GENERATION OF TOLEROGENIC ORGANS USING NORMOTHERMIC or HYPOTHERMIC PERFUSION PUMP WITH TREG CELL BASED IMMUNOTHERAPY WITH OR WITHOUT STEM CELLS

Abstract

The present disclosure concerns methods for generating tolerogenic organs for transplantation and methods for assessing the progression thereof through perfusion of Treg cells either alone or with stem cells. Such assessments include molecular, cytological, and histological analyses of tissue biopsies to detect immunological changes in the immune composition of organ cell infiltrates induced by Regulatory T cell (Treg) immunotherapy either alone or in combination with stem cells. In further aspects, the present disclosure concerns normothermic and hypothermic perfusion pump machines utilization for the preservation and treatment of solid organs for transplantation through the infusion of Treg cells, either alone or in combination with stem cells to generate tolerogenic organs.

Description

1    GENERATION OF TOLEROGENIC ORGANS USING NORMOTHERMIC or HYPOTHERMIC PERFUSION  PUMP WITH TREG  CELL BASED IMMUNOTHERAPY WITH OR WITHOUT STEM CELLS   GOVERNMENT SUPPORT

[0001] The present application claims priority to U.S. Provisional Patent Application 63 / 640,542,  filed April 30, 2024, the content of which is hereby incorporated by reference in its entirety.  BACKGROUND

[0002] Transplantation is the treatment of choice for patients with end‐stage organ failure. The advent of pharmacologic‐induced  immunosuppression over recent decades has greatly  impacted the  incidence  of  rejection  and  early  allograft  outcomes. However,  long‐term  graft  and  patient survival  along  with  quality  of  life  are  still  hindered  by  the  side  effects  associated  with immunosuppressant drugs. Patients undergoing transplantation have reported a high prevalence of complications  such  as  renal  dysfunction, new‐onset  diabetes, and  neurologic  complications. Regulatory T (Treg) cell therapy is a promising alternative approach to induce tolerance and promote  acceptance of the transplanted allograft. However, factors such as the lack of information of specific  population of Treg cells and the requirement of in vitro expansion are limiting their implementation  in the clinic. As such new methodologies and materials for generating tolerogenic organs by Treg  cells are needed.  SUMMARY

[0003] A 1st  aspect of  the present disclosure, either  alone or  in  combination with  any other aspect set forth herein concerns a method for producing a tolerogenic organ or tissue comprising:  obtaining a donor organ or tissue, establishing an ex vivo perfusion circuit through the donor organ  or tissue of perfusate, wherein the perfusate comprises T cells and wherein the perfusion circuit is  at a normothermic or hypothermic temperature, and transplanting the donor organ or tissue into a  subject once the donor organ or tissue is tolerogenic.        2

[0004] A 2nd aspect of  the present disclosure, either alone or  in combination with any other aspect set forth herein concerns the method of the 1st aspect, wherein the perfusion circuit run at  a normothermic temperature of 34 °C ± 3 °C.

[0005] A 3rd aspect of  the present disclosure, either alone or  in  combination with any other aspect set forth herein concerns the method of the 1st aspect, wherein the perfusion circuit is run  at a hypothermic temperature of about 1 to about 15 °C.

[0006] A 4th aspect of  the present disclosure, either alone or  in  combination with any other aspect  set  forth  herein  concerns  the method  of  the  1st,  2nd,  or  3rd  aspect, wherein  the  T  cells comprise Treg cells.

[0007] A 5th aspect of  the present disclosure, either alone or  in  combination with any other aspect  set  forth  herein  concerns  the  method  of  the  4th  aspect,  wherein  the  perfusate  further comprises a stem cell.

[0008] A 6th aspect of  the present disclosure, either alone or  in  combination with any other aspect set forth herein concerns the method of the 5th aspect, wherein the stem cell comprises a  totipotent stem cell, a pluripotent stem cell, a multipotent stem cell, an oligopotent stem cell, an  unipotent stem cell, or a combination thereof.

[0009] A 7th aspect of  the present disclosure, either alone or  in  combination with any other aspect set forth herein concerns the method of the 5th aspect, wherein the stem cell is derived from  the same organ or tissue as that of the donor organ or tissue.

[0010] An 8th aspect of the present disclosure, either alone or  in combination with any other aspect set forth herein concerns the method of the 1st aspect, wherein the donor organ or tissue is  a liver, a lung, a kidney, a heart, an eye, an intestine, an ovary, a uterus, a stomach, a tongue, an  esophagus, a trachea, a pancreas, skin, an adrenal gland, a tendon, bone, cornea, tendon, or a valve.

[0011] A 9th aspect of  the present disclosure, either alone or  in  combination with any other aspect set forth herein concerns the method of the 1st aspect, wherein the perfusate is recirculated  through the circuit.

[0012] A 10th aspect of the present disclosure, either alone or  in combination with any other aspect set forth herein concerns the method of the 1st aspect, wherein the T cells comprise clinical  grade T cells.        3

[0013] An 11th aspect of the present disclosure, either alone or in combination with any other  aspect set forth herein concerns the method of the 1st aspect, wherein the perfusate is varied from  normothermic to hypothermic during perfusion of the donor organ or tissue,

[0014] A 12th aspect of the present disclosure, either alone or  in combination with any other aspect set forth herein concerns the method of the 1st aspect, further comprising establishing an immunoprofile  of  the  donor  organ  or  tissue  by  molecular,  histological  and / or  cytological methodology or a combination thereof.

[0015] A 13th aspect of the present disclosure, either alone or  in combination with any other aspect set forth herein concerns the method of the 1st aspect, further comprising obtaining a sample  from the perfusate to establish the microenvironment of the donor organ or tissue by assessing for  cell surface markers and / or nucleic acids.

[0016] A 14th aspect of the present disclosure, either alone or  in combination with any other aspect set forth herein concerns a method for establishing an immunoprofile of an ex vivo / ex situ  of a solid organ or tissue comprising perfusing an organ or tissue ex vivo or ex situ in a perfusion circuit with a perfusate, obtaining a sample  from  the perfusate and / or solid organ or  tissue and assessing at least one or more of the molecular status, histological status, and / or cytological status.

[0017] A 15th aspect of the present disclosure, either alone or  in combination with any other aspect set forth herein concerns a method for establishing a microenvironment of a solid organ or tissue  comprising  perfusing  a  solid  organ  or  tissue  in  a  perfusion  circuit  with  a  perfusate  at normothermic or hypothermic conditions, wherein the perfusate comprises Treg cells either alone or in  combination  with  stem  cells,  and  establishing  a  molecular,  histological,  and / or  cytological assessment from a sample thereof.

[0018] A 16th aspect of the present disclosure, either alone or  in combination with any other aspect set  forth herein concerns a system  for generating  tolerogenic organs  for  transplantation, comprising a perfusion circuit, a perfusate solution, a means to regulate the temperature of the  perfusate solution, and a means to circulate the perfusion solution through a donor organ, wherein  the perfusate solution comprises Treg cells.        4

[0019] A 17th aspect of the present disclosure, either alone or  in combination with any other aspect set forth herein concerns the system of the 16th aspect, wherein the perfusate solution is at  a normothermic temperature of 34 °C ± 3 °C.

[0020] An 18th aspect of the present disclosure, either alone or in combination with any other  aspect set forth herein concerns the system of the 16th aspect, wherein the perfusate solution is at  a hypothermic temperature of 1 to 15 °C ± 3 °C.

[0021] A 19th aspect of the present disclosure, either alone or  in combination with any other aspect set forth herein concerns the system of the 16th, 17th, or 18th aspect, wherein the perfusate  solution further comprises stem cells.  DESCRIPTION

[0022] The present disclosure concerns approaches to preparing tolerogenic organs or organs  that are immunologically tolerant that will be receptive to Treg therapies. As referred to herein, a  donor organ will refer to a complete or partial organ or tissue to be transplanted into a subject. Such may  include  systemic  organs,  connective  tissue,  skin,  muscle,  bone,  or  any  other  perfusable collection of cells.

[0023] In  some  aspects,  the  present  disclosure  includes  methodologies  to  establish  an immunoprofile  signature  for modifications  in a  solid organ  following  infusion with T  cells either alone or in combination with stem cells. As will be described elsewhere herein, in some aspects, the  present disclosure concerns preparation of tolerogenic organs and or tolerogenic cells therein. While  such methods can certain be utilized with such, such methods for establishing an immunoprofile do  not need to be limited to assessment of tolerogenic organs as described herein.

[0024] In aspects, the present disclosure concerns establishing an ex vivo or ex situ perfusion  circuit of a perfusate solution through a donor organ or tissue. The perfusate may pass through once  or may be recirculated through the donor organ. The perfusate solution includes T cells, such as Treg  cells, to generate tolerogenic organs or tissues. The perfusate circuit, as is described herein, can be  run at normothermic and / or hypothermic conditions to improved generation of tolerogenic organs.  The perfusate may optionally include stem cells.

[0025] In some aspects, the present disclosure concerns contacting cells of an organ with T cells.  In some aspects, the contact is done by perfusing an organ to be transplanted into a subject with T        5   to  infuse  or  perfuse  a  solid  organ  amenable  for  transplantation with  T  cells  either  alone  or  in combination with stem cells. T cells may include cytotoxic (CD8+) T cells, Helper (CD4+) T cells, and Regulatory T cells (Treg).  In some aspects, the methods  include perfusing a solid organ with Treg cells. Solid organs amenable for transplantation may include a liver, kidney, pancreas, ovaries, heart,  lung, uterus, and / or other composite graft(s), described as solid organ(s) hereafter.

[0026] In some aspects, the methods use molecular, cytological and histological analyses of tissue biopsies  to  detect  immunological  changes  in  the  immune  composition  of  organ  cell  infiltrates induced by Treg cell infusion either alone or in combination with stem cells. Immunological changes  in the organ microenvironment induced by infused cells in solid organ transplantation can create an  immunoprofile signature.

[0027] In  some aspects,  the present disclosure  concerns perfusion or  infusion of T  cells  in a perfusate  solution  into  donor  organs  or  cells  thereof  to  be  transplanted.  In  some  aspects,  the perfusion  is performed under normothermic  conditions,  such  that  the perfusion  temperature  is maintained close to body temperature of 34 to 37 °C (± 1 or 2 or 3 °C). In some aspects, the perfusion  is performed at hypothermic temperatures, such as of about 1 °C to about 15 ° C, including about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, and 14 °C.  In some aspects, perfusion may be a combination of hypothermic and normothermic conditions.

[0028] In some aspects, the perfusion or infusion of the donor organ or cells thereof is performed  with T cell, such as a Treg cell. In some aspects, the T cells are in a solution. In some aspects, the  solution is normothermic or hypothermic. In some aspects, the T cells are incubated in the solution  for a period of time prior to perfusion through the organ or cells thereof. In some aspects, the T cells  and / or the solution for the perfusion are of the perfusion temperature prior to initiation thereof, such  that  the  perfused  organ  or  cells  thereof  receive  the  desired  temperature  T  cells  and / or perfusion solution.

[0029] In some aspects, the T cells are  in the perfusion solution at a desired concentration or number of cells per mL. For example. For 4L of perfusate, between 2x104 and 4x109 T cells can be  utilized..        6

[0030] in a perfusion solution.  In some aspects, the perfusion solution is normothermic perfusion solution, which may include packed red blood cells, Ringer's  lactate,  albumin,  and  additives  like  insulin,  glucose, multivitamins,  nutrients,  bile  salts, vasodilators, and anticoagulants, actively oxygenated. In some aspects, the perfusion solution is a hyporthermic  perfusion  solution  which  may  include  actively  oxygenated  UW  (University  of Wisconsin) or HTK (histidine‐tryptophan‐ketoglutarate) solution with colloids, such as hydroxyethyl  starch, glutathione, and adenosine.

[0031] In some aspects, the perfusion solution is of a neutral pH. In some aspects, the pH of the  perfusion solution is of about 5.0 to about 8.0, including about 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8,  5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, and 7.9.

[0032] In some aspects, the perfusion solution may include blood or a component thereof, such  as to provide or transport oxygen to the cells therein. In some aspects, the perfusion solution may include at  least one of plasma,  red blood  cells, platelets, white blood  cells, or any  combination thereof.

[0033] In some aspects, the T cells are  included  in the  in the perfusion solution  in addition to other possible blood components,  including red blood cells (RBCs).  In some aspects, the solution may include only one type of T cell, two types of T cell, or any combination of T cell. In some aspects,  the T cells in the perfusion solution may be at a desired ratio to a different type of T cell. For example,  the solution may include at least two types of T cell, wherein the first type is at a ratio to the second  type of about 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60,  1:75, or 1:100 etc.

[0034] In some aspects, the perfusion solution may include only T cells as the only type of cell  and / or cellular material. In other aspects, one or more types of stem cell may be included, including  totipotent, pluripotent, multipotent, oligopotent, and unipotent stem cells. Stem cells may include pluripotent  and / or  tissue  specific  stem  cells.  Stem  cells may  include  embryonic  stem  cells  and induced pluripotent stem cells. Stem cells may  include one or more of mesenchymal stem cells, adipose stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, lung stem cells, cardiac stem cells,  hepatic stem cells, bone or skeletal stem cells, muscle stem cells and combinations thereof. In some aspects,  stem cells of  the  type of organ being  transplanted can be utilized. For example, a  liver        7    potent stem cells, such as embryonic stem cells.

[0035] In  some  aspects,  the  present  disclosure  concerns  perfusion  of  donor  organs  or  cells thereof with T cells to increase infiltration of T cells, such as Tregs, cytotoxic T cells, and / or helper T cells,  therein.  In some aspects,  the control of  the perfusion  temperature, such as normothermic and / or  hypothermic  can  influence  infiltration.  In  some  aspects,  the  presence  of  stem  cells  can influence  infiltration and / or enhance  the effects once  infiltrated.  In some aspects,  the perfusion solutions may include one or more additional components to influence infiltration.

[0036] In some aspects, the methods herein concern perfusion with T cells, such as Treg T cells, cytotoxic T cells and / or helper T cells.  In some aspects, the T cells are of clinical grade.  It will be understood that such is of a standard such that the T cells can be administered directly to a human  subject and are of sufficient quality for safe and effective medical treatments. In some aspects, such  can include T cells produced with good manufacturing practice (GMP) or good laboratory practice (GLP)  guidelines  and  undergoing  rigorous  quality  control  to  meet  purity,  potency,  and  safety standards.

[0037] In  some  aspects,  the present disclosure  concerns perfusion of  a donor organ or  cells thereof with T cells, such as Treg cells. In some aspects, the donor organ or cells thereof are for a  subject, such as to be transplanted in a subject. In some aspects, the perfusion is performed ex vivo  wherein an organ is excised from one subject, perfused as set forth herein, and then transplanted  into a recipient subject. In some aspects, the organ is a whole organ. In some aspects, the organ is  a part of an organ. In some aspects, the organ is a liver, a lung, a kidney, a heart, an eye, an intestine,  an ovary, a uterus, a stomach, a tongue, an esophagus, a trachea, a pancreas or a graft such as a  skin graft. In some aspects, the organ may be a tissue or a gland, such as an adrenal gland, a tendon,  bone, cornea, tendon, or a valve. In some aspects, the donor organ may not be from a first subject  but instead is a lab grown or grown ex vivo.

[0038] In some aspects, the present disclosure concerns monitoring a donor organ as set forth  herein to determine if it is tolerogenic. In some aspects, the present disclosure includes obtaining a  sample from a donor organ and determining if such is tolerogenic. In some aspects, the sample is  taken at one or more time points either prior to or during or after perfusion of the organ as set forth        8    the presence of immune cells ‐histology and / or cytology‐, in addition to cellular and molecular tests  to determine the expression of particular genes or proteins , as well as potential ratios therebetween  to establish a change in the immunoprofile signature of one or more cells of the donor organ or cells therein.  In some aspects, such can  include assessment  for expression of one or more expressed genes or proteins, such as surface proteins, to confirm a certain status of the T cell.

[0039] In  some  aspects,  the present disclosure  includes monitoring  for expression of  certain markers or expressed genes or proteins in the T cells to confirm a uniform status or immunoprofile.  In some aspects, the methods may include identifying changes in FoxP3 and Interferon‐gamma (IFN‐γ)  and / or  Granzyme  B  mRNA,  as  well  as  ratios  therebetween  as  signatures  of  Treg  cell  and conventional  T  cell  infiltration,  respectively.  For  example,  methods  such  as  polymerase  chain reaction  (PCR), molecular microscope diagnosis  (MMDx),  customized MMDx,  and digital  special profiling (DSP e.g. GEOMx™) can be utilized alone or in combination to detect and / or quantify mRNA  expression.

[0040] In some aspects, a molecular microscope diagnostic system, such as MMDx or similar can  be utilized to view and / or detect molecular changes induced by cellular treatment in tissue biopsy  samples.

[0041] In  some  aspects,  the  methods may  include  an  Alberta  Transplant  Applied  Genomics Centre  (ATAG‐ at  the University of Alberta, Canada)‐customized molecular microscope diagnostic system to detect immune‐molecular changes induced by the cell treatment(s).

[0042] In some aspects, the methods may include localization and / or molecular characterization of  changes on  infiltrated T  cells  after  cellular  treatment.  In  some  aspects,  the methods  include measurement with GeoMx™ Digital Spatial Profiler (NanoString Co.).

[0043] In some aspects, the methods may include histological analysis of tissue to examine the changes of  immunological  infiltrates  in  the  solid organ after  cell  treatment.  Such methods may include histological means understood in the art such as staining, immunohistochemistry, electron  microscopy, immunofluorescence and similar. Such methods may include obtaining a tissue biopsy  from the solid organ.        9

[0044] treatment with the cells as set forth herein. In some aspects, the methods may include examination  of the changes of total T cells and Treg cell infiltrates in the organ tissue after cell treatment. In some  aspects, the cytological methods may include phenotypic analysis of T cells and / or Treg cell and / or  stem cells infiltrates in the organ tissue after cell treatment. In some aspects, the cytological methods may  include determination of proteomic profile changes  in  infiltrated T cells  induced by  the  cell treatment.  In some aspects, such proteomic profile changes may be determined with a GeoMx™ Human Proteome Atlas.

[0045] In some aspects, organ status / damage may be estimated by exosomal microRNA and / or  organ cell free DNA from the perfusate. In some aspects, a sample of perfusate may be collected for  analysis of the status of the organ. In some aspects, evaluation of organ damage progression may  be performed using histologic, functional and molecular assessments. Such may include functional assessments measured by changes  in perfusate. For example, partial pressures of O2 and CO2, pH, base  excess,  bicarbonate,  O2  saturation,  hemoglobin,  hematocrit,  sodium,  potassium,  chloride, calcium, glucose, ATP and  lactate concentrations and bile production can be assessed. Such may also  include histological assessments. For example, biopsies can address acute or  chronic organ injury. In some aspects, a time course analysis will evaluate baseline parameters of organ damage  progression. In some aspects, evaluation of organ damage progression induced by effector cells using histologic,  functional and molecular assessments.  In  some  aspects  evaluation  of  organ  damage progression  induced  by  effector  cells  in  pre‐treated  organs  using  histologic,  functional  and molecular assessments.

[0046] The present disclosure also concerns establishing an ex vivo or ex situ circuit of perfusate  flow through the donor organ, wherein T cells, such as Treg cells, are in the perfusate as set forth herein.  The  present  disclosure  includes  infusing  clinical  grade  Treg  cells  either  alone  or  in combination with stem cells into a normothermic / hypothermic perfusion pump circuit, wherein the  T cells are allowed to infiltrate the solid organ in the circuit. The perfused cells result in an increase  in the number and / or frequency of infiltrated suppressive Treg cells and / or stem cells, poising a shift toward  a more  tolerogenic microenvironment.  Following  such  perfusion,  the  organs  are  better poised for a more successful eventual transplantation.        10

[0047] In  some  aspects,  the  perfusion  be  measured  or  monitored  by  the  number  or proportion of Treg (and / or stem) cell  infiltrates in the perfused organ. Such can be accomplished using molecular, histologic and cytologic assays as discussed herein. In some aspects, the perfusion  can be assessed through functional protective activity of Treg cells either alone or in combination  with stem cells based on a customized system to test anti‐effector cell function. Such may include  ex vivo functional evaluation of anti‐organ immune protection (cellular and antibody mediated). The Normothermic / Hypothermic  perfusion  circulatory  ex  vivo  system  can  be  utilized  to  evaluate protective  efficacy  of  Treg  cells  inducing  a  tolerogenic  microenvironment  in  solid  organs  for transplantation.

[0048] In some aspects, the functional analysis of the protective activity of perfused Treg cells  either alone or in combination with stem cells can involve at least one of the following: evaluation  of time‐dependent changes of untreated Normothermic / Hypothermic perfused organs; evaluation of  time‐dependent  changes  induced  in  the  Normothermic / Hypothermic  attached  organ  after infusion of primary T cells; and comparative evaluation of time‐ dependent changes of the T cell treatment  in  the Normothermic / Hypothermic  attached‐organ  pre‐infused with  Treg  cells  either alone or in combination with stem cells.

[0049] With respect to: evaluation of time‐dependent changes of Normothermic / Hypothermic  attached‐organs with no addition of cell treatment, such can include assessing the immunoprofile signature of organ‐resident T cells. Such can also  include  type and periodicity of measurements, such as sequential tissue biopsies taken  initially before the Normothermic / Hypothermic attached organ (baseline, untreated organ.  The assessments may also include organ functional quality of type & periodicity of measurements,  such  as  histological  changes  assessed  from  tissue  biopsies  and molecular and biochemical changes in the perfusate; histological assessments; biopsies to evaluate  acute or chronic organ injury as described herein; molecular assessments of organ originated cfDNA  levels in perfusate to monitor organ‐specific cell‐death by next generation sequencing (NGS) in the  Normothermic / Hypothermic attached organ system (organ‐derived cfDNA); molecular assessment  of organ‐originated exosome vesicle (EV) levels in the perfusate to monitor l organ cell damage by  NGS of miRNA‐containing EV in the perfusion pump attached organ (i.e., quantified by PCR, cfDNA); biochemical assessments such as (for e.g.  liver):  lactate clearance, bile production or markers for        11   biliary  viability,  biliary  bicarbonate  biliary  pH,  biliary  glucose  concentration, bile / perfusate  glucose  concentration  ratio,  and / or  biliary  lactate  dehydrogenase  concentration perfusate.  Stable  pressure / flow  dynamics  of  the  organ.  Soft  parenchymal  consistency, Transaminases AST and / or ALT levels.

[0050] The results from such assessments can allow the establishment of baseline parameters  and decay parameters of the organ attached to Normothermic / Hypothermic perfusion system. With  respect to evaluation of time‐dependent changes of Normothermic / Hypothermic attached organ  induced after infusion of primary T cells, such can include establishing the immunoprofile signature  changes of organ resident T cells and / or assessment of organ functional quality. For example, such may  include organ  immunoprofile  change  in organ  resident T  cells and / or  assessment  of  organ function quality. The results will determine the T cell organ infiltration and decay responses induced  by T cells compared to baseline as set out above.

[0051] With  respect  to  evaluation  of  time‐dependent  changes  of  the  T  cell  treatment  in Normothermic / Hypothermic attached organ pre‐conditioned with infused Treg cells either alone or  in combination with stem cells, such can include establishing the immunoprofile signature changes of organ  resident T cells and / or assessment of organ  functional  quality. For example, such may include organ immunoprofile change in organ‐resident T cells and / or assessment of organ function  quality. The results will determine the Treg cell organ infiltration and protective effect against the  effector cell‐mediated organ decay response measured herein above  EXAMPLES

[0052] Normothermic / Hypothermic perfusion with activated Treg and / or primary T cells either  alone or in combination with stem cells to establish an Immunoprofile.

[0053] In  some  aspects,  the  present  disclosure  concerns  normothermic  or  hypothermic perfusion of a solid organ, to infuse clinical‐grade activated Treg and / or stem cells and / or primary T cells therein. Such can  then  modify  the microenvironment  of  the  organ.  In  some  aspects,  such may  include  a molecular, histological and / or cytological readout and / or immunoprofile as set out above (e.g., PCR, MMDx, ATG‐customized MMDx, GeoMx profiler).

[0054] Normothermic / Hypothermic  perfusion  with  activated  Treg  cells  either  alone  or  in combination with stem cells to assess for anti‐effector T cell function.        12

[0055] cells either alone or in combination with stem cells to induce tolerogenic state to prevent or reduce  effector T cell‐mediated damage in solid organs for transplantation. In some aspects, organ damage  may be estimated by exosomal microRNA and organ cell free DNA. In some aspects, evaluation of  organ damage progression using histologic, functional and molecular assessments. Such may include  functional assessments measured by changes in perfusate. For example, in liver, partial pressures of O2  and  CO2,  pH,  base  excess,  bicarbonate,  O2  saturation,  hemoglobin,  hematocrit,  sodium, potassium, chloride, calcium, glucose, ATP and  lactate concentrations and bile production can be assessed. Such may include histological assessments. For example, in the liver, biopsies will address  acute or chronic organ injury, large and small‐droplet macrovesicular steatosis, coagulative necrosis, intrahepatic bile duct  injury (apoptosis, vacuolation, and  lifting of epithelium  from  the basement membrane), hepatocyte plate injury (e.g. hepatocyte loss of cohesion, detachment of hepatocyte  plates from the sinusoidal lining), and glycogen depletion, which were recorded as percentages of cells affected.  Such may  include molecular assessments:  organ  damage  estimated  by  exosomal microRNA and organ cell free DNA. In some aspects, a time course analysis will evaluate baseline  parameters of organ damage progression. In some aspects, evaluation of organ damage progression induced by effector cells using histologic, functional and molecular assessments. In  some aspects evaluation  of  organ  damage  progression  induced  by  effector  cells  in  pre‐treated  organs  using histologic, functional and molecular assessments. The organs will be pre‐treated with clinical grade  activated Treg cells infused in the perfusate.

[0056] Normothermic / Hypothermic perfusion of Treg either alone or  in combination with stem cells  to Generate Tolerogenic Organs

[0057] In some aspects, the present disclosure concerns the application of a normothermic or hypothermic perfusion pump for  infusing clinical‐grade, Treg cells either alone or  in combination with stem cells through a solid organ, of a subject, such as a human. In some aspects, the solid organ is  a  liver  or  kidney,  pancreas,  ovaries,  heart,  lung,  uterus,  and / or  other  composite  grafts.  The generation of ex vivo and / or ex situ change   in organ  immunoprofile   in a targeted solid organ intended  for  transplantation  can  be  achieved  through  either  normothermic  or  hypothermic perfusion with Treg cells either alone or in combination with stem cells.        13

[0058] The  present  disclosure  includes  clinical  grade  Treg  cells  either  alone  or  in combination with stem cells into a normothermic / hypothermic perfusion pump circuit and allowed  to infiltrate the solid organ in the circuit. The perfused cells will result in an increase in the number and / or  frequency of  infiltrated suppressive Treg cells and / or stem cells, poising a shift  toward a more  tolerogenic microenvironment.  Such  organs  can  then  allow  for much  successful  eventual transplantation.

[0059] In  some  aspects,  the  perfusion  methods  will  be  measured  or  monitored  through  a demonstration of increase in the number or proportion of Treg (and / or stem) cell infiltrates in the  perfused organ using molecular, histologic and cytologic assays as discussed herein above.

[0060] In some aspects, the perfusion methods will be measured and / or determined through a  demonstration of functional protective activity of Treg cells either alone or in combination with stem cells based on a customized  system  to  test anti‐effector cell  function. Such may  include ex vivo functional evaluation of organ protection. The Normothermic / Hypothermic perfusion circulatory ex vivo  model  can  be  utilized  to  evaluate  protective  efficacy  of  Treg  cells  inducing  a  tolerogenic microenvironment in solid organs for transplantation. The treated tolerogenic organ will be tested  in clinical trials with the goal of reducing or avoiding toxic side effects of current immunosuppressive  drug regimens.

[0061] In some aspects, the functional analysis of the protective activity of perfused Treg cells  either alone or in combination with stem cells can involve at least one of the following: evaluation  of time‐dependent changes of untreated Normothermic /  Hypothermic perfused organs; evaluation of  time‐dependent  changes  induced  in  the  Normothermic / Hypothermic  attached  organ  after infusion of primary T cells; and comparative evaluation of time‐ dependent changes of the T cell treatment  in  the Normothermic / Hypothermic  attached‐organ  pre‐infused with  Treg  cells  either alone or in combination with stem cells.

[0062] With respect to: evaluation of time‐dependent changes of Normothermic / Hypothermic  attached‐organs with no addition of cell treatment, such can include:

[0063] The  immunoprofile  signature  of  organ‐resident  T  cells.  Type  and  periodicity  of measurements:  Sequential  tissue biopsies  taken  initially before  the Normothermic / Hypothermic attached organ (baseline, untreated organ), until the functional decay parameters are significant.         14

[0064] changes assessed  from  tissue biopsies and molecular and biochemical changes  in  the perfusate. Histological assessments.  Biopsies will evaluate acute or chronic organ injury as described above. Molecular assessments: Assessment of organ originated cfDNA levels in perfusate to monitor organ‐specific  cell‐death  by  next  generation  sequencing  (NGS)  in  the  Normothermic / Hypothermic attached organ system (organ‐ derived cfDNA) Assessment of organ ‐originated exosome vesicle (EV) levels  in  the  perfusate  to monitor  l  organ  cell  damage  by NGS  of  miRNA‐containing  EV  in  the perfusion pump attached organ (i.e., quantified by PCR, cfDNA).

[0065] Biochemical Assessments will be performed as organ specific measurements. For example  in liver:

[0066] Lactate  clearance,  bile  production  or  markers  for  biliary  viability,  biliary  bicarbonate concentration, biliary pH, biliary glucose concentration, bile / perfusate glucose concentration ratio,  and / or biliary lactate dehydrogenase concentration perfusate. Stable pressure / flow dynamics of the  organ. Soft parenchymal consistency, Transaminases AST and / or ALT levels.

[0067] The  results will establish  the baseline parameters and decay parameters of  the organ attached to Normothermic / Hypothermic perfusion system.

[0068] With respect to evaluation of time‐dependent changes of Normothermic / Hypothermic attached  organ  induced  after  infusion  of  primary  T  cells,  such  can  include  establishing  the immunoprofile signature changes of organ resident T cells and / or assessment of organ functional  quality. For example, such may include organ immunoprofile change in organ resident T cells and / or assessment of organ  function quality. The  results will determine  the T cell organ  infiltration and decay responses induced by T cells compared to baseline as set out above.

[0069] With  respect  to  evaluation  of  time‐dependent  changes  of  the  T  cell  treatment  in Normothermic / Hypothermic attached organ pre‐conditioned with infused Treg cells either alone or  in combination with stem cells, such can include establishing the immunoprofile signature changes of organ  resident T cells and / or assessment of organ  functional  quality. For example, such may include organ immunoprofile change in organ‐resident T cells and / or assessment of organ function  quality. The results will determine the Treg cell organ infiltration and protective effect against the  effector cell‐mediated organ decay response measured herein above.        15

[0070] herein, will be apparent to those skilled in the art of the above description.  Such modifications are also intended to fall within the scope of the appended claims.

[0071] It  is  appreciated  that  all  reagents  are  obtainable by  sources  known  in  the  art  unless otherwise specified.

[0072] It  is also to be understood that this disclosure is not  limited to the specific aspects and methods described herein, as specific components and / or conditions may, of course, vary.

[0073] Furthermore,  the  terminology used herein  is used only  for  the purpose of describing particular aspects of the present disclosure and is not intended to be limiting in any way. It will be  also understood that, although the terms “first,” “second,” “third” etc. may be used herein to describe various  elements,  components,  regions,  layers,  and / or  sections,  these  elements,  components, regions, layers, and / or sections should not be limited by these terms. These terms are only used to  distinguish one element, component, region, layer, or section from another element, component, region,  layer,  or  section.  Thus,  “a  first  element,”  “component,”  “region,”  “layer,”  or  “section” discussed below could be termed a second (or other) element, component, region, layer, or section  without departing from the teachings herein. Similarly, as used herein, the singular forms “a,” “an,” and “the” are  intended  to  include  the plural  forms,  including “at  least one,” unless  the content clearly indicates otherwise. “Or” means “and / or.” As used herein, the term “and / or” includes any  and all combinations of one or more of the associated listed items. It will be further understood that the terms “comprises” and / or “comprising,” or “includes” and / or  “including” when  used  in  this specification, specify the presence of stated features, regions, integers, steps, operations, elements,  and / or components, but do not preclude the presence or addition of one or more other features,  regions, integers, steps, operations, elements, components, and / or groups thereof. The term “or a  combination thereof” means a combination including at least one of the foregoing elements.

[0074] Unless otherwise defined, all terms (including technical and scientific terms) used herein  have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this  disclosure belongs. It will be further understood that terms such as those defined in commonly used  dictionaries, should be interpreted as having a meaning that is consistent with their meaning in the        16    overly formal sense unless expressly so defined herein.

[0075] Reference  is made  in  detail  to  exemplary  compositions,  aspects  and methods  of  the present disclosure, which constitute the best modes of practicing the disclosure presently known to the inventors.  The drawings are not necessarily to scale.  However, it is to be understood that the disclosed aspects are merely exemplary of  the disclosure  that may be embodied  in  various  and alternative forms.  Therefore, specific details disclosed herein are not to be interpreted as limiting, but merely as a representative basis for any aspect of the disclosure and / or as a representative basis  for teaching one skilled in the art to variously employ the present disclosure.

[0076] Patents, publications, and applications mentioned in the specification are indicative of the levels of those skilled in the art to which the disclosure pertains.  These patents, publications, and applications are incorporated herein by reference to the same extent as if each  individual patent, publication, or application was specifically and individually incorporated herein by reference.

[0077] The foregoing description is illustrative of particular embodiments of the disclosure, but is  not  meant  to  be  a  limitation  upon  the  practice  thereof.  The  following  claims,  including  all equivalents thereof, are intended to define the scope of the disclosure.

Claims

17     1.  A method for producing a tolerogenic organ or tissue comprising:   obtaining a donor organ or tissue,    establishing an ex vivo perfusion circuit  through  the donor organ or  tissue of perfusate, wherein the perfusate comprises T cells and wherein the perfusion circuit is at a normothermic or  hypothermic temperature, and    transplanting the donor organ or tissue  into a subject once the donor organ or tissue  is tolerogenic.

2. The method of claim 1, wherein the perfusion circuit run at a normothermic temperature of 34 °C ± 3 °C.

3. The method of claim 1, wherein the perfusion circuit is run at a hypothermic temperature of about 1 to about 15 °C.

4. The method of claims 1, 2, or 3, wherein the T cells comprise Treg cells.

5. The method of claim 4, wherein the perfusate further comprises a stem cell.

6. The method of claim 5, wherein the stem cell comprises a totipotent stem cell, a pluripotent stem cell, a multipotent stem cell, an oligopotent stem cell, an unipotent stem cell, or a combination  thereof.

7. The method of claim 5, wherein the stem cell is derived from the same organ or tissue as that of the donor organ or tissue.

8. The method of claim 1, wherein the donor organ or tissue is a liver, a lung, a kidney, a heart, an eye, an intestine, an ovary, a uterus, a stomach, a tongue, an esophagus, a trachea, a pancreas,        18     9.  The method of claim 1, wherein the perfusate is recirculated through the circuit.

10. The method of claim 1, wherein the T cells comprise clinical grade T cells.

11. The method of claim 1, wherein the perfusate is varied from normothermic to hypothermic during perfusion of the donor organ or tissue,   12.  The method of  claim 1,  further  comprising establishing an  immunoprofile of  the donor organ or tissue by molecular, histological and / or cytological methodology or a combination thereof.

13. The  method  of  claim  1,  further  comprising  obtaining  a  sample  from  the  perfusate  to establish the microenvironment of the donor organ or tissue by assessing for cell surface markers  and / or nucleic acids.

14. A method for establishing an immunoprofile of an ex vivo / ex situ of a solid organ or tissue comprising perfusing an organ or tissue ex vivo or ex situ  in a perfusion circuit with a perfusate, obtaining a sample from the perfusate and / or solid organ or tissue and assessing at  least one or more of the molecular status, histological status, and / or cytological status.

15. A  method  for  establishing  a  microenvironment  of  a  solid  organ  or  tissue  comprising perfusing  a  solid  organ  or  tissue  in  a  perfusion  circuit  with  a  perfusate  at  normothermic  or hypothermic conditions, wherein the perfusate comprises Treg cells either alone or  in combination with stem cells, and establishing a molecular, histological, and / or cytological assessment  from a sample thereof.

16. A  system  for  generating  tolerogenic organs  for  transplantation,  comprising  a perfusion circuit, a perfusate solution, a means to regulate the temperature of the perfusate solution, and a        19    comprises Treg cells.

17. The system of claim 16, wherein the perfusate solution is at a normothermic temperature of 34 °C ± 3 °C.

18. The system of claim 16, wherein the perfusate solution is at a hypothermic temperature of 1 to 15 °C ± 3 °C.

19. The system of claim 16, 17, or 18, wherein the perfusate solution further comprises stem cells.