Methods for solid-phase peptide synthesis

Abstract

Provided is a method for solid-phase peptide synthesis comprising: (a) introducing glutamic acid and aspartic acid derivatives to a peptide backbone on a solid support to obtain a starting peptide; (b) activating the starting peptide with nitrite; (c) coupling the starting peptide with aliphatic chain and functionalities under ultrasound irradiation, or reacting the starting peptide with a reducing agent or an oxidizing agent under ultrasound irradiation to obtain a desired peptide; and (d) cleaving the desired peptide from the solid support.

Description

METHODS FOR SOLID-PHASE PEPTIDE SYNTHESISFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present invention relates to a method for solid-phase peptide synthesis, which comprises introducing glutamic acid derivatives or aspartic acid derivatives to a peptide backbone on a solid support and making the glutamic acid derivatives or aspartic acid derivatives for side chain attachment or modification by activation and ultrasound treatment. DESCRIPTION OF PRIOR ART

[0002] Site-selective modification on a peptide is important for the clinical applications and biomedical investigation of a peptide. For various applications, peptides are usually needed to functionalize suitable moieties, such as PEG, fluorescence tags, and contrast agents. However, unspecific modification causes low purity and batch-to-batch inconsistency. Moreover, the biological activity of a peptide is jeopardized once the modification is mistakenly introduced to the residue as a pharmacophore.

[0003] Therefore, a selective modification is needed, especially for biomedical applications. Besides, current peptide functionalization relies mostly on lysine and cystine, which own hydroxy or mercapto groups as nucleophiles on the side chain. Therefore, the introduction of an extra functional group relies on nucleophilic reaction. However, similar modifications relying on electrophilic reactions are rarely reported due to the nature of amino acids. No efficient way to introduce a nucleophile to a peptide limited the synthesis of peptide analogues and their development.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0004] For this purpose, 1, 3-diamino-4-nitrobenzene (Dnb) is introduced to aspartic acid and glutamic acid to generate the Fmoc-Glu (Dnb) -OH and Fmoc-Asp (Dnb) -OH. Both residues can be introduced to a peptide through conventional solid-phase peptide synthesis. Dnb is on-bead activated by alkyl nitrite to be benzotriazole (Bt) , which is a good leaving group for the introduction of various functional groups. Regardless, hydrolysis is inevitable while the reaction proceeded at room temperature with a shaker or under microwave irradiation.

[0005] The present invention discovers that the substitution under ultrasonic irradiation will greatly accelerate the reaction and reduce the hydrolysis. Ultrasound irradiation exhibits a facile, efficient route in synthetic chemistry and accomplishes a fast-growing technique, especially for solid-phase peptide synthesis. Ultrasound treatment enhances the thermal heating and mass transfer through the “cavitation effect, ” and improves the solubility of nucleophiles, and increases reaction rates. Armed with ultrasound irradiation, the present invention efficiently suppresses the hydrolysis at the substitution step. To combine the new protecting group and ultrasound irradiation, the present invention demonstrates a “clickable conjugation” strategy to attain the side chain modification, cyclization, and on-bead ligation in minute time. This method is suitable for the modification of aspartic acids, glutamic acids, glutamine, and asparagine.

[0006] Using these two residues, the present invention reports an efficient and selective synthetic method to functionalize the sidechain of aspartic acids, glutamic acids, glutamine, and asparagine with the assistance of ultrasonication.

[0007] While molecules with mono-and multi-nucleophiles are used as nucleophiles, corresponding functional peptides, including amphiphilic peptides, functional peptides, and functional branched peptides, are collected with only filtration. When another peptide is used as nucleophile, isopeptides are collected with simple filtration. While the prepared peptides possessed inherent nucleophiles, side chain-to-side chain, and side chain-to-tail cyclic peptides are collected with only filtration.

[0008] In addition to modification, this method can furnish higher purity through the on-bead ligation procedure with ultrasound irradiation.

[0009] Reduction by NaBH4 gave corresponding pentahomoserine and homoserine, which can be further oxidized to the corresponding aldehyde.

[0010] Herein, two residues are able to regulate the characteristics of a peptide in the desired properties. As an example, a lactam-bridged cyclic peptide is achieved by treating Fmoc-Lys (Alloc) -OH and Fmoc-Glu (Allyl) -OH with tetrakis (triphenylphosphine) palladium to selectively free the functional groups of side chain and then employed to the on-bead macrocyclization. However, it took 10 hours to complete the macrocyclization, which generated racemization and decomposition of desired peptides. Another strategy with mild or Lewis acid will also lead to a non-selective deprotection, because of harsh conditions. Here, the present invention utilizes Dnb monomer to protect carboxylic acid from preparing Fmoc-Glu (Dnb) -OH and Fomc-Asp (Dnb) -OH monomer.

[0011] As used herein, the term “a” or “an” are employed to describe elements and components of the present invention. This is done merely for convenience and to give a general sense of the present invention. This description should be read to include one or at least one and the singular also includes the plural unless it is obvious that it is meant otherwise.

[0012] The term “or” as used herein may mean “and / or. ”

[0013] The present invention provides a method for solid-phase peptide synthesis, comprising: (a) providing a solid support loaded with a compound of formula (I) , wherein, X is -C-, -C-C-, P1 is H or a first amino acid derivative, P2 is OH or a second amino acid derivative, which is linked to the solid support, and Y is an electron-withdrawing functional group or an electron-donating functional group; (b) reacting the compound of formula (I) with a nitrite in a polar solution to obtain a compound  of formula (II) , (c) reacting the compound of formula (II) with a third amino acid derivative having a N- terminal protecting group in the polar solution under ultrasound to obtain a compound of formula (III) , wherein P3 is the third amino acid derivative having the N-terminal protecting group; and (d) deprotecting and cleaving the compound of formula (III) from the solid support.

[0014] As used herein, the term “solid support” refers to a polymer carrier for use in solid-phase synthesis of polypeptides. The solid support refers to a resin or other polymer substances having porous-rich solid and solubility-poor ability. In one embodiment, the solid support comprises controlled-pore glass, magnetic beads, Rink amide resin, Tentagel resin, Wang resin, Merrifield resin, MBHA resin, PAM resin, PAL resin, Sieber Amide resin, trityl resin, Polyethylene Glycol-Polystyrene resin, Weinreb resin, oxime resin, DHP resin or Safety-catch resin. In a preferred embodiment, the trityl resin comprises trityl chloride resins, 2-chlorotrityl chloride resins, 4-carboxytrityl resins, 4-methyltrityl chloride resins, 2-hydrazine trityl resins, or 4-methoxytrityl chloride resins.

[0015] In the present invention, the compound of formula (I) is prepared by a solid phase peptide synthesis (SPPS) . The SPPS method comprises the steps of coupling of amino acid fragments, deprotection, reprotection, isolation and purification for synthesizing desired peptides. Therefore, the SPPS method is performed by treatment with a coupling reagent and a deprotection solution.

[0016] As used herein, the term “coupling reagent” refers to be an additive in which two starting materials are reacted together and particularly used in solid phase peptide synthesis named a coupling reaction or condensation. In one embodiment, the coupling reagent comprises benzotriazol-1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP) , benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) , (7-azabenzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyAOP) , bromotripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBrOP) , O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N′, N′-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) , hexafluorophosphate azabenzotriazole tetramethyl uronium (HATU) , hexafluorophosphate benzotriazole tetramethyl uronium (HBTU) , or O- (6-chlorobenzotriazol-1-yl) -N, N, N′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) .

[0017] In the present invention, the step of deprotection is used to remove the protecting group of the peptide of the compound. As used herein, the term “deprotection solution” refers to a base solution generally used to deprotect protecting group in solid phase peptide synthesis. In another embodiment, the deprotection solution comprises acetic acid (AcOH) , dimethylformamide (DMF) , N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) , dichloromethane (DCM) , diethylaminoe (DEA) , methyltetrahydrofuran (Me-THF) , tetrahydrofuran (THF) , acetonitrile (ACN) , N-butyl-2-pyrrolidone (NBP) , dimethyl sulfoxide (DMSO) , or cyrene.

[0018] In some aspects, the present invention couples the first amino acid derivative, a Dnb compound, and the second amino acid derivative to synthesize the compound of formula (I) by SPPS method. In addition, the compound of formula (I) can be prepared under ultrasound. The structure of Dnb compound is shown as follows: wherein P4 is a N-terminal protecting group.

[0019] In the present invention, the Dnb compound is used as the side chain group of the compound of formula (I) for derivatizing treatment. After the Dnb compound is activated with nitrite, the residue on the Dnb compound is introduced aliphatic chain and functionalities under ultrasound irradiation. The derivatizing treatment comprises performing one or more process steps selected from the group consisting of aromatization, functionalization, surface modification, cyclization, dimerization, electrophilic aromatic substitution, nucleophilic aromatic substitution, desymmetrizing, hydrogenation, nitration, diazotization, Friedel crafts reaction, coupling, Sandmeyer reaction, sulfonation, halogenation, recrystallization, esterification, reduction, oxidation, or any combinations thereof.

[0020] In some aspects, the first amino acid derivative comprises the first amino acid derivative having a N-terminal protecting group. In the present invention, the N-terminal protecting group of the first amino acid derivative is removed before the reaction of the step (b) .

[0021] As used herein, the term “protecting group” refers to a group that prevents reaction of the chemically reactive functional group under certain reaction conditions. The protecting group should be stable to the conditions of peptide linkage formation, while being readily removable without affecting the extant peptide chain. In one embodiment, the protecting group comprises 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) , tert-butoxycarbonyl (Boc) , tert-butyl (tBu) , O-tert-butyl (OtBu) , trityl (Trt) , 2, 2, 4, 6, 7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf) , acetyl (Ac) , benzyl carbamates (Cbz) , benzyl (Bzl) , benzyloxymethyl (Bom) , 2-chlorobenzyl (Cl-z) , tosyl (Tos) , benzy (Z) , allyl or alloxycarbonyl (Alloc) groups.

[0022] As used herein, the term “amino acid derivative” comprises amino acids or derivatives thereof. In one embodiment, the first amino acid derivative, the second amino acid derivative and the third amino acid derivative comprise a cyclic peptide, lipopeptide, peptide-drug conjugate, peptide dendron conjugate, isopeptide, branch peptide, or amphiphilic dendrimer.

[0023] In one embodiment, the electron-withdrawing functional group comprises NO2, halogen, carboxylic acid, and carboxylic acid derivatives. In another embodiment, the electron-donating functional group comprises methyl or methoxy.

[0024] In the present invention, the compound of formula (I) is activated by treatment with the nitrite and the polar solution. In one embodiment, the nitrite comprises alkyl nitrite, sodium nitrite, potassium nitrite, ethyl nitrite, butyl nitrite, t-butyl nitrite, pentyl nitrite, isoamyl nitrite, isobutyl nitrite, isopentyl nitrite, dicyclohexylamine nitrite, or tetrabutylammonium nitrite.

[0025] In another embodiment, the polar solution comprises acetic acid (AcOH) , dimethylformamide (DMF) , N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) , dichloromethane (DCM) , diethylaminoe (DEA) , methyltetrahydrofuran (Me-THF) , tetrahydrofuran (THF) , acetonitrile (ACN) , N-butyl-2-pyrrolidone (NBP) , dimethyl sulfoxide (DMSO) , or cyrene.

[0026] In some aspects, the present invention can add a base solution in the reaction of the step (c) to accelerate peptide synthesis. In one embodiment, the step (c) further comprises adding a base solution in the reaction. As used herein, the term “base solution” refers to a solution generally used in solid phase peptide synthesis to produce an alkaline environment. In one embodiment, the base solution comprises N-methylmorpholine (NMM) , N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) , trimethylamine (TEA) , or 1, 8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU) .

[0027] In the present invention, the N-terminal protecting group on the third amino acid derivative is removed by acidolytic cleavage. Therefore, the present invention uses an acid solution to deprotect the third amino acid derivative having the N-terminal protecting group. In one embodiment, the deprotection of the step (d) is performed by treatment with an acid solution. In a preferred embodiment, the acid solution comprises trifluoroacetic acid (TFA) , formic acid, HCl, or acetic acid.

[0028] In the present invention, the purpose of the reaction of the step (c) is to couple an amino acid derivative on the side chain of the compound of formula (II) . Therefore, the reaction of the step (c) can be repeated. Repeating coupling and deprotecting until a desired peptide is obtained.

[0029] In one embodiment, the frequence of the ultrasound ranges from 35 kHz-80 kHz.

[0030] In some aspects, the compound of formula (III) obtained in the step (d) may be a crude peptide or a crude product. Therefore, the crude peptide or the crude product needs to be further isolated or purified to obtain a desired peptide or a desired product. In the present invention, the method further comprises a step (e) , after the step (d) , comprising isolating or purifying the compound of formula (III) to obtain a desired product.

[0031] The present invention further provides a method for solid-phase peptide synthesis, comprising: (i) providing a solid support loaded with a compound of formula (I) , wherein, X is -C-, -C-C-, P1 is a N-terminal protecting group or a first amino acid derivative having a N-terminal  protecting group, P2 is OH or a second amino acid derivative, which is linked to the solid support, and Y is an electron-withdrawing functional group or an electron-donating functional group; (ii) reacting the compound of formula (I) with a nitrite in a polar solution to obtain a  compound of formula (II) , (iii) reacting the compound of formula (II) with a reducing agent in the polar solution under  ultrasound to obtain a compound of formula (IV) , (iv) deprotecting and cleaving the compound from the step (iii) from the solid support.

[0032] In one embodiment, the first amino acid derivative and the second amino acid derivative comprise a cyclic peptide, lipopeptide, peptide-drug conjugate, peptide dendron conjugate, isopeptide, branch peptide, or amphiphilic dendrimer.

[0033] In the present invention, the compound of formula (II) is reduced by means of the use of a suitable reducing agent in a suitable solvent under ultrasound. The purpose of the reduction is to give a hydroxy group on the side chain of the compound. In some aspects, the reducing agent is a metal hydride, a boron derivative, etc., such as NaBH4, LiAlH4, BH3-tetrahydrofuran (BH3-THF) , Diisobutylaluminum hydride (DIBAH) , Red-Al, etc. In one embodiment, the reducing agent comprises NaBH4, trimethylamine borane (TMAB) , BH3-THF, Red-Al, DIBAH or LiAlH4.

[0034] In the present invention, the compound of formula (IV) can be further oxidized by means of the use of a suitable oxidizing agent in a suitable solvent under ultrasound. In one embodiment, the step (iii) further comprises reacting the compound of formula (IV) with an oxidizing agent in the polar solution under ultrasound to obtain a compound of formula (V) ,

[0035] Any suitable oxidizing agent can be used in the methods of the invention. The purpose of the oxidation is to give an aldehyde group on the side chain of the compound. Suitable oxidizing agents include periodate salts (e.g. sodium periodate or potassium periodate, o-iodoxybenzoic acid (IBX) , Dess-Martin reagent) and lead tetraacetate. In one embodiment, the oxidizing agent comprises sodium periodate, potassium periodate, IBX, Dess-Martin reagent or lead tetraacetate.

[0036] In the present invention, the operation of the step (iv) is to deprotect and cleave the compound of formula (IV) or formula (V) from the solid support. The compound of formula (IV) or formula (V) obtained may be a crude peptide or a crude product. Therefore, the crude peptide or the crude product needs to be further isolated or purified to obtain a desired peptide or a desired product. In the present invention, the method further comprises a step (v) , after the step (iv) , comprising isolating or purifying the compound from the step (iv) to obtain a desired product.

[0037] The site-selective modification of a peptide is a vital role in the applications of peptide, allowing to improve its properties. For precise modification of a peptide backbone, the present invention develops a clickable conjugation strategy by incorporating a new glutamic acid and aspartic acid derivatives in a peptide. After activation with nitrite, these two residues are introduced aliphatic chain and functionalities under ultrasound irradiation. Besides, the same strategy can be used to prepare cyclic peptides, branch cyclic peptide. The present invention also combines this method with NaBH4 to give hydroxy group, allowed to oxidize to install aldehyde group on side chain. Alongside with the new protecting group, the US irradiation demonstrates a “clickable conjugation” strategy to attain the side chain modification, cyclization, on-bead ligation, reduction and oxidation in a matter of minutes. This investigation paves the way for the preparation of functional peptides with high purity and high efficiency.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0038] Fig. 1 shows the synthesis of the Dnb monomer.

[0039] Fig. 2 shows the synthesis of the linear peptide. M: solid support materials.

[0040] Fig. 3 shows the side chain modification of the peptide (Ia) . M: solid support materials.

[0041] Fig. 4 shows the synthesis of the cyclic peptide. M: solid support materials.

[0042] Fig. 5 shows the synthesis of the branch peptide. M: solid support materials.

[0043] Fig. 6 shows the synthesis of the Bt intermediate. M: solid support materials.

[0044] Fig. 7 shows the synthesis of the amphiphilic branch peptide. M: solid support materials.

[0045] Fig. 8 shows the reduction method of the side chain of the linear peptide. M: solid support materials.

[0046] Fig. 9 shows the oxidation method of the side chain of the linear peptide. M: solid support materials. EXAMPLES

[0047] The present invention may be implemented in many different forms and should not be construed as limited to the examples set forth herein. The described examples are not limited to the scope of the present invention as described in the claims.

[0048] Example 1: General procedure for Dnb monomer synthesis

[0049] Fig. 1 showed the synthesis of Dnb monomer. The synthetic method comprised the following steps:

[0050] 1. Fmoc-LGlu-OtBu (1) (10 g, 23.50 mmol) , HATU (hexafluorophosphate azabenzotriazole tetramethyl uronium) (1.5 equiv, 13.40 g, 35.25 mmol) , DMF (Dimethylformamide) (100 mL) and NMM (N-methylmorpholine) (2 equiv, 4.759 g, 47 mmol) were sequentially added to the reaction bottle then cooled the reaction mixture to 5℃.

[0051] 2. The mixture was stirred for 15 min, and 1, 2-diamino-4-nitrobenzene (1.2 equiv, 3.96 g, 25.85 mmol) was added to the reaction mixture.

[0052] 3. After removing ice bath, the resulting mixture was additionally stirred for 1 hour.

[0053] 4. The resulting mixture was cooled to 5℃ and was added slowly 0.5 M HCl (aq) (300 mL) .

[0054] 5. The resulting solid was filtered, washed with water to give the crude product.

[0055] 6. The crude product was recrystallized in Acetone / water (50 / 50) to give the pure product Fmoc-Glu (1, 2-diamino-4-nitrobenzene) -OtBu (2) .

[0056] 7. A solution of Fmoc-Glu (1, 2-diamino-4-nitrobenzene) -OtBu (10 g, 17.84 mmol) and HFIP (1, 1, 1, 3, 3, 3-Hexafluoro-2-propanol) (100 mL) was stirred at 0℃ and were added slowly 36.5%HCl (10 mL, 118 mmol) .

[0057] 8. The reaction mixture was stirred at 0℃ for 1 hour.

[0058] 9. After quenching by water (150 mL) , the resulting mixture was neutralized by 10%solution of sodium bicarbonate (110 mL) .

[0059] 10. The precipitate was collected by filtration, washed with H2O (50 mL) , and dried in vacuo to give the crude product.

[0060] 11. The crude product was recrystallized in a Acetone / water (50 / 50) to give the pure product Dnb monomer Fmoc-Glu (diamino-nitrobenzene) -OH (3) .

[0061] Example 2: General procedure for linear peptide synthesis

[0062] Fig. 2 showed the synthesis of the linear peptide. The synthetic method comprised the following steps:

[0063] 1. Solid-phase peptide synthesis (SPPS) resin (Rink amide resin 0.05 mmol) was pre-swollen in DMF (2 mL) for 1 hour and then filtrated and washed by DMF (2 mL) .

[0064] 2. The Fmoc protecting groups were removed by ultrasound agitation with 20%piperidine in DMF (2 mL ×1 min each) , followed by washing with DMF (6 mL) .

[0065] 3. Fmoc-amino acids (3 equiv) , PyBOP (benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate) (3 equiv) and 5%NMM in DMF (0.5 mL) were sequentially added to the resin and then performed with ultrasound agitation for 5-10 mins.

[0066] 4. Dnb monomer Fmoc-Glu (diamino-nitrobenzene) -OH (3 equiv) , HBTU (hexafluorophosphate benzotriazole tetramethyl uronium) (3 equiv) and 5%NMM in DMF (0.5 mL) were sequentially added to the resin and then performed with ultrasound agitation for 5-10 mins.

[0067] 5. Fmoc-Asp (diamino-nitrobenzene) -OH (3 equiv) , HATU (3 equiv) and 5%NMM in DMF (0.5 mL) were sequentially added to the resin and then performed with ultrasound agitation for 5-10 mins.

[0068] 6. In N-terminal capping step, acetic anhydride (4 equiv) and 5%NMM in DMF (4 mL) were sequentially added to the resin, followed by ultrasound irradiation for 5 mins.

[0069] 7. After each coupling, capping and step, the resin was washed with DMF (6 mL) and DCM (Dichloromethane) (6 mL) three times to obtain the product peptide (Ia) .

[0070] Example 3: The side chain modification procedure

[0071] Fig. 3 showed the side chain modification of the peptide (Ia) . The synthetic method comprised the following steps:

[0072] 1. Isoamyl nitrite (60 equiv, 0.4 mL) and AcOH (1.8 equiv, 5 uL) were added to a vial and stirred for 30 mins at 28℃.

[0073] 2. The protected peptide-bounded resin (Ia) was pre-swollen with DMF (3.6 mL) for 30 mins.

[0074] 3. After 30 mins, the resin was treated with isoamyl nitrite solution, followed by mechanical shaking for 15 mins.

[0075] 4. The protected peptide-bounded resin (IIa) was filtrated and washed with DMF (6 mL) and DCM (6 mL) .

[0076] 5. DMF (4 mL) and octylamine (4 equiv) were added to the resin, followed by ultrasound agitation for 1 min.

[0077] 6. DIPEA (N, N-Diisopropylethylamine) (4 equiv) was added to the resin and then performed with ultrasound agitation for 4 mins.

[0078] 7. The protected peptide-bounded resin (IIa) was filtered and washed with DMF (6 mL) and DCM (6 mL) three times.

[0079] 8. The protected peptide-bound resin (IIa) was added to a cocktail solution of TFA (Trifluoroacetic acid)  / triisopropysilane / H2O (95 / 2.5 / 2.5) (2 mL) , followed by ultrasound irradiation for 10 mins.

[0080] 9. The protected peptide-bound resin (IIa) was filtrated to afford a liquid and then the liquid was precipitated by cold ether in iced bath.

[0081] 10. The peptide (IIIa) was centrifuged (6000 rpm) for 5 min at 4℃ to obtain a precipitate as a solid product.

[0082] 11. The peptide (IIIa) was purified by medium pressure liquid chromatography (MPLC) .

[0083] Example 4: The cyclic peptide fabrication procedure

[0084] Fig. 4 showed the synthesis of the cyclic peptide. The synthetic method comprised the following steps:

[0085] 1. SPPS resin (Chlorotrityl chloride (CTC) resin 0.05 mmol) was pre-swollen in DMF (2 mL) for 1 hour, then filtrated and washed by DMF (2 mL) .

[0086] 2. The Fmoc protecting groups were removed by ultrasound agitation with 20%piperidine in DMF (2 mL ×1 min each) , followed by washing with DMF (6 mL) .

[0087] 3. Fmoc-amino acids (3 equiv) , PyBOP (3 equiv) and 5%NMM in DMF (0.5 mL) were sequentially added to the resin and then performed with ultrasound agitation for 5-10 mins.

[0088] 4. Dnb monomer Fmoc-Glu (diamino-nitrobenzene) -OH (3 equiv) , HBTU (3 equiv) and 5%NMM in DMF (0.5 mL) were sequentially added to the resin and then performed with ultrasound agitation for 5-10 mins.

[0089] 5. In N-terminal capping step, acetic anhydride (4 equiv) and 5%NMM in DMF (4 mL) were sequentially added to the resin, followed by ultrasound irradiation for 5 mins.

[0090] 6. After each coupling, and capping step, the resin was washed with DMF (6 mL) and DCM (6 mL) three times to obtain the product peptide (IIIa) .

[0091] 7. Isoamyl nitrite (60 equiv, 0.4 mL) and AcOH (1.8 equiv, 5 uL) were added to a vial and stirred for 30 mins at 28℃.

[0092] 8. The peptide-bounded resin (IIIa) was pre-swollen with DMF (3.6 mL) for 30 mins.

[0093] 9. After 30 mins, the resin was treated with isoamyl nitrite solution, followed by mechanical shaking for 15 mins.

[0094] 10. The peptide-bounded resin (IIIb) was filtrated and washed with DMF (6 mL) and DCM (6 mL) .

[0095] 11. DMF (4 mL) was added to peptide-bounded resin (IIIb) , followed by ultrasound agitation for 1 min.

[0096] 12. DIPEA (4 equiv) was added to the peptide-bounded resin (IIIb) and then performed with ultrasound agitation for 4 mins.

[0097] 13. The peptide-bounded resin (IIIb) was filtered and washed with DMF (6 mL) and DCM (6 mL) for three times.

[0098] 14. The resin was added to a cocktail solution of TFA / triisopropysilane / H2O (95 / 2.5 / 2.5) (2 mL) , followed by ultrasound agitation for 10 mins.

[0099] 15. The resin was filtrated to afford a liquid and then the liquid was precipitated by cold ether in iced bath.

[0100] 16. The peptide (IIIc) was centrifuged (6000 rpm) for 5 min at 4℃ to obtain a precipitate as a solid product.

[0101] Example 5: The branch peptide fabrication procedure

[0102] Fig. 5 showed the synthesis of the branch peptide. The synthetic method comprised the following steps:

[0103] 1. The resin (Rink amide resin, 0.05 mmol) was pre-swollen in DMF (2 mL) for 1 hour, then drained and washed by DMF (2 mL) .

[0104] 2. The Fmoc protecting groups were removed by ultrasound agitation with 20%piperidine in DMF (2 mL ×1 min each) , followed by washing with DMF (6 mL) .

[0105] 3. Fmoc amino acids (3 equiv) , HBTU (3 equiv) and 5%NMM in DMF (0.5 mL) were sequentially added to the resin and performed with ultrasound agitation for 5-10 mins to afford protected peptide-bounded resin (IVa) .

[0106] 4. After removing Fmoc protecting groups, followed by ultrasound agitation with Bt intermediate, DMF (2 mL) and DIPEA (4 equiv) for 5 mins.

[0107] 5. The peptide-bounded resin was filtered and washed with DMF (6 mL) and DCM (6 mL) for three times.

[0108] 6. The resin was added to a cocktail solution of TFA / triisopropysilane / H2O (95 / 2.5 / 2.5) (2 mL) , followed by ultrasound irradiation for 10 mins.

[0109] 7. The resin was filtrated to afford a liquid and then the liquid was precipitated by cold ether.

[0110] 8. The peptide (IVc) was centrifuged (6000 rpm) for 5 min at 4℃ to obtain a precipitate as a solid product.

[0111] 9. The crude peptide was purified by MPLC.

[0112] Example 6: General procedure for Bt intermediate

[0113] Fig. 6 showed the synthesis of the Bt intermediate. The synthetic method comprised the following steps:

[0114] 1. SPPS resin (CTC resin 0.05 mmol) was pre-swollen in DMF (2 mL) for 1 hour, then filtrated and washed by DMF (2 mL) .

[0115] 2. The Fmoc protecting groups were removed by ultrasound agitation with 20%piperidine in DMF (2 mL ×1 min each) , followed by washing with DMF (6 mL) .

[0116] 3. Fmoc-amino acids (3 equiv) , PyBOP (3 equiv) and 5%NMM in DMF (0.5 mL) were sequentially added to the resin and then performed with ultrasound agitation for 5-10 mins.

[0117] 4. Dnb monomer Fmoc-Glu (diamino-nitrobenzene) -OH (Va) (3 equiv) , HBTU (3 equiv) and 5%NMM in DMF (0.5 mL) were sequentially added to the resin and then performed with ultrasound agitation for 5-10 mins.

[0118] 5. In N-terminal capping step, acetic anhydride (4 equiv) and 5%NMM in DMF (4 mL) were sequentially added to the resin, followed by ultrasound irradiation for 5 mins.

[0119] 6. After each coupling and capping step, the resin was washed with DMF (6 mL) and DCM (6 mL) three times to obtain the product peptide (Vb) .

[0120] 7. Isoamyl nitrite (60 equiv, 0.4 mL) and AcOH (1.8 equiv, 5 uL) were added to a vial and stirred for 30 mins at 28℃.

[0121] 8. The protected peptide-bounded resin (Vb) was pre-swollen in DMF (3.6 mL) for 30 mins.

[0122] 9. After 30 mins, the protected peptide-bounded resin (Vb) was treated with isoamyl nitrite solution, followed by mechanical shaking for 15 mins.

[0123] 10. The protected peptide-bounded resin (Vc) was filtrated and washed with DMF (6 mL) and DCM (6 mL) .

[0124] 11. Dnb monomer Fmoc-Glu (diamino-nitrobenzene) -OH (3 equiv) , HBTU (3 equiv) and 5%NMM in DMF (0.5 mL) were sequentially added to the resin and then performed with ultrasound agitation for 5-10 mins to obtain protected peptide-bounded resin (Vd) .

[0125] 12. Isoamyl nitrite (60 equiv, 0.4 mL) and AcOH (1.8 equiv, 5 uL) were added to a vial and stirred for 30 mins at 28℃.

[0126] 13. The protected peptide-bounded resin (Vd) was pre-swollen in DMF (3.6 mL) for 30 mins.

[0127] 14. After 30 mins, the protected peptide-bounded resin (Vd) was treated with isoamyl nitrite solution, followed by mechanical shaking for 15 mins.

[0128] 15. The protected peptide-bounded resin (Vd) was added 2%TFA in anisole (4 mL) , followed by shaking for 30 mins.

[0129] 16. The resin was filtrated to afford the liquid, and the liquid was precipitated by cold water.

[0130] 17. The protected peptide (Ve) (Bt intermediate) was centrifuged (6000 rpm) for 5 min at 4℃ to obtain a precipitate as a solid product.

[0131] Example 7: The amphiphilic branch peptide fabrication procedure

[0132] Fig. 7 showed the synthesis of the amphiphilic branch peptide. The synthetic method comprised the following steps:

[0133] 1. SPPS resin (Rink amide resin, 0.05 mmol) was pre-swollen in DMF (2 mL) for 1 hour, then drained and washed with DMF (2 mL) .

[0134] 2. The Fmoc protecting groups were removed by ultrasound agitation with 20%piperidine in DMF (2 mL ×1 min each) , followed by washing with DMF (6 mL) .

[0135] 3. To the resin was added the Fmoc-Glu (dnb) -OH (3 equiv) , HBTU (3 equiv) and 5%NMM in DMF (0.5 mL) , followed by ultrasonic agitation for 5-10 mins.

[0136] 4. After the coupling reaction, the resin was washed with DMF (6 mL) .

[0137] 5. The same elongation step to prepare lysine dendron was applied with Fmoc-Lys(Fmoc) -OH (3 equiv) , Fmoc-Lys (Fmoc) -OH (3 equiv) , Boc-Lys (Boc) -OH (3 equiv) , Fmoc-Lys(Boc) -OH sequentially to afford the branch peptide backbone (VIa) .

[0138] 6. Isoamyl nitrite (60 equiv, 0.4 mL) and AcOH (1.8 equiv, 5 uL) were added to a vial and stirred for 30 mins at 28℃.

[0139] 7. The protected peptide-bounded resin (VIb) was pre-swollen with DMF (3.6 mL) for 30 mins.

[0140] 8. After 30 mins, the protected peptide-bounded resin (VIb) was treated with isoamyl nitrite solution, followed by mechanical shaking for 30 mins.

[0141] 9. The protected peptide-bounded resin (VIb) was filtrated and washed with DMF (6 mL) and DCM (6 mL) .

[0142] 10. DMF (2 mL) , DCM (2mL) and stearyl amine (4 equiv) were added to the protected peptide-bounded resin (VIb) , followed by ultrasound agitation for 1 min.

[0143] 11. DIPEA (4 equiv) was added to the resin and then performed with ultrasound agitation for 4 mins.

[0144] 12. The resin was filtered and washed with DMF (6 mL) and DCM (6 mL) for three times.

[0145] 13. The resin was added a cocktail solution of TFA / triisopropysilane / H2O (95 / 2.5 / 2.5) (2 mL) , followed by ultrasound irradiation for 10 mins.

[0146] 14. The resin was filtrated to afford a liquid and then the liquid was precipitated by cold ether in iced bath.

[0147] 15. The peptide (VIc) was centrifuged (6000 rpm) for 5 min at 4℃ to obtain a precipitate as a solid product.

[0148] Example 8: The on-bead reduction of side chain for linear peptide procedure

[0149] Fig. 8 showed the reduction method of the side chain of the linear peptide. The reduction method comprised the following steps:

[0150] 1. Isoamyl nitrite (60 equiv, 0.4 mL) and AcOH (1.8 equiv, 5 μL) were added to a vial and stirred for 30 mins at 28℃.

[0151] 2. The protected peptide-bounded resin (Ia) was pre-swollen with DMF (3.6 mL) for 30 mins.

[0152] 3. After 30 mins, the protected peptide-bounded resin (Ia) was treated with Isoamyl nitrite solution, followed by mechanical shaking for 15 mins.

[0153] 4. The protected peptide-bounded resin (Ia) was filtrated and washed with DMF (6mL) and DCM (6 mL) .

[0154] 5. DMF (4 mL) and NaBH4 (4 equiv) were added to the resin, followed by ultrasound agitation for 1 min.

[0155] 6. The resin was filtered and washed with DMF (6 mL) and DCM (6 mL) for three times.

[0156] 7. The resin was added to a cocktail solution of TFA / triisopropysilane / H2O (95 / 2.5 / 2.5) (2 mL) , followed by ultrasound irradiation for 10 mins.

[0157] 8. The resin was filtrated to afford a liquid and then the liquid was precipitated by cold ether in iced bath.

[0158] 9. The peptide (VIIa) was centrifuged (6000 rpm) for 5 min at 4℃ to obtain a precipitation as a solid product.

[0159] Example 9: The on-bead oxidation of side chain for linear peptide procedure

[0160] Fig. 9 showed the oxidation method of the side chain of the linear peptide. The oxidation method comprised the following steps:

[0161] 1. After the on-bead reduction with the protected peptide-bounded resin (Ia) to generate the protected peptide-bounded resin (VIIa) , the resin was washed with DMF (6 mL) and DCM (6 mL) three times.

[0162] 2. DMF (4 mL) and the oxidizing agent Dess-martin reagent (4 equiv) were added to the resin, followed by ultrasound agitation for 10 min.

[0163] 3. The resin was filtered and washed with DMF (6 mL) and DCM (6 mL) for three times.

[0164] 4. The resin was added to a cocktail solution of TFA / triisopropysilane / H2O (95 / 2.5 / 2.5) (2 mL) , followed by ultrasound irradiation for 10 mins.

[0165] 5. The resin was filtrated to afford a liquid and then the liquid was precipitated by cold ether in iced bath.

[0166] 6. The peptide (VIIIa) was centrifuged (6000 rpm) for 5 min at 4℃ to obtain a precipitate as a solid product.

[0167] 7. The peptide (VIIIa) was purified by MPLC.

[0168] Those skilled in the art recognize the foregoing outline as a description of the method for communicating hosted application information. The skilled artisan will recognize that these are illustrative only and that many equivalents are possible.

Claims

1.A method for solid-phase peptide synthesis, comprising:(a) providing a solid support loaded with a compound of formula (I) ,wherein,X is -C-, -C-C-,P1 is H or a first amino acid derivative,P2 is OH or a second amino acid derivative, which is linked to the solid support, andY is an electron-withdrawing functional group or an electron-donating functional group;(b) reacting the compound of formula (I) with a nitrite in a polar solution to obtain a compound of formula (II) ,(c) reacting the compound of formula (II) with a third amino acid derivative having a N-terminal protecting group in the polar solution under ultrasound to obtain a compound of formula (III) ,wherein P3 is the third amino acid derivative having the N-terminal protecting group; and(d) deprotecting and cleaving the compound of formula (III) from the solid support.2.The method of claim 1, wherein the first amino acid derivative, the second amino acid derivative and the third amino acid derivative comprise a cyclic peptide, lipopeptide, peptide-drug conjugate, peptide dendron conjugate, isopeptide, branch peptide, or amphiphilic dendrimer.3.The method of claim 1, wherein the electron-withdrawing functional group comprises NO2, halogen, carboxylic acid, and carboxylic acid derivatives.4.The method of claim 1, wherein the electron-donating functional group comprises methyl or methoxy.5.The method of claim 1, wherein the step (c) further comprises adding a base solution in the reaction.6.The method of claim 1, wherein the deprotection of the step (d) is performed by treatment with an acid solution.7.The method of claim 1, wherein the frequence of the ultrasound ranges from 35 kHz-80 kHz.8.A method for solid-phase peptide synthesis, comprising:(i) providing a solid support loaded with a compound of formula (I) ,wherein,X is -C-, -C-C-,P1 is a N-terminal protecting group or a first amino acid derivative having a N-terminal protecting group,P2 is OH or a second amino acid derivative, which is linked to the solid support, and Y is an electron-withdrawing functional group or an electron-donating functional group;(ii) reacting the compound of formula (I) with a nitrite in a polar solution to obtain a compound of formula (II) ,(iii) reacting the compound of formula (II) with a reducing agent in the polar solution under ultrasound to obtain a compound of formula (IV) ,(iv) deprotecting and cleaving the compound from the step (iii) from the solid support.9.The method of claim 8, wherein the first amino acid derivative and the second amino acid derivative comprise a cyclic peptide, lipopeptide, peptide-drug conjugate, peptide dendron conjugate, isopeptide, branch peptide, or amphiphilic dendrimer.10.The method of claim 8, wherein the electron-withdrawing functional group comprises NO2, halogen, carboxylic acid, and carboxylic acid derivatives.11.The method of claim 8, wherein the electron-donating functional group comprises methyl or methoxy.12.The method of claim 8, wherein the reducing agent comprises NaBH4, trimethylamine borane, BH3-tetrahydrofuran, Red-Al, diisobutylaluminum hydride or LiAlH4.13.The method of claim 8, wherein the step (iii) further comprises reacting the compound of formula (IV) with an oxidizing agent in the polar solution under ultrasound to obtain a compound of formula (V) , 14.The method of claim 13, wherein the oxidizing agent comprises sodium periodate, potassium periodate, o-iodoxybenzoic acid, Dess-Martin reagent or lead tetraacetate.

Images