Multi-well device for large-scale, high throughput formation of microtissues and its use

Abstract

Described is a device for large-scale, high throughput, and rapid fabrication of microtissues. The device is designed as an invertible insert or a hanging insert, suitable for inversion and placement inside a single-compartment tissue culture plate. Further, the device has a three-dimensional support and contains a two-dimensional array of microwells with round-bottom cavities. The device facilitates the formation of multiple microtissues, including both cell aggregates and matrix-incorporated microtissues, through a single deposition process. Features of the device allow harvesting of microtissues via low-speed centrifugation.

Description

MULTI-WELL DEVICE FOR LARGE-SCALE, HIGH THROUGHPUT FORMATION OF MICROTISSUES AND ITS USE

[0001] REFERENCE TO SEQUENCE DISCLOSURE

[0002] The sequence listing file under the file name “P3302PC00_Sequence_listing. xml” submitted in ST. 26 XML file format with a file size of 9.72 KB created on August 14, 2024 is incorporated herein by referenceFIELD OF THE INVENTION

[0003] This invention is generally related to devices, particularly a multi-well device for large-scale production of microtissues in a single harvest.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0004] Modular tissue engineering, which emphasizes the use of small biological tissue units for building up the whole construct, has seen increased interest in regenerative medicine in recent years. Compared to traditional tissue engineering where cells are seeded onto a bulk scaffold, the properties of individual biological modules or units, usually in the form of microtissues, could be more controllable with minimal nutrient transport problem because of their short diffusion distance and large surface area-to-volume ratio. However, “bottom-up” approach of tissue engineering still has only limited clinical application as there is a lack of efficient methods and platforms for large-scale production of microtissues; while millions or even more microtissues are often needed to generate a clinically applicable tissue or organ implant. Furthermore, the optimal microtissue environment for cultivating different cells often varies hugely, adding extra difficulty in scaling up the microtissue production.

[0005] Microtissues can be formed from cells only, which are often termed cell aggregates or spheroids, or from cells mixed with scaffold matrix. Different strategies have been employed for the fabrication of both types of microtissues. Methods for forming cell aggregates include: direct cell-seeding on cell-repelling surfaces, which facilitate cell aggregation as adhesive cells tend to bind  with each other when they cannot attach to the supporting surface; and hanging drop and microwell patterned surface, which work by providing a small, curved or pointed bottom such that cells are concentrated within a small space as they sink by gravity, allowing close contact between them, thereby facilitating their interactions and cell-cell adhesion formation. These methods, however, are not suitable for microtissues with scaffold matrices as these microtissues require compartmentalization of the cell-matrix mixture or else a bulk mass of tissue will be fabricated.

[0006] Cell culture devices have been designed that contain v-or u-shaped microwells, so that cell suspension can be added on the microwell-containing surface and then sedimented or centrifuged to the bottom of individual microwells where they aggregate and form spheroid. However, since these products are dedicated to making cell aggregates or spheroids without any matrix protein incorporation, they are usually not applicable for extracellular matrix incorporation as the cell-matrix solution cannot be separated in the microwell compartment due to such as incompatible microwell dimension and insufficient separation between individual microwells. Furthermore, harvesting microtissues from these devices often requires vigorous flushing that generates large shear leading to cell or tissue damage. Although some more recent inventions with microwell designs addressed the importance of cell-matrix interaction in forming microtissues, the interaction is often facilitated by coating the microwell surface with matrix proteins. Thus, only cells on the surface of the microtissue can interact with the matrix proteins, which is not sufficiently biomimetic, and these designs seldom target at large-scale microtissue fabrication and limited for in vitro study or drug screening only.

[0007] Methods for fabricating matrix-incorporated microtissues have been devised, such as the use of phase separation in water-oil emulsion, droplet formation by electrospraying or direct deposition through repeat pipetting, or mixing of cell suspension with scaffold particles in a spinner flask bioreactor. Although electrospraying, emulsion-based, and microcarrier-based approaches are more convenient for large-scale microgel fabrication, they involve the use of  high voltage, chemicals or shear force to separate the cell-matrix mixture, which could damage the cells and / or denature the matrix material. In comparison, formation of individual droplets is a milder fabrication method that avoids the use of chemical additives and allow more flexible and accurate control on the droplet composition and volume. However, the droplet-by-droplet dispensing is time consuming and not suitable for large-scale microtissue formation. Even though the production could be automated with the use of commercially available pipetting robots, the process is still slow and these machines often demand a large working space not easily available, especially for applications requiring production in facilities compliant to the Good Manufacturing Practice (GMP) . Additionally, the incorporation of pipetting robots in the manufacturing process could be costly and technically demanding as these machines often require specialized personnel for programming, operation and maintenance.

[0008] Accordingly, the current microtissues fabrication strategies lack the flexibility to cater for the fabrication of both cell aggregates or matrix-incorporated microtissues, and / or are difficult to scale up due to severe time-and space-consuming processes. Thus, there remains an unmet need for an efficient and widely applicable platform or method for the mass production of microtissues.

[0009] Therefore, it is an object of the invention to provide improved platforms for large-scale production of microtissues.

[0010] It is an object of the invention to provide devices for large-scale production of microtissues via droplet formation.SUMMARY OF THE INVENTION

[0011] Described is a device for large-scale, high throughput, and rapid fabrication of microtissues with improved control of the size, volume, and composition of the microtissues and ease of recovery of the microtissues. The device is designed as an invertible insert or a hanging insert, suitable for inversion and placement inside a single-compartment tissue culture plate, such that the microtissues can be collected in the tissue culture plate by centrifugation, preferably low-speed centrifugation (e.g., less than 2,000 rpm,  such as between 500 rpm and 2,000 rpm) . In an inverted position, the droplets inside individual micro- / mini-wells carrying microtissue easily fall off from the well array with small force. A low-speed centrifugation of 500 rpm has been tested to be sufficient for water droplets to fall out from these microwells.

[0012] The device has a three-dimensional support and for large-scale microtissue fabrication, and the device contains: (i) a microstructured layer with an upper major surface and a lower major surface, and (ii) a two-dimensional array of microwells (i.e., having microscale dimensions) having an opening at the upper major surface, extending between the upper major surface and the lower major surface, and having a closed end toward the lower major surface. The closed end of one or more microwells has a concave up curvature, preferably round-bottom. The microwells contain round-bottom cavities that can trap cell suspension or cell-scaffold matrix mixture. Preferably, the upper major surface is partially hydrophilic. Preferably, the upper major surface has a contact angle between 45 ℃ and 90 ℃, more preferably between 50 ℃ and 90 ℃.

[0013] Preferably, the device is formed from a material selected from polystyrene, polypropylene, polydimethylsiloxane, or a combination thereof.

[0014] In use, the device facilitates the formation of multiple microtissues, including both cell aggregates and matrix-incorporated microtissues, through a single deposition process, instead of the time-consuming, droplet-by-droplet deposition.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0015] FIGs. 1A and 1B are schematics showing the overall setup to make anatomical constructs. FIG. 1A shows experiments used to select microtissue composition. FIG. 1B shows a bottom-up strategy for fabricating an ear-shaped construct from microtissues.

[0016] FIG. 2A shows the top-view and side-view, of a multi-well array device for large-scale microtissue fabrication. All dimensions are expressed in mm.

[0017] FIG. 2B show a non-limiting procedure for using the device.

[0018] FIGs. 3A-3E entities made during the process for making an ear-shaped construct from microtissues. FIG. 3A shows a CAD model of an ear with its dimensions. FIG. 3B shows a 3D-printed ear model. FIG. 3C shows an elastomeric ear model negative. FIG. 3D shows a replicate of the 3D-printed ear model. FIG. 3E shows the final agarose ear mold, equilibrating in culture medium. Scale bar: 5 mm.

[0019] FIGs. 4A and 4B are an image and a bar graph, respectively, showing the morphology (FIG. 4A) and sizes (FIG. 4B) of different microtissues. Scale bar: 500 μm. FIG. 4C shows images of the gross appearance of the ear cartilage mini-constructs fused from different microtissues. The insert shows the over-exposed image of the mini-constructs for evaluating the degree of fusion among the microtissues. Scale bar: 500 μm. Insert figures are at the same scale as the parent image.

[0020] FIGs. 5A-5D are bar graphs showing gene expression analysis by quantitative PCR of the ear cartilage mini-constructs after 3 weeks in vitro culture. FIGs. 5E-5H are bar graphs showing the biochemical and mechanical characterization of the ear cartilage mini-constructs after 3 weeks in vitro culture.

[0021] FIGs. 6A-6C are bar graphs showing the biochemical and mechanical characterization of subcutaneously implanted ear cartilage mini-constructs.

[0022] FIG. 7A is an image showing the morphologies of microtissues fabricated by the device, in comparison to those formed by traditional hanging drop method. FIGs. 7B and 7C are bar graphs showing the viability count of microtissues formed by the device compared to those formed by hanging drop method.

[0023] FIG. 8 is an image showing the gross appearance of an ear-shaped construct.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0024] I. Definitions

[0025] “Array of microwells” refers to a collection of microwells on a substrate material. The microwells have a three-dimensional structure with dimensions,  e.g., openings with, for example, diameters in the range of between about 1,000 μm and about 6,000 μm, and depths in the range between about 500 μm and 3,000 μm. “Array” means a plurality of microwells, which are localized wells or chambers in an array format on a substrate material; the size of the array and its microwells will depend on the composition and end use of the array.

[0026] “Large-scale, ” as relates to a device with a plurality of microwells for microtissue production, refers to quantities of between about 500 and 50,000 microtissues obtained from the device in a single harvest.

[0027] II. Devices

[0028] Described is a device for large-scale, high throughput, and rapid fabrication of microtissues with improved control of the size, volume, and composition of the microtissues and ease of recovery of the microtissues. The device is capable of fabricating microtissues, including cell aggregates and cells mixed with scaffold matrix, i.e., matrix-incorporated microtissues. Prior cell culture devices are not capable of forming matrix-incorporated microtissues mainly due to incompatible microwell dimension and insufficient separation between individual microwells. In the disclosed device, the micro-or mini-well dimension is designed to contain sufficient volume to form matrix-incorporated microtissues, and the micro-or mini-well separation together with the operation method ensures individual compartmentalization of each droplet / microtissue. The device is preferably designed as an invertible insert or a hanging insert, suitable for inversion and placement inside a tissue culture plate, such as a single-compartment tissue culture plate, such that the microtissues can be collected in the tissue culture plate by centrifugation, preferably low-speed centrifugation (e.g., less than 2,000 rpm, such as between 500 rpm and 2,000 rpm) , when the device is positioned at an inverted configuration, such as when the upper major surface containing the microwells facing down. The disclosed devices address a significant bottleneck in prior hanging-drop cell culture devices that had structural features that could cater to a single dispensing process of microtissue. In the prior devices, droplet-by-droplet dispensing is  still required, rendering them difficult and largely unsuitable for achieving high-throughput generation of microtissue.

[0029] The device is made from a biocompatible material and contains a plurality of microwells arranged in a two dimensional array. Preferably, the microwells contain round-bottom cavities that can trap cell suspension or cell-scaffold matrix mixture, such that multiple microtissues can be fabricated through a single loading process, instead of the time-consuming, droplet-by-droplet dispensing. A single loading process is defined as the loading of cell solution or cell-matrix mixture on the well array, at volume with reference to the total number of microtissues to be fabricated, in one go. Multiple droplets / microtissues can be formed by this single loading step on the well array depending on the number of micro- / mini-wells present on the well array. On the other hand, microtissues fabrication through droplet-by-droplet dispensing means the dispensing of droplets at distinct location of the collecting container. Even with multichannel pipettes, less than 10 droplets / microtissues can be formed at a time. Repeated dispensing is required for fabrication of larger numbers of microtissues using the droplet-by-droplet method. Further, prior cell culture devices were not amenable to a single loading process, because of the arrangement of the microwells and their spacing. Further, the materials commonly employed for prior cell culture devices, do not favor the single loading of cell mixture.

[0030] Preferably the device and / or the process of fabricating microtissues using the device are free from the use of any chemical additive as required in most other emulsion-based microfluidics methods.

[0031] This device facilitates the formation of multiple microtissues, including both cell aggregates and matrix-incorporated microtissues, through a single deposition process, which has not been reported previously especially for the matrix-incorporated microtissues.

[0032] In a preferred form, the device has a three-dimensional support and for large-scale microtissue fabrication, and the device contains: (i) a microstructured layer with an upper major surface and a lower major surface, and (ii) a two- dimensional array of microwells (i.e., having microscale dimensions) having an opening at the upper major surface, extending between the upper major surface and the lower major surface, and having a closed end toward the lower major surface. The closed end of one or more microwells has a concave up curvature and, preferably, the upper major surface is partially hydrophilic, such that the contact angle is preferably between 45 ℃ and 90 ℃, more preferably between 50 ℃ and 90 ℃. It is believed that smaller contact angles likely cannot cater hanging drop culture application, while a greater contact angle will have difficulty in spreading the material into the microwell. The device is capable of generating between about 500 to about 50,000, preferably about 2,000 microtissues in a single harvest.

[0033] In some forms, the device is formed from a biocompatible and / or sterile material selected from polymers (e.g., polydimethylsiloxane (PDMS) , agarose, gelatin, hydrogels, elastomer, polymethylmethacrylate (PMMA) , polycarbonate (PC) , polystyrene, polypropylene (PP) , polyethylene (PE) , high density polyethylene (HDPE) , polyimide, cyclic olefin polymers (COP) , cyclic olefin copolymers (COC) , polyethylene terephthalate (PET) ) , metals or metal films (e.g., aluminum, stainless steel, copper, chromium, and titanium) , or a combination thereof. Preferably, the device is formed from a material selected from polydimethylsiloxane, polystyrene, polypropylene, or a combination thereof.

[0034] Further details on the device and components thereof are provided in the following sections.

[0035] i. Microwell Arrays

[0036] In a preferred form, the closed end of at least one of the microwells does not have sharp edges, corners, or flat surfaces. Preferably, the closed end of at least one of the microwells is round-bottomed.

[0037] Further, the microwells are separated with spaces between each other. The spacing can be, and is preferably, determined by calculating the distance between centers. Varying the spacing between sites can result in the formation of arrays of high density, medium density, or lower density. The microwells  may be spaced any suitable distance apart. Spacing is determined by measuring the distance between the center points of two adjoining microwells. The microwells are generally spaced between 50 μm and 500 μm apart. In some forms, the microwells may be spaced between about 100 μm to about 200 μm apart. In some forms, the microwells may be spaced between about 300 μm to about 5,000 μm apart. In some forms, the microwells may be spaced between about 50 to about 100 μm apart. A particular advantage of spacing wells apart is that it allows efficient fabrication of large amounts of microtissues with controlled size, volume and composition. The well spacings also ensure sufficient separation between neighboring droplets such that they cannot coalesce and matrix-incorporated microtissues can be fabricated.

[0038] In some forms, the geometry of the micro-or mini-wells and their spacings are configured to promote spreading of liquid, cells, and / or scaffold matrix into the microwells (e.g., round-bottomed wells) . In these forms, preferably, the geometry of the micro-or mini-well is chosen to be rounded, with no sharp edge as well as a depth-to-radius ratio less than 1: 1 to promote spreading of materials into the micro-or mini-wells. The geometry of the spacings prevents the liquid, cells, and / or scaffold matrix from settling on the spaces between microwells. Non-limiting examples of suitable surface features include, but are not limited to, domed, ridged, or peaked surface features that encircle the wells or straddle the surface between wells.

[0039] The size of a microwell can be made to accommodate any suitable volume in the micro-liter regime. In some forms, a microwell volume is about 1 μL to about 50 μL. In some forms, a microwell volume is about 1 μL to about 40 μL. In some forms, a microwell volume is about 1 μL to about 30 μL. In some forms, a microwell volume is about 1 μL to about 20 μL. In some forms, a microwell volume is about 1 μL to about 10 μL. In some forms, a microwell volume is greater than 1 μL to about 50 μL. In some forms, a microwell volume is greater 1 μL to about 40 μL. In some forms, a microwell volume is greater 1 μL to about 30 μL. In some forms, a microwell volume is greater 1  μL to about 20 μL. In some forms, a microwell volume is greater 1 μL to about 10 μL. In some forms, a microwell volume is about 5 μL or about 4 μL.

[0040] The microwells may have any suitable diameter (width) . In some forms, the microwells have a diameter (width) in one dimension of about 1,000 μm to about 6,000 μm. In some forms, the microwells have a diameter (width) in one dimension of about 1, 500 μm to about 2,000 μm. In some forms, the microwells have a diameter (width) in one dimension of about 2,000 μm to about 3,000 μm.

[0041] The microwells extending between the upper major surface and the lower major surface may have any suitable depth. One or more of the microwells have a depth between about 300 μm and about 3,000 μm. In some forms, the depth of one or more of the microwells is between about 300 μm to about 500 μm. In some forms, the depth one or more of the microwells is between about 1,000 μm to about 2,000 μm. The depth of a microwell can be measured, for example using a Wyko NT9100 Optical Profiler (Veeco, Plainview, N. Y. ) . Routine microwell depth measurements can be made using the area difference plot feature of the instrument. The instrument can compare the depth of a plurality of microwells to a reference point on a surface of the device (e.g., the upper major surface) to provide an average microwell depth.

[0042] Preferably, the microwells have low cell adhesion and / or cell-repellent surfaces. Such surfaces can be conferred by the material of the well array, selected from polymers (e.g., silicone, poly (ethylene glycol) ) , or surface modification treatments including, but not limited to polishing and blasting, or coating with cell-repellent coating (e.g., pluronics and poly (ethylene glycol) ) . Preferably, the total cell adhesion force for the microtissue to the well array does not exceed the centrifugal force (such as 50g in relative centripetal force (RCF) ) used to harvest the microtissues, such that the microtissues can be rapidly harvested by low-speed centrifugation.

[0043] In some forms, microtissues, such as cells, cell aggregates (e.g., cell spheroids) , or cells mixed with scaffold matrix are disposed in at least one microwell of the microwell array. In some forms, microtissues, such as cells, cell aggregates (e.g., cell spheroids) , or cells mixed with scaffold matrix are  disposed in at least 25%of the microwells of the microarray. In some forms, microtissues, such as cells, cell aggregates (e.g., cell spheroids) , or cells mixed with scaffold matrix are disposed in at least 50%of the microwells of the microwell array. In some forms, microtissues, such as cells, cell aggregates (e.g., cell spheroids) , or cells mixed with scaffold matrix are disposed in at least 75%of the microwells of the microwell array. In some forms, microtissues, such as cells, cell aggregates (e.g., cell spheroids) , or cells mixed with scaffold matrix are disposed in at least 90%of the microwells of the microwell array. In some forms, microtissues, such as cells, cell aggregates (e.g., cell spheroids) , or cells mixed with scaffold matrix are disposed in about 100%of the microwells of the microwell array.

[0044] The array of microwells preferably contains a sufficient number of microwells to generate microtissues sufficient to mold one or more body parts, such as an ear. The array of microwells can contain any number of microwells depending on the diameter of the microwell and the dimension of the culture plate. Depending on the end use of the array, substrates are made to contain a certain number of microwells (e.g., between 500 microwells and 1,000 microwells, between 1,000 microwells and 2,000 microwells, between 4,000 microwells and 5,000 microwells, etc. )

[0045] ii. Microwell array surface treatment

[0046] In some forms, the entire device can be treated to modify their surface properties. In some forms one or more surfaces of the device, such as the upper major surface containing the spaces separating the microwells, microwell surface, and / or lower major surface can be treated to modify their surface properties. In some forms the upper major surface containing the spaces separating the microwells is treated to modify its surface properties. In some forms the microwells are treated to modify their surface properties. In some forms the lower major surface is treated to modify its surface properties. A variety of surface treatments and surface modification techniques can be used. Examples can include, but are not limited to, plasma treatments to render hydrophobic material surfaces more hydrophilic (e.g., oxygen plasma  treatment) ; wet or dry etching techniques to smooth or roughen glass and silicon surfaces; adsorption or grafting of polyethylene oxide or other polymer layers, for example pluronic; or bovine serum albumin to substrate surfaces to render them more hydrophilic and less prone to non-specific adsorption of biomolecules and cells; the use of silane reactions to graft chemically reactive functional groups to otherwise inert silicon and glass surfaces, etc., to modify the surface. The choice of surface treatment or surface modification utilized can depend on the type of surface property that is desired and / or on the type of material from which the microwell array is made. The treatment may enhance harvesting of microtissues from the device, by providing surface with low surface tension, low cell adhesion, and / or cell-repellent properties.

[0047] In some forms, the entire device can be coated with a thin layer of material to modify the properties and functions of these surfaces. In some forms one or more surfaces of the device, such as the upper major surface containing the spaces separating the microwells, microwell surface, and / or lower major surface can be coated with a thin layer of material to modify the properties and functions of these surfaces. In some forms the upper major surface containing the spaces separating the microwells is coated to modify its surface properties. In some forms the microwells are coated to modify their surface properties. In some forms the lower major surface is coated to modify its surface properties. The coating may enhance harvesting of microtissues from the device, by providing surface with low surface tension, low cell adhesion, and / or cell-repellent properties.

[0048] In some forms, one or more surfaces of the device are coated with a thin film containing of a material typically known to be compatible with cells and / or scaffold material. Other desirable properties of the coating include durability. The coating may preferably minimize non-specific absorption of macromolecules to the side and bottom walls of the microwells. The term “coating” refers to a relatively thin composition (e.g., a film) with a thickness that is significantly smaller than other characteristic dimensions of the substrate. In some forms, the coating is uniform and conformal to the surface being coated,  with a thickness between about 25 nm and about 1,000 nm. The thickness of the coating may be non-uniform over the surface of the array.

[0049] Many different types of materials can be used as a coating. The composition of a coating material will depend on the device, the application, and the method of coating deposition. In some forms, a coating is a polymer (e.g., an inorganic polymer) . A coating can be a non-metal oxide (e.g. silicon dioxide (SiO2) ) . Other coatings may be, for example, a metal alloy, a metal or semi-conductor oxide, nitride, carbide or boride. Many coatings are commercially available.

[0050] III. Methods of Making

[0051] The device described herein can be fabricated using any of a number of fabrication techniques. Non-limiting examples of fabrication methods that can be used include 3D printing or other direct write fabrication processes using curable materials; micro-molding and micro-embossing; bulk micromachining techniques such as photolithography and wet chemical etching, plasma etching, or deep reactive ion etching; laser micromachining; and similar techniques. A preferred fabrication method is 3D printing together with plastic molding, such as creating a negative model of the device in Fusion360 and printing by Objet500 Connex3 3D printer (Stratasys) using VeroClear, and using the negative model as a mold for molding plastic or silicon material into the designed device.

[0052] Microwell arrays can be fabricated from a variety of biocompatible substrate materials. The choice of material can depend on the choice of fabrication technique, and vice versa. Non-limiting examples of suitable materials include polymers (e.g., polydimethylsiloxane (PDMS) , agarose, gelatin, hydrogels, elastomer, polymethylmethacrylate (PMMA) , polycarbonate (PC) , polypropylene (PP) , polyethylene (PE) , high density polyethylene (HDPE) , polyimide, cyclic olefin polymers (COP) , cyclic olefin copolymers (COC) , polyethylene terephthalate (PET) ) , metals or metal films (e.g., aluminum, stainless steel, copper, chromium, and titanium) , etc. A hydrophilic material can be desirable for fabrication of the microwell arrays (e.g., to enhance  wettability and minimize non-specific binding of cells and other biological material) . Hydrophobic materials that can be treated or coated (e.g., by oxygen plasma treatment, or grafting of a polyethylene oxide surface layer) can also be used for fabrication of the microwell arrays. The use of porous, hydrophilic materials for the fabrication of the microwell array can be desirable in order to facilitate capillary wicking / venting of entrapped air bubbles in the device. In some forms, the device is fabricated from a single material. In some forms, the device is fabricated from two or more different materials that may be covalently bonded or present as a mixture.

[0053] In some forms, prepolymers or monomers of the above-described polymers are mixed with a curing agent, and allowed to cure inside a mold to form the device. Suitable weight ratios of the prepolymers or monomers to the curing agent are about 10: 1. Suitable curing agents include, but are not limited to vinyl-terminated PDMS, dimethylhydroxyacetophenone (DMHA) , 2, 4, 6-trimethylbenzoyldiphenylphosphone oxide (TPO) , hydroxylcyclohexylphenylketone (CPK) , 2, 2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA) , benzophenone, 2, 2-diethyloxyactetophenone, 2, 4-diethylthiozanthone. A suitable temperature for the curing process is about 60 ℃.

[0054] IV. Methods of Using

[0055] Once made, the device described herein finds use in a number of applications. In a preferred form, the device is used for large-scale microtissue fabrication.

[0056] The disclosed device can be further understood through the following enumerated paragraphs or embodiments.

[0057] 1. A device having a three-dimensional support and for large-scale microtissue fabrication, the device containing:

[0058] (i) a microstructured layer with an upper major surface and a lower major surface, and

[0059] (ii) a two-dimensional array of microwells (i.e., having microscale dimensions) having an opening at the upper major surface, extending between  the upper major surface and the lower major surface, and having a closed end toward the lower major surface,

[0060] wherein the closed end of one or more microwells has a concave up curvature and, preferably, the upper major surface is partially hydrophilic preferably having a contact angle between 45 ℃ and 90 ℃, more preferably between 50 ℃ and 90 ℃.

[0061] 2. The device of paragraph 1, wherein the closed end of at least one of the microwells does not have sharp edges, corners, or flat surfaces.

[0062] 3. The device of paragraph 1 or 2, wherein the closed end of at least one of the microwells is round-bottomed.

[0063] 4. The device of any one of paragraphs 1 to 3, having a plurality of microwells such that the device is capable of generating between about 500 and about 5,000 microtissues in a single harvest.

[0064] 5. The device of any one of paragraphs 1 to 4, wherein the device is designed as an invertible insert or a hanging insert, suitable for inversion and placement inside a tissue culture plate, such as a single-compartment tissue culture plate.

[0065] 6. The device of any one of paragraphs 1 to 5, wherein the of the microwells have low cell adhesion and / or cell-repellent surfaces such that microtissues inside the round-bottomed microwells can be extracted by low-speed centrifugation of less than 2,000 rpm with the device being positioned at an inverted configuration (such as having the upper major surface facing down) .

[0066] 7. The device of any one of paragraphs 1 to 6, wherein at least one of the microwells has a volume from 1 μL to about 50 μL.

[0067] 8. The device of any one of paragraphs 1 to 7, containing one or more surfaces interspersed between the microwells.

[0068] 9. The device of paragraph 8, wherein the one or more surfaces are configured to promote spreading of liquid, cells, and / or scaffold matrix into the round-bottomed microwells.

[0069] 10. The device of any one of paragraphs 1 to 9, wherein the device is formed from a material selected from polymers (e.g., polydimethylsiloxane  (PDMS) , agarose, gelatin, hydrogels, elastomer, polymethylmethacrylate (PMMA) , polycarbonate (PC) , polystyrene, polypropylene (PP) , polyethylene (PE) , high density polyethylene (HDPE) , polyimide, cyclic olefin polymers (COP) , cyclic olefin copolymers (COC) , polyethylene terephthalate (PET) ) , metals or metal films (e.g., aluminum, stainless steel, copper, chromium, and titanium) , or a combination thereof.

[0070] 11. The device of any one of paragraphs 1 to 10, wherein the device is formed from a material selected from polydimethylsiloxane, polystyrene, polypropylene, or a combination thereof.

[0071] 12. The device of any one of paragraphs 1 to 11, wherein the microwells have low cell adhesion and / or cell-repellent surfaces such that the total cell adhesion force for the microtissue to the microwell’s surface is less than the centrifugal force (such as 50g in relative centrifugal force) used to harvest the microtissues.

[0072] 13. The device of any one of paragraphs 1 to 12, wherein at least one of the microwells contains microtissues, such as cells, cell aggregates (e.g., cell spheroids) , or cells mixed with scaffold matrix, preferably biocompatible and / or biodegradable scaffold matrix.

[0073] 14. The device of paragraph 13, wherein the scaffold matrix contains fibrillar proteins (e.g., collagens, fibronectin, laminin) , glycosaminoglycans (e.g., hyaluronic acid, heparan sulphate, chondroitin sulphate) , gelatin, elastin, proteoglycans (e.g., decorin, versican, aggrecan) , matricellular proteins (e.g., osteopontin, thrombospondin) , alginates, polyesters (e.g., polycaprolactone, poly (lactic acid) , poly (glycolic acid) , poly (lactic-co-glycolic acid) ) , poly (dimethyl siloxane) , ceramic materials (e.g., hydroxyapatite, tricalcium phosphate) , or polystyrene.

[0074] 15. The device of any one of paragraphs 1 to 14, wherein the microwells are capable of sustaining a hanging drop containing microtissue at 37 ℃ between about 1 hour and about 2 days, about 2 hours and about 2 days, about 5 hours and about 2 days, about 10 hours and about 2 days, about 15 hours and about 2 days, about 1 day and about 2 days, or about 2 days.

[0075] 16. The device of any one of paragraphs 1 to 15, having a total amount of between about 500 and about 5,000 microtissues in a single harvest.

[0076] Examples

[0077] Example 1: Large-scale production of microtissues and building of ear-shaped cartilage from human auricular chondrocyte microtissues

[0078] The auricle is a prominent feature of the anatomy, such that any defect or damage would be easily visible and could bring negative impact on one’s social life and psychological health. Reconstruction of the auricle requires a complex shaped ear implant that would match the patient’s contralateral ear and integrate with the tissues at the surgery site. Currently, autologous ear implants carved using patient’s rib cartilage are most favored among surgeons, because of their lower immunogenicity and better integration with the surgical site tissue (Nagata S. Total auricular reconstruction with a three-dimensional costal cartilage framework. Paper presented at: Annales de chirurgie plastique et esthetique 1995; Yanyong, et al., Journal of Plastic, Reconstructive &Aesthetic Surgery 2009; 62 (12) : 1550-1554) . However, donor site morbidity and tedious surgical procedures were the major drawback for this treatment (Baluch, et al., Plastic Surgery 2014; 22 (1) : 39-43) .

[0079] Tissue engineering takes both the advantage of producing an autologous ear implant without cartilage biopsy by de novo synthesis of ear graft using autologous auricular chondrocytes and a supporting scaffold. Mainstream approaches include seeding of cells into an ear shaped scaffold (Cao, et al., Plast Reconstr Surg. 1997; 100: 297-302; Hirano, et al., Plos one 2021; 16 (7) : e0253149; Zhao, et al., Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery 2015; 43 (3) : 382-389; Zhou, et al., EBioMedicine 2018; 28: 287-302; Zhou, et al., Tissue Engineering Part A 2011; 17 (11-12) : 1573-1581) , as well as encapsulating cells in hydrogels contained in an ear-shaped mold (Chung, et al., Tissue engineering 2006; 12 (9) : 2665-2673; Cohen, et al., PloS One2018; 13 (10) : e0202356; De Chalain, et al., Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials, The Japanese Society for Biomaterials, and The Australian Society for Biomaterials 1999; 44 (3) : 280-288; Visscher, et al., Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials 2019; 107 (5) : 1711-1721) or supported by a rigid  framework having the contours of an ear (Zhou, et al., Tissue Engineering Part A 2011; 17 (11-12) : 1573-1581; Lee, et al., Biomacromolecules. 2011; 12 (2) : 306-313) . The scaffold, mold, or ear framework can be 3D printed with high precision control in their geometries and customizing capabilities. Although most of these studies reported successful ear graft generation, there are shortcomings that need to be overcome. For instance, the scaffold seeding approach is difficult to achieve homogeneous cell distribution (Solchaga, et al., Tissue Engineering 2006; 12 (7) : 1851-1863; Wang, et al., ACS Applied Bio Materials 2020; 3 (10) : 6932-6943) ; and the hydrogel approach is hampered by contraction of the hydrogel by the encapsulated cells, thus distorting the shape of the construct (Ahearne, Interface focus 2014; 4 (2) : 20130038; Dong, et al., Regenerative Biomaterials 2021; 8 (4) : rbab030) . In the rigid framework approach, the framework is often made of non-degradable or slow degrading material, which may increase the chances of undesirable immune response. Furthermore, poor integration of foreign material with host tissue often leads to implant failure.

[0080] These issues could be overcome by a bottom-up approach where small building blocks, or microtissues, are combined to form a macrostructure, as the cell distribution in each small unit is more controllable. Two most common choice of microtissues include cell aggregates and microgels, which are formed by encapsulating cells in hydrogels in small volumes. Various natural biomaterials, such as collagen (Hui, et al., Biomaterials 2008; 29 (22) : 3201-3212; Yeung, et al., Osteoarthritis and Cartilage 2019; 27: S426) , hyaluronic acid (Jia, et al., Biomacromolecules 2006; 7 (12) : 3336-3344; Yung-Chih and Cheng-Hong, Materials Science and Engineering: C 2017; 76: 760-774) , and alginate (Yung-Chih and Cheng-Hong, Materials Science and Engineering: C 2017; 76: 760-774; Jeon, et al., Materials Today Chemistry 2019; 12: 61-70; Utech, et al., Advanced healthcare materials 2015; 4 (11) : 1628-1633) , have been used for microgel fabrication. Nevertheless, large-scale microtissue production remains as a challenge when adopting a bottom-up approach for implant fabrication. Furthermore, while substantial studies have demonstrated that cell-cell and cell- matrix interactions greatly influence tissue phenotype, it remains unclear and there is a lack of consensus whether a matrix-free condition or a matrix-incorporated condition contributes to better tissue phenotype.

[0081] This study therefore aimed to devise an improved, low cost, bottom-up fabrication method that is applicable for generating tissue implants, such as an ear-shaped implant with an optimal choice of microtissue. The overall study design is illustrated in FIGs. 1A and 1B. Comparisons were made between different types of microtissues, which are cell aggregates (matrix-free) , matrix-incorporated aggregates, and microgels, and the best candidate for ear cartilage tissue construction was determined based on their in vitro and in vivo tissue properties. Collagen was chosen as the biomaterial of interest, because it is a natural extracellular matrix component that is frequently used in cartilage tissue engineering, is known to bind and interact with chondrocytes, and is able to form a hydrogel at physiological condition. Hyaluronic acid, another major component of cartilage extracellular matrix, was further incorporated into collagen microgel, to represent microtissue with a more complex matrix environment.

[0082] The second part of the study focuses on the fabrication of an ear-shaped construct from microtissues. A molding strategy was developed, which involves first fabricating thousands of microtissues using a well array prototype device, and then combining the fabricated microtissues in an ear-shaped agarose mold. The well array device allows for the formation of a thousand microtissue by a single deposition of cell / matrix pre-polymer suspension, which circumvents the traditional droplet-based microtissue fabrication strategy. Following the strategy, an ear-shaped construct was created with a cartilage-like phenotype, demonstrating its feasibility for application in clinical setting.

[0083] Materials and methods

[0084] (i) Isolation and culture of auricular chondrocytes

[0085] The study was approved by the Hong Kong Human Research Independent Review Board (IRB) (reference number: UW 20-130) . Ear tissue remnants were obtained from microtia patients undergoing total auricle  reconstruction surgery with informed consents for auricular chondrocytes isolation.

[0086] The ear cartilage was dissected from the raw ear tissue with the removal of surrounding connective tissues, and was then minced into small pieces for digestion with 0.2%pronase (Sigma-aldrich) for 1.5 hour followed by 0.1%collagenase type IA (Sigma-aldrich) overnight at 37 ℃. The resulting solution was passed through a 70-μm cell strainer (Corning Falcon) for collecting the chondrocytes. The isolated chondrocytes were cultured with DMEM / F12 medium supplemented with 10%FBS (USA origin, Life Technologies) and 1%Antibiotic-Antimycotic (Life Technologies) at 37℃. The cells were passaged using 0.25%Trypsin-EDTA (Life Technologies) .

[0087] (ii) Microtissue formation and fusion culture for generating ear cartilage mini-tissues

[0088] Chondrocytes of the third passage were trypsinized, counted, and used to fabricate different types of microtissues. Droplets of 4 μL containing 1 × 106 cells / mL chondrocytes in expansion medium without other matrix material (cell aggregate, Agg) , with 50 μg / mL collagen (collagen-incorporated cell aggregate, Col-Agg) , 500 μg / mL collagen (collagen microgel, Col-Mic) , or 500 μg / mL collagen supplemented with 1000 μg / mL HA (collagen-HA microgel, CH-Mic) were pipetted onto petri dish lid, which was then inverted to enable hanging drop culture. The hanging drops were left in 37 ℃ incubator undisturbed for 2 days to allow aggregation and tight binding.

[0089] To fabricate ear cartilage mini-tissues, the microtissues were transferred to 0.6 mL microtubes. Each mini-tissue was fused from 50 microtissues. Upon fusion, the medium was changed to chondrogenic medium consisting of DMEM-HG medium (Life Technologies) supplemented with 10 ng / mL TGFβ3 (Merck Millipore) , 100nM dexamethasone (Sigma) , 0.1 mM L-ascorbic acid (Sigma) , 1%ITS-A (Gibco) , 0.35 mM L-proline (Sigma) , 1.25 mg / mL BSA (Sigma) , and 1%antibiotic-antimycotic to stimulate ear cartilage matrix deposition. The ear cartilage mini-tissues were cultured for 3 weeks before further evaluation.

[0090] (iii) Subcutaneous implantation of ear cartilage mini-tissues into nude mice model

[0091] All animal handling and surgical procedures were approved by the Committee on the Use of Live Animals in Teaching and Research (CULATR) of the University of Hong Kong (protocol number: 5304-20) . BALB / c nude mice of 6-8 weeks were anaesthetized with ketamine and xylazine mixture. Subcutaneous pockets were made on the dorsum of the animal and inserted with the mini-tissues. After 8 weeks, the animals were sacrificed to harvest the implanted tissues for evaluation.

[0092] (iv) Design, fabrication and application of the well array device

[0093] The well array was designed to be made up of a series of closely packed and optimally sized and spaced concave cavities / mini-sized wells (mini-well) to trap cell / cell-matrix solution, FIG. 2A. In this study, the prototype device was designed to hold 4 μL of liquid (e.g., liquid containing cells or cells and cell-matrix material) in a single microwell and was made with PDMS. The negative molds for each well array were modelled in Fusion360 and printed by Objet500 Connex3 3D printer (Stratasys) using VeroClear. The PDMS prepolymer and curing agent mixture (SlygardTM 184; Dow) were prepared at a 10: 1 weight ratio and allowed to cure inside the mold at 60℃. The fabricated PDMS device was sterilized by autoclave and UV radiation, and further coated with 5%Pluronic F127 overnight to increase the wettability of the PDMS well array device before cell culture. A schematic diagram is shown in FIG. 2B to illustrate the general steps involved in making microtissues using the well array.

[0094] (v) Fabrication of agarose ear mold and ear-shaped construct

[0095] An ear model was made using Meshmixer, and printed using a benchtop 3D printer (Polarbear 3D2+) . The printed ear model was replicated using EcoFlex silicone elastomer (00-30, Smooth-on) by mold casting twice. The elastomeric ear model was autoclaved and ultraviolet irradiated, and was used to create the ear-shaped cavity in the agarose mold.

[0096] A 2 w / v%agarose solution, prepared by dissolving the agarose powder ( LE agarose, Lonza) in distilled water, was added to completely  cover the elastomeric ear model and allowed to solidify. The elastomeric ear model was then removed carefully from the agarose mold, which was equilibrated with culture medium overnight before use. All the entities made during the process, including the ear model, the elastomer negative and replicate, as well as the agarose mold, are shown in FIGs. 3A-3E.

[0097] The ear-shaped construct was made by filling the agarose mold cavity with microtissues. The construct was cultured inside the mold in chondrogenic medium for 3 weeks before further evaluation.

[0098] (vi) Histology and immunohistochemistry

[0099] Samples were fixed with 4%paraformaldehyde, embedded in paraffin and sectioned with 10μm thickness. The sections were subjected to standard haematoxylin and eosin (H&E) staining for examination of tissue morphology, or safranin O and Miller’s elastic tissue staining for visualizing sulphated glycosaminoglycan (GAG) and elastic fibre deposition respectively.

[0100] Immunohistochemistry was performed against type II collagen, aggrecan, type I collagen, elastin and sox9. Type II collagen was retrieved with pepsin in 5mM hydrochloric acid at 37 ℃ for 30 minutes, while other markers were retrieved by incubation in citrate buffer at 100℃ for 30 minutes. Endogenous hydrogen peroxidase was blocked with 3%hydrogen peroxide, followed by incubation with 1.5%serum to prevent non-specific protein binding. Subsequently, the sections were stained with primary antibodies at 4 ℃ overnight. Primary antibodies used include: mouse anti-type II collagen (1: 2000, CP18, Millipore) , rabbit anti-type II collagen (1: 200, AB761, Millipore) , mouse anti-sox9 (1: 200, ab76997, Abcam) , mouse anti-type I collagen (1: 2000, C2456, Sigma) , rabbit anti-type I collagen (1: 400, ab34710, Abcam) , rabbit anti-aggrecan (1: 800, ab186414, Abcam) , rabbit anti-elastin (1: 1000, ab21610, Abcam) . After 30 minutes secondary antibody incubation, the stained sections were subjected to standard DAB colour development. Nucleus was counterstained with haematoxylin.

[0101] (vii) Quantitative polymerase chain reaction

[0102] RNA was extracted from the bead-homogenized samples using RNeasy Mini Kit (Qiagen) and reverse transcribed using the High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) . PCR was performed using power SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems) in the StepOnePlus PCR System (Applied Biosystems) machine using the standard comparative CT method. The primers used in this study were listed in Table 1. COL2A1, ACAN, ELN and SOX9 were normalized against GAPDH. The gene expression level was presented as fold change against monolayer cultured chondrocytes of the same passage.

[0103] Table 1: List of primers used in this study.

[0104] (viii) Biochemical evaluation

[0105] GAG content: Samples were digested with papain at 65 ℃ overnight before subjecting to standard dimethylmethylene blue (DMMB) assay. The GAG content was normalized against DNA and hydroxyproline content to account for the differences in input collagen and cell number, respectively, in individual samples. The DNA content was determined using a commercial fluorometric assay kit (QuantiFluoTM DNA assay kit, Bioassay Systems) . The  papain digest was further hydrolysed with 6N HCl at 130 ℃ for 4 hours for HYP measurement using standard assay.

[0106] Elastin content: Elastin was quantified using the Fastin-Elastin assay kit (Biocolor) . Insoluble elastin within the samples were hydrolysed into soluble α-elastin using 0.25M oxalic acid for 1 hour at 100℃ with a total of three changes of oxalic acid. Supernatant containing α-elastin in each change was collected and pooled for the fastin-elastin assay following manufacturer’s instruction.

[0107] (ix) Mechanical evaluation by microplate compression

[0108] The mechanical properties of the mini-tissues were measured in terms of reduced elastic modulus using a microplate compression test developed in our lab previously (Chan, et al., Annals of Biomedical Engineering 2008; 36 (7) : 1254-1267) . A step change loading regime with the displacement rate of the manipulator holder set as 1 μm / sand 5 μm / sbefore and after the step change respectively was used in this experiment.

[0109] (x) Live dead staining of microtissue formed with well array device

[0110] Live dead staining was conducted using a commercial kit ( Viability / Cytotoxicity Kit, Invitrogen) following manufacturer’s instructions, and imaged using a confocal microscope (Leica) . The live and dead cells were counted to calculate the percentage of viability cells.

[0111] (xi) Statistical analysis

[0112] All quantitative results were analysed in Statistics 27 (IBM) , and presented either as mean ± 2*standard error in bar chart or in boxplot. Normality assumption was verified for all groups before proceeding to one-way ANOVA test. Level of significance was set at α = 0.05.

[0113] Results

[0114] (i) In vitro characterization of different ear cartilage mini-constructs

[0115] Morphology of different microtissues and their assembly: Microtissues of different compositions were made and fused to generate mini-sized ear cartilage constructs for small-scale evaluation. The morphology of different microtissues  and their mini-constructs are shown in FIGs. 4A and 4B, respectively. After 2 weeks of culture, all microtissues integrated with the microtissue boundaries disappeared (FIG. 4B, insert) . Agg and Col-Agg appeared to integrate better with earlier microtissue boundary disappearance at Day 3 culture.

[0116] Ear cartilage phenotype characterization: All the mini-constructs were able to exhibit cartilage-like phenotype after 21 days chondrogenic induction, as reflected by the appearance of lacunae together with intense safranin O and aggrecan IHC staining as well as upregulation of ACAN and SOX9 gene expression with large amount of GAG measured in the matrix (FIGs. 5A-5D) . GAG / HYP ratio was found to be statistically higher in Agg and Col-Agg in one-way ANOVA, though no significant difference was found in the ACAN gene expression (p=0.115) . Nevertheless, this ratio could be contributed by the higher collagen input and in turn the amount of HYP in Col-Mic and CH-Mic, as there was no observable difference in GAG / DNA ratio among all groups.

[0117] Mature elastic fibres, typically demonstrated by intense black stain in the elastic tissue stain, could not be observed in all groups, Agg and Col-Agg appeared to have a larger proportion of bluish stain, which may suggest the presence of immature elastic fibres. However, the auricular chondrocytes in all groups were able to express elastin as seen in elastin IHC, while the elastin content in Agg and Col-Agg was again found to be higher with statistical significance when compared with CH-Mic (p ≤ 0.029) , though no significant difference was found in their gene expression (p=0.247) , FIGs. 5E-5H.

[0118] The major difference among all mini-constructs was found in collagen type II and Sox9 IHC, with Agg and Col-Agg showing a much larger amount of collagen II positive tissue matrix as well as greater proportion of Sox9 positive nucleus, though the difference was not large enough or the sample size was not large enough to create a statistical significant in their gene expression (p=0.121 for COL2A1; p=0.063 for SOX9) (FIGs. 5A-5D) . In terms of mechanical properties, the reduced elastic modulus of Agg and Col-Agg was again found to be significantly higher than Col-Mic and CH-Mic ( (FIGs. 5E-5H) ) , suggesting an in vitro niche with minimal amount of matrix material may be more favorable  for ear cartilage phenotype presentation. Nevertheless, all groups had a much lower modulus than the native tissue, which was probably due to the inability of the auricular chondrocytes to produce a mature matrix in vitro.

[0119] (ii) In vivo maturation of ear cartilage mini-constructs

[0120] After 8 weeks subcutaneous implantation, the ear cartilage mini-constructs were observed to mature, with more intense GAG and elastic tissue staining as well as type II collagen staining especially at the central region. However, the GAG, elastic fibres and type II collagen positive areas were observed to be much larger in Agg and Col-Agg group. The observation was also supported by higher GAG content with statistical significance when compared with CH-Mic group (GAG / HYP: p=0.007 for Agg vs CH-Mic, p=0.016 for Col-Agg vs CH-Mic; GAG / DNA: p=0.042 for Col-Agg vs CH-Mic) (FIGs. 6A-6C) . The mechanical properties of all groups except CH-Mic were comparable to the native tissues level, possibly a result of the maturation of the ear cartilage tissue matrix in vivo (FIGs. 6A-6C) . However, the sample size may not be large enough to detect significance among all groups (p=0.062) .

[0121] (iii) Microtissue fabrication by well array device

[0122] Agg and Col-Agg microtissues were fabricated using the well array prototype device, and evaluated by H&E and live-dead staining. Both types of microtissues did not appear to have obvious difference in terms of morphology and size when fabricated using the well array or by hanging drop method (FIG. 7A) . A slight improvement in viability was observed when the microtissues were fabricated using the well array, with a significant difference detected in Agg with p=0.021 (FIGs. 7B and 7C) .

[0123] (iv) Ear-shaped construct fabrication

[0124] Upon placing the chondrocytes aggregates into the agarose ear mold, the aggregates fused together as expected and took up the shape of the mold cavity, generating an ear-like structure. The fabricated ear was strong enough to be picked up by forceps without changing shape. Histology of the ear construct showed lacunae structures and intense GAG staining with homogeneous distribution, indicating the cartilage phenotype has also been attained (FIG. 8) .

[0125] In this study, microtissues of different compositions were made and could be fused to form larger constructs. Among the four microtissues made, Agg and Col-Agg represent a niche with high cell-cell contact, while Col-Mic and CH-Mic represent a collagen-rich microgel environment. The cell-cell distance was also larger in Col-Mic and CH-Mic as observed in histological staining. These two groups of microtissues showed large differences in their ease of fusing as well as tissue phenotype. The observation that Agg and Col-Agg microtissues fused faster than the collagen-rich microtissues is consistent with a previous study, which reported that the presence of large amounts of ECM may hamper the fusion process as matrix remodelling is required before redistribution of the cells (Kosheleva, et al., Scientific reports 2020; 10 (1) : 1-15) .

[0126] In terms of tissue phenotype, the Agg and Col-Agg groups achieved a more homogeneous cartilage-like matrix with greater type II collagen deposition in vitro, though the GAG deposition in vitro was similar judging from their GAG / DNA ratio, while the higher GAG / HYP ratio was probably due to the larger amount of input collagen in the Col-Mic and CH-Mic that contributed to larger amount of HYP. The mechanical properties also improved in the Agg and Col-Agg, likely resulting from the difference in matrix composition.

[0127] Although high cell density is known to favor chondrocyte or chondrogenic differentiation, there is a lack of evidence in the literature directly comparing cell aggregates with collagen hydrogel systems. In a previous study by Lien, et al., gelatin scaffold of large pore sizes that facilitated the formation of micromass structures resulted in better chondrogenic phenotype than those with smaller pore sizes, where a majority of chondrocytes adhered to the gelatin matrix and adopted an elongated morphology without observable GAG deposition (Sio-Mei, et al., Acta Biomaterialia 2009; 5 (2) : 670-679) . Their results may echo the results described herein that cell-cell contact among chondrocytes promotes chondrogenic phenotype better than when the chondrocytes bind to collagen.

[0128] The ear cartilage mini-constructs made from all types of microtissues cultured in vitro were not able to reach the elastin / elastic tissue content as in the  native cartilage tissue, yet could achieve similar staining intensity as the native tissue after in vivo implantation. A similar observation has also been reported in previous studies (Enomura, et al., International Journal of Molecular Sciences 2020; 21 (22) : 8496; Rosa, et al., PloS One 2014; 9 (8) : e105170) , suggesting further stimulation, which could be referenced from the in vivo subcutaneous environment, could be taken as a reference for stimulating the auricular chondrocytes to deposit a more mature elastic matrix in vitro.

[0129] Furthermore, it was observed that the input collagen appeared to remain within the construct throughout in vitro culture, as could be seen more clearly in the elastic tissue stain where large ‘clumps’ of collagen was stained in bright pink by van Gieson’s stain. Although collagen is biodegradable and could be taken up by cells, a previous study suggested that auricular chondrocytes expressed a more anabolic than catabolic gene profile (Hellingman, et al., Cell Transplantation 2011; 20 (6) : 925-940) , possibly explaining the lack of degradation of the input collagen by the newly synthesized matrix.

[0130] Upon in vivo implantation, all the ear cartilage tissues integrated well with the surrounding tissues, and were able to further mature with biochemical composition and mechanical properties reaching the native tissue level. Consistent with other studies, a layer of type I collagen positive layer was found to surround the implanted construct (Zhou, et al., Tissue Engineering Part A 2011; 17 (11-12) : 1573-1581; Lee, et al., Biomacromolecules. 2011; 12 (2) : 306-313) , resembling a perichondrium structure, while the elastic cartilage matrix mainly located at the centre of the implanted tissues. Without wishing to be bound by theory, it is believed that a hypoxic environment created by this type I collagen envelop may contribute to the in vivo chondrogenic matrix maturation, given that it has been established that hypoxia can promote chondrocyte matrix synthesis (Coyle, et al., Journal of Orthopaedic Research 2009; 27 (6) : 793-799) . It may, therefore, be worth investigating the ability of a hypoxic culture environment in stimulating the maturation of ear cartilage tissue, especially the elastic tissue matrix, in vitro.

[0131] While all the groups of microtissues demonstrated tissue maturation in vivo, Agg and Col-Agg appeared to maintain a larger construct size and also contained a greater proportion of ear cartilage-like matrix than the Col-Mic and CH-Mic groups. Interestingly, the collagen “clumps, ” as seen in the elastic tissue stain image, were all located at the periphery of the implanted construct only and reciprocal to the elastic cartilage tissue region. Therefore, microtissues with a dense collagen matrix with larger cell-cell distance may potentially hamper the in vivo matrix remodelling. While further investigation is needed to confirm the observation and elucidate the mechanism, this concept is worth noting attention as collagen has been explored as a scaffold material in ear cartilage tissue engineering (Zhao, et al., Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery 2015; 43 (3) : 382-389; Cohen, et al., PloS One 2018; 13 (10) : e0202356; De Chalain, et al., Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials, The Japanese Society for Biomaterials, and The Australian Society for Biomaterials 1999; 44 (3) : 280-288) .

[0132] While Agg and Col-Agg tissues achieved similar biological properties, they presented different advantages when being applied for ear cartilage tissue engineering. Agg microtissues do not need additional materials, thus could lower the production cost; yet it was observed that some patients’ cells may be less capable of forming tight aggregation, leading to formation of loose aggregate which could be difficult to handle. Addition of minimal amount of collagen as in Col-Agg was found to facilitate their aggregation. Thus, both Agg and Col-Agg microtissues are applicable to ear cartilage engineering, though most of the time Agg is sufficient and the latter can be used when the chondrocytes are less able to aggregate.

[0133] An in-house well array prototype device was fabricated to facilitate large-scale production of microtissues including both cell aggregates and microgels, and applied in the bottom-up ear construct fabrication. While different spheroid plates are commercially available for high throughput spheroid fabrication, they could not cater for microgel fabrication and lack a rapid and effective tissue recovery mechanism. Thus, these spheroid plates are  usually not applicable for the bottom-up based tissue engineering. In this study, both the microtissue formation and harvest procedures took less than 2 hours for making the ear construct with the use of the device, which significantly improved the efficiency of the process. The Agg microtissues obtained from the well array device even had a slightly better viability, which could be due to a shorter processing time. Although PDMS was used to fabricate the prototype device due to its biocompatibility, low cost and easy fabrication, better device material, such as polystyrene or polypropylene used in traditional cell culture container, as well as corresponding manufacturing strategy, may be worth exploring for further improving the user-friendliness of the device.

[0134] In fabricating the ear shaped construct, different to previous studies which also used molding techniques (Cohen, et al., PloS One 2018; 13 (10) : e0202356; Rosa, et al., PloS One 2014; 9 (8) : e105170; Liao, et al., Plastic and Reconstructive Surgery 2015; 135 (2) : 313e-321e) , agarose was chosen as the mold material as it is bioinert and porous to allow media diffusion into the mold cavity, and also transparent to allow easier observation of the ear construct throughout the culture. Although agarose has long been used for tissue molding, it is often limited to the production of tissues with simple geometry, because the soft agarose could easily be torn apart during demolding from model with undercut and complex structure (Gunja, et al., Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2009; 3 (7) : 521-530; Livoti and Morgan, Tissue Engineering Part A 2010; 16 (6) : 2051-2061) . Using a highly flexible ear model, agarose with ear-shaped cavity was successfully generated for holding and molding the auricular chondrocyte microtissues. Although the ear construct made in this study has been reduced in size and further study is needed to determine its in vivo dimensional stability, it was demonstrated that our proposed strategy is feasible for generating an elastic cartilage tissue with customizable and complex shape in vitro with good in vivo compatibility.

[0135] In summary, this work demonstrates an application of a bottom-up tissue engineering method for ear cartilage tissue engineering. It was found that microtissues with high cell density are necessary to achieve optimal ear cartilage  tissue properties, and a device was developed for large-scale microtissue fabrication with a feasible approach for making a customizable ear shaped construct. Based on the results of this study, further research could be conducted to promote in vitro maturation of the engineered ear cartilage as well as to fabricate a full-sized ear implant with in vivo stability.

[0136] Those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific forms of the invention described herein. Such equivalents are intended to be encompassed by the following claims.

Claims

1.A device having a three-dimensional support and for large-scale microtissue fabrication, the device containing:(i) a microstructured layer with an upper major surface and a lower major surface, and(ii) a two-dimensional array of microwells (i.e., having microscale dimensions) having an opening at the upper major surface, extending between the upper major surface and the lower major surface, and having a closed end toward the lower major surface,wherein the closed end of one or more microwells has a concave up curvature and, preferably, the upper major surface is partially hydrophilic preferably having a contact angle between 45 ℃ and 90 ℃, more preferably between 50 ℃ and 90 ℃.2.The device of claim 1, wherein the closed end of at least one of the microwells does not have sharp edges, corners, or flat surfaces.3.The device of claim 1 or 2, wherein the closed end of at least one of the microwells is round-bottomed.4.The device of any one of claims 1 to 3, having a plurality of microwells such that the device is capable of generating between about 500 and about 5,000 microtissues in a single harvest.5.The device of any one of claims 1 to 4, wherein the device is designed as an invertible insert or a hanging insert, suitable for inversion and placement inside a tissue culture plate, such as a single-compartment tissue culture plate.6.The device of any one of claims 1 to 5, wherein the of the microwells have low cell adhesion and / or cell-repellent surfaces such that microtissues inside the round-bottomed microwells can be extracted by low-speed centrifugation of less than 2,000 rpm with the device being positioned at an inverted configuration (such as having the upper major surface facing down) .7.The device of any one of claims 1 to 6, wherein at least one of the microwells has a volume from 1 μL to about 50 μL.8.The device of any one of claims 1 to 7, containing one or more surfaces interspersed between the microwells.9.The device of claim 8, wherein the one or more surfaces are configured to promote spreading of liquid, cells, and / or scaffold matrix into the round-bottomed microwells.10.The device of any one of claims 1 to 9, wherein the device is formed from a material selected from polymers (e.g., polydimethylsiloxane (PDMS) , agarose, gelatin, hydrogels, elastomer, polymethylmethacrylate (PMMA) , polycarbonate (PC) , polystyrene, polypropylene (PP) , polyethylene (PE) , high density polyethylene (HDPE) , polyimide, cyclic olefin polymers (COP) , cyclic olefin copolymers (COC) , polyethylene terephthalate (PET) ) , metals or metal films (e.g., aluminum, stainless steel, copper, chromium, and titanium) , or a combination thereof.11.The device of any one of claims 1 to 10, wherein the device is formed from a material selected from polydimethylsiloxane, polystyrene, polypropylene, or a combination thereof.12.The device of any one of claims 1 to 11, wherein the microwells have low cell adhesion and / or cell-repellent surfaces such that the total cell adhesion force for the microtissue to the microwell’s surface is less than the centrifugal force (such as 50g in relative centrifugal force) used to harvest the microtissues.13.The device of any one of claims 1 to 12, wherein at least one of the microwells contains microtissues, such as cells, cell aggregates (e.g., cell spheroids) , or cells mixed with scaffold matrix, preferably biocompatible and / or biodegradable scaffold matrix.14.The device of claim 13, wherein the scaffold matrix contains fibrillar proteins (e.g., collagens, fibronectin, laminin) , glycosaminoglycans (e.g., hyaluronic acid, heparan sulphate, chondroitin sulphate) , gelatin, elastin, proteoglycans (e.g., decorin, versican, aggrecan) , matricellular proteins (e.g., osteopontin, thrombospondin) , alginates, polyesters (e.g., polycaprolactone, poly (lactic acid) , poly (glycolic acid) , poly (lactic-co-glycolic acid) ) , poly (dimethyl siloxane) , ceramic materials (e.g., hydroxyapatite, tricalcium phosphate) , or polystyrene.15.The device of any one of claims 1 to 14, wherein the microwells are capable of sustaining a hanging drop containing microtissue at 37 ℃between about 1 hour and about 2 days, about 2 hours and about 2 days,  about 5 hours and about 2 days, about 10 hours and about 2 days, about 15 hours and about 2 days, about 1 day and about 2 days, or about 2 days.16.The device of any one of claims 1 to 15, having a total amount of between about 500 and about 5,000 microtissues in a single harvest.

Images