Training random forest model using fecal biomarkers for assessing autism spectrum disorder

Abstract

Described herein are systems, methods, and other techniques for training and deploying a random forest model to predict a presence of ASD in a subject. A training dataset can be obtained including abundance measurements of a first cohort of subjects with ASD and a second cohort of subjects without ASD across the set of microbial markers. Multiple candidate random forest models are trained by generating a validation dataset comprising one of k subsets of the training dataset and a training subset comprising the remaining k-1 subsets, training a candidate random forest model of the k candidate random forest models using the training subset, and assessing the candidate random forest model using the validation dataset by computing performance metrics for the candidate random forest model. Candidate random forest models are evaluated by computing an AUC.

Description

TRAINING RANDOM FOREST MODEL USING FECAL BIOMARKERS FOR ASSESSING AUTISM SPECTRUM DISORDERBACKGROUND OF THE INVENTION

[0001] Autism Spectrum Disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder characterized by persistent challenges in social interaction, communication, and restricted and repetitive patterns of behavior, interests, or activities. ASD affects individuals across their lifespan and is typically diagnosed in early childhood. The disorder encompasses a broad range of symptoms and severity levels, leading to the use of the term “spectrum. ”

[0002] ASD has gained significant attention in recent decades due to its increasing prevalence and its impact on individuals, families, and society as a whole. According to the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) , approximately 1 in 36 children in the United States are diagnosed with ASD. This prevalence rate has been rising steadily over the years, although improved diagnostic criteria and increased awareness may contribute to some extent. The exact causes of ASD are still being researched, and it is believed to arise from a combination of genetic, environmental, and developmental factors. ASD affects individuals of all racial, ethnic, and socioeconomic backgrounds, and it is more prevalent in males than females.SUMMARY OF THE INVENTION

[0003] While there have been studies exploring the connections between the gut microbiome and autism spectrum disorder (ASD) , the conventional understanding of the association between the microbiome at the genome level and ASD remains incomplete. For example, questions have remained about the replicability of biomarkers across cohorts and ages. The present description explores the potential of using fecal microbiota signatures to aid ASD diagnosis. In three separate studies, evidence was accumulated to suggest that the gut microbiome is altered in children with ASD.

[0004] In the first study, metagenomic sequencing was performed on fecal samples from 1, 017 well-phenotyped children and generated 6.24 terabytes of sequence data. Integrated analyses showed that 19 archaea, 126 bacteria, 6 fungi, 24 viruses, 909 microbial genes, and 104  microbial pathways were altered in children with ASD compared with neurotypical children. Machine-learning analysis using a single kingdom panel showed an area under the receiving operator curve (AUROC) of 0.61 to 0.85 in differentiating ASD from neurotypical children. Multi-kingdom and microbial functional markers consisting of a panel of 27 markers (2 archaea, 2 fungi, 2 viruses, 8 bacteria, 6 microbial genes and 7 pathways) showed superior diagnostic accuracy with an AUC of 0.88 at a specificity of 89.7%and a sensitivity of 90.5%for the diagnosis of ASD. This model maintained an AUC of 0.81 in two independent validation cohorts at different ages and showed a low false positive rate in two unrelated-disease cohorts.

[0005] The diagnostic value of this 27-marker multi-kingdom panel remain significant (p=9.4e-07) in a public dataset of 195 samples across different populations. Functional analysis showed that accuracy of the model was driven predominantly by the thiamine diphosphate biosynthesis pathway which was less abundant in children with ASD suggesting a relationship between microbial thiamine metabolism and ASD. Collectively, these findings highlight the potential application of multi-kingdom and functional gut microbiota markers as non-invasive diagnostic tools in ASD.

[0006] In the second study, metagenomic sequencing was performed on 598 fecal samples to investigate the potential of microbial taxonomic and metagenome-assembled genome (MAG) markers distinguishing children with ASD from age and gender-matched neurotypical children. A combined microbial taxa and microbial MAG markers showed a better classification performance than either microbial taxa or microbial MAG markers alone for detecting ASD. A machine-learning model comprising 5 bacterial taxa and 44 microbial MAG markers (2 viral MAGs and 42 bacterial MAGs) achieved an AUROC of 0.886 in the discovery cohort and 0.734 in an independent validation cohort. By analogy with an authorized behavioral diagnostic device procedure as well as improving the model efficiency, a trade-off was made to stratify the outputs of the model into high-and median-confidence sections. In the validation cohort, the high-confidence section of the model showed an AUROC of 0.906 at a sensitivity of 85.7%and specificity of 93.4%in distinguishing children with ASD from neurotypical children.

[0007] Furthermore, it was observed that a higher ASD risk score showed a significant positive correlation with the more severe social impairment symptoms measured by the social responsiveness scale (SRS) . The microbiome panel showed a superior classification performance  in children 6 years and younger with an AUROC of 0.845 than older children (> 6 years) , and the model was broadly applicable to subjects across genders, with or without gastrointestinal tract symptoms (constipation and diarrhea) and with or without psychiatric comorbidities (ADHD and anxiety) . This study highlights the potential clinical validity of fecal microbiome to aid in ASD diagnosis.

[0008] In the third study, a total of 1, 627 children (aged 1-13 years, 24.4%female) from five independent cohorts were recruited. Extensive phenotypic data (236 factors) were collected including age, sex, body mass index (BMI) , diet, medication, co-morbidity, concomitant psychiatric disorders, gastrointestinal (GI) symptoms (including stool consistency assessed by Bristol stool form score, BSFS) , family characteristics and technical factors related to sample collection, storage, and processing. All faecal samples were processed using the same standardised protocol to reduce the batch effects caused by technical factors. The findings from the third study were validated in public datasets of 237 faecal metagenomes. Amongst associations of the gut microbiome in children with ASD, 31 faecal microbiome markers were identified that showed good and reproducible diagnostic performance for ASD across different ages and cohorts.

[0009] A summary of the various embodiments of the invention is provided below as a list of examples. As used below, any reference to a series of examples is to be understood as a reference to each of those examples disjunctively (e.g., "Examples 1-4" is to be understood as "Examples 1, 2, 3, or 4" ) .

[0010] Example 1 is a computer-implemented method of training a random forest model to predict a presence of autism spectrum disorder (ASD) in a subject, the method comprising: obtaining a training dataset including: abundance measurements of a first cohort of subjects with ASD across a set of microbial markers (or biological markers) ; and abundance measurements of a second cohort of subjects without ASD across the set of microbial markers (or biological markers) ; dividing the training dataset into k subsets; training k candidate random forest models by, for each of the k subsets: generating a validation dataset comprising one of the k subsets and a training subset comprising a remaining k-1 of the k subsets; training a candidate random forest model of the k candidate random forest models using the training subset; and assessing the candidate random forest model using the validation dataset by computing performance metrics  for the candidate random forest model; evaluating the k candidate random forest models by computing an area under curve (AUC) value for each of the k candidate random forest models; and deploying one of the k candidate random forest models as the trained random forest model based on one of the k candidate random forest models having a maximum AUC value.

[0011] Example 2 is the computer-implemented method of example (s) 1, wherein training the candidate random forest model using the training subset includes: generating n groups of the training subset by sampling, from the training subset (i) subjects from the first and second cohorts of subjects and (ii) microbial markers (or biological markers) from the set of microbial markers (or biological markers) ; and constructing n decision trees using the n groups of the training subset, the n decision trees forming the candidate random forest model.

[0012] Example 3 is the computer-implemented method of example (s) 1-2, wherein the subjects from the first and second cohorts of subjects are sampled with replacement, and wherein the microbial markers from the set of microbial markers are sampled with replacement.

[0013] Example 4 is the computer-implemented method of example (s) 2, wherein the subjects from the first and second cohorts of subjects are randomly sampled, and wherein the microbial markers from the set of microbial markers are randomly sampled.

[0014] Example 5 is the computer-implemented method of example (s) 1-4, wherein the performance metrics include one or more of: a total of false positives, a total of true positives, a total of false negatives, a total of true negatives.

[0015] Example 6 is the computer-implemented method of example (s) 1-5, wherein the k candidate random forest model having a maximum AUC value have a first set of hyperparameters, wherein the computer-implemented method further comprises: training a k second candidate random forest model having a second set of hyperparameters different than the first set of hyperparameters; and evaluating the k second candidate random forest models by computing an AUC value for the k second candidate random forest model; wherein the k candidate random forest models or the k second candidate random forest model is deployed as the trained random forest model based on the k candidate random forest model or the k second candidate random forest model having the maximum AUC value.

[0016] Example 7 is the computer-implemented method of example (s) 6, further comprising: training a k third candidate random forest model having a third set of hyperparameters different than the first set of hyperparameters and the second set of hyperparameters; and evaluating the k third candidate random forest model by computing an AUC value for the k third candidate random forest models; wherein the k candidate random forest model, the k second candidate random forest model, or the k third candidate random forest model is selected as the trained random forest model based on the k candidate random forest models, the k second candidate random forest models, or the k third candidate random forest models having the maximum AUC value.

[0017] Example 8 is the computer-implemented method of example (s) 6, wherein the first set of hyperparameters and the second set of hyperparameters differ in at least one of the following: a quantity of decision trees in respective candidate random forest models; a maximum number of nodes in the decision trees in the respective candidate random forest models; a maximum or a minimum quantity of sampled subjects from the first and second cohorts of subjects used to construct the decision trees in the respective candidate random forest models; or a maximum or a minimum quantity of sampled microbial markers from the set of microbial markers used to construct the decision trees in the respective candidate random forest models.

[0018] Example 9 is the computer-implemented method of example (s) 1-5, wherein the k candidate random forest models have a first set of hyperparameters, wherein the computer-implemented method further comprises: training k second candidate random forest models having a second set of hyperparameters different than the first set of hyperparameters; and evaluating the k second candidate random forest models by computing an AUC value for each of the k second candidate random forest models; wherein one of the k candidate random forest models or one of the k second candidate random forest models is deployed as the trained random forest model based on one of the k candidate random forest models or one of the k second candidate random forest models having the maximum AUC value.

[0019] Example 10 is the computer-implemented method of example (s) 9, wherein the set of hyperparameters corresponding to one of the k candidate random forest models or one of the k second candidate random forest models having the maximum AUC value is used to retrain the  random forest models using the whole reference dataset, and is deployed as the trained random forest model.

[0020] Example 11 is the computer-implemented method of example (s) 9, further comprising: training k third candidate random forest models having a third set of hyperparameters different than the first set of hyperparameters and the second set of hyperparameters; and evaluating the k third candidate random forest models by computing an AUC value for each of the k third candidate random forest models; wherein one of the k candidate random forest models, one of the k second candidate random forest models, or one of the k third candidate random forest models is selected as the trained random forest model based on one of the k candidate random forest models, one of the k second candidate random forest models, or one of the k third candidate random forest models having the maximum AUC value.

[0021] Example 12 is the computer-implemented method of example (s) 9, wherein the first set of hyperparameters and the second set of hyperparameters differ in at least one of the following: a quantity of decision trees in respective candidate random forest models; a maximum number of nodes in the decision trees in the respective candidate random forest models; a maximum or a minimum quantity of sampled subjects from the first and second cohorts of subjects used to construct the decision trees in the respective candidate random forest models; or a maximum or a minimum quantity of sampled microbial markers from the set of microbial markers used to construct the decision trees in the respective candidate random forest models.

[0022] Example 13 is the computer-implemented method of example (s) 1-12, further comprising: comparing the AUC value for each of the k candidate random forest models to identify the maximum AUC value.

[0023] Example 14 is the computer-implemented method of example (s) 1-13, wherein obtaining the training data includes: obtaining a reference dataset; and dividing the reference dataset into the training dataset and a test dataset, wherein the test dataset is used to evaluate the k candidate random forest models.

[0024] Example 15 is the computer-implemented method of example (s) 1-14, wherein the abundance measurements for the first and second cohorts of subjects are relative abundance measurements.

[0025] Example 16 is a method for assessing risk or presence for autism spectrum disorder (ASD) in a subject, the method comprising: (a) generating a classifier algorithm from a reference dataset, wherein the reference dataset is obtained from a cohort of subjects with known classification of ASD and another cohort of subjects without ASD by measuring the relative abundance of one or more microbiome-derived biomarkers selected from Tables 1, 2, 3, and / or 4 in a stool sample for each of the subjects in the cohort; (b) detecting in a stool sample taken from the subject, the relative abundance of one or more microbiome-derived biomarkers selected from Tables 1, 2, 3, and / or 4; (c) comparing the relative abundance (s) of the one or more microbiome-derived biomarkers selected from Tables 1, 2, 3, and / or 4 obtained from (b) with the reference dataset by applying the classification algorithm generated from (a) ; and (d) determining the probability of ASD in the subject and determining the subject as having high risk for ASD if the probability is higher than a determination threshold.

[0026] Example 17 is a method for assessing risk or presence for autism spectrum disorder (ASD) in a subject, the method comprising: (a) generating a classifier algorithm from a reference dataset, wherein the reference dataset is obtained from a cohort of subjects with known classification of ASD and another cohort of subjects without ASD by measuring the relative abundance of all the functional genes detected in the reference dataset in a stool sample for each of the subjects in the cohort, and wherein the average abundance and prevalence are greater than or equal to 0.15%and 5%respectively; (b) detecting in a stool sample taken from the subject, the relative abundances of all the functional genes detected in the reference dataset; (c) comparing the relative abundances of all the functional genes detected in the reference dataset obtained from (b) with the reference dataset by applying the classification algorithm generated from (a) ; and (d) determining the probability of ASD in the subject and determining the subject as having high risk for ASD if the probability is higher than a determination threshold.

[0027] Example 18 is a method for assessing risk or presence for autism spectrum disorder (ASD) in a subject, the method comprising: (a) generating a classifier algorithm from a reference dataset, wherein the reference dataset is obtained from a cohort of subjects with known classification of ASD and another cohort of subjects without ASD by measuring the relative abundance of all the microbial functional pathways detected in the reference dataset in a stool sample for each of the subjects in the cohort, and wherein the average abundance and prevalence  are greater than or equal to 0.15%and 5%respectively; (b) detecting in a stool sample taken from the subject, the relative abundances of all the microbial functional pathways detected in the reference dataset; (c) comparing the relative abundances of all the microbial functional pathways detected in the reference dataset obtained from (b) with the reference dataset by applying the classification algorithm generated from (a) ; and (d) determining the probability of ASD in the subject and determining the subject as having high risk for ASD if the probability is higher than a determination threshold.

[0028] Example 19 is a method for assessing risk or presence for autism spectrum disorder (ASD) in a subject, the method comprising: (a) generating a classifier algorithm from a reference dataset, wherein the reference dataset is obtained from a cohort of subjects with known classification of ASD and another cohort of subjects without ASD by measuring the relative abundances of all the microbial functional pathways, bacteria, functional genes, archaea, fungi and viruses combined detected in the reference dataset in a stool sample for each of the subjects in the cohort, and wherein the average abundance and prevalence are greater than or equal to 0.15%and 5%respectively; (b) detecting in a stool sample taken from the subject, the relative abundances of all the microbial functional pathways, bacteria, functional genes, archaea, fungi and viruses combined detected in the reference dataset; (c) comparing the relative abundances of all the microbial functional pathways, bacteria, functional genes, archaea, fungi and viruses combined detected in the reference dataset obtained from (b) with the reference dataset by applying the classification algorithm generated from (a) ; and (d) determining the probability of ASD in the subject and determining the subject as having high risk for ASD if the probability is higher than a determination threshold.

[0029] Example 20 is the method of any one of example (s) 16-19, wherein the subject is not using probiotics, antidepressants, anti-epileptics and exposed to antibiotics within one month before the test.

[0030] Example 21 is the method of any one of example (s) 16-20, wherein the subject is male.

[0031] Example 22 is the method of any one of example (s) 16-20, wherein the subject is female.

[0032] Example 23 is the method of any one of example (s) 16-20, wherein the cohort of subjects with known classification of ASD and another cohort of subjects without ASD are all male.

[0033] Example 24 is the method of any one of example (s) 16-20, wherein the cohort of subjects with known classification of ASD and another cohort of subjects without ASD are all female.

[0034] Example 25 is the method of any one of example (s) 16-20, wherein the cohort of subjects with known classification of ASD and another cohort of subjects without ASD include male and female subjects.

[0035] Example 26 is a computer-readable medium comprising instructions that, when executed by one or more processors, cause the one or more processors to perform the method of any preceding claim.

[0036] Example 27 is a system comprising: one or more processors; and a computer-readable medium comprising instructions that, when executed by one or more processors, cause the one or more processors to perform the method of any preceding claim.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0037] FIGS. 1A and 1B illustrate example steps for a method of training a random forest classifier to predict a presence of ASD in a subject.

[0038] FIG. 2 illustrates example steps for a method of training a random forest classifier to predict a presence of ASD in a subject.

[0039] FIG. 3 illustrates example steps for a method of applying a trained random forest model to predict a presence of ASD in a subject.

[0040] FIG. 4 illustrates different phases of a study.

[0041] FIG. 5 illustrates a variance in multi-kingdom microbiome composition explained by phenotypes groups in multivariate PERMANOVA analysis.

[0042] FIG. 6 illustrates alpha diversity in multi-kingdom microbiome measured by Shannon index of children with ASD and neurotypical children.

[0043] FIG. 7 illustrates volcano plots that show the associations between multi-kingdom species and ASD calculated by MaAsLin2 after adjusting for significant confounders.

[0044] FIG. 8 illustrates a variance in microbiome function explained by phenotypes groups in multivariate PERMANOVA analysis.

[0045] FIG. 9 illustrates volcano plots that show associations between microbiome functions and ASD calculated by MaAsLin 2 after adjusting for significant confounders.

[0046] FIG. 10 illustrates a schematic diagram of random forest model development.

[0047] FIG. 11 shows a box-and-whisker plot displaying the distribution of AUC scores for evaluations taken on the test dataset, obtained by random forest classification.

[0048] FIG. 12 illustrates a chart showing associations between the top 27 markers with ASD assessed by MaAsLin2.

[0049] FIG. 13 illustrates differential abundances of the 27 markers between ASD and neurotypical children.

[0050] FIG. 14 illustrates p value and mean decrease in accuracy for each of 27 markers using a random forest model.

[0051] FIG. 15 illustrates differences in the relative abundance of 27 markers between ASD and neurotypical children on an independent hospital cohort, evaluated by the two-sided Wilcoxon rank-sum test.

[0052] FIG. 16 illustrates the area under curve of random forest models employing different features in a validation cohort.

[0053] FIG. 17 illustrates the performance metric details of trained random forest models for classifying ASD using different features in the validation cohort.

[0054] FIG. 18 illustrates violin plots comparing the microbial richness, Shannon diversity and Pielou’s evenness at the species level and MAGs level between 2 groups, with statistical significance determined by Welch’s t-test.

[0055] FIG. 19 illustrates a comparison of four different models (random forest classifier, logistic regression, support vector machines, and gradient boosting classifier) for the detection of ASD using gut microbial different levels of taxonomy and microbial MAGs.

[0056] FIG. 20 illustrates a framework for dataset partition, model training and independent validation.

[0057] FIG. 21 illustrates fecal microbiome-based model performance in the discovery cohort for a random forest model using 49 microbial biomarkers (5 microbial taxa and 44 microbial MAG markers) predicting ASD incidents.

[0058] FIG. 22 illustrates a heatmap of correlations between host phenotypes and identified microbial features, with correlations calculated through Spearman’s rank correlation analysis.

[0059] FIG. 23 illustrates fecal microbiome-based model performance in the validation cohort for an optimal random forest model using 49 microbial biomarkers (5 microbial taxa and 44 microbial MAG markers) predicting ASD incidents.

[0060] FIG. 24 illustrates the distribution of the predicted risk score (ASD probability) across all samples in the validation cohort, with the area under the right-side line denoting the ASD probability distribution of children with ASD in the validation cohort and the area under the left-side line denoting the ASD probability distribution of healthy controls.

[0061] FIG. 25 illustrates a heatmap of correlations between microbial biomarkers and different autistic symptom scores, with correlations calculated through Spearman’s rank correlation analysis.

[0062] FIG. 26 illustrates correlations of the single core symptom index and SRS T-score with predicted ASD probability (SRS-T: Total T scores; SRS-RRB: Restricted Interests and Repetitive Behavior; SRS-SCI: Social Communication and Interaction) .

[0063] FIG. 27 illustrates AUROC for the optimal model tested in 4 sub-groups of the validation cohort.

[0064] FIG. 28 illustrates different phases of a study.

[0065] FIG. 29 illustrates a variance in multi-kingdom (archaea, bacteria, fungi, and viruses) microbiome composition explained by phenotypes groups in multivariate PERMANOVA analysis.

[0066] FIG. 30 illustrates alpha diversity in multi-kingdom (archaea, bacteria, fungi and viruses) microbiome measured by Shannon index of children with ASD (n=709) and NT children (n=374) .

[0067] FIG. 31 illustrates volcano plots that show the associations between multi-kingdom (archaea, bacteria, fungi, and viruses) species and ASD calculated by MaAsLin2 after adjusting for significant confounders.

[0068] FIG. 32 illustrates a variance in microbiome function (pathways and genes) explained by phenotypes groups in multivariate PERMANOVA analysis.

[0069] FIG. 33 illustrates volcano plots that show associations between microbiome functions (pathways and KO genes) and ASD calculated by MaAsLin 2 after adjusting for significant confounders.

[0070] FIG. 34 illustrates a schematic diagram of random forest model development.

[0071] FIG. 35 shows a box-and-whisker plot displaying the distribution of AUC scores for evaluations taken on a test dataset, obtained by random forest classification.

[0072] FIG. 36 illustrates a chart showing associations between top 31 markers with ASD assessed by MaAsLin2.

[0073] FIG. 37 illustrates differential abundances and the p value of 31 markers between ASD and neurotypical children.

[0074] FIG. 38 illustrates the mean decrease in accuracy for each of the 31 markers used in a random forest model.

[0075] FIG. 39 illustrates the AUC (95%CI) of random forest models employing different features in a validation cohort.

[0076] FIG. 40 shows performance metric details of a trained random forest models for classifying ASD using different features in a validation cohort.

[0077] FIG. 41 shows associations between ASD and 31 identified faecal microbiome markers across five cohorts.

[0078] FIG. 42 shows the AUC of a model using 31 markers tested in independent ADHD and atopic dermatitis cohorts.

[0079] FIG. 43 illustrates an example computer system comprising various hardware elements.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0080] Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder with unclarified etiology. Emerging evidence suggests a substantial role of gut microbiota in the pathogenesis of ASD through the gut-brain axis and highlights the diagnostic potential of certain bacterial species for early risk prediction. A current risk prediction test using microbiome relied exclusively on the bacteria data. By employing multi-kingdom microbiome data, the disclosed techniques can provide a cost-effective and accurate method to support clinical decision making against ASD, and hence to help improve ASD prevention and management. The present inventors discovered significant associations between ASD and microbial taxa and metagenome-assembled genomes (MAGs) . In some embodiments, associations were found between ASD and multi-kingdom microbial markers including archaea, bacteria, fungi, viruses, and genes, as well as microbial pathways. In this regard, this invention provides a novel approach for determining the presence or risk of ASD in a subject by detecting a set of microbial markers (e.g., including microbial taxa and MAGs) in fecal samples and analyzing them with a random forest model.

[0081] As used herein, the terms “microbial-derived markers” , “microbial biomarkers” , or “microbial markers” refer to the collection of multi-kingdom microbial species (including archaea, bacteria, fungi, and viruses) , functional pathways, functional genes, microbial taxa, and MAGs. The relative abundance of deoxyribonucleic acid (DNA) fragments can be measured for each archaeal, bacterial, fungal, and viral species in a fecal sample of each of the subjects. The relative abundance of functional pathways and functional genes can be inferred from the above relative abundance of DNA fragments, for example through the annotation with Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) orthology (KO) . The term “microbial taxa” refers to operational taxonomic units at various taxonomic rank such as genus, species and strains. A taxon at a higher rank covers all the members belonging to that taxon, for example, the genus  “Lactococcus” refers to all species belonging to the Lactococcus genus. The term “metagenome-assembled genome” refers to partial or complete microbial genomes. MAGs are constructed by first assembling sequencing reads into contigs, which are then binned into MAGS on the basis of nucleotide frequency, abundance and / or co-variation of abundance across a group of samples which represents a group of sequences from genome assembly with similar characteristics.

[0082] As used herein, the term “reference dataset” refers to dataset generated from a cohort of subjects having a clear diagnosis of ASD and another cohort of subjects who have not been diagnosed with ASD and do not show any signs of ASD. It can be generated by measuring the relative abundance for each of the “microbial-derived markers” for each subject in the cohort, followed by the aggregation of such data generated from each subject. In order for a “reference dataset” to be properly established, a sufficient number of individuals (e.g., at least 10, 12, 15, 20, 24, 50, 100 or more individuals) should be included. The diagnosis of subjects in the cohort can be determined by a standard method. For example, a diagnosis can be made according to the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition (DSM-5) by child psychiatrists with post-specialist qualifications.

[0083] As used herein, the term “training dataset” refers to a subset of the “reference dataset” . It includes the known health classifications (ASD or NT) for the subjects and the feature vectors for the subjects, which can be used to train a machine learning model.

[0084] The present invention provides a set of microbial markers useful for determining the presence or assessing risk of ASD in a subject. The set of microbial markers can include (1) all the microbial markers listed in Tables 1, 2, 3, and / or 4, (2) all the functional genes detected in the reference dataset, (3) all the microbial functional pathways detected in the reference dataset, and / or (4) all the microbial functional pathways, bacteria, functional genes, archaea, fungi, and viruses combined as detected in the reference dataset, where the average abundance and prevalence for (2) , (3) , and (4) are greater than or equal to 0.15%and 5%respectively.

[0085] The microbial markers identified in this study as pertinent to ASD can be detected and measured by known methods in stool samples taken from subjects who are assessed for the presence of ASD or their risk for developing ASD. For example, various methods have been reported in the literature for determining the levels of bacterial species in a sample, such as amplification (e.g., by polymerase chain reaction) and sequencing of bacterial polynucleotide  sequence taking advantage of the sequence similarity in the commonly shared 16S rRNA bacterial sequences. Nucleic acid-based analytical methods are generally useful for the detection and quantitative measurement of any gene markers. Moreover, metagenomic next-generation sequencing is a more recently developed technology for rapid determination of the presence and level of microbial species such as Archaea, bacteria, fungi, and viruses in a sample by each species’ unique genomic sequence. For biological pathway markers, analytic methods can be found in the literature as well as described herein for assessing their presence and level, e.g., by analyzing the pertinent metabolites or by-products of such pathways.

[0086] Table 1 below provides an example list of microbial-derived markers (species, genes, and pathways) for determining the presence or risk of ASD in a subject sorted by the level of importance. The microbial-derived markers in Table 1 were identified during the study described in reference to FIGS. 4 to 17 (the “first study” ) .

[0087] Table 1

[0088] Tables 2 and 3 below provide example lists of microbial markers for determining the presence or risk of ASD, where Table 2 provides an example list of microbial taxa and Table 3 provides an example list of microbial genetic sequences. Microbial markers in Tables 2 and 3 are sorted by the level of importance for determining the presence or risk of ASD in a subject. The microbial markers in Tables 2 and 3 were identified during the study described in reference to FIGS. 18 to 27 (the “second study” ) .

[0089] Table 2

[0090] Table 3

[0091] Table 4 below provides an example list of microbial-derived markers (species, genes, and pathways) for determining the presence or risk of ASD in a subject sorted by the level of importance. The microbial-derived markers in Table 4 were identified during the study described in reference to FIGS. 28 to 42 (the “third study” ) .

[0092] Table 4

[0093] Some embodiments provide a method for determining the presence or risk of ASD in a subject that comprises the generation of a trained machine-learning classifier comprising a random forest model. In some embodiments, the subject is a male subject. In some embodiments, the subject is a female subject. In some embodiments, the subject may be male or female. In some embodiments, the subject is a child, under the age of 18 years, for example younger than 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, or 5 years of age, e.g., between 1 to 15 years, 2 to 14 years, 3 to 13 years, 4 to 12 years, 5 to 11 years of age, such as 4 to 10, or 5 to 10, or 6 to 10 years of age. In some embodiments, the subject is of an Asian descent, such as a Chinese descent. In some embodiments, the subject may be of any race or ethnicity.

[0094] A classifier can be a machine learning model that outputs a probability or score that a given entity is in a class. The probability can be a value between 0.0 and 1.0 and a value, called the discrimination cutoff (or threshold) , can be the dividing line between classes. For example, if the discrimination cutoff is 0.6, an entity with a probability between 0.0 and 0.6 can be sorted into a first class (e.g., NT) and if the probability is between 0.6 and 1.0 the entity can be sorted into s second class (e.g., ASD) . In some cases when a higher level of accuracy is needed, an indeterminate category can be introduced by using 2 discrimination cutoffs as the dividing line between classes. The probabilities falling in between the 2 cutoffs are referred to as median-confidence section and represents indeterminate category. The probabilities lower than the lower cutoff and higher than the higher cutoff are referred to as high-confidence sections.

[0095] In one example, if the 2 discrimination cutoffs are 0.389 and 0.670, an entity with a probability between 0.0 to 0.389 can be sorted into a first class (e.g. NT) and if the probability is between 0.670 and 1, the entity can be sorted into a second class (e.g. ASD) . If an entity with a probability between 0.389 and 0.670, the entity can be sorted into the indeterminate class. The optimal cut-off values for cases and controls in the high-confidence section may be determined by the maximized proportion of the true positive / false positive ratio and true negative / false negative ratio, respectively. In some examples, the best cut-off values of the median-confidence section can be determined by ROC analyses that maximizes the Youden index.

[0096] A random forest is a supervised learning approach used in machine learning for classification and regression. It averages the results of many decision trees applied to distinct subsets of a dataset to improve the dataset’s projected accuracy. A nested cross-validation procedure can be applied to calculate within-cohort accuracy by randomly splitting the feature vectors into a training dataset and a test dataset. The training dataset can be randomly divided into k subsets. The subsets can be used to create k folds where k-1 of the subsets are used as training subsets and the remining subset is used as a validation subset. The training subsets can be used to train the model and the validation dataset to evaluate the model’s performance during training. The test dataset, which may not be used to train the model, can be used to evaluate the trained model.

[0097] In some examples, the validation procedure can be a 20-times repeated (or 10-times repeated) , k-fold -stratified cross-validation (balancing class proportions across folds) where k=5. For each of the 5 splits in these examples, a random forest model can be trained on the training subset, which can then be used to predict classifications on the validation dataset. The model’s performance can be evaluated using appropriate performance metrics (e.g., accuracy, precision, recall, area under curve (AUC) , etc. ) . In some examples, after completing all iterations of cross-validation, the performance metrics obtained in each fold can be aggregated. This could be done by calculating the mean, median, or any other appropriate aggregation method. This process can be repeated 20 times (or 10 times) while adjusting the model’s hyperparameters. The cross-validation process is repeated with the adjusted hyperparameters of the model and the performance of different combinations of hyperparameter values is evaluated. This allows the optimal set of hyperparameters that yield the best performance to be identified.

[0098] The candidate random forest models can be evaluated on the test data after this process has been repeated 20 times (or 10 times) . In some examples, the lambda hyperparameter can be selected for each model to maximize the AUC for the receiver operating curve (ROC) under the constraint that the model contains at least five nonzero coefficients. In some examples, the lambda hyperparameter for a model can be varied until the maximum AUC-ROC for that model is found and those hyperparameters are chosen as the lambda hyperparameter.

[0099] In some examples, the training and tuning procedure is stepwise, comprising k-fold cross-validation followed by hyperparameter tuning. For example, in a fivefold-stratified cross-validation (balancing class proportions across folds) where k=5, for each of the 5 splits in this example, a random forest model can be trained on the training subset, which can then be used to predict classifications on the validation dataset. The model’s performance can be evaluated using appropriate performance metrics (e.g., accuracy, precision, recall, AUC, etc. ) . In some examples, after completing all iterations of cross-validation, the fold with best performance metrics (e.g. maximum AUC) is chosen and used to adjust the model’s hyperparameters by evaluating the model’s performance metrics on the test data. The lambda hyperparameter can be selected for each model to maximize the AUC for the receiver operating curve (ROC) under the constraint that the model contains at least five nonzero coefficients. In some examples, the hyperparameter for a model can be varied until the maximum AUC-ROC for that model is found and those hyperparameters are chosen as the lambda hyperparameter.

[0100] In some examples, after the lambda hyperparameter is selected, the candidate random forest models can be evaluated by re-splitting the whole reference dataset into a train-test sample split of 70 / 30%. This process can be repeated 20 times (or 10 times) to obtain 20 (or 10) performance metrics for each candidate random forest models. After completing all iterations of the 20-times (10-times) repeat, the performance metrics obtained in each repeat can be aggregated. This could be done by calculating the mean, median, or any other appropriate aggregation method. This allows the optimal candidate random forest models that yield the best performance to be identified.

[0101] The area under the receiver operating characteristic curve (i.e., the AUC) can be used to compare the performance across models of different methods and features. The AUC is a metric that considers the trade-offs between sensitivity and specificity at all possible thresholds for  comparing the performance across various classifiers. The baseline AUC value can be 0.5 for a random classifier.

[0102] The area under the precision-recall curve (AUPR) can be provided as a complimentary assessment, which considers the trade-offs between precision (or positive predictive value) and recall (or sensitivity) with a baseline that equals the proportion of positive disease cases in all samples. Precision is the fraction of relevant instances among the retrieved instances and the recall is the total proportion of relevant instances that were retrieved. The precision recall curve is a plot of the precision (x-axis) vs recall (y-axis) . An AUPR value of 1.0 indicates high precision and recall while a value of 0.0 indicates low precision and recall.

[0103] FIGS. 1A and 1B illustrate example steps for a method 100 of training a random forest classifier to predict a presence of ASD in a subject. One or more steps of method 100 may be omitted during performance of method 100, and steps of method 100 may be performed in any order and / or in parallel. One or more steps of method 100 may be performed by one or more processors. Method 100 may be implemented as a computer-readable medium or computer program product comprising instructions which, when the program is executed by one or more computers, cause the one or more computers to carry out one or more steps of method 100.

[0104] Step 102 includes obtaining a reference dataset from a first cohort of subjects who are diagnosed with ASD and a second cohort of subjects who are not diagnosed with ASD and do not show any sign of ASD. Step 102 may include steps 104 and 106.

[0105] Step 104 includes identifying a set of microbial markers. The set of microbial markers may include one or more of the microbial-derived markers within Tables 1, 2, 3, and / or 4.

[0106] Step 106 includes, for each individual within the first cohort of subjects and the second cohort of subjects, determining the relative abundance of each of the set of microbial-derived markers identified in step 104.

[0107] Step 108 includes dividing the reference dataset into a training dataset and a test dataset. The training dataset is used to train the models and the performance of the trained models can be assessed with the withheld test dataset.

[0108] Step 110 includes dividing the training dataset into k subsets. The sizes of the k subsets may be equal or may differ from each other. For example, each of the k subsets may include abundance measurements for an approximately equal number of subjects. In some examples, the subjects may be randomly put into each of the k subsets such that each subset may include an approximately equal distribution of subjects who are diagnosed with ASD and subjects that are not diagnosed with ASD.

[0109] Step 112 includes training k candidate random forest models by, for each of the k subsets, generating a validation dataset comprising one of the k subsets and a training subset comprising a remaining k-1 of the k subsets at step 114, training a candidate random forest model of the k candidate random forest models using the training subset at step 116, and assessing the candidate random forest model using the validation dataset by computing performance metrics for the candidate random forest model at step 118.

[0110] In some examples, training the candidate random forest model using the training subset includes generating n groups of the training subset by sampling, from the training subset (i) subjects from the first and second cohorts of subjects and (ii) microbial markers from the set of microbial markers and constructing n decision trees using the n groups of the training subset. The n decision trees can form the candidate random forest model. In some examples, the subjects from the first and second cohorts of subjects are sampled with replacement. In some examples, the microbial markers from the set of microbial markers are sampled with replacement. For example, a first portion of a particular group of the n groups may include abundance measurements of a first subject for a first microbial marker and a second microbial marker, a second portion of the particular group may include abundance measurements of a second subject for the first microbial marker and the second microbial marker, and a third portion of the particular group may again include abundance measurements of the first subject for the first microbial marker and the second microbial marker.

[0111] Each of the n decision trees may be constructed (trained) using the training data from the corresponding group, which includes abundance measurements and ASD indicators (e.g., 0 or 1, NT or ASD, etc. ) indicating whether a subject is diagnosed with ASD. In some examples, the training data may be prepared as a set of feature vectors (abundance measurements) and their corresponding target labels (ASD indicators) . During the training process, a decision tree  algorithm recursively splits the data into subsets based on the abundance measurements for the microbial markers to minimize the impurity or error in each split. This process continues until a stopping criterion is met (e.g., the maximum tree depth is reached, or the number of data points in a leaf node is below a certain threshold, etc. ) .

[0112] Each non-leaf node in a trained decision tree examines an input abundance measurement for a particular microbial marker and causes the decision tree to be further traversed along a first or second path based on whether the input abundance measurement for the particular microbial marker is less than or greater than a threshold associated with the node. Each leaf node in a trained decision tree corresponds to one of the target labels (ASD indicators, i.e., 0 or 1) . Once all the decision trees are trained, the random forest model combines (e.g., aggregates) their predictions to make a final decision. In some examples, all of the predictions are averaged, and the average is compared to a threshold to produce a final output. In some examples, each tree "votes" for the class it predicts (0 or 1) , and the class with the most votes becomes the final prediction.

[0113] In some examples, each of the n groups may correspond to a particular microbial taxa, MAG, biological entity, or kingdom. For example, a first group of the n groups may include abundance measurements of multiple subjects for one or more microbial markers that are microbial taxa, a second group may include transcript-per-million measurements of multiple subjects for one or more microbial markers that are microbial genetic sequences, a third group may include abundance measurements of multiple subjects for one or more microbial markers that are bacteria, a fourth group may include abundance measurements of multiple subjects for one or more microbial markers that are fungi, and a fifth group may include abundance measurements of multiple subjects for one or more microbial markers that are viruses. In accordance with this example, a first decision tree of the n decision trees may be specific to microbial taxa, a second decision tree may be specific to microbial genetic sequences, a third decision tree may be specific to bacteria, a fourth decision tree may be specific to fungi, and a fifth decision tree may be specific to viruses. In another example, a particular group of the n groups may include abundance measurements of multiple subjects for microbial markers of multiple types of biological entities or kingdoms (e.g., taxa, MAGs, bacteria, fungi, viruses, etc. ) ,  and the corresponding decision tree may be constructed using abundance or transcript-per-million measurements of multiple types of biological entities.

[0114] In some examples, the performance metrics include one or more of: a total of false positives, a total of true positives, a total of false negatives, a total of true negatives. For example, after training the candidate random forest model using the training data from the k-1 subsets, the validation data from each subject from the remaining subset is passed into the n decision trees of the candidate random forest model to generate a set of outputs, which are aggregated (e.g., averaged) and compared to a discrimination cutoff to produce a final prediction for each subject. The prediction for each subject is compared to the corresponding ASD indicator, and the prediction is considered to be a true positive (candidate model predicts positive, and is correct) , a true negative (candidate model predicts negative, and is correct) , a false positive (candidate model predicts positive, but is incorrect) , or a false negative (candidate model predicts negative, but is incorrect) .

[0115] Step 120 includes evaluating the k candidate random forest models by computing an AUC value for each of the k candidate random forest models. In some examples, the performance metrics computed in step 118 may be used to plot a ROC curve by varying the discrimination value from 0 to 1 while tracking a total of true positives and a total of false positives at each of the discrimination values. The points representing the true positive rate (on the y-axis) against the false positive rate (on the x-axis) form the ROC curve. Once the ROC curve is generated, the AUC is computed by finding the area under the ROC curve. This is done by numerically integrating the curve using various methods like the trapezoidal rule. In various examples, step 120 may be performed using the validation dataset and / or the test dataset.

[0116] Step 122 includes comparing the AUC value for each of the k candidate random forest models to identify the maximum AUC value. The candidate model (s) having the maximum AUC may be selected.

[0117] Step 124 includes validating the candidate model with the highest AUC using data from the test dataset to obtain the models’ AUC (e.g., the probability that the model can correctly distinguish between a randomly selected correctly classified sample and an incorrectly classified sample) .

[0118] Step 126 includes, if the AUC from step 124 is not satisfactory, adjusting the models by (a) increasing the number of subjects in the training dataset, or (b) changing the hyperparameters of the models. In some examples, one or more hyperparameters (e.g. n_estimators, mtry, ntree, nodesize, maxnodes) can be tuned for each model candidate until the maximum AUC-ROC for that model is found. In one example, the parameter n_estimators may bet set to n_estimators = 2000. The AUC may not be satisfactory if its value is below a performance threshold.

[0119] Step 128 includes repeating steps 102 to 126 until the AUC from step 124 is satisfactory and a final model is obtained. Whether an AUC is acceptable can vary depending on the purpose of practical use. Lower AUC scores may indicate a lower level of confidence and a higher AUC score can indicate a higher level of confidence. An acceptable performance threshold can be an AUC value that is greater than or equal to 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, or 1.0. The final model may include decision trees that use a subset of the set of microbial-derived markers identified in step 104. This subset of microbial-derived markers may collectively be referred to as the biomarker panel. In some instances, step 128 includes identifying the biomarker panel comprising the subset of the set of microbial-derived markers that are used by the decision trees of the final model.

[0120] Step 130 includes calculating an ad hoc discrimination cutoff value of the final model for ASD prediction based on the Youden Index. The Youden index can integrate sensitivity and specificity information and, by using Youden index analysis, one could find that the optimal discrimination cutoff value such as the value providing the best tradeoff between sensitivity and specificity. The Youden index can be calculated with the following formula: Y=sensitivity+specificity-1

[0121] Step 132 includes deploying the final model as the trained random forest model based on one of the k candidate random forest models having a maximum AUC value that exceeds the performance threshold. In some examples, deploying the trained random forest model may include loading the weights associated with the model onto a specialized hardware accelerator or other computer hardware.

[0122] FIG. 2 illustrates example steps for a method of training a random forest classifier to predict a presence of ASD in a subject. The example steps in FIG. 2 may be used in conjunction with method 100. In some examples, when building the model, the different sets of  hyperparameter are not compared to the k-fold validation. Instead, from the k-fold cross validation, the best model is chosen. Then, different sets of hyperparameter are applied in the best model using the whole training set, and the AUC is evaluated in the 30%test dataset.

[0123] FIG. 3 illustrates example steps for a method 300 of applying a trained random forest model to predict a presence of ASD in a subject. Step 302 includes, from the fecal sample of the subject whose presence or risk of ASD is to be determined, determining the relative abundance of the same microbial-derived markers used in the decision trees of the final random forest model (i.e., the biomarker panel) . The markers can include (1) the microbial-derived markers listed in Tables 1, 2, 3, and / or 4; (2) all the functional genes detected in the reference dataset; (3) all the microbial functional pathways detected in the reference dataset; and / or (4) all the microbial functional pathways, bacteria, functional genes, archaea, fungi, and viruses combined as detected in the reference dataset, where the average abundance and prevalence for each of the markers in (2) , (3) , and (4) detected in the reference dataset are greater than or equal to 0.15%and 5%, respectively.

[0124] Step 304 includes comparing the relative abundance of the microbial-derived markers obtained from step 302 from the subject with the thresholds in the decision trees obtained from the final random forest classifier of method 100, where decision trees are generated by random forest training from the reference data, and wherein the relative abundance of each of the microbial-derived markers obtained in step 302 from the subject are run down the decision trees to generate a risk score (or probability) .

[0125] Step 306 includes determining that the subject has an increased risk for ASD when the risk score is greater than the discrimination cutoff value or determining that the subject does not have an increased risk for ASD when the risk score is not greater than the discrimination cutoff value. Alternatively, the risk score can be interpreted as a continuous scale, wherein, the higher the score, the higher the risk that the subject has ASD.

[0126] Various techniques, such as shotgun metagenomic sequencing, can be used to characterize a sample’s microbial taxa, MAGs, microbial species, genes, and functional pathways. In shotgun metagenomic sequencing, DNA is obtained from a heterogenous sample of cells and segmented into DNA fragments that can be aligned with the genomes of multiple  microbial taxa, MAGs, microbial species, genes, and functional pathways to identify the microbial taxa, MAGs, microbial species, genes, and functional pathways in the sample.

[0127] The reference dataset can be an aggregate set of such metagenomics data obtained by sequencing the fecal sample collected from a cohort of subjects who are diagnosed with ASD as well as from another cohort of subjects who are not diagnosed with ASD and do not show any sign of ASD (non-ASD or NT) . In various embodiments, the number of individuals can be 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 50000, 100000, 500000, or 1000000 individuals. In some embodiments, comorbidities such as attention deficit and hyperactivity disorder (ADHD) are employed to stratify the reference dataset into subgroups for training subgroup-specific machine-learning classifiers. In some embodiments, confounding factors such as gastrointestinal (GI) symptoms, diet, and age are employed to pair an equal number of ASD and non-ASD subjects. In various examples, the ASD and non-ASD subjects are all male, all female, or include both male and female subjects. In some embodiments, the ASD and non-ASD subjects are free from mental retardation, neurological disorders, psychosis, depressive disorders or other major medical illness. In some embodiments, ASD and non-ASD subjects are advised to stop taking probiotics, antidepressants, anti-epileptics, and exposure to antibiotics within one month before collection of the fecal sample. In some embodiments, subjects who participated in dietary intervention programs, have special dietary habits (i.e. low-fat diet, metabolic diet, vegetarian diet and allergic to certain foods) are excluded from the reference dataset.

[0128] In some examples, the sequencing data in the metagenomic dataset are generated using the same standardized protocol, e.g., steps including fecal DNA extraction, sequencing, raw data quality filter, host reads decontamination, and microbiome interpretation are standardized. The metagenomics data in the reference dataset can be obtained by (1) prospectively recruiting a cohort of subjects who are diagnosed with ASD and another cohort of subjects who are not diagnosed with ASD and do not show any sign of ASD and sequencing their fecal samples or (2) downloading from one or more public databases, or (3) a combination of (1) and (2) .

[0129] A fecal sample is obtained from a person to be tested. Collection of a stool sample from an individual can be easily achieved either in a clinic or at the individual’s home. An appropriate amount of stool is collected and may be stored according to standard procedures prior to further  preparation. In some embodiments, the fecal samples are frozen at -80C. Alternatively, the fecal samples are frozen with preservatives to enhance the stability of the nucleotides in the fecal samples. The fecal samples can later be used to generate metagenomics data by undergoing steps including fecal DNA extraction, sequencing, raw data quality filtering, host reads decontamination, and microbiome interpretation using the same standardized protocol as that used to generate the reference dataset.

[0130] FIGS. 4 to 17 show results from a first study that explored multi-kingdom analyses of gut archaea, bacteria, fungi, viruses, and their genes and functions. Presented herein are metagenomic analyses of 1, 017 well-phenotyped ASD and neurotypical children, as well as validation of these findings in a public dataset of 195 faecal metagenome. Amongst 1, 188 significant multi-kingdom associations of the gut microbiome in children with ASD, 27 fecal microbiome markers were identified that showed good and reproducible diagnostic performance for ASD across different ages and cohorts.

[0131] In the examples shown in FIGS. 4 to 17, the random forest models were first trained on the randomly selected training dataset (70%, 5-fold cross-validation) and then applied to the withheld test dataset (30%) to access the performance. Then, the hyperparameters (for example, mtry, ntree, nodesize, maxnodes) were tuned based on the model performance in the test dataset to avoid overfitting issues. Finally, with the best combination of hyperparameters, the random split of the cohort was repeated 20 times to obtain a distribution of random forest prediction evaluations on the test dataset, and the mean AUC value was calculated accordingly for visualization of results. The highest ranked and frequently selected microbial features were considered predictive signatures for further interpretation. The prediction performance for each feature was retrieved using the same training datasets. The trained models were then tested in the independent validation cohort to assess their robustness.

[0132] FIGS. 4 to 7 show associations between ASD and multi-kingdom fecal microbiome composition. FIG. 4 illustrates the different phases of the first study, including a discovery phase 402, a machine learning phase 404, a deployment phase 406, and a validation phase 408. The study included 1, 017 children (aged 1-13 years, 84.3%male) from six independent cohorts. Extensive phenotypic data (n=227) were collected including age, gender, body mass index (BMI) , diet, medication, co-morbidity, concomitant psychiatric disorders, GI symptoms (including stool  consistency) , and family characteristics. All fecal samples were processed using the same standardized protocol. A total of 6.24 terabytes (TB) of sequence data was obtained at an average depth of 6.28 gigabases (GB) for each metagenome. In the discovery cohort, metagenomic sequencing was performed on fecal samples from 331 ASD and 116 neurotypical children (ages 5-11, all male) .

[0133] The dataset was processed by Kraken2 and HUMAnN3 and filtered by 15%prevalence. The dataset contains 8, 915 taxa (382 archaea, 8, 145 bacteria, 80 fungi and 308 viruses) at the species level, 499 functional pathways, and 5, 128 KO microbial genes. In an independent hospital cohort, a total of 172 fecal samples were sequenced from 82 ASD and 90 neurotypical children (aged 4-11, all male) and these data were used as external validation. A community cohort with younger children consisting of 84 ASD and 40 neurotypical children (aged 1-8, all male) was included to validate the findings in different age groups. To test the potential gender-related differences of gut microbiome markers in ASD, an independent female cohort of 39 ASD and 39 neurotypical children (aged 4-12, all females) was included. Two additional non-ASD cohorts of children with attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) (n=118) and Atopic dermatitis (n=78) were used to evaluate the specificity of these findings. Furthermore, 195 fecal metagenome (aged 2-13, all males) from previously published studies were also involved into the analysis as external validation.

[0134] As gut microbiota composition is largely shaped by environmental and host factors, the impact of 227 host factors were analyzed, including age, ASD, body mass index (BMI) , comorbidity (n=7) , diet (n=201) , family characteristics (n=5) , GI parameters (n=4) , medication (n=4) , and psychiatric disorders (n=3) on the gut microbiome composition. In the discovery cohort (age 5-11, n=447, all male) , these host factors in combination explained 13.0%, 15.8%, 8.86%and 10.5%of the inter-individual microbiome variation for archaea, bacteria, fungi and viruses, respectively.

[0135] FIG. 5 illustrates a variance in multi-kingdom (archaea, bacteria, fungi, and viruses) microbiome composition explained by phenotypes groups in multivariate PERMANOVA analysis. The presence of GI symptoms and a diagnosis of ASD ranked amongst the top two factors accounting for the largest microbiome composition variation. Amongst all host and dietary factors studied, a total of 26 factors showed a significant impact on all four kingdoms of  gut microbiota composition, and these factors were adjusted in all subsequent association analyses. Next, changes in gut microbiota diversity in ASD and neurotypical children were assessed.

[0136] FIG. 6 illustrates alpha diversity in multi-kingdom (archaea, bacteria, fungi and viruses) microbiome measured by Shannon index of children with ASD (n = 331) and neurotypical (NT) children (n = 116) . A p-value (two-sided test) was calculated by MMUPHin. Data are shown via the interquartile ranges (IQRs) with the median as a horizontal line and the whiskers extending up to the most extreme points within 1.5× the IQR. Outliers are represented as dots. ASD children showed a decrease in Shannon diversity Index of archaea (p=0.0081) , bacteria (p=0.034) and viruses (p=0.0091) compared with neurotypical children. The richness of archaea, bacteria and viruses was also significantly lower in ASD than neurotypical children. There was however no significant difference in diversity (p=0.77) or richness (p=0.45) of the fungi between ASD and neurotypical children.

[0137] FIG. 7 illustrates volcano plots that show the associations between multi-kingdom (archaea, bacteria, fungi, and viruses) species and ASD calculated by MaAsLin2 after adjusting for significant confounders. Associations with an adjusted p value (FDR) less than 0.05 are considered as significant and are marked with solid circles, with associations enriched in ASD found in the upper right quadrant of each plot in FIG. 7 and associations depleted in ASD found in the upper left quadrant of each plot. The top ranked species are labeled with names.

[0138] To identify microbial markers for ASD, associations between multi-kingdom species and ASD were examined. A total of 19 archaeal, 126 bacterial, 6 fungal, and 24 viral species showed differential abundances between ASD and neurotypical children (FDR<0.05) . The relative abundance of 161 out of 175 identified microbial species were found to be significantly decreased in the gut of children with ASD compared with neurotypical children. This finding was most pronounced for the bacteria communities, whereby 122 bacteria species were depleted in the gut of children with ASD whereas only four bacteria species were enriched in ASD. Alterations in bacteria species in children with ASD were driven by the depletion of Weissella confusa, Weissella cibaria, and other short-chain fatty acids-producing bacteria, such as Bacteroides sp. PHL2737, Lawsonibacter asaccharolyticus, Bacteroides faecalis. In addition,  there was an enrichment of several opportunistic pathogens in the gut of children with ASD, such as Pseudomonas sp. BT422 and Stenotrophomonas sp. G4.

[0139] FIGS. 8 and 9 show associations between ASD and fecal microbiome functions. FIG. 8 illustrates a variance in microbiome function (pathways and genes) explained by phenotypes groups in multivariate PERMANOVA analysis. The influence of host phenotype factors on microbial functions based on the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) orthology (KO genes, n=5, 128) and metabolic pathways (n=499) was explored. As shown in FIG. 8, host phenotype factors explained 17.7%and 14.1%of the variation of microbiome functional pathways and KO genes. A diagnosis of ASD ranked as the top factor accounting for 4.1%and 2.8%of the variation for microbiome functional pathways and KO genes, respectively. A total of 20 host and diet factors showed a significant impact on the gut microbiome functions. After adjusting for the above 20 host factors, 909 differential microbial genes were identified: 849 were decreased and 60 were increased in children with ASD compared with neurotypical children.

[0140] FIG. 9 illustrates volcano plots that show the associations between microbiome functions (pathways and KO genes) and ASD calculated by MaAsLin 2 after adjusting for significant confounders. Associations with an adjusted p value (FDR) less than 0.05 were considered as significant and are marked with solid circles, with associations enriched in ASD found in the upper right quadrant of each plot in FIG. 9 and associations depleted in ASD found in the upper left quadrant of each plot. The top ranked pathways are labeled with names.

[0141] At the pathway level, of the 104 differential pathways (FDR<0.05) , 88 pathways showed negative associations and 16 showed positive associations with ASD. Several functional pathways involved in amino acid biosynthesis, especially for L-isoleucine, were found to be enriched in children with ASD compared to neurotypical children, while several pathways of fatty acid metabolism, such as the oleate beta-oxidation pathway and fatty acid salvage pathway, showed negative associations with ASD. It was found that thiamine diphosphate biosynthesis was reduced in children with ASD, compared with neurotypical children. Impairment of thiamine diphosphate synthesis has been associated with ASD and other mental disorders in both animal and human studies. A negative association was observed between ASD and the shunt  pathway of 4-Aminobutyric acid (GABA) . GABA is major inhibitory neurotransmitter of the mammalian central nervous system and has been associated with ASD in previous studies.

[0142] FIGS. 10 to 14 demonstrate how random forest classifiers trained on multi-kingdom microbiome composition and function data can predict the absence of ASD. FIG. 10 illustrates a schematic diagram of random forest model development. A balanced reference dataset 1016 of ASD (n=116) versus NT children (n=116) was constructed from the original discovery cohort (n=447) using a one-by-one paring algorithm accounting for all significant confounders (n=26) . In some examples, reference dataset 1016 includes feature vectors for six components: archaea, bacteria, fungi, viruses, microbial pathways, and KO genes.

[0143] A train-test sample split of 70 / 30%of reference dataset 1016 was performed to produce a training dataset 1018 and a test dataset 1020. Training dataset 1018 was used to train a set of decision trees 1022 that are aggregated to form a random forest model 1024. In the illustrated example, each of decision trees 1022 corresponds to a particular biological entity or kingdom. In various examples, random forest model 1024 can be formed using decision trees 1022 of a single kingdom or biological entity (e.g., only bacteria decision trees) or using decision trees 1022 of multiple kingdoms or biological entities (e.g., bacteria, fungi, and viruses) . After training random forest model 1024, test dataset 1020 was used to estimate the accuracy of random forest model 1024 by computing the AUC for the model. This process of training and testing was repeated 20 times to obtain a distribution of random forest prediction evaluations on test dataset 1020.

[0144] The performance of archaea, fungi, viruses, KO genes, or function pathways has not previously been explored in ASD. To avoid discrimination bias driven by imbalanced sample size and residual confounders, a matched subcohort of children with ASD (n=116) and neurotypical children by one-to-one pairing algorithm was constructed based on the discovery cohort (n=447) . A total of 26 confounders identified above were employed in the pairing algorithm, including age, BMI, BSFS, GI symptoms (n=2) and dietary factors (n=21) . After matching, there was no difference of these 26 confounders between ASD and neurotypical children in the matched subcohort, which was then used for the development of the random forest models.

[0145] FIG. 11 shows a box-and-whisker plot displaying the distribution of AUC scores for evaluations taken on the test dataset, obtained by random forest classification. Differences  between groups were evaluated by the two-sided Wilcoxon rank-sum test. In FIG. 11, asterisks indicate FDR<0.05. Prevalence and relative abundance of the top 27 markers employed by the random forest model in the balanced dataset of ASD (n=116) and neurotypical children (n=116) are also shown.

[0146] The accuracy of the models was tested using a single kingdom marker to distinguish ASD from neurotypical children. Amongst all single-kingdom markers, the microbial pathway model displayed the strongest predictive ability to detect ASD with an average score of an AUC value of 0.85 at a specificity of 81.5%and a sensitivity of 84.9%. The model using bacterial features had the second highest score with an average AUC of 0.81, followed by KO genes (average AUC of 0.79) , archaea (average AUC 0.69) , fungi (average AUC of 0.67) , and viruses-based (average AUC of 0.61) models. Collectively, these findings demonstrate that marker features from different kingdoms provide promising predictive capabilities for ASD diagnosis.

[0147] Since all single-kingdom features displayed diagnostic potential for children with ASD, the performance of models that combine the individual multi-kingdom features was explored. Data was combined from all four kingdoms, including their functions and genes. It found that the combined model showed superior performance (average AUC 0.88) for the diagnosis of ASD at a specificity of 88.6%and sensitivity of 85.8%, compared with models based on single-kingdom features (all adjusted p<0.05) . Furthermore, the accuracy of this model based on the combined multi-kingdom features was 87.1%with a positive prediction value of 96.3%and a negative prediction value of 86.8%. These results confirmed that the multi-kingdom fecal microbiome biomarker panel had higher diagnostic performance for detecting ASD than single-kingdom panel.

[0148] FIG. 12 illustrates a chart showing associations between the top 27 markers with ASD assessed by MaAsLin2. To identify the minimal number of microbiome markers to achieve the highest accuracy, identified markers were included consecutively into the model according to their ranking, and finally, a total of 27 microbial features (2 archaea, 2 fungi, 2 viruses, 8 bacteria, 6 KO genes, and 7 pathways) showed an AUC of 0.88 with a sensitivity of 89.7%, a specificity of 90.5%and an accuracy of 90.1%for the diagnosis of ASD. The prevalence and relative abundance of the markers also differed significantly between children with ASD and neurotypical children.

[0149] FIG. 13 illustrates differential abundances of the 27 markers between ASD and neurotypical children. It can be observed that 19 markers were significantly depleted whereas 8 markers were significantly enriched in the gut of children with ASD (all FDR<0.01) .

[0150] FIG. 14 illustrates the p value and the mean decrease in accuracy for each of the 27 markers used in the random forest model (where *means FDR<0.05, **means FDR<0.01, ***means FDR<0.001) . The importance of these 27 features was re-analyzed in the final ensembled model and it was observed that the accuracy of the model was driven predominantly by the thiamine diphosphate biosynthesis pathway, which support the potential role of thiamine diphosphate in ASD pathogenesis. In addition, the depletion of several bacteria, including Weissella confusa, Lawsonibacter asaccharolyticus, Weissella cibaria and Bacteroides sp. PHL2737, were also some of the top-ranked microbial features contributing to the diagnostic accuracy. It was also found that the palmitoleate biosynthesis I pathway was listed in these top 27 features. Palmitoleate has been previously linked to constipation, thus the enriched biosynthesis pathway of this may also account for the common occurrence of constipation in children with ASD. Collectively, the analysis showed that a 27-fecal microbiome panel marker derived from archaea, bacteria, fungi, viruses, KO genes and microbial functional pathways represents a potentially promising non-invasive tool for the diagnosis of ASD.

[0151] FIGS. 15 to 17 show the validation of the random forest models on an independent hospital cohort. FIG. 15 illustrates differences in the relative abundance of 27 markers between ASD (n=82) and NT children (n=90) in an independent hospital cohort, evaluated by the two-sided Wilcoxon rank-sum test. To externally validate the diagnostic value and to avoid over-optimistic reporting of diagnostic accuracy, the 27-marker panel and the random forest models were tested on an independent hospital cohort (82 ASD and 90 neurotypical boys, aged 4-11) . The relative abundance of the 26 markers remained significantly different between children with ASD and neurotypical children.

[0152] FIG. 16 illustrates the AUC (95%CI) of random forest models employing different features in the validation cohort. It was found that the models maintained an AUC ranging from 0.59 to 0.85.

[0153] FIG. 17 shows the performance metric details of the trained random forest models for classifying ASD using different features in the validation cohort. The sensitivity, specificity and  accuracy were calculated based on the Youden index. The ensembled model using 27 markers (AUC 0.81) ranked first in accuracy at 82.1%, with a sensitivity of 83.8%and a specificity of 80.8%. Furthermore, the models showed an AUC ranging from 0.58 to 0.92 in a younger subset of children in this validation cohort (n=31, 6 years old or younger) , where the ensembled model using 27 markers achieved the highest accuracy. To test whether this panel could be applied to predict the risk of ASD in younger children, the ensembled model was tested using 27 markers in another younger cohort (84 ASD and 40 neurotypical boys, 1-8 years old) , and the model achieved an AUC of 0.81 with a sensitivity of 65.48%and a specificity of 90%after adjusting for imbalanced sample size.

[0154] When reducing the age range to six years or younger (31 Neurotypical children and 72 subjects with ASD) or even four years or younger (18 Neurotypical children and 34 subjects with ASD) , the ensembled model showed promising diagnostic value across ages with an AUC of 0.81 and 0.84, respectively. Next, the associations between these 27 markers were tested with ASD in this younger cohort stratified by age and confirmed that most of these associations were still reproducible. Next, it was investigated whether the 27-marker model would also work well for females. The model was tested in an all-female cohort, and it achieved an AUC of 0.59. Though the diagnostic accuracy dropped in female children, it was found that the difference in the relative abundance of four key markers between children with ASD and neurotypical children remained significant in females, including the thiamine diphosphate biosynthesis pathway, Weissella confuse, Natribaculum Luteum, and Bacteroides phage B40_8. Taken together, these results demonstrated the robustness of the model and the 27-marker panel across age and cohorts.

[0155] In light of shared microbiota alterations across different diseases, it is important to verify the disease specificity for the identified microbial biomarkers panel to ensure a low false positive rate for the diagnosis of ASD. For this purpose, the model was assessed in two non-ASD cohorts in children with attention deficit hyperactivity disorder (ADHD, n=118) or atopic dermatitis (n=78) . ADHD and atopic dermatitis have been previously reported to be associated with alterations in the gut microbiota. AUC values of the marker panel were significantly lower in children with Atopic dermatitis or ADHD (AUC 0.525; p=0.704) and atopic dermatitis (AUC 0.547; p=0.396) compared with the independent cohort of children with ASD. A total of 20 of  these tested subjects were predicted as ASD based on the threshold calculated from the discovery cohort, reflecting a false positive rate of 10.2%. Overall, these results support the notion that the 27-biomarker multi-kingdom panel is highly specific to ASD.

[0156] To further test the reproducibility of the 27-marker multi-kingdom panel, 195 shotgun fecal metagenome data from six public dataset from Asian, European, and American was integrated. The marker panel showed a significant diagnostic value at an AUC of 0.704 (p=9.4e-07, 95%CI=0.629-0.779) in differentiating ASD and neurotypical children. This performance from public dataset further confirmed the robustness and generalizability of the 27-marker multi-kingdom panel across different populations and geographical locations.

[0157] Due to the enormous interindividual heterogeneity of the gut microbiota, it is plausible that distinct species or strains in different individuals may trigger a similar pathology or phenotype by expressing common pathways. Hence, targeting their broader metagenomic functions, instead of specific taxa may represent an effective approach to study microbiome-mediated pathogenesis in ASD. Decreased concentrations of plasma thiamine (vitamin B1) and its related metabolites, such as thiamine diphosphate, have been implicated in ASD, but the reason underlying this is still unclear. It was found that the relative abundance of the thiamine diphosphate biosynthesis pathway exhibited a consistent reduction in ASD across four cohorts compared with neurotypical children (see FIGS. 9 and 15) . The microbial function panel also showed the highest performance value in differentiating ASD from neurotypical children (see FIG. 14) . A total of ten enzymes were involved in the thiamine diphosphate biosynthesis pathway. In the discovery cohort (n=447) , all of these ten enzymes were depleted in children with ASD, and eight of them reached significance (FDR<0.05) after multiple comparison adjustments.

[0158] These associations were further evaluated in the independent hospital cohort (n=172) . It was observed that the relative abundance of these 10 enzymes was all significantly lower in ASD than in neurotypical children. Altogether, these findings highlighted that the decreased abundance of thiamine diphosphate biosynthesis genes in the gut microbiota appeared to be strongly associated with ASD. The data above support the notion that microbiota-mediated functions are altered in ASD, which also relates to multi-kingdom genes.

[0159] In this study, a comprehensive analysis was performed on the multi-kingdom and functional microbiome using over 1,000 metagenomic datasets across six different independent cohorts in children. For the first time, a series of both bacterial and non-bacterial markers were discovered, and their performance in detecting children with ASD across cohorts was evaluated. 1,188 significant ASD-associated microbial multi-kingdom taxa, functional genes, and pathways were identified. It was shown that fungal, archaeal, viral species and functional microbiome pathways could separate children with ASD and neurotypical children across different age groups. It was demonstrated that a random forest model based on the 27-feature panel achieved high predictive values for ASD diagnosis (average AUC=0.88) , including in children younger than six years old (AUC=0.81) . The reproducible performance of the models across cohorts and ages suggests their potential as a promising diagnostic and predictive tool for ASD.

[0160] A series of novel bacterial and non-bacterial markers were discovered and their associations with ASD were profiled. Among them, several promising beneficial bacteria were observed, such as Weissella confusa, Weissella cibaria, Lawsonibacter asaccharolyticus, and Bacteroides faecalis that exhibited significant negative associations with ASD. Besides, ASD was also positively linked to the opportunistic pathogens Pseudomonas and Stenotrophomonas. Collectively, this imbalanced bacterial ecosystem may have important roles in the pathophysiology of ASD. In addition, it was found that specific microbial function could contribute to ASD pathogenesis via the de-regulation of thiamine diphosphate biosynthesis, which may explain the reduced level of thiamine-related metabolites in ASD children. Thiamine-related metabolites play crucial roles in mental health and neural signal transduction. These findings provided further evidence that thiamine diphosphate biosynthesis of the gut microbiome may also serve as a novel therapeutic target in the future.

[0161] There has been a debate on whether ASD-associated gut dysbiosis is driven solely by dietary preferences. The results disclosed herein show that diet has an impact on the gut microbiome in ASD children. However, ASD-associated microbiome alterations including microbial diversity and composition remain present after correction for dietary factors and GI symptoms in the model, suggesting that diet may not have a large influence on the accuracy of the panel of markers. Furthermore, an analysis was performed of two common childhood  diseases known to have association with gut microbiome alterations, atopic dermatitis and ADHD. It was demonstrated that the 27-marker panel remained specific to the diagnosis of ASD.

[0162] As an added aspect of this disclosure, a test subject who has been deemed to have ASD or at a heightened risk of developing ASD as determined by the method of this invention may receive appropriate treatment as a therapeutic or prophylactic measure to address the ongoing symptoms or the potentially higher risk. For example, a child may be given medication such as antipsychotic and / or antidepressant drugs or may be given therapies such as those specifically designed to address behavioral problems and / or to improve language, communication, or social skills.

[0163] Analysis of children cohorts that are heterogeneous for lifestyle, ethnicity and location and presents a distinct opportunity for studying ASD-associated microbiome. By combining multiple small hospital-based and community cohorts of potentially low generalizability, better representation of the spectrum of ASD cases and controls was obtained. With appropriate methodology, artifactual findings due to batch effects observed in any individual dataset can be avoided. The use of large, diverse training datasets also enables the development of more accurate diagnostic models, and the availability of independent validation datasets allows more realistic estimation of that accuracy.

[0164] FIGS. 18 to 27 show results from a second study that performed shotgun metagenomic sequencing and supervised machine learning of the gut microbiota in 598 children with ASD and neurotypical children to dissect microbial signatures at different levels of the fecal microbial community for ASD. Statistical and machine-learning approaches were employed to compare the gut metagenomes in a discovery cohort and their performance was evaluated in an independent validation cohort. A panel of microbial markers were identified that can aid the diagnosis of ASD.

[0165] In the second study, a total of 598 children aged 3 to 11 years old (median age: 7; interquartile range (IQR) 6-9 years, 80%males) were recruited including 264 with clinician-confirmed ASD children and 334 unrelated neurotypical children. The discovery cohort (n=273) comprised 129 children with ASD and 144 neurotypical children matched by age and gender, and an independent validation cohort (n=325) consisted of 135 children with ASD and 190 neurotypical children. The baseline characteristics of the subjects are shown in Table 5.

[0166] Table 5

[0167] To characterize the gut microbiota profile in children with ASD, gut microbiome diversity and composition were compared between children with ASD and neurotypical children at the level of species and high-resolution level of MAGs. Microbial richness at the species and MAG levels were both lower in the gut of children with ASD compared with neurotypical children (p-value species = 0.0001, p-value MAGs = 0.105) . As shown in FIG. 18, microbial diversity (Shannon) and evenness (Pielou) at the MAG level were significantly decreased in children with ASD. The gut microbiota composition in children with ASD was significantly distinct from that of neurotypical children at both the species and MAGs levels (p-value species =0.001, p-value MAGs = 0.001, based on the Bray-Curtis dissimilarities) . However, as shown in Table 6, a diagnosis of ASD accounted for a larger proportion of microbiome variation at the MAGs level compared with the species level (R2species=0.54%, R2MAGs =1.83%) suggesting that microbial MAGs provided higher resolution with more microbial information in potential characterizing distinct microbial changes related to ASD.

[0168] Table 6

[0169] In the discovery cohort, the potential of the gut microbiome was examined for ASD detection. As shown in FIG. 19, the model performance was measured using microbial taxonomy and microbial MAGs alone and in combination in the model. First, a random forest classifier (RF) was used to analyze all microbial features and their performance was compared against three other approaches including logistic regression (LG) , support vector machines (SVMs) , and gradient boosting classifier (XGBoost) . Amongst the four different classifiers, there was a general trend for better diagnostic performance using microbial taxonomy at higher than lower resolution levels. Microbial species and microbial MAGs achieved an area under the receiver operating characteristic curve (AUROC) of 0.809 and 0.827 in the RF classifier, respectively, in distinguishing children with ASD from neurotypical children. The diagnostic performance of the RF model outperformed that of the models using the LG (AUROCspecies: 0.737; AUROCMAGs: 0.809) , SVMs (AUROC species: 0.762; AUROCMAGs: 0.809) , and XGBoost classifiers (AUROCspecies: 0.821; AUROCMAGs: 0.808) . Furthermore, the combination of microbial taxonomy and microbial MAGs together achieved better diagnostic performance than individual microbial taxonomy or microbial MAGs alone with an average AUROC of 0.858, 0.858, 0.811, and 0.816 based on RF, LG, SVMs, and XGBoost classifiers, respectively.

[0170] To reduce redundant microbiome induced interference in biomarker identification, a pre-selection of microbial biomarkers associated with ASD was performed by testing the differential abundance of taxa and MAGs via analysis of the composition of microbiomes (ANCOM) in the discovery cohort. After adjusting for age, gender, and body mass index (BMI) , 54 microbial taxa and 703 microbial MAGs showed significantly differential abundance between ASD and neurotypical children at the threshold > 0.6. Next, the pre-selected microbial features for biomarker identification and model training were combined in ASD diagnostics by using RF, LG, SVMs and XGBoost classifiers.

[0171] FIG. 20 shows the workflow for the development of a fecal microbiome-based ASD diagnosis model. For both children with ASD and neurotypical children, samples were randomly partitioned based on the prediction target into a training set for the discovery cohort (70%of samples) and a testing set for evaluation (remaining 30%) , and the partitioning itself was randomly performed 10 times to assess sampling variation. Within the discovery cohort,  prediction models were trained and tested through cross-validation, and the optimal model was assessed for the final performance in an independent validation cohort.

[0172] FIG. 21 shows results using the RF classifier, with which the highest predictive power was obtained from 5 bacterial taxa and 44 microbial MAGs (2 vial MAGs and 42 bacterial MAGs) with an AUROC of 0.886 (95%confidence interval: 0.868–0.892; at the best cut-off value, sensitivity: 0.773, specificity: 0.834) through cross-validation. Amongst 49 microbial markers, there were 2 bacterial taxa and 9 microbial MAGs enriched in children with ASD while 3 bacterial taxa and 35 microbial MAGs showed lower abundances in children with ASD when compared with neurotypical children, suggesting the ASD-specific microbiome alterations were largely attributed to ASD-lacked gut microbes. Furthermore, the associations of these biomarkers with host factors were explored within the discovery cohort. As shown in FIG. 22, negligible direct associations were found between these microbial biomarkers with gender, BMI, and GI symptoms, suggesting these selected biomarkers were not supposed to be affected by these host factors. FIG. 23 shows results using the optimal diagnostic model applied to an independent validation cohort consisting of 135 ASD children and 190 neurotypical children. The optimal model showed an AUROC of 0.734 (95%confidence interval: 0.682, 0.782; sensitivity=80.0%, specificity=71.6%) in distinguishing children with ASD from neurotypical children. The same panel of the microbial markers tested in the LG classifier showed comparable results (AUROC=0.742) with the RF classifier but outperformed that of XGBoost (AUROC=0.720) and SVMs (AUROC=0.709) . By analogy with the current authorized behavioral diagnostic device (Cognoa) and enhancing model utilization efficiency, the outputs of the model were stratified into high-and median-confidence sections by applying the optimal cutoffs.

[0173] FIG. 24 shows the distribution of the predicted risk score (ASD probability) across all samples in the validation cohort, with the area under line 2402 denoting the ASD probability distribution of children with ASD in the validation cohort and the area under line 2404 denoting the ASD probability distribution of healthy controls. Depending on the clinical settings, the model’s accuracy can be improved by applying 2 cutoffs of ASD probability to the classification algorithm, where the region between the 2 cutoffs is referred to as the median-confidence section and classified as indeterminate. ASD probabilities falling outside the median-confidence section are referred to as the high-confidence section.

[0174] As shown in FIG. 24, the performance using the high degree confidence section reached an AUROC of 0.906 at a sensitivity of 85.7%and specificity of 93.4%for the detection of ASD. The AUROC, sensitivity, and specificity in the high-degree confidence section showed superior performance with an increase of 23%in AUROC, 4.1%in sensitivity, and 38.6%in specificity compared with the overall performance of the model. In the validation cohort, the distribution of ASD risk scores (ASD probability) of ASD cases peaked at 0.62 while the distribution of ASD risk scores (ASD probability) of neurotypical children peaked at 0.36, suggesting a robust classification capability of the microbiome model.

[0175] In some cases, the Social Responsiveness Scale second edition (SRS-2) is used for identifying the severity of social impairment within the autism spectrum. Two of the SRS-2 subscale scores, social communication and interaction (SRS-SCI) & repetitive and restrictive behaviors (SRS-RRB) which correspond to two core symptom domains of ASD and align with the DSM-5 criteria for ASD, are analyzed. FIG. 25 shows that the identified 49 microbial biomarkers showed significant correlations with the single core symptom index (social communication and interaction (SRS-SCI) & repetitive and restrictive behaviors (SRS-RRB) ) and the total severity score (SRS-T) in the validation cohort.

[0176] The higher abundance of ASD-enriched bacteria Clostridium and microbial MAGs annotated to Ruminococcus gnavus was positively correlated with the more severe symptoms in ASD, including core symptom index (social communication and interaction and repetitive and restrictive behaviors) and total severity score. Meanwhile, the lower abundance of ASD-lacked microbial MAGs annotated to Lachnospiraceae bacterium, Faecalibacterium prausnitzii and Desulfovibrio piger was also correlated with the more severe symptoms in ASD.

[0177] Next, the association between predicted ASD risk scores (ASD probability) and these ASD clinical scores were further explored. FIG. 26 shows that the predicted ASD risk scores (ASD probability) showed consistently positive correlations with social communication and interaction scores, repetitive and restrictive behaviors scores, and total severity scores. A child who showed more severe ASD symptoms defined by a higher SRS score tends to have a higher ASD probability score based on the model. This result suggests that the microbial markers and microbiome-based model are not only associated with the presence of ASD but also reflect the severity of ASD symptoms.

[0178] To further determine the generalizability of the model in different groups of children, subjects were stratified in the validation cohort into sub-groups based on their age, gender, presence of GI symptoms, and presence of psychiatric comorbidities (ADHD and anxiety) . As shown in FIG. 27, the sub-groups included children aged 6 years and younger (n=71; versus those older than six years old, n=254) , male (n=224; versus female, n=101) , children without GI symptoms (n=309; versus children with GI symptoms including constipation and diarrhea, n=16) , and children without psychiatric comorbidities (n=251; vs children with ADHD, n=26) and without anxiety (n=255; vs children with anxiety, n=50) . It was found that the model's performance was higher in younger (≤ 6 years old) than older children (> 6 years old) with the AUROC increasing from 0.734 to 0.845. Whereas its performance in the other models remained mostly unchanged across other sub-groups (AUROCmale: 0.745, AUROCfemale: 0.708, AUROCno_gi_symptoms: 0.733, AUROCgi_symptoms: 0.720, AUROCno-ADHD: 0.729, AUROCADHD: 0.730; AUROCno-anxiety: 0.740, AUROCanxiety: 0.728) . These observations suggest that the model had higher accuracy in younger children but its diagnostic performance was not affected by gender or the presence of GI symptoms or concurrent psychiatric comorbidities (ADHD and anxiety) .

[0179] Currently, the gold standard of clinical diagnosis for ASD is based physician’s assessment using the history of development and clinical observation of behaviors, aided by several psychological tests. However, the dynamic nature of a child's developmental trajectory and heterogeneous presentation poses a challenge to the early detection of the disorder. Therefore, a robust biological marker may be of clinical utility for aiding earlier detection. The gut microbiota is increasingly recognized as a modulator of brain development and behavior, but its role as a potential biomarker in ASD detection is not well utilized. Using shotgun metagenomic sequencing and machine learning, ASD-associated microbial taxa and MAGs were identified and subsequently a microbiome-based model was developed for aiding the diagnosis of ASD.

[0180] The described studies focused on the childhood period, which represents an important window of human growth and health. Indeed, the described models are more sensitive in 6-year-olds and younger children. Besides, metagenomic assembly was integrated with reference-based microbial profiling approaches to characterize the novelty microbial features in ASD. An in-house gene catalog was built by the de novo metagenomic assembly that provided more  information (nucleotide sequences of multi-kingdom microorganisms present in the sample) and a high-resolution microbial community. As shown in the described findings, higher prediction performance was observed at higher microbial resolution levels for ASD, suggesting that the strength of association for higher resolution of gut microbial features may outweigh their lower resolution, and it can more accurately capture the microbial alterations in ASD.

[0181] Based on the model, the predicted risk score (ASD probability) showed significant positive correlations with the severity of social skills (total T-score) and single core symptoms (social communication and interaction & repetitive and restrictive behaviors) across the autism spectrum, suggesting children with ASD shown more severe symptoms tend to have more typical "ASD-type" gut microbial profiling. The microbiome model is more sensitive in children 6 years or younger suggesting that ASD-associated microbes may act as a proxy for risk stratification for ASD during an early age, which helps children earlier access to services with potentially long-term impact on children’s developmental outcomes. Clinically, ASD accompanying other mental and physical health conditions may contribute to lower certainty by making differential diagnosis more challenging. ADHD and anxiety are the most commonly diagnosed comorbidities, accounting for 40%to 70%of individuals with ASD40, 41. Nevertheless, the microbiome-based model showed good applicability in different subsets of the presence or absence of comorbidities in the validation cohort.

[0182] Given the dynamic nature of ASD during a child's development, the single cutoff / threshold for algorithm output was not suitable for the condition of ASD detection. By analogy with the current behavioral diagnostic device (Cognoa) and providing a more applicable model, high-and medium-confidence intervals were set for the predicted risk score (ASD probability) . The model will return medium-confidence results when the predicted ASD probability ranges from 0.389 to 0.670. The described model is superior to the behavioral Cognoa device performance as shown by a higher specificity and more even sensitivity and specificity, suggesting the model is more reliable in identifying a subject not having ASD.

[0183] Notably, beneficial commensals such as Bacteroides uniformis, Lachnospiraceae bacterium and Blautia wexlerae were observed to decrease in ASD in the cohort. In murine studies, Bacteroides uniformis and Lachnospiraceae bacterium A2 were reported to link with modulating the behavior and restoring ASD-like phenotypes via modulating intestinal amino  acid transport and serum glutamine levels and modulating the peripheral Immunoregulation, respectively. Blautia wexlerae was also reported to have anti-inflammatory effects on peripheral blood, and significantly reduced in other psychiatric conditions. In addition, children with ASD were observed to harbor reduced Caudovirales species which have been reported to enhance the capacity for novel object recognition and memory via up-regulating memory-involved brain genes. Children with ASD were also characterized by enriched Clostridium and Ruminococus gnavus. Clostridium has been reported to be associated with brain tissue damage and neurological disorders by producing clostridial toxins that could distort dendritic arbor complexity during childhood development. Ruminococus gnavus derived tryptophan decarboxylases could modulate neurotransmitter tryptamine formation, which suggests a possible direct mechanism by which the gut microbiota influences host behavior.

[0184] FIG. 28 illustrates the different phases of the third study, including a discovery phase 2802, a machine learning phase 2804, a deployment phase 2806, and a validation phase 2808. A total of 1, 627 children (aged 1-13 years, 24.4%female) from five independent cohorts were recruited in this study. In total, over 10 terabytes of sequence data were obtained at an average depth of 6.34 gigabases for each metagenome. In the discovery cohort, metagenomic sequencing was performed on faecal samples from 709 ASD and 374 neurotypical children (age 3-12, 24.3%female) . The dataset was processed by Kraken2 and HUMAnN3 and filtered by 15%prevalence and contained 8, 972 taxa (393 archaea, 8, 178 bacteria, 78 fungi and 323 viruses) at the species level, 500 functional pathways and 5, 225 KEGG orthology of microbial gene families.

[0185] In an independent hospital cohort, a total of 172 faecal samples from 82 ASD and 90 neurotypical children (aged 4-11, all male) were sequenced and these data were used as external validation. Also included was a community cohort with younger children consisting of 116 ASD and 60 neurotypical children (aged 1-8, 29.5%female) to validate the findings in different age groups. 237 faecal metagenome (aged 2-13, 17.7%female) from published datasets were included in the analysis for external validation. Two additional non-ASD cohorts of children with attention deficit hyperactivity disorder (ADHD, n=118) and atopic dermatitis (n=78) were used to evaluate the specificity of the findings.

[0186] Extensive phenotypic data (236 factors) were collected including age, sex, BMI, diet, medication, co-morbidity, concomitant psychiatric disorders, GI symptoms (including stool  consistency assessed by Bristol stool form score, BSFS) , family characteristics and technical factors related to sample collection, storage, and processing. All faecal samples were processed using the same standardised protocol to reduce the batch effects caused by technical factors. In the discovery cohort, metagenomic sequencing was performed on faecal samples from 709 ASD and 374 neurotypical children (age 3-12, 24.3%female) . The dataset was processed by Kraken2 and HUMAnN3 and filtered by 15%prevalence and contained 8, 972 taxa (393 archaea, 8, 178 bacteria, 78 fungi and 323 viruses) at the species level, 500 functional pathways and 5, 225 KEGG orthology of microbial gene families (KO genes) .

[0187] In an independent hospital cohort, a total of 172 faecal samples were sequenced from 82 ASD and 90 neurotypical children (aged 4-11, all male) and this data were used as external validation. Also included was a community cohort with younger children consisting of 116 ASD and 60 neurotypical children (aged 1-8, 29.5%female) to validate the findings in different age groups. 237 faecal metagenome (aged 2-13, 17.7%female) from published datasets were included in the analysis for external validation. Two additional non-ASD cohorts of children with attention deficit hyperactivity disorder (ADHD, n=118) and atopic dermatitis (n=78) were used to evaluate the specificity of the findings.

[0188] As gut microbiota composition is largely shaped by environmental and host factors, the impact of 236 host factors were analyzed, including ASD, age, sex, BMI, co-morbidities (n=7) , diet (n=201) , family characteristics (n=5) , gastrointestinal (GI) parameters / symptoms (n=4) , medication (n=4) , co-occurring psychiatric disorders (n=3) and technical factors (n=7) on the gut microbiome composition. In the discovery cohort (age 3-12, n=1083, 24.3%female) , these host factors in combination explained 12.5%, 15.1%, 10.7%and 11.7%of the inter-individual microbiome variation for archaea, bacteria, fungi and viruses, respectively.

[0189] FIG. 29 illustrates a variance in multi-kingdom (archaea, bacteria, fungi, and viruses) microbiome composition explained by phenotypes groups in multivariate PERMANOVA analysis. GI parameters and a diagnosis of ASD ranked amongst the top two factors accounting for the largest microbiome composition variation. Amongst all host and dietary factors studied, a total of 21 factors showed a significant impact on all four kingdoms of gut microbiota composition, including ASD, age, sex, BMI, three GI parameters, fifteen dietary factors and  sequencing batch, therefore these factors were adjusted in all subsequent association analyses. Next, changes in the gut microbiota diversity in ASD and neurotypical children were assessed.

[0190] FIG. 30 illustrates alpha diversity in multi-kingdom (archaea, bacteria, fungi and viruses) microbiome measured by Shannon index of children with ASD (n=709) and NT children (n=374) . ASD children showed a decrease in the Shannon diversity Index for archaea, bacteria and viruses compared with neurotypical children. There was however no significant difference in the diversity of the fungi between ASD and neurotypical children. The richness of archaea, bacteria, fungi and viruses was also significantly lower in ASD than in neurotypical children.

[0191] FIG. 31 illustrates volcano plots that show the associations between multi-kingdom (archaea, bacteria, fungi, and viruses) species and ASD calculated by MaAsLin2 after adjusting for significant confounders. Associations with an adjusted p value (FDR) less than 0.05 are considered as significant and are marked with solid circles, with associations enriched in ASD found in the upper right quadrant of each plot in FIG. 31 and associations depleted in ASD found in the upper left quadrant of each plot. The top ranked species are labeled with names.

[0192] To identify microbial markers for ASD, associations between multi-kingdom species and ASD were examined. A total of 14 archaeal, 51 bacterial, 7 fungal and 18 viral species showed differential abundances between ASD and neurotypical children (FDR<0.05) . The relative abundance of 80 out of 90 identified microbial species was found to be significantly decreased in the gut of children with ASD compared with NT children. This finding was most pronounced for the bacteria communities, whereby 50 bacteria species were depleted in the gut of children with ASD whereas only one bacteria species was enriched in ASD. Alterations in bacteria species in children with ASD were driven by the depletion of Streptococcus thermophilus, and short-chain fatty acids-producing bacteria, such as Bacteroides sp. PHL2737, Lawsonibacter intracellularis, and Bacteroides species.

[0193] FIGS. 32 and 33 show associations between ASD and fecal microbiome functions. FIG. 32 illustrates a variance in microbiome function (pathways and genes) explained by phenotypes groups in multivariate PERMANOVA analysis. The influence of host phenotype factors on microbial functions based on the KEGG orthology (KO genes, n=5, 225) and metabolic pathways (n=500) was explored. As shown in FIG. 32, host phenotype factors explained 17.1%and 15.7%of the variation of microbiome functional pathways and KO genes, respectively. A diagnosis of  ASD ranked as the top factor accounting for 4.3%and 3.6%of the variation for microbiome functional pathways and KO genes, respectively. A total of 19 host and diet factors showed a significant impact on the gut microbiome functions, including ASD, age, sex, BMI, two GI parameters, twelve dietary factors and sequencing batch. After adjusting for these confounders, 27 differential KO genes were identified: 23 were decreased and 4 were increased in children with ASD compared with neurotypical children (FDR<0.01) .

[0194] FIG. 33 illustrates volcano plots that show the associations between microbiome functions (pathways and KO genes) and ASD calculated by MaAsLin 2 after adjusting for significant confounders. Associations with an adjusted p value (FDR) less than 0.01 were considered as significant and are marked with solid circles, with associations enriched in ASD found in the upper right quadrant of each plot in FIG. 33 and associations depleted in ASD found in the upper left quadrant of each plot. The top ranked pathways are labeled with names.

[0195] FIGS. 34 to 38 demonstrate how random forest classifiers trained on multi-kingdom microbiome composition and function data can predict the presence or absence of ASD. FIG. 34 illustrates a schematic diagram of random forest model development. A balanced reference dataset 3416 of ASD (n=301) versus NT children (n=301) was constructed from the original discovery cohort (n=1083) using a one-by-one paring algorithm accounting for all significant confounders (n=24) . In some examples, reference dataset 3416 includes feature vectors for six components: archaea, bacteria, fungi, viruses, microbial pathways, and KO genes.

[0196] A train-test sample split of 70 / 30%of reference dataset 3416 was performed to produce a training dataset 3418 and a test dataset 3420. Training dataset 3418 was used to train a set of decision trees 3422 that are aggregated to form a random forest model 3424. In the illustrated example, each of decision trees 3422 corresponds to a particular biological entity or kingdom. In various examples, random forest model 3424 can be formed using decision trees 3422 of a single kingdom or biological entity (e.g., only bacteria decision trees) or using decision trees 3422 of multiple kingdoms or biological entities (e.g., bacteria, fungi, and viruses) . After training random forest model 3424, test dataset 3420 was used to estimate the accuracy of random forest model 3424 by computing the AUC for the model. This process of training and testing was repeated 20 times to obtain a distribution of random forest prediction evaluations on test dataset 3420.

[0197] The performance of archaea, fungi, viruses, KO genes, or function pathways has not previously been explored in ASD. To avoid discrimination bias driven by imbalanced sample size and residual confounders, a matched subcohort of children with ASD (n=301, 95 girls and 206 boys) and neurotypical children (n=301, 95 girls and 206 boys) by one-to-one pairing algorithm was constructed based on the discovery cohort (n=447) . A total of 24 confounders identified above were employed in the pairing algorithm, including age, sex, BMI, three GI parameters, sequencing batch and 17 dietary factors. After matching, there was no difference of these 24 confounders between ASD and neurotypical children in the matched subcohort, which was then used for the development of the random forest models.

[0198] Specifically, the distribution of age (p=0.56) , sex (p=1) , BMI (p=0.64) , sequencing batch (p=0.79) and BSFS (p=0.14 by chi-square test) were comparable between children with ASD and neurotypical children. The prevalence of functional constipation (9.3%vs 8.9%; p=0.5) or functional defecation disorders (10.3%vs 7.9%, p=0.2) were also comparable between children with ASD and neurotypical children. In addition, there was no difference in the consumption frequency of 17 dietary factors between children with ASD and neurotypical children (all p>0.05 by chi-square test) , including beverages (Yakult) , dairy products (cheese and whole milk) , eggs (whole boiled eggs and scrambled / sunnyside up eggs) , fruits (apple / pear) , grains (wheat noodles / udon) , meats (barbeque pork / lean pork, salmon) , cooking oil (peanut oil, olive oil, corn oil, vegetable oil and canola oil) , snacks (candies and ice cream) and vegetables (choy sum) . These results illustrated a comparable environmental and host background in children with ASD and neurotypical children thus the model was less likely to be affected by these important factors.

[0199] FIG. 35 shows a box-and-whisker plot displaying the distribution of AUC scores for evaluations taken on the test dataset, obtained by random forest classification. Differences between groups were evaluated by the two-sided Wilcoxon rank-sum test. In FIG. 35, asterisks indicate FDR<0.05. Prevalence and relative abundance of the top 31 markers employed by the random forest model in the balanced dataset of ASD (n=301) and neurotypical children (n=301) are also shown.

[0200] The accuracy of the models was tested using a single kingdom marker to distinguish ASD from neurotypical children. Amongst all single-kingdom markers, the microbial pathway  model displayed the strongest predictive ability to detect ASD with an average score of an AUC value of 0.87 at a specificity of 86.4%and a sensitivity of 89.7%. The model using microbial genes had the second highest score with an average AUC of 0.86, followed by bacteria (average AUC of 0.85) , archaea (average AUC 0.76) , fungi (average AUC of 0.74) , and viruses-based (average AUC of 0.68) models. Collectively, these findings demonstrate that marker features from different kingdoms provide promising predictive capabilities for ASD diagnosis.

[0201] Since all single-kingdom features displayed diagnostic potential for children with ASD, the performance of models that combine the individual multi-kingdom features was explored. Data was combined from all four kingdoms, including their functions and genes. It found that the combined model showed superior performance (average AUC 0.91) for the diagnosis of ASD at a specificity of 95.1%and sensitivity of 89.5%, compared with models based on single-kingdom features (all adjusted p<0.05) . Furthermore, the accuracy of this model based on the combined multi-kingdom features was 90.5%with a positive prediction value of 97.8%and a negative prediction value of 89.1%. These results confirmed that the multi-kingdom fecal microbiome biomarker panel had higher diagnostic performance for detecting ASD than single-kingdom panel.

[0202] FIG. 36 illustrates a chart showing associations between the top 31 markers with ASD assessed by MaAsLin2. To identify the minimal number of microbiome markers to achieve the highest accuracy, identified markers were included consecutively into the model according to their ranking, and finally, a total of 31 microbial features (2 archaea, 2 fungi, 3 viruses, 9 bacteria, 5 microbial gene families, and 10 pathways) showed an AUC of 0.91 with a specificity of 92.5%and a sensitivity of 94.1%for the diagnosis of ASD. The prevalence and relative abundance of the markers also differed significantly between children with ASD and neurotypical children.

[0203] FIG. 37 illustrates differential abundances and the p value of the 31 markers between ASD and neurotypical children. It can be observed that 21 markers were significantly depleted whereas 10 markers were significantly enriched in the gut of children with ASD (all FDR<0.05) .

[0204] FIG. 38 illustrates the mean decrease in accuracy for each of the 31 markers used in the random forest model (where *means FDR<0.05, **means FDR<0.01, ***means FDR<0.001) . The importance of these 31 features was re-analyzed in the final ensembled model and it was observed that the accuracy of the model was driven predominantly by the ubiquinol-7  biosynthesis pathway, the GTPase and the thiamine diphosphate biosynthesis pathway, which support the potential role of thiamine diphosphate in ASD pathogenesis. In addition, the depletion of several bacteria, including Streptococcus thermophilus, Lawsonia intracellularis, Weissella confuse, Weissella cibaria and Bacteroides sp. PHL2737, were also some of the top-ranked microbial features contributing to the diagnostic accuracy. It was also found that the palmitoleate biosynthesis I pathway was listed in these top 31 features. Palmitoleate has been previously linked to constipation, thus the enriched biosynthesis pathway of this may also account for the common occurrence of constipation in children with ASD. Collectively, the analysis showed that a 31-fecal microbiome panel marker derived from archaea, bacteria, fungi, viruses, KO genes and microbial functional pathways represents a potentially promising non-invasive tool for the diagnosis of ASD.

[0205] FIGS. 39 to 42 show the validation of the random forest models on an independent hospital cohort. To externally validate the diagnostic value and to avoid over-optimistic reporting of diagnostic accuracy, the 31-marker panel and the trained models were tested in an independent hospital cohort (82 ASD and 90 neurotypical boys, aged 4-11) .

[0206] FIG. 39 illustrates the AUC (95%CI) of random forest models employing different features in the validation cohort. The sensitivity, specificity and accuracy were calculated based on the Youden index. The AUC were calculated after adjustment for technical factors and available covariates including age, sex, BMI, BSBF, functional constipation and defecation disorders. FIG. 40 shows the performance metric details of the trained random forest models for classifying ASD using different features in the validation cohort. The trained models maintained an AUC ranging from 0.55 to 0.87. Among them, the ensembled model using 31 markers (adjusted AUC 0.87) ranked first in accuracy at 82%, with a sensitivity of 91%and a specificity of 73%. The relative abundance of the 28 out of 31 markers remained significantly different between children with ASD and neurotypical children.

[0207] Furthermore, the trained models showed an AUC ranging from 0.61 to 0.89 in a younger subset of children in this validation cohort (n=31, 6 years old or younger) , where the ensembled model using 31 markers again achieved the highest accuracy. To test whether this panel could be applied to predict the risk of ASD in younger children, the trained model using 31 markers was tested in another younger cohort (116 ASD and 60 neurotypical subjects, 1-8 years  old, 29.5%female) . The model achieved an AUC of 0.89, a sensitivity of 75.9%and a specificity of 86.7%with a relatively balanced performance for both males (AUC 0.88) and females (AUC 0.92) . When reducing the age range to six years or younger (42 neurotypical children; 88 subjects with ASD) and four years or younger (27 neurotypical children; 46 subjects with ASD) , the model showed an accuracy of 88.6%and 86.3%, respectively.

[0208] FIG. 41 shows associations between ASD and the 31 identified faecal microbiome markers across five cohorts in this study. The coef value of each association was only marked when corresponding FDR less than 0.05. FIG. 42 shows the AUC of the model using 31 markers tested in the independent ADHD and atopic dermatitis cohorts. ADHD and atopic dermatitis have been reported to be associated with alterations in the gut microbiota. AUC values of the marker panel were lower in children with atopic dermatitis or ADHD (AUC 0.513, p=0.809) and atopic dermatitis (AUC 0.575, p=0.157) . Taken together, these results demonstrated the robustness of our trained model and the 31-marker panel across ages, sexes, and cohorts.

[0209] To further test the reproducibility of the 31-marker multi-kingdom panel, 237 shotgun faecal metagenome data from six public datasets from Asia, Europe and America40-45 were integrated. The trained model showed an AUC of 0.78 (p=9.17e-14, 95%CI=0.72-0.84, Sensitivity 65.30%, Specificity 72.40%) in differentiating ASD from neurotypical children. More importantly, the model showed comparable performance for male (AUC 0.77) and female (AUC 0.82) , confirming the applicability of the model to both sexes. Overall, this 31-marker multi-kingdom panel may be relevant across different populations and geographical locations.

[0210] Due to the enormous interindividual heterogeneity of the gut microbiota, it is plausible that distinct species or strains in different individuals may trigger a similar pathology or phenotype by expressing common pathways. Hence, targeting their broader metagenomic functions, instead of specific taxa may represent an effective approach to studying microbiome-mediated pathogenesis in ASD. Previous studies suggest that ubiquinol improves symptoms in children with ASD. Decreased concentrations of plasma thiamine (vitamin B1) and its related metabolites, such as thiamine diphosphate, have been implicated in ASD. However, the reasons underlying these observations are still unclear. The relative abundance of the ubiquinol-7 biosynthesis pathway and the thiamine diphosphate biosynthesis pathway were found to exhibit a consistent reduction in ASD across three cohorts compared with neurotypical children and  predominantly drove the accuracy of our diagnosis model (FIG. 41) . Microbial function panel also showed the highest diagnostic value in differentiating ASD from neurotypical children (FIG. 35) . A total of 17 enzymes were involved in these two pathways, and most of them were depleted in children with ASD across different cohorts. Altogether, these findings highlighted that decreased abundance of ubiquinol-7 and thiamine diphosphate biosynthesis genes in the gut microbiota appeared to be strongly associated with ASD. The data above support the notion that microbiota-mediated functions and microbial genes were altered in ASD.

[0211] In this study, a comprehensive analysis was performed on the multi-kingdom and functional microbiome using over 1, 600 metagenomic datasets across five different independent cohorts in children. For the first time, a series of both bacterial and non-bacterial markers were discovered, and their performance in detecting children with ASD across cohorts was evaluated. 1,188 significant ASD-associated microbial multi-kingdom taxa, functional genes, and pathways were identified. It was shown that fungal, archaeal, viral species and functional microbiome pathways could separate children with ASD and neurotypical children across different age groups. It was demonstrated that a random forest model based on the 31-feature panel achieved high predictive values for ASD diagnosis (average AUC=0.91) , including in children younger than four years old (AUC=0.91) . The reproducible performance of the models across cohorts, sexes, ages, and public datasets suggests their potential as a promising diagnostic and predictive tool for ASD.

[0212] A series of novel bacterial and non-bacterial markers were discovered and their associations with ASD were profiled. Among them, several promising beneficial bacteria were observed, such as Streptococcus thermophilus, Weissella confusa, and Weissella cibaria that exhibited significant negative associations with ASD. In addition, it was found that specific microbial function could contribute to ASD pathogenesis via the de-regulation of ubiquinol and thiamine diphosphate biosynthesis. Ubiquinol and thiamine-related metabolites play crucial roles in mental health and neural signal transduction. These findings provided further evidence that thiamine diphosphate biosynthesis of the gut microbiome may also serve as a novel therapeutic target in the future.

[0213] FIG. 43 illustrates an example computer system 4300 comprising various hardware elements, in accordance with some embodiments of the present disclosure. Computer system  4300 may be incorporated into or integrated with devices described herein and / or may be configured to perform some or all of the steps of the methods provided by various embodiments. For example, in various embodiments, computer system 4300 may be configured to perform any of methods 100 or 300. It should be noted that FIG. 43 is meant only to provide a generalized illustration of various components, any or all of which may be utilized as appropriate. FIG. 43, therefore, broadly illustrates how individual system elements may be implemented in a relatively separated or relatively more integrated manner.

[0214] In the illustrated example, computer system 4300 includes a communication medium 4302, one or more processor (s) 4304, one or more input device (s) 4306, one or more output device (s) 4308, a communications subsystem 4310, and one or more memory device (s) 4312. Computer system 4300 may be implemented using various hardware implementations and embedded system technologies. For example, one or more elements of computer system 4300 may be implemented within an integrated circuit (IC) , an application-specific integrated circuit (ASIC) , an application-specific standard product (ASSP) , a field-programmable gate array (FPGA) , such as those commercially available by  or LATTICE a system-on-a-chip (SoC) , a microcontroller, a printed circuit board (PCB) , and / or a hybrid device, such as an SoC FPGA, among other possibilities.

[0215] The various hardware elements of computer system 4300 may be communicatively coupled via communication medium 4302. While communication medium 4302 is illustrated as a single connection for purposes of clarity, it should be understood that communication medium 4302 may include various numbers and types of communication media for transferring data between hardware elements. For example, communication medium 4302 may include one or more wires (e.g., conductive traces, paths, or leads on a PCB or integrated circuit (IC) , microstrips, striplines, coaxial cables) , one or more optical waveguides (e.g., optical fibers, strip waveguides) , and / or one or more wireless connections or links (e.g., infrared wireless communication, radio communication, microwave wireless communication) , among other possibilities.

[0216] In some embodiments, communication medium 4302 may include one or more buses that connect the pins of the hardware elements of computer system 4300. For example, communication medium 4302 may include a bus that connects processor (s) 4304 with main  memory 4314, referred to as a system bus, and a bus that connects main memory 4314 with input device (s) 4306 or output device (s) 4308, referred to as an expansion bus. The system bus may itself consist of several buses, including an address bus, a data bus, and a control bus. The address bus may carry a memory address from processor (s) 4304 to the address bus circuitry associated with main memory 4314 in order for the data bus to access and carry the data contained at the memory address back to processor (s) 4304. The control bus may carry commands from processor (s) 4304 and return status signals from main memory 4314. Each bus may include multiple wires for carrying multiple bits of information and each bus may support serial or parallel transmission of data.

[0217] Processor (s) 4304 may include one or more central processing units (CPUs) , graphics processing units (GPUs) , neural network processors or accelerators, digital signal processors (DSPs) , and / or other general-purpose or special-purpose processors capable of executing instructions. A CPU may take the form of a microprocessor, which may be fabricated on a single IC chip of metal–oxide–semiconductor field-effect transistor (MOSFET) construction. Processor (s) 4304 may include one or more multi-core processors, in which each core may read and execute program instructions concurrently with the other cores, increasing speed for programs that support multithreading.

[0218] Input device (s) 4306 may include one or more of various user input devices such as a mouse, a keyboard, a microphone, as well as various sensor input devices, such as an image capture device, a temperature sensor (e.g., thermometer, thermocouple, thermistor) , a pressure sensor (e.g., barometer, tactile sensor) , a movement sensor (e.g., accelerometer, gyroscope, tilt sensor) , a light sensor (e.g., photodiode, photodetector, charge-coupled device) , and / or the like. Input device (s) 4306 may also include devices for reading and / or receiving removable storage devices or other removable media. Such removable media may include optical discs (e.g., Blu-ray discs, DVDs, CDs) , memory cards (e.g., CompactFlash card, Secure Digital (SD) card, Memory Stick) , floppy disks, Universal Serial Bus (USB) flash drives, external hard disk drives (HDDs) or solid-state drives (SSDs) , and / or the like.

[0219] Output device (s) 4308 may include one or more of various devices that convert information into human-readable form, such as without limitation a display device, a speaker, a printer, a haptic or tactile device, and / or the like. Output device (s) 4308 may also include devices  for writing to removable storage devices or other removable media, such as those described in reference to input device (s) 4306. Output device (s) 4308 may also include various actuators for causing physical movement of one or more components. Such actuators may be hydraulic, pneumatic, electric, and may be controlled using control signals generated by computer system 4300.

[0220] Communications subsystem 4310 may include hardware components for connecting computer system 4300 to systems or devices that are located external to computer system 4300, such as over a computer network. In various embodiments, communications subsystem 4310 may include a wired communication device coupled to one or more input / output ports (e.g., a universal asynchronous receiver-transmitter (UART) ) , an optical communication device (e.g., an optical modem) , an infrared communication device, a radio communication device (e.g., a wireless network interface controller, a  device, an IEEE 802.11 device, a Wi-Fi device, a Wi-Max device, a cellular device) , among other possibilities.

[0221] Memory device (s) 4312 may include the various data storage devices of computer system 4300. For example, memory device (s) 4312 may include various types of computer memory with various response times and capacities, from faster response times and lower capacity memory, such as processor registers and caches (e.g., L0, L1, L2) , to medium response time and medium capacity memory, such as random-access memory (RAM) , to lower response times and lower capacity memory, such as solid-state drives and hard drive disks. While processor (s) 4304 and memory device (s) 4312 are illustrated as being separate elements, it should be understood that processor (s) 4304 may include varying levels of on-processor memory, such as processor registers and caches that may be utilized by a single processor or shared between multiple processors.

[0222] Memory device (s) 4312 may include main memory 4314, which may be directly accessible by processor (s) 4304 via the address and data buses of communication medium 4302. For example, processor (s) 4304 may continuously read and execute instructions stored in main memory 4314. As such, various software elements may be loaded into main memory 4314 to be read and executed by processor (s) 4304 as illustrated in FIG. 43. Typically, main memory 4314 is volatile memory, which loses all data when power is turned off and accordingly needs power to preserve stored data. Main memory 4314 may further include a small portion of non-volatile  memory containing software (e.g., firmware, such as BIOS) that is used for reading other software stored in memory device (s) 4312 into main memory 4314. In some embodiments, the volatile memory of main memory 4314 is implemented as RAM, such as dynamic random-access memory (DRAM) , and the non-volatile memory of main memory 4314 is implemented as read-only memory (ROM) , such as flash memory, erasable programmable read-only memory (EPROM) , or electrically erasable programmable read-only memory (EEPROM) .

[0223] Computer system 4300 may include software elements, shown as being currently located within main memory 4314, which may include an operating system, device driver (s) , firmware, compilers, and / or other code, such as one or more application programs, which may include computer programs provided by various embodiments of the present disclosure. Merely by way of example, one or more steps described with respect to any methods discussed above, may be implemented as instructions 4316, which are executable by computer system 4300. In one example, such instructions 4316 may be received by computer system 4300 using communications subsystem 4310 (e.g., via a wireless or wired signal that carries instructions 4316) , carried by communication medium 4302 to memory device (s) 4312, stored within memory device (s) 4312, read into main memory 4314, and executed by processor (s) 4304 to perform one or more steps of the described methods. In another example, instructions 4316 may be received by computer system 4300 using input device (s) 4306 (e.g., via a reader for removable media) , carried by communication medium 4302 to memory device (s) 4312, stored within memory device (s) 4312, read into main memory 4314, and executed by processor (s) 4304 to perform one or more steps of the described methods.

[0224] In some embodiments of the present disclosure, instructions 4316 are stored on a computer-readable storage medium (or simply computer-readable medium) . Such a computer-readable medium may be non-transitory and may therefore be referred to as a non-transitory computer-readable medium. In some cases, the non-transitory computer-readable medium may be incorporated within computer system 4300. For example, the non-transitory computer-readable medium may be one of memory device (s) 4312 (as shown in FIG. 43) . In some cases, the non-transitory computer-readable medium may be separate from computer system 4300. In one example, the non-transitory computer-readable medium may be a removable medium provided to input device (s) 4306 (as shown in FIG. 43) , such as those described in reference to  input device (s) 4306, with instructions 4316 being read into computer system 4300 by input device (s) 4306. In another example, the non-transitory computer-readable medium may be a component of a remote electronic device, such as a mobile phone, that may wirelessly transmit a data signal that carries instructions 4316 to computer system 4300 and that is received by communications subsystem 4310 (as shown in FIG. 43) .

[0225] Instructions 4316 may take any suitable form to be read and / or executed by computer system 4300. For example, instructions 4316 may be source code (written in a human-readable programming language such as Java, C, C++, C#, Python) , object code, assembly language, machine code, microcode, executable code, and / or the like. In one example, instructions 4316 are provided to computer system 4300 in the form of source code, and a compiler is used to translate instructions 4316 from source code to machine code, which may then be read into main memory 4314 for execution by processor (s) 4304. As another example, instructions 4316 are provided to computer system 4300 in the form of an executable file with machine code that may immediately be read into main memory 4314 for execution by processor (s) 4304. In various examples, instructions 4316 may be provided to computer system 4300 in encrypted or unencrypted form, compressed or uncompressed form, as an installation package or an initialization for a broader software deployment, among other possibilities.

[0226] In one aspect of the present disclosure, a system (e.g., computer system 4300) is provided to perform methods in accordance with various embodiments of the present disclosure. For example, some embodiments may include a system comprising one or more processors (e.g., processor (s) 4304) that are communicatively coupled to a non-transitory computer-readable medium (e.g., memory device (s) 4312 or main memory 4314) . The non-transitory computer-readable medium may have instructions (e.g., instructions 4316) stored therein that, when executed by the one or more processors, cause the one or more processors to perform the methods described in the various embodiments.

[0227] In another aspect of the present disclosure, a computer-program product that includes instructions (e.g., instructions 4316) is provided to perform methods in accordance with various embodiments of the present disclosure. The computer-program product may be tangibly embodied in a non-transitory computer-readable medium (e.g., memory device (s) 4312 or main  memory 4314) . The instructions may be configured to cause one or more processors (e.g., processor (s) 4304) to perform the methods described in the various embodiments.

[0228] In another aspect of the present disclosure, a non-transitory computer-readable medium (e.g., memory device (s) 4312 or main memory 4314) is provided. The non-transitory computer-readable medium may have instructions (e.g., instructions 4316) stored therein that, when executed by one or more processors (e.g., processor (s) 4304) , cause the one or more processors to perform the methods described in the various embodiments.

[0229] The methods, systems, and devices discussed above are examples. Various configurations may omit, substitute, or add various procedures or components as appropriate. For instance, in alternative configurations, the methods may be performed in an order different from that described, and / or various stages may be added, omitted, and / or combined. Also, features described with respect to certain configurations may be combined in various other configurations. Different aspects and elements of the configurations may be combined in a similar manner. Also, technology evolves and, thus, many of the elements are examples and do not limit the scope of the disclosure or claims.

[0230] Specific details are given in the description to provide a thorough understanding of exemplary configurations including implementations. However, configurations may be practiced without these specific details. For example, well-known circuits, processes, algorithms, structures, and techniques have been shown without unnecessary detail in order to avoid obscuring the configurations. This description provides example configurations only, and does not limit the scope, applicability, or configurations of the claims. Rather, the preceding description of the configurations will provide those skilled in the art with an enabling description for implementing described techniques. Various changes may be made in the function and arrangement of elements without departing from the spirit or scope of the disclosure.

[0231] Having described several example configurations, various modifications, alternative constructions, and equivalents may be used without departing from the spirit of the disclosure. For example, the above elements may be components of a larger system, wherein other rules may take precedence over or otherwise modify the application of the technology. Also, a number of steps may be undertaken before, during, or after the above elements are considered. Accordingly, the above description does not bind the scope of the claims.

[0232] As used herein and in the appended claims, the singular forms “a” , “an” , and “the” include plural references unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “a user” includes reference to one or more of such users, and reference to “a processor” includes reference to one or more processors and equivalents thereof known to those skilled in the art, and so forth.

[0233] Also, the words “comprise, ” “comprising, ” “contains, ” “containing, ” “include, ” “including, ” and “includes, ” when used in this specification and in the following claims, are intended to specify the presence of stated features, integers, components, or steps, but they do not preclude the presence or addition of one or more other features, integers, components, steps, acts, or groups.

[0234] It is also understood that the examples and embodiments described herein are for illustrative purposes only and that various modifications or changes in light thereof will be suggested to persons skilled in the art and are to be included within the spirit and purview of this application and scope of the appended claims.

[0235] All patents, patent applications, and other publications, including GenBank Accession Numbers or similar sequence identification numbers, cited in this application are incorporated by reference in the entirety of their contents for all purposes.

Claims

1.A computer-implemented method of training a random forest model to predict a presence of autism spectrum disorder (ASD) in a subject, the method comprising:obtaining a training dataset including:identifying a set of microbial markers;abundance measurements of a first cohort of subjects with ASD across the set of microbial markers; andabundance measurements of a second cohort of subjects without ASD across the set of microbial markers;dividing the training dataset into k subsets;training k candidate random forest models by, for each of the k subsets:generating a validation dataset comprising one of the k subsets and a training subset comprising a remaining k-1 of the k subsets;training a candidate random forest model of the k candidate random forest models using the training subset; andassessing the candidate random forest model using the validation dataset by computing performance metrics for the candidate random forest model;evaluating the k candidate random forest models by computing an area under curve (AUC) value for each of the k candidate random forest models; anddeploying one of the k candidate random forest models as the trained random forest model based on one of the k candidate random forest models having a maximum AUC value.2.The computer-implemented method of claim 1, wherein training the candidate random forest model using the training subset includes:generating n groups of the training subset by sampling, from the training subset (i) subjects from the first and second cohorts of subjects and (ii) microbial markers from the set of microbial markers; andconstructing n decision trees using the n groups of the training subset, the n decision trees forming the candidate random forest model.3.The computer-implemented method of claim 2, wherein the subjects from the first and second cohorts of subjects are sampled with replacement, and wherein the microbial markers from the set of microbial markers are sampled with replacement.4.The computer-implemented method of claim 2, wherein the subjects from the first and second cohorts of subjects are randomly sampled, and wherein the microbial markers from the set of microbial markers are randomly sampled.5.The computer-implemented method of claim 1, wherein the performance metrics include one or more of: a total of false positives, a total of true positives, a total of false negatives, a total of true negatives.6.The computer-implemented method of claim 1, wherein the k candidate random forest models have a first set of hyperparameters, wherein the computer-implemented method further comprises:training k second candidate random forest models having a second set of hyperparameters different than the first set of hyperparameters; andevaluating the k second candidate random forest models by computing an AUC value for each of the k second candidate random forest models;wherein one of the k candidate random forest models or one of the k second candidate random forest models is deployed as the trained random forest model based on one of the k candidate random forest models or one of the k second candidate random forest models having the maximum AUC value.7.The computer-implemented method of claim 6, wherein a set of hyperparameters corresponding to one of the k candidate random forest models or one of the k second candidate random forest models having the maximum AUC value is used to retrain the random forest models using the whole reference dataset, and is deployed as the trained random forest model.8.The computer-implemented method of claim 6, further comprising:training k third candidate random forest models having a third set of hyperparameters different than the first set of hyperparameters and the second set of hyperparameters; andevaluating the k third candidate random forest models by computing an AUC value for each of the k third candidate random forest models;wherein one of the k candidate random forest models, one of the k second candidate random forest models, or one of the k third candidate random forest models is selected as the trained random forest model based on one of the k candidate random forest models, one of the k second candidate random forest models, or one of the k third candidate random forest models having the maximum AUC value.9.The computer-implemented method of claim 6, wherein the first set of hyperparameters and the second set of hyperparameters differ in at least one of the following:a quantity of decision trees in respective candidate random forest models;a maximum number of nodes in the decision trees in the respective candidate random forest models;a maximum or a minimum quantity of sampled subjects from the first and second cohorts of subjects used to construct the decision trees in the respective candidate random forest models; ora maximum or a minimum quantity of sampled microbial markers from the set of microbial markers used to construct the decision trees in the respective candidate random forest models.10.The computer-implemented method of claim 1, further comprising:comparing the AUC value for each of the k candidate random forest models to identify the maximum AUC value.11.The computer-implemented method of claim 1, wherein obtaining the training data includes:obtaining a reference dataset; anddividing the reference dataset into the training dataset and a test dataset, wherein the test dataset is used to evaluate the k candidate random forest models.12.The computer-implemented method of claim 1, wherein the abundance measurements for the first and second cohorts of subjects are relative abundance measurements.13.The computer-implemented method of claim 1, wherein the k candidate random forest models have a set of hyperparameters comprising:10 to 500 decision trees;1 to 5 nodes in the decision trees;70%to 80%of subjects from the first and second cohorts of subjects used to construct the decision trees in the respective candidate random forest models; and5 to 50 sampled microbial markers from the set of microbial markers used to construct the decision trees in the respective candidate random forest models.14.A non-transitory computer-readable medium comprising instructions that, when executed by one or more processors, cause the one or more processors to perform a method of training a random forest model to predict a presence of autism spectrum disorder (ASD) in a subject, the method comprising:obtaining a training dataset including:identifying a set of microbial markers;abundance measurements of a first cohort of subjects with ASD across the set of microbial markers; andabundance measurements of a second cohort of subjects without ASD across the set of microbial markers;dividing the training dataset into k subsets;training k candidate random forest models by, for each of the k subsets:generating a validation dataset comprising one of the k subsets and a training subset comprising a remaining k-1 of the k subsets;training a candidate random forest model of the k candidate random forest models using the training subset; andassessing the candidate random forest model using the validation dataset by computing performance metrics for the candidate random forest model;evaluating the k candidate random forest models by computing an area under curve (AUC) value for each of the k candidate random forest models; anddeploying one of the k candidate random forest models as the trained random forest model based on one of the k candidate random forest models having a maximum AUC value.15.The non-transitory computer-readable medium of claim 14, wherein training the candidate random forest model using the training subset includes:generating n groups of the training subset by sampling, from the training subset (i) subjects from the first and second cohorts of subjects and (ii) microbial markers from the set of microbial markers; andconstructing n decision trees using the n groups of the training subset, the n decision trees forming the candidate random forest model.16.The non-transitory computer-readable medium of claim 15, wherein the subjects from the first and second cohorts of subjects are sampled with replacement, and wherein the microbial markers from the set of microbial markers are sampled with replacement.17.The non-transitory computer-readable medium of claim 15, wherein the subjects from the first and second cohorts of subjects are randomly sampled, and wherein the microbial markers from the set of microbial markers are randomly sampled.18.The non-transitory computer-readable medium of claim 14, wherein the performance metrics include one or more of: a total of false positives, a total of true positives, a total of false negatives, a total of true negatives.19.A system comprising:one or more processors; anda computer-readable medium comprising instructions that, when executed by one or more processors, cause the one or more processors to perform a method of training a random forest model to predict a presence of autism spectrum disorder (ASD) in a subject, the method comprising:obtaining a training dataset including:identifying a set of microbial markers;abundance measurements of a first cohort of subjects with ASD across the set of microbial markers; andabundance measurements of a second cohort of subjects without ASD across the set of microbial markers;dividing the training dataset into k subsets;training k candidate random forest models by, for each of the k subsets:generating a validation dataset comprising one of the k subsets and a training subset comprising a remaining k-1 of the k subsets;training a candidate random forest model of the k candidate random forest models using the training subset; andassessing the candidate random forest model using the validation dataset by computing performance metrics for the candidate random forest model;evaluating the k candidate random forest models by computing an area under curve (AUC) value for each of the k candidate random forest models; anddeploying one of the k candidate random forest models as the trained random forest model based on one of the k candidate random forest models having a maximum AUC value.20.The system of claim 19, wherein training the candidate random forest model using the training subset includes:generating n groups of the training subset by sampling, from the training subset (i) subjects from the first and second cohorts of subjects and (ii) microbial markers from the set of microbial markers; andconstructing n decision trees using the n groups of the training subset, the n decision trees forming the candidate random forest model.

Images