Lipid nanoparticle formulations and methods of use thereof

Abstract

It relates, in part, to lipid nanoparticles (LNPs) comprising a payload molecules (i.e., nucleic acid molecules and / or therapeutic agents) and methods of use thereof for in vivo delivery of the payload molecules to a target cell or tissue. In certain embodiments, the payload molecules comprise polypeptides, nucleic acids molecules, enzymes, or any combination thereof. In certain embodiments, the target cell is a hematopoietic stem cells (HSCs). In certain embodiments, it relates to the use of the LNPs described herein for the treatment, prevention, and / or amelioration of diseases and / or disorders in a subject, including but not limited to blood disorders.

Description

LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS AND METHODS OF USE THEREOF1. FIELD

[0001] The present disclosure generally relates to lipid nanoparticle (LNP) comprising a payload molecules (i.e., nucleic acid molecules and / or therapeutic agents) and methods of use thereof for in vivo delivery of the payload molecules to a target cell or tissue.2. DESCRIPTION OF THE RELATED ART

[0002] There are many challenges associated with manipulation in vivo , e.g., modification of specific cells, represents a continuing medical challenge. Modifying a cell in vivo , e.g., for delivery of nucleic acid molecules such as mRNA, or delivery of other payloads, is challenging for many reasons, including the difficulty in specifically targeting cells of interest in vivo to modify them.

[0003] Hematopoietic stem cells (HSCs) are vital adult stem cells that can self-renew and rebuild the entire human hematopoietic system. Ex vivo gene therapy strategies involve the collection of patient HSCs, genetically modifying and transplanting these HSCs, but the process can be harmful due to bone marrow (BM) transplantation and conditioning. Gene editing of hematopoietic stem cells (HSCs) with lipid nanoparticles (LNPs) has not been reported.

[0004] Thus, there exists a need to develop methods and compositions that can target desired cells and deliver a payload for modifying the cells in vivo. In particular, modification of stem or progenitor cells to thereby modify many cell types in a particular lineage in vivo would be of tremendous benefit.3. SUMMARY

[0005] The present disclosure provides a lipid nanoparticle (LNP) comprising: a payload; the payload modifies the mammal bone marrow cells, e.g., bone marrow monocytes, an hematopoietic stem / progenitor cells (HSPCs) .

[0006] Further disclosed here is a pharmaceutical composition comprising a lipid nanoparticle (LNP) composition, and a pharmaceutically acceptable excipient. Also disclosed here is a pharmaceutical composition comprising a lipid nanoparticle (LNP) composition and a pharmaceutically acceptable excipient. Also disclosed here is a method of delivering a polynucleotide encoding at least one protein of interest to a cell.

[0007] In an aspect, it provides a lipid nanoparticle (LNP) composition comprising:

[0008] an optional payload, wherein the payload modifies a cell, said cell is selected from the  group consisting of a stem or progenitor cell, a bone marrow cell and a CD34+ cell ;

[0009] a lipid nanoparticle (LNP) .

[0010] In another embodiment, the bone marrow cell is from human.

[0011] In another embodiment, the stem or progenitor cell is from human.

[0012] In another embodiment, the CD34+ cell is from human.

[0013] In another embodiment, the hematopoietic stem or progenitor cell (HSPC) is from human.

[0014] In another embodiment, the bone marrow cell comprises a bone marrow monocyte, a bone marrow B cell, a bone marrow memory B cell, or a bone marrow T cell.

[0015] In another embodiment, the stem or progenitor cell comprises a hematopoietic stem / progenitor cell (HSPC) , an erythroid progenitor cell, a myeloid progenitor cell, a common lymphoid progenitor cell, a multipotent progenitor cell, or a multipotent stem cell.

[0016] In an embodiment, the lipid nanoparticle (LNP) comprises: (a) an ionizable lipid.

[0017] In another embodiment, the lipid nanoparticle (LNP) further comprises one or more selected from the group consisting of: (b) a phospholipid; (c) a structural lipid; (d) a polymer conjugated lipid.

[0018] In an embodiment, the phospholipid is selected from the group consisting of 1.2-dilinoleoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine (DLPC) , 1.2-dimyristoyl-sn-glycero-phosphocholine (DMPC) , 1.2-dioleoy 1-sn-gly cero -3 -pho sphocholine (DOPC ) , 1.2-dipalmitoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine (DPPC) , 1.2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , 1.2-diundecanoyl-sn-glycero-phosphocholine (DUPC) , l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) , 1.2-di-O-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine, sl-oleoyl-2-cholesterylhemisuccinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1.2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1.2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1.2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1.2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanola mine (DOPE) , 1.2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1.2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1.2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,  1.2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1.2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1.2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1.2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac- (l-glycerol) sodium salt (DOPG) , sphingomyelin, and combinations thereof.

[0019] In an embodiment, the structural lipid is selected from the group consisting of cholesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, tomatidine, ursolic acid, alpha-tocopherol.

[0020] In an embodiment, the polymer conjugated lipid is selected from the group consisting of PEG-modified phosphatidylethanolamines, PEG-modified phosphatidic acids, PEG-modified ceramides, PEG-modified dialkylamines, PEG-modified diacylglycerols, and PEG-modified dialkylglycerols. For example, a PEG lipid may be PEG-dioleoylgylcerol (PEG-DOG) , PEG-dimyristoyl-glycerol (PEG-DMG) , PEG-dipalmitoyl-glycerol (PEG-DPG) , PEG-dilinoleoyl-glycero-phosphatidyl ethanolamine (PEG-DLPE) , PEG-dimyrstoyl-phosphatidylethanolamine (PEG-DMPE) , PEG-dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine (PEG-DPPE) , PEG-distearoylglycerol (PEG-DSG) , PEG-diacylglycerol (PEG-DAG, e.g., PEG-DMG, PEG-DPG, and PEG-DSG) , PEG-ceramide, PEG-distearoyl-glycero-phosphoglycerol (PEG-DSPG) , PEG-dioleoyl-glycero-phosphoethanolamine (PEG-DOPE) , 2- [ (polyethylene glycol) -2000] -N, N-ditetradecylacetamide, or a PEG-distearoyl-phosphatidylethanolamine (PEG-DSPE) lipid, and mixtures thereof.

[0021] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (I) , (Ⅱ) , (Ⅲ) , (Ⅳ) , (Ⅴ) and (VI) ;

[0022] wherein in Formula (I) , the definition of A, B, G1, G2, X, Y, U, n, Rx is described in Patent Application No. CN202210725548.7;

[0023] wherein in Formula (II) , the definition of R1, R2, R3, R4, L1 is described in Patent Application No. CN202211695784.5 in Formula (I) ;

[0024] wherein in Formula (III) , the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, G1, L1, L2, L3, a, b, c, d, e, f is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 100791 in Forumula (I) ;

[0025] In particular, in Formular (III) ,

[0026] G1 is - (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-6;

[0027] R1 and R2 are, at each occurrence, each independently either: (a) C1-C6 alkyl; or (b) together with the N connecting them form a 3-8-membered heterocyclic group; or (c) together with any C in G1 form a 3-8-membered heterocyclic group;

[0028] L1 is O, N, S or absent;

[0029] R3, R4, R5, R6, R7 are each independently selected from H, C1-8 alkyl or -O-C2-12 alkenyl; a, b are each independently selected from a positive integer of 1-10;

[0030] L2 is O, N, S or absent;

[0031] R8, R9, R10, R11, R12 are each independently selected from H or C1-8 alkyl;

[0032] c, d are each independently selected from a positive integer of 1-10;

[0033] L3 is selected from O, N, S or absent;

[0034] R13, R14, R15, R16, R17 are each independently selected from H, C1-8 alkyl or -O-C2-12 alkenyl;

[0035] e, f is each independently selected from a positive integer of 1-10;

[0036] In certain embodiments of the present invention, wherein, G1 is -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2-; or R1, R2 are (1) each independently methyl, ethyl or propyl; or (2) together with the N connecting them form a 5 or 6-membered heterocyclic group;

[0037] In other of the foregoing embodiments, wherein, one of R1 and R2 together with any C in G1 form a 5 or 6 membered heterocyclic group, the other one is methyl, ethyl or propyl;

[0038] In certain embodiments of the present invention, wherein, L1 is or absent; At least two of R3, R4 and R5 are not H, R6 and R7 are H;

[0039] a is selected from a positive integer of 1-10 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10) ;

[0040] b is 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9;

[0041] In certain embodiments of the present invention, wherein, L2 is or absent, preferably absent;

[0042] R8, R9, R10, R11, R12 are independently H; c, d are independently selected from a positive integer of 1-10; For example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.

[0043] In certain embodiments of the present invention, the sum of c and d is 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10;

[0044] In certain embodiments of the present invention, L2 is absent, the sum of c and d is 5, 6, 7, 8, 9, 10;

[0045] In certain embodiments of the present invention, wherein, L3 is R13, R14 are each hydrogen; At least two of R15, R16 and R17 are not H; e is 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9; f is selected from a positive integer of 1-10, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;

[0046] wherein in Formula (IV) , the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, G1, L1, L2, L3, L4, a, b, c, d, e, f, g is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 100823 in Formula (I) ;

[0047] In particular, in Formula IV,

[0048] Wherein,

[0049] G1 is - (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-6,

[0050] R1 and R2 are (a) each independently selected from C1-C6 alkyl, alkoxyl, 0 to 3 H in the foregoing alkyl and alkoxyl, at each occurrence, are further substituted by halogen, hydroxyl, C1-6 alkyl, C1-6 alkoxyl, halogen substituted C1-6 alkyl or hydroxyl substituted C1-6 alkyl; optionally, (b) at each occurrence, together with the N connecting them form a 3-8-membered heterocyclic group; or (c) any of R1 and R2 together with any C in G1 form a 3-8-membered heterocyclic group, in which, at each occurrence, 0 to 3 cyclic C are further substituted by O, N, S and 0 to 3 H are further substituted by halogen, hydroxyl, C1-6 alkyl, C1-6 alkoxyl, halogen substituted C1-6 alkyl or hydroxyl substituted C1-6 alkyl;

[0051] L1 is selected from alkynyl, O, N, S or absent; h, i, k selected from a positive integer of 1-10; j is 0 or 1;

[0052] R3, R4, R5, R6, R7 are each independently H, C1-12 alkyl, C1-12 alkenyl, C1-12 alkynyl or C1-12 alkoxyl; 0 to 3 H in the foregoing alkyl, alkenyl, alkynyl or alkoxyl, at each occurrence, are further substituted by halogen, hydroxyl, C1-12 alkyl, C1-12 alkoxyl, halogen substituted C1-12 alkyl or hydroxyl substituted C1-12 alkyl;

[0053] a, b is each independently selected from a positive integer of 1-10;

[0054] L2 is alkynyl, O, N, S or absent; h, I, k are selected from a positive integer of 1-10; j is 0 or 1;

[0055] R8, R9, R10, R11, R12 are each independently H, C1-12 alkyl, C1-12 alkenyl, C1-12 alkynyl or C1-12 alkoxyl; 0 to 3 H in the foregoing alkyl, alkenyl, alkynyl or alkoxyl, at each occurrence, are further substituted by halogen, hydroxyl, C1-12 alkyl, C1-12 alkoxyl, halogen substituted C1-12 alkyl or hydroxyl substituted C1-12 alkyl;

[0056] c, d are each independently selected from a positive integer of 1-10;

[0057] L3, L4 are each independently selected from alkynyl, O, N, S or absent; l, n are selected from a positive integer of 1-10; m is 0 or 1;

[0058] R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19 are each independently H, C1-12 alkyl, C1-12 alkenyl, C1-12 alkynyl or C1-12 alkoxyl; 0 to 3 H in the foregoing alkyl, alkenyl, alkynyl or alkoxyl, at each occurrence, are further substituted by halogen, hydroxyl, C1-12 alkyl, C1-12 alkoxyl, halogen substituted C1-12 alkyl or hydroxyl substituted C1-12 alkyl;

[0059] e, f, g are each independently selected from a positive integer of 1-10;

[0060] In certain embodiments of the present invention, G1 is -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2-, 0 or 1 or 2 H in said methyl, ethyl, propyl or butyl optionally further substituted with halogen, hydroxyl or C1-3 alkyl groups; or R1, R2 are together with the N connecting them form a 5 or 6-membered heterocyclic group, in which, at each occurrence, 0 or 1 or 2 cyclic C are optionally further substituted by N, O, S and 0 or 1 or 2 H are optionally further substituted by halogen, hydroxyl or C1-3 alkyl;

[0061] In certain embodiments of the present invention, one of R1, R2 together with any C in G1 form a 5 or 6-membered heterocyclic group, the other one of R1, R2 is methyl, ethyl, propyl or butyl; In foregoing methyl, ethyl, propyl and butyl, at each occurrence, 0 or 1 or 2 H are further optionally substituted by halogen, hydroxyl, C1-3 alkyl; In foregoing  heterocyclic group, at each occurrence, 0 or 1 or 2 cyclic C are further optionally substituted by N, O, S and 0 or 1 or 2 H are further optionally substituted by halogen, hydroxyl, C1-3 alkyl;

[0062] In certain embodiments of the present invention,

[0063] L1 is

[0064] alkynyl, O or absent; h, I, k are each independently selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10; j is 0 or 1; At least two of R3, R4, R5 are not H; R6 and R7 are H;

[0065] a is selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10; .

[0066] b is selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10;

[0067] Preferably, at least one of a and b is not 0 or both a and b are not 0;

[0068] In some certain embodiments of the present invention,

[0069] L2 is alkynyl, O or absent; h is selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10;

[0070] R8 and R9 are each independently H, at least two of R10, R11 and R12 are not H;

[0071] c, d are each independently selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10; Preferably, at least one of c and d is not 0 of both c and d are not 0;

[0072] In some certain embodiments of the present invention,

[0073] L3, L4 are each independently selected from alkynyl, O or absent;

[0074] R13 and R14 are each independently H; At least two of R15, R16, R17, R18, R19 are not H; Preferably, at least two of R16, R18 and R19 are not H;

[0075] e, f, g are each independently selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10;

[0076] In certain embodiments of the present invention,

[0077] L3 is alkynyl, O or absent;

[0078] R13, R14 are each independently H; At least two of R15, R16 and R17 are not H; e, f are each independently selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10;

[0079] wherein in Formula V, the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, X, L1, L2, L3, L4, L5 is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421 in Formula (I) ;

[0080] In particular, in Formula V,

[0081] R1 is selected from -OH and Ra (Rb) N-, wherein Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C10 alkyl or C1-C10 haloalkyl;

[0082] R2 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0083] R3 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, or Rc- (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-14, more preferably a positive integer of 1-10;

[0084] Rc is selected from the structure as shown below:

[0085] wherein represents a connection bond;

[0086] L1, L2, L3, L4, L5 are absent or each independently selected from the group consisting of:

[0087] X is absent or -CH-or N;

[0088] R4 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0089] R5 is absent or C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0090] R6 is C1-C30 alkyl, C2-C30 alkenyl, C2-C30 alkynyl;

[0091] R7 is C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl;

[0092] R8, R9 are absent or is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S;

[0093] R10, R11 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl, or -Rh-C1-C14 alkyl, -Rh-C2-C14 alkenyl, -Rh-C2-C14 alkynyl, wherein Rh is O or S.

[0094] In another embodiment, Ra and Rb are each independently hydrogen, C1-C6 alkyl or C1-C6 haloalkyl.

[0095] In another embodiment, R2 is selected from - (CH2) m-, wherein m is a positive integer from 1-20, preferably, a positive integer from 1-14, preferably, a positive integer from 1-10, more preferably, a positive integer from 1-6.

[0096] In another embodiment, R6 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl.

[0097] In another embodiment, R2 is C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.

[0098] In another embodiment, R2, R7 is each independently C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0099] In another embodiment, R4, R5 is each independently - (CH2) q-CH3, wherein q is selected from a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-12, more preferably, a positive integer of 1-8.

[0100] In another embodiment, R4, R5 each independently has a structure -Rd-Re-; wherein Rd is absent or selected from the following functional group: - (CH2) - (CH=CH) -;

[0101] Re is - (CH2) p-CH3, wherein p is selected from a positive integer of 0-20, preferably, p is selected from a positive integer of 0-12, preferably, p is selected from a positive integer of 0-8.

[0102] In another embodiment, R8, R9 is each independently - (CH2) q-CH3, wherein q is selected from a positive integer of 1-14, preferably, a positive integer of 1-12, and preferably, a positive integer of 1-8.

[0103] In another embodiment, R7 is - (CH2) q-CH3, wherein q is selected from a positive integer of 1-14, preferably, a positive integer of 1-12, and preferably, a positive integer of 1-8.

[0104] In another embodiment, R6 has a structure -Rf-Rg-;

[0105] wherein Rf is selected from the following functional group: - (CH2) s1- (CH=CH) -CH2- (CH=CH) - (CH2) s2-CH3, s1 is a positive integer of 1-14, preferably, a positive integer of 1-10, and s2 is a positive integer of 1-8, preferably, a positive integer of 1-6;

[0106] Rg is - (CH2) m-, wherein m is a positive integer of 1-14, preferably, a positive integer of 1-10, more preferably, a positive integer of 1-6.

[0107] In another embodiment, R10, R11 is each independently C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl,  C2-C10 alkynyl or -Rh-C1-C10 alkyl, -Rh-C2-C10 alkenyl, -Rh-C2-C10 alkynyl, wherein Rh is O or S.

[0108] In another embodiment, R11 is C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl.

[0109] In another embodiment, R8, R9 is each independently C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl or -Rh-C1-C10 alkyl, -Rh-C2-C10 alkenyl, -Rh-C2-C10 alkynyl, wherein Rh is O or S.

[0110] In another embodiment, R9 is C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl.

[0111] In another embodiment, X is absent or -CH-.

[0112] In another embodiment, the compound of Formula V has a structure of Formula V-1 as follows:

[0113] wherein

[0114] R1-R2, R6-R11, L2-L5 are defined as above;

[0115] R3 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl.

[0116] In another embodiment, R3 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0117] In another embodiment, R3 is C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl.

[0118] In another embodiment, the compound of Formula V has a structure of Formula V-2 as follows:

[0119] wherein

[0120] R1-R2, R6-R7, R10-R11, L1-L5 are defined as above;

[0121] R3 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, or Rc- (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-14, more preferably a positive integer of 1-10, Rc is defined as above;

[0122] R5 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0123] R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.

[0124] In another embodiment, R5 is C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.

[0125] In another embodiment, R5 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0126] In another embodiment, R3 is C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.

[0127] In another embodiment, R3 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0128] In another embodiment, the compound of Formula V has a structure of Formula V-3 as  follows:

[0129] Wherein

[0130] R1-R3, R6, R7, R10, R11, L1-L5 are defined as above;

[0131] R4 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0132] R5 is C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0133] R8, R9 is each independently C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.

[0134] In another embodiment, R4 is C1-C14 alkyl, C2-C14 alkenyl, C2-C14 alkynyl.

[0135] In another embodiment, R4 is C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0136] In another embodiment, R5 is C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl.

[0137] In another embodiment, R8, R9 is each independently C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl.

[0138] In another embodiment, R9 is C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl.

[0139] In another embodiment, the compound of Formula V has a structure of Formula V-4 as follows:

[0140] Wherein

[0141] R1-R7, R10-R11, L1-L3, L5 are defined as above;

[0142] wherein in Formula VI, the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, G1, L1, L2 is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 116607 in Formula (I) .

[0143] In particular in Formular VI,

[0144] wherein

[0145] Each of R1 and R2 is independently selected from hydrogen, C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl or C1-C10 haloalkyl; or

[0146] R1 and R2 together with the N connecting them form a 4-10-membered heterocyclic group containing 1-3 heteroatoms selected from N, S and O;

[0147] G1 is - (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-15, preferably, a positive integer of 1-10, more preferably a positive integer of 1-6;

[0148] R3 is selected from hydrogen, substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, C3-C20 cycloalkyl, or or Ra-La-Rb, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, O- (C2-C15 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C15 haloalkyl, C1-C15 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2, Ra is - (CH2) s, s is a positive integer of 1-15, preferably, a positive integer of 1-10, La is selected from - (C=O) O-, -O (C=O) -, - (S-S) -, -O (S=O) -, - (C=O) S-, -S (C=O) -, - (C=S) O-, -NH (C=O) -, - (C=S) NH-, -NH (C=S) -, - (C=O) NH-, preferably - (C=O) O; Rb is selected from C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0149] R4 is - (CH2) m-, wherein m is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-15; more preferably a positive integer of 1-10;

[0150] L1 is selected from - (C=O) O-, -O (C=O) -, - (S-S) -, -O (S=O) -, - (C=O) S-, -S (C=O) -, - (C=S) O-, -NH (C=O) -, - (C=S) NH-, -NH (C=S) -, - (C=O) NH-, preferably - (C=O) O, -O (C=O) -;

[0151] R5 is selected from C1-C30 alkyl, C2-C30 alkenyl, C2-C30 alkynyl;

[0152] R6 is - (CH2) q-, wherein q is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-15; more preferably a positive integer of 1-10;

[0153] L2 is selected from - (C=O) O-, -O (C=O) -, - (S-S) -, -O (S=O) -, - (C=O) S-, -S (C=O) -, - (C=S) O-, -NH (C=O) -, - (C=S) NH-, -NH (C=S) -, - (C=O) NH-, preferably - (C=O) O, -O (C=O) -;

[0154] R7 is selected from substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more (preferably one or two) substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, O- (C2-C15 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C15 haloalkyl, C1-C15 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0155] In another embodiment, R7 is wherein Rc is - (CH2) p-, wherein p is a positive integer of 1-15, preferably, a positive integer of 1-10; more preferably a positive integer of 1-6; each Rd and Re is independently selected from C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl or Rd and Re together with their intervening atoms form an optionally substituted ring:

[0156] wherein x is selected from 1 or 2.

[0157] In another embodiment, each of R1 and R2 is independently selected from  hydrogen, C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl or C1-C6 haloalkyl.

[0158] In another embodiment, R1 and R2 together with the N connecting them form a 5-10-membered heterocyclic group containing 1-2 heteroatoms selected from N and O.

[0159] In another embodiment, R1 and R2 together with the N connecting them form a 5-7-membered heterocyclic group containing 1-2 heteroatoms selected from N and O.

[0160] In another embodiment, R3 is selected from substituted or unsubstituted C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, C3-C15 cycloalkyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, O- (C2-C10 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C10 haloalkyl, C1-C10 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0161] In another embodiment, R3 is selected from substituted or unsubstituted C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, C3-C10 cycloalkyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, O- (C2-C10 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C10 haloalkyl, C1-C10 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0162] In another embodiment, Rb is selected from C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl.

[0163] In another embodiment, R5 is selected from C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl.

[0164] In another embodiment, R5 is selected from C2-C12 alkenyl, C2-C12 alkynyl.

[0165] In another embodiment, R7 is selected from C1-C20 alkyl, C2-C12 alkenyl, C2-C12 alkynyl.

[0166] In another embodiment, R7 is selected from substituted C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents (preferably one or two) selected from the group consisting of: halogen, C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, O- (C2-C10 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C10 haloalkyl, C1-C10 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0167] In another embodiment, R7 is selected from substituted C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents (preferably one or two) selected from the group consisting of: halogen, C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, O- (C2-C10 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C10 haloalkyl, C1-C10 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0168] In another embodiment, the compound of Formula VI has a structure of Formula VI-1 as follows:

[0169] wherein

[0170] R1-R6, G1, L1 are defined as above;

[0171] R7 is selected from substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more (preferably one or two) substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, O- (C2-C15 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C15 haloalkyl, C1-C15 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0172] In another embodiment, R7 is selected from substituted C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents (preferably one or two) selected from the group consisting of: halogen, C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, O- (C2-C10 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C10 haloalkyl, C1-C10 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0173] In another embodiment, the compound of Formula VI has a structure of Formula VI-2 as follows:

[0174] wherein

[0175] R1-R6, G1, L1 are defined as above;

[0176] R7 is selected from C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl.

[0177] In another embodiment, R7 is selected from C1-C20 alkyl, C2-C12 alkenyl, C2-C12 alkynyl.

[0178] In another embodiment, R1-R7, G1, L1, L2 are the specific groups corresponding to each specific compound in the embodiment.

[0179] In an embodiment, the ionizable lipid is Compound (I) , which is described in Patent Application No CN202210725548.7 in Formula (I) .

[0180] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (I-1) , (I-1’) , which is described in Patent Application No. CN 202210725548.7 in Formula V-1 and V-2.

[0181] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of  Compound (I-1-1) , (I-1-2) , (I-1-3) , (I-1-4) , (I-1-5) , which is described in Patent Application No. CN 202210725548.7 in Table 3 (Compound1, 2, 3, 4, 5) .

[0182] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅱ) , which is described in Patent Application No. CN 202211695784.5 in Formula (I) .

[0183] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅱ-1) , (Ⅱ-2) , (Ⅱ-3) , (Ⅱ-4) , (Ⅱ-5) , (Ⅱ-6) , (Ⅱ-7) , (Ⅱ-8) , (Ⅱ-9) , (Ⅱ-10) , (Ⅱ-11) , (Ⅱ-12) , (Ⅱ-13) , (Ⅱ-14) , (Ⅱ-15) , (Ⅱ-16) , (Ⅱ-17) , (Ⅱ-18) , (Ⅱ-19) , which is described in Patent Application No. CN 202211695784.5 in Table 1 .

[0184] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅱ-1) , (Ⅱ-2) , (Ⅱ-3) , (Ⅱ-4) , (Ⅱ-5) , which is described in Patent Application No. CN 202211695784.5 in Table 1 (Compound1, 2, 3, 4, 5) .

[0185] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅲ) , which is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 100791 in Formula (I) .

[0186] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅲ-1) , (Ⅲ-2) , (Ⅲ-3) , (Ⅲ-4) , (Ⅲ-5) , (Ⅲ-6) , (Ⅲ-7) , (Ⅲ-8) , (Ⅲ-9) , (Ⅲ-10) , (Ⅲ-11) , (Ⅲ-12) , (Ⅲ-13) , (Ⅲ-14) , (Ⅲ-15) , (Ⅲ-16) , (Ⅲ-17) , (Ⅲ-18) , (Ⅲ-19) , (Ⅲ-20) , (Ⅲ-21) , (Ⅲ-22) , (Ⅲ-23) , (Ⅲ-24) , (Ⅲ-25) , (Ⅲ-26) , (Ⅲ-27) , (Ⅲ-28) , (Ⅲ-29) , (Ⅲ-30) , (Ⅲ-31) , (Ⅲ-32) , (Ⅲ-33) , (Ⅲ-34) , (Ⅲ-35) , which is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 100791 in Table 1.

[0187] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅳ) , which is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 100823 in Formula I.

[0188] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅳ-1) , (Ⅳ-2) , (Ⅳ-3) , (Ⅳ-4) , (Ⅳ-5) , (Ⅳ-6) , (Ⅳ-7) , (Ⅳ-8) , (Ⅳ-9) , (Ⅳ-10) , (Ⅳ-11) , (Ⅳ-12) , (Ⅳ-13) , (Ⅳ-14) , (Ⅳ-15) , (Ⅳ-16) , (Ⅳ-17) , (Ⅳ-18) , (Ⅳ-19) , (Ⅳ-20) , (Ⅳ-21) , (Ⅳ-22) , (Ⅳ-23) , (Ⅳ-24) , (Ⅳ-25) , (Ⅳ-26) , (Ⅳ-27) , (Ⅳ-28) , (Ⅳ-29) , (Ⅳ-30) , (Ⅳ-31) , which is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 100823 in Table 1.

[0189] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅳ-1) , (Ⅳ-2) , (Ⅳ-3) , (Ⅳ-4) , (Ⅳ-5) , (Ⅳ-6) , (Ⅳ-7) , (Ⅳ-8) , (Ⅳ-9) , (Ⅳ-10) , (Ⅳ-11) , (Ⅳ-12) , (Ⅳ-13) , (Ⅳ-14) , which is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 100823 in Table 1.

[0190] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅴ) , which is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421 in Formula I.

[0191] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅴ-1) , (Ⅴ-2) , (Ⅴ-3) , (Ⅴ-4) , which is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421.

[0192] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅴ-1-1) , (Ⅴ-1-2) , (Ⅴ-1-3) , (Ⅴ-1-4) , (Ⅴ-1-5) , (Ⅴ-1-6) , (Ⅴ-1-7) , (Ⅴ-1-8) , (Ⅴ-1-9) , (Ⅴ-1-10) , (Ⅴ-1-11) , (Ⅴ-1-12) , (Ⅴ-1-13) , (Ⅴ-1-14) , (Ⅴ-1-15) , (Ⅴ-1-16) , (Ⅴ-1-17) , (Ⅴ-1-18) , (Ⅴ-1-19) , (Ⅴ-1-20) , (Ⅴ-1-21) , (Ⅴ-1-22) , (Ⅴ-1-23) , (Ⅴ-1-24) , (Ⅴ-1-25) , (Ⅴ-1-26) , (Ⅴ-1-27) , (Ⅴ-1-28) , (Ⅴ-1-29) , (Ⅴ-1-30) , (Ⅴ-1-31) , (Ⅴ-1-32) , which is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421 in Table 1.

[0193] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅴ-1-1) , (Ⅴ-1-2) , (Ⅴ-1-3) , (Ⅴ-1-4) , (Ⅴ-1-5) , (Ⅴ-1-6) , (Ⅴ-1-7) , (Ⅴ-1-8) , (Ⅴ-1-9) , (Ⅴ-1-10) , (Ⅴ-1-11) , (Ⅴ-1-12) , (Ⅴ-1-13) , (Ⅴ-1-14) , (Ⅴ-1-15) , which is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421 in Table 1 (Compound1-15) . In an embodiment, the lipid nanoparticle (LNP) comprises a molar ratio of about 20-65%ionizable lipid; 5-25%phospholipid; 15-55%structural lipid; and 0.15-15%polymer conjugated lipid.

[0194] In an embodiment, the payload comprises a nucleic-acid molecule, a peptide molecule, a lipid molecule, or a combination thereof.

[0195] In an embodiment, the payload comprises a polynucleotide or nucleic acid, e.g., a DNA or an RNA.

[0196] In an embodiment, the payload comprises a small interfering ribonucleic acid (siRNA) , a short hairpin RNA (shRNA) , a micro-ribonucleic acid (miRNA) , a primary micro-ribonucleic acid (pri-miRNA) , a long non-coding RNA (lncRNA) , a messenger ribonucleic acid (mRNA) , a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) related nucleic acid, a CRISPR-RNA (crRNA) , a single guide ribonucleic acid (sgRNA) , a trans-activating CRISPR ribonucleic acid (tracrRNA) , a plasmid deoxyribonucleic acid (pDNA) , a transfer ribonucleic acid (tRNA) , an antisense oligonucleotide (ASO) , an antisense ribonucleic acid (RNA) , a guide ribonucleic acid, deoxyribonucleic acid (DNA) , a double stranded deoxyribonucleic acid (dsDNA) , a single stranded deoxyribonucleic acid (ssDNA) , a single stranded ribonucleic acid (ssRNA) , a double stranded ribonucleic acid (dsRNA) , a circular RNA, a CRISPR- associated (Cas) protein, or a combination thereof.

[0197] In an embodiment, the polynucleotide comprises an mRNA.

[0198] In an embodiment, the mRNA comprises at least one chemical modification.

[0199] In an embodiment, the chemical modification is selected from the group consisting of pseudouridine, pyridin-4-one ribonucleoside, N1-methylpseudouridine, 2-thiouridine, 4′-thiouridine, 5-methylcytosine, 2-thio-1-methyl-1-deaza-pseudouridine, 2-thio-1-methyl-pseudouridine, 2-thio-5-aza-uridine, 2-thio-dihydropseudouridine, 2-thio-dihydrouridine, 2-thio-pseudouridine, 4-methoxy-2-thio-pseudouridine, 4-methoxy-pseudouridine, 4-thio-1-methyl-pseudouridine, 4-thio-pseudouridine, 5-aza-uridine, dihydropseudouridine, 5-methyluridine, 5-methyluridine, 5-methoxyuridine, and 2′-O-methyl uridine.

[0200] In an embodiment, the payload comprises one or more guide RNAs (gRNA) , and the polynucleotide or nucleic acid encoding a base editor, e.g., an adenine base editor or a cytosine base editor; or

[0201] In an embodiment, the polynucleotide or nucleic acid encoding an RNA-guided DNA binding agent, e.g., a nuclease (e.g., a Cas nuclease such as Cas9, Cas12i) , to a target DNA.

[0202] In an embodiment, the Cas protein is a Cas9 protein or a Casl2i protein,

[0203] In an embodiment, the gRNA targets a target sequence of a genomic location of the causal mutation and modify the genomic sequence to remove the causal mutation, e.g., the gRNA has at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 1-4, 12.

[0204] In an embodiment, the adenine base editor comprises a nuclease and a deaminase, e.g., the nuclease has at least 80%sequence identity to SEQ ID NOs: 10, e.g., deaminase has at least 80%sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 8-9, e.g., the adenine base editor has at least 80%sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 6 and 11. In an embodiment, the payload modifies an HSPC, e.g, modification of a genotype, phenotype, or function of the HSPC.

[0205] In another embodiment, the ionizable lipid is a compound of Formula (I) , Formula (Ⅱ) , Formula (Ⅲ) , Formula (Ⅳ) , Formula (Ⅴ) , Formula (VI) or a salt or solvate thereof.

[0206] According to some embodiments of any of the aspects or embodiments herein, the LNP is in size ranging from about 50 nm to about 110 nm in diameter, for example about 50 nm to about 100 nm, about 50 nm to about 95 nm, about 50 nm to about 90 nm, about 50 nm to about 85 nm, about 50 nm to about 80 nm, about 50 nm to about 75 nm, about 50 nm to about 70 nm, about 50 nm to about 65 nm, about 50 nm to about 60 nm, about 50 nm to about 55 nm, about 60 nm to about 110 nm, about 60 nm to about 100 nm, about 60 nm to about 95 nm, about 60 nm to about 90 nm, about 60  nm to about 85 nm, about 60 nm to about 80 nm, about 60 nm to about 75 nm, about 60 nm to about 70 nm, about 60 nm to about 65 nm, about 70 nm to about 110 nm, about 70 nm to about 100 nm, about 70 nm to about 95 nm, about 70 nm to about 90 nm, about 70 nm to about 85 nm, about 70 nm to about 80 nm, about 70 nm to about 75 nm, about 80 nm to about 110 nm, about 80 nm to about 100 nm, about 80 nm to about 95 nm, about 80 nm to about 90 nm, about 80 nm to about 85 nm, about 90 nm to about 110 nm, or about 90 nm to about 100 nm.

[0207] According to some embodiments of any of the aspects or embodiments herein, the LNP is less than about 100 nm in size, for example less than about 105 nm, less than about 100 nm, less than about 95 nm, less than about 90 nm, less than about 85 nm, less than about 80 nm, less than about 75 nm, less than about 70 nm, less than about 65 nm, less than about 60 nm, less than about 55 nm, less than about 50 nm, less than about 45 nm, less than about 40 nm, less than about 35 nm, less than about 30 nm, less than about 25 nm, less than about 20 nm, less than about 15 nm, or less than about 10 nm in size. According to some embodiments of any of the aspects or embodiments herein, the LNP is less than about 70 nm in size, for example less than about 65 nm, less than about 60 nm, less than about 55 nm, less than about 50 nm, less than about 45 nm, less than about 40 nm, less than about 35 nm, less than about 30 nm, less than about 25 nm, less than about 20 nm, less than about 15 nm, or less than about 10 nm in size. According to some embodiments, the LNP is less than about 60 nm in size, for example less than about 55 nm, less than about 50 nm, less than about 45 nm, less than about 40 nm, less than about 35 nm, less than about 30 nm, less than about 25 nm, less than about 20 nm, less than about 15 nm, or less than about 10 nm in size.

[0208] According to some embodiments of any of the aspects or embodiments herein, the LNP composition has a total lipid to payload, e.g., nucleic acid ratio of about 10: 1.

[0209] According to some embodiments of any of the aspects or embodiments herein, the LNP composition has a total lipid to payload, e.g., nucleic acid ratio of about 20: 1.

[0210] According to some embodiments of any of the aspects or embodiments herein, the composition has a total lipid to payload, e.g., nucleic acid ratio of about 30: 1.

[0211] According to some embodiments of any of the aspects or embodiments herein, the composition has a total lipid to payload, e.g., nucleic acid ratio of about 40: 1.

[0212] According to some embodiments of any of the aspects or embodiments herein, the composition has a total lipid to payload, e.g., nucleic acid ratio of about 50: 1.

[0213] In an aspect, disclosed herein is a pharmaceutical composition, comprising the lipid nanoparticle (LNP) composition or the pharmaceutical composition e.g, as described herein, and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0214] In an aspect, disclosed herein is a GMP-grade pharmaceutical composition, comprising a delivery lipid nanoparticle in the lipid nanoparticle (LNP) composition or the pharmaceutical composition, e.g, as described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0215] In an aspect, disclosed herein is a method of delivering a polynucleotide encoding at least one protein of interest to a cell of interest of a subject in need thereof, the method comprising administering to a subject the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition or the lipid nanoparticle (LNP) composition, e.g, as described herein.

[0216] In another embodiment, the cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, a bone marrow cell and a CD34+ cell.

[0217] In an aspect, disclosed herein is a method of modifying a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell, comprising contacting the cell with the lipid nanoparticle (LNP) composition or the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition, as described herein, thereby modifying the cell.

[0218] In an aspect, disclosed herein is a method of treating a subject having a disease, a disorder, a mutation, or a single nucleotide polymorphism (SNP) , comprising administering to a subject an effective amount of the lipid nanoparticle (LNP) composition or the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition as described herein, wherein the lipid nanoparticle (LNP) composition or the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition results in a modification of a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell in the subject.

[0219] In another embodiment, the subject is a human or non-human mammal (such as mouse, rat, rabbit, monkey) .

[0220] In an embodiment, the subject is a mammal.

[0221] In an embodiment, the mammal is a human.

[0222] In an embodiment, the subject having a disease or disorder.

[0223] In an embodiment, the disease or disorder is selected in a group consisting of infectious diseases, allergies, autoimmune diseases, blood disorders, metabolic diseases, neurologic diseases, and cancer diseases.

[0224] In an embodiment, the blood disorders is selected from β-thalassemia, sickle cell disease (SCD) and other hereditary blood disorders.

[0225] In an embodiment, the composition is administered as a single dose.

[0226] In an embodiment, the pharmaceutical composition may include one or more lipid nanoparticles compositions as described herein. For example, the pharmaceutical composition may comprise one or more lipid nanoparticles compositions including one or more different therapeutic and / or prophylactics including but not limited to one or more nucleic acids of different types or encode different agents.

[0227] In an embodiments, the pharmaceutical composition comprises one or more pharmaceutically acceptable excipients or accessory ingredients including but not limited to a pharmaceutically acceptable carrier. A composition may be administered to a subject. In an embodiment, a composition is administered as described herein. In an embodiment, the ordinary skilled worker, considering the therapeutic context, age, and general health of the recipient, will be able to devise an appropriate dosage level and dosing regimen using the pharmaceutical compositions described herein for treatment of various conditions in various patients. For example, in some embodiments, a selected dosage depends upon the desired therapeutic effect, on the route of administration, and on the duration of the treatment desired.

[0228] In an embodiment, compositions in accordance with the present disclosure may be administered at dosage levels sufficient to deliver from about 0.0001 mg / kg to about 10 mg / kg of body weight, from about 0.001 mg / kg to about 10 mg / kg, from about 0.005 mg / kg to about 10 mg / kg, from about 0.01 mg / kg to about 10 mg / kg, from about 0.05 mg / kg to about 10 mg / kg, from about 0.1 mg / kg to about 10 mg / kg, from about 1 mg / kg to about 10 mg / kg, from about 2 mg / kg to about 10 mg / kg, from about 5 mg / kg to about 10 mg / kg, from about 0.0001 mg / kg to about 5 mg / kg, from about 0.001 mg / kg to about 5 mg / kg, from about 0.005 mg / kg to about 5 mg / kg, from about 0.01 mg / kg to about 5 mg / kg, from about 0.05 mg / kg to about 5 mg / kg, from about 0.1 mg / kg to about 5 mg / kg, from about 1 mg / kg to about 5 mg / kg, from about 2 mg / kg to about 5 mg / kg, from about 0.0001 mg / kg to about 2.5 mg / kg, from about 0.001 mg / kg to about 2.5 mg / kg, from about 0.005 mg / kg to about 2.5 mg / kg, from about 0.01 mg / kg to about 2.5 mg / kg, from about 0.05 mg / kg to about 2.5 mg / kg, from about 0.1 mg / kg to about 2.5 mg / kg, from about 1 mg / kg to about 2.5 mg / kg, from about 2 mg / kg to about 2.5 mg / kg, from about 0.0001 mg / kg to about 1.5 mg / kg, from about 0.001 mg / kg to about 1.5 mg / kg, from about 0.005 mg / kg to about 1.5 mg / kg, from about 0.01 mg / kg to about 1.5 mg / kg, from about 0.05 mg / kg to about 1.5 mg / kg, from about 0.1 mg / kg to about 1.5 mg / kg, from about 0.0001 mg / kg to about 1.5 mg / kg, from about 0.001 mg / kg to about 1.5 mg / kg, from about 0.005 mg / kg to about 1.5 mg / kg, from about 0.01 mg / kg  to about 1.5 mg / kg, from about 0.05 mg / kg to about 1 mg / kg, from about 0.1 mg / kg to about 1 mg / kg, from about 0.0001 mg / kg to about 0.25 mg / kg, from about 0.001 mg / kg to about 0.25 mg / kg, from about 0.005 mg / kg to about 0.25 mg / kg, from about 0.01 mg / kg to about 0.25 mg / kg, from about 0.05 mg / kg to about 0.25 mg / kg, or from about 0.1 mg / kg to about 0.25 mg / kg of a therapeutic and / or prophylactic (e.g., an mRNA) in a given dose, where a dose of 1 mg / kg provides 1 mg of a therapeutic and / or prophylactic per 1 kg of subject body weight. In some embodiments, a dose of about 0.001 mg / kg to about 10 mg / kg of a therapeutic and / or prophylactic (e.g., mRNA) of a LNP may be administered. In other embodiments, a dose of about 0.005 mg / kg to about 2.5 mg / kg of a therapeutic and / or prophylactic may be administered. In some embodiments, a dose of about 0.1 mg / kg to about 1 mg / kg may be administered. In other embodiments, a dose of about 0.05 mg / kg to about 0.25 mg / kg may be administered. In other embodiments, a dose of about 0.1 mg / kg may be administered. A dose may be administered one or more times per day, in the same or a different amount, to obtain a desired level of mRNA expression and / or therapeutic, diagnostic, prophylactic, or imaging effect.

[0229] The desired dosage may be delivered, for example, three times a day, two times a day, once a day, every other day, every third day, every week, every two weeks, every three weeks, or every four weeks. In some embodiments, the desired dosage may be delivered using multiple administrations (e.g., two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, or more administrations) . In some embodiments, a single dose may be administered, for example, prior to or after a surgical procedure or in the instance of an acute disease, disorder, or condition.

[0230] In an embodiment, the lipid nanoparticle (LNP) composition or the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition is administered one time:

[0231] a. increases HbF level; and / or

[0232] b. increases expression of γ-globin;

[0233] c. long-term expression of at least 5%, or at least about 10%, or at least about 20%, or at least about 30%, or at least about 50%of total hemoglobin as compared to a healthy subject.

[0234] In an embodiment, the lipid nanoparticle (LNP) composition or the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition is formulated for systemic delivery.

[0235] In an embodiment, the lipid nanoparticle (LNP) composition or the pharmaceutical  composition or the GMP-grade pharmaceutical composition is administered systemically, e.g., parenterally (e.g., intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intrathecally, or intradermally) or enterally (e.g., orally, rectally or sublingually) .

[0236] In an aspect, disclosed herein is a method of ameliorating a symptom of a subject having a disease, a disorder, a mutation, or a single nucleotide polymorphism (SNP) , comprising administering to a subject an effective amount of the lipid nanoparticle (LNP) composition or the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition comprising a payload, e.g, as described herein, wherein the lipid nanoparticle (LNP) composition or the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition results in a modification of a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell in the subject, and / or result in a modification of a component associated with the cell or a parameter associated with the cell, thereby ameliorating the symptom of the subject.

[0237] In an aspect, disclosed herein is a method of delivering an LNP composition comprising delivery a payload to a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell or a tissue, e.g, in a subject, comprising contacting the cell, or the tissue with the lipid nanoparticle (LNP) composition, or the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition, e.g, as described herein.

[0238] In another embodiment, the tissue comprises bone marrow.

[0239] In an embodiment, the cell or the tissue has low or no gene of interest expression level. In an embodiment, the gene of interest is a pathogenic gene, which is selected from the group consisting of: an γ-globin gene, e.g., HBG1 or HBG2 gene , and any combination thereof.

[0240] In an embodiment, the lipid nanoparticle (LNP) composition, or the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition provides at least one of the following benefits:

[0241] (i) mRNA level of γ-globin genes (HBG1 or HBG2) are increased in the mammal bone marrow cell compared to an untreated cell;

[0242] (ii) mRNA level of γ-globin genes (HBG1 or HBG2) are increased at least 1.5 fold compared to an untreated cell.

[0243] (ⅲ) γ-globin protein level of treated cell is increased compared to an untreated cell. In an aspect, disclosed herein is a method of increasing expression of a therapeutic payload or a prophylactic payload in a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+cell, comprising administering to the cell the LNP composition, or the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition, e.g, as described herein. In an aspect, disclosed herein is a use of a therapeutically effective amount of the LNP composition or the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition, e.g, as described herein, in the preparation of a medicament for treating β-thalassemia.

[0244] In an embodiment, the β-thalassemia is associated with mutations in the regulatory region of the γ-globin (HBG) gene.

[0245] In an aspect, disclosed herein is a kit comprising a composition, e.g, as described herein, and instructions for using the kit.

[0246] In an aspect, it provides a kit comprising

[0247] (a1) a first container and a lipid nanoparticle (LNP) in the first container;

[0248] (a2) a second container and a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell in the second container; (a3) an optional third container and a payload in the third container, wherein the payload modifies a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell; and

[0249] instructions for using the kit.

[0250] In another embodiment, the first container, the second container and the third container are different containers.

[0251] In another embodiment, the drug of the first container is a single formulation containing a lipid nanoparticle (LNP) .

[0252] In another embodiment, the drug of the second container is a single formulation containing a cell, said cell is selected from the group consisting ofa stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell.

[0253] In another embodiment, the dosage form of the drug is selected from the group consisting of: a lyophilized formulation, a liquid formulation, or a combination thereof.

[0254] In another embodiment, the dosage form of the drug is an oral dosage form or an injectable dosage form.

[0255] In one aspect, it provides a kit comprising a container and the lipid nanoparticle (LNP) composition, or the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition e.g, as described herein in the container.

[0256] In another embodiment, the drug of the container is a single formulation containing the lipid nanoparticle (LNP) composition, or the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition e.g, as described herein.

[0257] In an aspect, disclosed herein is a modified cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+cell as described herein.

[0258] In an aspect, disclosed herein is a frozen preparation of a modified cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell, made according to a method disclosed above.

[0259] In an aspect, disclosed herein is the modified cell, or frozen preparation of a modified cell, disclosed above, for use in treating a subject having a disease or disorder.

[0260] In an embodiment, the modified cell, or frozen preparation of a modified cell disclosed above, for use in ameliorating a symptom of a subject having a disease or disorder.

[0261] In an embodiment, the disease or disorder is selected from the group consisting of a hemoglobinopathy, a clotting factor disorder, a blood cell disorder, and an immune cell disorder.

[0262] In an embodiment, the modified cell is autologous to the subject.

[0263] In an embodiment, the modified cell is allogeneic to the subject.

[0264] 4. BRIEF DESCRIPTIONS OF THE DRAWINGS

[0265] FIGs. 1a-1n show in vivo adenine base editing of the HBG locus in the mouse BM cells. FIG. 1a displays workflow of intravenous (i. v. ) administration of LNPs with co-encapsulated ABE8e mRNA and sgRNA-25. For intravenous administration, three different doses of LNPs were administered in adult NCG-X mice. The mice were  injected with LNPs every two weeks until the end of five injections. FIG. 1b displays Average base editing efficiency in mouse BM cells with or without mobilization treatment. FIG. 1c displays β-like globin expression (γ) in the BM cells of engrafted mice after LNPs treated measured by RT-qPCR. FIG. 1d, FIG. 1e show BM collected after LNP-ABE8e treated and analyzed by flow cytometry for human cell chimerism (FIG. 1d) , and multilineage reconstitution (FIG. 1e) in the BM. FIG. 1f displays percent base editing after treatment with re-doses and fifth-dose of LNP-ABE8e was administered intravenously via tail vein injection in NCG-X mice. FIG. 1g depicts β-like globin expression (γ) in the BM cells after LNPs treated measured by RT-qPCR. FIG. 1h, FIG. 1i depicts BM collected 2 weeks after injection of LNPs and analyzed by flow cytometry for human cell chimerism (FIG. 1h) , and multilineage reconstitution (FIG. 1i) in the BM. FIG. 1j, FIG. 1k displays overall editing frequency engrafted HSPCs, B cells, myeloid cells, CD34+ , erythroid cells, and BM cells after re-doses and fifth-dose of LNPs, measured by deep sequence analysis. FIG. 1l displays base editing efficiency in vitro differentiated erythroid cells from LNPs edited BM cells. FIG. 1m displays γ-globin expression by RT-qPCR analysis in erythroid cells in vitro differentiated from LNPs edited BM cells. FIG. 1n displays enucleation of in vitro differentiated erythroid cells. All statistical significance in the figures were analyzed with the unpaired two-tailed Student’s t test, with p values noted where appropriate. NS, not significant by two-tailed Student’s t-test.

[0266] Fig. 2 Illustrates in vivo screening of new synthesis lipids for ABE8e-mRNA delivery in mice. a, A schematic to illustrate the synthesis and screening method for lipids. b, Percent editing on target base (A6) of mPCSK9 after treatment with different candidate LNP-ABE8e in an in vivo setting using C57BL / 6 mice.

[0267] Fig. 3a-3i show Reactivation of γ-globin through LNP-ABE8e-mediated base editing in a mouse model of β-thalassemia. Fig. 3a displays transplantation of β-thalassemia patient-derived CD34+ HSPCs into NCG-X mice and analysis of after LNP-ABE8e treated BM cells. Fig. 3b displays base editing efficiency in BM cells and in vitro differentiated erythroid cells. Fig. 3c displays quantification of β-like globin expression in LNP-ABE8e treated BM cells using RT-qPCR. Fig. 3d displays human cell engraftment in recipient BM measured by percentage of human CD45+cells (hCD45+) . Fig. 3e displays Percentages of myeloid cells (hCD33+) and B cells (hCD19+) in the hCD45+ cell population in recipient BM. Fig. 3f displays quantification of β-like globin expression in vitro differentiated erythroid cells using  RT-qPCR. Fig. 3g displays enucleation of in vitro differentiated erythroid cells. Fig. 3h displays cell size measured by relative forward scatter intensity. Fig. 3i displays circularity of enucleated erythroid cells by imaging flow cytometry. All statistical significance in the figures were analyzed with the unpaired two-tailed Student’s t test, with p values noted where appropriate.

[0268] Fig. 4 displays summary of deep sequencing data derived from the LNP-ABE8e edited BM cells. After performing LNP-ABE8e base editing on NCG-X mice, next-generation sequencing was conducted on BM cells.

[0269] 5. DETAILED DESCRIPTION OF CERTAIN EMBODIMENTS OF THE INVENTION

[0270] Before the disclosed compounds, methods, uses, and kits are described in more detail, it should be understood that the aspects described herein are not limited to specific embodiments, methods, apparati, or configurations, and as such can, of course, vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular aspects only and, unless specifically defined herein, is not intended to be limiting.

[0271] Provided herein are lipid nanoparticle (LNP) compositions, kits, methods for the treatment of various diseases (e.g., β-thalassemia, sickle cell disease (SCD) ) . Also provided are methods of synthesizing compounds described herein. Additionally provided are methods of delivering agents (e.g., RNA (e.g., mRNA) ) to cells for the treatment of various diseases (e.g., β-thalassemia, sickle cell disease (SCD) ) .

[0272] General Techniques

[0273] Techniques and procedures described or referenced herein include those that are generally well understood and / or commonly employed using conventional methodology by those skilled in the art, such as, for example, the widely utilized methodologies described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed. 2001) ; Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003) .

[0274] Terminology

[0275] Unless described otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as is commonly understood by one of ordinary skill in the art. For purposes of interpreting this specification, the following description of terms will apply and whenever appropriate, terms used in the singular will also include the plural and vice versa. All patents, applications, published applications, and other publications are incorporated by reference in their entirety. In the event that any description of terms set  forth conflicts with any document incorporated herein by reference, the description of term set forth below shall control.

[0276] As used herein and unless otherwise specified, the term “lipid” refers to a group of organic compounds that include, but are not limited to, esters of fatty acids and are generally characterized by being poorly soluble in water, but soluble in many nonpolar organic solvents. While lipids generally have poor solubility in water, there are certain categories of lipids (e.g., lipids modified by polar groups, e.g., DMG-PEG2000) that have limited aqueous solubility and can dissolve in water under certain conditions. Known types of lipids include biological molecules such as fatty acids, waxes, sterols, fat-soluble vitamins, monoglycerides, diglycerides, triglycerides, and phospholipids. Lipids can be divided into at least three classes: (1) “simple lipids, ” which include fats and oils as well as waxes; (2) “compound lipids, ” which include phospholipids and glycolipids (e.g., DMPE-PEG2000) ; and (3) “derived lipids” such as steroids. Further, as used herein, lipids also encompass lipidoid compounds. The term “lipidoid compound, ” also simply “lipidoid” , refers to a lipid-like compound (e.g. an amphiphilic compound with lipid-like physical properties) .

[0277] As used herein and unless otherwise specified, the term “delivering” means providing an entity to a destination. For example, delivering a therapeutic and / or prophylactic to a subject may involve administering a LNP including the therapeutic and / or prophylactic to the subject (e.g, by an intravenous, intramuscular, intradermal, pulmonary or subcutaneous route) . Administration of a LNP to a mammal or mammalian cell may involve contacting one or more cells with the lipid nanoparticle. The term “lipid nanoparticle” or “LNP” refers to a particle having at least one dimension on the order of nanometers (nm) (e.g., 1 to 1,000 nm) , which contains one or more types of lipid molecules. The LNP provided herein can further contain at least one non-lipid payload molecule (e.g., one or more nucleic acid molecules) . In some embodiments, the LNP comprises a non-lipid payload molecule either partially or completely encapsulated inside a lipid shell. Particularly, in some embodiments, wherein the payload is a negatively charged molecule (e.g., mRNA encoding a viral protein) , and the lipid components of the LNP comprise at least one cationic lipid. Without being bound by the theory, it is contemplated that the cationic lipids can interact with the negatively charged payload molecules and facilitates incorporation and / or encapsulation of the payload into the LNP during LNP formation. Other lipids that can form part of a LNP as provided herein include but are not limited to neutral  lipids and charged lipids, such as steroi. ds, polymer conjugated lipids, and various zwitterionic lipids.

[0278] As used herein, the term "encapsulate" means to enclose, surround, or encase. In some embodiments, a compound, polynucleotide (e.g, an mRNA) , or other composition may be fully encapsulated, partially encapsulated, or substantially encapsulated.

[0279] For example, in some embodiments, an mRNA of the disclosure may be encapsulated in a lipid nanoparticle, e.g, a liposome.

[0280] As used herein, by "liposome" is meant a structure including a lipid-containing membrane enclosing an aqueous interior. Liposomes may have one or more lipid membranes. Liposomes include single-layered liposomes (also known in the art as unilamellar liposomes) and multi-layered liposomes (also known in the art as multilamellar liposomes) .

[0281] As used herein, "encapsulation efficiency" refers to the amount of a therapeutic and / or prophylactic that becomes part of a LNP, relative to the initial total amount of therapeutic and / or prophylactic used in the preparation of a LNP. For example, if 97 mg of therapeutic and / or prophylactic are encapsulated in a LNP out of a total 100 mg of therapeutic and / or prophylactic initially provided to the composition, the encapsulation efficiency may be given as 97%. As used herein, "encapsulation" may refer to complete, substantial, or partial enclosure, confinement, surrounding, or encasement.

[0282] The term “cationic lipid” refers to a lipid that is either positively charged at any pH value or hydrogen ion activity of its environment, or capable of being positively charged in response to the pH value or hydrogen ion activity of its environment (e.g., the environment of its intended use) . Thus, the term “cationic” encompasses both “permanently cationic” and “cationisable” . In certain embodiments, the positive charge in a cationic lipid results from the presence of a quaternary nitrogen atom. In certain embodiments, the cationic lipid comprises a zwitterionic lipid that assumes a positive charge in the environment of its intended use (e.g., at physiological pH) . In certain embodiments, the cationic lipid is one or more lipids of Formula (I) , (Ⅱ) , (Ⅲ) , (Ⅳ) , (Ⅴ) (and sub-formulas thereof) as described herein.

[0283] The term “polymer conjugated lipid” refers to a molecule comprising both a lipid portion and a polymer portion. An example of a polymer conjugated lipid is a pegylated lipid (PEG-lipid) , in which the polymer portion comprises a polyethylene glycol.

[0284] The term “neutral lipid” encompasses any lipid molecules existing in uncharged form s or neutral zwitterionic forms at a selected pH value or within a selected pH range. In some embodiments, the selected useful pH value or range corresponds to the pH condition in an environment of the intended uses of the lipids, such as the physiological pH. As non-limiting examples, neutral lipids that can be used in connection with the present disclo sure include, but are not limited to, phosphotidylcholines such as 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) , 1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) , 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) , phophatidylethanolamines such as 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) , 2- ( (2, 3-bis (oleoyloxy) propyl) dimethylammonio) ethyl hydrogen phosphate (DOCP) , sphin gomyelins (SM) , ceramides, steroids such as sterols and their derivatives. Neutral lipi ds as provided herein may be synthetic or derived (isolated or modified) from a natura l source or compound.

[0285] The term “charged lipid” encompasses any lipid molecules that exist in either positive ly charged or negatively charged forms at a selected pH or within a selected pH range. In some embodiments, the selected pH value or range corresponds to the pH conditio n in an environment of the intended uses of the lipids, such as the physiological pH. A s non-limiting examples, charged lipids that can be used in connection with the present discl osure include, but are not limited to, phosphatidylserines, phosphatidic acids, phospha tidylglycerols, phosphatidylinositols, sterol hemisuccinates, dialkyl trimethylarnmoni um-propanes, (e.g., DOTAP, DOTMA) , dialkyl dimethylaminopropanes, ethyl phosphoch olines, dimethylaminoethane carbamoyl sterols (e.g., DC-Chol) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine sodium salt (DOPS-Na) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho- (1'-rac-glycerol) sodium salt (DOPG-Na) , and 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate sodium salt (DOPA-

[0286] Na) . Charged lipids as provided herein may be synthetic or derived (isolated or modif ied) from a natural source or compound.

[0287] As used herein, and unless otherwise specified, the term “alkyl” refers to a straight or branched hydrocarbon chain radical consisting solely of carbon and hydrogen atoms,  which is saturated. In one embodiment, the alkyl group has, for example, from one to twenty-four carbon atoms (C1-C24 alkyl) , four to twenty carbon atoms (C4-C20 alkyl) , six to sixteen carbon atoms (C6-C16 alkyl) , six to nine carbon atoms (C6-C9 alkyl) , one to fifteen carbon atoms (C1-C15 alkyl) , one to twelve carbon atoms (C1-C12 alkyl) , one to eight carbon atoms (C1-C8 alkyl) or one to six carbon atoms (C1-C6 alkyl) and which is attached to the rest of the molecule by a single bond. Examples of alkyl groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, n-propyl, 1-methylethyl (isopropyl) , n-butyl, n-pentyl, 1, 1-dimethylethyl (t-butyl) , 3-methylhexyl, 2-methylhexyl, and the like. Unless otherwise specified, an alkyl group is optionally sub stituted.

[0288] As used herein, and unless otherwise specified, the term “alkenyl” refers to a straight or branched hydrocarbon chain radical consisting solely of carbon and hydrogen atom s, which contains one or more carbon-carbon double bonds. The term “alkenyl” also embraces radicals having “cis” and “trans” configurations, or alternatively, “E” and “Z” configurations, as appreciated by those of ordinary skill in the art. In one embodim ent, the alkenyl group has, , for example, from two to twenty-four carbon atoms (C2-C24 alkenyl) , four to twenty carbon atoms (C4-C20 alkenyl) , six to sixteen carbon atoms (C6-C16 alkenyl) , six to nine carbon atoms (C6-C9 alkenyl) , two to fifteen carbon atoms (C2-C15 alkenyl) , two to twelve carbon atoms (C2-C12 alkenyl) , two to eight carbon atoms (C2-C8 alkenyl) or two to six carbon atoms (C2-C6 alkenyl) and which is attached to the rest of the molecule by a single bond. Exampl es of alkenyl groups include, but are not limited to, ethenyl, prop-1-enyl, but-1-enyl, pent-1-enyl, penta-1, 4-dienyl, and the like. Unless otherwise specified, an alkenyl group is optionally substit uted.

[0289] As used herein, and unless otherwise specified, the term “alkynyl” refers to a straight or branched hydrocarbon chain radical consisting solely of carbon and hydrogen atom s, which contains one or more carbon-carbon triple bonds. In one embodiment, the alkynyl group has, for example, from tw  o to twenty-four carbon atoms (C2-C24 alkynyl) , four to twenty carbon atoms (C4-C20 alkynyl) , six to sixteen carbon atoms (C6-C16 alkynyl) , six to nine carbon atoms (C6-C9 alkynyl) , two to fifteen carbon atoms (C2-C15 alkynyl) , two to twelve carbon atoms (C2-C12 alkynyl) , two to eight carbon atoms (C2-C8 alkynyl) or two to six carbon atoms (C2-C6 alkynyl) and which is attached to the rest of the molecule by a single bond. Exampl es of alkynyl groups include, but are not limited to, ethynyl, propynyl, butynyl, pentyn yl, and the like. Unless otherwise specified, an alkynyl group is optionally substituted.

[0290] As used herein, and unless otherwise specified, the term “alkylene” or “alkylene chain” refers to a straight or branched multivalent (e.g., divalent or trivalent) hydrocarbon c hain linking the rest of the molecule to a radical group (or groups) , consisting solely of carbon and hydrogen, which is saturated. In one embodiment, the alkylene has, for example, from one to twenty-four carbon atoms (C1-C24 alkylene) , one to fifteen carbon atoms (C1-C15 alkylene) , one to twelve carbon atoms (C1-C12 alkylene) , one to eight carbon atoms (C1-C8 alkylene) , one to six carbon atoms (C1-C6 alkylene) , two to four carbon atoms (C2-C4 alkylene) , one to two carbon atoms (C1-C2 alkylene) . Examples of alkylene groups include, but are not limited to, methylene, ethylene, propylene, n-butylene, and the like. The alkylene chain is attached to the rest of the molecule throu gh a single bond and to the radical group through a single bond. The points of attachm ent of the alkylene chain to the rest of the molecule and to the radical group (s) can be through one carbon or any two (or more) carbons within the chain. Unless otherwise specified, an alkylene chain is optionally substituted.

[0291] As used herein, and unless otherwise specified, the term “alkenylene” refers to a strai ght or branched multivalent (e.g., divalent or trivalent) hydrocarbon chain linking the rest of the molecule to a radical group (or groups) , consisting solely of carbon and hy drogen, which contains one or more carbon-carbon double bonds. In one embodiment, the alkenylene has, for example, from two t o twenty-four carbon atoms (C2-C24 alkenylene) , two to fifteen carbon atoms (C2- C15 alkenylene) , two to twelve carbon atoms (C2-C12 alkenylene) , two to eight carbon atoms (C2-C8 alkenylene) , two to six carbon atoms (C2-C6 alkenylene) or two to four carbon atoms (C2-C4 alkenylene) . Examples of alkenylene include, but are not limited to, ethenylene, pr openylene, n-butenylene, and the like. The alkenylene is attached to the rest of the molecule throug h a single or double bond and to the radical group through a single or double bond. Th e points of attachment of the alkenylene to the rest of the molecule and to the radical g roup (s) can be through one carbon or any two (or more) carbons within the chain. Un less otherwise specified, an alkenylene is optionally substituted.

[0292] As used herein, and unless otherwise specified, the term “cycloalkyl” refers to a non-aromatic monocyclic or polycyclic hydrocarbon radical consisting solely of carbon an d hydrogen atoms, and which is saturated. Cycloalkyl group may include fused or brid ged ring systems. In one embodiment, the cycloalkyl has, for example, from 3 to 15 ri ng carbon atoms (C3-C15 cycloalkyl) , from 3 to 10 ring carbon atoms (C3-C10 cycloalkyl) , or from 3 to 8 ring carbon atoms (C3-C8 cycloalkyl) . The cycloalkyl is attached to the rest of the molecule by a single bond .Examples of monocyclic cycloalkyl radicals include, but are not limited to, cyclopro pyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, and cyclooctyl. Examples of po lycyclic cycloalkyl radicals include, but are not limited to, adamantyl, norbornyl, deca linyl, 7, 7-dimethyl-bicyclo [2.2.1] heptanyl, bicyclo [1.1.1] pentyl and the like. Unless otherwise specifie d, a cycloalkyl group is optionally substituted.

[0293] As used herein, and unless otherwise specified, the term “cycloalkylene” is a multival ent (e.g., divalent or trivalent) cycloalkyl group. Unless otherwise specified, a cycloal kylene group is optionally substituted.

[0294] As used herein, and unless otherwise specified, the term “cycloalkenyl” refers to a no n-aromatic monocyclic or polycyclic hydrocarbon radical consisting solely of carbon an d hydrogen atoms, and which includes one or more carbon-carbon double bonds. Cycloalkenyl may include fused or bridged ring systems. In one embodiment, the cycloalkenyl has, for example, from 3 to 15 ring carbon atoms (C3-C15 cycloalkenyl) , from 3 to 10 ring carbon atoms (C3- C10 cycloalkenyl) , or from 3 to 8 ring carbon atoms (C3-C8 cycloalkenyl) .

[0295] The cycloalkenyl is attached to the rest of the molecule by a single bond. Examples of monocyclic cycloalkenyl radicals include, but are not limited to, cyclopropenyl, cyclo butenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, cycloheptenyl, cyclooctenyl, and the like. Unle ss otherwise specified, a cycloalkenyl group is optionally substituted.

[0296] As used herein, and unless otherwise specified, the term “cycloalkenylene” is a multiv alent (e.g., divalent or trivalent) cycloalkenyl group. Unless otherwise specified, a cyc loalkenylene group is optionally substituted.

[0297] As used herein, and unless otherwise specified, the term “heterocyclyl” refers to a non -aromatic radical monocyclic or polycyclic moiety that contains one or more (e.g., one, one or two, one to three, or one to four) heteroatoms independently selected from nitr ogen, oxygen, phosphorous, and sulfur. The heterocyclyl may be attached to the main structure at any heteroatom or carbon atom. A heterocyclyl group can be a monocyclic , bicyclic, tricyclic, tetracyclic, or other polycyclic ring system, wherein the polycycli c ring systems can be a fused, bridged or spiro ring system. Heterocyclyl polycyclic ri ng systems can include one or more heteroatoms in one or more rings. A heterocyclyl group can be saturated or partially unsaturated. Saturated heterocycloalkyl groups can be termed “heterocycloalkyl” . Partially unsaturated heterocycloalkyl groups can be te rmed “heterocycloalkenyl” if the heterocyclyl contains at least one double bond, or “h eterocycloalkynyl” if the heterocyclyl contains at least one triple bond. In one embodi ment, the heterocyclyl has, for example, 3 to 18 ring atoms (3-to 18-membered heterocyclyl) , 4 to 18 ring atoms (4-to 18-membered heterocyclyl) , 5 to 18 ring atoms (3-to 18-membered heterocyclyl) , 4 to 8 ring atoms (4-to 8-membered heterocyclyl) , or 5 to 8 ring atoms (5-to 8-membered heterocyclyl) . Whenever it appears herein, a numerical range such as “3 to 18” refers to each integer in the given range; e.g., “3 to 18 ring atoms” means that the heterocyclyl group can consist of 3 ring atoms, 4 ring atoms, 5 ring atoms, 6 ring ato ms, 7 ring atoms, 8 ring atoms, 9 ring atoms, 10 ring atoms, etc., up to and including 1 8 ring atoms. Examples of heterocyclyl groups include, but are not limited to, imidazo lyl, imidazolidinyl, oxazolyl, oxazolidinyl, thiazolyl, thiazolidinyl, pyrazolidinyl, pyra zolyl, isoxazolidinyl, isoxazolyl, isothiazolidinyl, isothiazolyl, morpholinyl, pyrrolyl, pyrrolidinyl, furyl, tetrahydrofuryl, thiophenyl, pyridinyl, piperidinyl, quinolyl, and is  oquinolyl. Unless otherwise specified, a heterocyclyl group is optionally substituted. As used herein, and unless otherwise specified, the term “heterocyclylene” is a multiv alent (e.g., divalent or trivalent) heterocyclyl group. Unless otherwise specified, a hete rocyclylene group is optionally substituted.

[0298] As used herein, and unless otherwise specified, the term “aryl” refers to a monocyclic aromatic group and / or multicyclic monovalent aromatic group that contain at least on e aromatic hydrocarbon ring. In certain embodiments, the aryl has from 6 to 18 ring c arbon atoms (C6-C18 aryl) , from 6 to 14 ring carbon atoms (C6-C14 aryl) , or from 6 to 10 ring carbon atoms (C6-C10 aryl) . Examples of aryl groups include, but are not limited to, phenyl, naphthyl, f luorenyl, azulenyl, anthryl, phenanthryl, pyrenyl, biphenyl, and terphenyl. The term “aryl” also refers to bicyclic, tricyclic, or other multicyclic hydrocarbon rings, where at least one of the rings is aromatic and the others of which may be saturated, partially u nsaturated, or aromatic, for example, dihydronaphthyl, indenyl, indanyl, or tetrahydro naphthyl (tetralinyl) . Unless otherwise specified, an aryl group is optionally substitut ed.

[0299] As used herein, and unless otherwise specified, the term “arylene” is a multivalent (e. g., divalent or trivalent) aryl group. Unless otherwise specified, an arylene group is op tionally substituted.

[0300] As used herein, and unless otherwise specified, the term “heteroaryl” refers to a mono cyclic aromatic group and / or multicyclic aromatic group that contains at least one aro matic ring, wherein at least one aromatic ring contains one or more (e.g., one, one or t wo, one to three, or one to four) heteroatoms independently selected from O, S, and N. The heteroaryl may be attached to the main structure at any heteroatom or carbon ato m.In certain embodiments, the heteroaryl has from 5 to 20, from 5 to 15, or from 5 to 10 ring atoms. The term “heteroaryl” also refers to bicyclic, tricyclic, or other multicy clic rings, where at least one of the rings is aromatic and the others of which may be s aturated, partially unsaturated, or aromatic, wherein at least one aromatic ring contain s one or more heteroatoms independently selected from O, S, and N. Examples of mo nocyclic heteroaryl groups include, but are not limited to, pyrrolyl, pyrazolyl, pyrazoli nyl, imidazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, thiazolyl, thiadiazolyl, isothiazolyl, furanyl, thie nyl, oxadiazolyl, pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, and triazinyl. Examples of bicyclic heteroaryl groups include, but are not limited to, indolyl, benzothiazolyl, b enzoxazolyl, benzothienyl, quinolinyl, tetrahydroisoquinolinyl, isoquinolinyl, benzimi  dazolyl, benzopyranyl, indolizinyl, benzofuranyl, isobenzofuranyl, chromonyl, couma rinyl, cinnolinyl, quinoxalinyl, indazolyl, purinyl, pyrrolopyridinyl, furopyridinyl, thie nopyridinyl, dihydroisoindolyl, and tetrahydroquinolinyl. Examples of tricyclic hetero aryl groups include, but are not limited to, carbazolyl, benzindolyl, phenanthrollinyl, a cridinyl, phenanthridinyl, and xanthenyl. Unless otherwise specified, a heteroaryl gro up is optionally substituted.

[0301] As used herein, and unless otherwise specified, the term “heteroarylene” is a multival ent (e.g., divalent or trivalent) heteroaryl group. Unless otherwise specified, a heteroar ylene group is optionally substituted.

[0302] When the groups described herein are said to be “substituted, ” they may be substitute d with any appropriate substituent or substituents. Illustrative examples of substituents include, but are not limited to, those found in the exemplary compounds and embodi ments provided herein, as well as: a halogen atom such as F, CI, Br, or I; cyano; oxo (=O) ; hydroxyl (-OH) ; alkyl; alkenyl; alkynyl; cycloalkyl; aryl; - (C=O) OR’; -O (C=O) R’; -C (=O) R’; -OR’; -S (O) xR’; -S-SR’; -C (=O) SR’; -SC (=O) R’; -NR’R’; -NR’C (=O) R’; -C (=O) NR’R’; -NR’C (=O) NR’R’; -OC (=O) NR’R’; -NR’C (=O) OR’; -NR’S (O) xNR’R’; -NR’S (O) xR’; and -S (O) xNR’R’, wherein: R’ is, at each occurrence, independently H, C1-C15 alkyl or cycloalkyl, and x is 0, 1 or 2. In some embodiments the substituent is a C1 -C12 alkyl group. In other embodiments, the substituent is a cycloalkyl group. In other embodiments, the substituent is a halo group, such as fluoro. In other embodiments, th e substituent is an oxo group. In other embodiments, the substituent is a hydroxyl grou p.In other embodiments, the substituent is an alkoxy group (-OR’) . In other embodiments, the substituent is a carboxyl group. In other embodimen ts, the substituent is an amino group (-NR’R’) .

[0303] As used herein, and unless otherwise specified, the term “optional” or “optionally” (e. g., optionally substituted) means that the subsequently described event of circumstanc es may or may not occur, and that the description includes instances where said event or circumstance occurs and instances in which it does not. For example, “optionally s ubstituted alkyl” means that the alkyl radical may or may not be substituted and that t he description includes both substituted alkyl radicals and alkyl radicals having no sub stitution.

[0304] As used herein, and unless otherwise specified, the term “prodrug” of a biologically a  ctive compound refers to a compound that may be converted under physiological cond itions or by solvolysis to the biologically active compound. In one embodiment, the te rm “prodrug” refers to a metabolic precursor of the biologically active compound that is pharmaceutically acceptable. A prodrug may be inactive when administered to a sub ject in need thereof, but is converted in vivo to the biologically active compound. Pro drugs are typically rapidly transformed in vivo to yield the parent biologically active c ompound, for example, by hydrolysis in blood. The prodrug compound often offers ad vantages of solubility, tissue compatibility or delayed release in a mammalian organis m (see, Bundgard, H., Design of Prodrugs (1985) , pp. 7-9, 21-24 (Elsevier, Amsterdam) ) . A discussion of prodrugs is provided in Higuchi, T., et al. , A. C. S. Symposium Series, Vol. 14, and in Bioreversible Carriers in Drug Design, E d.Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 198 7.

[0305] In one embodiment, the term “prodrug” is also meant to include any covalently bonde d carriers, which release the active compound in vivo when such prodrug is administe red to a mammalian subject. Prodrugs of a compound may be prepared by modifying f unctional groups present in the compound in such a way that the modifications are cle aved, either in routine manipulation or in vivo, to the parent compound. Prodrugs incl ude compounds wherein a hydroxyl, amino or mercapto group is bonded to any group that, when the prodrug of the compo und is administered to a mammalian subject, cleaves to form a free hydroxyl, free ami no or free mercapto group, respectively.

[0306] Examples of prodrugs include, but are not limited to, acetate, formate and benzoate derivatives of alcohol or amide derivatives of amine functional groups in the compounds provided herein.

[0307] The term "pharmaceutically acceptable" is employed herein to refer to those compounds, materials, compositions, and / or dosage forms which are, within the scope of sound medical judgment, suitable for use in contact with the tissues of human beings and animals without excessive toxicity, irritation, allergic response, or other problem or complication, commensurate with a reasonable benefit / risk ratio.

[0308] The term "pharmaceutically acceptable excipient, " as used herein, refers any ingredient other than the compounds described herein (for example, a vehicle capable of suspending or dissolving the active compound) and having the properties of being substantially nontoxic and non-inflammatory in a patient. Excipients may include, for  example: antiadherents, antioxidants, binders, coatings, compression aids, disintegrants, dyes (colors) , emollients, emulsifiers, fillers (diluents) , film formers or coatings, flavors, fragrances, glidants (flow enhancers) , lubricants, preservatives, printing inks, sorbents, suspensing or dispersing agents, sweeteners, and waters of hydration. Exemplary excipients include, but are not limited to: butylated hydroxytoluene (BHT) , calcium carbonate, calcium phosphate (dibasic) , calcium stearate, croscarmellose, crosslinked polyvinyl pyrrolidone, citric acid, crospovidone, cysteine, ethylcellulose, gelatin, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, lactose, magnesium stearate, maltitol, mannitol, methionine, methylcellulose, methyl paraben, microcrystalline cellulose, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, povidone, pregelatinized starch, propyl paraben, retinyl palmitate, shellac, silicon dioxide, sodium carboxymethyl cellulose, sodium citrate, sodium starch glycolate, sorbitol, starch (corn) , stearic acid, sucrose, talc, titanium dioxide, vitamin A, vitamin E, vitamin C, and xylitol.

[0309] As used herein, and unless otherwise specified, the term "pharmaceutically acceptable salt" includes both acid and base addition salts. Examples of pharmaceutically acceptable acid addition salts include, but are not limited to, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and the like, and organic acids such as, but not limited to, acetic acid, 2, 2-dichloroacetic acid, adipic acid, alginic acid, ascorbic acid, aspartic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid, 4-acetamidobenzoic acid, camphoric acid, camphor-10-sulfonic acid, capric acid, caproic acid, caprylic acid, carbonic acid, cinnamic acid, citric acid, cyclamic acid, dodecylsulfuric acid, ethane-1, 2-disulfonic acid, ethanesulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, formic acid, fumaric acid, galactaric acid, gentisic acid, glucoheptonic acid, gluconic acid, glucuronic acid, glutamic acid, glutaric acid, 2-oxo-glutaric acid, glycerophosphoric acid, glycolic acid, hippuric acid, isobutyric acid, lactic acid, lactobionic acid, lauric acid, maleic acid, malic acid, malonic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, mucic acid, naphthalene-1, 5-disulfonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, 1-hydroxy-2-naphthoic acid, nicotinic acid, oleic acid, orotic acid, oxalic acid, palmitic acid, pamoic acid, propionic acid, pyroglutamic acid, pyruvic acid, salicylic acid, 4-aminosalicylic acid, sebacic acid, stearic acid, succinic acid, tartaric acid, thiocyanic acid, p-toluenesulfonic acid, trifluoroacetic acid, undecylenic acid, and the like.

[0310] Examples of pharmaceutically acceptable base addition salt include, but are not limited to, salts prepared from addition of an inorganic base or an organic base to a free acid  compound. Salts derived from inorganic bases include, but are not limited to, the sodium, potassium, lithium, ammonium, calcium, magnesium, iron, zinc, copper, manganese, aluminum salts and the like. In one embodiment, the inorganic salts are the ammonium, sodium, potassium, calcium, and magnesium salts. Salts derived from organic bases include, but are not limited to, salts of primary, secondary, and tertiary amines, substituted amines including naturally occurring substituted amines, cyclic amines and basic ion exchange resins, such as ammonia, isopropylamine, trimethylamine, diethylamine, triethylamine, tripropylamine, diethanolamine, ethanolamine, deanol, 2-dimethylaminoethanol, 2-diethylaminoethanol, dicyclohexylamine, lysine, arginine, histidine, caffeine, procaine, hydrabamine, choline, betaine, benethamine, benzathine, ethylenediamine, glucosamine, methylglucamine, theobromine, triethanolamine, tromethamine, purines, piperazine, piperidine, N-ethylpiperidine, polyamine resins and the like. In one embodiment, the organic bases are isopropylamine, diethylamine, ethanolamine, trimethylamine, dicyclohexylamine, choline and caffeine.

[0311] A compound provided herein may contain one or more asymmetric centers and may thus give rise to enantiomers, diastereomers, and other stereoisomeric forms that may be defined, in terms of absolute stereochemistry, as (R) -or (S) -or, as (D) -or (L) -for amino acids. Unless otherwise specified, a compound provided herein is meant to include all such possible isomers, as well as their racemic and optically pure forms. Optically active (+) and (-) , (R) -and (S) -, or (D) -and (L) -isomers may be prepared using chiral synthons or chiral reagents, or resolved using conventional techniques, for example, chromatography and fractional crystallization. Conventional techniques for the preparation / isolation of individual enantiomers include chiral synthesis from a suitable optically pure precursor or resolution of the racemate (or the racemate of a salt or derivative) using, for example, chiral high pressure liquid chromatography (HPLC) . When the compounds described herein contain olefinic double bonds or other centers of geometric asymmetry, and unless specified otherwise, it is intended that the compounds include both E and Z geometric isomers. Likewise, all tautomeric forms are also intended to be included.

[0312] As used herein, and unless otherwise specified, the term “isomer” refers to different compounds that have the same molecular formula. “Stereoisomers” are isomers that differ only in the way the atoms are arranged in space. “Atropisomers” are stereoisomers from hindered rotation about single bonds. “Enantiomers” are a pair of  stereoisomers that are non-superimposable mirror images of each other. A mixture of a pair of enantiomers in any proportion can be known as a “racemic” mixture. “Diastereoisomers” are stereoisomers that have at least two asymmetric atoms, but which are not mirror-images of each other.

[0313] “Stereoisomers” can also include E and Z isomers, or a mixture thereof, and cis and trans isomers or a mixture thereof. In certain embodiments, a compound described herein is isolated as either the E or Z isomer. In other embodiments, a compound described herein is a mixture of the E and Z isomers.

[0314] “Tautomers” refers to isomeric forms of a compound that are in equilibrium with each other. The concentrations of the isomeric forms will depend on the environment the compound is found in and may be different depending upon, for example, whether the compound is a solid or is in an organic or aqueous solution.

[0315] It should also be noted a compound described herein can contain unnatural proportions of atomic isotopes at one or more of the atoms. For example, the compounds may be radiolabeled with radioactive isotopes, such as for example tritium (3H) , iodine-125 (125I) , sulfur-35 (35S) , or carbon-14 (14C) , or may be isotopically enriched, such as with deuterium (2H) , carbon-13 (13C) , or nitrogen-15 (15N) . As used herein, an “isotopolog” is an isotopically enriched compound. The term “isotopically enriched” refers to an atom having an isotopic composition other than the natural isotopic composition of that atom. “Isotopically enriched” may also refer to a compound containing at least one atom having an isotopic composition other than the natural isotopic composition of that atom. The term “isotopic composition” refers to the amount of each isotope present for a given atom. Radiolabeled and isotopically enriched compounds are useful as therapeutic agents, e.g., cancer therapeutic agents, research reagents, e.g., binding assay reagents, and diagnostic agents, e.g., in vivo imaging agents. All isotopic variations of a compound described herein, whether radioactive or not, are intended to be encompassed within the scope of the embodiments provided herein. In some embodiments, there are provided isotopologs of a compound described herein, for example, the isotopologs are deuterium, carbon-13, and / or nitrogen-15 enriched. As used herein, “deuterated” , means a compound wherein at least one hydrogen (H) has been replaced by deuterium (indicated by D or 2H) , that is, the compound is enriched in deuterium in at least one position. It should be noted that if there is a discrepancy between a depicted structure and a name for that structure, the depicted structure is to be accorded more weight.

[0316] As used herein, and unless otherwise specified, the term “pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient” includes without limitation any adjuvant, carrier, excipient, glidant, sweetening agent, diluent, preservative, dye / colorant, flavor enhancer, surfactant, wetting agent, dispersing agent, suspending agent, stabilizer, isotonic agent, solvent, or emulsifier which has been approved by the United States Food and Drug Administration as being acceptable for use in humans or domestic animals.

[0317] The term “composition” is intended to encompass a product containing the specified ingredients (e.g., a mRNA molecule provided herein) in, optionally, the specified amounts.

[0318] The term “polynucleotide” or “nucleic acid, ” as used interchangeably herein, refers to polymers of nucleotides of any length and includes, e.g., DNA and RNA. The nucleotides can be deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases, and / or their analogs, or any substrate that can be incorporated into a polymer by DNA or RNA polymerase or by a synthetic reaction. A polynucleotide may comprise modified nucleotides, such as methylated nucleotides and their analogs. Nucleic acid can be in either single-or double-stranded forms. As used herein and unless otherwise specified, “nucleic acid” also includes nucleic acid mimics such as locked nucleic acids (LNAs) , peptide nucleic acids (PNAs) , and morpholinos. “Oligonucleotide, ” as used herein, refers to short synthetic polynucleotides that are generally, but not necessarily, fewer than about 200 nucleotides in length. The terms “oligonucleotide” and “polynucleotide” are not mutually exclusive. The description above for polynucleotides is equally and fully applicable to oligonucleotides. Unless specified otherwise, the left-hand end of any single-stranded polynucleotide sequence disclosed herein is the 5’ end; the left-hand direction of double-stranded polynucleotide sequences is referred to as the 5’ direction. The direction of 5’ to 3’ addition of nascent RNA transcripts is referred to as the transcription direction; sequence regions on the DNA strand having the same sequence as the RNA transcript that are 5’ to the 5’ end of the RNA transcript are referred to as “upstream sequences” ; sequence regions on the DNA strand having the same sequence as the RNA transcript that are 3’ to the 3’ end of the RNA transcript are referred to as “downstream sequences” .

[0319] An “isolated nucleic acid” is a nucleic acid, for example, an RNA, DNA, or a mixed nucleic acids, which is substantially separated from other genome DNA sequences as well as proteins or complexes such as ribosomes and polymerases, which naturally accompany a native sequence. An “isolated” nucleic acid molecule is one which is  separated from other nucleic acid molecules which are present in the natural source of the nucleic acid molecule. Moreover, an “isolated” nucleic acid molecule, such as an mRNA molecule, can be substantially free of other cellular material, or culture medium when produced by recombinant techniques, or substantially free of chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized. In a specific embodiment, one or more nucleic acid molecules encoding an antigen as described herein are isolated or purified. The term embraces nucleic acid sequences that have been removed from their naturally occurring environment, and includes recombinant or cloned DNA or RNA isolates and chemically synthesized analogues or analogues biologically synthesized by heterologous systems. A substantially pure molecule may include isolated forms of the molecule.

[0320] As used herein, "heterologous" indicates that a sequence (e.g., an amino acid sequence or the polynucleotide that encodes an amino acid sequence) is not normally present in a given polypeptide or polynucleotide. For example, an amino acid sequence that corresponds to a domain or motif of one protein may be heterologous to a second protein.

[0321] The term “encoding nucleic acid” or grammatical equivalents thereof as it is used in reference to nucleic acid molecule encompasses (a) a nucleic acid molecule in its native state or when manipulated by methods well known to those skilled in the art that can be transcribed to produce mRNA which is then translated into a peptide and / or polypeptide, and (b) the mRNA molecule itself. The antisense strand is the complement of such a nucleic acid molecule, and the encoding sequence can be deduced therefrom. The term “coding region” refers to a portion in an encoding nucleic acid sequence that is translated into a peptide or polypeptide. The term “untranslated region” or “UTR” refers to the portion of an encoding nucleic acid that is not translated into a peptide or polypeptide. Depending on the orientation of a UTR with respect to the coding region of a nucleic acid molecule, a UTR is referred to as the 5’-UTR if located to the 5’-end of a coding region, and a UTR is referred to as the 3’-UTR if located to the 3’-end of a coding region.

[0322] The term "open reading frame" , abbreviated as "ORF" , refers to a segment or region of an mRNA molecule that encodes a polypeptide. The ORF comprises a continuous stretch of non-overlapping, in-frame codons, beginning with the initiation codon and ending with a stop codon, and is translated by the ribosome.

[0323] The term “mRNA” as used herein refers to a message RNA molecule comprising one or  more open reading frame (ORF) that can be translated by a cell or an organism provided with the mRNA to produce one or more peptide or protein product. The region containing the one or more ORFs is referred to as the coding region of the mRNA molecule. In certain embodiments, the mRNA molecule further comprises one or more untranslated regions (UTRs) . In certain embodiments, the mRNA is a monocistronic mRNA that comprises only one ORF. In certain embodiments, the monocistronic mRNA encodes a peptide or protein comprising at least one epitope of a selected antigen (e.g., a pathogenic antigen or a tumor associated antigen) . In other embodiments, the mRNA is a multicistronic mRNA that comprises two or more ORFs. In certain embodiments, the multiecistronic mRNA encodes two or more peptides or proteins that can be the same or different from each other. In certain embodiments, each peptide or protein encoded by a multicistronic mRNA comprises at least one epitope of a selected antigen. In certain embodiments, different peptide or protein encoded by a multicistronic mRNA each comprises at least one epitope of different antigens. In any of the embodiments described herein, the at least one epitope can be at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 epitopes of an antigen.

[0324] The term “nucleobases” encompasses purines and pyrimidines, including natural compounds adenine, thymine, guanine, cytosine, uracil, inosine, and natural or synthetic analogs or derivatives thereof.

[0325] The term “functional nucleotide analog” as used herein refers to a modified version of a canonical nucleotide A, G, C, U or T that (a) retains the base-pairing properties of the corresponding canonical nucleotide, and (b) contains at least one chemical modification to (i) the nucleobase, (ii) the sugar group, (iii) the phosphate group, or (iv) any combinations of (i) to (iii) , of the corresponding natural nucleotide. As used herein, base pairing encompasses not only the canonical Watson-Crick adenine-thymine, adenine-uracil, or guanine-cytosine base pairs, but also base pairs formed between canonical nucleotides and functional nucleotide analogs or between a pair of functional nucleotide analogs, wherein the arrangement of hydrogen bond donors and hydrogen bond acceptors permits hydrogen bonding between a modified nucleobase and a canonical nucleobase or between two complementary modified nucleobase structures. For example, a functional analog of guanosine (G) retains the ability to base-pair with cytosine (C) or a functional analog of cytosine. One example of such non-canonical base pairing is the base pairing between the modified nucleotide inosine and adenine,  cytosine, or uracil. As described herein, a functional nucleotide analog can be either naturally occurring or non-naturally occurring.

[0326] Accordingly, a nucleic acid molecule containing a functional nucleotide analog can have at least one modified nucleobase, sugar group and / or internucleoside linkage. Exemplary chemical modifications to the nucleobases, sugar groups, or internucleoside linkages of a nucleic acid molecule are provided herein.

[0327] As used herein, the term "RNA element" refers to a portion, fragment, or segment of an RNA molecule that provides a biological function and / or has biological activity (e.g., translational regulatory activity) . Modification of a polynucleotide by the incorporation of one or more RNA elements, such as those described herein, provides one or more desirable functional properties to the modified polynucleotide. RNA elements, as described herein, can be naturally-occurring, non-naturally occurring, synthetic, engineered, or any combination thereof. For example, naturally-occurring RNA elements that provide a regulatory activity include elements found throughout the transcriptomes of viruses, prokaryotic and eukaryotic organisms (e.g., humans) . RNA elements in particular eukaryotic mRNAs and translated viral RNAs have been shown to be involved in mediating many functions in cells. Exemplary natural RNA elements include, but are not limited to, translation initiation elements (e.g, internal ribosome entry site (IRES) , see Kieft et al., (2001) RNA 7 (2) : 194-206) , translation enhancer elements (e.g, the APP mRNA translation enhancer element, see Rogers et al, . (1999) J Biol Chem 274 (10) : 6421-6431) , mRNA stability elements (e.g, AU-rich elements (AREs) , see Gameau et al., (2007) Nat Rev Mol Cell Biol 8 (2) : 113-126) , translational repression element (see e.g, Blumer et al., (2002) Mech Dev 110 (1 -2) : 97-112) , protein-binding RNA elements (e.g, iron-responsive element, see Selezneva et al., (2013) J Mol Biol 425 (18) : 3301-3310) , cytoplasmic polyadenylation elements (Villalba et al, . (2011) Curr Opin Genet Dev 21 (4) : 452-457) , and catalytic RNA elements (e.g, ribozymes, see Scott et al, . (2009) Biochim Biophys Acta 1789 (9-10) : 634-641) .

[0328] The terms “translational enhancer element, ” “TEE” and “translational enhancers” as used herein refers to an region in a nucleic acid molecule that functions to promotes translation of a coding sequence of the nucleic acid into a protein or peptide product, such as via cap-dependent or cap-independent translation. A TEE typically locates in the UTR region of a nucleic acid molecule (e.g., mRNA) and enhance the translational level of a coding sequence located either upstream or downstream. For example, a TEE in a 5’-UTR of a nucleic acid molecule can locate between the promoter and the starting  codon of the nucleic acid molecule. Various TEE sequences are known in the art (Wellensiek et al. Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements, Nature Methods, 2013 Aug; 10 (8) : 747-750; Chappell et al. PNAS June 29, 2004 101 (26) 9590-9594) . Some TEEs are known to be conserved across multiple species (Pánek et al. Nucleic Acids Research, Volume 41, Issue 16, 1 September 2013, Pages 7625-7634) .

[0329] As used herein, the term “stem-loop sequence” refers to a single-stranded polynucleotide sequence having at least two regions that are complementary or substantially complementary to each other when read in opposite directions, and thus capable of base-pairing with each other to form at least one double helix and an unpaired loop. The resulting structure is known as a stem-loop structure, a hairpin, or a hairpin loop, which is a secondary structure found in many RNA molecules.

[0330] The term “peptide” as used herein refers to a polymer containing between two and fifty (2-50) amino acid residues linked by one or more covalent peptide bond (s) . The terms apply to naturally occurring amino acid polymers as well as amino acid polymers in which one or more amino acid residues is a non-naturally occurring amino acid (e.g., an amino acid analog or non-natural amino acid) .

[0331] The terms “polypeptide” and “protein” are used interchangeably herein to refer to a polymer of greater than fifty (50) amino acid residues linked by covalent peptide bonds. That is, a description directed to a polypeptide applies equally to a description of a protein, and vice versa. The terms apply to naturally occurring amino acid polymers as well as amino acid polymers in which one or more amino acid residues is a non-naturally occurring amino acid (e.g., an amino acid analog) . As used herein, the terms encompass amino acid chains of any length, including full length proteins (e.g., antigens) .

[0332] The term “antigen” refers to a substance that can be recognized by the immune system of a subject (including by the adaptive immune system) , and is capable of triggering an immune response after the subject is contacted with the antigen (including an antigen-specific immune response) . In certain embodiments, the antigen is a protein associated with a diseased cell, such as a cell infected by a pathogen or a neoplastic cell (e.g., tumor associated antigen (TAA) ) .

[0333] In the context of a peptide or polypeptide, the term “fragment” as used herein refers to a peptide or polypeptide that comprises less than the full length amino acid sequence. Such a fragment may arise, for example, from a truncation at the amino terminus, a  truncation at the carboxy terminus, and / or an internal deletion of a residue (s) from the amino acid sequence. Fragments may, for example, result from alternative RNA splicing or from in vivo protease activity. In certain embodiments, fragments refers to polypeptides comprising an amino acid sequence of at least 5 contiguous amino acid residues, at least 10 contiguous amino acid residues, at least 15 contiguous amino acid residues, at least 20 contiguous amino acid residues, at least 25 contiguous amino acid residues, at least 30 contiguous amino acid residues, at least 40 contiguous amino acid residues, at least 50 contiguous amino acid residues, at least 60 contiguous amino residues, at least 70 contiguous amino acid residues, at least 80 contiguous amino acid residues, at least 90 contiguous amino acid residues, at least contiguous 100 amino acid residues, at least 125 contiguous amino acid residues, at least 150 contiguous amino acid residues, at least 175 contiguous amino acid residues, at least 200 contiguous amino acid residues, at least 250, at least 300, at least 350, at least 400, at least 450, at least 500, at least 550, at least 600, at least 650, at least 700, at least 750, at least 800, at least 850, at least 900, or at least 950 contiguous amino acid residues of the amino acid sequence of a polypeptide. In a specific embodiment, a fragment of a polypeptide retains at least 1, at least 2, at least 3, or more functions of the polypeptide.

[0334] An “epitope” is the site on the surface of an antigen molecule to which a single antibody molecule binds, such as a localized region on the surface of an antigen that is capable of being bound to one or more antigen binding regions of an antibody, and that has antigenic or immunogenic activity in an animal, such as a mammal (e.g., a human) , that is capable of eliciting an immune response. An epitope having immunogenic activity is a portion of a polypeptide that elicits an antibody response in an animal. An epitope having antigenic activity is a portion of a polypeptide to which an antibody binds as determined by any method well known in the art, including, for example, by an immunoassay. Antigenic epitopes need not necessarily be immunogenic. Epitopes often consist of chemically active surface groupings of molecules such as amino acids or sugar side chains and have specific three dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics. Antibody epitopes may be linear epitopes or conformational epitopes. Linear epitopes are formed by a continuous sequence of amino acids in a protein. Conformational epitopes are formed of amino acids that are discontinuous in the protein sequence, but which are brought together upon folding of the protein into its three-dimensional structure. Induced epitopes are formed when the three  dimensional structure of the protein is in an altered conformation, such as following activation or binding of another protein or ligand. In certain embodiments, an epitope is a three-dimensional surface feature of a polypeptide. In other embodiments, an epitope is linear feature of a polypeptide. Generally an antigen has several or many different epitopes and may react with many different antibodies.

[0335] The term “genetic vaccine” as used herein refers to a therapeutic or prophylactic composition comprising at least one nucleic acid molecule encoding an antigen associated with a target disease (e.g., an infectious disease or a neoplastic disease) . Administration of the vaccine to a subject ( “vaccination” ) allows for the production of the encoded peptide or protein, thereby eliciting an immune response against the target disease in the subject. In certain embodiments, the immune response comprises adaptive immune response, such as the production of antibodies against the encoded antigen, and / or activation and proliferations of immune cells capable of specifically eliminating diseased cells expressing the antigen. In certain embodiments, the immune response further comprises innate immune response. According to the present disclosure, a vaccine can be administered to a subject either before or after the onset of clinical symptoms of the target disease. In some embodiments, vaccination of a healthy or asymptomatic subject renders the vaccinated subject immune or less susceptible to the development of the target disease. In some embodiments, vaccination of a subject showing symptoms of the disease improves the condition of, or treats, the disease in the vaccinated subject.

[0336] The terms “innate immune response” and “innate immunity” are recognized in the art, and refer to non-specific defense mechanism a body’s immune system initiates upon recognition of pathogen-associated molecular patterns, which involves different forms of cellular activities, including cytokine production and cell death through various pathways. As used herein, innate immune responses include, without limitation, increased production of inflammation cytokines (e.g., type I interferon or IL-10 production) , activation of the NFκB pathway, increased proliferation, maturation, differentiation and / or survival of immune cells, and in some cases, induction of cell apoptosis. Activation of the innate immunity can be detected using methods known in the art, such as measuring the (NF) -κB activation.

[0337] The terms “adaptive immune response” and “adaptive immunity” are recognized in the art, and refer to antigen-specific defense mechanism a body’s immune system initiates upon recognition of a specific antigen, which include both humoral response and cell- mediated responses. As used herein, adaptive immune responses include cellular responses that is triggered and / or augmented by a vaccine composition, such as a genetic composition described herein. In some embodiments, the vaccine composition comprises an antigen that is the target of the antigen-specific adaptive immune response. In other embodiments, the vaccine composition, upon administration, allows the production in an immunized subject of an antigen that is the target of the antigen-specific adaptive immune response. Activation of an adaptive immune response can be detected using methods known in the art, such as measuring the antigen-specific antibody production, or the level of antigen-specific cell-mediated cytotoxicity.

[0338] The term “antibody” is intended to include a polypeptide product of B cells within the immunoglobulin class of polypeptides that is able to bind to a specific molecular antigen and is composed of two identical pairs of polypeptide chains, wherein each pair has one heavy chain (about 50-70 kDa) and one light chain (about 25 kDa) , each amino-terminal portion of each chain includes a variable region of about 100 to about 130 or more amino acids, and each carboxy-terminal portion of each chain includes a constant region. See, e.g., Antibody Engineering (Borrebaeck ed., 2d ed. 1995) ; and Kuby, Immunology (3d ed. 1997) . In specific embodiments, the specific molecular antigen can be bound by an antibody provided herein, including a polypeptide, a fragment or an epitope thereof. Antibodies also include, but are not limited to, synthetic antibodies, recombinantly produced antibodies, camelized antibodies, intrabodies, anti-idiotypic (anti-Id) antibodies, and functional fragments of any of the above, which refers to a portion of an antibody heavy or light chain polypeptide that retains some or all of the binding activity of the antibody from which the fragment was derived. Non-limiting examples of functional fragments include single-chain Fvs (scFv) (e.g., including monospecific, bispecific, etc. ) , Fab fragments, F (ab’) fragments, F (ab) 2 fragments, F (ab’) 2 fragments, disulfide-linked Fvs (dsFv) , Fd fragments, Fv fragments, diabody, triabody, tetrabody, and minibody. In particular, antibodies provided herein include immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, for example, antigen-binding domains or molecules that contain an antigen-binding site (e.g., one or more CDRs of an antibody) . Such antibody fragments can be found in, for example, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1989) ; Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers ed., 1995) ; Huston et al., 1993, Cell Biophysics 22: 189-224; Plückthun and Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178: 497-515; and Day, Advanced Immunochemistry (2d ed. 1990) . The  antibodies provided herein can be of any class (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, and IgA) or any subclass (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) of immunoglobulin molecule.

[0339] The term “administer” or “administration” refers to the act of injecting or otherwise physically delivering a substance as it exists outside the body (e.g., a lipid nanoparticle composition as described herein) into a patient, such as by mucosal, intradermal, intravenous, intramuscular delivery, and / or any other method of physical delivery described herein or known in the art. When a disease, disorder, condition, or a symptom thereof, is being treated, administration of the substance typically occurs after the onset of the disease, disorder, condition, or symptoms thereof. When a disease, disorder, condition, or symptoms thereof, are being prevented, administration of the substance typically occurs before the onset of the disease, disorder, condition, or symptoms thereof.

[0340] The term “Administering" refers to a method of delivering a composition to a subject or patient. A method of administration may be selected to target delivery (e.g., to specifically deliver) to a specific region or system of a body. For example, an administration may be parenteral (e.g, subcutaneous, intracutaneous, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasynovial, intrastemal, intrathecal, intralesional, or intracranial injection, as well as any suitable infusion technique) , oral, trans-or intra-dermal, interdermal, rectal, intravaginal, topical (e.g, by powders, ointments, creams, gels, lotions, and / or drops) , mucosal, nasal, buccal, enteral, vitreal, intratumoral, sublingual, intranasal; by intratracheal instillation, bronchial instillation, and / or inhalation; as an oral spray and / or powder, nasal spray, and / or aerosol, and / or through a portal vein catheter. Preferred means of administration are intravenous or subcutaneous. “Intermittent” administration is treatment that is not consecutively done without interruption, but rather is cyclic in nature.

[0341] The term “targeted delivery” or the verb form “target” as used herein refers to the process that promotes the arrival of a delivered agent (such as a therapeutic payload molecule in a lipid nanoparticle composition as described herein) at a specific organ, tissue, cell and / or intracellular compartment (referred to as the targeted location) more than any other organ, tissue, cell or intracellular compartment (referred to as the non-target location) . Targeted delivery can be detected using methods known in the art, for example, by comparing the concentration of the delivered agent in a targeted cell population with the concentration of the delivered agent at a non-target cell population  after systemic administration. In certain embodiments, targeted delivery results in at least 2 fold higher concentration at a targeted location as compared to a non-target location.

[0342] An “effective amount” is generally an amount sufficient to reduce the severity and / or frequency of symptoms, eliminate the symptoms and / or underlying cause, prevent the occurrence of symptoms and / or their underlying cause, and / or improve or remediate the damage that results from or is associated with a disease, disorder, or condition, including, for example, infection and neoplasia. In some embodiments, the effective amount is a therapeutically effective amount or a prophylactically effective amount.

[0343] The term “therapeutically effective amount” as used herein refers to the amount of an agent (e.g., a vaccine composition) that is sufficient to reduce and / or ameliorate the severity and / or duration of a given disease, disorder, or condition, and / or a symptom related thereto (e.g., an infectious disease such as caused by viral infection, or a neoplastic disease such as cancer) . A “therapeutically effective amount” of a substance / molecule / agent of the present disclosure (e.g., the lipid nanoparticle composition as described herein) may vary according to factors such as the disease state, age, sex, and weight of the individual, and the ability of the substance / molecule / agent to elicit a desired response in the individual. A therapeutically effective amount encompasses an amount in which any toxic or detrimental effects of the substance / molecule / agent are outweighed by the therapeutically beneficial effects. In certain embodiments, the term “therapeutically effective amount” refers to an amount of a lipid nanoparticle composition as described herein or a therapeutic or prophylactic agent contained therein (e.g., a therapeutic mRNA) effective to “treat” a disease, disorder, or condition, in a subject or mammal.

[0344] A “prophylactically effective amount” is an amount of a pharmaceutical composition that, when administered to a subject, will have the intended prophylactic effect, e.g., preventing, delaying, or reducing the likelihood of the onset (or reoccurrence) of a disease, disorder, condition, or associated symptom (s) (e.g., an infectious disease such as caused by viral infection, or a neoplastic disease such as cancer) . Typically, but not necessarily, since a prophylactic dose is used in subjects prior to or at an earlier stage of a disease, disorder, or condition, a prophylactically effective amount may be less than a therapeutically effective amount. The full therapeutic or prophylactic effect does not necessarily occur by administration of one dose, and may occur only after administration of a series of doses. Thus, a therapeutically or prophylactically effective  amount may be administered in one or more administrations.

[0345] As used herein and unless otherwise specified, the terms “treat” , “treating” , and “treatment” refer to an alleviation, in whole or in part, of a disorder, disease or condition, or one or more of the symptoms associated with a disorder, disease, or condition, or slowing or halting of further progression or worsening of those symptoms, or alleviating or eradicating the cause (s) of the disorder, disease, or condition itself.

[0346] As used herein, "expression" of a nucleic acid sequence refers to one or more of the following events: (1) production of an RNA template from a DNA sequence (e.g., by transcription) ; (2) processing of an RNA transcript (e.g, by splicing, editing, 5' cap formation, and / or 3' end processing) ; (3) translation of an RNA into a polypeptide or protein; and (4) post-translational modification of a polypeptide or protein.

[0347] As used herein, the term "ex vivo” refers to events that occur outside of an organism (e.g, animal, plant, or microbe or cell or tissue thereof) . Ex vivo events may take place in an environment minimally altered from a natural (e.g, in vivo) environment.

[0348] As used herein and unless otherwise specified, the terms “prevent, ” “preventing, ” and “prevention” refer to reducing the likelihood of the onset (or recurrence) of a disease, disorder, condition, or associated symptom (s) (e.g., an infectious disease such as caused by viral infection, or a neoplastic disease such as cancer) .

[0349] As used herein and unless otherwise specified, the terms “manage, ” “managing, ” and “management” refer to the beneficial effects that a subject derives from a therapy (e.g., a prophylactic or therapeutic agent) , which does not result in a cure of the disease. In certain embodiments, a subject is administered one or more therapies (e.g., prophylactic or therapeutic agents, such as a lipid nanoparticle composition as described herein) to “manage” an infectious or neoplastic disease, one or more symptoms thereof, so as to prevent the progression or worsening of the disease.

[0350] The term “prophylactic agent” refers to any agent that can totally or partially inhibit the development, recurrence, onset, or spread of disease and / or symptom related thereto in a subject.

[0351] The term “therapeutic agent” refers to any agent that can be used in treating, preventing, or alleviating a disease, disorder, or condition, including in the treatment, prevention, or alleviation of one or more symptoms of a disease, disorder, or condition and / or a symptom related thereto.

[0352] The term “therapy” refers to any protocol, method, and / or agent that can be used in the prevention, management, treatment, and / or amelioration of a disease, disorder, or  condition. In certain embodiments, the terms “therapies” and “therapy” refer to a biological therapy, supportive therapy, and / or other therapies useful in the prevention, management, treatment, and / or amelioration of a disease, disorder, or condition, known to one of skill in the art such as medical personnel.

[0353] As used herein, a “prophylactically effective serum titer” is the serum titer of an antibody in a subject (e.g., a human) , that totally or partially inhibits the development, recurrence, onset, or spread of a disease, disorder, or condition, and / or symptom related thereto in the subject.

[0354] In certain embodiments, a “therapeutically effective serum titer” is the serum titer of an antibody in a subject (e.g., a human) , that reduces the severity, the duration, and / or the symptoms associated with a disease, disorder, or condition, in the subject.

[0355] The term “serum titer” refers to an average serum titer in a subject from multiple samples (e.g., at multiple time points) or in a population of at least 10, at least 20, at least 40 subjects, up to about 100, 1000, or more.

[0356] The term “side effects” encompasses unwanted and / or adverse effects of a therapy (e.g., a prophylactic or therapeutic agent) . Unwanted effects are not necessarily adverse. An adverse effect from a therapy (e.g., a prophylactic or therapeutic agent) might be harmful, uncomfortable, or risky. Examples of side effects include, diarrhea, cough, gastroenteritis, wheezing, nausea, vomiting, anorexia, abdominal cramping, fever, pain, loss of body weight, dehydration, alopecia, dyspenea, insomnia, dizziness, mucositis, nerve and muscle effects, fatigue, dry mouth, loss of appetite, rashes or swellings at the site of administration, flu-like symptoms such as fever, chills, and fatigue, digestive tract problems, and allergic reactions. Additional undesired effects experienced by patients are numerous and known in the art. Many are described in Physician’s Desk Reference (68th ed. 2014) .

[0357] The terms “subject” and “patient” may be used interchangeably. As used herein, in certain embodiments, a subject is a mammal, such as a non-primate (e.g., cow, pig, horse, cat, dog, rat, etc. ) or a primate (e.g., monkey and human) . In specific embodiments, the subject is a human. In one embodiment, the subject is a mammal (e.g., a human) having an infectious disease or neoplastic disease. In another embodiment, the subject is a mammal (e.g., a human) at risk of developing an infectious disease or neoplastic disease.

[0358] The term “detectable probe” refers to a composition that provides a detectable signal. The term includes, without limitation, any fluorophore, chromophore, radiolabel,  enzyme, antibody or antibody fragment, and the like, that provide a detectable signal via its activity.

[0359] The term “detectable agent” refers to a substance that can be used to ascertain the existence or presence of a desired molecule, such as an antigen encoded by an mRNA molecule as described herein, in a sample or subject. A detectable agent can be a substance that is capable of being visualized or a substance that is otherwise able to be determined and / or measured (e.g., by quantitation) .

[0360] The term “Substantially all” refers to at least about 60%, at least about 65%, at least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 85%, at least about 90%, at least about 95%, at least about 98%, at least about 99%, or about 100%.

[0361] As used herein, and unless otherwise indicated, the term “about” or “approximately” means an acceptable error for a particular value as determined by one of ordinary skill in the art, which depends in part on how the value is measured or determined. In certain embodiments, the term “about” or “approximately” means within 1, 2, 3, or 4 standard deviations. In certain embodiments, the term “about” or “approximately” means within 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.05%, or less of a given value or range.

[0362] The singular terms “a” , “an” and “the” as used herein include the plural reference unless the context clearly indicates otherwise. All publications, patent applications, accession numbers, and other references cited in this specification are herein incorporated by reference in their entirety as if each individual publication or patent application were specifically and individually indicated to be incorporated by reference. The publications discussed herein are provided solely for their disclosure prior to the filing date of the present application. Nothing herein is to be construed as an admission that the present invention is not entitled to antedate such publication by virtue of prior invention. Further, the dates of publication provided can be different from the actual publication dates which can need to be independently confirmed.

[0363] A number of embodiments of the invention have been described. Nevertheless, it will be understood that various modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention. Accordingly, the descriptions in the Experimental section and examples are intended to illustrate but not limit the scope of invention described in the claims.

[0364] A lipid nanoparticle (LNP) and pharmaceutical composition

[0365] In an aspect, disclosed herein is a lipid nanoparticle (LNP) composition comprising:

[0366] an optional payload, wherein the payload modifies a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell (e.g. HSPC) , a bone marrow cell and a CD34+ cell ;

[0367] a lipid nanoparticle (LNP) .

[0368] In an embodiment, the payload modifies a stem or progenitor cell, e.g, a common myeloid progenitor cell, a common lymphoid progenitor cell, a multipotent progenitor cell, or a multipotent stem cell.

[0369] In an embodiment, the payload modifies a monocyte cell, a macrophage cell, a neutrophil cell, a basophil cell, an eosinophil cell, an erythrocyte cell, a dendritic cell, or a megakaryocyte cell.

[0370] In an embodiment, the modified cell, e.g, modified stem or progenitor cell, e.g, modified HSPC, has one, two, three, four, five or all of the following functional characteristics:

[0371] (i) ability to self-renew;

[0372] (ii) unlimited proliferative potential;

[0373] (iii) ability to enter and / or exit a quiescent state, e.g, a cell state where no proliferation occurs, e.g, GO phase of the cell cycle;

[0374] (iv) ability to differentiate into any hematopoietic lineage, e.g, myeloid and / or lymphoid lineages, e.g, common lymphoid progenitor (CLP) or a differentiated cell thereof; and / or common myeloid progenitor (CMP) or a differentiated cell thereof;

[0375] (v) ability to repopulate any hematopoietic lineage, e.g, myeloid and / or lymphoid lineages, e.g, common lymphoid progenitor (CLP) or a differentiated cell thereof; and / or common myeloid progenitor (CMP) or a differentiated cell thereof; e.g, in an organism; and / or (vi) ability to form colony forming units (CFU) .

[0376] In an embodiment, the modified cell, e.g, modified stem or progenitor cell, e.g, modified HSPC, has (i) the ability to self-renew. In an embodiment, the modified cell, e.g., modified stem or progenitor cell, e.g., modified HSPC, has (ii) unlimited proliferative potential. In an embodiment, the modified cell, e.g., modified stem or progenitor cell, e.g., modified HSPC, has (iii) the ability to enter and / or exit a quiescent state, e.g., a cell state where no proliferation occurs, e.g., GO phase of the cell cycle. In an embodiment, the modified cell, e.g., modified stem or progenitor cell, e.g., modified HSPC, has (iv) the ability to differentiate into any hematopoietic lineage, e.g., myeloid and / or lymphoid lineages, e.g., common lymphoid progenitor (CLP) or a differentiated cell thereof; and / or common myeloid progenitor (CMP) or a  differentiated cell thereof. In an embodiment, the modified cell, e.g., modified stem or progenitor cell, e.g., modified HSPC, has (v) ability to repopulate any hematopoietic lineage, e.g., myeloid and / or lymphoid lineages, e.g., common lymphoid progenitor (CLP) or a differentiated cell thereof; and / or common myeloid progenitor (CMP) or a differentiated cell thereof; e.g., in an organism. In an embodiment, the modified cell, e.g., modified stem or progenitor cell, e.g., modified HSPC, has (vi) the ability to form colony forming units (CFU) .

[0377] In an embodiment, the modified HSPC has the ability to form CFU, e.g., as measured in an ex-vivo colony -forming unit (CFU) assay, e.g., as described in Example 2. In an embodiment, the CFU ability is compared to an otherwise similar HSC which has not been contacted with an LNP, or has been contacted with a different LNP.

[0378] In an embodiment, the modified HSPC has the ability to differentiate into myeloid cells, e.g., as measured in an ex-vivo colony-forming unit (CFU) assay. In an embodiment the ability of the modified HSPC to differentiate into myeloid cells is compared to an otherwise similar HSC which has not been contacted with an LNP, or has been contacted with a different LNP.

[0379] In an embodiment, the modified HSPC has the ability to differentiate into lymphoid cells, e.g, as measured in a lineage tracing experiment. In an embodiment, the ability of the modified HSPC to differentiate into lymphoid cells is compared to an otherwise similar HSPC which has not been contacted with an LNP, or has been contacted with a different LNP.

[0380] In an embodiment, the modified HSPC has the ability to differentiate into an erythrocyte cell or a platelet. In an embodiment, the ability of the modified HSPC to differentiate into an erythrocyte cell or a platelet is compared to an otherwise similar HSC which has not been contacted with an LNP, or has been contacted with a different LNP. In an embodiment, the modified HSPC differentiates into an erythrocyte cell or a platelet in vivo. In an embodiment, the modified HSPC differentiates into an erythrocyte cell or a platelet in vitro.

[0381] In an embodiment, the modified HSPC persists, e.g., in vivo , for at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 300, or 365 days or more. In an embodiment, the in vivo persistence of the modified HSPC results in differentiation into one or more cells, e.g., cells in the myeloid and / or cells in the lymphoid lineage. In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the modified cell (e.g, modified stem or progenitor cell, e.g, modified HSPC) is a human  cell, and has one, two, three, four, five, six, seven, eight, or all of the following expression characteristics:

[0382] (i) expression of CD34, e.g, detectable expression of CD34, e.g, cell surface expression of CD34; (ii) expression of CD45, e.g, detectable expression of CD45, e.g, cell surface expression of CD45; (iii) expression of CD38, e.g, detectable expression of CD38, e.g, cell surface expression of CD38; (iv) expression of CD90 e.g, detectable expression of CD90, e.g, cell surface expression of CD90; (v) expression of CD133 e.g, detectable expression of CD133, e.g, cell surface expression of CD133;

[0383] (vi) expression of CD45RA, e.g, detectable expression of CD45RA, e.g, cell surface expression of CD45RA;

[0384] (vii) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g, common myeloid progenitor (CMP) , megakaryocyte erythroid progenitor (MEP) , granulocyte-macrophage progenitor (GMP) and / or common lymphoid progenitor (CLP) ;

[0385] (viii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g, TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP; or (ix) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (vii) - (viii) , e.g, lineage negative (Lin-) .

[0386] In an embodiment, the modified cell is a modified human HSPC and has (i) expression of CD34, e.g, detectable expression of CD34, e.g, cell surface expression of CD34and has (ii) expression of CD45, e.g, detectable expression of CD45, e.g, cell surface expression of CD45. In an embodiment, the modified cell is a modified human HSPC . In an embodiment, the modified cell is a modified human HSPC and has (iii) expression of CD38, e.g, detectable expression of CD38, e.g, cell surface expression of CD38. In an embodiment, the modified cell is a modified human HSPC and has (iv) expression of CD90 e.g., detectable expression of CD90, e.g., cell surface expression of CD90. In an embodiment, the modified cell is a modified human HSPC and has (v) expression of CD133 e.g., detectable expression of CD133, e.g., cell surface expression of CD133. In an embodiment, the modified cell is a modified human HSPC and has (vi) expression of CD45RA, e.g., detectable expression of CD45RA, e.g., cell surface expression of CD45RA. In an embodiment, the modified cell is a modified human HSPC and has (vii) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g., CMP, MEP, GMP and / or CLP. In an embodiment, the modified cell is a modified human HSPC and has (viii) no detectable or low expression  of markers associated with lineage committed cells, e.g., TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP. In an embodiment, the modified cell is a modified human HSPC and has (ix) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (vii) - (viii) , e.g., lineage negative (Lin-) .

[0387] In an embodiment, the modified human HSPC expresses any one of (i) - (vi) . In an embodiment, the modified human HSPC expresses any two of (i) - (vi) . In an embodiment, the modified human HSPC expresses any three of (i) - (vi) . In an embodiment, the modified human HSPC expresses all of (i) - (vi) .

[0388] In an embodiment, the modified human HSPC has no detectable or low expression of (vii) or (viii) . In an embodiment, the modified human HSPC has no detectable or low expression of both (vii) and (viii) , e.g., wherein the human HSPC is a lineage negative HSPC.

[0389] In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the modified cell (e.g, modified stem or progenitor cell, e.g, modified HSPC) is a non-human primate (NHP) cell and has one, two, three, four, five, six, seven, eight, or all of the following expression characteristics: (i) expression of CD34, e.g, detectable expression of CD34, e.g, cell surface expression of CD34; (ii) expression of CD45, e.g, detectable expression of CD45, e.g, cell surface expression of CD45; (iii) expression of c-Kit (CD117) , e.g, detectable expression of c-Kit (CD117) , e.g, cell surface expression of c-Kit (CD117) ; (iv) expression of CD90 e.g, detectable expression of CD90, e.g, cell surface expression of CD90; (v) expression of CD123 e.g, detectable expression of CD123, e.g, cell surface expression of CD123; (vi) expression of CD45RA, e.g, detectable expression of CD45RA, e.g, cell surface expression of CD45RA; (vii) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g., CMP, MEP, GMP and / or CLP; (viii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g., TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP; or (ix) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (vii) - (viii) , e.g, lineage negative (Lin-) .

[0390] In an embodiment, the modified cell is a modified NHP HSPC and has (i) expression of CD34, e.g, detectable expression of CD34, e.g, cell surface expression of CD34. In an embodiment, the modified cell is a modified NHP HSPC and has (ii) expression of CD45, e.g, detectable expression of CD45, e.g, cell surface expression of CD45. In an embodiment, the modified cell is a modified NHP HSPC and has (iii) expression of c-Kit (CD117) , e.g, detectable expression of c-Kit (CD117) , e.g, cell surface expression  of c-Kit (CD117) . In an embodiment, the modified cell is a modified NHP HSPC and has (iv) expression of CD90, e.g, detectable expression of CD90, e.g, cell surface expression of CD90. In an embodiment, the modified cell is a modified NHP HSPC and has (v) expression of CD 123, e.g, detectable expression of CD123, e.g., cell surface expression of CD123. In an embodiment, the modified cell is a modified NHP HSPC and has (vi) expression of CD45RA, e.g, detectable expression of CD45RA, e.g, cell surface expression of CD45RA. In an embodiment, the modified cell is a modified NHP HSPC and has (vii) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g., CMP, MEP, GMP and / or CLP. In an embodiment, the modified cell is a modified NHP HSPC and has (viii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g., TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP. In an embodiment, the modified cell is a modified NHP HSPC and has (ix) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (vii) - (viii) , e.g, lineage negative (Lin-) .

[0391] In an embodiment, the modified NHP HSPC expresses any one of (i) - (vi) . In an embodiment, the modified NHP HSPC expresses any two of (i) - (vi) . In an embodiment, the modified NHP HSPC expresses any three of (i) - (vi) . In an embodiment, the modified NHP HSPC expresses all of (i) - (vi) .

[0392] In an embodiment, the modified NHP HSPC has no detectable or low expression of (vii) or (viii) . In an embodiment, the modified NHP HSPC has no detectable or low expression of both (vii) and (viii) , e.g, wherein the NHP HSPC is a lineage negative HSPC.

[0393] In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the modified cell, (e.g., modified stem or progenitor cell, e. g ., modified HSPC) is a modified mouse cell and has one, two, three, four, five, six, seven or all of the following expression characteristics: (i) expression of CD34, e.g., detectable expression of CD34, e.g., cell surface expression of CD34; (ii) expression of CD 150, e.g., detectable expression of CD 150, e.g, cell surface expression of CD 150; (iii) expression of Sca-1 e.g, detectable expression of Sca-1, e.g, cell surface expression of Sca-1; (iv) expression of c-kit e.g, detectable expression of c-KIT, e.g, cell surface expression of c-kit; (v) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g, CMP and / or CLP; (vi) no detectable or low expression of markers associated with committed precursor cells, e.g, MEP, GM, TNK and / or BCP; (vii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g, TCP, NKP, GP, MP,  EP and / or MkP; or (viii) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (v) - (vii) , e.g, lineage negative (Lin-) .

[0394] In an embodiment, the modified cell is a modified mouse HSPC and has (i) expression of CD34, e.g, detectable expression of CD34, e.g, cell surface expression of CD34. In an embodiment, the modified cell is a modified mouse HSPC and has (ii) expression of CD 150, e.g, detectable expression of CD 150, e.g, cell surface expression of CD 150. In an embodiment, the modified cell is a modified mouse HSPC and has (iii) expression of Sca-1 e.g, detectable expression of Sca-1, e.g, cell surface expression of Sca-1. In an embodiment, the modified cell is a modified mouse HSPC and has (iv) expression of c-kit e.g, detectable expression of c-KIT, e.g, cell surface expression of c-kit. In an embodiment, the modified cell is a modified mouse HSPC and has (v) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g, CMP and / or CLP. In an embodiment, the modified cell is a modified mouse HSPC and has (vi) no detectable or low expression of markers associated with committed precursor cells, e.g, MEP, GM, TNK and / or BCP. In an embodiment, the modified cell is a modified mouse HSPC and has (vii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g., TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP. In an embodiment, the modified cell is a modified mouse HSPC and has (viii) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (v) - (vii) , e.g, lineage negative (Lin-) .

[0395] In an embodiment, the modified mouse HSPC expresses any one of (i) - (iv) . In an embodiment, the modified mouse HSPC expresses any two of (i) - (iv) . In an embodiment, the modified mouse HSPC expresses any three of (i) - (iv) . In an embodiment, the modified mouse HSPC expresses all of (i) - (iv) .

[0396] In an embodiment, the modified mouse HSPC has no detectable or low expression of any one of (v) - (vii) . In an embodiment, the modified mouse HSPC has no detectable or low expression of any two of (v) - (vii) . In an embodiment, the modified mouse HSPC has no detectable or low expression of all of (v) - (vii) , e. g ., wherein the mouse HSPC is a lineage negative HSPC.

[0397] In an embodiment, the modified mouse HSPC expresses c-Kit and Seal, e.g., a C-KIT+and Sca-1+ HSC. In an embodiment, the modified mouse HSPC expresses c-Kit and Seal, e.g., a C-KIT+ and Sca-1+ HSC, and has no detectable expression or low expression of any one, two or all of (v) - (vii) .

[0398] In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the  modified cell (e.g, modified stem or progenitor cell, e.g, modified HSPC) is a modified human cell and has one, two, three, four, five, six, seven, eight, or all of the following expression characteristics: (i) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of NHP CD34; (ii) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of NHP CD45; (iii) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of NHP c-Kit (CD 117) ; (iv) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of NHP CD90; (v) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of NHP CD 123; (vi) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of NHP CD45RA; (vii) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g, a human ortholog or equivalent of NHP CMP, MEP, GMP and / or CLP; (viii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g, a human ortholog or equivalent of NHP TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP; or (ix) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (vii) - (viii) , e.g, lineage negative (Lin-) , or a human ortholog or equivalent thereof.

[0399] In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the modified cell, (e. g ., modified stem or progenitor cell, e. g ., modified HSPC) is a modified human cell and has one, two, three, four, five, six, seven or all of the following expression characteristics: (i) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of mouse CD34; (ii) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of mouse CD 150; (iii) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of mouse Sca-1; (iv) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of mouse c-kit; (v) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g, a human ortholog or equivalent of mouse CMP and / or CLP; (vi) no detectable or low expression of markers associated with committed precursor cells, e.g, a human ortholog or equivalent of mouse MEP, GM, TNK and / or BCP; (vii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g, a human ortholog or equivalent of mouse TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP; or (viii) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage  markers of (v) - (vii) , e.g, lineage negative (Lin-) , or a human ortholog or equivalent thereof. In an embodiment, the modified human HSPC expresses human orthologs or equivalents of mouse c-Kit and Seal. In an embodiment, the modified human HSPC expresses human orthologs or equivalents of mouse c-Kit and Seal, and has no detectable expression or low expression of any one, two or all of (v) - (vii) .

[0400] Hematopoietic stem and progenitor cells for in vivo modification

[0401] In an embodiment, any of the methods disclosed herein comprise in vivo modification of a stem or progenitor cell, e.g, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) . In an embodiment, any of the methods disclosed herein comprise in vivo gene editing of a stem and progenitor cell (HSPC) , e.g, a hematopoietic stem or progenitor cell (HSPC) . In an embodiment, the stem or progenitor cell comprises an HSPC or a population of HSPCs (e.g, a population of HSCs, HPCs, or a combination thereof) . In an embodiment, the HSPC comprises an HSPC derived from an embryonic stem or progenitor cell or an HSPC derived from an induced pluripotent stem or progenitor cell.

[0402] In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the cell is an HSPC, e. g ., a multipotent HSC or a multipotent HPC. In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the cell is a common myeloid progenitor cell, a common lymphoid progenitor cell, a multipotent progenitor cell, or a multipotent stem cell.

[0403] In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the HSPC has one, two, three, four, five or all of the following functional characteristics: (i) ability to self-renew; (ii) unlimited proliferative potential; (iii) ability to enter and / or exit a quiescent state, e.g., a cell state where no proliferation occurs, e.g., GO phase of the cell cycle; (iv) ability to differentiate into any hematopoietic lineage, e.g., myeloid and / or lymphoid lineages, e.g., common lymphoid progenitor (CLP) or a differentiated cell thereof; and / or common myeloid progenitor (CMP) or a differentiated cell thereof; (v) ability to repopulate any hematopoietic lineage, e.g., myeloid and / or lymphoid lineages, e.g., common lymphoid progenitor (CLP) or a differentiated cell thereof; and / or common myeloid progenitor (CMP) or a differentiated cell thereof; e.g., in an organism; and / or (vi) ability to form colony forming units (CFU) . In an embodiment, the HSPC has (i) the ability to self-renew. In an embodiment, the HSPC has (ii) unlimited proliferative potential. In an embodiment, the HSPC has (iii) the ability to enter and / or exit a quiescent state, e.g., a cell state  where no proliferation occurs, e.g., GO phase of the cell cycle. In an embodiment, the HSPC has (iv) the ability to differentiate into any hematopoietic lineage, e.g., myeloid and / or lymphoid lineages, e.g., common lymphoid progenitor (CLP) or a differentiated cell thereof; and / or common myeloid progenitor (CMP) or a differentiated cell thereof. In an embodiment, the HSPC has (v) ability to repopulate any hematopoietic lineage, e.g., myeloid and / or lymphoid lineages, e.g., common lymphoid progenitor (CLP) or a differentiated cell thereof; and / or common myeloid progenitor (CMP) or a differentiated cell thereof; e.g., in an organism. In an embodiment, the HSPC has (vi) the ability to form colony forming units (CFU) .

[0404] In an embodiment of any of the methods or compositions disclosed herein, the HSPC is a human HSPC, and has one, two, three, four, five, six, seven, eight, or all of the following expression characteristics: (i) expression of CD34, e.g., detectable expression of CD34, e.g., cell surface expression of CD34; (ii) expression of CD45, e.g., detectable expression of CD45, e.g., cell surface expression of CD45; (iii) expression of CD38, e.g., detectable expression of CD38, e.g., cell surface expression of CD38; (iv) expression of CD90 e.g., detectable expression of CD90, e.g, cell surface expression of CD90; (v) expression of CD133 e.g, detectable expression of CD133, e.g., cell surface expression of CD133; (vi) expression of CD45RA, e.g, detectable expression of CD45RA, e.g, cell surface expression of CD45RA; (vii) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g, CMP, MEP, GMP and / or CLP; (viii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g., TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP; or (ix) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (vii) - (viii) , e.g, lineage negative (Lin-) .

[0405] In an embodiment, the HSPC is a human HSPC and has (i) expression of CD34, e.g, detectable expression of CD34, e.g, cell surface expression of CD34. In an embodiment, the HSPC is a human HSPC and has (ii) expression of CD45, e.g, detectable expression of CD45, e.g, cell surface expression of CD45. In an embodiment, the HSPC is a human HSPC and has (iii) expression of CD38, e.g, detectable expression of CD38, e.g, cell surface expression of CD38. In an embodiment, the HSPC is a human HSPC and has (iv) expression of CD90 e.g, detectable expression of CD90, e.g, cell surface expression of CD90. In an embodiment, the HSPC is a human HSPC and has (v) expression of CD133 e.g, detectable expression of CD133, e.g, cell surface expression of CD133. In an embodiment, the HSPC is a human HSPC and has (vi) expression of CD45RA, e.g,  detectable expression of CD45RA, e.g, cell surface expression of CD45RA. In an embodiment, the HSPC is a human HSPC and has (vii) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g, CMP, MEP, GMP and / or CLP. In an embodiment, the HSPC is a human HSPC and has (viii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g, TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP. In an embodiment, the HSPC is a human HSPC and has (ix) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (vii) - (viii) , e.g, lineage negative (Lin-) .

[0406] In an embodiment, the human HSPC expresses any one of (i) - (vi) . In an embodiment, the human HSPC expresses any two of (i) - (vi) . In an embodiment, the human HSPC expresses any three of (i) - (vi) . In an embodiment, the human HSPC expresses all of (i) -(vi) .

[0407] In an embodiment, the human HSPC has no detectable or low expression of (vii) or (viii) . In an embodiment, the human HSPC has no detectable or low expression of both (vii) and (viii) , e.g, wherein the human HSPC is a lineage negative HSPC.

[0408] In an embodiment of any of the methods and compositions disclosed herein, the HSPC is an NHP HSPC and has one, two, three, four, five, six, seven, eight, or all of the following expression characteristics: (i) expression of CD34, e.g., detectable expression of CD34, e.g., cell surface expression of CD34; (ii) expression of CD45, e.g ., detectable expression of CD45, e.g., cell surface expression of CD45; (iii) expression of c-Kit (CD117) , e.g., detectable expression of c-Kit (CD117) , e.g., cell surface expression of c-Kit (CD117) ; (iv) expression of CD90 e.g., detectable expression of CD90, e.g., cell surface expression of CD90; (v) expression of CD123 e.g., detectable expression of CD123, e.g., cell surface expression of CD123; (vi) expression of CD45RA, e.g., detectable expression of CD45RA, e.g., cell surface expression of CD45RA; (vii) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g., CMP, MEP, GMP and / or CLP; (viii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g., TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP; or (ix) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (vii) - (viii) , e.g., lineage negative (Lin-) .

[0409] In an embodiment, the HSPC is an NHP HSPC and has (i) expression of CD34, e.g., detectable expression of CD34, e.g, cell surface expression of CD34 and has (ii) expression of CD45, e.g., detectable expression of CD45, e.g., cell surface expression of CD45. In an embodiment, the HSPC is an NHP HSPC. In an embodiment, the HSPC  is an NHP HSPC and has (iii) expression of c-Kit (CD117) , e.g, detectable expression of c-Kit (CD117) , e.g, cell surface expression of c-Kit (CD117) . In an embodiment, the HSPC is an NHP HSPC and has (iv) expression of CD90 e.g, detectable expression of CD90, e.g, cell surface expression of CD90.

[0410] In an embodiment, the HSPC is an NHP HSPC and has (v) expression of CD123 e.g, detectable expression of CD123, e.g., cell surface expression of CD123. In an embodiment, the HSPC is an NHP HSPC and has (vi) expression of CD45RA, e.g, detectable expression of CD45RA, e.g, cell surface expression of CD45RA. In an embodiment, the HSPC is an NHP HSPC and has (vii) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g, CMP, MEP, GMP and / or CLP. In an embodiment, the HSPC is an NHP HSPC and has (viii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g, TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP. In an embodiment, the HSPC is an NHP HSPC and has (ix) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (vii) - (viii) , e.g, lineage negative (Lin-) .

[0411] In an embodiment, the NHP HSPC expresses any one of (i) - (vi) . In an embodiment, the NHP HSPC expresses any two of (i) - (vi) . In an embodiment, the NHP HSPC expresses any three of (i) - (vi) . In an embodiment, the NHP HSPC expresses all of (i) - (vi) . In an embodiment, the NHP HSPC has no detectable or low expression of (vii) or (viii) . In an embodiment, the NHP HSPC has no detectable or low expression of both (vii) and (viii) , e.g ., wherein the NHP HSPC is a lineage negative HSPC.

[0412] In an embodiment of any of the methods and compositions disclosed herein, the HSPC is a mouse HSPC and has one, two, three, four, five, six, seven or all of the following expression characteristics: (i) expression of CD34, e.g., detectable expression of CD34, e.g., cell surface expression of CD34; (ii) expression of CD 150 e.g., detectable expression of CD 150, e.g., cell surface expression of CD 150; (iii) expression of Sca-1 e.g., detectable expression of Sca-1, e.g., cell surface expression of Sca-1; (iv) expression of c-kit e.g., detectable expression of c-KIT, e.g., cell surface expression of c-kit; (v) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g., CMP and / or CLP; (vi) no detectable or low expression of markers associated with committed precursor cells, e.g., MEP, GM, TNK and / or BCP; (vii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g., TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP; or (viii) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (viii) - (x) , e.g., lineage negative  (Lin-) .

[0413] In an embodiment, the HSPC is a mouse HSPC and has (i) expression of CD34, e.g., detectable expression of CD34, e.g., cell surface expression of CD34. In an embodiment, the HSPC is a mouse HSPC and has (ii) expression of CD 150 e.g., detectable expression of CD 150, e.g., cell surface expression of CD 150. In an embodiment, the HSPC is a mouse HSPC and has (iii) expression of Sca-1 e.g., detectable expression of Sca-1, e.g., cell surface expression of Sca-1. In an embodiment, the HSPC is a mouse HSPC and has (iv) expression of c-kit e.g., detectable expression of c-KIT, e.g., cell surface expression of c-kit. In an embodiment, the HSPC is a mouse HSPC and has (v) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g., CMP and / or CLP. In an embodiment, the HSPC is a mouse HSPC and has (vi) no detectable or low expression of markers associated with committed precursor cells, e.g., MEP, GM, TNK and / or BCP. In an embodiment, the HSPC is a mouse HSPC and has (vii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g., TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP. In an embodiment, the HSPC is a mouse HSPC and has (viii) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (v) - (vii) , e. g ., lineage negative (Lin-) .

[0414] In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the mouse HSPC has no detectable expression or low expression of any one of (v) - (vii) . In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the mouse HSPC has no detectable expression or low expression of any two of (v) - (vii) . In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the mouse HSPC has no detectable expression or low expression of all of (v) - (vii) , e.g., wherein the HSPC is a lineage negative HSPC.

[0415] In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the mouse HSPC expresses c-Kit and Seal, e.g., a C-KIT+ and Sca-1+ HSC. In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the mouse HSPC expresses c-Kit and Seal, e.g., a C-KIT+ and Sca-1+ HSC, and the mouse HSPC has no detectable expression or low expression of any one, any two or all of (v) - (vii) . In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the modified cell (e.g, modified stem or progenitor cell, e.g, modified HSPC is a modified human cell and has one, two, three, four, five, six, seven, eight, or all of the following expression characteristics: (i) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface  expression) of a human ortholog or equivalent of NHP CD34; (ii) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of NHP CD45; (iii) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of NHP c-Kit (CD 117) ; (iv) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of NHP CD90; (v) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of NHP CD 123; (vi) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of NHP CD45RA; (vii) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g, a human ortholog or equivalent of NHP CMP, MEP, GMP and / or CLP; (viii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g, a human ortholog or equivalent of NHP TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP; or (ix) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (vii) - (viii) , e.g, lineage negative (Lin-) , or a human ortholog or equivalent thereof.

[0416] In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the modified cell, (e. g ., modified stem or progenitor cell, e. g ., modified HSPC) is a modified human cell and has one, two, three, four, five, six, seven or all of the following expression characteristics: (i) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of mouse CD34; (ii) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of mouse CD 150; (iii) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of mouse Sca-1; (iv) expression (e.g, detectable expression, e.g, cell surface expression) of a human ortholog or equivalent of mouse c-kit; (v) no detectable or low expression of markers associated with primitive progenitor cells, e.g, a human ortholog or equivalent of mouse CMP and / or CLP; (vi) no detectable or low expression of markers associated with committed precursor cells, e.g, a human ortholog or equivalent of mouse MEP, GM, TNK and / or BCP; (vii) no detectable or low expression of markers associated with lineage committed cells, e.g, a human ortholog or equivalent of mouse TCP, NKP, GP, MP, EP and / or MkP; or (viii) no detectable or low expression of markers associated with one, two or all cell lineage markers of (v) - (vii) , e.g, lineage negative (Lin-) , or a human ortholog or equivalent thereof. In an embodiment, the modified human HSPC expresses human orthologs or equivalents of mouse c-Kit and Seal. In an embodiment, the modified human HSPC  expresses human orthologs or equivalents of mouse c-Kit and Seal, and has no detectable expression or low expression of any one, two or all of (v) - (vii) .

[0417] In an embodiment of any of compositions disclosed herein, prior to contacting the cell with the LNP composition, the cell (e.g, population of cells, ) is isolated from a subject and expanded, enriched and / or cultured in vitro. In an embodiment of any of the compositions disclosed herein, the expanded, enriched and / or cultured cell, e.g, population of cells, is administered into a host, e.g, an autologous or allogeneic host.

[0418] Lipid nanoparticle (LNP) content

[0419] In some embodiments, nucleic acids of the invention are formulated as lipid nanoparticle (LNP) compositions. Lipid nanoparticles typically comprise amino lipid, phospholipid, structural lipid and PEG lipid components along with the nucleic acid cargo of interest.

[0420] The lipid nanoparticles of the invention can be generated using components, compositions, and methods as are generally known in the art, see for example CN202210725548.7 (Patent publication number: CN114989182A) , CN202211695784.5 (Patent publication number: CN116162071A) , , PCT / CN2023 / 100791, PCT / CN2023 / 100823 and PCT / CN2023 / 106421, PCT / CN2023 / 116607.

[0421] In an embodiment, the lipid nanoparticle (LNP) comprises: (a) an ionizable lipid.

[0422] In another embodiment, the lipid nanoparticle (LNP) further comprises one or more selected from the group consisting of: (b) aphospholipid; (c) astructural lipid; (d) apolymer conjugated lipid. In an embodiment, the phospholipid is selected from the group consisting of 1.2-dilinoleoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine (DLPC) , 1.2-dimyristoyl-sn-glycero-phosphocholine (DMPC) , 1.2-dioleoy 1-sn-gly cero -3 -pho sphocholine (DOPC ) , 1.2-dipalmitoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine (DPPC) , 1.2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , 1.2-diundecanoyl-sn-glycero-phosphocholine (DUPC) , l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) , 1.2-di-O-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine, l-oleoyl-2-cholesterylhemisuccinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1.2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,  1.2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1.2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1.2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanola mine (DOPE) , 1.2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1.2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1.2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1.2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1.2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1.2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1.2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac- (l-glycerol) sodium salt (DOPG) , sphingomyelin, and combinations thereof.

[0423] In an embodiment, the structural lipid is selected from the group consisting of cholesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, tomatidine, ursolic acid, alpha-tocopherol.

[0424] In an embodiment, the polymer conjugated lipid is selected from the group consisting of PEG-modified phosphatidylethanolamines, PEG-modified phosphatidic acids, PEG-modified ceramides, PEG-modified dialkylamines, PEG-modified diacylglycerols, and PEG-modified dialkylglycerols. For example, a PEG lipid may be PEG-dioleoylgylcerol (PEG-DOG) , PEG-dimyristoyl-glycerol (PEG-DMG) , PEG-dipalmitoyl-glycerol (PEG-DPG) , PEG-dilinoleoyl-glycero-phosphatidyl ethanolamine (PEG-DLPE) , PEG-dimyrstoyl-phosphatidylethanolamine (PEG-DMPE) , PEG-dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine (PEG-DPPE) , PEG-distearoylglycerol (PEG-DSG) , PEG-diacylglycerol (PEG-DAG, e.g., PEG-DMG, PEG-DPG, and PEG-DSG) , PEG-ceramide, PEG-distearoyl-glycero-phosphoglycerol (PEG-DSPG) , PEG-dioleoyl-glycero-phosphoethanolamine (PEG-DOPE) , 2- [ (polyethylene glycol) -2000] -N, N-ditetradecylacetamide, or a PEG-distearoyl-phosphatidylethanolamine (PEG-DSPE) lipid, and mixtures thereof.

[0425] In an embodiment, the lipid nanoparticle (LNP) comprises a molar ratio of about 20-65%ionizable lipid; 5-25%phospholipid; 15-55%structural lipid; and 0.15-15%PEG lipid.

[0426] In some embodiments, the lipid nanoparticle comprises a molar ratio of 20-60%ionizable lipid relative to the other lipid components. For example, the lipid nanoparticle may comprise a molar ratio of 20-50%, 20-40%, 20-30%, 30-60%, 30-50%, 30-40%, 40-60%, 40-50%, or 50-60%ionizable lipid. In some embodiments, the  lipid nanoparticle comprises a molar ratio of 20%, 30%, 40%, 50, or 60%amino lipid. In some embodiments, the lipid nanoparticle comprises a molar ratio of 5-25%phospholipid relative to the other lipid components. For example, the lipid nanoparticle may comprise a molar ratio of 5-30%, 5-15%, 5-10%, 10-25%, 10-20%, 10-25%, 15-25%, 15-20%, 20-25%, or 25-30%phospholipid. In some embodiments, the lipid nanoparticle comprises a molar ratio of 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, or 30%phospholipid.

[0427] In some embodiments, the lipid nanoparticle comprises a molar ratio of 25-55%structural lipid relative to the other lipid components. For example, the lipid nanoparticle may comprise a molar ratio of 10-55%, 25-50%, 25-45%, 25-40%, 25-35%, 25-30%, 30-55%, 30-50%, 30-45%, 30-40%, 30-35%, 35-55%, 35-50%, 35-45%, 35-40%, 40-55%, 40-50%, 40-45%, 45-55%, 45-50%, or 50-55%structural lipid. In some embodiments, the lipid nanoparticle comprises a molar ratio of 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, or 55%structural lipid.

[0428] In some embodiments, the lipid nanoparticle comprises a molar ratio of 0.5-15%PEG lipid relative to the other lipid components. For example, the lipid nanoparticle may comprise a molar ratio of 0.5-10%, 0.5-5%, 1-15%, 1-10%, 1-5%, 2-15%, 2-10%, 2-5%, 5-15%, 5-10%, or 10-15%PEG lipid. In some embodiments, the lipid nanoparticle comprises a molar ratio of 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, or 15%PEG-lipid.

[0429] In some embodiments, the lipid nanoparticle comprises a molar ratio of 20-60%amino lipid, 5-25%phospholipid, 25-55%structural lipid, and 0.5-15%PEG lipid. In some embodiments, the lipid nanoparticle comprises a molar ratio of 20-60%amino lipid, 5-30%phospholipid, 10-55%structural lipid, and 0.5-15%PEG lipid.

[0430] Ionizable lipid

[0431] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from CN202210725548.7, CN202211695784.5, PCT / CN2023 / 100791, PCT / CN2023 / 100823 or PCT / CN2023 / 106421 or PCT / CN2023 / 116607.

[0432] In an embodiment, the ionizable lipid comprises a compound of any one of Formula of (I) , (Ⅱ) , (Ⅲ) , (Ⅳ) , (Ⅴ) , (VI) , or a salt or solvate thereof.

[0433] In some embodiments, the ionizable lipid is the compound of Formula (I) ,

[0434] wherein in Formula I, the definition of A, B, G1, G2, X, Y, U, n, Rx is described in Patent Application No. CN202210725548.7;

[0435] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (I-1) , (I-1’) .

[0436] wherein in Formula I-1, I-1’, the definition of R1, R2, G1, G3, G4, L1, L2 is described in Patent Application No. CN202210725548.7 and as described in Formula I;

[0437] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (I-1-1) , (I-1-2) , (I-1-3) , (I-1-4) , (I-1-5) .

[0438] wherein the compound I-1-1, I-1-2, I-1-3, I-1-4, I-1-5 and the preparation method thereof is described in Patent Application No. CN202210725548.7 (Compound 1, 2, 3, 4, 5 in table3) ;

[0439] In some embodiments, the ionizable lipid is a compound of Formula (Ⅱ) ,

[0440] wherein in Formula II, the definition of R1, R2, R3, R4, L1 is described in Patent Application No. CN202211695784.5.

[0441] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅱ-1) , (Ⅱ-2) , (Ⅱ-3) , (Ⅱ-4) , (Ⅱ-5) , (Ⅱ-6) , (Ⅱ-7) , (Ⅱ-8) , (Ⅱ-9) , (Ⅱ-10) , (Ⅱ-11) , (Ⅱ-12) , (Ⅱ-13) , (Ⅱ-14) , (Ⅱ-15) , (Ⅱ-16) , (Ⅱ-17) , (Ⅱ-18) and (Ⅱ-19) , which is corresponding to the compounds as shown in Table 1 in Patent Application No. CN202211695784.5 and the preparation thereof is described in Patent Application No. CN202211695784.5, as shown below.

[0442] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅱ-1) .

[0443] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅱ-2) .

[0444] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅱ-3) .

[0445] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅱ-4) .

[0446] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅱ-5) .

[0447] In an embodiment, the ionizable lipid is the Compound (Ⅲ) .

[0448] wherein in Formula III, the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, G1, L1, L2, L3, a, b, c, d, e, f is described in Patent  Application No. PCT / CN2023 / 100791.

[0449] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅲ-1) , (Ⅲ-2) , (Ⅲ-3) , (Ⅲ-4) , (Ⅲ-5) , (Ⅲ-6) , (Ⅲ-7) , (Ⅲ-8) , (Ⅲ-9) , (Ⅲ-10) , (Ⅲ-11) , (Ⅲ-12) , (Ⅲ-13) , (Ⅲ-14) , (Ⅲ-15) , (Ⅲ-16) , (Ⅲ-17) , (Ⅲ-18) , (Ⅲ-19) , (Ⅲ-20) , (Ⅲ-21) , (Ⅲ-22) , (Ⅲ-23) , (Ⅲ-24) , (Ⅲ-25) , (Ⅲ-26) , (Ⅲ-27) , (Ⅲ-28) , (Ⅲ-29) , (Ⅲ-30) , (Ⅲ-31) , (Ⅲ-32) , (Ⅲ-33) , (Ⅲ-34) , (Ⅲ-35) , which is corresponding to the compounds as shown in Table 1 in Patent Application No. PCT / CN2023 / 100791, as shown below and the preparation method thereof is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 100791.

[0450] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-1) .

[0451] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-2) .

[0452] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-3) .

[0453] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-4) .

[0454] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-5) .

[0455] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-6) .

[0456] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-7) .

[0457] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-8) .

[0458] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-9) .

[0459] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-10) .

[0460] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-11) .

[0461] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-12) .

[0462] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-13) .

[0463] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-14) .

[0464] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-15) .

[0465] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-16) .

[0466] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-17) .

[0467] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-18) .

[0468] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-19) .

[0469] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-20) .

[0470] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-21) .

[0471] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-22) .

[0472] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-23) .

[0473] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-24) .

[0474] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-25) .

[0475] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-26) .

[0476] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-27) .

[0477] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-28) .

[0478] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-29) .

[0479] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-30) .

[0480] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-31) .

[0481] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-32) .

[0482] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-33) .

[0483] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-34) .

[0484] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅲ-35) .

[0485] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅳ) .

[0486] wherein in Formula IV, the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, G1, L1, L2, L3, L4, a, b, c, d, e, f, g is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 100823.

[0487] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅳ-1) , (Ⅳ-2) , (Ⅳ-3) , (Ⅳ-4) , (Ⅳ-5) , (Ⅳ-6) , (Ⅳ-7) , (Ⅳ-8) , (Ⅳ-9) , (Ⅳ-10) , (Ⅳ-11) , (Ⅳ-12) , (Ⅳ-13) , (Ⅳ-14) , (Ⅳ-15) , (Ⅳ-16) , (Ⅳ-17) , (Ⅳ-18) , (Ⅳ-19) , (Ⅳ-20) , (Ⅳ-21) , (Ⅳ-22) , (Ⅳ-23) , (Ⅳ-24) , (Ⅳ-25) , (Ⅳ-26) , (Ⅳ-27) , (Ⅳ-28) , (Ⅳ-29) , (Ⅳ-30) , (Ⅳ-31) , which is corresponding to the compounds as shown in Table 1 in Patent Application No. PCT / CN2023 / 100823, as shown below and the preparation method thereof is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 100823.

[0488] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅳ-1) , (Ⅳ-2) , (Ⅳ-3) , (Ⅳ-4) , (Ⅳ-5) , (Ⅳ-6) , (Ⅳ-7) , (Ⅳ-8) , (Ⅳ-9) , (Ⅳ-10) , (Ⅳ-11) , (Ⅳ-12) , (Ⅳ-13) , (Ⅳ-14) .

[0489] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅳ-1) .

[0490] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅳ-2) .

[0491] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅳ-3) .

[0492] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅳ-4) .

[0493] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅳ-5) .

[0494] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅳ-6) .

[0495] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅳ-7) .

[0496] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅳ-8) .

[0497] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅳ-9) .

[0498] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅳ-10) .

[0499] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅳ-11) .

[0500] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅳ-12) .

[0501] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅳ-13) .

[0502] In an embodiment, the ionizable lipid is the compound (Ⅳ-14) .

[0503] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅴ) .

[0504] wherein in Formula V, the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, X, L1, L2, L3, L4, L5 is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421.

[0505] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅴ-1) , (Ⅴ-2) , (Ⅴ-3) , (Ⅴ-4) .

[0506] wherein in Formula V-1, the definition of R1, R2, R3, R6, R7, R8, R9, R10, R11, L2, L3, L4, L5 is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421.

[0507] wherein in Formula V-2, the definition of R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, L1, L2, L3, L4, L5 is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421.

[0508] wherein in Formula V-3, the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, L1, L2, L3, L4, L5 is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421.

[0509] wherein in Formula V-4, the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R10, R11, L1, L2, L3, L5 is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421.

[0510] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (Ⅴ-1-1) , (Ⅴ-1-2) , (Ⅴ-1-3) , (Ⅴ-1-4) , (Ⅴ-1-5) , (Ⅴ-1-6) , (Ⅴ-1-7) , (Ⅴ-1-8) , (Ⅴ-1-9) , (Ⅴ-1-10) , (Ⅴ-1-11) , (Ⅴ-1-12) , (Ⅴ-1-13) , (Ⅴ-1-14) , (Ⅴ-1-15) , (Ⅴ-1-16) , (Ⅴ-1-17) , (Ⅴ-1-18) , (Ⅴ-1-19) , (Ⅴ-1-20) , (Ⅴ-1-21) , (Ⅴ-1-22) , (Ⅴ-1-23) , (Ⅴ-1-24) , (Ⅴ-1-25) , (Ⅴ-1-26) , (Ⅴ-1-27) , (Ⅴ-1-28) , (Ⅴ-1-29) , (Ⅴ-1-30) , (Ⅴ-1-31) , (Ⅴ-1-32) , which is corresponding to the compounds as shown in Table 1 in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421, as shown below and the preparation method thereof is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421.

[0511] .

[0512] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (VI) .

[0513] wherein in Formula VI, the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, G1, L1, L2 is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 116607.

[0514] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (VI-1) , (VI-2) .

[0515] wherein in Formula VI-1, the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, G1, L1 is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 116607.

[0516] wherein in Formula VI-2, the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, G1, L1 is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 116607.

[0517] In an embodiment, the ionizable lipid is selected from the group consisting of Compound (ⅤI-1-1) , (ⅤI -1-2) , (ⅤI -1-3) , (ⅤI -1-4) , (ⅤI -1-5) , (ⅤI -1-6) , (ⅤI -1-7) , (ⅤI -1-8) , (ⅤI -1-9) , (ⅤI -1-10) , (ⅤI -1-11) , (ⅤI -1-12) , (ⅤI -1-13) , (ⅤI -1-14) , (ⅤI -1-15) , (ⅤI -1-16) , (ⅤI -1-17) , (ⅤI -1-18) , (ⅤI -1-19) , (ⅤI -1-20) , (ⅤI -1-21) , (ⅤI -1-22) , (ⅤI -1-23) , (ⅤI -1-24) , (ⅤI -1-25) , (ⅤI -1-26) , (ⅤI -1-27) , (ⅤI -1-28) , which is corresponding to the compounds as shown in Table 1 in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421, as shown below and the preparation method thereof is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421.

[0518] LNP Correspondence Used in the Examples

[0519] Payload for in vivo modification of cell or tissue

[0520] In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the LNP composition comprises a payload, e.g, as described herein. In an embodiment, the payload modifies, e.g, increases or decreases, the component or parameter associated with the cell or tissue, resulting in a modified cell, e.g, modified HSPC, or tissue.

[0521] In an embodiment, the payload comprises a nucleic-acid molecule, a peptide molecule, a lipid molecule, or a combination thereof.

[0522] In an embodiment, the payload comprises a polynucleotide or nucleic acid, e.g., a DNA or an RNA.

[0523] In an embodiment, said payload comprises a small interfering ribonucleic acid (siRNA) , a short hairpin RNA (shRNA) , a micro-ribonucleic acid (miRNA) , a primary micro-ribonucleic acid (pri-miRNA) , a long non-coding RNA (lncRNA) , a messenger ribonucleic acid (mRNA) , a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) related nucleic acid, a CRISPR-RNA (crRNA) , a single guide ribonucleic acid (sgRNA) , a trans-activating CRISPR ribonucleic acid (tracrRNA) , a plasmid deoxyribonucleic acid (pDNA) , a transfer ribonucleic acid (tRNA) , an antisense oligonucleotide (ASO) , an antisense ribonucleic acid (RNA) , a guide ribonucleic acid, deoxyribonucleic acid (DNA) , a double stranded deoxyribonucleic acid (dsDNA) , a single stranded deoxyribonucleic acid (ssDNA) , a single stranded ribonucleic acid (ssRNA) , a double stranded ribonucleic acid (dsRNA) , a circular RNA, a CRISPR-associated (Cas) protein, or a combination thereof.

[0524] In an embodiment, the polynucleotide comprises an mRNA.

[0525] In an embodiment, the mRNA comprises at least one chemical modification.

[0526] In an embodiment, the chemical modification is selected from the group consisting of pseudouridine, pyridin-4-one ribonucleoside, N1-methylpseudouridine, 2-thiouridine, 4′-thiouridine, 5-methylcytosine, 2-thio-1-methyl-1-deaza-pseudouridine, 2-thio-1-methyl-pseudouridine, 2-thio-5-aza-uridine, 2-thio-dihydropseudouridine, 2-thio-dihydrouridine, 2-thio-pseudouridine, 4-methoxy-2-thio-pseudouridine, 4-methoxy-pseudouridine, 4-thio-1-methyl-pseudouridine, 4-thio-pseudouridine, 5-aza- uridine, dihydropseudouridine, 5-methyluridine, 5-methyluridine, 5-methoxyuridine, and 2′-O-methyl uridine.

[0527] In an embodiment, the payload comprises one or more guide RNAs (gRNA) , and the polynucleotide or nucleic acid encoding a base editor, e.g., an adenine base editor or a cytosine base editor; or the polynucleotide or nucleic acid encoding an RNA-guided DNA binding agent, e.g., a nuclease (e.g., a Cas nuclease such as Cas9, Cas12i) , to a target DNA.

[0528] In an embodiment, the payload comprises a genetic modulator (e.g, a modulator that genetically alters the cell or tissue) . In an embodiment the genetic modulator comprises a system which modifies a nucleic acid sequence in a DNA molecule, e.g, by altering a nucleobase, e.g, introducing an insertion, a deletion, a mutation (e.g, a missense mutation, a silent mutation or a nonsense mutation) , a duplication, or an inversion, or any combination thereof. In an embodiment, the genetic modulator comprises a DNA base editor, CRISPR / Cas gene editing system, a zinc finger nuclease (ZFN) system, a Transcription activator-like effector nuclease (TALEN) system, a meganuclease system, or a transposase system, or any combination thereof.

[0529] In an embodiment, the genetic modulator comprises a template DNA. In an embodiment, the genetic modulator does not comprise a template DNA. In an embodiment, the genetic modulator comprises a template RNA. In an embodiment, the genetic modulator does not comprise a template RNA.

[0530] In an embodiment, the genetic modulator is a CRISPR / Cas gene editing system. In an embodiment, the CRISPR / Cas gene editing system comprises a guide RNA (gRNA) molecule comprising a targeting sequence specific to a sequence of a target gene and a peptide having nuclease activity, e.g, endonuclease activity, e.g, a Cas protein or a fragment or a variant thereof, e.g, a Cas9 protein, a fragment or a variant thereof; a Cas3 protein, a fragment or a variant thereof; a Cas12 protein, a fragment or a variant thereof, e.g, a Cas12a protein, a fragment or a variant thereof; a Cas12e protein, a fragment or a variant thereof; a Cas12i protein, a fragment or a variant thereof; a Cas13 protein, a fragment or a variant thereof; or a Cas14 protein, a fragment or a variant thereof.

[0531] In an embodiment, the CRISPR / Cas gene editing system comprises a gRNA molecule comprising a targeting sequence specific to a sequence of a target gene, and a nucleic acid encoding a peptide having nuclease activity, e.g, endonuclease activity, e.g, a Cas protein or a fragment or variant thereof, e.g, a Cas9 protein, a fragment or a variant thereof; a Cas3 protein, a fragment or a variant thereof; a Casl2a protein, a fragment or  a variant thereof; a Casl2e protein, afragment or a variant thereof; a Casl3 protein, a fragment or a variant thereof; or a Cas14 protein, a fragment or a variant thereof.

[0532] In an embodiment, the Cas protein is a Cas9 protein or a Casl2i protein.

[0533] In an embodiment, the CRISPR / Cas gene editing system comprises a nucleic acid encoding a gRNA molecule comprising a targeting sequence specific to a sequence of a target gene, and a Cas9 protein, a fragment or a variant thereof.

[0534] In an embodiment, the CRISPR / Cas gene editing system comprises a nucleic acid encoding a gRNA molecule comprising a targeting sequence specific to a sequence of a target gene, and a nucleic acid encoding a Cas9 protein, a fragment or a variant thereof. In an embodiment, the DNA base editor is an adenine base editor (ABE) or cytosine base editor (CBE) ; In an embodiment, the adenine base editor is ABE8e;

[0535] In an embodiment, the gRNA targets a target sequence of a genomic location of the causal mutation and modify the genomic sequence to remove the causal mutation.

[0536] In an embodiment, the gRNA has at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 1-4, 12.

[0537] In an embodiment, the adenine base editor comprises a nuclease and a deaminase, e.g., the nuclease has at least 80%sequence identity to SEQ ID NOs: 10.

[0538] In an embodiment, deaminase has at least 80%sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 8-9.

[0539] In an embodiment, the adenine base editor has at least 80%sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 6 and 11.

[0540] In an embodiment, the CRISPR / Cas gene editing system further comprises a template DNA. In an embodiment, the CRISPR / Cas gene editing system further comprises a template RNA. In an embodiment, the CRISPR / Cas gene editing system further comprises a reverse transcriptase.

[0541] In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the genetic modulator is a zinc finger nuclease (ZFN) system. In an embodiment, the ZFN system comprises a peptide having: a Zinc finger DNA binding domain, a fragment or a variant thereof; and / or nuclease activity, e. g ., endonuclease activity. In an embodiment, the ZFN system comprises a peptide having a Zn finger DNA binding domain. In an embodiment, the Zn finger binding domain comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or more Zinc fingers. In an embodiment, the ZFN system comprises a peptide having nuclease activity e.g., endonuclease activity. In an embodiment, the peptide having nuclease activity is a type-II restriction 1-like endonuclease, e.g., a Fokl endonuclease.

[0542] In an embodiment, the ZFN system comprises a nucleic acid encoding a peptide having: a zinc finger DNA binding domain, a fragment or a variant thereof; and / or nuclease activity, e.g., endonuclease activity.

[0543] In an embodiment, the ZFN system comprises a nucleic acid encoding a peptide having a Zn finger DNA binding domain. In an embodiment, the Zn finger binding domain comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or more Zinc fingers. In an embodiment, the ZFN system comprises a nucleic acid encoding a peptide having nuclease activity e.g., endonuclease activity. In an embodiment, the peptide having nuclease activity is a type-II restriction 1-like endonuclease, e.g., a Fokl endonuclease.

[0544] In an embodiment, the system further comprises a template, e.g., template DNA.

[0545] In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the genetic modulator is a Transcription activator-like effector nuclease (TALEN) system.

[0546] In an embodiment, the system comprises a peptide having: a Transcription activator-like (TAL) effector DNA binding domain, a fragment or a variant thereof; and / or nuclease activity, e. g ., endonuclease activity. In an embodiment, the system comprises a peptide having a TAL effector DNA binding domain, a fragment or a variant thereof.

[0547] In an embodiment, the system comprises a peptide having nuclease activity, e.g., endonuclease activity. In an embodiment, the peptide having nuclease activity is a type-II restriction 1-like endonuclease, e.g., a Fokl endonuclease.

[0548] In an embodiment, the system comprises a nucleic acid encoding a peptide having: a Transcription activator-like (TAL) effector DNA binding domain, a fragment or a variant thereof; and / or nuclease activity, e.g., endonuclease activity. In an embodiment, the system comprises a nucleic acid encoding a peptide having a Transcription activator-like (TAL) effector DNA binding domain, a fragment or a variant thereof. In an embodiment, the system comprises a nucleic acid encoding a peptide having nuclease activity, e.g., endonuclease activity. In an embodiment, the peptide having nuclease activity is a type-II restriction 1-like endonuclease, e.g, a Fokl endonuclease. In an embodiment, the payload modifies an HSPC, e.g, modification of a genotype, phenotype, or function of the HSPC.

[0549] Pharmaceutical composition

[0550] In an aspect, the disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the LNP composition as described herein, and a pharmaceutically acceptable excipient. In an embodiment, the pharmaceutical composition comprising: (a) a first polynucleotide (e.g, mRNA) comprising: (1) a sequence encoding a therapeutic payload  or prophylactic payload, and (2) a binding element; and (b) a second polynucleotide (e. g ., mRNA) comprising a sequence encoding: (1) an effector molecule, and (2) a polypeptide that recognizes the binding element (atether molecule) . In an embodiment, the pharmaceutical composition comprising: comprises one or more guide RNAs (gRNA) , and the polynucleotide or nucleic acid encoding a base editor, e.g., an adenine base editor or a cytosine base editor; or the polynucleotide or nucleic acid encoding an RNA-guided DNA binding agent, e.g., a nuclease (e.g., a Cas nuclease such as Cas9, Cas12i) , to a target DNA.

[0551] In an embodiment, the LNP composition does not comprise an additional targeting moiety. In some embodiments of the disclosure, the polynucleotide is formulated in compositions and complexes in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients. Pharmaceutical compositions can optionally comprise one or more additional active substances, e.g. therapeutically and / or prophylactically active substances. Pharmaceutical compositions of the present disclosure can be sterile and / or pyrogen-free. General considerations in the formulation and / or manufacture of pharmaceutical agents can be found, for example, in Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams &Wilkins, 2005.

[0552] In an aspect, the disclosure provides a GMP-grade pharmaceutical composition comprising the delivery lipid nanoparticle as described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0553] Methods of delivering the LNP compositions and other methods

[0554] The present disclosure provides LNP compositions, which can be delivered to cells, e.g, target cells, e.g., in vitro or in vivo. For in vivo protein expression, the cell is contacted with the LNP by administering the LNP to a subject to thereby increase or induce protein expression in or on the cells within the subject.

[0555] In one embodiment, the LNP is administered intravenously. In another embodiment, the LNP is administered intramuscularly. In yet other embodiment, the LNP is administered by a route selected from the group consisting of subcutaneously, intranodally and intratum orally.

[0556] In an embodiment, the cell is contacted with the LNP for a single treatment / transfection.

[0557] In another embodiment, the cell is contacted with the LNP for multiple treatments / transfections.

[0558] In an embodiment, for in vivo delivery, the cell is contacted with the LNP by administering the LNP to a subject to thereby deliver the payload to cells within the subject. For example, in one embodiment, the LNP is administered intravenously. In another embodiment, the LNP is administered intramuscularly. In yet other embodiment, the LNP is administered by a route selected from the group consisting of subcutaneously, intranodally and intratum orally.

[0559] In a related aspect, provided herein is an LNP composition (e.g., an LNP composition described herein) for use in a method of modifying a cell or tissue in a subject.

[0560] In yet another aspect, provided herein is a method of delivering an LNP composition disclosed herein.

[0561] In a related aspect, provided herein is an LNP composition (e.g, an LNP composition described herein) for use in a method of delivering the LNP composition to a cell or tissue, e.g, in vivo.

[0562] In an embodiment, the method or use, comprises contacting the cell in vitro, in vivo or ex vivo with the LNP composition.

[0563] In an embodiment, the LNP composition of the present disclosure is contacted with cells, e.g, ex vivo or in vivo and can be used to deliver a payload, e.g, a secreted polypeptide, an intracellular polypeptide or a transmembrane polypeptide to a subject.

[0564] In an embodiment, the LNP composition of the present disclosure is formulated for a single administration to a subject. In another embodiment, the LNP composition of the present disclosure is formulated for repeat administration to a subject.

[0565] In an embodiment, the disclosure provides a method of delivering a polynucleotide encoding at least one protein of interest to a cell of interest of a subject in need thereof, the method comprisingadministering to the subject the pharmaceutical composition as described herein or a LNP as described herein.

[0566] the LNP composition of the present disclosure, the disclosure provides a method of modifying a mammal bone marrow cell, e.g., a bone marrow monocyte, an hematopoietic stem / progenitor cell (HSPC) astem or progenitor cell, e.g, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) , comprising contacting the cell with a lipid nanoparticle (LNP) composition as described herein, thereby modifying the cell.

[0567] In an aspect, the disclosure provides a method of treating a subject having a disease, a disorder, a mutation, or a single nucleotide polymorphism (SNP) , comprising administering to the subject an effective amount of an LNP composition as  described herein, wherein said LNP composition results in a modification of a mammal bone marrow cell, e.g., a bone marrow monocyte, an hematopoietic stem / progenitor cell (HSPC) astem or progenitor cell, in the subject.

[0568] In an embodiment, the subject is a mammal.

[0569] In an embodiment, the mammal is a human.

[0570] In an embodiment, the subject having a disease or disorder.

[0571] In an embodiment, the disease or disorder is selected in a group consisting of infectious diseases, allergies, autoimmune diseases, blood disorders, metabolic diseases, neurologic diseases, and cancer diseases. In an embodiment, the disease or disorder is selected from the group consisting of a hemoglobinopathy, a clotting factor disorder, a blood cell disorder, and an immune cell disorder. In an embodiment of any of the methods, compositions, or cells disclosed herein, the subject has a mutation or SNP that is associated with, or causes, a disease or disorder selected from the group consisting of a hemoglobinopathy, a clotting factor disorder, a blood cell disorder, and an immune cell disorder.

[0572] In an embodiment, the blood disorders is selected from β-thalassemia, .

[0573] In an embodiment, the composition is administered as a single dose.

[0574] In an embodiment, the composition is administered one time:

[0575] a. increases HbF level; and / or

[0576] b. increases expression of γ-globin;

[0577] c. long-term expression of at least 50%of total hemoglobin as compared to a healthy subject.

[0578] In an embodiment, the LNP composition is formulated for systemic delivery.

[0579] In an embodiment, the LNP composition is administered systemically, e.g., parenterally (e.g., intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intrathecally, or intradermally) or enterally (e.g., orally, rectally or sublingually) .

[0580] In an aspect, the disclosure provides a method of ameliorating a symptom of a subject having a disease, a disorder, a mutation, or a single nucleotide polymorphism (SNP) , comprising administering to the subject an effective amount of an LNP composition comprising a payload, wherein said LNP composition results in a modification of a mammal bone marrow cell, e.g., a bone marrow monocyte, an hematopoietic stem / progenitor cell (HSPC) astem or progenitor cell, in the subject, e.g., modification of a component associated with the cell or a parameter associated with the cell, thereby ameliorating the symptom of the subject.

[0581] In an aspect, the disclosure provides a method of delivering an LNP composition comprising delivery a payload to a mammal bone marrow cell, e.g., a bone marrow monocyte, an hematopoietic stem / progenitor cell (HSPC) astem or progenitor cell, or tissue, e.g, in a subject, comprising contacting the cell, or tissue with the LNP composition as described herein.

[0582] In an embodiment, mammal bone marrow cell, e.g., a bone marrow monocyte, an hematopoietic stem / progenitor cell (HSPC) astem or progenitor cell, or tissue has low or no gene of interest expression level.

[0583] In an embodiment, the pathogenic gene of interest is selected from the group consisting of: anγ-globin gene, e.g., HBG1 or HBG2 gene , and any combination thereof.

[0584] In an embodiment, the LNP composition provides at least one of the following benefits:

[0585] (i)mRNA level of γ-globin genes (HBG1 or HBG2) are increased in the mammal bone marrow cell compared to an untreated cell;

[0586] (ii) mRNA level of γ-globin genes (HBG1 or HBG2) are increased at least 1.5 fold compared to an untreated cell.

[0587] (ⅲ) γ-globin protein levels of the gene is increased compared to an untreated cell.

[0588] In an aspect, the disclosure provides a method of increasing expression of a therapeutic payload or a prophylactic payload in a mammal bone marrow cell, e.g., a bone marrow monocyte, an hematopoietic stem / progenitor cell (HSPC) , comprising administering to the mammal bone marrow cell the LNP composition as described herein.

[0589] In an aspect, the disclosure provides use of a therapeutically effective amount of the mRNA or the pharmaceutical compositionas described herein in the preparation of a medicament for treating β-thalassemia.

[0590] In an embodiment, the method, the use or the mRNA for use, the β-thalassemia is associated with mutations in the regulatory region of the γ-globin (HBG) gene.

[0591] In an aspect, the disclosure provides a kit comprising a composition described herein; and instructions for using the kit.

[0592] In an aspect, the disclosure provides a modified cell, e.g., a modified stem cell, e.g., a modified HSPC, made according to a method described herein.

[0593] In an aspect, the disclosure provides a frozen preparation of a modified cell, e.g., a modified stem cell, e.g., a modified HSPC, made according to a method described herein.

[0594] In an embodiment, the modified cell, or frozen preparation of a modified cell , for use in treating a subject having a disease or disorder.

[0595] In an embodiment, the modified cell, or frozen preparation of a modified cell , for use in ameliorating a symptom of a subject having a disease or disorder.

[0596] In an embodiment, the modified cell, or frozen preparation of a modified cell, for use of the disease or disorder is selected from the group consisting of a hemoglobinopathy, a clotting factor disorder, a blood cell disorder, and an immune cell disorder.

[0597] In an embodiment, the modified cell, or frozen preparation of a modified cell, is autologous to the subject.

[0598] In an embodiment, the modified cell, or frozen preparation of a modified cell, is allogeneic to the subject.

[0599] EXEMPLIFICATION

[0600] In order that the present disclosure may be more fully understood, the following examples are set forth. The synthetic and biological examples described in this application are offered to illustrate the compounds, pharmaceutical compositions, and methods provided herein and are not to be construed in any way as limiting their scope.

[0601] Example 1: In vivo gene editing of HSPCs with LNPs comprising ABE8e mRNA and sgRNA

[0602] This example describes in vivo adenine base editing of the HBG locus in the mouse BM cells, according to the presence of the SpCas9 NGG protospacer adjacent motif (PAM) sequence and the human HBG promoter regions, all possible sgRNAs (n=92) within 500 bp upstream of the human HBG promoter regions, which could approach saturation mutagenesis in situ at each genomic position were designed, and 40 sgRNAs were selected preliminarily, four sgRNAs (sgRNA-22 (SEQ ID NO. 12) , sgRNA-35 (SEQ ID NO. 3) , sgRNA-41 (SEQ ID NO. 4) , sgRNA-25 (SEQ ID NO. 1) , sgRNA-26 (SEQ ID NO. 2) ) were selected finally. In this example, the sgRNA-25 (SEQ ID NO. 1) was used.

[0603] Human CD34+ HSPCs (provided by Shanghai Bangyao Biological Technology Co., Ltd. ) were obtained from healthy donors and engrafted into immunodeficient NCG-X mice (purchased from GemPharmatech) . The CD34+ HSPCs were thawed on day 0 in X-VIVO 15 (Lonza, 04-418Q) supplemented with 100 ng ml-1 SCF, 100 ng ml-1 human thrombopoietin (TPO) , and 100 ng ml-1 recombinant human Flt3-ligand (Flt3-L) . The NCG-X mice were administered granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) for 5 consecutive days before the initial dosing, and plerixafor was injected subcutaneously  on the dosing day.

[0604] In this example, the LNPs was LNP-028, which contain ionizable cationic lipid compound (028) (corresponding to compound 31 in PCT / CN2023 / 100791) . After a 16-week period, the immunodeficient NCG-X mice which support human hematopoietic engraftment without conditioning therapy were administered LNP-ABE8e genome editing system (the LNP formulated with ABE8e mRNA and sgRNA-25) via tail vein injection using different dosage regimens (Fig. 1a) , and every dosage is 1.5 mg / kg. For intravenous administration, three different doses (dose, re-dose, and fifth-dose) of LNPs were administered in adult NCG-X mice. The mice were injected with LNPs every two weeks until the end of five injections.

[0605] As a control, a cohort of separate mice were injected with PBS buffer. There were three animals in each LNP-ABE8e group (n=3) . One week after the last administration of the LNP or control, mice were euthanized and bone marrow cells were harvested and processed for flow cytometry with the indicated markers.

[0606] Fig. 1a-1n depict in vivo adenine base editing of the HBG locus in the mouse BM cells. Fig. 1a depicts Workflow of intravenous (i. v. ) administration of LNPs with co-encapsulated ABE8e mRNA and sgRNA-25. Fig. 1b depicts the average editing efficiencies of 11.0% (A5, 10.8-11.6%) and 8.4% (A6, 7.5-9.9%) in the non-mobilized group compared to 9.0% (A5, 8.5-10.0%) and 7.0% (A6, 5.8-7.6%) in the mobilized group. As shown in Fig. 1c, a significant induction of γ-globin (mean 22.2%in the non-mobilized group and 21.8%in the mobilized group) was observed. As shown in Fig. 1d-1e, BM was collected after LNP-ABE8e treated and analyzed by flow cytometry for human cell chimerism , and multilineage reconstitution in the BM, similar levels of human lymphoid and myeloid engraftment were observed between the mock and LNPs infusion groups. Based on these results, it can be concluded that the editing efficiency and induction level of γ-globin were similar between the non-mobilized group and the mobilized group, thus selecting the non-mobilized approach for subsequent in vivo treatment. Re-dosing (2nd dose) and fifth-dose further increased editing rates to 18.8%and 45.5%at A5, respectively (A6, mean 15.3%for re-dose and 39.3%for fifth-dose; Fig. 1f) .

[0607] Notably, γ-globin mRNA levels were further elevated (mean 31.4%for re-dose and 42.6%for fifth-dose, compared to 2.5%in the mock; Fig. 1g) . Comparable human lymphoid and myeloid engraftment was observed between the edited and unedited groups (Fig. 1h, i) . Analysis of BM cells using FACS revealed effective editing of  erythroid cells similar to other lineages (mean 24.7%for A5 re-dose, 20.5%for A6 re-dose; mean 50.0%for A5 fifth-dose, 44.4%for A6 fifth-dose; Fig. 1j, k) .

[0608] In human erythroid cells from the BM, we observed effective editing rates and robust induction of γ-globin at similar levels as BM cells after LNPs editing (Fig. 1l, m) . After LNP-ABE8e base editing, we observed efficient enucleation of terminal enucleated erythroid cells from the BM cell in NCG-X mice (Fig. 1n) .

[0609] In summary, the data showed that LNP-ABE8e, as a non-viral delivery platform, can efficiently edit BM cells and increase the expression level of γ-globin in a humanized mouse model, thus proving to be an effective approach for in vivo induction of therapeutic γ-globin production.

[0610] Example 2: In vivo therapeutic base editing of BM reconstituted from HSPCs of a β-thalassemia patient.

[0611] To get more efficient BM delivery, the structural of ionizable lipid components in LNP were optimized, three variants named LNP-115 which contain ionizable cationic lipid compound (115) (corresponding to compound 15 in PCT / CN2023 / 116607) , LNP-168 which contain ionizable cationic lipid compound (168) (corresponding to compound 18 in PCT / CN2023 / 100791) and LNP-217 which contain ionizable cationic lipid compound (217) (corresponding to compound 1 in PCT / CN2023 / 116607) were developed.

[0612] In this example, intravenous injections of the formulated LNP-ABE8e into C57BL / 6 mice (purchased from GemPharmatech) for in vivo evaluation were conducted, the mPCSK9-sgRNA (SEQ ID NO. 5) was used, Total BM cells were isolated and subjected to evaluate the editing efficiency (Fig. 2a) .

[0613] we successfully formulated LNPs containing ABE8e mRNA and chemically modified sgRNA targeting mPCSK9 locus in a 1: 1 weight ratio, allowing us to achieve in vivo genome editing therapy by targeting the BM with LNPs, the LNPs-ABE8e were administered through tail vein injection in wild-type C57BL / 6J mice and conducted an initial evaluation of the in vivo editing effect of LNP-028 in BM cells. After a single injection of LNP-ABE8e, the average editing efficiency targeting the mPCSK9 locus was 10.7%, increasing the number of administrations resulted in a further increase in editing efficiency to 20.2%, LNP-168 exhibited the highest efficiency in base editing within BM cells, achieving an editing efficiency nearly 40.0%with just two injections compared to LNP-028 (Fig. 2b) . This is suggestsed that LNP-168 had significant potential as a delivery vehicle for ABE8e mRNA and sgRNA.

[0614] As shown in Fig. 3a, transplantation of β-thalassemia patient-derived CD34+ HSPCs into immunodeficient NCG-X mice, followed by intravenous administration of LNP-168-ABE8e to demonstrate phenotypic rescue in vivo, with two doses of intravenous administration of LNP-168-ABE8e, the average base edit frequency at the target HBG promoter was measured (Fig. 3a) .

[0615] Notably, with two doses of intravenous administration of LNP-ABE8e, the average base edit frequency at the target HBG promoter achieved 42.6%, accompanied by potent induction of γ-globin in BM cells (Fig. 3b, c and Fig. 4) .

[0616] The majority of BM cells in the recipient mice were human cells expressing the CD45 hematopoietic antigen, indicating that the proportion of human cells in the BM was not affected by LNP-168-ABE8e (Fig. 3d) . In addition, in vivo genome editing also had no effect on the proportion of myeloid and B-cells in the BM (Fig. 3e) . The base editing rate at the HBG promoter remained consistent in erythroid cells differentiated from HSPCs edited by LNP-168-ABE8e, indicating that in vivo genome editing did not affect erythrocyte differentiation (Fig. 3b) . In human erythroid cells derived from the BM, robust induction of γ-globin was observed after editing (mean increase from 0.14 to 0.6 relative to α-globin; Fig. 3f) . Following base editing, higher enucleation efficiency, increased cell size, and a more circular shape in enucleated erythroid cells was observed, suggesting the restoration of the morphology of erythroid cells in patients with β-thalassemia following in vivo genome editing (Fig. 3g-i) .

[0617] In summary, the data showed that the use of the LNP-168-ABE8e in vivo genome editing system allows for efficient base editing, thereby inducing sufficient γ-globin expression to rescue the hematological phenotype of β-thalassemia.

[0618] And in this example, LNP-183 contain ionizable cationic lipid compound (183) was also used, and the result shows efficient base editing, the base editting frequency is not shown.

[0619] Example 3: LNP encapsulation and preparation of ionizable lipids.

[0620] The ionizable cationic lipid and LNP composition are described in CN202210725548.7 (CN114989182A) , CN202211695784.5 (CN116162071A) , PCT / CN2023 / 100791, PCT / CN2023 / 100823, PCT / CN2023 / 106421 and PCT / CN2023 / 116607. The ABE8e mRNA and gRNA cargo in a 1: 1 ratio was encapsulated in a lipid nanoparticle through an ethanol-drop nanoprecipitation process. Briefly, lipids (proprietary ionizable cationic lipid: 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, cholesterol, and a PEG-lipid) were rapidly mixed using Precision NanoSystems NanoAssemblr Benchtop  Instrument with mRNA in citrate buffer, pH 5.0, at an N: P ratio 4.5. The RNA-loaded dispersions were neutralized by buffer exchanged into phosphate-buffered saline (PBS) , pH 7.4, and filtered using a 0.2-um sterile filter. Formulated LNP was then vialed and stored refrigerated at 4℃ until further use. Encapsulation efficiencies were determined by Quant-iT Ribogreen assay (Life Technologies) . Particle size and polydispersity were measured by dynamic light scattering using a Malvern Zetasizer DLS instrument. Dosing was calculated using total RNA.

[0621] The ionizable cationic lipid of LNP-028 is the compound (31) , described in PCT / CN2023 / 100791 (see, e. g ., Example 31) , which is incorporated herein by reference in its entirety. The ionizable cationic lipid of LNP-115 is the compound (15) , described in PCT / CN2023 / 116607 (see, e.g., Table 1) . The ionizable cationic lipid of LNP-168 is the compound (18) , described in PCT / CN2023 / 100791 (see, e. g ., Example 18) . The ionizable cationic lipid of LNP-217 is the compound (1) , described in PCT / CN2023 / 100791 (see, e. g ., Example 1) .

[0622] Compound (183) , (31) , (15) , (18) , (1) were prepared according to the following methods and representative procedures.

[0623] The preparation of Compound (183) (also referred to as compound 1 in the present invention as shown below) is shown as following:

[0624] Intermediate 1-2: N-octylformamide

[0625] The reaction solution of octan-1-amine (10.00 g, 77.38 mmol, 1.0 eq) in ethyl formate (30 mL) was stirred at 60 ℃ for 16 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure. The desired product was obtained as a colorless oil (12.10 g, 98.6%yield) which can be used for the next step without further purification.

[0626] Intermediate 1-3: 1-isocyanooctane

[0627] Phosphorus oxychloride (18.72 g, 122.10 mmol, 1.6 eq) was added to the solution of 1-2 (12.00 g, 76.31 mmol, 1.0 eq) and TEA (63.47 mL, 457.86 mmol, 6.0 eq) in THF (100 mL) slowly at 0 ℃. The reaction mixture was stirred for 3 hours and quenched by saturated aqueous NaHCO3 (100 mL) , then extracted with EtOAc (100 mL x 3) . The organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 1 / 0 to 40 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (8.00 g, 75.3%yield) .

[0628] Intermediate 1-6: 9- ( (2-butyloctyl) oxy) -9-oxononanoic acid

[0629] The solution of nonanedioic acid (10.10 g, 53.65 mmol, 5.0 eq) , DMAP (0.66 g, 5.37 mmol, 0.5 eq) , DIEA (13.87 g, 107.30 mmol, 10.0 eq) and EDCI (3.09 g, 16.09 mmol, 1.5  eq) was stirred at 25 ℃ for 0.5 hours before 2-butyloctan-1-ol (2.00 g, 10.73 mmol, 1.0 eq) was added. The reaction soltuion was stirred at 25 ℃ for 15.5 hours and concentrated under reduced pressure. The residue was diluted with H2O (100 mL) and extracted with EtOAc (100 mL x 3) , the organic layers were combined and washed with aqueous saturated NaCl solution, dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced pressure. The residue was purified by silica column, 9- ( (2-butyloctyl) oxy) -9-oxononanoic acid was obtained as a colorless oil (3.00 g, 78.4%yield) .

[0630] Intermediate 1-8: 10- ( (tetrahydro-2H-pyran-2-yl) oxy) decanoic acid

[0631] The solution of 10-hydroxydecanoic acid (5.00 g, 26.56 mmol, 1.0 eq) , DHP (3.35 g, 39.84 mmol, 1.5 eq) , TsOH (0.23 g, 1.33 mmol, 0.05 eq) in THF (50 mL) was stirred at 25 ℃ for 16 hours. The reaction solution was concentrated, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 10 / 1 to 1 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (6.30 g, 87.1%purity) .

[0632] Intermediate 1-9: 2-butyloctyl 10- ( (tetrahydro-2H-pyran-2-yl) oxy) decanoate

[0633] A solution of 1-8 (6.30 g, 23.13 mmol, 1.0 eq) , 1-5 (6.46 g, 34.70 mmol, 1.5 eq) , DMAP (1.41 g, 11.56 mmol, 0.5 eq) , DIPEA (8.97 g, 69.39 mmol, 3.0 eq) , EDCI (6.65 g, 34.70 mmol, 1.5 eq) in DCM (60 mL) was stirred at 25 ℃ for 16 hours. The reaction solution was concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 40 / 1 to 10 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (5.30 g, 52.0%yield) .

[0634] Intermediate 1-10: 2-butyloctyl 10-hydroxydecanoate

[0635] The solution of 1-9 (5.30 g, 12.03 mmol, 1.0 eq) and TsOH (2.07 g, 12.03 mmol, 1.0 eq) in EtOH (20 mL) was stirred at 25 ℃ for 16 hours and concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 20 / 1 to 2 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (1.60 g, 37.3%yield) .

[0636] Intermediate 1-11: 2-butyloctyl 10-oxodecanoate

[0637] To a solution of 1-10 (0.80 g, 2.24 mmol, 1.0 eq) , NaHCO3 (0.47 g, 5.60 mmol, 2.5 eq) in DCM (10 mL) was slowly added DMP (1.14 g, 2.69 mmol, 1.2 eq) at 0 ℃. The reaction solution was stirred at 0 ℃ for 2 hours and quenched by saturated aqueous Na2S2O3 (5 mL) , then extracted with DCM (30 mL x 3) , the organic layers were  combined, dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated unde reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 1 / 0 to 4 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (570.0 mg, 71.6%yield) .

[0638] Compound 1: 2-butyloctyl 10- (9- ( (2-butyloctyl) oxy) -N- (3- (dimethylamino) propyl) -9-oxononanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0639] A solution of 1-11 (150.0 mg, 0.42 mmol, 1.0 eq) , 1-12 (42.9 mg, 0.42 mmol, 1.0 eq) in MeOH (2 mL) was stirred at 25 ℃ for 0.5 hour before 1-6 (0.18 g, 0.50 mmol, 1.2 eq) was added, the reaction soluton was stirred for another 0.5 hour at 25 ℃, then 1-3 (58.4 mg, 0.42 mmol, 1.0 eq) was added. After stirring at 25 ℃ for 15 hours, the reaction solution was concentrated and diluted with H2O (30 mL) , then extracted with EtOAc (10 mL x 3) , the organic layers were combined, diried over ahydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (DCM / MeOH = 1 / 0 to 20 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (210.0 mg, 53.1%yield) . MS: m / z [M+H] + =934.8. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.68 (s, 1H) , 4.72 (s, 1H) , 3.97 (d, J = 4.0 Hz, 4H) , 3.47-3.10 (m, 4H) , 2.55-2.10 (m, 14H) , 2.07-1.52 (m, 15H) , 1.50-1.12 (m, 57H) , 1.05-0.78 (m, 15H) .

[0640] The preparation of Compound (168) (also known as compound 2 in the present invention as shown below) is as shown following:

[0641] Intermediate 2-1: 1-isocyanononane

[0642] Intermediate 2-1 was prepared according to a similar procedure of compound 1-3.

[0643] Compound 2 was prepared according to a similar Ugi procedure of compound 1 from 2-1 instead of 1-11.40%yield. MS: m / z [M+H] + = 976.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.65 (s, 1H) , 4.71 (s, 1H) , 3.96 (d, J = 4.0 Hz, 4H) , 3.23-3.14 (m, 3H) , 2.51-2.27 (m, 10H) , 1.98-1.33 (m, 17H) , 1.30-1.19 (m, 59H) , 1.04-0.96 (m, 6H) , 0.92-0.82 (m, 15H) .

[0644] The preparation of Compound (028) (also referred to as compound 3 in the present invention as shown below) is shown following:

[0645] Intermediate 3-6: 2-butyloctyl 8-isocyanooctanoate

[0646] Intermediate 3-3: 2-butyloctyl 8- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) octanoate

[0647] The solution of 3-1 (8.02 g, 30.93 mmol, 1.5 eq) , 2-butyloctan-1-ol (5.00 g, 20.62 mmol, 1.0 eq) , DMAP (2.52 g, 20.62 mmol, 1.0 eq) , DIEA (7.99 g, 61.86 mmol, 3.0 eq) and EDCI (5.93 g, 30.93 mmol, 1.5 eq) in DCM (60 mL) was stirred at 25 ℃ for 16 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column. 2-butyloctyl 8- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) octanoate was obtained as a colorless oil (7.20 g, 81.6%yield) . MS: m / z [M+H] + = 428.4.

[0648] Intermediate 3-4: 2-butyloctyl 8-aminooctanoate

[0649] The solution of 3-3 (7.20 g, 16.84 mmol, 1.0 eq) in HCl / dioxane (4 M, 40 mL) was stirred at 25 ℃ for 2 hours and concentrated under reduced pressure. The residue was diluted with aqueous saturated NaHCO3 solution (100 mL) and extracted with DCM (100 mL x 3) , the organic layers were combined and concentrated under reduced pressure, 2-butyloctyl 8-aminooctanoate was obtained as a colorless oil (5.00 g, 90.6%yield) . MS: m / z [M+H] + =328.3.

[0650] Intermediate 3-5: 2-butyloctyl 8-formamidooctanoate

[0651] The solution of 3-4 (5.00 g, 15.27 mmol, 1.0 eq) in ethyl formate (50 mL) was reflux overnight and concentrated under reduced pressure. The residue was purified by silica column, 2-butyloctyl 8-formamidooctanoate was obtained as a colorless oil (2.63 g, 30.8%yield) . MS: m / z [M+H] + = 356.3.

[0652] Intermediate 3-6: 2-butyloctyl 8-isocyanooctanoate

[0653] Phosphorus oxychloride (1.71 g, 11.82 mmol, 1.6 eq) was added to the solution of 3-5 (2.63 g, 7.39 mmol, 1.0 eq) and (6.15 mL, 44.34 mmol, 6.0 eq) in THF (20 mL) slowly at 0 ℃. The reaction mixture was stirred for 3 hours and quenched by saturated aqueous NaHCO3 (100 mL) , then extracted with EtOAc (30 mL x 3) . The organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced pressure. The residue was purified by silica column, 2-butyloctyl 8-isocyanooctanoate was obtained as a colorless oil (1.45 g, 57.9%yield) .

[0654] Compound 3 was prepared according to a similar Ugi procedure of compound 1 from intermediates 1-6, 3-6, 1-11 and N, N-diethylpropane-1, 3-diamine. 39.8%yield. MS:m / z [M+H] + = 1161.0. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.65 (s, 1H) , 4.69 (s, 1H) , 3.96 (d, J = 8.0 Hz, 5H) , 3.38-3.12 (m, 4H) , 2.53-2.26 (m, 11H) , 1.99-1.89 (m, 1H) , 1.77-1.54 (m, 16H) , 1.47-1.39 (m, 3H) , 1.33-1.17 (m, 71H) , 1.02-0.98 (m, 6H) , 0.93-0.84 (m, 18H) .

[0655] The preparation of Compound (217) (also referred to as compound 4 in the present invention as shown below) is shown following

[0656] 2-butyloctyl 10- (N- (9- ( (2-butyloctyl) oxy) -9-oxononyl) -3- (diethylamino) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0657] Intermediate 4-3: 2-butyloctyl 9- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) nonanoate

[0658] A solution of 9- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) nonanoic acid (6.78 g, 24.79 mmol, 1.1 eq) , 2-butyloctan-1-ol (4.20 g, 22.54mmol, 1.0 eq) , EDCI (8.64g, 45.08mmol, 2.0 eq) , DIEA (8.74 g, 67.62 mmol, 3.0 eq) and DMAP (2.75g, 22.54mmol, 1.0 eq) in DCM (100 mL) was stirred at 25 ℃ for 16 hours. The reaction solution was concentrated and diluted with H2O (200 mL) . The resulting solution was extracted with EtOAc (50 mL x  3) , the organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 1 / 0 to 10 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (8.00 g, 80.3%purity) . MS: m / z [M+H] + = 442.4.

[0659] Intermediate 4-4: 2-butyloctyl 9-aminononanoate

[0660] The solution of 4-3 (8.00 g , 18.71 mmol) in HCl / dioxane (50 mL, 4 M) was stirred at 25 ℃ for 2 hours. The reaction solution was concentrated and quenched by saturated aqueous NaHCO3 (50 mL) , then extracted with EtOAc (30 mL x 3) , the organic layers were combined, dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the desired product was obtained as a colorless oil (3.50 g, 57.1%yield) . MS: m / z [M+H] + = 342.4.

[0661] Compound 4 was prepared according to a similar Ugi procedure of compound 1 from 1-3, 1-11, 4-4 and 3- (diethylamino) propanoic acid. 19.8%yield. MS: m / z [M+H] += 962.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.61 (s, 1H) , 4.74 (s, 1H) , 3.96 (d, J = 8.0 Hz, 4H) , 3.24-3.13 (m, 4H) , 2.90-2.78 (m, 4H) , 2.61-2.49 (m, 4H) , 2.31-2.26 (m, 4H) , 2.04-1.92 (m, 1H) , 1.66-1.55 (m, 8H) , 1.50-1.15 (m, 65H) , 1.10-1.00 (m, 6H) 0.92-0.85 (m, 15H) .

[0662] The preparation of Compound (115) (also referred to as compound 5 in the present invention as shown below) is as shown below:

[0663] Compound 5 was prepared according to a similar Ugi procedure of compound 4 from 2-hexyldecyl 8-oxooctanoate instead of 1-11.22.8%yield. MS: m / z [M+H] + =990.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.66 (s, 1H) , 4.71 (s, 1H) , 3.96 (d, J = 8.0 Hz, 4H) , 3.26-3.13 (m, 4H) , 2.57-2.43 (m, 5H) , 2.40-2.35 (m, 2H) , 2.31-2.26 (m, 4H) , 1.99-1.89 (m, 1H) , 1.86-1.77 (m, 3H) , 1.66-1.55 (m, 8H) , 1.49-1.16 (m, 65H) , 1.04-1.00 (m,  6H) 0.93-0.83 (m, 15H) .

[0664] Example 4: ABE8e mRNA synthesis

[0665] An mRNA encoding ABE8e protein (SEQ ID NO. 6) was synthesized in vitro using a T7 RNA polymerase-mediated transcription with complete replacement of uridine by N1-methylpseudouridine. The DNA template (SEQ ID NO. 7) used in the in vitro reaction contained the ABE8e open-reading frame flanked by 5’ UTR and 3’ UTR sequences and was terminated by a polyA tail. Capping of the in vitro transcribed mRNAs was performed co-transcriptionally using the trinucleotide cap1 analog, CleanCap (TriLink, no. N-7413) . mRNA was purified by RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Cat. No. 74104) purification as described. All mRNAs were analyzed by an automatic nucleic acid analysis system (Qsep-100, Bioptic) and were stored frozen at -80℃.

[0666] Sequence information:

Claims

1.An lipid nanoparticle (LNP) composition comprisinga payload, wherein,the payload modifies a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell.2.A pharmaceutical composition comprising:a modified cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell;a lipid nanoparticle (LNP) comprising a payload which can modify the cell selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell.3.The composition of clam 1 or 2, whereinthe lipid nanoparticle (LNP) further comprises:(a) an ionizable lipid; and(b) a phospholipid; and / or(c) a structural lipid; and / or(d) a polymer conjugated lipid;4.The composition of claim 3, whereinthe phospholipid is selected from the group consisting of1.2-dilinoleoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine (DLPC) ,1.2-dimyristoyl-sn-glycero-phosphocholine (DMPC) ,1.2-dioleoy 1-sn-gly cero -3 -pho sphocholine (DOPC) ,1.2-dipalmitoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine (DPPC) ,1.2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) ,1.2-diundecanoyl-sn-glycero-phosphocholine (DUPC) ,l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) ,1.2-di-O-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine,l-oleoyl-2-cholesterylhemisuccinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,1.2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,1.2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,1.2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,1.2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanola mine (DOPE) ,1.2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,1.2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,1.2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,1.2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,1.2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,1.2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,1.2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac- (l-glycerol) sodium salt (DOPG) , sphingomyelin, and combinations thereof.5.The composition of claim 3, whereinthe structural lipid is selected from the group consisting of cholesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, tomatidine, ursolic acid, alpha-tocopherol.6.The composition of claim 3, whereinthe polymer conjugated lipid is selected from the group consisting of PEG-modified phosphatidylethanolamines, PEG-modified phosphatidic acids, PEG-modified ceramides, PEG-modified dialkylamines, PEG-modified diacylglycerols, and PEG-modified dialkylglycerols. For example, a PEG lipid may be PEG-dioleoylgylcerol (PEG-DOG) , PEG-dimyristoyl-glycerol (PEG-DMG) , PEG-dipalmitoyl-glycerol (PEG-DPG) , PEG-dilinoleoyl-glycero-phosphatidyl ethanolamine (PEG-DLPE) , PEG-dimyrstoyl-phosphatidylethanolamine (PEG-DMPE) , PEG-dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine (PEG-DPPE) , PEG-distearoylglycerol (PEG-DSG) , PEG-diacylglycerol (PEG-DAG, e.g., PEG-DMG, PEG-DPG, and PEG-DSG) , PEG-ceramide, PEG-distearoyl-glycero-phosphoglycerol (PEG-DSPG) , PEG-dioleoyl-glycero-phosphoethanolamine (PEG-DOPE) , 2- [ (polyethylene glycol) -2000] -N, N-ditetradecylacetamide, or a PEG-distearoyl-phosphatidylethanolamine (PEG-DSPE) lipid, and mixtures thereof.7.The composition of claim 3, whereinthe ionizable lipid is selected from the group consisting of compounds of Formula (I) , Formula (Ⅱ) , Formula (Ⅲ) , Formula (Ⅳ) , Formula (Ⅴ) and Formula (VI) ;wherein in Formula I, the definition of A, B, G1, G2, X, Y, U, n, Rx is described in Patent Application No. CN202210725548.7;wherein in Formula II, the definition of R1, R2, R3, R4, L1 is described in Patent Application No. CN202211695784.5;wherein in Formula III, the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, G1, L1, L2, L3, a, b, c, d, e, f is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 100791;wherein in Formula IV, the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, G1, L1, L2, L3, L4, a, b, c, d, e, f, g is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 100823;wherein in Formula V, the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, X, L1, L2, L3, L4, L5 is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 106421;wherein in Formula VI, the definition of R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, G1, L1, L2 is described in Patent Application No. PCT / CN2023 / 116607.8.The composition of claim 3, whereinthe lipid nanoparticle (LNP) comprises a molar ratio of about 20-65%ionizable lipid; 5-25%phospholipid; 15-55%structural lipid; and 0.15-15%polymer conjugated lipid.9.The composition of claim 1 or claim 2, whereinthe payload comprises a nucleic-acid molecule, a peptide molecule, a lipid molecule, or a combination thereof.10.The composition of claim 9, whereinthe payload comprises a polynucleotide or nucleic acid, e.g., a DNA or an RNA.11.The composition of claim 10, whereinthe payload comprises a small interfering ribonucleic acid (siRNA) , a short hairpin RNA (shRNA) , a micro-ribonucleic acid (miRNA) , a primary micro-ribonucleic acid (pri-miRNA) , a long non-coding RNA (lncRNA) , a messenger ribonucleic acid (mRNA) , a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) related nucleic acid, a CRISPR-RNA (crRNA) , a single guide ribonucleic acid (sgRNA) , a trans-activating CRISPR ribonucleic acid (tracrRNA) , a plasmid deoxyribonucleic acid (pDNA) , a transfer ribonucleic acid (tRNA) , an antisense oligonucleotide (ASO) , an antisense ribonucleic acid (RNA) , a guide ribonucleic acid, deoxyribonucleic acid (DNA) , a double stranded deoxyribonucleic acid (dsDNA) , a single stranded deoxyribonucleic acid (ssDNA) , a single stranded ribonucleic acid (ssRNA) , a double stranded ribonucleic acid (dsRNA) , a circular RNA, a CRISPR-associated (Cas) protein, or a combination thereof.12.The composition of claim 11, whereinthe polynucleotide comprises an mRNA.13.The composition of claim 12, whereinthe mRNA comprises at least one chemical modification.14.The composition of claim 13, whereinthe chemical modification is selected from the group consisting of pseudouridine, pyridin-4-one ribonucleoside, N1-methylpseudouridine, 2-thiouridine, 4′-thiouridine, 5-methylcytosine, 2-thio-1-methyl-1-deaza-pseudouridine, 2-thio-1-methyl-pseudouridine, 2-thio-5-aza-uridine, 2-thio-dihydropseudouridine, 2-thio-dihydrouridine, 2-thio-pseudouridine, 4-methoxy-2-thio-pseudouridine, 4-methoxy-pseudouridine, 4-thio-1-methyl-pseudouridine, 4-thio-pseudouridine, 5-aza-uridine, dihydropseudouridine, 5-methyluridine, 5-methyluridine, 5-methoxyuridine, and 2′-O-methyl uridine.15.The composition of claim 11, whereinthe payload comprises one or more guide RNAs (gRNA) , andthe polynucleotide or nucleic acid encoding a base editor, e.g., an adenine base editor or a cytosine base editor; orthe polynucleotide or nucleic acid encoding an RNA-guided DNA binding agent, e.g., a nuclease (e.g., Type II CRISPR-Cas polypeptide or a Type V CRISPR-Cas polypeptide, e.g., a Cas nuclease such as Cas9, Cas12i) , to a target DNA.16.The composition of any one of the preceding claims, wherein the Cas protein is a Cas9 protein or a Casl2i protein,17.The composition of claim 15,the gRNA targets a target sequence of a genomic location of the causal mutation and modify the genomic sequence to remove the causal mutation, e.g., the gRNA has at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 1-4.18.The composition of any one of the preceding claims,the adenine base editor comprises a nuclease and a deaminase, e.g., the nuclease has at least 80%sequence identity to SEQ ID NOs: 10, e.g., deaminase has at least 80%sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 8-9, e.g., the adenine base editor has at least 80%sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 6 and 11.19.The composition of claim 1 or claim 2, whereinthe payload modifies an HSPC, e.g, modification of a genotype, phenotype, or function of the HSPC.20.The composition of any one of the preceding claims, whereinthe ionizable lipid is a compound of Formula (I) , Formula (Ⅱ) , Formula (Ⅲ) , Formula (Ⅳ) , Formula (Ⅴ) or a salt or solvate thereof.21.A pharmaceutical composition comprisingthe composition of any one of claims 1-20, and a pharmaceutically acceptable excipient.22.A GMP-grade pharmaceutical composition comprisinga delivery lipid nanoparticle in the composition of any of claims 1-20, and a pharmaceutically acceptable carrier.23.A method of delivering a polynucleotide encoding at least one protein of interest to a cell of interest of a subject in need thereof, the method comprising administering to a subject the pharmaceutical composition of claim 21 or the GMP-grade pharmaceutical composition of claim 22 or the composition of any one of claims 1-20.24.A method of modifying a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell, comprising contacting the cell with the composition of any one of claims 1-20 or the pharmaceutical composition of claim 21 or the GMP-grade pharmaceutical composition of claim 22, thereby modifying the cell.25.A method of treating a subject havinga disease, a disorder, a mutation, or a single nucleotide polymorphism (SNP) , comprising administering to a subject an effective amount of the composition of any one of claims 1-20 or the pharmaceutical composition of claim 21 or the GMP-grade pharmaceutical composition of claim 22, wherein said composition results in a modification of a cell, said cell is selected from the group consisting of stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell in the subject.26.The method of claim 25, whereinthe subject is a mammal.27.The method of claim 26, whereinthe mammal is a human.28.The method of any one of claims 25 to 27, whereinthe subject having a disease or disorder.29.The method of claim 28, whereinthe disease or disorder is selected from a group consisting of infectious diseases, allergies, blood disorders, metabolic diseases, neurologic diseases, immune cell disorder, clotting factor disorder, hemoglobinopathy and cancer diseases.30.The method of claim 29, whereinthe blood disorders is selected from β-thalassemia, sickle cell disease (SCD) and other hereditary blood disorders.31.The method of claim 25, whereinthe composition is administered as a single dose.32.The method of claim 31, whereinthe composition is administered one time, wherein results the changes ofa. increases HbF level; and / orb. increases expression of γ-globin; and / orc. long-term expression of at least 50%of total hemoglobin as compared to a healthy subject.33.The method of claim 25, whereinthe composition is formulated for systemic delivery.34.The method of claim 33, whereinthe composition is administered systemically, e.g., parenterally (e.g., intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intrathecally, or intradermally) or enterally (e.g., orally, rectally or sublingually) .35.A method of ameliorating a symptom of a subject havinga disease, a disorder, a mutation, or a single nucleotide polymorphism (SNP) , comprising administering to a subject an effective amount of the composition of any one of claims 1-20 or the pharmaceutical composition of claim 21 or the GMP-grade pharmaceutical composition of claim 22 comprising a payload, wherein said composition results in a modification of a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell in the subject, and / or result in a modification of a component associated with the cell or a parameter associated with the cell, thereby ameliorating the symptom of the subject.36.A method of delivering an LNP composition comprisingdelivering a payload to a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell, or a tissue with the composition of any one of claims 1-20 or the pharmaceutical composition of claim 21 or the GMP-grade pharmaceutical composition of claim 22.37.The method of claim 36, whereinthe cell or the tissue has low or no gene of interest expression level.38.The method of claim 37, whereinthe gene of interest is a pathogenic gene, which is selected from the group consisting of: an γ-globin gene, e.g., HBG1 or HBG2 gene, and a combination thereof.39.The method of claim 36, whereinthe composition or the pharmaceutical composition or the GMP-grade pharmaceutical composition provides at least one of the following benefits:(i) mRNA level of γ-globin genes (HBG1 or HBG2) are increased in the mammal bone marrow cell compared to an untreated cell;(ii) mRNA level of γ-globin genes (HBG1 or HBG2) are increased at least 1.5 fold compared to an untreated cell.(ⅲ) γ-globin protein level of treated cell is increased compared to an untreated cell.40.A method of increasing expression of a therapeutic payload or a prophylactic payload in a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell, comprising administering to the cell the composition of any one of claims 1-20 or the pharmaceutical composition of claim 21 or the GMP-grade pharmaceutical composition of claim 22.41.Use of a therapeutically effective amount of the composition according to any one of claims 1-20 or the pharmaceutical composition according to claim 21 or the GMP-grade pharmaceutical composition of claim 22 in the preparation of a medicament for treating β-thalassemia.42.The use according to claim 41, whereinthe β-thalassemia is associated with mutations in the regulatory region of the γ-globin genes (HBG1 or HBG2) .43.A kit comprising(a1) a first container and a lipid nanoparticle (LNP) in the first container;(a2) a second container and a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell in the second container;(a3) an optional third container and a payload in the third container, wherein the payload modifies a cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell; andinstructions for using the kit.44.A kit comprising a container and the composition of any one of claims 1-20 or the pharmaceutical composition of claim 21 or the GMP-grade pharmaceutical composition of claim 22 in the container.45.A modified cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell made according to a method of any one of claims 24-42.46.A frozen preparation of a modified cell, said cell is selected from the group consisting of a stem or progenitor cell, e.g., an erythroid progenitor cell, a hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) ; a bone marrow cell; and a CD34+ cell made according to a method of any one of claims 24-42.47.The modified cell of 45, or frozen preparation of a modified cell of 46, for use in treating a subject having a disease or disorder.48.The modified cell of 45, or frozen preparation of a modified cell of 46, for use in ameliorating a symptom of a subject having a disease or disorder.49.The modified cell, or frozen preparation of a modified cell, for use of claim 47 or 48, whereinthe disease or disorder is selected from the group consisting of a hemoglobinopathy, a clotting factor disorder, a blood cell disorder, and an immune cell disorder.50.The modified cell, or frozen preparation of a modified cell, for use of any of claims 47-49, whereinthe modified cell is autologous to the subject.51.The modified cell, or frozen preparation of a modified cell, for use of any of claims 47-50, whereinthe modified cell is allogeneic to the subject.

Images