Engineered il2rΒ variants and methods of use thereof

Abstract

This disclosure provides engineered IL2Rβ variants, and methods of use thereof. In some embodiments, the engineered IL2Rβ variants include one or more non-native histidine residues.

Description

ENGINEERED IL2RΒ VARIANTS AND METHODS OF USE THEREOF

[0001] CLAIM OF PRIORITY

[0002] This application claims priority to U.S. Provisional Patent Application No. 63 / 655,486, filed on June 03, 2024, the entire contents of which are hereby incorporated by reference.

[0003] SEQUENCE LISTING

[0004] This application contains a Sequence Listing that has been submitted electronically as an XML file named 52246-0028WO1_SL_ST26. xml. The XML file, created on May 19, 2025, is 28, 396 bytes in size. The material in the XML file is hereby incorporated by reference in its entirety.TECHNICAL FIELD

[0005] This disclosure relates to engineered IL2Rβ variants, and methods of use thereof.BACKGROUND

[0006] Cytokines belonging to the common γ chain (γc) family are central regulators of the development, proliferation, survival and differentiation of multiple cell lineages of the innate and adaptive immune system, and as such are of high interest for anticancer therapeutic applications.

[0007] Among them, IL-2 is the most comprehensively one. It became the first immunotherapy approved by the United States Food and Drug Administration (FDA) for cancer treatment nearly 30 years ago. However, IL-2 has the effect of promoting the proliferation of regulatory T cells and CD4+ helper T cells. It can also eliminate self-relative T cells via activation-induced cell death (AICD) to prevent autoimmunity. Thus, IL-15 has gradually emerged as an alternative to IL-2 in cancer treatment because of its functional similarity to IL-2 with several added benefits. For example, the physiological / pathological roles and mechanisms of action of IL-15 in immunity have been more thoroughly investigated. IL-15 is essential in the growth, mobilization and activation of immune cells such as natural killer (NK) cells, CD8+ T cells, γδ T cells and natural killer T (NKT) cells. IL-15 can also enhance the anti-tumor activity of immune cells.

[0008] Recombinant IL-15 has been tested as an antitumor agent in various clinical trials, which showed promising anti-tumor activities. However, due to unspecific activation of immune cells by IL-15 during systemic circulation, excessive toxicity has been reported in cancer patients, which limits its clinical application.

[0009] Thus, there is a need to develop cancer therapies targeting the IL-15 pathway with enhanced anti-tumor efficacy and limited toxicities.SUMMARY

[0010] This disclosure relates to engineered IL2Rβ variants, protein constructs, and methods of use thereof. In some embodiments, the variants and protein constructs thereof include one or more non-native histidine residues within wildtype IL2Rβ extracellular region, without interfering the overall structure or residues critical for IL2Rβ / IL-15 interaction. As a result, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof can have a comparable or high binding affinity to IL-15 at a neutral pH (e.g., about pH 7.5) and a low binding affinity to IL-15 at an acidic pH (e.g., about pH 6.0) . Because tumor microenvironment usually has an acidic pH, the engineered IL2Rβ variants and protein constructs thereof described herein can be used as a “protective lid” to shield IL-15 from activating immune cells prematurely during systemic circulation. Once the variants or protein constructs reach tumor sites, the lid can be loosened up, which enables IL-15 to activate immune cells within the tumor microenvironment.

[0011] Also provided herein are methods for screening IL2Rβ variants or protein constructs thereof with desired pH-dependent binding ability to an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) . The methods can be useful for identifying IL2Rβ variants or protein constructs thereof to selectively release the IL2Rβ ligand within tumor microenvironment. In some embodiments, the screened IL2Rβ variants or protein constructs thereof can be linked to a targeting moiety that specifically binds to a tumor-associated antigen, to direct the IL2Rβ variants or protein constructs thereof to tumor sites.

[0012] In one aspect, the disclosure is related to an engineered IL2Rβ polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 80%identical to SEQ ID NO: 1 or 18, in some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide comprises one or more non-native histidine residues. In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide described herein comprises one or more of the following: (a) the amino acid that corresponds to Y12 of SEQ ID NO: 1 is H (histidine) ; (b) the amino acid that corresponds to R15 of SEQ ID NO: 1 is H; (c) the amino acid that corresponds to R41 of SEQ ID NO: 1 is H; (d) the amino acid that corresponds to R42 of SEQ ID NO: 1 is H; (e) the amino acid that corresponds to Q70 of SEQ ID NO: 1 is H; (f) the amino acid that corresponds to K71 of SEQ ID NO: 1 is H; (g) the amino acid that corresponds to L72 of SEQ ID NO: 1 is H; (h) the amino acid that corresponds to T73 of SEQ ID NO: 1 is H; (i) the amino acid that corresponds to T74 of SEQ ID NO: 1 is H; (j) the amino acid that corresponds to V75 of SEQ ID NO: 1 is H; (k) the amino acid that corresponds to F98 of SEQ ID NO: 1 is H; (l) the amino acid that corresponds to F101 of SEQ ID NO: 1 is H; (m) the amino acid that corresponds to E102 of SEQ ID NO: 1 is H; (n) the amino acid that corresponds to Y134 of SEQ ID NO: 1 is H; (o) the amino acid that corresponds to F135 of SEQ ID NO: 1 is H; and (p) the amino acid that corresponds to Q188 of SEQ ID NO: 1 is H. In some embodiments, the amino acid that corresponds to Y12 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to R15 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to R41 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to R42 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to Q70 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to K71 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to L72 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to T73 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to T74 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to V75 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to F98 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to F101 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to E102 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβpolypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to Y134 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to F135 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue. In some embodiments, the amino acid that corresponds to Q188 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.

[0013] In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide described herein comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 2-17. In some embodiments, the engineered IL2Rβpolypeptide described herein comprises an amino acid sequence that corresponds to the extracellular region of human interleukin-2 receptor subunit beta (IL2Rβ) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide further comprises a CH2 domain and a CH3 domain of IgG1 Fc or IgG4 Fc. In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide further comprises a hinge region, e.g., an IgG1 or IgG4 hinge region. In some embodiments, the CH2 domain is an IgG1 or IgG4 CH2 domain and the CH3 domain is an IgG1 or IgG4 CH3 domain.

[0014] In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide binds to an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) with a binding affinity that is at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or at least 100%as compared to that of a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof at a neutral pH. In some embodiments, the neutral pH is about 6.5 to about 8.0, about 6.5 to about 7.5, about 6.5 to about 7.0, about 7.0 to about 8.0, about 7.0 to about 7.5, or about 7.5 to about 8.0. In some embodiments, the neutral pH is about 6.5, about 6.6, about 6.7, about 6.8, about 6.9, about 7.0, about 7.1, about 7.2, about 7.3, about 7.4, about 7.5, about 7.6, about 7.7, about 7.8, about 7.9, or about 8.0.

[0015] In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide binds to an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) with a binding affinity that is less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, or less than 20%as compared to that of a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof at an acidic pH. In some embodiments, the acidic pH is about 5.0 to about 6.4, about 5.0 to about 6.0, about 5.0 to about 5.5, about 5.5 to about 6.4, about 5.5 to about 6.0, or about 6.0 to about 6.4. In some embodiments, the acidic pH is about 5.0, about 5.1, about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, or about 6.4. In some embodiments, the binding affinity gradually decreases when the pH decreases.

[0016] In some embodiments, the IL2Rβ ligand comprises or consists of interleukin 15 (IL-15) , e.g., human IL-15, or a functional variant thereof. In some embodiments, the IL2Rβligand comprises a His-tag and / or a sushi domain of interleukin 15 receptor, alpha subunit (IL15Rα) . In some embodiments, the IL2Rβ ligand comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 19.

[0017] In one aspect, the disclosure is related to a protein construct comprising two identical polypeptides, in some embodiments, each polypeptide comprises, optionally from N-terminus to C-terminus: the engineered IL2Rβ polypeptide described herein, an optional hinge region, and an Fc region, in some embodiments, the two polypeptides associate with each other, forming a dimer. In some embodiments, the hinge region is a human IgG1 or IgG4 hinge region, and the Fc region is a human IgG1 or IgG4 Fc region.

[0018] In one aspect, the disclosure is related to a protein construct comprising (a) a first polypeptide comprising, optionally from N-terminus to C-terminus: the engineered IL2Rβpolypeptide described herein, an optional first hinge region, a first Fc region; and (b) a second polypeptide comprising, optionally from N-terminus to C-terminus: an optional second hinge region, a second Fc region; in some embodiments, the first polypeptide and the second polypeptide associate with each other, forming a dimer. In some embodiments, the second polypeptide further comprises a second engineered IL2Rβ polypeptide. In some embodiments, the second polypeptide further comprises an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) . In some embodiments, the protein construct described herein further comprises a targeting moiety that specifically binds to a tumor-associated antigen.

[0019] In one aspect, the disclosure is related to a protein construct comprising (a) the engineered IL2Rβ polypeptide described herein; and (b) an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) .

[0020] In one aspect, the disclosure is related to a protein construct comprising (a) a first polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: the engineered IL2Rβ polypeptide described herein, an optional first hinge region, a first CH2 domain, and a first CH3 domain; and

[0021] (b) a second polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) , an optional second hinge region, a second CH2 domain, and a second CH3 domain; in some embodiments, the first polypeptide and the second polypeptide associate with each other, forming a dimer.

[0022] In one aspect, the disclosure is related to a protein construct comprising (a) a first polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: an optional first hinge region, a first CH2 domain, a first CH3 domain, and the engineered IL2Rβ polypeptide described herein; and (b) a second polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: an optional second hinge region, a second CH2 domain, a second CH3 domain, and an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) ; in some embodiments, the first polypeptide and the second polypeptide associate with each other, forming a dimer.

[0023] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition comprising the engineered IL2Rβ polypeptide or the protein construct described herein; and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0024] In one aspect, the disclosure is related to a nucleic acid encoding the engineered IL2Rβ polypeptide or the protein construct described herein.

[0025] In one aspect, the disclosure is related to a vector comprising the nucleic acid described herein. In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising the nucleic acid described herein. In some embodiments, the cell is a CHO cell.

[0026] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing an engineered IL2Rβpolypeptide or a protein construct, the method comprising (a) culturing the cell described herein under conditions sufficient for the cell to produce the engineered IL2Rβ polypeptide or the protein construct; and (b) collecting the engineered IL2Rβ polypeptide or the protein construct produced by the cell.

[0027] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the engineered IL2Rβ polypeptide or the protein construct described herein, and optionally an IL2Rβ ligand, to the subject.

[0028] In one aspect, the disclosure is related to a method of selectively enabling an IL2Rβligand to activate immune cells within the tumor microenvironment, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the engineered IL2Rβ polypeptide or the protein construct described herein, and optionally an IL2Rβ ligand, to the subject. In some embodiments, the subject has a solid tumor or a hematologic cancer. In some embodiments, the cancer is melanoma, head and neck cancer, colorectal cancer, lymphoma, leukemia, bladder cancer, multiple myeloma, pancreatic cancer, gastric cancer, or lung cancer.

[0029] In one aspect, the disclosure is related to a method of decreasing the rate of tumor growth, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the engineered IL2Rβ polypeptide or the protein construct described herein, and optionally an IL2Rβ ligand.

[0030] In one aspect, the disclosure is related to a method of killing a tumor cell, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising an IL2Rβ ligand and the engineered IL2Rβ polypeptide or the protein construct described herein, and optionally an IL2Rβ ligand.

[0031] In some embodiments, the IL2Rβ ligand comprises or consists of IL-15 (e.g., human IL-15) or a functional variant thereof.

[0032] In one aspect, the disclosure is related to an engineered cytokine binder, in some embodiments, the engineered cytokine binder can dynamically bind to a cytokine, thereby reducing the cytokine-induced immune response during systemic administration. In some embodiments, the engineered cytokine binder can change binding affinity to the cytokine in a pH-dependent manner. In some embodiments, the engineered cytokine binder can bind to the cytokine at a neutral pH, thereby reducing the cytokine-induced immune response during systemic administration. In some embodiments, the engineered cytokine binder has a reduced binding affinity to the cytokine at an acidic pH, thereby exposing the cytokine in tumor microenvironment. In some embodiments, the engineered cytokine binder remains partially shielding the cytokine at an acidic pH, thereby minimizing the potential toxicity due to excessive cytokine exposure in human. In some embodiments, the engineered cytokine binder comprises the extracellular region of a cytokine receptor having one or more non-native histidine residues. In some embodiments, the cytokine is IL-15 or a functional variant thereof, and the engineered cytokine binder comprises the extracellular region of IL2Rβ, in some embodiments, the IL2Rβ comprises one or more non-native histidine residues. In some embodiments, the engineered cytokine binder comprises or consists of an antibody or antigen-binding fragment thereof (e.g., scFv or VHH) that binds to the cytokine (e.g., IL15 or a functional variant thereof) , wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises one or more non-native histidine residues.

[0033] In one aspect, the disclosure is related to a protein construct comprising the engineered cytokine binder described herein, and a cytokine (e.g., a wildtype cytokine or a functional variant thereof) .

[0034] In one aspect, the disclosure provides an engineered IL2Rβ polypeptide comprises one or more histidine mutations (e.g., histidine substitutions) .

[0035] As used herein, the term “non-native histidine” refers to a histidine mutation, wherein a histidine amino acid residue substitutes a non-histidine amino acid residue in a wildtype protein, or is inserted at a position wherein a histidine amino acid residue does not naturally exist in that position. In some embodiments, at least one or two histidine residues are introduced by substitution. In some embodiments, the protein or the polypeptide may have additional mutations.

[0036] As used herein, the term “histidine mutation” refers to a mutation (e.g., a substitution or insertion) , wherein an amino acid residue in a wildtype protein is substituted with a histidine residue or a histidine residue is inserted in the protein.

[0037] As used herein, the term “engineered IL2Rβ polypeptide” refers to a polypeptide derived from a wildtype IL2Rβ polypeptide or a portion thereof, optionally with one or more mutations (e.g., insertions, deletions, or substitutions) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide comprises or consists of an amino acid sequence corresponding to the extracellular region of human IL2Rβ (e.g., amino acids 27-240 of human IL2Rβ (SEQ ID NO: 18) ) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide does not include the signal peptide of human IL2Rβ. In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide has one or more (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10) mutations (e.g., amino acids are substituted by histidine residues) .

[0038] As used herein, the term “protein construct” refers to a complex having one or more polypeptides. In some embodiments, the protein construct is a fusion protein, e.g., a fusion protein including a His-tag or an Fc region, and an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) . In some embodiments, the protein construct has two or more polypeptides, wherein the polypeptides can associate with each other, forming a dimer or a multimer (e.g., a trimer) .

[0039] As used herein, the term “cancer” refers to cells having the capacity for uncontrolled autonomous growth. Examples of such cells include cells having an abnormal state or condition characterized by rapidly proliferating cell growth. The term is meant to include cancerous growths, e.g., tumors; oncogenic processes, metastatic tissues, and malignantly transformed cells, tissues, or organs, irrespective of histopathologic type or stage of invasiveness. Also included are malignancies of the various organ systems, such as respiratory, cardiovascular, renal, reproductive, hematological, neurological, hepatic, gastrointestinal, and endocrine systems; as well as adenocarcinomas which include malignancies such as most colon cancers, renal-cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular tumors, non-small cell carcinoma of the lung, and cancer of the small intestine. Cancer that is “naturally arising” includes any cancer that is not experimentally induced by implantation of cancer cells into a subject, and includes, for example, spontaneously arising cancer, cancer caused by exposure of a patient to a carcinogen (s) , cancer resulting from insertion of a transgenic oncogene or knockout of a tumor suppressor gene, and cancer caused by infections, e.g., viral infections. The term “carcinoma” is art recognized and refers to malignancies of epithelial or endocrine tissues. The term also includes carcinosarcomas, which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. An “adenocarcinoma” refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which the tumor cells form recognizable glandular structures. The term “sarcoma” is art recognized and refers to malignant tumors of mesenchymal derivation. The term “hematopoietic neoplastic disorders” includes diseases involving hyperplastic / neoplastic cells of hematopoietic origin. A hematopoietic neoplastic disorder can arise from myeloid, lymphoid or erythroid lineages, or precursor cells thereof. A hematologic cancer is a cancer that begins in blood-forming tissue, such as the bone marrow, or in the cells of the immune system. Examples of hematologic cancer include e.g., leukemia, lymphoma, and multiple myeloma etc.

[0040] As used herein, the term “tumor” is used interchangeably with the term “cancer” herein, e.g., both terms encompass solid and liquid, e.g., diffuse or circulating, tumors. As used herein, the term “cancer” or “tumor” includes premalignant, as well as malignant cancers and tumors.

[0041] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present invention is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated in the present disclosure. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[0042] As used herein, the terms “polypeptide, ” “peptide, ” and “protein” are used interchangeably to refer to polymers of amino acids of any length of at least two amino acids.

[0043] As used herein, the terms “polynucleotide, ” “nucleic acid molecule, ” and “nucleic acid sequence” are used interchangeably herein to refer to polymers of nucleotides of any length of at least two nucleotides, and include, without limitation, DNA, RNA, DNA / RNA hybrids, and modifications thereof.

[0044] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Methods and materials are described herein for use in the present invention; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0045] Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0046] FIGS. 1A-1B show ELISA binding curves of IL2Rβ_wt, IL2Rβ_mt01, IL2Rβ_mt02, IL2Rβ_mt03, or IL2Rβ_mt04 with serially diluted His-sushi-IL15_wt at pH 7.5 (FIG. 1A) or pH 6.0 (FIG. 1B) .

[0047] FIGS. 1C-1D show ELISA binding curves of IL2Rβ_wt, IL2Rβ_mt05, IL2Rβ_mt06, IL2Rβ_mt07, or IL2Rβ_mt08 with serially diluted His-sushi-IL15_wt at pH 7.5 (FIG. 1C) or pH 6.0 (FIG. 1D) .

[0048] FIGS. 1E-1F show ELISA binding curves of IL2Rβ_wt, IL2Rβ_mt09, IL2Rβ_mt10, IL2Rβ_mt11, or IL2Rβ_mt12 with serially diluted His-sushi-IL15_wt at pH 7.5 (FIG. 1E) or pH 6.0 (FIG. 1F) .

[0049] FIGS. 1G-1H show ELISA binding curves of IL2Rβ_wt, IL2Rβ_mt13, IL2Rβ_mt14, IL2Rβ_mt15, or IL2Rβ_mt16 with serially diluted His-sushi-IL15_wt at pH 7.5 (FIG. 1G) or pH 6.0 (FIG. 1H) .

[0050] FIG. 2A shows ELISA binding curves of IL2Rβ_wt or IL2Rβ_mt01 with serially diluted His-sushi-IL15_wt at pH 7.5 or pH 6.0. EC50 values of the ELISA binding curves are provided.

[0051] FIG. 2B shows ELISA binding curves of IL2Rβ_wt or IL2Rβ_mt05 with serially diluted His-sushi-IL15_wt at pH 7.5 or pH 6.0. EC50 values of the ELISA binding curves are provided.

[0052] FIG. 2C shows ELISA binding curves of IL2Rβ_wt or IL2Rβ_mt10with serially diluted His-sushi-IL15_wt at pH 7.5 or pH 6.0. EC50 values of the ELISA binding curves are provided.

[0053] FIG. 2D shows ELISA binding curves of IL2Rβ_wt or IL2Rβ_mt12 with serially diluted His-sushi-IL15_wt at pH 7.5 or pH 6.0. EC50 values of the ELISA binding curves are provided.

[0054] FIG. 2E shows ELISA binding curves of IL2Rβ_wt or IL2Rβ_mt15 with serially diluted His-sushi-IL15_wt at pH 7.5 or pH 6.0. EC50 values of the ELISA binding curves are provided.

[0055] FIG. 3 shows a schematic structure of an exemplary Shielded Designer Immuno-Cytokine (SDIC) .

[0056] FIG. 4 is a table that lists amino acid sequences of IL2Rβ_wt and its variants.

[0057] FIG. 5 lists amino acid sequences discussed in the disclosure.DETAILED DESCRIPTION

[0058] Interleukin 15 (also known as IL-15 or IL15) plays an important role in innate and adaptive immunity. It is a four-helix bundle cytokine, and was discovered in 1994. It was described as a T cell proliferation factor which shared IL-2 receptor β subunit with IL-2. IL-15 is a pleiotropic cytokine, constitutively expressed by many type of cells such as macrophages, monocytes, dendritic cells (DCs) , T cells, as well as epithelial cells, fibroblasts, keratinocytes, and nerve cells. However, IL-15 is mainly produced by macrophages, monocytes and DCs.

[0059] IL-15 is especially involved in lymphocyte and NK cell functioning and homeostasis. IL-15 signals through a heterotrimeric receptor which consist of three subunits, the IL-15 receptor α (IL15Rα or CD215) specific subunit, IL2 / IL-15 receptor β subunit (IL2Rβ or IL15Rβ) , and γc (CD132) subunit, a common chain for other cytokines such as IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, and IL-21. After activation, myeloid cells produce IL-15 as a membrane-bound heterodimer complexed with IL15Rα, and it is dominantly trans-presented to the cells expressing the dimeric IL2Rβ / γc receptor. IL-15 signaling requires Janus kinases (Jak) -1 and Jak-3 to phosphorylate and activate the signal transducer and activator of transcription (STAT) 3 and STAT5. Furthermore, IL-15 stimulates both the phosphatidylinositol 3-kinase / protein kinase B (PI3K / AKT) and RAS / mitogen-activated protein kinase (RAS / MAPK) pathways. IL-15 acts on many cells of the immune system, being able to increase proliferation of B cells and secretion of immunoglobulins, and is critical for the ontogeny of NK and CD8+ T cells, inducing cell activation, proliferation, cytolytic activity and the production of cytokines such as interferon-γ (IFN-γ) by these cells. Although IL-2 and IL-15 present many similar functions on lymphocytes, there are some differences. IL-15 does not exert significant effects on regulatory T cells (Tregs) , a subset of cells that inhibit antitumor immunity and promote tumor development and progression; and by acting as a survival factor of CD8 memory T cells, it plays an important role in supporting the long-term maintenance, high-avidity T cell responses to malignant cells.

[0060] A detailed description of IL-15, IL2Rβ, and their functions can be found, e.g., in Isvoranu, G., et al. "Therapeutic potential of interleukin‐15 in cancer. " Experimental and Therapeutic Medicine 22.1 (2021) : 1-6; and Cai, M., et al. "Research progress of interleukin-15 in cancer immunotherapy. " Frontiers in Pharmacology 14 (2023) : 1184703; each of which is incorporated by reference in its entirety.

[0061] The present disclosure provides engineered IL2Rβ variants having one or more non-native histidine residues. In some embodiments, one or two amino acid residues in a wildtype human IL2Rβ extracellular region are selectively mutated to histidine (s) . In some embodiments, the mutations do not substantially change the overall structure of IL2Rβ or its extracellular region. In some embodiments, the histidine mutations can maintain IL2Rβ’s stable binding with IL-15 at a neutral pH (e.g., any of the neutral pH described herein) , thereby completely or partially shielding IL-15 from activating immune cells prematurely. On the other hand, the histidine mutations can reduce IL2Rβ’s binding with IL-15 at an acidic pH (e.g., any of the acidic pH described herein) , thereby enabling IL-15 to activate immune cells within tumor microenvironment (low pH condition) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ variants described herein can bind to IL-15 alone, or together with IL15Rαand common-γ chain receptor (CD132) to form the IL15Rα / IL2Rβ / γc complex, and induce downstream signaling pathways, and / or proliferation and activation immune cell (e.g., CD8+T cell or NK cell) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ variants comprise or consist of any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein.

[0062] Also provided herein are protein constructs that comprise the engineered IL2Rβvariants described herein. In some embodiments, the protein constructs further comprise a targeting moiety that specifically binds to a tumor-associated antigen (TAA) . In some embodiments, the protein constructs can be recruited to tumor microenvironment (with a high expression of the tumor-associated antigen) , and release IL-15 to activate immune cells in a pH-dependent manner.

[0063] The disclosure also provides methods of screening cytokine receptor (e.g., IL2Rβ) variants having a comparable or high binding affinity to a corresponding cytokine (e.g., IL-15) at a neutral pH and a low binding affinity to the corresponding cytokine (e.g., IL-15) at an acidic pH.

[0064] Engineered IL2Rβ variants

[0065] Human IL2Rβ (SEQ ID NO: 18) includes, from N-terminus to C-terminus, a signal peptide, an extracellular region, a transmembrane region, and a cytoplasmic region. According to the UniProt Database (UniProt ID: P14784) , the signal peptide of human IL2Rβ corresponds to amino acids 1-26 of SEQ ID NO: 18, the extracellular region of human IL2Rβ corresponds to amino acids 27-240 of SEQ ID NO: 18, the transmembrane region of human IL2Rβ corresponds to amino acids 241-265 of SEQ ID NO: 18, and the cytoplasmic region of human IL2Rβ corresponds to amino acids 266-551 of SEQ ID NO: 18.

[0066] Based on the 3D structure of human IL2Rβ, distance of the Calpha atoms of one or more amino acid residues (e.g., those in close proximity) in the 3D structure can be determined. Selected residue (s) within human IL2Rβ extracellular region can be mutated to histidine residue (s) , without substantially interfering the overall structure of IL2Rβ. It is contemplated that the newly introduced histidine residue (s) do not cause structural hindrance for IL-15 binding at a physiological pH. However, these residue (s) can cause charge repulsion at a lower pH to reduce IL-15 binding due to the protonation of histidine mutation at these selected positions.

[0067] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt01) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 12 (e.g., Y12) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt01 is set forth in SEQ ID NO: 2.

[0068] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt02) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 15 (e.g., R15) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt02 is set forth in SEQ ID NO: 3.

[0069] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt03) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 41 (e.g., R41) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt03 is set forth in SEQ ID NO: 4.

[0070] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt04) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 42 (e.g., R42) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt04 is set forth in SEQ ID NO: 5.

[0071] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt05) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 70 (e.g., Q70) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt05 is set forth in SEQ ID NO: 6.

[0072] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt06) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 71 (e.g., K71) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt06 is set forth in SEQ ID NO: 7.

[0073] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt07) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 72 (e.g., L72) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt07 is set forth in SEQ ID NO: 8.

[0074] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt08) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 73 (e.g., T73) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt08 is set forth in SEQ ID NO: 9.

[0075] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt09) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 74 (e.g., T74) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt09 is set forth in SEQ ID NO: 10.

[0076] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt10) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 75 (e.g., V75) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt10 is set forth in SEQ ID NO: 11.

[0077] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt11) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 98 (e.g., F98) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt11 is set forth in SEQ ID NO: 12.

[0078] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt12) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 101 (e.g., F101) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt12 is set forth in SEQ ID NO: 13.

[0079] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt13) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 102 (e.g., E102) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt13 is set forth in SEQ ID NO: 14.

[0080] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt14) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 134 (e.g., Y134) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt14 is set forth in SEQ ID NO: 15.

[0081] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt15) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 135 (e.g., F135) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt15 is set forth in SEQ ID NO: 16.

[0082] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., IL2Rβ_mt16) , which includes a histidine residue at a position corresponding to position 188 (e.g., Q188) of IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . The sequence of IL2Rβ_mt16 is set forth in SEQ ID NO: 17.

[0083] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide comprising or consisting of the extracellular region of human IL2Rβ, or amino acids 27-240 of human IL2Rβ (SEQ ID NO: 18) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide comprises or consists of a sequence corresponding to amino acids 27-240 of human IL2Rβ(SEQ ID NO: 18) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide contains one or more (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, or 16) non-native histidine residues, or histidine mutations.

[0084] In some embodiments, provided herein is an engineered IL2Rβ polypeptide comprising one or more (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, or 16) of the following: (a) the amino acid that corresponds to Y12 of SEQ ID NO: 1 is H; (b) the amino acid that corresponds to R15 of SEQ ID NO: 1 is H; (c) the amino acid that corresponds to R41 of SEQ ID NO: 1 is H; (d) the amino acid that corresponds to R42 of SEQ ID NO: 1 is H; (e) the amino acid that corresponds to Q70 of SEQ ID NO: 1 is H; (f) the amino acid that corresponds to K71 of SEQ ID NO: 1 is H; (g) the amino acid that corresponds to L72 of SEQ ID NO: 1 is H; (h) the amino acid that corresponds to T73 of SEQ ID NO: 1 is H; (i) the amino acid that corresponds to T74 of SEQ ID NO: 1 is H; (j) the amino acid that corresponds to V75 of SEQ ID NO: 1 is H; (k) the amino acid that corresponds to F98 of SEQ ID NO: 1 is H; (l) the amino acid that corresponds to F101 of SEQ ID NO: 1 is H; (m) the amino acid that corresponds to E102 of SEQ ID NO: 1 is H; (n) the amino acid that corresponds to Y134 of SEQ ID NO: 1 is H; (o) the amino acid that corresponds to F135 of SEQ ID NO: 1 is H; and (p) the amino acid that corresponds to Q188 of SEQ ID NO: 1 is H.

[0085] In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, or 17. In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide described herein comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 1 or 18, wherein the amino acid sequence comprises one or more (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, or 16) of the histidine mutations described herein.

[0086] In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide can have at least or about 1 (e.g., at least or about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40) amino acid insertions, deletions, or substitutions as compared to any one of SEQ ID NOs: 1-17.

[0087] In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide does not include the signal peptide of human IL2Rβ (e.g., amino acids 1-26 of human IL2Rβ (SEQ ID NO: 18) ) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide includes all or part of the signal peptide of human IL2Rβ (e.g., amino acids 1-26 of human IL2Rβ (SEQ ID NO: 18) ) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide does not include the transmembrane region of human IL2Rβ (e.g., amino acids 241-265 of human IL2Rβ (SEQ ID NO: 18) ) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide includes all or part (e.g., at least 1, 2, 3, or 4 amino acid residues) of the transmembrane region of human IL2Rβ (e.g., amino acids 241-265 of human IL2Rβ (SEQ ID NO: 18) ) . In some embodiments, the engineered IL2Rβpolypeptide does not include the cytoplasmic region of human IL2Rβ (e.g., amino acids 266-551 of human IL2Rβ (SEQ ID NO: 18) ) . In some embodiments, the engineered IL2Rβpolypeptide includes all or part of the cytoplasmic region of human IL2Rβ (e.g., amino acids 266-551 of human IL2Rβ (SEQ ID NO: 18) ) .

[0088] The engineered IL2Rβ polypeptide can have additional modifications. In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide can have a CH2 domain and / or a CH3 domain of Fc. In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide can be linked to the N-terminus of the CH2 domain (e.g., through an optional hinge region or a GS linker) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide can be linked to the C-terminus of the CH3 domain (e.g., through an optional GS linker) . In some embodiments, the hinge region is an IgG hinge region (e.g., IgG1 hinge region) . In some embodiments, the CH2 domain is an IgG CH2 domain (e.g., IgG1 CH2 domain) . In some embodiments, the CH3 domain is an IgG CH3 domain (e.g., IgG1 CH3 domain) .

[0089] In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptides described herein can also include a tag (e.g., His-tag) to facilitate purification, screening and / or detection. In some embodiments, the tag is connected to the N-terminus or C-terminus of any engineered IL2Rβpolypeptides described herein. In some embodiments, the tag is a His-tag that includes at least 6, at least 7, or at least 8 contiguous His residues.

[0090] In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptides described herein can be expressed in Expi293 or CHO (e.g., CHO-S) cells. In some embodiments, the cells are Expi293FTM cells or ExpiCHO-STM cells

[0091] IL2Rβ protein constructs

[0092] The disclosure provides protein constructs comprising the engineered IL2Rβ variants described herein (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) . In some embodiments, the protein construct described herein is a fusion protein. In some embodiments, the protein construct described herein has two or more polypeptides.

[0093] In some embodiments, the protein construct described herein includes two identical polypeptides, and each polypeptide comprises, optionally from N-terminus to C-terminus, an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) , an optionally hinge region (e.g., a human IgG1 hinge region) , and an Fc region (e.g., a human IgG1 Fc region) . In some embodiments, the two polypeptides associate with each other, forming a dimer (e.g., a homodimer) .

[0094] In some embodiments, the protein construct described herein includes two polypeptides: a first polypeptide and a second polypeptide. In some embodiments, the first polypeptide includes, optionally from N-terminus to C-terminus, a first engineered IL2Rβpolypeptide (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) , an optionally first hinge region, and a first Fc region. In some embodiments, the second polypeptide includes, optionally from N-terminus to C-terminus, an optional second hinge region, and a second Fc region. In some embodiments, the first polypeptide and the second polypeptide associate with each other, forming a dimer (e.g., a heterodimer) . In some embodiments, the second polypeptide further includes a second engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) . In some embodiments, the first engineered IL2Rβ polypeptide and the second engineered IL2Rβ polypeptide are identical. In some embodiments, the first engineered IL2Rβ polypeptide are different. In some embodiments, the first and / or second hinge regions, and the first and / or second Fc regions are derived from human IgG (e.g., human IgG1) .

[0095] In some embodiments, the second polypeptide further includes an IL2Rβ ligand (e.g., any of the IL2Rβ ligands described herein) . In some embodiments, in the first polypeptide, the engineered IL2Rβ polypeptide is linked to the first Fc region (e.g., N-terminus of the CH2 domain of the first Fc region, optionally through the first hinge region and / or a linker peptide) . In some embodiments, in the second polypeptide, the IL2Rβ ligand is linked to the second Fc region (e.g., N-terminus of the CH2 domain of the second Fc region, optionally through the second hinge region and / or a linker peptide) . In some embodiments, in the first polypeptide, the engineered IL2Rβ polypeptide is linked to the first Fc region (e.g., C-terminus of the CH3 domain of the first Fc region, optionally through a linker peptide) . In some embodiments, in the second polypeptide, the IL2Rβ ligand is linked to the second Fc region (e.g., C-terminus of the CH3 domain of the second Fc region, optionally through a linker peptide) . The linker peptide can be any of the linkers described herein (e.g., a flexible linker) .

[0096] In some embodiments, the protein construct described herein includes an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) and an IL2Rβ ligand (e.g., any of the IL2Rβ ligand described herein) .

[0097] In some embodiments, the disclosure is related to a protein construct comprising the engineered IL2Rβ polypeptide described herein. In some embodiments, the protein construct comprises two or more engineered IL2Rβ polypeptides. In some embodiments, at least two of the engineered IL2Rβ polypeptides are identical. In some embodiments, at least two of the engineered IL2Rβ polypeptides are different. In some embodiments, the protein construct further comprises an Fc region. In some embodiments, the Fc region is an IgG1 Fc region. In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide is linked to the N-terminus of the Fc region. In some embodiments, the engineered IL2Rβ polypeptide is linked to the N-terminus of the Fc region via a linker peptide (e.g., any of the linkers described herein) . In some embodiments, the Fc region described herein is a polypeptide comprising or consisting of a CH2 domain and a CH3 domain.

[0098] In some embodiments, the protein construct described herein further comprises a fragment crystallizable region (Fc) . In some embodiments, the Fc described herein comprises or consists of two CH2 domains and two CH3 domains of human IgG. In some embodiments, the engineered IL2Rβ variant (e.g., any of the engineered IL2Rβ variants described herein) is linked to the N-terminus of the Fc (e.g., linked to the N-terminus of one of the two CH2 domains) or C-terminus of the Fc (e.g., linked to the C-terminus of one of the two CH3 domains) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ variant is linked to the Fc via a linker peptide (e.g., any of the linkers described herein) .

[0099] In some embodiments, the protein construct described herein has an N-terminal His-tag. In some embodiments, the protein construct described herein has a C-terminal His-tag. In some embodiments, the His-tag includes at least 6, at least 7, or at least 8 contiguous His residues. In some embodiments, provided herein are protein constructs that include, from N-terminus to C-terminus, a His-tag (e.g., any of the His-tags described herein) , and an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) . In some embodiments, provided herein are protein constructs that include, from N-terminus to C-terminus, an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., any of the engineered IL2Rβpolypeptides described herein) , and a His-tag (e.g., any of the His-tags described herein) .

[0100] In some embodiments, the protein construct described herein further includes a targeting moiety (e.g., a tumor-targeting moiety) . In some embodiments, the protein construct can be expressed in Expi293 or CHO-Scells. In some embodiments, the targeting moiety is fused to the engineered IL2Rβ polypeptide. In some embodiments, the targeting moiety is fused to the engineered IL2Rβ polypeptide via a linker peptide (e.g., a flexible linker) . In some embodiments, the targeting moiety is linked to the N-terminus of the engineered IL2Rβpolypeptide via a linker peptide. In some embodiments, the targeting moiety is linked to the C-terminus of the engineered IL2Rβ polypeptide via a linker peptide. In some embodiments, the targeting moiety is connected to at least one polypeptide of a protein construct described herein (e.g., any of the protein constructs having two polypeptides) . In some embodiments, the targeting moiety is connect to the N-terminus to the C-terminus of the at least one polypeptide, optionally via a linker peptide. In some embodiments, the linker peptide is a flexible linker (e.g., a GS linker) . Details of flexible linkers can be found, e.g., Chen, X., et al."Fusion protein linkers: property, design and functionality. " Advanced Drug Delivery Reviews 65.10 (2013) : 1357-1369, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0101] In some embodiments, the protein constructs described herein can be expressed in Expi293 or CHO (e.g., CHO-S) cells. In some embodiments, the cells are Expi293FTM cells or ExpiCHO-STM cells

[0102] As used herein, the term “targeting moiety” refers to as used herein refers to any molecule or binding portion thereof (e.g., an immunoglobulin or an antigen binding fragment, a small molecule, or a receptor or a portion thereof) that can bind to a cell surface or extracellular matrix molecule at a site to which an engineered IL2Rβ polypeptide or protein construct thereof of the disclosure is to be localized, for example on tumor cells in the tumor microenvironment. The targeting moiety can also have a functional activity in addition to localizing an engineered IL2Rβ polypeptide or protein construct thereof to a particular site. For example, a targeting moiety that is an anti-PD1 antibody or an antigen binding portion thereof can also exhibit anti-tumor activity or enhance the anti-tumor activity of IL-15 by inhibiting PD1 signaling.

[0103] In some embodiments, the targeting moiety can be any type of antibody or fragment thereof that retains specific binding to an antigenic determinant. In one embodiment the antigen binding moiety is a full-length antibody. In one embodiment the antigen binding moiety is an immunoglobulin molecule, particularly an IgG class immunoglobulin molecule, more particularly an IgG1 or IgG4 immunoglobulin molecule. Antibody fragments include, but are not limited to, VH (or VH) fragments, VL (or VL) fragments, Fab fragments, F (ab’ ) 2 fragments, scFv fragments, Fv fragments, minibodies, diabodies, triabodies, and tetrabodies.

[0104] In some embodiments, the targeting moiety described herein can specifically bind to a tumor-associated antigen (TAA) . The term “tumor-associated antigen” or “TAA” refers to a molecule (typically a protein, carbohydrate, lipid or some combination thereof) that is expressed on the surface of a cancer cell, either entirely or as a fragment (e.g., MHC / peptide) , and which is useful for the preferential targeting of a pharmacological agent to the cancer cell. In some embodiments, a TAA is a marker expressed by both normal cells and cancer cells, e.g., a lineage marker, e.g., CD19 on B cells. In some embodiments, a TAA is a cell surface molecule that is overexpressed in a cancer cell in comparison to a normal cell, for instance, 1-fold over expression, 2-fold overexpression, 3-fold overexpression or more in comparison to a normal cell. In some embodiments, a TAA is a cell surface molecule that is inappropriately synthesized in the cancer cell, for instance, a molecule that contains deletions, additions or mutations in comparison to the molecule expressed on a normal cell. In some embodiments, a TAA will be expressed exclusively on the cell surface of a cancer cell, entirely or as a fragment (e.g., MHC / peptide) , and not synthesized or expressed on the surface of a normal cell. Accordingly, the term “TAA” encompasses antigens that are specific to cancer cells, sometimes known in the art as tumor-specific antigens ( “TSAs” ) .

[0105] Exemplary tumor-associated antigens (TAA) include, but not limited to, Fibroblast Activation Protein (FAP) , the A1 domain of Tenascin-C (TNC A1) , the A2 domain of Tenascin-C (TNC A2) , the Extra Domain B of Fibronectin (EDB) , the Melanoma-associated Chondroitin Sulfate Proteoglycan (MCSP) , MART-1 / Melan-A, gp100, Dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) , adenosine deaminase-binding protein (ADAbp) , cyclophilin b, colorectal associated antigen (CRC) -C017-1A / GA733, Carcinoembryonic Antigen (CEA) and its immunogenic epitopes CAP-1 and CAP-2, etv6, aml1, Prostate Specific Antigen (PSA) and its immunogenic epitopes PSA-1, PSA-2, and PSA-3, prostate-specific membrane antigen (PSMA) , T-cell receptor / CD3-zeta chain, MAGE-family of tumor antigens (e.g., MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2) , MAGE-Xp3 (MAGE-B3) , MAGE-Xp4 (MAGE-B4) , MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-05) , GAGE-family of tumor antigens (e.g., GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9) , BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tyrosinase, p53, MUC family, HER2 / neu, p21ras, RCAS1, α-fetoprotein, E-cadherin, α-catenin, β-catenin and γ-catenin, p120ctn, gp100 Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, adenomatous polyposis coli protein (APC) , fodrin, Connexin 37, Ig-idiotype, p15, gp75, GM2 and GD2 gangliosides, viral products such as human papilloma virus proteins, Smad family of tumor antigens, Imp-1, PIA, EBV-encoded nuclear antigen (EBNA) -1, brain glycogen phosphorylase, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40) , SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 and CT-7, c-erbB-2, Her2, EGFR, IGF-1R, CD2 (T-cell surface antigen) , CD3 (heteromultimer associated with the TCR) , CD22 (B-cell receptor) , CD23 (low affinity IgE receptor) , CD30 (cytokine receptor) , CD33 (myeloid cell surface antigen) , CD40 (tumor necrosis factor receptor) , IL-6R- (IL6 receptor) , CD20, MCSP, PDGFβR (β-platelet-derived growth factor receptor) , ErbB2 epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) , EGFR variant III (EGFRvIII) , CD19, disialoganglioside GD2, ductal-epithelial mucine, gp36, TAG-72, glioma-associated antigen, β-human chorionic gonadotropin, alphafetoprotein (AFP) , lectin-reactive AFP, thyroglobulin, MN-CA IX, human telomerase reverse transcriptase, RU1, RU2 (AS) , intestinal carboxyl esterase, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, prostase specific antigen (PSA) , PAP, LAGA-1a, p53, prostein, PSMA, surviving and telomerase, prostate-carcinoma tumor antigen-1 (PCTA-1) , ELF2M, neutrophil elastase, ephrin B2, insulin growth factor (IGF1) -I, IGF-II, IGFI receptor, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, tumor stromal antigens, the extra domain A (EDA) and extra domain B (EDB) of fibronectin and the A1 domain of tenascin-C (TnC A1) .

[0106] Non-limiting examples of viral antigens include an EBV antigen (e.g., Epstein-Barr virus LMP-1) , a hepatitis C virus antigen (e.g., hepatitis C virus E2 glycoprotein) , an HIV antigen (e.g., HIV gp160, and HIV gp120) ; a CMV antigen; a HPV-specific antigen, or an influenza virus antigen (e.g., influenza virus hemagglutinin) . Non-limiting examples of ECM antigens include syndecan, heparanase, integrins, osteopontin, link, cadherins, laminin, laminin type EGF, lectin, fibronectin, notch, tenascin, collagen and matrixin. Other TAAs are cell surface molecules of tumor or viral lymphocytes, for example T-cell co-stimulatory proteins such as CD27, CD28, 4-1BB (CD137) , OX40, CD30, CD40, ICOS, lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) , CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, and B7-H3. In particular embodiments, the TAAs are checkpoint inhibitors, for example CTLA-4, PD1, PDL1, PDL2, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2.

[0107] In some embodiments, the targeting moiety can bind to an immune checkpoint inhibitor. In some embodiments, the targeting moiety can bind to PD-1, PD-L1, PD-L2, SIRPα , OX40, CD47, LAG3, TIGIT, BTLA, CTLA-4, VISTA, IDO1 / IDO2, B7-H3, CD27, CD39, or CD73.

[0108] In some embodiments, the present disclosure is related to a protein construct having a schematic structure shown in FIG. 3, which is also named a Shielded Designer Immuno-Cytokine (SDIC) . In some embodiments, the “Anti-TAA” is any of the targeting moieties that can bind to a TAA (e.g., any of the TAAs described herein) . In some embodiments, the “protective lid” is any of the engineered cytokine binders described herein. In some embodiments, the “designer cytokine” is any of the wildtype cytokine or a functional variant thereof described herein.

[0109] In some embodiments, the protein construct described herein includes a first polypeptide and a second polypeptide. In some embodiments, the first polypeptide includes, optionally from N-terminus to C-terminus, one or more targeting moieties that can bind to a first antigen (e.g., any of the TAAs described herein) , an optional first hinge region, a first Fc region, and an engineered cytokine binder (e.g., any of the engineered cytokine binders described herein) . In some embodiments, the second polypeptide includes, optionally from N-terminus to C-terminus, one or more targeting moieties that can bind to a second antigen (e.g., any of the TAAs described herein) , an optional second hinge region, a second Fc region, and a wildtype cytokine or a functional variant thereof. In some embodiments, the first and second polypeptides can associate with each other, forming a dimer (e.g., a homodimer or a heterodimer) . In some embodiments, the first and second Fc regions include one or more mutations (e.g., knobs-into-holes mutations) to promote heterodimerization. In some embodiments, the first and second antigens are the same. In some embodiments, the first and second antigens are different. In some embodiments, the protein construct further includes a third polypeptide comprising one or more targeting moieties that can bind to a third antigen, and a fourth polypeptide comprising one or more targeting moieties that can bind to a fourth antigen. In some embodiments, the first, second, third, and / or fourth antigens are the same. In some embodiments, the first, second, third, and / or fourth antigens are different. In some embodiments, the third polypeptide can associate with the first polypeptide, forming a dimer (e.g., a homodimer or a heterodimer) . In some embodiments, the fourth polypeptide can associate with the second polypeptide, forming a dimer (e.g., a homodimer or a heterodimer) .

[0110] In some embodiments, the engineered cytokine binder described herein comprises the extracellular region of a cytokine receptor having one or more non-native histidine residues. In some embodiments, the cytokine receptor is a receptor of IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 , IL-9, IL-10, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35, or IL-36. In some embodiments, the cytokine receptor is a receptor of IL-2, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IFNα, GM-CSF, or FLT-3.

[0111] In some embodiments, the engineered cytokine binder is an antibody or antigen binding fragment thereof (e.g., scFv) . In some embodiments, the engineered cytokine binder is a single-chain variable fragment (scFv) . The scFv usually has one heavy chain variable domain, and one light chain variable domain. In some embodiments, the scFv has two heavy chain variable domains, and two light chain variable domains.

[0112] In some embodiments, the engineered cytokine binder is a single domain antibody. A single-domain antibody (sdAb) , also known as a nanobody, is an antibody fragment consisting of a single monomeric variable antibody domain. Like a whole antibody, it can bind selectively to a specific antigen. In some embodiments, the single-domain antibodies are engineered from heavy-chain antibodies found in camelids and are called VHH or VHH fragments.

[0113] In some embodiments, the engineered cytokine binder comprises or consists of a fusion protein, an enzyme, a soluble protein, a membrane protein, a structural protein, a regulatory protein, a receptor, an immunomodulatory protein, a heat shock protein, a functional fragment of any one of the proteins, an epitope fragment of any one of the proteins, or any combinations thereof.

[0114] As illustrated in FIG. 3, the protective lid can dynamically bind to the designer cytokine, thereby reducing the designer cytokine-induced immune response during systemic administration. In some embodiments, the protective lid can bind to the designer cytokine in a pH-dependent manner. For example, the protective lid can bind to the designer cytokine at a neutral pH, thereby reducing the designer cytokine-induced immune response during systemic administration; the protective lid can have a reduced binding affinity to the designer cytokine at an acidic pH, thereby exposing the designer cytokine in tumor microenvironment. In some embodiments, the protective lid can partially bind to the designer cytokine at an acidic pH, thereby reducing the toxicity of the designer cytokine in tumor microenvironment. In some embodiments, the protective lid is any of the engineered IL2Rβ variants described herein, and the designer cytokine is any of the IL2Rβ ligands described herein.

[0115] In some embodiments, the protective lid has a comparable or high binding affinity to the designer cytokine at a neutral pH and a low binding affinity to the designer cytokine at an acidic pH. As a result, the protective lid can shield the designer cytokine from inducing immune response prematurely during systemic administration, and release the designer cytokine to induce immune response within the tumor microenvironment. In some embodiments, the protective lid does not fully dissociate from the designer cytokine at an acidic pH, thereby partially exposing the designer cytokine within the tumor microenvironment. It is contemplated that the designer cytokine, when bound with the protective lid at an acidic pH, can exhibit an attenuated toxicity in tumor microenvironment, as compared to that when the designer cytokine is completely dissociated from the protective lid at the acidic pH. This is important for administering the protein construct having one or more targeting moieties (e.g., those that can bind to a TAA for tumor treatment) . For example, the attenuated toxicity of the designer cytokine allows the protein construct to be administered at a higher dose level without inducing undesired immune response by the designer cytokine.

[0116] The disclosure also provides a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising a sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any amino acid sequences disclosed herein.

[0117] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For example, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0118] The engineered IL2Rβ variants (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) and protein constructs can further comprises an Fc region of an antibody. These antibodies can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , class or subclass (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE1, IgE2) . In some embodiments, the Fc region is derived from human IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4) . In some embodiments, the Fc region is an IgG1 Fc region (e.g., human IgG1 Fc region) .

[0119] In some embodiments, the engineered IL2Rβ variant is linked to the Fc region through an antibody hinge region (e.g., IgG, IgE hinge region) . In addition, the Fc region can be modified to provide desired effector functions or serum half-life.

[0120] In some embodiments, the protein constructs as described herein include a functional Fc region. In some embodiments, the Fc region is human IgG1, human IgG2, human IgG3, or human IgG4. In some embodiments, effector function of a functional Fc region is antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) . In some embodiments, effector function of a functional Fc region is phagocytosis. In some embodiments, effector function of a functional Fc region is ADCC and phagocytosis. In some embodiments, the protein constructs as described herein have an Fc region without effector function. In some embodiments, the Fc is a human IgG4 Fc. In some embodiments, the Fc does not have a functional Fc region. For example, the Fc region has LALA mutations (L234A and L235A mutations in EU numbering) , or LALA-PG mutations (L234A, L235A, P329G mutations in EU numbering) .

[0121] Some other modifications to the Fc region can be made. For example, a cysteine residue (s) can be introduced into the Fc region, thereby allowing interchain disulfide bond formation in this region. The homodimeric fusion protein thus generated may have any increased half-life in vitro and / or in vivo. In some embodiments, the IgG4 has S228P mutation (EU numbering) . The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange.

[0122] In some embodiments, Fc regions are provided having a carbohydrate structure that lacks fucose attached (directly or indirectly) to an Fc region. For example, the amount of fucose in such Fc region composition may be from 1%to 80%, from 1%to 65%, from 5%to 65%or from 20%to 40%. The amount of fucose is determined by calculating the average amount of fucose within the sugar chain at Asn297, relative to the sum of all glycostructures attached to Asn297 (e.g. complex, hybrid and high mannose structures) as measured by MALDI-TOF mass spectrometry, as described in WO 2008 / 077546, for example. Asn297 refers to the asparagine residue located at about position 297 in the Fc region (EU numbering of Fc region residues; or position 314 in Kabat numbering) ; however, Asn297 may also be located about ±3 amino acids upstream or downstream of position 297, i.e., between positions 294 and 300, due to minor sequence variations in Fc region sequences. Such fucosylation variants may have improved ADCC function. In some embodiments, to reduce glycan heterogeneity, the Fc region can be further engineered to replace the Asparagine at position 297 with Alanine (N297A) .

[0123] In some embodiments, knobs-into-holes (KIH) can be added to the Fc region. It involves engineering CH3 domains to create either a “knob” or a “hole” in each heavy chain to promote heterodimerization. The KIH technique is described e.g., in Xu, Yiren, et al. "Production of bispecific antibodies in ‘knobs-into-holes’ using a cell-free expression system. " MAbs. Vol. 7. No. 1. Taylor &Francis, 2015, which is incorporated by reference in its entirety. In some embodiments, one heavy chain has a T366W, and / or S354C (knob) substitution (EU numbering) , and the other heavy chain has an Y349C, T366S, L368A, and / or Y407V (hole) substitution (EU numbering) . In some embodiments, one heavy chain has one or more of the following substitutions Y349C and T366W (EU numbering) . The other heavy chain can have one or more the following substitutions E356C, T366S, L368A, and Y407V (EU numbering) .

[0124] IL2Rβ ligands

[0125] In some embodiments, the engineered IL2Rβ variants (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) or protein constructs thereof (e.g., any of the protein constructs described herein) can bind to an IL2Rβ ligand. In some embodiments, the IL2Rβligand comprises or consists all or part of a IL-15 protein (e.g., a human IL-15 protein) . In some embodiments, the IL-15 protein is a wildtype IL-15 protein. In some embodiments, the IL-15 protein contains one or more mutations.

[0126] In some embodiments, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof can bind with an IL2Rβ ligand at a neutral pH (e.g., any of the neutral pHs described herein) , thereby shielding the IL2Rβ ligand from activating immune cells prematurely. At an acidic pH (e.g., any of the acidic pHs described herein) , the binding activity of the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof with the IL2Rβ ligand is reduced, therefore enabling the IL2Rβ ligand to activate immune cells within the tumor microenvironment (which usually has an acidic pH) .

[0127] In some embodiments, the IL2Rβ ligand described herein is IL-15 (e.g., human IL-15) or a functional variant thereof.

[0128] IL-15 is 14-15 kDa glycoprotein encoded by the 34 kb region of chromosome 4q31 in humans, and at the central region of chromosome 8 in mice. The human IL-15 gene comprises nine exons and eight introns, four of which (exons 5 through 8) code for the mature protein. Human IL-15 (SEQ ID NO: 20; NP_000576.1) includes, from N-terminus to C-terminus, a signal peptide, a propeptide, and a soluble chain. According to the UniProt Database (UniProt ID: P40933) , the signal peptide of human IL-15 corresponds to amino acids 1-29 of SEQ ID NO: 20, the propeptide of human IL-15 corresponds to amino acids 30-48 of SEQ ID NO: 20, and the soluble chain of human IL-15 corresponds to amino acids 49-162 of SEQ ID NO: 20. The soluble chain of human IL-15 is also shown as SEQ ID NO: 26.

[0129] In some embodiments, the IL2Rβ ligand includes an amino acid sequence that corresponds to the soluble chain of human IL-15 (without signal peptide and propeptide) . In some embodiments, the soluble chain of human IL-15 described herein comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 26.

[0130] In some embodiments, the protein construct further includes a tag (e.g., a His-tag) that is fused to the engineered IL-15 variant, e.g., to facilitate screening and / or detection. In some embodiments, the His tag comprises or consists of at least 6, at least 7, or at least 8 contiguous histidine residues. In some embodiments, the His tag has a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the tag (e.g., the His-tag) is connected to the N-terminus or C-terminus of any engineered IL-15 variants described herein.

[0131] In some embodiments, the IL2Rβ ligand further includes a sushi domain of interleukin 15 receptor, alpha subunit (IL15Rα) . The IL-15 receptor is composed of three subunits: IL15Rα, CD122, and CD132. Two of these subunits, CD122 and CD132, are shared with the receptor for IL-2, but IL-2 receptor has an additional subunit (CD25) . The shared subunits contain the cytoplasmic motifs required for signal transduction, and this forms the basis of many overlapping biological activities of IL15 and IL2, although in vivo the two cytokines have separate biological effects. IL-15Rα specifically binds IL15 with very high affinity, and is capable of binding IL-15 independently of other subunits.

[0132] According to the UniProt Database (UniProt ID: Q13261) , human IL15Rα (SEQ ID NO: 23, NP_002180.1) is a 267 amino acid having a signal peptide that corresponds to amino acids 1-30 of SEQ ID NO: 23, an extracellular region that corresponds to amino acids 31-205 of SEQ ID NO: 23, a transmembrane region that corresponds to amino acids 206-228 of SEQ ID NO: 23, and a cytoplasmic region that corresponds to amino acids 229-267 of SEQ ID NO: 23. In particular, the sushi domain corresponds to amino acids 31-95 of SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the sushi domain described herein contains at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 additional amino acid residues in the extracellular region of human IL15Rα. In some embodiments, the additional amino acid residues correspond to any one or more of amino acids 96-107 of SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the sushi domain described herein comprises or consists of amino acids 31-107 of SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the sushi domain has a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 22. Details of the sushi domain can be found, e.g., in Orchardson, M., et al. "The Sushi domain of soluble IL-15 receptor alpha is essential for binding IL-15 and inhibiting inflammatory and allogenic responses in vitro and in vivo. " The Journal of Immunology 167.1 (2001) : 277-82, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0133] In some embodiments, the IL2Rβ ligand described herein comprises or consists of, optionally from N-terminus to C-terminus, a His-tag (e.g., any of the His-tags described herein) , a sushi domain of IL15Rα (e.g., any of the IL15Rα sushi domains described herein) , IL-15 or a functional variant thereof (e.g., any of the IL-15 or its functional variants thereof described herein) . In some embodiments, the sushi domain and the IL-15 or its functional variant thereof are connected via a linker peptide. In some embodiments, the linker peptide has a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the IL2Rβ ligand described herein comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 19.

[0134] In some embodiments, the linker peptide described herein includes an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 100%identical to one or more (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8) repeats of GGGGS (SEQ ID NO: 25) . In some embodiments, the linker peptide is a GS linker. As used herein, the term “GS linker” refers to a linker having sequences comprising primarily of glycine and serine residues. In some embodiments, the GS linker consists of glycine and serine residues. In some embodiments, the linker peptide is a flexible linker. Details of flexible linkers can be found, e.g., Chen, X., et al. "Fusion protein linkers: property, design and functionality. " Advanced Drug Delivery Reviews 65.10 (2013) : 1357-1369, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0135] In some embodiments, the IL2Rβ ligand is an engineered IL-15 polypeptide comprising one or more non-native disulfide bonds. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises at least two cysteine mutations.

[0136] Characterization of the engineered IL2Rβ variants or protein constructs

[0137] In some embodiments, the binding activity of the engineered IL2Rβ variants (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) or protein constructs thereof described herein is determined, e.g., by ELISA.

[0138] In some embodiments, an engineered IL2Rβ variant (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) can bind to an IL2Rβ ligand (e.g., any of the IL2Rβligands described herein) with a binding affinity that is at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 100% (or less than 80%, less than 75%, less than 70%, less than 65%, less than 60%, less than 55%, less than 50%, less than 45%, less than 40%, less than 35%, less than 30%, less than 25%, or less than 20%) as compared to that of a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof at a neutral pH (e.g., any of the neutral pH described herein) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ variant can bind to the IL2Rβ ligand with a binding affinity that is less than 80%, less than 75%, less than 70%, less than 65%, less than 60%, less than 55%, less than 50%, less than 45%, less than 40%, less than 35%, less than 30%, less than 25%, or less than 20%as compared to that of the wildtype IL2Rβ or the fragment thereof at an acidic pH (e.g., any of the acidic pH described herein) .

[0139] In some embodiments, the wildtype IL2Rβ or the fragment thereof described herein includes the extracellular domain of a wildtype IL2Rβ protein, e.g., amino acids 27-240 of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the wildtype IL2Rβ or the fragment thereof comprises an amino acid sequence that is at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 1.

[0140] In some embodiments, a protein construct (e.g., any of protein constructs described herein) can bind to an IL2Rβ ligand (e.g., any of the IL2Rβ ligands described herein) with a binding affinity that is at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 100% (or less than 80%, less than 75%, less than 70%, less than 65%, less than 60%, less than 55%, less than 50%, less than 45%, less than 40%, less than 35%, less than 30%, less than 25%, or less than 20%) as compared to that of a control protein construct at a neutral pH (e.g., any of the neutral pH described herein) . In some embodiments, the protein construct can bind to the IL2Rβ ligand with a binding affinity that is less than 80%, less than 75%, less than 70%, less than 65%, less than 60%, less than 55%, less than 50%, less than 45%, less than 40%, less than 35%, less than 30%, less than 25%, or less than 20%as compared to that of the control protein construct at an acidic pH (e.g., any of the acidic pH described herein) .

[0141] In some embodiments, the protein construct described herein has two identical polypeptides, and each polypeptide comprises, optionally from N-terminus to C-terminus, an engineered IL2Rβ polypeptide (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) , an optionally hinge region (e.g., a human IgG1 hinge region) , and an Fc region (e.g., a human IgG1 Fc region) . In some embodiments, the control protein construct described herein has two identical polypeptides, and each polypeptide comprises, optionally from N-terminus to C-terminus, the extracellular domain of a wildtype human IL2Rβ protein, an optional hinge region, and an Fc region.

[0142] In some embodiments, the binding affinity described herein is determined using any of the methods described herein, e.g., any of the ELISA binding assays described herein. For example, the binding affinity can be evaluated based on EC50 (half maximal effective concentration) of each engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof, relative to the EC50 of a control molecule (e.g., a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof; or a control protein construct) . The value of EC50 of a particular engineered IL2Rβ variant or protein construct thereof is typically negatively correlated with its binding affinity. A small EC50 indicates a strong binding affinity. In some embodiments, RBE (relative binding efficacy) can be deduced from the EC50 by comparing the EC50 to the EC50 of a reference protein construct. The value of RBE of a particular engineered IL2Rβ variant or protein construct thereof is positively correlated with its binding affinity.

[0143] In some embodiments, the newly introduced non-native histidine residue (s) can reduce the IL2Rβ ligand-binding ability of the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof at an acidic pH, without causing substantial conformational changes of the protein structure. In some embodiments, the residues critical for IL-15 or common cytokine γchain (γc) binding are unmutated, and the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof can induce downstream signaling pathways, e.g., inducing the growth, mobilization and / or activation of immune cells such as natural killer (NK) cells, CD8+ T cells, γδ T cells and natural killer T (NKT) cells. In some embodiments, introduction of the non-native histidine residues (e.g., any of the histidine mutations described herein) can lead to protein conformational change with a RMSD (root-mean-square deviation of atomic positions) value of less than less than less than less than less than less than less than less than less than or less than In some embodiments, the RMSD value is calculated by structurally align the wild-type protein and the protein variants. In some embodiments, only Calpha atoms are used for determining the conformational change.

[0144] In some embodiments, the one or more histidine mutations described herein do not substantially interfere the overall structure of the IL2Rβ variant. In some cases, the introduced histidine residues do not exhibit any spatial clashes with the un-mutated residues. In some cases, a skilled person in the art may perform a simulation of the mutated histidine structure in silico, and determine the associated conformational changes. In some embodiments, the associated conformational change is minimal, e.g., with a RMSD value that is considered insignificant by a skilled person in the art.

[0145] In some embodiments, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof as described herein can increase immune response, activity or number of immune cells (e.g., T cells or NK cells) within tumor microenvironment by at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 folds, 3 folds, 5 folds, 10 folds, or 20 folds.

[0146] In some implementations, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof can bind to an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) , with a dissociation rate (koff) of less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, or less than 0.001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, or greater than 0.0001 s-1.

[0147] In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 × 102 / Ms, greater than 1 × 103 / Ms, greater than 1 × 104 / Ms, greater than 1 × 105 / Ms, or greater than 1 ×106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is less than 1 × 105 / Ms, less than 1 × 106 / Ms, or less than 1 × 107 / Ms.

[0148] Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, KD is less than 1 × 10-6 M, less than 1 × 10-7 M, less than 1 × 10-8 M, less than 1 × 10-9 M, or less than 1 × 10-10 M. In some embodiments, the KD is less than 300 nM, 200 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. In some embodiments, KD is greater than 1 × 10-7 M, greater than 1 × 10-8 M, greater than 1 × 10-9 M, or greater than 1 × 10-10 M.

[0149] General techniques for measuring the affinity include, e.g., ELISA, radioimmunoassay (RIA) , and surface plasmon resonance (SPR) . In some embodiments, the affinity is determined by cell-based assays.

[0150] In some embodiments, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof described herein can bind to an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) , with an EC50 value that is less than 100-fold, less than 90-fold, less than 80-fold, less than 70-fold, less than 60-fold, less than 50-fold, less than 40-fold, less than 30-fold, less than 20-fold, less than 10-fold, less than 9-fold, less than 8-fold, less than 7-fold, less than 6-fold, less than 5-fold, less than 4-fold, less than 3-fold, less than 2-fold, or less than 1-fold, as compared to that of a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof or a control protein construct at a neutral pH (e.g., any of the neutral pH described herein) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof described herein can bind to an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) , with an EC50 value that is at least 1-fold, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, at least 30-fold, at least 40-fold, at least 50-fold, at least 60-fold, at least 70-fold, at least 80-fold, at least 90-fold, or at least 100-fold, as compared to that of a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof or a control protein construct at an acidic pH (e.g., any of the acidic pH described herein) .

[0151] In some embodiments, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof described herein can be expressed and purified by methods commonly used in the art, e.g., affinity chromatography. In some cases, the protein constructs can be purified by size-exclusive chromatography (SEC) coupled with HPLC. In some embodiments, the percentage of the main peak in the SEC-HPLC analysis result is at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%. In some embodiments, the percentage of high molecular weight peak (HMW%) and / or low molecular weight peak (LMW%) is less than 5%, less than 4%, less than 3%, less than 2%, or less than 1%.

[0152] In some embodiments, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof described herein can inhibit tumor growth, e.g., when administered together with an IL2Rβligand (e.g., any of the IL2Rβ ligands described herein) in a tumor-bearing animal. In some cases, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof has a tumor growth inhibition percentage (TGI%) that is greater than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, or 200%. In some embodiments, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof described herein has a tumor growth inhibition percentage that is less than 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, or 200%. The TGI%can be determined, e.g., at 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 days after the treatment starts. As used herein, the tumor growth inhibition percentage (TGI%) is calculated using the following formula: TGI (%) = [1-Mean (Tfinal-Tinitial)  / Mean (Cfinal-Cinitial) ] ×100

[0153] Tfinal is the average tumor volume in the treatment group on the final day. Tinitial is the average tumor volume in the treatment group on Day 0. Cfinal is the average tumor volume in the control group on the final day. Cinitial is the average tumor volume in the control group on Day 0.

[0154] In some embodiments, the TGI%of the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof described herein is at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, at least 150%, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, or at least 10-fold greater that of a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof, or a control protein construct described herein.

[0155] In some embodiments, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof described herein can promote proliferation and / or activation of NK cells and CD8+ T cells. In some embodiments, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof described herein do not promote proliferation and / or activation of regulatory T cells.

[0156] Methods of making engineered IL2Rβ variants and protein constructs

[0157] The engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof described herein can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the DNA encoding an IL2Rβ(e.g., human IL2Rβ) or a part thereof (e.g., the extracellular region of human IL2Rβ) or by peptide synthesis. Such variants include, for example, deletions, insertions, or substitutions of residues within the amino acids sequences. In some embodiments, selective histidine mutations can be introduced by substitution.

[0158] Screening can be performed. In a population of such variants, some engineered IL2Rβvariants can be expressed and purified using methods known in the art. In addition, the binding affinity of some engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof to an IL2Rβligand (e.g., any of the IL2Rβ ligands described herein) at a neutral or acidic pH can be determined by ELISA. Different protocols can be used. Based on the experimental results above, some engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof with a good expression / purification profile, a comparable or high binding affinity to the IL2Rβ ligand at a neutral pH, and / or a low binding affinity to the IL2Rβ ligand at an acidic pH, can be selected to generate any of the protein constructs described herein (e.g., any of the protein constructs having a targeting moiety that specifically binds to a TAA) .

[0159] In some embodiments, an engineered IL2Rβ variant can have a comparable or high binding affinity to an IL2Rβ ligand at a neutral pH (e.g., at about 6.5, about 6.6, about 6.7, about 6.8, about 6.9, about 7.0, about 7.1, about 7.2, about 7.3, about 7.4, about 7.5, about 7.6, about 7.7, about 7.8, about 7.9, or about 8.0) , if the binding affinity is at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 100%as compared to that of a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof (e.g., a wildtype IL2Rβ extracellular region) . In some embodiments, a protein construct can have a comparable or high binding affinity to an IL2Rβ ligand at a neutral pH (e.g., at about 6.5, about 6.6, about 6.7, about 6.8, about 6.9, about 7.0, about 7.1, about 7.2, about 7.3, about 7.4, about 7.5, about 7.6, about 7.7, about 7.8, about 7.9, or about 8.0) , if the binding affinity is at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 100%as compared to that of a control protein construct (e.g., any of the control protein constructs described herein) . In some embodiments, the binding affinity is measured by RBE.

[0160] In some embodiments, an engineered IL2Rβ variant can have a comparable or high binding affinity to an IL2Rβ ligand at a neutral pH (e.g., at about 6.5, about 6.6, about 6.7, about 6.8, about 6.9, about 7.0, about 7.1, about 7.2, about 7.3, about 7.4, about 7.5, about 7.6, about 7.7, about 7.8, about 7.9, or about 8.0) , if the EC50 is less than 120%, less than 110%, less than 100%, less than 90%, less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%as compared to that of a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof (e.g., a wildtype IL2Rβextracellular region) . In some embodiments, a protein construct can have a comparable or high binding affinity to an IL2Rβ ligand at a neutral pH (e.g., at about 6.5, about 6.6, about 6.7, about 6.8, about 6.9, about 7.0, about 7.1, about 7.2, about 7.3, about 7.4, about 7.5, about 7.6, about 7.7, about 7.8, about 7.9, or about 8.0) , if the EC50 is less than 120%, less than 110%, less than 100%, less than 90%, less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50% as compared to that of a control protein construct (e.g., any of the control protein constructs described herein) .

[0161] In some embodiments, an engineered IL2Rβ variant can have a low binding affinity to an IL2Rβ ligand at an acidic pH (e.g., at about 5.0, about 5.1, about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, or about 6.4) , if the binding affinity is less than 80%, less than 75%, less than 70%, less than 65%, less than 60%, less than 55%, less than 50%, less than 45%, less than 40%, less than 35%, less than 30%, less than 25%, or less than 20%as compared to that of a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof (e.g., a wildtype IL2Rβ extracellular region) . In some embodiments, a protein construct can have a low binding affinity to an IL2Rβ ligand at an acidic pH (e.g., at about 5.0, about 5.1, about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, or about 6.4) , if the binding affinity is less than 80%, less than 75%, less than 70%, less than 65%, less than 60%, less than 55%, less than 50%, less than 45%, less than 40%, less than 35%, less than 30%, less than 25%, or less than 20%as compared to that of a control protein construct (e.g., any of the control protein constructs described herein) .

[0162] In some embodiments, an engineered IL2Rβ variant can have a low binding affinity to an IL2Rβ ligand at an acidic pH (e.g., at about 5.0, about 5.1, about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, or about 6.4) , if the EC50 is at least 80%, at least 90%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, at least 150%, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, at least 30-fold, at least 40-fold, at least 50-fold, at least 60-fold, at least 70-fold, at least 80-fold, at least 90-fold, or at least 100-fold as compared to that of a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof (e.g., a wildtype IL2Rβ extracellular region) . In some embodiments, a protein construct can have a low binding affinity to an IL2Rβ ligand at an acidic pH (e.g., at about 5.0, about 5.1, about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, or about 6.4) , if the EC50 is at least 80%, at least 90%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, at least 150%, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, at least 30-fold, at least 40-fold, at least 50-fold, at least 60-fold, at least 70-fold, at least 80-fold, at least 90-fold, or at least 100-fold as compared to that of a control protein construct (e.g., any of the control protein constructs described herein) . In some embodiments, the binding affinity is determined at the same pH or different pH for the engineered IL2Rβvariant and the wildtype IL2Rβ or a fragment thereof.

[0163] In some embodiments, the engineered IL2Rβ variant or a protein construct thereof can have a binding affinity to an IL2Rβ ligand at an acidic pH (e.g., any of the acidic pHs described herein) that is less than 80%, less than 75%, less than 70%, less than 65%, less than 60%, less than 55%, less than 50%, less than 45%, less than 40%, less than 35%, less than 30%, less than 25%, or less than 20%as compared to that at a neutral pH (e.g., any of the neutral pHs described herein) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ variant or a protein construct thereof can have a binding affinity to an IL2Rβ ligand at an acidic pH (e.g., any of the acidic pHs described herein) that is at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, or at least 90%as compared to that at a neutral pH (e.g., any of the neutral pHs described herein) .

[0164] In some embodiments, the engineered IL2Rβ variant or a protein construct thereof can bind to an IL2Rβ ligand at an acidic pH (e.g., any of the acidic pHs described herein) with an EC50 that is at least 80%, at least 90%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, at least 150%, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, or at least 10-fold as compared to that at a neutral pH (e.g., any of the neutral pHs described herein) . In some embodiments, the engineered IL2Rβ variant or a protein construct thereof can bind to an IL2Rβ ligand at an acidic pH (e.g., any of the acidic pHs described herein) with an EC50 that is less than 80%, less than 90%, less than 100%, less than 110%, less than 120%, less than 130%, less than 140%, less than 150%, less than 2-fold, less than 3-fold, less than 4-fold, less than 5-fold, less than 6-fold, less than 7-fold, less than 8-fold, less than 9-fold, or less than 10-fold as compared to that at a neutral pH (e.g., any of the neutral pHs described herein) .

[0165] In some embodiments, the engineered IL2Rβ variant or the protein construct thereof does not fully dissociate from the IL2Rβ ligand at an acidic pH, thereby partially exposing the IL2Rβ ligand to the tumor microenvironment. It is contemplated that the IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) , when bound with the engineered IL2Rβ variant or protein construct thereof, can exhibit an attenuated toxicity in tumor microenvironment, as compared to that when the IL2Rβ ligand is completely dissociated from an engineered IL2Rβvariant or protein construct thereof having a lower IL2Rβ ligand-binding affinity at an acidic pH.

[0166] Any combination of deletions, insertions, and / or combinations can be made to arrive at a variant that has have a comparable or high binding affinity to an IL2Rβ ligand at a neutral pH and a low binding affinity to the IL2Rβ ligand at an acidic pH. The amino acid changes introduced into the variant can also alter or introduce new post-translational modifications into the polypeptide, such as changing (e.g., increasing or decreasing) the number of glycosylation sites, changing the type of glycosylation site (e.g., changing the amino acid sequence such that a different sugar is attached by enzymes present in a cell) , or introducing new glycosylation sites.

[0167] Engineered IL2Rβ variants can be derived from any species of animal, including mammals. Non-limiting examples of IL2Rβ variants include IL2Rβ variants derived from humans, primates, e.g., monkeys and apes, cows, pigs, horses, sheep, camelids (e.g., camels and llamas) , chicken, goats, and rodents (e.g., rats, mice, hamsters and rabbits) .

[0168] The present disclosure also provides recombinant vectors (e.g., an expression vectors) that include an isolated polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) , host cells into which are introduced the recombinant vectors (i.e., such that the host cells contain the polynucleotide and / or a vector comprising the polynucleotide) , and the production of recombinant polypeptides or fragments thereof by recombinant techniques.

[0169] As used herein, a “vector” is any construct capable of delivering one or more polynucleotide (s) of interest to a host cell when the vector is introduced to the host cell. An “expression vector” is capable of delivering and expressing the one or more polynucleotide (s) of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector has been introduced. Thus, in an expression vector, the polynucleotide of interest is positioned for expression in the vector by being operably linked with regulatory elements such as a promoter, enhancer, and / or a poly-Atail, either within the vector or in the genome of the host cell at or near or flanking the integration site of the polynucleotide of interest such that the polynucleotide of interest will be translated in the host cell introduced with the expression vector.

[0170] A vector can be introduced into the host cell by methods known in the art, e.g., electroporation, chemical transfection (e.g., DEAE-dextran) , transformation, transfection, and infection and / or transduction (e.g., with recombinant virus) . Thus, non-limiting examples of vectors include viral vectors (which can be used to generate recombinant virus) , naked DNA or RNA, plasmids, cosmids, phage vectors, and DNA or RNA expression vectors associated with cationic condensing agents.

[0171] In some implementations, a polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) is introduced using a viral expression system (e.g., vaccinia or other pox virus, retrovirus, or adenovirus) , which may involve the use of a non-pathogenic (defective) , replication competent virus, or may use a replication defective virus. Techniques for incorporating DNA into such expression systems are well known to those of ordinary skill in the art. The DNA may also be “naked. ” The uptake of naked DNA may be increased by coating the DNA onto biodegradable beads that are efficiently transported into the cells.

[0172] For expression, the DNA insert comprising a polypeptide-encoding polynucleotide disclosed herein can be operatively linked to an appropriate promoter (e.g., a heterologous promoter) , such as the phage lambda PL promoter, the E. coli lac, trp and tac promoters, the SV40 early and late promoters and promoters of retroviral LTRs, to name a few. Other suitable promoters are known to the skilled artisan. In some embodiments, the promoter is a cytomegalovirus (CMV) promoter. In some embodiments, the promoter is a human promoter, e.g., uHS or HS promoter. The human promoters can improve expression of proteins derived from human. Details of such human promoters can be found, e.g., in Antoniou, M., et al. "Transgenes encompassing dual-promoter CpG islands from the human TBP and HNRPA2B1 loci are resistant to heterochromatin-mediated silencing. " Genomics 82.3 (2003) : 269-279; and Zhang, F., et al. "A ubiquitous chromatin opening element (UCOE) confers resistance to DNA methylation–mediated silencing of lentiviral vectors. " Molecular Therapy 18.9 (2010) : 1640-1649; each of which is incorporated herein by reference in its entirety. The expression constructs can further contain sites for transcription initiation, termination and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation. The coding portion of the mature transcripts expressed by the constructs may include a translation initiating at the beginning and a termination codon (UAA, UGA, or UAG) appropriately positioned at the end of the polypeptide to be translated.

[0173] As indicated, the expression vectors can include at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture and tetracycline or ampicillin resistance genes for culturing in E. coli and other bacteria. Representative examples of appropriate hosts include, but are not limited to, bacterial cells, such as E. coli, Streptomyces, and Salmonella typhimurium cells; fungal cells, such as yeast cells; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells; animal cells such as CHO, COS, Bowes melanoma, and HK 293 cells; and plant cells. Appropriate culture mediums and conditions for the host cells described herein are known in the art.

[0174] Non-limiting vectors for use in bacteria include pQE70, pQE60 and pQE-9, available from Qiagen; pBS vectors, Phagescript vectors, Bluescript vectors, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, available from Stratagene; and ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 available from Pharmacia. Non-limiting eukaryotic vectors include pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG available from Stratagene; and pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL available from Pharmacia. Other suitable vectors will be readily apparent to the skilled artisan.

[0175] Non-limiting bacterial promoters suitable for use include the E. coli lacI and lacZ promoters, the T3 and T7 promoters, the gpt promoter, the lambda PR and PL promoters and the trp promoter. Suitable eukaryotic promoters include the CMV immediate early promoter, the HSV thymidine kinase promoter, the early and late SV40 promoters, the promoters of retroviral LTRs, such as those of the Rous sarcoma virus (RSV) , and metallothionein promoters, such as the mouse metallothionein-I promoter.

[0176] In the yeast Saccharomyces cerevisiae, a number of vectors containing constitutive or inducible promoters such as alpha factor, alcohol oxidase, and PGH can be used.

[0177] Introduction of the construct into the host cell can be affected by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals, such as Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986) , which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0178] In some embodiments, the host cell is a human cell suitable for protein expression, e.g., HEK293 cells or CHO cells (e.g., CHO-Scells) . In some embodiments, the host cells are Expi293 cells. The Expi293 Expression System is designed to deliver up to 6× more protein in just one week, compared with other transient 293 expression systems that can take two weeks or more. This is in part due to the fact that Expi293F cells are adapted to achieve higher pg / cell / day productivity than standard HEK 293 cells, and the Expifectamine 293 Transfection Reagent and enhancers enable high-efficiency transfection and expression levels of high-density HEK 293 cultures. Additionally, the Expi293 Expression System requires less plasticware, which means less waste and more incubator space.

[0179] Transcription of DNA encoding a polypeptide of the present disclosure by higher eukaryotes may be increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-acting elements of DNA, usually about from 10 to 300 bp that act to increase transcriptional activity of a promoter in a given host cell-type. Examples of enhancers include the SV40 enhancer, which is located on the late side of the replication origin at base pairs 100 to 270, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancers.

[0180] For secretion of the translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space or into the extracellular environment, appropriate secretion signals may be incorporated into the expressed polypeptide. The signals may be endogenous to the polypeptide or they may be heterologous signals.

[0181] The polypeptide (e.g., engineered IL2Rβ variants) can be expressed in a modified form, such as a fusion protein (e.g., a HSA-fusion or GST-fusion) or with a His-tag, and may include not only secretion signals, but also additional heterologous functional regions. For instance, a region of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be added to the N-terminus of the polypeptide to improve stability and persistence in the host cell, during purification, or during subsequent handling and storage. Also, peptide moieties can be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. The addition of peptide moieties to polypeptides to engender secretion or excretion, to improve stability and to facilitate purification, among others, are familiar and routine techniques in the art.

[0182] Methods of treatment

[0183] The engineered IL2Rβ variants and protein constructs thereof of the present disclosure can be used for various therapeutic purposes.

[0184] In one aspect, the disclosure provides methods for treating a cancer in a subject, methods of reducing the rate of the increase of volume of a tumor in a subject over time, methods of reducing the risk of developing a metastasis, or methods of reducing the risk of developing an additional metastasis in a subject. In some embodiments, the treatment can halt, slow, retard, or inhibit progression of a cancer. In some embodiments, the treatment can result in the reduction of in the number, severity, and / or duration of one or more symptoms of the cancer in a subject.

[0185] In one aspect, the disclosure features methods that include administering a therapeutically effective amount of an engineered IL2Rβ variant (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) or a protein construct (e.g., any of the protein constructs described herein) , and optionally an IL2Rβ ligand (e.g., any of the IL2Rβ ligands described herein) , to a subject in need thereof (e.g., a subject having, or identified or diagnosed as having, a cancer) , e.g., breast cancer (e.g., triple-negative breast cancer) , carcinoid cancer, cervical cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, renal cancer, colorectal cancer, gastric cancer, testicular cancer, thyroid cancer, bladder cancer, urethral cancer, or hematologic malignancy. In some embodiments, the cancer is unresectable melanoma or metastatic melanoma, non-small cell lung carcinoma (NSCLC) , small cell lung cancer (SCLC) , bladder cancer, or metastatic hormone-refractory prostate cancer. In some embodiments, the subject has a solid tumor. In some embodiments, the cancer is squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN) , renal cell carcinoma (RCC) , triple-negative breast cancer (TNBC) , or colorectal carcinoma. In some embodiments, the subject has Hodgkin's lymphoma. In some embodiments, the subject has triple-negative breast cancer (TNBC) , gastric cancer, urothelial cancer, Merkel-cell carcinoma, or head and neck cancer.

[0186] In some embodiments, the cancer described herein is melanoma, head and neck cancer, colorectal cancer, lymphoma, leukemia, bladder cancer, multiple myeloma, pancreatic cancer, gastric cancer, or lung cancer. In some embodiments, the lymphoma is Non-Hodgkin’s lymphoma.

[0187] In some embodiments, the compositions and methods disclosed herein can be used for treatment of patients at risk for a cancer. Patients with cancer can be identified with various methods known in the art.

[0188] In one aspect, the disclosure provides methods for treating, preventing, or reducing the risk of developing disorders associated with an abnormal or unwanted immune response, e.g., an autoimmune disorder, e.g., by administering a therapeutically effective amount of an engineered IL2Rβ variant (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) or a protein construct (e.g., any of the protein constructs described herein) , and optionally an IL2Rβ ligand (e.g., any of the IL2Rβ ligands described herein) , to a subject in need thereof. These autoimmune disorders include, but are not limited to, rheumatoid arthritis, Crohn’s disease, systemic lupus erythematosus, ankylosing spondylitis, inflammatory bowel diseases (IBD) , ulcerative colitis, or scleroderma. In some embodiments, the autoimmune disorders include allergy, asthma, and / or atopic dermatitis. Thus, an engineered IL2Rβ variant (e.g., any of the engineered IL2Rβ polypeptides described herein) or a protein construct (e.g., any of the protein constructs described herein) , and optionally an IL2Rβ ligand (e.g., any of the IL2Rβ ligands described herein) , can be used to inhibit immune response. In some embodiments, the immune disorders described herein is allergy, asthma, myocarditis, nephritis, hepatitis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, scleroderma, hyperthyroidism, idiopathic thrombocytopenic purpura, autoimmune hemolytic anemia, ulcerative colitis, autoimmune liver disease, diabetes, pain or neurological disorders.

[0189] As used herein, by an “effective amount” is meant an amount or dosage sufficient to effect beneficial or desired results including halting, slowing, retarding, or inhibiting progression of a disease, e.g., a cancer. An effective amount will vary depending upon, e.g., an age and a body weight of a subject to which the engineered IL2Rβ variants and protein constructs, the IL2Rβ ligand, vector comprising the polynucleotide encoding the engineered IL2Rβ variants and protein constructs, and / or compositions thereof is to be administered, a severity of symptoms and a route of administration, and thus administration can be determined on an individual basis.

[0190] An effective amount can be administered in one or more administrations. By way of example, an effective amount of the engineered IL2Rβ variants and / or protein constructs is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, inhibit, slow and / or delay progression of a cancer in a patient or is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, slow and / or delay proliferation of a cell (e.g., a biopsied cell, any of the cancer cells described herein, or cell line (e.g., a cancer cell line) ) in vitro. As is understood in the art, an effective amount may vary, depending on, inter alia, patient history as well as other factors such as the type (and / or dosage) of the engineered IL2Rβ variants and protein constructs used.

[0191] Effective amounts and schedules for administering the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof, the polynucleotides encoding the engineered IL2Rβ variants or protein constructs, and / or compositions disclosed herein may be determined empirically, and making such determinations is within the skill in the art. Those skilled in the art will understand that the dosage that must be administered will vary depending on, for example, the mammal that will receive the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof, the polynucleotides, and / or compositions disclosed herein, the route of administration, the particular type of polynucleotides, and / or compositions disclosed herein used and other drugs being administered to the mammal.

[0192] A typical daily dosage of an effective amount of the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof and / or the IL2Rβ ligand is 0.1 mg / kg to 200 mg / kg (mg per kg of patient weight) . In some embodiments, the dosage can be less than 150 mg / kg, 140 mg / kg, 130 mg / kg, 120 mg / kg, 110 mg / kg, 100 mg / kg, 90 mg / kg, 80 mg / kg, 70 mg / kg, 60 mg / kg, 50 mg / kg, 40 mg / kg, 30 mg / kg, 20 mg / kg, 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, or 0.1 mg / kg. In some embodiments, the dosage can be greater than 150 mg / kg, 140 mg / kg, 130 mg / kg, 120 mg / kg, 110 mg / kg, 100 mg / kg, 90 mg / kg, 80 mg / kg, 70 mg / kg, 60 mg / kg, 50 mg / kg, 40 mg / kg, 30 mg / kg, 20 mg / kg, 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, or 0.1 mg / kg. In some embodiments, the dosage is about 150 mg / kg, 140 mg / kg, 130 mg / kg, 120 mg / kg, 110 mg / kg, 100 mg / kg, 90 mg / kg, 80 mg / kg, 70 mg / kg, 60 mg / kg, 50 mg / kg, 40 mg / kg, 30 mg / kg, 20 mg / kg, 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, or 1 mg / kg. In some embodiments, the dosage is about 1 to 150 mg / kg, about 1 to 100 mg / kg, about 1 to 80 mg / kg, about 1 to 50 mg / kg, about 1 to 30 mg / kg, about 1 to 20 mg / kg, about 1 to 10 mg / kg, about 1 to 5 mg / kg, about 5 to 150 mg / kg, about 5 to 100 mg / kg, about 5 to 80 mg / kg, about 5 to 50 mg / kg, about 5 to 30 mg / kg, about 5 to 20 mg / kg, about 5 to 10 mg / kg, about 10 to 150 mg / kg, about 10 to 100 mg / kg, about 10 to 80 mg / kg, about 10 to 50 mg / kg, about 10 to 30 mg / kg, about 10 to 20 mg / kg, about 20 to 150 mg / kg, about 20 to 100 mg / kg, about 20 to 80 mg / kg, about 20 to 50 mg / kg, about 20 to 30 mg / kg, about 30 to 150 mg / kg, about 30 to 100 mg / kg, about 30 to 80 mg / kg, about 30 to 50 mg / kg, about 50 to 150 mg / kg, about 50 to 100 mg / kg, about 50 to 80 mg / kg, about 80 to 150 mg / kg, about 80 to 100 mg / kg, or about 100 to 150 mg / kg.

[0193] In any of the methods described herein, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof can be administered to the subject at least once a week.

[0194] In some embodiments, the one or more additional therapeutic agents can be administered to the subject prior to, or after administering the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof. In some embodiments, the one or more additional therapeutic agents are administered to the subject such that there is an overlap in the bioactive period of the one or more additional therapeutic agents and the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof in the subject.

[0195] Pharmaceutical compositions and routes of administration

[0196] Also provided herein are pharmaceutical compositions that contain the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof described herein. The pharmaceutical compositions can be formulated in any manner known in the art.

[0197] Pharmaceutical compositions are formulated to be compatible with their intended route of administration (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) . The compositions can include a sterile diluent (e.g., sterile water or saline) , a fixed oil, polyethylene glycol, glycerine, propylene glycol or other synthetic solvents, antibacterial or antifungal agents, such as benzyl alcohol or methyl parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like, antioxidants, such as ascorbic acid or sodium bisulfite, chelating agents, such as ethylenediaminetetraacetic acid, buffers, such as acetates, citrates, or phosphates, and isotonic agents, such as sugars (e.g., dextrose) , polyalcohols (e.g., mannitol or sorbitol) , or salts (e.g., sodium chloride) , or any combination thereof. Liposomal suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. Preparations of the compositions can be formulated and enclosed in ampules, disposable syringes, or multiple dose vials. Where required (as in, for example, injectable formulations) , proper fluidity can be maintained by, for example, the use of a coating, such as lecithin, or a surfactant. Absorption of the agents can be prolonged by including an agent that delays absorption (e.g., aluminum monostearate and gelatin) . Alternatively, controlled release can be achieved by implants and microencapsulated delivery systems, which can include biodegradable, biocompatible polymers (e.g., ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid) .

[0198] Compositions containing the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof described herein can be formulated for parenteral (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) administration in dosage unit form (i.e., physically discrete units containing a predetermined quantity of active compound for ease of administration and uniformity of dosage) .

[0199] Pharmaceutical compositions for parenteral administration are preferably sterile and substantially isotonic and manufactured under Good Manufacturing Practice (GMP) conditions. Pharmaceutical compositions can be provided in unit dosage form (i.e., the dosage for a single administration) . Pharmaceutical compositions can be formulated using one or more physiologically acceptable carriers, diluents, excipients or auxiliaries. The formulation depends on the route of administration chosen. For injection, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof can be formulated in aqueous solutions, preferably in physiologically-compatible buffers to reduce discomfort at the site of injection. The solution can contain formulatory agents such as suspending, stabilizing and / or dispersing agents. Alternatively, the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof can be in lyophilized form for constitution with a suitable vehicle, e.g., sterile pyrogen-free water, before use.

[0200] Toxicity and therapeutic efficacy of compositions can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals (e.g., monkeys) . One can, for example, determine the LD50 (the dose lethal to 50%of the population) and the ED50 (the dose therapeutically effective in 50%of the population) : the therapeutic index being the ratio of LD50: ED50. Agents that exhibit high therapeutic indices are preferred. Where an agent exhibits an undesirable side effect, care should be taken to minimize potential damage (i.e., reduce unwanted side effects) . Toxicity and therapeutic efficacy can be determined by other standard pharmaceutical procedures.

[0201] Exemplary doses include milligram or microgram amounts of any of the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof described herein per kilogram of the subject’s weight. While these doses cover a broad range, one of ordinary skill in the art will understand that therapeutic agents can vary in their potency, and effective amounts can be determined by methods known in the art. Typically, relatively low doses are administered at first, and the attending health care professional or veterinary professional (in the case of therapeutic application) or a researcher (when still working at the development stage) can subsequently and gradually increase the dose until an appropriate response is obtained. In addition, it is understood that the specific dose level for any particular subject will depend upon a variety of factors including the activity of the specific compound employed, the age, body weight, general health, gender, and diet of the subject, the time of administration, the route of administration, the rate of excretion, and the half-life of the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof in vivo.

[0202] The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration. The disclosure also provides methods of manufacturing the engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof for various uses as described herein.

[0203] Methods of screening engineered cytokine receptor variants

[0204] Provided herein are methods of screening cytokine receptor variants with a desired pH-dependent cytokine-binding ability.

[0205] In some embodiments, the disclosure is related to methods of screening engineered IL2Rβ variants or protein constructs thereof having a comparable or high binding affinity to an IL2Rβ ligand at a neutral pH and / or a low binding affinity to the IL2Rβ ligand at an acidic pH.

[0206] In some embodiments, the method comprises (a) introducing one or more non-native histidine residues in a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof (e.g., any of the IL2Rβ proteins or fragments thereof described herein) to generate a plurality (e.g., at least 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, or 10) of IL2Rβ variants; (b) determining the binding affinity between each of the plurality of IL2Rβ variants and an IL2Rβ ligand (e.g., any of the IL2Rβ ligands described herein) at a neutral pH (e.g., any of the neutral pH described herein) , wherein a first group of engineered IL2Rβ variants having at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or at least 100%binding affinity to the IL2Rβ ligand as compared to a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof are selected; (c) determining the binding affinity between each of the plurality of IL2Rβ variants and the IL2Rβ ligand (e.g., any of the IL2Rβ ligands described herein) at an acidic pH (e.g., any of the acidic pH described herein) , wherein a second group of IL2Rβ variants having less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, or less than 20%binding affinity to the IL2Rβ ligand as compared to a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof are selected. In some embodiments, those IL2Rβ variants in both the first and the second groups of IL2Rβ variants represent the screened cytokine receptor variants that have a comparable or high binding affinity to the IL2Rβ ligand at a neutral pH and a low binding affinity to the IL2Rβ ligand at an acidic pH.

[0207] In some embodiments, the method comprises (a) introducing one or more non-native histidine residues in a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof (e.g., any of the IL2Rβ proteins or fragments thereof described herein) to generate a plurality (e.g., at least 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, or 10) of protein constructs comprising the IL2Rβ variants; (b) determining the binding affinity between each of the plurality of protein constructs and an IL2Rβ ligand (e.g., any of the IL2Rβ ligands described herein) at a neutral pH (e.g., any of the neutral pH described herein) , wherein a first group of protein constructs having at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or at least 100%binding affinity to the IL2Rβ ligand as compared to a control protein constructs (e.g., any of the control protein constructs described herein) are selected; (c) determining the binding affinity between each of the plurality of protein constructs and the IL2Rβ ligand (e.g., any of the IL2Rβ ligands described herein) at an acidic pH (e.g., any of the acidic pH described herein) , wherein a second group of protein constructs having less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, or less than 20%binding affinity to the IL2Rβ ligand as compared to a control protein constructs (e.g., any of the control protein constructs described herein) are selected. In some embodiments, those protein constructs in both the first and the second groups of protein constructs represent the screened protein constructs that have a comparable or high binding affinity to the IL2Rβ ligand at a neutral pH and a low binding affinity to the IL2Rβ ligand at an acidic pH.

[0208] In some embodiments, functional assays are performed to compare the one or more expressed IL2Rβ variants.

[0209] EXAMPLES

[0210] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0211] Example 1. Design of IL2Rβ variants with various IL15-biding affinities at different pHs

[0212] Human interleukin 15 receptor is composed of the interleukin-2 receptor subunit beta (IL2Rβ or CD122) and common-γ chain receptor (CD132) , along with a unique ligand-specific subunit, interleukin-15 receptor subunit alpha (IL15Rα) , which bears homology to interleukin-2 receptor subunit alpha (IL2Rα) . The common-γ chain receptor is shared with various cytokines, including IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, and IL-21.

[0213] Human IL2Rβ (NCBI reference sequence: NP_000869.1; UniProt ID: P14784; SEQ ID NO: 18) is a 551 amino acid protein that includes, from N-terminus to C-terminus, a signal peptide (corresponding to amino acids 1-26 of SEQ ID NO: 18) , an extracellular region (corresponding to amino acids 27-240 of SEQ ID NO: 18) , a transmembrane region (corresponding to amino acids 241-265 of SEQ ID NO: 18) , and a cytoplasmic region (corresponding to amino acids 266-551 of SEQ ID NO: 18) .

[0214] Different IL2Rβ variant proteins (or IL2Rβ variants) were designed by introducing one or more histidine mutations in the human IL2Rβ extracellular region (IL2Rβ_wt or IL2RB_wt; SEQ ID NO: 1) . It was contemplated that the one or more histidine mutations can maintain IL2Rβ’s stable binding with IL-15 at a neutral pH (e.g., about pH 7.5) , but have a weak binding at an acidic pH (e.g., about pH 6.0) . The engineered IL2Rβ variants may be used as a “protective lid” to shield IL-15 (or its variants) from activating immune cells prematurely during systemic circulation. Once the engineered IL2Rβ variants reach tumor sites (lower pH environment) , the lid can be loosened up, which enables IL-15 (or its variants) to activate immune cells within the tumor microenvironment.

[0215] Specifically, one selected amino acid residue in IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) can be mutated to a histidine residue, and the following IL2Rβ variants were obtained, as shown in the table below.

[0216] Table 1.

[0217] The amino acid positions described above are relative to IL2Rβ_wt (SEQ ID NO: 1) . For example, IL2Rβ_mt01 (Y12H; SEQ ID NO: 2) contains a Tyr-to-His mutation at position 12 of SEQ ID NO: 1. Sequences of the IL2Rβ variants are listed in FIG. 3.

[0218] Example 2. Determination of the binding activity between IL-15 and engineered IL2Rβvariants at different pHs

[0219] To determine the binding activity between IL-15 and engineered IL2Rβ variants, ELISA assays were performed. Specifically, His-tagged IL-15 sushi domain (or His-sushi-IL15_wt; SEQ ID NO: 19) and variants was diluted in coating buffer (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, 7.7 mM NaN3 , pH 9.6 in ddH2O) (10 μg / mL) and incubated in the 96 well half area plate (CORNING, Cat#: 3690) at 4℃ overnight. The wells were blocked with 2%BSA (APOLO Biochemical, Cat#: APL-007-500g) in PBS (Gibco, Cat#: 14190-136) at room temperature for 1 hour, and then washed with PBST (0.05% 20 in PBS) . After washing, the wells were incubated with serially diluted IL2Rβ_wt and variants (from 50 nM, 8-fold diluted with 0.5%BSA in PBS, pH 7.5) at room temperature for 2 hours. The plate was washed three times with PBST, then incubated with pH 7.5 and pH 6.0 0.5%BSA in PBS at room temperature for 30 minutes. After washing with PBST, anti-human Fcγ-HRP antibody in dilution solution (1: 3000 dilute with 0.2%BSA in PBS; Jackson ImmunoResearch, Cat#: 109-005-098) was added and incubate at room temperature for 1 hour. Next, the plate was washed four to five times with PBST. Finally, color development was carried out with TMB substrate (Invitrogen, Cat#: 00-4201-56) . The color development was stopped by adding an equal volume of 2N H2SO4 per well as TMB substrate solution. Absorbance at 450 nm in each well was measured using a microplate reader (VarioskanTM LUK, Thermo Scientific, type3020) .

[0220] The following tables summarize the results obtained in FIGS. 1A-1H.

[0221] Table 2. Summary of FIGS. 1A-1B

[0222] Table 3. Summary of FIGS. 1C-1D

[0223] Table 4. Summary of FIGS. 1E-1F

[0224] Table 5. Summary of FIGS. 1G-1H

[0225] The results of the His-sushi-IL15-wt binding results of IL2Rβ_mt01, IL2Rβ_mt05, IL2Rβ_mt10, IL2Rβ_mt12, and IL2Rβ_mt15 are shown in FIGS. 2A-2E, respectively. The results indicate that these selected variants, particularly IL2Rβ_mt15, may be a good candidate because of its pH-dependent binding ability to IL-15.

[0226] OTHER EMBODIMENTS

[0227] It is to be understood that while the invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the invention, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.An engineered IL2Rβ polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 80%identical to SEQ ID NO: 1 or 18, wherein the engineered IL2Rβ polypeptide comprises one or more non-native histidine residues.2.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 1, comprising one or more of the following:(a) the amino acid that corresponds to Y12 of SEQ ID NO: 1 is H (histidine) ;(b) the amino acid that corresponds to R15 of SEQ ID NO: 1 is H;(c) the amino acid that corresponds to R41 of SEQ ID NO: 1 is H;(d) the amino acid that corresponds to R42 of SEQ ID NO: 1 is H;(e) the amino acid that corresponds to Q70 of SEQ ID NO: 1 is H;(f) the amino acid that corresponds to K71 of SEQ ID NO: 1 is H;(g) the amino acid that corresponds to L72 of SEQ ID NO: 1 is H;(h) the amino acid that corresponds to T73 of SEQ ID NO: 1 is H;(i) the amino acid that corresponds to T74 of SEQ ID NO: 1 is H;(j) the amino acid that corresponds to V75 of SEQ ID NO: 1 is H;(k) the amino acid that corresponds to F98 of SEQ ID NO: 1 is H;(l) the amino acid that corresponds to F101 of SEQ ID NO: 1 is H;(m) the amino acid that corresponds to E102 of SEQ ID NO: 1 is H;(n) the amino acid that corresponds to Y134 of SEQ ID NO: 1 is H;(o) the amino acid that corresponds to F135 of SEQ ID NO: 1 is H; and(p) the amino acid that corresponds to Q188 of SEQ ID NO: 1 is H.3.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to Y12 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.4.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to R15 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.5.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to R41 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.6.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to R42 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.7.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to Q70 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.8.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to K71 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.9.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to L72 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.10.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to T73 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.11.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to T74 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.12.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to V75 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.13.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to F98 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.14.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to F101 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.15.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to E102 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.16.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to Y134 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.17.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to F135 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.18.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 2, wherein the amino acid that corresponds to Q188 of SEQ ID NO: 1 in the engineered IL2Rβ polypeptide is a histidine residue.19.The engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-18, comprising an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 2-17.20.The engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-19, comprising an amino acid sequence that corresponds to the extracellular region of human interleukin-2 receptor subunit beta (IL2Rβ) .21.The engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-20, wherein the engineered IL2Rβ polypeptide further comprises a CH2 domain and a CH3 domain of IgG1 Fc or IgG4 Fc.22.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 21, wherein the engineered IL2Rβ polypeptide further comprises a hinge region, e.g., an IgG1 or IgG4 hinge region.23.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 21 or 22, wherein the CH2 domain is an IgG1 or IgG4 CH2 domain and the CH3 domain is an IgG1 or IgG4 CH3 domain.24.The engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-23, wherein the engineered IL2Rβ polypeptide binds to an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) with a binding affinity that is at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or at least 100%as compared to that of a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof at a neutral pH.25.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 24, wherein the neutral pH is about 6.5 to about 8.0, about 6.5 to about 7.5, about 6.5 to about 7.0, about 7.0 to about 8.0, about 7.0 to about 7.5, or about 7.5 to about 8.0.26.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 24, wherein the neutral pH is about 6.5, about 6.6, about 6.7, about 6.8, about 6.9, about 7.0, about 7.1, about 7.2, about 7.3, about 7.4, about 7.5, about 7.6, about 7.7, about 7.8, about 7.9, or about 8.0.27.The engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-26, wherein the engineered IL2Rβ polypeptide binds to an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) with a binding affinity that is less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, or less than 20%as compared to that of a wildtype IL2Rβ or a fragment thereof at an acidic pH.28.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 27, wherein the acidic pH is about 5.0 to about 6.4, about 5.0 to about 6.0, about 5.0 to about 5.5, about 5.5 to about 6.4, about 5.5 to about 6.0, or about 6.0 to about 6.4.29.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 27, wherein the acidic pH is about 5.0, about 5.1, about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, or about 6.4; or wherein the IL2Rβ ligand comprises or consists of interleukin 15 (IL-15) , e.g., human IL-15, or a functional variant thereof.30.The engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 24-29, wherein the binding affinity gradually decreases when the pH decreases.31.The engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 24-30, wherein the IL2Rβ ligand comprises a His-tag and / or a sushi domain of interleukin 15 receptor, alpha subunit (IL15Rα) .32.The engineered IL2Rβ polypeptide of claim 31, wherein the IL2Rβ ligand comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 19.33.A protein construct comprising two identical polypeptides, wherein each polypeptide comprises, optionally from N-terminus to C-terminus: the engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-32, an optional hinge region, and an Fc region, wherein the two polypeptides associate with each other, forming a dimer.34.The protein construct of claim 33, wherein the hinge region is a human IgG1 or IgG4 hinge region, and the Fc region is a human IgG1 or IgG4 Fc region.35.A protein construct comprising(a) a first polypeptide comprising, optionally from N-terminus to C-terminus: the engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-32, an optional first hinge region, a first Fc region; and(b) a second polypeptide comprising, optionally from N-terminus to C-terminus: an optional second hinge region, a second Fc region;wherein the first polypeptide and the second polypeptide associate with each other, forming a dimer.36.The protein construct of claim 35, wherein the second polypeptide further comprises a second engineered IL2Rβ polypeptide.37.The protein construct of claim 35 or 36, wherein the second polypeptide further comprises an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) .38.The protein construct of any one of claims 35-37, further comprising a targeting moiety that specifically binds to a tumor-associated antigen.39.A protein construct comprising(a) the engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-32; and(b) an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) .40.A protein construct comprising(a) a first polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: the engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-32, an optional first hinge region, a first CH2 domain, and a first CH3 domain; and(b) a second polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) , an optional second hinge region, a second CH2 domain, and a second CH3 domain;wherein the first polypeptide and the second polypeptide associate with each other, forming a dimer.41.A protein construct comprising(a) a first polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: an optional first hinge region, a first CH2 domain, a first CH3 domain, and the engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-32; and(b) a second polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: an optional second hinge region, a second CH2 domain, a second CH3 domain, and an IL2Rβ ligand (e.g., IL-15 or a functional variant thereof) ;wherein the first polypeptide and the second polypeptide associate with each other, forming a dimer.42.A pharmaceutical composition comprising the engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-32 or the protein construct of any one of claims 33-41; anda pharmaceutically acceptable carrier.43.A nucleic acid encoding the engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-32 or the protein construct of any one of claims 33-41.44.A vector comprising the nucleic acid of claim 43.45.A cell comprising the nucleic acid of claim 43.46.The cell of claim 45, wherein the cell is a CHO cell.47.A method of producing an engineered IL2Rβ polypeptide or a protein construct, the method comprising(a) culturing the cell of claim 45 or 46 under conditions sufficient for the cell to produce the engineered IL2Rβ polypeptide or the protein construct; and(b) collecting the engineered IL2Rβ polypeptide or the protein construct produced by the cell.48.A method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-32 or the protein construct of any one of claims 33-41, and optionally an IL2Rβ ligand, to the subject.49.A method of selectively enabling an IL2Rβ ligand to activate immune cells within the tumor microenvironment, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-32 or the protein construct of any one of claims 33-41, and optionally an IL2Rβ ligand, to the subject.50.The method of claim 48 or 49, wherein the subject has a solid tumor or a hematologic cancer.51.The method of claim 48 or 49, wherein the cancer is melanoma, head and neck cancer, colorectal cancer, lymphoma, leukemia, bladder cancer, multiple myeloma, pancreatic cancer, gastric cancer, or lung cancer.52.A method of decreasing the rate of tumor growth, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-32 or the protein construct of any one of claims 33-41, and optionally an IL2Rβ ligand.53.A method of killing a tumor cell, the method comprisingcontacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising an IL2Rβ ligand and the engineered IL2Rβ polypeptide of any one of claims 1-32 or the protein construct of any one of claims 33-41, and optionally an IL2Rβ ligand.54.The method of any one of claims 48-53, wherein the IL2Rβ ligand comprises or consists of IL-15 (e.g., human IL-15) or a functional variant thereof.55.An engineered cytokine binder, wherein the engineered cytokine binder can dynamically bind to a cytokine, thereby reducing the cytokine-induced immune response during systemic administration.56.The engineered cytokine binder of claim 55, wherein the engineered cytokine binder can change binding affinity to the cytokine in a pH-dependent manner.57.The engineered cytokine binder of claim 55 or 56, wherein the engineered cytokine binder can bind to the cytokine at a neutral pH, thereby reducing the cytokine-induced immune response during systemic administration.58.The engineered cytokine binder of any one of claims 55-57, wherein the engineered cytokine binder has a reduced binding affinity to the cytokine at an acidic pH, thereby exposing the cytokine in tumor microenvironment.59.The engineered cytokine binder of any one of claims 55-58, wherein the engineered cytokine binder remains partially shielding the cytokine at an acidic pH, thereby minimizing the potential toxicity due to excessive cytokine exposure in human.60.The engineered cytokine binder of any one of claims 55-59, wherein the engineered cytokine binder comprises the extracellular region of a cytokine receptor having one or more non-native histidine residues.61.The engineered cytokine binder of any one of claims 55-60, wherein the cytokine is IL-15 or a functional variant thereof, and the engineered cytokine binder comprises the extracellular region of IL2Rβ, wherein the IL2Rβ comprises one or more non-native histidine residues.62.The engineered cytokine binder of any one of claims 55-59, wherein the engineered cytokine binder comprises or consists of an antibody or antigen-binding fragment thereof (e.g., scFv or VHH) that binds to the cytokine (e.g., IL15 or a functional variant thereof) , wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises one or more non-native histidine residues.63.A protein construct comprising the engineered cytokine binder of any one of claims 55-62, and a cytokine (e.g., a wildtype cytokine or a functional variant thereof) .

Images