KASP marker primer combinations for germplasm identification of new wheatgrass and their applications

Abstract

This invention discloses a KASP marker primer combination for the identification of new wheatgrass germplasm and its application. The KASP primer combination contains 48 pairs of KASP primers. This invention also provides the application of the KASP marker primer combination for the identification of new wheatgrass germplasm in constructing fingerprint maps of new wheatgrass germplasm resources. These 48 KASP markers can clearly distinguish all tested germplasm, achieving unique identification of each germplasm resource. By constructing a fingerprint map with "molecular identity card" function, the identification process for new wheatgrass germplasm is simplified, detection is faster, and costs are lower, and it helps improve the accuracy of variety breeding. This invention is applicable to variety authenticity identification, germplasm resource phylogenetic analysis, and breeding material identification.

Description

Technical Field

[0001] This invention belongs to the field of biotechnology, specifically relating to a KASP marker primer combination for the identification of new wheatgrass germplasm and its application. Background Technology

[0002] *Psathyrostachys juncea*, a perennial herbaceous plant belonging to the genus *Psathyrostachys* in the Poaceae family, possesses excellent stress resistance characteristics such as cold tolerance, tolerance to poor soil, and wide adaptability. It is a core high-quality forage germplasm resource for ecological restoration and high-quality development of grassland animal husbandry in arid and semi-arid regions of northern my country. This species is cross-pollinated, with a complex genetic background, weak foundation in genomics research, and relatively lagging systematic exploration at the molecular biology level. With the continuous upgrading of the needs for improving the quality and efficiency of grassland animal husbandry and ecological construction, achieving accurate identification of *Psathyrostachys juncea* germplasm resources and efficient evaluation of varietal purity and authenticity has become a key technical support for accelerating the breeding and promotion of superior varieties.

[0003] Currently, genetic diversity analysis and variety identification of wheatgrass mainly rely on traditional molecular marker technologies such as SSR (simple sequence repeat) and ISSR. These technologies require gel electrophoresis for detection, which has inherent drawbacks such as cumbersome procedures, low throughput, and insufficient automation, making it difficult to meet the practical needs of large-scale, rapid, and precise identification. Single nucleotide polymorphism (SNP) markers, due to their advantages of wide genomic distribution, abundant quantity, strong genetic stability, and ease of high-throughput automated genotyping, have become the core of next-generation molecular marker technologies. Competitive allele-specific PCR (KASP) technology, as a high-throughput SNP genotyping scheme based on fluorescence detection, combines high detection accuracy, cost-effectiveness, flexible application, and tolerance for DNA quality requirements. It has been successfully applied in various crops such as rice, maize, and wheat for variety DNA fingerprinting construction, authenticity identification, and molecular marker-assisted selection.

[0004] DNA fingerprinting, by screening for highly polymorphic and stable core molecular markers, can assign a unique "molecular ID card" to each variety, providing objective and reliable technical evidence for variety rights protection, purity monitoring, parental material management, and market rights protection. Although the KASP technology system is mature and has significant advantages, its application in the identification of new wheatgrass germplasm resources is still lacking. The core technical bottleneck lies in the absence of publicly reported KASP marker primer combinations specifically developed for the genomic characteristics of new wheatgrass. In practice, researchers are often forced to use non-specific markers from closely related species or universal primers, leading to a series of technical problems such as low typing success rates, insufficient polymorphic information, and poor universality among different genetic materials. This makes it difficult to efficiently and stably construct standard DNA fingerprint maps for new wheatgrass suitable for actual breeding and rights protection identification scenarios. This technological gap severely restricts the progress of accurate identification of new wheatgrass germplasm resources, scientific screening of core parental materials, and the establishment of molecular design breeding platforms.

[0005] Therefore, the targeted development of specific KASP marker primer combinations based on polymorphic SNP sites in wheatgrass and the establishment of a stable, efficient, and standardized DNA fingerprinting identification system for wheatgrass are of urgent practical need and important strategic significance for strengthening the protection and management of germplasm resources of this species, improving breeding efficiency, protecting the legitimate rights and interests of variety owners, and promoting the healthy and sustainable development of grassland animal husbandry. Summary of the Invention

[0006] The purpose of this invention is to overcome the shortcomings of the existing technology and provide a KASP marker primer combination for the identification of new wheatgrass germplasm and its application.

[0007] Primer name Forward primer-1 Forward primer-2 Universal primer Maker1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGAAGTAACGCTTTTCACCACG SEQ ID NO: 1 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGAAGTAACGCTTTTCACCAC SEQ ID NO: 2 CAAAGAGGTACTTGCACACGC SEQ ID NO: 3 Maker2 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGAAGTAACGCTTTTCACCAC SEQ ID NO: 4 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGAAGTAACGCTTTTCACCACG SEQ ID NO: 5 CAAAGAGGTACTTGCACACGC SEQ ID NO: 6 Maker3 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGTCTTCCGACTCTTCTTCCTCGT SEQ ID NO: 7 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGTCTTCCGACTCTTCTTCCTCGC SEQ ID NO: 8 ACCACAGTAGAAGCCATTAAGC SEQ ID NO: 9 Maker4 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTCCCTCCATCACTGATAACTATCCTTG SEQ ID NO: 10 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTCCCTCCATCACTGATAACTATCCTT SEQ ID NO: 11 CTTGCCATCATCAAAGGGGTATAAATAC SEQ ID NO: 12 Maker5 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTGGAGGACACTGACAAGAGGTTC SEQ ID NO: 13 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATTGGAGGACACTGACAAGAGGTTCG SEQ ID NO: 14 GCTGAAGAGAGTGATCAAGGACAG SEQ ID NO: 15 Maker6 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTGGAGGACACTGACAAGAGGTTCG SEQ ID NO: 16 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATTGGAGGACACTGACAAGAGGTTC SEQ ID NO: 17 GAGCTGAAGAGAGTGATCAAGGAC SEQ ID NO: 18 Maker7 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAACGTTTGCTTAGGAAATTTTAGCCCCGSEQ ID NO :19 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAACGTTTGCTTAGGAAATTTTAGCCCCASEQ ID NO :20 CCAGCAGAAGGAACATATGCAAAATTATSEQ ID NO :21 Maker8 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAACGTTTGCTTAGGAAATTTTAGCCCCASEQ ID NO :22 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAACGTTTGCTTAGGAAATTTTAGCCCCGSEQ ID NO :23 CCAGCAGAAGGAACATATGCAAAATTATSEQ ID NO :24 Maker9 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTCAACTTCAATGATCTTCGATCCTACCAGSEQ ID NO :25 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTCAACTTCAATGATCTTCGATCCTACCAASEQ ID NO :26 CTCTATGGCATCCATTCAACTACTGGSEQ ID NO :27 Maker10 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGCCTGGCAGTAGATATTCAACAACTGSEQ ID NO :28 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGCCTGGCAGTAGATATTCAACAACTASEQ ID NO :29 GAGTGTAAGTGGTGCAAATGAAGTTAASEQ ID NO :30 Maker11 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTATCAGGATTCGGAGATTTGTTAACACGGSEQ ID NO :31 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTATCAGGATTCGGAGATTTGTTAACACGASEQ ID NO :32 CAGTATGGTAGCTTCATTTGACTGACTAASEQ ID NO :33 Maker12 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGATGAGCCGTACCAGCAGAGSEQ ID NO :34 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGATGAGCCGTACCAGCAGATSEQ ID NO :35 GAAGTGCAAGCGATGTGGTTTSEQ ID NO :36 Maker13 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAACTGACCAAGGCGAGTCCAASEQ ID NO :37 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAACTGACCAAGGCGAGTCCAGSEQ ID NO :38 GGATTTGTCCTTGCAATCTTCTCASEQ ID NO :39 Maker14 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTTTGACGGGCTTGTCCTTGTTAAATASEQ ID NO :40 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTTGACGGGCTTGTCCTTGTTAAATGSEQ ID NO :41 AGCTCTAATCTGATTCAGAATCACGASEQ ID NO :42 Maker15 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGCTTGACCTGTACGTTTTTGCASEQ ID NO :43 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGCTTGACCTGTACGTTTTTGCGSEQ ID NO :44 ATCTACAGGTTCAGTATGGCTGCSEQ ID NO :45 Maker16 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTTCAGAGTCGGTTAAAAAGGAAAACACTSEQ ID NO :46 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTTCAGAGTCGGTTAAAAAGGAAAACACASEQ ID NO :47 GAACTTGTGTGAATCCAAACTGGCASEQ ID NO :48 Maker17 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGATGCATTGGCTGACAGTGGASEQ ID NO :49 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGATGCATTGGCTGACAGTGGTSEQ ID NO :50 TTGTTCTGCGAGTTCTTCCTGSEQ ID NO :51 Maker18 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGTCTTTGGATTCAGTGATGGAAGAACTCSEQ ID NO :52 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGTCTTTGGATTCAGTGATGGAAGAACTASEQ ID NO :53 TCAGATTCTTTGTCTTTAAGCAAAGTGCSEQ ID NO :54 Maker19 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATAGGACATTAACTTGCCTTTCCGACATCSEQ ID NO :55 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATAGGACATTAACTTGCCTTTCCGACATTSEQ ID NO :56 GTGGAACTGCATTGAAGATAGATTTGSEQ ID NO :57 Maker20 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCACCTGACCCAATGTTGATCCCSEQ ID NO :58 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCACCTGACCCAATGTTGATCCTSEQ ID NO :59 GTGGCAGAATTTCCTTTGGAACASEQ ID NO :60 Maker21 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGAATTTATGGATGGAAGCCCTAAAGACAGSEQ ID NO :61 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGAATTTATGGATGGAAGCCCTAAAGACAASEQ ID NO :62 CTAGGAACCTTGTTAAGAATATGTGTCGSEQ ID NO :63 Maker22 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTCACCTCCTCTCTAATATTTTGTGGACAGSEQ ID NO :64 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTCACCTCCTCTCTAATATTTTGTGGACAASEQ ID NO :65 TTTTTAAAGCGAGCAGGGAAGGSEQ ID NO :66 Maker23 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGAATTACCCAAAACAATCAGAGACSEQ ID NO :67 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGAATTACCCAAAACAATCAGAGAASEQ ID NO :68 GAGTTCTCGATTGATGGTCCCAAATSEQ ID NO :69 Maker24 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACACTGGGCAGAAGATCAATTAACTCASEQ ID NO :70 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACACTGGGCAGAAGATCAATTAACTCGSEQ ID NO :71 TACACAAAAGAAGAGGGAGTGGCSEQ ID NO :72 Maker25 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGGCACCCGGATAAGATTGCGSEQ ID NO :73 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGGCACCCGGATAAGATTGCTSEQ ID NO :74 GAACCTTCCCTTGGCTTCCTCSEQ ID NO :75 Maker26 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGGCACCCGGATAAGATTGCTSEQ ID NO :76 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGGCACCCGGATAAGATTGCGSEQ ID NO :77 GAACCTTCCCTTGGCTTCCTCSEQ ID NO :78 Maker27 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCTTGAGGAACAGCTGCAACCSEQ ID NO :79 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCTTGAGGAACAGCTGCAACGSEQ ID NO :80 CCTTCCGAGCTTGAGGAACAGSEQ ID NO :81 Maker28 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTCCTGTTGGAGACGCTGAGGTSEQ ID NO :82 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTCCTGTTGGAGACGCTGAGGCSEQ ID NO :83 CCTCATCGGGTTGAACTCGTCSEQ ID NO :84 Maker29 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAGCTGAAACTTGTCTTGTCTCGCAGSEQ ID NO :85 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAGCTGAAACTTGTCTTGTCTCGCAASEQ ID NO :86 CCAATGTCCCCAAACTTGTTTTTCTSEQ ID NO :87 Maker30 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATGAGTGATAGAATTGGCCTTGGCGSEQ ID NO :88 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATGAGTGATAGAATTGGCCTTGGCASEQ ID NO :89 ATCAATCCTTGAAGGTAGAGACATSEQ ID NO :90 Maker31 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAACACGAAGCTCCCTTTGGCTSEQ ID NO :91 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAACACGAAGCTCCCTTTGGCASEQ ID NO :92 ACCTCCTTATCTTCTTTTGCCCSEQ ID NO :93 Maker32 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAACACGAAGCTCCCTTTGGCASEQ ID NO :94 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAACACGAAGCTCCCTTTGGCTSEQ ID NO :95 ACCTCCTTATCTTCTTTTGCCCTSEQ ID NO :96 Maker33 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAAATCCAGTCAGCTCCCAGGATTSEQ ID NO :97 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAATCCAGTCAGCTCCCAGGATASEQ ID NO :98 TGTCAAAACTTGCCAAATCCAGTSEQ ID NO :99 Maker34 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAACTCCTTGCTCTTTGCTGCTCTSEQ ID NO :100 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAACTCCTTGCTCTTTGCTGCTCCSEQ ID NO :101 AATGAGTGCTACCTTGGTCTTCCSEQ ID NO :102 Maker35 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCATACCTAGATAACATTGAGGACAAGCGSEQ ID NO :103 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCATACCTAGATAACATTGAGGACAAGCASEQ ID NO :104 ATAATGCGGAAATTATTCTCAGGAACAGSEQ ID NO :105 Maker36 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTCTCTCTCTGTTCCTGAGAATAATTTCTSEQ ID NO :106 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTCTCTCTCTGTTCCTGAGAATAATTTCCSEQ ID NO :107 TAAGCAAGAGTATTGGAAGAAAAGGTACSEQ ID NO :108 Maker37 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGACTCCTTCTTTCTGGGCTGGSEQ ID NO :109 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGACTCCTTCTTTCTGGGCTGASEQ ID NO :110 CTGGAAGTATTGTCGCTGTTTCCSEQ ID NO :111 Maker38 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTTCTACTTAAGGCATCAGCAGCTTSEQ ID NO :112 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCTTCTACTTAAGGCATCAGCAGCTCSEQ ID NO :113 TGAGTATAAGAAAGGGAAGGACAACSEQ ID NO :114 Maker39 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTGGACTACAAAGATGTCAACCGAGSEQ ID NO :115 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTGGACTACAAAGATGTCAACCGATSEQ ID NO :116 CAATGGGTAGTGGTCTTTGGGASEQ ID NO :117 Maker40 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGCAGATCTGTCTTTAGCAGGCAGSEQ ID NO :118 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGCAGATCTGTCTTTAGCAGGCATSEQ ID NO :119 GCAAATCAGGTATCATCTTCAGCASEQ ID NO :120 Maker41 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTCCACCAACTATATCGATTCTAGAGAATSEQ ID NO :121 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTCCACCAACTATATCGATTCTAGAGAAASEQ ID NO :122 GTCGACAATCATAGACTTACGATTGAAASEQ ID NO :123 Maker42 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTACCCGAAAGTACAGAGGATCCTGSEQ ID NO :124 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTACCCGAAAGTACAGAGGATCCTASEQ ID NO :125 GATAACTCAAGAGCCCATTTTCCGSEQ ID NO :126 Maker43 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGGGAAGTAGAAGGATTGGTCSEQ ID NO :127 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGGGAAGTAGAAGGATTGGTTSEQ ID NO :128 CTAGACAAGATCAAGTTACATCAGATGSEQ ID NO :129 Maker44 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGGCACGTCCAAAGTAGAAAASEQ ID NO :130 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGCACGTCCAAAGTAGAAATSEQ ID NO :131 CCGGCCTTAAAATTAATTTTCASEQ ID NO :132 Maker45 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTTGCTCTTTGCTGCTCCSEQ ID NO :133 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTCCTTGCTCTTTGCTGCTCTSEQ ID NO :134 TGAATCACAAAATGAGTGCTACCTTSEQ ID NO :135 Maker46 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAACGATGAAGTTGTAAGCATCATSEQ ID NO :136 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAACGATGAAGTTGTAAGCATCACSEQ ID NO :137 AGAATTTGCATACACAATGAGGGSEQ ID NO :138 Maker47 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAACATTCTCCAAGCCAAAAAGSEQ ID NO :139 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAACATTCTCCAAGCCAAAAACSEQ ID NO :140 CCTCTAGTAGTTTGGCCAGTTCTTSEQ ID NO :141 Maker48 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCAGACCAATTGACAGGTGTGTSEQ ID NO:142 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTCAGACCAATTGACAGGTGTGCSEQ ID NO:143 CAGATAGCACCATTTGAGATGTTGTSEQ ID NO :144 A universal fluorescent tag is added to the 5' end of the KASP primers; the 5' end of the forward primer-1 is tagged with: GAAGGTGACCAAGTTCATGCT, and the 5' end of the forward primer-2 is tagged with: GAAGGTCGGAGTCAACGGATT.

[0008] This invention also relates to the application of KASP marker primer combinations for the identification of new wheatgrass germplasm in the construction of fingerprint maps of new wheatgrass germplasm resources.

[0009] The beneficial effects of this invention are as follows: This invention develops 48 pairs of KASP marker primers based on dd-RAD simplified genome sequencing data of 81 new wheatgrass accessions, and constructs fingerprint maps of the 81 new wheatgrass accessions based on the 48 pairs of KASP marker primers. The fingerprint map construction creates a molecular identity card for germplasm resources, making the molecular identification process simpler, more time-saving, and lower in cost, and improving the accuracy of variety breeding. This invention can be used for variety authenticity identification and germplasm resource kinship identification. Attached Figure Description

[0010] Figure 1 This refers to the KASP molecular marker typing of new wheatgrass germplasm resources in Example 2 of this invention. Figure 1 ;

[0011] Figure 2 This refers to the KASP molecular marker typing of new wheatgrass germplasm resources in Example 2 of this invention. Figure 2 ;

[0012] Figure 3 This refers to the KASP molecular marker typing of new wheatgrass germplasm resources in Example 2 of this invention. Figure 3 ;

[0013] Figure 4 This refers to the KASP molecular marker typing of new wheatgrass germplasm resources in Example 2 of this invention. Figure 4 ;

[0014] Figure 5 This refers to the KASP molecular marker typing of new wheatgrass germplasm resources in Example 2 of this invention. Figure 5 ;

[0015] Figure 6 This refers to the KASP molecular marker typing of new wheatgrass germplasm resources in Example 2 of this invention. Figure 6 ;

[0016] Figure 7 This refers to the KASP molecular marker typing of new wheatgrass germplasm resources in Example 2 of this invention. Figure 7 ;

[0017] Figure 8 This refers to the KASP molecular marker typing of new wheatgrass germplasm resources in Example 2 of this invention. Figure 8 ;

[0018] Figure 9 This is an ML phylogenetic tree diagram of 81 new wheatgrass germplasm resources;

[0019] Figure 10 It is a curve showing the change of ΔK value with the value of K;

[0020] Figure 11 This is a bar stacking plot of the Q values ​​of 81 new wheatgrass germplasm resources;

[0021] Figure 12 This is a PCoA scatter plot of 81 new wheatgrass germplasm resources. Detailed Implementation

[0022] The present invention will now be described in detail with reference to the accompanying drawings.

[0023] Example 1: Development of 48 pairs of core KASP primers

[0024] Eighty-one new wheatgrass germplasm resources were collected. These eighty-one new wheatgrass germplasm materials were all planted and preserved in the National Perennial Forage Germplasm Resource Nursery (Hohhot). The germplasm resource numbers and sources of the eighty-one new wheatgrass are shown in Table 1.

[0025] Table 1. Germplasm resource numbers and sources of new wheatgrass.

[0026] serial number source Place of origin Nursery site number source Place of origin B1 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Canada B51 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Iran B2 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Canada B52 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Iran B4 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Canada B53 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Kazakhstan B6 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) USA B55 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Kazakhstan B7 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) USA B56 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B8 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Xinjiang, China B58 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B9 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Gansu, China B59 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B10 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B60 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B11 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Canada B61 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Kazakhstan B12 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Xinjiang, China B62 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B14 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Hohhot, Inner Mongolia, China B63 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Yili, Xinjiang, China B15 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Hohhot, Inner Mongolia, China B64 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B16 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Jiuquan, Gansu Province, China B66 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B18 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) USA B68 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B19 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) USA B69 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B20 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Libya, Bolivia B70 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B22 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Urumqi, Xinjiang, China B72 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B23 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) USA B73 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B25 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Kazakhstan B74 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B26 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Altay Mountains, Altay City, Xinjiang, China B76 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B27 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Bortala, Xinjiang, China B77 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B28 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B78 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B29 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B79 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B30 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B80 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B31 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B81 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Kazakhstan B32 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B82 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Kazakhstan B33 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B84 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) USA B34 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B86 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Kazakhstan B35 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B87 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Kazakhstan B38 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B88 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Kazakhstan B39 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B89 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Kazakhstan B40 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B90 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Kazakhstan B41 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B91 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B42 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B93 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B43 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B94 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Midong District, Urumqi, Xinjiang, China B45 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Libya, Bolivia B95 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B46 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B96 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B47 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B97 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B48 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B98 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B50 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia B100 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia P24 National Northern Forage Germplasm Resource Bank (Hohhot) Russia

[0027] Eighty-one wheatgrass germplasm resources were subjected to dd-RAD simplified genome sequencing to obtain high-quality raw reads for each sample. Subsequently, a population sequence clustering strategy independent of the reference genome was used for SNP discovery and KASP marker development. The specific process is as follows:

[0028] Step 1: Population Sequence Clustering and SNP Calling. First, the clean reads of each sample are deduplicated and corrected. Then, the ustacks component is used to aggregate reads with high sequence similarity (usually set to sequence consistency ≥95%) to the same "site", forming a candidate site set for each sample.

[0029] Using the cstacks component, candidate loci from all 81 samples were merged to construct a non-redundant "locus directory" representing the entire population. Each sequence cluster in this directory theoretically corresponds to a possible genomic locus. Using the populations component, reads from each sample were compared with the aforementioned "locus directory" to identify polymorphic loci in the population, thus obtaining the initial SNP dataset.

[0030] Step 2: High-quality SNP screening. Use VCFtools (0.1.16) to filter population SNPs and retain loci that meet all of the following criteria: average sequencing depth ≥3× in the population, quality value ≥30, minimum integrity ≥0.5 (i.e., successful genotyping in at least 80% of samples), and minimum allele frequency ≥0.05.

[0031] Step 3: Marker Specificity Verification and Polymorphism Screening. From the "Site Catalog," extract the complete sequence clusters (usually containing the SNP and sufficient flanking sequences) of the SNPs selected in Step 2. Specificity Verification: Using BLAST+ software, compare these sequences containing the SNP with the "Site Catalog" database constructed in Step 1. Strictly remove sequences highly homologous to multiple different sites in the catalog to ensure each marker is uniquely representative. Polymorphism Screening: Calculate the polymorphism information content (PIC) of the retained markers and select SNP markers with a PIC > 0.2.

[0032] Step 4: KASP primer design. Using the primer design software Primer3, allele-specific and universal primers required for KASP genotyping are designed for the highly specific and highly polymorphic SNP markers retained in Step 3, within their stable flanking sequence regions, to complete the conversion from SNP to KASP marker.

[0033] Step 5: Experimental Validation and Core Marker Screening. Representative germplasm materials B1, B2, B4, B6, B7, B8, B9, B11, B12, B14, and B10 (see Table 1) were used to conduct polymorphism validation experiments on the designed KASP primers. By analyzing the genotyping results, primers showing obvious signals or non-specific amplification in the negative control were removed, as were markers that could only distinguish two genotypes or had poor genotyping clustering effects. Finally, primer pairs with clear genotyping, high reproducibility, and the ability to stably distinguish between homozygous genotype 1, homozygous genotype 2, and heterozygous genotypes were retained as core KASP markers. Through this process, 48 ​​pairs of core KASP primers were successfully developed, and their SNP locus genotype information is shown in Table 2.

[0034] Table 2. SNP locus information for 48 core KASP markers

[0035] Primer name genotype Primer name genotype Primer name genotype Marker1 G:A Marker17 T:A Marker33 A:T Marker2 T:C Marker18 G:T Marker34 A:G Marker3 A:G Marker19 G:A Marker35 G:A Marker4 G:A Marker20 G:A Marker36 A:G Marker5 T:C Marker21 G:A Marker37 C:T Marker6 G:A Marker22 G:A Marker38 A:G Marker7 C:T Marker23 G:T Marker39 C:A Marker8 A:G Marker24 T:C Marker40 G:T Marker9 G:A Marker25 G:T Marker41 T:A Marker10 G:A Marker26 A:C Marker42 G:A Marker11 C:T Marker27 C:G Marker43 C:T Marker12 G:T Marker28 A:G Marker44 T:A Marker13 A:G Marker29 G:A Marker45 C:T Marker14 A:G Marker30 G:A Marker46 T:C Marker15 T:C Marker31 A:T Marker47 G:C Marker16 T:A Marker32 A:T Marker48 A:G

[0036] Step 6: Retain tags with a polymorphic information content (PIC) greater than 0.2;

[0037] Step 7: Design primers for the SNP markers and convert them into KASP markers;

[0038] The eighth step involved polymorphism verification of these SNP sites, resulting in the successful development of 48 pairs of core KASP primers (see Table 3).

[0039] Table 3 48 pairs of KASP primers for new wheatgrass

[0040] Primer Name Forward Primer - 1 Forward Primer - 2 Universal Primer Maker1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGAAGTAACGCTTTTCACCACGSEQ ID NO :1 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGAAGTAACGCTTTTCACCACASEQ ID NO :2 CAAAGAGGTACTTGCACACGCSEQ ID NO :3 Maker2 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGAAGTAACGCTTTTCACCACA SEQ ID NO :4 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGAAGTAACGCTTTTCACCACG SEQ ID NO :5 CAAAGAGGTACTTGCACACGCSEQ ID NO :6 Maker3 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGTCTTCCGACTCTTCTTCCTCGTSEQ ID NO :7 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGTCTTCCGACTCTTCTTCCTCGCSEQ ID NO :8 ACCACAGTAGAAGCCATTAAGCASEQ ID NO :9 Maker4 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTCCCTCCATCACTGATAACTATCCTTGSEQ ID NO :10 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTCCCTCCATCACTGATAACTATCCTTASEQ ID NO :11 CTTGCCATCATCAAAGGGGTATAAATACSEQ ID NO :12 Maker5 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTGGAGGACACTGACAAGAGGTTCASEQ ID NO :13 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATTGGAGGACACTGACAAGAGGTTCGSEQ ID NO :14 GCTGAAGAGAGTGATCAAGGACAGSEQ ID NO :15 Maker6 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTGGAGGACACTGACAAGAGGTTCGSEQ ID NO :16 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATTGGAGGACACTGACAAGAGGTTCASEQ ID NO :17 GAGCTGAAGAGAGTGATCAAGGACSEQ ID NO :18 Maker7 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAACGTTTGCTTAGGAAATTTTAGCCCCGSEQ ID NO :19 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAACGTTTGCTTAGGAAATTTTAGCCCCASEQ ID NO :20 CCAGCAGAAGGAACATATGCAAAATTATSEQ ID NO :21 Maker8 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAACGTTTGCTTAGGAAATTTTAGCCCCASEQ ID NO :22 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAACGTTTGCTTAGGAAATTTTAGCCCCGSEQ ID NO :23 CCAGCAGAAGGAACATATGCAAAATTATSEQ ID NO :24 Maker9 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTCAACTTCAATGATCTTCGATCCTACCAGSEQ ID NO :25 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTCAACTTCAATGATCTTCGATCCTACCAASEQ ID NO :26 CTCTATGGCATCCATTCAACTACTGGSEQ ID NO :27 Maker10 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGCCTGGCAGTAGATATTCAACAACTGSEQ ID NO :28 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGCCTGGCAGTAGATATTCAACAACTASEQ ID NO :29 GAGTGTAAGTGGTGCAAATGAAGTTAASEQ ID NO :30 Maker11 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTATCAGGATTCGGAGATTTGTTAACACGGSEQ ID NO :31 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTATCAGGATTCGGAGATTTGTTAACACGASEQ ID NO :32 CAGTATGGTAGCTTCATTTGACTGACTAASEQ ID NO :33 Maker12 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGATGAGCCGTACCAGCAGAGSEQ ID NO :34 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGATGAGCCGTACCAGCAGATSEQ ID NO :35 GAAGTGCAAGCGATGTGGTTTSEQ ID NO :36 Maker13 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAACTGACCAAGGCGAGTCCAASEQ ID NO :37 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAACTGACCAAGGCGAGTCCAGSEQ ID NO :38 GGATTTGTCCTTGCAATCTTCTCASEQ ID NO :39 Maker14 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTTTGACGGGCTTGTCCTTGTTAAATASEQ ID NO :40 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTTGACGGGCTTGTCCTTGTTAAATGSEQ ID NO :41 AGCTCTAATCTGATTCAGAATCACGASEQ ID NO :42 Maker15 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGCTTGACCTGTACGTTTTTGCASEQ ID NO :43 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGCTTGACCTGTACGTTTTTGCGSEQ ID NO :44 ATCTACAGGTTCAGTATGGCTGCSEQ ID NO :45 Maker16 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTTCAGAGTCGGTTAAAAAGGAAAACACTSEQ ID NO :46 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTTCAGAGTCGGTTAAAAAGGAAAACACASEQ ID NO :47 GAACTTGTGTGAATCCAAACTGGCASEQ ID NO :48 Maker17 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGATGCATTGGCTGACAGTGGASEQ ID NO :49 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGATGCATTGGCTGACAGTGGTSEQ ID NO :50 TTGTTCTGCGAGTTCTTCCTGSEQ ID NO :51 Maker18 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGTCTTTGGATTCAGTGATGGAAGAACTCSEQ ID NO :52 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGTCTTTGGATTCAGTGATGGAAGAACTASEQ ID NO :53 TCAGATTCTTTGTCTTTAAGCAAAGTGCSEQ ID NO :54 Maker19 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATAGGACATTAACTTGCCTTTCCGACATCSEQ ID NO :55 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATAGGACATTAACTTGCCTTTCCGACATTSEQ ID NO :56 GTGGAACTGCATTGAAGATAGATTTGSEQ ID NO :57 Maker20 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCACCTGACCCAATGTTGATCCCSEQ ID NO :58 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCACCTGACCCAATGTTGATCCTSEQ ID NO :59 GTGGCAGAATTTCCTTTGGAACASEQ ID NO :60 Maker21 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGAATTTATGGATGGAAGCCCTAAAGACAGSEQ ID NO :61 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGAATTTATGGATGGAAGCCCTAAAGACAASEQ ID NO :62 CTAGGAACCTTGTTAAGAATATGTGTCGSEQ ID NO :63 Maker22 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTCACCTCCTCTCTAATATTTTGTGGACAGSEQ ID NO :64 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTCACCTCCTCTCTAATATTTTGTGGACAASEQ ID NO :65 TTTTTAAAGCGAGCAGGGAAGGSEQ ID NO :66 Maker23 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGAATTACCCAAAACAATCAGAGACSEQ ID NO :67 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGAATTACCCAAAACAATCAGAGAASEQ ID NO :68 GAGTTCTCGATTGATGGTCCCAAATSEQ ID NO :69 Maker24 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACACTGGGCAGAAGATCAATTAACTCASEQ ID NO :70 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACACTGGGCAGAAGATCAATTAACTCGSEQ ID NO :71 TACACAAAAGAAGAGGGAGTGGCSEQ ID NO :72 Maker25 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGGCACCCGGATAAGATTGCGSEQ ID NO :73 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGGCACCCGGATAAGATTGCTSEQ ID NO :74 GAACCTTCCCTTGGCTTCCTCSEQ ID NO :75 Maker26 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGGCACCCGGATAAGATTGCTSEQ ID NO :76 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGGCACCCGGATAAGATTGCGSEQ ID NO :77 GAACCTTCCCTTGGCTTCCTCSEQ ID NO :78 Maker27 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCTTGAGGAACAGCTGCAACCSEQ ID NO :79 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCTTGAGGAACAGCTGCAACGSEQ ID NO :80 CCTTCCGAGCTTGAGGAACAGSEQ ID NO :81 Maker28 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTCCTGTTGGAGACGCTGAGGTSEQ ID NO :82 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTCCTGTTGGAGACGCTGAGGCSEQ ID NO :83 CCTCATCGGGTTGAACTCGTCSEQ ID NO :84 Maker29 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAGCTGAAACTTGTCTTGTCTCGCAGSEQ ID NO :85 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAGCTGAAACTTGTCTTGTCTCGCAASEQ ID NO :86 CCAATGTCCCCAAACTTGTTTTTCTSEQ ID NO :87 Maker30 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATGAGTGATAGAATTGGCCTTGGCGSEQ ID NO :88 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATGAGTGATAGAATTGGCCTTGGCASEQ ID NO :89 ATCAATCCTTGAAGGTAGAGACATSEQ ID NO :90 Maker31 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAACACGAAGCTCCCTTTGGCTSEQ ID NO :91 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAACACGAAGCTCCCTTTGGCASEQ ID NO :92 ACCTCCTTATCTTCTTTTGCCCSEQ ID NO :93 Maker32 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAACACGAAGCTCCCTTTGGCASEQ ID NO :94 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAACACGAAGCTCCCTTTGGCTSEQ ID NO :95 ACCTCCTTATCTTCTTTTGCCCTSEQ ID NO :96 Maker33 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAAATCCAGTCAGCTCCCAGGATTSEQ ID NO :97 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAATCCAGTCAGCTCCCAGGATASEQ ID NO :98 TGTCAAAACTTGCCAAATCCAGTSEQ ID NO :99 Maker34 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAACTCCTTGCTCTTTGCTGCTCTSEQ ID NO :100 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAACTCCTTGCTCTTTGCTGCTCCSEQ ID NO :101 AATGAGTGCTACCTTGGTCTTCCSEQ ID NO :102 Maker35 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCATACCTAGATAACATTGAGGACAAGCGSEQ ID NO :103 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCATACCTAGATAACATTGAGGACAAGCASEQ ID NO :104 ATAATGCGGAAATTATTCTCAGGAACAGSEQ ID NO :105 Maker36 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTCTCTCTCTGTTCCTGAGAATAATTTCTSEQ ID NO :106 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTCTCTCTCTGTTCCTGAGAATAATTTCCSEQ ID NO :107 TAAGCAAGAGTATTGGAAGAAAAGGTACSEQ ID NO :108 Maker37 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGACTCCTTCTTTCTGGGCTGGSEQ ID NO :109 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGACTCCTTCTTTCTGGGCTGASEQ ID NO :110 CTGGAAGTATTGTCGCTGTTTCCSEQ ID NO :111 Maker38 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTTCTACTTAAGGCATCAGCAGCTTSEQ ID NO :112 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCTTCTACTTAAGGCATCAGCAGCTCSEQ ID NO :113 TGAGTATAAGAAAGGGAAGGACAACSEQ ID NO :114 Maker39 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTGGACTACAAAGATGTCAACCGAGSEQ ID NO :115 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTGGACTACAAAGATGTCAACCGATSEQ ID NO :116 CAATGGGTAGTGGTCTTTGGGASEQ ID NO :117 Maker40 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGCAGATCTGTCTTTAGCAGGCAGSEQ ID NO :118 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGCAGATCTGTCTTTAGCAGGCATSEQ ID NO :119 GCAAATCAGGTATCATCTTCAGCASEQ ID NO :120 Maker41 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTCCACCAACTATATCGATTCTAGAGAATSEQ ID NO :121 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTCCACCAACTATATCGATTCTAGAGAAASEQ ID NO :122 GTCGACAATCATAGACTTACGATTGAAASEQ ID NO :123 Maker42 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTACCCGAAAGTACAGAGGATCCTGSEQ ID NO :124 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTACCCGAAAGTACAGAGGATCCTASEQ ID NO :125 GATAACTCAAGAGCCCATTTTCCGSEQ ID NO :126 Maker43 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGGGAAGTAGAAGGATTGGTCSEQ ID NO :127 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGGGAAGTAGAAGGATTGGTTSEQ ID NO :128 CTAGACAAGATCAAGTTACATCAGATGSEQ ID NO :129 Maker44 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGGCACGTCCAAAGTAGAAAASEQ ID NO :130 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGCACGTCCAAAGTAGAAATSEQ ID NO :131 CCGGCCTTAAAATTAATTTTCASEQ ID NO :132 Maker45 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTTGCTCTTTGCTGCTCCSEQ ID NO :133 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTCCTTGCTCTTTGCTGCTCTSEQ ID NO :134 TGAATCACAAAATGAGTGCTACCTTSEQ ID NO :135 Maker46 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAACGATGAAGTTGTAAGCATCATSEQ ID NO :136 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAACGATGAAGTTGTAAGCATCACSEQ ID NO :137 AGAATTTGCATACACAATGAGGGSEQ ID NO :138 Maker47 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAACATTCTCCAAGCCAAAAAGSEQ ID NO :139 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAACATTCTCCAAGCCAAAAACSEQ ID NO :140 CCTCTAGTAGTTTGGCCAGTTCTTSEQ ID NO :141 Maker48 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCAGACCAATTGACAGGTGTGTSEQ ID NO :142 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTCAGACCAATTGACAGGTGTGCSEQ ID NO :143 CAGATAGCACCATTTGAGATGTTGTSEQ ID NO :144

[0041] The primers in Table 3 are fluorescently labeled primers.

[0042] Example 2: Constructing a fingerprint map of new wheatgrass germplasm resources

[0043] The 48 pairs of KASP primers of this invention were used to genotype 81 new wheatgrass germplasm resources and construct fingerprint maps. The specific method is as follows:

[0044] 1) Material preparation: 81 new wheatgrass germplasm resources were selected. These 81 new wheatgrass germplasm materials were all planted and preserved in the National Perennial Forage Germplasm Resource Nursery (Hohhot). The germplasm resource numbers and sources of the 81 new wheatgrass are shown in Table 1.

[0045] 2) DNA extraction: During the seedling stage, tender leaves of the above 81 new wheatgrass germplasm materials were placed in 2ml cryovials and quickly frozen in liquid nitrogen. After being brought back to the laboratory, DNA was extracted using the High-Efficiency Plant Genomic DNA Extraction Kit (DP305) from Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd. For detailed steps, please refer to the kit instructions.

[0046] 3) Primer synthesis: Universal fluorescent tags were added to the 5' end of 48 pairs of primers: GAAGGTGACCAAGTTCATGCT was added to the 5' end of forward primer sequence-1, and GAAGGTCGGAGTCAACGGATT was added to the 5' end of forward primer sequence-2. Primer synthesis was completed by Nanjing Jisi Huiyuan Biotechnology Co., Ltd.

[0047] 4) PCR amplification system: The PCR amplification system has a volume of 5µL, including 2.5µL of 2×KASP Mastermix, 1.25µL of primer mix, 0.1µL of ROX fluorescent dye and 1.15µL of DNA template;

[0048] 5) PCR amplification conditions: 5℃ pre-denaturation for 10 min; 95℃ denaturation for 20 sec, annealing and extension at 61-55℃ for 1 min, for a total of 10 cycles, with the temperature decreasing by 0.6℃ per cycle; second round of PCR reaction: 95℃ denaturation for 20 sec, 55℃ annealing and extension for 60 sec, for a total of 27 cycles; finally, fluorescence information is read at 25℃ for 30 sec.

[0049] 6) Fluorescence data reading: All reactions in this invention were performed in the Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex real-time quantitative PCR system; fluorescence was excited at 485nm and emitted at 520nm, and HEX was excited at 535nm and emitted at 556nm. The corresponding product fluorescence signal values ​​were taken to complete genotyping (FAM excitation indicates one homozygous genotype, HEX excitation indicates another homozygous genotype, and simultaneous excitation of both FAM and HEX fluorescence indicates a heterozygous genotype).

[0050] 7) Fingerprint mapping: The 48 selected KASP markers were used to genotype 81 new wheatgrass germplasm resources, such as... Figure 1-8As shown in the figure (Note: green ■ indicates heterozygous Allele1 / Allele2; blue ◆ indicates homozygous Allele1 / Allele1; black ● indicates homozygous Allele2 / Allele2 negative control; black * undetermined; red ▲ indicates negative control (NTC)), fingerprint maps were constructed accordingly. Different genotypes in the fingerprint maps are: A:A, C:C, T:T, G:G, A:T, A:G, A:C, A:A, C:T, T:C, G:A, G:C, N / N (deleted). The fingerprint maps of 81 new wheatgrass germplasm resources constructed with 48 KASP markers are shown in Table 4.

[0051] Table 4. Fingerprint maps of 81 new wheatgrass germplasm resources

[0052] B1 G:G / C:C / G:G / G:G / T:C / G:A / T:T / A:A / G:G / G:G / C:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / G:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / N:N / T:T / G:G / A:A / G:G / T:T / G:G / T:T / A:A / C:T / T:T / G:G / G:G B11 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / T:T / A:A / A:G / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / N:N / A:A / T:T / G:G / C:A / G:T / T:T / G:G / C:T / A:A / C:T / T:T / G:G / A:G B22 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / G:G / A:A / A:A / T:T / A:A / C:C / G:G / T:T / G:G / C:T / T:A / C:C / T:T / G:C / A:A B31 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:C / A:G / G:G / N:N / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / G:T / A:A / G:G / G:A / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / C:T / G:G / C:C / G:T / T:T / G:G / C:C / A:A / C:T / T:C / G:G / G:G B41 G:G / C:C / G:G / G:A / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:G / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:G / G:A / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:G / T:T / G:G / A:A / G:T / T:T / G:G / C:T / T:A / C:T / T:C / G:C / G:G B51 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / T:T / G:G / A:G / A:A / T:C / T:T / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / G:G / T:T / T:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:C / G:T / T:T / G:G / C:C / T:A / C:T / C:C / G:C / G:G B61 G:G / C:C / G:G / G:G / T:C / G:A / T:T / A:A / G:G / G:A / T:T / G:G / G:G / A:A / C:C / T:A / A:A / G:T / G:G / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:A / G:G / A:A / T:T / G:G / A:A / G:G / T:T / G:G / C:C / T:T / T:T / T:T / G:G / G:G B72 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:C / A:G / G:G / G:G / C:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:T / A:A / N:N / G:G / A:A / G:G / G:G / T:T / T:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / A:T / A:T / A:A / G:G / A:A / N:N / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:T / T:T / C:C / C:C / G:G / A:G B81 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / G:G / A:G / A:A / T:C / T:T / T:A / G:T / A:A / A:A / G:A / G:G / T:T / T:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:A / G:A / T:T / A:A / A:A / A:G / G:A / N:N / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:C / A:A / C:T / C:C / G:C / A:G B91 G:A / T:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / T:T / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / G:A / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:G / G:G / A:T / A:T / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / T:T / A:A / C:T / T:T / G:G / G:G P24 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:A / T:T / G:G / A:G / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:A / G:G / A:T / A:T / A:A / G:G / G:A / A:A / N:N / N:N / C:C / G:G / T:T / G:G / T:T / A:A / C:C / N:N / C:C / A:G B2 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:A / G:G / T:T / G:T / G:G / A:G / C:C / T:T / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / A:A / A:A / T:T / G:G / C:C / G:G / T:T / G:G / C:T / T:T / C:T / T:C / G:C / G:G B12 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / G:G / A:A / G:G / C:C / T:T / A:A / G:T / G:G / G:G / G:A / G:G / G:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:A / A:A / T:T / G:G / A:A / G:T / T:T / G:A / C:T / T:T / C:T / T:T / G:G / G:G B23 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / G:A / A:A / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / G:G / A:A / A:A / T:T / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / C:C / A:A / C:C / T:T / G:G / G:G B32 A:A / T:T / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:A / G:A / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:A / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / A:A / G:T / T:T / G:G / C:C / A:A / C:T / C:C / G:G / A:A B42 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:A / G:G / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:G / G:G / A:T / A:T / A:A / A:G / G:G / N:N / T:T / G:G / C:A / G:G / A:A / G:G / C:T / T:A / C:T / T:T / C:C / G:G B52 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / G:G / G:G / G:A / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:T / A:A / C:C / N:N / G:C / G:G B62 G:A / T:C / G:G / G:A / C:C / G:G / C:C / A:G / G:G / G:G / T:T / G:G / A:G / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:A / A:T / A:T / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / A:G / C:C / G:G / T:A / G:G / C:C / T:A / C:T / C:C / G:G / G:G B73 G:G / C:C / G:G / A:A / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / T:T / A:G / A:G / C:C / T:T / T:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / A:A / A:A / C:T / G:G / C:A / G:T / T:A / G:G / T:T / A:A / C:T / C:C / G:C / A:G B82 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / G:G / A:A / A:G / T:C / T:T / A:A / T:T / G:A / A:A / G:G / G:A / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:T / T:A / C:C / C:C / G:G / A:A B93 G:G / C:C / G:G / G:G / T:C / G:A / C:C / A:G / G:G / G:G / C:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:A / G:T / T:T / G:G / C:T / T:A / C:T / T:C / G:C / G:G B4 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / C:T / T:T / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / G:G / G:A / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:A / A:A / T:T / G:G / C:C / G:G / T:T / G:G / T:T / A:A / C:T / T:T / G:C / G:G B14 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:T / N:N / T:T / A:A / G:G / G:G / G:G / G:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:G / G:A / T:T / A:A / A:A / A:A / G:G / A:A / T:T / G:G / C:C / G:G / T:T / G:G / C:T / A:A / T:T / C:C / G:C / G:G B25 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:A / G:G / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / G:G / G:A / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:C / T:T / T:T / G:G / C:T / A:A / C:C / C:C / G:G / G:G B33 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / G:G / A:A / G:A / G:A / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:G / G:G / A:T / A:T / A:A / A:G / A:A / A:A / C:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:T / T:T / C:T / T:C / G:G / G:G B43 G:A / T:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:A / C:C / G:G / A:G / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / N:N / C:T / A:G / C:C / G:G / A:A / G:G / C:T / A:A / C:T / T:C / G:G / A:G B53 G:G / C:C / N:N / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / N:N / A:G / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:A / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:T / A:A / C:C / C:C / G:G / G:G B63 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / T:A / T:T / A:A / A:A / G:A / A:A / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / A:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / N:N / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:C / A:A / C:T / T:C / G:C / G:G B74 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / T:T / G:G / A:A / A:G / T:C / T:T / A:A / T:T / A:A / G:G / G:G / G:A / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / N:N / T:T / G:G / C:C / G:G / T:A / G:G / T:T / A:A / C:T / T:T / C:C / A:G B84 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / C:T / G:G / A:G / A:G / C:C / T:T / A:A / T:T / G:G / A:A / G:G / G:G / T:T / T:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:A / A:A / C:T / G:G / A:A / G:G / T:T / G:A / C:C / T:T / C:T / T:T / G:G / G:G B94 G:G / C:C / G:G / G:A / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:A / G:A / T:T / A:A / A:A / A:G / A:A / A:A / T:T / G:G / C:C / G:G / T:T / G:G / C:T / T:A / C:T / T:C / G:C / G:G B6 G:G / C:C / G:G / N:N / T:C / G:A / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / G:G / A:A / N:N / C:C / T:A / A:A / N:N / G:A / G:A / G:G / G:G / T:T / T:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:A / A:A / T:T / G:G / C:A / N:N / T:T / G:G / C:T / T:A / C:T / T:T / G:G / G:G B15 G:G / C:C / N:N / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / C:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / G:A / G:G / G:A / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / A:A / G:G / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:T / T:A / C:T / C:C / C:C / G:G B26 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / C:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / G:G / G:G / N:N / G:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:G / G:A / A:T / A:T / A:A / G:G / A:A / A:A / C:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / T:T / A:A / C:C / T:C / G:C / A:G B34 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / N:N / A:G / G:G / G:G / T:T / G:G / A:G / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / G:G / A:A / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / A:T / A:T / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:C / T:T / T:T / G:G / C:T / T:T / C:T / C:C / G:G / G:G B45 G:A / T:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:A / G:G / T:T / G:G / A:A / A:G / C:C / T:A / A:A / G:T / G:G / G:G / G:G / G:A / T:T / T:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / A:G / C:C / G:G / T:A / G:G / N:N / T:T / C:T / T:C / G:G / A:G B55 G:G / C:C / N:N / G:G / T:C / G:A / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / G:T / G:A / A:A / G:G / G:G / T:T / C:C / G:T / A:C / A:A / A:A / G:G / G:G / A:T / A:T / A:A / A:G / A:A / A:A / T:T / G:G / C:C / G:G / T:T / G:G / C:C / T:A / C:T / T:C / G:G / A:G B64 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / T:T / G:G / A:A / A:A / T:C / T:T / A:A / G:G / G:G / A:A / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:G / G:A / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / N:N / T:T / C:T / C:C / G:G / A:A B76 G:A / T:C / A:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / T:T / A:A / A:G / C:C / T:T / A:A / N:N / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:A / G:A / A:A / T:T / A:A / G:G / G:G / A:G / T:T / G:G / C:A / G:T / T:T / G:G / C:T / A:A / C:C / T:T / G:G / A:G B86 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:G / T:T / G:G / A:A / A:G / C:C / T:A / A:A / G:G / G:A / A:A / G:G / N:N / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:G / T:T / A:A / T:T / A:G / A:A / A:G / T:T / G:G / C:C / G:T / T:A / G:G / C:T / T:A / C:T / T:C / G:G / A:G B95 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / G:A / A:A / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:C / G:G / T:T / G:G / C:C / A:A / C:C / T:T / G:G / A:A B7 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / C:T / G:T / A:A / A:G / T:C / T:T / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / G:G / G:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:G / N:N / A:G / A:A / G:G / T:T / G:G / C:T / T:A / C:T / T:C / G:G / G:G B16 G:G / C:C / G:G / G:A / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / C:T / T:T / A:A / A:G / C:C / T:T / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / G:G / G:G / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / N:N / G:G / T:T / A:G / A:A / G:T / T:T / G:G / T:T / T:A / C:T / T:T / G:C / G:G B27 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:G / T:T / G:G / A:G / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / T:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:C / G:G / T:T / G:G / N:N / A:A / C:C / T:C / G:G / G:G B35 G:G / C:C / A:A / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / A:A / C:T / G:G / A:G / A:A / C:C / T:A / T:T / T:T / G:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:A / A:A / A:G / T:T / A:G / A:A / G:G / T:T / G:G / C:C / T:A / T:T / T:T / G:G / A:A B46 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / C:T / G:G / A:A / A:G / C:C / T:T / A:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / G:T / T:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / A:T / A:T / A:A / A:A / G:G / A:A / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:T / A:A / T:T / T:C / G:G / G:G B56 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / C:T / T:T / G:G / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / C:T / G:G / C:A / G:G / T:T / N:N / T:T / A:A / C:T / T:C / G:G / G:G B66 G:A / T:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:G / C:T / G:G / A:G / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:T / A:C / A:A / A:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / N:N / T:T / G:G / C:C / G:G / T:T / G:G / C:C / A:A / C:T / T:T / C:C / G:G B77 G:A / T:C / G:G / G:A / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / T:T / G:T / A:A / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / A:A / G:G / G:G / G:G / G:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:G / G:A / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:T / A:A / C:T / T:C / C:C / A:A B87 G:A / T:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / G:G / A:A / A:A / T:C / T:T / A:A / T:T / A:A / G:G / G:G / G:A / G:T / C:C / G:T / A:C / A:A / G:G / G:G / G:A / T:T / A:A / A:A / G:G / A:A / A:A / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:T / A:A / C:C / T:C / G:G / A:G B96 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:A / G:A / T:T / G:G / A:A / A:G / T:C / T:T / T:A / T:T / G:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:A / A:T / A:T / A:A / G:G / A:A / A:A / T:T / G:G / A:A / G:G / T:T / N:N / C:T / T:A / C:C / C:C / G:C / G:G B8 G:G / C:C / G:G / G:G / T:C / G:A / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / G:T / A:A / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:A / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / T:T / A:A / C:T / T:T / C:C / A:G B18 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:G / C:T / T:T / A:G / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:C / A:A / C:C / T:T / C:C / G:G B28 G:G / C:C / G:G / G:G / T:C / G:A / T:T / N:N / G:G / G:G / C:T / G:G / A:G / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / T:C / T:T / A:A / A:A / A:A / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:C / G:T / T:T / G:G / C:C / A:A / C:T / T:C / G:G / G:G B38 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / G:G / G:G / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / G:A / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:G / A:T / A:T / A:A / A:G / G:G / N:N / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:T / T:A / C:T / T:C / G:G / A:G B47 G:G / C:C / G:G / G:A / T:C / G:A / T:T / A:A / G:G / G:A / T:T / G:T / A:A / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / N:N / T:T / A:G / C:C / G:G / T:T / G:G / C:T / A:A / C:T / T:C / C:C / G:G B58 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / G:G / A:G / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / G:A / A:A / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / A:A / C:A / G:G / T:T / G:G / T:T / T:A / C:T / T:C / G:G / A:G B68 G:G / C:C / N:N / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / N:N / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / N:N / A:A / T:T / G:A / N:N / G:G / G:G / T:T / T:C / N:N / C:C / G:G / A:G / G:G / G:G / T:T / A:A / N:N / A:G / G:G / G:G / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:T / T:A / C:T / T:T / G:C / A:A B78 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / G:G / A:G / N:N / C:C / T:T / A:A / G:T / N:N / A:A / G:A / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / A:A / G:G / T:A / G:G / C:T / A:A / C:T / T:C / G:G / A:G B88 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:G / T:T / G:G / A:G / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / G:A / A:A / G:G / G:A / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:C / T:T / T:T / G:G / C:C / T:A / C:T / T:T / G:G / G:G B97 G:G / C:C / G:G / G:A / C:C / N:N / T:T / N:N / G:G / G:G / C:T / G:G / G:G / A:G / C:C / T:T / A:A / T:T / G:A / A:A / G:A / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / A:A / G:G / N:N / A:A / A:A / A:G / G:A / A:A / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:T / T:A / C:T / T:T / G:G / A:G B9 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / T:T / T:T / G:G / N:N / C:C / T:T / A:A / G:T / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:A / G:G / A:A / C:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:T / A:A / T:T / T:C / G:G / G:G B19 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:G / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:T / T:A / G:T / G:G / A:A / G:G / G:G / T:T / T:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:A / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / C:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:C / T:T / C:T / T:C / G:G / A:G B29 G:G / C:C / G:G / N:N / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:G / T:T / G:T / A:A / A:A / C:C / A:A / A:A / G:T / G:G / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / N:N / C:T / G:G / C:C / G:G / T:T / G:G / C:C / T:T / C:T / T:T / G:G / A:G B39 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / T:T / T:T / A:G / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / G:A / A:A / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:A / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:C / G:G / T:T / G:G / T:T / T:T / C:T / T:C / G:C / A:G B48 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:G / T:T / G:G / A:G / A:A / C:C / T:A / A:A / G:T / G:A / G:G / G:G / G:G / T:T / C:C / G:T / A:C / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / G:G / A:A / A:A / T:T / G:G / A:A / G:G / T:T / G:G / C:C / T:A / C:C / C:C / G:G / G:G B59 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:A / C:T / T:T / A:G / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / G:A / A:A / G:G / G:G / G:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / A:G / T:T / G:G / A:A / G:T / T:T / G:G / C:C / T:A / C:C / C:C / G:G / G:G B69 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:A / G:A / C:T / G:G / A:A / G:G / C:C / T:T / A:A / T:T / G:A / N:N / G:G / G:G / T:T / C:C / G:T / A:C / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / A:A / C:T / G:G / C:C / G:G / T:T / G:G / C:T / T:A / C:C / N:N / G:C / G:G B79 G:G / C:C / G:G / G:A / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:G / C:T / G:G / A:A / A:G / C:C / T:T / A:A / T:T / A:A / G:G / G:G / G:A / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / N:N / T:T / G:G / C:C / G:G / T:T / G:A / C:C / A:A / C:T / T:T / G:G / G:G B89 G:G / C:C / G:G / G:A / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:A / C:C / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / G:T / A:A / G:G / G:G / G:A / T:T / C:C / G:T / A:C / A:A / A:G / G:A / G:G / A:T / A:T / A:A / G:G / G:G / A:A / T:T / G:G / A:A / G:G / T:T / G:G / C:C / A:A / C:C / T:C / G:C / G:G B98 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:A / T:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / T:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / G:G / G:A / A:A / T:T / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / C:T / A:A / C:C / T:T / G:G / G:G B10 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / C:T / G:G / A:G / A:A / C:C / T:T / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / G:G / T:T / T:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:G / T:T / G:G / C:C / G:G / A:A / G:G / T:T / T:A / C:T / N:N / G:G / A:G B20 G:G / C:C / G:G / G:A / C:C / G:G / T:T / A:A / G:A / G:G / C:T / G:G / A:A / A:G / C:C / T:A / A:A / G:G / G:G / G:G / G:G / G:A / T:T / T:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / A:A / G:G / T:T / G:G / C:C / T:T / C:T / T:C / G:G / A:G B30 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:G / C:T / N:N / A:G / A:A / C:C / A:A / A:A / G:T / G:A / A:A / G:G / G:G / T:T / T:C / G:G / C:C / A:A / G:G / G:A / G:A / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / T:T / T:A / C:T / T:T / G:G / G:G B40 G:G / C:C / G:G / G:A / C:C / G:G / T:T / A:A / G:A / G:A / T:T / G:G / A:G / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / G:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:C / G:G / T:T / G:G / C:T / A:A / C:T / C:C / G:G / A:G B50 G:G / C:C / N:N / G:A / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / T:T / G:G / A:G / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:A / G:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:A / A:A / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / C:C / A:A / C:C / T:C / C:C / G:G B60 G:A / T:C / A:A / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / C:T / G:G / A:A / A:A / C:C / T:A / A:A / T:T / G:A / A:A / G:G / G:A / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:G / G:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / N:N / T:T / G:G / C:C / G:T / T:T / G:G / T:T / T:A / C:C / T:C / G:G / G:G B70 G:G / C:C / N:N / G:G / C:C / G:G / T:T / A:A / G:G / G:A / T:T / G:G / A:G / A:A / C:C / A:A / T:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:A / T:T / C:C / G:G / C:C / A:A / A:G / G:A / G:G / A:T / A:T / A:A / G:G / G:G / N:N / T:T / A:G / C:C / G:G / T:T / G:G / C:T / A:A / C:C / T:C / G:G / G:G B80 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:G / T:T / G:G / A:A / A:G / C:C / T:T / A:A / G:T / A:A / G:G / G:G / G:G / T:T / T:C / G:G / C:C / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:A / A:A / C:T / G:G / C:C / G:T / T:T / G:G / C:C / A:A / C:T / T:T / G:G / G:G B90 G:A / T:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:G / T:T / G:G / A:G / G:G / C:C / A:A / A:A / T:T / A:A / A:A / G:G / G:G / T:T / T:C / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / G:G / T:T / A:A / A:A / A:G / G:G / A:A / T:T / G:G / C:A / G:T / T:T / G:G / T:T / A:A / C:T / T:T / G:G / G:G B100 G:G / C:C / G:G / G:G / C:C / G:G / C:T / A:G / G:G / G:A / T:T / G:G / A:A / A:G / C:C / T:A / A:A / T:T / G:A / G:G / G:G / G:G / T:T / T:C / G:T / A:C / A:A / G:G / G:A / G:G / A:T / A:T / A:A / A:G / A:A / A:A / T:T / G:G / C:A / G:G / T:T / G:G / T:T / T:A / C:T / T:C / G:G / G:G

[0053] Example 3: Genetic evolution analysis of 81 new wheatgrass germplasm resources

[0054] Genetic evolution analysis was performed on 81 new wheatgrass germplasm resources using 48 pairs of developed KASP markers.

[0055] Step 1: Using the developed 48 pairs of KASP markers, a phylogenetic tree was constructed from 81 new wheatgrass germplasm resources using the FastTree software, employing the maximum likelihood method. (See...) Figure 9 .

[0056] Step 2: Genetic structure analysis using Structure (version 2.3.1). Import the KASP genotyping data into Structure (version 2.3.1) software for analysis. K was set from 1 to 20, and MCMC (Markov Chain MonieCarfo) and Burn-in (length of burn-in period) were set to 100,000 and 500,000 respectively. Each K value was repeated 10 times. The results file from the Structure run was analyzed using the Structure Harvester tool to calculate and plot the curve of ΔK value versus K value. See [link to relevant documentation]. Figure 10 The optimal K value is determined based on the peak value; that is, the peak value is the optimal K value.

[0057] After determining the optimal K value, use the Structure Harvester tool to export the corresponding data file (indfile) to CLUMPP 2.0 software. Modify the parameter file according to the corresponding K value, number of repetitions, and number of individuals. Run CLUMPP software to merge the 10 repetitions corresponding to the optimal K value into a single Q-value matrix. Use the Q-value matrix exported from CLUMPP 2.0 software to import the Q-value matrix into the R package pophelper to draw a Q-value bar stacked plot (Q plot). See [link to documentation]. Figure 11 .

[0058] Step 3: Calculate the genetic distance matrix using GenALEX software (version: 6.51b2), perform two-dimensional principal coordinate analysis based on the GD matrix, and plot PCoA (Principal Co-ordinates Analysis) scatter plots for principal coordinate 1 and principal coordinate 2. See [link / reference]. Figure 12 The preset populations are marked with different colors on the graph, and the PCoA matrix corresponding to the first 10 principal components is exported.

[0059] Cluster analysis, population genetic structure analysis, and principal component analysis were performed on 81 wheatgrass germplasm resources using 48 pairs of KASP markers. The results showed that the 81 wheatgrass germplasm resources were divided into 4 groups, indicating that the 81 wheatgrass germplasm resources have rich genetic diversity and complex and diverse genetic backgrounds.

[0060] Finally, it should be noted that the above content is only used to illustrate the technical solution of the present invention, and is not intended to limit the scope of protection of the present invention. Simple modifications or equivalent substitutions made by those skilled in the art to the technical solution of the present invention do not depart from the essence and scope of the technical solution of the present invention.

Claims

1. A KASP marker primer combination for the identification of new ryegrass germplasm, characterized in that: The KASP marker primer combination consists of 48 pairs of KASP primers, and the nucleotide sequences of the KASP primers are shown in the following table:

2. The application of the KASP marker primer combination for identifying new grassland species in claim 1 in the construction of new grassland species resource fingerprint.

Images