Collagen Compositions and Uses Thereof

Abstract

The present invention relates to collagen-based compositions and methods for the preparation and use of said compositions. The compositions may find application in, but are not limited to, sealing and / or repairing tissue, delivering agents to tissue, and / or culturing cells.

Description

Collagen Compositions and Uses ThereofTechnical Field

[0001] The present invention relates generally to the fields of biology and medicine. More specifically, the present invention relates to compositions suitable for sealing and / or repairing tissue, methods for the production thereof and methods for the use thereof. Without limitation, compositions described herein may also be suitable for the delivery of agents to biological targets such as tissues and cells and / or for culturing cells. However, it will be appreciated that the invention is not limited to these particular fields of use.Background

[0002] The following discussion of the prior art is provided to place the invention in an appropriate technical context and enable the advantages of it to be more fully understood. It should be appreciated, however, that any discussion of the prior art throughout the specification should not be considered as an express or implied admission that such prior art is widely known or forms part of the common general knowledge in the field.

[0003] Collagens, a group of structural proteins, are the most abundant proteins in the human body. Collagens are found in connective tissue, skin, tendons, bones, and cartilage. They provide structural support to tissues and play an important role in cellular processes such as tissue repair, intercellular communication and cellular migration. Whilst collagens are not transparent in the skin, the organization of collagen fibrils is largely responsible for the transparency and refraction of the cornea, lens and vitreous body of the eye, and the structural strength of the eye can predominantly be attributed to collagens present in the sclera.

[0004] Tissue degeneration as a result of disease and injury to tissue resulting from trauma have traditionally been treated using replacement tissue from a suitable donor. However, lack of availability of suitable donor tissue can severely limit the process. More recently, bioengineering has afforded an alternative means for the replacement and / or repair of biological tissue. Bioengineering allows for the creation of synthetic substitute tissue prior to transplantation. The structural properties and potential for transparency of collagens described above have led to the application of this group of proteins as biomaterials.

[0005] One disadvantage of the use of collagen-based biomaterials is the requirement for crosslinking of the collagen fibrils in order to achieve the required mechanical strength. Options available to crosslink collagen include physical crosslinking, chemical crosslinking, electro-compaction and photocrosslinking. However, each of the aforementioned methods has its drawbacks. Physical crosslinking generally results in lower optical properties for applications involving the eye. Chemical crosslinking methods may be toxic to cells. Electro-compaction results in a reduction in mechanical strength. Photocrosslinking can be slow and photosensitizing agents may be toxic to cells and / or affect the transparency of the biomaterials.

[0006] A need exists for collagen-based biomaterials with improved properties.

[0007] Rhegmatogenous retinal detachment (RRD) is a severe, potentially vision-threatening disease. RRD refers to tearing of the retina which can lead to irreversible vision loss and requires immediate surgery. Such tears are one of the main causes of retinal blindness worldwide, resulting in a significant social and economic burden. Generally, RRD is preceded by breaks in the retina, through which subretinal fluid can accumulate in the potential space between the neurosensory retina and the underlying retinal pigment epithelial (RPE) cells and lead to inflammation and proliferative vitreoretinopathy (PVR) . The release of pigmentary epithelial cells and glial cells through retinal breaks leads to the formation of epiretinal, intraretinal or subretinal membranes with strong contractile power, which then damage the function of the retina. Sealing retinal breaks completely during surgery could prevent PVR and RRD recurrence. Current RRD surgical treatment includes vitrectomy, laser and tamponade. However, none of these methods seal the breaks completely and as a result, RPE exposure still exists after surgery.

[0008] A need exists to improve the performance of surgery for RRD.

[0009] It is an object of the present invention to overcome or ameliorate one or more the disadvantages of the prior art, or at least to provide a useful alternative.Summary of the Invention

[0010] The present invention alleviates at least one of the problems associated with the production and effective use of collagen-based biomaterials. The present inventors have surprisingly developed collagen-based biomaterials which can be crosslinked in a short time and / or with the use of a low concentration of a photosensitizing agent and / or with the use of heat.

[0011] In the context of retinal and neural tissue, the inventors have surprisingly found that a biomaterial comprising collagen is compatible with cells, e.g., retinal pigment epithelial cells and / or Müller cells, and / or supports the growth and / or proliferation of cells, e.g., retinal pigment epithelial cells and / or Müller cells. Additionally, the collagen-based biomaterials of the present invention may be able to seal and / or repair breaks in retinal and / or neural tissue.

[0012] Without limitation, the compositions and methods described herein are generally useful for sealing and / or repairing tissue, the delivery of agents (e.g., cells, drugs and / or other substances) to biological targets (e.g., tissue, membranes, cells) and / or culturing cells. The compositions and methods may find application, for example, in tissue repair and / or regeneration.

[0013] The present invention relates at least in part to the following embodiments:

[0014] Embodiment 1. A composition comprising:

[0015] - 5-24 mg / ml collagen;

[0016] - 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions; and

[0017] - 0.0005-0.05 mg / ml riboflavin,

[0018] wherein the collagen comprises type I collagen, type II collagen and / or type IV collagen.

[0019] Embodiment 2. The composition of embodiment 1, wherein the composition comprises about 0.005 mg / ml riboflavin.

[0020] Embodiment 3. A composition comprising:

[0021] - 5-24 mg / ml collagen;

[0022] - 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions; and

[0023] - platelet lysate,

[0024] wherein the collagen comprises type I collagen, type II and / or type IV collagen.

[0025] Embodiment 4. The composition of embodiment 3, wherein the composition comprises 0.01%-40% (v / v) platelet lysate.

[0026] Embodiment 5. A composition comprising:

[0027] - 5-24 mg / ml collagen;

[0028] - 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions; and

[0029] - fibrinogen,

[0030] wherein the collagen comprises type I collagen, type II and / or type IV collagen.

[0031] Embodiment 6. The composition of embodiment 5, wherein the composition comprises 0.01-4 mg / ml fibrinogen.

[0032] Embodiment 7. The composition of any one of embodiments 1 to 6, wherein the composition further comprises mammalian cells.

[0033] Embodiment 8. The composition of embodiment 7, wherein the mammalian cells comprise or consist of human cells.

[0034] Embodiment 9. The composition of embodiment 7 or embodiment 8, wherein the mammalian cells comprise any one or more of: neuronal cells, neuroglial cells, epithelial cells, photoreceptor cells, Müller cells, endothelial cells, retinal pigment epithelial cells, therapeutic cells.

[0035] Embodiment 10. The composition of any one of embodiments 1 to 9, further comprising any one or more of: a culture medium, growth factors such as brain derived growth factor and neuronal growth factor, hormones, matrix proteins, glycoproteins, vitamins, ions other than sodium ions or calcium ions, ion sources, fibronectin, amino acids, antibiotics, anaesthetics, factor XIII, Fetal Bovine Serum (FBS) , Fetal Calf Serum (FCS) , human serum, therapeutic drugs such as neuroprotective, antifibrotic, anti-apoptotic, anti-vascular and regenerative medications, nucleic acids.

[0036] Embodiment 11. The composition of any one of embodiments 1 to 10, wherein the collagen is neutralised.

[0037] Embodiment 12. A method of preparing a composition, the method comprising:

[0038] (i) providing a first solution comprising:

[0039] - collagen, wherein the collagen comprises type I, type II collagen and / or type IV collagen; and

[0040] - sodium ions and / or calcium ions;

[0041] (ii) providing a second solution comprising riboflavin; and

[0042] (iii) combining the first solution and the second solution,

[0043] wherein the composition comprises:

[0044] - 6-24 mg / ml of the collagen;

[0045] - 0.04-0.15 M of the sodium ions and / or 0.008-0.4 M of the calcium ions; and

[0046] - 0.0005-0.05 mg / ml of the riboflavin.

[0047] Embodiment 13. A method of preparing a composition, the method comprising:

[0048] (i) providing a solution comprising:

[0049] - 6-24 mg / ml collagen, wherein the collagen comprises type I, type II collagen and / or type IV collagen;

[0050] - 0.0005-0.05 mg / ml riboflavin; and

[0051] - 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions;

[0052] (ii) applying the solution to a surface; and

[0053] (iii) activating the riboflavin.

[0054] Embodiment 14. The method of embodiment 13, wherein applying the solution to a surface forms a layer, and wherein steps (ii) and (iii) are repeated a plurality of times, wherein each layer is applied on top of the preceding layer.

[0055] Embodiment 15. The method of any one of embodiments 12 to 14, wherein the composition comprises about 0.005 mg / ml riboflavin.

[0056] Embodiment 16. The method of any one of embodiments 13 to 15, wherein the activating in step (iii) comprises applying light capable of activating the riboflavin.

[0057] Embodiment 17. A method of preparing a composition, the method comprising:

[0058] (i) providing a first solution comprising:

[0059] - collagen, wherein the collagen comprises type I, type II collagen and / or type IV collagen; and

[0060] - sodium ions and / or calcium ions;

[0061] (ii) providing a second solution comprising platelet lysate; and

[0062] (iii) combining the first solution and the second solution,

[0063] wherein the composition comprises:

[0064] - 6-24 mg / ml of the collagen;

[0065] - 0.04-0.15 M of the sodium ions and / or 0.008-0.4 M of the calcium ions; and

[0066] - the platelet lysate.

[0067] Embodiment 18. The method of embodiment 17, wherein the composition comprises 0.01%-40% (v / v) platelet lysate.

[0068] Embodiment 19. A method of preparing a composition, the method comprising:

[0069] (i) providing a first solution comprising:

[0070] - collagen, wherein the collagen comprises type I, type II collagen and / or type IV collagen; and

[0071] - sodium ions and / or calcium ions;

[0072] (ii) providing a second solution comprising fibrinogen; and

[0073] (iii) combining the first solution and the second solution,

[0074] wherein the composition comprises:

[0075] - 6-24 mg / ml of the collagen;

[0076] - 0.04-0.15 M of the sodium ions and / or 0.008-0.4 M of the calcium ions; and

[0077] - the fibrinogen.

[0078] Embodiment 20. The method of embodiment 19, wherein the composition comprises 0.01-4 mg / ml fibrinogen.

[0079] Embodiment 21. The method of any one of embodiments 12 to 20, further comprising adding mammalian cells.

[0080] Embodiment 22. The method of embodiment 21, wherein the mammalian cells comprise or consist of human cells.

[0081] Embodiment 23. The method of embodiment 21 or embodiment 22, wherein the mammalian cells comprise any one or more of: neuronal cells, neuroglial cells, epithelial cells, photoreceptor cells, Müller cells, endothelial cells, retinal pigment epithelial cells, therapeutic cells.

[0082] Embodiment 24. The method of any one of embodiments 12 to 23, wherein the composition further comprises any one or more of: a culture medium, growth factors such as brain derived growth factor and neuronal growth factor, hormones, matrix proteins, glycoproteins, vitamins, ions other than sodium ions or calcium ions, ion sources, fibronectin, amino acids, antibiotics, anaesthetics, factor XIII, Fetal Bovine Serum (FBS) , Fetal Calf Serum (FCS) , human serum, therapeutic drugs such as neuroprotective, antifibrotic, anti-apoptotic, anti-vascular and regenerative medications, nucleic acids.

[0083] Embodiment 25. The method of any one of embodiments 12 to 24, wherein the collagen is neutralised.

[0084] Embodiment 26. A composition obtained or obtainable by the method of any one of embodiments 12 to 25.

[0085] Embodiment 27. A method of sealing and / or repairing retinal tissue, the method comprising applying the composition of any one of embodiments 1 to 11 or 26 to the tissue.

[0086] Embodiment 28. A method of sealing and / or repairing brain tissue, the method comprising applying the composition of any one of embodiments 1 to 11 or 26 to the tissue.

[0087] Embodiment 29. A method of sealing and / or repairing retinal tissue, the method comprising applying to a subject in need thereof a composition comprising:

[0088] - 5-24 mg / ml collagen; and

[0089] - 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions,

[0090] wherein the collagen comprises type I collagen and / or type IV collagen.

[0091] Embodiment 30. A method of sealing and / or repairing brain tissue, the method comprising applying to a subject in need thereof a composition comprising:

[0092] - 5-24 mg / ml collagen; and

[0093] - 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions,

[0094] wherein the collagen comprises type I collagen and / or type IV collagen.

[0095] Embodiment 31. The method of embodiment 29 or embodiment 30, wherein the composition is applied at a temperature of about 37 ℃.

[0096] Embodiment 32. The method of embodiment 31, wherein the temperature is kept at about 37 ℃ for at least 1 minute.

[0097] Embodiment 33. The method of any one of embodiments 29 to 32, wherein the composition further comprises platelet lysate.

[0098] Embodiment 34. The method of embodiment 33, wherein the composition comprises 0.01%-40% (v / v) platelet lysate.

[0099] Embodiment 35. The method of any one of embodiments 29 to 32, wherein the composition further comprises fibrinogen.

[0100] Embodiment 36. The method of embodiment 35, wherein the composition comprises 0.01-4 mg / ml fibrinogen.

[0101] Embodiment 37. A method of delivering agents to tissue, the method comprising applying the composition of any one of embodiments 1 to 11 or 26 to the tissue.

[0102] Embodiment 38. A method of culturing cells, the method comprising applying the cells to the composition of any one of embodiments 1 to 11 or 26.

[0103] Embodiment 39. The method of embodiment 38, wherein the cells comprise or consist of Müller cells and / or retinal pigment epithelial cells.

[0104] Definitions

[0105] As used in this application, the singular form “a” , “an” and “the” include plural references unless the context clearly dictates otherwise. For example, the term “tissue” also includes a plurality of tissues.

[0106] As used herein, the term “comprising” means “including” . Variations of the word “comprising” , such as “comprise” and “comprises, ” have correspondingly varied meanings. Thus, for example, a composition “comprising” component ‘A’ may consist  exclusively of component ‘A’ or may include one or more additional components (e.g., component ‘B’ and / or component ‘C’ ) .

[0107] As used herein, the term “tissue” will be understood to encompass both cells that are component / s of the tissue and organ / s formed from the tissue.

[0108] As used herein, the term “kit” refers to any delivery system for delivering materials. Such delivery systems include systems that allow for the storage, transport, or delivery of reaction reagents (e.g., labels, reference samples, supporting material, etc. in appropriate containers) and / or supporting materials (e.g., buffers, written instructions for performing an assay etc. ) from one location to another. For example, kits may include one or more enclosures, such as boxes, containing the relevant reaction reagents and / or supporting materials.

[0109] As used herein, the term “about” when used in reference to a recited numerical value includes the recited numerical value and numerical values within plus or minus ten percent of the recited value.

[0110] As used herein, the term “plurality” means more than one. In certain specific aspects or embodiments, a plurality may mean 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, or more, and any numerical value derivable therein, and any range derivable therein.

[0111] As used herein, the term “between” when used in reference to a range of numerical values encompasses the numerical values at each endpoint of the range. For example, calcium ions with a concentration of between 0.008 M and 0.4 M is inclusive of calcium ions with a concentration 0.008 M and calcium ions with a concentration 0.4 M.

[0112] As used herein, the term “more than” when used in reference to a numerical value will be understood to mean “greater than or equal to” . For example, more than 0.018 M calcium ions encompasses a concentration of 0.018 M calcium ions and all concentrations of calcium ions greater than 0.018 M.

[0113] As used herein, the term “less than” when used in reference to a numerical value will be understood to mean “less than or equal to” . For example, less than 15 mg / ml collagen encompasses a concentration of 15 mg / ml collagen and all concentrations of collagen less than 15 mg / ml.

[0114] As used herein, the term “neutralised” when used to describe collagen will be understood to mean that the pH of the collagen solution is between 6.7 and 7.6. For  example, “neutralised” collagen could have a pH between 6.8 and 7.5, or between 6.9 and 7.4, or between 7.0 and 7.3, or between 6.9 and 7.2, etc.

[0115] As used herein, the term “culturing” , when used in the context of cells, will be understood to mean promoting the growth and / or proliferation of cells. Variations of the word “culturing” , such as “culture” and “cultures, ” have correspondingly varied meanings. Thus, for example, a method of “culturing” cells will be understood to mean a method of promoting an increase in both the size and number of cells.

[0116] As used herein, the term “crosslink” , when used in reference to collagen, will be understood to mean an increase in intra-and intermolecular covalent bonds. Variations of the word “crosslink” , such as “crosslinked” and “crosslinking, ” have correspondingly varied meanings. In some instances, collagen “crosslinking” will be understood to mean an increase in intra-and interfibrillar covalent bonds in collagen fibrils.

[0117] Any description of prior art documents herein, or statements herein derived from or based on those documents, is not an admission that the documents or derived statements are part of the common general knowledge of the relevant art.

[0118] For the purposes of description, all documents referred to herein are hereby incorporated by reference in their entirety unless otherwise stated.

[0119] Brief Description of the Figures

[0120] Preferred embodiments of the present invention will now be described by way of example only, with reference to the accompanying figures wherein:

[0121] Figure 1 provides a representative image of a Backflush Flute Needle used during vitrectomy.

[0122] Figure 2 provides representative images of light sources used during vitrectomy. Figure 2A provides an exemplary image of a commercially available light source. Figure 2B depicts the intraoperative role of a light source.

[0123] Figure 3 provides a representative image of an in-house built burst pressure testing device.

[0124] Figure 4 provides representative images of methods used to test brain tissue adhesion. A. shows the exterior of a half sheep’s brain; B. shows the interior of brain tissue; C. provides a representative image of a collagen IV bioink applied on the meninx; D. shows a collagen IV bioink applied on white matter; E. provides a representative image of a  collagen IV bioink applied on grey matter; F. shows a collagen IV bioink applied on a brainstem.

[0125] Figure 5 provides representative images of tissue culture of mouse retinas. A. provides an image of a mouse retina in basic DMEM. B. provides an exemplary image of a mouse retina in complete DMEM after 4 hours of initial culture.

[0126] Figure 6 provides representative images of testing for minimum concentrations of compositions used on retinal breaks using a porcine eye.

[0127] Figure 7 provides representative images of ARPE-19 and MIO-M1 cell morphology observed after 1 day of culturing. A. shows a control of ARP-19 cells cultured on an uncoated coverslip. B. depicts ARPE-19 cells cultured on a collagen I membrane on a coverslip, C. shows ARPE-19 cells cultured on a collagen I and IV mixed membrane on a coverslip, D. provides an exemplary image of a control of MIO-M1 cells cultured on an uncoated coverslip, E. shows MIO-M1 cells cultured on a collagen I membrane. F. provides an image of MIO-M1 cells cultured on a collagen I and IV mixed membrane. Magnification of 10x, scale bar represents 200 μm.

[0128] Figure 8 provides representative images taken following double labelling of ARPE-19 cells applied on a control coverslip (A) , collagen I membrane (B) and collagen I and IV mixture membrane (C) using antibodies against ZO-1 (green) and phalloidin (red) . Stronger phalloidin positive fibers and junctions could be observed between cells on the collagen I membrane and mixed membrane. Scale bar represents 50 μm.

[0129] Figure 9 provides representative images taken following double labelling of MIO-M1 cells applied on a control coverslip (A) , collagen I membrane (B) and collagen I and IV mixed membrane (C) using antibodies against CRALBP (a Müller cell marker, green) and GFAP (a Müller cell gliosis marker, red) . Scale bar represents 50 μm.

[0130] Figure 10 provides exemplary images taken following double labelling of MIO-M1 cells applied on a control coverslip (A) , collagen I membrane (B) and collagen I and IV mixed membrane (C) using antibodies against HO-1 (a functional antioxidant enzyme from Müller cells, green) and GS (a Müller cell activation marker, red) . Scale bar represents 50 μm.

[0131] Figure 11 provides representative images after 2-hour oxidative stress treatment with COCl2: double labelling of MIO-M1 cells applied on control coverslip (A) , collagen I membrane (B) and collagen I and IV mixed membrane (C) using antibodies against a-SMA  (a fibroblast marker, green) and GFAP (a Müller cell gliosis marker, red) . Scale bar represents 50 μm.

[0132] Figure 12 provides exemplary images taken 24 hours after retinal tissue culture. Cells (red arrows) moved from retinal tissue to collagen I and collagen IV membranes. Magnification of 10x, scale bar represents 200 μm.

[0133] Figure 13 provides representative images of RPE migration (A) , Müller cell growth (B) from tissue edge (red arrows) and RPE cell growth (C) on a collagen I membrane 72 hours after retinal tissue culture. A, B: Magnification of 10x, C: Magnification of 20x, scale bar represents 200 μm.

[0134] Figure 14 provides exemplary images taken after full-thickness incisions were made to mouse retinas on day 0.28 days after tissue culture, no cell growth and tissue repair were observed on the control coverslip (A) . Repairing cells could be observed on the collagen I membrane (B) and to a lesser extent on the collagen IV membrane (C) . Magnification of 10x, scale bar represents 200 μm.

[0135] Figure 15 A-L provides representative images of scratched wounds created on collagen I membranes with retinal tissue. The wounded areas were monitored from day 0 to day 7. The scratched areas are highlighted by white dashed lines in A-L. A, E, I represent one scratched area created on the surface of a coverslip without collagen I used as a control. B, F, J represent another control. C-L represent wounds created in cells cultured on a collagen I membrane. Figure 15M provides a graph of quantitative analyses of scratched areas between the control and the collagen I group. *P<0.05 and ****P<0.0001. Multiple unpaired t-tests were performed between the collagen I and the control groups. N=3 / group. Magnification of 4x, scale bar represents 200 μm.Detailed description

[0136] The present inventors have developed collagen-based biomaterials which can be crosslinked in a short time and / or with the use of a low concentration of a photosensitizing agent and / or with the use of heat. The present invention provides improved compositions and methods for delivering agents to a broad variety of biological targets and / or for cell culture. Without limitation to any particular application, the compositions may be used for tissue repair and / or regeneration.

[0137] In the context of retinal and brain tissue, the inventors have surprisingly found that improved biomaterials comprising collagen are compatible with retinal and neuronal cells,  e.g., retinal pigment epithelial cells and / or Müller cells, and / or support the growth and / or proliferation of cells, e.g., retinal pigment epithelial cells and / or Müller cells. Additionally, the collagen-based biomaterials of the present invention may be able to seal and / or repair breaks in retinal and / or brain tissue.

[0138] There is a need in the art for effective collagen-derived biomaterials which may aid tissue repair and / or regeneration by providing replacement tissue and / or replacement cells. The compositions of the present invention are also ideal agents for the delivery of a diverse range of growth factors and other agents. The compositions described herein may utilise biomaterial that mimics in vivo tissue and acts as a scaffold for cells to populate, and / or, through the manipulation of conditions, encourage the cells themselves to regenerate their surrounding matrix. In the context of their suitability for application to retinal and / or neural tissue the present inventors have, for example, addressed the difficulties of creating a matrix that can embody the structural integrity of the tissue under treatment (e.g., the retina and / or the brain) whilst maintaining transparency and still being porous and biocompatible enough to allow for the infiltration, migration and / or proliferation of retinal and / or neuronal cells and growth factors.

[0139] Compositions of the invention

[0140] The compositions described herein may utilise collagen as a base scaffold material to provide structural support upon application to a biological target (e.., tissues, membranes, cells, organs) , to facilitate the sealing and / or repair of the biological target and / or the delivery of agents to the target.

[0141] The compositions may comprise type I collagen, type II collagen, type IV collagen or a mixture of one or more of these collagen types. The collagen in the compositions may be unmodified when compared to its naturally occurring counterpart. Modified collagen may also be used. In some embodiments, the modifications are at the end of the collagen fibre. The collagen may be neutralised.

[0142] The present inventors have identified optimal relative concentrations of collagen, sodium ions, calcium ions and other components for the compositions of the present invention, some of which are described in the Examples and claims. It will be understood that the relative concentrations of collagen, sodium ions, calcium ions and / or other components of the compositions disclosed are exemplary only.

[0143] The compositions of the present invention may further optionally comprise ions and / or one or more sources of ions. Non-limiting examples of suitable ions include calcium  ions and sodium ions. Non-limiting examples of suitable ion sources include compounds comprising calcium (e.g., calcium chloride) and sodium (e.g., sodium chloride) . Calcium ions and sodium ions may be present in the compositions of the present invention together or individually, for example, a composition may comprise 5-24 mg / ml collagen, 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions. The composition may comprise 1-20 mg / ml collagen, 0.07-0.5 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions. In some embodiments, the composition may comprise 1-20 mg / ml collagen, 0.06-0.25 M sodium ions and / or 0.008-0.1 M calcium ions. The composition may comprise 3-15 mg / ml collagen, 0.06-0.25 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions. Other potential ranges for components of the composition include but are not limited to 6-24 mg / ml collagen, 0.06-0.1 M sodium ions, and 0.01-0.05 M calcium ions, 5-15 mg / ml collagen, 0.06-0.08 M sodium ions, and 0.015-0.03 M calcium ions, 5-12 mg / ml collagen, 0.06-0.07 M sodium ions, and 0.018-0.02 M calcium ions, or 3-15 mg / ml collagen, 0.06-0.1 M sodium ions and / or 0.01-0.05 M calcium ions. In some embodiments, the composition may comprise 4-12 mg / ml collagen, 0.06-0.08 M sodium ions and / or 0.015-0.03 M calcium ions. Alternatively, the composition may comprise 5-10 mg / ml collagen, 0.06-0.07 M sodium ions and / or 0.018-0.02 M calcium ions. In some embodiments, the composition may comprise less than 15 mg / ml collagen and more than 0.06 M sodium ions and / or more than 0.018 M calcium ions.

[0144] Compositions of the invention may comprise less than 24 mg / ml collagen, or less than 23 mg / ml collagen, or less than 22 mg / ml collagen, or less than 21 mg / ml collagen, or less than 20 mg / ml collagen, or less than 19 mg / ml collagen, or less than 18 mg / ml collagen, or less than 17 mg / ml collagen, or less than 16 mg / ml collagen, or less than 15 mg / ml collagen, or less than 14 mg / ml collagen, or less than 13 mg / ml collagen, or less than 12 mg / ml collagen, or less than 11 mg / ml collagen, or less than 10 mg / ml collagen, or less than 9 mg / ml collagen, or less than 8 mg / ml collagen, or less than 7 mg / ml collagen, or less than 6 mg / ml collagen, or less than 5 mg / ml collagen, or less than 4 mg / ml collagen.

[0145] In other embodiments, the compositions may comprise more than 0.02 M sodium ions, or more than 0.03 M sodium ions, or more than 0.04 M sodium ions, or more than 0.05 M sodium ions, or more than 0.06 M sodium ions, or more than 0.07 M sodium ions, or more than 0.08 M sodium ions, or more than 0.09 M sodium ions, or more than 0.1 M sodium ions.

[0146] In further embodiments, the compositions may comprise more than 0.006 M calcium ions, or more than 0.007 M calcium ions, or more than 0.008 M calcium ions, or more than 0.009 M calcium ions, or more than 0.01 M calcium ions, or more than 0.011 M calcium ions, or more than 0.012 M calcium ions, or more than 0.013 M calcium ions, or more than 0.014 M calcium ions, or more than 0.015 M calcium ions, or more than 0.016 M calcium ions, or more than 0.017 M calcium ions, or more than 0.018 M calcium ions. One non-limiting composition of the invention comprises less than 24 mg / ml collagen, more than 0.04 M sodium ions and more than 0.008 M calcium ions.

[0147] The compositions may further comprise one or more crosslinking agents, for example, riboflavin. The riboflavin may be present in the compositions at a concentration of 0.0005-0.05 mg / ml. Other exemplary compositions may comprise riboflavin at a concentration of 0.001-0.009 mg / ml or at about 0.005 mg / ml riboflavin. In other embodiments of the invention, the riboflavin concentration is 0.01-0.5% (w / v) . In some compositions and / or methods of the invention, riboflavin could be present at an amount of about 0.01-0.1 mg. In some embodiments, the amount of riboflavin present is 0.01, 0.1 mg or any amount between these values.

[0148] One exemplary composition of the invention comprises 5-24 mg / ml collagen, 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions, and 0.0005-0.05 mg / ml riboflavin. In another embodiment, the composition comprises 5-24 mg / ml collagen, 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions, and 0.001-0.009 mg / ml riboflavin. In a further embodiment, the composition comprises 5-24 mg / ml collagen, 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions, and about 0.005 mg / ml riboflavin.

[0149] Light, such as UV light or blue light could be used to activate the riboflavin, crosslinking the composition. The person skilled in the art will be aware of other suitable crosslinking agents and / or light sources, for example, Rose Bengal dye and green light. In some embodiments, Rose Bengal is used as a photocrosslinking agent and is activated by green light. Alternatively, Rose Bengal is used as a photocrosslinking agent and is activated by white light. In some embodiments, 0.01-0.5% (w / v) Rose Bengal is used for photocrosslinking. In further embodiments, compositions provided by crosslinking the collagen composition with Rose Bengal and a suitable light source will be coloured. In some embodiments, the colour will be pink. These coloured compositions may be used for monitoring collagen metabolism in tissue, or for other uses requiring tracking of collagen  activity. In other embodiments, crosslinking agents may comprise fibrinogen and / or thrombin.

[0150] Alternatively, the compositions may be crosslinked by the application of heat. In some embodiments of the invention, the compositions are crosslinked at a temperature of about 37 ℃. During said crosslinking, the temperature may be kept at about 37 ℃ for between 10 seconds and 7 minutes, or between 20 seconds and 6 minutes, or between 30 seconds and 5 minutes, or between 40 seconds and 4 minutes, or between 50 seconds and 3 minutes, or between 1 minute and 2 minutes, or for at least 1 minute.

[0151] Compositions of the invention may also comprise platelet lysate. The platelet lysate may be human platelet lysate. One exemplary composition of the invention comprises 5-24 mg / ml collagen, 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions, and 0.05%-5%(v / v) platelet lysate. Another composition may comprise 5-24 mg / ml collagen, 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions, and 0.01%-40% (v / v) platelet lysate. In some embodiments of the invention, the composition comprises more than 0.01% (v / v) platelet lysate, or more than 0.02% (v / v) platelet lysate, or more than 0.03% (v / v) platelet lysate, or more than 0.04% (v / v) platelet lysate, or more than 0.05% (v / v) platelet lysate, or more than 0.06% (v / v) platelet lysate, or about 0.05% (v / v) platelet lysate.

[0152] Fibrinogen may also be a component of the compositions of the invention. One non-limiting example of a composition of the invention comprises 5-24 mg / ml collagen, 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions, and 0.01-2 mg / ml fibrinogen. Another composition may comprise 5-24 mg / ml collagen, 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions, and 0.01-4 mg / ml fibrinogen. In some embodiments of the invention, the composition comprises more than 0.01 mg / ml fibrinogen, or more than 0.02 mg / ml fibrinogen, or more than 0.03 mg / ml fibrinogen, or more than 0.04 mg / ml fibrinogen, or more than 0.05 mg / ml fibrinogen, or more than 0.06 mg / ml fibrinogen, or more than 0.07 mg / ml fibrinogen, or more than 0.08 mg / ml fibrinogen, or more than 0.09 mg / ml fibrinogen, or more than 0.1 mg / ml fibrinogen, or more than 0.11 mg / ml fibrinogen, or more than 0.12 mg / ml fibrinogen, or more than 0.13 mg / ml fibrinogen, or more than 0.14 mg / ml fibrinogen, or more than 0.15 mg / ml fibrinogen, or more than 0.16 mg / ml fibrinogen, or more than 0.17 mg / ml fibrinogen, or more than 0.18 mg / ml fibrinogen, or more than 0.19 mg / ml fibrinogen, or more than 0.2 mg / ml fibrinogen, or about 0.2 mg / ml fibrinogen.

[0153] The compositions may further comprise cells. The cells may, for example, be mammalian cells (e.g., human cells, canine cells, feline cells, bovine cells, porcine cells, equine cells, caprine cells, hircine cells, murine cells, leporine cells, cricetine cells, musteline cells, or any combination thereof) . The type of cells utilised will generally depend on the specific purpose for which the composition is to be used. For example, the cells may be of the same type as a tissue to which the composition is to be administered (e.g., retinal epithelial cells, Müller cells, eye surface cells including those of the central and / or peripheral corneal epithelium, bulbar and / or tarsal conjunctival epithelia, tarsal conjunctival stroma, and / or lid margin; skin cells including but not limited to keratinocytes, melanocytes, Merkel cells, and Langerhans cells; and neural tissue cells including but not limited to neurons and glial cells) . Other examples include epithelial cells, keratocytes, neuronal cells, neuroglial cells, photoreceptor cells and endothelial cells. The endothelial cells may be primary endothelial cells. In some embodiments, the cells may be hematopoietic stem cells, bone marrow stem cells, neural stem cells, epithelial stem cells, skin stem cells, muscle stem cells, adipose stem cells, pluripotent stem cells, induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, or any combination thereof. In some embodiments, the cells may be neuronal cells. One non-limiting example of suitable epithelial cells is retinal epithelial cells. A non-limiting example of suitable endothelial cells is corneal endothelial cells. The cells of the compositions may be autologous (i.e., self-derived from a given subject intended to receive the composition, or allogeneic (i.e., donor-derived) . The cells may be therapeutic cells, i.e., cells suitable for use in cell therapy.

[0154] The compositions of the present invention may comprise essential and / or non-essential amino acids. Non-limiting examples of suitable essential amino acids include isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, cysteine, tyrosine, histidine and arginine.

[0155] The compositions of the present invention may comprise additional components (e.g., agent / s) including, but not limited to, fibronectin, anaesthetics, antibiotics, hormones (e.g., insulin) , growth factors (e.g., human epidermal growth factor (hEGF) , platelet derived growth factor, vascular endothelial growth factor, fibroblast growth factor (FGF) , epithelial growth factor, transforming growth factor [including beta] , brain derived growth factor, neuronal growth factor and connective tissue growth factor) , fibrin stabilizing factors (e.g., factor XIII) , matrix protein / s (e.g., collagen [such as type II collagen] , laminin, integrin) ,  vitamins (e.g., vitamin C, riboflavin) , glycoproteins (e.g., transferrin) , Fetal Bovine Serum (FBS) , Fetal Calf Serum (FCS) , human serum, platelet lysate, human platelet lysate, therapeutic drugs such as neuroprotective, antifibrotic, anti-apoptotic, anti-vascular and regenerative medications, nucleic acids, and any combination thereof. The nucleic acids may be used in gene therapy. In some embodiments, the composition comprises a culture medium comprising the ions and amino acids. Non-limiting examples of suitable growth factors include vascular endothelial growth factor (VEGF) , brain derived growth factor, neuronal growth factor and fibroblast growth factor (FGF) . The vitamins may be ascorbate (vitamin C) and / or riboflavin. The matrix proteins could include, but are not limited to, type II collagen; and / or laminin.

[0156] The compositions of the present invention may include other suitable ingredients including water and / or culture medium (e.g., DMEM, DMEM / F-12, MEM, CnT-PR) . The culture medium may comprise, for example, any one or more of Glycine, L-Alanine, L-Arginine hydrochloride, L-Asparagine-H2O, L-Aspartic acid, L-Cysteine hydrochloride-H2O, L-Cystine 2HCl, L-Glutamic Acid, L-Glutamine, L-Histidine hydrochloride-H2O, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine hydrochloride, L-Methionine, L-Phenylalanine, L-Proline, L-Serine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Tyrosine disodium salt dihydrate, L-Valine, Vitamins, Biotin, Choline chloride, D-Calcium pantothenate, Folic Acid, Niacinamide Pyridoxine hydrochloride, Riboflavin, Thiamine hydrochloride, Vitamin B12, i-Inositol, Inorganic Salts, Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd. ) , Cupric sulfate (CuSO4-5H2O) , Ferric Nitrate (Fe (NO3) 3"9H2O) , Ferric sulfate (FeSO4-7H2O) , Magnesium Chloride (anhydrous) , Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd. ) , Potassium Chloride (KCl) , Sodium Bicarbonate (NaHCO3) , Sodium Chloride (NaCl) , Sodium Phosphate dibasic (Na2HPO4) anhydrous, Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-, Zinc sulfate (ZnSO4-7H2O) , Other Components, D-Glucose (Dextrose) , Hypoxanthine Na, Linoleic Acid, Lipoic Acid, Putrescine 2HCl, Sodium Pyruvate, Thymidine, or any combination thereof. In some embodiments, ions are provided as components of an ionic salt included in the composition.

[0157] Non-limiting properties of the compositions include one or more of the following:

[0158] - Non-Newtonian shear-thinning fluid properties, whereby the viscosity of the composition may decrease as the shear-rate increases. In some embodiments, the viscosity of the compositions may be in the range of 0.01 and 1000 Pa. sat room temperature.

[0159] - Optical clarity without impeding or without substantially impeding vision arising from transmittance of light, for example, over 90%in the visual colour range of 400-700nm.

[0160] - Suitability for 2D and / or 3D printing (e.g., bioprinting / extrusion printing) with capacity to maintain or substantially maintain shape / structure following printing.

[0161] - Suitability for printing while maintaining the viability of cells within the composition during the printing process.

[0162] - Capacity to be provided in two-or three-dimensional structure with or without the inclusion of viable cells.

[0163] - Capacity to sustain and / or promote the growth of cells (e.g., sustain and / or promote the expansion growth of primary human cells such as epithelial cells (e.g., retinal epithelial cells) , Müller cells, neuroglial cells, keratocytes, neuronal cells, endothelial cells and therapeutic cells.

[0164] - Capacity to promote the formation of spheroid organoids.

[0165] - Capacity for degradation by cells over time (e.g., 2-7 days) .

[0166] - Maintenance of cell viability over time (e.g., 7 days at 34℃) .

[0167] - Capacity to adhere to various surfaces, including tissues, organs, membranes (e.g., mammalian and human tissues, organs, membranes) .

[0168] The compositions of the present invention may be printable collagen bioinks with mechanical and structural properties that may facilitate application to tissue in a structured form. The bioinks of the present invention may be compatible with cells, e.g., retinal epithelial cells and or Müller cells and / or may support the growth and / or proliferation of cells. The compositions of the present invention may be used to apply collagen gels to tissue (e.g., eye tissue) using two-or three-dimensional (extrusion) bioprinting techniques. The compositions may provide a means of delivering agents to biological targets (e.g., organs, tissues, cells) . While suitable for application to the retina and / or the brain, the compositions described herein provide a platform for numerous applications in the areas of tissue repair and / or regeneration, culturing cells and the delivery of agents by virtue of providing, for example, structural support, viable cells, and other factors.

[0169] Preparation of compositions

[0170] In general, the compositions of the present invention may be prepared by combining a plurality of different preparations. Lyophilised bovine collagen may be used in the preparation of the compositions. Additionally or alternatively, human collagen may be  used. The collagen may be neutralised prior to the addition of ions and other components of the compositions. A person skilled in the art would recognise that various buffer solutions could be used to keep the collagen at physiological pH and to maintain solubility.

[0171] In one exemplary embodiment of the invention, a composition is prepared by providing a first solution comprising collagen, wherein the collagen comprises type I collagen, type II collagen and / or type IV collagen, and sodium ions and / or calcium ions; providing a second solution comprising riboflavin; and combining the first solution and the second solution, wherein the composition comprises: 6-24 mg / ml of the collagen; 0.04-0.15 M of the sodium ions and / or 0.008-0.4 M of the calcium ions; and 0.0005-0.05 mg / ml of the riboflavin. In some embodiments of the invention, the composition is then applied to a surface, and the riboflavin is activated. Applying the solution to a surface may form a layer. In further embodiments of the invention, the solutions are combined and applied to a surface a plurality of times, each layer being applied on top of the preceding layer. The concentration of riboflavin used in the methods of the invention may be quite low, for example, 0.001-0.009 mg / ml or about 0.005 mg / ml.

[0172] Light, such as UV light or blue light, could be used to activate the riboflavin, crosslinking the composition. The solution, which may contain collagen and sodium and / or calcium ions, may be extruded in a line and UV light or blue light may be applied. Additional lines may be applied on top of the first line to form a structure which will be crosslinked by the crosslinking agent and the application of light.

[0173] In some embodiments, crosslinking occurs in under 15 minutes, under 14 minutes, under 13 minutes, under 12 minutes, under 11 minutes, under 10 minutes, under 9 minutes, under 8 minutes, under 7 minutes, under 6 minutes, under 5 minutes, under 4 minutes, under 3 minutes, under 2 minutes or under 1 minute. The light source used may be 3 mW / cm2 365 nm UV, 10mW / cm2 blue light or a tissue culture hood UV lamp.

[0174] As outlined above, the person skilled in the art will be aware of other suitable crosslinking agents and / or light sources, for example, Rose Bengal dye and green light. In some embodiments, Rose Bengal is used as a photocrosslinking agent and is activated by green light. Alternatively, Rose Bengal is used as a photocrosslinking agent and is activated by white light. In some embodiments, 0.01-0.5% (w / v) Rose Bengal is used for photocrosslinking. In further embodiments, compositions provided by crosslinking the collagen composition with Rose Bengal and a suitable light source will be coloured. In  some embodiments, the colour will be pink. In other embodiments, crosslinking agents may comprise fibrinogen and / or thrombin.

[0175] Crosslinking with the use of Rose Bengal may occur in under 15 minutes, under 14 minutes, under 13 minutes, under 12 minutes, under 11 minutes, under 10 minutes, under 9 minutes, under 8 minutes, under 7 minutes, under 6 minutes, under 5 minutes, under 4 minutes, under 3 minutes, under 2 minutes or under 1 minute. The light source used may be 100 mw / cm2 white light. The person skilled in the art would realise that the light source and parameters could be varied according to the particular application.

[0176] Alternatively, the compositions may be crosslinked by the application of heat. In some embodiments of the invention, the compositions are crosslinked at a temperature of about 37 ℃. During said crosslinking, the temperature may be kept at about 37 ℃ for between 10 seconds and 7 minutes, or between 20 seconds and 6 minutes, or between 30 seconds and 5 minutes, or between 40 seconds and 4 minutes, or between 50 seconds and 3 minutes, or between 1 minute and 2 minutes, or for at least one minute.

[0177] In another non-limiting embodiment of the invention, a composition is prepared by providing a first solution comprising collagen, wherein the collagen comprises type I collagen, type II collagen and / or type IV collagen, sodium ions and / or calcium ions; providing a second solution comprising platelet lysate; and combining the first solution and the second solution, wherein the composition comprises 6-24 mg / ml of the collagen, 0.04-0.15 M of the sodium ions and / or 0.008-0.4 M of the calcium ions, and the platelet lysate. The platelet lysate may comprise or consists of human platelet lysate. The composition may comprise, for example, 0.01%-40%platelet lysate or 0.05%-5% (v / v) platelet lysate.

[0178] In another exemplary method of the invention, a composition is prepared by providing a first solution comprising collagen, wherein the collagen comprises type I collagen, type II collagen and / or type IV collagen, sodium ions and / or calcium ions; providing a second solution comprising fibrinogen; and combining the first solution and the second solution, wherein the composition comprises 6-24 mg / ml of the collagen, 0.04-0.15 M of the sodium ions and / or 0.008-0.4 M of the calcium ions, and the fibrinogen. The composition may comprise, for example, 0.01-2 mg / ml fibrinogen or 0.01-4 mg / ml fibrinogen.

[0179] The methods of the present invention may further comprise adding cells, for example, retinal pigment epithelial cells and / or Müller cells. Other non-limiting examples of components of the compositions which could be added during preparation include a culture  medium, growth factors such as brain derived growth factor and neuronal growth factor, hormones, matrix proteins, glycoproteins, vitamins, ions other than sodium ions or calcium ions, ion sources, fibronectin, amino acids, antibiotics, anaesthetics, factor XIII, Fetal Bovine Serum (FBS) , Fetal Calf Serum (FCS) , human serum, therapeutic drugs such as neuroprotective, antifibrotic, anti-apoptotic, anti-vascular and regenerative medications, and nucleic acids.

[0180] The collagen gels of the present invention may have various thicknesses according to the application, for example, the thickness of a gel could be between 50 μm to 3 mm.

[0181] In some embodiments, the invention provides devices and / or kits for the preparation of the compositions. The devices and / or kits may facilitate the separation of different preparations needed to form the compositions of the invention until use.

[0182] The devices and kits may further comprise a component providing a means to facilitate mixing of the two compartmentalised preparations such as, for example, by removal of barrier / sseparating the first and second compartments, and / or by puncturing a seal or wall of either or both compartments. The skilled person will readily understand that various arrangements can be made for this purpose.

[0183] Additionally or alternatively, devices and kits may be configured in a manner that ensures mixing of the two compartmentalised preparations during or following release of the preparations from the device or kit.

[0184] In some embodiments, the devices and kits may comprise additional compartments comprising additional components to be used in generating the composition (e.g., platelet lysate, ions, amino acids, cells, antibiotics, growth factors, fibrin stabilizing factors, anaesthetics, and so on) . The device or kit may be configured in such a way to facilitate mixing of these additional components with each other and / or with the other components of the compositions.

[0185] The devices and kits may facilitate mixing of separated components prior to, during or immediately following discharge of the components from the device or kit.

[0186] In some embodiments, the compositions are bioinks and the device is a three-dimensional (3D) printer (e.g., an extrusion printer) .

[0187] One non-limiting example of a kit, package or device of the present invention comprises 5-24 mg / ml collagen, 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions, and 0.0005-0.05 mg / ml riboflavin. The collagen may comprise type I collagen, type II  collagen and / or type IV collagen. In other embodiments of the invention, the kit may comprise 0.001-0.009 mg / ml riboflavin, or about 0.005 mg / ml riboflavin.

[0188] Another exemplary kit, package or device of the present invention comprises 5-24 mg / ml collagen, 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions, and platelet lysate. The platelet lysate may be human platelet lysate. The kit, package or device may be used to prepare a composition comprising more than 0.01% (v / v) platelet lysate, or more than 0.02% (v / v) platelet lysate, or more than 0.03% (v / v) platelet lysate, or more than 0.04% (v / v) platelet lysate, or more than 0.05% (v / v) platelet lysate, or more than 0.06%(v / v) platelet lysate, or about 0.05% (v / v) platelet lysate.

[0189] In another embodiment, the invention provides a kit, package or device comprising 5-24 mg / ml collagen, 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions and fibrinogen. The kit, package or device may be used to prepare a composition comprising more than 0.01 mg / ml fibrinogen, or more than 0.02 mg / ml fibrinogen, or more than 0.03 mg / ml fibrinogen, or more than 0.04 mg / ml fibrinogen, or more than 0.05 mg / ml fibrinogen, or more than 0.06 mg / ml fibrinogen, or more than 0.07 mg / ml fibrinogen, or more than 0.08 mg / ml fibrinogen, or more than 0.09 mg / ml fibrinogen, or more than 0.1 mg / ml fibrinogen, or more than 0.11 mg / ml fibrinogen, or more than 0.12 mg / ml fibrinogen, or more than 0.13 mg / ml fibrinogen, or more than 0.14 mg / ml fibrinogen, or more than 0.15 mg / ml fibrinogen, or more than 0.16 mg / ml fibrinogen, or more than 0.17 mg / ml fibrinogen, or more than 0.18 mg / ml fibrinogen, or more than 0.19 mg / ml fibrinogen, or more than 0.2 mg / ml fibrinogen, or about 0.2 mg / ml fibrinogen.

[0190] The kits, packages and / or devices may further comprise cells, for example, retinal pigment epithelial cells and / or Müller cells. Other non-limiting examples of components of the kits, packages or devices include a culture medium, growth factors such as brain derived growth factor and neuronal growth factor, hormones, matrix proteins, glycoproteins, vitamins, ions other than sodium ions or calcium ions, ion sources, fibronectin, amino acids, antibiotics, anaesthetics, factor XIII, Fetal Bovine Serum (FBS) , Fetal Calf Serum (FCS) , human serum, therapeutic drugs such as neuroprotective, antifibrotic, anti-apoptotic, anti-vascular and regenerative medications, and nucleic acids.

[0191] Applications of the compositions

[0192] The present inventors have developed compositions which may be used for sealing and / or repairing tissue. Examples of tissue which may be sealed and / or repaired using the compositions of the invention are retinal tissue and neural tissue. In some embodiments of  the invention, retinal tissue and / or neural tissue may be sealed and / or repaired by the application of a composition comprising 5-24 mg / ml type I, type II and / or type IV collagen, 0.04-0.15 sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions and by applying heat. The composition may be applied at a temperature of about 37 ℃. The temperature may be kept at about 37 ℃ for between 10 seconds and 7 minutes, or between 20 seconds and 6 minutes, or between 30 seconds and 5 minutes, or between 40 seconds and 4 minutes, or between 50 seconds and 3 minutes, or between 1 minute and 2 minutes, or for at least one minute. Compositions used in these methods may further comprise platelet lysate, for example, human platelet lysate, and / or fibrinogen.

[0193] In further embodiments, retinal tissue and / or neural tissue may be sealed and / or repaired by the application of a composition of the invention which includes riboflavin. This composition may be crosslinked via light activation.

[0194] One non-limiting example of an application of the compositions of the invention in sealing and / or repairing retinal tissue is during vitrecomy.

[0195] In one non-limiting embodiment, the compositions of the invention may be used in sealing and / or repairing tissue, for example retinal tissue and / or neural tissue, in combination with laser treatment.

[0196] Characteristics of the compositions of the present invention make them highly suitable for bioprinting. In addition to their use in therapeutic applications in sealing and / or repairing tissue, the compositions of the present invention may be used in therapeutic applications where there is a need for delivery of agents (e.g., growth factors, therapeutic drugs, vitamins, matrix proteins and / or cells) and / or for the fixation of individual biological surfaces, and / or in tissue culture methods.

[0197] In some embodiments the compositions can act as a fixative for biological structures. They may provide structural and / or nutritional support to a wound. Additionally or alternatively, the compositions may facilitate the growth of target cell type / s, including those which may be provided as a component of the compositions.

[0198] While no limitation exists as to the type of tissue to which the compositions may be applied, the present inventors have demonstrated that the compositions are highly effective in the sealing and / or repair of retinal and brain tissue, for example, the grey matter.

[0199] In these embodiments, the compositions may be used to promote the proliferation and / or migration of cells such as retinal pigment epithelial cells or Müller cells. The  compositions may, for example, support multidirectional growth and / or stratification of cells.

[0200] The present invention thus provides methods for sealing / repairing tissue, and medicaments manufactured for such treatment methods. The tissue may, for example, be located in or around the eye or the brain.

[0201] The present invention also provides methods for the delivery of a variety of agents to biological targets. The targets may, for example, be located in or around eye or brain tissue.

[0202] It will be appreciated by persons of ordinary skill in the art that numerous variations and / or modifications can be made to the present invention as disclosed in the specific embodiments without departing from the spirit or scope of the present invention as broadly described. The present embodiments are, therefore, to be considered in all respects as illustrative and not restrictive.

[0203] Examples

[0204] The present invention will now be described with reference to specific Examples, which should not be construed as in any way limiting.

[0205] Example One:

[0206] Materials and methods

[0207] Collagen I / IV for tissue application

[0208] Two types of tissue were tested: retina and brain. For retinal tissue, peripheral retinal breaks and penetrating holes were examined. For the brain, collagen was applied on the exterior and interior sections of brains.

[0209] Retinal breaks

[0210] Collagen could be applied in two ways: as collagen I bioink / biomaterials or as combined collagen I and IV bioinks / biomaterials. The collagen biomaterials could be directly dropped onto the retinal tissue using a Backflush Flute Needle (Figure 1) , or any needle / extruding device compatible with retinal surgery. The biomaterials were crosslinked with various methods depending on the composition.

[0211] Three types of collagen biomaterials were prepared with the following compositions:

[0212] Composition 1: Pure collagen I, IV or I and IV mixed solution (minimum concentration 5mg / ml) with Ca2+ (minimum concentration 2%w / v)

[0213] Composition 2: Composition 1 with riboflavin at 0.005 mg / ml

[0214] Composition 3: Composition 1 with human platelet lysate

[0215] Compositions 1 to 3 were prepared as liquids and then applied to the wounded area and directly crosslinked by incubating at 37 ℃ for compositions 1 and 3, or light activation (Figure 2) for composition 2.

[0216] Alternatively, compositions 1 to 3 could be crosslinked first as a thin membrane and then directly aspirated by a Backflush Flute Needle onto the wound.

[0217] The adhesiveness of each composition was tested on porcine eyes. Retinal breaks of 2 or 3 mm in diameter were created. The biomaterials were applied to the breaks. After activation via light or incubation at 37 ℃, the membranes were stained and rinsed with water to check if they still adhered to the tissue.

[0218] Penetrating holes and burst pressure testing

[0219] A fully penetrating hole 2 mm in diameter was created in a porcine eye cup secured on a Barron Artificial Anterior Chamber (Figure 3) . A water meter was set up to generate pressure depending on the amount of water in the tube. Collagen I and collagen IV with light activation were tested for burst pressure. Pressures in intraocular range were tested: 70 cm water, 140 cm water, 204 cm water and 272 cm water, which are approximately equivalent to 5 mm, 10 mm, 15 mm and 25mm Hg respectively.

[0220] Adhesion to brain tissue

[0221] A sheep’s brain was used for this test. Representative compositions from those described above were tested including:

[0222] · Collagen IV (5 and 10 mg / ml) with riboflavin; crosslinking by white light for 2 minutes

[0223] · Collagen IV (4mg / ml) with collagen I (1 mg / ml) and fibrinogen (0.2 mg / ml) ; crosslinking by incubation at 37 ℃ for 5 minutes

[0224] · Collagen IV (10 mg / ml) with 0.5%human platelet lysate; crosslinking by incubation at 37 ℃ for 5 minutes

[0225] The above collagen biomaterials were applied to the exterior, interior including meninx, grey and white matters of brain together with the brainstem and crosslinked accordingly (Figure 4) . Water was used to rinse the biomaterials to examine adhesiveness.

[0226] In vitro biocompatibility test

[0227] Collagen membrane made directly on a coverslip

[0228] A collagen membrane was made by light activation. 30 μl of collagen biomaterial was dropped onto a size 0 coverslip. The biomaterial was then spread evenly to cover the entire surface of the coverslip which was 13 mm in diameter. The coverslip with collagen  biomaterials mixed with riboflavin was then UVed for 2 to 3 minutes to crosslink the collagen. The membrane was formed on the coverslip.

[0229] Collagen I membrane biocompatibility test

[0230] Collagen I membranes made as described above were used for this test. MIO-M1 human Müller cells (RRID: CVCL_0433) were cultured in DMEM media (Invitrogen#11885) containing 4.5 g / l D-glucose, 110 mg / l sodium pyruvate, 1%penicillin / streptomycin and 10%fetal bovine serum (FBS) unless specified otherwise. ARPE-19 human RPE cells (RRID: CVCL_0145) were cultured in DMEM media (Invitrogen#11885092) containing 1.0 g / l D-glucose, 110 mg / l sodium pyruvate, 1%penicillin / streptomycin and 10%FBS unless specified otherwise. The MIO-M1 cells and ARPE-19 cells were seeded on a collagen I applied coverslip and a simple glass coverslip as a control respectively. The morphology of the cells was observed 24 hours to 14 days after cell culture under phase-contrast microscopy.

[0231] The cells were incubated 48 hours after culture with antibodies against ZO-1 (Anti-ZO1 tight junction protein antibody, Abcam#ab96587, 1: 200) and Rhodamine-phalloidin (1:40, stock solution 200 units / ml; Life Technologies #R415c) to study RPE cell tight junctions and RPE65 (Novus#NB-100-355, 1: 200) to identify RPE cells. Primary antibodies against glial fibrillary acidic protein (GFAP, Dako#Z0334, 1: 250) were applied to study Müller cell morphology and gliosis. CRALBP (Abcam#15051, 1: 200) were used for phenotypic characterisation of Müller cells. Alpha smooth muscle actin antibodies (α-SMA, Cell Signalling#48938, 1: 200) were used to identify differentiated cell fibrosis. Heme oxygenase-1 (HO-1, Anti-Heme Oxygenase 1 antibody, Abcam#ab13243) is the primary antioxidant enzyme released by Müller cells. After incubating with primary antibodies at +4 ℃ overnight, the bound antibodies were detected with corresponding secondary antibodies conjugated with Alexa Fluor 488 or 594 (1: 1000; Invitrogen) and then examined by confocal laser scanning microscopy.

[0232] Collagen I and IV mixed membrane biocompatibility test

[0233] Collagen I and IV mixed membranes made as described above with a ratio of collagen I :IV of 12 : 1 were used in this experiment. MIO-M1 human Müller cells (RRID: CVCL_0433) were cultured in DMEM media (Invitrogen#11885) containing 4.5 g / l D-glucose, 110 mg / l sodium pyruvate, 1%penicillin / streptomycin and 10%FBS unless specified otherwise. ARPE-19 human RPE cells (RRID: CVCL_0145) were cultured in DMEM media (Invitrogen#11885092) containing 1.0 g / l D-glucose, 110 mg / l sodium  pyruvate, 1%penicillin / streptomycin and 10%FBS unless specified otherwise. Cell culture was followed by observation and immunofluorescence staining as described above.

[0234] Ex vivo retinal tissue culturing

[0235] C57BL / 6 mice were killed by cervical dislocation. The eyeballs were enucleated and the anterior part was excised. The eyeballs were then rinsed with Hanks’ Balanced Saline Solution (GIBCO HBSS; #14025076; Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Germany) and incubated in basic culture medium lacking FBS. The complete culture medium was a composite made of 50%Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (PAN Biotech, Aidenbach, Germany) , 25%FBS (PAN Biotech) , and 25%HBSS supplemented with 2 mM L-glutamine (PAN Biotech) , 5.75 mg / ml glucose, and antibiotics (100 lg / ml streptomycin and 100 units / ml penicillin (PAN Biotech) .

[0236] Retinal explant cultures were accomplished by following established protocols. Briefly, the eyeball was cut at the ora serrata, the anterior part excised, and complete eyecups, that is, sclera and retina, were cut at 3, 6, 9, and 12 o’ clock positions. Subsequently, the neural retina with retinal pigment epithelium was carefully peeled from the sclera and transferred to the culture insert sitting in a culture disc using a transfer pipette. The photoreceptor layer was facing the established supporting collagen I membranes (made by the method described above on a coverslip) , collagen IV membrane (made by the method described above on a coverslip) or the control coverslips (Figure 5) . After the isolated retina was carefully flattened using blunt-end forceps, 1 ml basic DMEM was added to the disc and explants were maintained in a humidified atmosphere of 5%CO2 and 95%air at 37 degrees centigrade for the respective time periods. The culture medium was exchanged to complete DMEM after the initial 4 hours and every other day thereafter. Tissues were transferred to a six-well plate and observed after 24 hours to 28 days culture under phase-contrast microscopy. Cell growth and the change in the full-thickness retina sections were measured for tissue repair.

[0237] Ex Vivo Scratch test

[0238] Retinal cells were cultured on control and collagen I membranes until the cells reached full confluence. A 10 μl pipette was used to gently scratch the surface to create wounded areas on collagen I and a control (non-coated coverslip) without tearing the underlying membrane. The surfaces were observed for a period of one week. Images were taken at days 0, 2 and 7 and analysed using Image J. The experiment was repeated twice. Data were presented as mean ± standard error of mean (SEM) . GraphPad Prism 7.0 was  used for statistical analysis. Comparisons between the two groups were made using paired or unpaired t-tests. A p value <0.05 was regarded as statistically significant.

[0239] Results

[0240] Collagen biomaterials for tissue adhesion

[0241] Sealing retinal breaks

[0242] The following compositions remained on the retinal tissue after rinsing with water (Figure 6) .

[0243] Composition 1: Pure collagen solution with Ca2+ at physiological pH. The minimum concentration of collagen (collagen I or IV or mixed collagen I and IV) required to effectively seal the retinal breaks with 2 minutes incubation at 37 ℃ was 5 mg / ml; a minimum concentration of 10 mg / ml of collagen solution was required to be an effective sealant for retinal breaks with 1 minute incubation at 37 ℃.

[0244] Composition 2: Composition 1 with riboflavin. Blue light activation worked, however for retinal applications, white light activation was tested. A minimum of 2 minutes of white light activation at a distance of  2 cm between the collagen and light source worked. The minimum collagen concentration was 5 mg / ml, which could be pure collagen I, pure collagen IV or collagen I and IV mixed where the collagen concentration after combination was 5mg / ml.

[0245] Composition 3: Composition 1 with human platelet lysate (hPL) . The crosslinking method was incubation at 37 ℃. The minimum incubation time was 1 minute with the hPL being 1.25%to 40%. When the incubation time was increased to 2 minutes, the hPL range was 0.5%to 40%. When the incubation time increased to 5 minutes, the hPL range was 0.01%to 40%. In this composition, the collagen was collagen I with a minimum concentration of 5mg / ml, collagen IV with a minimum concentration of 10mg / ml, and collagen I and IV mixed where the minimum concentration of collagen after combination was 5mg / ml.

[0246] Retinal holes and burst pressure testing

[0247] Only light activated compositions were tested in this setting. The results showed that 10 mg / ml of collagen I with 2 minutes of light activation withstood all tested pressures (highest pressure tested being about 20 mm Hg) . However, collagen IV on its own could not seal the perforation hole.

[0248] Brain tissue adhesion

[0249] All of the compositions tested adhered to the exterior of brain tissue and the grey matter. However, none of the materials adhered to the white matter. The biomaterials tested crosslinked to form membranes on the white matter but the membranes could be easily rinsed off by water.

[0250] Cell culturing of ARPE-19 and MIO-M1 cells on collagen membranes

[0251] The ARPE-19 cells cultured on control, collagen I and collagen I and IV mixed membranes all showed the same cobblestone shaped morphology (Figure 7 A-C) . The control and collagen I and IV mixed membrane groups had similar cell densities (Figure 7 A, C) . The cell density was higher on the collagen I (Figure 7B) than the control and collagen I and IV mixed membrane. MIO-M1 cells also showed similar morphologies across all the groups (Figure 7, D-F) . The collagen I membrane appeared to have higher MIO-M1 cell density than the collagen I and IV mixed membrane and also higher than the control.

[0252] Immunostaining of ARPE-19 cells and MIO-M1 cells with collagen membranes

[0253] Two typical markers for ARPE-19 cells, ZO-1 and phalloidin were used. Both ZO-1 (red) and phalloidin (green) positive double labelling was observed on ARPE cells (Figure 8) . ZO-1 was clearly visible in the border of cells and phalloidin could be seen in the border and intracellularly in all groups. ARPE-19 cells cultured on collagen mixed membranes showing stronger phalloidin staining, followed by the collagen I membrane with the control showing the least phalloidin staining (Figure 8C) .

[0254] Double labeling of CRALBP and GFAP for MIO-M1 cells produced strong CRALAP labeling in all groups (Figure 9A-C) . GFAP, which is a marker signaling MIO-M1 activation, was only detected in the control group (Figure 9A) , and no GFAP staining was detected in the collagen I or collagen I and IV mixed groups (Figure 9 B&C) . Double labeling of HO-1 and GS also showed similar results (Figure 10 A-C) . HO-1 is a functional antioxidant enzyme expressed in physical Müller cells which was seen in all groups, but GS, a Müller cell activation marker was only detected in the control group (Figure 10A) . The results in Figure 9 and Figure 10 confirm the Müller cell characteristics of MIO-M1 cells cultured on collagen I and mixed membranes. Collagen membranes could maintain the physical status of Müller cells and reduce cell activation.

[0255] The results from the oxidative stress treatment demonstrated that the majority of MIO-M1 cells cultured on the collagen I membrane retained normal cell morphology and expressed the least a-SMA staining. Both the control and collagen I and IV mixed groups  showed abnormal MIO-M1 cell morphologies. The control group showed strongest GFAP and a-SMA staining compared to the collagen I and collagen I and IV mixed groups (Figure 11) .

[0256] Ex vivo retinal tissue culturing

[0257] After 24 hours of explant culturing, the largest number of retinal cells had migrated out of the retina on the collagen IV membrane, followed by the collagen I membrane, and the control had the least cells migrated out of the explant (Figure 12) . These cells were mostly rod-shaped and are likely to be photoreceptor cells. After 72 hours, RPE and Müller cells were observed migrating and proliferating out of the explants on the collagen I membrane (Figure 13) .

[0258] A preliminary tissue repair test was carried out by creating an incision in a mouse retina. Most of the cells grew to fill in the gap in the tissue on the collagen I membrane, followed by the collagen IV membrane. Only a few cells were observed growing in the gap on the control (Figure 14) .

[0259] Ex vivo scratch tests

[0260] An obvious reduction of the wounded area of cells cultured on the collagen I membrane was observed compared to the control. After normalization to the day 0 area, an obviously linear reduction of the wound area was observed in the collagen I membrane group. The cell growth and healing process on collagen I was significantly quicker than the control on day 2 and day 7 (Figure 15) .

[0261] Example Two: Rabbit Trial

[0262] This Example demonstrates the effectiveness of different types of the collagen bioinks of the invention in sealing retinal breaks during vitrectomy surgery in rabbits.

[0263] Materials and methods

[0264] Methodology

[0265] 15 adult male New Zealand rabbits were divided into 5 groups as follows, with 3 rabbits in each group:

[0266] 1. Collagen I (12mg / ml Collagen I, 0.25mM CaCl2, 0.005 mg / ml riboflavin)

[0267] 2. Collagen I (as in Group 1) &laser

[0268] 3. Collagen IV (12mg / ml Collagen I, 0.25mM CaCl2, 0.005 mg / ml riboflavin)

[0269] 4. Collagen IV (as in Group 3) &laser

[0270] 5. Surgical control group: laser alone.

[0271] Surgery was undertaken on right eyes only, with the left eyes serving as internal normal controls.

[0272] Procedure

[0273] Surgery was performed under deep general anesthesia and commenced with the removal of the lens using phacoemulsification, followed by a complete vitrectomy. Subsequently, a retinal detachment was created manually by injecting balanced salt solution close to the retina, thus inducing both a retinal break and limited retinal detachment. Following air-for-fluid exchange, laser was applied first in groups 2, 4 and 5. This was followed by the application of bioink for groups 1-4. In the surgical control group, only laser treatment was performed. Laser was not used in groups 1 &3, and bioink was applied immediately following air-for-fluid exchange. Bioinks were crosslinked by light activation using the Xenon Illumnation System with a light intensity of 23 Lumen. After retinal break treatment with laser in the control group, sterilized air was replaced in the vitreous cavity of the rabbit. For the other four experimental groups, balanced salt solution (BSS) was inserted into the vitreous cavity. The surgery concluded with the closure of all incisions.

[0274] Assessment Points

[0275] Day 0 (the day of surgery) and Day 1, Day 2, Day 9 post-surgery

[0276] Results

[0277] Postoperative Inflammatory Response

[0278] The postoperative inflammatory response was one of the criteria for assessing the success of the surgery and the stability of postoperative conditions. Postoperatively, the anterior segment of the rabbit's eye was examined under a slit lamp, and photographs of the anterior segment were taken. The main indicators observed were: 1) whether the cornea was edematous; 2) the presence of exudation and cells in the anterior chamber; and 3) whether the pupil was fixed or adherent to the residual lens capsule. The severity of corneal edema was scored from 0 to 4, with higher scores indicating more severe edema. The response of exudation and cells in the anterior chamber was also scored from 0 to 4, with higher scores reflecting more exudation and a more pronounced response. Pupillary adhesion was scored from 0 to 2, where 0 indicated no adhesion, 1 indicated partial adhesion, and 2 indicated complete adhesion. Postoperatively, 0.5%Tobramycin and Dexamethasone eye drops were administered three times daily to treat the rabbit's operated eye. The statistical results were calculated as numerical percentages for comparison between groups (Table 1) .

[0279] Table 1: Postoperative anterior chamber reaction levels in each group of rabbit eyes expressed as percentages, with 0%being the least severe and 100%being the most severe (n=3) .

[0280] Structural Reattachment Rate

[0281] Structural reattachment refers to the retina lying flat, with no obvious traction or proliferation around the retinal breaks and no significant subretinal fluid. Postoperatively, the reattachment of the retina was assessed by performing fundus photography, retinal OCT scans, and slit-lamp examinations of the fundus in the rabbit's eye. If the retina around the iatrogenic break was successfully reattached, it was considered a success; however, if the retina detached at the site of the iatrogenic break, it was considered a failure. Put another way, a fully reattached retina with no detachment was considered a complete success. Meanwhile, because the rabbit’s retina was easily detached after surgery, some of the rabbits had a retina detached from a site other than that of the iatrogenic break, which was considered a partial success. The statistical results were calculated as numerical percentages for comparison between groups for complete successful rates and partial successful rates respectively (Tables 2 and 3) .

[0282] Table 2: Postoperative retinal reattachment rates (partial success rates) for each group of rabbit eyes expressed as percentages, with 0%being the least successful and 100%being the most successful (n=3) .

[0283] Table 3: Postoperative retinal reattachment rates (full success rates) for each group of rabbit eyes expressed as percentages, with 0%being the least successful and 100%being the most successful (n=3) .

[0284] Day 2 and Day 9 post-surgery, the collagen IV bioink groups exhibited lower levels of postoperative inflammatory response and higher rates of postoperative retinal reattachment. The control group had higher levels of postoperative inflammatory response and lower rates of retinal reattachment. The collagen I bioink groups fell in between these two others. The group combining laser treatment with collagen IV bioink to seal retinal breaks had the lowest postoperative inflammatory response and the highest retinal reattachment rate.

[0285] In this Example, a combination of laser treatment and the use of Col IV bioink improved outcomes in the stabilization and attachment of the retina post-vitrectomy in rabbit retinal detachment models. Collagen bioinks are a promising potential replacement for the use of intraocular gases or silicone oil tamponade following vitrectomy and do not increase the severity of postoperative inflammatory responses.

Claims

1.A composition comprising:- 5-24 mg / ml collagen;- 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions; and- 0.0005-0.05 mg / ml riboflavin,wherein the collagen comprises type I collagen, type II collagen and / or type IV collagen.2.The composition of claim 1, wherein the composition comprises about 0.005 mg / ml riboflavin.3.A composition comprising:- 5-24 mg / ml collagen;- 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions; and- platelet lysate,wherein the collagen comprises type I collagen, type II and / or type IV collagen.4.The composition of claim 3, wherein the composition comprises 0.01%-40%(v / v) platelet lysate.5.A composition comprising:- 5-24 mg / ml collagen;- 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions; and- fibrinogen,wherein the collagen comprises type I collagen, type II and / or type IV collagen.6.The composition of claim 5, wherein the composition comprises 0.01-4 mg / ml fibrinogen.7.The composition of any one of claims 1 to 6, wherein the composition further comprises mammalian cells.8.The composition of claim 7, wherein the mammalian cells comprise or consist of human cells.9.The composition of claim 7 or claim 8, wherein the mammalian cells comprise any one or more of: neuronal cells, neuroglial cells, epithelial cells, photoreceptor cells, Müller cells, endothelial cells, retinal pigment epithelial cells, therapeutic cells.10.The composition of any one of claims 1 to 9, further comprising any one or more of: a culture medium, growth factors such as brain derived growth factor and neuronal growth factor, hormones, matrix proteins, glycoproteins, vitamins, ions other than sodium ions or calcium ions, ion sources, fibronectin, amino acids, antibiotics, anaesthetics, factor XIII, Fetal Bovine Serum (FBS) , Fetal Calf Serum (FCS) , human serum, therapeutic drugs such as neuroprotective, antifibrotic, anti-apoptotic, anti-vascular and regenerative medications, nucleic acids.11.The composition of any one of claims 1 to 10, wherein the collagen is neutralised.12.A method of preparing a composition, the method comprising:(i) providing a first solution comprising:- collagen, wherein the collagen comprises type I, type II collagen and / or type IV collagen; and- sodium ions and / or calcium ions;(ii) providing a second solution comprising riboflavin; and(iii) combining the first solution and the second solution,wherein the composition comprises:- 6-24 mg / ml of the collagen;- 0.04-0.15 M of the sodium ions and / or 0.008-0.4 M of the calcium ions; and- 0.0005-0.05 mg / ml of the riboflavin.13.A method of preparing a composition, the method comprising:(i) providing a solution comprising:- 6-24 mg / ml collagen, wherein the collagen comprises type I, type II collagen and / or type IV collagen;- 0.0005-0.05 mg / ml riboflavin; and- 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions;(ii) applying the solution to a surface; and(iii) activating the riboflavin.14.The method of claim 13, wherein applying the solution to a surface forms a layer, and wherein steps (ii) and (iii) are repeated a plurality of times, wherein each layer is applied on top of the preceding layer.15.The method of any one of claims 12 to 14, wherein the composition comprises about 0.005 mg / ml riboflavin.16.The method of any one of claims 13 to 15, wherein the activating in step (iii) comprises applying light capable of activating the riboflavin.17.A method of preparing a composition, the method comprising:(i) providing a first solution comprising:- collagen, wherein the collagen comprises type I, type II collagen and / or type IV collagen; and- sodium ions and / or calcium ions;(ii) providing a second solution comprising platelet lysate; and(iii) combining the first solution and the second solution,wherein the composition comprises:- 6-24 mg / ml of the collagen;- 0.04-0.15 M of the sodium ions and / or 0.008-0.4 M of the calcium ions; and- the platelet lysate.18.The method of claim 17, wherein the composition comprises 0.01%-40% (v / v) platelet lysate.19.A method of preparing a composition, the method comprising:(i) providing a first solution comprising:- collagen, wherein the collagen comprises type I, type II collagen and / or type IV collagen; and- sodium ions and / or calcium ions;(ii) providing a second solution comprising fibrinogen; and(iii) combining the first solution and the second solution,wherein the composition comprises:- 6-24 mg / ml of the collagen;- 0.04-0.15 M of the sodium ions and / or 0.008-0.4 M of the calcium ions; and- the fibrinogen.20.The method of claim 19, wherein the composition comprises 0.01-4 mg / ml fibrinogen.21.The method of any one of claims 12 to 20, further comprising adding mammalian cells.22.The method of claim 21, wherein the mammalian cells comprise or consist of human cells.23.The method of claim 21 or claim 22, wherein the mammalian cells comprise any one or more of: neuronal cells, neuroglial cells, epithelial cells, photoreceptor cells, Müller cells, endothelial cells, retinal pigment epithelial cells, therapeutic cells.24.The method of any one of claims 12 to 23, wherein the composition further comprises any one or more of: a culture medium, growth factors such as brain derived growth factor and neuronal growth factor, hormones, matrix proteins, glycoproteins, vitamins, ions other than sodium ions or calcium ions, ion sources, fibronectin, amino acids, antibiotics, anaesthetics, factor XIII, Fetal Bovine Serum (FBS) , Fetal Calf Serum (FCS) , human serum, therapeutic drugs such as neuroprotective, antifibrotic, anti-apoptotic, anti-vascular and regenerative medications, nucleic acids.25.The method of any one of claims 12 to 24, wherein the collagen is neutralised.26.A composition obtained or obtainable by the method of any one of claims 12 to 25.27.A method of sealing and / or repairing retinal tissue, the method comprising applying the composition of any one of claims 1 to 11 or 26 to the tissue.28.A method of sealing and / or repairing brain tissue, the method comprising applying the composition of any one of claims 1 to 11 or 26 to the tissue.29.A method of sealing and / or repairing retinal tissue, the method comprising applying to a subject in need thereof a composition comprising:- 5-24 mg / ml collagen; and- 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions,wherein the collagen comprises type I collagen and / or type IV collagen.30.A method of sealing and / or repairing brain tissue, the method comprising applying to a subject in need thereof a composition comprising:- 5-24 mg / ml collagen; and- 0.04-0.15 M sodium ions and / or 0.008-0.4 M calcium ions,wherein the collagen comprises type I collagen and / or type IV collagen.31.The method of claim 29 or claim 30, wherein the composition is applied at a temperature of about 37 ℃.32.The method of claim 31, wherein the temperature is kept at about 37 ℃ for at least 1 minute.33.The method of any one of claims 29 to 32, wherein the composition further comprises platelet lysate.34.The method of claim 33, wherein the composition comprises 0.01%-40% (v / v) platelet lysate.35.The method of any one of claims 29 to 32, wherein the composition further comprises fibrinogen.36.The method of claim 35, wherein the composition comprises 0.01-4 mg / ml fibrinogen.37.A method of delivering agents to tissue, the method comprising applying the composition of any one of claims 1 to 11 or 26 to the tissue.38.A method of culturing cells, the method comprising applying the cells to the composition of any one of claims 1 to 11 or 26.39.The method of claim 38, wherein the cells comprise or consist of Müller cells and / or retinal pigment epithelial cells.

Images