or other epitranscriptomic marks read by YTH-family proteins to influence decay or translation; (v) well-characterized zip-code or Staufen-binding sites that direct the mRNA to particular sub-cellular locales (e.g., leading-edge lamellipodia, neuronal dendrites) ; (vi) cap-independent translation enhancers positioned at the 3′ end (e.g., tombusvirus-or BYDV-derived 3′ CITEs) that recruit initiation factors in trans; (vii) SECIS elements that permit selenocysteine incorporation; and (viii) ligand-responsive aptamers, riboswitches, or self-cleaving aptazymes that modulate stability or translation in response to small molecules. As noted above, structures such as aptamers, riboswitches, G-quadruplexes, and other compact tertiary folds can be functional in either the 5′ UTR or the 3′ UTR, and their placement can be tailored to achieve the desired regulatory outcome.

[0159] As shown in FIG. 1, for illustrative purposes, assuming there is a mutation in the range from Exon X+1 to Exon Y, leading to dysfunction in its mature mRNA, such mutation can be corrected using the RTMs provided herein. In some embodiments, provided herein are 5’ splicing site RTMs (5’ss RTMs) , which comprise 1) a replacement fragment comprising a 5’ fragment of the coding sequence (CDS) starting from the ATG codon to Exon X, with inserted Intron X (the immediate non-coding sequence 5’ to the mutant exons) , and the fragment containing Exon X+1 to Exon Y, which has the correct sequence (i.e., without the mutation in the pre-mRNA) ; and 2) an engineered tail-end (3’ end) Intron Y that comprises a trans-splicing fragment (i.e., the SD site) and a binding fragment that reverse complementarily pairs with the pre-mRNA at the 5’ end of its Intron Y (or in other words, the intron sequence to the 3’ end of Exon Y of the pre-mRNA) . The replacement fragment of the 5’ss-RTMs provided herein can further include a 5’ UTR sequence. In some embodiments, the 5’UTR is the endogenous 5’ UTR of the target pre-mRNA. A trans-splicing event occurs between the 5’ss-RTM’s Intron Y’s 5’ -splice site and the endogenous pre-mRNA’s Intron Y’s 3’ -splice site, resulting in the production of an mRNA with correct sequence, as depicted in FIG. 1.

[0160] Additionally, as shown in FIG. 2, the mutation in the range from Exon X+1 to Exon Y can also be corrected with a 3’ splicing site RTMs (3’ss RTMs) . The 3’ss-RTMs provided herein comprise 1) an engineered tail-end (5’ end) Intron X that comprises a binding sequence that reverse complementarily pairs with the pre-mRNA at the 3’ -end of Intron X (or in other words, the intron sequence to the 5’ end of Exon X+1 of the pre-mRNA) ; and 2) a replacement fragment comprising a 3’ fragment of the CDS starting from Exon X+1 to Exon Y, which has the correct sequence (i.e., without the mutation in the pre-mRNA) , the inserted Intron Y (the immediate non-coding sequence 3’ of the mutant exons) and from Exon Y+1 to stop codon. The replacement fragment of the 3’ss-RTMs provided herein can further include a 3’ UTR sequence. In some embodiments, the 3’ UTR is the endogenous 3’ UTR of the target pre-mRNA. A trans-splicing event occurs between the 3’ss-RTM’s Intron X’s 3’ -splice site and the endogenous pre-mRNA’s Intron X’s 5’ -splice site, resulting in the producing of an mRNA with correct sequence, as depicted in FIG. 2. In some embodiments, the 3’ss RTMs comprise a 3 UTR that improves trans-splicing efficiency, expression or RNA stability. In some embodiments, the 3’ UTR includes polyadenylation region to modify RNA expression / stability. Further elements such as a 3’ hairpin structure, circularized RNA, nucleotide base modification, or synthetic analogs can be incorporated into RTMs to promote or facilitate nuclear localization and spliceosomal incorporation, and intra-cellular stability. Protective groups can also be included to modulate the stability of the molecule and prevent degradation.

[0161] The RTMs disclosed herein are nucleic acid molecules. The RTMs can be DNA, RNA, DNA / RNA hybrid, or nucleic acid analog molecules. In some embodiments, the RTMs are DNA molecules. In some embodiments, the RTMs are RNA molecules. Provided herein are also vectors comprising the RTM provided herein. In some embodiments, the vector is a recombinant expression vector. In some embodiments, the vector is a viral vector, such as an adenovirus (AV) , an Adeno-Associated Virus (AAV) , a lentivirus (LV) , a retrovirus (RV) , a herpes simplex virus (HSV) , or a baculovirus (BEV) . In some embodiments, the viral vector is a single-stranded Adeno-Associated Virus (ssAAV) or a self-complementary Adeno-Associated Virus (scAAV) . In some embodiments, the vector is a non-viral vector. In some embodiments, the non-viral vector is a plasmid, a liposome, a nanoparticle, a polymer, a transposon, an exosome, a minicircle, a cosmid, a YAC vector, or BAC vector.

[0162] Provided herein are also cells comprising the RTMs disclosed herein. Provided herein are also cells comprising vectors disclosed herein.

[0163] Provided herein are also pharmaceutical compositions comprising the RTMs disclosed herein and at least one pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Provided herein are also pharmaceutical compositions comprising the vectors disclosed herein and at least one pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Provided herein are also pharmaceutical compositions comprising the cells disclosed herein and at least one pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0164] Provided herein are also methods for mRNA editing, comprising utilizing the RTMs to correct mutations in endogenous mRNAs. In some embodiments, provided herein are methods of correcting a pre-mRNA with a mutation comprising contacting the pre-mRNA with the RTM disclosed herein under conditions suitable for trans-splicing, wherein the replacement fragment of the RTM has the correct sequence. As such, upon trans-splicing, mRNAs with the correct sequence (i.e., without the mutation) are generated, which can be further processed and expressed in the cell.

[0165] Provided herein are also methods for mRNA editing, comprising utilizing the RTMs to prepare mRNA with desired modification. In some embodiments, the methods of editing a pre-mRNA comprise contacting the pre-mRNA with the RTM disclosed herein under conditions suitable for trans-splicing, wherein the replacement fragment of RTM has the edited sequence. As such, upon trans-splicing, mRNAs with the edited sequence (i.e., with the desired modification) are generated, which can be further processed and expressed in the cell.

[0166] The methods provided herein can be performed in vitro or in vivo. In some embodiments, methods provided herein are performed in vitro. Accordingly, provided herein are methods of correcting an endogenous pre-mRNA with a mutation in a cell comprising transferring the RTM disclosed herein to the cell, wherein the replacement fragment of RTM has the correct sequence. Provided herein are methods of editing an endogenous pre-mRNA with a mutation in a cell comprising transferring the RTM disclosed herein to the cell, wherein the replacement fragment of RTM has the edited sequence.

[0167] In some embodiments, the methods provided herein are performed in vivo. In some embodiments, provided herein are methods of treating a disease or disorder associated with a gene mutation in a subject in need thereof comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition disclosed herein, wherein the replacement fragment of RTM in the pharmaceutical composition has the correct sequence for the mutated gene. 6.1.3 Dual RTM systems

[0168] Provided herein are also innovative dual RTM systems that include both a 5’ss RTM and a 3’ss RTM, wherein the two RTMs are designed to synergistically enhance the trans-splicing efficiency. Each of the 5’ss RTM and 3’ss RTM can independently engage in trans-splicing with the target-pre mRNA Additionally, the two RTMs of the dual RTM system can recognize each other and produce full-length mRNA independently of endogenous templates. Such capacity overcomes the challenges faced by existing technology using RTM for mRNA editing by obviating the need to use endogenous template and identify splicing sites within native introns. It also overcomes the packaging size restriction of delivery vectors.

[0169] Specifically, the dual RTMs systems comprise paired engineered RTMs: a 5’ss RTM and a 3’ss RTM. The 5’ss RTM and 3’ss RTM can either collaboratively pair with endogenous target mutant pre-mRNA, facilitating the production of corrected or modified mature mRNA through trans-splicing (FIGs. 1 and 2) , or can pair with each other and generate full-length target mature mRNA independently of endogenous templates (FIG. 3) . The design of sequence elements in 5’ss-RTM and 3’ss-RTM is interdependent. As shown in FIG. 3, the inserted intron of 5’ss-RTM (Intron X) and the 5’ intron of 3’ss-RTM can form a trans-splicing pair, and conversely, the inserted intron of the 3’ss-RTM and the 3’ intron of 5’ss-RTM can form a trans-splicing pair. As such, these two RTMs can establish a stable interaction, which facilitates trans-splicing events independent of the endogenous pre-mRNA of the target gene and produces full-length target mRNA with desired sequence.

[0170] Both the 5’ss RTM and the 3’ss RTM contain an inserted intron and a tail-end intron. In the 3’ss RTM, the 5’ intron comprises, from 5’ to 3’ , a binding fragment and a 3’ splicing fragment. The 3’ splicing fragment can be derived from a natural intron, and the binding fragment is designed to be reverse complementary to the endogenous intron in the target pre-mRNA or the inserted intron in the paired 5’ss RTM. As such, the pairing of the 5’ intron with the endogenous intron in the target pre-mRNA allows the 3’s RTM to engage in trans-splicing with the target pre-mRNA, and the pairing of the 5’ intron with the inserted intron in the paired 5’ss RTM allows the 3’s RTM to engage in trans-splicing with the 5’ss RTM (FIGs. 2 and 3) .

[0171] In the 5’ss RTM, the 3’ intron comprises, from 5’ to 3’ , a 5’ splicing fragment and a binding fragment. The 5’ splicing fragment can be derived from a natural intron, and the binding fragment is designed to be reverse complementary to the endogenous intron in the target pre-mRNA or the inserted intron in the paired 3’ss RTM. As such, the pairing of the 3’ intron with the endogenous intron in the target pre-mRNA allows the 5’s RTM to engage in trans-splicing with the target pre-mRNA, and the pairing of the 3’ intron with the inserted intron in the paired 3’ss RTM allows the 5’s RTM to engage in trans-splicing with the 3’ss RTM (FIGs. 1 and 3) .

[0172] Both the 5’ss RTM and the 3’ss RTM contain an inserted intron in their respective replacement sequences. The inserted introns comprise both a 5’ splicing fragment and a 3’ splicing fragment, and are capable of cis-splicing. In the dual RTM system, the trans-pairing with a tail-end intron effectively blocks either the 5’ or 3’ splicing fragment on the inserted intron, allowing the occurrence of trans-splicing instead of cis-splicing. For example, as shown in FIG. 3, inserted Intron X is capable of cis-splicing on its own, but when paired with the 5’ intron of the 3’ss RTM, the 3’s splicing site of Intron X is blocked. As such, instead of cis-splicing, Intron X engages in trans-splicing with the 5’ intron of the 3’ss RTM.

[0173] Accordingly, the dual RTM systems are designed such that the 5’ss RTM and 3’ss RTM can interact with each other and produce full length mRNA independent of the endogenous mRNA template (FIG. 3) . The trans-splicing event occurring between the inserted intron of the 5’ss RTM and the 5’ intron of the 3’ss RTM joins the upstream portion of replacement fragment (before the inserted intron) of the 5’ss RTM to the replacement fragment of the 3’ss RTM; the trans-splicing event occurring between the inserted intron of the 3’ss RTM and the 3’ intron of the 5’s RTM joins the replacement fragment of the 5’ss RTM to the downstream portion of the replacement fragment (after the inserted intron) of the 3’ss RTM. As such, the shared coding exon present in both RTMs appears only once in the trans-splicing products. The residual inserted intron can be subsequently removed by a conventional cis-splicing reaction, yielding a mature mRNA that preserves the correct open-reading frame. In addition to the inserted introns that are designed to pair with the tail-end intron on the partner RTM to engage in trans-splicing, the replacement fragments on both 5’ss and 3’ss RTMs can include one or more additional introns. The additional intron (s) can be either natural intron (s) or engineered introns (s) . The additional intron (s) , if retained in the trans-splicing products, can also be excised from the final mRNA products by cis-splicing.

[0174] In a dual RTM system, the replacement fragment of either or both of the 5’ss and 3’ss RTMs comprise a coding sequence. In some embodiments, the replacement fragment of 5’ss RTM can comprise a coding sequence, and upon trans-splicing, the replacement fragment, which is designed to carry a mutation-free sequence (correct sequence) can be seamlessly linked to the downstream exons in the target pre-mRNA, with the resulting mRNA contains the correct sequence in place of the original mutant region while leaving all downstream native exons intact. Translation of this edited transcript therefore yields a full-length, functional protein free of the mutation in the target pre-mRNA. In some embodiments, the replacement fragment of 3’ss RTM can comprise a coding sequence, and upon trans-splicing, the replacement fragment, which is designed to carry a mutation-free sequence (correct sequence) can be seamlessly linked to the upstream exons in the target pre-mRNA, with the resulting mRNA contains the correct sequence in place of the original mutant region while leaving all upstream native exons intact. Translation of this edited transcript therefore yields a full-length, functional protein free of the mutation in the target pre-mRNA. In some embodiments, the replacement fragment carries a sequence with desired modification (modified sequence) , and the trans-splicing thus generates mRNA containing the desired modification.

[0175] In a dual RTM system, the coding sequence of an mRNA sequence can be divided into three parts, namely, the N coding sequence, M coding sequence, and C coding sequence. The N coding sequence (N-CS) denotes a nucleotide sequence that encodes the N-terminal portion of the target protein or polypeptide, beginning with (or immediately downstream of) the start codon and extending to a predefined internal boundary. The M coding sequence (M-CS) denotes a nucleotide sequence that encodes the internal, middle segment of the target protein or polypeptide, bounded upstream by the N-CS and downstream by the C-CS. The C coding sequence (C-CS) denotes a nucleotide sequence that encodes the C-terminal portion of the target protein or polypeptide, terminating at (or immediately upstream of) the stop codon. As such, the coding sequences, when linked in the order N–M–C, form a contiguous coding sequence that encodes a functional protein or polypeptide.

[0176] It is expressly contemplated herein that the coding sequences (i.e., N-CS, M-CS, and / or C-CS) can include additional intron (s) . The additional intron (s) can be either natural intron (s) or engineered introns (s) . The additional intron (s) , if retained in the trans-splicing products, can also be excised from the final mRNA products by cis-splicing.

[0177] Accordingly, in some embodiments, provided herein are dual RTM system comprising a 5’ss RTM and a 3’ss RTM, wherein (1) the 5’ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a replacement fragment and a 3’ intron; wherein the replacement fragment comprises (i) a N coding sequence, (ii) an inserted intron, and (iii) a M coding sequence; and (2) the 3’ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a 5’ intron and a replacement fragment; wherein the replacement fragment comprises (i) the M coding sequence, (ii) an inserted intron, and (iii) a C coding sequence; wherein the coding sequences, when linked in the order N–M–C, form a contiguous coding sequence that encodes a functional protein or polypeptide; and wherein each intron has a binding fragment, and the binding fragments of following introns reverse complementarily pair with each other: (i) the inserted intron of the 5’ss RTM and the 5’ intron of 3’ss RTM; and (ii) the inserted intron of the 3’ss RTM and the 3’ intron of the 5’ss RTM.

[0178] The 3’ss RTM comprises a 5’ intron and an inserted intron, each comprising a 3’ trans-splicing fragment. In some embodiments, one or both of 3’ trans-splicing fragments contain an SRE selected from the high-activity SREs disclosed herein or identified using methods described herein. In some embodiments, one or both of the SRE are derived from introns screened based on SkipProb in the human transcriptome. By integrating efficient SREs, the splicing efficiency of RTMs can be enhanced. In some embodiments, one or both 3’ trans-splicing fragments of the 3’ss RTM contain an SRE derived from an intron having a SkipProb of at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, or at least 90%. In some embodiments, one or both 3’ trans-splicing fragments of the 3’ss RTM contain an SRE derived from an intron having a SkipProb of at least 50%. In some embodiments, one or both 3’ trans-splicing fragments of the 3’ss RTM contain an SRE derived from an intron having a SkipProb of at least 60%. In some embodiments, one or both 3’ trans-splicing fragments of the 3’ss RTM contain an SRE derived from an intron having a SkipProb of at least 70%. In some embodiments, one or both 3’ trans-splicing fragments of the 3’ss RTM contain an SRE derived from an intron having a SkipProb of at least 75%. In some embodiments, one or both 3’ trans-splicing fragments of the 3’ss RTM contain an SRE derived from an intron having a SkipProb of at least 80%. In some embodiments, one or both 3’ trans-splicing fragments of the 3’ss RTM contain an SRE derived from an intron having a SkipProb of at least 85%. In some embodiments, one or both 3’ trans-splicing fragments of the 3’ss RTM contain an SRE derived from an intron having a SkipProb of at least 90%.

[0179] In some embodiments, the engineered 5’ intron in the 3’ss RTMs provided herein comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of the 5’ intron in the 3’ss RTMs has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37, 40, 41, 42, 47, 50, 73, 74, 77, 97, 105, 107, 113, 115, 131, 133, and 135.

[0180] In some embodiments, the inserted intron in the 3’ss RTMs provided herein comprises a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33.

[0181] In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of the inserted intron in the 3’ss RTMs has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37, 40, 41, 42, 47, 50, 73, 74, 77, 97, 105, 107, 113, 115, 131, 133, and 135.

[0182] In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from AZIN2 Intron 3. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 113. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from BRCA1 Intron 13. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 47. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from CD209 Intron 3. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 42. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from CD38 Intron 3. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from COL4A5 Intron 25. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 131. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from COL4A5 Intron 32. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 77. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from COL4A5 Intron 39. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from COL4A5 Intron 35. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 133. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from IFT122 Intron 8. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 74. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from KCNIP2 Intron 5. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from LCN10 Intron 2. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from LINC02889 Intron 8. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 97. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from MPHOSPH6 Intron 2. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from MRPL48 Intron 4. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 37. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from NMNAT3 Intron 5. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 107. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from NSF Intron 2. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 73. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from SHOC2 Intron 2. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 115. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from TBK1 Intron 14. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 50. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 105. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from ZNF346 Intron 2. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 40. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from mouse Col4a5 Intron 30. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 135. In some embodiments, the engineered 5’ intron and / or the inserted intron in the 3’ss RTMs comprise a 3’ trans-splicing fragment containing an SRE derived from mouse Col4a5 Intron 33.

[0183] Meanwhile, the 5’ trans-splicing fragments present in the introns of the 5′ss RTM perform the reciprocal role in trans-splicing. Each 5’ trans-splicing fragment furnishes the canonical GU dinucleotide and surrounding consensus nucleotides required for spliceosome engagement and, when the two RTMs hybridize, is juxtaposed to the SRE of the partner intron so that the spliceosome recognizes a complete SD–SA pair in trans. While the SD can be the donor that is naturally linked to the particular SRE sequence from which the element was derived, such provenance is not required; any SD sequence that supports accurate exon ligation and yields efficient trans-splicing with the chosen SRE is suitable. A person of ordinary skill in the art can select or engineer alternative SD motifs, for example, by adjusting the extended (C / A) AG GURAGU consensus, using routine mutagenesis and functional screening to match the SRE of interest and optimize editing efficiency.

[0184] In some embodiments, the 3’ intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from ADGRG1 Intron 8, AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of the 3’ intron has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 66-72, 76, 101, 109, 111, 117, 119, 132, 134, and 136.

[0185] In some embodiments, the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from ADGRG1 Intron 8, AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of the inserted intron has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 66-72, 76, 101, 109, 111, 117, 119, 132, 134, and 136.

[0186] In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from ADGRG1 Intron 8. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from AZIN2 Intron 3. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 117. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from BRCA1 Intron 13. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from CD209 Intron 3. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from CD38 Intron 3. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 70. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from COL4A5 Intron 25. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 66. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 69. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from COL4A5 Intron 32. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 132. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from COL4A5 Intron 35. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 76. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from COL4A5 Intron 39. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 134. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from IFT122 Intron 8. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from KCNIP2 Intron 5. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from LCN10 Intron 2. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from LINC02889 Intron 8. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 101. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from MPHOSPH6 Intron 2. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from MRPL48 Intron 4. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from NMNAT3 Intron 5. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 111. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from NSF Intron 2. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 71. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from SHOC2 Intron 2. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 119. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from TBK1 Intron 14. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 68. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 109. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from ZNF346 Intron 2. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 67. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from mouse Col4a5 Intron 30. In some embodiments, the 3’ intron and / or the inserted intron in the 5’ss RTMs provided herein comprise a 5’ trans-splicing fragment containing an SD derived from mouse Col4a5 Intron 33. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 136.

[0187] The dual RTM system disclosed herein comprise two sets of trans-splicing introns, (1) the inserted intron of the 5’ss RTM and the 5’ intron of the 3’ss RTM, and (2) the 3’s intron of the 5’ss RTM and the inserted intron of the 3’ss RTM. Each pair involves an intron (the inserted intron or the 3’s intron of the 5’ss RTM) providing the 5’s trans-splicing fragment, and an intron (the 5’ intron or the inserted intron of the 3’ss RTM) providing the 3’s trans-splicing fragment. The 5’ and 3’ trans-splicing fragments can be any pair of trans-splicing fragments disclosed herein or otherwise known in the art. In some embodiments, for example, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to: (1) SEQ ID NOs: 66 and 37, respectively; (2) SEQ ID NOs: 66 and 41, respectively; (3) SEQ ID NOs: 66 and 42, respectively; (4) SEQ ID NOs: 66 and 44, respectively; (5) SEQ ID NOs: 67 and 40, respectively; (6) SEQ ID NOs: 67 and 41, respectively; (7) SEQ ID NOs: 67 and 42, respectively; (8) SEQ ID NOs: 67 and 44, respectively; (8) SEQ ID NOs: 68 and 50, respectively; (9) SEQ ID NOs: 70 and 41, respectively; (10) SEQ ID NOs: 71 and 73, respectively; (11) SEQ ID NOs: 71 and 73, respectively; (12) SEQ ID NOs: 72 and 74, respectively; (13) SEQ ID NOs: 76 and 47, respectively; (14) SEQ ID NOs: 101 and 97, respectively; (15) SEQ ID NOs: 109 and 105, respectively; (16) SEQ ID NOs: 111 and 107, respectively; or (17) SEQ ID NOs: 117 and 113, respectively; or (19) SEQ ID NOs: 119 and 115, respectively.

[0188] In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 66 and 37, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 66 and 41, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 66 and 42, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 66 and 44, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 67 and 40, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 67 and 41, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 67 and 42, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 67 and 44, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 68 and 50, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 70 and 41, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 71 and 73, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 71 and 73, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 72 and 74, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 76 and 47, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 101 and 97, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 109 and 105, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 111 and 107, respectively; or SEQ ID NOs: 117 and 113, respectively; or SEQ ID NOs: 119 and 115, respectively.

[0189] As a person of ordinary skill in the art would understand, the two sets of trans-splicing introns, namely, (1) the inserted intron of the 5’ss RTM and the 5’ intron of the 3’ss RTM, and (2) the 3’s intron of the 5’ss RTM and the inserted intron of the 3’ss RTM, can be independently designed, as long as they can both achieve effective trans-splicing. For illustrative purposes, in some embodiments: the inserted intron of the 5’ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (1) ; the 3’ intron of the 5’ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (2) ; the 5’ intron of 3’ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (3) ; and the inserted intron of 3’ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (4) ; wherein the splicing fragments (1) , (2) , (3) , and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to: (i) SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively; (ii) SEQ ID NOs: 76, 68, 47, and 50, respectively; (iii) SEQ ID NOs: 66, 67, 41, and 41, respectively; (iv) SEQ ID NOs: 66, 67, 42, and 42, respectively; (v) SEQ ID NOs: 66, 67, 44, and 44, respectively; (vi) SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively; (vii) SEQ ID NOs: 71, 72, 73, and 74, respectively; (viii) SEQ ID NOs: 70, 72, 41, and 74, respectively; (ix) SEQ ID NOs: 71, 101, 73, and 97, respectively; (x) SEQ ID NOs: 109, 111, 105, and 107, respectively; or (xi) SEQ ID NOs: 117, 119, 113, and 115, respectively.

[0190] In some embodiments, (1) the 5’ trans-splicing fragment of the inserted intron of the 5’ss RTM; (2) the 5’ trans-splicing fragment of the 3’ intron of the 5’ss RTM; (3) the 3’ trans-splicing fragment of the 5’ intron of 3’ss RTM; and (4) the 3’ trans-splicing fragment of the inserted intron of 3’ss RTM have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively. In some embodiments, the trans-splicing fragment (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 76, 68, 47, and 50, respectively. In some embodiments, the trans-splicing fragment (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 66, 67, 41, and 41, respectively. In some embodiments, the trans-splicing fragment (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 66, 67, 42, and 42, respectively. In some embodiments, the trans-splicing fragment (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 66, 67, 44, and 44, respectively. In some embodiments, the trans-splicing fragment (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively. In some embodiments, the trans-splicing fragment (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 71, 72, 73, and 74, respectively. In some embodiments, the trans-splicing fragment (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 70, 72, 41, and 74, respectively. In some embodiments, the trans-splicing fragment (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 71, 101, 73, and 97, respectively. In some embodiments, the trans-splicing fragment (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 109, 111, 105, and 107, respectively. In some embodiments, the trans-splicing fragment (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 117, 119, 113, and 115, respectively.

[0191] It is to be understood that the dual RTM systems disclosed herein are not limited by the choice of specific splicing fragment sequences. Other splicing fragments identified using methods disclosed herein or otherwise in the art can also be adopted.

[0192] The dual RTM systems provided herein have two pairs of trans-splicing introns, each with a set of reverse complementarily paired binding fragments, namely (1) the binding fragment of the inserted intron of the 5’ss RTM and the binding fragment of the 5’ intron of the 3’ss RTM, and (2) the binding fragment of the inserted intron of the 3’ss RTM and the binding fragment of the 3’s intron of the 5’ss RTM. In some embodiments, the length for the reverse complementarily paired binding fragments ranges from 30 to 1500 base pairs (bp) . In some embodiments, the length for the reverse complementarily paired binding fragments ranges from 50 to 1000 bp, from 100 to 900 bp, from 200 to 900 bp, from 300 to 800 bp, from 400 to 700 bp, from 500 to 700 bp, from 150 to 600 bp, from 200 to 600 bp, from 300 to 600 bp, from 400 to 600 bp, from 500 to 600 bp, or from 180 to 300 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 50 to 1000 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 100 to 900 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 200 to 900 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 300 to 800 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 400 to 700 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 500 to 700 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 150 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 200 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 300 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 400 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 500 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 180 to 300 bp. In some embodiments, the length for the reverse complementarily paired binding fragments is about 150 bp, about 200 bp, about 300 bp, about 400 bp, about 500 bp, about 600 bp, about 700 bp, about 800 bp, or about 900 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 150 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 300 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 400 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 500 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 600 bp.

[0193] The dual RTM systems provided herein have two sets of reverse complementarily paired binding fragments, (1) the binding fragment of the inserted intron of the 5’ss RTM and the binding fragment of the 5’ intron of the 3’ss RTM, and (2) the binding fragment of the inserted intron of the 3’ss RTM and the binding fragment of the 3’s intron of the 5’ss RTM. In some embodiments, the binding fragments are derived from natural introns.

[0194] For example, in some embodiments, an inserted intron and its pairing end-tail intron (i.e., the inserted intron of the 5’ss RTM and the 5’ intron of the 3’ss RTM, or the inserted intron of the 3’ss RTM and the 3’s intron of the 5’ss RTM) can be at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a binding fragment derived from COL4A5 Intron 25 (Intron 25 binding fragment) and its reverse complementary fragment, respectively. In some embodiments, the complementary region can be about 75 bp in length, about 150 bp in length, about 300 bp in length, about 400 bp in length, about 500 bp in length, or about 600 bp in length. In some embodiments, Intron 25 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 35 and 78, respectively. In some embodiments, Intron 25 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 35 and 36, respectively. Intron 25 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 99 and 94, respectively. In some embodiments, Intron 25 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 82 and 80, respectively.

[0195] In some embodiments, an inserted intron and its pairing end-tail intron (i.e., the inserted intron of the 5’ss RTM and the 5’ intron of the 3’ss RTM, or the inserted intron of the 3’ss RTM and the 3’s intron of the 5’ss RTM) can be at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a binding fragment derived from COL4A5 Intron 32 (Intron 32 binding fragment) and its reverse complementary fragment, respectively. In some embodiments, the complementary region can be about 75 bp in length, about 150 bp in length, about 300 bp in length, about 400 bp in length, about 500 bp in length, or about 600 bp in length. In some embodiments, Intron 32 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 38 and 79, respectively. In some embodiments, Intron 32 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 38 and 39, respectively. Intron 32 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 96 and 102, respectively. In some embodiments, Intron 32 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 81 and 83, respectively.

[0196] In some embodiments, an inserted intron and its pairing end-tail intron (i.e., the inserted intron of the 5’ss RTM and the 5’ intron of the 3’ss RTM, or the inserted intron of the 3’ss RTM and the 3’s intron of the 5’ss RTM) can be at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a binding fragment derived from COL4A5 Intron 35 (Intron 35 binding fragment) and its reverse complementary fragment, respectively. In some embodiments, the complementary region can be about 75 bp in length, about 150 bp in length, about 300 bp in length, about 400 bp in length, about 500 bp in length, or about 600 bp in length. In some embodiments, Intron 35 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 45 and 46, respectively.

[0197] In some embodiments, an inserted intron and its pairing end-tail intron (i.e., the inserted intron of the 5’ss RTM and the 5’ intron of the 3’ss RTM, or the inserted intron of the 3’ss RTM and the 3’s intron of the 5’ss RTM) can be at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a binding fragment derived from COL4A5 Intron 39 (Intron 39 binding fragment) and its reverse complementary fragment, respectively. In some embodiments, the complementary region can be about 75 bp in length, about 150 bp in length, about 300 bp in length, about 400 bp in length, about 500 bp in length, or about 600 bp in length. In some embodiments, Intron 39 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 48 and 49, respectively.

[0198] In some embodiments, an inserted intron and its pairing end-tail intron (i.e., the inserted intron of the 5’ss RTM and the 5’ intron of the 3’ss RTM, or the inserted intron of the 3’ss RTM and the 3’s intron of the 5’ss RTM) can be at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a binding fragment derived from mouse COL4A5 Intron 30 (mouse Intron 30 binding fragment) and its reverse complementary fragment, respectively. In some embodiments, the complementary region can be about 75 bp in length, about 150 bp in length, about 300 bp in length, about 400 bp in length, about 500 bp in length, or about 600 bp in length. In some embodiments, m-Intron 30 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 89 and 91, respectively. In some embodiments, m-Intron 30 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 85 and 87, respectively.

[0199] In some embodiments, an inserted intron and its pairing end-tail intron (i.e., the inserted intron of the 5’ss RTM and the 5’ intron of the 3’ss RTM, or the inserted intron of the 3’ss RTM and the 3’s intron of the 5’ss RTM) can be at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a binding fragment derived from COL4A5 mouse Intron 33 (mouse Intron 33 binding fragment) and its reverse complementary fragment, respectively. In some embodiments, the complementary region can be about 75 bp in length, about 150 bp in length, about 300 bp in length, about 400 bp in length, about 500 bp in length, or about 600 bp in length. In some embodiments, mouse Intron 33 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 88 and 86, respectively. In some embodiments, mouse Intron 33 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 92 and 90, respectively.

[0200] It is to be understood that the dual RTM systems disclosed herein are not limited by the choice of specific splicing fragment sequences or binding fragment sequences. Other reverse complementarily paired sequences can also be adopted herein. To avoid mispairing, two different sets of binding pairs are used for each trans-splicing pairs. For example, the binding fragment pair (1) for the trans-splicing pair of inserted intron of the 5’ss RTM and the 5’ intron of the 3’ss RTM, and the binding fragment pair (2) for the trans-splicing pair of the inserted intron of the 3’ss RTM and the 3’s intron of the 5’ss RTM, can constitute of (1) Intron 25 binding fragment (e.g., SEQ ID NO: 35, 82, or 99) and its reverse complement fragment and (2) Intron 32 binding fragment (e.g., SEQ ID NO: 38, 81, 84, or 96) and its reverse complement fragment. The two binding pairs can constitute of (1) Intron 35 binding fragment (e.g., SEQ ID NO: 45) and its reverse complement fragment and (2) Intron 39 binding fragment (e.g., SEQ ID NO: 48) and its reverse complement fragment. The two binding pairs can also constitute of (1) mouse Intron 30 binding fragment (e.g., SEQ ID NO: 85 or 89) and its reverse complement fragment and (2) mouse Intron 33 binding fragment (e.g., SEQ ID NO: 88 or 92) and its reverse complement fragment.

[0201] In some embodiments, the 5’ss, 3’ss, or both RTMs in the dual RTM systems provided herein can be further optimized by incorporating an RNA-stabilizing element positioned between the binding fragment and the trans-splicing fragment. Suitable RNA-stabilizing elements include, without limitation, G-quadruplex (G4) motifs, kissing-loop-like duplexes; canonical stem–loop or hairpin structures (e.g., GC-rich clamps or thermodynamically stable tetraloops such as GNRA or UNCG) ; pseudoknots, including H-type and quasi-knot architectures; RNA triplex motifs comprising Hoogsteen base-paired third strands; tRNA-like scaffolds derived from plant viral 3′ termini; internal ribosome-entry site (IRES) core domains that adopt stable multi-stem conformations; self-dimerizing C-rich i-motifs; stabilizing aptamer folds (e.g., theophylline-binding or spinach aptamers) with or without cognate ligands; ribozyme core folds rendered catalytically inactive but conformationally rigid (e.g., HDV or hammerhead cores) ; and synthetic lock-and-key modules engineered from complementary sense / antisense micro-domains that anneal intramolecularly. The stabilizing element can be flanked by short linker sequences (1–10 nt) to avoid interfering with splice-site recognition and may itself carry chemical modifications-such as 2′-O-methyl, 2′-fluoro, phosphorothioate, or locked nucleic acid (LNA) residues-that further increase nuclease resistance without disrupting the desired secondary or tertiary structure. In some embodiments, the 5’ss RTM, 3’ss RTM, or both further comprise a G4 motif (e.g., SEQ ID NO: 64) . In some embodiments, the 5’ss RTM, 3’ss RTM, or both further comprise kissing-loop-like sequence (e.g., SEQ ID NO: 65 &137) .

[0202] Provided herein are dual RTM systems comprising a 5’ss RTM and a 3’ss RTM, wherein the 5’ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a replacement fragment comprising (1) an inserted intron and (2) a 3’ intron; and wherein the 3’ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , (3) a 5’ intron and (4) a replacement fragment comprising an inserted intron. In some embodiments, (1) the inserted intron of the 5’ss RTM, (2) the 3’ intron of the 5’ss RTM, (3) the 5’ intron of the 3’ss RTM, and (4) the inserted intron of the 3’ss RTM have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 6, 7, 4, and 5, respectively. In some embodiments, introns (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 10, 11, 12, and 13, respectively. In some embodiments, introns (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 6, 7, 21, and 22, respectively. In some embodiments, introns (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 6, 7, 23, and 24, respectively. In some embodiments, introns (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 6, 7, 27, and 28, respectively. In some embodiments, introns (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 6, 30, 29, and 5, respectively. In some embodiments, introns (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 33, 34, 31, and 32, respectively. In some embodiments, introns (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 56, 57, 58, and 59, respectively. In some embodiments, introns (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 60, 61, 62, and 63, respectively. In some embodiments, introns (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 98, 100, 93, and 95, respectively. In some embodiments, introns (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 108, 110, 103, and 106, respectively. In some embodiments, introns (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 116, 118, 112, and 114, respectively. In some embodiments, introns (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and 126, respectively. In some embodiments, introns (1) , (2) , (3) and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 127, 128, 129, and 130, respectively.

[0203] In some embodiments, the replacement fragment of a 5’ss RTM can further include 5’ untranslated region (5’ UTR) . The 5′ UTR can be selected or engineered to contain one or more regulatory features that influence translation initiation, transcript stability, nuclear export, or sub-cellular localization. Representative features include: (i) a canonical or optimized Kozak consensus and related translation-initiator sequence (TISU) to improve ribosome scanning and start-codon recognition; (ii) internal ribosome-entry sites (IRESs) or other cap-independent translation-enhancer elements that permit efficient initiation under stress or in cap-deficient contexts; (iii) strategically placed up-stream open-reading frames (uORFs) or attenuator peptides that fine-tune downstream ORF translation; (iv) an optional leader intron whose splicing is coupled to nuclear export and cap-binding-protein exchange; (v) RNA-folding motifs-such as stable GC-rich stem–loops, G-quadruplexes, or engineered pseudoknots-that modulate ribosome scanning speed or protect the 5′ end from nucleases; and (vi) ligand-responsive riboswitches or aptamers that enable small-molecule control of translation. Any of these structures can be used singly or in combination and may incorporate chemically modified bases (e.g., 2′-O-methyl, ψ-uridine) to enhance stability or reduce innate-immune activation. Certain elements-such as riboswitches, aptamers, G-quadruplexes, and other secondary structures-are functional whether placed in the 5′ UTR or the 3′ UTR, giving designers additional flexibility.

[0204] In some embodiments, the replacement fragment of a 3′ ss RTM can further comprise a 3′ untranslated region (3′ UTR) . The 3′ UTR can likewise be configured with regulatory elements that govern transcript half-life, localization, and translational efficiency. Exemplary elements include: (i) canonical or alternative polyadenylation signals flanked by upstream and downstream auxiliary motifs that dictate cleavage and tail addition; (ii) AU-rich or GU-rich elements, cytoplasmic polyadenylation elements (CPEs) , or other binding sites for RNA-stability factors such as HuR, TTP, or CPEB; (iii) microRNA-response elements (MREs) that allow cell-type-specific repression by endogenous miRNAs; (iv) clusters of m6A (N6-methyladenosine) or other epitranscriptomic marks read by YTH-family proteins to influence decay or translation; (v) well-characterized zip-code or Staufen-binding sites that direct the mRNA to particular sub-cellular locales (e.g., leading-edge lamellipodia, neuronal dendrites) ; (vi) cap-independent translation enhancers positioned at the 3′ end (e.g., tombusvirus-or BYDV-derived 3′ CITEs) that recruit initiation factors in trans; (vii) SECIS elements that permit selenocysteine incorporation; and (viii) ligand-responsive aptamers, riboswitches, or self-cleaving aptazymes that modulate stability or translation in response to small molecules. As noted above, structures such as aptamers, riboswitches, G-quadruplexes, and other compact tertiary folds can be functional in either the 5′ UTR or the 3′ UTR, and their placement can be tailored to achieve the desired regulatory outcome.

[0205] For illustrative purposes, dual RTMs are prepared for GFP protein. As shown in FIG. 8, 3’ss RTM and 5’ss RTM are designed to edit the mutant GFP mRNA which contains a stop codon in the middle exon (GFP-M) . The 3’ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a 5’ intron, a GFP-M exon, an inserted intron, and a GFP-C exon, wherein both introns comprise a binding fragment and an SRE. The 5’ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a GFP-N exon, an inserted intron, a GFP-M exon, and a 3’intron, wherein both introns comprise a SD sequence and a binding fragment. As shown, the inserted intron of the 5’ss RTM reverse complementarily pairs with the 5’s intron of the 3’ss RTM via their binding fragments, and the inserted intron of the 3’ss RTM reverse complementarily pairs with the 3’ intron of the 5’ss RTM via their binding fragments. It is to be understood that the dual RTM systems are not limited by the coding sequences of the replacement sequences, and can be designed to edit / express any mRNA sequence by incorporating the desired replacement sequence. For example, to express a target protein (POI; or protein-of-interest) , the coding sequence of the POI can be divided into three parts, similar as the GFP-N exon, M exon, and C exon, and the exon sequences can be incorporated into the dual RTM system as the GFP exons. Upon splicing, the exon sequences will be linked together to form the mature mRNA that can translate into the desired POI.

[0206] The dual RTM systems disclosed herein are also nucleic acid molecules. The RTMs can be DNA, RNA, DNA / RNA hybrid, or nucleic acid analog molecules. In some embodiments, the RTMs are DNA molecules. In some embodiments, the RTMs are RNA molecules. Provided herein are also vectors comprising the RTM provided herein. In some embodiments, provided herein are single vectors that comprise both the 5’ss RTM and the 3’ss RTM. In some embodiments, provided herein are two vectors, one comprising the 5’ss RTM and the other comprising 3’ss RTM.

[0207] In some embodiments, the vector (s) can be a recombinant expression vector. In some embodiments, the vector (s) can be a viral vector, such as an adenovirus (AV) , an Adeno-Associated Virus (AAV) , a lentivirus (LV) , a retrovirus (RV) , a herpes simplex virus (HSV) , or a baculovirus (BEV) . In some embodiments, the viral vector (s) can be a single-stranded Adeno-Associated Virus (ssAAV) or a self-complementary Adeno-Associated Virus (scAAV) . In some embodiments, the vector (s) can be a non-viral vector. In some embodiments, the non-viral vector can be a plasmid, a liposome, a nanoparticle, a polymer, a transposon, an exosome, a minicircle, a cosmid, a YAC vector, or BAC vector.

[0208] Provided herein are also cells comprising the dual RTM systems disclosed herein.

[0209] Provided herein are also pharmaceutical compositions comprising the dual RTM systems disclosed herein, and at least one pharmaceutically acceptable carrier. Provided herein are also pharmaceutical compositions comprising the cell containing the dual RTM systems disclosed herein, and at least one pharmaceutically acceptable carrier.

[0210] Provided herein are also methods for mRNA editing, comprising utilizing the dual RTM system to correct mutations in endogenous mRNAs or prepare mRNA with desired modification.

[0211] Provided herein are also methods of correcting a pre-mRNA with a mutation, comprising contacting the pre-mRNA with the dual RTM systems disclosed herein under conditions suitable for trans-splicing, wherein the replacement fragment of 5’ss RTM and / or the 3’ss RTM has the correct sequence. Provided herein are also method of editing a pre-mRNA comprising contacting the pre-mRNA with the dual RTM system disclosed herein under conditions suitable for trans-splicing, wherein the replacement fragment of 5’ss RTM and / or the 3’ss RTM has the edited sequence.

[0212] The methods provided herein can be performed in vitro or in vivo. In some embodiments, methods provided herein are performed in vitro. Accordingly, provided herein are methods of correcting an endogenous pre-mRNA with a mutation in a cell comprising transferring the dual RTM system disclosed herein to the cell, wherein the replacement fragment of the 5’ss RTM and / or the 3’ss RTM has the correct sequence. Provided herein are methods of editing an endogenous pre-mRNA with a mutation in a cell comprising transferring the dual RTM system disclosed herein to the cell, wherein the replacement fragment of the 5’ss RTM and / or the 3’ss RTM has the edited sequence.

[0213] In some embodiments, the methods provided herein are performed in vivo. In some embodiments, provided herein are methods of treating a disease or disorder associated with a gene mutation in a subject in need thereof comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising the dual RTM system disclosed herein, wherein the replacement fragment of the 5’ss RTM and / or the 3’ss RTM in the dual RTM system has the correct sequence for the mutated gene.

[0214] In addition to editing mRNA sequences, the dual RTM system provided herein can also be used for recombinant expression independent of an endogenous mRNA template. In some embodiments, provided herein are also methods of expressing a recombinant mRNA, comprising culturing the dual RTM system disclosed herein under conditions suitable for trans-splicing. In some embodiments, provided herein also methods of expressing a recombinant mRNA, comprising culturing the cell comprising the dual RTM system disclosed herein conditions suitable for recombinant expression.

[0215] Because the coding sequences will be split into two halves into the 5’ss RTM and the 3’ss RTM, the size of the target mRNA can be up about twice the packing capacity limitation of the delivery vectors. In some embodiments, the dual RTM systems provided herein can produce recombinant mRNA that is at least 5 kb in length. In some embodiments, the dual RTM systems provided herein can produce recombinant mRNA that is at least 8 kb in length, at least 10 kb in length, or at least 12 kb in length. In some embodiments, the dual RTM systems provided herein can produce recombinant mRNA that ranges from 4 kb to 15 kb, 5 kb to 15 kb, 6 kb to 15 kb, 7 kb to 15 kb, 8 kb to 15 kb, 4 kb to 12 kb, 5 kb to 12 kb, 6 kb to 12 kb, 7 kb to 12 kb, 8 kb to 12 kb, 4 kb to 10 kb, 5 kb to 10 kb, 6 kb to 10 kb, 7 kb to 10 kb, or 8 kb to 10 kb in length. In some embodiments, the mRNA product ranges from 5 kb to 15 kb in length. In some embodiments, the mRNA product ranges from 5 kb to 12 kb in length. In some embodiments, the mRNA product ranges from 5 kb to 10 kb in length. 6.1.4 Triple or Multiple RTM systems

[0216] The dual-RTMs system can be extended to triple RTM systems, which can be further extendable to quadruple RTMs or quintuple RTMs systems and so on. The multi-RTM systems obviate the packaging size limitation of recombinant vectors (e.g., AAV) and the recombinant production of mRNA of large sizes by splitting the long target product into multiple segments that can be linked together by trans-splicing.

[0217] The triple RTM system provided herein involves three RTMs: N-ss RTM, M-ss RTM, C-ss RTM. The N-ss RTM and C-ss RTM correspond to the 5’ss RTM and 3’ss RTM in the dual RTM system, which can each pair with endogenous target mutant pre-mRNA, facilitating the production of corrected or modified mature mRNA through trans-splicing. Additionally, an M-ss RTM is further included, which is designed such that all three RTMs can interact with each other and form the full-length mRNA upon trans-splicing. In a triple RTM system, the N-ss RTM and the 5’ fragment of the M-ss RTM forms a dual RTM system that, upon trans-splicing, joins the N-terminal region and middle region of the target mRNA. Similarly, the 3’ fragment of the M-ss RTM and the C-ss RTM forms a second dual RTM system that, upon trans-splicing, joins the middle region of the target mRNA and the C-terminal region of the target mRNA.

[0218] As shown in FIG. 4, the trans-splicing event occurring between the inserted intron of the N-ss RTM and the 5’ intron of the M-ss RTM joins the upstream portion of the replacement fragment (Exon 1 to Exon X) of the N-ss RTM to the entire replacement fragment of the M-ss RTM; the trans-splicing event occurring between the 3’ intron of the N-ss RTM and the first inserted intron of the M-ss RTM joins the entire replacement fragment of the N-ss RTM to the middle-to-downstream portion of the replacement fragment (Exon Y+1 to the 3’ end) of the M-ss RTM; the trans-splicing event occurring between the second inserted intron of the M-ss RTM and the 5’ intron of the C-ss RTM joins the upstream-to-middle portion of the replacement fragment (the 5’ end to Exon Z) of the M-ss RTM to the entire replacement fragment of the C-ss RTM; the trans-splicing event occurring between the inserted intron of the C-ss RTM and the 3’ intron of the M’ss RTM joins the entire replacement fragment of the M-ss RTM to the downstream portion of the replacement fragment (Exon U+1 to 3’ end) of the C-ss RTM. As such, the shared coding exon present in the RTMs appears only once in the trans-splicing products. The residual inserted intron can be subsequently removed by a conventional cis-splicing reaction, yielding a mature mRNA that preserves the correct open-reading frame. In addition to the inserted introns that are designed to pair with the tail-end intron on the partner RTM to engage in trans-splicing, the replacement fragments on one or more of the RTMs in the triple RTM system can include one or more additional introns. The additional intron (s) can be either natural intron (s) or engineered introns (s) . The additional intron (s) , if retained in the trans-splicing products, can also be excised from the final mRNA products by cis-splicing.

[0219] According, in a triple RTM system, the N-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , 1) a replacement fragment comprising an inserted intron, and (2) a 3’s intron, wherein the inserted intron and the 3’ intron each comprises a 5’ trans-splicing fragment. The M-ss RTM comprises, from 5’ to 3’, a 5’ intron, a replacement fragment comprising a first inserted intron and a second inserted intron, and a 3’ intron, wherein the 5’ intron and the first inserted intron each comprises a 3’ trans-splicing fragment, and wherein the second inserted intron and the 3’ intron each comprises a 5’ trans-splicing fragment. The C-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , (1) a 5’ intron and (2) a replacement fragment comprising an inserted intron, wherein the 5’ intron and the inserted intron each comprises trans-splicing.

[0220] As shown, in the triple RTM system, the following four intron pairs can engage in trans-splicing: (1) the inserted intron of N-ss RTM (Intron X) and the 5’ intron of the M-ss RTM; (2) the first inserted intron of M-ss RTM (Intron Y) and the 3’ intron of the N-ss RTM; (3) the second inserted intron of M-ss RTM (Intron Z) and the 5’ intron of the C-ss RTM; and (4) the inserted intron of C-ss RTM (Intron U) and the 3’ intron of the M-ss RTM.

[0221] In a triple RTM system, the N-ss RTM and C-ss RTM can edit target pre-mRNA to generate mature mRNA with corrected or modified sequence in the same manner as the 5’ss RTM and 3’ss RTM, respectively. Additionally, in a triple RTM system, the N-ss RTM, M-ss RTM and C-ss RTM can interact with each other and produce full length mRNA by trans-splicing, independent of the endogenous mRNA template. For example, in some embodiments, the coding sequence of an mRNA sequence can be divided into five parts, namely, the N coding sequence (e.g., Exon 1 to Exon X in FIG. 4) , M1 coding sequence (e.g., Exon X+1 to Exon Y in FIG. 4) , M2 coding sequence (e.g., Exon Y+1 to Exon Z in FIG. 4) , M3 coding sequence (e.g., Exon Z+1 to Exon U in FIG. 4) , and C coding sequence (e.g., Exon U+1 to the last exon) . The N coding sequence (N-CS) denotes a nucleotide sequence that encodes the N-terminal portion of the target protein or polypeptide, beginning with (or immediately downstream of) the start codon and extending to a predefined internal boundary. The M1, M2, M3 coding sequences (M1-CS, M2-CS, and M3-CS) each denotes a nucleotide sequence that encodes the internal, middle segment of the target protein or polypeptide, arranged in the N to C direction, bounded upstream by the N-CS and downstream by the C-CS. The C coding sequence (C-CS) denotes a nucleotide sequence that encodes the C-terminal portion of the target protein or polypeptide, terminating at (or immediately upstream of) the stop codon. As such, the coding sequences, when linked in the order N–M1-M2-M3–C, form a contiguous coding sequence that encodes a functional protein or polypeptide (FIGs. 4 and 13) .

[0222] As such, in the triple RTM system provided herein, the replacement fragment in N-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , (i) a N coding sequence, (ii) the inserted intron, and (iii) a M1 coding sequence; the replacement fragment in M-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , (i) the M1 coding sequence, (ii) the first inserted intron, (iii) a M2 coding sequence, (iv) the second inserted intron, and (v) a M3 coding sequence; and the replacement fragment in C-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , (i) the M3 coding sequence, (ii) the inserted intron, and (iii) a C coding sequence. It is expressly contemplated herein that the coding sequences (i.e., N-CS, M1-CS, M2-CS, M3-CS, and / or C-CS) can include additional intron (s) . The additional intron (s) can be either natural intron (s) or engineered introns (s) . The additional intron (s) , if retained in the trans-splicing products, can also be excised from the final mRNA products by cis-splicing.

[0223] Accordingly, provided herein are triple RTM systems comprising a N-ss RTM, a M-ss RTM, and a C-ss RTM, wherein (1) the N-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a replacement fragment and a 3’ intron, wherein the replacement fragment comprises (i) a N coding sequence, (ii) an inserted intron, and (iii) an M1 coding sequence; (2) the M-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a 5’ intron, a replacement fragment, and a 3’ intron; wherein the replacement fragment comprises (i) the M1 coding sequence, (ii) a first inserted intron, (iii) an M2 coding sequence; (iv) a second inserted intron, and (v) an M3 coding sequence; and (3) the C-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a 5’ intron, and a replacement fragment, wherein the replacement fragment comprises (i) the M3 coding sequence, (ii) an inserted intron, and (iii) a C coding sequence; wherein the coding sequences, when linked in the order N–M1–M2–M3-C, form a contiguous coding sequence that encodes a functional protein or polypeptide; wherein each intron has a binding fragment, and the binding fragments of the following introns reverse complementarily pair with each other: (i) the inserted intron of N-ss RTM and the 5’ intron of the M-ss RTM; (ii) the first inserted intron of M-ss RTM and the 3’ intron of the N-ss RTM; (iii) the second inserted intron of M-ss RTM and the 5’ intron of the C-ss RTM; and (iv) the inserted intron of C-ss RTM and the 3’ intron of the M-ss RTM.

[0224] The 5’ intron and the first inserted intron of the M-ss RTM, as well the 5’ intron and the inserted intron of the C-ss RTM each comprises a 3’ trans-splicing fragment. In some embodiments, one, two, three, or four of these 3’ trans-splicing fragments contain an SRE selected form the high-activity SREs disclosed herein or identified using methods described herein. In some embodiments, one, two, three, or four of the SRE are screened based on SkipProb in the human transcriptome. By integrating efficient SREs, the splicing efficiency of RTMs can be enhanced. In some embodiments, one, two, three, or four of the SREs are derived from an intron having a SkipProb of at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, or at least 90%. In some embodiments, one, two, three, or four of the SREs are derived from an intron having a SkipProb of at least 40%. In some embodiments, one, two, three, or four of the SREs are derived from an intron having a SkipProb of at least 50%. In some embodiments, one, two, three, or four of the SREs are derived from an intron having a SkipProb of at least 60%. In some embodiments, one, two, three, or four of the SREs are derived from an intron having a SkipProb of at least 70%. In some embodiments, one, two, three, or four of the SREs are derived from an intron having a SkipProb of at least 75%. In some embodiments, one, two, three, or four of the SREs are derived from an intron having a SkipProb of at least 80%. In some embodiments, one, two, three, or four of the SREs are derived from an intron having a SkipProb of at least 85%. In some embodiments, one, two, three, or four of the SREs are derived from an intron having a SkipProb of at least 90%.

[0225] In some embodiments, one, two, three, or four of these 3’ trans-splicing fragments (namely, the splicing fragments present in the 5’ intron and the first inserted intron of the M-ss RTM, as well as in the 5’ intron and the inserted intron of the C-ss RTM) comprise an SRE derived from AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of these introns can independently have at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37, 40, 41, 42, 47, 50, 73, 74, 77, 97, 105, 107, 113, 115, 131, 133, and 135.

[0226] In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns (namely, the splicing fragments present in the 5’ intron and the first inserted intron of the M-ss RTM, as well in the 5’ intron and the inserted intron of the C-ss RTM) has an SRE derived from AZIN2 Intron 3. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 113. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from BRCA1 Intron 13. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 47. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from CD209 Intron 3. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 42. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from CD38 Intron 3. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from COL4A5 Intron 25. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 131. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from COL4A5 Intron 32. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 77. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from COL4A5 Intron 39. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from COL4A5 Intron 35. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 133. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from IFT122 Intron 8. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 74. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from KCNIP2 Intron 5. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from LCN10 Intron 2. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from LINC02889 Intron 8. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 97. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from MPHOSPH6 Intron 2. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from MRPL48 Intron 4. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 37. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from NMNAT3 Intron 5. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 107. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from NSF Intron 2. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 73. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from SHOC2 Intron 2. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 115. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from TBK1 Intron 14. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 50. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 105. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from ZNF346 Intron 2. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 40. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from mouse Col4a5 Intron 30. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 135. In some embodiments, the 3’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SRE derived from mouse Col4a5 Intron 33.

[0227] Meanwhile, the inserted intron and the 3’ intron of the N-ss RTM, as well as the second inserted intron and the 3’ intron of the M-ss RTM each comprises a 5’ trans-splicing fragments. The 5’ trans-splicing fragments perform the reciprocal role in trans-splicing. Each 5’ trans-splicing fragment contains an SD, which furnishes the canonical GU dinucleotide and surrounding consensus nucleotides required for spliceosome engagement and, when two RTMs hybridize, is juxtaposed to the SRE of the partner intron so that the spliceosome recognizes a complete SD–SA pair in trans. While the SD can be the donor that is naturally linked to the particular SRE sequence from which the element was derived, such provenance is not required; any SD sequence that supports accurate exon ligation and yields efficient trans-splicing with the chosen SRE is suitable. A person of ordinary skill in the art can select or engineer alternative SD motifs, for example, by adjusting the extended (C / A) AG GURAGU consensus, using routine mutagenesis and functional screening to match the SRE of interest and optimize editing efficiency.

[0228] In some embodiments, two, three, or four of these 5’ trans-splicing fragments (namely, the splicing fragments present in the inserted intron and the 3’ intron of the N-ss RTM, as well as in the second inserted intron and the 3’ intron of the M-ss RTM) an SD derived from ADGRG1 Intron 8, AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of these introns can independently have at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 66-72, 76, 101, 109, 111, 117, 119, 132, 134, and 136.

[0229] In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns (namely, the splicing fragments present in the inserted intron and the 3’ intron of the N-ss RTM, as well as in the second inserted intron and the 3’ intron of the M-ss RTM) can have an SD derived from ADGRG1 Intron 8. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from AZIN2 Intron 3. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 117. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from BRCA1 Intron 13. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from CD209 Intron 3. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from CD38 Intron 3. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 70. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from COL4A5 Intron 25. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 66. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 69. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from COL4A5 Intron 32. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 132. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from COL4A5 Intron 35. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 76. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from COL4A5 Intron 39. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 134. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from IFT122 Intron 8. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from KCNIP2 Intron 5. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from LCN10 Intron 2. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from LINC02889 Intron 8. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 101. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from MPHOSPH6 Intron 2. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from MRPL48 Intron 4. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from NMNAT3 Intron 5. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 111. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from NSF Intron 2. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 71. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from SHOC2 Intron 2. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 119. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from TBK1 Intron 14. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 68. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 109. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from ZNF346 Intron 2. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 67. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from mouse Col4a5 Intron 30. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment of one, two, three or four of these introns contain an SD derived from mouse Col4a5 Intron 33. In some embodiments, the 5’ trans-splicing fragment has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 136.

[0230] The triple RTM systems provided herein have four sets of trans-splicing introns, (1) the inserted intron of the N-ss RTM and the 5’s intron of the M-ss RTM; (2) the first inserted intron of the M-ss RTM and the 3’s intron of the N-ss RTM; (3) the second inserted intron of the M-ss RTM and the 5’s intron of the C-ss RTM, and (4) the 3’s intron of the M-ss RTM and the inserted intron of the C-ss RTM. Each pair involves an intron providing the 5’s trans-splicing fragment, and an intron providing the 3’s trans-splicing fragment. The 5’ and 3’ trans-splicing fragments can be any pair of trans-splicing fragments disclosed herein or otherwise known in the art. In some embodiments, for example, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to: (1) SEQ ID NOs: 66 and 37, respectively; (2) SEQ ID NOs: 66 and 41, respectively; (3) SEQ ID NOs: 66 and 42, respectively; (4) SEQ ID NOs: 66 and 44, respectively; (5) SEQ ID NOs: 67 and 40, respectively; (6) SEQ ID NOs: 67 and 41, respectively; (7) SEQ ID NOs: 67 and 42, respectively; (8) SEQ ID NOs: 67 and 44, respectively; (8) SEQ ID NOs: 68 and 50, respectively; (9) SEQ ID NOs: 70 and 41, respectively; (10) SEQ ID NOs: 71 and 73, respectively; (11) SEQ ID NOs: 71 and 73, respectively; (12) SEQ ID NOs: 72 and 74, respectively; (13) SEQ ID NOs: 76 and 47, respectively; (14) SEQ ID NOs: 101 and 97, respectively; (15) SEQ ID NOs: 109 and 105, respectively; (16) SEQ ID NOs: 111 and 107, respectively; or (17) SEQ ID NOs: 117 and 113, respectively; or (19) SEQ ID NOs: 119 and 115, respectively.

[0231] In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 66 and 37, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 66 and 41, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 66 and 42, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 66 and 44, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 67 and 40, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 67 and 41, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 67 and 42, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 67 and 44, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 68 and 50, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 70 and 41, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 71 and 73, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 71 and 73, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 72 and 74, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 76 and 47, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 101 and 97, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 109 and 105, respectively. In some embodiments, the 5’ and 3’ trans-splicing fragments can have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 111 and 107, respectively; or SEQ ID NOs: 117 and 113, respectively; or SEQ ID NOs: 119 and 115, respectively.

[0232] As a person of ordinary skill in the art would understand, the four sets of trans-splicing introns, namely, (1) the inserted intron of the N-ss RTM and the 5’s intron of the M-ss RTM; (2) the first inserted intron of the M-ss RTM and the 3’s intron of the N-ss RTM; (3) the second inserted intron of the M-ss RTM and the 5’s intron of the C-ss RTM, and (4) the 3’s intron of the M-ss RTM and the inserted intron of the C-ss RTM, can be independently designed, as long as they can both achieve effective trans-splicing. For illustrative purposes, in some embodiments: (A) the inserted intron of the N-ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (1a) ; the 3’ intron of the N-ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (2a) ; the 5’ intron of M-ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (3a) ; the first inserted intron of M-ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (4a) ; wherein the trans-splicing fragments (1a) , (2a) , (3a) , and (4a) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to: (i) SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively; (ii) SEQ ID NOs: 76, 68, 47, and 50, respectively; (iii) SEQ ID NOs: 66, 67, 41, and 41, respectively; (iv) SEQ ID NOs: 66, 67, 42, and 42, respectively; (v) SEQ ID NOs: 66, 67, 44, and 44, respectively; (vi) SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively; (vii) SEQ ID NOs: 71, 72, 73, and 74, respectively; (viii) SEQ ID NOs: 70, 72, 41, and 74, respectively; (ix) SEQ ID NOs: 71, 101, 73, and 97, respectively; (x) SEQ ID NOs: 109, 111, 105, and 107, respectively; or (xi) SEQ ID NOs: 117, 119, 113, and 115, respectively. In some embodiments, (B) the second inserted intron of the M-ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (1b) ; the 3’ intron of the M-ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (2b) ; the 5’ intron of C-ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (3b) ; the inserted intron of C-ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (4b) ; wherein the trans-splicing fragments (1b) , (2b) , (3b) , and (4b) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to: (i) SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively; (ii) SEQ ID NOs: 76, 68, 47, and 50, respectively; (iii) SEQ ID NOs: 66, 67, 41, and 41, respectively; (iv) SEQ ID NOs: 66, 67, 42, and 42, respectively; (v) SEQ ID NOs: 66, 67, 44, and 44, respectively; (vi) SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively; (vii) SEQ ID NOs: 71, 72, 73, and 74, respectively; (viii) SEQ ID NOs: 70, 72, 41, and 74, respectively; (ix) SEQ ID NOs: 71, 101, 73, and 97, respectively; (x) SEQ ID NOs: 109, 111, 105, and 107, respectively; or (xi) SEQ ID NOs: 117, 119, 113, and 115, respectively.

[0233] In some illustrative embodiments, (A) the inserted intron of the N-ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (1a) ; the 3’ intron of the N-ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (2a) ; the 5’ intron of M-ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (3a) ; the first inserted intron of M-ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (4a) ; wherein the trans-splicing fragments (1a) , (2a) , (3a) , and (4a) have nucleotide sequences SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively; and (B) the second inserted intron of the M-ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (1b) ; the 3’ intron of the M-ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (2b) ; the 5’ intron of C-ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (3b) ; the inserted intron of C-ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (4b) ; wherein the trans-splicing fragments (1b) , (2b) , (3b) , and (4b) have nucleotide sequences SEQ ID NOs: 76, 68, 47, and 50, respectively. It is to be understood that the triple RTM systems disclosed herein are not limited by the choice of specific splicing fragment sequences. Other splicing fragments identified using methods disclosed herein or otherwise in the art can also be adopted.

[0234] The triple RTM systems provided herein contain four sets of reverse complementarily paired sequences, namely, the binding fragments of: (1) the inserted intron of the N-ss RTM and the 5’s intron of the M-ss RTM; (2) the first inserted intron of the M-ss RTM and the 3’s intron of the N-ss RTM; (3) the second inserted intron of the M-ss RTM and the 5’s intron of the C-ss RTM, and (4) the 3’s intron of the M-ss RTM and the inserted intron of the C-ss RTM. In some embodiments, the length for the reverse complementarily paired binding fragments ranges from 30 to 1500 base pairs (bp) . In some embodiments, the length for the reverse complementarily paired binding fragments ranges from 50 to 1000 bp, from 100 to 900 bp, from 200 to 900 bp, from 300 to 800 bp, from 400 to 700 bp, from 500 to 700 bp, from 150 to 600 bp, from 200 to 600 bp, from 300 to 600 bp, from 400 to 600 bp, from 500 to 600 bp, or from 180 to 300 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 50 to 1000 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 100 to 900 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 200 to 900 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 300 to 800 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 400 to 700 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 500 to 700 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 150 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 200 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 300 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 400 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 500 to 600 bp. In some embodiments, the length of the complementary region ranges from 180 to 300 bp. In some embodiments, the length for the reverse complementarily paired binding fragments is about 150 bp, about 200 bp, about 300 bp, about 400 bp, about 500 bp, about 600 bp, about 700 bp, about 800 bp, or about 900 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 150 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 300 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 400 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 500 bp. In some embodiments, the length of the complementary region is about 600 bp.

[0235] The triple RTM systems provided herein have four sets of reverse complementarily paired sequences, which are the binding fragments of: (1) the inserted intron of the N-ss RTM and the 5’s intron of the M-ss RTM; (2) the first inserted intron of the M-ss RTM and the 3’s intron of the N-ss RTM; (3) the second inserted intron of the M-ss RTM and the 5’s intron of the C-ss RTM, and (4) the 3’s intron of the M-ss RTM and the inserted intron of the C-ss RTM. In some embodiments, the binding fragments are each derived from a natural intron.

[0236] For example, in some embodiments, an inserted intron and its pairing end-tail intron (i.e., the inserted intron of the N-ss RTM and the 5’ intron of the M-ss RTM, the first inserted intron of the M-ss RTM and the 3’s intron of the N-ss RTM, the second inserted intron of the M-ss RTM and the 5’ intron of the C-ss RTM, the inserted intron of the C-ss RTM and the 3’s intron of the M-ss RTM) can be at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a binding fragment derived from COL4A5 Intron 25 (Intron 25 binding fragment) and its reverse complementary fragment, respectively. In some embodiments, the complementary region can be about 75 bp in length, about 150 bp in length, about 300 bp in length, about 400 bp in length, about 500 bp in length, or about 600 bp in length. In some embodiments, Intron 25 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 35 and 78, respectively. In some embodiments, Intron 25 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 35 and 36, respectively. Intron 25 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 99 and 94, respectively. In some embodiments, Intron 25 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 82 and 80, respectively.

[0237] In some embodiments, an inserted intron and its pairing end-tail intron (i.e., the inserted intron of the N-ss RTM and the 5’ intron of the M-ss RTM, the first inserted intron of the M-ss RTM and the 3’s intron of the N-ss RTM, the second inserted intron of the M-ss RTM and the 5’ intron of the C-ss RTM, the inserted intron of the C-ss RTM and the 3’s intron of the M-ss RTM) can be at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a binding fragment derived from COL4A5 Intron 32 (Intron 32 binding fragment) and its reverse complementary fragment, respectively. In some embodiments, the complementary region can be about 75 bp in length, about 150 bp in length, about 300 bp in length, about 400 bp in length, about 500 bp in length, or about 600 bp in length. In some embodiments, Intron 32 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 38 and 79, respectively. In some embodiments, Intron 32 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 38 and 39, respectively. Intron 32 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 96 and 102, respectively. In some embodiments, Intron 32 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 81 and 83, respectively.

[0238] In some embodiments, an inserted intron and its pairing end-tail intron (i.e., the inserted intron of the N-ss RTM and the 5’ intron of the M-ss RTM, the first inserted intron of the M-ss RTM and the 3’s intron of the N-ss RTM, the second inserted intron of the M-ss RTM and the 5’ intron of the C-ss RTM, the inserted intron of the C-ss RTM and the 3’s intron of the M-ss RTM) can be at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a binding fragment derived from COL4A5 Intron 35 (Intron 35 binding fragment) and its reverse complementary fragment, respectively. In some embodiments, the complementary region can be about 75 bp in length, about 150 bp in length, about 300 bp in length, about 400 bp in length, about 500 bp in length, or about 600 bp in length. In some embodiments, Intron 35 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 45 and 46, respectively.

[0239] In some embodiments, an inserted intron and its pairing end-tail intron (i.e., the inserted intron of the N-ss RTM and the 5’ intron of the M-ss RTM, the first inserted intron of the M-ss RTM and the 3’s intron of the N-ss RTM, the second inserted intron of the M-ss RTM and the 5’ intron of the C-ss RTM, the inserted intron of the C-ss RTM and the 3’s intron of the M-ss RTM) can be at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a binding fragment derived from COL4A5 Intron 39 (Intron 39 binding fragment) and its reverse complementary fragment, respectively. In some embodiments, the complementary region can be about 75 bp in length, about 150 bp in length, about 300 bp in length, about 400 bp in length, about 500 bp in length, or about 600 bp in length. In some embodiments, Intron 39 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 48 and 49, respectively.

[0240] In some embodiments, an inserted intron and its pairing end-tail intron (i.e., the inserted intron of the N-ss RTM and the 5’ intron of the M-ss RTM, the first inserted intron of the M-ss RTM and the 3’s intron of the N-ss RTM, the second inserted intron of the M-ss RTM and the 5’ intron of the C-ss RTM, the inserted intron of the C-ss RTM and the 3’s intron of the M-ss RTM) can be at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a binding fragment derived from mouse COL4A5 Intron 30 (mouse Intron 30 binding fragment) and its reverse complementary fragment, respectively. In some embodiments, the complementary region can be about 75 bp in length, about 150 bp in length, about 300 bp in length, about 400 bp in length, about 500 bp in length, or about 600 bp in length. In some embodiments, m-Intron 30 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 89 and 91, respectively. In some embodiments, m-Intron 30 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 85 and 87, respectively.

[0241] In some embodiments, an inserted intron and its pairing end-tail intron (i.e., the inserted intron of the N-ss RTM and the 5’ intron of the M-ss RTM, the first inserted intron of the M-ss RTM and the 3’s intron of the N-ss RTM, the second inserted intron of the M-ss RTM and the 5’ intron of the C-ss RTM, the inserted intron of the C-ss RTM and the 3’s intron of the M-ss RTM) can be at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a binding fragment derived from COL4A5 mouse Intron 33 (mouse Intron 33 binding fragment) and its reverse complementary fragment, respectively. In some embodiments, the complementary region can be about 75 bp in length, about 150 bp in length, about 300 bp in length, about 400 bp in length, about 500 bp in length, or about 600 bp in length. In some embodiments, mouse Intron 33 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 88 and 86, respectively. In some embodiments, mouse Intron 33 binding fragment and its reverse complementary fragment have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 92 and 90, respectively.

[0242] It is to be understood that the dual RTM systems disclosed herein are not limited by the choice of specific splicing fragment sequences or binding fragment sequences. Other reverse complementarily paired sequences can also be adopted herein. To avoid mispairing, four different sets of binding pairs are used for each trans-splicing pairs. For example, the binding fragment pair (1) for the trans-splicing pair of inserted intron of the N-ss RTM and the 5’ intron of the M-ss RTM, the binding fragment pair (2) for the trans-splicing pair of the first inserted intron of the M-ss RTM and the 3’s intron of the N-ss RTM, the binding fragment pair (3) for the trans-splicing pair of second inserted intron of the M-ss RTM and the 5’ intron of the C-ss RTM, the binding fragment pair (4) for the trans-splicing pair of the inserted intron of the C-ss RTM and the 3’s intron of the M-ss RTM, can constitute of (1) Intron 25 binding fragment (e.g., SEQ ID NO: 35, 82, or 99) and its reverse complement fragment, (2) Intron 32 binding fragment (e.g., SEQ ID NO: 38, 81, 84, or 96) and its reverse complement fragment, (3) Intron 35 binding fragment (e.g., SEQ ID NO: 45) and its reverse complement fragment and (4) Intron 39 binding fragment (e.g., SEQ ID NO: 48) and its reverse complement fragment.

[0243] It is to be understood that the triple RTM systems disclosed herein are not limited by the choice of specific inserted intron sequences or binding fragment sequences. Other reverse complementarily paired sequences can also be adopted herein.

[0244] In some embodiments, one, two or three of the RTMs in the triple RTM systems provided herein can be further optimized by incorporating an RNA-stabilizing element positioned between the binding fragment and the trans-splicing fragment. Suitable RNA-stabilizing elements include, without limitation, G-quadruplex (G4) motifs, kissing-loop-like duplexes; canonical stem–loop or hairpin structures (e.g., GC-rich clamps or thermodynamically stable tetraloops such as GNRA or UNCG) ; pseudoknots, including H-type and quasi-knot architectures; RNA triplex motifs comprising Hoogsteen base-paired third strands; tRNA-like scaffolds derived from plant viral 3′ termini; internal ribosome-entry site (IRES) core domains that adopt stable multi-stem conformations; self-dimerizing C-rich i-motifs; stabilizing aptamer folds (e.g., theophylline-binding or spinach aptamers) with or without cognate ligands; ribozyme core folds rendered catalytically inactive but conformationally rigid (e.g., HDV or hammerhead cores) ; and synthetic lock-and-key modules engineered from complementary sense / antisense micro-domains that anneal intramolecularly. The stabilizing element can be flanked by short linker sequences (1–10 nt) to avoid interfering with splice-site recognition and may itself carry chemical modifications-such as 2′-O-methyl, 2′-fluoro, phosphorothioate, or locked nucleic acid (LNA) residues-that further increase nuclease resistance without disrupting the desired secondary or tertiary structure. In some embodiments, the N-ss RTM, M-ss RTM, C-ss RTM, or any combination thereof, further comprise a G4 motif (e.g., SEQ ID NO: 64) . In some embodiments, the N-ss RTM, M-ss RTM, C-ss RTM, or any combination thereof, further comprise kissing-loop-like sequence (e.g., SEQ ID NO: 65 &137) .

[0245] Provided herein are triple RTM systems comprising a N-ss RTM, a M-ss RTM, and a C-ss RTM, wherein (1) the N-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a replacement fragment comprising an inserted intron and a 3’ intron; (2) the M-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a 5’ intron, a replacement fragment comprising a first inserted intron and a second inserted intron, and a 3’ intron; and (3) the C-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a 5’ intron, and a replacement fragment comprising an inserted intron; wherein (1) the inserted intron and the 3’ intron of the N-ss RTM each has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identity with SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively; (2) the 5’ intron, the first inserted intron, the second inserted intron, and the 3’ intron of the M-ss RTM each has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identity with SEQ ID NOs: 4, 5, 10, and 11, respectively; and (3) the 5’ intron and the inserted intron of the C-ss RTM each has at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identity with SEQ ID NOs: 12 and 13, respectively.

[0246] In some embodiments, the replacement fragment of a N-ss RTM can further include 5’ untranslated region (5’ UTR) . The 5′ UTR can be selected or engineered to contain one or more regulatory features that influence translation initiation, transcript stability, nuclear export, or sub-cellular localization. Representative features include: (i) a canonical or optimized Kozak consensus and related translation-initiator sequence (TISU) to improve ribosome scanning and start-codon recognition; (ii) internal ribosome-entry sites (IRESs) or other cap-independent translation-enhancer elements that permit efficient initiation under stress or in cap-deficient contexts; (iii) strategically placed up-stream open-reading frames (uORFs) or attenuator peptides that fine-tune downstream ORF translation; (iv) an optional leader intron whose splicing is coupled to nuclear export and cap-binding-protein exchange; (v) RNA-folding motifs-such as stable GC-rich stem–loops, G-quadruplexes, or engineered pseudoknots-that modulate ribosome scanning speed or protect the 5′ end from nucleases; and (vi) ligand-responsive riboswitches or aptamers that enable small-molecule control of translation. Any of these structures can be used singly or in combination and may incorporate chemically modified bases (e.g., 2′-O-methyl, ψ-uridine) to enhance stability or reduce innate-immune activation. Certain elements-such as riboswitches, aptamers, G-quadruplexes, and other secondary structures-are functional whether placed in the 5′ UTR or the 3′ UTR, giving designers additional flexibility.

[0247] In some embodiments, the replacement fragment of a C-ss RTM can further comprise a 3′ untranslated region (3′ UTR) . The 3′ UTR can likewise be configured with regulatory elements that govern transcript half-life, localization, and translational efficiency. Exemplary elements include: (i) canonical or alternative polyadenylation signals flanked by upstream and downstream auxiliary motifs that dictate cleavage and tail addition; (ii) AU-rich or GU-rich elements, cytoplasmic polyadenylation elements (CPEs) , or other binding sites for RNA-stability factors such as HuR, TTP, or CPEB; (iii) microRNA-response elements (MREs) that allow cell-type-specific repression by endogenous miRNAs; (iv) clusters of m6A (N6-methyladenosine) or other epitranscriptomic marks read by YTH-family proteins to influence decay or translation; (v) well-characterized zip-code or Staufen-binding sites that direct the mRNA to particular sub-cellular locales (e.g., leading-edge lamellipodia, neuronal dendrites) ; (vi) cap-independent translation enhancers positioned at the 3′ end (e.g., tombusvirus-or BYDV-derived 3′ CITEs) that recruit initiation factors in trans; (vii) SECIS elements that permit selenocysteine incorporation; and (viii) ligand-responsive aptamers, riboswitches, or self-cleaving aptazymes that modulate stability or translation in response to small molecules. As noted above, structures such as aptamers, riboswitches, G-quadruplexes, and other compact tertiary folds can be functional in either the 5′ UTR or the 3′ UTR, and their placement can be tailored to achieve the desired regulatory outcome.

[0248] For illustrative purposes, triple RTMs are prepared for GFP protein. As shown in FIG. 11, full-length mature mRNA for GFP is split into five fragments, GFP-N (e.g., SEQ ID NO: 14) , GFP-M1 (e.g., SEQ ID NO: 15) , GFP-M2 (e.g., SEQ ID NO: 16) , GFP-M3 (e.g., SEQ ID NO: 17) , and GFP-C (e.g., SEQ ID NO: 18) . The triple RTMs include the N-ss RTM, M-ss RTM and C-ss RTM. The N-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a GFP-N exon, an inserted intron, a GFP-M1 exon, and a 3’intron. The M-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a 5’ intron, the GFP-M1 exon, a first inserted intron, a GFP-M2 exon, a second inserted intron, a GFP-M3 exon, and a 3’ intron. The C-ss RTM comprises, from 5’ to 3’ , a 5’ intron, the GFP-M3 exon, an inserted intron, and GFP-C exon.

[0249] As shown, the inserted intron of the N-ss RTM pairs with the 5’s intron of the M-ss RTM for trans-splicing; the first inserted intron of the M-ss RTM pairs with the 3’ intron of the N-ss RTM for trans-splicing; the second inserted intron of the M-ss RTM pairs with the 5’s intron of the C-ss RTM for trans-splicing; and the inserted intron of the C-ss RTM pairs with the 3’ intron of the M-ss RTM for trans-splicing. It is to be understood that the triple RTM systems are not limited by the coding sequences of the replacement sequences, and can be designed to edit / express any mRNA sequence by incorporating the desired replacement sequence. For example, to express a target protein (POI; or protein-of-interest) , the coding sequence of the POI can be divided into five parts, similar as the GFP-N exon, M1 exon, M2 exon, M3 exon, and C exon, and the exon sequences can be incorporated into the triple RTM system as the GFP exons. Upon splicing, the exon sequences will be linked together to form the mature mRNA that can translate into the desired POI.

[0250] The triple RTM systems disclosed herein are also nucleic acid molecules. The RTMs can be DNA, RNA, DNA / RNA hybrid, or nucleic acid analog molecules. In some embodiments, the RTMs are DNA molecules. In some embodiments, the RTMs are RNA molecules. Provided herein are also vectors comprising the RTM provided herein. In some embodiments, provided herein is a single vector that comprise N-ss RTM, M-ss RTM and C-ss RTM. In some embodiments, provided herein are two vectors that collectively comprise N-ss RTM, M-ss RTM and C-ss RTM. In some embodiments, provided herein are three vectors, one comprising the N-ss RTM, one comprising the M-ss RTM and the other comprising C-ss RTM.

[0251] In some embodiments, the vector (s) can be a recombinant expression vector. In some embodiments, the vector (s) can be a viral vector, such as an adenovirus (AV) , an Adeno-Associated Virus (AAV) , a lentivirus (LV) , a retrovirus (RV) , a herpes simplex virus (HSV) , or a baculovirus (BEV) . In some embodiments, the viral vector (s) can be a single-stranded Adeno-Associated Virus (ssAAV) or a self-complementary Adeno-Associated Virus (scAAV) . In some embodiments, the vector (s) can be a non-viral vector. In some embodiments, the non-viral vector can be a plasmid, a liposome, a nanoparticle, a polymer, a transposon, an exosome, a minicircle, a cosmid, a YAC vector, or BAC vector.

[0252] Provided herein are also cells comprising the triple RTM systems disclosed herein.

[0253] Provided herein are also pharmaceutical compositions comprising the triple RTM systems disclosed herein, and at least one pharmaceutically acceptable carrier. Provided herein are also pharmaceutical compositions comprising the cell comprising triple RTM systems disclosed herein, and at least one pharmaceutically acceptable carrier.

[0254] Provided herein are also methods for mRNA editing, comprising utilizing the triple RTM system to correct mutations in endogenous mRNAs or prepare mRNA with desired modification.

[0255] Provided herein are also methods of correcting a pre-mRNA with a mutation, comprising contacting the pre-mRNA with the triple RTM systems disclosed herein under conditions suitable for trans-splicing, wherein the replacement fragment of N-ss RTM, M-ss RTM and / or C-ss RTM has the correct sequence. Provided herein are also method of editing a pre-mRNA comprising contacting the pre-mRNA with the triple RTM system disclosed herein under conditions suitable for trans-splicing, wherein the replacement fragment of N-ss RTM, M-ss RTM and / or C-ss RTM has the edited sequence.

[0256] The methods provided herein can be performed in vitro or in vivo. In some embodiments, methods provided herein are performed in vitro. Accordingly, provided herein are methods of correcting an endogenous pre-mRNA with a mutation in a cell comprising transferring the triple RTM system disclosed herein to the cell, wherein the replacement fragment of N-ss RTM, M-ss RTM and / or C-ss RTM has the correct sequence. Provided herein are methods of editing an endogenous pre-mRNA with a mutation in a cell comprising transferring the triple RTM system disclosed herein to the cell, wherein the replacement fragment of N-ss RTM, M-ss RTM and / or C-ss RTM has the edited sequence.

[0257] In some embodiments, the methods provided herein are performed in vivo. In some embodiments, provided herein are methods of treating a disease or disorder associated with a gene mutation in a subject in need thereof comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising the triple RTM system disclosed herein, wherein the replacement fragment of N-ss RTM, M-ss RTM and / or C-ss RTM in the triple RTM system has the correct sequence for the mutated gene.

[0258] In addition to editing mRNA sequences, the triple RTM system provided herein can also be used for recombinant expression independent of an endogenous mRNA template. In some embodiments, provided herein are also methods of expressing a recombinant mRNA, comprising culturing the triple RTM system disclosed herein under conditions suitable for trans-splicing. In some embodiments, provided herein also methods of expressing a recombinant mRNA, comprising culturing the cell comprising the triple RTM system disclosed herein conditions suitable for recombinant expression.

[0259] Because the coding sequences will be split into three fragments into the N-ss RTM, M-ss RTM and the C-ss RTM, the size of the target mRNA can go up to about three times the packing capacity limitation of the delivery vectors. In some embodiments, the triple RTM systems provided herein can produce recombinant mRNA that is at least 5 kb in length. In some embodiments, the triple RTM systems provided herein can produce recombinant mRNA that is at least 8 kb in length, at least 10 kb in length, at least 12 kb in length, or at least 15 kb in length. In some embodiments, the dual RTM systems provided herein can produce recombinant mRNA that ranges from 5 kb to 20 kb, 8 kb to 20 kb, 10 kb to 20 kb, 12 kb to 20 kb, 15 kb to 20 kb, 18 kb to 20 kb, 5 kb to 15 kb, 8 kb to 15 kb, 10 kb to 15 kb, 12 kb to 15 kb, 5 kb to 12 kb, 8 kb to 12 kb, 10 kb to 12 kb, 5 kb to 10 kb, or 8 kb to 10 kb in length. In some embodiments, the mRNA product ranges from 5 kb to 15 kb in length. In some embodiments, the mRNA product ranges from 10 kb to 15 kb in length. In some embodiments, the mRNA product ranges from 12 kb to 15 kb in length. 6.2 Vectors, cells, and recombinant expression

[0260] The RTMs provided herein can be used for mRNA editing, modification, and expression of target protein. In some embodiments, the RTMs can be delivered to target cells using a vector. Accordingly, provided herein are recombinant expression vectors comprising an RTM disclosed herein. The vectors can be expression vectors. The vectors can be recombinant vectors. In some embodiments, the vectors can deliver the RTM systems to a cell such that they effectively edit a target mRNA in the cell or express an exogenous target protein in the cell. Upon delivery to the cell, the RTMs encoded by the introduced nucleic acid are expressed within the cell. In some embodiments, the vector is a eukaryotic expression vector. In some embodiments, the vector is made of virus derived sequences. In some embodiments, the vector comprises specific regulatory elements in order to direct tissue-specific transgene expression.

[0261] Suitable expression vectors for in vitro or in vivo expression can be found in the literature. These vectors can also be easily modified by the person of skill in the art in order to be applied in the methods disclosed herein. The expression vectors usually contain all genetic elements that are necessary for the production of a specific RTM molecule.

[0262] In some embodiments, the vector disclosed herein include plasmids, phagemids, phages, cosmids, artificial mammalian chromosomes, knock-out or knock-in constructs, viruses, in particular adenovirus, vaccinia virus, lentivirus (Chang and Gay (20001) Curr. Gene Therap. 1: 237-251) , Herpes simplex virus (HSV-1, Carlezon et al., (2000) Crit. Rev. Neurobiol; 14 (1) : 47-67) , baculovirus, retrovirus, adeno-associated-virus (AAV, Carter and Samulski (2000) J. Mol. Med. 6: 17-27) , rhinovirus, human immune deficiency virus (HIV) , filovirus and engineered versions thereof (see, for example, Cobinger et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19: 225-30) , virosomes, “naked” DNA liposomes, and nucleic acid coated particles, in particular gold spheres. Particularly preferred are viral vectors like adenoviral vectors or retroviral vectors (Lindemann et al., (1997) Mol. Med. 3: 466-76 and Springer et al., (1998) Mol. Cell. 2: 549-58) . Liposomes are usually small unilamellar or multilamellar vesicles made of neutral cationic and / or anionic lipids, for example, by ultrasound treatment of liposomal suspensions. The DNA can, for example, be ionically bound to the surface of the liposomes or internally enclosed in the liposome. Suitable lipid mixtures are known in the art and comprise, for example, cholesterol, phospholipide like, for example, phosphatidylcholin (PC) , phosphatidylserin (PS) and the like, DOTMA (1, 2-Dioleyloxpropyl-3-trimethylammoniumbromid) and DPOE (Dioleoylphosphatidylethanola-min) which both have been used on a variety of cell lines.

[0263] In some embodiments, the vector is a viral vector.

[0264] In some embodiments, the viral vector is an adenovirus (AV) , an Adeno-Associated Virus (AAV) , a lentivirus (LV) , a retrovirus (RV) , a herpes simplex virus (HSV) , or a baculovirus (BEV) . In some embodiments, the expression vector is selected from viral expression vectors (e.g., viral vectors based on vaccinia virus; poliovirus; adenovirus (see, e.g., Li et al. ., Invest Opthalmol Vis. Sci. 35: 2543 2549, 1994; Borras et al. ., Gene Ther 6: 515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92: 7700 7704, 1995; Sakamoto et al. ., H Gene Ther 5: 1088 1097, 1999; WO 94 / 12649, WO 93 / 03769; WO 93 / 19191; WO 94 / 28938; WO 95 / 11984 and WO 95 / 00655) ; adeno-associated virus (AAV) (see, e.g., Ali et al. ., Hum Gene Ther 9: 81 86, 1998, Flannery et al. ., PNAS 94: 69166921, 1997; Bennett et al. ., Invest Opthalmol Vis Sci 38: 2857 2863, 1997; Jomary et al. ., Gene Ther 4: 683 690, 1997, Rolling et al. ., Hum Gene Ther 10: 641 648, 1999; Ali et al. ., Hum Mol Genet 5: 591 594, 1996; Srivastava in WO 93 / 09239, Samulski et al. ., J. Vir. (1989) 63: 3822-3828; Mendelson et al.., Virol. (1988) 166: 154-165; and Flotte et al. ., PNAS (1993) 90: 10613-10617) ; SV40; herpes simplex virus; human immunodeficiency virus (see, e.g., Miyoshi et al. ., PNAS 94: 10319 23, 1997; Takahashi et al. ., J Virol 73: 7812 7816, 1999) ; a retroviral vector (e.g., Murine Leukemia Virus, spleen necrosis virus, and vectors derived from retroviruses such as Rous Sarcoma Virus, Harvey Sarcoma Virus, avian leukosis virus, a lentivirus, human immunodeficiency virus, myeloproliferative sarcoma virus, and mammary tumor virus) ; and the like. In some embodiments, a recombinant expression vector of the present disclosure is a recombinant lentivirus vector. In some embodiments, a recombinant expression vector of the present disclosure is a recombinant retroviral vector.

[0265] In some embodiments, the viral vectors used in the methods described herein are lentivirus based viral vectors. Four plasmids are used to make the construct: Gag / pol sequence containing plasmid, Rev sequence containing plasmids, Envelope protein containing plasmid (i.e., VSV-G) , and Cis plasmid with the packaging elements and the transgene. For lentiviral vector production, the four plasmids are co-transfected into cells (i.e., HEK293 based cells) , whereby polyethylenimine or calcium phosphate can be used as transfection agents, among others. The lentivirus is then harvested in the supernatant. Exemplary protocols for production of lentiviral vectors can be found in Lesch et al., 2011, Gene Therapy 18: 531-538, and Ausubel et al., 2012, Bioprocess Int. 10 (2) : 32-43, both of which are incorporated by reference herein in their entireties.

[0266] In some embodiments, the viral vectors provided herein are herpes simplex virus-based viral vectors. In some embodiments, the viral vectors provided herein are MLV based viral vectors. In some embodiments, the viral vectors provided herein are human immunodeficiency virus (HIV) -based vectors. In some embodiments, the viral vectors provided herein are lentivirus-based viral vectors. In some embodiments, the viral vectors provided herein are alphavirus-based viral vectors. Alphavirus vectors include semliki forest virus (SFV) and sindbis virus (SIN) . In some embodiments, alphavirus vectors provided herein are recombinant, replication-defective alphaviruses.

[0267] In some embodiments, a recombinant expression vector of the present disclosure is a recombinant AAV vector. In some embodiments, the viral vector is or comprises an AAV. AAV vectors of the present disclosure can comprise or be derived from any natural or recombinant AAV serotype. According to the present disclosure, the AAV vectors can utilize or be based on a serotype or include a peptide selected from any of the following: AAV1, AAV2, AAV2.5, AAV2G9, AAV3, AAV3a, AAV3b, AAV3-3, AAV4, AAV4-4, AAV5, AAV6, AAV6.1, AAV6.2, AAV6.1.2, AAV7, AAV7.2, AAV8, AAV9, AAV9.11, AAV9.13, AAV9.16, AAV9.24, AAV9.45, AAV9.47, AAV9.61, AAV9.68, AAV9.84, AAV9.9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, and any other AAV now known or later discovered. See, e.g., Fields et al. VIROLOGY, 4th ed. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996. Additional AAV serotypes and clades have been identified recently. See, e.g., Gao et al. J. Virol. 78: 6381 (2004) ; Moris et al. Virol. 33: 375 (2004) .

[0268] Additionally, the AAV vectors can also utilize or be based on a serotype or include a peptide selected from any of the following VOY101, VOY201, AAVPHP. B (PHP. B) , AAVPHP. A(PHP. A) , AAVG2B-26, AAVG2B-13, AAVTH1.1-32, AAVTH1.1-35, AAVPHP. B2 (PHP. B2) , AAVPHP. B3 (PHP. B3) , AAVPHP. N / PHP. B-DGT, AAVPHP. B-EST, AAVPHP. B-GGT, AAVPHP. B-ATP, AAVPHP. B-ATT-T, AAVPHP. B-DGT-T, AAVPHP. B-GGT-T, AAVPHP. B-SGS, AAVPHP. B-AQP, AAVPHP. B-QQP, AAVPHP. B-SNP (3) , AAVPHP. B-SNP, AAVPHP. B-QGT, AAVPHP. B-NQT, AAVPHP. B-EGS, AAVPHP. B-SGN, AAVPHP. B-EGT, AAVPHP. B-DST, AAVPHP. B-DST, AAVPHP. B-STP, AAVPHP. B-PQP, AAVPHP. B-SQP, AAVPHP. B-QLP, AAVPHP. B-TMP, AAVPHP. B-TTP, AAVPHP. S / G2A12, AAVG2A15 / G2A3 (G2A3) , AAVG2B4 (G2B4) , AAVG2B5 (G2B5) , PHP. S, AAV16.3, AAV24.1, AAV27.3, AAV42.12, AAV42-1b, AAV42-2, AAV42-3a, AAV42-3b, AAV42-4, AAV42-5a, AAV42-5b, AAV42-6b, AAV42-8, AAV42-10, AAV42-11, AAV42-12, AAV42-13, AAV42-15, AAV42-aa, AAV43-1, AAV43-12, AAV43-20, AAV43-21, AAV43-23, AAV43-25, AAV43-5, AAV44.1, AAV44.2, AAV44.5, AAV223.1, AAV223.2, AAV223.4, AAV223.5, AAV223.6, AAV223.7, AAV1-7 / rh. 48, AAV1-8 / rh. 49, AAV2-15 / rh. 62, AAV2-3 / rh. 61, AAV2-4 / rh. 50, AAV2-5 / rh. 51, AAV3.1 / hu. 6, AAV3.1 / hu. 9, AAV3-9 / rh. 52, AAV3-11 / rh. 53, AAV4-8 / r11.64, AAV4-9 / rh. 54, AAV4-19 / rh. 55, AAV5-3 / rh. 57, AAV5-22 / rh. 58, AAV7.3 / hu. 7, AAV16.8 / hu. 10, AAV16.12 / hu. 11, AAV29.3 / bb. 1, AAV29.5 / bb. 2, AAV106.1 / hu. 37, AAV114.3 / hu. 40, AAV127.2 / hu. 41, AAV127.5 / hu. 42, AAV128.3 / hu. 44, AAV130.4 / hu. 48, AAV145.1 / hu. 53, AAV145.5 / hu. 54, AAV145.6 / hu. 55, AAV161.10 / hu. 60, AAV161.6 / hu. 61, AAV33.12 / hu. 17, AAV33.4 / hu. 15, AAV33.8 / hu. 16, AAV52 / hu. 19, AAV52.1 / hu. 20, AAV58.2 / hu. 25, AAVA3.3, AAVA3.4, AAVA3.5, AAVA3.7, AAVC1, AAVC2, AAVC5, AAV-DJ, AAV-DJ8, AAVF3, AAVF5, AAVH2, AAVrh. 72, AAVhu. 8, AAVrh. 68, AAVrh. 70, AAVpi. 1, AAVpi. 3, AAVpi. 2, AAVrh. 60, AAVrh. 44, AAVrh. 65, AAVrh. 55, AAVrh. 47, AAVrh. 69, AAVrh. 45, AAVrh. 59, AAVhu. 12, AAVH6, AAVLK03, AAVH-1 / hu. 1, AAVH-5 / hu. 3, AAVLG-10 / rh. 40, AAVLG-4 / rh. 38, AAVLG-9 / hu. 39, AAVN721-8 / rh. 43, AAVCh. 5, AAVCh. 5R1, AAVcy. 2, AAVcy. 3, AAVcy. 4, AAVcy. 5, AAVCy. 5R1, AAVCy. 5R2, AAVCy. 5R3, AAVCy. 5R4, AAVcy. 6, AAVhu. 1, AAVhu. 2, AAVhu. 3, AAVhu. 4, AAVhu. 5, AAVhu. 6, AAVhu. 7, AAVhu. 9, AAVhu. 10, AAVhu. 11, AAVhu. 13, AAVhu. 15, AAVhu. 16, AAVhu. 17, AAVhu. 18, AAVhu. 20, AAVhu. 21, AAVhu. 22, AAVhu. 23.2, AAVhu. 24, AAVhu. 25, AAVhu. 27, AAVhu. 28, AAVhu. 29, AAVhu. 29R, AAVhu. 31, AAVhu. 32, AAVhu. 34, AAVhu. 35, AAVhu. 37, AAVhu. 39, AAVhu. 40, AAVhu. 41, AAVhu. 42, AAVhu. 43, AAVhu. 44, AAVhu. 44R1, AAVhu. 44R2, AAVhu. 44R3, AAVhu. 45, AAVhu. 46, AAVhu. 47, AAVhu. 48, AAVhu. 48R1, AAVhu. 48R2, AAVhu. 48R3, AAVhu. 49, AAVhu. 51, AAVhu. 52, AAVhu. 54, AAVhu. 55, AAVhu. 56, AAVhu. 57, AAVhu. 58, AAVhu. 60, AAVhu. 61, AAVhu. 63, AAVhu. 64, AAVhu. 66, AAVhu. 67, AAVhu. 14 / 9, AAVhu. t 19, AAVrh. 2, AAVrh. 2R, AAVrh. 8, AAVrh. 8R, AAVrh. 10, AAVrh. 12, AAVrh. 13, AAVrh. 13R, AAVrh. 14, AAVrh. 17, AAVrh. 18, AAVrh. 19, AAVrh. 20, AAVrh. 21, AAVrh. 22, AAVrh. 23, AAVrh. 24, AAVrh. 25, AAVrh. 31, AAVrh. 32, AAVrh. 33, AAVrh. 34, AAVrh. 35, AAVrh. 36, AAVrh. 37, AAVrh. 37R2, AAVrh. 38, AAVrh. 39, AAVrh. 40, AAVrh. 46, AAVrh. 48, AAVrh. 48.1, AAVrh. 48.1.2, AAVrh. 48.2, AAVrh. 49, AAVrh. 51, AAVrh. 52, AAVrh. 53, AAVrh. 54, AAVrh. 56, AAVrh. 57, AAVrh. 58, AAVrh. 61, AAVrh. 64, AAVrh. 64R1, AAVrh. 64R2, AAVrh. 67, AAVrh. 73, AAVrh. 74, AAVrh8R, AAVrh8R A586R mutant, AAVrh8R R533A mutant, AAAV, BAAV, caprine AAV, bovine AAV, AAVhE1.1, AAVhEr1.5, AAVhER1.14, AAVhEr1.8, AAVhEr1.16, AAVhEr1.18, AAVhEr1.35, AAVhEr1.7, AAVhEr1.36, AAVhEr2.29, AAVhEr2.4, AAVhEr2.16, AAVhEr2.30, AAVhEr2.31, AAVhEr2.36, AAVhER1.23, AAVhEr3.1, AAV2.5T, AAV-PAEC, AAV-LK01, AAV-LK02, AAV-LK03, AAV-LK04, AAV-LK05, AAV-LK06, AAV-LK07, AAV-LK08, AAV-LK09, AAV-LK10, AAV-LK11, AAV-LK12, AAV-LK13, AAV-LK14, AAV-LK15, AAV-LK16, AAV-LK17, AAV-LK18, AAV-LK19, AAV-PAEC2, AAV-PAEC4, AAV-PAEC6, AAV-PAEC7, AAV-PAEC8, AAV-PAEC11, AAV-PAEC12, AAV-2-pre-miRNA-101, AAV-8h, AAV-8b, AAV-h, AAV-b, AAV SM 10-2, AAV Shuffle 100-1, AAV Shuffle 100-3, AAV Shuffle 100-7, AAV Shuffle 10-2, AAV Shuffle 10-6, AAV Shuffle 10-8, AAV Shuffle 100-2, AAV SM 10-1, AAV SM 10-8, AAV SM 100-3, AAV SM 100-10, BNP61 AAV, BNP62 AAV, BNP63 AAV, AAVrh. 50, AAVrh. 43, AAVrh. 62, AAVrh. 48, AAVhu. 19, AAVhu. 11, AAVhu. 53, AAV4-8 / rh. 64, AAVLG-9 / hu. 39, AAV54.5 / hu. 23, AAV54.2 / hu. 22, AAV54.7 / hu. 24, AAV54.1 / hu. 21, AAV54.4R / hu. 27, AAV46.2 / hu. 28, AAV46.6 / hu. 29, AAV128.1 / hu. 43, true type AAV (ttAAV) , UPENN AAV 10, Japanese AAV 10 serotypes, AAV CBr-7.1, AAV CBr-7.10, AAV CBr-7.2, AAV CBr-7.3, AAV CBr-7.4, AAV CBr-7.5, AAV CBr-7.7, AAV CBr-7.8, AAV CBr-B7.3, AAV CBr-B7.4, AAV CBr-E1, AAV CBr-E2, AAV CBr-E3, AAV CBr-E4, AAV CBr-E5, AAV CBr-e5, AAV CBr-E6, AAV CBr-E7, AAV CBr-E8, AAV CHt-1, AAV CHt-2, AAV CHt-3, AAV CHt-6.1, AAV CHt-6.10, AAV CHt-6.5, AAV CHt-6.6, AAV CHt-6.7, AAV CHt-6.8, AAV CHt-P1, AAV CHt-P2, AAV CHt-P5, AAV CHt-P6, AAV CHt-P8, AAV CHt-P9, AAV CKd-1, AAV CKd-10, AAV CKd-2, AAV CKd-3, AAV CKd-4, AAV CKd-6, AAV CKd-7, AAV CKd-8, AAV CKd-B1, AAV CKd-B2, AAV CKd-B3, AAV CKd-B4, AAV CKd-B5, AAV CKd-B6, AAV CKd-B7, AAV CKd-B8, AAV CKd-H1, AAV CKd-H2, AAV CKd-H3, AAV CKd-H4, AAV CKd-H5, AAV CKd-H6, AAV CKd-N3, AAV CKd-N4, AAV CKd-N9, AAV CLg-F1, AAV CLg-F2, AAV CLg-F3, AAV CLg-F4, AAV CLg-F5, AAV CLg-F6, AAV CLg-F7, AAV CLg-F8, AAV CLv-1, AAV CLv1-1, AAV Clv1-10, AAV CLv1-2, AAV CLv-12, AAV CLv1-3, AAV CLv-13, AAV CLv1-4, AAV Clv1-7, AAV Clv1-8, AAV Clv1-9, AAV CLv-2, AAV CLv-3, AAV CLv-4, AAV CLv-6, AAV CLv-8, AAV CLv-D1, AAV CLv-D2, AAV CLv-D3, AAV CLv-D4, AAV CLv-D5, AAV CLv-D6, AAV CLv-D7, AAV CLv-D8, AAV CLv-E1, AAV CLv-K1, AAV CLv-K3, AAV CLv-K6, AAV CLv-L4, AAV CLv-L5, AAV CLv-L6, AAV CLv-M1, AAV CLv-M11, AAV CLv-M2, AAV CLv-M5, AAV CLv-M6, AAV CLv-M7, AAV CLv-M8, AAV CLv-M9, AAV CLv-R1, AAV CLv-R2, AAV CLv-R3, AAV CLv-R4, AAV CLv-R5, AAV CLv-R6, AAV CLv-R7, AAV CLv-R8, AAV CLv-R9, AAV CSp-1, AAV CSp-10, AAV CSp-11, AAV CSp-2, AAV CSp-3, AAV CSp-4, AAV CSp-6, AAV CSp-7, AAV CSp-8, AAV CSp-8.10, AAV CSp-8.2, AAV CSp-8.4, AAV CSp-8.5, AAV CSp-8.6, AAV CSp-8.7, AAV CSp-8.8, AAV CSp-8.9, AAV CSp-9, AAV. hu. 48R3, AAV. VR-355, AAV3B, AAV4, AAV5, AAVF1 / HSC1, AAVF11 / HSC11, AAVF12 / HSC12, AAVF13 / HSC13, AAVF14 / HSC14, AAVF15 / HSC15, AAVF16 / HSC16, AAVF17 / HSC17, AAVF2 / HSC2, AAVF3 / HSC3, AAVF4 / HSC4, AAVF5 / HSC5, AAVF6 / HSC6, AAVF7 / HSC7, AAVF8 / HSC8, and / or AAVF9 / HSC9 and variants thereof.

[0269] The viral genome of the AAV vectors of the present disclosure can be single stranded or self-complementary. The size of the vector genome can be small, medium, large or the maximum size. In some embodiments, the AAV vector used in the present disclosure is a single strand vector (ssAAV) . In some embodiments, the AAV vectors can be self-complementary AAV vectors (scAAVs) . See, e.g., US7, 465, 583. scAAV vectors contain both DNA strands that anneal together to form double stranded DNA. By skipping second strand synthesis, scAAVs allow for rapid expression in the cell. In some embodiments, the AAV vector used in the present disclosure is a scAAV.

[0270] Methods for producing and / or modifying AAV vectors are disclosed in the art such as pseudotyped AAV vectors (International Patent Publication Nos. WO200028004; WO200123001; WO2004112727; WO2005005610 and WO2005072364, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entireties) .

[0271] In some embodiments, the vector is a VLP, e.g. a structure that in at least one attribute resembles a virus, but which has not been demonstrated to be infectious. In some embodiments, the VLP is a nonreplicating, noninfectious viral shell that contains a viral capsid but lacks all or part of the viral genome, in particular, the replicative components of the viral genome. In some embodiments, the VLP is composed of one or more viral proteins, such as, but not limited to those proteins referred to as capsid, coat, shell, surface, and structural proteins e.g., VP1, VP2) . In some embodiments, the VLP resembles the structure of a bacteriophage, being non-replicative and noninfectious, and lacking at least the gene or genes coding for the replication machinery of the bacteriophage, and also lacking the gene or genes encoding the protein or proteins responsible for viral attachment to or entry into the host. In some embodiments, the VLP comprises a polypeptide that promotes or is suitable for VLP delivery, including, without limitation, a retroviral gag polyprotein comprising a matrix polypeptide, a capsid polypeptide, and a nucleocapsid polypeptide (optionally with one or more heterologous protease cleavage sites (e.g. TEV cleavage site, a PreScission (fusion protein of glutathione S-transferase (GST) and human rhinovirus (HRV) type 14 3C protease) cleavage site, a human rhinovirus 3C protease cleavage site, an enterokinase cleavage site, an Epstein-Barr virus protease cleavage site, a cathepsin D cleavage site, and / or a thrombin cleavage site) between one or both of: the matrix polypeptide and the capsid polypeptide; and the capsid polypeptide and the nucleocapsid polypeptide, e.g., a lentiviral gag polyprotein, e.g., a bovine immunodeficiency virus gag polyprotein, a murine leukemia virus (MLV) a gag protein, a simian immunodeficiency virus gag polyprotein, a feline immunodeficiency virus gag polyprotein, a human immunodeficiency virus gag polyprotein, an equine infection anemia virus gag polyprotein, and a caprine arthritis encephalitis virus gag polyprotein or a gag polyprotein of an alpha retrovirus, a beta retrovirus, a gamma retrovirus, a delta retrovirus, an epsilon retrovirus, or a spumavirus. In some embodiments, the polypeptide that promotes or is suitable for VLP delivery is co-delivered with a protease to promote cleavage of the chimeric protein. In some embodiments, the cleavage of the chimeric protein occurs between the endonuclease and the polypeptide that promotes or is suitable for VLP delivery. In some embodiments, the protease is fused to a polypeptide that promotes or is suitable for VLP delivery.

[0272] In some embodiments, the vector is a non-viral vector. In some embodiments, the non-viral vector is a plasmid, a liposome, a nanoparticle, a polymer, a transposon, an exosome, a minicircle, a cosmid, a YAC vector, or BAC vector.

[0273] In some embodiments, the vector is a nanoparticle, e.g., any particle having a diameter of less than about 1000 nm. In some embodiments, nanoparticles suitable for use in delivering the present compositions to a target cell have a diameter of about 500 nm or less, e.g., from about 25 nm to about 35 nm, from about 35 nm to about 50 nm, from about 50 nm to about 75 nm, from about 75 nm to about 100 nm, from about 100 nm to about 150 nm, from about 150 nm to about 200 nm, from about 200 nm to about 300 nm, from about 300 nm to about 400 nm, or from about 400 nm to about 500 nm. In some embodiments, nanoparticles suitable for use in delivering the present compositions to a target cell have a diameter of from about 25 nm to about 200 nm. In some embodiments, nanoparticles suitable for use in delivery have a diameter of about 100 nm or less. In some embodiments, nanoparticles suitable for use in delivery have a diameter of from about 35 nm to about 60 nm.

[0274] In some embodiments, the composition comprises a lipid nanoparticle (LNP) , a liposome, a lipoplexes or a polymeric nanoparticle. In some embodiments, the LNP comprises one or more of ionizable lipids, amino lipids, anionic lipids, neutral lipids, amphipathic lipids, helper lipids, structural lipids, PEG lipids, and lipoids.

[0275] In some embodiments, the vector is a particle, e.g., a delivery particle comprising lipid or lipidoid and hydrophilic polymer, e.g., a cationic lipid and a hydrophilic polymer, for instance where the cationic lipid comprises l, 2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP) or 1, 2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) and / or where the hydrophilic polymer comprises ethylene glycol or polyethylene glycol (PEG) ; and / or where the particle further comprises cholesterol.

[0276] In some embodiments, a liposome is used to deliver a composition of the present disclosure to a target cell. Liposomes are spherical vesicle structures composed of a uni-or multilamellar lipid bilayer surrounding internal aqueous compartments and a relatively impermeable outer lipophilic phospholipid bilayer. Liposomes can be made from several different types of lipids; however, phospholipids are most commonly used to generate liposomes. Several other additives can be added to liposomes in order to modify their structure and properties. For instance, either cholesterol or sphingomyelin can be added to the liposomal mixture in order to help stabilize the liposomal structure and to prevent the leakage of the liposomal inner cargo. A liposome formulation may be mainly comprised of natural phospholipids and lipids such as 1, 2-distearoryl-sn-glycero-3-phosphatidyl choline (DSPC) , sphingomyelin, egg phosphatidylcholines and monosialoganglioside.

[0277] In some embodiments, the composition is in the form of a lipoplex. Lipoplexes that utilize cationic lipids have proven utility for gene transfer. Cationic lipids, due to their positive charge, naturally complex with the negatively charged DNA. Also, as a result of their charge, they interact with the cell membrane. Endocytosis of the lipoplex then occurs, and the DNA is released into the cytoplasm. The cationic lipids also protect against degradation of the DNA by the cell.

[0278] In some embodiments, the composition is in the form of a polyplex. Most polyplexes consist of cationic polymers and their production is regulated by ionic interactions. One large difference between the methods of action of polyplexes and lipoplexes is that polyplexes cannot release their DNA load into the cytoplasm, so to this end, co-transfection with endosome-lytic agents (to lyse the endosome that is made during endocytosis) such as inactivated adenovirus must occur. However, this is not always the case; polymers such as polyethylenimine have their own method of endosome disruption as does chitosan and trimethylchitosan.

[0279] In some embodiments, the composition is in the form of a dendrimer, a highly branched macromolecule with a spherical shape which can also be used to genetically modify stem cells. The surface of the dendrimer particle can be functionalized to alter its properties. In particular, it is possible to construct a cationic dendrimer. When in the presence of genetic material such as a DNA plasmid, charge complementarity leads to a temporary association of the nucleic acid with the cationic dendrimer. On reaching its destination, the dendrimer-nucleic acid complex can be taken up into a cell by endocytosis.

[0280] In some embodiments, sugar-based particles can be used, for example GalNAc, which can be used to deliver a composition of the present disclosure to a target cell.

[0281] Depending on the expression system, any of a number of transcription and / or translation control elements, including constitutive and inducible promoters, transcription enhancer elements, transcription terminators, and the like can be used in the expression vector. In some embodiments, a vector described herein is operably linked to a control element, e.g., a transcriptional control element, such as a promoter. In some embodiments, a nucleotide sequence encoding a target mRNA or a target protein is operably linked to a control element, e.g., a transcriptional control element, such as a promoter. In some embodiments, the transcriptional control element is a promoter. In some embodiments, the promoter is a constitutively active promoter. In some embodiments, the promoter is a regulatable promoter. In some embodiments, the promoter is an inducible promoter. In some embodiments, the promoter is a tissue-specific promoter. In some embodiments, the promoter is a cell type-specific promoter. In some embodiments, the transcriptional control element (e.g., the promoter) is functional in a targeted cell type or targeted cell population. For example, in some embodiments, the transcriptional control element is functional in eukaryotic cells, e.g., hematopoietic stem cells (e.g., mobilized peripheral blood (mPB) CD34 (+) cell, bone marrow (BM) CD34 (+) cell, and the like) . In some embodiments, eukaryotic promoters (promoters functional in a eukaryotic cell) include EF1a, those from cytomegalovirus (CMV) immediate early, herpes simplex virus (HSV) thymidine kinase, early and late SV40, long terminal repeats (LTRs) from retrovirus, and mouse metallothionein-I. Selection of the appropriate vector and promoter is well within the level of ordinary skill in the art.

[0282] In some embodiments, the promoter is derived from viruses and can therefore be referred to as viral promoters, or they are derived from any organism, including prokaryotic or eukaryotic organisms. In some embodiments, the promoter is used to drive expression by any RNA polymerase (e.g., pol I, pol II, pol III) . Exemplary promoters include, but are not limited to the SV40 early promoter, mouse mammary tumor virus long terminal repeat (LTR) promoter; adenovirus major late promoter (Ad MLP) ; a herpes simplex virus (HSV) promoter, a cytomegalovirus (CMV) promoter such as the CMV immediate early promoter region (CMVIE) , a rous sarcoma virus (RSV) promoter, a human U6 small nuclear promoter (U6) (Miyagishi et al. ., Nature Biotechnology 20, 497 -500 (2002) ) , an enhanced U6 promoter (e.g., Xia et al. ., Nucleic Acids Res. 2003 Sep 1 ; 31 (17) ) , a human H1 promoter (H1) , and the like.

[0283] In some embodiments, the promoter is operable in a eukaryotic cell (e.g., a U6 promoter, an enhanced U6 promoter, an H1 promoter, and the like) . In some embodiments, the promoter is an inducible promoter. Examples of inducible promoters include, without limitation, chemically / biochemically-regulated and physically-regulated promoters such as alcohol -regulated promoters, tetracycline-regulated promoters and other tetracycline-responsive promoter systems, steroid-regulated promoters, metal-regulated promoters, pathogenesis-regulated promoters, temperature / heat-inducible promoters, and light-regulated promoters.

[0284] In some embodiments, the promoter is a spatially restricted promoter (e.g., cell type specific promoter, tissue specific promoter, and the like) such that in a multi-cellular organism, the promoter is active (e.g., “ON” ) in a subset of specific cells. Spatially restricted promoters can also be referred to as enhancers, transcriptional control elements, control sequences, etc. Any convenient spatially restricted promoter can be used as long as the promoter is functional in the targeted host cell (e.g., eukaryotic cell; prokaryotic cell) .

[0285] In some embodiments, the promoter is a reversible promoter. Suitable reversible promoters, including reversible inducible promoters are known in the art. Such reversible promoters, and systems based on such reversible promoters but also comprising additional control proteins.

[0286] In some embodiments, the vector contains a ribosome binding site for translation initiation and a transcription terminator. In some embodiments, the vector includes appropriate sequences for amplifying expression.

[0287] In some embodiments, the RTMs disclosed herein are provided as nucleic acids. In some embodiments, the RTMs disclosed herein are provided as RNA. In some embodiments, the RTMs disclosed herein are provided as DNA. In some embodiments, the RNA is generated by direct chemical synthesis or is transcribed in vitro from a DNA. Once synthesized, the RNA can be introduced into a cell by any of the well-known techniques for introducing nucleic acids into cells (e.g., microinjection, electroporation, transfection, and the like) .

[0288] Methods of introducing a nucleic acid into a host cell are known in the art, and any convenient method can be used to introduce a present composition into a target cell (e.g., prokaryotic cell, eukaryotic cell, plant cell, animal cell, mammalian cell, human cell, and the like) . Suitable methods include, e.g., viral infection, transfection, conjugation, protoplast fusion, lipofection, electroporation, calcium phosphate precipitation, polyethyleneimine (PEI) -mediated transfection, DEAE-dextran mediated transfection, liposome-mediated transfection, particle gun technology, calcium phosphate precipitation, direct micro injection, nanoparticle-mediated nucleic acid delivery, and the like.

[0289] In some embodiments, the present disclosure provides a cell comprising the RTMs disclosed herein. In some embodiments, the cells provided herein comprise the vectors disclosed herein. In some embodiments, the cells provided herein comprise the AAVs disclosed herein. In some embodiments, the cells provided herein comprise the LNPs disclosed herein.

[0290] In some embodiments, the cell is a prokaryotic cell. In some embodiments, the cell is a eukaryotic cell. In some embodiments, the cell is a mammalian cell. In some embodiments, the cell is a human cell. In some embodiments, the cell is an immortalized cell. In some embodiments, the cell is harvested from a subject.

[0291] In some embodiments, the cell derived from the subject is derived from a biological sample. In some embodiments, the biological sample comprises a biopsy, tissue or bodily fluid. In some embodiments, the biological sample comprises one or more of tumor cells, cultured cells, stem cells, and differentiated cells. In some embodiments, biological sample refers to a sample obtained or derived from a source of interest (e.g., a cell) , as described herein. In some embodiments, a source of interest comprises an organism, such as an animal or human. In some embodiments, a biological sample is a biological tissue or fluid. Non-limiting examples of biological samples include bone marrow, blood, blood cells, ascites, (tissue or fine needle) biopsy samples, cell-containing body fluids, free floating nucleic acids, sputum, saliva, urine, cerebrospinal fluid, peritoneal fluid, pleural fluid, feces, lymph, gynecological fluids, swabs (e.g., skin swabs, vaginal swabs, oral swabs, and nasal swabs) , washings or lavages such as a ductal lavages or broncheoalveolar lavages, aspirates, scrapings, specimens (e.g., bone marrow specimens, tissue biopsy specimens, and surgical specimens) , feces, other body fluids, secretions, and / or excretions, and cells therefrom, and the like.

[0292] In some embodiments, the present disclosure provides a modified cell comprising a composition of the present disclosure. In some embodiments, the present disclosure provides a modified cell comprising a composition of the present disclosure, where the modified cell is a cell that does not normally comprise a composition of the present disclosure. In some embodiments, the present disclosure provides a modified cell (e.g., a genetically modified cell) comprising nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a composition of the present disclosure. In some embodiments, there is provided a genetically modified cell that is genetically modified with an mRNA comprising a nucleotide sequence encoding a composition of the present disclosure. In some embodiments, there is provided a genetically modified cell that is genetically modified with a recombinant expression vector comprising a composition of the present disclosure.

[0293] In some embodiments, the cells are primary cells, cancer cells, animal cells, plant cells, algal cells, fungal cells, and the like. In some embodiments, a cell that serves as a recipient for a composition of the present disclosure is referred to as a “host cell” or a “target cell. ” In some embodiments, the host cell or a target cell can be a recipient of a composition or system of the present disclosure. A host cell or a target cell can be a recipient of a RNP of the present disclosure.

[0294] Non-limiting examples of cells (target cells) include: a prokaryotic cell, eukaryotic cell, a bacterial cell, an archaeal cell, a cell of a single-cell eukaryotic organism, a protozoa cell, a cell from a plant (e.g., cells from plant crops, fruits, vegetables, grains, soy bean, com, maize, wheat, seeds, tomatoes, rice, cassava, sugarcane, pumpkin, hay, potatoes, cotton, cannabis, tobacco, flowering plants, conifers, gymnosperms, angiosperms, ferns, clubmosses, homworts, liverworts, mosses, dicotyledons, monocotyledons, and the like) , an algal cell, (e.g., Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochlor opsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens, C. agardh, and the like) , seaweeds (e.g., kelp) a fungal cell (e.g., a yeast cell, a cell from a mushroom) , an animal cell, a cell from an invertebrate animal (e.g., fruit fly, cnidarian, echinoderm, nematode, and the like) , a cell from a vertebrate animal (e.g., fish, amphibian, reptile, bird, mammal) , a cell from a mammal (e.g., an ungulate (e.g., a pig, a cow, a goat, a sheep) ; a rodent (e.g., a rat, a mouse) ; a non-human primate; a human; a feline (e.g., a cat) ; a canine (e.g., a dog) ; and the like) , and the like. In some embodiments, the cell is a cell that does not originate from a natural organism (e.g., the cell can be a synthetically made cell; also referred to as an artificial cell) .

[0295] In some embodiments, the cell is an in vitro cell (e.g., established cultured cell line) . A cell can be an ex vivo cell (cultured cell from an individual) . In some embodiments, the cell is in vivo cell (e.g., a cell in an individual) . In some embodiments, the cell is an isolated cell. In some embodiments, the cell is inside of an organism. In some embodiments, the cell is an organism. In some embodiments, the cell is in a cell culture (e.g., in vitro cell culture) . In some embodiments, the cell is in a collection of cells. In some embodiments, the cell is a prokaryotic cell or derived from a prokaryotic cell, cell culture (e.g., in vitro cell culture) . In some embodiments, the cell is a bacterial cell or can be derived from a bacterial cell. In some embodiments, the cell is an archaeal cell or derived from an archaeal cell. In some embodiments, the cell is a eukaryotic cell or derived from a eukaryotic cell. In some embodiments, the cell is a plant cell or derived from a plant cell. In some embodiments, the cell is an animal cell or derived from an animal cell. In some embodiments, the cell is an invertebrate cell or derived from an invertebrate cell. In some embodiments, the cell is a vertebrate cell or derived from a vertebrate cell. In some embodiments, the cell is a mammalian cell or derived from a mammalian cell. In some embodiments, the cell is a rodent cell or derived from a rodent cell. In some embodiments, the cell is a human cell or derived from a human cell. In some embodiments, the cell is a microbe cell or derived from a microbe cell. In some embodiments, the cell is a fungal cell or derived from a fungal cell. In some embodiments, the cell is an insect cell. In some embodiments, the cell is an arthropod cell. In some embodiments, the cell is a protozoan cell.

[0296] In some embodiments, the suitable cells include a stem cell (e.g., an embryonic stem (ES) cell, an induced pluripotent stem (iPS) cell; a germ cell (e.g., an oocyte, a sperm, an oogonia, a spermatogonia, and the like) ; a somatic cell, e.g., a fibroblast, an oligodendrocyte, a glial cell, a hematopoietic cell, a neuron, a muscle cell, a bone cell, a hepatocyte, a pancreatic cell, and the like.

[0297] In some embodiments, the cell is an immune cell, a neuron, an epithelial cell, and endothelial cell, or a stem cell. In some embodiments, the immune cell is a T cell, a B cell, a monocyte, a natural killer cell, a dendritic cell, or a macrophage. In some embodiments, the immune cell is a cytotoxic T cell. In some embodiments, the immune cell is a helper T cell. In some embodiments, the immune cell is a regulatory T cell (Treg) .

[0298] In some embodiments, the cell is a stem cell. Stem cells include adult stem cells. Adult stem cells are also referred to as somatic stem cells. Adult stem cells are resident in differentiated tissue but retain the properties of self-renewal and ability to give rise to multiple cell types, usually cell types typical of the tissue in which the stem cells are found. Numerous examples of somatic stem cells are known to those of skill in the art, including muscle stem cells; hematopoietic stem cells; epithelial stem cells; neural stem cells; mesenchymal stem cells; mammary stem cells; intestinal stem cells; mesodermal stem cells; endothelial stem cells; olfactory stem cells; neural crest stem cells; and the like. Stem cells of interest include mammalian stem cells, where the term “mammalian” refers to any animal classified as a mammal, including humans; non-human primates; domestic and farm animals; and zoo, laboratory, sports, or pet animals, such as dogs, horses, cats, cows, mice, rats, rabbits, etc. In some embodiments, the stem cell is a human stem cell. In some embodiments, the stem cell is a rodent (e.g., a mouse; a rat) stem cell. In some embodiments, the stem cell is a non-human primate stem cell.

[0299] In some embodiments, the suitable cells include human embryonic stem cells, fetal cardiomyocytes, myofibroblasts, mesenchymal stem cells, autotransplated expanded cardiomyocytes, adipocytes, totipotent cells, pluripotent cells, blood stem cells, myoblasts, adult stem cells, bone marrow cells, mesenchymal cells, embryonic stem cells, parenchymal cells, epithelial cells, endothelial cells, mesothelial cells, fibroblasts, osteoblasts, chondrocytes, exogenous cells, endogenous cells, stem cells, hematopoietic stem cells, bone-marrow derived progenitor cells, myocardial cells, skeletal cells, fetal cells, undifferentiated cells, multi-potent progenitor cells, unipotent progenitor cells, monocytes, cardiac myoblasts, skeletal myoblasts, macrophages, capillary endothelial cells, xenogenic cells, allogenic cells, and post-natal stem cells.

[0300] In some embodiments, the stem cell is a hematopoietic stem cell (HSC) . In some embodiments, the stem cell is a neural stem cell (NSC) . In some embodiments, the stem cell is a mesenchymal stem cell (MSC) .

[0301] In some embodiments, the cell is a plant cell. For example, the cell can be a cell of a major agricultural plant. In some embodiments, the cell is an arthropod cell. In some embodiments, the cell is an insect cell.

[0302] In some embodiments, introducing the recombinant expression vector into cells can occur in any culture media and under any culture conditions that promote the survival of the cells. In some embodiments, introducing the recombinant expression vector into a target cell is carried out in vivo or ex vivo. In some embodiments, introducing the recombinant expression vector into a target cell is carried out in vitro.

[0303] The present disclosure provides methods for replacement of endogenous mRNA sequences with desired sequences, which provides a general ability with many specific applications. As a person of ordinary skill would appreciate, the RTM technology disclosed herein can impart arbitrary changes to both coding and non-coding regions of target RNAs. For example, the RTMs can correct a mutant sequence. For another example, the RTMs can insert engineered sequences into a target mRNA to impart new activities to the target RNA, such as altered RNA stability or altered RNA translation. This feature can be used to increase production of protein by a target mRNA.

[0304] In some embodiments, provided herein are methods of correcting mutations in mRNAs by trans-splicing. Trans-splicing is a significant step in the process of protein production. Incorrect mRNA sequences may lead to incorrect protein production, e.g., incorrect amino acid sequence or misfolding. To that end, any of the composition, systems, and nucleic acids as disclosed herein can be used in any of the methods as disclosed herein to correct the target mRNA sequence or portion thereof. For example, the target mRNA sequence or portion thereof can comprise a missing or mutated sequence. Methods as disclosed herein can comprise providing an RTM with the correct sequence. Methods as disclosed herein can also be used to, e.g., correct an amino acid sequence, correct protein or polypeptide misfolding, increase protein production, or decrease protein production.

[0305] In some embodiments, described herein are methods of editing the mRNA to include a desired feature. In some embodiments, the methods comprise providing an RTM as described herein which is configured to promote replacing an endogenous fragment of a target mRNA molecule with the replacement fragment of the RTM, wherein the replacement fragment contains the desired feature. In some embodiments, the desired feature is a modified sequence. In some embodiments, the desired feature is a modification to the mRNA.

[0306] In some embodiments, the present disclosure provides a method of editing an mRNA (e.g., a pre-mRNA) , comprising contacting the mRNA with the RTMs disclosed herein, the vector disclosed herein, the cell disclosed herein, or the pharmaceutical composition disclosed herein. In some embodiments, the present disclosure provides a method of editing an mRNA in a cell, comprising contacting the cell with the RTMs disclosed herein, the vector disclosed herein, the cell disclosed herein, or the pharmaceutical composition disclosed herein. In some embodiments, the present disclosure provides a method of editing an mRNA in a subject in need thereof, comprising administering an effective amount of the RTMs disclosed herein, the vector disclosed herein, the cell disclosed herein, or the pharmaceutical composition disclosed herein to the subject. In some embodiments, the editing is selected from one or more of insertion, deletion, substitution. In some embodiments, the editing corrects a mutation in the endogenous gene transcript. In some embodiments, the editing provides a desired modification to the endogenous transcript.

[0307] In addition to editing mRNA sequences, the dual / triple / multiple RTM systems provided herein can also be used for recombinant expression independent of an endogenous mRNA template. In some embodiments, provided herein are also methods of expressing a recombinant mRNA, comprising culturing the RTM systems disclosed herein under conditions suitable for trans-splicing, wherein RTM systems are designed such that the replacement fragments thereof can generate the full-length mRNA upon splicing, which can be further processed and expressed. In some embodiments, provided herein also methods of expressing a recombinant mRNA, comprising culturing the cell comprising the RTM systems disclosed herein conditions suitable for recombinant expression.

[0308] In some embodiments, the present disclosure provides a method of trans-splicing a nucleic acid, e.g., a pre-mRNA in a cell, the method comprising contacting the cell with the RTMs disclosed herein, the vector disclosed herein, the cell disclosed herein, or the pharmaceutical composition disclosed herein. In some embodiments, the present disclosure provides a method of trans-splicing a nucleic acid, e.g., a pre-mRNA in a cell, in a subject in need thereof, comprising administering an effective amount of the RTMs disclosed herein, the vector disclosed herein, the cell disclosed herein, or the pharmaceutical composition disclosed herein.

[0309] In some embodiments of the methods provided herein, the contacting step is carried out in a cell in vitro. In some embodiments, the contacting step is carried out in a cell in vivo. In some embodiments, the contacting step is carried out in a cell ex vivo.

[0310] In some embodiments, the present disclosure provides methods of editing a target mRNA by “contact” a target mRNA with the RTM disclosed herein. Methods provided herein encompass all methods for contacting the target mRNA with the RTM disclosed herein. For example, when performing a method in a cell (e.g., inside of a cell in vitro, inside of a cell in vivo, inside of a cell ex vivo) , the method includes transferring into the cell of the RTM or the vector comprising the RTM. In some embodiments, the methods can also be performed in vitro outside of a cell, which includes contacting a target mRNA with the RTM disclosed herein outside of a cell in vitro.

[0311] In some embodiments, methods provided herein comprise contacting a nucleic acid (e.g., a mRNA or pre-mRNA) with RTM disclosed herein under conditions suitable for trans-splicing. In some embodiments, methods provided herein comprising culturing the RTMs under conditions suitable for trans-splicing. As used herein and consistently with its understanding in the art, “condition suitable for trans-splicing” refers to the specific set of circumstances and environments in which trans-splicing can effectively occur. The condition suitable for trans-splicing can include a combination of biochemical, structural, and environmental factors that together facilitate the precise and efficient joining of exons from different RNA molecules. The suitable conditions typically involve the presence of splicing factors, appropriate sequence motifs, and environment factors. For example, suitable condition for trans-splicing can require splicing factors, which are proteins or enzymes that recognize and catalyze the splicing reaction. Additionally, as disclosed above, specific nucleotide sequences at the splice sites (donor and acceptor sites) that can be recognized by the splicing machinery are needed, including conserved splice site sequences like the 5’ splice site, branch point, polypyrimidine tract, and 3’ splice site. Furthermore, proper folding of the RNA molecules helps bring the exons into proximity and align them correctly for the trans-splicing reaction. Environmental factors, including pH, temperature, ionic strength, and the presence of necessary cofactors, also support the splicing process, whether the trans-splicing is performed inside or outside a living cell. Suitable conditions therefore encompass the intracellular environment of a living cell, where the native temperature (about 37 ℃) , pH (about 7.2–7.6) , ionic strength, divalent cation concentration (e.g., 1–3 mM Mg2+) , nucleotide triphosphates, and endogenous snRNPs are present, as well as in vitro systems such as nuclear extracts or reconstituted spliceosomal assays that provide equivalent components and reaction parameters. 6.3 Pharmaceutical compositions

[0312] Disclosed herein are also pharmaceutical compositions, comprising a pharmaceutically acceptable carrier and the RTMs, the expression vectors, or the cells described herein. Disclosed herein are also the RTMs, the expression vectors, the cells described herein, or the pharmaceutical preparation described herein for use as a medicament.

[0313] In some embodiments, provided herein are also pharmaceutical compositions comprising an effective amount of RTMs disclosed herein, and a pharmaceutically acceptable carrier. The RTM can be administered in amounts which are effective to produce the desired effect in the targeted cell. Effective dosages of the synthetic RTMs can be determined through procedures well known to those in the art which address such parameters as biological half-life, bioavailability and toxicity. The amount of the composition of which will be effective will depend on the nature of the disease or disorder being treated and can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro assays can be employed to help identify optimal dosage ranges.

[0314] In some embodiments, provided herein pharmaceutical compositions comprising the compositions described herein and a pharmaceutically acceptable carrier. In some embodiments, pharmaceutical excipients can be liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable, or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. The pharmaceutical excipients can be, for example, saline, gum acacia, gelatin, starch paste, talc, keratin, colloidal silica, urea and the like. In addition, auxiliary, stabilizing, thickening, lubricating, and coloring agents can be used. In some embodiments, the pharmaceutically acceptable excipients are sterile when administered to a subject. Water is a useful excipient when any agent described herein is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid excipients, specifically for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients also include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol and the like. Any agent described herein, if desired, can also comprise minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents. Other examples of suitable pharmaceutical excipients are described in REMINGTON ’S PHARMACEUTICAL SCIENCES 1447-1676 (Alfonso R. Gennaro eds., 19th ed. 1995) , incorporated herein by reference.

[0315] The pharmaceutical compositions provided herein can be supplied in various formulations. Any inventive pharmaceutical composition (and / or additional therapeutic agents) described herein can take the form of solutions, suspensions, emulsion, drops, tablets, pills, pellets, capsules, capsules containing liquids, gelatin capsules, powders, sustained-release formulations, suppositories, emulsions, aerosols, sprays, suspensions, lyophilized powder, frozen suspension, desiccated powder, or any other form suitable for use. In some embodiments, the composition is in the form of a capsule. In some embodiments, the composition is in the form of a tablet. In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated in the form of a soft-gel capsule. In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated in the form of a gelatin capsule. In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated as a liquid.

[0316] The formulations comprising the pharmaceutical compositions disclosed herein can conveniently be presented in unit dosage forms and can be prepared by any of the methods well known in the art of pharmacy. Such methods generally include the step of bringing the therapeutic agents into association with a carrier, which constitutes one or more accessory ingredients. Typically, the formulations are prepared by uniformly and intimately bringing the therapeutic agent into association with a liquid carrier, a finely divided solid carrier, or both, and then, if necessary, shaping the product into dosage forms of the desired formulation (e.g., wet or dry granulation, powder blends, etc., followed by tableting using conventional methods known in the art) .

[0317] In some embodiments, any pharmaceutical compositions (and / or additional agents) described herein are formulated in accordance with routine procedures as a composition adapted for a mode of administration described herein.

[0318] Routes of administration include, for example: oral, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, sublingual, intranasal, intracerebral, intravaginal, transdermal, rectally, by inhalation, or topically. Administration can be local or systemic. In some embodiments, the administration is by parenteral injection. The mode of administration can be left to the discretion of the practitioner and depends in-part upon the site of the medical condition. In most instances, administration results in the release of any agent described herein into the bloodstream.

[0319] In some embodiments, the pharmaceutical compositions disclosed herein can be administered locally to the area in need of treatment. This can be achieved by, for example, and not by way of limitation, local infusion during surgery, topical application, e.g., in conjunction with a wound dressing after surgery, by injection, by means of a catheter, by means of a suppository, or by means of an implant, said implant being of a porous, non-porous, or gelatinous material, including membranes, such as sialastic membranes, or fibers.

[0320] In some embodiments, the compositions described herein are formulated for oral administration. Compositions for oral delivery can be in the form of tablets, lozenges, aqueous or oily suspensions, granules, powders, emulsions, capsules, syrups, or elixirs, for example. Orally administered compositions can comprise one or more agents, for example, sweetening agents such as fructose, aspartame or saccharin; flavoring agents such as peppermint, oil of wintergreen, or cherry; coloring agents; and preserving agents, to provide a pharmaceutically palatable preparation. Moreover, where in tablet or pill form, the compositions can be coated to delay disintegration and absorption in the gastrointestinal tract thereby providing a sustained action over an extended period of time. Selectively permeable membranes surrounding an osmotically active driving any compositions described herein are also suitable for orally administered compositions. In these latter platforms, fluid from the environment surrounding the capsule is imbibed by the driving compound, which swells to displace the agent or agent composition through an aperture. TA time delay material such as glycerol monostearate or glycerol stearate can also be useful. Oral compositions can include standard excipients such as mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, and magnesium carbonate. In some embodiments, the excipients are of pharmaceutical grade. Suspensions, in addition to the active compounds, may contain suspending agents such as, for example, ethoxylated isostearyl alcohols, polyoxyethylene sorbitol and sorbitan esters, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar-agar, tragacanth, etc., and mixtures thereof.

[0321] Dosage forms suitable for parenteral administration (e.g., intravenous, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous and intra-articular injection and infusion) include, for example, solutions, suspensions, dispersions, emulsions, and the like. They may also be manufactured in the form of sterile solid compositions (e.g., lyophilized composition) , which can be dissolved or suspended in sterile injectable medium immediately before use. They can contain, for example, suspending or dispersing agents known in the art. Formulation components suitable for parenteral administration include a sterile diluent such as water for injection, saline solution, fixed oils, polyethylene glycols, glycerine, propylene glycol or other synthetic solvents; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl paraben; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as EDTA; buffers such as acetates, citrates or phosphates; and agents for the adjustment of tonicity such as sodium chloride or dextrose.

[0322] For intravenous administration, suitable carriers include physiological saline, bacteriostatic water, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) or phosphate buffered saline (PBS) . The carrier should be stable under the conditions of manufacture and storage and should be preserved against microorganisms. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, and liquid polyetheylene glycol) , and suitable mixtures thereof.

[0323] The compositions provided herein, alone or in combination with other suitable components, can be made into aerosol formulations (e.g., “nebulized” ) to be administered via inhalation. Aerosol formulations can be placed into pressurized acceptable propellants, such as dichlorodifluoromethane, propane, nitrogen, and the like.

[0324] The pharmaceutical compositions (and / or additional agents) described herein can be administered by controlled-release or sustained-release means or by delivery devices that are well known to those of ordinary skill in the art. Examples include, but are not limited to, those described in U.S. Patent Nos. 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; 4,008,719; 5,674,533; 5,059,595; 5,591,767; 5,120,548; 5,073,543; 5,639,476; 5,354,556; and 5,733,556, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Such dosage forms can be useful for providing controlled-or sustained-release of one or more active ingredients using, for example, hydropropyl cellulose, hydropropylmethyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, other polymer matrices, gels, permeable membranes, osmotic systems, multilayer coatings, microparticles, liposomes, microspheres, or a combination thereof to provide the desired release profile in varying proportions. Suitable controlled-or sustained-release formulations known to those skilled in the art, including those described herein, can be readily selected for use with the active ingredients of the agents described herein. The invention thus provides single unit dosage forms suitable for oral administration such as, but not limited to, tablets, capsules, gelcaps, and caplets that are adapted for controlled-or sustained-release.

[0325] Pharmaceutical formulations preferably are sterile. Sterilization can be accomplished, for example, by filtration through sterile filtration membranes. Where the composition is lyophilized, filter sterilization can be conducted prior to or following lyophilization and reconstitution.

[0326] Provided herein are also pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more of the ingredients of the pharmaceutical compositions disclosed herein. In some embodiments, the packs or kits are associated with such container (s) with a notice in the form prescribed by a governmental agency regulating the manufacture, use or sale of pharmaceuticals or biological products, which notice reflects approval by the agency of manufacture, use or sale for human administration.

[0327] In some embodiments, the RTMs, vectors or the cells disclosed herein can be used to treat a human disease or disorder. In some embodiments, the disease or disorder is associated with a gene mutation. In some embodiments, the disease or disorder is not associated with a gene mutation but can benefit from the exogenous expression of a therapeutic protein. In some embodiments, the methods provided herein can replace a mutated mRNA within one with the correct sequence. In some embodiments, the methods provided herein provide exogenous expression of an mRNA encoding a protein with therapeutic benefit.

[0328] Indeed, low efficiency has been a major barrier to many nucleic acid editing approaches including RNA trans-splicing. The disclosure provides compositions and methods for specifically targeting disease-causing RNA molecules and replacing disease-causing RNA sequences within these RNA molecules with high efficiency. The trans-splicing RNA molecule implementations show utility in a variety of contexts including replacement of disease causing sequences or insertion of engineered sequences into target RNAs. The engineered sequences can alter the translation or stability of target mRNAs to affect protein production. Distinct from typical RTMs, the RTMs provided herein can also result in effective exogenous expression of therapeutic proteins independent of an endogenous template.

[0329] In some embodiments, the methods provided herein comprise administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the RTMs, vectors, or cells described herein. In some embodiments, the subject is afflicted with, diagnosed, or suspected to have, a disease or disorder. In some embodiments, the disease or disorder is associated with a gene mutation. In some embodiments, the disease or disorder can be treated with an exogenous therapeutic protein.

[0330] In some embodiments, pharmaceutical compositions are administered in diseases or disorders associated with a gene mutation. In some embodiments, pharmaceutical compositions are administered in diseases or disorders involving an absence or decreased (relative to normal or desired) level of an endogenous protein or function, for example, in hosts where the protein is lacking, genetically defective, biologically inactive or underactive, or under expressed. The activity of the protein encoded for by the mRNA resulting from the synthetic RTM mediated trans-splicing reaction can be readily detected, e.g., by obtaining a host tissue sample (e.g., from biopsy tissue) and assaying it in vitro for mRNA or protein levels, structure and / or activity of the expressed target mRNA. Many methods standard in the art can be thus employed, including but not limited to immunoassays to detect and / or visualize the protein encoded for by the chimeric mRNA (e.g., Western blot, immunoprecipitation followed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, immunocytochemistry, etc. ) and / or hybridization assays to detect formation of mRNA expression by detecting and / or visualizing the presence of resulting mRNA (e.g., Northern assays, dot blots, in situ hybridization, and Reverse-Transcription PCR, etc. ) , etc. Alternatively, direct visualization of a reporter gene either encoded by the synthetic RTM or associated with an RTM can be carried out. 6.4 Methods and Uses

[0331] The RTMs disclosed herein can be deployed as single constructs or in dual-and triple-RTM configurations to repair pathogenic pre-mRNA, edit transcripts for gain-of-function or loss-of-function applications, or assemble large coding sequences (e.g., >5kb, or >10 kb) that cannot fit in a single vector. The RTM systems combine programmable binding fragments with 5’ trans-splicing fragments, and 3’ trans-splicing fragments (containing high-activity SRE) to drive precise spliceosome-catalyzed strand exchange.

[0332] RTMs (alone or in dual / multi-RTM systems) can be introduced into a target cell or organism under conditions that permit: (i) hybridization of the RTM binding fragment (s) to the chosen pre-mRNA; (ii) spliceosome recruitment to the engineered intron (s) ; and (iii) one or more trans-splicing reactions that exchange the endogenous exon (s) for the RTM-supplied replacement fragment (s) . Suitable environments include the nucleus of cultured cells, primary patient-derived cells ex vivo, or tissues in vivo following vector delivery. Suitable delivery vehicles are known in the art, some disclosed above, encompassing plasmids, synthetic mRNA / LNPs, integrase-defective lentivirus, single-stranded or self-complementary AAV, dual-or triple-AAV cassettes, adenovirus, HSV, minicircles and episomal EBV-based plasmids.

[0333] Single RTMs can be used in, for example, correction of mutant pre-mRNA and transcript editing. Provided herein are methods of correcting a pre-mRNA with a mutation comprising contacting the pre-mRNA with the RTM, dual RTM system, triple or multiple RTM system disclosed herein or the vector containing the same under conditions suitable for trans-splicing, wherein a replacement fragment of the RTM or an RTM of the dual / triple / multiple systems has the correct sequence. Provided herein are also methods of editing a pre-mRNA comprising contacting the pre-mRNA with the RTM, dual RTM system, triple or multiple RTM system disclosed herein or the vector containing the same under conditions suitable for trans-splicing, wherein a replacement fragment of the RTM or an RTM of the dual / triple / multiple systems has the edited sequence. Provided herein are also methods of correcting a pre-mRNA with a mutation in a cell comprising transferring the RTM, dual RTM system, triple or multiple RTM system disclosed herein or the vector containing the same to the cell, wherein a replacement fragment of the RTM or an RTM of the dual / triple / multiple systems has the correct sequence.

[0334] A single 3′-ss RTM carrying a wild-type 3′ replacement fragment can swap in the correct downstream coding sequence, leaving all upstream exons intact. Exemplary targets include, for example, COL7A1 in recessive dystrophic EB (RDEB) , CEP290-LCA10 and HBB β-thalassaemia alleles. Conversely, a 5′-ss RTM can replace 5′ exons (e.g., SMN2 exon 7 conversion in SMA) .

[0335] In some embodiments, a replacement fragment can encode an edited sequence introducing pharmacologically beneficial amino-acid substitutions (e.g., high-activity FIX-Padua for Haemophilia B) or regulatory tags such as degrons or fluorescent reporters; edits can also include silent bar-codes for lineage tracing.

[0336] The RTMs provided herein can also be used in cell-based manufacture and research tools. For example, in recombinant production cell lines the RTM can install affinity tags, signal peptides, secretion enhancers or intein segments into an endogenous transcript, enabling cost-effective manufacture of complex biologics or formation of split-protein biosensors.

[0337] In addition to the above uses, the dual RTM systems can also be used in bidirectional exon replacement. Specifically, a 5′-ss RTM donates an upstream replacement fragment, while a 3′-ss RTM donates a downstream fragment. Two sequential trans-splicing events excise the mutant region while preventing duplication of the central M-exon. The dual RTM systems can also be used in manufacturing oversized recombinant mRNA. Culturing a dual-RTM pair in producer cells allows assembly of synthetic mRNAs ≥ 5 kb, 8 kb, 10 kb or 12 kb, e.g., full-length von Willebrand factor or prime-editor mRNA. The resulting mature mRNA can be harvested directly or translated in situ. Either RTM can carry the longer fragment; either can also include a 5′-UTR, 3′-UTR or other cis-acting elements, such as RNA-stabilizing G4 / kissing-loop element. Partial edits are also contemplated, for example, only one RTM can contain corrective sequence while the other merely provides a splice site to facilitate removal of an undesired exon. The RTM can also carry non-coding payloads. For example, an RTM can splice in regulatory RNAs (e.g., miRNA sponges, antisense sequences) downstream of a coding exon to modulate gene networks.

[0338] The triple / multiple RTM system can also be used in reconstitution of mRNAs with very large ORF. An N-ss, M-ss and C-ss RTM can together supply three replacement fragments that assemble a mature mRNA ≥ 8 kb, 10 kb, 12 kb or even 15 kb. This strategy enables full-length dystrophin (11.4 kb) , titin domains, multi-domain fusion editors (e.g., Cas9-RT-deaminase) , or complex epigenome editors to be produced in vivo where single or dual vectors are insufficient.

[0339] Triple / multiple systems can also be used in multi-module editing. For example, the triple / multiple systems can be used in exchanging non-contiguous exons, allowing simult...

Claims

An RNA Trans-Splicing Molecule (RTM) comprising a replacement fragment and a tail-end intron; wherein the tail-end intron has a binding fragment that reverse complementarily pairs with a target pre-mRNA, and wherein the replacement fragment comprises a coding sequence of the target mRNA.The RTM of claim 1, wherein the replacement fragment comprises an inserted intron in the coding sequence.The RTM of claim 2, wherein the inserted intron is a natural intron.The RTM of claim 2, wherein the inserted intron is an engineered intron.The RTM of any one of claims 1 to 4, wherein the tail-end intron is a 5’ intron comprising a 3’ trans-splicing fragment.The RTM of claim 5, wherein the 3’ trans-splicing fragment comprises a splicing regulatory element (SRE) derived from a natural intron having an exon skipping probability (SkipProb) of at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, or at least 90%.The RTM of claim 6, wherein the natural intron is AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33.The RTM of any one of claims 5 to 7, wherein the 3’ trans-splicing fragment is at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37, 40, 41, 42, 47, 50, 73, 74, 77, 97, 105, 107, 113, 115, 131, 133, and 135.The RTM of any one of claims 1 to 4, wherein the tail-end intron is a 3’ intron comprising a 5’ trans-splicing fragment.The RTM of claim 9, wherein the 5’ trans-splicing fragment comprises a splice donor (SD) derived from a natural intron selected from: ADGRG1 Intron 8, AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33.The RTM of claim 9 or 10, wherein the 5’ trans-splicing fragment is at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 66-72, 76, 101, 109, 111, 117, 119, 132, 134, and 136.The RTM of any one of claims 1 to11, wherein the length of the complementary region ranges from 30 to 1500 base pairs (bp) .The RTM of claim 12, wherein the length of the complementary region ranges from 50 to 1000 bp, from 100 to 900 bp, from 200 to 900 bp, from 300 to 800 bp, from 400 to 700 bp, from 500 to 700 bp, from 150 to 600 bp, from 200 to 600 bp, from 300 to 600 bp, from 400 to 600 bp, from 500 to 600 bp, or from 180 to 300 bp.The RTM of claim 12, wherein the length of the complementary region is about 150 bp, about 300 bp, about 400 bp, about 500 bp, or about 600 bp.The RTM of any one of claims 1 to 14, further comprising an RNA stabilizing element.The RTM of claim 15, wherein the RNA stabilizing element is a G-quadruplex (G4) motif or a kissing-loop-like structure.The RTM of claim 16, wherein the G4 motif has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 64.The RTM of claim 16, wherein the kissing-loop-like structure has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 65 or 137.The RTM of any one of claims 1 to 18, wherein the replacement fragment further comprises a 5’ untranslated region, a 3’ untranslated region, or both.The RTM of any one of claims 1 to 19, wherein the RTM is a DNA.The RTM of any one of claims 1 to 19, wherein the RTM is an RNA.A vector comprising the RTM of any one of claims 1 to 21.The vector of claim 22, wherein the vector is a recombinant expression vector.The vector of claim 22 or 23, wherein the vector is a viral vector.The vector of claim 24, wherein the viral vector is an adenovirus (AV) , an Adeno-Associated Virus (AAV) , a lentivirus (LV) , a retrovirus (RV) , a herpes simplex virus (HSV) , or a baculovirus (BEV) .The vector of claim 25, wherein the viral vector is a single-stranded Adeno-Associated Virus (ssAAV) or a self-complementary Adeno-Associated Virus (scAAV) .The vector of claim 22 or 23, wherein the vector is a non-viral vector.The vector of claim 27, wherein the non-viral vector is a plasmid, a liposome, a nanoparticle, a polymer, a transposon, an exosome, a minicircle, a cosmid, a YAC vector, or BAC vector.A cell comprising the RTM of any one of claims 1 to 21 or the vector of any one of claims 22 to 28.A pharmaceutical composition comprising the RTM of any one of claims 1 to 21, the vector of any one of claims 22 to 28, or the cell of claim 29, and at least one pharmaceutically acceptable carrier.A method of correcting a pre-mRNA with a mutation comprising contacting the pre-mRNA with the RTM of any one of claims 1 to 21 or the vector of any one of claims 22 to 28 under conditions suitable for trans-splicing, wherein the replacement fragment of RTM has the correct sequence.A method of editing a pre-mRNA comprising contacting the pre-mRNA with the RTM of any one of claims 1 to 21 or the vector of any one of claims 22 to 28 under conditions suitable for trans-splicing, wherein the replacement fragment of RTM has the edited sequence.A method of correcting a pre-mRNA with a mutation in a cell comprising transferring the RTM of any one of claims 1 to 21 or the vector of any one of claims 22 to 28 to the cell, wherein the replacement fragment of RTM has the correct sequence.A method of treating a disease or disorder associated with a gene mutation in a subject in need thereof comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of claim 30, wherein the replacement fragment of RTM has the correct sequence for the mutated gene.A dual RTM system comprising a 5’ splicing site (5’ss) RTM and a 3’ splicing site (3’ss) RTM, wherein(1) the 5’ss RTM comprises, from 5’ to 3’, a replacement fragment and a 3’ intron; wherein the replacement fragment comprises (i) a N coding sequence, (ii) an inserted intron, and (iii) a M coding sequence; and(2) the 3’ss RTM comprises, from 5’ to 3’, a 5’ intron and a replacement fragment; wherein the replacement fragment comprises (i) the M coding sequence, (ii) an inserted intron, and (iii) a C coding sequence;wherein the coding sequences, when linked in the order N–M–C, form a contiguous coding sequence that encodes a functional protein or polypeptide; andwherein each intron has a binding fragment, and the binding fragments of following introns reverse complementarily pair with each other: (i) the inserted intron of the 5’ss RTM and the 5’ intron of 3’ss RTM; and (ii) the inserted intron of the 3’ss RTM and the 3’ intron of the 5’ss RTM.The dual RTM system of claim 35, wherein the 5’ intron comprises a 3’ trans-splicing fragment comprising an SRE derived from a natural intron having a SkipProb of at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, or at least 90%.The dual RTM system of claim 36, wherein the natural intron is AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33.The dual RTM system of claim 36 or 37, wherein the 3’ trans-splicing fragment is at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37, 40, 41, 42, 47, 50, 73, 74, 77, 97, 105, 107, 113, 115, 131, 133, and 135.The dual RTM system of any one of claims 35 to 38, wherein the inserted intron of the 3’ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment comprising an SRE derived from a natural intron having a SkipProb of at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, or at least 90%.The dual RTM system of claim 39, wherein the natural intron is AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33.The dual RTM system of claim 39 or 40, wherein the 3’ trans-splicing fragment of the inserted intron is at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37, 40, 41, 42, 47, 50, 73, 74, 77, 97, 105, 107, 113, 115, 131, 133, and 135.The dual RTM system of any one of claims 35 to 41, wherein the 3’ intron comprises a 5’ trans-splicing fragment comprising an SD derived from a natural intron selected from: ADGRG1 Intron 8, AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33.The dual RTM system of claim 42, wherein the 5’ trans-splicing fragment is at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 66-72, 76, 101, 109, 111, 117, 119, 132, 134, and 136.The dual RTM system of any one of claims 35 to 43, wherein the inserted intron of the 5’ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment comprising an SD derived from a natural intron selected from: ADGRG1 Intron 8, AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33.The dual RTM system of claim 44, wherein the 5’ trans-splicing fragment of the inserted intron is at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 66-72, 76, 101, 109, 111, 117, 119, 132, 134, and 136.The dual RTM system of claim 35, wherein:the inserted intron of the 5’ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (1) ;the 3’ intron of the 5’ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (2) ;the 5’ intron of 3’ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (3) ; andthe inserted intron of 3’ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (4) ; andwherein the trans-splicing fragments (1) , (2) , (3) , and (4) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to:(i) SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively;(ii) SEQ ID NOs: 76, 68, 47, and 50, respectively;(iii) SEQ ID NOs: 66, 67, 41, and 41, respectively;(iv) SEQ ID NOs: 66, 67, 42, and 42, respectively;(v) SEQ ID NOs: 66, 67, 44, and 44, respectively;(vi) SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively;(vii) SEQ ID NOs: 71, 72, 73, and 74, respectively;(viii) SEQ ID NOs: 70, 72, 41, and 74, respectively;(ix) SEQ ID NOs: 71, 101, 73, and 97, respectively;(x) SEQ ID NOs: 109, 111, 105, and 107, respectively; or(xi) SEQ ID NOs: 117, 119, 113, and 115, respectively.The dual RTM system of any one of claims 35 to 46, wherein the length of the complementary region of either one or both of the binding pairs ranges from 30 to 1500 base pairs (bp) .The dual RTM system of claim 47, wherein the length of the complementary region of either one or both of the binding pairs ranges from 50 to 1000 bp, from 100 to 900 bp, from 200 to 900 bp, from 300 to 800 bp, from 400 to 700 bp, from 500 to 700 bp, from 150 to 600 bp, from 200 to 600 bp, from 300 to 600 bp, from 400 to 600 bp, from 500 to 600 bp, or from 180 to 300 bp.The dual RTM system of claim 47, wherein the length of the complementary region of either one or both of the binding pairs is about 150 bp, about 300 bp, about 400 bp, about 500 bp, or about 600 bp.The dual RTM system of any one of claims 35 to 49, wherein either one or both of the 5’ss RTM and the 3’ss RTM further comprise an RNA stabilizing element in one or both of the introns.The dual RTM system of claim 50, wherein the RNA stabilizing element is a G4 motif or a kissing-loop-like structure.The dual RTM system of claim 35, wherein (1) the inserted intron of the 5’ss RTM, (2) the 3’ intron of the 5’ss RTM, (3) the 5’ intron of the 3’ss RTM, and (4) the inserted intron of the 3’ss RTM have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to:(i) SEQ ID NOs: 6, 7, 4, and 5, respectively;(ii) SEQ ID NOs: 10, 11, 12, and 13, respectively;(iii) SEQ ID NOs: 6, 7, 21, and 22, respectively;(iv) SEQ ID NOs: 6, 7, 23, and 24, respectively;(v) SEQ ID NOs: 6, 7, 27, and 28, respectively;(vi) SEQ ID NOs: 6, 30, 29, and 5, respectively;(vii) SEQ ID NOs: 33, 34, 31, and 32, respectively;(viii) SEQ ID NOs: 56, 57, 58, and 59, respectively;(ix) SEQ ID NOs: 60, 61, 62, and 63, respectively;(x) SEQ ID NOs: 98, 100, 93, and 95, respectively;(xi) SEQ ID NOs: 108, 110, 103, and 106, respectively;(xii) SEQ ID NOs: 116, 118, 112, and 114, respectively;(xiii) SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and 126, respectively; or(xiv) SEQ ID NOs: 127, 128, 129, and 130, respectively.The dual RTM system of any one of claims 35 to 52, wherein (1) the replacement fragment of 5’ss RTM further comprises a 5’ untranslated region, (2) the replacement fragment of 3’ss RTM further comprises a 3’ untranslated region, or both (1) and (2) .The dual RTM system of any one of claims 35 to 53, wherein the 5’ss and 3’ss RTMs are DNAs.The dual RTM system of any one of claims 35 to 53, wherein the 5’ss and 3’ss RTMs are RNAs.The dual RTM system of any one of claims 35 to 55 comprising a vector comprising the 5’ss and 3’ss RTMs.The dual RTM system of any one of claims 35 to 55 comprising two vectors separately comprising the 5’ss RTM and 3’ss RTM.The dual RTM system of claim 57, wherein the vector (s) is a recombinant expression vector (s) .The dual RTM system of claim 58, wherein the vector (s) is a viral vector.The dual RTM system of claim 59, wherein the viral vector is an adenovirus (AV) , an Adeno-Associated Virus (AAV) , a lentivirus (LV) , a retrovirus (RV) , a herpes simplex virus (HSV) , or a baculovirus (BEV) .The dual RTM system of claim 60, wherein the viral vector is a single-stranded Adeno-Associated Virus (ssAAV) or a self-complementary Adeno-Associated Virus (scAAV) .The dual RTM system of claim 58, wherein the vector (s) is a non-viral vector.The dual RTM system of claim 62, wherein the non-viral vector is a plasmid, a liposome, a nanoparticle, a polymer, a transposon, an exosome, a minicircle, a cosmid, a YAC vector, or BAC vector.A cell comprising the dual RTM system of any one of claims 35 to 63.A pharmaceutical composition comprising the dual RTM system of any one of claims 35 to 63, or the cell of claim 64, and at least one pharmaceutically acceptable carrier.A method of correcting a pre-mRNA with a mutation comprising contacting the pre-mRNA with the dual RTM system of any one of claims 35 to 63 under conditions suitable for trans-splicing, wherein the replacement fragment of 5’ss RTM and / or the 3’ss RTM has the correct sequence.A method of editing a pre-mRNA comprising contacting the pre-mRNA with the dual RTM system of any one of claims 35 to 63 under conditions suitable for trans-splicing, wherein the replacement fragment of 5’ss RTM and / or the 3’ss RTM has the edited sequence.A method of correcting a pre-mRNA with a mutation in a cell comprising transferring the dual RTM system of any one of claims 35 to 63 to the cell, wherein the replacement fragment of 5’ss RTM and / or the 3’ss RTM has the correct sequence.A method of treating a disease or disorder associated with a gene mutation in a subject in need thereof comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of claim 65, wherein the replacement fragment of 5’ss RTM and / or the 3’ss RTM has the correct sequence for the mutated gene.A method of expressing a recombinant mRNA, comprising culturing the dual RTM system of any one of claims 35 to 63 under conditions suitable for trans-splicing.A method of expressing a recombinant mRNA, comprising culturing the cell of claim 64 under conditions suitable for recombinant expression.The method of claim 70 or 71, wherein the recombinant mRNA is at least 5 kb in length.The method of claim 70 or 71, wherein the recombinant mRNA is at least 8 kb in length, at least 10 kb in length, or at least 12 kb in length.A triple RTM system comprising a N-ss RTM, a M-ss RTM, and a C-ss RTM, wherein(1) the N-ss RTM comprises, from 5’ to 3’, a replacement fragment and a 3’ intron, wherein the replacement fragment comprises (i) a N coding sequence, (ii) an inserted intron, and (iii) an M1 coding sequence;(2) the M-ss RTM comprises, from 5’ to 3’, a 5’ intron, a replacement fragment, and a 3’ intron; wherein the replacement fragment comprises (i) the M1 coding sequence, (ii) a first inserted intron, (iii) an M2 coding sequence; (iv) a second inserted intron, and (v) an M3 coding sequence; and(3) the C-ss RTM comprises, from 5’ to 3’, a 5’ intron, and a replacement fragment, wherein the replacement fragment comprises (i) the M3 coding sequence, (ii) an inserted intron, and (iii) a C coding sequence;wherein the coding sequences, when linked in the order N–M1–M2–M3-C, form a contiguous coding sequence that encodes a functional protein or polypeptide;wherein each intron has a binding fragment, and the binding fragments of the following introns reverse complementarily pair with each other: (i) the inserted intron of N-ss RTM and the 5’ intron of the M-ss RTM; (ii) the first inserted intron of M-ss RTM and the 3’ intron of the N-ss RTM; (iii) the second inserted intron of M-ss RTM and the 5’ intron of the C-ss RTM; and (iv) the inserted intron of C-ss RTM and the 3’ intron of the M-ss RTM.The triple RTM system of claim 74, wherein the 5’ intron of the M-ss RTM and / or the C-ss RTM comprise a 3’ trans-splicing fragment comprising an SRE derived from a natural intron having a SkipProb of at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, or at least 90%.The triple RTM system of claim 75, wherein the natural intron is AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33.The triple RTM system of claim 75 or 76, wherein the 3’ trans-splicing fragment is at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37, 40, 41, 42, 47, 50, 73, 74, 77, 97, 105, 107, 113, 115, 131, 133, and 135.The triple RTM system of any one of claims 74 to 77, wherein the first inserted intron of the M-ss RTM and / or the inserted intron of the C-ss RTM comprise a 3’ trans-splicing fragment comprising an SRE derived from a natural intron having a SkipProb of at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, or at least 90%.The triple RTM system of claim 78, wherein the natural intron is AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33.The triple RTM system of claim 78 or 79, wherein the 3’ trans-splicing fragment of the inserted intron is at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37, 40, 41, 42, 47, 50, 73, 74, 77, 97, 105, 107, 113, 115, 131, 133, and 135.The triple RTM system of any one of claims 74 to 80, wherein the 3’ intron of the M-ss RTM and / or the C-ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment comprising an SD derived from a natural intron selected from: ADGRG1 Intron 8, AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33.The triple RTM system of claim 81, wherein the 5’ trans-splicing fragment is at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 66-72, 76, 101, 109, 111, 117, 119, 132, 134, and 136.The triple RTM system of any one of claims 74 to 82, wherein the inserted intron of the N-ss RTM and / or the second inserted intron of the M-ss RTM comprise a 5’ trans-splicing fragment comprising an SD derived from a natural intron selected from: ADGRG1 Intron 8, AZIN2 Intron 3, BRCA1 Intron 13, CD209 Intron 3, CD38 Intron 3, COL4A5 Intron 25, COL4A5 Intron 32, COL4A5 Intron 35, COL4A5 Intron 39, IFT122 Intron 8, KCNIP2 Intron 5, LCN10 Intron 2, LINC02889 Intron 8, MPHOSPH6 Intron 2, MRPL48 Intron 4 , NMNAT3 Intron 5, NSF Intron 2, SHOC2 Intron 2, TBK1 Intron 14, TBK1 Intron 14_truncated, ZNF346 Intron 2, mouse Col4a5 Intron 30, or mouse Col4a5 Intron 33.The triple RTM system of claim 83, wherein the 5’ trans-splicing fragment of the inserted intron is at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 66-72, 76, 101, 109, 111, 117, 119, 132, 134, and 136.The triple RTM system of claim 74, wherein:(A)the inserted intron of the N-ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (1a) ;the 3’ intron of the N-ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (2a) ;the 5’ intron of M-ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (3a) ; andthe first inserted intron of M-ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (4a) ;wherein the trans-splicing fragments (1a) , (2a) , (3a) , and (4a) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to:(i) SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively;(ii) SEQ ID NOs: 76, 68, 47, and 50, respectively;(iii) SEQ ID NOs: 66, 67, 41, and 41, respectively;(iv) SEQ ID NOs: 66, 67, 42, and 42, respectively;(v) SEQ ID NOs: 66, 67, 44, and 44, respectively;(vi) SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively;(vii) SEQ ID NOs: 71, 72, 73, and 74, respectively;(viii) SEQ ID NOs: 70, 72, 41, and 74, respectively;(ix) SEQ ID NOs: 71, 101, 73, and 97, respectively;(x) SEQ ID NOs: 109, 111, 105, and 107, respectively; or(xi) SEQ ID NOs: 117, 119, 113, and 115, respectively; and / or(B)the second inserted intron of the M-ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (1b) ;the 3’ intron of the M-ss RTM comprises a 5’ trans-splicing fragment (2b) ;the 5’ intron of C-ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (3b) ; andthe inserted intron of C-ss RTM comprises a 3’ trans-splicing fragment (4b) ;wherein the trans-splicing fragments (1b) , (2b) , (3b) , and (4b) have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to:(i) SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively;(ii) SEQ ID NOs: 76, 68, 47, and 50, respectively;(iii) SEQ ID NOs: 66, 67, 41, and 41, respectively;(iv) SEQ ID NOs: 66, 67, 42, and 42, respectively;(v) SEQ ID NOs: 66, 67, 44, and 44, respectively;(vi) SEQ ID NOs: 66, 67, 37, and 40, respectively;(vii) SEQ ID NOs: 71, 72, 73, and 74, respectively;(viii) SEQ ID NOs: 70, 72, 41, and 74, respectively;(ix) SEQ ID NOs: 71, 101, 73, and 97, respectively;(x) SEQ ID NOs: 109, 111, 105, and 107, respectively; or(xi) SEQ ID NOs: 117, 119, 113, and 115, respectively.The triple RTM system of any one of claims 74 to 85, wherein the length of the complementary region of any one, two, three or all four of the binding pairs ranges from 30 to 1500 base pairs (bp) .The triple RTM system of claim 86, wherein the length of the complementary region of any one, two, three or all four of the binding pairs ranges from 50 to 1000 bp, from 100 to 900 bp, from 200 to 900 bp, from 300 to 800 bp, from 400 to 700 bp, from 500 to 700 bp, from 150 to 600 bp, from 200 to 600 bp, from 300 to 600 bp, from 400 to 600 bp, from 500 to 600 bp, or from 180 to 300 bp.The triple RTM system of claim 86, wherein the length of the complementary region of any one, two, three or all four of the binding pairs is about 150 bp, about 300 bp, about 400 bp, about 500 bp, or about 600 bp.The triple RTM system of any one of claims 74 to 88, wherein any one, two, or all three of the N-ss RTM, the M-ss RTM, and C-ss RTM further comprise an RNA stabilizing element between the binding fragment and the SRE in one or more introns.The triple RTM system of claim 89, wherein the RNA stabilizing element is a G4 motif or a kissing-loop-like structure.The triple RTM system of claim 74, wherein(A) (1) the inserted intron of the N-ss RTM, (2) the 3’ intron of the N-ss RTM, (3) the 5’ intron of the M-ss RTM, and (4) the first inserted intron of the N-ss RTM have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to:(i) SEQ ID NOs: 6, 7, 4, and 5, respectively;(ii) SEQ ID NOs: 10, 11, 12, and 13, respectively;(iii) SEQ ID NOs: 6, 7, 21, and 22, respectively;(iv) SEQ ID NOs: 6, 7, 23, and 24, respectively;(v) SEQ ID NOs: 6, 7, 27, and 28, respectively;(vi) SEQ ID NOs: 6, 30, 29, and 5, respectively;(vii) SEQ ID NOs: 33, 34, 31, and 32, respectively;(viii) SEQ ID NOs: 56, 57, 58, and 59, respectively;(ix) SEQ ID NOs: 60, 61, 62, and 63, respectively;(x) SEQ ID NOs: 98, 100, 93, and 95, respectively;(xi) SEQ ID NOs: 108, 110, 103, and 106, respectively;(xii) SEQ ID NOs: 116, 118, 112, and 114, respectively;(xiii) SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and 126, respectively; or(xiv) SEQ ID NOs: 127, 128, 129, and 130, respectively; and / or(B) (1) the second inserted intron of the M-ss RTM, (2) the 3’ intron of the M-ss RTM, (3) the 5’ intron of the C-ss RTM, and (4) the inserted intron of the C-ss RTM have nucleotide sequences that are independently at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to:(i) SEQ ID NOs: 6, 7, 4, and 5, respectively;(ii) SEQ ID NOs: 10, 11, 12, and 13, respectively;(iii) SEQ ID NOs: 6, 7, 21, and 22, respectively;(iv) SEQ ID NOs: 6, 7, 23, and 24, respectively;(v) SEQ ID NOs: 6, 7, 27, and 28, respectively;(vi) SEQ ID NOs: 6, 30, 29, and 5, respectively;(vii) SEQ ID NOs: 33, 34, 31, and 32, respectively;(viii) SEQ ID NOs: 56, 57, 58, and 59, respectively;(ix) SEQ ID NOs: 60, 61, 62, and 63, respectively;(x) SEQ ID NOs: 98, 100, 93, and 95, respectively;(xi) SEQ ID NOs: 108, 110, 103, and 106, respectively;(xii) SEQ ID NOs: 116, 118, 112, and 114, respectively;(xiii) SEQ ID NOs: 123, 124, 125, and 126, respectively; or(xiv) SEQ ID NOs: 127, 128, 129, and 130, respectively.The triple RTM system of any one of claims 74 to 91, wherein (1) the replacement fragment of N-ss RTM further comprises a 5’ untranslated region, (2) the replacement fragment of C-ss RTM further comprises a 3’ untranslated region, or both (1) and (2) .The triple RTM system of any one of claims 74 to 92, wherein the N-ss, M-ss, and C-ss RTMs are DNAs.The triple RTM system of any one of claims 74 to 92, wherein the N-ss, M-ss, and C-ss RTMs are RNAs.The triple RTM system of any one of claims 74 to 94 comprising at least one or two vectors collectively comprising the N-ss, M-ss, and C-ss RTMs.The triple RTM system of any one of claims 74 to 94 comprising three vectors separately comprising the N-ss RTM, M-ss RTM, and C-ss RTM.The triple RTM system of claim 95 or 96, wherein the vector (s) is a recombinant expression vector (s) .The triple RTM system of claim 97, wherein the vector (s) is a viral vector.The triple RTM system of claim 98, wherein the viral vector is an adenovirus (AV) , an Adeno-Associated Virus (AAV) , a lentivirus (LV) , a retrovirus (RV) , a herpes simplex virus (HSV) , or a baculovirus (BEV) .The triple RTM system of claim 99, wherein the viral vector is a single-stranded Adeno-Associated Virus (ssAAV) or a self-complementary Adeno-Associated Virus (scAAV) .The triple RTM system of claim 97, wherein the vector (s) is a non-viral vector.The triple RTM system of claim 101, wherein the non-viral vector is a plasmid, a liposome, a nanoparticle, a polymer, a transposon, an exosome, a minicircle, a cosmid, a YAC vector, or BAC vector.A cell comprising the triple RTM system of any one of claims 74 to 102.A pharmaceutical composition comprising the triple RTM system of any one of claims 74 to 102, or the cell of claim 103, and at least one pharmaceutically acceptable carrier.A method of correcting a pre-mRNA with a mutation comprising contacting the pre-mRNA with the triple RTM system of any one of claims 74 to 102 under conditions suitable for trans-splicing, wherein the replacement fragment of N-ss RTM, M-ss RTM and / or C-ss RTM has the correct sequence.A method of editing a pre-mRNA comprising contacting the pre-mRNA with the triple RTM system of any one of claims 74 to 102 under conditions suitable for trans-splicing, wherein the replacement fragment o of N-ss RTM, M-ss RTM and / or C-ss RTM has the edited sequence.A method of correcting a pre-mRNA with a mutation in a cell comprising transferring the triple RTM system of any one of claims 74 to 102 to the cell, wherein the replacement fragment of N-ss RTM, M-ss RTM and / or C-ss RTM has the correct sequence.A method of treating a disease or disorder associated with a gene mutation in a subject in need thereof comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of claim 104, wherein the replacement fragment of N-ss RTM, M-ss RTM and / or C-ss RTM has the correct sequence for the mutated gene.A method of expressing a recombinant mRNA, comprising culturing the triple RTM system of any one of claims 74 to 102 under conditions suitable for trans-splicing.A method of expressing a recombinant mRNA, comprising culturing the cell of claim 103 under conditions suitable for recombinant expression.The method of claim 109 or 110, wherein the recombinant mRNA is at least 8 kb in length.The method of claim 109 or 110, wherein the recombinant mRNA is at least 10 kb in length, at least 12 kb in length, or at least 15 kb in length.A method of preparing an RTM comprising (1) identifying an intron with a SkipProb of at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, or at least 90%, and (2) constructing an RTM comprising, from 5’ to 3’, a replacement fragment and a 3’ intron, wherein the 3’ intron comprises (i) a binding fragment that reverse complementarily pairs with a target pre-mRNA and (ii) a 3’ trans-splicing fragment comprising an SRE derived from the identified intron.An engineered RNA comprising a kissing-loop like sequence having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 65 or 137.A DNA encoding the engineered RNA of claim 114.An RTM comprising a binding fragment and an engineered intron, and a kissing-loop like sequence having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 65 or 137 between the binding fragment and the engineered intron.

Images