Methods of making cells expressing an engineered receptor

Abstract

Provided are methods of making engineered cells (e.g., CAR-T cells) that express an engineered receptor (e.g., CAR), and compositions generated by such methods.

Description

METHODS OF MAKING CELLS EXPRESSING AN ENGINEERED RECEPTORCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATION

[0001] This application claims priority benefits of International Application No. PCT / CN2024 / 128898 filed on October 31, 2024, and International Application No. PCT / CN2024 / 133876 filed on November 22, 2024, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.TECHNICAL FIELD

[0002] The disclosure relates to methods of making engineered cells (e.g., CAR-T cells) engineered to express an engineered receptor (e.g., CAR) , and compositions generated by such methods.BACKGROUND

[0003] Adoptive cell transfer (ACT) therapy with T cells, especially with T cells transduced with Chimeric Antigen Receptors (CARs) , has shown promise in several hematologic cancer trials. The manufacture of gene-modified T cells is currently a lengthy and complex process. At present, the production of CAR-T cell preparations mainly includes T cell enrichment, activation, transduction and in vitro expansion. The production cycle of the conventional process is long, requiring 2-3 weeks, and the production cost is high. At the same time, the harvested products tend to be at the end of differentiation, and the clinical treatment effect is not good. Further, since T cells from different patients react differently to the same lentivirus, certain patients suffer from low CAR-T transduction efficiency. Also, the starting raw material from some patients may be limited in quantity or quality, and the T cells from some donors cannot meet the clinical dosage requirements after in vitro expansion (due to different proliferation capability) . There is a need for an improved method of making engineered cells (e.g., CAR-T cells) for adoptive cell transfer therapy.SUMMARY

[0004] This disclosure relates to methods of making engineered cells expressing an engineered receptor (e.g., CAR) , and compositions generated using such methods. Also disclosed are methods of using such engineered cells to treat diseases. The methods may significantly shorten the time required to make engineered cells. Further, the methods may improve the viability and persistence of the engineered cells. The methods described herein may (1) reduce the waiting time for reinfusion of CAR-T preparations for patients, (2) reduce the risk of disease progression, (3) save clinical observation and treatment costs, (4) obtain sufficient CAR-T for clinical infusion, (5) retain more young CAR-T cells, (6) enhance CAR-T cells’ tumor killing ability, and / or (7) enhance the CAR-T persistence in in vivo and suppression of tumor growth. The methods described herein focus on shortening the manufacture process, reducing production costs, enhancing process robustness, and improving clinical efficacy. The present disclosure provides a rapid, safe, effective and cheap autologous cell preparation production process by exploring and optimizing the activation time and serum substitute.

[0005] The data in the present disclosure showed that the short-term production process through activation (12-23 hours) followed by transduction (1-10 hours) is beneficial in (1) retaining more young T cells, (2) enhancing tumor killing ability and the persistence of tumor inhibition, and (3) reducing the clinical dosage requirements. Further, the CAR+%of the cell preparation can be further increased by removing the CD3 / CD28 beads after the activation.

[0006] In one aspect, the disclosure is related to a method for making a population of engineered cells, the method comprising: (I) activating a population of cells from a sample; (II) optionally removing activator used in step (I) ; (III) introducing one or more vectors encoding an engineered receptor into the population of cells; and (IV) harvesting the population of cells from step (III) , wherein the total length of steps (I) , (II) and (III) is less than or equal to 28 hours, preferably, the total length is less than or equal to 24, 25, 26, 27 or 28 hours.

[0007] In one aspect, the disclosure is related to a method for making a population of engineered cells, comprising: (a) activating a population of cells from a sample by an activator; (b) removing the activator; (c) introducing a vector encoding an engineered receptor into the population of cells; and (d) harvesting the population of cells from step (c) , wherein the total length of steps (a) , (b) and (c) is less than or equal to 28 hours, preferably, the total length is less than or equal to 24, 25, 26, 27 or 28 hours.

[0008] In some embodiments, the length of step (a) is 12-23 hours, preferably, the length of step (a) is 16, 18, 20, or 22 hours.

[0009] In some embodiments, the length of step (c) is 1-10 hours, preferably, the length of step (a) is 2, 4, 6, or 8 hours.

[0010] In some embodiments, the population of cells of step (a) is isolated from a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) sample.

[0011] In some embodiments, the step (b) and / or (c) further comprising centrifugation and / or washing.

[0012] In some embodiments, the activator comprises CD3 / CD28 beads.

[0013] In some embodiments, the activator consists of CD3 / CD28 beads.

[0014] In some embodiments, step (c) is performed in the absence of the activator.

[0015] In some embodiments, steps (a) and / or (c) are performed in a serum-free cell medium.

[0016] In some embodiments, the serum-free cell medium comprises human platelet lysate (HPL) .

[0017] In some embodiments, the medium comprises at least one cytokine selected from the group consisting of IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, and IL-21.

[0018] In some embodiments, the population of cells from step (d) is administered to a patient without expansion after step (d) .

[0019] In some embodiments, the population of cells from step (d) is further expanded after step (d) .

[0020] In some embodiments, the population of cells from step (d) is further expanded after step (d) for less than 5 days.

[0021] In some embodiments, the population of cells from step (d) is frozen and stored for further use after step (d) .

[0022] In some embodiments, the population of cells from step (d) comprises more than 10%, 20%, 30%, 40%or 50%T stem cell memory cells (Tscm) and  T cells (Tn) .

[0023] In some embodiments, the percentage of Tn in the population of cells from step (d) differs by no more than 10%from the percentage of Tn in the population of cells at the beginning of step (a) .

[0024] In some embodiments, the percentage of Tscm in the population of cells from step (d) differs by no more than 10%from the percentage of Tscm in the population of cells at the beginning of step (a) .

[0025] In some embodiments, the population of cells from step (d) , after being administered in vivo, persists longer or expands at a higher level, compared with cells made by a conventional CAR-T production process.

[0026] In some embodiments, the population of cells from step (d) , after being administered in vivo, shows a stronger anti-tumor activity than cells made by a conventional CAR-T production process.

[0027] In some embodiments, the population of cells from step (d) is expanded by no more than 10%, compared to the population of cells at the beginning of step (a) .

[0028] In some embodiments, the engineered receptor comprises an extracellular antigen binding domain or ligand binding domain, and optionally an intracellular signaling domain.

[0029] In some embodiments, the engineered receptor is selected from the group consisting of an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , a T cell antigen coupler (TAC) or a portion thereof.

[0030] In some embodiments, the population of cells from a donor comprises immune cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , hematopoietic stem cells, pluripotent stem cells, or embryonic stem cells.

[0031] In some embodiments, wherein the immune cells are selected from a group consisting of T cells, NK cells, NK-T cells, dendritic cells, and a combination thereof.

[0032] In some embodiments, the immune cells are T cells.

[0033] In one aspect, the disclosure is related to a method of manufacturing of a population of engineered immune cells, the method comprising: (a) activating a population of cells from a sample, and then optionally removing activator used in this step; (b) introducing one or more vectors encoding a multi-specific chimeric antigen receptor (CAR) system into the cells; and (c) harvesting the cells from step (b) , wherein the total length of steps (a) and (b) is less than or equal to 28 hours, preferably, the total length is less than or equal to 24, 25, 26, 27 or 28 hours, wherein the multi-specific CAR system comprises a first antigen binding domain specifically recognizing a solid tumor antigen and a second antigen binding domain specifically recognizing a blood cell antigen.

[0034] In some embodiments, the disclosure is related to a method of manufacturing of a population of engineered immune cells, the method comprising: (a) activating a population of cells from a sample; (b) introducing one or more vectors encoding a multi-specific chimeric antigen receptor (CAR) system into the cells; and (c) harvesting the cells from step (b) , wherein the total length of steps (a) and (b) is less than or equal to 28 hours, preferably, the total length is less than or equal to 24, 25, 26, 27 or 28 hours, wherein the multi-specific CAR system comprises a first antigen binding domain specifically recognizing a solid tumor antigen and a second antigen binding domain specifically recognizing a blood cell antigen.

[0035] In some embodiments, the disclosure is related to a method of manufacturing of a population of engineered immune cells, the method comprising: (a) activating a population of cells from a sample, and then removing activator used in this step; (b) introducing one or more vectors encoding a multi-specific chimeric antigen receptor (CAR) system into the cells; and (c) harvesting the cells from step (b) , wherein the total length of steps (a) and (b) is less than or equal to 28 hours, preferably, the total length is less than or equal to 24, 25, 26, 27 or 28 hours, wherein the multi-specific CAR system comprises a first antigen binding domain specifically recognizing a solid tumor antigen and a second antigen binding domain specifically recognizing a blood cell antigen.

[0036] In some embodiments, the length of step (a) is 12-23 hours, preferably, the length of step (a) is 16-20 hours.

[0037] In some embodiments, the length of step (b) is 1-10 hours, preferably, the length of step (a) is 4-8 hours.

[0038] In some embodiments, the step (a) and step (b) at least partially overlap in time.

[0039] In some embodiments, the cells are harvested and administered to a subject in need thereof without in vitro expansion.

[0040] In some embodiments, the multi-specific CAR system is a bispecific CAR system.

[0041] In some embodiments, the bispecific CAR system comprises: (1) the first antigen binding domain specifically recognizing the solid tumor antigen; (2) the second antigen binding domain specifically recognizing the blood cell antigen; (3) a transmembrane domain; and (4) an intracellular signaling domain comprising a co-stimulatory signaling domain.

[0042] In some embodiments, the bispecific CAR system comprises: (1) a first CAR comprising: i) the first antigen binding domain specifically recognizing the solid tumor antigen; ii) a first transmembrane domain; and iii) a first intracellular signaling domain comprising a co-stimulatory signaling domain; and (2) a second CAR comprising: i) the second antigen binding domain specifically recognizing the blood cell antigen; ii) a second transmembrane domain.

[0043] In some embodiments, the second CAR is expressed transiently.

[0044] In some embodiments, the second CAR is expressed by a vector that is not integrated into the genome of the engineered cell.

[0045] In some embodiments, the second CAR is introduced into the engineered cell by a non-integrating lentiviral vector (e.g., a lentiviral vector with a mutant integrase) .

[0046] In some embodiments, the second CAR comprises a second intracellular signaling domain.

[0047] In some embodiments, the second intracellular signaling domain comprises a co-stimulatory signaling domain and / or a CD3ζ primary intracellular signaling domain.

[0048] In some embodiments, the first intracellular signaling domain further comprises a CD3ζprimary intracellular signaling domain, and the second intracellular signaling domain does not comprise a CD3ζ primary intracellular signaling domain.

[0049] In some embodiments, the solid tumor antigen is selected from the group consisting of Claudin 18.2, DLL3, GUCY2C, tMUC1, PRLR, CLCA1, MUC12, GPR35, GPRC5D, CR1L, MUC17, TMPRSS11B, TMPRSS11E, CD207, SLC30A8, CFC1, SLC12A3, SSTR1, GPR27, FZD10, TSHR, SIGLEC15, SLC6A3, KISS1R, QRFPR, GPR119, CLDN6, UPK2, ADAM12, SLC45A3, ACPP, MUC21, MUC16, MS4A12, ALPP, CEA, EphA2, FAP, GPC3, IL13-Rα2, Mesothelin, PSMA, ROR1, VEGFR-II, GD2, FR-α, ErbB2, EpCAM, EGFRvIII, B7H3, CLL1, and EGFR.

[0050] In some embodiments, the blood cell antigen is a B cell antigen.

[0051] In some embodiments, the B cell antigen is selected from the group consisting of CD19, CD20, CD22, CD33, CD34, CD37, CD38, CD45R, CD21, CD79a, CD79b, CD5, FcRH5, and BCMA.

[0052] In some embodiments, the blood cell antigen is a plasma cell antigen.

[0053] In some embodiments, the plasma cell antigen is BCMA or GPRC5D.

[0054] In some embodiments, the step (a) is performed in an activation medium, and the activation medium comprises at least one cytokine selected from the group consisting of IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, and IL-21.

[0055] In some embodiments, the sample comprises peripheral blood mononuclear cells (PBMC) .

[0056] In some embodiments, the population of engineered immune cells comprises more than 10%, 20%, 30%, 40%or 50%T stem cell memory cells (Tscm) and  T cells (Tn) .

[0057] In some embodiments, the population of engineered immune cells, after being administered in vivo, persists longer or expands at a higher level, compared with cells made by an otherwise similar method in which the total length of steps (a) and (b) is more than 28 hours.

[0058] In some embodiments, the population engineered immune cells are expanded by no more than 10%, compared to the population of cells at the beginning of step (a) .

[0059] In some embodiments, the engineered immune cells proliferate faster upon exposure to a blood cell antigen (e.g., B cell antigen) , comparing to otherwise similar engineered immune cells that do not comprise the second antigen binding domain.

[0060] In some embodiments, the engineered immune cells comprise an immune cell selected from the group consisting of a T cell, a macrophage, a dendritic cell, a monocyte, an NK cell, or an NKT cell.

[0061] In some embodiments, the engineered immune cells comprise a T cell.

[0062] In one aspect, the disclosure is related to a population of engineered cells or engineered immune cells made by the methods described herein.

[0063] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition, comprising the population of engineered cells or engineered immune cells described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0064] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering to the subject in need thereof a therapeutically effective amount of the population of engineered cells or engineered immune cells described herein, or the pharmaceutical composition described herein.

[0065] In some embodiments, the disease or disorder is infectious disease, autoimmune disease, or tumor.

[0066] In some embodiments, the tumor is hematological cancer or solid tumor.

[0067] In some embodiments, the hematological cancer is acute myeloid leukemia (AML) , B-cell acute lymphoid leukemia (BALL) , T-cell acute lymphoid leukemia (TALL) , acute lymphoid leukemia (ALL) , chronic myelogenous leukemia (CML) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , multiple myeloma (MM) , myelodysplastic syndrome (MDS) , myeloproliferative neoplasms (MPNs) , chronic myeloid leukemia (CML) , and blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN) .

[0068] In some embodiments, the solid tumor is plasmacytomas, breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, melanoma, oral cancer, mesothelioma, ovarian cancer, colorectal cancer, gastric cancer, cervical cancer, brain cancer, skin cancer, lymphoma, epithelial neoplasms, soft tissue sarcoma, esophageal cancers, or CNS tumors.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0069] FIGS. 1A-1F show the in vitro short-term killing efficiency (FIG. 1A) , CAR positive rate (CAR+%) (FIG. 1B) , cell subpopulation (FIG. 1C) , cell phenotype (FIG. 1D) , in vivo efficacy (FIG. 1E) , and PK data (FIG. 1F) of preparations made by different production methods (ST-CART, or C-CAR) , respectively. ST-CART means engineered cells made by the short-term production process. C-CAR means engineered cells made by the conventional process. Post-T means T cells isolated from PBMC cells. C-UnT means un-transduced T cells. “Tem” means effector memory T cells. “Teff” means effector T cells. “Tcm” means central memory T cells. “Tn” means  T cells. “Tscm” means stem cell memory T cells or T stem cell memory cells.

[0070] FIGS. 2A-2B show the CAR+%of anti-GPRC5D CAR in all groups (Group 0, Group 1, Group 2) of ST-CART cells prepared based on samples from Donor 1 (FIG. 2A) and Donor 2 (FIG. 2B) .

[0071] FIGS. 3A-3D show a comparison of the short-term production method (ST-CAR) and the conventional method (C-CAR) . FIG. 3A shows that the cell proliferation fold data at harvest time before formulation. FIG. 3B shows the cell phenotype percentages (e.g., Teff, Tem, Tcm, and Tn+Tscm) of the ST-CAR and C-CAR cells at harvest time before formulation. FIG. 3C shows the cell phenotype percentages (e.g., CD4+ and CD8+) of the ST-CAR and C-CAR cells at harvest time before formulation. FIG. 3D shows that the GRPRC5D CAR and CD19 CAR expression levels in thawed ST-CAR. “ST-CAR” means engineered cells made by the short-term process. “C-CAR” means engineered cells made by the conventional process. “Post-T cells” means T cells isolated from PBMC cells. “C-UnT” means un-transduced T cells. “Tem” means effector memory T cells. “Teff” means effector T cells. “Tcm” means central memory T cells. “Tn” means  T cells. “Tscm” means stem cell memory T cells or T stem cell memory cells.

[0072] FIGS. 4A-4C show the in vivo testing results. FIG. 4A shows the in vivo bioluminescence testing results on the Nalm6 tumor growth in mixed animal model mice. FIG. 4B shows the quantified signal intensity (signal flux) for the bioluminescence imaging data in FIG. 4A. FIG. 4C shows the subcutaneous MM. 1S tumor sizes.

[0073] FIGS. 5A-5B show the proliferation of C-CAR and ST-CAR cells in animal models by flow cytometry evaluation of (1) the percentages of human CD3+ cells in live peripheral blood cells (FIG. 5A) and (2) the percentages of human CD3+, GPRC5D CAR and CD19 CAR triple positive cells in live peripheral blood cells (FIG. 5B) .DETAILED DESCRIPTION

[0074] The present disclosure provides methods of making immune effector cells (e.g., T cells or NK cells) engineered to express an engineered receptor (e.g., CAR) , compositions comprising such cells, and methods of using such cells for treating diseases. The methods disclosed herein may be used to make immune effector cells engineered to express an engineered receptor in less than 28 hours. The methods described herein provide a faster manufacturing process for making engineered cells (e.g., CAR-T cells) .

[0075] Without wishing to be bound by theory, the methods provided herein preserve the undifferentiated or less differentiated phenotype of T cells, such as  T cells, T stem like cells, Tcm, during the manufacturing process. These engineered cells with an undifferentiated phenotype may persist longer and / or expand better in vivo after infusion. The engineered cells produced by the manufacturing methods described herein may comprise a higher percentage of stem cell memory T cells, compared to engineered cells produced by conventional manufacturing processes. For example, the engineered cells prepared using the methods described herein may have a higher percentage of  cells (e.g., T cells) and central memory cells (e.g., central memory T cells) than those produced by conventional processes. After the engineered cells are reinfused into the human body, after the antigens are stimulated by antigens, the engineered cells (e.g.,  T cells and central memory T cells) will proliferate in vivo to eliminate tumors.

[0076] At present, the CAR-T preparations are mostly used in the treatment of hematological cancer, and there is a need for CAR-T preparations that are effective for treating solid tumors. The difference in drug efficacy may be due to the fact that, in the case of solid tumor, there are limited contact between tumor cells and the CAR-T cells infused into the body. As such, the CAR-T cells may not obtain sufficient stimulation of tumor cell antigens in peripheral blood, so they cannot obtain the activation of signaling pathways necessary for T cell expansion, cannot expand in large quantities, and cannot effectively eliminate tumor cells. Thus, there is a need to provide engineered cells (e.g., CAR-T cells) that can effectively proliferate in the peripheral blood of solid tumor patients, where tumor antigens may be limited.

[0077] In the case of engineered cells prepared by the short-term production process, the engineered cells contain a higher percentage of  cells (e.g., T cells) and central memory cells (e.g., central memory T cells) than those produced by conventional processes. Compared with memory T cells, native T cells require more than 100 times the antigen stimulation, and the activation takes is 6-30 hours, which is much longer than the antigen activation time required for memory T cell activation (0.5-2 hours) . If the activation threshold cannot be reached, these naive T cells will gradually lose the ability to differentiate into effector T cells and become exhausted (Galletti, Giovanni, et al. "Two subsets of stem-like CD8+ memory T cell progenitors with distinct fate commitments in humans. " Nature immunology 21.12 (2020) : 1552-1562) .

[0078] In one aspect, the current disclosure provides an engineered cell comprising a bispecific chimeric antigen receptor (CAR) , comprising: i) a first antigen binding domain specifically recognizing a solid tumor antigen; and ii) a second antigen binding domain specifically recognizing a blood cell antigen (e.g., B cell antigen, T cell antigen, red blood cell antigen) . The blood cell antigen recognizes, e.g., white blood cells (monocytes, lymphocytes, neutrophils, eosinophils, basophils, and macrophages) , red blood cells (erythrocytes) , and platelets. Specifically, the engineered cell may comprise a bispecific CAR comprising: i) the first antigen binding domain specifically recognizing a solid tumor antigen; ii) the second antigen binding domain specifically recognizing a blood cell antigen (e.g., B cell antigen, T cell antigen, red blood cell antigen) ; iii) a transmembrane domain; and iv) an intracellular signaling domain comprising a co-stimulatory signaling domain. Alternatively, the engineered cell may comprise a dual-CAR system comprising: (a) a first CAR comprising: i) the first antigen binding domain specifically recognizing a solid tumor antigen; ii) a first transmembrane domain; and iii) a first intracellular signaling domain comprising a co-stimulatory signaling domain; and (b) a second CAR comprising: i) the second antigen binding domain specifically recognizing a blood cell antigen (e.g., B cell antigen, T cell antigen, red blood cell antigen) ; ii) a second transmembrane domain; and iii) a second intracellular signaling domain comprising a co-stimulatory signaling domain.

[0079] The solid tumor antigen may be selected from ACPP, ADAM12, ALPP, CD207, CEA, CFC1, Claudin 18.2, CLCA1, CLDN6, CR1L, DLL3, EGFR. EGFRvIII, EpCAM, EphA2, ErbB2, FAP, FR-α, FZD10, GD2, GPC3, GPR119, GPR27, GPR35, GPRC5D, GUCY2C, IL13-Rα2, KISS1R, Mesothelin, MS4A12, MUC12, MUC16, MUC17, MUC21, PRLR, PSMA, QRFPR, ROR1, SIGLEC15, SLC12A3, SLC30A8, SLC45A3, SLC6A3, SSTR1, TMPRSS11B, TMPRSS11E, tMUC1, TSHR, UPK2, and VEGFR-II. The B cell antigen may be selected from CD19, CD20, CD21, CD22, CD33, CD34, CD37, CD38, CD45R, CD79a, CD79b, CD5, FcRH5, and BCMA.

[0080] The engineered cells (e.g., CAR-T cells) described herein may proliferate faster upon exposure to a B cell antigen, as compared to engineered cells that do not comprise a CAR comprising a binding domain for a B cell antigen. Without wishing to be bound by theory, by expressing a CAR comprising a binding domain for a B cell antigen, the engineered cells (e.g., CAR-T cells) can (1) obtain sufficient antigen stimulation, which activates the downstream signaling pathway of T cells, (2) obtain sufficient expansion, and (3) migrate to and infiltrate the tissue where the solid tumor is located to kill tumor cells.

[0081] As used herein, the term "Chimeric Antigen Receptor" or alternatively a "CAR" refers to a recombinant polypeptide construct comprising at least an extracellular antigen binding domain, a transmembrane domain and a cytoplasmic signaling domain (also referred to herein as "an intracellular signaling domain" ) comprising a functional signaling domain derived from a stimulatory molecule as defined herein. The domains in the CAR polypeptide construct may be in the same polypeptide chain, for example, comprise a chimeric fusion protein. The domains in the CAR polypeptide construct may be not contiguous with each other, for example, are in different polypeptide chains.

[0082] “Multi-specific CAR system” refers to a CAR system comprising two or more antigen-binding domains that recognize more than one antigen. The two or more antigen-binding domains may bind to the same or different targets. The two or more antigen binding domains can be arranged in any form, for example, parallel form, loop form, or tandem form. The two or more antigen-binding domains are arranged in tandem in the extracellular domain of one CAR, or the two or more antigen-binding domains are arranged in the extracellular domain of independent CARs. The most basic design for engineering multi-specific CAR T cells is transducing two or more CAR constructs into the same cell, which allows multiple antigens to be targeted.

[0083] “Bispecific CAR system” refers to a CAR system that is capable of targeting two same or different antigens, including a tandem CAR (bivalent tandem CAR or bivalent loop CAR) and a dual CAR system (bicistronic CAR) . Bispecific CAR-T cells are usually generated by transduction with a bivalent vector or a bicistronic vector. Bispecific CAR-T cells can also be generated by transduction with two vectors, each encoding a different CAR.

[0084] As used herein, the terms “extracellular domain” or “extracellular region” are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that is outside the cell membrane. The extracellular domain can be entire portion of a receptor that is outside the cell membrane, or just a part thereof (e.g., at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%of the entire portion) . The extracellular domain can be derived from the extracellular domain of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The extracellular domain may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, and / or substitutions.

[0085] As used herein, the terms “intracellular domain” , “intracellular region” or “cytoplasmic region” are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that is inside the cell. The intracellular domain can be entire portion of a receptor that is inside the cell, or just a part thereof (e.g., at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%of the entire portion) . The intracellular domain can be derived from the intracellular domain of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The intracellular domain may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, and / or substitutions.

[0086] As used herein, the terms “transmembrane domain” or “transmembrane region” are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that is embedded in the cell membrane. The transmembrane domain can be entire portion of a receptor that is embedded in the cell membrane, or just a part thereof (e.g., at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%of the entire portion) . The transmembrane domain can be derived from the transmembrane domain of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The transmembrane domain may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, and / or substitutions. The transmembrane domain may be a transmembrane domain of a CAR.

[0087] As used herein, the terms “hinge domain” or “hinge region” are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that connects the transmarine region and the extracellular domain. The hinge region may be part of an extracellular domain. The hinge region can be derived from the hinge region of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The hinge region may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, and / or substitutions. The hinge region may be a hinge region of a CAR.

[0088] As used herein, the term “overlap” may mean completely overlap or partially overlap. Completely overlap includes the concept of simultaneously or concurrently. For example, if step one and step two completely overlap, step one can begin at the start of step two, and end at the end of step two. If step one and step two partially overlap, step one can begin before the start of step two, and end before the end of step two. Alternatively, if step one and step two partially overlap, step one can begin before the start of step two, and end after the end of step two.

[0089] As used herein, a “vector” is any construct capable of delivering one or more polynucleotides of interest to a host cell when the vector is introduced to the host cell. An “expression vector” is capable of delivering and expressing the one or more polynucleotides of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector has been introduced. Thus, in an expression vector, the polynucleotide of interest is positioned for expression in the vector by being operably linked with regulatory elements such as a promoter, enhancer, and / or a poly-A tail, either within the vector or in the genome of the host cell at or near or flanking the integration site of the polynucleotide of interest such that the polynucleotide of interest will be translated in the host cell introduced with the expression vector.

[0090] The term “introducing” or “introduced” means “transfecting” or “transfected” or “transforming” or “transformed” or “transducing” or “transduced” , which refers to a process by which exogenous nucleic acid is transferred into the host cell. A “transfected” or “transformed” or “transduced” cell is one which has been transfected, transformed or transduced with exogenous nucleic acid.

[0091] As used herein, the term “T-cell receptor” or “TCR” as used herein refers to an endogenous or modified T-cell receptor comprising an extracellular antigen binding domain that binds to a specific antigenic peptide bound in an MHC molecule. The TCR may comprise a TCRα polypeptide chain and a TCRβ polypeptide chain. The TCR may comprise a TCRγ polypeptide chain and a TCRδpolypeptide chain. The TCR may specifically bind a tumor antigen. “TCR-T” refers to a T cell that expresses a recombinant TCR. Expression of a heterologous antigen receptor, such as a heterologous TCR or CAR, can alter the immunogenic specificity of the T cells so that they recognize or display improved recognition for one or more tumor antigens that are present on the surface of the cancer cells of an individual with cancer.

[0092] As used herein, the term “cancer” refers to cells having the capacity for autonomous growth. Examples of such cells include cells having an abnormal state or condition characterized by rapidly proliferating cell growth. The term is meant to include cancerous growths, e.g., tumors; oncogenic processes, metastatic tissues, and malignantly transformed cells, tissues, or organs, irrespective of histopathologic type or stage of invasiveness. Also included are malignancies of the various organ systems, such as respiratory, cardiovascular, renal, reproductive, hematological, neurological, hepatic, gastrointestinal, and endocrine systems; as well as adenocarcinomas which include malignancies such as most colon cancers, renal-cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular tumors, non-small cell carcinoma of the lung, and cancer of the small intestine. Cancer that is “naturally arising” includes any cancer that is not experimentally induced by implantation of cancer cells into a subject, and includes, for example, spontaneously arising cancer, cancer caused by exposure of a patient to a carcinogen (s) , cancer resulting from insertion of a transgenic oncogene or knockout of a tumor suppressor gene, and cancer caused by infections, e.g., viral infections. The term “carcinoma” is art recognized and refers to malignancies of epithelial or endocrine tissues. The term also includes carcinosarcomas, which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. An “adenocarcinoma” refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which the tumor cells form recognizable glandular structures. The term “sarcoma” is art recognized and refers to malignant tumors of mesenchymal derivation. The term “hematopoietic neoplastic disorders” includes diseases involving hyperplastic / neoplastic cells of hematopoietic origin. A hematopoietic neoplastic disorder can arise from myeloid, lymphoid or erythroid lineages, or precursor cells thereof.

[0093] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present disclosure is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated by the present disclosure. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[0094] The term "autologous" refers to any material derived from the same individual to whom it is later to be re-introduced into the individual.

[0095] The term "allogeneic" refers to any material derived from a different animal of the same species as the individual to whom the material is introduced. Two or more individuals are said to be allogeneic to one another when the genes at one or more loci are not identical. Allogeneic material from individuals of the same species may be sufficiently unlike genetically to interact antigenically.

[0096] The term "remove" or "removing" means that any methods or steps that after "removing" from the culture medium, the residual or remaining activator in the culture medium cannot effectively activate cells, or the residual or remaining activator in the culture medium does not meet the minimum dose or quantity for cell activation.

[0097] “Derived from” as that term is used herein, indicates a relationship between a first and a second molecule. It generally refers to structural similarity between the first molecule and a second molecule and does not connotate or include a process or source limitation on a first molecule that is derived from a second molecule. For example, in the case of an intracellular signaling domain that is derived from a CD3zeta molecule, the intracellular signaling domain retains sufficient CD3zeta sequence / structure such that is has the required function, namely, the ability to generate a signal under the appropriate conditions. It does not connotate or include a limitation to a particular process of producing the intracellular signaling domain, for example, it does not mean that, to provide the intracellular signaling domain, one must start with a CD3zeta sequence and delete unwanted sequence, or impose mutations, to arrive at the intracellular signaling domain.

[0098] “Immune effector cell, ” as that term is used herein, refers to a cell that is involved in an immune response, for example, in the promotion of an immune effector response. Examples of immune effector cells include T cells, for example, alpha / beta T cells and gamma / delta T cells, B cells, natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, mast cells, and myeloid-derived phagocytes.

[0099] As used herein, a “ T cell” , “naive T cell” or “Tn” refers to a T cell that is antigen-inexperienced. An antigen-inexperienced T cell may have encountered its cognate antigen in the thymus but not in the periphery.  T cells may be precursors of memory cells.  T cells may express CCR7, but not CD45RO.  T cells may express both CD45RA and CCR7, but not CD45RO. T cells may be characterized by expression of CD62L, CD27, CCR7, CD45RA, CD28, and CD127, and the absence of CD95 or CD45RO isoform.  T cells may express CD62L, IL-7 receptor-α, IL-6 receptor, and CD132, but not CD25, CD44, CD69, or CD45RO. T cells may express CD45RA, CCR7, and CD62L and not CD95 or IL-2 receptor β. Surface expression levels of markers may be assessed using flow cytometry.

[0100] As used herein, the term “central memory T cells” or “Tcm” refers to a subset of T cells that in humans are CD45RO positive and express CCR7. Central memory T cells may express CD95. Central memory T cells may express IL-2R, IL-7R and / or IL-15R. Central memory T cells may express CD45RO, CD95, IL-2 receptor β, CCR7, and CD62L. Surface expression levels of markers may be assessed using flow cytometry.

[0101] As used herein, the terms “stem memory T cells, ” “stem cell memory T cells, ” “stem cell-like memory T cells, ” “memory stem T cells, ” “T memory stem cells, ” “T stem cell memory cells, ” “TSCM cells” or “Tscm” refer to a subset of memory T cells with stem cell-like ability, for example, the ability to self-renew and / or the multipotent capacity to reconstitute memory and / or effector T cell subsets. Stem memory T cells may express CD45RA, CD95, IL-2 receptor β, CCR7, and CD62L. Surface expression levels of markers may be assessed using flow cytometry. Exemplary stem memory T cells are disclosed in Gattinoni et al., Nat Med. 2017 January 06; 23 (1) : 18–27, herein incorporated by reference in its entirety.

[0102] As used herein, the term “effector memory T cells” or “Tem” refers to a subset of memory T cells with effector functions. In general, the memory T cells include stem cell memory T (Tscm) cells and central memory T (Tcm) cells and effector memory T (Tem) cells, which have different specific phenotypes. Tcm cells and Tem cells are often distinguished by CCR7 expression and function. Tcm cells (characterized by the CD45RO+CCR7+ phenotype) generally reside in lymphoid organs and do not have an immediate lytic function, whereas Tem cells are found in nonlymphoid tissues, have lytic activity and are CD45RO+CCR7-. Tem cells may express higher levels of receptors responsible for migration to inflamed tissues and have a stronger immediate effector function than Tcm cells.

[0103] As used herein, the term “effector T cells” or “Teff” refers to a subset of T cells with effector functions. After  T cells differentiate into Teff cells, they may readily release cytotoxic granules and effector cytokines upon engagement of their TCR with the cognate antigen. Teff cells may be negative for CD27, CD28, and lymph node homing markers, but may express markers of terminal T cell activation such as Killer cell lectin-like receptor subfamily G, member 1 (KLGR-1) and the NK marker CD57.

[0104] The term “about” when referring to a measurable value such as an amount, a temporal duration, and the like, is meant to encompass variations of ± 20%or in some instances ± 10%, or in some instances ± 5%, or in some instances ± 1 %, or in some instances ± 0.1 %from the specified value, as such variations are appropriate to perform the disclosed methods.

[0105] The term “activator” refers to an agent that can activate immune cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , hematopoietic stem cells, pluripotent stem cells, or embryonic stem cells. For example, the activator may comprise CD3 / CD28 beads / polymers, nanoparticles, or nanocolloids (and / or any of the following co-activators alone or in combination: a reagent that stimulates ICOS, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-lBB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIMI, CD2, or CD226) . The activator may be a T cell activator. The activator may comprise anti-CD3 antibodies and / or anti-CD28 antibodies. The activator may comprise cytokines such as IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, or any combination thereof.

[0106] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs. Methods and materials are described herein for use in the present disclosure; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. Methods of making engineered cells (e.g., immune effector cells)

[0107] In one aspect, the present disclosure provides methods of making a population of cells (e.g., T cells) that express an engineered receptor. The method may include (1) contacting a population of cells with an activation medium or activator (e.g., CD3 / CD28 beads) , and then optionally removing the activation medium or activator (e.g., by washing) ; (2) introducing a vector encoding an engineered receptor into the population of cells, and (3) harvesting the cells for storage or administration. Step (1) may be performed for 12-23 hours (e.g., 16-20 hours) . Step (2) may be performed for 1-10 hours (e.g., 4-8 hours) . Optionally, the step (1) and step (2) may be performed simultaneously or concurrently. The combined length of step (1) and step (2) may be less than 28 hours (e.g., less than 24 hours) .

[0108] In one aspect, the present disclosure provides methods of making a population of cells (e.g., T cells) that express an engineered receptor. The method may include (1) contacting a population of cells with an activation medium; (2) introducing a vector encoding an engineered receptor into the population of cells, and (3) harvesting the cells for storage or administration. Step (1) may be performed for 12-23 hours (e.g., 16-20 hours) . Step (2) may be performed for 1-10 hours (e.g., 4-8 hours) . Optionally, the step (1) and step (2) may be performed simultaneously or concurrently. The combined length of step (1) and step (2) may be less than 28 hours (e.g., less than 24 hours) .

[0109] In one aspect, the present disclosure provides methods of making a population of cells (e.g., T cells) that express an engineered receptor. The method may include (1) contacting a population of cells with an activation medium (activator) and then removing the activation medium (activator) ; (2) introducing a vector encoding an engineered receptor into the population of cells, and (3) harvesting the cells for storage or administration. Step (1) may be performed for 12-23 hours (e.g., 16-20 hours) . Step (2) may be performed for 1-10 hours (e.g., 4-8 hours) . The combined length of step (1) and step (2) may be less than 28 hours (e.g., less than 24 hours) .

[0110] Step (1) may be performed for less than 12 hours, less than 13 hours, less than 14 hours, less than 15 hours, less than 16 hours, less than 17 hours, less than 18 hours, less than 19 hours, less than 20 hours, less than 21 hours, less than 22 hours, or less than 23 hours. Step (2) may be performed for less than 1 hour, less than 2 hours, less than 3 hours, less than 4 hours, less than 5 hours, less than 6 hours, less than 7 hours, less than 8 hours, less than 9 hours, or less than 10 hours. The combined length of step (1) and step (2) may be less than 13 hours, less than 14 hours, less than 15 hours, less than 16 hours, less than 17 hours, less than 18 hours, less than 19 hours, less than 20 hours, less than 21 hours, less than 22 hours, less than 23 hours, less than 24 hours, less than 25 hours, less than 26 hours, less than 27 hours, less than 28 hours, less than 29 hours, less than 30 hours, less than 31 hours, less than 32 hours, or less than 33 hours.

[0111] The activation may be performed for 23 hours, the transfection may be performed for 1 hour, and the total length of the method may be 24 hours. The activation may be performed for 22 hours, the transfection may be performed for 2 hours, and the total length of the method may be 24 hours. The activation may be performed for 21 hours, the transfection may be performed for 3 hours, and the total length of the method may be 24 hours. The activation may be performed for 20 hours, the transfection may be performed for 4 hours, and the total length of the method may be 24 hours. The activation may be performed for 19 hours, the transfection may be performed for 5 hours, and the total length of the method may be 24 hours. The activation may be performed for 18 hours, the transfection may be performed for 6 hours, and the total length of the method may be 24 hours. The activation may be performed for 17 hours, the transfection may be performed for 7 hours, and the total length of the method may be 24 hours. The activation may be performed for 16 hours, the transfection may be performed for 8 hours, and the total length may be 24 hours. The activation may be performed for 20 hours, the transfection may be performed for 6 hours, and the total length of the method may be 26 hours. The activation may be performed for 18 hours, the transfection may be performed for 8 hours, and the total length of the method may be 26 hours. The activation may be performed for 20 hours, the transfection may be performed for 8 hours, and the total length of the method may be 28 hours. The activation may be performed for 22 hours, the transfection may be performed for 6 hours, and the total length of the method may be 28 hours.

[0112] When not removing the activator, the activation and the transfection may be performed simultaneously or concurrently, and the total length of the method may be less than 24 hours. When not removing the activator, the activation and the transfection may be performed simultaneously or concurrently, and the total length of the method may be 24 hours. When not removing the activator, the activation and the transfection may be performed simultaneously or concurrently, and the total length of the method may be 25 hours. When not removing the activator, the activation and the transfection may be performed simultaneously or concurrently, and the total length of the method may be 26 hours. When not removing the activator, the activation and the transfection may be performed simultaneously or concurrently, and the total length of the method may be 27 hours. When not removing the activator, the activation and the transfection may be performed simultaneously or concurrently, and the total length of the method may be 28 hours.

[0113] The total length of the method may be less than 24 hours. The total length of the method may be 24 hours. The total length of the method may be 25 hours. The total length of the method may be 26 hours. The total length of the method may be 27 hours. The total length of the method may be 28 hours.

[0114] The population of the harvested cells from step (3) may increase by no more than 10%, 20%, 30%, or 40%compared to the number of cells at the beginning of step (1) .

[0115] Short-term production process (also named rapid process, or fast manufacturing process) means the production time of CAR-T cells is less than that of the conventional process, and the related patents include but not limited to WO2021173985, WO2021173995, WO2020210678, WO2023021477, WO2020114491, WO2022234009, WO2018106732, WO2023122277, WO2021148019, and WO2024081167.

[0116] Conventional CAR-T production / manufacturing process (also named conventional process / method, or conventional production / manufacturing process) means the production time of CAR-T cells is at least 72 hours (or 3 days) , or the total length of the activation and transfection is no less than 72 hours (or 3 days) , and the CAR-T cells are administered to a subject in need thereof after in vitro expansion. In other words, the production time is long, and the in vitro expansion step is essential for conventional CAR-T production.

[0117] The population of starting cells may be collected from a sample from a subject. The population of cells may be collected from the peripheral blood of a subject. The population of cells may be collected from the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) . T cells (e.g., CD4+ T cells and / or CD8+ T cells) may be purified from the PBMC, for example, using a cell sorting machine. The purified T cells may then be seeded for CAR-T manufacturing using the methods described herein. The purified T cells may be seeded at a density of 1 × 106, 2 × 106, 3 × 106, 4 × 106, 5 × 106, or 10 ×106.

[0118] Different from conventional CAR-T manufacturing processes, the current methods may preserve or increase the undifferentiated T cells during CAR-T manufacturing, generating a CAR-T product that may persist longer after being infused into a subject.

[0119] During step (1) , the cells may be activated with an activator (e.g., CD3 / CD28 beads) . For example, the cells may be activated with T Cell TransAct from Miltenyi, Enceed beads from GenScript, Dynabeads from Thermo, Human CD3 / CD28 T Cell Activation Beads from Biolegend,  from Acro, or other magnetic beads and nanoparticle beads for T cell activation. During step (1) , the cells can be exposed to an activation medium. The activation medium may comprise at least one cytokine selected from the group consisting of IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, and IL-21. The activation medium may contain one or more of the below cytokines: IL-2, IL-7, IL-15 (e.g., hetIL-15 (IL15 / sIL-15Ra) ) , IL-21, and IL-6 (e.g., IL-6 / sIL-6R) ) . The cytokine may be selected from IL-2, IL-7 or IL-15. The cytokine may be a recombinant cytokine. The concentration of the cytokine in the activation medium may be from 1 IU / mL to 1500 IU / mL, such as from 1 IU / mL to 100 IU / mL, 2 IU / mL to 50 IU / mL, 5 IU / mL to 10 IU / mL, 10 IU / mL to 500 IU / mL, 50 IU / mL to 250 IU / mL, 100 IU / mL to 200 IU / mL, 50 IU / mL to 1500 IU / mL, 100 IU / mL to 1000 IU / mL, or 200 IU / mL to 600 IU / mL. The concentration of the cytokine in the activation medium, may be at least 1 IU / mL, 5 IU / mL, 10 IU / mL, 50 IU / mL, 100 IU / mL, 200 IU / mL, 500 IU / mL, 1000 IU / mL or 1500 IU / mL. The activation medium may also include an agent capable of activating an intracellular signaling domain of a TCR complex, such as an anti-CD3 and / or anti-CD28 antibody.

[0120] During step (1) , the activation medium may be free and / or substantially free of serum. The activation medium may contain a serum-free media. The serum free media may be a defined and / or well-defined cell culture media. The serum free media may be a controlled culture media that has been processed, e.g., filtered to remove inhibitors and / or growth factors. The serum-free media may contain serum albumin, hydrolysates, growth factors, hormones, carrier proteins, and / or attachment factors. The serum-free media may contain albumin, such as bovine serum albumin, human serum albumin, and / or recombinant albumin. The serum free media may contain a basal media, e.g., DMEM, RPMI 1640 or TexMACS, containing amino acids, vitamins, inorganic salts, buffers, antioxidants and energy sources. The serum free media may be supplemented, such as with, but not limited to, albumin, chemically defined lipids, growth factors, insulin, cytokines, and / or antioxidants. The serum free media may be formulated to support growth, proliferation, health, homeostasis of cells of a certain cell type, such as immune cells, T cells, and / or CD4+ and CD8+ T cells.

[0121] In step (1) , the activation medium may contain cytokines that can activate the cells. The activation medium may contain cytokines that can make the cells more receptive to the nucleic acid molecule (e.g., in a viral particle) in step (2) . The activation medium may help prepare the cells for more efficient transduction by the nucleic acid molecule (e.g., in a viral particle) in step (2) . The activation medium may stimulate the expression of low-density lipid receptor (LDL-R) in the cells. Prior to step (2) , the cells may contain greater than 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%or more of low-density lipid receptor (LDL-R) positive cells.

[0122] The concentration of cells in the activation medium may be from or from about 1.0 × 105 cells / mL to 1.0 × 108 cells / mL, such as at least or about at least or about 1.0 × 105 cells / mL, 5 × 105 cells / mL, 1 × 106 cells / mL, 5 × 106 cells / mL, 1 × 107 cells / mL, 5 × 107 cells / mL or 1 × 108 cells / mL.

[0123] Prior to step (2) , the activator is removed. The removal method including but is not limited to washing, magnetic field, and centrifugation. The cells may be centrifuged and washed. Prior to step (2) , the cells may be centrifuged and washed for 1 time, 2 times, 3 times, 4 times, or 5 times. Prior to (2) , the cells may be centrifuged at 400×g for 10min. Prior to step (2) , the cells may be centrifuged and washed by a buffer (e.g., PBS) or culture medium (e.g., TexMacs) .

[0124] During step (2) , the cells may be contacted with a nucleic acid molecule encoding a CAR (e.g., in a viral particle) . The cells may be transduced with a DNA molecule encoding a CAR. The provided methods involve methods of transducing cells by contacting, e.g. incubating, a cell composition comprising a plurality of cells with a viral particle. The cells to be transduced may comprise primary cells obtained from a subject, such as cells enriched and / or selected from a subject. The cells to be transduced may comprise greater than or greater than about 75%, 80%, 85%, 90%, 95%or more T cell obtained from a sample from a subject. The cells to be transduced may contain greater than 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%or more of low-density lipid receptor (LDL-R) positive cells. The starting cells to be transduced may be enriched and / or selected for T cells, such as CD4+ and / or CD8+ T cells.

[0125] During step (2) , the viral particles may be provided at a certain ratio of copies of the viral vector particles or infectious units (IU) thereof, per total number of cells (IU / cell) in the input composition or total number of cells to be transduced. For example, the viral particles may be present at 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, or 60 IU of the viral vector particles per one of the cells. The titer of viral vector particles is between 1 × 106 IU / mL and 1 × 108 IU / mL, such as between or between about 5 × 106 IU / mL and 5 × 107 IU / mL, such as at least 6 × 106 IU / mL, 7 × 106 IU / mL, 8 ×106 IU / mL, 9 × 106 IU / mL, 1 × 107 IU / mL, 2 × 107 IU / mL, 3 × 107 IU / mL, 4 × 107 IU / mL, or 5 ×107 IU / mL. During step (2) , transduction can be performed at a multiplicity of infection (MOI) of less than 100, such as less than 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 or less. The transduction may be performed for 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 7 hours or 8 hours.

[0126] The transduction may be performed in solution. The cells and viral particles may be contacted in a volume of from or from about 0.5 mL to 500 mL, such as from or from about 0.5 mL to 200 mL, 0.5 mL to 100 mL, 0.5 mL to 50 mL, 0.5 mL to 10 mL, 0.5 mL to 5 mL, 5 mL to 500 mL, 5 mL to 200 mL, 5 mL to 100 mL, 5 mL to 50 mL, 5 mL to 10 mL, 10 mL to 500 mL, 10 mL to 200 mL, 10 mL to 100 mL, 10 mL to 50 mL, 50 mL to 500 mL, 50 mL to 200 mL, 50 mL to 100 mL, 100 mL to 500 mL, 100 mL to 200 mL or 200 mL to 500 mL.

[0127] During step (2) , the incorporation of the nucleic acid molecule (e.g., in a viral particle) can be aided with centrifugation. During step (2) , the cells and the nucleic acid molecule (e.g., in a viral particle) may be centrifuged at room temperature.

[0128] During step (2) , no need to add adjuvants or transduction enhancement reagent. During step (2) , an adjuvant or a transduction enhancement reagent may be added to enhance transduction efficiency. The adjuvant or transduction enhancement reagent may comprise a cationic polymer. The adjuvant or transduction enhancement reagent may be chosen from: LentiBOOSTTM (Sirion Biotech) , vectofusin-1, F108 (Poloxamer 338 or  F-38) , protamine sulfate, hexadimethrine bromide (Polybrene) , PEA, Pluronic F68, Pluronic F127, Synperonic or LentiTransTM. The transduction enhancement reagent may be LentiBOOSTTM (Sirion Biotech) . The transduction enhancement reagent may be F108 (Poloxamer 338 or  F-38) .

[0129] During step (2) , the method may comprise transducing the population of cells (for example, T cells) with a viral vector, e.g., by subjecting the population of cells and viral vector to a centrifugal force under conditions such that transduction efficiency is enhanced. The cells may be transduced by spinoculation.

[0130] The population of cells may be harvested for storage or administration no later than 72, 60, 48, 36, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, or 18 hours after the beginning of contacting the population of cells with the activation medium or activator. The population of cells may be harvested for storage or administration no later than 28 hours after the beginning of contacting the population of cells with the activation medium or activator. The population of cells may be harvested for storage or administration no later than 27 hours after the beginning of contacting the population of cells with the activation medium or activator. The population of cells may be harvested for storage or administration no later than 26 hours after the beginning of contacting the population of cells with the activation medium or activator. The population of cells may be harvested for storage or administration no later than 25 hours after the beginning of contacting the population of cells with the activation medium or activator. The population of cells is harvested for storage or administration no later than 24 hours after the beginning of contacting the population of cells with the activation medium or activator. The population of cells may be harvested for storage or administration no later than 23 hours after the beginning of contacting the population of cells with the activation medium or activator. The population of cells may be harvested for storage or administration no later than 22 hours after the beginning of contacting the population of cells with the activation medium or activator.

[0131] The population of cells may not increase during the manufacturing process described herein. The population of cells may increase by no more than 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, or 60%, for example, as assessed by the number of living cells, compared to the population of cells before it is contacted with the activation medium or activator. The population of cells may increase by no more than 5%, for example, as assessed by the number of living cells, compared to the population of cells before it is contacted with the activation medium or activator. The population of cells may increase by no more than 10%, for example, as assessed by the number of living cells, compared to the population of cells before it is contacted with the activation medium or activator. The population of cells may increase by no more than 15%, for example, as assessed by the number of living cells, compared to the population of cells before it is contacted with the activation medium or activator. The population of cells may increase by no more than 20%, for example, as assessed by the number of living cells, compared to the population of cells before it is contacted with the activation medium or activator. The population of cells may increase by no more than 25%, for example, as assessed by the number of living cells, compared to the population of cells before it is contacted with the activation medium or activator. The population of cells may increase by no more than 30%, for example, as assessed by the number of living cells, compared to the population of cells before it is contacted with the activation medium or activator. The population of cells may increase by no more than 35%, for example, as assessed by the number of living cells, compared to the population of cells before it is contacted with the activation medium or activator. The population of cells may increase by no more than 40%, for example, as assessed by the number of living cells, compared to the population of cells before it is contacted with the activation medium or activator.

[0132] The population of harvested cells in step (3) may be further expanded after harvesting. For example, the population of cells from step (3) may be further expanded after step (3) for less than 5 days, less than 4 days, less than 3 days, less than 2 days, or less than one day.

[0133] The harvested cells in step (3) may be frozen and stored for further use after step (3) .

[0134] The population of cells manufactured using the manufacturing methods described herein may show a higher percentage of  cells, compared with cells made by conventional methods. The population of cells manufactured using the manufacturing methods described herein may show a percentage of  cells that is more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, more than 90%, or more than 95%higher, compared with cells made by conventional methods. Samples and sources of cells

[0135] The cells that are used in the methods described herein generally are eukaryotic cells, such as mammalian cells, and typically are human cells. For example, the cells can be T cells, including CD3+ T cells, CD4+ T cells, and / or CD8+ T cells. The cells may be derived from the blood, bone marrow, lymph, or lymphoid organs, are cells of the immune system, such as cells of the innate or adaptive immunity, e.g., myeloid or lymphoid cells, including lymphocytes, typically T cells and / or NK cells. Other exemplary cells include stem cells, such as multipotent and pluripotent stem cells, including induced pluripotent stem cells (iPSCs) .

[0136] The cells typically are primary cells, such as those isolated directly from a subject and / or isolated from a subject and frozen. The cells may include one or more subsets of T cells or other cell types, such as whole T cell populations, CD4+ cells, CD8+ cells, and subpopulations thereof, such as those defined by function, activation state, maturity, potential for differentiation, expansion, recirculation, localization, and / or persistence capacities, antigen-specificity, type of antigen receptor, presence in a particular organ or compartment, marker or cytokine secretion profile, and / or degree of differentiation. With reference to the subject to be treated, the cells may be allogeneic and / or autologous. The cells may be pluripotent and / or multipotent, such as stem cells, such as induced pluripotent stem cells (iPSCs) . The methods may include isolating cells from the subject, preparing, processing, culturing, and / or engineering them, and re-introducing them into the same subject, before or after cryopreservation.

[0137] Among the sub-types and subpopulations of T cells and / or of CD4+ and / or of CD8+ T cells are  T (TN) cells, effector T cells (TEFF) , memory T cells and sub-types thereof, such as stem cell memory T (TSCM) , central memory T (TCM) , effector memory T (TEM) , or terminally differentiated effector memory T cells, tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) , immature T cells, mature T cells, helper T cells, cytotoxic T cells, mucosa-associated invariant T (MAIT) cells, naturally occurring and adaptive regulatory T (Treg) cells, helper T cells, such as TH1 cells, TH2 cells, TH3 cells, TH17 cells, TH9 cells, TH22 cells, follicular helper T cells, alpha / beta T cells (αβ T cells) , and delta / gamma T cells (γδ T cells) .

[0138] The cells may be natural killer (NK) cells. The cells may be monocytes or granulocytes, e.g., myeloid cells, macrophages, neutrophils, dendritic cells, mast cells, eosinophils, and / or basophils.

[0139] The cells may be derived from cell lines, e.g., T cell lines. The cells may be obtained from a xenogeneic source, for example, from mouse, rat, non-human primate, and pig.

[0140] The cells may be isolated from a sample, such as a biological sample, e.g., one obtained from or derived from a subject. The subject from which the cell is isolated may be one having the disease or condition or in need of a cell therapy or to which cell therapy will be administered. The subject may be a human in need of a particular therapeutic intervention, such as the adoptive cell therapy for which cells are being isolated, processed, and / or engineered.

[0141] The cells may be primary cells, e.g., primary human cells. The samples include tissue, fluid, and other samples taken directly from the subject, as well as samples resulting from one or more processing steps, such as separation, centrifugation, genetic engineering (e.g. transduction with viral vector) , washing, and / or incubation. The biological sample can be a sample obtained directly from a biological source or a sample that is processed. Biological samples include, but are not limited to, body fluids, such as blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, synovial fluid, urine and sweat, tissue and organ samples, including processed samples derived therefrom.

[0142] The sample from which the cells are derived or isolated may be blood or a blood-derived sample, or is or is derived from an apheresis or leukapheresis product. Exemplary samples include whole blood, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) , leukocytes, bone marrow, thymus, tissue biopsy, tumor, leukemia, lymphoma, lymph node, gut associated lymphoid tissue, mucosa associated lymphoid tissue, spleen, other lymphoid tissues, liver, lung, stomach, intestine, colon, kidney, pancreas, breast, bone, prostate, cervix, testes, ovaries, tonsil, or other organ, and / or cells derived therefrom. Samples include, in the context of cell therapy, e.g., adoptive cell therapy, samples from autologous and / or allogeneic sources.

[0143] Cells from the circulating blood of a subject may be obtained by apheresis or leukapheresis. The samples may contain lymphocytes, including T cells, monocytes, granulocytes, B cells, other nucleated white blood cells, red blood cells, and / or platelets, and may contain cells other than red blood cells and platelets.

[0144] The blood cells collected from the subject may be washed, e.g., to remove the plasma fraction and to place the cells in an appropriate buffer or media for subsequent processing steps. The cells may be washed with phosphate buffered saline (PBS) . The wash solution may lack calcium and / or magnesium and / or many or all divalent cations. A washing step may be accomplished a semi-automated “flow-through” centrifuge. A washing step may be accomplished by tangential flow filtration (TFF) . The cells may be resuspended in a variety of biocompatible buffers after washing, such as, for example, calcium / magnesium free PBS. Components of a blood cell sample may be removed and the cells may be resuspended in culture media.

[0145] Prior to the enriching and / or selecting of cells, the cells may be contacted with serum or plasma, such as human serum or plasma. The serum or plasma may be autologous to the subject from which the cells were obtained. The serum or plasma may be present in the sample at a concentration of at least or at least about 10% (v / v) , at least or at least about 15% (v / v) , at least or at least about 20%(v / v) , at least or at least about 25% (v / v) , at least or at least about 30% (v / v) , at least or at least about 35%(v / v) , or at least or at least about 40% (v / v) . Prior to the selection and / or transduction of cells, the cells may be contacted with an anticoagulant. The anti-coagulant may be or contains free citrate ion, e.g. anticoagulant citrate dextrose solution, Solution A (ACD-A) .

[0146] Prior to the enriching and / or selecting cells, cells from a sample may be transferred or suspended in a serum-free media. The serum free media may be a defined and / or well-defined cell culture media. The serum free media may be a controlled culture media that has been processed, e.g., filtered to remove inhibitors and / or growth factors. The serum free media may contain proteins. The serum-free media may contain serum albumin, hydrolysates, growth factors, hormones, carrier proteins, and / or attachment factors. The serum-free media may contain proteins, e.g., albumin, such as bovine serum albumin, human serum albumin, and / or recombinant albumin. The serum free media may contain a basal media, e.g., DMEM, RPMI 1640 or TexMACS, containing amino acids, vitamins, inorganic salts, buffers, antioxidants and energy sources. The serum free media may be supplemented, such as with, but not limited to, albumin, chemically defined lipids, growth factors, insulin, cytokines, and / or antioxidants. The serum free media may be formulated to support growth, proliferation, health, homeostasis of cells of a certain cell type, such as immune cells, T cells, and / or CD4+ and CD8+ T cells.

[0147] Prior to the selection and / or enrichment of cells, the sample or the cells in the sample can be rested or held prior to further processing steps. The sample may be maintained at or held at a temperature of from or from about 2℃ to 8℃ for up to 48 hours, such as for up to 12 hours, 24 hours or 36 hours.

[0148] The methods described herein may include steps for freezing, e.g., cryopreserving, the cells, either before or after isolation, selection and / or enrichment and / or incubation for transduction and engineering. The freeze and subsequent thaw step may remove granulocytes and, to some extent, monocytes in the cell population. The cells may be suspended in a freezing solution, e.g., following a washing step to remove plasma and platelets. An exemplary freezing solution may be PBS containing 20%DMSO and 8%human serum albumin (HSA) . The freezing solution may be then diluted 1: 1 with media so that the final concentration of DMSO and HSA are 10%and 4%, respectively. The cells may be generally then frozen to -80℃ at a rate of 1℃ per minute and stored in the vapor phase of a liquid nitrogen storage tank.

[0149] Isolation of the cells may include one or more preparation and / or non-affinity based cell separation steps. Cells may be washed, centrifuged, and / or incubated in the presence of one or more reagents, for example, to remove unwanted components, enrich for desired components, lyse or remove cells sensitive to particular reagents. Cells may be separated based on one or more properties, such as density, adherent properties, size, sensitivity and / or resistance to particular components.

[0150] The isolation methods may include the separation of different cell types based on the expression or presence in the cell of one or more specific molecules, such as surface markers, e.g., surface proteins, intracellular markers, or nucleic acid. The separation may be affinity-or immunoaffinity-based separation. For example, the isolation may include separation of cells and cell populations based on the cells’ expression or expression level of one or more markers, typically cell surface markers, for example, by incubation with an antibody or binding partner that specifically binds to such markers, followed generally by washing steps and separation of cells having bound the antibody or binding partner, from those cells having not bound to the antibody or binding partner.

[0151] Such separation steps can be based on positive selection, in which the cells having bound the reagents are retained for further use, and / or negative selection, in which the cells having not bound to the antibody or binding partner are retained. Both fractions may be retained for further use. Negative selection can be particularly useful where no antibody is available that specifically identifies a cell type in a heterogeneous population, such that separation is best carried out based on markers expressed by cells other than the desired population.

[0152] For example, specific subpopulations of T cells, such as cells positive or expressing high levels of one or more surface markers, e.g., CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, and / or CD45RO+T cells, are isolated by positive or negative selection techniques. For example, CD3+, CD28+T cells can be positively selected using anti-CD3 / anti-CD28 conjugated magnetic beads (e.g.,  M-450 CD3 / CD28 T Cell Expander) .

[0153] T cells may be separated from a PBMC sample by negative selection of markers expressed on non-T cells, such as B cells, monocytes, or other white blood cells, such as CD14. A CD4+ or CD8+selection step may be used to separate CD4+ helper and CD8+ cytotoxic T cells. Such CD4+ and CD8+populations can be further sorted into sub-populations by positive or negative selection for markers expressed or expressed to a relatively higher degree on one or more  memory, and / or effector T cell subpopulations.

[0154] CD8+ cells may be further enriched for or depleted of  central memory, effector memory, and / or central memory stem cells, such as by positive or negative selection based on surface antigens associated with the respective subpopulation. Enrichment for central memory T (TCM) cells may be carried out to increase efficacy, such as to improve long-term survival, expansion, and / or engraftment following administration, which is particularly robust in such sub-populations.

[0155] The sample or composition of cells to be separated may be incubated with small, magnetizable or magnetically responsive material, such as magnetically responsive particles or microparticles, such as paramagnetic beads (e.g., such as CytoSinct Dynabeads or MACS beads) . The magnetically responsive material, e.g., particle, generally is directly or indirectly attached to a binding partner, e.g., an antibody, that specifically binds to a molecule, e.g., surface marker, present on the cell, cells, or population of cells that it is desired to separate, e.g., that it is desired to negatively or positively select. The magnetic particle or bead may comprise a magnetically responsive material bound to a specific binding member, such as an antibody or other binding partner. The sample may be placed in a magnetic field, and those cells having magnetically responsive or magnetizable particles attached thereto will be attracted to the magnet and separated from the unlabeled cells. For positive selection, cells that are attracted to the magnet may be retained; for negative selection, cells that are not attracted (unlabeled cells) may be retained. A combination of positive and negative selection may be performed during the same selection step, where the positive and negative fractions are retained and further processed or subject to further separation steps.

[0156] The magnetically responsive particles may be coated in primary antibodies or other binding partners, secondary antibodies, lectins, enzymes, or streptavidin. The magnetic particles may be attached to cells via a coating of primary antibodies specific for one or more markers. The cells, rather than the beads, may be labeled with a primary antibody or binding partner, and then cell-type specific secondary antibody-or other binding partner (e.g., streptavidin) -coated magnetic particles, may be added. Streptavidin-coated magnetic particles may be used in conjunction with biotinylated primary or secondary antibodies.

[0157] The affinity-based selection may be performed via magnetic-activated cell sorting (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) or flow cytometry (FACS) .

[0158] Cells for transduction by the provided retroviral vector particles may include, for example, monocytes, monocyte-derived macrophages, monocyte-derived dendritic cells or resting T cells. The provided retroviral particles can transduce resting T cells. The input composition may comprise a plurality of cells, such as immune cells, e.g. T cells, that are non-cycling and / or quiescent and / or resting and / or in which a majority of cells, e.g. greater than 50%, 60%, 70%, 80%, 80%or more cells, in a population so transduced are non-cycling and / or quiescent and / or resting. The input composition may comprise a population of T cells in which at least 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%or more of the T cells in the population are resting T cells. The methods described herein may involve transduction of T cells in which no more than 5%, 10%, 20%, 30%, or 40%of the T cells express a T cell activation marker (e.g., HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L (CD154) , and 4-1BB (CD137) ) . Cell culture medium

[0159] The methods of the application can utilize culture media conditions comprising 5%or less, for example 2%, human AB serum. Exemplary culture media conditions and compositions are described in Smith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTSTM Immune Cell Serum Replacement” Clinical &Translational Immunology (2015) 4, e31; doi: 10.1038 / cti. 2014.31. The methods of the application can utilize media conditions comprising at least about 0.1%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%or 10%serum. The media may comprise about 0.5%-5%, about 0.5%-4.5%, about 0.5%-4%, about 0.5%-3.5%, about 0.5%-3%, about 0.5%-2.5%, about 0.5%-2%, about 0.5%-1.5%, about 0.5%-1.0%, about 1.0%-5%, about 1.5%-5%, about 2%-5%, about 2.5%-5%, about 3%-5%, about 3.5%-5%, about 4%-5%, or about 4.5%-5%serum. The media may comprise about 0.5%, about 1%, about 2%, about 3%, about 4%, or about 5%serum. The serum may comprise human serum, e.g., human AB serum. The serum may be human serum that has been allowed to naturally coagulate after collection, e.g., off-the-clot (OTC) serum. The serum may be plasma-derived serum human serum. Plasma-derived serum can be produced by defibrinating pooled human plasma collected in the presence of an anticoagulant, e.g., sodium citrate.

[0160] The methods of the application can utilize culture media conditions comprising serum-free medium. The serum free medium may be OpTmizerTMCTSTM (LifeTech) , ImmunocultTMXF (Stemcell technologies) , CellGroTM (CellGenix) , TexMacsTM (Miltenyi) , StemlineTM (Sigma) , Xvivo15TM (Lonza) ,  (Irvine Scientific) , or (RandD systems) . The serum-free medium can be supplemented with a serum substitute such as ICSR (immune cell serum replacement) from LifeTech. The level of serum substitute (for example, ICSR) can be, for example, up to 5%, for example, about 1%, 2%, 3%, 4%, or 5%. The serum-free medium can be supplemented with serum, e.g., human serum, e.g., human AB serum. Engineered receptor (e.g., CAR)

[0161] One aspect of the present disclosure provides cells (e.g., immune cells) that express an engineered receptor. The engineered receptor can comprise an extracellular ligand binding domain or an extracellular antigen binding domain, and optionally an intracellular signaling domain. Exemplary engineered receptors include, but are not limited to, chimeric antigen receptor (CAR) , engineered T-cell receptor (TCR) , and T-cell antigen coupler (TAC) receptor. The engineered receptor can comprise an extracellular antigen binding domain that specifically binds to an antigen (e.g., a tumor antigen) , a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain and / or a co-stimulatory signaling domain. The intracellular signaling domain can comprise an intracellular signaling domain of a TCR co-receptor. The engineered receptor can be encoded by a heterologous polynucleotide operably linked to a promoter (such as a constitutive promoter or an inducible promoter) .

[0162] The engineered receptor can comprise one or more specific binding domains that target at least one tumor antigen, and one or more intracellular effector domains, such as one or more primary intracellular signaling domains and / or co-stimulatory signaling domains.

[0163] The engineered receptor can be a chimeric antigen receptor (CAR) . Many chimeric antigen receptors are known in the art and can be suitable for the engineered cells described herein. CARs can also be constructed with a specificity for any cell surface marker by utilizing antigen binding fragments or antibody variable domains of, for example, antibody molecules.

[0164] CARs of the present disclosure may comprise an extracellular domain comprising at least one antigen binding domain that specifically binds at least one tumor antigen, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain.

[0165] The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes an immune effector function of the CAR-containing cell, e.g., a CAR-T cell. Immune effector function or immune effector response refers to function or response, e.g., of an immune effector cell, that enhances or promotes an immune attack of a target cell. For example, an immune effector function or response can refer to a property of a T or NK cell that promotes killing or the inhibition of growth or proliferation, of a target cell. Examples of immune effector function, e.g., in a CAR-T cell, include cytolytic activity (such as antibody-dependent cellular toxicity, or ADCC) and helper activity (such as the secretion of cytokines) . The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes proliferation and / or survival of the CAR containing cell. The CAR may comprise one or more intracellular signaling domains selected from the signaling domains of CD28, CD137, CD3, CD27, CD40, ICOS, GITR, and OX40. The signaling domain of a naturally occurring molecule can comprise the entire intracellular or cytoplasmic portion, or the entire native intracellular signaling domain, of the molecule, or a fragment or derivative thereof.

[0166] The intracellular signaling domain of a CAR can comprise a primary intracellular signaling domain. “Primary intracellular signaling domain” refers to cytoplasmic signaling sequence that acts in a stimulatory manner to induce immune effector functions. The primary intracellular signaling domain may contain a signaling motif known as Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif, or ITAM. The primary intracellular signaling domain may comprise a functional signaling domain of a protein selected from the group consisting of CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, common FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon RIb) , CD79a, CD79b, Fcgamma RIIa, DAP10, and DAP12. The primary intracellular signaling domain may comprise a nonfunctional or attenuated signaling domain of a protein selected from the group consisting of CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, common FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon RIb) , CD79a, CD79b, Fcgamma RIIa, DAP10, and DAP12. The nonfunctional or attenuated signaling domain can be a mutant signaling domain having a point mutation, insertion or deletion that attenuates or abolishes one or more immune effector functions, such as cytolytic activity or helper activity, including antibody-dependent cellular toxicity (ADCC) . The CAR may comprise a nonfunctional or attenuated CD3 zeta (i.e. CD3ζ or CD3z) signaling domain. The intracellular signaling domain may not comprise a primary intracellular signaling domain. An attenuated primary intracellular signaling domain may induce no more than about any of 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%or less of an immune effector function (such as cytolytic function against target cells) compared to CARs having the same construct, but with the wild-type primary intracellular signaling domain.

[0167] The intracellular signaling domain of a CAR can comprise one or more (such as any of 1, 2, 3, or more) co-stimulatory signaling domains. “Co-stimulatory signaling domain” can be the intracellular portion of a co-stimulatory molecule. The term “co-stimulatory molecule” refers to a cognate binding partner on an immune cell (such as T cell) that specifically binds with a co-stimulatory ligand, thereby mediating a co-stimulatory response by the immune cell, such as, but not limited to, proliferation and survival. Co-stimulatory molecules are cell surface molecules other than antigen receptors or their ligands that contribute to an efficient immune response. A co-stimulatory molecule can be represented in the following protein families: TNF receptor proteins, Immunoglobulin-like proteins, cytokine receptors, integrins, signaling lymphocytic activation molecules (SLAM proteins) , and activating NK cell receptors. Co-stimulatory molecules include, but are not limited to an MHC class I molecule, BTLA and a Toll ligand receptor, as well as OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a / CD18) , ICOS (CD278) , and 4-1BB (CD137) . Further examples of such co-stimulatory molecules include CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49d, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE / RANKL, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CD100 (SEMA4D) , CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG / Cbp, CD19a, and a ligand that specifically binds with CD83.

[0168] The CAR can comprise a single co-stimulatory signaling domain. The CAR can comprise two or more co-stimulatory signaling domains. The intracellular signaling domain can comprise a functional primary intracellular signaling domain and one or more co-stimulatory signaling domains. The CAR may not comprise a functional primary intracellular signaling domain (such as CD3ζ) . The CAR can comprise an intracellular signaling domain consisting of or consisting essentially of one or more co-stimulatory signaling domains. The CAR can comprise an intracellular signaling domain consisting of or consisting essentially of a nonfunctional or attenuated primary intracellular signaling domain (such as a mutant CD3ζ) and one or more co-stimulatory signaling domains. Upon binding of the antigen binding domain to tumor antigen, the co-stimulatory signaling domains of the CAR can transduce signals for enhanced proliferation, survival and differentiation of the modified immune cells having the CAR (such as T cells) , and inhibit activation induced cell death. The one or more co-stimulatory signaling domains can be derived from one or more molecules selected from the group consisting of CD27, CD28, 4-1BB (i.e., CD137) , OX40, CD30, CD40, CD3, lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) , CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 and ligands that specially bind to CD83.

[0169] The intracellular signaling domain of a CAR can comprise a co-stimulatory signaling domain derived from CD28. The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain of CD3ζ and a co-stimulatory signaling domain of CD28. The intracellular signaling domain in the chimeric receptor of the present disclosure can comprise a co-stimulatory signaling domain derived from 4-1BB (i.e., CD137) . The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain of CD3ζ and a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB. The intracellular signaling domain can comprise a polypeptide comprising from the N-terminus to the C-terminus: a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB and a primary intracellular signaling domain of CD3ζ.

[0170] The intracellular signaling domain of the CAR can comprise a co-stimulatory signaling domain of CD28 and a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB. The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain of CD3ζ, a co-stimulatory signaling domain of CD28, and a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB. The intracellular signaling domain can comprise a polypeptide comprising from the N-terminus to the C-terminus: a co-stimulatory signaling domain of CD28, a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB, and a primary intracellular signaling domain of CD3ζ.

[0171] The antigen binding domain of a CAR may comprise one or more (such as any one of 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more) antibodies or antibody fragments, which can be selected from an scFv, a Fv, a Fab, a (Fab′) 2, a minibody, a diabody, a single domain antibody (sdAb) , or a VHH domain. The antigen binding domain of a CAR can comprise a ligand or an extracellular portion of a receptor that specifically binds to a tumor antigen. The CAR can be a monospecific, bispecific or multispecific CAR. The antigen binding domain of a CAR can specifically bind to a single tumor antigen. The antigen binding domain of a CAR can bind to two or more tumor antigens. The engineered receptor (e.g., CAR) may redirect the specificity of the engineered cells through the expression of a chimeric antigen receptor (CAR) or TCR on these cells.

[0172] The antigen may be a tumor antigen selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, hTERT, IL-13Rα2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, PD-L2, and other tumor antigens with clinical significance, and combinations thereof. The antigen may be GPC3. The antigen may be DLL3. The antigen may be BCMA. The antigen may be GPRC5D.

[0173] The tumor antigen can be derived from an intracellular protein of tumor cells. The tumor antigen can be expressed on the surface of tumor cells. Many TCRs specific for tumor antigens (including tumor-associated antigens) have been described, including, for example, NY-ESO-1 cancer-testis antigen, the p53 tumor suppressor antigens, TCRs for tumor antigens in melanoma (e.g., MARTI, gp 100) , leukemia (e.g., WT1, minor histocompatibility antigens) , and breast cancer (e.g., HER2, NY-BR1) .

[0174] The transmembrane domain of a CAR can be selected from the transmembrane domain of an alpha, beta or zeta chain of a T-cell receptor, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18) , ICOS (CD278) , 4-1BB (CD137) , GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , CD160, CD19, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CD100 (SEMA4D) , SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, and / or NKG2C. The transmembrane domain of the CAR can be a CD4, CD3, CD8α, or CD28 transmembrane domain. The transmembrane domain of the CAR can comprise a CD8α transmembrane domain. The transmembrane domain can be derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 and PD1.

[0175] The extracellular domain can be connected to the transmembrane domain by a hinge domain. The hinge domain can be a hinge domain of CD8α.

[0176] The CAR can also comprise a signal peptide (SP) , such as a CD8α signal peptide.

[0177] Many CARs targeting different tumor antigens have been widely disclosed in the field, such as CD19 CARs or BCMA CARs. The extracellular antigen binding domain of CD19 CARs can be or include the CD19 binding fragment (e.g., FMC63, SJ25C1, or those disclosed in different patents such as WO 2022 / 012683, etc) . BCMA CARs also have been well described, related patents include but not limited to WO 2016 / 014789, WO 2016 / 014565, WO 2013 / 154760, and WO 2018 / 028647, etc. GPRC5D CARs also have been well described, related patents include but not limited to WO2023030272, WO2023116782, PCT / CN2023 / 131797, and PCT / CN2024 / 1075 82, etc. The extracellular antigen binding domain of BCMA CARs may be or include BCMA binding fragment. The BCMA binding fragment may bind to one or more epitopes on BCMA. The BCMA CARs may be bivalent CARs comprising two anti-BCMA sdAbs targeting same or different BCMA epitopes. The GPRC5D CARs may be bivalent CARs comprising two anti-GPRC5D sdAbs targeting same or different GPRC5D epitopes.

[0178] The engineered receptor can be a modified T-cell receptor or engineered T-cell receptor. The engineered TCR can be specific for a tumor antigen. The tumor antigen can be selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, PD-L2, and other tumor antigens with clinical significance, and combinations thereof. The tumor antigen can be derived from an intracellular protein of tumor cells. The tumor antigen can be expressed on the surface of tumor cells. Many TCRs specific for tumor antigens (including tumor-associated antigens) have been described, including, for example, NY-ESO-1 cancer-testis antigen, the p53 tumor suppressor antigens, TCRs for tumor antigens in melanoma (e.g., MARTI, gp 100) , leukemia (e.g., WT1, minor histocompatibility antigens) , and breast cancer (e.g., HER2, NY-BR1) . Any of the TCRs known in the art can be used. The TCR can have an enhanced affinity to the tumor antigen. Exemplary TCRs and methods for introducing the TCRs to immune cells have been described, for example, in U. S. Pat. No.5, 830, 755, and Kessels et al. Immunotherapy through TCR gene transfer. Nat. Immunol. 2, 957-961 (2001) , which are incorporated herein by reference in the entirety.

[0179] The TCR receptor complex is an octomeric complex formed by variable TCR receptor αand β chains (or γ and δ chains on case of γδ T cells) with three dimeric signaling modules CD3δ / ε, CD3γ / ε and CD247 (T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain) ζ / ζ or ζ / η. Ionizable residues in the transmembrane domain of each subunit form a polar network of interactions that hold the complex together. TCR complex has the function of activating signaling cascades in T cells.

[0180] The engineered receptor can be an engineered TCR comprising one or more T-cell receptor (TCR) fusion proteins (TFPs) . Exemplary TFPs have been described, for example, in US20170166622A1, which is incorporated herein by reference in its entirety. The TFP can comprise an extracellular domain of a TCR subunit that comprises an extracellular domain or portion thereof of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications. The TFP can comprise a transmembrane domain that comprises a transmembrane domain of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications. The TFP can comprise a transmembrane domain that comprises a transmembrane domain of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a TCR zeta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications.

[0181] The TFP can comprise a TCR subunit comprising at least a portion of a TCR extracellular domain, and a TCR intracellular domain comprising a stimulatory domain from an intracellular signaling domain of CD3 epsilon; and an antigen binding domain, wherein the TCR subunit and the antigen binding domain are operatively linked, and wherein the TFP incorporates into a TCR when expressed in a T cell.

[0182] The engineered receptor can be a T-cell antigen coupler (TAC) receptor. Exemplary TAC receptors have been described, for example, in US20160368964A1, which is incorporated herein by reference. The TAC can comprise an antigen binding domain, a TCR-binding domain that specifically binds a protein associated with the TCR complex, and a T-cell receptor signaling domain. The antigen binding domain can be an antibody fragment, such as scFv or VHH, which specifically binds to a tumor antigen. The antigen binding domain can be a designed Ankyrin repeat (DARPin) polypeptide. The tumor antigen can be selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, PD-L2, and other tumor antigens with clinical significance, and combinations thereof. The tumor antigen can be derived from an intracellular protein of tumor cells. The tumor antigen can be expressed on the surface of tumor cells. The protein associated with the TCR complex can be CD3, such as CD3 epsilon. The TCR-binding domain can be a single chain antibody, such as scFv, or a VHH. The TCR-binding domain can be derived from UCHT1. The TAC receptor can comprise a cytosolic domain and a transmembrane domain. The T-cell receptor signaling domain can comprise a cytosolic domain derived from a TCR co-receptor. Exemplary TCR co-receptors include, but are not limited to, CD4, CD8, CD28, CD45, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 and CD154. The TAC receptor can comprise a transmembrane domain and a cytosolic domain derived from CD4. The TAC receptor can comprise a transmembrane domain and a cytosolic domain derived from CD8 (such as CD8α) .

[0183] T cell co-receptors are expressed as membrane proteins on T cells. They can provide stabilization of the TCR: peptide: MHC complex and facilitate signal transduction. The two subtypes of T cell co-receptor, CD4 and CD8, display strong specificity for particular MHC classes. The CD4 co-receptor can only stabilize TCR: MHC II complexes while the CD8 co-receptor can only stabilize the TCR: MHC I complex. The differential expression of CD4 and CD8 on different T cell types results in distinct T cell functional subpopulations. CD8+ T cells are cytotoxic T cells.

[0184] The engineered receptor (such as CAR, TCR, or TAC) can target one or more tumor antigens. Tumor antigens are proteins that are produced by tumor cells that can elicit an immune response, particularly T-cell mediated immune responses. The selection of the targeted antigen will depend on the particular type of cancer to be treated. Exemplary tumor antigens include, for example, a glioma-associated antigen, carcinoembryonic antigen (CEA) , β-human chorionic gonadotropin, alpha-fetoprotein (AFP) , lectin-reactive AFP, thyroglobulin, RAGE-1, MN-CAIX, human telomerase reverse transcriptase, RU1, RU2 (AS) , intestinal carboxyl esterase, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, prostate-specific antigen (PSA) , PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prostein, PSMA, HER2 / neu, survivin, telomerase, prostate-carcinoma tumor antigen-1 (PCTA-1) , MAGE, ELF2M, neutrophil elastase, ephrinB2, CD22, insulin growth factor (IGF) -I, IGF-II, IGF-I receptor and mesothelin.

[0185] The tumor antigen can comprise one or more antigenic cancer epitopes associated with a malignant tumor. Malignant tumors express a number of proteins that can serve as target antigens for an immune attack. These molecules include but are not limited to tissue-specific antigens such as MART-1, tyrosinase and gp100 in melanoma and prostatic acid phosphatase (PAP) and prostate-specific antigen (PSA) in prostate cancer. Other target molecules belong to the group of transformation-related molecules such as the oncogene HER2 / Neu / ErbB-2. Yet another group of target antigens are onco-fetal antigens such as carcinoembryonic antigen (CEA) . In B-cell lymphoma the tumor-specific idiotype immunoglobulin constitutes a truly tumor-specific immunoglobulin antigen that is unique to the individual tumor. B cell differentiation antigens such as CD19, CD20 and CD37 are other candidates for target antigens in B-cell lymphoma.

[0186] The tumor antigen can be a tumor-specific antigen (TSA) or a tumor-associated antigen (TAA) . A TSA is unique to tumor cells and does not occur on other cells in the body. A TAA associated antigen is not unique to a tumor cell, and instead is also expressed on a normal cell under conditions that fail to induce a state of immunologic tolerance to the antigen. The expression of the antigen on the tumor can occur under conditions that enable the immune system to respond to the antigen. TAAs can be antigens that are expressed on normal cells during fetal development, when the immune system is immature, and unable to respond or they can be antigens that are normally present at extremely low levels on normal cells, but which are expressed at much higher levels on tumor cells.

[0187] Non-limiting examples of TSA or TAA antigens include the following: Differentiation antigens such as MART-1 / MelanA, gp 100 (Pmel 17) , tyrosinase, TRP-1, TRP-2 and tumor-specific multilineage antigens such as MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; overexpressed embryonic antigens such as CEA; overexpressed oncogenes and mutated tumor-suppressor genes such as p53, Ras, HER2 / neu; unique tumor antigens resulting from chromosomal translocations; such as BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; and viral antigens, such as the Epstein Barr virus antigens EBVA and the human papillomavirus (HPV) antigens E6 and E7. Other large, protein-based antigens include TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB3, c-Met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenin, CDK4, Mum-1, p15, p16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alpha-fetoprotein, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOv18, NB / 70K, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, 90K\Mac-2 binding protein\cyclophilin C-associated protein, TAAL6, TAG72, TLP, and TPS. Nucleic acids encoding the engineered receptor (e.g., CAR)

[0188] The present disclosure provides nucleic acids encoding the engineered receptor (e.g., CAR, TCR) described herein. The nucleic acids described herein can be used to transfect or transduce cells to make the cells express the engineered receptor described herein.

[0189] A nucleic acid of the present disclosure can be operably linked to a transcriptional control element, e.g., a promoter, and enhancer, etc.

[0190] The promoter may be a CD8 cell-specific promoter, a CD4 cell-specific promoter, a neutrophil-specific promoter, or an NK-specific promoter. For example, a CD4 gene promoter can be used; see, e.g., Salmon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 7739; and Marodon et al. (2003) Blood 101: 3416. As another example, a CD8 gene promoter can be used. NK cell-specific expression can be achieved by use of an NcrI (p46) promoter; see, e.g., Eckelhart et al. Blood (2011) 117: 1565.

[0191] Other examples of suitable promoters include the immediate early cytomegalovirus (CMV) promoter sequence. This promoter sequence is a strong constitutive promoter sequence capable of driving high levels of expression of any nucleic acid sequence operatively linked thereto. Other constitutive promoter sequences can also be used, including, but not limited to a simian virus 40 (SV40) early promoter, a mouse mammary tumor virus (MMTV) or human immunodeficiency virus (HIV) long terminal repeat (LTR) promoter, a MoMuLV promoter, an avian leukemia virus promoter, an Epstein-Barr virus immediate early promoter, a Rous sarcoma virus promoter, the EF-1 alpha promoter, as well as human gene promoters such as, but not limited to, an actin promoter, a myosin promoter, a hemoglobin promoter, and a creatine kinase promoter. Further, the disclosure should not be limited to the use of constitutive promoters. Inducible promoters are also contemplated as part of the disclosure. The use of an inducible promoter provides a molecular switch capable of turning on expression of the nucleic acid sequence which it is operatively linked when such expression is desired, or turning off the expression when expression is not desired. Examples of inducible promoters include, but are not limited to a metallothionine promoter, a glucocorticoid promoter, a progesterone promoter, and a tetracycline promoter.

[0192] The nucleic acid of the present disclosure may be provided for the production of a CAR or a TCR described herein (e.g., in a mammalian cell) . The nucleic acid of the present disclosure may also provide for amplification of the nucleic acid.

[0193] A vector, for example an expression vector (e.g., a lentiviral vector) can be used to introduce the nucleic acid described herein into an immune cell (e.g., a T cell) or precursor thereof. The vector (e.g., a lentiviral vector) of the present disclosure may comprise one or more nucleic acids encoding for the engineered receptor described herein. The vector (e.g., lentiviral vector) may comprise additional elements that will aid in the functional expression of the CAR described herein. The expression vector may comprise a mammalian promoter. The vector may comprise an elongation-factor-1-alpha promoter (EF-1α promoter) . The use of an EF-1α promoter may increase the efficiency in expression of downstream transgenes (e.g., a CAR encoding nucleic acid) . Physiologic promoters (e.g., an EF-1α promoter) may be less likely to induce integration mediated genotoxicity, and may abrogate the ability of the retroviral vector to transform stem cells. Other physiological promoters suitable for use in a vector (e.g., lentiviral vector) can be incorporated into a vector of the present disclosure. The vector (e.g., lentiviral vector) may comprise a non-requisite cis acting sequence that can improve titers and gene expression.

[0194] The nucleic acid can encode a naked CAR. The nucleic acid can comprise from the 5'end to the 3'end, a CD8α signal peptide, an extracellular antigen binding domain, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane domain, a CD137 co-stimulatory signaling domain, a CD3ζ primary intracellular signaling domain. Engineered cells manufactured by the methods described herein (cell preparation)

[0195] One aspect of the present disclosure provides engineered cells manufactured by the methods described herein. One aspect of the present disclosure provides a population of cells (for example, immune effector cells, for example, T cells or NK cells) made by any of the manufacturing methods described herein, engineered to express a CAR.

[0196] The engineered receptor (e.g., CAR) may redirect the specificity of the engineered cells through the expression of a chimeric antigen receptor (CAR) or TCR on these cells. CAR expression may be induced through electroporation of engineered cells for the insertion of genetic material, or by infecting these cells with viral vectors, such as lentiviruses or retroviruses containing the desired genetic material. Such genetic editing may improve the potency of the engineered cells by improving homing, cytokine production, recycle killing, and / or improved engraftment.

[0197] The engineered cells may be engineered immune effector cells (e.g., T cells or NK cells) made by the methods described herein. The engineered immune effector cells may be engineered to express a CAR, wherein the engineered immune effector cells exhibit antitumor properties. The CAR may comprise an antigen binding domain, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain. The engineered cells (for example, T cells or NK cells) may be transformed with the CAR so that the CAR is expressed on the cell surface. The cells (for example, T cells or NK cells) may be transduced with a viral vector encoding the CAR. The viral vector may be a retroviral vector. The viral vector may be a lentiviral vector. The engineered cells may stably express the CAR. The engineered cells (for example, T cells or NK cells) may be transfected or transduced with a nucleic acid, for example, mRNA, cDNA, or DNA, encoding a CAR.

[0198] The percentage of  cells (e.g., T cells) in the population of cells at the end of the manufacturing process may differ by no more than 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15%, from the percentage of cells (e.g., T cells) , in the population of cells at the beginning of the manufacturing process. The population of cells at the end of the manufacturing process may show a higher percentage of cells (e.g., T cells) , for example, at least 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 50%higher, compared with cells made by an otherwise similar method which lasts, for example, more than 28 hours (for example, which lasts more than 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 days) or which involves expanding the population of cells in vitro for, for example, more than 3 days (for example, expanding the population of cells in vitro for 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 days) . The percentage of  cells (e.g., T cells) in the population of cells at the end of the manufacturing process may more than 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, or 60%.

[0199] The percentage of central memory cells (e.g., central memory T cells) in the population of cells at the end of the manufacturing process may differ by no more than 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15%from the percentage of central memory cells, for example, central memory T cells, for example, CD95+ central memory T cells, in the population of cells at the beginning of the manufacturing process (for example, at the beginning of the cytokine process or the activation process described herein) .

[0200] The population of cells at the end of the manufacturing process after being administered in vivo, may persists longer or expands at a higher level (for example, at least 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, or 90%higher) , compared with cells made by an otherwise similar method which lasts, for example, more than 28 hours (for example, which lasts more than 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 days) or which involves expanding the population of cells in vitro for, for example, more than 3 days (for example, expanding the population of cells in vitro for 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 days) .

[0201] The cells may be immune cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , hematopoietic stem cells, pluripotent stem cells, or embryonic stem cells. The cells may be immune cells. The cells may be selected from a group consisting of T cells, αβT cells, γδT cells, NK cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , hematopoietic stem cells, pluripotent stem cells, embryonic stem cells, and a combination thereof. The cells may be T cells. The cells may be NK cells. The cells may be αβ T cells. The cells may be γδ T cells. The cells may be Vδ1 T cells.

[0202] The engineered cells may be an autologous cells, syngeneic cells, allogeneic cells, or xenogeneic cells with respect to the individual receiving them. The engineered cells may be modified by changing the major histocompatibility complex (MHC) profile, by inactivating β2-microglobulin to prevent the formation of functional Class I MHC molecules, or by inactivating Class II MHC molecules. The engineered cells may be autologous cells obtained from the human subject receiving them. The engineered cells may be allogeneic T cells obtained from the human subject.

[0203] The engineered cells described herein may include eukaryotic cells, e.g., mammalian cells. The engineered cells may be human cells. The engineered cells may be equine, bovine, murine, ovine, canine, or feline cells.

[0204] The cytotoxicity of the engineered cells against tumor cells may be evaluated in a killing efficiency assay, where the engineered cells are co-cultured with tumor cells for 24 hours. The effector cell: target cell (E: T) ratio may be 0.5: 1, 1: 1, 2: 1, 2.5: 1, 5: 1, or 10: 1. The in vitro cytotoxicity of the engineered cells may be determined using an LDH (lactate dehydrogenase) based cytotoxicity assay. The engineered cells (e.g., CAR-T cells) may be co-cultured with target cells for at least or about 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 12 hours, 16 hours, 18 hours, 1 day, 2 days, 3 days, or longer, such that the engineered cells (e.g., CAR-T cells) can be activated. The in vitro cytotoxicity of the engineered immune cells may be at least 15%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or at least 95%. The in vitro cytotoxicity of the engineered immune cells may be below 15%, below 20%, below 30%, below 40%, below 50%, below 60%, below 70%, below 80%, below 90%, below 95%. The in vitro cytotoxicity of the engineered immune cells may be about 40%-90%, about 40%-80%, or about 50%-80%. The cytotoxicity may be specific for the target cells that express an antigen specifically recognized by the engineered cells. The engineered cells may induce little or background cytotoxicity against target cells which do not express the antigen. Comparing to untransduced cells (C-UnT) , the in vitro cytotoxicity of the engineered cells may be higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 10, 00%.

[0205] To evaluate the CAR positive rate (CAR+%) of the engineered cells, the engineered cells may be subjected to a flow cytometry analysis. The engineered cells may have a CAR positive rate of more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%.

[0206] The phenotype percentages of the engineered cells may be evaluated by a flow cytometry analysis. The engineered cells may have a CD4+CD8-percentage of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The engineered cells may have a CD4+CD8-percentage of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. Comparing to untransduced cells (C-UnT) , the CD4+CD8-percentage of the engineered cells may be higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 42%, more than 43%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, or more than 500%.

[0207] To evaluate the viability of the engineered cells, the engineered cells may be subjected to a viability analysis. The engineered cells may have a viability of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The engineered cells may have a viability of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. The viability of the engineered cells may be at least or about 80%, at least or about 90%, at least or about 100%, at least or about 110%, at least or about 120%, as compared to the viability of un-transduced cells.

[0208] The phenotype percentages of the engineered cells may be evaluated by a flow cytometry analysis. The engineered cells may have a Tn+Tscm percentage of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The engineered cells may have Tn+Tscm percentage of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. Comparing to C-CAR, the Tn+Tscm percentage of the engineered cells may be higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, or more than 500%.

[0209] To evaluate the vector copy number (VCN)  / CAR positive rate (CAR+%) of the engineered cells, the engineered cells may be subjected to a flow cytometry analysis. The engineered cells may have a VCN / CAR+%of more than 1, more than 1.1, more than 1.2, more than 1.3, more than 1.4, more than 1.5, more than 1.6, more than 1.7, more than 1.8, more than 1.9, or more than 2. The engineered cells may have a VCN / CAR+%of less than 1, less than 1.1, less than 1.2, less than 1.3, less than 1.4, less than 1.5, less than 1.6, less than 1.7, less than 1.8, less than 1.9, or less than 2.

[0210] To evaluate the low density lipoprotein receptor (LDLR) positive rate (LDLR+%) of the cells, the cells may be subjected to a flow cytometry analysis. The cells may have a LDLR positive rate of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%, after 12 hours, 14 hours, 16 hours, 18 hours, or 20 hours of activation. The cells may have a LDLR positive rate of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%, after 12 hours, 14 hours, 16 hours, 18 hours, or 20 hours of activation. Comparing to cells not exposed to the activation medium, the LDLR positive rate of the cells may be higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 10, 00%, after 12 hours, 14 hours, 16 hours, 18 hours, or 20 hours of activation. Engineered cells comprising a bispecific CAR system

[0211] One aspect of the present disclosure provides engineered immune cells comprising a bispecific CAR system comprising (1) a first CAR comprising a binding domain for a solid tumor antigen ( “tumor antigen CAR” ) , and (2) a second CAR comprising a binding domain for a blood cell antigen ( “Blood cell antigen CAR” ) . The present disclosure also provides engineered immune cells comprising a bispecific CAR system targeting a solid tumor antigen and a blood cell antigen. The present disclosure also provides engineered immune cells comprising a bispecific CAR system targeting a solid tumor antigen and a B cell antigen.

[0212] The solid tumor antigen may be Claudin 18.2, DLL3, GUCY2C, tMUC1, PRLR, CLCA1, MUC12, GPR35, GPRC5D, CR1L, MUC17, TMPRSS11B, TMPRSS11E, CD207, SLC30A8, CFC1, SLC12A3, SSTR1, GPR27, FZD10, TSHR, SIGLEC15, SLC6A3, KISS1R, QRFPR, GPR119, CLDN6, UPK2, ADAM12, SLC45A3, ACPP, MUC16, MS4A12, ALPP, CEA, EphA2, FAP, GPC3, IL13-Rα2, Mesothelin, PSMA, ROR1, VEGFR-II, GD2, FR-α, ErbB2, EpCAM, EGFRvIII, or EGFR. The B cell antigen may be CD19, CD20, CD22, CD34, CD37, CD38, CD45R, CD33, or BCMA.

[0213] The engineered cells (e.g., CAR-T cells) described herein may proliferate faster upon exposure to a B cell antigen, as compared to engineered cells that do not comprise a CAR comprising a binding domain for a B cell antigen. Without wishing to be bound by theory, by expressing a CAR comprising a binding domain for a B cell antigen, the engineered cells (e.g., CAR-T cells) can (1) obtain sufficient antigen stimulation, which activates the downstream signaling pathway of T cells, (2) obtain sufficient expansion, and (3) migrate to and infiltrate the tissue where the solid tumor is located to kill tumor cells.

[0214] In the bispecific CAR system, because the B cell antigen CAR targets an antigen expressed by normal tissue cells, it may have a long-term inhibitory effect on the corresponding normal cell population. The expression of the B cell antigen CAR in T cells may be a transient expression. Stable expression methods include virus infection methods using lentivirus and retrovirus viruses as vectors. In this expression method, the CAR sequence can be stably inserted into the genome of cells to obtain stable and long-term expression. Transient expression methods include virus infection methods using non-integrating viral expression vectors such as adeno-associated virus (AAV) and lentiviruses with integrase mutations (losing the ability to insert into the genome for expression) , or mRNA-based transient expression delivery systems based transient expression delivery systems. After the initial expansion of CAR-T cells, the engineered cells transiently expressing B cell antigen CAR may gradually lose the B cell antigen CAR and will no longer target cells expressing B cell antigens. Transient expression may be achieved with Sendai virus (SeV) vector, transient transfection, Epstein–Barr virus (EBV) episomal plasmids, AAV vector, minicircle, synthetic mRNA, and microRNA mimic. In a preferred embodiment, transient expression may be achieved with a mutant integrase (e.g., D64V) non-integrating lentiviral vector (NILV) packaging system, which is used to package the lentivirus virus particle that is used to infect cells to express the B cell antigen CAR. Common mutant integrase includes any of the below mutations: H12, D64, D116, N120, Q148, E152, and W235. In one embodiment, the D64 mutation is introduced to the third-generation packaging plasmid pMDLg / pRRE containing the pol gene, so that the integrase enzyme will lose the ability to insert and integrate into the genome. 1.Dual-CAR

[0215] One aspect of the present disclosure provides a dual chimeric antigen receptor (Dual-CAR) system comprising: (a) a first chimeric antigen receptor (CAR) comprising: i) a first antigen binding domain specifically recognizing a solid tumor antigen; ii) a first transmembrane domain; and iii) a first intracellular signaling domain, optionally comprising a co-stimulatory signaling domain; and (b) a second chimeric antigen receptor (CAR) comprising: i) a second antigen binding domain specifically recognizing a B cell antigen; ii) a second transmembrane domain; and iii) optionally comprising a second intracellular signaling domain, optionally comprising a co-stimulatory signaling domain and / or a CD3ζ primary intracellular signaling domain.

[0216] The first intracellular signaling domain may further comprise a primary intracellular signaling domain of an immune cell, and the second intracellular signaling domain may lack a primary intracellular signaling domain that is derived from CD3ζ.

[0217] The antigen binding domain of each CAR in the dual-CAR system described herein may comprise one or more (such as any one of 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more) antibodies or antibody fragments.

[0218] The first and / or the second antigen binding domain may comprise a first antigen binding moiety and / or a second antigen binding moiety, which can be selected from a Fab, a Fab’ , a F (ab’ ) 2, an Fv, a single-chain Fv (scFv) , minibody, a diabody, a single-domain antibody (sdAb) or VHH domain. The first antigen binding domain may comprise a first and a second antigen binding moieties which are sdAbs (e.g., VHH domains) . The second antigen binding domain may comprise an antigen binding moiety which is a single chain Fv (scFv, such as VL-VH pairs) . The antigen binding domain of the first CAR and / or the second CAR described herein may comprise one or more (such as any one of 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more) sdAbs or scFvs. The sdAbs and / or scFvs can be fused to each other directly via peptide bonds, or via peptide linkers.

[0219] The dual-CAR system may comprise a first CAR targeting DLL3 (also referred herein as “DLL3 CAR” ) comprising: (a) a first antigen binding domain comprising an anti-DLL3 binding moiety; (b) a first transmembrane domain; and (c) a first intracellular signaling domain. The first intracellular signaling domain may comprise a co-stimulatory signaling domain and a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell (such as T cell) . The primary intracellular signaling domain may be derived from CD3ζ. The co-stimulatory signaling domain of the first intracellular signaling domain may be derived from a molecule selected from the group consisting of a co-stimulatory molecule derived from CD27, CD28, CD137 (4-1BB) , OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, and ligands of CD83. The DLL3 CAR may further comprise a hinge domain (such as a CD8α hinge domain) located between the C-terminus of the DLL3 antigen binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain. The DLL3 CAR may further comprise a signal peptide (such as a CD8α signal peptide) located at the N-terminus of the antigen binding domain. The first CAR may comprise from the N-terminus to the C-terminus: a CD8α signal peptide, a DLL3 antigen binding domain, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane domain, a co-stimulatory signaling domain derived from 4-1BB, and a primary intracellular signaling domain derived from CD3ζ. The DLL3 CAR may be monospecific. The DLL3 CAR may be bispecific or bivalent.

[0220] The dual-CAR system may comprise a first CAR targeting GPRC5D (also referred herein as “GPRC5D CAR” ) comprising: (a) a first antigen binding domain comprising an anti-GPRC5D binding moiety; (b) a first transmembrane domain; and (c) a first intracellular signaling domain. The first intracellular signaling domain may comprise a co-stimulatory signaling domain and a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell (such as T cell) . The primary intracellular signaling domain may be derived from CD3ζ. The co-stimulatory signaling domain of the first intracellular signaling domain may be derived from a molecule selected from the group consisting of a co-stimulatory molecule derived from CD27, CD28, CD137 (4-1BB) , OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, and ligands of CD83. The GPRC5D CAR may further comprise a hinge domain (such as a CD8α hinge domain) located between the C-terminus of the GPRC5D antigen binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain. The GPRC5D CAR may further comprise a signal peptide (such as a CD8α signal peptide) located at the N-terminus of the antigen binding domain. The first CAR may comprise from the N-terminus to the C-terminus: a CD8α signal peptide, a GPRC5D antigen binding domain, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane domain, a co-stimulatory signaling domain derived from 4-1BB, and a primary intracellular signaling domain derived from CD3ζ. The GPRC5D CAR may be monospecific. The GPRC5D CAR may be bispecific or bivalent.

[0221] The dual-CAR system may comprise a second CAR targeting CD19 (also referred herein as “CD19 CAR” ) comprising: (a) a second antigen binding domain comprising an anti-CD19 binding moiety; (b) a second transmembrane domain; and (c) a second intracellular signaling domain comprising a co-stimulatory signaling domain. The second intracellular signaling domain may lack a primary intracellular signaling domain that is derived from CD3ζ. The second intracellular signaling domain may lack a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell (such as T cell) . The co-stimulatory signaling domain of the second intracellular signaling domain may be derived from a molecule selected from the group consisting of a co-stimulatory molecule derived from CD27, CD28, CD137 (4-1BB) , OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, and ligands of CD83. The CD19 CAR may comprise a hinge domain (such as a CD28 hinge domain or a mutant CD28 hinge domain) located between the C-terminus of the CD19 antigen binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain. The CD19 CAR may comprise a signal peptide (such as a CD8α signal peptide) located at the N-terminus of the CD19 antigen binding domain. The second CAR may comprise from the N-terminus to the C-terminus: a CD8α signal peptide, the CD19 antigen binding domain, a CD28 hinge domain or a mutant CD28 hinge domain, a transmembrane domain derived from CD28, and a co-stimulatory signaling domain derived from CD28.

[0222] The dual-CAR system may comprise a second CAR targeting BCMA (also referred herein as “BCMA CAR” ) comprising: (a) a second antigen binding domain comprising an anti-BCMA binding moiety; (b) a second transmembrane domain; and (c) a second intracellular signaling domain comprising a co-stimulatory signaling domain. The second intracellular signaling domain may lack a primary intracellular signaling domain that is derived from CD3ζ. The second intracellular signaling domain may lack a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell (such as T cell) . The co-stimulatory signaling domain of the second intracellular signaling domain may be derived from a molecule selected from the group consisting of a co-stimulatory molecule derived from CD27, CD28, CD137 (4-1BB) , OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, and ligands of CD83. The BCMA CAR may comprise a hinge domain (such as a CD28 hinge domain or a mutant CD28 hinge domain) located between the C-terminus of the BCMA antigen binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain. The BCMA CAR may comprise a signal peptide (such as a CD8α signal peptide) located at the N-terminus of the BCMA antigen binding domain. The second CAR may comprise from the N-terminus to the C-terminus: a CD8αsignal peptide, the BCMA antigen binding domain, a CD28 hinge domain or a mutant CD28 hinge domain, a transmembrane domain derived from CD28, and a co-stimulatory signaling domain derived from CD28. 2. Tandem CAR

[0223] In one aspect, the present disclosure provides a bispecific chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain that specifically recognizes both a solid tumor antigen (e.g., DLL3 or GPRC5D) and a B cell antigen (e.g., CD19 or BCMA) ; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain.

[0224] The antigen binding domain may be derived from one or more variable regions of a monoclonal antibody linked together. An antibody in scFv format consists of variable regions of heavy chain (VH) and light chain (VL) , which are joined together by a flexible peptide linker or a disulfide bond. The antigen binding domain may comprise one or more (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, or 6) VH-VL pairs.

[0225] The bispecific CAR may comprise: (a) an antigen binding domain comprising (1) a solid tumor binding moiety specifically recognizing a solid tumor antigen (e.g., GPRC5D or DLL3) , and (2) a B cell binding moiety specifically recognizing a B cell antigen (e.g., CD19 or BCMA) ; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. The solid tumor binding moiety may comprise an anti-DLL3 scFv (or sdAb) or anti-GPRC5D scFv (or sdAb) . The B cell binding moiety may comprise an anti-CD19 scFv (or sdAb) or an anti-BCMA scFv (or sdAb) . The intracellular signaling domain may comprise a co-stimulatory signaling domain and a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell (such as T cell) . The intracellular signaling domain may lack a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell (such as T cell) . The co-stimulatory signaling domain of the intracellular signaling domain may be derived from a molecule selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137 (4-1BB) , OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, and ligands of CD83. The bispecific CAR may comprise a hinge domain (such as a CD28 hinge domain or mutant CD28 hinge domain) located between the C-terminus of the antigen binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain. The bispecific CAR may comprise a signal peptide (such as a CD8α signal peptide) located at the N-terminus of the antigen binding domain. The bispecific CAR may comprise from the N-terminus to the C-terminus: a CD8α signal peptide, the antigen binding domain, a CD28 hinge domain or a mutant CD28 hinge domain, a transmembrane domain derived from CD28, and a co-stimulatory signaling domain derived from CD28. 3. Other CAR regions

[0226] Other components and regions of bispecific CAR are described in more detail below. (a) Intracellular Signaling Domain

[0227] The bispecific CAR of the present disclosure comprises at least one intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain is responsible for activation of at least one of the normal effector functions of the immune cell expressing the CARs. As used herein, the terms “intracellular signaling domain” , or “intracellular signaling region” are used interchangeably herein and refer to the portion of a protein which transduces the effector function signal and directs the cell to perform a specialized function. While usually the entire intracellular signaling domain can be employed, in many cases it is not necessary to use the entire chain. To the extent that a truncated portion of the intracellular signaling domain is used, such truncated portion may be used in place of the intact chain as long as it transduces the effector function signal. The term intracellular signaling domain is thus meant to include any truncated portion of the intracellular signaling domain sufficient to transduce the effector function signal (e.g., at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%of the entire portion) . An intracellular signaling domain can be derived from the intracellular or cytoplasmic signaling domain of a wild-type membrane protein (e.g., a receptor) or a functional variant thereof. An intracellular signaling domain may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, and / or substitutions. An intracellular signaling domain may comprise a co-stimulatory signaling domain and / or a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell. The term “effector function” refers to a specialized function of a cell. Effector function of a T cell, for example, may be cytolytic activity or helper activity including the secretion of cytokines.

[0228] The intracellular signaling domain may comprise a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell. The CAR may comprise an intracellular signaling domain consisting essentially of a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell. “Primary intracellular signaling domain” refers to cytoplasmic signaling sequence that acts in a stimulatory manner to induce immune effector functions. The primary intracellular signaling domain may contain a signaling motif known as immunoreceptor tyrosine-based activation motif, or ITAM. An “ITAM, ” as used herein, is a conserved protein motif that is generally present in the tail portion of signaling molecules expressed in many immune cells. The motif may comprises two repeats of the amino acid sequence YxxL / I separated by 6-8 amino acids, wherein each x is independently any amino acid, producing the conserved motif YxxL / Ix (6-8) YxxL / I. ITAMs within signaling molecules are important for signal transduction within the cell, which is mediated at least in part by phosphorylation of tyrosine residues in the ITAM following activation of the signaling molecule. ITAMs may also function as docking sites for other proteins involved in signaling pathways. Exemplary ITAM-containing primary intracellular signaling sequences include those derived from CD3ζ, FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon Rib) , CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, and / or CD66d.

[0229] The primary intracellular signaling domain of the bispecific CAR, and / or the primary intracellular signaling domain of the first CAR in the dual-CAR system may be derived from CD3ζ, and retain the relevant function of the primary intracellular signaling domain of CD3ζ. The primary intracellular signaling domain may have a sequence that is identical to the primary intracellular signaling domain of CD3ζ, or at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%or 99%identical to the sequence of the primary intracellular signaling domain of CD3ζ. The primary intracellular signaling domain may consist of the cytoplasmic signaling domain of CD3ζ. The primary intracellular signaling domain may be a cytoplasmic signaling domain of wild-type CD3ζ. The primary intracellular signaling domain may be a functional mutant of the cytoplasmic signaling domain of CD3ζ containing one or more mutations, such as Q65K. (b) Co-stimulatory Signaling Domain

[0230] Many immune effector cells require co-stimulation, in addition to stimulation of an antigen-specific signal, to promote cell proliferation, differentiation and survival, as well as to activate effector functions of the cell. The CAR may comprise at least one co-stimulatory signaling domain. The term “co-stimulatory signaling domain, ” as used herein, refers to at least a portion of a protein that mediates signal transduction within a cell to induce an immune response such as an effector function. The co-stimulatory signaling domain of the chimeric antigen receptor described herein can be a cytoplasmic signaling domain from a co-stimulatory protein, which transduces a signal and modulates responses mediated by immune cells, such as T cells, NK cells, macrophages, neutrophils, or eosinophils. The co-stimulatory signaling domain can be the cytoplasmic portion of a co-stimulatory molecule. The term "co-stimulatory molecule" refers to a cognate binding partner on an immune cell (such as T cell) that specifically binds with a co-stimulatory ligand, thereby mediating a co-stimulatory response by the immune cell, such as, but not limited to, proliferation and survival.

[0231] The intracellular signaling domain may comprise a single co-stimulatory signaling domain. An intracellular signaling domain may comprise two or more (such as about any of 2, 3, 4, or more) co-stimulatory signaling domains. An intracellular signaling domain may comprise two or more of the same co-stimulatory signaling domains. An intracellular signaling domain may comprise two or more co-stimulatory signaling domains from different co-stimulatory proteins, such as any two or more co-stimulatory proteins described herein. The intracellular signaling domain may comprise a primary intracellular signaling domain (such as primary intracellular signaling domain of CD3ζ) and one or more co-stimulatory signaling domains. The one or more co-stimulatory signaling domains and the primary intracellular signaling domain (such as primary intracellular signaling domain of CD3ζ) may be fused to each other via optional peptide linkers. The primary intracellular signaling domain, and the one or more co-stimulatory signaling domains may be arranged in any suitable order. The one or more co-stimulatory signaling domains may be located between the transmembrane domain and the primary intracellular signaling domain (such as primary intracellular signaling domain of CD3ζ) . Multiple co-stimulatory signaling domains may provide additive or synergistic stimulatory effects.

[0232] Activation of a co-stimulatory signaling domain in a host cell (e.g., an immune cell) may induce the cell to increase or decrease the production and secretion of cytokines, phagocytic properties, proliferation, differentiation, survival, and / or cytotoxicity. The co-stimulatory signaling domain of any co-stimulatory molecule may be compatible for use in the CARs described herein. The type (s) of co-stimulatory signaling domain is selected based on factors such as the type of the immune effector cells in which the effector molecules would be expressed (e.g., T cells, NK cells, macrophages, neutrophils, or eosinophils) and the desired immune effector function (e.g., ADCC effect) . Examples of co-stimulatory signaling domains for use in the CARs can be the cytoplasmic signaling domain of co-stimulatory proteins, including, without limitation, members of the B7 / CD28 family (e.g., B7-1 / CD80, B7-2 / CD86, B7-H1 / PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA / CD272, CD28, CTLA-4, Gi24 / VISTA / B7-H5, ICOS / CD278, PD-1, PD-L2 / B7-DC, and PDCD6) ; members of the TNF superfamily (e.g., 4-1BB / TNFSF9 / CD137, 4-1BB Ligand / TNFSF9, BAFF / BLyS / TNFSF13B, BAFF R / TNFRSF13C, CD27 / TNFRSF7, CD27 Ligand / TNFSF7, CD30 / TNFRSF8, CD30 Ligand / TNFSF8, CD40 / TNFRSF5, CD40 / TNFSF5, CD40 Ligand / TNFSF5, DR3 / TNFRSF25, GITR / TNFRSF18, GITR Ligand / TNFSF18, HVEM / TNFRSF14, LIGHT / TNFSF14, Lymphotoxin-alpha / TNF-beta, OX40 / TNFRSF4, OX40 Ligand / TNFSF4, RELT / TNFRSF19L, TACI / TNFRSF13B, TL1A / TNFSF15, TNF-alpha, and TNF RII / TNFRSF1B) ; members of the SLAM family (e.g., 2B4 / CD244 / SLAMF4, BLAME / SLAMF8, CD2, CD2F-10 / SLAMF9, CD48 / SLAMF2, CD58 / LFA-3, CD84 / SLAMF5, CD229 / SLAMF3, CRACC / SLAMF7, NTB-A / SLAMF6, and SLAM / CD150) ; and any other co-stimulatory molecules, such as CD2, CD7, CD53, CD82 / Kai-1, CD90 / Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a / LMIR1, HLA Class I, HLA-DR, Ikaros, Integrin alpha 4 / CD49d, Integrin alpha 4 beta 1, Integrin alpha 4 beta 7 / LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, Dectin-1 / CLEC7A, DPPIV / CD26, EphB6, TIM-1 / KIM-1 / HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, lymphocyte function associated antigen-1 (LFA-1) , and NKG2C.

[0233] The one or more co-stimulatory signaling domains may be derived from one or more molecules selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137 (4-1BB) , OX40, CD30, CD40, CD3, lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) , CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 and ligands that specially bind to CD83.

[0234] The intracellular signaling domain of the CAR of the present disclosure may comprise a co-stimulatory signaling domain derived from CD137 (i.e., 4-1BB) . The intracellular signaling domain of the CAR (e.g., the first CAR in the dual-CAR or the bispecific CAR) may comprise a primary intracellular signaling domain of CD3ζ and a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB. The intracellular signaling domain of the CAR may comprise a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB.

[0235] The intracellular signaling domain of the CAR (e.g., the first CAR of the dual-CAR or the bispecific CAR) of the present disclosure may comprise a co-stimulatory signaling domain derived from CD28. The intracellular signaling domain of the CAR (e.g., the first CAR in the dual-CAR or bispecific CAR) may comprise a primary intracellular signaling domain of CD3ζ and a co-stimulatory signaling domain of CD28.

[0236] Also within the scope of the present disclosure are variants of any of the co-stimulatory signaling domains described herein, such that the co-stimulatory signaling domain is capable of modulating the immune response of the immune cell. The co-stimulatory signaling domains may comprise up to 10 amino acid residue variations (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, or 8) as compared to a wild-type counterpart. Such co-stimulatory signaling domains comprising one or more amino acid variations may be referred to as variants. Mutation of amino acid residues of the co-stimulatory signaling domain may result in an increase in signaling transduction and enhanced stimulation of immune responses relative to co-stimulatory signaling domains that do not comprise the mutation. Mutation of amino acid residues of the co-stimulatory signaling domain may result in a decrease in signaling transduction and reduced stimulation of immune responses relative to co-stimulatory signaling domains that do not comprise the mutation.

[0237] In the dual-CAR system, the first intracellular signaling domain of the first CAR may consist of 1, 2, 3, 4, 5, or more co-stimulatory signaling domains. The first intracellular signaling domain of the first CAR may consist of one co-stimulatory signaling domain. The first intracellular signaling domain of the first CAR may comprise 1, 2, 3, 4, 5, or more primary intracellular signaling domain of an immune cell (such as T cell) . The first intracellular signaling domain of the first CAR may consist of one primary intracellular signaling domain of an immune cell (such as T cell) , which is capable of inducing a primary activation signal in an immune cell (such as T cell) . A primary intracellular signaling domain may be a T cell receptor (TCR) component. A primary intracellular signaling domain of the first intracellular signaling domain may comprise an immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) . A primary intracellular signaling domain of the first intracellular signaling domain may comprise an amino acid sequence derived from CD3 zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (ICOS) , FceRI, CD66d, DAP10, DAP12, or combinations thereof. The primary intracellular signaling domain of the first intracellular signaling domain may be derived from CD3ζ. The primary intracellular signaling domain may consist of the cytoplasmic signaling domain of CD3ζ. The primary intracellular signaling domain may be a cytoplasmic signaling domain of wild-type CD3ζ. The primary intracellular signaling domain may be a functional mutant of the cytoplasmic signaling domain of CD3ζ containing one or more mutations, such as Q65K.

[0238] In the dual-CAR system, the second intracellular signaling domain of the second CAR may consist of 1, 2, 3, 4, 5, or more co-stimulatory signaling domains. The second intracellular signaling domain of the second CAR may consist of one co-stimulatory signaling domain. The second intracellular signaling domain of the second CAR may each comprise more than one co-stimulatory domain.

[0239] Each of the first CAR and the second CAR in the dual-CAR system as described herein may comprise at least one co-stimulatory signaling domain of the first intracellular signaling domain and / or one co-stimulatory signaling domain of the second intracellular signaling domain, which may comprise a functional signaling domain from a protein selected from the group consisting of a MHC class I molecule, a TNF receptor protein, an Immunoglobulin-like protein, a cytokine receptor, an integrin, a signaling lymphocytic activation molecule (SLAM protein) , an activating NK cell receptor, BTLA, a Toll ligand receptor, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1, CD11a / CD18, 4-1BB (CD137) , B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278) , GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR) , KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD 11b, ITGAX, CD 11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE / RANKL, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CD100 (SEMA4D) , CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG / Cbp, CD19a, and a CD83 ligand. The co-stimulatory signaling domain of the first intracellular signaling domain and / or the co-stimulatory signaling domain of the second intracellular signaling domain may comprise a functional signaling domain from OX40, CD28, 4-1BB, ICOS, or a signaling portion thereof. The co-stimulatory signaling domain of the first intracellular signaling domain and / or the second intracellular signaling domain may derived from 4-1BB and / or CD28. The co-stimulatory signaling domain of the first intracellular signaling domain may comprise a cytoplasmic signaling domain of 4-1BB and the co-stimulatory signaling domain of the second intracellular signaling domain may comprise a cytoplasmic signaling domain of CD28. (c) Transmembrane Domain

[0240] Each of the first CAR and the second CAR in the dual-CAR system and the bispecific CAR of the present disclosure may comprise a transmembrane domain that can be directly or indirectly fused to the extracellular antigen binding domain. As used herein, the terms “transmembrane domain” or “transmembrane region” are used interchangeably herein to refer to the portion of a membrane protein (e.g., a receptor) that is embedded in the cell membrane. A transmembrane region can be entire portion of the protein that is embedded in the cell membrane, or just a part thereof (e.g., at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%of the entire portion) . A transmembrane region can be derived from the transmembrane region of a wild-type receptor or a functional variant thereof. A transmembrane region can have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, and / or substitutions. The transmembrane domain may be derived either from a natural or from a synthetic source. Transmembrane domains compatible for use in the CARs described herein may be obtained from a naturally occurring protein. Alternatively, it can be a synthetic, non-naturally occurring protein segment, e.g., a hydrophobic protein segment that is thermodynamically stable in a cell membrane.

[0241] Transmembrane domains are classified based on three dimensional structures of the transmembrane domain. For example, transmembrane domains may form an alpha helix, a complex of more than one alpha helix, a beta-barrel, or any other stable structure capable of spanning the phospholipid bilayer of a cell. Furthermore, transmembrane domains may also or alternatively be classified based on the transmembrane domain topology, including the number of passes that the transmembrane domain makes across the membrane and the orientation of the protein. For example, single-pass membrane proteins cross the cell membrane once, and multi-pass membrane proteins cross the cell membrane at least twice (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7 or more times) . Membrane proteins may be defined as Type I, Type II or Type III depending upon the topology of their termini and membrane-passing segment (s) relative to the inside and outside of the cell. Type I membrane proteins have a single membrane-spanning region and are oriented such that the N-terminus of the protein is present on the extracellular side of the lipid bilayer of the cell and the C-terminus of the protein is present on the cytoplasmic side. Type II membrane proteins also have a single membrane-spanning region but are oriented such that the C-terminus of the protein is present on the extracellular side of the lipid bilayer of the cell and the N-terminus of the protein is present on the cytoplasmic side. Type III membrane proteins have multiple membrane-spanning segments and may be further sub-classified based on the number of transmembrane segments and the location of N-terminus and C-terminus.

[0242] A transmembrane domain of each CAR described herein may be derived from a Type I single-pass membrane protein. The transmembrane domains from multi-pass membrane proteins may also be compatible for use in the CARs described herein. Multi-pass membrane proteins may comprise a complex (at least 2, 3, 4, 5, 6, 7 or more) alpha helices or a beta sheet structure. The N-terminus and the C-terminus of a multi-pass membrane protein may be present on opposing sides of the lipid bilayer, e.g., the N-terminus of the protein is present on the cytoplasmic side of the lipid bilayer and the C-terminus of the protein is present on the extracellular side.

[0243] The transmembrane domain of each CAR may comprise a transmembrane domain chosen from the transmembrane domain of an alpha, beta or zeta chain of a T-cell receptor, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD152, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18) , ICOS (CD278) , 4-1BB (CD137) , GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRFl) , CD160, CD19, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7Ra, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CD100 (SEMA4D) , SLAMF6 (NTB-A, Lyl08) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, PD1, and / or NKG2C. The transmembrane domain may be derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, CD4, CD28, 4-1BB, CD80, CD86, CD152 and PD1.

[0244] Transmembrane domains for use in the CARs described herein can also comprise at least a portion of a synthetic, non-naturally occurring protein segment. The transmembrane domain may be a synthetic, non-naturally occurring alpha helix or beta sheet. The protein segment is at least approximately 20 amino acids, e.g., at least 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, or more amino acids. Examples of synthetic transmembrane domains are known in the art, for example in U. S. Patent No. 7, 052, 906 and PCT Publication No. WO 2000 / 032776, the relevant disclosures of which are incorporated by reference herein.

[0245] The transmembrane domain provided herein may comprise a transmembrane region and a cytoplasmic region located at the C-terminal side of the transmembrane domain. The cytoplasmic region of the transmembrane domain may comprise three or more amino acids and, helps to orient the transmembrane domain in the lipid bilayer. One or more cysteine residues may be present in the transmembrane region of the transmembrane domain. One or more cysteine residues are present in the cytoplasmic region of the transmembrane domain. The cytoplasmic region of the transmembrane domain may comprise positively charged amino acids. The cytoplasmic region of the transmembrane domain may comprise the amino acids arginine, serine, and lysine.

[0246] The transmembrane region of the transmembrane domain may comprise hydrophobic amino acid residues. A transmembrane domain of each CAR provided herein may comprise an artificial hydrophobic sequence. For example, a triplet of phenylalanine, tryptophan and valine may be present at the C terminus of the transmembrane domain. A transmembrane region comprises mostly hydrophobic amino acid residues, such as alanine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, or valine. The transmembrane region may comprise a poly-leucine-alanine sequence. The hydropathy, or hydrophobic or hydrophilic characteristics of a protein or protein segment, can be assessed by any method known in the art, for example the Kyte and Doolittle hydropathy analysis. (d) Hinge domain

[0247] Each of the first CAR and the second CAR in the dual-CAR system and the bispecific CAR of the present disclosure may comprise a hinge domain that is located between the extracellular antigen binding domain and the transmembrane domain. As used herein, the terms “hinge domain” or “hinge region” are used interchangeably herein to refer to the portion of a membrane protein (e.g., a receptor) that connects a transmembrane region and the extracellular domain. A hinge domain is a small structural domain that sits between the antigen binding domain and the cell’s outer membrane. For example, a hinge domain may be located between a C-terminus of an antigen binding domain and an N-terminus of a transmembrane domain. A hinge domain can be part of an extracellular domain. A hinge domain can be derived from a hinge domain of a wild-type receptor or a functional variant thereof. A hinge domain can have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, and / or substitutions.

[0248] A hinge domain can allow for flexibility of the protein and movement of one or both of the domains relative to one another. Any amino acid sequence that provides such flexibility and movement of the extracellular antigen binding domain relative to the transmembrane domain of the effector molecule can be used.

[0249] The hinge domain may contain about 10-100 amino acids, e.g., about any one of 15-75 amino acids, 20-50 amino acids, or 30-60 amino acids. The hinge domain may be at least about any one of 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, or 75 amino acids in length.

[0250] The hinge domain can be a hinge domain of a naturally occurring protein. Hinge domains of any protein known in the art to comprise a hinge domain can be used in the chimeric receptors described herein. The hinge domain may be a portion of a hinge domain of a naturally occurring protein and confers flexibility to the chimeric receptor. A hinge domain may be derived from CD8α. The hinge domain may be a portion of the hinge domain of CD8α, e.g., a fragment containing at least 15 (e.g., 20, 25, 30, 35, or 40) consecutive amino acids of the hinge domain of CD8α. A hinge domain may be a membrane-proximal region of CD28. The hinge domain of CD28 may be a wild-type CD28 hinge domain or a mutant CD28 hinge domain.

[0251] Hinge domains of antibodies, such as an IgG, IgA, IgM, IgE, or IgD antibodies, can also be compatible for use in the pH-dependent chimeric receptor systems described herein. The hinge domain may be a hinge domain that joins the constant domains CH1 and CH2 of an antibody. A hinge domain may be of an antibody and may comprise the hinge domain of the antibody and one or more constant regions of the antibody. The hinge domain may comprise a hinge domain of an antibody and the CH3 constant region of the antibody. The hinge domain may comprise a hinge domain of an antibody and the CH2 and CH3 constant regions of the antibody. The antibody may be an IgG, IgA, IgM, IgE, or IgD antibody. The antibody may be an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 antibody. The hinge region may comprise the hinge region and the CH2 and CH3 constant regions of an IgG1 antibody. The hinge region may comprise the hinge region and the CH3 constant region of an IgG1 antibody.

[0252] Non-naturally occurring peptides may also be used as hinge domains for the chimeric receptors described herein. The hinge domain between the C-terminus of the extracellular ligand-binding domain of an Fc receptor and the N-terminus of the transmembrane domain is a peptide linker, such as a (GxS) n linker, wherein x and n, independently can be an integer between 3 and 12, including 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, or more. (e) Signal Peptide

[0253] Each of the first CAR and the second CAR in the dual-CAR system and the bispecific CAR of the present disclosure may comprise a signal peptide (also known as a signal sequence) at the N-terminus of the antigen binding domain. In general, signal peptides are peptide sequences that target a polypeptide to the desired site in a cell. The signal peptide may target the effector molecule to the secretory pathway of the cell and will allow for integration and anchoring of the effector molecule into the lipid bilayer. Signal peptides including signal sequences of naturally occurring proteins or synthetic, non-naturally occurring signal sequences, which are compatible for use in the CARs described herein will be evident to one of skill in the art. A signal peptide may be derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, GM-CSF receptor α, and IgG1 heavy chain. The signal peptide may be a signal peptide derived from CD8α. (f) Peptide Linker

[0254] When multiple antibodies (e.g., multiple antibody fragments) are present in the present CARs, the various antibodies or antibody fragments may be fused to each other via one or more peptide linkers (e.g., VHH-Linker-VHH, or VL-Linker-VH) . The antibodies or antibody fragments may be directly fused to each other without any peptide linkers. The peptide linkers connecting different antibodies may be the same or different. Different domains of the CARs may also be fused to each other via peptide linkers.

[0255] Each peptide linker in a CAR may have the same or different length and / or sequence depending on the structural and / or functional features of the antibodies and / or the various domains. Each peptide linker may be selected and optimized independently. The length, the degree of flexibility and / or other properties of the peptide linker (s) used in the CARs may have some influence on properties, including but not limited to the affinity, specificity or avidity for one or more particular antigens or epitopes. For example, longer peptide linkers may be selected to ensure that two adjacent domains do not sterically interfere with one another. A short peptide linker may be disposed between the transmembrane domain and the intracellular signaling domain of a CAR. A peptide linker may comprise flexible residues (such as glycine and serine) so that the adjacent domains are free to move relative to each other. For example, a glycine-serine doublet can be a suitable peptide linker.

[0256] The peptide linker can be of any suitable length. The peptide linker may be at least about any of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 or more amino acids long. The peptide linker may be no more than about any of 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 or fewer amino acids long.

[0257] The peptide linker may have a naturally occurring sequence, or a non-naturally occurring sequence. For example, a sequence derived from the hinge region of heavy chain only antibodies may be used as the linker. See, for example, WO1996 / 34103. The peptide linker may be a flexible linker. Exemplary flexible linkers include but not limited to glycine polymers (G) n, glycine-serine polymers, glycine-alanine polymers, alanine-serine polymers, threonine-serine, and other flexible linkers known in the art. Other linkers known in the art, for example, as described in WO2016014789, WO2015158671, WO2016102965, US20150299317, WO2018067992, US7741465, Colcher et al., J. Nat. Cancer Inst. 82: 1191-1197 (1990) , and Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) may also be included in the CARs provided herein, the disclosure of each of which is incorporated herein by reference.

[0258] The dual-CAR system may include a first CAR and a second CAR linked by a self-cleaving peptide. As used herein, a “self-cleaving peptide” or “2A linker” refers to an oligopeptide that allow multiple proteins to be encoded as polyproteins, which dissociate into component proteins upon translation. Use of the term “self-cleaving” is not intended to imply a proteolytic cleavage reaction. Various self-cleaving or 2A linkers are known to those of skill in the art, including, without limitation, those found in members of the Picornaviridae virus family, e.g., foot-and-mouth disease virus (FMDV) , equine rhinitis A virus (ERAV0, Thosea asigna virus (TaV) , and porcine tescho virus-1 (PTV-1) ; and carioviruses such as Theilovirus and encephalomyocarditis viruses. 2A linkers derived from FMDV, ERAV, PTV-1, and TaV are referred to herein as “F2A, ” “E2A, ” “P2A, ” and “T2A, ” respectively. Those of skill in the art would be able to select the appropriate self-cleaving peptide. The dual-CAR system may comprise a DLL3 CAR and a CD19 CAR, linked by a self-cleaving peptide. The dual-CAR system may comprise a GPRC5D CAR and a CD19 CAR, linked by a self-cleaving peptide.

[0259] The hinge domain, transmembrane domain, and / or intracellular signaling domain (e.g., costimulatory signaling domain and / or primary intracellular signaling domain) of the CARs may be derived from a first generation, a second generation, a third generation, or a fourth generation CAR structure. Details of the structural features of CARs can be found, e.g., in Jackson, Hollie J., et al., Nature Reviews Clinical Oncology 13.6 (2016) : 370; and Subklewe, Marion, et al., Transfusion Medicine and Hemotherapy 46.1 (2019) : 15-24; each of which is incorporated herein by reference.

[0260] Tumor suppression by the engineered cells may be evaluated using an in vivo tumor suppression assay. The engineered cells prepared according to the method described herein may effectively suppress tumor growth. Methods of treatment

[0261] The methods for making engineered cells described herein, and the resulting engineered cells described herein can be used in a variety of experimental, therapeutic and commercial applications.

[0262] In one aspect, the disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the engineered cells made by the methods described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0263] In one aspect, the disclosure provides a method of treating a disease or disorder in a subject (e.g., human subject) , the method comprising administering to the subject, an effective amount of the engineered cell described herein, or the pharmaceutical composition described herein. The disease or disorder may be cancer, an autoimmune disease, a tumor, or an infection.

[0264] The disease or disorder may be solid tumor. “Solid tumor” refers to an abnormal mass of tissue that usually does not contain cysts or liquid areas. Solid tumors may be benign (not cancer) , or malignant (cancer) . Different types of solid tumors are named for the type of cells that form them. Examples of solid tumors are sarcomas, carcinomas, and lymphomas. Leukemias (cancers of the blood) generally do not form solid tumors.

[0265] In one aspect, the disclosure provides a method of modulating an immune response comprising administering an effective amount of engineered cells described herein to a subject in need thereof.

[0266] The term “effective amount” as used herein means an amount effective, at dosages and for periods of time necessary to achieve the desired results.

[0267] In another aspect, the present disclosure provides a method for treating a disease or disorder by administering an effective amount of engineered cells described herein to a subject in need thereof. The disease or disorder may be infectious disease, autoimmune disease, or tumor. The cancer may be hematological cancer or solid tumor. Examples of cancer that can be treated include, but are not limited to, acute myeloid leukemia (AML) , B-cell acute lymphoid leukemia (BALL) , T-cell acute lymphoid leukemia (TALL) , acute lymphoid leukemia (ALL) , chronic myelogenous leukemia (CML) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , multiple myeloma (MM) , plasmacytoma, myelodysplastic syndrome (MDS) , myeloproliferative neoplasms (MPNs) , chronic myeloid leukemia (CML) , and blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN) , breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, melanoma, oral cancer, mesothelioma, ovarian cancer, colorectal cancer, gastric cancer, cervical cancer, brain cancer, skin cancer, lymphoma, epithelial neoplasms, soft tissue sarcoma, esophageal cancers, or CNS tumors.

[0268] Beyond affecting a patient's bone marrow to form multiple myeloma (MM) , myeloma can also form solid tumors call plasmacytomas. GPRC5D is a target of plasmacytoma.

[0269] The disclosure further includes the use of the engineered cells described herein in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition to modulate an immune response, to treat an infection or to treat cancer as described hereinabove.

[0270] The engineered cells can also be used in experimental models, for example, to further study and elucidate the function of the cells.

[0271] One or more of the engineered cells described herein can be administered to a subject in a single, unified form, such as an intravenous injection, or in multiple forms, for example, as multiple intravenous infusions or injections, or subcutaneous injections. The engineered cells may expand within a subject's body, in vivo, after administration to a subject. The engineered cells can be frozen to provide cells for multiple treatments with the same cell preparation. The engineered cells of the disclosure, and pharmaceutical compositions comprising the same, can be packaged as a kit. A kit can include instructions (e.g., written instructions) on the use of the engineered cells and compositions comprising the same.

[0272] A method of treatment can comprise administering to a subject a therapeutically effective amount of the engineered cells. The therapeutically effective amount of the engineered cells may be administered for at least 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, or 1 year. The therapeutically effective amount of the engineered cells may be administered for at least one week. The therapeutically effective amount of the engineered cells may be administered for at least two weeks.

[0273] The engineered cells described herein can be administered before, during, or after the occurrence of a disease or condition, and the timing of administering the engineered cells can vary. For example, the engineered cells can be used as a prophylactic and can be administered continuously to subjects with a propensity to conditions or diseases in order to lessen a likelihood of the occurrence of the disease or condition. The engineered cells can be administered to a subject during or as soon as possible after the onset of the symptoms. The administration of the engineered cells can be initiated immediately within the onset of symptoms, within the first 3 hours of the onset of the symptoms, within the first 6 hours of the onset of the symptoms, within the first 24 hours of the onset of the symptoms, within 48 hours of the onset of the symptoms, or within any period of time from the onset of symptoms. The initial administration can be via any route practical (e.g., intravenous infusions or injections) , such as by any route described herein using any formulation described herein. The administration of the engineered cells of the disclosure may be an intravenous administration. One or multiple dosages of the engineered cells can be administered as soon as is practicable after the onset of a cancer or an infectious disease, and for a length of time necessary for the treatment of the disease, such as, for example, from about 24 hours to about 48 hours, from about 48 hours to about 1 week, from about 1 week to about 2 weeks, from about 2 weeks to about 1 month, from about 1 month to about 3 months. For the treatment of cancer, one or multiple dosages of the engineered cells can be administered years after onset of the cancer and before or after other treatments. The engineered cells can be administered for at least about 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, at least 48 hours, at least 72 hours, at least 96 hours, at least 1 week, at least 2 weeks, at least 3 weeks, at least 4 weeks, at least 1 month, at least 2 months, at least 3 months, at least 4 months, at least 5 months, at least 6 months, at least 7 months, at least 8 months, at least 9 months, at least 10 months, at least 11 months, at least 12 months, at least 1 year, at least 2 years at least 3 years, at least 4 years, or at least 5 years. The length of treatment can vary for each subject.

[0274] Methods for administration of engineered cells for adoptive cell therapy are known and can be used in connection with the provided methods and compositions. For example, adoptive T cell therapy methods are described, e.g., in US Patent Application Publication No. 2003 / 0170238 to Gruenberg et al; US Patent No. 4, 690, 915 to Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10) : 577-85) . See, e.g., Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10) : 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1) : 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4) : e61338. The cell therapy, e.g., adoptive T cell therapy can be carried out by autologous transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from the subject who is to receive the cell therapy, or from a sample derived from such a subject. Thus, the cells may be derived from a subject, e.g., patient, in need of a treatment and the cells, following isolation and processing, are administered to the same subject.

[0275] The cell therapy (e.g., adoptive T cell therapy) can be carried out by allogeneic transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from a subject other than a subject who is to receive or who ultimately receives the cell therapy, e.g., a first subject. The cells then may be administered to a different subject, e.g., a second subject, of the same species. The first and second subjects may be genetically identical. The first and second subjects may be genetically similar. The second subject may express the same HLA class or supertype as the first subject.

[0276] The subject (e.g., human subject) may have been treated with a therapeutic agent targeting the disease or condition, e.g., the tumor, prior to administration of the cells or composition containing the cells. The subject may be refractory or non-responsive to the other therapeutic agent. The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogenic HSCT. The administration may effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0277] The subject may be responsive to the other therapeutic agent, and treatment with the therapeutic agent reduces disease burden. The subject may be initially responsive to the therapeutic agent, but exhibits a relapse of the disease or condition over time. The subject may have not relapsed. The subject may be determined to be at risk for relapse, such as at a high risk of relapse, and thus the cells are administered prophylactically, e.g., to reduce the likelihood of or prevent relapse. The subject may has not received prior treatment with another therapeutic agent.

[0278] The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogenic HSCT. The administration may effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0279] The engineered cells described herein can be administered to an animal, such as a mammal, even more a human, to treat a cancer. In addition, the engineered cells can be used for the treatment of any condition related to a cancer, especially a cell-mediated immune response against a tumor cell (s) , where it is desirable to treat or alleviate the disease.

[0280] The engineered cells (e.g., immune cells, T cells, or NK cells) described herein can be included in a composition for immunotherapy. The composition can include a pharmaceutical composition and further include a pharmaceutically acceptable carrier. A therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition comprising the engineered cells can be administered.

[0281] The engineered cells can be immediately used in the above therapeutic, experimental or commercial applications or the cells can be cryopreserved for use at a later date. The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration.

[0282] The engineered cells disclosed herein can be formulated in unit dosage forms suitable for single administration of precise dosages. The unit dosage forms may comprise additional lymphocytes. In unit dosage form, the formulation is divided into unit doses containing appropriate quantities of one or more compounds. The unit dosage can be in the form of a package containing discrete quantities of the formulation. Non-limiting examples are packaged tablets or capsules, and powders in vials or ampoules. Aqueous suspension compositions can be packaged in single-dose non-reclosable containers. Multiple-dose reclosable containers can be used, for example, in combination with a preservative or without a preservative. The pharmaceutical composition may not comprise a preservative. Formulations for parenteral injection can be presented in unit dosage form, for example, in ampoules, or in multi-dose containers with a preservative. EXAMPLES

[0283] The disclosure is further described in the following examples, which do not limit the scope of the disclosure described in the claims. Example 1. Making CAR-T cells using the ST-CART process

[0284] A single blood collection from a healthy donor was used as the starting material. GenScript’s magnetic beads were used to sort (CytoSinctTM) and activate (EnceedTM) T cells.

[0285] For the ST-CART process, the cells were activated in the activation medium in a PL-70 bag for 18-23 hours. The cells were centrifuged in a centrifuge tube, the supernatant was discarded, and the cells were then resuspended with complete medium and optionally washed. Lentivirus was used to perform transduction (MOI = 1) , using a vector encoding a humanized CAR (described as “T3” in WO2021008610A1, which is incorporated herein by reference in its entirety) . The cells were harvested 1-6 hours after adding the lentivirus, and the total length of the process was 24-28 hours. When harvesting, CAR-T cells were washed and formulated for later administration. And CAR-T cells were administered to a subject in need thereof without in vitro expansion.

[0286] As a control, another batch of cells was made using the conventional process (C-CAR) . Specifically, the cells were activated in the activation medium for 48 hours. Lentivirus was used to infect (MOI = 1) the cells. Additional cell culture medium was added 24 hours after adding the virus. The cell culture medium was supplemented with IL-2 4 days after adding the virus. The cells were harvested 7 days after adding the virus.

[0287] The cytotoxicity (killing efficiency) of CAR-T cells was evaluated in a cell killing assay, where the CAR-T cells were co-cultured with tumor cells for 24 hours. SHP-77-Luc was used as the target cell. CAR-T cells were incubated with SHP-77-Luc at effector to target ratios of 2: 1, 1: 1, and 0.5: 1. After co-culture for 24 hours, the in vitro cytotoxicity of the CAR-T cells was determined using an LDH (lactate dehydrogenase) based cytotoxicity assay.

[0288] For C-CAR, CAR positive rate (CAR+%) was determined using flow cytometry. 1 million cells were washed with DPBS  resuspended in 100 μl DPBS consisting of 1 μl Human TruStain FcX and then fixed for 10 min. The cells were then incubated with FITC-labeled Human DLL3 His Tag Protein (ACRO) (1 μl protein in 100 μl DPBS) for 15 min at 4℃. Positively stained cells were differentiated from the background using C-UnT as a control.

[0289] For ST-CART, CAR positive rate (CAR+%) was determined using flow cytometry. Frozen cells were seeding into G-Rex 24 well plates after thawing, and flow cytometry was performed on day 3, day 5, and day 7 during culture process. CAR+%at the plateau stage was reported.

[0290] The phenotype percentages of the engineered cells may be evaluated by a flow cytometry analysis. The cell surface markers that were evaluated included CD8, CD4, CD45RO, and CCR7.

[0291] The anti-tumor activity of CAR-T cells was evaluated in a H82 tumor model. H82 cells were implanted subcutaneously in NOD / SCID mice. Treatment began when tumors were palpable (240 mm3) and mice were euthanized when their tumor volumes reached about 2000 mm3. Tumor volumes were measured 2 times per week. CAR-T cells were administered intravenously with CAR positive T cells. Mice and tumors were monitored for about 23 days after tumor cell implantation. The pharmacokinetics (PK) of the CAR-T cells were evaluated by collecting the peripheral blood cells and determining the percentage of CAR-T cells.

[0292] The results are shown in FIGS. 1A-1F. FIG. 1A shows that ST-CART and C-CAR processes have comparable short-term killing efficiencies in vitro. FIG. 1B shows that ST-CART and C-CAR processes have comparable CAR+%at the same MOI. FIG. 1C shows that the ST-CART preparation has a higher proportion of CD4+ T cells comparing to the C-CAR preparation. FIG. 1D shows that ST-CART preparation and sorted unactivated T cells ( “Post-T” ) have similar Tn+Tscm proportion, which is much higher than that of the C-CAR preparation. FIG. 1E shows that ST-CART preparation had a higher in vivo efficacy comparing to the C-CAR preparation (at the same 1 million dose in the vivo experiments) . FIG. 1F shows that PK and efficacy are positively correlated: ST-CART > C-CAR at same dose. Example 2. Evaluating the impact of bead removal during the process on CAR expression levels in CAR-T cells

[0293] Tissue samples from two healthy donors were used as the starting material. Cells were isolated and CD3 / CD28 beads were used to activate T cells.

[0294] The isolated cells from a cryopreserved / fresh leukapheresis product, or an alternative source of hematopoietic tissue such as a cryopreserved / fresh whole blood product, a cryopreserved / fresh bone marrow product, or a cryopreserved / fresh tumor or organ biopsy or removal, were activated with CD3 / CD28 beads in the culture medium (TexMacs with 300 IU / ml IL-2) , in a PL-30 bag for 18-23 hours.

[0295] For Group 0, the cells were centrifuged in a 50 ml centrifuge tube. Supernatant was discarded, the cells were resuspended with complete medium and seeded at 10E6 cells / ml in a G-rex 6M multi-well cell culture plate. Lentivirus was used to perform transduction, using a vector encoding a humanized GPRC5D CAR (5D361M, described in PCT / CN2024 / 107582, which is incorporated herein by reference in its entirety) .

[0296] For Group 1, the cells were centrifuged in a 50 ml centrifuge tube. Supernatant was discarded, and the cells were resuspended with complete medium, and the beads were removed one time (e.g., by washing, magnetic field method, centrifuging, or centrifuging and washing) . Then, the cells were resuspended with complete medium and seeded at 10E6 cells / ml in a G-rex 6M multi-well cell culture plate for lentivirus transduction as described above regarding the Group 0.

[0297] For Group 2, the cells were centrifuged in a 50 ml centrifuge tube. Supernatant was discarded, and cells were resuspended with complete medium, and the beads were removed two times (method same as Group 1 and repeated once) . Then, the cells were resuspended with complete medium, and seeded at 10E6 cells / ml with complete medium in a G-rex 6M multi-well cell culture plate for lentivirus transduction as described above regarding the Group 0.

[0298] All the centrifugation condition was set as 400×g for 10min. For transduction, lentivirus (at calculated volume) was added to the culture medium to reach MOI=2 in each group except the control untransduced group. The cells were harvested 1-6 hours after adding the lentivirus. When harvesting, 50 mL centrifuge tubes were used for washing and centrifugation with TexMacs medium for four times at 400×g for 10min. Then, the cells were resuspended with formulation buffer, transfered to tubes, and freezed at -80℃ for storage or next test steps. The CAR-T cells are administered to a subject in need thereof without in vitro expansion.

[0299] For all groups (Group 0, Group 1, Group 2) , CAR positive rates (CAR+%) were determined using flow cytometry. Frozen cells were seeded into G-Rex 24 well plates after thawing, and flow cytometry was performed on day 3, day 5, day 7, day 9, and day 12 during the culture process.

[0300] The CAR+%results are shown in FIG 2A-B. FIG 2A-B shows that CAR+%of anti-GPRC5D CAR in all groups. Example 3. Generation and manufacture of CAR-T cells comprising a dual-CAR

[0301] We conducted a vector encoding simultaneously the CD19 and GPRC5D to provide both dual specificity and dual 4-1BB costimulation using two independent CAR molecules. Then the CAR-T cells are generated with short-term production process (ST-CAR) and a conventional process (C-CAR) using the third generation of lentivirus packaging system.

[0302] A single blood collection from a healthy donor is used as the starting material. Magnetic beads (GenScript, CytoSinctTM CD4 Nanobead, Catalog number: L00932-7.5, CytoSinctTM CD8 Nanobeads, Catalog number: L00933-7.5) were used to sort and activate T cells by using T cell activation reagent (GenScript, EnceedTM, Catalog number: L00935) .

[0303] For the short-term production process, the cells were activated in the medium in a PL-70 bag for 18-23 hours. Lentivirus was used to perform transduction (MOI = 4) . The cells were harvested 1-6 hours after adding the lentivirus, and the total length of the process was 24-28 hours. When harvesting, CAR-T cells were washed and formulated for later administration. And CAR-T cells are administered to a subject in need thereof without in vitro expansion.

[0304] For the conventional process, the cells were activated in the medium with CD3 / CD28 activation beads in a PL-70 bag for 48 hours. The cells were transduced with lentivirus at a MOI=4. 24 hours after adding the lentivirus, the cells were washed and the medium was replaced with fresh medium. The cells were cultured for another 7 days (in vitro expansion) . When harvesting, CAR-T cells were washed and formulated for later administration.

[0305] The dual CAR comprises a first CAR targeting GPRC5D ( “GPRC5D CAR” ) and a second CAR targeting CD19 ( “CD19 CAR” ) fused by a cleavable peptide linker. Each of the GPRC5D CAR and the CD19 CAR has a complete CAR structure, containing a CD8 signal peptide, an antigen binding domain, a hinge domain, a CD8 transmembrane domain and a 4-1BB co-stimulation and a CD3 zeta domain. The CD19 CAR contains a scFv of FMC63. Nalm-6 cells have a high CD19 expression level.

[0306] After transduction, the CAR-T cells expressed both CD19 CAR and GPRC5D CAR ( “dual CAR” ) simultaneously. Days after infusion of the prepared cells into a GPRC5D-positive MM. 1S multiple myeloma, CAR-T cells expressing a single GPRC5D CAR may have a poor in vivo proliferation due to the lack of GPRC5D antigen stimulation in peripheral blood. The CD19 CAR and GPRC5D CAR co-expressed cells will be stimulated by CD19 antigen in peripheral blood and proliferate in MM. 1S+Nalm6 mixed model in vivo. Example 4. Ex vivo CAR-T cells test

[0307] 1.0×106 cells from each group (including C-CAR, C-UnT, ST-CAR, and ST-UnT) were collected and the CAR expression level of GPRC5D × CD19 dual CAR-T was measured by flowcytometry (CytoFLEX S) , staining with MonoRabTM Rabbit Anti-Camelid VHH Antibody [iFluor488] (GenScript, Catalog number: A01862-200) . The CAR expression levels of GPRC5D ×CD19 dual CAR-T made by the short-term production process was measured by the same antibody 5-7 days after thawing of cryopreserved cells to allow the CAR expression level to reach a plateau. The results are shown in Table 1. Table 1. CAR expression level

[0308] Similarly, cells from different groups (including C-CAR, C-UnT, ST-CAR, and ST-UnT) were analyzed with flowcytometry to determine cell expansion fold (FIG. 3A) , cell phenotype percentages (e.g., Teff, Tem, Tcm, and Tn+Tscm) (FIG. 3B) , CD4 and CD8 percentages (FIG. 3C) , and CAR expression levels (FIG. 3D) . BV421 anti-human CCR7 antibody from Biolegend, PE anti-human CD45 RO antibody from Biolegend, AF700 anti-human CD8 antibody and APC / Cy7 anti-human CD4 antibody from Biolegend were used for the flow cytometry analysis.

[0309] FIG. 3A shows that the cell proliferation fold data at harvest time before formulation. As shown in FIG. 3A, the comparing to ST-CAR, C-CAR cells were expanded many folds before formulation. FIG. 3B shows the cell phenotype percentages (e.g., Teff, Tem, Tcm, and Tn+Tscm) of the ST-CAR and C-CAR cells at harvest time before formulation. As shown in FIG. 3B, similar to T cells isolated from PBMC cells ( “Post-T cells” ) , both ST-CAR cells and ST-UnT cells contained a high proportion of Tnaive and Tscm cells. FIG. 3C shows the cell phenotype percentages (e.g., CD4+and CD8+) of the ST-CAR and C-CAR cells at harvest time before formulation. As shown in FIG. 3C, both ST-CAR and ST-UnT group had a CD4 / CD8 ratio that is similar to Post-T cells. FIG. 3D shows that the GRPRC5D CAR and CD19 CAR expression levels in thawed ST-CAR. As shown in FIG. 3D, the expression of both GRPRC5D CAR and CD19 CAR increased from Day 3 to Day 11 after thawing. CAR expression of GPRC5D CAR at Day 7 was utilized as dose setting in animal study. Example 5. In vivo test

[0310] The anti-tumor activity of GPRC5D × CD19 dual CAR-T cells was evaluated in both a MM. 1S tumor model and a MM. 1S plus Nalm6 mixed tumor model. For the MM. 1S tumor model, in 7-8 week old NOD / ShiLtJGpt-Prkdc em26I l2rg em26  / Gpt (NCG) mice, 5×106 MM. 1S cells were implanted subcutaneously in the right flank. For the mixed tumor model, either 3×105 or 1×105 Nalm6-Luc cells were implanted intravenously 5 days post MM. 1S implantation. Tumor-bearing mice were randomized into control and treatment groups when the MM. 1S tumor volume reached approximately 120 mm3.

[0311] The cell preparations from Example 1 are injected into the different NCG animal models to evaluate their in vivo proliferation and tumor-suppression activities. The tumor-bearing mice (either MM. 1S tumor model mice with no Nalm6-Luc cells or mixed tumor model mice with Nalm6-Luc cells) were treated with the below treatment via i.v. injection. Table 2. Treatment scheme

[0312] The mice were euthanized when their tumor volumes exceeded 2000 mm3. MM. 1S tumor volumes were measured twice a week, while the growth of Nalm6 tumors was assessed using bioluminescent imaging once a week post-treatment. Mice and tumors were monitored for approximately 35 days following tumor cell implantation (23 days after treatment) . The pharmacokinetics (PK) of the CAR-T cells were evaluated by collecting peripheral blood cells and determining the percentage of CAR-T cells.

[0313] FIGS. 4A-4C show the in vivo testing results. FIG. 4A shows the in vivo bioluminescence testing results on the Nalm6 tumor growth in mixed animal model mice. Blank means those animals have no CAR-T, no HBSS treatment, no tumor burden but were injected with substrate to show the basal luminescence signal in animal. FIG. 4B shows the quantified signal intensity (signal flux) for the bioluminescence imaging data in FIG. 4A. As shown in FIG. 4B, groups 7 (C-CAR) and 9 (C-CAR) showed the best tumor suppression effects early on (Day 5 to Day 15) . However, groups 8 (ST-CAR) and 10 (ST-CAR) showed increasing tumor suppression and eventually caught up with the C-CAR groups at day 20. By contrast, groups 4 (HBSS) , 5 (C-UnT) , and 6 (ST-UnT) showed little or no tumor suppression. FIG. 4C shows the subcutaneous MM. 1S tumor volume data. As shown in FIG. 2C, groups 8 (ST-CAR) and 10 (ST-CAR) showed comparable or better tumor suppression compared with groups 7 (C-CAR) and 9 (C-CAR) after Day 15.

[0314] FIGS. 5A-5B show the proliferation of C-CAR and ST-CAR cells in animal models by flow cytometry evaluation of (1) the percentages of human CD3+ cells in live peripheral blood cells (FIG. 5A) and (2) the percentages of human CD3+, GPRC5D CAR and CD19 CAR triple positive cells in live peripheral blood cells (FIG. 5B) . As shown in FIGS. 5A-5B, groups 8 (ST-CAR) and 10 (ST-CAR) showed the highest proliferation of introduced CAR-T cells. By comparison, groups 2 (C-CAR) , 7 (C-CAR) and 9 (C-CAR) showed much less proliferation of introduced CAR-T cells. The proliferation of ST-CAR cells was not detected in the MM. 1S only model (groups 1-3) but was significantly higher than that of C-CAR cells at the aforementioned dosages in the mixed model (groups 4-10) . OTHER EMBODIMENTS

[0315] It is to be understood that while the disclosure has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the disclosure, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.A method for making a population of engineered cells, the method comprising:(I) activating a population of cells from a sample;(II) optionally removing activator used in step (I) ;(III) introducing one or more vectors encoding an engineered receptor into the population of cells; and(IV) harvesting the population of cells from step (III) ,wherein the total length of steps (I) , (II) and (III) is less than or equal to 28 hours, preferably, the total length is less than or equal to 24, 25, 26, 27 or 28 hours.2.A method for making a population of engineered cells, comprising:(a) activating a population of cells from a sample by an activator;(b) removing the activator;(c) introducing a vector encoding an engineered receptor into the population of cells; and(d) harvesting the population of cells from step (c) ,wherein the total length of steps (a) , (b) and (c) is less than or equal to 28 hours, preferably, the total length is less than or equal to 24, 25, 26, 27 or 28 hours.3.The method of claim 2, wherein the length of step (a) is 12-23 hours, preferably, the length of step (a) is 16, 18, 20, or 22 hours.4.The method of claim 2 or claim 3, wherein the length of step (c) is 1-10 hours, preferably, the length of step (a) is 2, 4, 6, or 8 hours.5.The method of any one of claims 2-4, wherein the population of cells of step (a) is isolated from a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) sample.6.The method of any one of claims 2-5, wherein the step (b) and / or (c) further comprising centrifugation and / or washing.7.The method of any one of claims 2-6, wherein the activator comprises CD3 / CD28 beads.8.The method of any one of claims 2-6, wherein the activator consists of CD3 / CD28 beads.9.The method of any one of claims 2-8, wherein step (c) is performed in the absence of the activator.10.The method of any one of claims 2-9, wherein steps (a) and / or (c) are performed in a serum-free cell medium.11.The method of claim 10, wherein the serum-free cell medium comprises human platelet lysate (HPL) .12.The method of any one of claims 10-11, wherein the medium comprises at least one cytokine selected from the group consisting of IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, and IL-21.13.The method of any one of claims 2-12, wherein the population of cells from step (d) is administered to a patient without expansion after step (d) .14.The method of any one of claims 2-12, wherein the population of cells from step (d) is frozen and stored for further use after step (d) .15.The method of any one of claims 2-12, wherein the population of cells from step (d) is further expanded after step (d) .16.The method of claim 15, wherein the population of cells from step (d) is further expanded after step (d) for less than 5 days.17.The method of any one of claims 2-16, wherein the population of cells from step (d) comprises more than 10%, 20%, 30%, 40%or 50%T stem cell memory cells (Tscm) and   T cells (Tn) .18.The method of any one of claims 2-17, wherein the percentage of Tn in the population of cells from step (d) differs by no more than 10%from the percentage of Tn in the population of cells at the beginning of step (a) .19.The method of any one of claims 2-18, wherein the percentage of Tscm in the population of cells from step (d) differs by no more than 10%from the percentage of Tscm in the population of cells at the beginning of step (a) .20.The method of any one of claims 2-19, wherein the population of cells from step (d) , after being administered in vivo, persists longer or expands at a higher level, compared with cells made by a conventional CAR-T production process.21.The method of any one of claims 2-20, wherein the population of cells from step (d) , after being administered in vivo, shows a stronger anti-tumor activity than cells made by a conventional CAR-T production process.22.The method of any one of claims 2-21, wherein the population of cells from step (d) is expanded by no more than 10%, compared to the population of cells at the beginning of step (a) .23.The method of any one of claims 2-22, wherein the engineered receptor comprises an extracellular antigen binding domain or ligand binding domain, and optionally an intracellular signaling domain.24.The method of any one of claims 2-23, wherein the engineered receptor is selected from the group consisting of an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , a T cell antigen coupler (TAC) or a portion thereof.25.The method of any one of claims 2-24, wherein the population of cells from a donor comprises immune cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , hematopoietic stem cells, pluripotent stem cells, or embryonic stem cells.26.The method of claim 25, wherein the immune cells are selected from a group consisting of T cells, NK cells, NK-T cells, dendritic cells, and a combination thereof.27.The method of claim 26, wherein the immune cells are T cells.28.A method of manufacturing of a population of engineered immune cells, the method comprising:(a) activating a population of cells from a sample, and then optionally removing activator used in this step;(b) introducing one or more vectors encoding a multi-specific chimeric antigen receptor (CAR) system into the cells; and(c) harvesting the cells from step (b) ,wherein the total length of steps (a) and (b) is less than or equal to 28 hours, preferably, the total length is less than or equal to 24, 25, 26, 27 or 28 hours,wherein the multi-specific CAR system comprises a first antigen binding domain specifically recognizing a solid tumor antigen and a second antigen binding domain specifically recognizing a blood cell antigen.29.The method of claim 28, wherein the length of step (a) is 12-23 hours, preferably, the length of step (a) is 16-20 hours.30.The method of claim 28 or claim 29, wherein the length of step (b) is 1-10 hours, preferably, the length of step (a) is 4-8 hours.31.The method of any one of claims 28-30, wherein the step (a) and step (b) at least partially overlap in time.32.The method of any one of claims 28-31, wherein the multi-specific CAR system is a bispecific CAR system.33.The method of claim 32, wherein the bispecific CAR system comprises:(1) the first antigen binding domain specifically recognizing the solid tumor antigen;(2) the second antigen binding domain specifically recognizing the blood cell antigen;(3) a transmembrane domain; and(4) an intracellular signaling domain comprising a co-stimulatory signaling domain.34.The method of claim 32, wherein the bispecific CAR system comprises:(1) a first CAR comprising:i) the first antigen binding domain specifically recognizing the solid tumor antigen;ii) a first transmembrane domain; andiii) a first intracellular signaling domain comprising a co-stimulatory signaling domain; and(2) a second CAR comprising:i) the second antigen binding domain specifically recognizing the blood cell antigen;ii) a second transmembrane domain.35.The method of claim 34, wherein the second CAR is expressed transiently.36.The method of claim 34 or claim 35, wherein the second CAR is expressed by a vector that is not integrated into the genome of the engineered cell.37.The method of any one of claims 34-36, wherein the second CAR is introduced into the engineered cell by a non-integrating lentiviral vector (e.g., a lentiviral vector with a mutant integrase) .38.The method of any one of claims 34-37, wherein the second CAR comprises a second intracellular signaling domain.39.The method of claim 38, wherein the second intracellular signaling domain comprises a co-stimulatory signaling domain and / or a CD3ζ primary intracellular signaling domain.40.The method of any one of claims 34-39, wherein the first intracellular signaling domain further comprises a CD3ζ primary intracellular signaling domain, and the second intracellular signaling domain does not comprise a CD3ζ primary intracellular signaling domain.41.The method of any one of claims 28-40, wherein the solid tumor antigen is selected from the group consisting of Claudin 18.2, DLL3, GUCY2C, tMUC1, PRLR, CLCA1, MUC12, GPR35, GPRC5D, CR1L, MUC17, TMPRSS11B, TMPRSS11E, CD207, SLC30A8, CFC1, SLC12A3, SSTR1, GPR27, FZD10, TSHR, SIGLEC15, SLC6A3, KISS1R, QRFPR, GPR119, CLDN6, UPK2, ADAM12, SLC45A3, ACPP, MUC21, MUC16, MS4A12, ALPP, CEA, EphA2, FAP, GPC3, IL13-Rα2, Mesothelin, PSMA, ROR1, VEGFR-II, GD2, FR-α, ErbB2, EpCAM, EGFRvIII, B7H3, CLL1, and EGFR.42.The method of any one of claims 28-41, wherein the blood cell antigen is a B cell antigen.43.The method of claim 42, wherein the B cell antigen is selected from the group consisting of CD19, CD20, CD22, CD33, CD34, CD37, CD38, CD45R, CD21, CD79a, CD79b, CD5, FcRH5, and BCMA.44.The method of any one of claims 28-41, wherein the blood cell antigen is a plasma cell antigen, and the plasma cell antigen is BCMA or GPRC5D.45.The method of any one of claims 28-44, wherein the step (a) is performed in an activation medium, and the activation medium comprises at least one cytokine selected from the group consisting of IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, and IL-21.46.The method of any one of claims 28-45, wherein the sample comprises peripheral blood mononuclear cells (PBMC) .47.The method of any one of claims 28-46, wherein the population of engineered immune cells comprises more than 10%, 20%, 30%, 40%or 50%T stem cell memory cells (Tscm) and   T cells (Tn) .48.The method of any one of claims 28-47, wherein the population of engineered immune cells, after being administered in vivo, persists longer or expands at a higher level, compared with cells made by an otherwise similar method in which the total length of steps (a) and (b) is more than 28 hours.49.The method of any one of claims 28-48, wherein the population engineered immune cells are expanded by no more than 10%, compared to the population of cells at the beginning of step (a) .50.The method of any one of claims 28-49, wherein the engineered immune cells proliferate faster upon exposure to a blood cell antigen (e.g., B cell antigen) , comparing to otherwise similar engineered immune cells that do not comprise the second antigen binding domain.51.The method of any one of claims 28-50, wherein the engineered immune cells comprise an immune cell selected from the group consisting of a T cell, a macrophage, a dendritic cell, a monocyte, an NK cell, or an NKT cell.52.The method of claim 51, wherein the engineered immune cells comprise a T cell.53.A population of engineered cells or engineered immune cells made by the methods of any one of claims 2-27, or 28-52.54.A pharmaceutical composition, comprising the population of engineered cells or engineered immune cells of claim 53, and a pharmaceutically acceptable carrier.55.A method of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering to the subject in need thereof a therapeutically effective amount of the population of engineered cells or engineered immune cells of claim 53, or the pharmaceutical composition of claim 54.56.The method of claim 55, wherein the disease or disorder is infectious disease, autoimmune disease, or tumor.57.The method of claim 56, wherein the tumor is hematological cancer or solid tumor.58.The method of claim 57, wherein the hematological cancer is acute myeloid leukemia (AML) , B-cell acute lymphoid leukemia (BALL) , T-cell acute lymphoid leukemia (TALL) , acute lymphoid leukemia (ALL) , chronic myelogenous leukemia (CML) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , multiple myeloma (MM) , myelodysplastic syndrome (MDS) , myeloproliferative neoplasms (MPNs) , chronic myeloid leukemia (CML) , and blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN) .59.The method of claim 57, wherein the solid tumor is plasmacytomas, breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, melanoma, oral cancer, mesothelioma, ovarian cancer, colorectal cancer, gastric cancer, cervical cancer, brain cancer, skin cancer, lymphoma, epithelial neoplasms, soft tissue sarcoma, esophageal cancers, or CNS tumors.

Images