Compositions and methods for increasing protein expression

Abstract

Compositions and methods comprising artificial poly (A) sequences having at least one cytosine and at least one uridine and / or guanosine are provided.

Description

COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING PROTEIN EXPRESSION

[0001] RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims priority to U.S. Provisional Patent Application No. 63 / 513, 354, filed July 13, 2023, the contents of which is hereby incorporated by reference in the entirety for all purposes.BACKGROUND

[0003] Messenger RNA (mRNA) is the key molecule in the flow of genetic information. mRNAs are long nucleotide chains that encode protein information from the genome. They produce all the proteins in the cell, thus are one of the essential biomolecules of life. While mRNAs have been the subject of basic biological research for half a century, only in the past two decades has it been recognized and developed to be a potentially new powerful therapeutic tool. Synthetic mRNA therapeutics, aka mRNA drugs, have several advantages over DNA-and protein-based counterparts. mRNA possesses no risk of genomic integration as it is readily processed in the cytoplasm and does not enter the nucleus. It is also completely degraded by endogenous physiological metabolic pathways, allowing transient effect that is advantageous for pharmaceuticals. Furthermore, mRNA naturally possesses sensory units, allowing it to tune protein production according to biomolecules present in the cell. In 1990, Wolff, et al. demonstrated that injection of engineered mRNA on mice for in vivo expression of the encoded protein. This discovery led many research groups in the 1990s to explore the diverse applications of mRNA for biomedical purposes, such as gene therapy and vaccination. While the results were promising, mRNA therapeutics face concerns in regard to its instability and high immunogenicity. As mRNAs naturally degrades in the biological system, high dose or repeated administration is commonly required. There are artificial sequences and chemically modified nucleotides that can enhance mRNAs performance if placed in UTR and / or ORF sequences. There is a need for compositions and methods that can improve the stability of mRNAs.

[0004] BRIEF SUMMARY

[0005] In one aspect, the disclosure features an artificial poly (A) sequence comprising about a string of about 30-150 consecutive (e.g., about 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, or 150) adenines, wherein at least one adenine is substituted with a cytosine and at least one adenine is substituted with an uridine or  guanosine in the last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end. In some embodiments, at least one adenine is substituted with a cytosine, at least one adenine is substituted with an uridine, and at least one adenine is substituted with a guanosine in the last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end. In some embodiments, the artificial poly (A) sequence comprises between 18 and 149 (e.g., between 18 and 120, between 18 and 110, between 18 and 100, between 18 and 90, between 18 and 80, between 18 and 70, between 18 and 60, between 18 and 50, between 18 and 40, between 18 and 30, between 18 and 20, between 30 and 129, between 40 and 129, between 50 and 129, between 60 and 129, between 70 and 129, between 80 and 129, between 90 and 129, between 100 and 129, between 110 and 129, between 120 and 129, between 130 and 139, between 140 and 149) consecutive adenines, with at least one, possibly more, of which substituted with cytosine, uridine, and / or guanosine. In some embodiments, the last nucleotide of the artificial poly (A) sequence is not a cytosine.

[0006] In some embodiments, up to 40% (e.g., 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30%, 32%, 34%, 36%, 38%, or 40%) of the nucleotides in the artificial poly (A) sequence are cytosines. In some embodiments, up to 25% (e.g., 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, or 24%) of the nucleotides in the artificial poly (A) sequence are cytosines.

[0007] In some embodiments, most of the cytosines (i.e., 90%or more of the cytosines) in the artificial poly (A) sequence are located in the last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end. Further, in some embodiments, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located consecutively.

[0008] In particular embodiments, the artificial poly (A) sequence comprises about 40 adenines and at least one adenine is substituted with a cytosine and at least one adenine is substituted with an uridine or guanosine between the 27th nucleotide and the 39th nucleotide of the artificial poly (A) sequence. In some embodiments, at least one adenine is substituted with a cytosine, at least one adenine is substituted with an uridine, and at least one adenine is substituted with a guanosine between the 27th nucleotide and the 39th nucleotide of the artificial poly (A) sequence. In certain embodiments, the artificial poly (A) sequence comprises between 24 and 39 (e.g., 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, or 39) adenines. In certain embodiments, the artificial poly (A) sequence comprises between 1 and 16 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, or 16) cytosines. In some embodiments, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located between the 25th nucleotide and the  39th nucleotide of the artificial poly (A) sequence. Further, in certain embodiments, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located consecutively. In some embodiments, the last nucleotide of the artificial poly (A) sequence is not a cytosine.

[0009] In particular embodiments, the artificial poly (A) sequence comprises about 60 adenines and at least one adenine is substituted with a cytosine and at least one adenine is substituted with an uridine or guanosine between the 41th nucleotide and the 59th nucleotide of the artificial poly (A) sequence. In some embodiments, at least one adenine is substituted with a cytosine, at least one adenine is substituted with an uridine, and at least one adenine is substituted with a guanosine between the 41th nucleotide and the 59th nucleotide of the artificial poly (A) sequence. In certain embodiments, the artificial poly (A) sequence comprises between 36 and 59 (e.g., 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, or 59) adenines. In certain embodiments, the artificial poly (A) sequence comprises between 1 and 24 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, or 24) cytosines. In some embodiments, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located between the 37th nucleotide and the 59th nucleotide of the artificial poly (A) sequence. Further, in certain embodiments, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located consecutively. In some embodiments, the last nucleotide of the artificial poly (A) sequence is not a cytosine.

[0010] In particular embodiments, the artificial poly (A) sequence comprises about 100 adenines and at least one adenine is substituted with a cytosine and at least one adenine is substituted with an uridine or guanosine between the 67th nucleotide and the 99th nucleotide of the artificial poly (A) sequence. In some embodiments, at least one adenine is substituted with a cytosine, at least one adenine is substituted with an uridine, and at least one adenine is substituted with a guanosine between the 67th nucleotide and the 99th nucleotide of the artificial poly (A) sequence. In certain embodiments, the artificial poly (A) sequence comprises between 60 and 99 (e.g., 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, or 99) adenines. In certain embodiments, the artificial poly (A) sequence comprises between 1 and 40 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, or 40) cytosines. In some embodiments, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located between the 61st nucleotide and the 99th nucleotide of the artificial poly (A) sequence. Further, in some embodiments, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located consecutively. In some embodiments,  the last nucleotide of the artificial poly (A) sequence is not a cytosine. The claimed poly (A) sequence of this invention is able to, when present at the 3’ end of a polypeptide-encoding sequence in an mRNA molecule, improve the stability of the mRNA. Further improvement of stability is achieved synergistically by way of additional modification of the mRNA including 5’cap modification, artificial 5’ and 3’ UTR sequences, and a coding region with an optimized codon, as well as chemical modifications of the mRNA such as the substitution of naturally-occurring nucleotides with non-naturally-occurring nucleotides, e.g., pseudouridine and 5-methyl-cytosine.

[0011] In some embodiments, the artificial poly (A) sequence comprises a sequence of any one of SEQ ID NOS: 2-8 and 10.

[0012] The disclosure also features an expression cassette comprising a promoter and a nucleotide sequence encoding the artificial poly (A) sequence described herein. In some embodiments, the expression cassette further comprises a multiple cloning site between the promoter and the coding sequence for the artificial poly (A) sequence so as to permit insertion of a polynucleotide sequence encoding a protein of interest to be operably linked to the promoter and the sequence encoding the poly (A) sequence. In some embodiments, the  expression cassette further comprises a transcription initiation codon and a transcription termination codon, both operably linked to the promoter and the sequence encoding the artificial poly (A) sequence. In particular embodiments, the expression cassette further comprises a polynucleotide sequence encoding a polypeptide (e.g., the polypeptide can be a therapeutic protein or an antigen (e.g., an antigen from a viral, bacterial, or fungal pathogen) ) between the promoter and the sequence encoding the artificial poly (A) sequence, wherein the polynucleotide sequence is operably linked to the promoter and the sequence encoding the artificial poly (A) sequence. In some embodiments, the polypeptide can be a natural antigen from a cell, or a part thereof, such as OVA MHC class I epitope SIINFEKL (SEQ ID NO: 11) or a part thereof.

[0013] The disclosure also provides an expression vector (e.g., a circularized vector such as a plasmid or a viral vector) comprising the expression cassette described herein.

[0014] In another aspect, the disclosure also provides a host cell comprising the expression cassette or the expression vector described herein.

[0015] In another aspect, the disclosure provides an RNA polynucleotide expressed from the expression cassette described herein as well as an RNA molecule that contains, from 5’ end to 3’ end, a polynucleotide sequence encoding a polypeptide (e.g., the polypeptide can be a therapeutic protein or an antigen (e.g., an antigen from a viral, bacterial, or fungal pathogen) ) and a poly (A) sequence of this invention as described above and herein. In some embodiments, the polypeptide can be a natural antigen from a cell, or a part thereof, such as OVA MHC class I epitope SIINFEKL (SEQ ID NO: 11) or a part thereof.

[0016] In a further aspect, the disclosure provides a method of increasing protein expression of a polypeptide (e.g., the polypeptide can be a therapeutic protein or an antigen (e.g., an antigen from a viral, bacterial, or fungal pathogen) ) inside a cell, comprising transfecting the cell with the expression vector described herein. In some embodiments, the polypeptide can be a natural antigen from a cell, or a part thereof, such as OVA MHC class I epitope SIINFEKL (SEQ ID NO: 11) or a part thereof.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0017] FIG. 1 shows relative EGFP expression from HEK293 cells at 24 hours post-transfection with EGFP mRNAs with different tail sequences. n=3; data are presented as mean ± SD.

[0018] FIG. 2 shows relative EGFP expression from HEK293 cells at 24 hours post-transfection with EGFP mRNAs with different tail sequences and cap analogs. n=3; data are presented as mean ± SD.

[0019] FIG. 3 shows relative EGFP expression from MCF-7 cells at 24 hours post-transfection with EGFP mRNAs with different tail sequences and cap analogs. n=3; data are presented as mean ± SD.

[0020] FIG. 4 shows relative EGFP expression from HEK293 cells at 24 hours post-transfection with EGFP mRNAs with different tail sequences and cap analogs. n=3; data are presented as mean ± SD.DETAILED DESCRIPTION

[0021] I. Introduction

[0022] The inventors have discovered that artificial poly (A) sequences containing adenines and at least one cytosine, when joined to the 3’ end of an RNA sequence, can effectively enhance protein expression from the RNA sequence (see, e.g., Li et al., Mol Ther Nucleic Acids, 2022, 30: 300-310, incorporated herein by reference in its entirety) . These artificial poly (A) sequences can be used for both simple and smart model mRNA drugs, with the effect being cell type independent and delivery reagent independent. As the artificial poly (A) sequences can be simply incorporated into the DNA templates by regular PCR reactions, no additional cost is needed for synthesizing mRNA drugs carrying the artificial poly (A) sequences. The artificial poly (A) sequence can be used with other mRNA technologies including modified nucleotide, modified cap analog. Therefore, these artificial poly (A) sequences can be broadly used on the existing and future mRNA drugs for enhancement of efficacy and for reduction of cost.

[0023] II. Definitions

[0024] As used herein, the term “artificial poly (A) sequence” refers to an RNA polynucleotide containing a string of consecutive adenines, among which at least one is substituted with cytosine. Typically, the last nucleotide in the artificial poly (A) sequence is not cytosine.

[0025] As used herein, the phrase “last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end” refers to the nucleotides located close to the 3’ end of the artificial poly (A) sequence, in which these nucleotides make up one-third of all the nucleotides in the sequence. For example if the artificial poly (A) sequence has 40 nucleotides, the last one-third portion of  the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end refers to the 27th nucleotide to the 40th nucleotide. In another example if the artificial poly (A) sequence has 20 nucleotides, the last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end refers to the 14th nucleotide to the 20th nucleotide.

[0026] As used herein, the term “about” denotes a range of values that is + / -10%of a specified value. For instance, “about 40” denotes the value range of 40 + / -40 x 10%, i.e., 36 to 44.

[0027] As used herein, the term “between” denotes a range of values set within a lower bound and an upper bound, in which the lower bound value and the upper bound value are included. For example, a nucleotide between the 27th nucleotide and the 39th nucleotide, of a polynucleotide containing total 40 nucleotides, can be the 27th, 28th, 29th, 30th, 31st, 32nd, 33rd, 34th, 35th, 36th, 37th, 38th, or 39th nucleotide.

[0028] The term “expression cassette” refers to a nucleic acid construct, generated recombinantly or synthetically, with a series of specified nucleic acid elements that permit transcription of a particular polynucleotide sequence in a host cell. An expression cassette may be a part of a circular construct such as a plasmid, a viral genome or vector, or a longer nucleic acid fragment. Typically, an expression cassette includes a polynucleotide to be transcribed, operably linked to a promoter (e.g., a heterologous promoter) . "Operably linked" in this context means that two or more genetic elements, such as a polynucleotide coding sequence and a promoter, are placed in relative positions that permit the proper biological functioning of the elements, such as the promoter directing transcription of the coding sequence. Other elements (e.g., heterologous elements) that may be present in an expression cassette include those that enhance transcription (e.g., enhancers) and terminate transcription (e.g., terminators) , as well as those that confer certain binding affinity or antigenicity to the recombinant protein produced from the expression cassette.

[0029] The term “multiple cloning site” refers to a short stretch of nucleotide sequence comprising multiple restriction endonuclease recognition sites permitting insertion of another sequence encoding an RNA or protein.

[0030] The term “nucleic acid” refers to deoxyribonucleotides or ribonucleotides and polymers thereof in either single-or double-stranded form, anxd complements thereof. The term encompasses nucleic acids containing known nucleotide analogs or modified backbone residues or linkages, which are synthetic, naturally occurring, and non-naturally occurring,  which have similar binding properties as the reference nucleic acid, and which are metabolized in a manner similar to the reference nucleotides. Examples of such analogs include, without limitation, phosphorothioates, phosphoramidates, methyl phosphonates, chiral-methyl phosphonates, 2-O-methyl ribonucleotides, peptide-nucleic acids (PNAs) .

[0031] Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence also implicitly encompasses conservatively modified variants thereof (e.g., degenerate codon substitutions) and complementary sequences, as well as the sequence explicitly indicated. Specifically, degenerate codon substitutions may be achieved by generating sequences in which the third position of one or more selected (or all) codons is substituted with mixed-base and / or deoxyinosine residues (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991) ; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985) ; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994) ) .

[0032] As used herein, the term “polynucleotide” refers to an oligonucleotide, or nucleotide, and fragments or portions thereof, and to DNA or RNA of genomic or synthetic origin, which may be single-or double-stranded, and represent the sense or anti-sense strand. A single polynucleotide is translated into a single polypeptide.

[0033] As used herein, the terms “peptide” and “polypeptide” are used interchangeably and describe a single polymer in which the monomers are amino acid residues which are joined together through amide bonds. A polypeptide is intended to encompass any amino acid sequence, either naturally occurring, recombinant, or synthetically produced.

[0034] The terms “identical” or percent “identity, ” in the context of two or more nucleic acids or polypeptide sequences, refer to two or more sequences or subsequences that are the same or have a specified percentage of amino acid residues or nucleotides that are the same (i.e., about 60%identity, preferably 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or higher identity over a specified region, when compared and aligned for maximum correspondence over a comparison window or designated region) as measured using a BLAST 2.0 sequence comparison algorithms with default parameters described below, or by manual alignment and visual inspection (see, e.g., NCBI web site ncbi. nlm. nih. gov / BLAST / or the like) . Such sequences are then said to be “substantially identical. ” As described below, the preferred algorithms can account for gaps and the like. Preferably, identity exists over a region that is at least about 25 amino acids or nucleotides in length, or more preferably over a region that is 50-100 or more amino acids or nucleotides in length.

[0035] For sequence comparison, typically one sequence acts as a reference sequence, to which test sequences are compared. When using a sequence comparison algorithm, test and reference sequences are entered into a computer, subsequence coordinates are designated, if necessary, and sequence algorithm program parameters are designated. Preferably, default program parameters can be used, or alternative parameters can be designated. The sequence comparison algorithm then calculates the percent sequence identities for the test sequences relative to the reference sequence, based on the program parameters.

[0036] A “comparison window” , as used herein, includes reference to a segment of any one of the number of contiguous positions selected from the group consisting of from 20 to 600, usually about 50 to about 200, more usually about 100 to about 150 in which a sequence may be compared to a reference sequence of the same number of contiguous positions after the two sequences are optimally aligned. Methods of alignment of sequences for comparison are well-known in the art.

[0037] An algorithm that is suitable for determining percent sequence identity and sequence similarity are the BLAST and BLAST 2.0 algorithms, which are described in Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) and Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) , respectively. BLAST and BLAST 2.0 are used, with the parameters described herein, to determine percent sequence identity for the nucleic acids and proteins of the disclosure. Software for performing BLAST analyses is publicly available through the National Center for Biotechnology Information (http:  / / www. ncbi. nlm. nih. gov / ) . This algorithm involves first identifying high scoring sequence pairs (HSPs) by identifying short words of length W in the query sequence, which either match or satisfy some positive-valued threshold score T when aligned with a word of the same length in a database sequence. T is referred to as the neighborhood word score threshold (Altschul et al., supra) . These initial neighborhood word hits act as seeds for initiating searches to find longer HSPs containing them. The word hits are extended in both directions along each sequence for as far as the cumulative alignment score can be increased. Cumulative scores are calculated using, for nucleotide sequences, the parameters M (reward score for a pair of matching residues; always > 0) and N (penalty score for mismatching residues; always < 0) . For amino acid sequences, a scoring matrix is used to calculate the cumulative score. Extension of the word hits in each direction are halted when: the cumulative alignment score falls off by the quantity X from its maximum achieved value; the cumulative score goes to zero or below, due to the accumulation of one or more negative-scoring residue alignments; or the end of either sequence is reached. The BLAST algorithm  parameters W, T, and X determine the sensitivity and speed of the alignment. The BLASTN program (for nucleotide sequences) uses as defaults a wordlength (W) of 11, an expectation (E) of 10, M=5, N=-4 and a comparison of both strands. For amino acid sequences, the BLASTP program uses as defaults a wordlength of 3, and expectation (E) of 10, and the BLOSUM62 scoring matrix (see Henikoff &Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989) ) alignments (B) of 50, expectation (E) of 10, M=5, N=-4, and a comparison of both strands.

[0038] III. Artificial poly (A) sequence

[0039] The disclosure provides an artificial poly (A) sequence that has at least one cytosine. The artificial poly (A) sequence can contain about 30-130 adenines, in which at least one adenine is substituted with a cytosine and at least one adenine is substituted with an uridine or guanosine in the last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end. In certain embodiments, the artificial poly (A) sequence can contain 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50 adenines, in which at least one adenine is substituted with a cytosine and at least one adenine is substituted with an uridine or guanosine in the last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end (e.g., at least one adenine is substituted with a cytosine, at least one adenine is substituted with an uridine, and at least one adenine is substituted with a guanosine) in the last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end. In other embodiments, two or more adenines in the artificial poly (A) sequence are substituted with cytosines and at least one cytosine is located in the last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end. In other embodiments, two, three, four, or more adenines in the artificial poly (A) sequence are substituted with uridines. In other embodiments, two, three, four, or more adenines in the artificial poly (A) sequence are substituted with guanosines.

[0040] In some embodiments of the artificial poly (A) sequence, up to 40% (e.g., 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30%, 32%, 34%, 36%, 38%, or 40%) of the nucleotides in the artificial poly (A) sequence are cytosines. In some embodiments of the artificial poly (A) sequence, from 60%to 98% (e.g., 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, or 98%) of the nucleotides in the artificial poly (A) sequence are adenines. In some embodiments, the artificial poly (A) sequence can contain between 18 and 129 (e.g., between 18 and 120, between 18 and 110, between 18 and 100, between 18 and 90, between 18 and 80, between 18 and 70, between 18 and 60, between 18 and 50, between 18 and 40, between 18 and 30, between 18  and 20, between 30 and 129, between 40 and 129, between 50 and 129, between 60 and 129, between 70 and 129, between 80 and 129, between 90 and 129, between 100 and 129, between 110 and 129, between 120 and 129) adenines. In some embodiments, the artificial poly (A) sequence can contain between 1 and 20 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20) cytosines. In some embodiments of the artificial poly (A) sequences described herein, the last nucleotide of the artificial poly (A) sequence is not a cytosine.

[0041] In certain embodiments of the artificial poly (A) sequences described herein, most of the cytosines (i.e., 90%or more of the cytosines) in the artificial poly (A) sequence are located in the last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end. The cytosines in the artificial poly (A) sequence can be located consecutively, i.e., in a contiguous chain of cytosines without any adenines in between. In some embodiments, the cytosines in the artificial poly (A) sequence can be located consecutively in the last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end, in which the last nucleotide in the artificial poly (A) sequence is not cytosine. In other embodiments, the cytosines in the artificial poly (A) sequence can be spread out (i.e., adenines may be located between cytosines) throughout the length of the artificial poly (A) sequence. In some embodiments, the cytosines in the artificial poly (A) sequence can be spread out within in the last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end, in which the last nucleotide in the artificial poly (A) sequence is not cytosine.

[0042] In particular, an artificial poly (A) sequence can contain about 40 adenines and at least one adenine is substituted with a cytosine and at least one adenine is substituted with an uridine or guanosine (e.g., at least one adenine is substituted with a cytosine, at least one adenine is substituted with an uridine, and at least adenine is substituted with a guanosine) between the 27th nucleotide and the 39th nucleotide of the artificial poly (A) sequence, in which the last nucleotide of the artificial poly (A) sequence is not a cytosine. In some embodiments of this artificial poly (A) sequence, the sequence can contain between 1 and 16 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, or 16) cytosines. In certain embodiments of this artificial poly (A) sequence, the sequence can contain between 24 and 39 (e.g., 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, or 39) adenines. In certain embodiments of this artificial poly (A) sequence, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located between the 25th nucleotide and the 39th nucleotide (e.g., between the 26th and the 39th nucleotide, between the 27th and the 39th nucleotide, between the 28th and the 39th nucleotide, between the 29th and the 39th nucleotide, between the 30th and the 39th nucleotide, between the 31st and the 39th  nucleotide, between the 32nd and the 39th nucleotide, between the 33rd and the 39th nucleotide, between the 34th and the 39th nucleotide, between the 35th and the 39th nucleotide, between the 36th and the 39th nucleotide, or between the 37th and the 39th nucleotide) of the artificial poly (A) sequence. In certain embodiments, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located consecutively, i.e., in a contiguous chain of cytosines without any adenines in between. In certain embodiments, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located consecutively between the 25th nucleotide and the 39th nucleotide (e.g., between the 26th and the 39th nucleotide, between the 27th and the 39th nucleotide, between the 28th and the 39th nucleotide, between the 29th and the 39th nucleotide, between the 30th and the 39th nucleotide, between the 31st and the 39th nucleotide, between the 32nd and the 39th nucleotide, between the 33rd and the 39th nucleotide, between the 34th and the 39th nucleotide, between the 35th and the 39th nucleotide, between the 36th and the 39th nucleotide, or between the 37th and the 39th nucleotide) of the artificial poly (A) sequence, in which the last nucleotide in the artificial poly (A) sequence is not cytosine.

[0043] In particular, an artificial poly (A) sequence can contain about 60 adenines and at least one adenine is substituted with a cytosine and at least one adenine is substituted with an uridine or guanosine (e.g., at least one adenine is substituted with a cytosine, at least one adenine is substituted with an uridine, and at least one adenine is substituted with a guanosine) between the 41st nucleotide and the 59th nucleotide of the artificial poly (A) sequence, in which the last nucleotide of the artificial poly (A) sequence is not a cytosine. In some embodiments of this artificial poly (A) sequence, the sequence can contain between 1 and 24 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, or 24) cytosines. In certain embodiments of this artificial poly (A) sequence, the sequence can contain between 36 and 59 (e.g., 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, or 59) adenines. In certain embodiments of this artificial poly (A) sequence, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located between the 37th nucleotide and the 59th nucleotide (e.g., between the 38th and the 59th nucleotide, between the 39th and the 59th nucleotide, between the 40th and the 59th nucleotide, between the 41st and the 59th nucleotide, between the 42nd and the 59th nucleotide, between the 43rd and the 59th nucleotide, between the 44th and the 59th nucleotide, between the 45th and the 59th nucleotide, between the 46th and the 59th nucleotide, between the 47th and the 59th nucleotide, between the 48th and the 59th nucleotide, between the 49th and the 59th nucleotide, between the 50th and the 59th nucleotide, between the 51st and the 59th nucleotide, between the 52nd and the 59th nucleotide,  between the 53rd and the 59th nucleotide, between the 54th and the 59th nucleotide, between the 55th and the 59th nucleotide, between the 56th and the 59th nucleotide, or between the 57th and the 59th nucleotide) of the artificial poly (A) sequence. In certain embodiments, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located consecutively, i.e., in a contiguous chain of cytosines without any adenines in between. In certain embodiments, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located consecutively between the 37th nucleotide and the 59th nucleotide (e.g., between the 38th and the 59th nucleotide, between the 39th and the 59th nucleotide, between the 40th and the 59th nucleotide, between the 41st and the 59th nucleotide, between the 42nd and the 59th nucleotide, between the 43rd and the 59th nucleotide, between the 44th and the 59th nucleotide, between the 45th and the 59th nucleotide, between the 46th and the 59th nucleotide, between the 47th and the 59th nucleotide, between the 48th and the 59th nucleotide, between the 49th and the 59th nucleotide, between the 50th and the 59th nucleotide, between the 51st and the 59th nucleotide, between the 52nd and the 59th nucleotide, between the 53rd and the 59th nucleotide, between the 54th and the 59th nucleotide, between the 55th and the 59th nucleotide, between the 56th and the 59th nucleotide, or between the 57th and the 59th nucleotide) of the artificial poly (A) sequence, in which the last nucleotide in the artificial poly (A) sequence is not cytosine.

[0044] In particular, an artificial poly (A) sequence can contain about 100 adenines and at least one adenine is substituted with a cytosine and at least one adenine is substituted with an uridine or guanosine (e.g., at least one adenine is substituted with a cytosine, at least one adenine is substituted with an uridine, and at least one adenine is substituted with a guanosine) between the 67th nucleotide and the 99th nucleotide of the artificial poly (A) sequence, in which the last nucleotide of the artificial poly (A) sequence is not a cytosine. In some embodiments of this artificial poly (A) sequence, the sequence can contain between 1 and 40 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, or 40) cytosines. In certain embodiments of this artificial poly (A) sequence, the sequence can contain between 60 and 99 (e.g., 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, or 99) adenines. In certain embodiments of this artificial poly (A) sequence, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located between the 61st nucleotide and the 99th nucleotide (e.g., between the 62nd and the 99th nucleotide, between the 63rd and the 99th nucleotide, between the 64th and the 99th nucleotide, between the 65st and the 99th nucleotide, between the 66th and the 99th nucleotide, between the 67th and the 99th nucleotide,  between the 68th and the 99th nucleotide, between the 69th and the 99th nucleotide, between the 70th and the 99th nucleotide, between the 71st and the 99th nucleotide, between the 72nd and the 99th nucleotide, between the 73rd and the 99th nucleotide, between the 74th and the 99th nucleotide, between the 75th and the 99th nucleotide, between the 76th and the 99th nucleotide, between the 77th and the 99th nucleotide, between the 78th and the 99th nucleotide, between the 79th and the 99th nucleotide, between the 80th and the 99th nucleotide, between the 81st and the 99th nucleotide, between the 82nd and the 99th nucleotide, between the 83rd and the 99th nucleotide, between the 84th and the 99th nucleotide, between the 85th and the 99th nucleotide, between the 86th and the 99th nucleotide, between the 87th and the 99th nucleotide, between the 88th and the 99th nucleotide, between the 89th and the 99th nucleotide, between the 90th and the 99th nucleotide, between the 91st and the 99th nucleotide, between the 92nd and the 99th nucleotide, between the 93rd and the 99th nucleotide, between the 94th and the 99th nucleotide, between the 95th and the 99th nucleotide, between the 96th and the 99th nucleotide, or between the 97th and the 99th nucleotide) of the artificial poly (A) sequence. In certain embodiments, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located consecutively, i.e., in a contiguous chain of cytosines without any adenines in between. In certain embodiments, all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located consecutively between the 61st nucleotide and the 99th nucleotide (e.g., between the 62nd and the 99th nucleotide, between the 63rd and the 99th nucleotide, between the 64th and the 99th nucleotide, between the 65st and the 99th nucleotide, between the 66th and the 99th nucleotide, between the 67th and the 99th nucleotide, between the 68th and the 99th nucleotide, between the 69th and the 99th nucleotide, between the 70th and the 99th nucleotide, between the 71st and the 99th nucleotide, between the 72nd and the 99th nucleotide, between the 73rd and the 99th nucleotide, between the 74th and the 99th nucleotide, between the 75th and the 99th nucleotide, between the 76th and the 99th nucleotide, between the 77th and the 99th nucleotide, between the 78th and the 99th nucleotide, between the 79th and the 99th nucleotide, between the 80th and the 99th nucleotide, between the 81st and the 99th nucleotide, between the 82nd and the 99th nucleotide, between the 83rd and the 99th nucleotide, between the 84th and the 99th nucleotide, between the 85th and the 99th nucleotide, between the 86th and the 99th nucleotide, between the 87th and the 99th nucleotide, between the 88th and the 99th nucleotide, between the 89th and the 99th nucleotide, between the 90th and the 99th nucleotide, between the 91st and the 99th nucleotide, between the 92nd and the 99th nucleotide, between the 93rd and the 99th nucleotide, between the 94th and the 99th nucleotide, between the 95th and the 99th nucleotide, between the 96th and the 99th nucleotide, or between the 97th and the 99th  nucleotide) of the artificial poly (A) sequence, in which the last nucleotide in the artificial poly (A) sequence is not cytosine.

[0045] In other embodiments of this artificial poly (A) sequence, the cytosines in the artificial poly (A) sequence can be spread out (i.e., adenines may be located between cytosines) throughout the length of the artificial poly (A) sequence. In some embodiments, the cytosines in the artificial poly (A) sequence can be spread out between the 25th nucleotide and the 39th nucleotide (e.g., between the 26th and the 39th nucleotide, between the 27th and the 39th nucleotide, between the 28th and the 39th nucleotide, between the 29th and the 39th nucleotide, between the 30th and the 39th nucleotide, between the 31st and the 39th nucleotide, between the 32nd and the 39th nucleotide, between the 33rd and the 39th nucleotide, between the 34th and the 39th nucleotide, between the 35th and the 39th nucleotide, between the 36th and the 39th nucleotide, or between the 37th and the 39th nucleotide) of the artificial poly (A) sequence, in which the last nucleotide in the artificial poly (A) sequence is not cytosine.

[0046] In particular embodiments, the disclosure provides an artificial poly (A) sequence comprising a sequence of any one of SEQ ID NOS: 1-10 as listed in the following table. In some embodiments, the artificial poly (A) sequence comprises a sequence of any one of SEQ ID NOS: 2-8 and 10.

[0047] IV. Expression cassette and vector

[0048] The disclosure also provides expression cassettes comprising a promoter and an artificial poly (A) sequence described herein. Such an expression cassette, especially in the form of a replicable vector (e.g., a DNA plasmid or a viral vector) , is useful tool for the cloning / subcloning and expression of any coding sequence for a protein. Thus, in some cases, the expression cassette can further comprise a polynucleotide sequence encoding a polypeptide (e.g., the polypeptide can be a therapeutic protein or an antigen (e.g., an antigen from a viral, bacterial, or fungal pathogen) ) between the promoter and the artificial poly (A) sequence, wherein the polynucleotide sequence is operably linked to the promoter and the artificial poly (A) sequence. In some embodiments, the polypeptide can be a natural antigen from a cell, or a part thereof, such as OVA MHC class I epitope SIINFEKL (SEQ ID NO: 11) or a part thereof. In some embodiments, the expression cassette can further comprise a multiple cloning site between the promoter and the artificial poly (A) sequence. Moreover, the expression cassette can further comprise a transcription initiation codon and a transcription termination codon, both of which can be operably linked to the promoter and the artificial poly (A) sequence. Additional elements such as transcriptional activation or enhancer sequences may be included in the expression cassettes and vectors.

[0049] In some embodiments, the promoter may be homologous or heterologous to the polynucleotide between the promoter and the artificial poly (A) sequence. In some embodiments, the promoter may be inducible. In some embodiments, the promoter may be cell or tissue-specific. In some embodiments, the promoter may be a constitutive promoter. In some embodiments, the expression cassette can be expressed specifically in certain cell and / or tissue types within one or more organs. Alternatively, the expression cassette can be expressed constitutively (e.g., using a constitutive promoter) . Further, an expression cassette can contain a marker gene that confers a selectable phenotype on transfected cells. For example, the marker may encode antibiotic resistance, such as resistance to kanamycin, G418, bleomycin, or hygromycin.

[0050] The disclosure also provides expression vectors comprising the expression cassette. The expression vectors serve as vehicles that can deliver the expression cassettes into the targeted destination, e.g., inside cells. The expression vectors can be transfected into cells. Techniques for transfecting a wide variety of cells are well known and described in the  technical and scientific literature. See, e.g., Kim and Eberwine, Anal Bioanal Chem. 397 (8) : 3173-8, 2020. The disclosure also provides a host cell that comprises the expression cassette or the expression vector described herein. Once transfected into the target cells, the polynucleotide encoding the polypeptide (e.g., the polypeptide can be a therapeutic protein or an antigen (e.g., an antigen from a viral, bacterial, or fungal pathogen) ) and the artificial poly (A) sequence can be transcribed into an RNA polynucleotide. In some embodiments, the polypeptide can be a natural antigen from a cell, or a part thereof, such as OVA MHC class I epitope SIINFEKL (SEQ ID NO: 11) or a part thereof.

[0051] V. Other modifications

[0052] An artificial poly (A) sequence described herein or an RNA polynucleotide containing an artificial poly (A) sequence described herein can contain other modifications to improve its stability.

[0053] To address its issues, modifications of mRNA structural elements have been investigated to improve the stability and translational efficiency. These modifications include 5’cap modification, artificial 5’ and 3’ UTR sequences, and a coding region with an optimized codon. Furthermore, chemical modifications of mRNA molecules, including pseudouridine and 5-methyl-cytosine, have been observed to increase protein translation while reducing immune response.

[0054] Modified nucleobases

[0055] An artificial poly (A) sequence described herein or an RNA polynucleotide containing an artificial poly (A) sequence described herein can contain one or more modified nucleobases. A modified nucleobase (or base) refers to a nucleobase having at least one change that is structurally distinguishable from a naturally-occurring nucleobase (i.e., adenine, guanine, cytosine, thymine, or uracil) . In some embodiments, a modified nucleobase is functionally interchangeable with its naturally-occurring counterpart. Both naturally-occurring and modified nucleobases are capable of hydrogen bonding. Modified nucleobases may help to improve the stability of a polynucleotide, such as increasing its half-life and preventing intracellular degradation and proteolytic cleavage. In some embodiments, an artificial poly (A) sequence described herein or an RNA polynucleotide containing an artificial poly (A) sequence described herein may include at least one modified nucleobase. Examples of modified nucleobases include, but are not limited to, 5-methylcytosine, 5-hydroxymethyl cytosine, xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, 6-methyladenine, 6-methylguanine, 2-propyladenine,  2-propylguanine, 2-thiouracil, 2-thiothymine, 2-thiocytosine, 5-halouracil, 5-halocytosine, 5-propynyluracil, 5-propynylcytosine, 6-azouracil, 6-azocytosine, 6-azothymine, 5-uracil (pseudouracil) , 4-thiouracil, 8-haloadenine, 8-aminoadenine, 8-thioladenine, 8-thioalkyladenine, 8-hydroxyladenine, 8-haloguanine, 8-aminoguanine, 8-thiolguanine, 8-thioalkylguanine, 8-hydroxylguanine, 5-halouracil, 5-bromouracil, 5-trifluoromethyluracil, 5-halocytosine, 5-bromocytosine, 5-trifluoromethylcytosine, 7-methylguanine, 7-methyladenine, 2-fluoroadenine, 2-aminoadenine, 8-azaguanine, 8-azaadenine, 7-deazaguanine, 7-deazaadenine, 3-deazaguanine, and 3-deazaadenine.

[0056] Modified sugars

[0057] An artificial poly (A) sequence described herein or an RNA polynucleotide containing an artificial poly (A) sequence described herein can contain one or more modified sugars. A modified sugar refers to a sugar having at least one change that is structurally distinguishable from a naturally-occurring sugar (i.e., ribose in RNA) . Modifications on modified sugars may help to improve the stability of an artificial poly (A) sequence described herein or an RNA polynucleotide containing an artificial poly (A) sequence described herein. In some embodiments, the sugar is a pentofuranosyl sugar. The pentofuranosyl sugar ring of a nucleoside may be modified in various ways including, but not limited to, addition of a substituent group, particularly, at the 2’ position of the ring; bridging two non-geminal ring atoms to form a bicyclic sugar (i.e., a locked sugar) ; and substitution of an atom or group such as –S–, –N (R) –or –C (R1) (R2) for the ring oxygen. Examples of modified sugars include, but are not limited to, substituted sugars, especially 2′–substituted sugars having a 2′–F, 2′–OCH2 (2′–OMe) , or a 2′–O (CH2) 2-OCH3 (2′–O–methoxyethyl or 2′–MOE) substituent group; and bicyclic sugars. A bicyclic sugar refers to a modified pentofuranosyl sugar containing two fused rings. For example, a bicyclic sugar may have the 2’ ring carbon of the pentofuranose linked to the 4’ ring carbon by way of one or more carbons (i.e., a methylene) and / or heteroatoms (i.e., sulfur, oxygen, or nitrogen) . The second ring in the sugar limits the flexibility of the sugar ring and thus, constrains the oligonucleotide in a conformation that is favorable for base pairing interactions with its target nucleic acids. An example of a bicyclic sugar is a locked sugar, which is a pentofuranosyl sugar having the 2’ –oxygen linked to the 4’ ring carbon by way of a carbon (i.e., a methylene) or a heteroatom (i.e., sulfur, oxygen, or nitrogen) . In some embodiments, a locked sugar has the 2’ –oxygen linked to the 4’ ring carbon by way of a carbon (i.e., a methylene) . In other words, a locked sugar has a 4′– (CH2) –O–2′ bridge, such  as α–L–methyleneoxy (4′–CH2–O–2′) and β–D–methyleneoxy (4′–CH2–O–2′) . A nucleoside having a lock sugar is referred to as a locked nucleoside.

[0058] Other examples of bicyclic sugars include, but are not limited to, (6′S) –6′ methyl bicyclic sugar, aminooxy (4′–CH2–O–N (R) –2′) bicyclic sugar, oxyamino (4′–CH2–N (R) –O–2′) bicyclic sugar, wherein R is, independently, H, a protecting group or C1-C12 alkyl. The substituent at the 2′ position can also be selected from allyl, amino, azido, thio, O–allyl, O–C1-C10 alkyl, OCF3, O (CH2) 2SCH3, O (CH2) 2–O–N (Rm) (Rn) , and O–CH2–C (=O) –N (Rm) (Rn) , wherein each Rm and Rn is, independently, H or substituted or unsubstituted C1-C10 alkyl.

[0059] In some embodiments, a modified sugar is an unlocked sugar. An unlocked sugar refers to an acyclic sugar that has a 2’, 3’-seco acyclic structure, where the bond between the 2’ carbon and the 3’ carbon in a pentofuranosyl ring is absent.

[0060] Modified internucleoside linkages

[0061] An artificial poly (A) sequence described herein or an RNA polynucleotide containing an artificial poly (A) sequence described herein can contain one or more internucleoside linkages. An internucleoside linkage refers to the backbone linkage that connects the nucleosides. An internucleoside linkage may be a naturally-occurring internucleoside linkage (i.e., a phosphate linkage, also referred to as a 3’ to 5’ phosphodiester linkage, which is found in DNA and RNA) or a modified internucleoside linkage. A modified internucleoside linkage refers to an internucleoside linkage having at least one change that is structurally distinguishable from a naturally-occurring internucleoside linkage. Modified internucleoside linkages may help to improve the stability of an artificial poly (A) sequence described herein or an RNA polynucleotide containing an artificial poly (A) sequence described herein.

[0062] Examples of modified internucleoside linkages include, but are not limited to, a phosphorothioate linkage, a phosphorodithioate linkage, a phosphoramidate linkage, a phosphorodiamidate linkage, a thiophosphoramidate linkage, a thiophosphorodiamidate linkage, a phosphoramidate morpholino linkage, and a thiophosphoramidate morpholino linkage, and a thiophosphorodiamidate morpholino linkage, which are known in the art and described in, e.g., Bennett and Swayze, Annu Rev Pharmacol Toxicol. 50: 259-293, 2010. A phosphorothioate linkage is a 3’ to 5’ phosphodiester linkage that has a sulfur atom for a non-bridging oxygen in the phosphate backbone of an oligonucleotide. A phosphorodithioate linkage is a 3’ to 5’ phosphodiester linkage that has two sulfur atoms for non-bridging oxygens in the phosphate backbone of an oligonucleotide. A thiophosphoramidate linkage refers to a  3’ to 5’ phospho-linkage that has a sulfur atom for a non-bridging oxygen and a NH group as the 3’-bridging oxygen in the phosphate backbone of an oligonucleotide. In some embodiments, an artificial poly (A) sequence described herein or an RNA polynucleotide containing an artificial poly (A) sequence described herein has at least one (e.g., at least two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, or 39) phosphorothioate linkage. In some embodiments, all of the internucleoside linkages in an artificial poly (A) sequence described herein or an RNA polynucleotide containing an artificial poly (A) sequence described herein are phosphorothioate linkages.

[0063] VI. Methods

[0064] The artificial poly (A) sequences described herein can be used in methods of increasing protein expression. The disclosure also provides methods of increasing protein expression of a polypeptide (e.g., the polypeptide can be a therapeutic protein or an antigen (e.g., an antigen from a viral, bacterial, or fungal pathogen) ) inside a cell by transfecting the cell with an expression vector comprising an expression cassette, wherein the expression cassette comprises a promoter operably linked to a polynucleotide sequence encoding the polypeptide and an artificial poly (A) sequence described herein, and wherein the artificial poly (A) sequence is joined to the 3’ end of the polynucleotide sequence. In some embodiments, the polypeptide can be a natural antigen from a cell, or a part thereof, such as OVA MHC class I epitope SIINFEKL (SEQ ID NO: 11) or a part thereof. Once the expression vector is transfected into the cell, the polypeptide (e.g., the polypeptide can be a therapeutic protein or an antigen (e.g., an antigen from a viral, bacterial, or fungal pathogen) ) can be produced from the expression cassette. The RNA polynucleotide comprising the artificial poly (A) sequence is more stable and has longer half-life compared to a corresponding RNA polynucleotide without the artificial poly (A) sequence, which subsequently leads to increased protein expression.

[0065] RNA Delivery

[0066] In addition to transfecting cells with an expression vector containing an expression cassette such that the RNA polynucleotide comprising the artificial poly (A) sequence can be transcribed inside the cell to produce the protein encoded by the expression vector, an RNA polynucleotide can also be delivered directly into the cells. Examples of RNA delivery systems include, but are not limited to, polymers, exosomes, liposomes, and emulsions. In some  embodiments, RNA polynucleotides comprising the artificial poly (A) sequence described herein may be loaded or packaged in liposomes or exosomes that specifically target a cell type, tissue, or organ. For example, exosomes are small membrane-bound vesicles of endocytic origin that are released into the extracellular environment following fusion of multivesicular bodies with the plasma membrane. Exosome production has been described for many immune cells including B cells, T cells, and dendritic cells, Techniques used to load a therapeutic compound (i.e., an RNA polynucleotide comprising the artificial poly (A) sequence) into exosomes are known in the art and described in, e.g., U.S. Patent Publication Nos. US 20130053426 and US 20140348904, and International Patent Publication No. WO 2015002956, which are incorporated herein by reference. In some embodiments, therapeutic compounds may be loaded into exosomes by electroporation or the use of a transfection reagent (i.e., cationic liposomes) . In some embodiments, an exosome-producing cell can be engineered to produce the exosome and load it with the therapeutic compound (i.e., an RNA polynucleotide comprising the artificial poly (A) sequence) . For example, exosomes may be loaded by transforming or transfecting an exosome-producing host cell with a genetic construct that expresses the therapeutic compound (i.e., an RNA polynucleotide comprising the artificial poly (A) sequence) , such that the therapeutic compound is taken up into the exosomes as the exosomes are produced by the host cell.

[0067] Various targeting moieties may be introduced into exosomes, so that the exosomes can be targeted to a selected cell type, tissue, or organ. Targeting moieties may bind to cell-surface receptors or other cell-surface proteins or peptides that are specific to the targeted cell type, tissue, or organ. In some embodiments, exosomes have a targeting moiety expressed on their surface. In some embodiments, the targeting moiety expressed on the surface of exosomes is fused to an exosomal transmembrane protein. Techniques of introducing targeting moieties to exosomes are known in the art and described in, e.g., U.S. Patent Publication Nos. US 20130053426 and US 20140348904, and International Patent Publication No. WO 2015002956, which are incorporated herein by reference.

[0068] EXAMPLES

[0069] Example 1 –Methods

[0070] Table 1 shows the nucleotide sequences of poly (A) tails used in all the samples. All the poly (A) tail sequences were incorporated into the DNA templates encoding for enhanced green fluorescent protein (EGFP) using PCR ( High-Fidelity 2X Master Mix) (NEB) . The  purified PCR products were directly used for in vitro synthesis of mRNAs using MEGAscriptTM T7 Transcription Kit (Invitrogen) . For the comparison between EGFP-40A, EGFP-31A8CA, EGFP-30AG8CA, EGFP-30A4CGCA, EGFP-30A8CGA, EGFP-30AU8CA, EGFP-30A4CUCA, and EGFP-30A8CUA, the mRNAs were synthesized with adenosine triphosphate, cytidine triphosphate, uridine triphosphate, guanosine triphosphate, and Anti Reverse Cap Analog ( “ARCA; ” TriLink BioTechnologies) with a molar ratio at 5: 5: 5: 1: 4. For the comparison between EGFP-40A, EGFP-31A8CA, EGFP-100A, and EGFP-79A20CA, 2 groups of mRNAs were synthesized, including (1) the condition used in the above, and (2) with adenosine triphosphate, cytidine triphosphate, uridine triphosphate, guanosine triphosphate, and m7G (5') ppp (5') G RNA Cap Structure Analog (G cap) (NEB) with a molar ratio at 5: 5: 5: 1: 4. All the cells are cultured and passaged using standard media and standard Trypsin protocol. LipofectamineTM MessengerMaxTM (Thermofisher) was used for all the transfections of mRNAs, following the manufacturer’s protocol. For all transfection, 15 ng of iRFP-encoding mRNA was co-transfected for positively transfected cell selection. The cells were collected 24 hours post-transfection and analyzed by flow cytometry using Attune NxT Flow Cytometer (Invitrogen) .

[0071] Table 1

[0072] Example 2 –Non-adenosine can be inserted into cytidine-containing tail retaining the protein enhancement effect

[0073] Uridine and guanosine were inserted into cytidine containing tail (before, in-between and after cytidine sequence; as shown in Table 1) . HEK293 cells were seeded in a 48-well plate 24 hrs before transfection at 0.5 × 105 cells / well. HEK293 cells were transfected with the EGFP-encoding mRNAs with different tails. 15 ng iRFP-encoding mRNA was co-transfected in all samples for positively transfected cell selection. At 24 hrs post-transfection, cell suspension was collected using standard Trypsin protocol. The EGFP and iRFP protein expression were determined by flow cytometry using Attune NxT Flow Cytometer (Invitrogen) . The EGFP intensities in the iRFP-positive cells were recorded. The readings were compared to that of EGFP-40A. As shown in FIG. 1, we observed the all EGFP with cytidine containing tail regardless of the insertion of non-adenosine enhances protein expression compared to EGFP-40A.

[0074] Example 3 –Cytidine-containing tail can induce a higher protein translational expression for natural capped mRNA than ARCA capped mRNA

[0075] Existing mRNA therapeutics and vaccines employed the anti-reverse cap analog (ARCA) [1] . Two groups of EGFP-40A and EGFP-31A8CA were synthesized (Group 1 carrying natural mRNA cap (G cap) ; Group 2 carrying ARCA cap) . HEK293 cells were seeded in a 48-well plate 24 hrs before transfection at 0.5 × 105 cells / well. HEK293 was transfected with the EGFP-40A and EGFP-31A8CA carrying either G cap or ARCA cap. 15 ng iRFP-encoding mRNA was co-transfected in all samples for positively transfected cell selection. At 24 hrs post-transfection, cell suspension was collected using standard Trypsin protocol. The EGFP and iRFP protein expression were determined by flow cytometry using Attune NxT Flow Cytometer (Invitrogen) . The EGFP intensities in the iRFP-positive cells were recorded. The readings were compared to that of EGFP-40A. As shown in FIG. 2, both the groups transfected with EGFP-31A8CA showed enhancement in protein production compared to the groups transfected with EGFP-40A. Importantly, the EGFP-31A8CA with natural cap showed nearly 2.5-times protein expression compared to that of the EGFP-40A with ARCA cap.

[0076] Example 4 –Cytidine-containing tail can induce a higher protein translational expression for natural capped mRNA than ARCA capped mRNA regardless of cell type

[0077] In addition, the same experiment was repeated on MCF-7 cells. MCF-7 cells were seeded in a 48-well plate 24 hrs before transfection at 0.5 × 105 cells / well. MCF-7 cells were transfected with the EGFP-40A and EGFP-31A8CA carrying either G cap or ARCA cap. 15 ng iRFP-encoding mRNA was co-transfected in all samples for positively transfected cell selection. At 24 hrs post-transfection, cell suspension was collected using standard Trypsin protocol. The EGFP and iRFP protein expression were determined by flow cytometry using Attune NxT Flow Cytometer (Invitrogen) . The EGFP intensities in the iRFP-positive cells were recorded. As shown in FIG. 3, similar results as HEK293 cells were observed, suggesting that the enhancement effect is not dependent on cell type.

[0078] Example 5 –Comparing various tails with 100 nucleotides

[0079] Synthetic mRNAs commonly has a poly (A) tail length of around 100 nucleotides [2-4] . We compared the protein production of EGFP-encoding mRNAs with natural cap and ARCA cap with tail length of 100 nts (carrying either 100A or 79A20CA) . HEK293 cells were seeded in a 48-well plate 24 hrs before transfection at 0.5 × 105 cells / well. HEK293 cells were transfected with the EGFP-100A and EGFP-79A20CA carrying either G cap or ARCA cap. 15 ng iRFP-encoding mRNA was co-transfected in all samples for positively transfected cell selection. At 24 hrs post-transfection, cell suspension was collected using standard Trypsin protocol. The EGFP and iRFP protein expressions were determined by flow cytometry using Attune NxT Flow Cytometer (Invitrogen) . The EGFP intensities in the iRFP-positive cells were recorded. The readings were compared to that of EGFP-40A. As shown in FIG. 4, the EGFP-79A20CA with natural cap achieved about 1.5 times higher EGFP expression compared to ARCA capped EGFP with tail composed of pure adenosine.

[0080] REFERENCES

[0081] [1] STEPINSKI, JANUSZ, et al. “Synthesis and properties of mRNAs containing the novel “anti-reverse” cap analogs 7-methyl (3′-O-methyl) GpppG and 7-methyl (3′-deoxy) GpppG, ” RNA 7.10, 1486-1495, 2001

[0082] [2] Gebre, M.S., Rauch, S., Roth, N. et al., “Optimization of non-coding regions for a non-modified mRNA COVID-19 vaccine, ” Nature 601, 410-414, 2022

[0083] [3] Vogel, A. B., Kanevsky, I., Che, Y. et al., “BNT162b vaccines protect rhesus macaques from SARS-CoV-2, ” Nature 592, 283-289, 2021

[0084] [4] Krawczyk, P.S., Gewartowska, O., Mazur, M., et al., “SARS-COV-2 mrna vaccine is re-adenlyated in vivo, enhancing antigen production and immune response, ” 2022 https:  / / www. biorxiv. org / content / 10.1101 / 2022.12.01.58149v2

[0085] The above examples are provided to illustrate the disclosure but not to limit its scope. Other variants of the disclosure will be readily apparent to one of ordinary skill in the art and are encompassed by the appended claims. All publications, databases, internet sources, patents, patent applications, and accession numbers cited herein are hereby incorporated by reference in their entireties for all purposes.

Claims

1.An artificial poly (A) sequence comprising about 30-150 adenines, wherein at least one adenine is substituted with a cytosine and at least one adenine is substituted with an uridine or guanosine in the last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end.2.The artificial poly (A) sequence of claim 1, wherein at least one adenine is substituted with a cytosine, at least one adenine is substituted with an uridine, and at least one adenine is substituted with a guanosine in the last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end.3.The artificial poly (A) sequence of claim 1 or 2, wherein the artificial poly (A) sequence comprises between 18 and 129 adenines.4.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 1 to 3, wherein the last nucleotide of the artificial poly (A) sequence is not a cytosine.5.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 1 to 4, wherein up to 40%of the nucleotides in the artificial poly (A) sequence are cytosines.6.The artificial poly (A) sequence of claim 5, wherein up to 25%of the nucleotides in the artificial poly (A) sequence are cytosines.7.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 1 to 6, wherein most of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located in the last one-third portion of the artificial poly (A) sequence closest to its 3’ end.8.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 1 to 7, wherein all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located consecutively.9.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 1 to 8, wherein the artificial poly (A) sequence comprises about 40 adenines and at least one adenine is substituted with a cytosine and at least one adenine is substituted with an uridine or guanosine between the 27th nucleotide and the 39th nucleotide of the artificial poly (A) sequence.10.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 1 to 9, wherein the artificial poly (A) sequence comprises about 40 adenines and at least one adenine is substituted with a cytosine, at least one adenine is substituted with an uridine, and at least one adenine is substituted with a guanosine between the 27th nucleotide and the 39th nucleotide of the artificial poly (A) sequence.11.The artificial poly (A) sequence of claim 9 or 10, wherein the artificial poly (A) sequence comprises between 24 and 39 adenines.12.The artificial poly (A) sequence of any one of claim 9 to 11, wherein the artificial poly (A) sequence comprises between 1 and 16 cytosines.13.The artificial poly (A) sequence of any one of claim 9 to 12, wherein all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located between the 25th nucleotide and the 39th nucleotide of the artificial poly (A) sequence.14.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 9 to 13, wherein all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located consecutively.15.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 9 to 14, wherein the last nucleotide of the artificial poly (A) sequence is not a cytosine.16.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 1 to 8, wherein the artificial poly (A) sequence comprises about 60 adenines and at least one adenine is substituted with a cytosine and at least one adenine is substituted with an uridine or guanosine between the 41st nucleotide and the 59th nucleotide of the artificial poly (A) sequence.17.The artificial poly (A) sequence of claim 16, wherein the artificial poly (A) sequence comprises between 36 and 59 adenines.18.The artificial poly (A) sequence of claim 16 or 17, wherein the artificial poly (A) sequence comprises between 1 and 24 cytosines.19.The artificial poly (A) sequence of any one of claim 16 to 18, wherein all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located between the 37th nucleotide and the 59th nucleotide of the artificial poly (A) sequence.20.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 16 to 19, wherein all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located consecutively.21.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 16 to 20, wherein the last nucleotide of the artificial poly (A) sequence is not a cytosine.22.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 1 to 8, wherein the artificial poly (A) sequence comprises about 100 adenines and at least one adenine is substituted with a cytosine and at least one adenine is substituted with an uridine or guanosine between the 67th nucleotide and the 99th nucleotide of the artificial poly (A) sequence.23.The artificial poly (A) sequence of claim 22, wherein the artificial poly (A) sequence comprises between 60 and 99 adenines.24.The artificial poly (A) sequence of claim 22 or 23, wherein the artificial poly (A) sequence comprises between 1 and 40 cytosines.25.The artificial poly (A) sequence of any one of claim 22 to 24, wherein all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located between the 61st nucleotide and the 99th nucleotide of the artificial poly (A) sequence.26.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 22 to 25, wherein all of the cytosines in the artificial poly (A) sequence are located consecutively.27.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 22 to 26, wherein the last nucleotide of the artificial poly (A) sequence is not a cytosine.28.The artificial poly (A) sequence of any one of claims 1 to 27, wherein the artificial poly (A) sequence comprises a sequence of any one of SEQ ID NOS: 2-8 and 10.29.An expression cassette comprising a promoter and a polynucleotide sequence encoding the artificial poly (A) sequence of any one of claims 1 to 27.30.The expression cassette of claim 29, further comprising a multiple cloning site between the promoter and the polynucleotide sequence encoding the artificial poly (A) sequence.31.The expression cassette of claim 29 or 30, further comprising a transcription initiation codon and a transcription termination codon, both operably linked to the promoter and the polynucleotide sequence encoding the artificial poly (A) sequence.32.The expression cassette of any one of claims 29 to 31, further comprising a polynucleotide sequence encoding a polypeptide between the promoter and the artificial poly (A) sequence, wherein the polynucleotide sequence is operably linked to the promoter and the polynucleotide sequence encoding the artificial poly (A) sequence.33.An expression vector comprising the expression cassette of any one of claims 29 to 32.34.A host cell comprising the expression cassette of any one of claims 29 to 32 or the expression vector of claim 33.35.An RNA polynucleotide expressed from the expression cassette of claim 32.36.An RNA molecule comprising a coding sequence for a polypeptide and the artificial poly (A) sequence of any one of claims 1 to 27.37.A method of increasing protein expression of a polypeptide inside a cell, comprising transfecting the cell with the expression vector of claim 33.

Images