Methods and compositions for tgfbi gene editing and therapy using crispr system and engineered protein delivery vehicle

Abstract

Disclosed are a method and composition for TGFBI gene editing and therapy using CRISPR system and engineered protein delivery vehicle.

Description

Methods and Compositions for TGFBI Gene Editing and Therapy using CRISPR System and Engineered Protein Delivery Vehicle

[0001] The present application claims the benefit of priorities to the following International Applications: PCT / CN2024 / 120630, filed on September 24, 2024; PCT / CN2024 / 132364, filed on November 15, 2024; and PCT / CN2025 / 095495, filed on May 16, 2025; the disclosure of which are hereby incorporated by reference in their entirety.Technical Field

[0002] The present disclosure relates to methods and components for the control of TGFBI gene expression, or gene-editing, by introducing double-stranded breaks, and for treating subjects having any diseases associated with TGFBI.Background

[0003] Transforming growth factor beta-induced gene (TGFBI; BIGH3; BIG-H3) encodes transforming growth factor beta-induced protein (TGFBIp) , a 68-kDa extracellular matrix (ECM) protein composed of 683 amino acid residues. TGFBIp is also described as keratoepithelin (KE) , BIGH3, big-h3, or bigh3 depending on the major production site or the time of description. TGFBIp contains a secretory signal peptide sequence, a cysteine-rich EMI domain, four homologous fasciclin 1 (FAS1) domains which each contain 140 amino acid residues at the N-terminus, and an arginine-glycine-aspartate (RGD) motif which binds to integrin at the C-terminus. TGFBIp was first isolated from an adenocarcinoma cell line, where it was upregulated after TGF-b treatment.

[0004] Corneal dystrophies are inherited corneal diseases that are typically slowly progressive, symmetric, and without relationship to systemic or environmental factors (American Academy of Ophthalmology (2007) ) . Once genetic analysis became available, specific genetic defects began to be associated with corneal dystrophies. Munier et al. (1997) recognized the following relationships between TGFBI mutations and specific corneal dystrophies: p. Arg124Leu for Reis-Bücklers corneal dystrophy (RBCD) , p. Arg555Gln for Thiel-Behnke corneal dystrophy (TBCD) , p. Arg124Cys for lattice corneal dystrophy type 1 (LCD1) , p. Arg555Trp for granular corneal dystrophy type 1 (GCD1) , and p. Arg124His for granular corneal dystrophy type 2 (GCD2) . As of the date of this review, at least 30 mutations in the TGFBI gene have been associated with corneal dystrophies, and most cases demonstrate a conserved mutation in one of two hot spots at codon Arg124 in first FAS1 domain or Arg555 in fourth FAS1 domain. Information of all mutations and variants in the TGFBI corneal dystrophies are available at the Leiden Open Variation Database (LOVD) locus specific database (http:  / / databases. love. nl / shared / genes / TGFBI) .

[0005] There still exists an unmet need for treatment of Corneal dystrophies, and here provides an effective treatment modality to repair the mutated sequence of the gene responsible for TGFBI corneal dystrophies.Summary

[0006] The present disclosure solves the above-mentioned technical problems through the following technical solutions:

[0007] In one aspect, the present disclosure provides a guide RNA (gRNA) comprising:(a) a spacer sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 51-100;(b) a spacer sequence comprising at least 16, 17, 18, 19 or 20 contiguous nucleotides of a sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 51-100; or(c) a spacer sequence with at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, or 90%identity to a sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 51-100.

[0008] In some embodiments, the gRNA is a dual guide RNA or a single guide RNA (sgRNA) , preferably, the gRNA is a sgRNA.

[0009] In some embodiments, the sgRNA comprises a spacer sequence that has the pattern of sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 279-290.

[0010] In some embodiments, the sgRNA in this disclosure comprises(a) a sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 103-202, and 219-278;(b) a sequence with at least 90%identity to a sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 103-202, and 219-278; or(c) a sequence with at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, or 90%identity to a sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 103-202, and 219-278.

[0011] In some embodiments, the sgRNA in this disclosure comprises(a) a sequence of SEQ ID NO: 219;(b) a sequence with at least 90%identity to a sequence of SEQ ID NO: 219; or(c) a sequence with at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, or 90%identity to a sequence of SEQ ID NO: 219.

[0012] In some embodiments, the sgRNA in this disclosure comprises(a) a sequence of SEQ ID NO: 230;(b) a sequence with at least 90%identity to a sequence of SEQ ID NO: 230; or(c) a sequence with at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, or 90%identity to a sequence of SEQ ID NO: 230.

[0013] In some embodiments, the gRNA is modified, optionally, and the modification is selected from one or any combination of the following: methylation, ethylation, methoxylation, ethoxylation, fluorination of one or more of the nucleotides; or a phosphorothiolate linkage between two or more of the nucleotides; preferably, at least the first three nucleotides of the spacer sequence are modified.

[0014] In some embodiments, none of the nucleotides of the gRNA is modified.

[0015] In another aspect, the present disclosure provides a polynucleotide comprising a sequence encoding a guide RNA mentioned in this disclosure.

[0016] In yet another aspect, the present disclosure provides a CRISPR / Cas system comprising:(a) a guide RNA as described in this disclosure or a polynucleotide comprising a sequence encoding the guide RNA; and(b) an RNA-guided DNA binding agent or a polynucleotide comprising a sequence encoding the RNA-guided DNA binding agent;optionally, the polynucleotide comprising a sequence encoding the guide RNA is DNA or RNA, and / or the polynucleotide comprising a sequence encoding the RNA-guided DNA binding agent is DNA or RNA.

[0017] In some embodiments, the RNA-guided DNA binding agent is Cas9 or its variant; preferably, the Cas9 is SpCas9.

[0018] In some embodiments, the RNA-guided DNA binding agent has a nuclease activity or a nickase activity.

[0019] In some embodiments, wherein the RNA-guided DNA binding agent is a dead Cas protein.

[0020] In some embodiment, wherein the RNA-guided DNA binding agent further comprises a sequence selected from the group consisting of: a nuclear localization signal sequence, a nuclear export signal sequence, a cell-penetrating peptide sequence, an affinity tag sequence, a deaminase sequence, a reverse transcriptase sequence, a recombinase sequence, a methyltransferase sequence, a methylase sequence, an acetylase sequence, an acetyltransferase sequence, a transcriptional activator sequence, a transcriptional repressor domain sequence, a cryptochrome sequence, a light inducible / controllable domain sequence, or a chemically inducible / controllable domain sequence.

[0021] In still yet another aspect, the present disclosure provides a composition comprising a guide RNA as described in this disclosure or the CRISPR / Cas system as described in this disclosure.

[0022] In one aspect, the present disclosure provides a composition comprising a vector encoding a guide RNA as described in this disclosure.

[0023] In another aspect, the present disclosure provides a composition comprising a vector system comprising a sequence encoding a guide RNA as described in this disclosure and a sequence encoding an RNA-guided DNA binding agent as described in this disclosure.

[0024] In yet another aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical formulation comprising:(a) the gRNA as described in this disclosure, the polynucleotide as described in this disclosure, the CRISPR / Cas system as described in this disclosure, or the composition as described in this disclosure; and(b) a pharmaceutically acceptable carrier.

[0025] In still yet another aspect, the present disclosure provides an engineered protein delivery vehicle (ePDV) comprising:(a) a polyprotein comprising a first structural protein; and(b) a tropism factor.

[0026] In still yet another aspect, the present disclosure provides an engineered protein delivery vehicle (ePDV) comprising(a) a polyprotein comprising a first structural protein;(b) a tropism factor; and(c) a gRNA as described in this disclosure.

[0027] In some embodiments, the polyprotein as described in this disclosure is a protease-containing polyprotein comprising a first structural protein and a protease.

[0028] In some embodiments, the ePDV further comprises: (d) an RNA-guided DNA binding agent, or a polynucleotide comprising a sequence encoding the RNA-guided DNA binding agent.

[0029] In some embodiments, the RNA-guided DNA binding agent is fused with a second structural protein to form a fusion protein.

[0030] In some embodiments, the fusion protein further comprises:(a) a cleavable linker; and(b) a nuclear export sequence (NES) .

[0031] In some embodiments, the RNA-guided DNA binding agent and a second structural protein was previously fused via a cleavable linker located therebetween, thereby forming a fusion protein, and the cleavable linker has subsequently been cleaved by the protease of the protease-containing polyprotein.

[0032] In some embodiments, the second structural protein further comprises a NES.

[0033] In some embodiments, the first structural protein comprises a Gag polypeptide, optionally, the Gag polypeptide does not comprise a nucleocapsid (NC) domain.

[0034] In some embodiments, the second structural protein comprises a Gag polypeptide; optionally, the Gag polypeptide does not comprise a nucleocapsid (NC) domain.

[0035] In some embodiments, the RNA-guided DNA binding agent is a CRISPR nuclease.

[0036] In some embodiments, the CRISPR nuclease is a Cas9 protein.

[0037] In some embodiments, the Cas9 protein is a Cas9, a Cas9 nickase, or a dCas9.

[0038] In some embodiments, the fusion protein comprises two NES, three NES, four NES, five NES, six NES, seven NES, eight NES, nine NES, or ten NES.

[0039] In some embodiments, the fusion protein further comprises a nuclear localization sequence (NLS) .

[0040] In some embodiments, the fusion protein further comprises two NLS, three NLS, four NLS, or five NLS.

[0041] In some embodiments, the cleavable linker is located between the RNA-guided DNA binding agent and the NES.

[0042] In some embodiments, the cleavable linker comprises a protease cleavage site; preferably, the cleavable linker comprises a sequence of SEQ ID NO: 313.

[0043] In some embodiments, the protease cleavage site is a Moloney murine leukemia virus (MMLV) protease cleavage site or a Friend murine leukemia virus (FMLV) protease cleavage site.

[0044] In some embodiments, the cleavable linker comprises a sequence of SEQ ID NO:313.

[0045] In some embodiments, the protease-containing protein comprises an MMLV Gag-pro polyprotein or an FMLV Gag-pro polyprotein; preferably, the protease-containing protein comprises a sequence of SEQ ID NO: 312.

[0046] In some embodiments, the fusion protein comprises the structure: [Gag polypeptide] - [2X-5X NES] - [cleavable linker] - [NLS] - [RNA-guided DNA binding agent] - [NLS] ; optionally, the “] - [” comprises a linker.

[0047] In some embodiments, the fusion protein comprises the structure: [Gag polypeptide] - [2X-5X NES] - [cleavable linker] - [NLS] - [Cas9] - [NLS] , optionally the “] - [” comprises a linker; preferably, the fusion protein comprises the structure: [Gag polypeptide] - [4X NES] - [cleavable linker] - [NLS] - [Cas9] - [NLS] ; optionally the “] - [” comprises a linker; preferably, the fusion protein comprises a sequence selected from SEQ ID NO: 304 or SEQ ID NO: 404.

[0048] In some embodiments, the Gag polypeptide comprises a capsid (CA) polypeptide and / or a matrix (MA) polypeptide.

[0049] In some embodiments, at least one of the Gag polypeptide is selected from the group consisting of: a Moloney murine leukemia virus-derived structural protein, a Bovine immunodeficiency virus-derived structural protein, a Simian immunodeficiency virus-derived structural protein, a Feline immunodeficiency virus-derived structural protein, a Human immunodeficiency virus-derived structural protein, Equine infection anemia virus-derived structural protein, a Caprine arthritis encephalitis virus-derived structural protein, a Baboon endogenous virus-derived structural protein, and an endogenous retrovirus derived structural protein, preferably the endogenous retrovirus derived structural protein is a human endogenous retrovirus (HERV) derived structural protein.

[0050] In some embodiments, the Gag polypeptide is selected from the group consist of: Moloney murine leukemia virus (MMLV) -derived Gag polypeptide, and HIV-1 derived Gag polypeptide.

[0051] In some embodiments, the human endogenous retrovirus (HERV) derived structural protein is selected from the group consisting of PEG10, RTL1, Arc, Asprvl, HERV-Kcon, PNMA1, PNMA3, PNMA4, PNMA5, PNMA6, PNMA7, RTL1, MOAPI, and ZCCHC12.

[0052] In some embodiments, the tropism factor comprises a viral envelope glycoprotein derived from enveloped virus selected from a group consisting of: Vesicular Stomatitis Virus (VSV) , Rabies virus (RABV) , Eastern equine encephalitis virus (EEEV) , Mokola virus (MOKV) , Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) , Hepatitis B virus (HBV) , Chandipura virus (CNV / CHPV) , Baboon endogenous virus (BAEV) , Zika Virus, GP64 and Baculovirus; preferably, the tropism factor comprises a sequence selected from SEQ ID NO: 308 or SEQ ID NO: 301.

[0053] In one aspect, the present disclosure provides an engineered protein delivery vehicle (ePDV) , wherein the engineered protein delivery vehicle (ePDV) comprises (1) a protease-containing polyprotein comprising a sequence of SEQ ID NO: 312; (2) a fusion protein comprising a sequence of SEQ ID NO: 404; (3) a tropism factor comprising a sequence of SEQ ID NO: 308, and (4) a gRNA comprising a sequence of SEQ ID NO: 230.

[0054] In another aspect, the present disclosure provides an engineered protein delivery vehicle (ePDV) , wherein the engineered protein delivery vehicle (ePDV) comprises (1) a protease-containing polyprotein comprising a sequence of SEQ ID NO: 312; (2) a fusion protein comprising a sequence of SEQ ID NO: 404; (3) a tropism factor comprising a sequence of SEQ ID NO: 301, and (4) a gRNA comprising a sequence of SEQ ID NO: 230.

[0055] In one aspect, the present disclosure provides a plurality of polynucleotides comprising:(a) a first polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding a polyprotein, preferably a protease-containing polyprotein as described in this disclosure;(b) a second polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding a fusion protein as described in this disclosure;(c) a third polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding a tropism factor as described in this disclosure; and(d) a fourth polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding a guide RNA (gRNA) as described in this disclosure.

[0056] In another aspect, the present disclosure provides one or more vectors comprising the plurality of polynucleotides as described in this disclosure.

[0057] In some embodiments, each of the first, second, third, and fourth polynucleotides are on the separate vectors.

[0058] In some embodiments, two or more of the first, the second, third, and fourth polynucleotides are on the same vector.

[0059] In yet another aspect, the present disclosure provides a cell modified by:(a) the gRNA as described in this disclosure;(b) the polynucleotide as described in this disclosure;(c) the CRISPR-Cas system as described in this disclosure;(d) the composition as described in this disclosure;(e) the pharmaceutical formulation as described in this disclosure;(f) the ePDV as described in this disclosure;(g) the plurality of polynucleotides as described in this disclosure; or(h) one or more vectors as described in this disclosure;optionally, the cell is an ocular corneal stromal cell, an ocular corneal epithelial cell, or an ocular corneal posterior fibrous membrane cell.

[0060] In still yet another aspect, the present disclosure provides a method of making an engineered protein delivery vehicle (ePDV) comprising transfecting into a cell the plurality of polynucleotides as described in this disclosure, or the one or more vectors as described in this disclosure.

[0061] In one aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the ePDV as described in this disclosure.

[0062] In another aspect, the present disclosure provides a method of editing a nucleic acid molecule in a target cell comprising contacting the target cell with the ePDV as described in this disclosure, or the pharmaceutical composition as described in this disclosure; thereby installing one or more modifications to the nucleic acid molecule at a target site.

[0063] In yet another aspect, the present disclosure provides a kit comprising the ePDV mentioned above, or the plurality of polynucleotides as described in this disclosure.

[0064] In still yet another aspect, the present inventio provides an engineered protein delivery vehicle (ePDV) produced by transfecting, transducing, electroporating, or otherwise inserting the plurality of polynucleotides mentioned above, or the one or more vectors mentioned above, into a cell and expressing the components of the virus-like particle from the plurality of polynucleotides or one or more vectors in the cell, thereby allowing the ePDV to spontaneously assemble in the cell.

[0065] In one aspect, the present disclosure provides a method for treating, preventing, or diagnosing diseases associated with the TGFBI gene locus in a subject, comprising:(a) contacting the target cell with the gRNA as described in this disclosure;(b) contacting the target cell with the polynucleotide as described in this disclosure;(c) contacting the target cell with the CRISPR-Cas system as described in this disclosure;(d) contacting the target cell with the composition as described in this disclosure;(e) contacting the target cell with the pharmaceutical formulation as described in this disclosure;(f) contacting the target cell with the ePDV as described in this disclosure;(g) contacting the target cell with the plurality of polynucleotides as described in this disclosure; or(h) contacting the target cell with the one or more vectors as described in this disclosure.

[0066] In some embodiments, the disease is corneal dystrophy.

[0067] In one aspect, this disclosure provides a method of modifying the TGFBI gene and / or inducing a double-stranded break (DSB) within TGFBI, comprising delivering to a cell:(a) the CRISPR / Cas system as described in this disclosure;(b) the composition as described in this disclosure;(c) the pharmaceutical formulation as described in this disclosure;(d) the ePDV as described in this disclosure;(e) the plurality of polynucleotides as described in this disclosure;(f) the one or more vectors as described in this disclosure.

[0068] In one aspect, this disclosure provides a method for treating a corneal dystrophy in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a gene editing agent comprising the group consisting of:(a) the CRISPR / Cas system as described in this disclosure;(b) the composition as described in this disclosure;(c) the pharmaceutical formulation as described in this disclosure;(d) the ePDV as described in this disclosure;(e) the plurality as described in this disclosure; and(f) the one or more vectors as described in this disclosure.

[0069] In some embodiments, the corneal dystrophy is associated with a mutation in the TGFBI gene.

[0070] In some embodiments, the mutation is selected from the group consisting of p.Arg124Cys, p. Arg555Trp, or p. Thr623_Pro628del in the TGFBI gene; preferably, the mutation is p. Arg124Cys in the TGFBI gene.

[0071] In some embodiments, the gene editing agent is administered: (a) by intraocular injection selected from the group consisting of intrastromal injection, intracameral injection, and subconjunctival injection; or (b) by topical ocular administration selected from the group consisting of eye drops, ophthalmic gel, and ocular insert.

[0072] In some embodiments, the gene editing agent is administered by intrastromal injection.

[0073] Table 1-Sequence Listing 1

[0074] In Table 1, (N) X represents x contiguous nucleotides, where x is 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, or 25.Brief description of the drawings

[0075] FIG. 1 A&B shows the editing efficiency of each plasmid targeting at different sites of TGFBI gene in HEK293T cells.

[0076] [Rectified under Rule 91, 24.10.2025]FIG. 2 A&B shows the editing efficiency of each plasmid targeting at different sites of TGFBI gene in HCE-T cells. The plasmids were the same as tested in FIG. 1 A&B except for two additional plasmids Cell&Mol_p395 and p424 only tested in HCE-T cell line.

[0077] Table 2 Detailed information for the plasmids in FIG. 1 A&B and FIG. 2 A&B

[0078] FIG. 3 A&B shows the editing efficiency of each guide RNA packaged in ePDV system targeting at different sites of TGFBI gene in HEK293T and HCE-T cells.

[0079] Table 3 Detailed information of the guide RNA sequences in plasmids in FIG. 3 A&B

[0080] FIG. 4A illustrates the gene-editing efficiency in corneal tissues of NHPs at varying dose levels of the GEB101 (Dose level 1: 5.3E10 particles / eye; Dose level 2: 1.06E11 particles / eye; Dose level 3: 3.18E11 particles / eye) , while FIG. 4B presents post-administration observations of the GEB101 in NHPs, including gene-editing activity in non-corneal tissues and Anti-Cas9 antibody levels.

[0081] FIG. 5 High in vitro on-target editing efficiency of GEB-101. FIG. 5A shows Percentage of insertions and deletions (indels) following gene editing using TGFBI–targeting sgRNA (#3719) -expressing plasmid delivered by chemical transfection in HEK293T-SpCas9 cells, and the sgRNA (#3719) -expressing plasmid comprises a spacer sequence set forth in SEQ ID NO: 16 and a scaffold sequence set forth in SEQ ID NO: 101. FIG. 5 B shows Dose-dependent and saturated indels of GEB-101 in HEK293T cells. Experiments were performed on 96-well cell culture plates in two or three technical replicates. Bars denote arithmetic means ± standard deviations.

[0082] FIG. 6 shows High in vivo on-target editing efficiency of GEB-101 in cornea of a non-human primate (NHP) . FIG. 6 shows percentages of insertions and deletions in TGFBI gene mediated by different doses of GEB-101 in eyes of one NHP (Macaca fascicularis, crab-eating monkey) . Cornea (CE removed) 1-6 refers to the six pieces of tissues divided from one single cornea. BA, before administration; BE, before euthanasia; CE, corneal epithelium; RPE, retinal pigment epithelium.

[0083] FIG. 7 Reduced on-target editing efficiency in NHP after instrastromally injection of GEB-101 with one-third of the low dose suggested in the previous NHP experiment.

[0084] FIG. 8A Editing efficiency of cell samples treated with plasmid encodes Cas9 (SEQ ID NO. 203) and 3719-sgRNA (SEQ ID NO. 217) , or ePDVs with components in Table 7. FIG. 8B Assessment of off-target effects in cell samples following treatment with plasmid and ePDV by utilizing GUIDE-seq method. FIG. 8C Assessment of off-target effects in cell samples following treatment with plasmid and ePDV by deep amplicon-seq.

[0085] Table 4 -Sequence Listing 2 -example protein sequences of ePDV.

[0086] Table 5 -Sequence Listing 3 -The exemplary sequences in plasmids for ePDV.

[0087] Table 6 –Components of GEB101.

[0088] Table 7 –Components of PDV for GUIDE-Seq. Detailed description

[0089] The following examples further illustrate the present disclosure, but the present disclosure is not limited thereto.Definitions

[0090] The “engineered protein delivery vehicle” or “ePDV” , as described in this disclosure, refers to a delivery system with the structure resembling a virus particle. In preferred embodiments, an ePDV contains at least one fusogenic protein displayed on the surface of the particle. In some embodiments, the ePDV may also be termed “virus-derived Particle” , “engineered virus-like particle” , or eVLP, which may be formed by one or more virus-derived structural protein (s) , one or more endogenous virus structural protein (s) , and / or one or more virus-derived envelope protein (s) . It is important to note that the ePDV is capable of delivering proteins, but not limited to deliver proteins. In some embodiments, the ePDV herein can also be used to deliver nucleic acids or small molecules. The ePDV can deliver proteins, nucleic acids, small molecules, or any combination thereof-including RNPs or cargo consisting solely of nucleic acids or solely of proteins. In some embodiments, the cargo delivered by ePDV consists entirely of nucleic acids without any protein components. In some embodiments, ePDV can be used to deliver both proteins and nucleic acids (e.g., RNP) . In some embodiments, ePDV can be used to deliver proteins alone.

[0091] The term “protease cleavage site, ” as used herein, refers to an amino acid sequence that is recognized and cleaved by a protease, i.e., an enzyme that catalyzes proteolysis and breaks down proteins into smaller polypeptides, or single amino acids. In some embodiments, a protease cleavage site is included in a cleavable linker in a fusion protein, as described herein. In certain embodiments, a protease cleavage site is cleaved by the protease of a Gag-pol polyprotein. In some embodiments, a protease cleavage site comprises an MMLV protease cleavage site or an FMLV protease cleavage site.

[0092] When “t” or “T” appears in a sequence in this disclosure as a nucleotide of an RNA sequence, it should be understood as “u” or “U” .

[0093] The terms “protein” “peptide” and “polypeptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acid residues linked together by peptide (amide) bonds. The terms refer to a protein, peptide, or polypeptide of any size, structure, or function. Typically, a protein, peptide, or polypeptide will be at least three amino acids long. A protein, peptide, or polypeptide may refer to an individual protein or a collection of proteins. One or more of the amino acids in a protein, peptide, or polypeptide may be modified, for example, by the addition of a chemical entity such as a carbohydrate group, a hydroxyl group, a phosphate group, a famesyl group, an isofamesyl group, a fatty acid group, a linker for conjugation, functionalization, or other modification, etc. A protein, peptide, or polypeptide may also be a single molecule or may be a multi-molecular complex. A protein, peptide, or polypeptide may be just a fragment of a naturally occurring protein or peptide. A protein, peptide, or polypeptide may be naturally occurring, recombinant, or synthetic, or any combination. Any of the proteins provided herein may be produced by any method known in the art. For example, the proteins provided herein may be produced via recombinant protein expression and purification, which is especially suited for fusion proteins comprising a peptide linker. Methods for recombinant protein expression and purification are well known, and include those described by Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2012) ) , the contents of which are incorporated herein by reference.

[0094] The term a “fragment” of a polypeptide or a protein, as used herein, should encompass any polypeptide comprising, or alternatively or preferably consisting of, at least 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 17, 18, 19, 20, 25, 30 contiguous or discontinuous amino acids of the protein or polypeptide, as defined herein, as well as any polypeptide having more than 65%, preferably more than 80%, more preferably more than 90%and even more preferably more than 95%amino acid sequence identity thereto.

[0095] The term “variant” when used herein with reference to a polypeptide, refers to a polypeptide related, but not identical, to a wild type polypeptide, for example either by amino acid sequence, structure (e.g., secondary and / or tertiary) , activity (e.g., enzymatic activity) and / or function. Variants include polypeptides comprising one or more amino acid variations (e.g., mutations, insertions, and deletions) , truncations, modifications, or combinations compared to a wild type polypeptide. Variants also include derivatives of the wild type polypeptide and fragments of the wild type polypeptide. Preferred methods of generating a variant of a protein is by genetic engineering, preferably by insertion, substitution, deletion or a combination. A variant of a polypeptide or protein should encompass any polypeptide comprising, or alternatively or preferably consisting of, any natural or genetically engineered polypeptide having more than 70%, preferably more than 80%, even more preferably more than 90%, again more preferably more than 95%, and most preferably more than 97%amino acid sequence identity with the sequence of the protein or polypeptide.

[0096] The terms “polynucleotide” and “nucleic acid” used interchangeably herein, refer to a polymeric form of nucleotides of any length, either ribonucleotides or deoxyribonucleotides. Thus, terms “polynucleotide” and “nucleic acid” encompass single-stranded DNA; double-stranded DNA; multi-stranded DNA; single-stranded RNA; double-stranded RNA; multi-stranded RNA; genomic DNA; cDNA; DNA-RNA hybrids; and a polymer comprising purine and pyrimidine bases or other natural, chemically or biochemically modified, non-natural, or derivatized nucleotide bases.

[0097] As used herein, the term “contacting” means establishing a physical connection between two or more entities. For example, contacting a target nucleic acid with a guide nucleic acid means that the target nucleic acid and the guide nucleic acid are made to share a physical connection; e.g., can hybridize if the sequences share sequence similarity.

[0098] A “vector” or “expression vector” is a replicon, such as plasmid, phage, virus, or cosmid, to which another DNA segment, i.e., an “insert” , may be attached so as to bring about the replication or expression of the attached segment in a cell.

[0099] The term “naturally-occurring” or “unmodified” or “wild type” as used herein as applied to a nucleic acid, a polypeptide, a cell, or an organism, refers to a nucleic acid, polypeptide, cell, or organism that is found in nature.

[0100] “Ribonucleoprotein” (RNP) or “RNP complex” as used herein describes an gRNA, for example, together with a CRISPR / Cas effector polypeptide, such as a Cas protein. In some embodiments, the RNP comprises Cas9 and gRNA (e.g., sgRNA, dgRNA, or crRNA) .

[0101] “Guide RNA, ” and “gRNA” are used herein interchangeably to refer to either a crRNA (also known as CRISPR RNA) , or the combination of a crRNA and a trRNA (also known as tracrRNA) . The crRNA and trRNA may be associated as a single RNA molecule (single guide RNA, sgRNA) or in two separate RNA molecules (dual guide RNA, dgRNA) . “Guide RNA” or “gRNA” refers to each type. The trRNA may be a naturally-occurring sequence, or a trRNA sequence with modifications or variations compared to naturally-occurring sequences. Guide RNAs can include modified RNAs or unmodified RNAs as described herein.

[0102] As used herein, an “RNA-guided DNA binding agent” means a polypeptide or complex of polypeptides having RNA and DNA binding activity, or a DNA-binding subunit of such a complex, wherein the DNA binding activity is sequence-specific and depends on the sequence of the RNA. Exemplary RNA-guided DNA binding agents include Cas cleavases / nickases and inactivated forms ( “dCas DNA binding agents” ) . “Cas nuclease” , also called “Cas protein” , as used herein, encompasses Cas cleavases, Cas nickases, and dCas DNA binding agents. Cas cleavases / nickases and dCas DNA binding agents include a Csm or Cmr complex of a type III CRISPR system, the CaslO, Csml, or Cmr2 subunit, a Cascade complex of a type I CRISPR system, the Cas3 subunit, and Class 2 Cas nucleases. As used herein, a “Class 2 Cas nuclease” is a single-chain polypeptide with RNA-guided DNA binding activity, such as a Cas9 nuclease or a Cpf1 nuclease. Class 2 Cas nucleases include Class 2 Cas cleavases and Class 2 Cas nickases (e.g., H840A, D10A, or N863A variants) , which further have RNA-guided DNA cleavases or nickase activity, and Class 2 dCas DNA binding agents, in which cleavase / nickase activity is inactivated. Class 2 Cas nucleases include, for example, Cas9, Cpfl, C2cl, C2c2, C2c3, HF Cas9 (e.g., N497A, R661A, Q695A, Q926A variants) , HypaCas9 (e.g., N692A, M694A, Q695A, H698A variants) , eSPCas9 (1.0) (e.g, K810A, K1003A, R1060A variants) , and eSPCas9 (l. l) (e.g., K848A, K1003A, R1060A variants) proteins and modifications. Cpfl protein, Zetsche et al, Cell, 163: 1-13 (2015) , is homologous to Cas9, and contains a RuvC-like nuclease domain. Cpfl sequences of Zetsche are incorporated by reference in their entirety. See, e.g., Zetsche, Tables SI and S3. “Cas9” encompasses Spy Cas9, the variants of Cas9 listed herein, and equivalents. See, e.g., Makarova et al, Nat Rev Microbiol, 13 (11) : 722-36 (2015) ; Shmakov et al., Molecular Cell, 60: 385-397 (2015) .

[0103] As used in this disclosure, the term “located therebetween” or “located between” or other similar expressions in reference to the cleavable linker refers to the linker being located within a linear or non-linear arrangement connecting two components (e.g., gag polypeptide and DNA binding agent) , regardless of whether additional functional domains (e.g., nuclear export signals, localization sequences, or epitope tags) are present between the two components. The linker may be directly adjacent to either or both components, or separated by intervening domains

[0104] As presented in this disclosure, the terms “structural protein (s) ” , “structural component (s) ” , or their derivatives, in any tense-past, present, or future-and in either singular or plural form, refer to proteins that contribute to the overall structure of the ePDV disclosed herein or a viral core. The presence of structural proteins facilitates the self-assembly of ePDV. The term “structural protein” further includes functional variant, fragments or derivatives of such protein contributing to the structure of a capsid protein or of protein core of an ePDV or the viral. Typically, the structural proteins are localized inside the core of the ePDV or the viral.

[0105] As presented in this disclosure, the term “derived from, ” “derived, ” or other similar expressions, in reference to a protein originating from a specified species (e.g., virus or other species) , encompasses proteins that either (1) directly originate from such species or are recombinantly produced with ≥50%sequence identity to the native protein, and / or (2) retain part of or all core functional characteristics of the native protein, including engineered variants (e.g., mutations) that preserve these functions.

[0106] Below presents preferred embodiments of the present disclosure based on the drawings in order to illustrate the technical schemes of the present disclosure in detail.Examples

[0107] Example 1

[0108] Plasmid construction

[0109] The plasmids used for cell transfection were cloned using standard T4 ligation approach. Insert fragments containing 20 bp-spacer sequences with sticky end were generated via oligo anneal which then was ligated into BbsI digested vector pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (Addgene: Plasmid #42230) using T4 ligase (New England Biolabs: M0202L) . sgRNA was expressed from a U6 promoter. SpCas9 was expressed from a CMV promoter. The resulting plasmids were isolated using commercial endotoxin-free plasmid prep kit (Omega BioTek, Endo-Free Plasmid Mini Kit II D6950) and further used for cell transfection.

[0110] Cell transfection

[0111] Human embryonic kidney (HEK) cell line HEK293T were maintained in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) with high glucose (Gibco, Catalog #: 11965118) in 10%FBS (GeminiBio, Catalog #: 900-108) . Human Corneal Epithelial cells-Transformed (HCE-T) was maintained in DMEM / F12 (PM150312) + 15%FBS(164210-50) + 5 μg / ml Insulin (PB180432) + 10 ng / ml human EGF (PCK001) +1%Penicillin / Streptomycin (P / S, PB180120) (HCE-T cell and the culturing media were both purchased from Wuhan Pricella Biotechnology Co., Ltd. ) . All cells were maintained at 37 ℃ and 5%CO2 in a humidified incubator. For HEK293T transfection, cells were seeded around 24 h prior to transfection with 2.5 × 104 cells per well in a 96-well plate and for HCE-T transfection, 2 × 104 cells per well for HCE-T were seeded. In the case of HEK293T cells, to prevent bacterial contamination from plasmid samples 1%P / S (GibcoTM) was added in culturing medium. 200 ng or 300 ng plasmid were then transfected into HEK293T or HCE-T cells using LipofectamineTM 3000 transfection reagent (InvitrogenTM) , respectively, following the manufacture’s recommended protocol. For each cell transfection, plasmid targeting at a TTR target site was used as a positive control. After 72 hours of incubation, the cells were harvest and gDNA was isolated from the cells. The editing efficiency at the target was analyzed via NGS, and the editing efficiency results were shown in FIG. 1A, FIG. 1B, FIG. 2A and FIG. 2B.

[0112] Example 2

[0113] Preparation of ePDV with top 4 sgRNAs

[0114] The sgRNA with top 4 performance spacers (SEQ ID NO: 16, 24, 30 or 44) were chosen; and the corresponding sgRNA encoding sequences were cloned into plasmids for following ePDV production. Lenti-X 293T cells were transfected with several plasmids containing envelope protein encoding sequences (e.g., SEQ ID NO: 305, 310, or 311) , Gagpol encoding sequence (e.g., SEQ ID NO: 306) , and GagCas9 encoding sequences (e.g., SEQ ID NO: 307 or SEQ ID NO: 407) and sgRNA (e.g. SEQ ID NOs: 103-202, and 219-278) encoding sequence using PEI max. After 48 hours of transfection, the culture supernatant containing ePDV was collected, and PEG8000 was added to a final concentration of 10%. The mixture was placed in a 4℃ refrigerator overnight, and then centrifuged at 4000g for 20 minutes. The supernatant was removed and the precipitate was resuspended in a small amount of PBS to obtain a 50-fold concentrated ePDV. The prepared ePDV was aliquoted and stored at -80℃.

[0115] Cell line in vitro testing of ePDV gene editing efficiency

[0116] HCE-T cells were seeded at a density of 10, 000 cells per well in a 96-well plate. After 24 hours of culture, ePDV was added into the culture media and gently mixed by shaking. After an additional 48 hours, the cells were harvested. Genomic DNA was extracted, and the gene editing efficiency was analyzed by NGS (Next Generation Sequencing) . The expected outcome is to screen for a combination of Cas protein + sgRNA that has a high efficiency of TGFBI gene knockout, achieving saturated editing at the corresponding site in HCE-T cells. All top 4 sgRNAs with SpCas9 delivered by ePDV achieved saturated editing efficacy at the TGFBI gene.

[0117] Example 3

[0118] Preparation of ePDV with 21 different sgRNAs

[0119] The 21 sgRNA sequences (SEQ ID NO: 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267 or 268) were chosen; And the encoding sequences were cloned into plasmids for following ePDV production. Lenti-X 293T cells were transfected with several plasmids containing envelope protein encoding sequence (e.g., SEQ ID NO: 305, 310, or 311) ; Gagpol encoding sequence (e.g., SEQ ID NO: 306) ; GagCas9 encoding sequence (e.g., SEQ ID NO: 307 or SEQ ID NO: 407) and sgRNA encoding sequence using PEImax. After 48 hours of transfection, the culture supernatant containing ePDV was collected, and PEG8000 was added to a final concentration of 10%. The mixture was placed in a 4℃ refrigerator overnight, and then centrifuged at 4000g for 20 minutes. The supernatant was removed and the precipitate was resuspended in a small amount of PBS to obtain a 50-fold concentrated ePDV. The prepared ePDV was aliquoted and stored at -80℃.

[0120] Preparation of GEB-101

[0121] HEK293T cells were transfected with plasmids encoding envelope glycoprotein, Gagpol, GagCas9, and sgRNA using PEI. After 48 hours of transfection, the culture supernatant containing ePDVs was collected, and PEG8000 was added to a final concentration of 10%. The mixture was placed in a 4℃ refrigerator overnight, and then centrifuged at 4000g for 20 minutes. The supernatant was removed and the precipitate was resuspended in a small volume of PBS to obtain a 50-fold concentrated ePDVs. For animal study, the PEG precipitated ePDVs were further concentrated up to 1000-fold by ultracentrifugation. The purified ePDVs were aliquoted and stored at -80℃ before use.

[0122] The ePDV candidate described in Example 4, GEB-101-like ePDVs described in Example 7, the delivery vehicles ePDV described in Example 8, the delivery vehicles ePDV described in Example 9, the delivery vehicles ePDV described in Example 10 and the ePDV-delivered SpCas9 RNP complex described in Example 11 are prepared in accordance with a preparation method similar to that of GEB101.

[0123] Cell line in vitro testing of TGFBI gene editing efficiency using different guide RNAs packaged in ePDV

[0124] HEK293T cells were seeded at a density of 1.2 × 104 cells per well in a 96-well plate. After 24 hours of culture, ePDV was added into the culture media with different volume (2 μL or 10 μL) and gently mixed by shaking. After an additional 48 hours, the cells were harvested. Genomic DNA was extracted, and the gene editing efficiency was analyzed by NGS (Next Generation Sequencing) . The expected outcome is to screen for a combination of Cas protein with a sgRNA that has a high efficiency of TGFBI gene knockout, achieving saturated editing at the corresponding site in HEK293T cells. The TGFBI gene editing efficiency result was shown in FIG. 3A.

[0125] HCE-T cells were seeded at a density of 1.2 × 104 cells per well in a 96-well plate. After 24 hours of culture, ePDV was added into the culture media with different volume (2 μL or 10 μL) and gently mixed by shaking. After an additional 48 hours, the cells were harvested. Genomic DNA was extracted, and the gene editing efficiency was analyzed by NGS (Next Generation Sequencing) . The expected outcome is to screen for a combination of Cas protein with a sgRNA that has a high efficiency of TGFBI gene knockout, achieving saturated editing at the corresponding site in HCE-T cells. The TGFBI gene editing efficiency result was shown in FIG. 3B.

[0126] Example 4: Evaluation of Ocular ePDV Administration: Tissue Distribution, Gene-Editing Efficacy, and Safety in Mice and Non-Human Primates

[0127] We further evaluated the distribution and efficacy of ocularly administered ePDVs in mice and non-human primates (NHPs) , while screening the selected ePDV candidate for their efficacy and safety in animal models. The results demonstrated that following ocular injection, ePDVs exhibited robust distribution in targeted ocular tissues of both mice and NHPs, accompanied by exceptional gene-editing outcomes and a high safety profile. FIG. 4A illustrates the gene-editing efficiency in corneal tissues of NHPs at varying dose levels of the selected ePDV candidate, while FIG. 4B presents post-administration observations of the selected ePDV candidate in NHPs, including gene-editing activity in non-corneal tissues and Anti-Cas9 antibody levels. These data collectively highlight the superior efficacy and favorable safety of ePDV.

[0128] Necessary examinations and tests (such as ophthalmic examinations, systemic evaluations, and central laboratory tests) , visit evaluation process, and statistical analysis were conducted to assess efficacy, safety, and other relevant parameters.

[0129] Example 5: In Vitro On-target Editing Efficiency of GEB-101

[0130] High in vitro on-target editing efficiency of GEB-101: The CRISPR-SpCas9 system utilizes a sgRNA and the Streptococcus pyogenes-derived Cas9 (SpCas9) nuclease to form a RNP complex for genome editing. We identified an effective TGFBI-targeting sgRNA (#3719) with high editing (indels) efficiency of over 70%via direct plasmid transfection (FIG. 5A) . This sgRNA was selected for packaging inside ePDVs to form our drug candidate, GEB-101. We then verified the on-target editing efficiency of GEB-101 in HEK293T, a human fetal kidney epithelial-like cell line commonly used in retrovirus production. We observed a dose-dependent and saturated editing efficiency of some 60%when GEB-101 was tested in HEK293T cells (FIG. 5B) .

[0131] Example 6: In Vivo On-target Editing Efficiency of GEB-101 in Non-Human Primate (NHP)

[0132] High in vivo on-target editing efficiency of GEB-101 in cornea of otherwise healthy Macaca fascicularis (crab-eating monkey) : NHPs are phylogenetically close to humans, sharing numerous similarities in physiology, anatomy, immunology, neurology, and at genomic DNA level. These similarities make NHPs excellent models for biomedical research. In the proof-of-concept experiment, crab-eating monkeys were used for GEB-101 testing as the spacer sequence of GEB-101 aligns with the targeting site sequence in both humans and crab-eating monkeys. Two crab-eating monkeys were injected with GEB-101 intrastromally with a lower dose (1.0x1012 particles per eye in 100 μL) in one eye and a higher dose (2.5x1012 particles per eye in 100 μL) in another eye. A single dose is divided into two equal halves, with each half administered separately through two injections. This dosing regimen involves the sequential delivery of the divided dose to ensure controlled and targeted drug distribution within the eye. The monkeys were euthanized on day 7. The target tissue of interest was the corneal stroma, where mutations in the TGFBI gene can result in the deposition of dysfunctional TGFBI protein (TGFBIp) . The corneal stroma is composed predominantly of collagen fibrils, with keratocytes occupying only 3–5%of the stromal volume.

[0133] The corneal epithelium, consisting of 5–6 tightly arranged cell layers, is responsible for maintaining a barrier function. Given that the stroma is the primary site of interest, we removed the corneal epithelium (corneal epithelium curettage) during sampling on day 7 and used corneal stroma for on-target editing efficiency evaluation by next-generation sequencing (NGS) . To evaluate whole tissue-wide editing efficiency, we divided one cornea stroma tissue into 6 slices for indel evaluation separately.

[0134] The results showed that the indel percentages in corneal tissue (excluding epithelium) following local injection with GEB-101 in the monkey ranged from 21.9%to 39.0%in the low dose group and 17.1%to 38.6%in the high dose group (FIG. 6) . The maximum achievable editing efficiency was comparable between the high and low dose groups, inferring the selected doses might have been saturated. In contrast, minimal indels (<5%) were observed in other ocular tissues, including corneal epithelium, conjunctiva, iris, sclera, retina, and retinal pigment epithelium (RPE) -choroid, excepted in iris and sclera in the high dose group showing 6%–8%indels, suggesting possible dosage-dependent effect (FIG. 6) . Generally, we observed that indels in anterior sites were higher than those in posterior sites, consistent with the expectation considering their spatial proximity to the local injection site. These results demonstrated that GEB-101 can efficiently edit the TGFBI gene in the corneal stroma of the NHP. When comparing the high and low dose groups, despite the inherent limitations in precisely sampling NHP tissues (such as potential non-stromal cell inclusion) , we observed that the achieved editing efficiency was notably high, nearly reaching saturation levels within the cornea. Conversely, editing was minimal in other ocular tissues. These findings suggest that GEB-101 hold significant potential for further clinical evaluation as a treatment of stromal TGFBI dystrophies through genome editing.

[0135] Given that both low and high doses of GEB-101 demonstrate equivalent editing efficacy in the corneas of primates, it is hypothesized that the lower dose has likely achieved saturation in editing. To further explore the relationship between dosage and editing efficiency, a follow-up experiment was conducted using approximately one-third of the initial low dose (3.7 x 1011 particles / eye) on a different NHP. Intrastromal injections of two distinct production batches of GEB-101 were administered into each eye for comparison.

[0136] Results indicated that the indel rate for batch #1 ranged from 11%to 25.67%, while batch #2 ranged from 0.24%to 51.47%in corneal tissue. Despite the noticeable fluctuation in indel rates, the average rates across the six corneal samples indicated similar editing efficiencies between the two production batches, with averages of 21.15%for batch #1 and 17.72%for batch #2. Furthermore, the average editing efficiency in the cornea has decreased by roughly one-third compared with the aforementioned NHP experiment (FIG. 7) , indicating a typical dosage response effect. The NHP experiments underscored remarkable reproducibility and resilience while demonstrating a potential dose-dependent response effect.

[0137] Example 7: Follow-Up Investigation on Safety of Delivery Vehicles ePDVs in Rabbits

[0138] Follow-Up (28 days) Investigation on Safety of GEB-101-like ePDVs in Rabbit Corneal Model, and GEB-101-like ePDVs comprise the components of GEB-101 as set forth in Table 6, together with sgRNA-1257 having the sequence of SEQ ID NO: 260, and the two sgRNAs of the GEB-101-like ePDVs do not target the rabbit TGFBI gene: Encouraging results were obtained from our study in rabbits, which involved single corneal intrastromal injections of GEB-101-like ePDVs (identical to GEB-101 except that sgRNA used was not targeting the TGFBI gene) followed by a rigorous 28-day follow-up period across high, medium, and low dose groups, each comprising 2-3 eyes. The experimental protocol commenced on Day 1 with the intrastromal injection of GEB-101-like ePDVs (low dose: 1.15x1011 per eye; medium dose: 3.47x1011 per eye; high dose: 1.04x1012 per eye; all in 100μL) , followed by longitudinal assessments on days 4, 8, 15, 22, and 29 to monitor post-injection pathological changes. To simulate clinical interventions in patients with corneal dystrophies, rabbits underwent epithelial curettage prior to the injection of ePDVs, a procedure that is comparable to those employed in PTK or corneal transplantation surgeries. This is one reason why the cornea exhibits very slight to moderate degrees of damage at early time points.

[0139] The study comprehensively evaluated various corneal parameters, including opacity, edema, scars, and neovascularization. Specifically, with the exception of corneal scars, which did not impair vision, other symptoms such as corneal edema, opacity, and neovascularization were largely resolved within 28 days (Table 8) . Notably, minimal corneal neovascularization was observed in one rabbit from the ePDVs medium dose group at day 29 post-injection, and this was probably attributed to individual animal variability, with high dose animals showing complete resolution of corneal abnormalities on day 29. Control groups, including a buffer and saline group, were established to isolate the specific effects of ePDVs. Corneal observations over the 28-day period underscores the dose-dependent effects of ePDVs on corneal health in rabbits, contributing to our understanding of efficacy and safety of ePDVs, and highlighting the importance of dose optimization for potential clinical applications.

[0140] Table 8. Corneal observations following intrastromal injection of GEB-101-like ePDVs in Rabbits. Abbreviations: CO, corneal opacity; CE, corneal edema; CS, corneal scar; CN, corneal neovascularization. Symbols on degree:  / , none; ±, very slight; +, slight; ++, mild; +++, moderate. Dosage: low dose (1.15 x 1011 particles / eye) ; medium dose (3.47 x 1011 particles / eye) ; high dose (1.04 x 1012 particles / eye)

[0141] Example 8: Genome-wide Off-target Profile of SpCas9 delivered by ePDVs Minimal off-target effects of ePDVs compared with plasmids: the gene editing off-target effects of ePDV-delivered SpCas9 RNP complex were compared with those of a plasmid-encoded SpCas9. In targeting TGFBI gene in HEK293T cells, we observed comparable levels of on-target editing efficiencies using the two delivery methods (ePDV 60.20%vs Plasmid 46.27%) , which are near the saturation editing level (FIG. 8A) . To evaluate genome-wide off-target effects, we employed the widely used GUIDE-seq method (Tsai, S., Zheng, Z., Nguyen, N. et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol 33, 187–197 (2015) . ) , the same method used in safety profile assessment of the world’s first approved CRISPR-based medication CASGEVYTM. GUIDE-seq data showed that 3-4 off-target sites were identified in the plasmid delivery method, all located at intergenic or intronic regions of the genome, whereas no detectable off-target sites were found in the ePDV delivery treatment (FIG. 8B) . These results suggest that ePDV-delivered RNP has lower off-target effects compared with plasmid-encoded SpCas9, while achieving even better on-target editing efficiency. Our results are consistent with a previous report showing that a plasmid-encoding SpCas9 showed 0.19%to 11.32%on various numbers of off-target sites for three therapeutically relevant targets, whereas eVLP showed no barely observable off-target effect.

[0142] Furthermore, the identified off-target sites are all located within the intergenic or intronic regions of the genome, suggesting a reduced possibility of causing disturbance to exons and subsequent protein structures. Taken together, both ours and the previous studies demonstrated that delivery of SpCas9 in the RNP format, enabled by ePDV or eVLP, would provide highly specific genome editing with minimal off-target effects, achieving a lower risk of genotoxicity. Further investigations such as, CIRCLE-seq, in silico detection method followed by deep sequencing will be conducted in the future to obtain a comprehensive off-target profile of GEB-101.

Claims

1.A guide RNA (gRNA) comprising:(a) a spacer sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 51-100;(b) a spacer sequence comprising at least 16, 17, 18, 19 or 20 contiguous nucleotides of a sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 51-100; or(c) a spacer sequence with at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, or 90%identity to a sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 51-100.2.The gRNA of claim 1, wherein the gRNA is a dual guide RNA or a single guide RNA (sgRNA) , preferably, the gRNA is a sgRNA.3.The gRNA of claim 2, wherein the sgRNA comprises a sequence that has the pattern of sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 279-290.4.The gRNA of claim 2 or 3, wherein the sgRNA comprises:(a) a sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 103-202, and 219-278;(b) a sequence with at least 90%identity to a sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 103-202 and 219-278; or(c) a sequence with at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, or 90%identity to a sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 103-202, and 219-278.5.The gRNA of any one of claims 1-4, wherein the gRNA is modified, optionally, and the modification is selected from one or any combination of the following: methylation, ethylation, methoxylation, ethoxylation, fluorination of one or more of the nucleotides; or a phosphorothiolate linkage between two or more of the nucleotides; preferably, at least the first three nucleotides of the spacer sequence are modified.6.The gRNA of any one of claims 1-4, wherein none of the nucleotides of the gRNA is modified.7.A polynucleotide comprising a sequence encoding the guide RNA of any one of claims 1-6.8.A CRISPR / Cas system comprising:(a) the guide RNA of any one of claims 1-6 or a polynucleotide comprising a sequence encoding the guide RNA; and(b) an RNA-guided DNA binding agent or a polynucleotide comprising a sequence encoding the RNA-guided DNA binding agent;optionally, the polynucleotide comprising a sequence encoding the guide RNA is DNA or RNA; and / orthe polynucleotide comprising a sequence encoding the RNA-guided DNA binding agent is DNA or RNA.9.The CRISPR / Cas system of claim 8, wherein the RNA-guided DNA binding agent is Cas9 or its variant; preferably, the Cas9 is SpCas9.10.The CRISPR / Cas system of claim 8 or 9, wherein the RNA-guided DNA binding agent has a nuclease activity or a nickase activity.11.The CRISPR / Cas system of claim 8 or 9, wherein the RNA-guided DNA binding agent is a dead Cas protein.12.The CRISPR / Cas system of any one of claims 8-11, wherein the RNA-guided DNA binding agent further comprises a sequence selected from the group consisting of: a nuclear localization signal sequence, a nuclear export signal sequence, a cell-penetrating peptide sequence, an affinity tag sequence, a deaminase sequence, a reverse transcriptase sequence, a recombinase sequence, a methyltransferase sequence, a methylase sequence, an acetylase sequence, an acetyltransferase sequence, a transcriptional activator sequence, a transcriptional repressor domain sequence, a cryptochrome sequence, a light inducible / controllable domain sequence, or a chemically inducible / controllable domain sequence.13.A composition comprising the guide RNA of any one of claims 1-6 or the CRISPR / Cas system of any one of claims 8-12.14.A composition comprising a vector encoding the guide RNA of any one of claims 1-6.15.A composition comprising a vector system comprising a sequence encoding the guide RNA of any one of claims 1-6 and a sequence encoding the RNA-guided DNA binding agent as defined in any one of claims 8-12.16.A pharmaceutical formulation comprising the gRNA of any one of claims 1-6, the polynucleotide of claim 7, the CRISPR / Cas system of any one of claims 8-12, or the composition of any one of claims 13-15; and a pharmaceutically acceptable carrier.17.An engineered protein delivery vehicle (ePDV) comprising(a) a polyprotein comprising a first structural protein;(b) a tropism factor; and(c) the gRNA of any one of claims 1-6.18.The ePDV of claim 17, wherein the polyprotein is a protease-containing polyprotein comprising the first structural protein and a protease.19.The ePDV of claim 17 or 18, wherein the ePDV further comprises: (d) an RNA-guided DNA binding agent, or a polynucleotide comprising a sequence encoding the RNA-guided DNA binding agent.20.The ePDV of claim 19, wherein the RNA-guided DNA binding agent is fused with a second structural protein to form a fusion protein.21.The ePDV of claim 20, wherein the fusion protein further comprises:(a) a cleavable linker; and(b) a nuclear export sequence (NES) .22.The ePDV of claim 19, wherein the RNA-guided DNA binding agent and a second structural protein were previously fused via a cleavable linker located therebetween, thereby forming a fusion protein, and the cleavable linker has subsequently been cleaved by the protease of the protease-containing polyprotein.23.The ePDV of claim 22, wherein the fusion protein further comprises a NES.24.The ePDV of any one of the claims 17-23, wherein the first structural protein comprises a Gag polypeptide, optionally wherein the Gag polypeptide does not comprise a nucleocapsid (NC) domain.25.The ePDV of any one of the claims 20-23, wherein the second structural protein comprises a Gag polypeptide, optionally wherein the Gag polypeptide does not comprise a nucleocapsid (NC) domain.26.The ePDV of any one of claims 19-25, wherein the RNA-guided DNA binding agent is a CRISPR nuclease.27.The ePDV of claim 26, wherein the CRISPR nuclease is a Cas9 protein.28.The ePDV of claim 27, wherein the Cas9 protein is a Cas9, a Cas9 nickase, or a dCas9.29.The ePDV of any one of claims 20-28, wherein the fusion protein comprises two NES, three NES, four NES, five NES, six NES, seven NES, eight NES, nine NES, or ten NES.30.The ePDV of any one of claims 20-29, wherein the fusion protein further comprises a nuclear localization sequence (NLS) .31.The ePDV of any one of claims 20-30, wherein the fusion protein further comprises two NLS, three NLS, four NLS, or five NLS.32.The ePDV of any one of claims 21-31, wherein the cleavable linker is located between the RNA-guided DNA binding agent and the NES.33.The ePDV of any one of claims 21-32, wherein the cleavable linker comprises a protease cleavage site; preferably, the cleavable linker comprises a sequence of SEQ ID NO: 313.34.The ePDV of claim 33, wherein the protease cleavage site is a Moloney murine leukemia virus (MMLV) protease cleavage site or a Friend murine leukemia virus (FMLV) protease cleavage site.35.The ePDV of any one of claims 18-34, wherein the protease-containing protein comprises an MMLV Gag-pro polyprotein or an FMLV Gag-pro polyprotein; preferably, the protease-containing protein comprises a sequence of SEQ ID NO: 312.36.The ePDV of any one of claims 20-35, wherein the fusion protein comprises the structure: [Gag polypeptide] - [2X-5X NES] - [cleavable linker] - [NLS] - [RNA-guided DNA binding agent] - [NLS] ; preferably, the fusion protein comprises the structure: [Gag polypeptide] - [4X NES] - [cleavable linker] - [NLS] - [RNA-guided DNA binding agent] - [NLS] ; optionally, the “] - [” comprises a linker.37.The ePDV of any one of claims 20-36, wherein the fusion protein comprises the structure: [Gag polypeptide] - [2X-5X NES] - [cleavable linker] - [NLS] - [Cas9] - [NLS] ; preferably, the fusion protein comprises the structure: [Gag polypeptide] - [4X NES] - [cleavable linker] - [NLS] - [Cas9] - [NLS] ; optionally the “] - [” comprises a linker; preferably, the fusion protein comprises a sequence selected from SEQ ID NO: 304 or SEQ ID NO: 404.38.The ePDV of any one of claims 24-37, wherein the Gag polypeptide comprises a capsid (CA) polypeptide and / or a matrix (MA) polypeptide.39.The ePDV of any one of claims 24-38, wherein at least one of the Gag polypeptide is selected from the group consisting of: a Moloney murine leukemia virus-derived structural protein, a Bovine immunodeficiency virus-derived structural protein, a Simian immunodeficiency virus-derived structural protein, a Feline immunodeficiency virus-derived structural protein, a Human immunodeficiency virus-derived structural protein, Equine infection anemia virus-derived structural protein, a Caprine arthritis encephalitis virus-derived structural protein, a Baboon endogenous virus-derived structural protein, and an endogenous retrovirus derived structural protein, preferably the endogenous retrovirus derived structural protein is a human endogenous retrovirus (HERV) derived structural protein.40.The ePDV of claim 39, wherein the Gag polypeptide is selected from the group consist of: Moloney murine leukemia virus (MMLV) -derived Gag polypeptide, and HIV-1 derived Gag polypeptide.41.The ePDV of claim 39, wherein the human endogenous retrovirus (HERV) derived structural protein is selected from the group consisting of: PEG10, RTL1, Arc, Asprvl, HERV-Kcon, PNMA1, PNMA3, PNMA4, PNMA5, PNMA6, PNMA7, RTL1, MOAPI, and ZCCHC12.42.The ePDV of any one of claims 17-41, wherein the tropism factor comprises a viral envelope glycoprotein derived from enveloped virus selected from a group consisting of: Vesicular Stomatitis Virus (VSV) , Rabies virus (RABV) , Eastern equine encephalitis virus (EEEV) , Mokola virus (MOKV) , Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) , Hepatitis B virus (HBV) , Chandipura virus (CNV / CHPV) , Baboon endogenous virus (BAEV) , Zika Virus, GP64 and Baculovirus, preferably, the tropism factor comprises a sequence selected from SEQ ID NO: 308 or SEQ ID NO: 301.43.A plurality of polynucleotides comprising: (i) a first polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding the polyprotein as defined in any one of claims 17-42; (ii) a second polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding the fusion protein as defined in any one of claims 20-42; (iii) a third polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding the tropism factor as defined in any one of the claims 17-42, and (iv) a fourth polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding the guide RNA (gRNA) as defined in any one of the claims 1-6.44.One or more vectors comprising the plurality of polynucleotides of claim 43.45.The one or more vectors of claim 44, wherein each of first, second, third, and fourth polynucleotides are on separate vectors.46.The one or more vectors of claim 44, wherein two or more of the first, the second, third, and fourth polynucleotides are on a same vector.47.A cell modified by: a) the gRNA of any one of claims 1-6; b) the polynucleotide of claim 7; c) the CRISPR-Cas system of any one of claims 8-12; d) the composition any one of claims 13-15; e) the pharmaceutical formulation of claim 16; f) the ePDV of any one of claims 17-42; g) the plurality of polynucleotides of claim 43; or h) the one or more vectors of any one of claim 44-46, optionally, the cell is an ocular corneal stromal cell, an ocular corneal epithelial cell, or an ocular corneal posterior fibrous membrane cell.48.A method of making an engineered protein delivery vehicle (ePDV) comprising transfecting the plurality of polynucleotides of claim 43, or the one or more vectors of any one of claims 44-46 into a cell.49.A pharmaceutical composition comprising the ePDV of any one of claims 17-42.50.A method of editing a nucleic acid molecule in a target cell comprising contacting the target cell with the ePDV of any one of claims 17-42, or the pharmaceutical composition of claim 49, thereby installing one or more modifications to the nucleic acid molecule at a target site.51.A kit comprising the ePDV of any one of claims 17-42, or the plurality of polynucleotides of claim 43.52.An engineered protein delivery vehicle (ePDV) produced by transfecting, transducing, electroporating, or otherwise inserting the plurality of polynucleotides of claim 43, or the one or more vectors of any one of claims 44-46, into a cell and expressing one or more components of a virus-like particle from the plurality of polynucleotides or the one or more vectors in the cell, thereby allowing the ePDV to spontaneously assemble in the cell.53.A method for treating, preventing, or diagnosing a disease associated with TGFBI gene locus in a subject, comprising:(a) contacting a target cell with the gRNA of any one of claims 1-6;(b) contacting a target cell with the polynucleotide of claim 7;(c) contacting a target cell with the CRISPR-Cas system of any one of claims 8-12;(d) contacting a target cell with the composition any one of claims 13-15;(e) contacting a target cell with the pharmaceutical formulation of claim 15; (f) contacting a target cell with the ePDV of any one of claims 17-42;(g) contacting a target cell with the plurality of polynucleotides of claim 43; or(h) contacting a target cell with the one or more vectors of any one of claims 44-46.54.The method of claim 53, wherein the diseases is corneal dystrophy.55.A method of modifying TGFBI gene and / or inducing a double-stranded break (DSB) within TGFBI, comprising delivering to a cell:(a) the CRISPR / Cas system of any one of claims 8-12;(b) the composition of any one of claims 13-15;(c) the pharmaceutical formulation of claim 16;(d) the ePDV of any one of claims 17-42;(e) the plurality of polynucleotides of claim 43; or(f) the one or more vectors of any one of claims 44-46.56.A method for treating a corneal dystrophy in a subject in need, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a gene editing agent comprising the group consisting of:(a) the CRISPR / Cas system of any one of claims 8-12;(b) the composition of any one of claims 13-15;(c) the pharmaceutical formulation of claim 16;(d) the ePDV of any one of claims 17-42;(e) the plurality of polynucleotides of claim 43; and(f) the one or more vectors of any one of claims 44-46.57.The method of claim 56, wherein the corneal dystrophy is associated with a mutation in the TGFBI gene.58.The method of claim 57, wherein the mutation is selected from the group consisting of: p. Arg124Cys, p. Arg555Trp, or p. Thr623_Pro628del in the TGFBI gene; preferably, the mutation is p. Arg124Cys in the TGFBI gene.59.The method of any one of claims 56-58, wherein the gene editing agent is administered: (a) by intraocular injection selected from the group consisting of intrastromal injection, intracameral injection, and subconjunctival injection; or (b) by topical ocular administration selected from the group consisting of eye drops, ophthalmic gel, and ocular insert.60.The method of any one of claims 56-59, wherein the gene editing agent is administered by intrastromal injection.

Images