Use of condensation-promoting factor in regulating lipid homeostasis

Abstract

Methods, compounds, and compositions for promoting cellular COPII condensation, regulating plasma lipid in a subject, or treating or preventing diseases, disorders or conditions related to or resulted from dyslipidemia, chylomicron retention disease, or symptoms thereof.

Description

USE OF CONDENSATION-PROMOTING FACTOR IN REGULATING LIPID HOMEOSTASIS

[0001] CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] The present application claims the priority of a PCT patent application filed on September 8, 2023, with the application number PCT / CN2023 / 117698, entitled “USE OF CONDENSATION-PROMOTING FACTOR IN REGULATING LIPID HOMEOSTASIS” .FIELD OF THE INVENTION

[0003] The present disclosure belongs to the field of lipid regulation. Specifically, the present invention relates to a method and a composition of regulating circulating lipids by regulating the level of condensation-promoting factor, such as manganese ion.BACKGROUND

[0004] Precise control of circulating lipids, particularly in the number of lipid-ferrying lipoproteins, is instrumental in health and disease. The COPII complex prioritizes the secretion of lipoproteins into the circulation, via self-constrained condensation that balances assembly and dynamics for maximal outputs. Nevertheless, means to regulate biomolecular condensation for pivotal physiological outcomes or disease treatment remains limited.

[0005] Atherosclerotic cardiovascular diseases (ASCVD) and related metabolic complications continue to rank as the top killer in modern society, despite much progress in the understanding of their etiology and in the development of therapeutics. Dyslipidemia represents the most common risk factor for ASCVD and a major therapeutic target. Bulk lipids including triglycerides and cholesterol are ferried into the bloodstream via APOB-containing lipoproteins, which are initially assembled in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) before embarking on the secretory pathway en route into the circulation. Of note, elevated numbers of circulating APOB-containing lipoproteins, compared to increased blood lipids per se, confer higher CVD risks. However, precise control of the secretory program of lipoproteins into the circulation remains to be fully elucidated, especially compared to our understanding of lipoprotein uptake and clearance from the circulation.

[0006] The coater complex II (COPII) gates the entry into the secretory pathway at the ER surface, producing transport vesicles to shuttle numerous cargos with drastic qualitative and quantitative differences. COPII assembly and cargo packaging are initiated upon the activation of the small GTPase SAR1, which recruits the inner-coat heterodimer SEC23 / SEC24, followed by the outer-coat heterotetramer SEC31 / SEC13 that interacts with the inner coat. While SAR1 directly interacts with SEC23, SEC24 binds transmembrane cargos or cargo receptors that mediate selective transport events. Consistent with this general paradigm, the SAR1 paralog SAR1B pairs with the COPII cargo receptor SURF4 to drive a high-capacity yet selective ER exit program for lipoproteins. Moreover, mutations in SAR1B causes the rare disease Chylomicron Retention Disease (CMRD) in patients, whereas genetic polymorphisms of SURF4 strongly associate with plasma lipid levels in human populations, together highlighting the relevance of lipoprotein secretion to human diseases.

[0007] The cargo-selecting COPII subunit SEC24 contain poorly characterized intrinsically disordered regions (IDRs) , which could undergo dynamic and multi-valent interactions to drive protein condensation and to facilitate cellular organization and biological reactions. For lipoprotein transport, the COPII complex is able to undergo a self-constrained condensation in an IDR dependent manner, thereby maximizing the efficiency for coat assembly while maintaining optimal dynamics for vesicle production. Moreover, the unconventional mechanism is exploited genetically in humans at the level of SEC16A, which defines a dosage-sensitive secretory program to selectively mediate lipoprotein transport from general secretion. Nevertheless, effective means to precisely regulate the condensation-based lipoprotein delivery to achieve lipid control remains limited, especially in physiological or even pathological conditions.

[0008] Cardiovascular diseases (CVDs) and related metabolic disorders continue to rank as the leading cause of human mortality, causing >20 million deaths per year worldwide. Hyperlipidemia, or elevated circulating lipid levels, stands out as the primary risk factor of CVDs, notably through the inception of atherosclerosis. While the formation of atherosclerotic plaques is a protracted process, however, unstable plaques are prone to rupture and hemorrhage, initiating acute thrombosis that may trigger life-threatening myocardial infarction or stroke. Of note, atherosclerotic plaques in their nascent stages frequently remain clinically “silent” , therefore often evade patient awareness. Given this context, effective means to safely reverse the existing atherosclerotic plagues assumes great therapeutic significance. Regrettably, such approaches remain to be established to date, representing a major unmet medical need.SUMMARY OF THE INVENTION

[0009] The present disclosure is based, in part, upon the discovery of a novel regulation and its potential therapeutic translation of the condensation-dependent mechanism of COPII transport, which can be hijacked upon adenoviral infection. Biochemical reconstitution and purification identified divalent manganese as an unexpected mediator that regulates COPII. Mechanistically, manganese directly binds SEC23 / 24 and promotes its condensation in vitro and in cells, thereby tipping the assembly-versus-dynamics balance of COPII to selectively impact lipoprotein transport. Moreover, manganese can be mobilized from the mitochondria store to spatially regulate COPII on the ER surface and consequently modulate lipid metabolism, in a manner involving the mitochondria calcium uniporter (MCU) . Of particular note, titrating dietary manganese treats lipid disorders in both rare disease and the common atherogenic models, supporting translation of the discovery on fundamental biology into treatment of prevalent, life-threating diseases. The present inventors have collected evidence supporting the therapeutic potential of dietary manganese supplementation in vivo using murine models of dyslipidemia and atherosclerosis. Daily gavage of manganese enabled quantitative regulation of plasma lipids, exhibiting a unique bell-shape response. Consequently, dietary titration of manganese enabled tailored treatment for both the rare disease CMRD and the common hyperlipidemia. Moreover, during the course of the study, mice treated with manganese at all doses appeared grossly healthy, suggesting desirable safety of the treatment. Of particular note, the extensive lipid-lowering effects by manganese led to a remarkable reversal of atherosclerotic plaques. Hence, the present inventors provide a novel mean for treating pathological dyslipidemia and combatting CVD, which has been proven to be simple, effective and safe.

[0010] Therefore, in a first aspect, the present application provides a method of modulating plasma lipid in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of condensation-promoting factor, preferably manganese, more preferably divalent manganese.

[0011] In a second aspect, the present application provides a method of treating or preventing dyslipidemia in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of condensation-promoting factor, preferably manganese, more preferably divalent manganese.

[0012] In a third aspect, the present application provides a method of treating or preventing a disease, disorder or condition related to or resulted from dyslipidemia in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of manganese, preferably divalent manganese. For example, the disease, disorder or condition related to or resulted from dyslipidemia can be cardiovascular disease (CVD) , particularly atherosclerotic cardiovascular disease (ASCVD) . For example, the disease, disorder or condition related to or resulted from dyslipidemia is a metabolic disorder.

[0013] In a fourth aspect, the present application provides a method of treating chylomicron retention disease (CMRD) , comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of condensation-promoting factor, preferably manganese, more preferably divalent manganese.

[0014] In a fifth aspect, the present application provides a method of promoting cellular COPII condensation in a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of manganese, preferably divalent manganese.

[0015] In a six aspect, the present application provides a composition for modulating plasma lipid, comprising manganese, preferably divalent manganese. Said composition is for use of modulating plasma lipid in a subject.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0016] The following is a brief description of the drawings, which are presented for the purposes of illustrating the exemplary embodiments disclosed herein and not for the purposes of limiting the same.

[0017] Fig. 1A shows plasma triglyceride levels in control or adenovirus-infected Sar1b LKO, WT, and Surf4 LKO mice, respectively. Mice with indicated genotypes were infected with 0.5 OD of replication-defective adenovirus serotype 5 (Adv) or PBS (CTL) . Data are shown as mean ± SEM. ****: P < 0.0001. n.s.: not significant.

[0018] Fig. 1B shows plasma LDL-cholesterol levels in control or adenovirus-infected Sar1b LKO, WT, and Surf4 LKO mice, respectively. Samples from (A) were measured. Data are shown as mean ± SEM. *: P < 0.05. ****: P < 0.0001. n.s.: not significant.

[0019] Fig. 1C shows theoretic models depicting COPII output in lipid transport as a function of condensation in different mice with the indicated genotypes.

[0020] Fig. 2A shows Adv infection decreases plasma triglycerides in WT mice in a dose dependent manner. Data are presented as mean ± SEM. *: P < 0.05.

[0021] Fig. 2B shows that Adv infection decreases plasma triglycerides in WT mice in a dose dependent manner. Data are presented as mean ± SEM. *: P < 0.05.

[0022] Fig. 2C shows that Adv infection does not affect plasma triglycerides in Surf4 LKO mice. n.s.: not significant.

[0023] Fig. 3A shows the triglyceride level of plasma samples from Sar1b LKO mice infected with PBS (CTL) or 0.5 OD of Adv and fractionated into VLDL, LDL and HDL, prior to triglycerides measurement.

[0024] Fig. 3B shows the cholesterol level of plasma samples from Sar1b LKO mice infected with PBS (CTL) or 0.5 OD of Adv and fractionated as in Fig. 3A, prior to cholesterol measurement.

[0025] Fig. 3C shows the triglyceride level of plasma samples from WT mice infected with PBS (CTL) or 0.5 OD of Adv and fractionated as in Fig. 3A, prior to triglycerides measurement.

[0026] Fig. 3D shows the cholesterol of plasma samples from WT mice infected with PBS (CTL) or 0.5 OD of Adv and fractionated as in Fig. 3A, prior to cholesterol measurement.

[0027] Fig. 4A shows representative EM negative staining images of plasma lipoproteins purified fromSar1b LKO mice infected with PBS (CTL) or 0.5 OD of Adv.

[0028] Fig. 4B shows representative EM negative staining images of plasma lipoproteins purified from WT mice infected with PBS (CTL) or 0.5 OD of Adv.

[0029] Fig. 5A shows IB analysis of plasma sample from mice with indicated genotypes and treatments. Representative of three independent experiments is shown.

[0030] Fig. 5B shows quantification of IB signals in (G) . Data are presented as mean ± SEM. **: P < 0.01; ***: P < 0.001; ****: P < 0.0001; n.s.: not significant.

[0031] Fig. 5C shows IB of liver samples from mice with the indicated genotypes and treatments. Representative with three independent experiments is shown.

[0032] Fig. 5D shows quantification of IB signals in Fig. 5C. Data are shown as mean ± SEM. **: P < 0.01; ***: P < 0.001; ***: P < 0.0001; n.s.: not significant.

[0033] Fig. 6 is schematic illustration of genetic pathway of SAR1B, COPII and SURF4 in lipid transport, with the regulation on COPII via a putative mediator of Adenovirus.

[0034] Fig. 7A shows confocal images of SEC24A coalescence on primary hepatocytes treated with or without adenovirus. The nucleus is highlighted with a yellow dashed line. Lower: 3D reconstruction of a zoomed-in view of the white box. Scale bar = 5 μm.

[0035] Fig. 7B shows quantification of the integrated signals of SEC24A coalescence acquired by confocal microscopy. Related to Fig. 1 (D) . ****: P < 0.0001.

[0036] Fig. 8 shows that liver cytosol from Adv-infected mice enhances SEC23 / 24 phase separation in vitro. Left: Schematic of in vitro SEC23 / 24 liquid droplet assay with hepatic cytosol extracted from PBS (CTL) or Adv-infected WT mice. 6 μM of recombinant SEC23A / SEC24A was used.

[0037] Fig. 9 shows isolation of “condensation promoting factor (CP-factor) ” of SEC23 / 24 condensation from adenovirus-infected liver cytosol. Fractions from each step were incubated with 6 μM of SEC23A / SEC24A, followed by microscopy imaging. Lower panels: summary of CP activity in the indicated fractions based on the degree of SEC23 / 24 condensation.

[0038] Fig. 10A is microscopy images showing that the CP-factor in cytosol extracted from Adv infected liver is resistant to Proteinase K (PK) treatment or Benzonase treatment.

[0039] Fig. 10B is microscopy images showing fractions from each step in Fig. 10A incubated with 6 μM of SEC23A / SEC24A before microscopy imaging. Scale bar = 5 μm.

[0040] Fig. 11A shows elevation of manganese (Mn) concentration in Adv-infected hepatic cytosol. Cytosol extracted from CTL or Adv-infected liver were digested with HNO3, followed by ICP-MS.

[0041] Fig. 11B shows Ca2+ concentrations in cytosol extracted from CTL or Adv infected mouse liver, which are estimated by o-cresolphthalein complexone based colorimetric assay.

[0042] Fig. 11C shows metal abundance in cytosol extracted from CTL or Adv-infected liver, measured by ICP-MS.

[0043] Fig. 12 shows IB analysis of TMEM165 in mouse primary hepatocytes treated with 500 μM of indicated metal for 4 hours. Representative of three independent experiments is shown.

[0044] Fig. 13A shows that Adenovirus induces degradation of the cytosolic manganese sensor TMEM165. Twelve hours post Adv infection, primary hepatocytes were permeabilized by digitonin in the absence or presence of EDTA, followed by cultured for 12 hours in fresh medium. Cell lysates were subjected to IB with the indicated antibodies following SDS-PAGE. Representative results from three independent experiments were shown.

[0045] Fig. 13B shows that extracellular EDTA minimally restores TMEM165 levels in cells infected with Adv. WT primary hepatocytes were infected with Adv at MOI = 16.12 hours post infection, EDTA was added to the medium, followed by another 12 hours-culture. Primary hepatocytes treated with 500 μM MnCl2 is a positive control for TMEM165 degradation. Representative of three independent experiments is shown.

[0046] Fig. 14A shows confocal images of SEC24A coalescence in primary hepatocytes treated with or without 500 μM of MnCl2 for 4 hours. The nucleus is highlighted with a yellow dashed line. Lower: 3D reconstruction of a zoomed-in view of the white box. Scale bar = 5 μm.

[0047] Fig. 14B shows quantification of the integrated signals of SEC24A coalescence acquired by confocal microscopy. Related to Fig. 1 (J) . ****: P < 0.0001.

[0048] Fig. 15 shows confocal images of endogenous SEC24A treated with or without 500 μM of MnCl2. EGFP is knocked in at the N terminus of SEC24A in Huh7.5 cells.

[0049] Fig. 16A shows that Mn2+ promotes SEC23 / 24 phase separation in vitro. Recombinant SEC23A / 24A (8 μM) were incubated with MnCl2 at the indicated concentration, followed by microscopy imaging. Scale bar = 5 μm.

[0050] Fig. 16B shows that Ca2+ and Mg2+ shows no effect on SEC23 / 24 condensation in vitro. Scale bar = 5 μm. Recombinant SEC23A / 24A (8 μM) were incubated with 1mM of MnCl2, 1mM of CaCl2 or 1mM of MgCl2. Scale bar = 5 μm.

[0051] Fig. 17 shows phase diagram of SEC23 / 24 condensation at different concentrations of the protein and MnCl2, respectively.

[0052] Fig. 18 shows direct interaction between recombinant SEC23A / SEC24A and Mn2+immobilized on the IMAC beads, visualized by Coomassie Blue staining following SDS-PAGE.

[0053] Fig. 19 shows quantitative assessment of the interaction between Mn2+ and SEC23A / 24A, SEC23A / ΔIDRSEC24A or IDR of SEC24A by ITC.

[0054] Fig. 20 shows absence of detectable binding between the indicated regent pairs measured by ITC.

[0055] Fig. 21 shows the binding of Mn2+ with the indicated SEC23A / SEC24D proteins measured by ITC.

[0056] Fig. 22 is schematic of an in vitro phase separation assay to evaluate multivalent interaction facilitated by Mn2+ coordination. IDRs are released from the MBP by protease cleavage to form protein droplets. TssS: a manganese-binding domain.

[0057] Fig. 23 shows that Mn2+ binding promotes in vitro condensation of TssS fused IDR. 10 μM of MBP protected IDR_SEC24A (upper) or TssS-IDR_SEC24A (lower) were incubated with Ppase and MnCl2 at the indicated concentration, followed by microscopy imaging. Scale bar = 5 μm.

[0058] Fig. 24A shows confocal images of SEC24A coalescence on primary hepatocytes treated with 500μM of MnCl2 for the indicated time. Scale bar = 5 μm.

[0059] Fig. 24B shows quantification of the integrated signals of SEC24A coalescence in Fig. 24A.

[0060] Fig. 25 shows confocal microscopy images showing that IDRs of SEC24 are indispensable for Mn2+ enhanced COPII coalescence. Huh7.5 cells expressing ΔIDRSEC24D or FUS-IDRSEC24D were treated with or without 500 μM MnCl2 prior to confocal microscopy. Scale bars = 5 μm.

[0061] Fig. 26 is schematic depicting Mn2+-mediated effects on the assembly-vs-dynamics balance of the COPII complex in cells.

[0062] Fig. 27A shows that Mn2+ enhances cellular interaction of SEC16A and SEC23 / 24. HEK293A cells expressing FLAG-SEC16A treated with or without 500 μM of MnCl2 were lysed and subjected to anti-FLAG IP. Representative of three independent experiments is shown.

[0063] Fig. 27B shows quantification of the co-IP signals in Fig. 27A. Data are shown as mean ± SEM. *: P < 0.05; **: P < 0.01; ****: P < 0.0001; n.s.: not significant.

[0064] Fig. 28A shows that Mn2+ hampers the mobility of SEC24 coalescence assayed by FRAP.

[0065] Fig. 28B shows quantitative analysis of Fig. 28A shown as mean ± SEM. N > 10 for each group.

[0066] Fig. 29A shows that manganese selectively inhibits APOB secretion from primary hepatocytes. IB of the medium of primary hepatocyte treated with or without 500 μM of MnCl2 for 12 hours. Representative of three independent experiments is shown.

[0067] Fig. 29B shows quantification of IB signals in Fig. 29A. Data are shown as mean ± SEM. **: P < 0.01; n.s.: not significant.

[0068] Fig. 30A shows that manganese selectively retains APOB in primary hepatocytes. IB of cell lysates from primary hepatocyte treated with or without 500 μM of MnCl2 for 12 hours. Representative of three independent experiments is shown.

[0069] Fig. 30B shows quantification of IB signals in Fig. 30A. Data are shown as mean ± SEM. ***: P < 0.001; n.s.: not significant.

[0070] Fig. 31A shows confocal analysis of the mitochondria (MitoTracker) in primary hepatocytes infected with or without Adv at MOI=16. Scale bar = 5 μm.

[0071] Fig. 31B shows Confocal analysis of the ER (SEC61β-RFP) , Golgi (GM130) and lysosome (LysoTracker) in primary hepatocytes infected with or without Adv at MOI=16. Scale bar = 5 μm.

[0072] Fig. 32 shows that Adenoviral infection diminishes mitochondrial membrane potential. Primary hepatocytes with the indicated treatment were labelled by TMRM and assayed by flow cytometry. Representative of three independent experiments is shown.

[0073] Fig. 33A shows adenoviral infection or FCCP (Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxy phenylhydrazone) treatment increases cytosolic Mn2+ levels measured by the Fura-2 quench assay. Primary hepatocytes infected with Adv at MOI = 16 for 24 hours or treated with 500 nM FCCP for 12 hours were loaded with Fura-2 AM, followed by fluorescence measurement. Data are shown as distribution between 5%-95%. ****: P < 0.0001.

[0074] Fig. 33B shows cytosolic Mn2+ levels determined by Fura-2 quench assay. Primary hepatocytes treated with 500 μM of MnCl2 for 12 hours were loaded with Fura-2 AM, followed by fluorescence measurement. Data are shown as distribution between 5%-95%. ****: P <0.0001.

[0075] Fig. 34 shows that Adenoviral infection or FCCP increases cytosolic Mn2+ levels measured by TMEM165 degradation. Representative of three independent experiments is shown.

[0076] Fig. 35 shows FIB-SEM tomography of Mitochondria-ER contact sites (MECS) in murine hepatocytes. Scale bar = 100 nm. Lipoproteins are pseudo-colored in yellow.

[0077] Fig. 36A shows confocal images of SEC24A coalescence on primary hepatocytes infected with Adv at MOI=16 for 24 hours or treated with 500 nM FCCP for 12 hours. Scale bar = 5 μm.

[0078] Fig. 36B shows quantification of the integrated signals of SEC24A coalescence in Fig. 36A. ****: P <0.0001.

[0079] Fig. 37 shows bell-shape regulation on the secretion of APOB by FCCP. Primary hepatocytes from WT mice were treated with the indicated dose of FCCP. APOB and albumin in the medium were analyzed by IB and normalized to the secretion level at 0 nM FCCP treatment.

[0080] Fig. 38 shows IB analysis of APOB and ALB in the medium of primary hepatocytes treated with FCCP at the indicated concentration. Representative of three independent experiments is shown.

[0081] Fig. 39A is regional plot of the MCU-MICU1 locus showing the association with plasma LDL-cholesterol level in humans. Red line indicates the threshold of genome wide significance (P = 5 x 10-8) . The lead SNP is highlighted by a red arrow.

[0082] Fig. 39B is regional plot of the MCU-MICU1 locus showing the association with plasma non-HDL-cholesterol level in humans. Red line indicates the threshold of genome wide significance (P = 5 x 10-8) . The lead SNP is highlighted by a red arrow.

[0083] Fig. 40 shows allele frequency at rs11000443. Data are obtained from the 1000 Genome Project.

[0084] Fig. 41 shows summary of the GLGC genome wide association data between the lead SNP rs11000443 and plasma lipids in humans.

[0085] Fig. 42 shows simplified schematic illustration of mitochondria Mn2+ uptake, mediated by MCU and gated by MICU1. The arrow indicates Mn2+ flux.

[0086] Fig. 43 shows normalized MICU1 expression with the indicated SNP genotypes. Data were obtained from the GTEx database.

[0087] Fig. 44A shows that loss of hepatic Mcu decreases total triglycerides. Total plasma triglycerides level in LacZ L-CRISPR or Mcu L-CRISPR mice were measured. N = 8 for each group. Data are shown as mean ± SEM. ****: P < 0.0001.

[0088] Fig. 44B shows triglyceride levels of plasma samples from mice in Fig. 44A and fractionated into VLDL, LDL, and HDL by FPLC prior to triglyceride measurements.

[0089] Fig. 45A shows that loss of hepatic Mcu decreases LDL-C. Plasma samples from Fig. 44A were measured. Data are shown as mean ± SEM. ****: P < 0.0001.

[0090] Fig. 45B shows cholesterol levels of samples from Fig. 44A fractionated as in Fig. 44B, prior to cholesterol measurements.

[0091] Fig. 46A shows that loss of hepatic Mcu decreases the plasma APOB level. APOB and ALB in plasma samples from LacZ L-CRISPR or Mcu L-CRISPR mice were analyzed by IB, followed by quantification by image J. Data are shown as mean ± SEM. ****: P < 0.0001. n.s.: not significant.

[0092] Fig. 46B shows IB analysis of plasma samples from LacZ L-CRISPR or Mcu L-CRISPR mice. related to Fig. 4 (H) . Representative of three independent experiments is shown.

[0093] Fig. 47 shows that loss of Mcu abolishes FCCP-induced TMEM165 degradation in hepatocytes. Primary hepatocytes from LacZ L-CRISPR or Mcu L-CRISPR mice were treated with 500 nM FCCP for 12 hours, lysed and followed by IB analysis of TMEM165. Data are shown as mean ± SEM. **: P < 0.01; ***: P < 0.001. n.s.: not significant.

[0094] Fig. 48 shows that cytosolic Mn2+ levels determined by Fura-2 quench assay. Primary hepatocytes with the indicated genotypes were treated with or without 500 nM FCCP for 12 hours, prior to Fura-2 AM loading, followed by fluorescence measurement. Data are shown as distribution between 5%-95%. ****: P < 0.0001. n.s.: not significant.

[0095] Fig. 49 shows that loss of Mcu abolishes FCCP-induced inhibition of APOB secretion. Primary hepatocytes with indicated genotypes were treated with or without 500 nM FCCP for 12 hours. APOB and ALB in the medium were analyzed by IB, followed by quantification by image J. Data are shown as mean ± SEM. ****: P < 0.0001. n.s.: not significant.

[0096] Fig. 50A shows IB analysis of APOB and ALB in the medium of primary hepatocytes with indicated genotypes and treatments. Representative of three independent experiments is shown.

[0097] Fig. 50B shows IB analysis of whole cell lysates of primary hepatocytes with indicated genotypes and treatments. Representative of three independent experiments is shown.

[0098] Fig. 51A shows confocal images of SEC24A coalescence in primary hepatocytes from LacZ LCRISPR or Mcu L-CRISPR mice with indicated treatments. Scale bar = 5 μm.

[0099] Fig. 51B shows quantification of integrated signals of SEC24A coalescence in Fig. 51A. Data are shown as distribution between 5%-95%. ****: P < 0.0001. n.s.: not significant.

[0100] Fig. 52A shows experiment design of treating hypolipidemia in Sar1b LKO mice with Mn2+ supplement in drinking water. Mn-deficient CD: chow diet with manganese content less than 1 ppm.

[0101] [Rectified under Rule 91, 03.12.2024]Figs. 52B-C show that Mn2+ supplement restores plasma triglycerides and cholesterol in a dose dependent manner in Sar1b LKO mice, but not Surf4 LKO mice. Data are presented as mean ± SEM. ****: P<0.0001 by one-way ANOVA test. #: P < 0.05; ##: P < 0.01 by the posthoc test of Tukey. X-axis: manganese doses in the drinking water.

[0102] Fig. 53A shows IB of plasma samples from Mn-supplemented Sar1b LKO mice in Fig. 52A. Representative of three independent experiments is shown.

[0103] Fig. 53B shows quantification of IB signals in (A) . Data are shown as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. #: P < 0.05; ##: P < 0.01; ###: P < 0.001 by the posthoc test of Tukey.

[0104] Fig. 54A shows that Mn2+ supplement exhibits a dose-dependent alleviation if hepatic lipid accumulation induced by Sar1b inactivation. Upper, H&E staining; lower, oil red O staining (ORO) .

[0105] Fig. 54B shows histology of extra-hepatic tissues from Mn-supplemented Sar1b LKO mice.

[0106] Fig. 55 shows a summary of the selective impact of circulating lipids as a function of manganese regulation on COPII condensation in different genetic models.

[0107] Fig. 56 shows experiment design of treating hyperlipidemia using Mn2+ supplemented in drinking water, in mice receiving AAV-hPCSK9 and Mn-deficient WD. Mn-deficient WD: Western Diet with manganese content less than 1 ppm.

[0108] Fig. 57 A shows a bell-shaped plasma triglyceride level as a function of increasing Mn2+dose in drink. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. ##: P < 0.01; ###: P < 0.001 by the posthoc test of Tukey. X-axis: manganese doses in the drinking water.

[0109] Fig. 57B shows a bell-shaped plasma cholesterol level as a function of increasing Mn2+dose in drink. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. ##: P < 0.01; ###: P < 0.001; ####: P < 0.0001 by the posthoc test of Tukey. X-axis: manganese doses in the drinking water.

[0110] Fig. 58A shows triglyceride level of plasma samples in Fig. 56 fractionated into VLDL, LDL and HDL by FPLC, prior to triglyceride measurement.

[0111] Fig. 58B shows cholesterol level of plasma samples in Fig. 56 fractionated as in Fig. 58A, prior to cholesterol measurement.

[0112] Fig. 59A shows a bell-shape curve of plasma LDL-TG levels as a function of increasing Mn2+ dose in drink. Plasma samples in Fig. 56 are fractionated by FPLC, followed by triglyceride measurement and quantification using the area under curve (AUC) .

[0113] Fig. 59B shows a bell-shape curve of plasma LDL-CHOL levels as a function of the increasing Mn2+ dose in drink. Plasma samples are fractionated as in Fig. 59A, followed by cholesterol measurement and quantification.

[0114] Fig. 60 shows IB of plasma samples from Mn-supplemented hyperlipidemia mice in Fig. 56. Representative of three independent experiments is shown.

[0115] Fig. 61A shows representative images of atherosclerosis plaques in mice from Fig. 56.

[0116] Fig. 61B shows quantification of atherosclerotic lesion regions in Fig. 61A. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. ####: P < 0.0001 by the posthoc test of Tukey. X-axis: manganese doses in the drinking water.

[0117] Fig. 62 shows hepatic Mn concentration in mice from Fig. 56 determined by ICP-MS. The red dashed line indicates the level of hepatic manganese content in mice fed on normal manganese-containing diets.

[0118] Fig. 63 shows plasma AST and ALT levels in mice from Fig. 56. Data are presented as mean ± SEM. ***: P<0.001; ****: P < 0.0001; n.s.: not significant. X-axis: manganese doses in the drinking water.

[0119] [Rectified under Rule 91, 03.12.2024]Figs. 64A-E shows results of a study in human showing the correlation between plasma manganese and circulating cholesterol level. (A) Summary of basic parameters in human samples (B) Negative correlation between plasma manganese concentrations and total circulating cholesterol levels in healthy humans aged at 21-45y (N=281) . (C) Negative correlation between plasma manganese concentrations and the atherogenic LDL-cholesterol levels in healthy humans aged at 21-45y (N=281) . (D) Elevated circulating manganese was associated with lower total circulating cholesterol in healthy humans. Samples in (B) were grouped by manganese concentration from the lower end (N=100) or from the higher end (N=100) , respectively. Data are presented with violin plots. **, P<0.01. (E) Elevated circulating manganese was associated with lower the atherogenic LDL cholesterol in healthy humans. Samples in (C) were grouped by manganese concentration from the lower end (N=100) or from the higher end (N=100) , respectively. Data are presented with violin plots. ***, P<0.001.

[0120] Figs. 65a-i show that manganese regulates plasma lipid levels in wild type adult mice. (a) Experimental design of daily gavage of Mn2+ in wild type mice on normal chow. (b) Bell-shape regulation of plasma triglyceride levels by oral Mn2+ supply. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. ##: P < 0.01; ###: P < 0.001 by the posthoc test of Tukey. X-axis: manganese doses (mg / kg / day) . (c) Bell-shape regulation of plasma LDL-cholesterol levels by oral Mn2+ supply. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. #: P < 0.05 by the posthoc test of Tukey. X-axis: manganese doses (mg / kg / day) . (d) Pooled plasma samples in (a) were fractionated into VLDL, LDL and HDL by FPLC, followed by triglyceride measurement. Results of mice receiving 0, 5, 20 mg / kg Mn2+were presented. (e) Quantification of APOB-containing VLDL and LDL triglyceride levels acquired by FPLC as in (d) . (f) Pooled plasma samples in (a) were fractionated as in (d) , followed by cholesterol measurement. Results of mice receiving 0, 5, 20 mg / kg Mn2+ were presented. (g) Quantification of APOB-containing VLDL and LDL cholesterol levels acquired by FPLC as in (f) (h) Bell-shape regulation of plasma APOB levels by oral Mn2+ supply. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. ##: P < 0.01; ###: P < 0.001 by the posthoc test of Tukey. X-axis: manganese doses (mg / kg / day) . (i) IB analysis of plasma samples from mice with indicated doses of Mn2+ daily intake. Representative of three independent experiments is shown.

[0121] Figs. 66a-e show that manganese regulates plasma lipid levels in wild type adult mice. (a) Fraction of mice surviving after intragastric (i. g. ) administration of Mn2+ at the indicated dose (n=4 mice per dose) . (b) Plasma Mn2+ concentration-time curve following i. g. administration of 30 mg / kg body weight to mice. (c) Hepatic Mn2+ concentration-time curve following i. g. administration of 30 mg / kg body weight to mice. (d) Body weights of the mice with indicated doses of Mn2+ daily intake. Data are presented as mean ± SEM. n.s.: not significant. X-axis: manganese doses (mg / kg / day) . (e) Bell-shape regulation of plasma cholesterol levels by oral Mn2+ supply. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. ##: P < 0.01 by the posthoc test of Tukey. X-axis: manganese doses (mg / kg / day) .

[0122] Figs 67a-i show that manganese enables safe and selective regulation of blood lipid secretion. (a) Principal component analysis of mRNA profiles in the liver samples from mice with Mn2+ administration at indicated doses. N=3 for each group. (b) Volcano plots of mRNA expression on the liver samples from vehicle control and the 20mg / kg group. N=3 for each group. (c-f) GSEA enrichment analysis of mRNA expression profiles in the liver sample from vehicle control and the 20mg / kg group. (g) IB of liver samples from mice with indicated doses of Mn2+supply. Representative of three independent experiments is shown. (h) Histology on liver samples from vehicle control mice or mice receiving Mn2+ gavage at indicated doses. Scale bar=100μm (i) Plasma ALT and AST levels in control mice or mice receiving Mn2+ gavage at indicated doses. n.s.: not significant.

[0123] Figs. 68a-e show that manganese enables safe and selective regulation of blood lipid secretion. (a) Hepatic TG in the mice with indicated doses of Mn2+ daily intake. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. (b) Hepatic cholesterol in the mice with indicated doses of Mn2+ daily intake. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. (c) Histology of extra-hepatic tissues from the mice with indicated doses of Mn2+ daily intake. Scale bar=100μm. (d) Plasma CK levels in control mice or mice receiving Mn2+ gavage at indicated doses. n.s.: not significant. (e) Plasma ketone levels in control mice or mice receiving Mn2+ gavage at indicated doses. n.s.: not significant.

[0124] Fig. 69a-j show that dietary manganese titration treats hypolipidemia in rare lipid disorders. (a) Experimental design of treating hypolipidemia in Sar1b LKO mice with Mn2+supplemented in drink. (b) Mn2+ supplement restores plasma triglyceride level in a dose dependent manner in Sar1b LKO mice. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. #: P < 0.05; ##: P < 0.01 by the posthoc test of Tukey. (c) Mn2+supplement restores plasma cholesterol level in a dose dependent manner in Sar1b LKO mice. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. #: P < 0.05; ##: P < 0.01 by the posthoc test of Tukey. (d) Pooled plasma samples in (a) were fractionated into VLDL, LDL and HDL by FPLC, followed by triglyceride measurement. (e) Pooled plasma samples in (a) were fractionated as in (d) , followed by cholesterol measurement. (f) IB analysis of plasma samples from Mn-supplemented Sar1b LKO mice in (a) . Representative of three independent experiments is shown. (g) IB analysis of liver lysates from Mn-supplemented Sar1b LKO mice in (a) . Representative of three independent experiments is shown. (h) H&E and Oil Red O staining of liver slices from mice in (a) . scale bar=100μm. (i) Mn2+ supplement leads to a dose-dependent alleviation of hepatic triglyceride accumulation in Sar1b LKO mice. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. (j) Mn2+ supplement leads to a dose-dependent alleviation of hepatic triglyceride accumulation in Sar1b LKO mice. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. (k) Mn2+ supplement leads to a dose-dependent alleviation of hepatic cholesterol accumulation in Sar1b LKO mice. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test.

[0125] Figs. 70a-b show that dietary manganese titration treats hypolipidemia in rare lipid disorders. (a) Mn2+ supplement restores plasma LDL-cholesterol level in a dose dependent manner in Sar1b LKO mice. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. ####: P < 0.0001 by the posthoc test of Tukey. (b) Histology of extra-hepatic tissues from Mn-supplemented Sar1b LKO mice. Scale bar=100μm.

[0126] Figs. 71a-i show that dietary manganese titration treats pathological hyperlipidemia. (a) Experimental design of treating pathological hyperlipidemia using Mn2+ supplemented in drink. (b) Plasma cholesterol levels of mice with pathogenic induction before (baseline) and after Mn2+treatment. Data are presented as mean ± SEM. ***: P < 0.001; ****: P < 0.0001 by paired Student’s t test. n.s.: not significant. (c) Percentage changes in plasma cholesterol levels from baseline by Mn2+ treatment in (b) . Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. #: P < 0.05; ##: P < 0.01; ###: P < 0.001 by the posthoc test of Tukey. (d) Plasma LDL-C levels of mice with pathogenic induction before (baseline) and after Mn2+treatment. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by paired Student’s t test. n.s.: not significant. (e) Percentage changes in LDL-C levels from baseline by Mn2+ treatment in (d) . Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. ##: P < 0.01; ###: P < 0.001 by the posthoc test of Tukey. (f) Pooled plasma samples of vehicle or Mn2+ treated mice were fractionated into VLDL, LDL and HDL by FPLC, followed by triglyceride measurement. (g) Pooled plasma samples of vehicle or Mn2+ treated mice were fractionated as in (f) , followed by cholesterol measurement. (h) Dose dependent reduction in plasma APOB by Mn2+ treatment in hyperlipidemic mice. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. ##: P < 0.01; ###: P < 0.001 by the posthoc test of Tukey. (i) Plasma ALT and AST levels of vehicle or Mn2+ treated mice. Data are presented as mean ± SEM. ****: P <0.0001 by one-way ANOVA test. ###: P < 0.001; ####: P < 0.0001 by the posthoc test of Tukey.

[0127] Figs. 72a-i show that dietary manganese titration treats pathological hyperlipidemia. (a-d) validation of hyperlipidemia in mice receiving AAV-PCSK9 and Western Diet. Related to Fig. 71a. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by two tailed Student’s t-test. (e) Plasma triglyceride levels of mice with pathogenic induction before (baseline) and after Mn2+treatment. Data are presented as mean ± SEM. **: P < 0.01; ****: P < 0.0001 by paired Student’s t test. n.s.: not significant. (f) Changes in plasma triglyceride levels from baseline to the analysis time point after Mn2+ treatment in (d) . Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. ##: P < 0.01 by the posthoc test of Tukey. (g) Quantification of APOB-containing LDL triglyceride levels acquired by FPLC in (Fig. 71f) (h) Quantification of APOB-containing LDL cholesterol levels acquired by FPLC in Fig. 71g (i) Plasma CK levels in control mice or mice receiving Mn2+ gavage at indicated doses. n.s..: not significant. (j) Plasma ketone levels in control mice or mice receiving Mn2+ gavage at indicated doses. n.s.: not significant.

[0128] Figs. 73a-f show that dietary manganese titration enables plaque reversal. (a) Experimental design of treating atherosclerosis using Mn2+ supplemented in drink. (b) Representative images of en face Oil Red O staining of aorta from mice at baseline and after vehicle or Mn2+ treatment. (c) Dose dependent reduction in atherosclerosis by Mn2+ treatments revealed by quantification of plaque areas in (b) . Data are presented as mean ± SEM. ****: P <0.0001 by one-way ANOVA test. #: P < 0.05; ###: P < 0.001 by the posthoc test of Tukey. (d) Atherosclerosis regression curves as response to Mn2+ treatments. Data are presented as mean ±SEM. (e) Plasma MPO levels of mice receiving Mn2+ treatments at indicated doses. Data are presented as mean ± SEM. ****: P < 0.0001 by one-way ANOVA test. ###: P < 0.001; ####: P < 0.0001 by the posthoc test of Tukey. (f) Plasma CRP levels of mice receiving Mn2+ treatments at indicated doses. Data are presented as mean ± SEM. **: P < 0.01 by one-way ANOVA test. #: P < 0.05; ###: P < 0.001 by the posthoc test of Tukey.

[0129] Fig. 74 shows the validation of atherosclerotic plaque formation after pathogenic induction using 4 independent approaches.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0130] I. Definition

[0131] The term “circulating lipid” refers to lipids circulating in the blood of a subject.

[0132] The term “modulating” refers both up-regulation and down-regulation of, for example, plasma lipid or circulating lipid. It should be understood that up-regulation of certain types of lipids may occur along with down-regulation of other types of lipids. In some instances, the term “modulating” , “regulating” and “adjusting” can be used interchangeably.

[0133] The term “condensation promoting factor” refers to a factor that promotes COPII condensation in vivo.

[0134] The term “therapeutically effective amount" of an active agent refers to an amount required for at least partially attain a desired response.

[0135] II. Lipid regulation

[0136] In the present application, a novel method for regulating circulating lipids is being described. The method of the present application is partially based on a discovery of the inventors that condensation-promoting factors, in particular divalent manganese, play an essential role in modulating lipid metabolism by tuning the COPII condensation. The effect of divalent manganese was verified in pathological hyperlipidemia mouse model. The plasma lipid levels of the mice fed with different doses of manganese showed a bell-shape curve. When manganese was supplemented in an amount higher than a certain level, the plasma lipid level of the animals decreases with the increase of manganese dose. The mice showed the highest level of plasma lipid were fed with a manganese dose similar to that of a normal diet. It could be suggested that for subjects having a normal diet, additionally supplemented manganese may have a lipid-lowering effect.

[0137] In one embodiment of the present application, the present application provides a method of modulating plasma lipid in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of condensation-promoting factor, preferably manganese, more preferably divalent manganese. In some embodiments, the use of manganese means administering manganese in addition to the manganese normally existed in daily diet.

[0138] The present inventors also discovered that molecular regulator (s) that confer manganese responsiveness of COPII to regulate lipid homeostasis in vivo. Specifically, inhibition of Mcu (agene encoding for Mitochondrial Calcium Uniporter) lowered the level of atherogenic lipids. Accordingly, the present application also provides a method of regulating plasma lipids by inhibiting the expression of a gene encoding for mitochondrial calcium uniporter. In some embodiment, the gene inhibition is achieved by gene nuclease-based gene editing, such as ZFNs, TALENs and CRISPR / Cas9.

[0139] In some embodiments, the modulation of plasma lipid includes reducing one or more of atherogenic lipids. By “atherogenic lipids” , it generally refers to one or more of low-density lipoprotein (LDL) -cholesterol (LDL-C) , very-low-density lipoprotein (VLDL) -cholesterol (VLDL-C) , intermediate-density lipoprotein (IDL) -cholesterol (IDL-C) , non-high-density lipoprotein (non-HDL) -cholesterol (non-HDL-C) , apolipoprotein B (APOB) , ApoB-containing lipoprotein, and triglycerides. In one embodiment, the atherogenic lipids include cholesterol-rich ApoB-containing lipoproteins.

[0140] In some embodiments, the use of manganese or the inhibition of MCU can reduce the level of plasma LDL-C by at least 10%, by at least 20%, by at least 30%, by at least 40%, by at least 50%, by at least 60%, by at least 70%, by at least 70%, by at least 80%, by at least 90%, or more, as compared to the level before the use of manganese or the inhibition of MCU.

[0141] In some embodiments, the use of manganese or the inhibition of MCU can reduce the level of plasma VLDL-C by at least 10%, by at least 20%, by at least 30%, by at least 40%, by at least 50%, by at least 60%, by at least 70%, by at least 70%, by at least 80%, by at least 90%, or more, as compared to the level before the use of manganese or the inhibition of MCU.

[0142] In some embodiments, the use of manganese or the inhibition of MCU can reduce the level of plasma total triglycerides by at least 10%, by at least 20%, by at least 30%, by at least 40%, by at least 50%, by at least 60%, by at least 70%, by at least 70%, by at least 80%, by at least 90%, or more, as compared to the level before the use of manganese or the inhibition of MCU.

[0143] In some embodiments, the use of manganese or the inhibition of MCU can reduce the level of plasma APOB by at least 10%, by at least 20%, by at least 30%, by at least 40%, by at least 50%, by at least 60%, by at least 70%, by at least 70%, by at least 80%, by at least 90%, or more, as compared to the level before the use of manganese or the inhibition of MCU.

[0144] In some embodiments, the method for modulating plasma lipids of the present application does not substantially influence the plasma AST and / or ALT level of the subject.

[0145] III. Administration of Manganese

[0146] In the present application, manganese that functions as lipid modulating agent, is preferably divalent manganese. Divalent manganese can be provided in a form of salt suitable for use in the subject of interest. The divalent manganese can be provided as manganese salts of manganese and an organic acid or an inorganic acid. For example, the salt can be manganese chloride, manganese nitrate, manganese sulfate, manganese acetate, manganese thiocyanate, manganese stearate, manganese ascorbate and the like.

[0147] Divalent manganese can be provided as a composition in any suitable form. The composition comprising manganese, preferably divalent manganese, can be formulated for oral administration or parenteral administration, such as intraperitoneal (i. p. ) injection or intravenous (i.v. ) injection. The composition comprising a therapeutically effective amount of divalent manganese can be a liquid composition, such as a solution, a suspension, an emulsion or an injection, or a solid composition such as a powder or a tablet. The composition can be provided as food supplement.

[0148] For any purpose of the present application, the manganese, such as divalent manganese can be administered in an amount of 0.01-100 mg / kg body weight of the subject, preferably 0.02-80 mg / kg body weight of the subject, more preferably 0.03-60 mg / kg body weight of the subject, even more preferably 0.04-50 mg / kg body weight of the subject. Preferably, the manganese, such as divalent manganese, is administered in the indicated amount on a daily basis. For example, manganese, such as divalent manganese can be administered in a daily amount of 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 mg / kg body weight of the subject. In some embodiments, a preferred dosing amount for human subject is about 0.04-1 mg / kg body weight of the human subject, such as about 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 mg / kg body weight of the human subject, which is preferably calculated on a daily basis. In some embodiments, a preferred dosing amount for rodent subject, such as mouse, is about 10-50 mg / kg body weight of the rodent subject, such as about 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 mg / kg body weight of the rodent subject, which is preferably calculated on a daily basis.

[0149] For any purpose of the present application, the supplemental manganese is given in addition to normal diet. In some embodiments, the manganese, such as divalent manganese can be administered in an amount that is about 2-fold, about 3-fold, about 4-fold, about 5-fold, about 10-fold, about 20-fold, about 30-fold, about 40-fold, or about 50-fold higher than the manganese amount comprised in a normal diet of the subject.

[0150] The manganese, such as divalent manganese can be provided by a unit dosage containing a predetermined amount of the active ingredient. For example, the divalent manganese can be provided as a unit dosage comprising about 0.1-100mg divalent manganese per dose. Preferably, the unit dosage is administered on a daily basis, for example, once, twice or three times per one day. In some embodiments, a preferred unit dosage for human subject comprises about 1-100 mg divalent manganese per dose, more preferably about 2-50mg divalent manganese per dose, such as about 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 50 mg divalent manganese per dose. In some embodiments, a preferred unit dosage for rodent subject, such as mouse, comprises about 0.1-2 mg divalent manganese per dose, more preferably about 0.3-1.5mg divalent manganese per dose, such as about 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 or 1.5 mg divalent manganese per dose.

[0151] In some embodiments, manganese can be used in combination with an uncoupler, which is an agent that can uncouple oxidative phosphorylation in different organisms or organelles, including mitochondria, chloroplasts, and prokaryotes. In the context of the present application, the uncoupler is preferably a mitochondrial uncoupler. Exemplary uncouplers include FCCP and DNP (2, 4-Dinitrophenol) . FCCP can increase the cytosolic level of manganese by depolarizing mitochondria. The uncoupler, such as FCCP or DNP, can be delivered before, at the same time with, or after the delivery of manganese.

[0152] IV. Lipid disorders and a rare disease CMRD

[0153] The method of the present application comprising administration of a manganese can be used to treat or prevent rare or common lipid disorders in a subject in need thereof via lipid management. The lipid disorders can include but not limited to atherosclerosis, risk of developing atherosclerosis, hypercholesterolemia, dyslipidemia, coronary heart disease, a history of coronary heart disease, early onset coronary heart disease, risk of developing coronary heart disease, type II diabetes with dyslipidemia, hypertriglyceridemia, hyperlipidemia, pathological hyperlipidemia, hyperfattyacidemia, hepatic steatosis, non-alcoholic steatohepatitis, or non-alcoholic fatty liver disease.

[0154] In specific embodiments, the present application relates to a method of treating or preventing dyslipidemia, especially hyperlipidemia, e.g., pathological hyperlipidemia.

[0155] In specific embodiments, the present application relates to a method of treating or preventing cardiovascular disease (CVD) , particularly atherosclerotic cardiovascular disease (ASCVD) .

[0156] In specific embodiments, the present application relates to a method of treating or preventing atherosclerosis. In some embodiments, the treatment can reduce or reverse the atherosclerotic plaques.

[0157] By “treat” , “treating” or “treatment” as used herein, refers to an approach for obtaining beneficial or desired results including but not limited to a therapeutic benefit and / or a prophylactic benefit. For example, a treatment can comprise administering divalent manganese or inhibiting expression of Mcu. By therapeutic benefit is meant any therapeutically relevant improvement in or effect on one or more diseases, conditions, or symptoms under treatment. For prophylactic benefit, a composition can be administered to a subject at risk of developing a particular disease, condition, or symptom, or to a subject reporting one or more of the physiological symptoms of a disease, even though the disease, condition, or symptom may not have yet been manifested

[0158] The subject the present application may have elevated level of plasma lipids. The subject may be an individual who needs lipid lowering therapy, which can be determined by a physician. For example, an elevated level of plasma lipids can be characterized by a total cholesterol of greater than 200 mg / dL, LDL-C of greater than 100 mg / dL, and / or triglycerides of greater than 150 mg / dL in most human adults.

[0159] The subject of the present application can be a mammal, for example, a rodent such as mouse or rat, a farm animal, a pet animal, a non-human primate such as monkey, or human. The subject can be a subject of any age. For example, a human subject can be a child, an adolescent, or an adult.

[0160] The present application also provides a method of treating a subject having chylomicron retention disease (CMRD) , which comprises administering to the subject a therapeutically effective amount of condensation-promoting factor, preferably manganese, more preferably divalent manganese. CMRD is a rare hereditary disease, which is caused by deficiency or loss of the gene SAR1B encoding the Sar1B GTPase. The treatment by condensation-promoting factor, preferably manganese, more preferably divalent manganese of the present application can increase the plasma APOB levels of the CMRD subject.

[0161] EXAMPLES

[0162] Example 1. Viral hijacking of COPII condensation via the manganese messenger

[0163] In this example, the present inventors aimed to identify regulatory means on the self-constrained COPII condensation that selectively regulates lipoprotein transport, and reasoned that such regulation may produce binary or even opposite effects on plasma lipids depending on the intactness of COPII function. To this end, a murine model was established with hepatocyte-specific inactivation of the CMRD gene SAR1B (Sar1b LKO) , as the deficiency of the COPII-operating GTPase crippled COPII function and produced a ～90%reduction of circulating lipids compared to controls (Wang, X. et al. Receptor-Mediated ER Export of Lipoproteins Controls Lipid Homeostasis in Mice and Humans. Cell Metab 33, 350-366 e357, doi: 10.1016 / j. cmet. 2020.10.020 (2021) ) . Unexpectedly, when Sar1b LKO mice were exposed to adenovirus via the tail vein, the diminished levels of plasma lipids including triglycerides and cholesterol were significantly elevated (Fig. 1A-B, left panels, Fig. 2A) . By contrast, in wild type mice carrying intact Sar1b alleles and therefore normal COPII function, adenovirus infection reduced plasma triglyceride and cholesterol levels (Fig. 1A-B, middle panels, Fig. 2B) , consistent with the known but poorly-understood adenoviral “toxicity” (Wang, Z. &Zhang, X. Adenovirus vector-attributed hepatotoxicity blocks clinical application in gene therapy. Cytotherapy 23, 1045-1052, doi: 10.1016 / j. jcyt. 2021.07.013 (2021) .

[0164] To further demonstrate the specificity of the above viral effects with respect to COPII function in lipid regulation, the inventors employed hepatic Surf4 deficient mice (Surf4 LKO) in which the COPII complex was disjoined from lipoproteins (Wang, X. et al., 2021, supra) . Adenovirus infection didn’t affect plasma lipids in Surf4 LKO mice (Fig. 1A-B, right panels, Fig. 2C) .

[0165] Fig. 1C summarized the above effects on plasma lipids in different genetic models, by taking into consideration of the balanced condensation of COPII that selectively drive lipoprotein transport. Fractionation and profiling of plasma lipoproteins were performed to further characterize the opposite effects on the secreted lipoproteins by adenovirus infection depending on the functional intactness of the COPII machinery (Fig. 3A-D) . Adenovirus exposure elevated the diminished circulating lipoproteins in Sar1b LKO mice, but instead reduced the normal levels of lipoproteins in wild type mice. Accordingly, electrical Microscopy (EM) negative staining confirmed the opposite binary effects on the quantity of circulating lipoproteins in wild type versus Sar1b LKO mice (Fig. 4A-B) , which were confirmed by immune-blotting (IB) (Extended Fig. 67G&H) . IB of liver samples also revealed that adenovirus infection caused accumulation of APOB, APOA1 and APOE in hepatocytes in wild type mice, but by contrast reduced the intracellularly-trapped APOB, APOA1, and APOE in Sar1b LKO mice (Extended figure2I&J) . Of note, albumin levels remained unchanged in all cases, reflecting a specific effect on lipoproteins as a selective set of COPII cargos triggered upon adenoviral infection.

[0166] The above data suggested a simplified genetic scheme, in which adenovirus via an unknown mechanism affects the condensation-based function of COPII (Fig. 6) . Consistent with the functional-genetics rationale, super-resolution confocal microscopy and 3D reconstruction revealed that adenoviral infection significantly enlarged the condensed SEC24A puncta (Fig. 7A-B) , which assemble via IDR-dependent condensation.

[0167] Moreover, the viral effects on COPII condensation could be reconstituted in vitro, with purified inner coat complex SEC23 / 24 (Fig. 8) . When incubated with liver cytosol prepared from wild type mice, recombinant SEC23 / 34 was able to condense into in vitro droplets (Fig. 8, upper) . Compared to normal liver cytosol, however, liver cytosol prepared from adenovirus-infected mice significantly promoted the formation of in vitro liquid droplets enriched with SEC23 / 24 (Fig. 8, lower) , implicating a cytosolic factor or factors that could promote COPII condensation.

[0168] The inventors thus aimed to biochemically isolate the putative “condensation-promoting factor” (cp-factor) from adenovirus-infected liver cytosol (AIC) , using the in vitro SEC23 / 24 condensation assay as a readout (Fig. 9, upper) . When quantified with the abundance of the in vitro liquid droplets (Fig. 9, lower, Fig. 10A-B) , AIC (fraction 1) exhibited significant promoting effect on COPII condensation compared to the control cytosol. Of note, while treatment of reagents including proteinase K or the nuclease Benzonase didn’t affect the activity of cp-factor (fraction 2 or 3) , heat-inactivated AIC also retained the promoting effects on SEC23 / 24 condensation in AIC (fraction 4) . These results implied that the CP-factor may be a heat-resistant small molecule, therefore size exclusion fractionation was performed on heat-inactivated AIC. Indeed, the fraction containing molecules smaller than 1000 Dalton (<1kD) exhibited promoting effects on SEC23 / 24 condensation (fraction 6) , whereas the remaining fractions appeared slightly inhibitory (fraction 5) . Interestingly, addition of EDTA in fraction 6 abolished the promoting effects on SEC23 / 24 condensation (fraction 7) .

[0169] The EDTA-sensitive, small molecule nature of the CP-factor suggested the involvement of divalent metal ions in promoting COPII condensation. Therefore ICP-MS (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) was performed to measure metal ions in liver cytosol. Of note, adenovirus infection significantly elevated concentration of manganese (Mn) in the liver cytosol compared to non-infected controls (Fig. 11A) , while other metals such as zinc, nickel, copper, or iron remained largely unaltered (Fig. 11C) , as was calcium (Fig. 11B) .

[0170] Cytosolic manganese changes were further assessed using protein levels of TMEM165, as the protein is selectively degraded in response to elevation of cytosolic manganese (Fig. 12) . Consistent with the MS measurement, adenoviral infection accordingly reduced TMEM165 levels in primary hepatocytes, whereas EDTA chelation in permeabilized hepatocytes significantly prevented such degradation (Fig. 13A) . Of note, the addition of EDTA into the cell culture medium failed to abolish adenovirus-induced TMEM165 degradation (Fig. 13B) , implying an intracellular manganese store, which will be dissected in the later part of the study.

[0171] Based on the above results, experiment was conducted to test whether manganese promotes cellular COPII condensation similarly to adenovirus. Indeed, treating the cells with 500μM MnCl2 significantly enlarged the SEC24A puncta compared to control cells (Fig. 14A-B) , as was also observed with adenoviral infection. Manganese treatment exhibited similar promoting effects on cellular COPII condensates marked by SEC24A endogenously tagged with EGFP (EGFPSEC24A, Fig. 15) , further revealing an unexpected role of manganese as an endogenous small molecule COPII regulator that can be exploited by stimuli including viral infection.

[0172] Example 2. Manganese directly promotes COPII condensation in vitro

[0173] Based on the effects of manganese on cellular COPII, this example further tests whether divalent manganese may directly modulate SEC23 / 24 condensation in vitro.

[0174] Recombinant SEC23 / 24 within the range of hepatic concentrations (8μM) readily condensed into spherical protein droplets in physiologically relevant buffers (Fig. 16A, left panel) . Strikingly, inclusion of MnCl2 in the system significantly promoted the condensation of the COPII inner coats, starting at 10μM as the final concentration, whereas the addition of 250μM MnCl2 drastically enhanced the formation of SEC23 / 24 condensates reconstructed in the in vitro system (Fig. 16A, right panels) . As the cellular manganese concentration could range from ～100μM to close to 1mM, it was thus reasoned that manganese within physiologically relevant concentrations could promote SEC23 / 24 condensation. Consistent with this notion, titration of SEC23 / 24 as well as manganese concentrations generated an in vitro phase diagram that further confirmed the promoting effects on SEC23 / 24 condensation by divalent manganese (Fig. 17) . Moreover, neither calcium nor magnesium displayed promoting effects on SEC23 / 24 condensation, though these two divalent ions often overlap with manganese in their transport and function (Fig. 16B) .

[0175] Manganese, as a transition metal, could form coordination complexes with multiple ligands. Indeed, purified SEC23 / 24 could be isolated by Mn-coupled beads prepared using the immobilized metal affinity chromatography (IMAC) technology, whereas the addition of EDTA or free MnCl2 abolished the binding between Mn-IMAC beads and recombinant SEC23 / 24A (Fig. 18) . The data therefore suggested direct binding between the inner COPII coats and the metal ions.

[0176] Isothermal titration calorimetry (ITC) further demonstrated the interaction between divalent Mn with purified SEC23 / 24A, with Kd=～30μM (Fig. 19, left panels) . Of particular note, manganese interaction was mediated by the structured domains of SEC23 / 24, whereas the IDR regions displayed no detectable binding in ITC (Fig. 19, middle and right panels, and Fig. 20) . Similar binding was observed with SEC23A in complex with SEC24D, a different SEC24 paralog (Fig. 21) , whereas purified SEC31 / 13 displayed no detectable interaction with divalent Mn (Data not shown) .

[0177] The ITC experiments therefore suggested a possible mechanism for manganese’ condensation-promoting effects, in which Mn-binding may allosterically coordinate COPII inner coats to facilitate the multivalent interactions and promote condensation. The hypothesis was tested with a protease-activated in vitro condensation assay using just the IDRs from SEC24 (Fig. 22, upper) . To directly test the effects of manganese binding, an orthogonal Mn-binding domain (TssS peptide) from the bacteria Yersinia pseudotuberculosis (Zhu, L. et al. T6SS translocates a micropeptide to suppress STING-mediated innate immunity by sequestering manganese. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 118, doi: 10.1073 / pnas. 2103526118 (2021) ) was fused with the IDR region of SEC24 (Fig. 22, lower) . When cleaved from the MBP tag that maintains solubility, the freed IDRs readily formed liquid droplets as a result of weak, multivalent interactions (Fig. 23, upper panels) . Interestingly, while manganese showed little effects on the condensation of IDR alone, it greatly promoted the condensation of TssS-IDR in a dose-dependent manner (Fig. 23, lower panels) .

[0178] Taken together, the above in vitro assay and reconstruction experiments uncovered a direct role of manganese in promoting SEC23 / 24 condensation, which initiates an unconventional regulatory mechanism of COPII assembly to mediate selective transport events such as lipoprotein secretion.

[0179] Example 3. Manganese selectively controls cellular COPII function and lipoprotein secretion

[0180] In this example, the temporal feature of manganese-regulated COPII condensation regulated in cellular settings was examined.

[0181] Consistent with the direct binding to and the regulation of SEC23 / 24 observed in Example 2, cellular COPII condensation marked by endogenous SEC24A staining became increased starting as early as 30 minutes after the addition of MnCl2 into the culture medium (Fig. 24A, quantified in Fig. 24B) .

[0182] Compared to the wild type SEC24, manganese addition had no observable effects on the diffusive localization of SEC24 lacking IDR, but exacerbated the over-condensation of SEC24 bearing the IDR from FUS (Fused in Sarcoma) (Fig. 25) . The data therefore confirmed the condensation-dependent mechanism in COPII regulation by the metal ion in cells. On such basis, it was considered whether this novel regulatory means may shift the assembly-vs-dynamics balance of the transport complex that selectively regulates lipid transport (Fig. 26) .

[0183] Of note, co-immunoprecipitation revealed manganese treatment significantly increased the biochemical interactions between the SEC16A scaffold and SEC23 / 24 (Fig. 27A, quantified in Fig. 27B) , reflecting enhanced recruitment and assembly of the COPII complex due to elevated condensation.

[0184] On the other hand, when assayed by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) , manganese treatment significantly slowed the recovery of EGFPSEC24A fluorescence in cells compared to controls (Fig. 28A, quantified in Fig. 28B) , indicating stalled cellular dynamics of COPII.

[0185] Taken together, the biochemical and imaging analysis revealed that manganese addition in cells, via promoting SEC23 / 24 condensation, could shift the functional balance between maximal assembly and optimal dynamics of the COPII machinery.

[0186] The condensation-based regulation conferred by manganese on the COPII complex led the inventors to examine its impact on secretion. Interestingly, treating primary hepatocytes with 500μM MnCl2 significantly decreased APOB levels in the culture medium, while levels of the abundant secretory protein Albumin remained unchanged (Fig. 29A, quantified in Fig. 29B) . A concomitant intracellular accumulation of APOB, but not Albumin, in MnCl2-treated cells was also observed (Fig. 30A, quantified in Fig. 30B) .

[0187] Taken together, the imaging, biochemical and functional data revealed a specific control mechanism on a subset of COPII-mediated secretion featuring lipoprotein transport and operated by manganese, which fine-tunes the condensation-based selective function of the COPII complex.

[0188] Example 4. Mitochondrial manganese store regulates the COPII machinery for lipid control

[0189] The selective control by manganese on the COPII complex and lipoprotein secretion intrigued the inventors to further delineate the regulation of manganese, as a spatial and temporal signal cue in transport and metabolism. To this end, the inventors first took advantage of their previous results that adenovirus infection could elevate manganese to modulate the COPII complex. In particular, chelating extracellular manganese didn’t affect the adenovirus-induced degradation of the manganese sensor TMEM165 in primary hepatocytes (Fig. 13B) , implying an intracellular manganese store that can be modulated by the virus. Interestingly, adenovirus infection significantly shifted mitochondria from the filamentous structure to a largely granular shape in primary hepatocytes (Fig. 31A) , whereas the morphology of other organelles remained relatively unaltered (Fig. 31B) . Accordingly, adenovirus infection greatly reduced mitochondrial membrane potential in hepatocytes, as did the FCCP (Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxy phenylhydrazone) that is known to depolarize mitochondria (Fig. 32) .

[0190] Mitochondria is long known to uptake and store manganese, in a manner dependent on the membrane potential. Consistent with the loss of membrane potential, both adenovirus infection and FCCP treatment led to increased cytosolic manganese as measured by quenching of the Fura-2 dye (Fig. 33A-B) (Pan, Z., Choi, S. &Luo, Y. Mn2+ Quenching Assay for Store-Operated Calcium Entry. Methods Mol Biol 1843, 55-62, doi: 10.1007 / 978-1-4939-8704-7_4 (2018) ) . Both treatments also induced degradation of TMEM165 (Fig. 34) , further implicating the mitochondria as an intracellular manganese store that can be mobilized to elevate cytosolic manganese.

[0191] Mitochondria form extensive contacts with the ER, organizing the Mito-ER contact sites (MERCS) as spatial platforms for ion signaling and lipid metabolism. In particular, the MERCS contribute to the production of lipoproteins in hepatocytes, leading us to hypothesize that mitochondria might supply manganese to timely regulate the export of lipoproteins after their production. EM tomography often observed lipoproteins of 100-200nm size at the smooth ends of the rough ER in close proximity of mitochondria (Fig. 35) . As previously observed with adenovirus infection, confocal microscopy also revealed that mitochondria depolarization by FCCP significantly enlarged the COPII condensates on the ER surface (Fig. 36A-B) . Functionally, treating hepatocytes with increasing doses of FCCP produced a bell-shape regulation on the secretion of APOB (Fig. 37, red line, and Fig. 38) . Namely, low doses of FCCP promoted APOB and lipid secretion from hepatocytes, whereas higher FCCP doses appeared inhibitory, together reflecting the requirement of balanced COPII condensation for lipoprotein secretion. Moreover, the secretion of Albumin remained largely unaltered by FCCP treatment at different doses (Fig. 37, grey line) . Taken together, the results identified mitochondria as an intracellular manganese store that can be mobilized to signal the COPII complex on the ER surface, thereby selectively regulating lipoprotein transport.

[0192] The spatial effects of COPII regulation by manganese led us to further identify molecular regulator (s) that confer manganese responsiveness of COPII to regulate lipid homeostasis in vivo. The quantitative nature of both ion and lipid metabolism led the inventors to employ population genetics, with the hypothesis that such regulators may bear genetic variations that cause quantitative phenotypic outcomes in circulating lipids. Consistent with this idea, scanning the recently released GLGC (Global Lipid Genetics Consortium) data (Graham, S. E. et al. The power of genetic diversity in genome-wide association studies of lipids. Nature 600, 675-679, doi: 10.1038 / s41586-021-04064-3 (2021) ) identified a peak of signals in the MCU-MICU1 locus, which exhibited significant association with the atherogenic LDL-cholesterol levels in the plasma as well as the levels of non-HDL cholesterol and total cholesterol (Fig. 39A-B) . For the lead single nucleotide polymorphism (SNP, rs11000443, reference allele C) , its minor allele A has a ～9.2%global frequency as documented by the 1000 Genome Project (Fig. 40) and is associated with lower plasma LDL levels (Fig. 41, P = 3.41×10-31, β = -0.03) .

[0193] The mitochondria calcium uniporter (MCU) complex, comprised of the pore-forming subunit MCU, its stabilizer EMRE, and the regulatory subunits MICU1 / 2, was recently identified by a series of studies as the long-sought molecular mediator of mitochondria calcium uptake (Baughman, J. M. et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature 476, 341-345, doi: 10.1038 / nature10234 (2011) ; De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I. &Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature 476, 336-340, doi: 10.1038 / nature10230 (2011) ; Perocchi, F. et al. MICU1 encodes a mitochondrial EF hand protein required for Ca2+ uptake. Nature 467, 291-296, doi: 10.1038 / nature09358 (2010) ; Raffaello, A. et al. The mitochondrial calcium uniporter is a multimer that can include a dominant-negative pore-forming subunit. EMBO J 32, 2362-2376, doi: 10.1038 / emboj. 2013.157 (2013) ; and Sancak, Y. et al. EMRE is an essential component of the mitochondrial calcium uniporter complex. Science 342, 1379-1382, doi: 10.1126 / science. 1242993 (2013) ) . The highly selective uniporter also imports manganese into the mitochondria, a trait known long before the molecular identity of MCU was revealed (Chappell, J. B. &Greville, G. D. Isolated Mitochondria and Accumulation of Divalent Metal Ions. Fed Proc 22, 526-& (1963) ) , though this boutique function of the MCU complex is less characterized in vivo. Moreover, MCU-mediated manganese transport was shown to be suppressed by the inhibitory subunit MICU1 (summarized in Fig. 42) (Kamer, K. J. et al. MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca2+ and Mn2+. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 115, E7960-E7969, doi: 10.1073 / pnas. 1807811115 (2018) ; and Wettmarshausen, J. et al. MICU1 Confers Protection from MCU-Dependent Manganese Toxicity. Cell Rep 25, 1425-1435 e1427, doi: 10.1016 / j. celrep. 2018.10.037 (2018) ) . Of note, analysis of the GTEx expression database revealed significant associations between the minor A allele of rs11000443 SNP and higher gene expression in MICU1 (Fig. 43) , raising the possibility that reducing MCU uniporter activity may lower plasma lipids.

[0194] The human genetic analysis prompted the inventors to inactivate hepatic Mcu (Mcu L-CRISPR) with a previously established in vivo gene editing system based on the CRISPR / Cas9 technology. Compared to controls, Mcu L-CRISPR mice exhibited lower plasma triglycerides, in both VLDL and LDL fractions (Fig. 44A-B) . Accordingly, levels of atherogenic LDL-cholesterol were also reduced upon inhibition of hepatic MCU (Fig. 45A-B) . Consistent with the lipid measurement, circulating APOB levels were reduced in Mcu L-CRISPR mice compared to controls, while plasma levels of Albumin remained unchanged (Fig. 46A-B) .

[0195] When examined in isolated primary hepatocytes, loss of MCU led to reduced cellular TMEM165 levels, reflecting the redistribution of mitochondrial manganese into the cytosol (Fig. 47, column 1 vs 2) . Moreover, FCCP failed to induce additional TMEM165 degradation in the Mcu-CRISPR cells (Fig. 47, column 3 vs 4) , further implicating the uniporter as a membrane potential sensitive gate between the mitochondrial and cytosolic pools of manganese. Consistent with the biochemical readout, quantification with Fura-2 also confirmed elevation of cytosolic manganese upon MCU inactivation (Fig. 48) . Along the same line, Mcu-CRISPR hepatocytes exhibited impaired APOB secretion compared to control cells, whereas FCCP failed to impose additional inhibition (Fig. 49, Fig. 50A-B) .

[0196] The above functional results led the inventors to examine COPII condensation in response to MCU inactivation (Fig. 51A-B) . As observed previously, FCCP treatment enlarged COPII puncta on the ER surface when compared to control cells. Similar promoting effects on COPII condensation were observed in Mcu-CRISPR hepatocytes, whereas FCCP failed to impose additional impact on COPII condensation in these mutant cells. Taken together, the genetic, animal, and cell biology experiments pointed to a model in which mitochondria could supply manganese to spatially regulate lipoprotein transport, as a condensation-dependent, selective function of the COPII complex.

[0197] Example 5. Dietary manganese titration treats rare and common lipid disorders

[0198] The above results culminated into an idea of titrating the manganese signal to precisely control lipid secretion into the circulation in treating lipid-related diseases, particularly since the element can be supplied via food or drink and enriched by enterocytes and hepatocytes. The bell-shape function between COPII condensation and lipid transport, however, allows customized strategies based on the therapeutic needs. Moreover, a treatment application with the hypolipidemia model based on Sar1b deficiency was designed (Fig. 52A) , and different doses of manganese were supplemented in the drinking water.

[0199] As previously reported, the Sar1b LKO mice developed hypolipidemia. Interestingly, the diminished lipid levels, including triglycerides and cholesterol, were elevated when MnCl2 was supplemented up to 1g / L in the drink at different doses for 2 weeks (Fig. 52B-C) . Plasma APOB levels were accordingly elevated by manganese supplement as well, further suggesting a rescue of the transport defect due to the loss of the CMRD gene (Fig. 53A-B) . Quantitatively, the treatment outcome correlated with the doses of manganese supplements, thereby supporting the feasibility of titrating lipid transport via the manganese signal. By “titrating” , it means continuously adjusting the balance of a physical function or the concentration of a substance. Histological analysis revealed a dosage-dependent reduction of hepatic lipid accumulation by manganese in Sar1b LKO mice, whereas other tissues remained grossly unaltered (Fig. 54A-B) .

[0200] Importantly, manganese supplements at high doses (1g / L in the drink) failed to elevate the diminished lipid levels in the plasma of Surf4 LKO mice (Fig. 52B-C, red columns) . Hence, the above results in specific genetic models with crippled and disjoint COPII function again demonstrated the selective impact of manganese on lipid transport via COPII condensation, furthering the feasibility of fine-tuning plasma lipid levels via modulating condensation by the manganese signal in common, wild type background with intact COPII (Fig. 55) .

[0201] Thus, a long-term treatment strategy was designed on a pathological hyperlipidemia model, established with wild type mice receiving PCSK9 and western diet feeding (Fig. 56) . To allow manganese titration, manganese-free western diet was prepared and manganese at different doses ranging from 0-5g / L was supplied in drinking water.

[0202] Interestingly, after 4 months of treatment, plasma lipid levels in the different groups of mice exhibited a bell-shape curve as a function of manganese doses. Of particular note, mice receiving 0.02g / L manganese (roughly corresponding to the “normal” diet) displayed the highest levels of circulating lipids including triglycerides and cholesterol among the groups, whereas increasing doses of supplemented manganese correspondingly decreased plasma lipids compared to the summit group (Fig. 57A-B) .

[0203] Size fractionation of the plasma confirmed the changes in plasma lipids were mostly due to alterations in the atherogenic lipoproteins including VLDL and LDL (Fig. 58A-B) . Accordingly, quantification of triglyceride and cholesterol levels in the LDL fraction further revealed the bell-shape function between manganese supplements and circulating atherogenic lipids, peaking at the group receiving 0.02g / L manganese (Fig. 59A-B) . Of note, in mice supplemented with 0.2g / L manganese (～5-10 fold higher than the “normal” ) , atherogenic lipids were reduced to about half of the peak group (column 4 vs 2, Fig. 59A-B) . Similar results were observed with plasma APOB, while circulating albumin remained unaltered (Fig. 60) .

[0204] Consistent with the lipid measurements, atherosclerotic lesions developed in these mice at various degrees (Fig. 61A, quantified in Fig. 61B) , exhibiting a bell-shape as a function of manganese doses. Of particular note, while mice receiving 0.02g / L manganese developed the most severe atherosclerosis, increasing manganese supplementation to 0.06g / L, and in particular to 0.2g / L, showed significant protection. Importantly, mice receiving 0.02-0.06g / L manganese in supplements exhibited similar hepatic manganese content as mice fed on normal manganese-containing diets (Fig. 62) . This quantification was consistent with previous reports, which documented those normal diets contained 50-100μg / g manganese (Mercadante, C. J. et al. Manganese transporter Slc30a10 controls physiological manganese excretion and toxicity. J Clin Invest 129, 5442-5461, doi: 10.1172 / JCI129710 (2019) ) , and that manganese rich diets containing 2000μg / g manganese (20-40-fold higher than “normal” ) didn’t appear to cause apparent toxicity over months (Jenkitkasemwong, S. et al. SLC39A14 deficiency alters manganese homeostasis and excretion resulting in brain manganese accumulation and motor deficits in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 115, E1769-E1778, doi: 10.1073 / pnas. 1720739115 (2018) ; and Sato, I., Matsusaka, N., Kobayashi, H. &Nishimura, Y. Effects of dietary manganese contents on 54Mn metabolism in mice. J Radiat Res 37, 125-132, doi: 10.1269 / jrr. 37.125 (1996) ) . The latter dose roughly equals to ～2g / L of manganese supplemented by drinking water in our experiments (assuming ～5ml daily water intake per mouse) . Accordingly, plasma AST / ALT levels remained unaltered with up to 0.2g / L manganese supply in water in our experiments, whereas higher manganese doses (1 or 5g / L manganese) appeared to only slightly elevate these liver enzymes (Fig. 63) , further supporting the feasibility and safety in our therapeutic design with manganese supply. Taken together with the previous cellular and genetics results, the data suggested a model in which manganese regulates COPII condensation to gauge lipoprotein transport, furthering a translational application of titrating manganese supplements to precisely control lipid homeostasis in healthy and disease conditions.

[0205] Example 6. Study in healthy human

[0206] This example shows a study on the correlation between plasma manganese concentration and circulating cholesterol level in healthy humans.

[0207] Blood samples were collected from 281 healthy human volunteers of 21 to 45 years old. The plasma manganese concentration, total circulating cholesterol, and LDL-cholesterol of the samples were measured.

[0208] In Fig. 64B, plasma manganese concentrations and the atherogenic LDL-cholesterol level showed negative correlation. In Fig. 64C, plasma manganese concentration and the atherogenic LDL-cholesterol level showed negative correlation. In Fig. 64D, elevated circulating manganese was associated with lower total circulating cholesterol in healthy humans. In Fig. 64E, elevated circulating manganese was associated with lower the atherogenic LDL cholesterol in healthy humans.

[0209] Above results showed that increase of circulating manganese was correlated with lowered circulating lipid level represented by lowered total circulating cholesterol and LDL-cholesterol level, suggesting that circulating lipids may be lowered by increasing manganese level.

[0210] Methods

[0211] This section describes the materials and methods used in Examples 1-6.

[0212] Animal models

[0213] Animal housing and all the experimental procedures were authorized by the Institutional Animal Care and Use Committees of Peking University, an AAALAC certified animal facility. All mice used were bred on the C57BL6 / J background. Mice were housed at 22℃ on a 12h light / dark cycle with free access to normal chow diet and water, except as noted. All mice used for experiments were from in housing mating. The overall development and health of animals were monitored according to the AAALAC guidelines, and littermates were used as controls in experiments unless specified. Male mice of 8～16 weeks were used in all experiments, unless otherwise mentioned in the figure legends. Sar1bfl / fl mice were injected with adeno-associated virus (AAV) containing thyroxine-binding globulin (TBG) driven Cre recombinase (AAV-TBG-Cre) to generate Sar1b liver specific knockout mice (Sar1b LKO) . Hepatic Surf4 homozygous mice were obtained by injecting the Surf4fl / fl mice with AAV-TBG-Cre.

[0214] Cell culture

[0215] Huh7.5 cells, HEK293T cells, HEK293A cells and primary hepatocytes from mouse were cultured in DMEM supplemented 10%fetal bovine serum (FBS) and 1%penicillin / streptomycin (P / S) at 37 ℃ under an atmosphere of 5%CO2. Suspended HEK293F were grown in serum free medium SMM 293-TI supplemented with 100 U / mL penicillin / streptomycin at 37℃ with 5%CO2. SF9 cells were grown at 27℃ in serum free medium SF (Thermo Fischer) supplemented with 50 U / mL penicillin / streptomycin. High Five insect cells were grown at 27℃ in serum free medium HF (Thermo Fischer) supplemented with 50 U / mL penicillin / streptomycin.

[0216] Electrical Microscopy (EM) samples preparation and Images

[0217] Mice were euthanized and perfused with 0.1M sodium phosphate buffer (pH 7.4, 37℃) , followed by the pre-fixation solution (2.5%glutaraldehyde and 0.8%paraformaldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer, pH 7.4, 37℃) . Liver tissue were collected and stored in the pre-fixation solutions for 2 hours at room temperature. Liver tissue samples were cut into small pieces (～0.2 x 0.3 x 0.5 mm) and fixed in the pre-fixation solutions overnight at 4℃. After rinsing with 0.1M phosphate buffer, samples were immersed with 0.1M imidazole in PBS for 30 mins, and then post-fixed with 2%osmium tetroxide in PBS. After rinsing with high-purity MilliQ water (Thermo, GenPure Pro UV / UF, supplied with distilled water, 18MΩ) , samples were stained with 1%uranyl acetate at 4℃ overnight. Gradient dehydration was accomplished by gradual acetone series and embedded in epoxy resin (60℃ for 24 h) . Samples were sectioned using Leica EM UC7 (about 60 nm thick) and placed on copper grids. Images were recorded on a FEI Tecnai G2 20 Twin electron microscope fitted with an EagleTM4k CCD digital camera (FEI; USA) .

[0218] Negative staining of lipoproteins

[0219] Plasma from tyloxapol treated mice was diluted with PBS, and mixed with Optiprep as the volume ratio of 3: 1. The mixture was centrifuged at 55,000 rpm in TLN100 for 3 hours. Top 400 μL was collected as VLDL fraction. Carbon-coated copper grids were incubated on 3.33 μL of the VLDL preparation for 1min on ice. Excess solution was removed using a filter paper. The grids were then floated on three drops of 1%Ua (20 μL) . Excess Ua solution was removed using a filter paper. The grids were kept in the dark and air-drying at 4 ℃ for 10mins. Images were recorded on a FEI Tecnai G2 20 Twin electron microscope fitted with an EagleTM 4k CCD digital camera (FEI; USA) .

[0220] Fix cell Immunostaining

[0221] Cells cultured on glass coverslips were washed with PBS and then fixed in methanol for 5 min. the cells were rehydrated in PBS and then blocked with 2%BSA for 30 min. Cells were incubated with a primary antibody diluted in blocking buffer overnight at 4℃ and then washed with PBS. Lastly, the cells were incubated with the fluorophores conjugated secondary antibody for 2 hours at room temperature and then washed with PBS. The cells were mounted with anti-fade medium before imaging on the Zeiss laser scanning microscopy 980 or the Zeiss spinning disk microscopy.

[0222] Live cell imaging

[0223] Cells were plated on 35 mm glass bottom dishes one day before transfection. Live cell imaging was performed using a 63× oil immersion objective (NA 1.4) on Zeiss Spinning Disk microscope equipped with an incubator providing a humidified atmosphere with 5%CO2 at 37℃. Fluorescence intensity and areas of interested regions are quantified by Image J Fiji and analyzed by Prism (GraphPad 8) .

[0224] Plasma lipid analysis

[0225] Mice were fasted for 16 hours prior to plasma cholesterol and triglyceride measurements. Blood was harvested via tail vein using heparinized capillary tubes, and centrifuged at 6,000 g, 4℃ for 5 min to collect plasma. Plasma lipids were measured by commercially available kits (Zhongshengbeikong and Sigma) according to the manufacturer’s protocol.

[0226] For fast-protein liquid chromatography (FPLC) analysis, pooled plasma samples of the same genotype were subjected to FPLC by using the Superose 6 columns. Samples were fractionated at a flow rate of 0.5 mL / min and fractions were collected 350 μL / tube for cholesterol and triglycerides measurements.

[0227] Isolation of the cytosol fraction

[0228] Livers were perfused with 0.9% (w / v) NaCl and rapidly homogenized with a loose-fitted Dounce Homogenizer in 2 mL of ice-cold solution containing 50 mM HEPES-KOH, PH 7.2, 250 mM sorbitol, 70 mM KoAC, 5 mM EGTA-K+, 25 mM Mg (Oac) 2, and 1X EDTA-free protease inhibitors cocktails (Roche) . The homogenates were centrifuged at 1, 900 g for 10 min, and the supernatants were sequentially centrifuged at 25,000 g for 25 min, 186,000 g for 1 h, and 186,000 g for 1 h. The cytosol fraction was carefully collected to get rid of the fat layer and divided into multiple aliquots and stored at -80℃.

[0229] Isothermal titration calorimetry (ITC)

[0230] ITC experiments were performed using a MicroCal iTC200 (GE Healthcare) at 25℃. MnCl2 solution and proteins were in same buffer containing 20 mM Tris-HCl, PH 7.4, 500 mM NaCl. The concentration of MnCl2 solution in the syringe was 1 mM, and the concentration of proteins in cell were 20 μM. All proteins and metal solutions were extensively degassed prior to titration. A control experiment in the absence of protein was performed to measure the heat generated due to Mn2+ dilution in the buffer. Blank titrations of the MnCl2 solution into the dialysis buffer were performed to correct for the dilution heat of the MnCl2 solution. Titration with a reference offset of 5 μcal / s, a syringe stirring speed of 750 rpm, a pre-injection delay of 60 s, and a 120 s interval between injections. Data were analyzed with a on-site model using Origin7.0 (OriginLab) .

[0231] APOB secretion assay

[0232] Primary mouse hepatocytes were plated on 6 cm dishes. The medium was changed to serum-free DMEM 24 hours later, and 1, 6-hexanediol was added as indicated concentration. After incubating 3 hours at 37℃, the medium was collected and centrifugated to remove cell debris, followed by acetone precipitation at -80℃ for 2 hours. Proteins in the medium were pelleted by centrifugation at 16,000 g for 10 min, and resuspended for IB analysis.

[0233] ICP-MS

[0234] Samples were analyzed by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS, Varian 802-MS) , and the results were corrected using the appropriate buffers for reference and dilution factors. The cytosol was digested with 70%HNO3 at 65℃ for 2 hours, and the livers, brains and intestines were respectively digested with 100%HNO3 at 141℃ for 30 min, follow by the measurement of microelement content by ICP-MS.

[0235] IMAC pull down

[0236] Mn2+ chelating beads were prepared following the manufacture’s protocol (Smart-Lifesciences) . Briefly, IMAC beads were washed with ultrapure water 3 times, and then bind with 100mM MnCl2 for 8 hours at room temperature, finally washed Mn2+ chelating beads 3 times to remove free Mn2+, and stock Mn2+ chelating IMAC beads at 20%EtOH. For IMAC pull down, 6μM purified SEC23 / 24A protein were diluted in TBS buffer (20mM Tris-CI, PH 7.4, 500mM NaCl) , supplemented with protease inhibitor tablets (Roche) . Then incubated with Mn2+chelating beads for 2 hours at 4℃. Following 3 times washed with TBS buffer, the beads were eluted with 1.5XSDS sample buffer and separated by SDS-PAGE.

[0237] Immunoprecipitation (IP) and WB

[0238] For FLAG-SEC16A transfection experiments, HEK293A cells were seeded in 100 mm culture plates. 24 hours later, cells were transfected with 1.5 μg FLAG-SEC16A. 20 hours after transfections, 500 μM MnCl2 was added for 4 hours. Then, cells were rinsed twice with ice-cold PBS and lysed in ice-cold lysis buffer (50 mM Tris-CI, PH=7.4, 137 mM NaCl, 1 mM EGTA and 5 mM MgCl2, 1%NP-40 and 10%Glycerol) , supplemented with protease inhibitor tablets (Roche) . The soluble fractions of cell lysates were isolated by centrifugation at 13,000 rpm for 10 min by centrifugation. For Flag purifications, Flag M2 affinity gel was washed with lysis buffer 3 times. 20 μL of beads in 50%slurry was then added to pre-cleared cell lysates and incubated with rotation for 2 hours at 4℃. Finally, the beads were washed 3 times with lysis buffer. Immunoprecipitated proteins were denatured by the addition of 50 μL of 1.5X SDS sample buffer and boiling for 5 min. Then proteins were transferred onto nitrocellulose membranes (Bio-Rad) and analyzed by indicated antibodies.

[0239] Purification of recombinant proteins

[0240] For expression of recombinant MBP-IDR-GFP-His and MBP-IDR-MnBP-GFP-His, respective bacterial expression plasmids were transformed into E. Coli Nico21 competent cells. Recombinant proteins were induced by 1 mM IPTG at 18℃ for 18 hours. Cells were collected and lysed in resuspension buffer (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, and supplemented with 1 mM PMSF, 1 μg / mL Aprotinin, 1 μg / mL Pepstatin, 1 μg / mL Leupeptin) and purified with Ni-NTA beads. The proteins were washed with resuspension buffer containing 10 / 20 / 40 mM imidazole and elute with resuspension buffer containing 300 mM imidazole. For in vitro protease-activated in vitro liquid droplet assay, MBP tag was removed by PreScission protease (Ppase) . For expression of recombinant GST-SAR1BH79G, respective bacterial expression plasmids were transformed into E. Coli Nico21 competent cells. Recombinant proteins were induced by 1 mM IPTG at 18℃ for 18 hours. Cells were collected and lysed in lysis buffer (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM DTT and supplemented with 1 mM PMSF) and purified using GST-beads. After washing with lysis buffer, GST-SAR1BH79G were eluted with lysis buffer containing 20 mM GSH. Expression and purification of recombinant His-SEC24A complexed with His-SEC23A, His-ΔIDRSEC24A complexed with His-SEC23A, His-SEC24D complexed with His-SEC23A, His-ΔIDRSEC24D complexed with His-SEC23A and His-SEC31A / SEC13-GFP were carried out as previously described. Briefly, High Five insect cells at concentration of 2x106 / ml were infected with respective P2 baculovirus (1: 100) for 2 days. Cells were collected and lysed in lysis buffer (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10%glycerol, 1%TritonX100, supplemented with protease inhibitor cocktail and PMSF, pH 8.0) . After removal of cell debris, recombinant proteins were purified with Ni-NTA beads. After a gradient wash with washing buffer (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 / 20 / 40 mM imidazole, pH 8.0) , the proteins were eluted with elute buffer (20 mM Tris-HCl, 300 mM imidazole, pH 8.0) . Proteins concentration were determined by BCA assay according to manufacturer’s protocol.

[0241] Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) analysis

[0242] The FRAP experiments were performed on the Nikon A1R SI Confocal or the Zeiss LSM980. Defined regions were photobleached with the 561-nm laser beam or the 488-nm laser beam. Fluorescence signals were acquired without time interval and normalized to the signals prior to bleaching, and quantified by Mean ROI of Image J Fiji.

[0243] Adenovirus (Adv) , Adeno-Associated Virus (AAV) production and delivery

[0244] Adv were packaged and produced in HEK293A cells. In brief, cells were amplified in AD293 cells in large scale and purified by CsCl density gradient ultracentrifugation. The adenovirus titer was measured by the optimal density (OD) at 260 nm on a UV spectrophotometer, then calculate the particle concentration of the virus using the following formula (OD260 × 1012 = virus particle / mL) . Add sterile glycerol to the virus preparation to a final concentration of 10%and store at -80℃. AAV was produced in HEK293T cells by the three plasmids-based methods as previously described. Briefly, sub-confluent cells were co-transfected with the three plasmids by using PEI. At 48 hours post-transfection, cells were collected and lysed by treating with benzonase. AAV was purified via iodixanol gradient centrifugation, at 53,000 rpm for 2.5 hours at 16℃. Fractions of the virus were collected and diluted with 1× PBS, further concentrated in 100 kDa ultracentrifuge tube. The purified and concentrated virus were aliquoted and stored at -80℃. Virus titers were determined by qPCR with primers corresponding to the insert sequences. Adv and AAV delivery was performed via tail vein injection. For acute inactivation Sar1b and Surf4 gene, 1 × 1011 AAV-GFP or AAV-Cre expression viral genome copies were injected into each Sar1bfl / fl and Surf4fl / fl mouse simultaneously.

[0245] Diet induced Manganese Deficiency and Analysis of Atherosclerosis

[0246] Sar1b LKO mice were randomly divided into 4 dietary groups supplemented with increasing doses of Mn2+ in drinking water, fed with AIN-76A diet with no added manganese for 4 weeks. Mice were sacrificed by anesthetized followed with cervical dislocation. Liver, brain, and intestine tissues were excised immediately after euthanasia, flash frozen in liquid nitrogen, and stored at -80℃ for later use. WT mice receiving AAV-hPCSK9 D374Y were randomly divided into 5 dietary groups supplement with increasing doses of Mn2+ in drinking water, then fed with Western diet with no added manganese for 4 months. Mice were anesthetized and sacrificed, followed by perfusion with phosphate-buffered saline (PBS) and 4%paraformaldehyde (PFA) sequentially. The aortas were isolated and stained with Oil red O (Sigma-Aldrich) , photographed with Olympus stereo microscope equipped with a SCMOS camera. The lesion areas in thoracic aortic are quantified with Image J.

[0247] In vitro COPII droplet assay

[0248] Protein fluorescence labeling was performed by conjugating Cy3 NHS ester (AAT Bioquest) or Alexa 488 NHS ester (Thermo Fisher) to highly purified recombinant proteins following manufacturer’s instruction. Briefly, proteins were dialyzed against PBS (adjusted to pH 8.2 by Na2HCO3) and concentrated to ～0.6 mg / mL for SEC23 / SEC24. Cy3 NHS ester and Alexa 488 NHS ester dissolved in DMSO were incubated with corresponding recombinant proteins at room temperature for 1 hour. Free fluorophores were removed by dialyzed against PBS. Fluorescence labeled proteins were concentrated and stored at -80℃.

[0249] Freshly prepared recombinant SEC23 / SEC24 were mixed with previously fluorescence labeled SEC23 / SEC24 as the ratio of 100: 1. Phase separation was induced by diluting proteins into physiological salt condition (150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0) at room temperature. Purified MBP-IDR-GFP / MBP-IDR-TssS-GFP was diluted to indicated concentrations in 1.5 M NaCl buffer and phase separation was induced by adding Ppase protease at room temperature for 5 min. Liquid droplets of proteins were imaged in a glass-bottom cell culture dish using Zeiss spinning disk microscope.

[0250] To quantify the enrichment of indicated proteins in droplets, segmentation of droplets was performed by masking the droplets on SEC23 / SEC24 channel. The mean fluorescence intensity inside the droplet and outside the droplet were determined. After subtracting background obtained from droplet formation buffer under the same microscopy setting, enrichment scores were generated by dividing the mean intensity inside the droplet and the mean intensity outside the droplets.

[0251] Association analyses in populations

[0252] Genome-wide association data analysis of the MCU-MICU1 gene and lipid metabolism was performed using LocusZoom (http:  / / csg. sph. umich. edu / locuszoom / ) . Expression quantitative trait loci (eQTL) analysis for the SNP rs11000443 were carried out by the GTEx database.

[0253] Histology and Oil Red O staining

[0254] For histology analysis, the liver tissue was fixed in 4%PFA followed by paraffin embedding. Hematoxylin and eosin (H&E) staining were performed on 5 μm paraffin sections. For Oil Red O staining, the liver samples were embedded in OCT compound followed by snap freezing. Frozen tissues were cryo-sectioned at 8 μm and stained with Oil Red O following manufacturer’s protocol. Liver macrophages were visualized by immunohistochemical staining of F4 / 80.

[0255] Quantification and statistical analysis

[0256] All experimental data are shown as percentile distribution or mean ± SEM as indicated in the legends. Statistical analyses were performed using two-sided Student’s t tests for comparing the two groups with assumed normal distribution. P value < 0.05 was considered to be significant. Statistical significance levels have been denoted is the figure legends. All experimental results presented are representative ones from at least 3 independent experiments.

[0257] Example 7. Manganese regulates blood lipid levels in wild type adult mice

[0258] This example investigates the therapeutic potential of Mn2+ by using murine models.

[0259] The inventors first sought to estimate the safe doses of orally supplied Mn2+ by determining LD50 (median lethal dose) of Mn2+ in wild-type C57 / BL6 mice. A single oral gavage was administered at the concentrations up to 1g / kg of body weight (Fig. 66a) , and survival was monitored for one week. The LD50 was calculated to be ～286 mg / kg of body weight. Importantly, neither paralysis nor lethality was observed in mice receiving Mn2+ doses of 250 mg / kg or lower.

[0260] The inventors also assessed the kinetics of orally supplied Mn2+ in mice. Baseline blood samples were collected at time zero, followed by a single oral administration of 30 mg / kg Mn2+. Blood samples were collected at 0.25, 1, 2-, 4-, 8-and 24-hours post-administration to determine the Mn2+ concentration using ICP-MS. The calculated half-life of orally supplied Mn2+ in the blood was 2.18 hours (Fig. 66b) . Furthermore, the hepatic content of Mn2+ during this process was also examined. A rapid elevation within 4 hours was observed (Fig. 66c) , reflecting a quick distribution of exogenous Mn2+ into the liver.

[0261] Based on the above results, Mn2+ was administered to wild-type mice on normal diets by daily oral gavage of Mn2+ at the different doses (5, 10, 20, 40 mg / kg) for one month (Fig. 65a) . Even at the highest dose (40 mg / kg) , Mn2+ administration did not appear to alter body weight (Fig. 66d) . After only one week, the blood lipid levels in mice exhibited a bell-shape response to the Mn2+ dose administered (Fig. 65b-c&Fig. 66e) . Profiling of plasma lipids using size fractionation chromatography further revealed that a bell-shape regulation by Mn2+ on atherogenic lipoproteins including VLDL and LDL (Fig. 65 d-g) , with mice receiving Mn2+ at 5 mg / kg displayed highest lipid levels. Notably, in mice receiving the highest dose of 40 mg / kg, levels of LDL-Cholesterol (the major atherogenic lipid species) , were decreased by approximately 50%. Accordingly, similar bell-shape responses to administered Mn2+ were observed in plasma APOB levels. However, circulating levels of the conventional secretory proteins such as albumin remained unaltered, confirming the selective impact by the Mn2+messenger on lipoprotein secretion over general secretion (Fig. 65h-i) .

[0262] Taken together, these results provided evidence for the in vivo efficacy of Mn2+ treatment in blood lipid regulation.

[0263] Example 8. Manganese enables safe and selective regulation of blood lipid secretion

[0264] To systematically evaluate the specificity and safety of Mn2+ administration in blood lipid control in vivo, the inventors conducted transcriptomic analysis (RNA-Seq) to analyze mRNA profiles on liver samples from mice with Mn2+ administration 0, 5, and 20 mg / kg. PCA analysis of gene expression profiles showed little separation of all the samples receiving different Mn2+doses, indicating minimal changes in gene expression in the livers upon elevation of the Mn2+signal (Fig. 67a) . Differential expression analysis identified a limited number of genes that were significantly altered in the liver by Mn2+ administration. Of those genes, only 8 genes were up-regulated, while 17 genes were down-regulated in the liver from mice receiving 20mg / kg Mn2+, compared to control mice receiving mock administration (Fig. 67b) . Accordingly, gene set enrichment analysis (GSEA) showed moderate increased expression of genes in respiration chain complex assembly and decreased expression of genes in metal ion transport, probably owing to metabolic adaptations for exogenous manganese supply (Fig. 67c-f) . Meanwhile, little alteration was observed in stress related pathways including ER stress, mitochondria function, etc. Furthermore, immune blotting showed that no apparent cellular stress signs were observed compared to the control group, apart from the significant degradation in response to manganese as observed in TMEM165 (Fig. 67g) . Taken together, the transcriptome and biochemical analysis suggest grossly normal hepatic function in mice with Mn2+ administration with the dosage that produced lipid lowering effects in this study.

[0265] Histology analysis also revealed little alteration in liver morphology, though mild hepatic lipid accumulation was observed in mice receiving at the highest dose (Fig. 67h&68a-b) . Furthermore, no signs of immune cell infiltration or fibrosis was detected in all samples. Along the same line, plasma ALT and AST remained the same in all samples, indicating the absence of liver damage even in mice receiving at the highest dose of 40 mg / kg Mn2+ (Fig. 67i) . Further, most tissues in mice receiving Mn2+ exhibited normal histology indistinguishable from those in control mice (Fig. 68c) . Circulating levels of creatine kinase and ketones remained similar to those in control mice (Fig. 68d&e) , confirming overall healthy states in Mn2+ administered mice.

[0266] Example 9. Dietary manganese titration treats hypolipidemia in rare lipid disorders

[0267] In this example, similar study as shown in Example 5 was conducted to test a hypothesis on the potential of manganese therapy for treating broad spectrum lipid disorders. To test this hypothesis, the inventors first employed hepatic Sar1b-deficient mice (Sar1b LKO) , which exhibit hypolipidemia due to impaired COPII function and consequently lead to defective lipoprotein secretion. The inventors devised a treatment regimen involving varying doses of manganese supplementation through drinking water to quantitatively scrutinize the potential manganese therapy (Fig. 69a) , with the hypothesis that boosting the Mn2+ signal would rescue the hypolipidemia caused by crippled COPII function.

[0268] Consistent with the above, the diminished lipid levels in Sar1b LKO mice, including triglycerides, cholesterol and LDL-C, were significantly elevated when Mn2+ was supplemented in the drink for only 4 weeks (Fig. 69b-c&70a) . Consistent changes were also observed in the plasma FPLC profiles (Fig. 69d-e) . Importantly, the restorative impact on plasma lipids demonstrated a direct correlation with the administered manganese dosages, underscoring the tunable quality of the condensation-regulating manganese signal.

[0269] Consistent with a rescue of defects in lipoprotein transport, manganese supplementation also dose-dependently elevated the initially depleted levels of plasma APOB in Sar1b LKO mice, while plasma albumin remained unaltered (Fig. 69f) . This observation was further supported by H&E staining and Oil Red O staining, which revealed an alleviation in hepatic lipid accumulation in Sar1b LKO mice corresponding to the doses of supplied Mn2+ (Fig. 69g-i) . Meanwhile, other tissues including the heart, brain, gut and muscle appeared grossly normal (Fig. 70b) . Taken together, the data from genetic models of Sar1b LKO uncovered a specific and tunable effect of the manganese signal in treating hypolipidemia, representing one end of the spectrum of lipid disorders.

[0270] Example 10. Dietary manganese titration treats pathological hyperlipidemia

[0271] In this example, the inventors further examined the potential of manganese therapy for treating the common, hyperlipidemia, whether such therapeutic effects could even turn into the reversal of atherosclerotic plagues. To this end, the inventors employed an established pathological model with ectopic PCSK9 expression and western diet feeding, which effectively induce hyperlipidemia and atherosclerosis (Kumar, S., Kang, DW., Rezvan, A. et al. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Lab Invest 97, 935 945 (2017) . ) . To precisely control manganese levels during the pathogenic phase, 0.02g / L Mn2+ was supplied in drinking water by a customized Mn-deficient western diet. This level of Mn2+ supply mimics the normal dietary manganese supply. Following an examination to confirm the establishment of pathogenic hyperlipidemia and atherosclerosis in the afore-described disease model, these mice would be subjected to the therapeutic phase, during which the mice were randomly assigned to the control vehicle group (control) or one of the three treatment groups with Mn2+ provided in drinking water at doses of 0.2, 0.6, or 1 g / L (Fig. 71a) .

[0272] After 16 weeks of pathogenic induction, the mice developed hyperlipidemia as expected (Fig. 72a) and were then subjected to the manganese treatment for another 12 weeks. A 1.53%increase of plasma cholesterol was observed in the control group compared to the baseline at the initiation of the treatment phase, further supporting the successful establishment of the pathogenic model. Of note, Mn2+ treatment led to a dose-dependent reductions in total circulating cholesterol from the baseline in the groups, with a 25.63%reduction by 0.2 g / L Mn2+, a 57.96%reduction by 0.6 g / L Mn2+, and a 71.61%reduction by 1 g / L Mn2+ (Fig. 71b-c) . Similar dose-dependent reductions were also observed in plasma LDL-C (Fig. 71d-e) and TG (Fig. 72b-c) . Profiling of plasma lipids by size fractionation chromatography further confirmed the reduction of atherogenic lipoproteins including VLDL and LDL (Fig. 71 f-g, quantified in S4d-e) . Accordingly, Mn2+ treatment decreased plasma APOB levels in a dose-dependent manner (Fig. 71h) . Of note, plasma ALT and AST levels, while slightly elevated by the atherogenic diets, were even reduced in the Mn2+ treatment groups compared to the controls (Fig. 71i) . Blood ketones and plasma creatine kinase remained unchanged in all groups (Fig. 72f-g) .

[0273] In conclusion, the results demonstrated that Mn2+ treatment enabled the quantitative reduction of the pro-atherogenic lipids, without inducing apparent liver damages.

[0274] Example 11. Dietary manganese titration enables plaques reversal

[0275] As shown in Example 10, Mn2+ treatment enabled substantial and sustained reduction in atherogenic lipids in the circulation. In this example, the therapeutic potential of Mn2+ treatment in the reversal of atherosclerotic plagues is explored. The inventors utilized the afore-described murine models of hyperlipidemia, in which extensive atherosclerotic plaques were developed in mice after 16 weeks of pathogenic induction (Fig. 73a &74a) .

[0276] Strikingly, after a 12-week treatment period, fluorescence and magnetic particle imaging in vivo demonstrated that Mn2+ treatment led to a substantial reduction in plaque volumes from baseline. En face staining of the aorta further confirmed a similar dose-dependent plaque reversal responding to Mn2+ treatment from the baseline, with a 2.25%reduction by 0.2 g / L Mn2+, a 35.67%reduction by 0.6 g / L Mn2+, and a 71.98%reduction by 1 g / L Mn2+, in sharp contrast to a 13.11%increase in the control group (Fig. 71 b-d) . Strikingly, Mn2+ treatment at the 1 g / L dose led to near complete reversal of atherosclerotic plaques developed during the 4-month pathogenic phases. Moreover, biomarkers of systematic inflammation and cardiovascular conditions, including plasma myeloperoxidase (MPO) and C-reactive protein (CRP) , also exhibited significant decreases in response to Mn2+ doses in the treatment groups, compared to controls (Fig. 73e-f) .

[0277] Taken together, these data in murine disease models demonstrate the feasibility of manganese-based therapy for cardiovascular diseases via intensive lipid-lowering.

[0278] Materials and Methods

[0279] This section describes the materials and methods used in Examples 7-11.

[0280] Animal models

[0281] All animal housing and use were approved by the Institutional Animal Care and Use Committees of Peking University, an AAALAC accredited laboratory animal facility. Mice were housed under standardized conditions, including a temperature of 22℃, a 12-hour light / dark cycle, and a humidity level of 40%-60%. Mice had free access to food and water, unless otherwise specified. Male mice were used in all experiments. Mice were randomly assigned to different experimental groups. For treating hypolipidemia experiments, Sar1bfl / fl mice (KOMP: 061774, RRID: MMRRC_061774-UCD) were injected with adeno-associated virus (AAV) containing thyroxine-binding globulin (TBG) driven Cre recombinase (AAV-TBG-Cre) to generate Sar1b liver-specific knockout mice (Sar1b LKO) . Sar1b LKO mice were fed ad lib with AIN-76A diet with no added manganese, and have free access to water supplemented with Mn2+at corresponding doses as indicated. For murine models of hyperlipidemia and atherosclerosis, 6-week-old wild type mice receiving AAV-hPCSK9D374Y were fed ad lib with manganese deficient Western diets (MolDiets, M20120701) and water containing 0.02 g / L Mn2+ for 16 weeks to induce hyperlipidemia and atherosclerotic lesions. Then they were randomly allocated to 4 groups with extra Mn2+ supplemented in drink as indicated for another 12 weeks.

[0282] Determination of Mn LD50

[0283] To determine the LD50 of Mn, a single oral gavage was given to mice with 0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4, 0.5 or 1 g / kg MnCl2 in 0.2 mL H2O (n=4 for per dose) . The survival of the mice was monitored for one week. Mice received with doses of 0.4, 0.5, and 1 g / kg exhibited paralysis within minutes and subsequently died. No signs of paralysis or lethality were observed at any time with doses equal to or lower than 0.25 g / kg.

[0284] Plasma characterization and fast-protein liquid chromatography (FPLC) analysis

[0285] Blood samples were collected from tail tips of 16-h fasted mice via heparin capillary. Plasma was obtained by centrifugation at 6000 rpm, 4℃ for 10 min. Triglyceride, total cholesterol, LDL-Cholesterol, ALT / GPT, AST / GOT, creatine kinase, and ketone levels were measured using respective commercial kits (TR0100 of Sigma; 000180 of Zhongsheng beikong; A113-1-1 of Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute; 000000010, 000000020, N / A of Zhongsheng beikong; BC5060 of Solarbio, respectively) according to the manufacturer’s protocol. For FPLC analysis, pooled plasma samples of the same treatment were fractionated using Superose 6 columns. Fractions were collected at a flow rate of 0.5 mL / min for subsequent cholesterol and triglyceride measurements.

[0286] Adeno-Associated Virus (AAV) vector and viral delivery

[0287] AAV packaging and purification were carried out as previously described (ref) . AAV were delivered via tail vein injection. To obtain Sarlb LKO mice, each Sar1bfl / fl mouse at 6-week-old was simultaneously injected with 1E11 of AAV-TBG-Cre viral particles. For murine models of hyperlipidemia, each wild type mice were received 2E10 of hPCSK9D374Y viral particles.

[0288] RNA extraction and RNA-seq analysis

[0289] Total RNA was extracted from frozen liver samples using Trizol reagent following the manufacturer’s instructions. mRNA-seq analysis was performed by Novogene, Beijing, using the Illumina Novaseq 6000 platform. The following data analysis pipeline was employed for total liver mRNA-seq. Paired-end reads in the Fastq format with a length of 150 bp were downloaded, and FastQC was employed for pre-mapping sequencing quality assessment. The reads were then mapped to the mouse genome (mm10) using HISAT2 with default parameters, specifically selecting uniquely mapped reads. The raw gene counts for each sample using htseq-count from HTSeq and Fragments Per Kb of exon per Million mapped reads (FPKM) were calculated using StringTie. Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 and the differential expressed genes with fold change greater than 2 and FDR less than 0.05 were visualized as volcano plot by ggplot2. The Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) was performed on the ranked data sets according to log2 (Foldchange) by ClusterProfiler using the Gene Ontology (GO) database.

[0290] Metal measurement using ICP-MS

[0291] The liver samples from mice were subjected to acid digestion using 100%HNO3 at 140℃ for 30 min. The microelement content was then measured using Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS) on a PerkinElmer NexION 350X instrument. To measure metal concentrations in the plasma, plasma samples were diluted with a diluent containing 4%isopropanol, 1%NH3 / H2O, 0.01%EDTA, and 0.01%Triton X-100. The diluted samples were analyzed using ICP-MS / MS on an Agilent 8900 instrument. Calibration was performed using the internal standard 45Sc and a serial dilution of an external standard mix prepared from Agilent 5183-4688.

[0292] Immunoblotting

[0293] Liver samples were lysed using ice-cold lysis buffer containing 50 mM Tris-Cl (pH 7.4) , 137 mM NaCl, 1 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 1%Nonidet P-40, and 10%glycerol, supplemented with protease inhibitor tablets (Roche) , followed by centrifugation at 13,000 rpm for 10 min to obtain solubilized lysates. Proteins were resolved by 3 to 15%Tris-acetate SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulose membranes, followed by analyzed by indicated antibodies.

[0294] Histology

[0295] Tissue samples were collected and fixed in 4%PFA. Tissue embedding, sectioning, and hematoxylin and eosin (H&E) staining were performed Pathology Center at Peking University or Beijing ZKWB-Bio Biotechnology Co., Ltd. For Oil Red O staining, tissues were embedded in OCT compound and snap-frozen. Cryo-sections with a thickness of 8 μm were obtained and stained with Oil Red O as per the manufacturer's instructions. Immunohistochemistry was performed on paraffin-embedded liver sections. Deparaffinization and rehydration were followed by antigen retrieval. The sections were blocked with 10%goat serum for 30 min and incubated overnight at 4℃ with primary antibodies diluted in blocking buffer. Subsequently, the sections were incubated with secondary antibodies for 2 h at room temperature. Finally, visualization was achieved by using DAB (3, 3'-diaminobenzidine) staining.

[0296] Quantification of hepatic triglycerides and cholesterol

[0297] Liver samples were weighed and then homogenized in PBS. Lipids were extracted from the homogenates following established protocols of modified Bligh-Dyer method. In summary, the homogenates were vigorously mixed with a chloroform-methanol mixture (2: 1) . After centrifugation, the organic phase was carefully collected and concentrated using a rotary evaporator under vacuum. The resulting lipid extract was reconstituted in a solution of 15%Triton X-100 in ddH2O. The quantification of triglycerides and cholesterol was performed as previously outlined.

[0298] in vivo and en face analysis of atherosclerosis

[0299] 12 hours prior to in vivo imaging of atherosclerosis, mice were intravenously injected with 5HFeC NPs (7.5 mg Fe per kg weight) . Fluorescence imaging was performed using the IVIS spectrum (PerkinElmer, USA) , and quantitative analysis was done using Living Image Software (Caliper Life Sciences) . Magnetic Particle Imaging (MPI) imaging was performed using an MPI scanner (MOMENTUM, Magnetic Insight, Inc., Alameda, CA, USA) with specific parameters. The MPI images were analyzed using VivoQuant software. The 5HFeC NPs with active myeloperoxidase (MPO) targeting ability and related imaging equipment were obtained from CAS Key Laboratory of Molecular Imaging, Institute of Automation, Chinese Academy of Sciences. For en face analysis of atherosclerosis, the isolated aortas were stained with Oil red O and photographed using an Olympus stereo microscope equipped with an SCMOS camera. The lesion areas in the thoracic aorta were quantified using Image J.

[0300] Quantification and statistical analysis

[0301] All experimental data are presented as percentiles or mean ± SEM, as indicated in the figure legends. Sample sizes were not predetermined using statistical methods. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 9. Two-tailed Student's t-test or one-way ANOVA with Tukey's post-hoc test was used for calculating statistical significance, as specified in the figure legends. Results were considered significant when P < 0.05. Statistical significance levels were indicated in the figure legends. The presented experimental results are representative of at least 3 independent experiments. Mouse experiments were conducted with random allocation. Imaging and histology were reviewed in a blinded fashion.

Claims

1.A method of lowering plasma lipids in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a condensation-promoting factor.2.The method according to claim 1, wherein the condensation-promoting factor is manganese.3.The method according to claim 2, wherein the manganese is provided as divalent manganese.4.The method according to claim 3, the divalent manganese is provided as manganese chloride, manganese nitrate, manganese sulfate, manganese acetate, manganese thiocyanate, manganese stearate, or manganese ascorbate.5.The method according to any one of claims 2 to 4, wherein the manganese is administered in addition to the manganese existed in normal diet of the subject.6.The method according to any one of claims 2 to 5, wherein the manganese is administered in an amount of about 0.01-100 mg / kg body weight of the subject, preferably 0.02-80 mg / kg body weight of the subject, more preferably 0.03-60 mg / kg body weight of the subject, even more preferably 0.04-50 mg / kg body weight of the subject.7.The method according to claim 6, wherein the administration is on a daily basis.8.The method according to any one of claims 2 to 7, wherein the manganese is administered in an amount that is about 2-fold, about 3-fold, about 4-fold, about 5-fold, about 10-fold, about 20-fold, about 30-fold, about 40-fold, or about 50-fold higher than the manganese amount existed in a normal diet of the subject.9.The method according of any one of claims 1 to 8, further comprising administering a mitochondrial uncoupler.10.The method according to claim 9, wherein the mitochondrial uncoupler is Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxy phenylhydrazone or 2, 4-dinitrophenol.11.The method according to any one of claims 1 to 11, the plasma lipids are atherogenic lipids.12.The method according to claim 11, wherein the atherogenic lipids include one or more of claim low-density lipoprotein (LDL) -cholesterol (LDL-C) , very-low-density lipoprotein (VLDL) -cholesterol (VLDL-C) , intermediate-density lipoprotein (IDL) -cholesterol (IDL-C) , non-high-density lipoprotein (non-HDL) -cholesterol (non-HDL-C) , apolipoprotein B (APOB) , ApoB-containing lipoprotein, and triglycerides.13.The method according to any one of claims 1 to 12, wherein the subject has atherosclerosis, risk of developing atherosclerosis, hypercholesterolemia, dyslipidemia, coronary heart disease, a history of coronary heart disease, early onset coronary heart disease, risk of developing coronary heart disease, type II diabetes with dyslipidemia, hypertriglyceridemia, hyperlipidemia, hyperfattyacidemia, hepatic steatosis, non-alcoholic steatohepatitis, or non-alcoholic fatty liver disease.14.A method of lowering plasma lipids in a subject in need thereof, comprising inhibiting the expression of a gene encoding for mitochondrial calcium uniporter (MCU) .15.The method according to claim 14, wherein the gene inhibition is achieved by gene nuclease-based gene editing.16.A method of treating or preventing dyslipidemia in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a condensation-promoting factor, preferably manganese, more preferably divalent manganese.17.A method of treating or preventing a disease, disorder or condition related to or resulted from dyslipidemia in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a condensation-promoting factor, preferably manganese, more preferably divalent manganese.18.The method according to claim 17, wherein the disease, disorder or condition related to or resulted from dyslipidemia can be cardiovascular disease (CVD) , or atherosclerotic cardiovascular disease (ASCVD) .19.The method of any one of claims 16 to 18, wherein the divalent manganese is provided as manganese chloride, manganese nitrate, manganese sulfate, manganese acetate, manganese thiocyanate, manganese stearate, or manganese ascorbate.20.The method according to any one of claims 16 to 19, the divalent manganese is administered in addition to the divalent manganese existed in normal diet of the subject.21.The method according to any one of claims 16 to 20, wherein the manganese is administered in an amount of about 0.01-100 mg / kg body weight of the subject, preferably 0.02-80 mg / kg body weight of the subject, more preferably 0.03-60 mg / kg body weight of the subject, even more preferably 0.04-50 mg / kg body weight of the subject.22.The method according to claim 21, wherein the administration is on a daily basis.23.The method according to any one of claims 16 to 22, wherein the manganese is administered in an amount that is about 2-fold, about 3-fold, about 4-fold, about 5-fold, about 10-fold, about 20-fold, about 30-fold, about 40-fold, or about 50-fold higher than the manganese amount existed in a normal diet of the subject.24.The method according of any one of claims 16 to 23, further comprising administering a mitochondrial uncoupler.25.The method according to claim 24, wherein the mitochondrial uncoupler is Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxy phenylhydrazone or 2, 4-dinitrophenol.26.A method of treating chylomicron retention disease in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a condensation-promoting factor.27.The method according to claim 26, wherein the condensation-promoting factor is manganese.28.The method according to claim 27, wherein the manganese is provided as divalent manganese.29.The method according to claim 28, the divalent manganese is provided as manganese chloride, manganese nitrate, manganese sulfate, manganese acetate, manganese thiocyanate,  manganese stearate, or manganese ascorbate.30.The method according to any one of claims 27 to 29, wherein the manganese is administered in addition to the manganese existed in normal diet of the subject.31.The method according to any one of claims 27 to 30, wherein the manganese is administered in an amount of about 0.01-100 mg / kg body weight of the subject, preferably 0.02-80 mg / kg body weight of the subject, more preferably 0.03-60 mg / kg body weight of the subject, even more preferably 0.04-50 mg / kg body weight of the subject.32.The method according to claim 31, wherein the administration is on a daily basis.33.The method according to any one of claims 27 to 32, wherein the manganese is administered in an amount that is about 2-fold, about 3-fold, about 4-fold, about 5-fold, about 10-fold, about 20-fold, about 30-fold, about 40-fold, or about 50-fold higher than the manganese amount existed in a normal diet of the subject.34.The method according of any one of claims 26 to 33, further comprising administering a mitochondrial uncoupler.35.The method according to claim 34, wherein the mitochondrial uncoupler is Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxy phenylhydrazone or 2, 4-dinitrophenol.36.The method according to any one of claims 1-35, wherein the subject is human.37.The method according to claim 36, wherein the manganese is administered in an amount of about 0.04-1 mg / kg body weight of the subject, such as about 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 mg / kg body weight of the human subject.38.The method according to any one of claims 1-35, wherein the subject is a rodent, such as mouse.39.The method according to claim 38, wherein the manganese is administered in an amount of about 10-50 mg / kg body weight of the rodent subject, such as about 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 mg / kg body weight of the rodent subject.

Images